CN100431609C - 注射用的整合素配体修饰的载抗癌药的长循环脂质体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种注射用的整合素配体修饰的载抗癌药的长循环脂质体，特别涉及一种供注射用的载抗癌药物的靶向性脂质体给药系统，该系统是将脂质体的表面同时用聚乙二醇(PEG)和含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD)或RGD类似物的整合素配体进行修饰得到的一种高效脂质体给药系统。

Description

注射用的整合素配体修饰的载抗癌药的长循环脂质体

技术领域

本发明涉及药物制剂技术领域，特别涉及一种供注射用的载抗癌药物的靶向性脂质体给药系统，该系统是将脂质体的表面同时用聚乙二醇(PEG)和含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(RGD)或RGD类似物的整合素配体进行修饰得到的一种高效脂质体给药系统。

背景技术

恶性肿瘤一直是困扰人类的重要疾病，目前尚无治愈癌症的方法。对于恶性实体瘤的传统疗法为手术切除肿瘤后再用抗肿瘤药物进行化疗。大部分的化疗药物没有选择性，这些药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常的细胞产生杀伤作用，因此会产生严重的副作用，如阿霉素的心脏毒性作用等。将抗肿瘤药物用脂质体进行包载后可以明显延长其在体内循环的时间，有利于抗肿瘤药物向肿瘤区蓄积，从而增加了抗癌药物的治疗指数，即增加疗效，减少了毒副作用。目前已有阿霉素脂质体、柔红霉素脂质体、紫杉醇脂质体等产品上市。

普通脂质体虽然能够改善抗癌药物的疗效，但由于其易被肝脏、脾脏内的巨噬细胞摄取而迅速消除，药物在体内滞留时间短。普通脂质体的表面进一步用亲水性的聚乙二醇(PEG)进行修饰，可制成长循环脂质体。长循环脂质体能够逃避血浆中的调理素的调理从而避免了被巨噬细胞摄取(故也称为隐性脂质体)，显著延长了其在循环系统中的滞留时间，血药浓度也明显提高。长循环脂质体经增强滞留和渗透作用(EPR)可增加被包载药物向肿瘤组织内的蓄积，从而提高了抗癌药物传递的靶向性。目前已有阿霉素隐性脂质体上市(

)。

长循环脂质体能够延长药物在体内的循环时间，增强抗肿瘤药物向肿瘤内的蓄积，但并不意味着一定能够提高抗肿瘤药物的疗效。其原因之一在于大部分抗肿瘤药物的靶点中位于细胞核内的DNA，药物必须克服细胞膜这一屏障进入到细胞内才能发挥作用。脂质体包封的药物进入细胞内主要有三种途径，即扩散，膜融合以及被肿瘤细胞吞噬。如果包封在脂质体双分子膜内的药物不能够释放到细胞间质中，那么通过扩散途径进入肿瘤细胞内的药物会受到限制。由于大部分的脂质体材料不能与细胞膜进行融合，故经膜融合方式进入到细胞内的药物也有限。许多试验证明，普通的隐性脂质体不能经细胞吞噬作用进入到肿瘤细胞，所以长循环脂质体尽管能够增加肿瘤组织中的浓度，但疗效却不一定有所增加。由于通过增加扩散和膜融合的方式来增加抗肿瘤药物向细胞内的转运有很多局限性，用配体修饰长循环脂质体就成为提高抗癌药物靶向性的重要手段。国外有学者用叶酸，转铁蛋白以及单克隆抗体来修饰隐性脂质体用以增加药物传递的靶向性，动物试验证明能够显著提高抗癌药物的疗，但目前尚无这类产品上市。

有报道用含RGD的环状多肽修饰长循环脂质体作为抗癌药物的载体，RGD是由三种氨基酸(精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸按此顺序排列)组成的三肽。已证明此种环RGD肽的靶点在于肿瘤新生血管而非肿瘤细胞。其原理在于RGD环肽能够特异性地与肿瘤新生血管所表达的整合素αvβ3结合，通过破坏肿瘤的新生血管来切断肿瘤的营养和氧气的供应从而发挥抗肿瘤作用。本发明所用的多肽片段为含RGD序列的线性多肽，其靶点在于肿瘤细胞本身，能够被肿瘤细胞表面的整合素识别，介导与肿瘤细胞的粘附。RGD序列的线性多肽修饰的长循环脂质体能够向肿瘤组织蓄积，然后被肿瘤细胞表面所表达的一种或多种整合素识别，粘附在肿瘤细胞表面，然后经整合素介导的细胞吞噬作用进入到细胞，包载在脂质体中的药物释放到胞浆中从而发挥抗癌作用。

综合起来，本发明提高抗肿瘤药物靶向性的原理如下：1、由于肿瘤血管的高通透性，PEG修饰的长循环脂质体能通过增强渗透和滞留作用向肿瘤组织内蓄积。2、积蓄在肿瘤组织内经含RGD序列的线性多肽修饰的含药长循环脂质体被肿瘤细胞表面所表达的整合素所识别，粘附在肿瘤细胞表面，经内吞作用进入到肿瘤细胞内。简单地说，被动蓄积和主动转运使得最终到达肿瘤细胞内的抗癌药物显著增加，从而提高了抗癌药物传递的靶向性。

发明内容

本发明的目的是将脂质体表面同时用PEG和含RGD序列的线性多肽修饰，含RGD序列的线性多肽修饰的长循环脂质体兼具被动向肿瘤组织蓄积和主动向肿瘤细胞内转运的特点。含RGD序列的线性多肽连接在PEG链的末端使之不受PEG链的干扰，能够更好地被肿瘤细胞表面表达的整合素受体所识别。包封在脂质体的抗癌药物经过被动蓄积和主动转运两个过程最终到达肿瘤细胞内，与靶点结合后发挥细胞毒作用。本发明结合了长循环脂质体技术和促进脂质体向细胞内转运的策略，从而提高了长循环脂质体的靶向性，能够提高抗肿瘤药物的利用率。

本发明提出了一种供注射用的含RGD序列的线性多肽修饰的载抗癌药物的长循环脂质体给药系统，其特征在于其依据的理论是药物进入细胞分为两个步骤，即从血管扩散到肿瘤组织间隙和从肿瘤间隙向细胞内转运。用含RGD序列的线性多肽修饰的长循环脂质体实现了这个目的。

本发明所说的含RGD序列的线性多肽片段是含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的任何线性多肽片段，包括含RGD序列的三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽和十肽，或含RGD类似物(RGDm)的线性片段，如含精氨酸-6-氨基己酸及其衍生物的线性片段。优选的是三肽、四肽、五肽、六肽、七肽、八肽、九肽和十肽。最优选的是三肽。RGD序列的线性多肽可以通过现有技术得到，也可以在市场上买到。

本发明所说的长循环脂质体指用聚乙二醇(PEG)修饰脂质体的表面，使用的聚乙二醇(PEG)的分子量优选的为200-50000，更优选的为1000-5000。

本发明所说的被包封的药物包括任何适合制成脂质体剂型的抗肿瘤药物或肿瘤诊断试剂，优选的包括阿霉素、表阿霉素、顺铂、柔红霉素、紫杉醇或多烯紫杉醇等。

本发明所说的多肽的连接方法包括将含RGD序列的线性多肽连到PEG的末端，或直接连接到脂质体的表面。

本发明所说的脂质体是指主要以磷脂和胆固醇为材料所制成的脂质双分子层囊泡，包括了所有类型的磷脂，选自大豆磷脂，二月桂酰卵磷脂、二肉豆蔻酰卵磷脂、二棕榈酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、二硬脂酰卵磷脂、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰卵磷脂、1-棕榈酰-2-硬脂酰卵磷脂、1-硬脂酰-2-棕榈酰卵磷脂、蛋黄卵磷脂、氢化豆磷脂、二油酰基卵磷脂、二月桂酰磷脂酰甘油、二棕榈脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酸、二棕榈酰磷脂酸、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二棕榈酰磷脂酰二丝氨酸、脑磷脂酰丝氨酸、脑神经鞘磷脂、二棕榈酰神经鞘磷脂、二硬脂酰神经鞘磷脂、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺之一种或它们的组合。

本发明的脂质体，其特征在于，其中磷脂与胆固醇的比例是任意的。磷脂与胆固醇的比例优选的为0-1000∶1，更优选的为1-10∶1。

本发明的所述脂质体可分散在溶液、固体或半固体的介质中。优选的是制成注射给药的药物制剂形式，特别是供静脉注射的。

本发明的含RGD序列的线性多肽或含RGD类似物的线性片段修饰的长循环脂质体可以通过以下方法制备：

首先得到PEG修饰的磷脂(如DSPE-PEG)，再将PEG末端活化形成活化酯，得到末端活化的PEG修饰的磷脂(如DSPE-PEG-BTC)，含RGD序列的线性多肽(以*RGD*表示)或含RGD类似物的线性片段(以*RGDm*表示)与末端活化的PEG修饰的磷脂在HEPES缓冲液中反应，形成导向化合物，即含RGD序列的线性多肽和PEG共同修饰的磷脂，或含RGD类似物的线性片段和PEG共同修饰的磷脂(可分别用DSPE-PEG-*RGD*和DSPE-PEG-*RGDm*表示)。

取磷脂、胆固醇、DSPE-PEG、DSPE-PEG-*RGD*，或DSPE-PEG-*RGDm*作为制备脂质体的原料，置圆底烧瓶中，加入有机溶剂溶解后，按脂质体制备方法制备含RGD序列的线性多肽或含RGD类似物的线性片段修饰的长循环脂质体；也可先制备长循环脂质体，将导向化合物插入到制备好的脂质体中形成RGD修饰的长循环脂质体。用挤压过聚碳酯膜或者超声的方法将脂质体的粒径控制在120nm左右。抗癌药物可在制备前或制备过程中加入，或者通过其他方法装载到已制备好的脂质体中。

本发明的优点在于本发明用含RGD序列的线性多肽或含RGD类似物的线性片段修饰的长循环脂质体作为抗肿瘤药物的载体，进一步提高了抗肿瘤药物的治疗指数。

本发明与已报道的用整合素αvβ3特异性的RGD环肽修饰的脂质体作为抗癌药物的载体不同之处在于两种肽的种类不同，作用机制也不同。RGD环肽修饰的脂质体是靶向肿瘤新生血管通过破坏肿瘤新生血管而发挥抑制肿瘤生长的作用，而本载体是直接靶向肿瘤细胞本身，通过增加肿瘤细胞对抗癌药物的摄取达到抗肿瘤作用。

本发明所用的含RGD序列的线性多肽或含RGD类似物的线性片段分子量小，因而抗原性较小，不易被免疫细胞所识别而导致消除加快。

本法生产简单，可直接将包载抗癌药物隐性脂质体与含RGD序列的线性多肽或含RGD类似物的线性片段的导向化合物孵育而得。因此只须用化学方法合成导向化合物即可，适于大工业生产。

附图说明：

图1尾静脉注射阿霉素溶液(Free DOX，FD)、阿霉素长循环脂质体(SSL-DOX)、RGD修饰阿霉素长循环脂质体(RGD-SSL-DOX)和RGDm修饰阿霉素长循环脂质体(RGDm-SSL-DOX)后的血药浓度曲线。其中的RGDm代表精氨酸-6-氨基己酸(注：其他附图中的RGDm和本发明实施例中的RGDm都代表精氨酸-6-氨基己酸)

图2尾静脉注射阿霉素溶液(Free DOX，FD)、阿霉素长循环脂质体(SSL-DOX)、RGD修饰阿霉素长循环脂质体(RGD-SSL-DOX)和RGDm修饰阿霉素长循环脂质体(RGDm-SSL-DOX)后肿瘤组织中阿霉素浓度曲线

图3尾静脉注射生理盐类水(Saline)、阿霉素溶液(Free DOX，FD)、阿霉素长循环脂质体(SSL-DOX)、RGD修饰阿霉素长循环脂质体(RGD-SSL-DOX)和RGDm修饰阿霉素长循环脂质体(RGDm-SSL-DOX)后小鼠的存活率曲线。

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、包载阿霉素的RGD修饰的长循环脂质体

取大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000以及DSPE-PEG-RGD(摩尔比为20∶10∶2∶1)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使得在烧瓶壁上形成磷脂薄膜，加入123mM的硫酸氨溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再挤压过200nm的聚碳酯膜5次。将制得的脂质体过SephadexG50柱，用PBS缓冲液(pH7.4)作为流动相洗脱，收集脂质体部分，将收集到的脂质体置40℃水浴中加热，加入阿霉素粉末孵育20分钟，并时时振摇，即得本品。上述制得阿霉素脂质体的粒径应控制在120nm左右。

实施例2、包载阿霉素的RGD类似物(RGDm)修饰的长循环脂质体

取大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000以及DSPE-PEG-RGDm(摩尔比为20∶10∶2∶1)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使得在烧瓶壁上形成磷脂薄膜，加入123mM的硫酸氨溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再挤压过200nm的聚碳酯膜5次。将制得的脂质体过Sephadex G50柱，用PBS缓冲液(pH7.4)作为流动相洗脱，收集脂质体部分，将收集到的脂质体置40℃水浴中加热，加入阿霉素粉末孵育20分钟，并时时振摇，即得本品。上述制得阿霉素脂质体的粒径应控制在120nm左右。

实施例3、包载阿霉素的RGD及类似物修饰的长循环脂质体

取大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000(摩尔比为20∶10∶2)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使得在烧瓶壁上形成磷脂薄膜，加入123mM的硫酸氨溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再挤压过200nm的聚碳酯膜5次。将制得的脂质体过葡聚糖凝胶(Sephadex G50)柱，用PBS缓冲液(pH7.4)作为流动相洗脱，收集脂质体部分，将收集到的脂质体置40℃水浴中加热，加入阿霉素粉末孵育20分钟，并时时振摇。再加入处方量的导向化合物DSPE-PEG-RGD或DSPE-PEG-RGDm继续孵育30分钟，并时时振摇，然后将上述脂质体置4℃的冰箱中过夜，导向化体物自动插入到脂质体的磷脂双分子层中即得本品。上述制得阿霉素脂质体的粒径应控制在120nm左右。

实施例4、包载阿霉素的RGD及类似物修饰的长循环脂质体

取商品阿霉素脂质体

，加入导向化合物DSPE-PEG-RGD或DSPE-PEG-RGDm适量，置40℃的水浴中孵育30分钟，并时时振摇。再置4℃的冰箱中过夜，导向化合物自动插入到脂质体的磷脂双分子层中即得本品。

实施例5、包载柔红霉素的RGD修饰的长循环脂质体

取大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000以及DSPE-PEG-RGD(摩尔比为20∶10∶2∶1)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使得在烧瓶壁上形成磷脂薄膜，加入123mM的硫酸氨溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再挤压过200nm的聚碳酯膜5次。将制得的脂质体过SephadexG50柱，用PBS缓冲液(pH7.4)作为流动相洗脱，收集脂质体部分，将收集到的脂质体置40℃水浴中加热，加入柔红霉素粉末孵育20分钟，并时时振摇，即得本品。上述制得柔红霉素脂质体的粒径应控制在120nm左右。

实施例6、包载表阿霉素的RGD类似物(RGDm)修饰的长循环脂质体

取大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000以及DSPE-PEG-RGDm(摩尔比为20∶10∶2∶1)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使得在烧瓶壁上形成磷脂薄膜，加入123mM的硫酸氨溶液，水浴超声至出现蓝色乳光。再挤压过200nm的聚碳酯膜5次。将制得的脂质体过Sephadex G50柱，用PBS缓冲液(pH7.4)作为流动相洗脱，收集脂质体部分，将收集到的脂质体置40℃水浴中加热，加入表阿霉素粉末孵育20分钟，并时时振摇，即得本品。上述制得表阿霉素脂质体的粒径应控制在120nm左右。

实施例7、包载紫杉醇的RGD及类似物修饰的长循环脂质体

利用薄膜分散法制备包载紫杉醇的RGD及类似物修饰的长循环脂质体。取大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000、DSPE-PEG-RGD或DSPE-PEG-RGDm和紫杉醇(摩尔比为20∶10∶2∶1∶0.5)，置于圆底烧瓶中，加入适量氯仿溶解后，置水浴加热真空旋转蒸发除去有机溶剂，使得在烧瓶壁上形成磷脂薄膜。加0。02mol/LrTris-HCL缓冲液(pH 7.0，含0.15mol/L的NaCl)，旋转摇动圆底烧瓶，得到脂质体悬液。用氮气冲洗后，封口室温下平衡1天，探针超声处理15分钟，然后再挤压过200nm的聚碳酯膜5次，最后用5.4％葡萄糖溶液透析除盐，即得本品。上述制得紫杉醇脂质体的粒径应控制在120nm左右。

实施例8、包载顺铂的RGD修饰的长循环脂质体

取顺铂溶于0.9％的氯化钠溶液中，浓度为8.5mg/ml，至45℃的水浴中温育1小时。取大豆磷脂、胆固醇、DSPE-PEG2000以及DSPE-PEG-RGD(摩尔比为20∶10∶2∶1)，置于圆底烧瓶中，加入适量乙醇溶解，然后加入到上述药物的溶液中。使所得混合溶液中脂材的最终浓度为150mg/ml，乙醇的浓度为10％。将溶液在温度45℃条件下持续搅拌1小时，并在45℃条件下挤压过200nm的聚碳酯膜11次，最后过100nm的聚碳酯膜。将制得的脂质体放冷至室温，在冷却过程中，有深黄色的沉淀形成，弃去上清液，将样品在室温下静置更长时间，再收集上清液，如此反复。最后将样品稀释2倍后用含有1mM氯化钠10％蔗糖溶液透析直至溶液达到平衡。最后加入组氨酸缓冲液(pH6.5)至顺铂的最终浓度为10mM，即得白色透明，粒径为100nm的顺铂脂质体。

实施例9、包载阿霉素的RGD或RGDm修饰的长循环脂质体的药动学以及在肿瘤组织中的分布实验。

由于本发明结合了长循环脂质体技术和促进细胞内转运的方法来提高抗癌药物的疗效，故要求其具备长循环脂质体的特征，即延长药物在血液循环中的半衰期以及向肿瘤组织中蓄积。为此有必要对其药动学及肿瘤中的分布进行考察。以下是以C57BL/6小鼠接种黑色素瘤，尾静脉注射阿霉素制剂后的实验结果：

参比制剂：阿霉素长循环脂质体，阿霉素溶液。

试验制剂：包载阿霉素的RGD或RGDm修饰的长循环脂质体。

试验动物：接种鼠源性黑色素瘤的C57BL/6小鼠，体重18-22克，每个时间点为5只，尾静脉注射给药，给药剂量为5mg/kg体重。

试验结果：血药浓度以及肿瘤中药物浓度随时间的变化数据分别见附图1和附图2。

实验结果表明，RGD或RGDm修饰的长循环阿霉素脂质体具备阿霉素长循环脂质体的特征，能够在血液循环中维持较长的时间，并且能够在肿瘤组织中蓄积。四种阿霉素制剂在血中的AUC分别为：阿霉素溶液，22.7；阿霉素长循环脂质体，392.4；RGD修饰的阿霉素长循环脂质体，139.4；RGDm修饰的阿霉素长循环脂质体，198.8。四种阿霉素制剂在肿瘤组织中的AUC分别为：阿霉素溶液，27.4；阿霉素长循环脂质体，67.4；RGD修饰的阿霉素长循环脂质体，44.3；RGDm修饰的阿霉素长循环脂质体，54.3。

实施例10、RGD或RGDm修饰的阿霉素长循环脂质体的药效学试验。

参比制剂：阿霉素长循环脂质体，阿霉素溶液

试验制剂：包载阿霉素的RGD或RGDm修饰的长循环脂质体

试验动物：接种鼠源性黑色素瘤的C57BL/6小鼠，体重18-22克，每组小鼠数为12只，尾静脉注射给药，每七天一次，给药单剂量为5mg/kg体重，共给药四次，考察指标为小鼠存活率。

试验结果：试验结果见附图3。

结果表明，RGD或RGDm修饰的阿霉素长循环脂质体能够明显延长荷瘤小鼠的存活率。

Claims (3)

1、一种供注射用的载抗癌药物的长循环脂质体，其特征在于，该脂质体同时用分子量在200-50000聚乙二醇和含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的线性多肽片段或精氨酸-6-氨基己酸的线性片段修饰，所述抗癌药物选自阿霉素、表阿霉素、顺铂、柔红霉素、紫杉醇或多烯紫杉醇。

2、如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体是制成注射给药的药物制剂形式。

3、如权利要求1所述的脂质体，其特征在于，所述脂质体表面多肽的连接方法是将含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的线性多肽连到聚乙二醇末端，或直接连接到脂质体的表面。

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