CN112386709A - 一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统及其制备和应用 - Google Patents

一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统及其制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统及其制备和应用，所述递药系统包括脂质、载脂蛋白、载带药物和靶向多肽，所述靶向多肽由桥联结构将链接纳米载体端和激活巨胞饮功能的肽链共价连接形成。本发明递药系统通过多肽的修饰，主动靶向且能够有效调控多种肿瘤干细胞，利用该脂蛋白纳米递药体系通过自身增强的巨胞饮机制介导，使更多的脂蛋白纳米药物被肿瘤干细胞胞饮，以较低的给药剂量且安全有效的对肿瘤干细胞进行体内外靶向调控。该纳米递药系统可应用于多种肿瘤或中枢神经系统疾病的预防或治疗，制备流程简单且安全，具有较好的研究价值和临床应用前景。

Description

一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统及其制备和 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统及其制备和应用。
背景技术
肿瘤干细胞亚群造成残余肿瘤的复发、侵袭转移，手术无法完全切除且自身耐受放化疗。传统靶向肿瘤干细胞的方法包括靶向特异性受体、靶向特异信号通路、靶向特殊的微环境以及直接免疫治疗等，但都存在一定局限性，对其进行靶向递药面临较多的挑战，比如难以通过血脑屏障及血瘤屏障：生物屏障及复杂的肿瘤微环境使得绝大多数药物难以进入且有效分布于肿瘤内部；难以对复发肿瘤内的肿瘤干细胞亚群进行有效的富集和靶向；单一靶点的药物对高度异质性的具有复杂信号调控通路的肿瘤干细胞疗效局限，且目前大多数以单一的受体与配体结合模式进行靶向递送，对高度异质性的肿瘤内杀伤肿瘤干细胞的效果有限。理想的靶向治疗方式应需要满足多方面的需求，因此构建合适的纳米载体，不仅能克服屏障同时能够使肿瘤干细胞主动高效的靶向摄取载带多靶点调控药物的纳米载体，产生更高的富集浓度，并将药物释放，能够克服现有的瓶颈，为肿瘤的治疗提供新的策略。
肿瘤细胞重要的特征之一是能量代谢的改变，经典的Warburg效应提示肿瘤达到能量与物质合成的平衡与正常细胞所经历的途径不同。在多种肿瘤细胞中存在明显的蛋白质及糖类能量代谢的改变，在复发的肿瘤患者中甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸盐等代谢水平明显增强。这提示我们，与复发相关的肿瘤干细胞会获取更多的蛋白质以及糖类等营养产生特异性的能量代谢改变。因此通过代谢水平的差异进行靶向是一种良好的策略。而研究发现肿瘤干细胞可以通过巨胞饮这条与正常细胞具有明显差异的代谢通路对周围蛋白质相关的营养及药物进行主动的吞饮。
巨胞饮在胶质瘤细胞、胰腺癌细胞、肠癌细胞、巨噬细胞、树突状细胞等多种细胞中起到重要的非选择性摄取胞外溶液、蛋白等营养物质的作用。受多种与肌动蛋白、微丝重构、皱褶形成、囊泡形成相关的基因蛋白调控，主要包括Ras蛋白、Cdc42、Rac1、Src等。研究表明巨胞饮通路是肿瘤细胞如胰腺癌、胶质瘤、肺小细胞癌细胞重要的摄取蛋白质的通路。这些主要蛋白的上游又受多种膜表面受体的调控，大多属于细胞因子受体家族，主要包括表皮生长因子受体、白介素受体、粒细胞集落刺激因子受体等，因此在不同的细胞中激活其相关的表面受体即可通过不同调节通路、不同程度的引起激活巨胞饮的增强现象。
高密度脂蛋白是一种人体内天然的纳米颗粒，主要由磷脂、载脂蛋白、胆固醇和少量脂肪酸组成。作为天然纳米载体，其生物相容性好且稳定性优良，在递送成像试剂和治疗药物中发挥重要作用。然而体内药物的递送会遇到易降解、刺激炎症细胞因子分泌、细胞毒性、半衰期短、难以通过血脑屏障、脱靶效应等挑战，故而需要将药物通过纳米载体进行有效的靶向药物递送，同时可以高效负载相关药物。通过载药可以包载包括(DNA)、寡核苷酸(RNA)、microRNA、小干扰核苷酸(siRNA)以及小发夹RNA(shRNA)在内的基因药物以及小分子靶向药物、化疗药物等，针对肿瘤干细胞的复杂通路，可以选择具有多靶点调控能力的microRNA进行负载，同时调控多条通路从而抑制其自我更新的能力。对该载药的脂蛋白纳米载体进行靶向肽的修饰和进一步改造，即为本发明的纳米递送系统。
现有已公开的靶向肿瘤干细胞的纳米递送系统技术主要集中于单纯受体与配体的结合。如现有的公开技术包括CN201810317543采用外泌体膜包裹纳米载体利用其CD81、CD9膜蛋白产生肿瘤干细胞的靶向效果；CN201711273795、CN201710684008采用VAP肽与GRP78蛋白的高亲和活性效果产生肿瘤干细胞的靶向效果；CN201710471867利用靶向CD133的肽链(CX1X2X3X4X5X6X7X8LX9)修饰的纳米脂质体或胶束进行肿瘤干细胞的靶向；CN201710198933利用A15(RNA适配体)-聚乙二醇-十八醇嫁接物修饰的脂质纳米载体靶向CD133进行肿瘤干细胞的靶向；CN201610708677通过透明质酸修饰的四氧化三铁携带DAPT药物在外加磁场下增加对肿瘤干细胞的杀伤作用；通过包裹有肿瘤干细胞抗原Oct4(15肽)的靶向树突状细胞C-型凝集素受体的阳离子脂质体诱导特异性T细胞杀伤肿瘤干细胞；CN20141026081通过HCPB-1多肽修饰的磁性纳米载体靶向H460肺癌干细胞；
除此之外现有已公开的靶向肿瘤干细胞的纳米药物还有通过携带药物起到杀伤调控肿瘤干细胞的药效，包括CN107375213通过聚乙二醇-阿霉素和伊立替康产生一定的杀伤肿瘤干细胞的效果；CN201710097349通过碳纳米材料SWCNT抑制肿瘤干细胞的干性和分化；CN201610805898通过二茂铁基维甲酸/紫杉醇纳米载体共载microRNA抑制肿瘤干细胞；CN201510500260通过Angiopep-2修饰并包载盐霉素的脂蛋白纳米载体同时对肿瘤细胞、肿瘤干细胞及肿瘤新生血管进行多靶点杀伤。
发明内容
本发明的第一个目的在于，利用肿瘤干细胞可被激活的巨胞饮机制，提供靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统。
本发明的第二个目的在于，提供一种产生激活增强巨胞饮机制的修饰载药脂蛋白纳米递药系统的靶向多肽。
本发明的第三个目的在于，提供一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统的制备方法。
本发明的第四个目的在于，提供一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统在制备预防或治疗肿瘤或中枢神经系统疾病的药物中的应用。
为了实现上述第一个目的，本发明提供了一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统，其特征在于，所述递药系统包括脂质、载脂蛋白、载带药物和靶向多肽，所述靶向多肽由桥联结构将链接纳米载体端和激活巨胞饮功能的肽链共价连接形成，所述桥联结构包括Cys-Val、Cys-Phe、Cys-Leu、Cys-Ile、Cys-Gln、Leu-Glu、Gly-Ser-Gly、Ala-Pro-Ala、Cys-Pro-Cys、Gly-Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Val-Arg-Gly-Asp-Val、Pro-Ala-Pro-Ala-Pro、Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala、Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala、聚乙二醇中的一种或多种。
作为一个优选方案，所述靶向多肽的序列为FH27(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-RFFESH，SEQ ID NO.1)、FH29(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-KPVSLSYR，SEQ ID NO.2)以及FH38(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-KPVSLSYRAPARFFESH，SEQ ID NO.3)中的一种。
作为一个优选方案，所述脂质为蛋磷脂、豆磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂、鞘氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、胆固醇、胆固醇酯、甘油酯及其衍生物中的一种或多种。
作为一个优选方案，所述靶向多肽与脂质的摩尔比为1:10-1:300，优选1:100。
作为一个优选方案，所述载脂蛋白为ApoE，ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV，ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III中的一种或多种。
作为一个优选方案，所述载脂蛋白与靶向多肽的质量比为1:10-1:100，优选1:30。
作为一个优选方案，所述递药系统还包括固相内核，所述固相内核由药物分子、不溶性或难溶性无机盐构成，药物分子负载在固相内核中，所述不溶性或难溶性无机盐为可生物降解的磷酸钙沉淀、碳酸钙沉淀、硫酸钙沉淀、氟化钙沉淀、硅酸钙沉淀、海藻酸钙沉淀、硫酸镁沉淀、磷酸镁沉淀、碳酸镁沉淀、氟化镁沉淀、硅酸镁沉淀、硫酸钡沉淀、磷酸钡沉淀、碳酸钡沉淀、氟化钡沉淀、硅酸钡沉淀的一种或多种。
为了实现上述第二个目的，本发明提供了一种修饰载药脂蛋白纳米递药系统的靶向多肽，其特征在于，所述靶向多肽的序列为FH27(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-RFFESH)、FH29(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-KPVSLSYR)以及FH38(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-KPVSLSYRAPARFFESH)中的一种。
为了实现上述第三个目的，本发明提供了上述靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统的制备方法，包括如下步骤：
a)采用固相多肽合成法合成上述靶向多肽；
b)采用常规方法制备载药脂质纳米递药系统；
c)通过在上述b)制备的纳米递药系统溶液中先加入所述靶向多肽，再加入载脂蛋白，制备得到靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统。
为了实现上述第四个目的，本发明提供了靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统在制备预防或治疗肿瘤或中枢神经系统疾病的药物中的应用。
作为一个优选方案，所述肿瘤为脑胶质瘤和胰腺癌。
本发明的优点在于，靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统基于巨胞饮的原理，通过链接靶向肽，能够靶向在肿瘤干细胞表面高表达受体的同时又能够激活巨胞饮通路，形成利用代谢差异形成靶向富集的效果。利用肿瘤干细胞通过增强的巨胞饮通路主动摄取载药脂蛋白纳米载体，进一步携带药物，进行多通路的抑制，由此克服目前的多重阻碍，大大提高了对肿瘤干细胞的体内外靶向效率和调控能力。
附图说明
图1为透射电镜观察不含靶向肽以及含不同靶向肽(FH27、FH29、FH38)的载NC-microRNA药物的重组脂蛋白形态，标尺：50nm。
图2为人源胶质瘤干细胞样细胞(A)以及胰腺癌细胞系富集干细胞样细胞(B)对不含靶向多肽以及含不同靶向肽修饰的荧光标记载药脂蛋白纳米载体的细胞摄取情况，*p<0.05,**p<0.01，****p<0.0001表示存在显著性差异。
图3为在不含靶向多肽以及经不同靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体刺激下，人源胶质瘤干细胞样细胞对巨胞饮小泡特异性标记物Dextran的摄取、共定位以及加入EIPA巨胞饮抑制剂后的抑制摄取情况，*p<0.05,**p<0.01表示与不含靶向多肽的载药脂蛋白纳米载体组存在显著性差异。
图4为不同巨胞饮激活受体CXCR4表达水平下的人源胶质瘤干细胞样细胞(A)以及胰腺癌细胞系富集干细胞样细胞(B)对不含靶向多肽以及含不同靶向多肽修饰的荧光标记载药脂蛋白纳米载体的细胞摄取情况，*p<0.05,**p<0.01，****p<0.0001表示与CXCR4未敲低组相比，细胞摄取存在显著性差异。
图5为不含靶向多肽以及含不同靶向多肽修饰的荧光标记载药脂蛋白纳米载体与人源胶质瘤干细胞样细胞表面巨胞饮激活受体CXCR4的共定位情况(A)，巨胞饮激活受体CXCR4低表达时的共定位情况(B)，标尺：100μm。
图6为在NOD/SCID小鼠脑内注射人源胶质瘤干细胞样细胞(A)以及巨胞饮受体CXCR4低表达人源胶质瘤干细胞样细胞(B)，构建原位荷瘤小鼠模型，研究不同靶向多肽修饰的荧光标记载药脂蛋白纳米载体对原位荷瘤鼠血脑屏障的透过性，以不含靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体作为对照制剂，标尺：100μm。
图7为在NOD/SCID小鼠脑内注射人源胶质瘤干细胞样细胞以及巨胞饮受体CXCR4低表达人源胶质瘤干细胞样细胞，构建原位荷瘤小鼠模型，研究：(A)不同靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白载体与对人源胶质瘤干细胞样细胞靶向能力；(B)不同靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白载体在胶质瘤组织的分布与巨胞饮受体的表达水平的相关性，以不含靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体作为对照制剂，标尺：100μm。
图8为靶向多肽修饰的载miR-34a microRNA的脂蛋白纳米载体用于敲低人源胶质瘤干细胞样细胞干性相关SOX2蛋白表达(A)，抑制肿瘤细胞自我更新能力(B)。
图9为靶向多肽修饰的载miR-34a microRNA脂蛋白纳米载体与化疗药物替莫唑胺联合用药后，替莫唑胺IC50的测定。
图10为靶向多肽修饰的载miR-34a microRNA脂蛋白纳米载体用于抑制原位荷人源胶质瘤干细胞样细胞NOD/SCID鼠肿瘤细胞增殖(A)，延长小鼠生存期(B)。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。
实施例1.靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统的制备和表征
(1)制备
采用反相微乳法制备载药的磷酸钙固相内核。首先制备钙相，将300μL浓度为2.5M的CaCl2溶液与NC-miRNA共孵育，吹打数次，而后分散于20mL油相中形成分散均一的油包水反相微乳。磷相的制备为将300μL浓度为12.5mM Na2HPO4溶液分散于另一份20mL油相中，搅拌10min后，向磷相加入100μL浓度为20mg/mL的1,2-油酰磷脂酸(1,2-dioleoylphosphatidic acid，DOPA)溶液。待两相分散均匀后，将两相混合搅拌45min。此时，将40mL无水乙醇加入到上述混合微乳中破乳10min。破乳后的混合液通过高速离心(12,500g)约20min除去多余的表面活性剂及环己烷。在同样离心操作进行三次后，离心得到的沉淀即为载DOPA修饰的载药磷酸钙，将其分散于1mL氯仿中存放于玻璃瓶中用于后续实验。
采用薄膜水化法制备载药普通脂质体：称取脂质(2-10mg)置于500mL圆底烧瓶中，加入2mL乙醚，挥干除去磷脂中的水分，再加入上述制备的载药磷酸钙750μL及2mL氯仿溶液，置旋转蒸发仪上抽真空1h。加入4mL 0.01M PBS溶液(pH 7.4)，于40℃水浴间歇振摇10min至薄膜水化脱落得到脂质体。探头超声进一步减小脂质体粒径，得到含载药磷酸钙的普通脂质体(CaP-LNC)。
采用固相多肽合成法，合成靶向多肽FH27(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-RFFESH)、FH29(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-KPVSLSYR)以及FH38(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-KPVSLSYRAPARFFESH)。也可将桥联结构替换为Cys-Val、Cys-Phe、Cys-Leu、Cys-Ile、Cys-Gln、Leu-Glu、Gly-Ser-Gly、Ala-Pro-Ala、Cys-Pro-Cys、Gly-Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Val-Arg-Gly-Asp-Val、Pro-Ala-Pro-Ala-Pro、Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala、Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala、聚乙二醇中的一种或多种。
具体方法：在氯甲基聚苯乙烯树脂上接入氨基酸，在三氟乙酸的保护下脱氨基保护基团。而后通过氟化氢进行切割，乙醚冰浴沉淀，乙腈溶解后旋蒸，并采用乙腈水体系进一步纯化。将制得靶向多肽按照与磷脂的摩尔比1：30-1:100加入普通脂质体中，120rpm，37℃孵育24小时，而后将ApoE或ApoA-I等载脂蛋白(0.1-10mg)加入到上述溶液中(脂质总质量4mg)，轻轻混匀，置于震荡摇床于120rpm，37℃孵育24h，得到靶向多肽修饰的载NC-miRNA药物的脂蛋白纳米载体。同时作为一种优选方案的对照，靶向肽与载脂蛋白共同加入普通脂质体中孵育48小时。
(2)表征
靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体磷钨酸负染，透射电镜观察形态。激光粒度仪测定其粒径和表面电位，与未孵育靶向肽和ApoE的含磷酸钙载药普通脂质体比较。如图1，在电镜下含载药磷酸钙的重组脂蛋白呈均一的球形，分散均匀，粒径大小在30nm-50nm左右，链接FH38靶向肽的纳米载体粒径相对较大，通过激光粒度仪测定其表面电位约为-25mV左右。
实施例2.多种肿瘤干细胞高效摄取靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体(1)制备
同实施例1采用反相微乳法制备载药磷酸钙，后续采用薄膜水化法制备载药的普通脂质体，称取磷脂酰胆碱、磷脂酸(2-10mg)和荧光染料DiI(20-100μg)放入500ml圆底烧瓶中，同实施例1制备荧光标记的普通脂质体，将靶向多肽按照与磷脂的摩尔比1:100加入普通脂质体中，120rpm，37℃孵育24小时，而后将ApoE或ApoA-I等载脂蛋白(0.5-10mg)加入到上述溶液中(脂质总质量4mg)，轻轻混匀，置于震荡摇床于120rpm，37℃孵育24h，得到靶向多肽修饰的荧光标记载药脂蛋白纳米载体。
(2)将人源胶质瘤干细胞样细胞、胰腺癌细胞系富集干细胞样细胞以100个球接种于24孔板，5％二氧化碳培养箱培养过夜后，加入载荧光探针DiI的含靶向肽修饰的纳米载体和不含靶向肽修饰的纳米载体的DMEM溶液，DMPC浓度为20μg/ml，孵育4小时，PBS清洗一次后，轻柔吹打50次，将肿瘤球吹散后，过100μm孔径的细胞筛，而后采用多聚甲醛固定。将细胞悬液经过流式细胞仪检测其摄取制剂的荧光强度。
结果如图2A所示，在人源胶质瘤干细胞样细胞中，含FH38靶向肽的载药脂蛋白纳米载体的摄取效率是不含靶向肽脂蛋白纳米制剂的3.0倍，含FH29靶向肽的载药脂蛋白纳米载体的摄取效率是不含靶向肽脂蛋白纳米制剂的1.7倍，而含FH27靶向肽的载药脂蛋白纳米载体的摄取效率是不含靶向肽脂蛋白纳米制剂的1.1倍。且该摄取与载脂蛋白密切相关，无载脂蛋白单纯孵育靶向肽无明显增强效果。同样在人胰腺癌细胞系富集干细胞样细胞模型中，如图2B所示，含FH38靶向肽的载药脂蛋白纳米载体的摄取效率是不含靶向肽脂蛋白纳米制剂的1.5-1.8倍，表明靶向多肽修饰的载荧光的载药脂蛋白纳米载体在多种肿瘤模型中均具有增强摄取的效果。作为一种优选方案的对比，共同孵育靶向肽的摄取效率要低于先孵育靶向肽后孵育载脂蛋白的效率。
实施例3.靶向肽修饰的载药脂蛋白纳米载体通过增强巨胞饮提高肿瘤干细胞的摄取效率
(1)制备
采用薄膜水化法制备载药的普通脂质体，称取磷脂酰胆碱、磷脂酸(2-10mg)放入500ml圆底烧瓶中，同实施例1制备普通脂质体，将靶向肽按照与磷脂的摩尔比1:100加入普通脂质体中，120rpm，37℃孵育24小时，而后将ApoE或ApoA-I等载脂蛋白(0.5-10mg)加入到上述溶液中(脂质总质量4mg)，轻轻混匀，置于震荡摇床于120rpm，37℃孵育24h，得到靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体。
(2)将肿瘤干细胞以100个球接种于24孔板，5％二氧化碳培养箱培养过夜后，加入含靶向肽修饰的纳米载体和不含靶向肽修饰的纳米载体的DMEM溶液，DMPC浓度为20μg/ml，孵育2.5小时，而后加入巨胞饮通路标记物FITC-Dextran(1mg/ml)，再共孵育1.5小时，弃去培养液后PBS清洗一次，轻柔吹打50次，将肿瘤球吹散后，过100μm孔径的细胞筛，而后采用多聚甲醛固定。将细胞悬液经过流式细胞仪检测其FITC-Dextran的荧光强度。进一步通过巨胞饮抑制剂EIPA 150μM处理1.5小时后采用激光共聚焦显微镜观察制剂与Dextran的摄取和共定位情况。
结果如图3所示，在人源胶质瘤干细胞样细胞中，含FH38靶向肽的载药脂蛋白纳米载体的能够增强巨胞饮小泡特异性标记物Dextran的摄取量1.3倍，表明该增强机制与巨胞饮通路密切相关。可观察到制剂与dextran高度共定位，且EIPA能够有效抑制制剂和dextran的摄取。
实施例4.不同巨胞饮激活受体(CXCR4)表达水平的多肿瘤干细胞对靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体摄取情况对比。
(1)制备
称取磷脂酰胆碱、磷脂酸(2-10mg)和荧光染料DiI(20-100μg)放入500ml圆底烧瓶中，同实施例1制备荧光标记的普通脂质体，将靶向肽按照与磷脂的摩尔比1:100加入普通脂质体中，120rpm，37℃孵育24小时，而后将ApoE或ApoA-I等载脂蛋白(0.5-10mg)加入到上述溶液中(脂质总质量4mg)，轻轻混匀，置于震荡摇床于120rpm，37℃孵育24h，得到靶向多肽修饰荧光标记载药脂蛋白纳米载体。
(2)靶向多肽修饰的载药的脂蛋白纳米载体增强肿瘤干细胞的摄取与细胞巨胞饮受体表达水平相关
将人源胶质瘤干细胞样细胞、胰腺癌细胞系富集干细胞样细胞以105个细胞密度接种于12孔板，培养过夜后，加入CXCR4 shRNA慢病毒载体系统转染细胞(10μl/ml)，阴性NCshRNA慢病毒载体系统作为对照。转染18h后，吸除含慢病毒的培养基，离心换为新鲜培养基。继续培养3天后，向培养基中加入2μg/ml的嘌呤霉素杀死未转染成功的细胞。
将巨胞饮受体敲低的人源胶质瘤干细胞样细胞、胰腺癌细胞系富集干细胞样细胞和对照组以100个球接种于24孔板，5％二氧化碳培养箱培养过夜后，加入载荧光探针DiI的含靶向肽修饰的纳米载体和不含靶向肽修饰的纳米载体的DMEM溶液，DMPC浓度为20μg/ml，孵育4小时，PBS清洗一次后，轻柔吹打50次，将肿瘤球吹散后，过100μm孔径的细胞筛，而后采用多聚甲醛固定。将细胞悬液经过流式细胞仪检测其摄取制剂的荧光强度。
结果如图4所示，当CXCR4表达水平降低时，人源胶质瘤干细胞样细胞以及胰腺癌细胞系富集干细胞样细胞对含靶向肽修饰的纳米载体的摄取显著减少，表明了巨胞饮激活受体(CXCR4)高表达的肿瘤干细胞更容易摄取靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体。
实施例5.靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体通过巨胞饮激活受体(CXCR4)靶向摄取的评价
(1)制备
制备方法同实施例4，制得不含靶向多肽以及含不同靶向多肽修饰的荧光标记载药脂蛋白纳米载体，分别命名为DiI-CaP-rHDL,FH27-DiI-CaP-rHDL,FH29-DiI-CaP-rHDL和FH38-DiI-CaP-rHDL。
(2)靶向多肽修饰的荧光标记载药脂蛋白纳米载体通过肿瘤干细胞巨胞饮受体靶向摄取。
将巨胞饮受体敲低与不敲低的人源胶质瘤干细胞样细胞以100个球接种于24孔板，5％二氧化碳培养箱培养过夜后，加入载荧光探针DiI的含靶向肽修饰的纳米载体和不含靶向肽修饰的纳米载体的DMEM溶液，DMPC浓度为20μg/ml，孵育3.5小时。PBS洗一遍后，4％多聚甲醛室温固定15min，0.1％Triton-X通透20min，PBS洗一遍，加入4％BSA封闭40min。与细胞干性相关抗体SOX2在4℃孵育过夜，再与Alexa
Figure BDA0002169010760000101
488标记的荧光二抗孵育，PBS洗涤后用100ng/mL DAPI染色10min，加入抗荧光猝灭封片剂滴入玻璃底小皿中，荧光共聚焦显微镜观察。
结果如图5A所示，相比不含靶向多肽的制剂DiI-CaP-rHDL，靶向多肽修饰的荧光标记载药脂蛋白纳米载体在人源胶质瘤干细胞样细胞内部大量积聚且与细胞表面巨胞饮受体CXCR4存在共定位；如图5B所示，当巨胞饮受体CXCR4敲低后，人源胶质瘤干细胞样细胞对制剂的摄取减少，表明靶向多肽修饰的荧光标记载药脂蛋白纳米载体通过肿瘤干细胞巨胞饮受体靶向摄取。
实施例6.不同靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体对于血脑屏障透过性的评价
(1)制备
同实施例1采用反相微乳法制备载Cy5标记的无作用阴性对照microRNA磷酸钙载药的重组脂蛋白(Cy5-CaP-rHDL)。将靶向肽按照与磷脂的摩尔比1:100加入普通脂质体中，120rpm，37℃孵育24小时，而后将ApoE或ApoA-I等载脂蛋白(0.5-10mg)加入到上述溶液中(脂质总质量4mg)，轻轻混匀，置于震荡摇床于120rpm，37℃孵育24h，得到靶向多肽修饰的载Cy5荧光标记的载药脂蛋白纳米载体。
(2)采用NOD/SCID小鼠脑定位注射巨胞饮受体未敲低以及敲低后的人源胶质瘤干细胞样细胞，构建原位荷胶质瘤小鼠模型，评价靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体对于荷瘤小鼠血脑屏障的透过性以及与细胞巨胞饮受体表达水平的相关性
用截留分子量3kD的超滤离心管浓缩Cy5标记、靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白和不经靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白溶液，按miRNA 0.36mg/kg的剂量给药。荷瘤小鼠造模7天后，尾静脉给予载Cy5标记的靶向多肽修饰及无靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白制剂溶液。给药4h后，用5％水合氯醛麻醉并固定小鼠，剪开胸腔，充分暴露心脏，将头皮针头刺入左心室，剪开右心耳，立即用0.9％的生理盐水灌流至流出的灌流液无血色，然后以4％多聚甲醛溶液灌流固定，直至肝脏、四肢、尾变硬，取出心、肝、脾、肺、肾和脑(肿瘤)组织，生理盐水冲洗后置于小动物活体成像仪采集图像。实验结果如图6A所示，在巨胞饮受体CXCR4未敲低的荷瘤小鼠中，含FH38靶向肽的载药脂蛋白纳米载体给药组(FH38-Cy5-CaP-rHDL)小鼠脑部荧光强度高于其他组，表明相对于不含靶向多肽修饰的载体，含靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体可以高效透过血脑屏障分布于肿瘤部位。实验结果如图6B所示，在巨胞饮受体CXCR4敲低的荷瘤小鼠中，FH38-Cy5-CaP-rHDL处理组的小鼠脑部荧光强度显著低于不含靶向多肽的载药脂蛋白纳米载体对照组(Cy5-CaP-rHDL)，表明载体的这种靶向能力与细胞巨胞饮受体表达水平相关，巨胞饮受体表达水平越高，载体靶向能力越强。
实施例7.建立荷人源胶质瘤干细胞样细胞原位胶质瘤NOD/SCID小鼠模型，评价不同靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白的肿瘤靶向能力
(1)制备
同实施例6制备得到不同靶向多肽修饰的载Cy5荧光标记的载药脂蛋白纳米载体，以不含靶向多肽修饰的载Cy5荧光标记的载药脂蛋白纳米载体(Cy5-CaP-rHDL)为对照。
(2)采用NOD/SCID小鼠脑定位注射人源胶质瘤干细胞样细胞，构建原位荷胶质瘤小鼠模型，评价靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体的体内肿瘤靶向能力。
通过流式细胞术，评价靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白在原位脑肿瘤小鼠肿瘤组织中的摄取情况。通过尾静脉给予荷瘤鼠浓缩后的载Cy5标记、不同靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白(Cy5-FH27-CaP-rHDL、Cy5-FH29-CaP-rHDL以及Cy5-FH38-CaP-rHDL)和不经靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白(Cy5-CaP-rHDL)溶液。给药4h后，麻醉固定小鼠，心脏灌流后取出脑(肿瘤)组织。修剪肿瘤部位并用HBSS液冲洗后，用刀片将肿瘤组织切成匀浆状，移至培养皿中，加入含5ml 0.05％EDTA-胰酶、2.5ml HBSS液、2.5ml四型胶原酶(2000U/ml)的复合消化酶液中，置于37℃培养箱中消化15-20min。然后用含等效胰酶抑制剂及DNA酶的终止消化液10ml终止消化，反复剥离消化4次，收集细胞混悬液，用75μm滤网过滤，1000rpm离心20min。收集细胞于1.5ml离心管中，4％多聚甲醛室温固定20min，震摇，800rpm离心后加入100μl 0.1％Triton-X，通透20min。PBS小心洗一次，加入100μl 4％BSA封闭40min。与细胞干性相关抗体SOX2在4℃孵育过夜，再与Alexa
Figure BDA0002169010760000121
488标记的荧光二抗孵育，PBS洗一次后将细胞悬液经过流式细胞仪检测SOX2阳性的人源胶质瘤干细胞样细胞中Cy5标记的载药重组脂蛋白的荧光强度。实验结果如图7A所示，SOX2阳性人源胶质瘤干细胞样细胞中，对Cy5-FH38-CaP-rHDL的摄取量是未经靶向多肽修饰Cy5-CaP-rHDL摄取量的10.6倍，表明靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白载体具有良好的人源胶质瘤干细胞样细胞靶向性。
为了从脑切片水平评价靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白在原位脑肿瘤小鼠脑内的分布情况，通过尾静脉分别注射载Cy5标记、靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白(Cy5-FH27-CaP-rHDL、Cy5-FH29-CaP-rHDL以及Cy5-FH38-CaP-rHDL)和不经靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白(Cy5-CaP-rHDL)溶液至荷瘤鼠体内。给药4h后，麻醉固定小鼠，心脏灌流，取荷瘤小鼠完整的大脑，置4％多聚甲醛中后固定24h，PBS漂洗后依次置于15％和30％蔗糖溶液中脱水至下沉，然后用O.C.T.包埋并–20℃冷冻，作连续冰冻冠状切片，片厚为14μm。PBS漂洗后,脑切片用4％BSA常温封闭1h，与细胞干性抗体SOX2在4℃孵育一夜后，再与Alexa
Figure BDA0002169010760000131
488标记的荧光二抗孵育。PBS漂洗后用100ng/mL DAPI染色10min，PBS漂洗，拭去水渍，加入抗荧光猝灭剂封片，激光共聚焦显微镜观察。实验结果如图7B所示，相比于不经靶向多肽修饰的对照组(Cy5-CaP-rHDL)，靶向多肽修饰后的载体在胶质瘤部位有更多的蓄积，且肿瘤组织深处的荧光强度明显增强；然而在巨胞饮受体敲低的小鼠脑胶质瘤组织切片中，靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白载体在肿瘤部位的荧光强度显著减弱，表明靶向多肽修饰的载药重组脂蛋白载体具有优良的肿瘤靶向性，可在肿瘤组织内部广泛分布，且这种靶向性与巨胞饮受体的表达水平相关。
实施例8.靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体的体外药效评价
(1)制备
通过反向微乳法制备固相内核，将300-600μL浓度为2.5M的CaCl2溶液与miR-34a共孵育，吹打数次，而后分散于20mL油相中形成分散均一的油包水反相微乳。磷相的制备为将300-600μL浓度为12.5mM Na2HPO4溶液分散于另一份20mL油相中，搅拌10min后，向磷相加入100μL浓度为20mg/mL的1,2-油酰磷脂酸溶液。待两相分散均匀后，将两相混合搅拌45min。此时，将40mL无水乙醇加入到上述混合微乳中破乳10min。破乳后的混合液通过高速离心(12,500g)约20min除去多余的表面活性剂及环己烷。进一步通过薄膜水化法将固相内核与磷脂制备载miR-34a microRNA或者无干扰作用的NC microRNA的重组脂蛋白(miR-34a-CaP-rHDL、NC-CaP-rHDL)，并分别与靶向多肽进行孵育，以无靶向多肽修饰的重组脂蛋白纳米载体为对照。
(2)靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体对人源胶质瘤干细胞样细胞SOX2蛋白表达的敲低作用及抑制自我更新能力的评价
将对数生长期人源胶质瘤干细胞样细胞按每孔5×104的密度接种于6孔板中，培养12小时后，待细胞汇合度达到50％时进行药物处理。不同的复孔分别给予不同的纳米制剂，包括DMEM对照组、空载重组脂蛋白(CaP-rHDL)、载无干扰作用的NC miRNA且不同靶向多肽修饰的重组脂蛋白(NC-CaP-rHDL、FH27-NC-CaP-rHDL、FH29-NC-CaP-rHDL及FH38-NC-CaP-rHDL)、载miR-34a且不同靶向多肽修饰的重组脂蛋白(miR-34a-CaP-rHDL、FH27-miR-34a-CaP-rHDL、FH29-miR-34a-CaP-rHDL及FH38-miR-34a-CaP-rHDL)给药组，按100nMmiRNA浓度给药，37℃分别孵育12,24,48h后，细胞裂解收样，按照WB操作步骤进行实验，检测各组制剂处理后的胶质瘤细胞的SOX2蛋白表达水平。实验结果如图8A所示，孵育12h后，与无靶向多肽修饰的制剂处理组相比，经FH38靶向肽与FH27靶向肽修饰的制剂处理的细胞，其SOX2的蛋白表达水平减低了30-40％，表明miR-34a被有效释放出来抑制了肿瘤干性细胞的增值。孵育24h后，靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体处理组细胞的SOX2蛋白表达水平均显著低于无靶向多肽修饰的处理组；孵育48h后，所有载有miR-34a的脂蛋白纳米载体处理后的人源胶质瘤干细胞样细胞中SOX2蛋白水平均下降了50-60％，表明与无修饰的制剂(miR-34a-CaP-rHDL)相比，靶向多肽修饰后的载药脂蛋白纳米载体可以更高效快速地释放药物，有效抑制肿瘤干性细胞的增值。
将对数生长期的人源胶质瘤干细胞样细胞以及胰腺癌细胞系富集干细胞样细胞按每孔5×104的密度接种于6孔板中，培养12小时后，待细胞汇合度达到50％时进行药物处理。不同的复孔分别给予不同的纳米制剂，包括DMEM对照组和不同靶向多肽修饰的载miR-34a重组脂蛋白(miR-34a-CaP-rHDL)给药组。分别按5,50,100nM miRNA浓度给药，37℃孵育48h。更换成完全培养液后继续培养，72h后弃培养液，用PBS洗涤1遍，加入适量4％多聚甲醛固定细胞，然后用0.5％结晶紫溶液染色3min,水洗至背景清晰后拍照观察并统计细胞克隆数。实验结果如图8B所示，与无靶向多肽修饰的miR-34a-CaP-rHDL处理组相比，FH38靶向肽修饰的miR-34a-CaP-rHDL处理组形成的细胞克隆数更少且形态更小，表明靶向多肽修饰后的载药脂蛋白纳米载体可以有效递送至肿瘤干性细胞，从而影响肿瘤干性细胞的自我更新能力。
实施例9.靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体与化疗药物联合用药的体外药效评价
(1)制备
同实施例8制备载miR-34a microRNA重组脂蛋白(miR-34a-CaP-rHDL)，并与不同靶向多肽进行孵育。
(2)靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体与化疗药物替莫唑胺联合用药，抑制人源胶质瘤干细胞样细胞增殖能力的评价。通过CCK-8考察不同浓度的(5μM,20μM,50μM,100μM和200μM)替莫唑胺联合靶向多肽修饰后的载MiR34a(50nM)药物的脂蛋白纳米载体对其测定抑制细胞活力的效果。通过在37℃药物处理24小时后，加入10μl CCK-8，450nm波长酶标仪读值。
实验结果如图9所示，靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体(FH38-MiR34a-CaP-rHDL)与化疗药物替莫唑胺(TMZ)联合使用后，与单独TMZ处理组相比，可以显著降低替莫唑胺的使用量(TMZ IC50＝15μM)，表明在低剂量联合用药时可以有效促进肿瘤细胞凋亡并减少耐药等不良反应。
实施例10.靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米载体的体内药效评价
(1)制备
同实施例8制备载miR-34a microRNA的脂蛋白纳米载体，并与FH38靶向多肽进行孵育，命名为FH38-miR-34a-CaP-rHDL，无靶向多肽修饰的制剂命名为miR-34a-CaP-rHDL。
(2)靶向多肽修饰的载miR-34a的脂蛋白纳米载体与化疗药物替莫唑胺联合治疗，能够在体内促进人源胶质瘤干细胞样细胞凋亡并延长原位荷脑胶质瘤小鼠生存期。
将54只荷人源胶质瘤干细胞样细胞原位胶质瘤的NOD/SCID鼠随机分为6组，分别为生理盐水、替莫唑胺(TMZ)、载miR-34a的脂蛋白纳米载体(miR-34a-CaP-rHDL)、靶向多肽修饰的载miR-34a的脂蛋白纳米载体(FH38-miR-34a-CaP-rHDL)、TMZ与miR-34a-CaP-rHDL联合给药组、TMZ与FH38-miR-34a-CaP-rHDL联合给药组。于人源胶质瘤干细胞样细胞接种后第7、10、13、16和19天尾静脉注射制剂，灌胃给予替莫唑胺(miRNA给药量：0.36mg/kg，TMZ给药量：100mg/m2)。记录各组荷瘤小鼠死亡时间，绘制生存曲线。
将上述六组小鼠每组随机取3只小鼠，在造模后的第6、13、20天分别对荷瘤鼠脑部进行MRI成像，观察肿瘤增长情况。实验结果如图10A所示，相比生理盐水和单纯TMZ给药组，其他四组荷瘤鼠脑部肿瘤体积增长缓慢，表明载miR-34a的脂蛋白纳米载体有效抑制了肿瘤细胞的增殖。
将42只荷BxPC3胰腺癌干细胞样细胞的裸鼠随机分为6组，分别为生理盐水、吉西他滨(GEM)、载miR-34a的脂蛋白纳米载体(miR-34a-CaP-rHDL)、靶向多肽修饰的载miR-34a的脂蛋白纳米载体(FH38-miR-34a-CaP-rHDL)、GEM与miR-34a-CaP-rHDL联合给药组、GEM与FH38-miR-34a-CaP-rHDL联合给药组。于BxPC3胰腺癌干细胞样细胞接种后第7、10、13、16和19天尾静脉注射制剂，尾静脉给予GEM和miRNA药物(miRNA给药量：0.36mg/kg，GEM给药量：10mg/kg)。记录各组荷瘤小鼠死亡时间，绘制生存曲线。
荷瘤鼠的生存时间考察结果显示如图10B所示，替莫唑胺与靶向多肽修饰的载miR-34a的脂蛋白纳米载体联合给药组(TMZ+FH38-miR-34a-CaP-rHDL)小鼠的平均生存时间为59天，显著高于Saline组(21天)、单纯替莫唑胺给药组(24天)、单纯无靶向多肽修饰的载miR-34a的脂蛋白纳米载体组(28天)、单纯靶向多肽修饰的载miR-34a脂蛋白纳米载体组(33天)以及替莫唑胺与无靶向多肽修饰的载miR-34a脂蛋白纳米载体联合给药组(30天)，而且在接种肿瘤后的100天，TMZ与FH38-miR-34a-CaP-rHDL联合给药组仍有2只小鼠未死亡(22％存活率)。以上实验结果提示，靶向多肽修饰的载miR-34a的脂蛋白纳米载体具有优良的抗脑胶质瘤效果，并可显著增强现有化疗药物的效果。
在荷胰腺癌干细胞样细胞模型中，吉西他滨与靶向多肽修饰的载miR-34a的脂蛋白纳米载体联合给药组(TMZ+FH38-miR-34a-CaP-rHDL)小鼠的平均生存时间为96天，显著高于Saline组(29天)、单纯吉西他滨给药组(35天)、单纯无靶向多肽修饰的载miR-34a脂蛋白纳米载体组(66天)、单纯靶向多肽修饰的载miR-34a脂蛋白纳米载体组(68天)以及替莫唑胺与无靶向多肽修饰的载miR-34a脂蛋白纳米载体联合给药组(69天)，以上实验结果提示，靶向多肽修饰的载miR-34a脂蛋白纳米载体具有优良的抗胰腺癌的效果，并同样可显著增强现有化疗药物的效果，显示该药物可以用于多肿瘤模型，具有较好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海交通大学医学院
<120> 一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统及其制备和应用
<130> /
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 29
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Cys Phe Ala Glu Lys Phe Lys Glu Ala Val Lys Asp Tyr Phe Ala
1 5 10 15
Lys Phe Trp Asp Gly Ser Gly Arg Phe Phe Glu Ser His
20 25
<210> 2
<211> 31
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Cys Phe Ala Glu Lys Phe Lys Glu Ala Val Lys Asp Tyr Phe Ala
1 5 10 15
Lys Phe Trp Asp Gly Ser Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg
20 25 30
<210> 3
<211> 40
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ala Cys Phe Ala Glu Lys Phe Lys Glu Ala Val Lys Asp Tyr Phe Ala
1 5 10 15
Lys Phe Trp Asp Gly Ser Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Ala
20 25 30
Pro Ala Arg Phe Phe Glu Ser His
35 40

Claims (11)

1.一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统，其特征在于，所述递药系统包括脂质、载脂蛋白、载带药物和靶向多肽，所述靶向多肽由桥联结构将链接纳米载体端和激活巨胞饮功能的肽链共价连接形成，所述桥联结构包括Cys-Val、Cys-Phe、Cys-Leu、Cys-Ile、Cys-Gln、Leu-Glu、Gly-Ser-Gly、Ala-Pro-Ala、Cys-Pro-Cys、Gly-Phe-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Ala-Leu-Ala-Leu、Gly-Phe-Leu-Gly、Gly-Gly-Gly-Gly-Ser、Val-Arg-Gly-Asp-Val、Pro-Ala-Pro-Ala-Pro、Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala、Arg-Val-Leu-Ala-Glu-Ala、聚乙二醇中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统，其特征在于，所述靶向多肽的序列为FH27(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-RFFESH)、FH29(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-KPVSLSYR)以及FH38(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-KPVSLSYRAPARFFESH)中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统，其特征在于，所述脂质为蛋磷脂、豆磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂、鞘氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、胆固醇、胆固醇酯、甘油酯及其衍生物中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统，其特征在于，所述靶向多肽与脂质的摩尔比为1:10-1:300。
5.根据权利要求1所述的一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统，其特征在于，所述载脂蛋白为ApoE，ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV，ApoC-I、ApoC-II、ApoC-III中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统，其特征在于，所述载脂蛋白与靶向多肽的质量比为1:10-1:100。
7.根据权利要求1所述的一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统，其特征在于，所述递药系统还包括固相内核，所述固相内核由药物分子、不溶性或难溶性无机盐构成，药物分子负载在固相内核中，所述不溶性或难溶性无机盐为可生物降解的磷酸钙沉淀、碳酸钙沉淀、硫酸钙沉淀、氟化钙沉淀、硅酸钙沉淀、海藻酸钙沉淀、硫酸镁沉淀、磷酸镁沉淀、碳酸镁沉淀、氟化镁沉淀、硅酸镁沉淀、硫酸钡沉淀、磷酸钡沉淀、碳酸钡沉淀、氟化钡沉淀、硅酸钡沉淀的一种或多种。
8.一种修饰载药脂蛋白纳米递药系统的靶向多肽，其特征在于，所述靶向多肽的序列为FH27(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-RFFESH)、FH29(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-KPVSLSYR)以及FH38(AC-FAEKFKEAVKDYFAKFWD-GSG-KPVSLSYRAPARFFESH)中的一种。
9.权利要求1所述一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统的制备方法，包括如下步骤：
a)采用固相多肽合成法合成权利要求1或2所述靶向多肽；
b)采用常规方法制备载药脂质纳米递药系统；
c)通过在上述b)制备的纳米递药系统溶液中先加入所述靶向多肽，再加入载脂蛋白，制备得到靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统。
10.权利要求1所述的一种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统在制备预防或治疗肿瘤或中枢神经系统疾病的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的种靶向多肽修饰的载药脂蛋白纳米递药系统在制备预防或治疗肿瘤或中枢神经系统疾病的药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为脑胶质瘤和胰腺癌。
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