TWI734987B - 單醣標記之奈米脂質體藥物遞送系統，其製法及其作為藥物靶定遞送載體之應用 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種單醣標記奈米脂質體藥物遞送系統，其特徵在於作用為靶定分子的單醣配體係與膽固醇分子結合，且經單醣-修飾的膽固醇係嵌入脂質體之雙層膜結構中。本發明之葡萄糖胺標記奈米脂質體可將所攜載之藥物帶至目標細胞，例如腫瘤組織癌細胞與癌幹細胞，並藉由胞吞作用使藥物進入目標細胞中，而產生直接的毒殺作用或抑制幹性基因表現，如此不僅可避免對正常細胞產生毒性，亦能有效提高癌症臨床用藥及放射療法的治療效果。

Description

單醣標記之奈米脂質體藥物遞送系統，其製法及其 作為藥物靶定遞送載體之應用
本發明係關於一種奈米脂質體藥物遞送系統。更特別地，係關於一種於其表面標記有單醣配位體的奈米脂質體，而該單醣配位體係結合於嵌入其雙層膜組成之膽固醇分子上。
脂質體(又稱作微脂體或微脂粒)是一種利用磷脂雙分子層膜所形成的囊泡，來包裹藥物分子而形成的製劑。由於生物體質膜的基本結構也是磷脂雙分子層膜，因此脂質體具有與生物體細胞相類似的結構，具有很好的生物相容性。雖然現今已普遍利用脂質體作為一種藥物遞送系統，但若脂質體不具備標靶能力，則無法有效地將活性藥物(例如抗癌藥物)運送至患部(例如腫瘤細胞)，而需要提高給藥劑量始能達到所預期的治療效果。
已有先前技術嘗試通過在脂質體上連接某種識別分子(即所謂的靶定配位體，targeting ligand)，通過該配位體分子特異性與標靶細胞表面的相應受體作用，而使脂質體專一地在靶定區域釋藥。常見的已知靶定配位體包括：糖、維生素、植物凝血素、肽類激素、抗原、抗體和其他蛋白質等。例如，美國專利US 7,070,801曾嘗試藉由將糖鏈接在脂質體表面，達到將脂質體選擇性地送目標組織或細胞的目的，但是其必須透過與一預先結合在脂質體表面上的連接蛋白(linker protein)，例如人類白蛋白才可達成。
美國專利US 8,802,153 B2揭示一種具選擇性之 藥物遞送系統，其係將抗癌藥物紫杉醇(paclitaxel)包裝在一由聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)、聚乳酸(Polylactic Acid,PLA)等共聚物組成之奈米粒子中，該粒子上接合有一種用以靶定前列腺癌特定細胞膜抗原(PSMA)之分子(Apt)，而且係利用PEG當作連結分子(Linker)，使Apt配體連結在該粒子的最外層。美國專利US 8,747,891 B2揭示一種用於包埋親水性化療藥物之神經醯胺陰離子性脂質體(ceramide anionic liposomes)，其中該脂質體包含至少一種PEG修飾的中性脂質(其中至少一半為PEG(750)C8)、至少一種陰離子脂質、一種神經醯胺及陽離子或中性脂質，且所成的神經醯胺陰離子性脂質體在生理pH值條件下必須具有淨負電荷。利用PEG修飾脂質體雖然有助於增加穩定度及增長血液中循環時間，但近年來卻有研究結果相繼指出，PEG會干擾脂質體表面的配體與目標細胞上之標誌物(marker)結合。
美國專利申請案US 2017/0112800 A1揭露一種疏水紫杉烷(醇)-脂質共價綴合物，其係藉由在脂質雙層內產生超分子組裝，提供脂質體額外的穩定化，並導致藥物的瘤內濃度增加，而因此增加其治療功效。於該申請案中並無具體記載針對經由將靶定配位體接合在膽固醇上，並進一步用於製備具靶向功能之脂質體的相關技術內容。
現今癌症治療面臨到的主要問題是，許多抗癌藥物不具有癌症專一性，且在治療過程中癌幹細胞會產生抗藥性/抗輻射性，而使得在癌症治療過程必須要提高化療藥物/輻射線照射的劑量，此相對上也提高了對患者身體產生有害副作用的風險與機率。
於是，本發明首先合成一種與單醣或其衍生物分子共軛結合的膽固醇，並將其用於與至少一磷脂調配，而預期製得一種單醣分子標記的奈米脂質體。所得之單醣分子標記的奈米脂質體可做為抗癌藥物(例如，神經醯胺)之遞送載體，用於預防或治療癌幹細胞對該化療藥物的抗性。
本發明基於以上之目的發現，根據本發明方法所製得之攜載神經醯胺的葡萄糖胺標記的奈米脂質體，具備靶向癌細胞及癌幹細胞之能力；可提高抗癌藥物於細胞內作用之效果；所釋出的藥物能抑制癌幹細胞之幹性基因表現；且搭配臨床抗癌藥物或放射治療時，具有提高彼等療法對於目標癌症之療效。
於是，本發明之一方面係關於一種單醣分子標記的奈米脂質體藥物遞送系統，其特徵在於至少包含一種與單醣分子共軛結合的膽固醇及一種磷脂。所述之表面標記單醣分子的奈米脂質體藥物遞送系統亦可包含一種無修飾之膽固醇。於本發明之具體實施態樣，該與單醣分子共軛結合的膽固醇係位於該脂質體之雙層膜結構中，而該單醣分子展露於該脂質體之表面。該奈米脂質體藥物遞送系統可有效標靶至癌細胞或癌幹細胞表面上高度表現的葡萄糖載體蛋白(Glucose transporter 1,GLUT1)，並經由胞吞作用被內吞到細胞內，藉由此遞送系統，可將其攜載之藥物遞送到癌細胞或癌幹細胞內。於本發明之一具體實施例，所述之奈米脂質體尺寸係介於80-150nm，且具有表面電荷介於-10至-45毫伏特。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之磷脂可為中性脂質，其是指在生理pH下不帶電荷或是中性電荷的兩性離子形式的任何脂質。中性脂質之實例包括(但不局限於)二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、腦磷脂、腦苷脂、二醯基甘油和鞘磷脂等。再者，所述之磷脂亦可為陰離子脂質，其是指在生理pH下具負電荷的任何脂質。陰離子脂質的實例包括(但不局限)於雙十六碳鏈磷酸鹽(DHDP)、磷脂肌醇(PI)、磷脂絲胺酸(PS)例如二肉荳蔻醯基磷脂醯絲胺酸(DMPS)、二棕櫚醯基磷脂醯絲胺酸(DPPS)、磷酸醯甘油(PG)例如二肉 荳蔻醯基甘油(DMPG)、二油醯基磷脂酰甘油、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二月桂基磷脂醯甘油(DLPG)、二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)、二硬脂醯磷脂甘油(DSPG)、磷脂酸(PA)例如二肉荳蔻醯磷酸(DMPA)、二棕櫚醯磷酸(DPPA)及二磷脂醯甘油(DPG)等。
於本發明之其他具體實施態樣，所述單醣分子為可與膽固醇共軛結合之單醣分子，例如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖等或其衍生物，以葡萄糖或葡萄糖衍生物(例如，葡萄糖胺)為較佳。
於本發明之一具體實施態樣，所述之單醣分子標記的奈米脂質體藥物遞送系統可進一步包含一抗癌藥物，包括一親水性抗癌藥物或疏水性抗癌藥物。於本發明之一具體實施例，本發明之奈米脂質體藥物遞送系統，可用於攜載至少一化療藥物於其中空腔體中。
所述之單醣分子標記的奈米脂質體藥物遞送系統亦可與一鑲嵌於該遞送系統中之脂雙層的藥物組合，而形成一種標靶治療且將該藥物鑲嵌於脂雙層之奈米藥物脂質體。例如，於本發明之一具體實施例，係將神經醯胺攜載於本發明之單醣標記的奈米脂質體，而製備得一種單醣分子標記的神經醯胺奈米脂質體，其中該神經醯胺係嵌入該脂質體之雙層膜結構中。此實施樣態之奈米藥物脂質體亦可進一步於其中空腔體中包含其他藥物，而成為可標靶治療並可於脂雙層及中空腔體攜帶多重藥物的脂質體。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之標靶治療奈米藥物脂質體或神經醯胺奈米脂質體，可在脂質體的中空腔體攜載至少一種抗癌藥物，例如(但不限定於)阿黴素(doxorubicin)、泛艾黴素(epirubicin)、博來霉素(Bleomycin)、絲裂黴素C(Mitomycin C)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、喜樹鹼(Camptothecin)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、太平洋紫杉醇 (paclitaxel)、歐洲紫杉醇(Docetaxel)、吉西他濱(Gemcitabine)、Vinorelbine、愛萊諾迪肯(Irinotecan)、依託泊苷(Etoposide)、長春花鹼(Vinblastine)、培美曲塞(Pemetrexed)、羥基脲(Hydroxyurea)、氨甲蝶呤(Methotrexate)、卡培他濱(Capecitabine)、氟苷(Floxuridine)、卡巴他賽(Cabazitaxel)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、雌莫司汀(estramustine)、薑黃素(Curcumin)、類喜樹鹼衍生物SN-38及彼等藥物之組合。
於本發明之其他具體實施態樣，所述之標靶治療奈米藥物脂質體或神經醯胺奈米脂質體可用於預防或治療癌幹細胞對該抗癌藥物的抗性。
本發明之另一方面，係關於一種製備本發明表面標記單醣分子的奈米脂質體的方法，特徵在於包含：合成一單醣-修飾之膽固醇；將一磷脂、該單醣-修飾之膽固醇、一視需要之無修飾之膽固醇與藥物混合；利用薄膜水合法、溶劑分散法、有機溶劑注射法、界面活性劑法、薄膜擠壓法、French-Press法等方式，製造成單一脂雙層且大小一定的微脂體。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之磷脂、單糖-修飾之膽固醇與藥物係以二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)42-70mmole%、單醣-修飾之膽固醇20-28mmole%、神經醯胺10-30mmole%之比例混合。於本發明之另一項具體實施態樣，所述之單醣-修飾之膽固醇係葡萄糖胺-修飾之膽固醇。
本發明之又一方面，係關於一種醫藥組成物，較佳係用於癌症治療，包括(但不限於)癌幹細胞治療、抗藥性癌細胞治療、抗輻射性癌細胞治療及其組合。所述之醫藥組成物特徵在於包含：一攜載抗癌藥物的單醣分子標記的藥物遞送系統標靶治療奈米藥物脂質體，及一醫藥上可接受的基材、載體或賦形劑。
於本發明之一些具體實施態樣，所述之抗癌藥物可為神經醯胺及/或一化療藥物。所述之醫藥組成物可依製藥 領域中已習知的方法，與該醫藥上可接受的基材、載體或賦形劑製成適用於各種不同投藥途徑的劑型，例如(但不限定於)溶液、低劑、丸劑、錠劑、粉劑、乳液、經皮吸收敷料、膏劑、乳霜及含藥支架等。
所述之醫藥上可接受的基材、載體或賦形劑可為任何於製藥領域中已習知使用者。於本發明之一些具體實施態樣，所述之醫藥上可接受的基材實例包括多醣、蛋白質、合成高分子或其混合物。
圖1為依本發明之一實例製得之葡萄胺標記奈米脂質體於生理環境下之穿透式電子顯微鏡影像，顯示奈米脂質體為具有脂雙層膜的球形結構。
圖2係顯示藉由DSL(圖上半部)及TEM(圖下半部)測量本發明之葡萄糖胺標記奈米脂質體於PBS緩衝液中的安定性。脂質體係於儲放35天後以醋酸鈾染色(2wt%)。比例尺長度為100nm。
圖3係顯示本發明之葡萄糖胺標記奈米脂質體進入到非小細胞肺癌細胞球(H1299 non-small lung cancer，圖3A)與大腸癌細胞球(DLD-1 colon cancer，圖3B)內的共軛焦電子顯微鏡影像。
圖4係顯示本發明之葡萄糖胺標記奈米脂質體增進細胞對攜載於其中之神經醯胺的吸收。(A)顯示經由葡萄糖胺標記神經醯胺脂質體治療12小時之A549非小細胞肺癌癌幹細胞腫瘤細胞球(A549 non-small lung cancer stem cells tumour spheres,A549 CSCs sphere)呈現較高度攝取至細胞球內，並有效累積到細胞球深部(厭氧區域)，比例尺代表長度為50μm。(B)以流式細胞儀偵測結果顯示，Cy5.5之葡萄糖胺標記奈米脂質體更有效地被攝入A549非小細胞 肺癌癌幹細胞腫瘤細胞球中。
圖5係顯示葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體於體內試驗中動物體內各器官與腫瘤累積之情況及在腫瘤組織內累積之情況。(A)由非侵入式活體影像系統觀察到Cy5.5之葡萄糖胺標記奈米脂質體更有效地累積於腫瘤組織而降低其他器官累積量。(B)由共軛焦螢光顯微鏡的平面圖、3D圖及剖面圖觀察到Cy5.5之葡萄糖胺標記奈米脂質體更有效地進入到腫瘤組織內並可累積至厭氧區域。比例尺代表長度為100μm。
圖6係顯示葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體可有效抑制A549非小細胞肺癌癌幹細胞腫瘤細胞球的形成。比例尺代表長度為400μm。
圖7係顯示葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體具有選擇性毒殺腫瘤幹細胞的作用。(A)以流式細胞儀偵測結果顯示，葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體處理造成較高百分比例之A549非小細胞肺癌癌幹細胞腫瘤細胞球凋亡。(B)以流式細胞儀偵測結果顯示，葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體相較於游離態神經醯胺，可於A549親本癌細胞(parental cancer cells)與A549癌幹細胞中誘導較高比率的細胞凋亡，但對於L929正常成纖維細胞則無影響。葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體甚至在A549癌幹細胞中，可誘導較於A549親本癌細胞中更高比率的細胞凋亡。
圖8係顯示A549癌幹細胞對於抗癌藥物(10μM順鉑；5μM紫杉醇)及對於放射治療(5Gy及10Gy)的敏感度，在葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體存在下有明顯增加。反觀，經過葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體及同時抑制視網膜母細胞瘤蛋白(Retinoblastoma protein,RB)表現處理之A549癌幹細胞的存活細胞數量顯著增加。游離態神經醯胺代表以游離態神經醯胺治療的A549癌幹細胞；G5C3代表以葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體治療的A549癌幹細 胞；G5C3+shRB：以葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體與RB的shRNA共治療的A549癌幹細胞；游離態神經醯胺組及G5C3組係用於與對照組比較；G5C3+shRB組係與G5C3組比較。(*或#：p<0.05；**或##：p<0.01).
圖9係顯示經過葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體處理之A549癌幹細胞相較於對照組細胞，呈現較低的細胞遷移能力及侵入能力，而且若將RB抑制後則會回復這些能力。游離態神經醯胺代表以游離態神經醯胺治療的A549癌幹細胞；G5C3代表以葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體處理的A549癌幹細胞；G5C3+shRB：以葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體與RB的shRNA共治療的A549癌幹細胞；游離態神經醯胺組及G5C3組係用於與對照組比較；G5C3+shRB組係與G5C3組比較。(*或#：p<0.05；**或##：p<0.01).
圖10係顯示葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體搭配順鉑/紫杉醇治療可於活體內抑制腫瘤發展。圖10A為小鼠體內相對腫瘤體積之變化情形，顯示葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體的治療效果與臨床抗癌藥物相當，而本發明之奈米脂質體搭配臨床抗癌藥物共同治療，可明顯抑制腫瘤生長；圖10B為小鼠於治療期間的體重變化，顯示本發明之奈米脂質體無造成顯著的副作用。
圖11係以H&E染色、Ki67染色及半胱天冬酶3(caspase 3)染色觀察葡萄糖胺標記之神經醯胺脂質體搭配順鉑/紫杉醇治療之腫瘤組織切片，顯示本發明之奈米脂質體搭配臨床抗癌藥物共同治療，有效地造成腫瘤組織內組織壞死，並有效抑制腫瘤增生現象。比例尺代表長度為200μm。
圖12為依本發明之一實例製得之葡萄糖胺標記的奈米脂質體於生理環境下之穿透式電子顯微鏡影像，顯示奈米脂質體為具有脂雙層膜的球形結構。圖12A為攜載順鉑之葡萄糖胺標記的神經醯胺奈米脂質體；圖12B為葡萄糖胺標 記的神經醯胺奈米脂質體。
圖13為依本發明之一實例製得之攜載歐洲紫杉醇之葡萄糖胺-標記的神經醯胺奈米脂質體，於生理環境下之穿透式電子顯微鏡影像，顯示奈米脂質體為具有脂雙層膜的球形結構。
本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。
實施例一、表面標記單醣分子的奈米脂質體之製備
合成葡萄糖胺-膽固醇(glucose-cholesterol)
製備流程如下所示：
Figure 108117857-A0305-02-0011-2
首先合成膽固醇-NHS酯類。將膽固醇(1mmol)、琥珀酸酐(3mmol)、三乙胺(TEA,1mmol)及4-二甲氨基吡啶 (0.3mmol)溶解於乾燥二氯甲烷(DCM)中，並於室溫下攪拌24小時。之後，將產物(羧基-膽固醇)以飽和NaCl溶液萃取三次。將羧基-膽固醇溶解於DCM，再於旋轉蒸發器去除DCM。
將羧基-膽固醇(1mmol)、N-羥基琥珀醯亞胺(NHS,1.5mmol)及4-二甲氨基吡啶(0.3mmol)溶解於乾燥二氯甲烷(DCM)中。將溶液加入一備有磁性攪拌棒之二-頸圓底燒瓶中，通入氮氣，再將預先溶於乾燥DCM之N,N-二環己基碳二醯亞胺(DCC,3mmol)逐滴緩慢加入該羧基-膽固醇溶液(置於0℃冰浴中)，並於氮氣下攪拌進行反應24小時。之後，將產物過濾去除副產物DCU，並以飽和NaCl溶液萃取三次。將膽固醇-NHS酯溶解於DCM，再於旋轉蒸發器去除DCM。所得產物酯膽固醇-NHS酯之1H NMR(氯仿-d)：δ 0.6-2.4(m，來自膽固醇)，2.6(t,-COO-CH 2 CH2-COOH來自琥珀酸)，δ 2.6(t,-COO-CH2CH 2 -COOH來自琥珀酸)，δ 2.843(s,-CH 2 -CH 2 -來自NHS),δ 4.6-4.7(m,-CH-O-來自膽固醇)，δ 5.4(m,-C=CH-來自膽固醇)。
然後，將葡萄糖胺(1.2mmol)與所得之膽固醇-NHS酯溶解於二甲亞碸(DMSO)/去離子水(體積比：1：1)中，再將其置於玻璃瓶中。進行反應24小時後，將產物以飽和NaCl溶液萃取三次。將葡萄糖胺-膽固醇溶解於DCM，再於旋轉蒸發器去除DCM溶劑。所得產物之1H NMR(DMSO-d6)：δ 2.59-2.65(m,CCH2CH2C來自琥珀酸)；δ 0.6-2.4(m，來自膽固醇)，δ 2.6(t,-COO-CH 2 CH2-COOH來自琥珀酸)，δ 2.6(t,-COO-CH 2 CH 2 -COOH來自琥珀酸)，δ 3.3-3.7(s,-CH 2 - and -CH來自葡萄糖)，δ 4.6-4.7(m,-CH-O-來自膽固醇)，δ 5.4(m,-C=CH-來自膽固醇)。亦將所得產物以SHIMADZU傅立葉轉換紅外光譜儀分析(KBr)：1176cm-1(C-O-C伸長)，1258cm-1(O-C伸長)，1707cm-1(C=O伸長)，1793cm-1(C=O伸長)，2700-2900cm-1(C-H伸長)，2500-3300cm-1(O-H伸長)。
製備葡萄糖胺標記的奈米脂質體
將所合成之葡萄糖胺-膽固醇(Glu-Chol)、無修飾之膽固醇、修飾官能基NH2的膽固醇(Chol-NH2)及二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)(以6.3：1.7：4.3：18.2莫耳之比例)溶解於二氯甲烷(DCM)中，於室溫下以旋轉蒸發器形成液態薄膜。然後，將60℃之PBS水溶液(pH 7.4)加入以使該薄膜再水合(rehydrate)。將所成的溶液進行超音波震盪(22000Hz)6分鐘。之後將溶液依序通過0.22-μm PVDF濾膜(Millipore,Darmstadt，德國)兩次，及0.1-μm PVDF濾膜(Millipore,Darmstadt，德國)兩次，即可得含不同濃度葡萄糖胺標記脂質體。再與Cy5.5-NHS ester水溶液反應2天後，以MW6-8000透析袋進行透析，移除未反應的Cy5.5即可得螢光標記的脂質體。
使用JEOL JEM-2000EX II穿透式電子顯微鏡(JEOL Inc.,Peabody,MA)，並於以2%醋酸鈾染色後觀察，所得葡萄糖胺標記神經醯胺奈米脂質體之外觀形態。由圖1之穿透式電子顯微鏡影像顯示，本發明之奈米脂質體於生理環境下可維持良好的完整形態，為一種具有脂雙層膜的球形結構。
而將本發明之奈米脂質體於PBS及4℃下靜置7、35與42天之後，以DSL測量其粒徑及大小變化，並於靜置培養35天時以2%醋酸鈾染色，及於TEM顯微鏡觀察外觀形態，來進行穩定性評估。結果顯示，本發明之神經醯胺奈米脂質體經過於4℃儲放一個月以上，其粒徑及型態仍維持穩定(圖2)。
本實例依表一所列之脂質體組成製得六組含有不同濃度的葡萄糖胺的脂質體。由表一之分析數值顯示，所製得之此六組脂質體基本上性質相近，測得粒徑大小約為120nm，PDI約為0.2，表面電荷(zeta)約為-3至-15，因此可用於探討其標靶腫瘤厭氧區之能力。
表一、不同組成之奈米脂質體的粒徑大小、表面電荷及多分
Figure 108117857-A0305-02-0014-3
進一步探討本發明之葡萄糖胺-標記的奈米脂質體在非小細胞肺癌細胞球(H1299 non-small lung cancer)與大腸癌細胞球(DLD-1 colon cancer)內的分佈情況。實驗方法簡述如下：將如前述製得之Cy5.5-螢光標記的奈米脂質體與非小細胞肺癌腫瘤球體，或大腸癌腫瘤球體共培養5小時後，再加入150uM Hypoxyprobe-1(HP-FITC厭氧區指示劑)培養1小時。之後，以福馬林固定細胞後，並使用1：100稀釋的FITC-mAb1進行免疫染色，再於共軛焦激光掃描顯微鏡(CLSM,Zeiss 880)下，觀察厭氧區指示劑螢光的分佈。並另以CLSM觀察腫瘤組織中，含有螢光染劑標記的奈米脂質體分佈之情況。
由圖3之共軛焦電子顯微鏡的影像得知，隨著葡萄糖胺的濃度增加，葡萄糖胺-標記的奈米脂質體進入到癌細胞球內的量亦隨之提高。並且，由HP-FITC厭氧區指示劑與螢光標記之Cy5.5-葡萄糖胺標記奈米脂質體的重疊影像顯示，有葡萄糖胺標記的脂質體可標靶至腫瘤，並累積於腫瘤的厭氧區內，而且葡萄糖胺-膽固醇的濃度高於2.5mmole時，有呈現顯著的差異。
實施例二、葡萄糖胺-標記的神經醯胺奈米脂質體及對於癌細胞及癌幹細胞之標靶能力評估
製備：將所合成之葡萄糖胺-膽固醇、抗癌藥物神經醯胺、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)(以10.9：4.1：3.5莫耳之比例)溶解於二氯甲烷(DCM)中，於室溫下以旋轉蒸發器形成液態薄膜。然後，將60℃之PBS水溶液(pH 7.4)加入以使該薄膜再水合(rehydrate)。將所成的溶液進行超音波震盪(22000Hz)6分鐘。之後將溶液依序通過0.22-μm PVDF濾膜(Millipore,Darmstadt，德國)兩次，及0.1-μm PVDF濾膜(Millipore,Darmstadt，德國)兩次，而得到編號G5C3為表面標記葡萄糖胺分子的神經醯胺奈米脂質體，其中G代表葡萄糖胺而C代表神經醯胺。可依使用的葡萄糖胺與神經醯胺的含量比例不同，製備得不同的神經醯胺奈米脂質體，例如於表二所示。
Figure 108117857-A0305-02-0015-6
a粒徑、表面電荷(zeta-potential)及粒徑分散程度(PDI)係經由DLS測定得。
由動態光散射(DLS)之分析結果顯示，具有不同組成比例之神經醯胺奈米脂質體，有葡萄糖胺標記者的粒徑大約為100至150nm(表二)。粒徑分散程度(PDI)值大約為0.2，表示所得的神經醯胺奈米脂質體大小均一。
使用儀器Malvern Zetasizer 1000HSA(Malvern Instruments,Malvern,UK)於25℃下測定本發明之奈米脂質體之表面電荷，顯示帶有高含量葡萄糖胺之神經醯胺奈米脂質體(G4C4及G5C3)，其表面電荷係介於-10至-45毫伏特(mV)之間，神經醯胺包覆率約為97wt%。而將本發明之奈米脂質體於PBS及4℃下靜置7、35與42天之後，以DSL測量其粒徑及大小變化，並於靜置培養35天時以2%醋酸鈾染色，及於TEM顯微鏡觀察外觀形態，來進行穩定性評估。結果顯示，本發明之神經醯胺奈米脂質體經過於4℃儲放一個月以上，其粒徑及型態仍維持穩定。
神經醯胺奈米脂質體的癌細胞及癌幹細胞之標靶能力評估：腫瘤幹細胞(Cancer Stem Cells，以下簡稱CSC)是指一類具有自我更新(self-renewal)能力的未分化細胞。本實例藉利用由懸浮培養之肺癌細胞產生的活體外腫瘤球體模式(in vitro tumour sphere model)評估本發明奈米脂質體對於癌細胞及癌幹細胞之標靶能力。將1×104個經過藥物處理之存活細胞，接種於表面覆蓋有軟瓊脂的培養皿中，該柔軟的表面使細胞不能附著，從而形成懸浮在周圍的球狀體。10天後計算球狀體數目。
將於本實施例製得之G5C3奈米脂質體與Cy5.5-NHS酯反應一天，之後以PBS透析去除過量的Cy5.5-NHS酯，所製得之Cy5.5-G5C3奈米脂質體，與A549非小細胞肺癌癌幹細胞腫瘤細胞球(A549 non-small lung cancer stem cells tumour spheres,A549 CSCs sphere)共培養5小時後，再加入150uM Hypoxyprobe-1(HP-1)培養1小時後，以福馬林固定細胞後並使用1：100稀釋的FITC-mAb1進行免疫染色，再於共軛焦激光掃描顯微鏡(CLSM,Zeiss 880)下觀察螢光分佈之情況。
由圖4的共軛焦激光掃描顯微鏡的結果顯示，本 發明之神經醯胺奈米脂質體(G4C4與G5C3)藉由其膜上標記的葡萄糖胺，可有效標靶至癌細胞或癌幹細胞表面上高度表現的葡萄糖載體蛋白(Glucose transporter 1,GLUT1)，並經由胞吞作用被內吞到細胞內，以達到將所攜載之神經醯胺遞送到癌細胞或癌幹細胞內。
另製備含有螢光染劑之奈米脂質體進行活體內追蹤。將於本實施例一製得之G5C3奈米脂質體與Cy5.5-NHS酯反應一天，之後以PBS透析去除過量的Cy5.5-NHS酯。將H1299細胞(1×107細胞/0.1mL包含於matrigel(Corning Matrigel Matrix,Corning))以皮下注射植入四週齡雌性裸鼠的背部體表內。經過腫瘤細胞移植後四週，將其體內已生成H1299腫瘤之小鼠(腫瘤體積大約500mm3)，以靜脈內注射0.1mL Cy5.5-G5C3奈米脂質體(神經醯胺劑量為0.375mg/kg-1)進行處理。經過藥物注射23小時後，將帶有H1299腫瘤之小鼠以腹膜內注射0.1mL hypoxyprobeTM-1(濃度為40mg/mL)。於1小時後，以XENOGEN IVIS成像系統(IVIS50,PerkinElmer)觀察Cy5.5-G5C3奈米脂質體之活體內分佈。
將小鼠犧牲後取出器官及腫瘤。以福馬林固定的Tissue-Tek O.C.T.固定腫瘤，將組織切片包埋並使用1：100稀釋的FITC-mAb1進行免疫染色，再於共軛焦激光掃描顯微鏡(CLSM,Zeiss 880)下觀察螢光分佈。以CLSM觀察腫瘤組織中的含有螢光染劑之奈米脂質體分佈之情況。
由圖5的結果顯示，G5C3奈米脂質體大多累積於腫瘤並無明顯在腦、肝等器官中累積。
此外，經過本發明之奈米脂質體G4C4和G5C3處理組的球形成減少，此反映了該等處理組CSC細胞喪失其抗-細胞凋亡及長期自我-更新能力(圖6)。
實施例三、表面標記糖分子的奈米脂質體選擇性誘導人類肺癌細胞A549 CSC之細胞凋亡
本實例進一步透過Annexin V/PI染色分析本發 明之神經醯胺奈米脂質體對於癌細胞及癌幹細胞的細胞凋亡誘導作用。將細胞以5μL annexin V-FITC與5μL碘化丙錠(PI)(5μg/ml)(BD Biosciences)，於1×結合緩衝液(10mM HEPES,pH 7.4,140mM NaOH,2.5mm CaCl2)中，於室溫下進行染色15min，將細胞通過Cytomics FC500流式細胞儀(Beckman Coulter)，測定annexin V-FITC與PI之螢光以檢測細胞凋亡。呈現早期凋亡(annexin V+/PI-)及晚期凋亡(annexin V+/PI+)之細胞，皆定義為死亡細胞。由Annexin-FITC/PI染色之結果顯示，由於本發明之奈米脂質體增進了神經醯胺之遞送，因此細胞當用G4C4和G5C3處理時，懸浮球的細胞凋亡抗性被顯著抑制(圖7A)。
為明確證葡萄糖胺標記的脂質體神經醯胺具有選擇性細胞毒性作用，遂測定游離神經醯胺及本發明之奈米脂質體G5C3對於在貼附條件下培養的正常L929成纖維細胞、肺親本癌細胞與A549 CSC細胞的細胞凋亡作用。
由圖7B之結果顯示，游離神經醯胺及G5C3均未在正常L929成纖維細胞中引起顯著的細胞凋亡。而在親代肺癌細胞中，本發明之奈米脂質體G5C3較游離神經醯胺，具有更高的攝入率及更好的細胞毒性。已知A549 CSC對游離神經醯胺具有抗性，但是在使用G5C3處理之CSC細胞中，顯示出更高的細胞毒性，這可能是因為與親代細胞相比，CSC對糖酵解的能量需求有更大的依賴性。總體來說，本發明葡萄糖胺標記的神經醯胺脂質體的確能夠發揮選擇性細胞毒性作用，並且廣泛地阻斷CSC的治療抗性，而對正常的成纖維細胞不產生有害的影響。
實施例四、表面標記糖分子的奈米脂質體搭配臨床抗癌藥物/放射治療之癌幹細胞抑制評估
本實例係使用順鉑和紫杉醇這兩種常用於肺癌患者抗癌的臨床藥物，來驗證肺癌CSC的耐藥性是否會受G5C3脂質體共同投藥的影響。參見圖8A的結果發現，經過 本發明G5C3脂質體投藥處理組之CSC，對於順鉑和紫杉醇的敏感性較對照組CSC高，而阻斷RB的活性會抑制此效果。而且，在不同放射照射劑量下測量有或無G5C3脂質體處理之CSC的存活率，亦顯示經過本發明G5C3脂質體處理之CSC，對於放射照射的敏感性較對照組CSC高(圖8B)。且若喪失RB表現時，CSC會回復對放射治療的抗性，即使在有本發明G5C3脂質體存在下亦然。此外，G5C3脂質體還抑制肺癌CSC的遷移和侵襲能力(圖9A,9B)，但若降低RB的表現則亦挽救了CSC的轉移潛力，表示抑制RB的表現及活性可以抵消G5C3對於CSC之影響，亦即由G5C3引起的分化狀態和減輕的CSC特性是一種RB依賴性方式。綜合上述之結果，本發明G5C3脂質體搭配臨床抗癌藥物/放射治療可協同抑制CSC存活，如此有助於消除或減低癌幹細胞對於抗癌藥物/放射治療的抗性，提高治療效果。
實施例五、表面標記糖分子的奈米脂質體搭配抗癌藥物/放射治療之活體內腫瘤抑制評估
本實例係以活體內腫瘤移植模式(In vivo tumour xenograft model)評估本發明神經醯胺奈米脂質體搭配抗癌藥物之活體內腫瘤抑制功效。將H1299 CSCs及H1299癌細胞(1×106細胞/0.1mL)與Matrigel(Matrix高濃度)共同注射入四週齡雌性裸鼠的背部體表內，進行皮下移植。於移植一個月後，將產生H1299腫瘤之小鼠(腫瘤體積大約100mm3)以靜脈注射卡鉑/紫杉醇(CP)、G5C3神經醯胺奈米脂質體及卡鉑/紫杉醇與G5C3奈米脂質體之組合物(各藥物劑量為：50mg/kg卡鉑、18mg/kg紫杉醇及0.375mg/kg神經醯胺)進行處理。每隔兩天使用游標卡尺測量腫瘤大小(V)達30天以評估藥物之抗腫瘤活性，V=a×b2/2，其中a和b分別是腫瘤的長軸和短軸。在注射後30天，將小鼠犧牲並採集全血進行血球分析，以及使用自動臨床化學分析儀(DRI-CHEM 4000i,FUJI)與血液分析儀(XT-1800iv,Sysmex)評估生化指數。
由結果顯示，卡鉑/紫杉醇(CP)與本發明G5C3奈米脂質體之組合，抑制腫瘤生長的效果最為顯著(圖10A)。於26天後，卡鉑/紫杉醇(CP)與本發明G5C3之組合治療的抗腫瘤能力，分別是傳統CP治療及單獨G5C3脂質體投藥的9.6倍和9.1倍。由活體內投藥之結果證明，G5C3脂質體具有很強的抗腫瘤能力，增強化療的敏感性。此外，使用本發明G5C3脂質體或其搭配卡鉑/紫杉醇的組合治療，並未顯著改變小鼠的體重(圖10B)，這意味著G5C3可以保留正常細胞，同時對肺癌細胞產生不利影響，而且對動物體無造成顯著的副作用。
本實例亦使用H & E、Ki-67和半胱天冬酶3染色腫瘤組織，並藉由光學顯微鏡觀察以評估腫瘤的壞死、增殖及凋亡程度。由圖11之腫瘤組織切片染色結果顯示，經由CP或G5C3處理之腫瘤織組中，僅出現輕度的細胞壞死，而以在CP與本發明G5C3之組合治療組中，細胞壞死現象非常明顯。由ki-67染色的組織病理學結果顯示，對照組腫瘤具有正常增生，而相較於CP或G5C3脂質體治療組，CP與本發明G5C3之組合治療可顯著降低癌細胞增殖，如ki-67之染色結果所示。
再者，以半胱天冬酶3染色的組織病理學結果顯示，與CP治療組相比，單獨的G5C3脂質體以及CP和本發明G5C3之組合治療，皆能更顯著地促進細胞凋亡。這些腫瘤的組織病理學染色結果與前述體內抗腫瘤功效的結果一致，證明本發明之奈米脂質體搭配臨床用抗癌藥物，能有效造成腫瘤組織內之組織壞死，並有效抑制腫瘤增生，減少腫瘤體積甚至達到清除腫瘤的效果。
實施例六、攜載順鉑之葡萄糖胺-標記的神經醯胺奈米脂質體的製備
將二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、如實施例一之方法合成之葡萄糖胺-膽固醇、膽固醇與神經醯胺，分別依下表 2所示之各組莫耳比添加至濃縮瓶中，加入適量DCM後混合均勻，並以迴旋濃縮儀抽除DCM，使濃縮瓶底部形成一層薄膜後，放置真空烘箱一天。接著加入9mL乙醚(diethyl ether)於40℃溶解薄膜，再加入60℃含有順鉑(cisplatin)的3mL PBS(油：水=3：1 v/v)，並以振盪混合器(vortex)快速混合，之後以迴旋濃縮儀抽除乙醚，再補充適量PBS並放置於60℃烘箱中1小時，最後以0.2μm及0.1μm的filter過濾，即可得到具攜載順鉑之葡萄糖胺-標記神經醯胺標靶微脂。而得到編號為GC-PL之攜載順鉑之表面標記葡萄糖胺分子的神經醯胺奈米脂質體；G-PL為攜載順鉑之表面標記葡萄糖胺分子的奈米脂質體；GC-L為表面標記葡萄糖胺分子的神經醯胺奈米脂質體；G-L為表面標記葡萄糖胺分子的奈米脂質體；C-PL為攜載順鉑之神經醯胺奈米脂質體；PL為攜載順鉑之奈米脂質體，其中G代表葡萄糖胺、C代表神經醯胺而P代表順鉑，各別奈米脂質體之組成參見下表三。
Figure 108117857-A0305-02-0021-7
a粒徑大小、粒徑分散程度(PDI)及表面電荷係使用DLS進行測量
使用JEOL JEM-2000EX II穿透式電子顯微鏡(JEOL Inc.,Peabody,MA)，並於以2%醋酸鈾染色後觀察所得奈米脂質體之外觀形態。圖12為穿透式電子顯微鏡之觀察結果，顯示本實例所得之有或無攜載神經醯胺之葡萄糖胺-標記順鉑奈米脂質體，於生理環境下可維持良好的完整形態，具有脂雙層膜的球形結構且大小均一。
進一步分析所得攜載順鉑之葡萄糖胺-標記神經醯胺標靶微脂的載藥率(drug loading,DL)與有效包覆率(encapsulation efficiency,EE)。將製備好的微脂粒溶液以濃縮離心去除未包覆藥物後，再冷凍乾燥去除水分，接著秤取2mg乾燥粉末至微量離心管，以感應耦合電漿質譜儀(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)測定鉑(Pt)含量，即可推算載藥率(drug loading,DL)與有效包覆率(encapsulation efficiency,EE)。
對於神經醯胺之藥量及有效包覆率(encapsulation efficiency,EE)係以HPLC法測定。將製備好的微脂粒溶液以濃縮離心去除未包覆藥物後，記錄剩餘體積，取1ml至微量離心管冷凍乾燥，之後以1ml HPLC移動相回溶並過濾，透過高效液相層析儀(High performance liquid chromatography,HPLC)可測得1ml微脂粒溶液所含的ceramide藥量，便可推得實際藥量計算有效包覆率。UV測量波長為230nm，流速為1ml/min，移動相為ACN/MeOH=3/7(v/v)，約6分鐘的位置有ceramide訊號，計算其面積帶入檢量線可推得藥重，即可推算載藥率(DL)與有效包覆率(EE)。
Figure 108117857-A0305-02-0022-11
Figure 108117857-A0305-02-0023-8
a神經醯胺之有效包覆率(EE)係以HPLC法測定。
b順鉑之載藥率(DL)與有效包覆率(EE)係以ICP-MS法測定。
由HPLC及ICP-MS的鑑定結果得知，此奈米脂質體可以有效的包覆親水性藥物及疏水性藥物。該奈米脂質體攜載神經醯胺的有效包覆效率可達99%，並且順鉑的有效包覆效率為70%。
實施例七、攜載歐洲紫杉醇之葡萄糖胺-標記的神經醯胺奈米脂質體的製備
將二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、以如實施例一之方法，合成之葡萄糖胺-膽固醇、膽固醇與神經醯胺，分別依下表五所示之莫耳比添加至濃縮瓶中，溶解於二氯甲烷中混合均勻，並以迴旋濃縮儀抽除二氯甲烷，使濃縮瓶底部形成 一層薄膜後，放置真空烘箱一小時。預先配製溶劑(A)5ml PBS+1.5ml歐洲紫杉醇(Docetaxel)(EtOH/PBS=1：1(v/v))與溶劑(B)5ml PBS，並預熱至60℃。加入15ml乙醚至濃縮瓶，超音波震至薄膜均勻分散於乙醚中，並加入溶劑(A)超音波震盪及Vortex數秒，再以迴旋濃縮儀抽除乙醚。加入溶劑(B)放置60℃烘箱一小時，之後將溶液依序通過0.22-μm PVDF濾膜(Millipore,Darmstadt，德國)兩次，及0.1-μm PVDF濾膜(Millipore,Darmstadt，德國)兩次，而得到編號DL1.5為攜載歐洲紫杉醇之葡萄糖胺-標記的神經醯胺奈米脂質體。
Figure 108117857-A0305-02-0024-9
對於歐洲紫杉醇之藥量及有效包覆率(encapsulation efficiency,EE)係以HPLC法測定。將製備好的微脂粒溶液以濃縮離心去除未包覆藥物後，記錄剩餘體積，取1ml至微量離心管冷凍乾燥，之後以1ml HPLC移動相回溶並過濾，透過高效液相層析儀(High performance liquid chromatography,HPLC)可測得1ml微脂粒溶液所含的歐洲紫杉醇藥量，便可推得實際藥量計算有效包覆率。UV測量波長為274nm，流速為1ml/min，移動相為ACN/H2O=3/1(v/v)，約6分鐘的位置有歐洲紫杉醇訊號，計算其面積帶入檢量線可推得藥重，即可推算載藥率(DL)與有效包覆率(EE)。其計算公式如前述實施例六中所述。
Figure 108117857-A0305-02-0025-10
a粒徑大小、粒徑分散程度(PDI)及表面電荷係使用DLS進行測量。
b歐洲紫杉醇之載藥率(DL)與有效包覆率(EE)係以HPLC法測定。
使用JEOL JEM-2000EX II穿透式電子顯微鏡(JEOL Inc.,Peabody,MA)，並於以2%醋酸鈾染色後觀察所得奈米脂質體之外觀形態。圖13為穿透式電子顯微鏡之觀察結果，顯示本實例所得之有或無攜載神經醯胺之葡萄糖胺-標記順鉑奈米脂質體，於生理環境下可維持良好的完整形態，具有脂雙層膜的球形結構且大小均一。
綜合上述，本發明首先合成單醣分子標記之膽固醇，並將其與磷脂、活性藥物及視需要的無標記膽固醇調配，而製得表面標記單醣分子之奈米脂質體藥物遞送粒子。經由本發明之細胞及動物實驗證明，本發明之單醣分子標記奈米脂質體具有能夠特異性靶定、及將所攜載之藥物帶至目標癌細胞與癌幹細胞的功能，並可藉由胞吞作用使藥物進入目標細胞，產生直接的毒殺作用或抑制幹性基因之表現，故可有效應用於製備標靶治療奈米藥物。且經由活體投藥試驗證明，本發明之單醣分子標記奈米脂質體不會對施用的動物產生有害副作用，同時能有效抑制腫瘤生長與癌細胞轉移，並且與臨床抗癌藥物/放射治療組 合投藥與患者時，能產生協同抑制腫瘤之功效，及防止癌幹細胞產生對抗癌藥物的抗性。

Claims (15)

  1. 一種單醣分子標記的奈米脂質體藥物遞送系統，至少包含：一與單醣分子共軛結合的膽固醇及一磷脂，其中該單醣為葡萄糖或葡萄糖胺。
  2. 如請求項1所述之單醣分子標記的奈米脂質體藥物遞送系統，其中該磷脂係選自二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、腦磷脂、腦苷脂、二醯基甘油和鞘磷脂、雙十六碳鏈磷酸鹽(DHDP)、磷脂肌醇(PI)、磷脂絲胺酸(PS)、二肉荳蔻醯基磷脂醯絲胺酸(DMPS)、二棕櫚醯基磷脂醯絲胺酸(DPPS)、磷酸醯甘油(PG)、二肉荳蔻醯基甘油(DMPG)、二油醯基磷脂醯甘油(DOPG)、二月桂基磷脂醯甘油(DLPG)、二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)、二硬脂醯磷脂甘油(DSPG)、磷脂酸(PA)、二肉荳蔻醯磷酸(DMPA)、二棕櫚醯磷酸(DPPA)、二磷脂醯甘油(DPG)或其混合物。
  3. 如請求項1所述之單醣分子標記的奈米脂質體藥物遞送系統，其中該奈米脂質體尺寸係介於120-140nm，且具有表面電荷介於-3至-15毫伏特。
  4. 如請求項1所述之單醣分子標記的奈米脂質體藥物遞送系統，其進一步包含一抗癌藥物於該脂質體之中空腔體。
  5. 如請求項4所述之奈米脂質體藥物遞送系統，其中該抗癌藥物係選自阿黴素(doxorubicin)、泛艾黴素(epirubicin)、博來霉素(Bleomycin)、絲裂黴素C(Mitomycin C)、5-氟尿嘧啶 (5-fluorouracil)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、喜樹鹼(Camptothecin)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、歐洲紫杉醇(Docetaxel)、吉西他濱(Gemcitabine)、Vinorelbine、愛萊諾迪肯(Irinotecan)、依託泊苷(Etoposide)、長春花鹼(Vinblastine)、培美曲塞(Pemetrexed)、羥基脲(Hydroxyurea)、氨甲蝶呤(Methotrexate)、卡培他濱(Capecitabine)、氟苷(Floxuridine)、卡巴他賽(Cabazitaxel)、米托蒽醌(Mitoxantrone)或雌莫司汀(estramustine)、薑黃素(Curcumin)、類喜樹鹼衍生物SN-38及其組合。
  6. 一種如請求項1所述之單醣分子標記的奈米脂質體藥物遞送系統的製備方法，其特徵在於其包含：合成一單醣-修飾之膽固醇，其中該單醣為葡萄糖或葡萄糖胺；將一磷脂、一視需要之膽固醇與該單醣-修飾之膽固醇混合成混合物，其混合比例為磷脂50-60mmole%、膽固醇20-48mmole%與單醣-修飾之膽固醇2-20mmole%；將該混合物藉由薄膜水合法、溶劑分散法、有機溶劑注射法、界面活性劑法、薄膜擠壓法或French-Press法製成具有單一脂雙層且大小一定的奈米微脂體。
  7. 一種標靶治療奈米藥物脂質體，其特徵在於包含：如請求項1或4述之單醣分子標記的奈米脂質體藥物遞送系統及一鑲嵌於該遞送系統中脂雙層的藥物。
  8. 如請求項7所述之標靶治療奈米藥物脂質體，其中該奈米脂質體尺寸係介於80-160nm，且具有表面電荷介於-10至-45毫伏特。
  9. 如請求項7所述之標靶治療奈米藥物脂質體，其中該藥物為神經醯胺。
  10. 一種如請求項7所述之標靶治療奈米藥物脂質體的製備方法，其特徵在於包含：合成一單醣-修飾之膽固醇，其中該單醣為葡萄糖或葡萄糖胺；將一磷脂、該單醣-修飾之膽固醇與一藥物混合，其混合比例為磷脂52-77mmole%、單醣-修飾之膽固醇17-23mmole%、神經醯胺6-25mmole%；將所成之該混合物藉由薄膜水合法、溶劑分散法、有機溶劑注射法、界面活性劑法、薄膜擠壓法或French-Press法製成具有單一脂雙層且大小一定的奈米微脂體。
  11. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1或4述之單醣分子標記的奈米脂質體藥物遞送系統或如請求項7述之標靶治療奈米藥物脂質體及一醫藥上可接受的基材、載體或賦形劑。
  12. 如請求項11所述之醫藥組成物，其中該基材係選自多醣、蛋白質、合成高分子或其混合物。
  13. 如請求項11所述之醫藥組成物，其中該抗癌藥物係選自阿黴素(doxorubicin)、泛艾黴素(epirubicin)、博來霉素(Bleomycin)、絲裂黴素C(Mitomycin C)、5-氟尿嘧啶 (5-fluorouracil)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、喜樹鹼(Camptothecin)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、歐洲紫杉醇(Docetaxel)、吉西他濱(Gemcitabine)、Vinorelbine、愛萊諾迪肯(Irinotecan)、依託泊苷(Etoposide)、長春花鹼(Vinblastine)、培美曲塞(Pemetrexed)、羥基脲(Hydroxyurea)、氨甲蝶呤(Methotrexate)、卡培他濱(Capecitabine)、氟苷(Floxuridine)、卡巴他賽(Cabazitaxel)、米托蒽醌(Mitoxantrone)或雌莫司汀(estramustine)、薑黃素(Curcumin)、類喜樹鹼衍生物SN-38及其組合。
  14. 如請求項11所述之醫藥組成物，其係用於癌症治療。
  15. 如請求項14所述之醫藥組成物，其中該癌症治療係選自癌幹細胞治療、抗藥性癌細胞治療、抗輻射性癌細胞治療或其組合。
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2012年7月10日， PNAS vol. 109 no. 28 11294–11299 ；Cholesterol-tethered platinum II-based supramolecular nanoparticle increases antitumor efficacy and reduces nephrotoxicity 2012年10月Pharmacological Reports 2012, 64, 1020.1037；Nanoparticles as drug delivery systems 2018年12月29日，Molecules 2019, 24, 116; doi:10.3390；Cholesterol-Based Compounds: Recent Advances in Synthesis and Applications 1982年9月，Proc. Nati Acad. Sci. USA Vol. 79, pp. 5490-5493；Stability of carbohydrate-modified vesicles in vivo: Comparative effects of' ceranide. and cholesterol glycoconjugates *
2018年12月29日，Molecules 2019, 24, 116; doi:10.3390；Cholesterol-Based Compounds: Recent Advances in Synthesis and Applications
2018年2月24日，Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2018, 120, 1700389，Novel Method for the Synthesis of Cholesteryl Glucosides starting from Disaccharides。
Carbohydrate ResearchVolume 465, 30 July 2018, Pages 52-57
Carbohydrate ResearchVolume 465, 30 July 2018, Pages 52-57 2018年2月24日，Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2018, 120, 1700389，Novel Method for the Synthesis of Cholesteryl Glucosides starting from Disaccharides *

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