CN103371975A - 靶向长循环脂质体制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向长循环脂质体制剂及其制备方法，本发明将抗肿瘤药物阿霉素包载入被亲水性聚合物聚乙二醇和靶向配基环RGD肽修饰的靶向长循环脂质体中，该脂质体能延长药物在体内的循环时间，达到肿瘤靶向，提高疗效，降低毒副反应。
Description
技术领域
本发明涉及长循环脂质体制剂，具体涉及含有盐酸阿霉素的靶向脂质体及其制备方法。
背景技术
近几年癌症的发病率和死亡率居高不下，严重威胁人类健康。提高药物的肿瘤靶向性对于提高抗肿瘤药物的疗效，降低其毒性具有显著的临床意义和应用前景。许多恶性肿瘤的生长和转移均与整合素表达异常或分子结构改变有关。整合素在肿瘤细胞表面的表达高于正常细胞。Cilengitide[Cyclo(Arg-Gly-Asp-DPhe(NMeVal)]是一种强效αvβ3和αvβ5整合素受体抑制剂，能阻止肿瘤生长，其分子中Arg-Gly-Asp(RGD，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)构成的三肽序列是与整合素αvβ3和αvβ5受体的特异性结合位点，可阻断其介导的黏附和细胞迁移、入侵和新生血管生成作用。并且RGD肽能介导药物靶向表达αvβ3整合素受体的肿瘤血管内皮细胞。通过化学方法将RGD肽与脂质体共价结合，即在脂质体磷脂膜修饰多个RGD肽配体，形成的多价RGD结构有利于与靶细胞结合和内化，达到药物主动靶向肿瘤细胞的作用。
亲水性聚合物聚乙二醇(PEG)修饰的脂质体由于其表面共价结合的聚乙二醇能在脂质体表面形成一层水化膜，逃避网状内皮系统对脂质体的摄取，使脂质体在体内循环中的时间延长，不仅能增加靶向配体识别和结合靶细胞的机会，还可借助肿瘤的EPR(enhanced permeability and retention)效应，造成肿瘤局部高药物浓度，逆转肿瘤细胞的多药耐药性。
被亲水性聚合物聚乙二醇和靶向配基环RGD肽修饰的包载抗肿瘤药物的脂质体是提高恶性肿瘤化疗效果的理想的药物输送系统，它可通过环RGD肽对肿瘤细胞的特异性识别机制以及聚乙二醇延长脂质体体内循环时间，将药物载体导向肿瘤组织，使包载的抗癌药物浓集在癌变部位，提高化疗效果，降低细胞毒性药物对正常细胞组织的伤害。但是，环RGD肽由于本身在体内消除很快，消除半衰期仅为几分钟，而在一些将RGD肽接枝到聚乙二醇远端的消除速率也很快，因为整合素不仅存在于肿瘤细胞中，在脾脏单核巨噬细胞也有表达，因而导致RGD肽容易被脾脏摄取，缩短体内消除时间。
因此，目前的被亲水性聚合物聚乙二醇和靶向配基环RGD肽修饰的包载抗肿瘤药物的脂质体，难以满足临床应用的需要。如何既使RGD肽能发挥肿瘤靶向作用，又使聚乙二醇发挥其体内长循环作用，是制备聚乙二醇和RGD肽双重修饰脂质体需要解决的关键问题。
发明内容
本发明旨在提供一种靶向长循环脂质体制剂及其制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷，满足临床应用的需要。
所述的靶向长循环脂质体制剂，为盐酸阿霉素靶向脂质体制剂，由盐酸阿霉素和脂质体组成，重量比为：
盐酸阿霉素∶脂质体＝1∶10～1∶30；
优选为：盐酸阿霉素∶脂质体＝1∶12.3～1∶19；
所述脂质体包括如下重量百分比的组分：
优选为：
所述亲水性聚合物聚乙二醇选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)或巯基化聚乙二醇(聚乙二醇单甲醚2000-琥珀酰基半胱氨酸，PEG-SC)；
所述的靶向配基选自含有巯基的RGD肽及其类似物，RGD肽是指含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的环肽和线性肽，如RGDwc或环RGD肽即c(RGDfc)；
所述的RGD肽，可采用文献[1]Nefzi A，Fenwick JE.N-terminus 4-ChloromethylThiazole Peptide as a Macrocyclization Tool in the Synthesis of Cyclic Peptides：Applicationto the Synthesis of Conformationally Constrained RGD-Containing Integrin Ligands.
[2]Liu SQ，Tian Q，Wang L，Hedrick JL，Hui JH，Yang YY，Ee PL.InjectableBiodegradable Poly(ethylene glycol)/RGD Peptide Hybrid Hydrogels for in vitroChondrogenesis of Human Mesenchymal Stem Cells.报导的方法制备；
所述的环RGD肽，可以文献报导[3]Haubner，R.，et al.，Radiolabeled alpha(v)beta3 integrinantagonists：a new class of tracers for tumor targeting或[4]Chen，X.，et al.Pharmacokineticsand tumor retention of 125I-labeled RGD peptide are improved by PEGylation.为基础进行制备；例如：采用固相合成的方法，以2-氯三苯甲基树脂和Fmoc保护的氨基酸(茐甲基羰基-甘氨酸，茐甲基羰基-天冬氨酸β-叔丁基酯，茐甲基羰基-D-苯丙氨酸，N-芴甲氧羰酰基-2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸，芴甲氧羰基-S-三苯甲基-L-半胱氨酸)为原料，以HBTU/HOBt/DIEA为缩合剂，先将五个Fmoc保护的氨基酸通过接肽反应逐个接到树脂上，再脱去树脂得到直链五肽，通过DPPA/NaHCO3环合，经脱保护得到环五肽，用制备液相(RP-HPLC)分离提纯。
所述普通磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)或氢化大豆磷脂(HSPC)；
所述马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的制备方法，以及有关的理化鉴别参数，在中国专利，申请号为：200810205017.5中有详细的报导；
巯基化聚乙二醇的制备方法，以及有关的理化鉴别参数，在中国专利申请号200810205019.4中有详细的报导；
所述二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000为德国Lipoid公司生产的产品；
所述的盐酸阿霉素靶向脂质体制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)将普通磷脂、胆固醇和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺与有机溶剂混合溶解，蒸发除去有机溶剂，加缓冲液水化，经聚碳酸酯膜挤压，再用洗脱剂置换外水相，然后收集得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
所述的有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、水乙醇、乙醚或甲醇中的一种以上；
所述的用于水化的缓冲液选自浓度为0.125～0.250mol/L的硫酸铵溶液或pH为4.0的柠檬酸盐缓冲液；
所述的洗脱剂为缓冲液、葡萄糖溶液或氯化钠溶液，所述缓冲液选自磷酸缓冲液，如pH7.4的PBS、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液；氯化钠溶液如生理盐水；
(2)再将上述空白脂质体与盐酸阿霉素溶液混合、40℃～60℃孵育5min～1h，与靶向配基溶液混合、20℃～50℃孵育10min～1h，与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000或巯基化聚乙二醇溶液混合、20℃～50℃孵育10min～1h，即得聚乙二醇和靶向配基修饰的盐酸阿霉素脂质体；
所述的盐酸阿霉素溶液为盐酸阿霉素水溶液、盐酸阿霉素缓冲液或盐酸阿霉素氯化钠溶液，浓度为4mg/ml～10mg/ml；
靶向配基溶液为靶向配基水溶液、靶向配基缓冲液或靶向配基氯化钠溶液，浓度为0.3mg/ml～3mg/ml；
所述缓冲液选自磷酸缓冲液如pH7.4的PB S、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液；氯化钠溶液如生理盐水；
或者包括如下步骤：
(1)将普通磷脂、胆固醇、马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000与有机溶剂混合溶解，蒸发除去有机溶剂，加缓冲液水化，经聚碳酸酯膜挤压，再用洗脱剂通过葡聚糖凝胶置换外水相，然后收集得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
所述的有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、水乙醇、乙醚或甲醇中的一种以上；
所述的用于水化的缓冲液选自浓度为0.125～0.250mol/L的硫酸铵溶液或pH为4.0的柠檬酸盐缓冲液；
所述的洗脱剂为缓冲液、葡萄糖溶液或氯化钠溶液，缓冲液选自磷酸缓冲液，如pH7.4的PBS、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液；氯化钠溶液如生理盐水；
(2)将空白脂质体与盐酸阿霉素溶液混合，40℃～60℃孵育5min～1h，和靶向配基溶液混合20℃～50℃孵育10min～1h，即得聚乙二醇和靶向配基修饰的盐酸阿霉素脂质体；
所述的盐酸阿霉素溶液为盐酸阿霉素水溶液、盐酸阿霉素缓冲液或盐酸阿霉素氯化钠溶液，浓度为4mg/ml～10mg/ml；
靶向配基溶液为靶向配基水溶液、靶向配基缓冲液或靶向配基氯化钠溶液，浓度为0.3mg/ml～3mg/ml；
所述缓冲液选自磷酸缓冲液如pH7.4的PBS、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液；氯化钠溶液如生理盐水。
发明人经过广泛深入的研究，意外地发现，利用马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺将所述的靶向配基共价结合在脂质体膜表面，构建靶向长循环脂质体，具有肿瘤细胞靶向性以及体内长循环作用。这种组装方式与文献常用的在脂质体膜表面聚乙二醇远端连接配体的方式相比，能够发挥聚乙二醇的长循环作用，并且更为简单易行，具有潜在的应用价值。
为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
附图说明
图1为大鼠静脉给药盐酸阿霉素的血浆药时曲线。
具体实施方式
实施例1
称取氢化大豆磷脂HSPC 88.5mg(112μmol)、胆固醇29.4mg(76μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺4.45mg(5μmol)于茄形瓶中，加15mL三氯甲烷，超声溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，加入0.200mol/L硫酸铵溶液4mL于60℃下水化30min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜各15次挤压得到脂质体，再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与盐酸阿霉素水溶液(4mg/mL)2mL混合，于60℃孵育1h，包载盐酸阿霉素；再与环RGD肽水溶液(1.45mg/mL)2mL(即5μmol)混合，于37℃孵育1h，再与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000水溶液(7mg/mL)2mL(即5μmol)于40℃孵育1h；
将上述脂质体用超滤管浓缩至4mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例2
称取氢化大豆磷脂HSPC 44.2mg(56μmol)、胆固醇14.7mg(38μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺2.23mg(2.5μmol)于茄形瓶中，加8mL三氯甲烷，超声溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，加入0.200mol/L硫酸铵溶液2mL于60℃下水化30min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜各15次挤压得到脂质体，再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过透析置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与盐酸阿霉素水溶液(4mg/mL)1mL混合，于60℃孵育1h，包载盐酸阿霉素；再与环RGD肽水溶液(1.45mg/mL)1mL(即2.5μmol)混合，于37℃孵育1h，再与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000水溶液(14mg/mL)1mL(即5μmol)于40℃孵育1h；将上述脂质体用超滤管浓缩至2mL，即得PEG和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例3
称取氢化大豆磷脂HSPC 44.2mg(56μmol)、胆固醇14.7mg(38μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺4.45mg(5μmol)于茄形瓶中，加8mL三氯甲烷，超声溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，加入0.200mol/L硫酸铵溶液2mL于60℃下水化30min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜各15次挤压得到脂质体，再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与盐酸阿霉素水溶液(10mg/mL)0.4mL混合，于60℃孵育1h，包载盐酸阿霉素；再与环RGD肽水溶液(2.9mg/mL)1mL(即5μmol)混合，于37℃孵育1h，再与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000水溶液(7mg/mL)1mL(即2.5μmol)于40℃孵育1h；将上述脂质体用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例4
称取大豆卵磷脂S100 40mg(50μmol)、胆固醇19.3mg(50μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺2.23mg(2.5μmol)于茄形瓶中，加2mL二氯甲烷和8mL乙醇溶解后，旋转蒸发除去有机溶剂，加0.125mol/L硫酸铵溶液2mL于60℃下水化20min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜15次挤压再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与环RGD肽水溶液(0.36mg/mL)0.5mL(即0.3125μmol)混合，于37℃孵育1h，再与巯基化聚乙二醇的水溶液(5.5mg/mL)0.5mL(即1.25μmol)于37℃孵育1h，以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过琼脂糖凝胶除去未接枝的巯基化聚乙二醇，再与盐酸阿霉素水溶液(4mg/mL)1mL混合后于40℃孵育1h，用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例5
称取大豆卵磷脂S10039.5mg(50μmol)、胆固醇9.7mg(25μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺2.23mg(2.5μmol)于茄形瓶中，加2mL二氯甲烷和8mL乙醇溶解后，旋转蒸发除去有机溶剂，加0.150mol/L硫酸铵溶液2mL于60℃下水化20min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜15次挤压再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过透析置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与环RGD肽水溶液(0.72mg/mL)0.5mL(即0.625μmol)混合，于37℃孵育1h，再与巯基化聚乙二醇的水溶液(5.5mg/mL)0.5mL(即1.25μmol)于37℃孵育1h，以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过琼脂糖凝胶除去未接枝的巯基化聚乙二醇，再与盐酸阿霉素水溶液(4mg/mL)1mL混合后于40℃孵育1h，用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例6
称取蛋黄卵磷脂39.5mg(50μmol)、胆固醇19.3mg(50μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺4.45mg(5μmol)于茄形瓶中，加2mL二氯甲烷和8mL乙醇溶解后，旋转蒸发除去有机溶剂，加0.200mol/L硫酸铵溶液2mL于60℃下水化20min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜15次挤压再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与环RGD肽水溶液(2.9mg/mL)0.25mL(即1.25μmol)混合，于37℃孵育1h，再与巯基化聚乙二醇的水溶液(5.5mg/mL)1mL(即2.5μmol)于37℃孵育1h，以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶除去未接枝的巯基化聚乙二醇，再与盐酸阿霉素水溶液(4mg/mL)1mL混合后于40℃孵育1h，用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例7
称取蛋黄卵磷脂63.2mg(80μmol)、胆固醇3.9mg(10μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺7.12mg(8μmol)于茄形瓶中，加8mL三氯甲烷，超声溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，加入0.150mol/L硫酸铵溶液2mL于50℃下水化30min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜各15次挤压得到脂质体，再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与盐酸阿霉素的pH7.4PBS溶液(4mg/mL)1mL混合，于60℃孵育1h，包载盐酸阿霉素；再与环RGD肽pH7.4PBS溶液(0.58mg/mL)1mL(即1μmol)混合，于20℃孵育1h，再与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的pH7.4PBS溶液(2.8mg/mL)1mL(即1μmol)于20℃孵育1h；将上述脂质体用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例8
称取大豆卵磷脂S10047.4mg(60μmol)、胆固醇11.6mg(30μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺3.6mg(4μmol)于茄形瓶中，加8mL三氯甲烷，超声溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，加入0.250mol/L硫酸铵溶液2mL于60℃下水化30min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜各15次挤压得到脂质体，再以生理盐水为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与盐酸阿霉素水溶液(8mg/mL)0.5mL混合，于60℃孵育1h，包载盐酸阿霉素；再与环RGD肽生理盐水溶液(116mg/mL)1mL(即2μmol)混合，于40℃孵育30min，再与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000生理盐水溶液(4.2mg/mL)1mL(即1.5μmol)于40℃孵育30min；将上述脂质体用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例9
称取氢化磷脂HSPC 47.4mg(60μmol)、胆固醇5.8mg(15μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺5.3mg(6μmol)于茄形瓶中，加8mL三氯甲烷，超声溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，加入0.200mol/L硫酸铵溶液2mL于60℃下水化30min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜各15次挤压得到脂质体，再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与盐酸阿霉素水溶液(4mg/mL)1mL混合，于60℃孵育1h，包载盐酸阿霉素；再与环RGD肽水溶液(1.74mg/mL)1mL(即3μmol)混合，于50℃孵育15min，再与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000水溶液(8.4mg/mL)1mL(即3μmol)于50℃孵育15min；将上述脂质体用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例10
称取DPPC 29.4mg(40μmol)、DSPC7.9mg(10μmol)胆固醇9.7mg(25μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺2.23mg(2.5μmol)于茄形瓶中，加8mL三氯甲烷和2mL甲醇，超声溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，加入0.200mol/L硫酸铵溶液2mL于50℃下水化30min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，和100聚碳酸酯膜各20次挤压得到脂质体，再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与盐酸阿霉素水溶液(4mg/mL)1mL混合，于45℃孵育10min，包载盐酸阿霉素；再与环RGD肽水溶液(0.87mg/mL)1mL(即1.5μmol)混合，于37℃孵育30min，再与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000水溶液(4.2mg/mL)1mL(即1.5μmol)于37℃孵育30min；将上述脂质体用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例11
称取氢化大豆磷脂HSPC 44.2mg(56μmol)、胆固醇14.7mg(38μmol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 7mg(2.5μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺2.23mg(2.5μmol)于茄形瓶中，加8mL三氯甲烷和2mL甲醇，超声溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，加入0.125mol/L硫酸铵溶液2mL于60℃下水化25min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜各10次挤压得到脂质体，再以pH7.4的PBS为洗脱剂，透析置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与盐酸阿霉素pH7.4的PBS溶液(10mg/mL)0.4mL混合，于60℃孵育1h，包载盐酸阿霉素；再与环RGD肽pH7.4的PBS溶液(2.9mg/mL)0.5mL(即2.5μmol)混合，于50℃孵育10min；将上述脂质体用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例12
称取大豆磷脂S100 39.5mg(50μmol)、胆固醇3.9mg(10μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺2.23mg(2.5μmol)于茄形瓶中，加6mL二氯甲烷和4mL乙醚溶解后，旋转蒸发除去有机溶剂，加pH4.0柠檬酸盐缓冲液2mL于60℃下水化1h，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜15次挤压再以HEPES缓冲液为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换盐酸阿霉素外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与HEPES缓冲液配制的环RGD肽溶液(1.45mg/mL)0.5mL(即1.25μmol)混合，于50℃孵育10min，再与HEPES缓冲液配制的巯基化聚乙二醇水溶液(2.75mg/mL)1mL(即1.25μmol)于50℃孵育10min，以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过透析除去未接枝的巯基化聚乙二醇，再与盐酸阿霉素溶液(4mg/mL，HEPES缓冲液配制)1mL混合后于45℃孵育30min，用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例13
称取蛋黄卵磷脂39.5mg(50μmol)、胆固醇1.93mg(5μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺1.78mg(2μmol)于茄形瓶中，加4mL二氯甲烷和4mL甲醇溶解后，旋转蒸发除去有机溶剂，加pH4.0柠檬酸盐缓冲液2mL于50℃下水化30min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200和100nm聚碳酸酯膜各10次挤压再以生理盐水为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与环RGD肽水溶液(116mg/mL)0.5mL(即1μmol)混合，于30℃孵育30min，再与巯基化聚乙二醇的水溶液(2.2mg/mL)1mL(即1μmol)于30℃孵育30min，以生理盐水为洗脱剂，通过琼脂糖凝胶除去未接枝的巯基化聚乙二醇，再与盐酸阿霉素生理盐水溶液(4.6mg/mL)1mL混合后于60℃孵育5min，用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例14
称取大豆卵磷脂S100 39.5(50μmol)、胆固醇9.7mg(25μmol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 14mg(5μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺1.78mg(2μmol)于茄形瓶中，加4mL二氯甲烷和6mL乙醚，超声溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，加入0.250mol/L硫酸铵溶液2mL于60℃下水化25min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜各15次挤压得到脂质体，再以HEPES缓冲液为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与盐酸阿霉素水溶液(4mg/mL)1mL混合，于60℃孵育5min，包载盐酸阿霉素；再与环RGD肽HEPES缓冲液溶液(116mg/mL)0.5mL(即1μmol)混合，于20℃孵育1h；将上述脂质体用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例15
称取蛋黄卵磷脂711mg(90μmol)、胆固醇34.8mg(90μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺1.78mg(2μmol)于茄形瓶中，加10mL三氯甲烷溶解后，旋转蒸发除去有机溶剂，加0.150mol/L硫酸铵溶液2mL于45℃下水化30min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200和100nm聚碳酸酯膜各10次挤压再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与环RGD肽pH7.4的PBS溶液(116mg/mL)1mL(即2μmol)混合，于30℃孵育30min，再与巯基化聚乙二醇的水溶液(11mg/mL)1mL(即5μmol)于30℃孵育30min，以pH7.4的PBS溶液为洗脱剂，通过琼脂糖凝胶除去未接枝的巯基化聚乙二醇，再与盐酸阿霉素生理盐水溶液(4mg/mL)1mL混合后于45℃孵育5min，用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例16
称取蛋黄卵磷脂40mg(50μmol)、胆固醇3.9mg(10μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺8.9mg(10μmol)于茄形瓶中，加8mL三氯甲烷溶解后，旋转蒸发除去有机溶剂，加0.200mol/L硫酸铵溶液2mL于45℃下水化30min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200和100nm聚碳酸酯膜各10次挤压再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与盐酸阿霉素生理盐水溶液(10mg/mL)0.4mL混合后于50℃孵育30min，再与环RGD肽pH7.4的PBS溶液(116mg/mL)1mL(即2μmol)混合，于30℃孵育30min，再与二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000水溶液(5.6mg/mL)1mL(即2μmol)于30℃孵育30min，再，用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
实施例17
称取蛋黄卵磷脂39.5mg(50μmol)、胆固醇9.7mg(25μmol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 7mg(2.5μmol)和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺1.78mg(2μmol)于茄形瓶中，加4mL二氯甲烷和6mL乙醇，超声溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，加入pH4.0柠檬酸溶液2mL于50℃下水化25min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜各15次挤压得到脂质体，再以生理盐水为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
将所得空白脂质体与盐酸阿霉素生理盐水溶液(4mg/mL)1mL混合，于40℃孵育30min，包载盐酸阿霉素；再与环RGD肽生理盐水溶液(116mg/mL)0.5mL(即1μmol)混合，于37℃孵育30min；将上述脂质体用超滤管浓缩至2mL，即得聚乙二醇和RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。
对比例1盐酸阿霉素聚乙二醇修饰脂质体的制备
称取氢化大豆磷脂HSPC 44.2mg(56μmol)、胆固醇14.7mg(38μmol)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000 14mg(5μmol)于茄形瓶中，加8mL三氯甲烷，超声溶解，旋转蒸发除去有机溶剂，加入0.200mol/L硫酸铵溶液2mL于60℃下水化30min，超声分散，用薄膜挤出仪经400，200，100和50nm聚碳酸酯膜各15次挤压得到脂质体，再以pH7.4的PBS为洗脱剂，通过葡聚糖凝胶G-50置换外水相，得到空白脂质体；将所得空白脂质体与盐酸阿霉素水溶液(4mg/mL)1mL混合，于60℃孵育1h，将上述脂质体用超滤管浓缩至2mL，即得盐酸阿霉素聚乙二醇修饰脂质体。
实施例18
实施例1制备的聚乙二醇和环RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体的大鼠药代动力学研究
取SD大鼠，随机分成3组，每组6只，按5mg/kg给药，第一组静注盐酸阿霉素溶液剂(生理盐水配制，2mg/ml)；第二组静注对比例制备的盐酸阿霉素聚乙二醇修饰脂质体；第三组静注实施例1制备的聚乙二醇和环RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体。给药后于0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72和100小时于大鼠眼底静脉丛取血0.5mL，分离血浆，HPLC-荧光检测法测定血浆中的盐酸阿霉素含量。得盐酸阿霉素的血浆药时曲线如图1所示。结果表明，聚乙二醇和环RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体AUC和MRT(h)分别为溶液组的10倍和23.8倍，与盐酸阿霉素聚乙二醇修饰脂质体相当，说明其在体内具有长循环特性，能延长药物在体内的循环时间，有望提高药物疗效及降低毒副反应。
实施例19
实施例2～17制备的聚乙二醇和环RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体的大鼠药代动力学研究
实验方法同实施例19。计算血浆AUC和MRT，并与实施例18中溶液组相比，结果显示，实施例2～17制备的聚乙二醇和环RGD肽修饰的盐酸阿霉素脂质体的AUC为溶液组的5～11倍，MRT为溶液组的4～25倍，说明其在体内具有长循环特性，能延长药物在体内的循环时间，有望提高药物疗效及降低毒副反应。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。
Claims (9)
1.靶向脂质体，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：
2.根据权利要求1所述的靶向脂质体，其特征在于，包括如下重量百分比的组
3.根据权利要求1或2所述的靶向脂质体，其特征在于，所述亲水性聚合物聚乙二醇选自二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG2000）或巯基化聚乙二醇（聚乙二醇单甲醚2000-琥珀酰基半胱氨酸，PEG-SC）；
所述的靶向配基选自含有巯基的RGD肽及其类似物，RGD肽是指含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的环肽和线性肽，如RGDwc或环RGD肽即c（RGDfc）；
所述普通磷脂选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）或氢化大豆磷脂（HSPC）。
4.盐酸阿霉素靶向脂质体制剂，其特征在于，由盐酸阿霉素和权利要求1～3任一项所述的脂质体组成，重量比为：
盐酸阿霉素∶脂质体＝1∶10~1∶30。
5.根据权利要求4所述的酸阿霉素靶向脂质体制剂，其特征在于，重量比为：盐酸阿霉素∶脂质体＝1∶12.3~1∶19。
6.制备权利要求4或5所述的盐酸阿霉素靶向脂质体制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将普通磷脂、胆固醇和马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺与有机溶剂混合溶解，蒸发除去有机溶剂，加缓冲液水化，经聚碳酸酯膜挤压，再用洗脱剂置换外水相，然后收集得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
（2）再将上述空白脂质体与盐酸阿霉素溶液、靶向配基溶液、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000或巯基化聚乙二醇溶液混合孵育，即得聚乙二醇和靶向配基修饰的盐酸阿霉素脂质体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、水乙醇、乙醚或甲醇中的一种以上；
所述的用于水化的缓冲液选自浓度为0.125~0.250mol/L的硫酸铵溶液或pH为4.0的柠檬酸盐缓冲液；
所述的洗脱剂为缓冲液、葡萄糖溶液或氯化钠溶液，所述缓冲液选自磷酸缓冲液，如pH7.4的PBS、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液；氯化钠溶液如生理盐水；
步骤（2）中，所述的盐酸阿霉素溶液为盐酸阿霉素水溶液、盐酸阿霉素缓冲液或盐酸阿霉素氯化钠溶液，浓度为4mg/ml～10mg/ml，孵育条件为40℃~60℃，5min~1h；
靶向配基溶液为靶向配基水溶液、靶向配基缓冲液或靶向配基氯化钠溶液，浓度为0.3mg/ml～3mg/ml，孵育条件为20℃~50℃，10min~1h；
所述缓冲液选自磷酸缓冲液如pH7.4的PBS、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris 缓冲液；氯化钠溶液如生理盐水。
8.制备权利要求4或5所述的盐酸阿霉素靶向脂质体制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将普通磷脂、胆固醇、马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000与有机溶剂混合溶解，蒸发除去有机溶剂，加缓冲液水化，经聚碳酸酯膜挤压，再用洗脱剂通过葡聚糖凝胶置换外水相，然后收集得到含马来酰亚胺化磷脂酰乙醇胺的空白脂质体；
（2）将空白脂质体与盐酸阿霉素溶液、靶向配基溶液混合孵育，即得聚乙二醇和靶向配基修饰的盐酸阿霉素脂质体。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的有机溶剂为三氯甲烷、二氯甲烷、水乙醇、乙醚或甲醇中的一种以上；
所述的用于水化的缓冲液选自浓度为0.125~0.250mol/L的硫酸铵溶液或pH为4.0的柠檬酸盐缓冲液；
所述的洗脱剂为缓冲液、葡萄糖溶液或氯化钠溶液，缓冲液选自磷酸缓冲液，如pH7.4的PBS、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液；氯化钠溶液如生理盐水；
步骤（2）中，所述的盐酸阿霉素溶液为盐酸阿霉素水溶液、盐酸阿霉素缓冲液或盐酸阿霉素氯化钠溶液，浓度为4mg/ml～10mg/ml，孵育条件为40℃~60℃，5min~1h；
靶向配基溶液为靶向配基水溶液、靶向配基缓冲液或靶向配基氯化钠溶液，浓度为0.3mg/ml～3mg/ml，孵育条件为20℃~50℃，10min~1h；
所述缓冲液选自磷酸缓冲液如pH7.4的PBS、HEPES缓冲液、柠檬酸缓冲液或Tris缓冲液；氯化钠溶液为生理盐水。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20131030 |