CN102920649B - 载药纳米胶束及其制备方法和应用 - Google Patents

载药纳米胶束及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种载药纳米胶束及其制备方法和应用。该载药纳米胶束以聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸两亲性三嵌段共聚物为载体，在水溶液中自组装形成具有传输基因与药物的三层结构的纳米胶束；其中，聚亮氨酸之间的疏水作用使共聚物在水中形成胶束的核，用于包载疏水性药物多烯紫杉醇；聚赖氨酸使纳米胶束带正电荷，用于结合带负电的抗凋亡蛋白小干扰RNA；聚乙二醇用于保护载有药物和基因的纳米胶束的稳定性，延长纳米胶束在体内的循环时间。纳米胶束共同负载抗凋亡蛋白小干扰RNA基因药物和多烯紫杉醇药物，将基因治疗药物与化疗药物联合治疗癌症能够发挥两种药物的协同增效作用，为更好的治疗乳腺癌指明了方向。

Description

载药纳米胶束及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米医学领域，特别是涉及一种载药纳米胶束及其制备方法和应用。
背景技术
传统的已经研究出多种可以同时携载基因与化疗药物的传输体系，如Meng等用介孔二氧化硅纳米颗粒连接聚乙烯亚胺（PEI）同时携载了P糖蛋白小干扰RNA（Pgp siRNA）和阿霉素，有效地增强了耐药性肿瘤细胞对阿霉素的摄取并诱导了细胞凋亡；Cao等合成了一种两嵌段共聚物共同负载Bcl-2siRNA和阿霉素，有效地抑制了肝癌细胞的生长。但是上述载药体系普遍存在生物膜透过性及毒性问题，且负载药物或基因的效率不高。
发明内容
基于此，有必要提供一种生物膜透过性好、无毒且负载效率较高的载药纳米胶束及其制备方法。
一种载药纳米胶束，包括Bcl-2siRNA、多烯紫杉醇以及由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，其中，所述两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连；所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述聚乙二醇衍生物构成所述复合体的外层；所述Bcl-2siRNA分散在中间层的所述聚赖氨酸中，所述多烯紫杉醇分散在内层的所述聚亮氨酸层中。
在其中一个实施例中，所述聚乙二醇衍生物为氨基聚乙二醇羧酸。
在其中一个实施例中，所述两亲性三嵌段共聚物中所述聚乙二醇衍生物、所述聚赖氨酸及所述聚亮氨酸的单体摩尔比为45:10:40。
在其中一个实施例中，所述Bcl-2siRNA包括序列为SEQ ID NO:1的正义链及序列为SEQ ID NO:2的反义链。
一种载药纳米胶束的制备方法，包括如下步骤：
配制浓度范围为0.5-2mg/ml的多烯紫杉醇溶液及浓度范围为2-4mg/ml的两亲性三嵌段共聚物溶液，将所述多烯紫杉醇溶液与所述两亲性三嵌段共聚物溶液按照体积比为50-100:1000的比例混合后得到混合溶液，其中，所述两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连，所述多烯紫杉醇溶液及所述两亲性三嵌段共聚物溶液中溶剂均为二甲基亚砜；
向所述混合溶液中逐滴加入与所述两亲性三嵌段共聚物溶液同体积的超纯水，随后将得到的混合液置于分子截留量在3500的透析袋中，于超纯水中室温透析得到包含多烯紫杉醇的聚合物复合体，所述聚亮氨酸的疏水作用使所述两亲性三嵌段共聚物形成具有三层结构的复合体，所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述聚乙二醇构成所述复合体的外层，疏水性的所述多烯紫杉醇分散在内层的所述聚亮氨酸中；
按照所述包含多烯紫杉醇的聚合物复合体与Bcl-2 siRNA的质量比为530:1的比例，将所述包含多烯紫杉醇的聚合物复合体加入至浓度为50-100μg/ml的Bcl-2 siRNA焦碳酸二乙酯水溶液中，混合均匀，室温下静置20分钟，Bcl-2 siRNA被带正电荷的聚赖氨酸吸附而分散在中间层的所述聚赖氨酸中，得到所述载药纳米胶束。
在其中一个实施例中，所述两亲性三嵌段共聚物中所述聚乙二醇衍生物、所述聚赖氨酸及所述聚亮氨酸的单体摩尔比为45:10:40。
在其中一个实施例中，所述Bcl-2 siRNA包括序列为SEQ ID NO:1的正义链及序列为SEQ ID NO:2的反义链。
上述共同负载Bcl-2 siRNA和多烯紫杉醇药物的载药纳米胶束，由于其载体聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸（PEG-PLL-PLLeu）两亲性三嵌段共聚物具有良好的生物相容性，可生物降解并通过正常的生理途径吸收或排出体外，解决了生物膜透过性问题和载体的毒性问题；其次，纳米胶束包载疏水性药物多烯紫杉醇，使得难溶于水的多烯紫杉醇具有水溶性，且其通过纳米胶束输送可以提高药物疗效，具有被动靶向性，降低毒副作用；再次，纳米胶束负载Bcl-2siRNA进入细胞并使其不被降解，从而提高基因表达效率，解决了Bcl-2 siRNA穿透细胞膜的能力极差的问题，而且纳米胶束的聚乙二醇外壳使得纳米胶束具备保护Bcl-2 siRNA稳定性、以及长循环等特点。
上述载药纳米胶束共同负载Bcl-2 siRNA基因药物和多烯紫杉醇药物，将基因治疗药物与化疗药物联合治疗癌症能够发挥两种药物的协同增效作用，为更好的治疗乳腺癌指明了方向，可以广泛应用在制备治疗乳腺癌药物领域。
通过透析的方法使两亲性三嵌段共聚物、基因和药物在水溶液中自组装，形成具有输送Bcl-2 siRNA和多烯紫杉醇能力的三层结构的胶束纳米颗粒，制备方法简便易行，便于操作推广。
附图说明
图1为一实施方式的两亲性三嵌段共聚物的示意图；
图2为图1中两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体示意图；
图3为一实施方式的载药纳米胶束的示意图；
图4为一实施方式的载药纳米胶束制备方法的流程图；
图5为实施例4的载药纳米胶束在细胞学上的共传递效果检测图；
图6为实施例2-6的载药纳米胶束的基因负载效率检测图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对载药纳米胶束及其制备方法和应用进行进一步的说明。
如图1所示，一实施方式的两亲性三嵌段共聚物，其为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物（聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸，PEG-PLL-PLLeu）。分子量范围优选在3000-60000。其中，聚赖氨酸一端通过酰胺键与聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与聚亮氨酸相连。且该聚乙二醇衍生物的分子量为2000，聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的单体摩尔比为45:10:40。
优选的，本实施方式的聚乙二醇衍生物为氨基聚乙二醇羧酸（NH2-PEG-COOH）。
聚乙二醇（PEG）具有良好的生物相容性、生物可降解性并且降解产物没有毒性，在美国得到FDA的批准，并被广泛应用于生物材料领域和纳米医学领域。纳米材料经PEG表面修饰以后，可以降低其细胞粘附性，减少血清内物质的吸附性，同时减少巨噬细胞的排异吞噬，因此PEG修饰后的纳米材料可显著增加体内循环的时间。该两亲性三嵌段共聚物，即聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物（PEG-PLL-PLLeu），结合了聚乙二醇和聚氨基酸的优势，可以在水溶液中自组装形成具有三层结构的纳米载体，如图2所示，其中最内层的聚亮氨酸链段聚集形成疏水性内核，中间层的聚赖氨酸构成正电荷层，最外层的PEG衍生物起保护作用。以聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物为基础制备而成的阳离子纳米载体由于其特殊的结构使得聚赖氨酸正电荷得到聚集形成了一个正电荷层，大大曾强了负载基因和蛋白质等负电物质的能力，同时由于聚亮氨酸具有α-螺旋的二级结构使得阳离子纳米载体稳定性得到增加，由于该阳离子纳米载体同时具有疏水性内核和正电荷层，因此可以同时有效的负载小分子疏水性药物、基因物质以及蛋白质或多肽，是一种多功能的纳米载体。
本实施方式还提供了一种两亲性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：
步骤S110：以聚乙二醇衍生物作为引发剂，通过NCA开环聚合的方法合成包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的线性三嵌段共聚物，其中，侧链保护的聚赖氨酸一端通过酰胺键与聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与聚亮氨酸相连，且聚乙二醇衍生物的分子量为2000，侧链保护的聚赖氨酸的聚合度为10-200，聚亮氨酸的聚合度为10-200。
具体如下：将分子量为2000的聚乙二醇衍生物溶于有机溶剂中，浓度范围为1-100mg/mL，氮气保护下加热至30-50℃后加入LysZ-NCA（苄氧羰基赖氨酸的环状酸酐，一种侧链保护的赖氨酸环状酸酐）单体，LysZ-NCA单体与聚乙二醇衍生物的摩尔比为10:1，氮气保护下恒温反应24-120小时后加入Leu-NCA（亮氨酸的环状酸酐）单体，Leu-NCA单体与聚乙二醇衍生物的摩尔比为40:1，氮气保护下继续恒温反应24-120小时，反应结束后加入5-50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物。
步骤S120：脱去侧链保护的聚赖氨酸的侧链保护基团，得到包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸、且分子量在3000-60000的两亲性三嵌段共聚物。
具体如下：将包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物溶于0℃的三氟乙酸中，加入一定量的HBr体积浓度为30%的HBr/HAc溶液反应2-4小时后，再加入5-50倍于反应体系体积的乙醚进行沉淀、过滤，其中，加入的HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的2-4倍；将过滤后固体产物溶解于极性有机溶剂中，使用截留分子量为2000-8000的透析袋在水中透析12-96小时，每2-6小时换透析水一次，随后冻干，得到两亲性三嵌段共聚物。
通过使用NCA开环聚合的方法合成该两亲性三嵌段共聚物，制备过程简单，合成效率高。
如图3所示，一实施方式的载药纳米胶束包括Bcl-2 siRNA、多烯紫杉醇以及上述介绍的由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体。其中，Bcl-2siRNA分散在中间层的聚赖氨酸中，多烯紫杉醇分散在内层的聚亮氨酸层中。
在本实施方式中，抗凋亡蛋白小干扰RNA（Bcl-2 siRNA）是长度为21个核苷酸的双股RNA，包括序列为SEQ ID NO:1的正义链，及序列为SEQ ID NO:2的反义链。
上述共同负载Bcl-2 siRNA和多烯紫杉醇药物的载药纳米胶束，由于其载体聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸（PEG-PLL-PLLeu）两亲性三嵌段共聚物具有良好的生物相容性，可生物降解并通过正常的生理途径吸收或排出体外，解决了生物膜透过性问题和载体的毒性问题；其次，纳米胶束包载疏水性药物多烯紫杉醇，使得难溶于水的药物多烯紫杉醇具有水溶性，且其通过纳米胶束输送可以提高药物疗效，具有被动靶向性，降低毒副作用；再次，纳米胶束负载Bcl-2 siRNA进入细胞并使其不被降解，从而提高基因表达效率，解决了Bcl-2siRNA穿透细胞膜的能力极差的问题，而且纳米胶束的聚乙二醇外壳使得纳米胶束具备保护Bcl-2 siRNA稳定性、以及长循环等特点。
上述载药纳米胶束共同负载Bcl-2 siRNA基因药物和多烯紫杉醇药物，将基因治疗药物与化疗药物联合治疗癌症能够发挥两种药物的协同增效作用，为更好的治疗乳腺癌指明了方向，可以广泛应用在制备治疗乳腺癌药物领域。
此外，本实施方式还提供了一种载药纳米胶束制备方法，采用透析自组装的方法制备基因与药物共传输纳米胶束，如图2所示，具体包括如下步骤：
步骤S210，配制浓度范围为0.5-2mg/ml的多烯紫杉醇溶液及浓度范围为2-4mg/ml的两亲性三嵌段共聚物溶液，将多烯紫杉醇溶液与两亲性三嵌段共聚物溶液按照体积比为50-100:1000的比例混合后得到混合溶液。
在本实施方式中，多烯紫杉醇溶液及两亲性三嵌段共聚物溶液中溶剂均为二甲基亚砜（DMSO）。
步骤S220，向混合溶液中逐滴加入与两亲性三嵌段共聚物溶液同体积的超纯水，聚亮氨酸的疏水作用使两亲性三嵌段共聚物形成具有三层结构的复合体，聚亮氨酸构成复合体的内层，聚赖氨酸构成复合体的中间层，聚乙二醇衍生物构成复合体的外层，疏水性的多烯紫杉醇分散在内层的聚亮氨酸中，随后将得到的混合液置于分子截留量在3500的透析袋中，于超纯水中室温透析得到包含多烯紫杉醇的聚合物复合体。
步骤S230，按照包含多烯紫杉醇的聚合物复合体与Bcl-2 siRNA的质量比为5-30:1的比例，将包含多烯紫杉醇的聚合物复合体加入至浓度为50-100μg/ml的Bcl-2 siRNA焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液中，混合均匀，室温下静置20分钟，Bcl-2 siRNA被带正电荷的聚赖氨酸吸附而分散在中间层的聚赖氨酸中，得到载药纳米胶束。
通过透析的方法使共聚物、基因和药物在水溶液中自组装，形成具有输送Bcl-2 siRNA和多烯紫杉醇能力的三层结构的胶束纳米颗粒。该方法简便易行，便于操作推广。
以下为具体实施例部分：
实例1、羧基聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物的制备
将聚合管抽真空后充氮气保护，将0.5g分子量为2000的NH2-PEG-COOH用20mLDMF溶解后加入到聚合管内，按LysZ-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为10:1的比例加入LysZ-NCA单体，氮气保护下恒温反应24小时，然后按Leu-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为40:1的比例加入Leu-NCA单体，氮气、保护下继续恒温反应48小时，反应结束后加入20倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-PLysZ-PLeu三嵌段共聚物。
将以上所得PEG-PLysZ-PLeu聚合物溶于0℃的三氟乙酸中，加入HBr体积浓度为30%的HBr/HAc溶液反应2时后，加入15倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的2倍；将所得产物溶解于N,N-二甲基甲酰胺，使用截留分子量为3500的透析袋在水中透析12小时，每2小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物，平均分子量为8300。
实例2
两亲性三嵌段共聚物采用实施例1制备得到的羧基聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物。
配制浓度范围为0.5mg/ml的多烯紫杉醇溶液及浓度范围为2mg/ml的两亲性三嵌段共聚物溶液，将100μl多烯紫杉醇溶液与1ml两亲性三嵌段共聚物溶液混合，得到混合溶液。
向混合溶液中逐滴加入1ml超纯水，随后将得到的混合液置于分子截留量在3500的透析袋中，于2000ml超纯水中室温透析24小时，得到包含多烯紫杉醇的聚合物复合体。
配置浓度为100μg/ml的Bcl-2 siRNA焦碳酸二乙酯水溶液，将0.5μg的包含多烯紫杉醇的聚合物复合体与含有1μl的Bcl-2 siRNA焦碳酸二乙酯水溶液在室温下混合，静置共培育20分钟，得到载药纳米胶束。
实例3
两亲性三嵌段共聚物采用实施例1制备得到的羧基聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物的制备。
配制浓度范围为1mg/ml的多烯紫杉醇溶液及浓度范围为2mg/ml的两亲性三嵌段共聚物溶液，将50μl多烯紫杉醇溶液与1ml两亲性三嵌段共聚物溶液混合，得到混合溶液。
向混合溶液中逐滴加入1ml超纯水，随后将得到的混合液置于分子截留量在3500的透析袋中，于2000ml超纯水中室温透析24小时，得到包含多烯紫杉醇的聚合物复合体。
配置浓度为50μg/ml的Bcl-2 siRNA焦碳酸二乙酯水溶液，将0.5μg的包含多烯紫杉醇的聚合物复合体与含有2μl的Bcl-2 siRNA焦碳酸二乙酯水溶液在室温下混合，静置共培育20分钟，得到载药纳米胶束。
实例4
两亲性三嵌段共聚物采用实施例1制备得到的羧基聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物的制备。
配制浓度范围为2mg/ml的罗丹明B修饰的多烯紫杉醇溶液及浓度范围为2mg/ml的两亲性三嵌段共聚物溶液，将50μl罗丹明B修饰的多烯紫杉醇溶液与1ml两亲性三嵌段共聚物溶液混合，得到混合溶液。
向混合溶液中逐滴加入1ml超纯水，随后将得到的混合液置于分子截留量在10000的透析袋中，于2000ml超纯水中室温透析24小时，得到包含多烯紫杉醇的聚合物复合体。
配置浓度为80μg/ml的羧基荧光素（FAM）标记的siRNA焦碳酸二乙酯水溶液，将0.5μg的包含多烯紫杉醇的聚合物复合体与含有1.25μl的羧基荧光素（FAM）标记的siRNA焦碳酸二乙酯水溶液在室温下混合，静置共培育20分钟，得到载药纳米胶束。
如图5所示为实例4制备的基因与药物共传输纳米胶束进入细胞的激光共聚焦图片，该实验结果表明，该纳米胶束载体所携载的基因与药物在细胞内共定位，基因与药物是同时进入细胞的。
实例5
两亲性三嵌段共聚物采用实施例1制备得到的羧基聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物。
配制浓度范围为2mg/ml的多烯紫杉醇溶液及浓度范围为2mg/ml的两亲性三嵌段共聚物溶液，将100μl多烯紫杉醇溶液与1ml两亲性三嵌段共聚物溶液混合，得到混合溶液。
向混合溶液中逐滴加入1ml超纯水，随后将得到的混合液置于分子截留量在12000的透析袋中，于2000ml超纯水中室温透析24小时，得到包含多烯紫杉醇的聚合物复合体。
配置浓度为100μg/ml的Bcl-2 siRNA焦碳酸二乙酯水溶液，将1μg的包含多烯紫杉醇的聚合物复合体与含有1μl的Bcl-2 siRNA焦碳酸二乙酯水溶液在室温下混合，静置共培育20分钟，得到载药纳米胶束。
实例6
两亲性三嵌段共聚物采用实施例1制备得到的羧基聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物。
配制浓度范围为2mg/ml的多烯紫杉醇溶液及浓度范围为4mg/ml的两亲性三嵌段共聚物溶液，将100μl多烯紫杉醇溶液与1ml两亲性三嵌段共聚物溶液混合，得到混合溶液。
向混合溶液中逐滴加入1ml超纯水，随后将得到的混合液置于分子截留量在9000的透析袋中，于2000ml超纯水中室温透析24小时，得到包含多烯紫杉醇的聚合物复合体。
配置浓度为50μg/ml的Bcl-2 siRNA焦碳酸二乙酯水溶液，将2μg的包含多烯紫杉醇的聚合物复合体与含有2μl的Bcl-2 siRNA焦碳酸二乙酯水溶液在室温下混合，静置共培育20分钟，得到载药纳米胶束。
如图6所示为实例2-6制备的不同比例的药物载体与siRNA电泳图，该实验结果证明了，当载体与siRNA的质量比大于等于5时基因是可以完全负载的。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种载药纳米胶束的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 
配制浓度范围为0.5-2mg/ml的多烯紫杉醇溶液及浓度范围为2-4mg/ml的两亲性三嵌段共聚物溶液，将所述多烯紫杉醇溶液与所述两亲性三嵌段共聚物溶液按照体积比为50-100:1000的比例混合后得到混合溶液，其中，所述两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连，所述多烯紫杉醇溶液及所述两亲性三嵌段共聚物溶液中溶剂均为二甲基亚砜，其中，所述聚乙二醇衍生物为氨基聚乙二醇羧酸； 
向所述混合溶液中逐滴加入与所述两亲性三嵌段共聚物溶液同体积的水，随后将得到的混合液置于分子截留量在3500的透析袋中，于水中室温透析得到包含多烯紫杉醇的聚合物复合体，所述聚亮氨酸的疏水作用使所述两亲性三嵌段共聚物形成具有三层结构的复合体，所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述聚乙二醇衍生物构成所述复合体的外层，疏水性的所述多烯紫杉醇分散在内层的所述聚亮氨酸中； 
按照所述包含多烯紫杉醇的聚合物复合体与Bcl-2 siRNA的质量比为5-30:1的比例，将所述包含多烯紫杉醇的聚合物复合体加入至浓度为50-100μg/ml的Bcl-2 siRNA焦碳酸二乙酯水溶液中，混合均匀，静置20分钟，Bcl-2 siRNA被带正电荷的聚赖氨酸吸附而分散在中间层的所述聚赖氨酸中，得到所述载药纳米胶束。 
2.根据权利要求1所述的载药纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述两亲性三嵌段共聚物中所述聚乙二醇衍生物、所述聚赖氨酸及所述聚亮氨酸的单体摩尔比为45:10:40。 
3.如权利要求1所述的载药纳米胶束的制备方法，其特征在于，所述Bcl-2 siRNA包括序列为SEQ ID NO:1的正义链及序列为SEQ ID NO:2的反义链。 
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