TW201524533A - 高分子微胞醫藥組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明所提供的高分子微胞醫藥組成物，係含有具親水性高分子鏈鏈段與疏水性高分子鏈鏈段的嵌段共聚物單元α及嵌段共聚物單元β；其中，嵌段共聚物單元α及嵌段共聚物單元β係依親水性高分子鏈鏈段朝向外側、且疏水性高分子鏈鏈段朝向內側的狀態呈輻射狀排列；嵌段共聚物單元α的疏水性高分子鏈鏈段係由具有側鏈的重複單元構成；且側鏈之至少1者係具有親水性基。

Description

高分子微胞醫藥組成物
本發明係關於高分子微胞醫藥組成物。
習知有朝各種藥物輸送系統(drug delivery system，DDS)的開發進展。例如有開發出利用具有親水性鏈段與疏水性鏈段之嵌段共聚物的高分子微胞製劑(例如專利文獻1及專利文獻2)。該等習知型高分子微胞製劑技術對降低藥物的副作用、以及提高藥效具有頗大貢獻，但就能更高階兼顧該等的觀點，尚有待改善的空間。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2009/142326號公報
[專利文獻2]國際公開第2010/013836號公報
本發明目的在於提供：發揮高藥理作用、且副作用較少的高分子微胞醫藥組成物。
趨向能更長期維持血中之微胞粒子結構的習知型高分子微胞技術領域，就使嵌段共聚物間的疏水性相互作用能牢固地發揮之觀點，有構思選擇盡可能提高設定聚合物的疏水性鏈段部分之疏水性力的材料。例如將利用苄基之類的疏水性結構盡量埋藏聚胺基酸鏈段側鏈的嵌段共聚物(苄基導入率100%)，積極使用作為微胞構成材料的技術趨向。該趨向係當選擇藥物未結合型嵌段共聚物作為微胞構成材料時將特別明顯。
本發明者針對此種習知型材料選擇構思反其道而行，發現若大膽將針對由疏水性相互作用所產生微胞粒子結構的牢固維持貢獻，呈現較弱之嵌段共聚物(所謂第三世界的嵌段共聚物：第三聚合物)，使用作為微胞構成材料的一部分，便可發揮利用高分子微胞技術造成的藥物副作用抑制效果，且能大幅提升利用輸送對象藥物造成的藥理作用，遂完成本發明。
即，根據本發明所提供的高分子微胞醫藥組成物，係含有：具親水性高分子鏈鏈段與疏水性高分子鏈鏈段的嵌段共聚物單元α、以及具親水性高分子鏈鏈段與疏水性高分子鏈鏈段的嵌段共聚物單元β；其中，該嵌段共聚物單元α及該嵌段共聚物單元β係依該親水性高分子鏈鏈段朝向外側、且該疏水性高分子鏈鏈段朝向內側的狀態呈輻射狀排列； 該嵌段共聚物單元α的該疏水性高分子鏈鏈段係由具有側鏈的重複單元構成；且該側鏈之至少1者係具有親水性基。
根據本發明，可提供能更加明顯兼顧由藥物所產生之增強藥理作用、與抑制副作用的高分子微胞醫藥組成物。
11、21、31‧‧‧親水性高分子鏈鏈段
12、22、32‧‧‧疏水性高分子鏈鏈段
23‧‧‧藥物
33‧‧‧標的結合部位
100‧‧‧高分子微胞醫藥組成物
圖1係本發明一實施形態的高分子微胞醫藥組成物的概略圖。
圖2係表示試驗例1~6中，微胞製劑導入於細胞的試驗結果的圖表。
[1.高分子微胞醫藥組成物]
針對本發明之一實施形態的高分子微胞醫藥組成物說明如下。上述高分子微胞醫藥組成物係含有嵌段共聚物單元α(高分子單元α)與嵌段共聚物單元β(高分子單元β)。高分子單元α係具有：親水性高分子鏈鏈段11與疏水性高分子鏈鏈段12。高分子單元β係具有：親水性高分子鏈鏈段21與疏水性高分子鏈鏈段22。高分子單元α及高分子單元β係依各自的疏水性高分子鏈鏈段12及22朝向內側、且各自的親水性高分子鏈鏈段11及21朝向外側的狀態呈輻射狀排列。高分子單元α的疏水性高分子鏈鏈段12係由具有側鏈的重複單元構成。上述側鏈之至少1者係具有親水性基。高分子單元α及高分子單元β的親水性高分子鏈鏈段具代表性的係聚乙二醇鏈。高分子單元α及高分子單 元β的疏水性高分子鏈鏈段具代表性的係聚胺基酸鏈。另外，以下，有將嵌段共聚物單元α稱為骨架高分子單元α、將嵌段共聚物單元β稱為骨架高分子單元β的情況。又，本說明書中的「親水性基」係可採用任意適當的親水性基。上述親水性基係可列舉例如：羥基、羧基、及胺基。
本說明書中，所謂嵌段共聚物單元呈輻射狀排列，係只要嵌段共聚物單元依疏水性高分子鏈鏈段朝向內側、且親水性高分子鏈鏈段朝向外側而凝聚的狀態便可，即便各嵌段共聚物單元的排列起點並非集中於一點，而是具有略崩壞的輻射狀排列結構的微胞亦無妨。高分子微胞醫藥組成物即便係由嵌段共聚物單元造成的高分子凝聚體呈乾燥狀態者亦無妨。
根據上述高分子微胞醫藥組成物，相較於習知型高分子微胞製劑之下，治療係數獲大幅改善。雖獲得此種效果的機制尚未明確，但可推測如下。首先，高分子微胞具有利用由其粒子尺寸所造成的EPR效果，而容易滯留於標的細胞周邊的性質。然後，本發明的高分子微胞醫藥組成物可認為骨架高分子單元α會因其疏水性鏈段部分的親水性程度，而造成容易先行從微胞中脫離。若從在標的細胞周邊滯留的微胞中脫離單元α，便會因單元α的疏水性鏈段部分之疏水性基，導致在滯留微胞附近的標的細胞之細胞膜容易受刺激，使該細胞的細胞吞噬作用呈活躍化。其結果，提升含有輸送對象藥物的高分子微胞醫藥組成物朝標的細胞的到達性，可認為能更有效率發揮利用該藥物造成的藥理作用。
高分子微胞醫藥組成物100亦可更進一步含有具備：標的結合部位33所結合的親水性高分子鏈鏈段31、與疏水性高分子鏈鏈段32之嵌段共聚物單元γ(以下亦有稱為骨架高分子單元γ的情況)。骨架高分子單元γ係依親水性高分子鏈鏈段31朝向外側、且疏水性高分子鏈鏈段32朝向內側的狀態，一起與骨架高分子單元α及β呈輻射狀排列。
本說明書中，所謂標的結合部位，係指具有能對源自活體及病毒的物質進行特異性結合，而與該物質形成生物學鍵結對(bonding pair)之生物學認知機能(cognitive function)的部位。源自活體及病毒的物質係可例示存在於活體細胞、細菌、真菌、及病毒中的分子。活體細胞係可例示如：腫瘤細胞、新生血管細胞、及該等的周邊細胞；免疫活性細胞(例如B細胞)；發炎細胞(例如白血球)；血管內皮細胞；構成各種臟器的細胞等。標的結合部位亦可依含有將與此種物質形成鍵結對的蛋白質、肽及糖鏈等化合物，作為其結構之至少一部分的狀態而構成。
高分子微胞醫藥組成物的藥物含有態樣係可列舉例如：內含於微胞中的態樣、以及載持於例如微胞表面上的態樣。藥物具代表性的係結合於嵌段共聚物單元，惟在不致對本發明目的造成不良影響之前提下，亦可未結合於嵌段共聚物單元。藥物對上述嵌段共聚物單元的結合部位係當使內含於微胞時，只要設定為疏水性高分子鏈鏈段的側鏈及/或內側突出末端，而當使載持於微胞表面上時，只要設定為親水性高分子鏈鏈段的外側突出末端便可。當使藥物內含於微胞時，具代表 性的係在構成疏水性高分子鏈鏈段的重複單元之側鏈結合著藥物。圖示例中，藥物23係結合於骨架高分子單元β的疏水性高分子鏈鏈段22。針對上述藥物的具體例等容後述。另外，本發明的高分子微胞醫藥組成物具代表性的係含有藥物，但並非排除未含有藥物的狀態。例如本發明的高分子微胞醫藥組成物係含有標的結合部位，但另一方面亦可為未含有藥物的狀態。
高分子微胞醫藥組成物雖可為未含有標的結合部位的狀態，但就更高階發揮由本發明所造成之效果的觀點，較理想為含有標的結合部位的狀態。理由係可使利用EPR效果滯留於標的細胞周邊的高分子微胞，朝向該標的細胞而更容易局部性集聚。根據本發明的高分子微胞醫藥組成物，亦如後述試驗例所示，超過由作為標的結合部位之化合物造成的朝標的細胞之原本到達能力(例如由抗體朝細胞膜內的內吞能力(internalization))，俾使輸送對象藥物能到達標的細胞。圖1係例示在高分子微胞醫藥組成物100表面上結合著標的結合部位33之態樣。標的結合部位33係結合於骨架高分子單元γ的親水性高分子鏈鏈段31。另外，本發明的高分子微胞醫藥組成物並非排除標的結合部位亦結合於骨架高分子單元γ以外的嵌段共聚物單元的狀態。
高分子微胞醫藥組成物的骨架高分子單元α含有量，係例如15重量%以上、或例如20重量%以上、或例如35重量%以上。如後述實施例及試驗例所示，藉由使高分子微胞醫藥組成物中含有該單元α達既定量以上，便可更確實提升高分子微胞醫藥組成物朝標的細胞的到達性，俾能大幅增強由輸送對象藥物所造成的藥理作用。該單元α的含 有量上限並無特別的限制，就防止高分子微胞醫藥組成物過度崩壞的觀點，更具體而言，就使發揮由防止高分子微胞醫藥組成物所造成的副作用，且擔保到達血中標的細胞附近為止時微細胞結構的保持性的觀點，可設定為例如80重量%、或例如60重量%、或例如50重量%、或例如45重量%。
高分子微胞醫藥組成物的骨架高分子單元β含有量，係例如80重量%以下、或例如70重量%以下、或例如60重量%以下。該單元β的含有量下限並無特別的限制，就使高分子微胞醫藥組成物的輸送對象藥物搭載率不致過度降低之觀點，可設定為例如15重量%、或例如25重量%、或例如40質量%。當使高分子微胞醫藥組成物中含有骨架高分子單元γ的情況，其含有量係可設定例如1重量%、或例如3重量%、或例如5重量%、或例如10重量%，作為(1)下限可設定例如20重量%、或例如15重量%作為(2)上限。
上述高分子微胞醫藥組成物中，骨架高分子單元α與骨架高分子單元β係可依任意的適當比率存在，依莫耳比(前者：後者)計係可依例如1：20~20：1的範圍、較佳係1：10~10：1的範圍、更佳係1：5~5：1的範圍、特佳係1：2~2：1的範圍存在。
骨架高分子單元α及骨架高分子單元β、以及其他的骨架高分子單元(例如骨架高分子單元γ、及均未含有骨架高分子單元α、β及γ的骨架高分子單元)，係可依任意的適當比率存在，依莫耳比(骨架高分子單元α及β的合計莫耳量：其他的骨架高分子單元之合計莫耳量) 計，係可依例如100：0~100：300的範圍、較佳係100：1~100：100的範圍、更佳係100：2~100：50的範圍存在。
高分子微胞醫藥組成物100亦可含有2種以上的上述各嵌段共聚物單元。
[2.骨架高分子單元α]
骨架高分子單元α係具有親水性高分子鏈鏈段與疏水性高分子鏈鏈段。
骨架高分子單元α的疏水性高分子鏈鏈段係由具有側鏈的重複單元構成。上述側鏈之至少1者係具有親水性基。骨架高分子單元α的疏水性高分子鏈鏈段之側鏈中，具有親水性基的側鏈比例係例如20%以上、或例如35%以上。如後述實施例及試驗例所示，藉由將該具有親水性基的側鏈比例控制在既定量以上，便可更確實提升高分子微胞醫藥組成物朝標的細胞的到達性，俾能大幅增強由輸送對象藥物所造成的藥理作用。該具有親水性基的側鏈比例上限並無特別的限制，就防止高分子微胞醫藥組成物過度崩壞的觀點，可設定為例如80%、或例如60%、或例如50%。
藉由將高分子微胞醫藥組成物的骨架高分子單元α含有量、及疏水性高分子鏈鏈段之側鏈中具有親水性基的側鏈比例，控制於上述範圍內，便可更確實提升高分子微胞醫藥組成物朝標的細胞的到達性的機制雖尚未明確，但可推測如下述。如上所述，可認為骨架高分子單 元α會因其疏水性鏈段部分的親水性程度，而造成容易從微胞先行脫離。若將單元α的疏水性高分子鏈鏈段之側鏈中，具有親水性基的側鏈比例控制在上述範圍內，則認為可更確實誘導個別單元α從微胞先行脫離。而，若將微胞的單元α含有量控制於上述範圍，則認為會使可高階活性化標的細胞之細胞吞噬作用之量的單元α，更確實從微胞中先行脫離。其結果，提升含有輸送對象藥物的高分子微胞醫藥組成物朝標的細胞的到達性。另外，熟習高分子微胞技術領域的業者，即便假設為達微胞機能改善而構思到將藥物未結合型嵌段共聚物添加作為微胞構成材料，但就維持每個微胞的高藥物搭載率的觀點，通常趨向僅止於10質量%以下左右的添加比例。此處，如後述試驗例所示，10質量%的骨架高分子單元α的添加，相較於沒有添加該單元α的情況下，反而會導致朝標的細胞的到達性降低。因此，若屬於通常技術指向性，並不會更加提高該單元α的添加比例，反觀本發明者發現若大膽更加增加單元α的添加比例，便可更確實提升高分子微胞醫藥組成物朝標的細胞的到達性之難預測機能改善手段。
高分子微胞醫藥組成物100中，骨架高分子單元α係可依任意的適當狀態呈輻射狀排列。骨架高分子單元α係例如可依親水性高分子鏈鏈段11朝向外側、且疏水性高分子鏈鏈段12朝內側的狀態呈輻射狀排列。
骨架高分子單元α較理想係具有較骨架高分子單元β低的疏水性。該低疏水性可能起因於上述疏水性高分子鏈鏈段的側鏈所具有的親水性基。
當骨架高分子單元β的疏水性高分子鏈鏈段係由具有側鏈的重複單元構成時，骨架高分子單元α的疏水性高分子鏈鏈段之側鏈，可具有較骨架高分子單元β的疏水性高分子鏈鏈段之側鏈為數更多的親水性基。
骨架高分子單元α具代表性的係均未含有標的結合部位與藥物，但並非排除含有標的結合部位及/或藥物的狀態。
骨架高分子單元α可以係依一般式：A1-B1表示的嵌段共聚合體。A1係聚乙二醇鏈鏈段、B1係側鏈之至少1者具有親水性基的聚胺基酸鏈鏈段，具代表性的係含有：側鏈具有疏水性基的胺基酸殘基、與側鏈具有親水性基的胺基酸殘基。另外，以下有將聚乙二醇表示為「PEG」的情況。
骨架高分子單元α之具有疏水性基與親水性基的聚胺基酸鏈鏈段，係可例示如：聚麩胺酸或其酯或醯胺衍生物、以及聚天冬胺酸或其酯或醯胺衍生物。此種酯或醯胺衍生物係藉由使上述具有疏水性基與親水性基的相對應羥化合物或胺化合物、與聚麩胺酸或聚天冬胺酸的反應性衍生物(例如酯)，進行反應便可形成。
上述疏水性基係可列舉例如疏水性有機基。上述疏水性有機基係可列舉例如：具有C4~C16之直鏈、分支鏈或環狀結構的烷基、C6~C20之芳基、及C7~C20之芳烷基或固醇殘基。上述C6~C20之芳基及C7~C20 之芳烷基較佳係可列舉：苯基、萘基、甲苯基、二甲苯基、苄基、及苯乙基，更佳係苄基。又，源自上述固醇殘基的固醇，較佳係膽固醇、膽甾烷醇、及二羥膽固醇(dihydroxycholesterol)，更佳係膽固醇。
骨架高分子單元α的較佳具體例係可依以下一般式(I)及(II)所示。本發明的高分子微胞醫藥組成物亦可含有2種以上的骨架高分子單元α。
上述各式中，R1及R3係表示各自獨立的氫原子、或由亦可受保護之官能基取代、或未取代的低級烷基；R2係表示氫原子、飽和或不飽和的C1~C29脂肪族羰基或芳羰基；R4係表示羥基、飽和或不飽和的C1~C30脂肪族氧基或芳基-低級烷氧基； R5係表示-O-或-NH-；R6係總數(m+x)的10%~90%為氫原子、其餘為疏水性有機基；R7及R8係表示各自獨立的亞甲基或伸乙基；n係10~2500的整數；x係成為10~300的整數；m係成為0~300的整數(但，當m為1以上的情況，重複數為x的重複單元、與重複數為m的重複單元之鍵結順序係任意；R6係1個嵌段共聚物內的各重複單元中各自獨立選擇)
L1係表示從-NH-、-O-、-O-Z-NH-、-CO-、-CH2-、-O-Z-S-Z-及-OCO-Z-NH-(其中，Z係獨立的C1~C6伸烷基)所構成之群組中選擇的連接基；L2係表示從-OCO-Z-CO-及-NHCO-Z-CO-(其中，Z係獨立的C1~C6伸烷基)之中選擇的連接基。
R6總數(m+x)的氫原子比例係例如20%以上、或例如35%以上。上述比例係例如80%以下、或例如60%以下、或例如50%以下。
上述n較佳係10~1000、更佳係20~600、特佳係50~500。上述x及m分別較佳係20~200、更佳係30~100。
式(I)及(II)所示之骨架高分子單元α的聚胺基酸鏈段中，各重複單元的鍵結順序係任意。上述聚胺基酸鏈段係可具有各重複單元的鍵結順序呈無規的結構(無規結構)、由重複數為x的重複單元所構成之鏈段與由重複數為m的重複單元所構成之鏈段形成的結構(嵌段結構)、以 及m=0的結構(均聚物結構)中之任一者。
上述亦可受保護的官能基係可列舉：羥基、縮醛、縮酮、醛、糖殘基、順丁烯二醯亞胺基、羧基、胺基、硫醇基、活性酯等。當R1及R3係表示被亦可受保護之官能基取代的低級烷基時，親水性高分子鏈鏈段係例如依照WO96/33233、WO96/32434、WO97/06202所記載的方法便可獲得。所謂低級烷基，係指碳數例如7個以下、較佳係4個以下的直鏈或分支鏈烷基，例如包括有：甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基等。
骨架高分子單元α係例如將具有親水性高分子鏈的聚合物、及具有聚胺基酸鏈的聚合物，直接、或視需要依使分子量分佈變狹窄的方式進行精製後，再利用公知的方法進行偶合便可獲得。關於一般式(I)的嵌段共聚物，係例如使用能賦予R1的起始劑進行陰離子活性聚合(anionic living polymerization)，而形成聚乙二醇鏈後，再於成長末端側導入胺基，而從該胺基末端使β-苄基-L-天冬胺酸鹽、γ-苄基-L-麩胺酸鹽等受保護的胺基酸之N-羧酸酐(NCA)進行聚合亦可形成。
針對骨架高分子單元α的製造方法之具體例，說明如下。藉由以單邊末端受保護、而另一末端為胺基的聚乙二醇，例如MeO-PEG-CH2CH2CH2-NH2作為起始劑，在經脫水的有機溶劑中，依成為所需聚合度(胺基酸單元數)的方式添加N-羧基-β-苄基-L-天冬胺酸酐(BLA-NCA)、或N-羧基-γ-苄基-L-麩胺酸酐(BLG-NCA)，並使進行反應，便可獲得聚乙二醇-共聚天冬胺酸苄酯、或聚乙二醇-共聚麩胺 酸苄酯。又，將所獲得之嵌段共聚物的末端利用乙醯氯或醋酸酐施行乙醯化後，利用鹼水解除去苄基而形成聚乙二醇-共聚天冬胺酸或聚乙二醇-共聚麩胺酸後，於有機溶劑中，依成為所需酯化率的方式添加苄醇，再於N,N'-二環己基碳二醯亞胺(DCC)、N,N'-二異丙基碳二醯亞胺(DIPCI)等縮合劑的存在下進行反應，便可獲得部分性具有苄酯的嵌段共聚物。
再者，例如若取代上述苄醇，改為使膽固醇進行反應，便可獲得聚乙二醇-共聚天冬胺酸膽固醇酯、聚乙二醇-共聚麩胺酸膽固醇酯。
骨架高分子單元α的製造方法之另一具體例，係可列舉利用醯胺鍵而導入疏水性側鏈的方法。該製造方法係與上述相同的方式，將聚乙二醇-共聚天冬胺酸苄酯、或聚乙二醇-共聚麩胺酸苄酯的末端施行乙醯化。接著，利用鹼水解除去苄基，使所生成之羧基與具有胺基的疏水性側鏈進行反應，或者使聚乙二醇-共聚天冬胺酸苄酯或聚乙二醇-共聚麩胺酸苄酯、與具有一級胺的化合物進行反應，利用胺解(aminolysis)從酯鍵轉換為醯胺鍵。藉此可利用醯胺鍵導入疏水性側鏈。又，首先依成為所需醯胺化率的方式，在有機溶劑中，將1-辛胺等一級胺添加於聚乙二醇-共聚天冬胺酸苄酯中，經使進行既定時間反應後，再對未轉換的苄酯添加過大剩量的1,8-二胺基辛烷等，亦可成為疏水性基的末端被胺基取代的疏水性側鏈、與未被胺基取代的疏水性側鏈混雜之聚(胺基酸衍生物)鏈段。
骨架高分子單元α的其他較佳具體例，係可依以下一般式(III)及 (IV)所示：
上述式中，R1'係表示羥基、碳數1~12之未取代或取代的直鏈或分支狀烷氧基、碳數2~12之未取代或取代的直鏈或分支狀烯氧基、碳數2~12之未取代或取代的直鏈或分支狀炔氧基、或碳數1~12之未取代或取代的直鏈或分支狀烷基取代亞胺基；R2'係表示氫原子、碳數1~12之未取代或取代的直鏈或分支狀烷基、或碳數1~24之未取代或取代的直鏈或分支狀烷基羰基；R3a、R3b、R4a及R4b係表示相互獨立的亞甲基或伸乙基；R5a及R5b係表示相互獨立的-O-或-NH-；R6a及R6b係表示相互獨立的碳數6~27之飽和或不飽和直鏈或分支狀脂肪族烴基、碳數6~27之芳香族烴基、或固醇基(steryl)；R7a及R7b係相互獨立，從下述基：-NH-(CH2)p1-〔NH-(CH2)q1-〕r1NH2 (i)；-NH-(CH2)p2-N〔-(CH2)q2-NH2〕2 (ii)；-NH-(CH2)p3-N{〔-(CH2)q3-NH2〕〔-(CH2)q4-NH-〕r2H} (iii)；及-NH-(CH2)p4-N{-(CH2)q5-N〔-(CH2)q6-NH2〕2}2 (iv)所構成之群組中選擇相同或不同的基， 其中，p1~p4、q1~6、及r1~2分別係相互獨立的1~5之整數；R8'係表示從離胺酸、鳥胺酸、精胺酸、高精胺酸(homoarginine)、及組胺酸所構成之群組中選擇的胺基酸側鏈；m'係5~80的整數；n'係0~m'的整數；x'係0~20的整數；y'係0~x'的整數；z'係0~20的整數；但，x'與z'的和係1以上且20以下，上述各重複單元的鍵結順序係任意，R6a、R6b、R7a、R7b及R8'係在1個聚胺基酸內的各胺基酸殘基中可任意選擇；L1'及L3'係相互獨立的-S-S-或價鍵(Valence Bond)；L2'係-NH-、-O-、-O(CH2)p5-NH-、或-L2a-(CH2)q7-L2b-；其中，p5及q7係相互獨立的1~5之整數；L2a係OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH或COO；L2b係NH或O；L4'係-OCO-(CH2)p6-CO-、-NHCO-(CH2)p7-CO-、或-L4a-(CH2)q8-CO-；其中，p6、p7、及q8係相互獨立的1~5之整數；L4a係OCONH、-CH2NHCO-、NHCOO、NHCONH、CONH或COO；R9'及R10'係相互獨立的氫原子或未取代或取代的碳數1~12之直鏈或分支狀烷基；k'係表示30~20,000的整數。
上述式(III)及(IV)中，由R1'及R2'基所定義的碳數1~12之直鏈或分支狀烷氧基、烷基取代亞胺基、及烷基的烷基部分，係可列舉例如： 甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、第二丁基、第三丁基、正己基、癸基、及十一烷基等。碳數2~12的直鏈或分支狀烯氧基、或碳數2~12的直鏈或分支狀炔氧基中之烯基或炔基部分，係可列舉碳數達2以上的上述所例示之烷基中含有雙鍵或三鍵者。
針對此種基或部分，作為「被取代」時的取代基並無限定，係可列舉：C1-6烷氧基、芳氧基、芳基C1-3氧基、氰基、羧基、胺基、C1-6烷氧羰基、C2-7丙烯醯胺基、三-C1-6烷基矽烷氧基、矽烷氧基、矽烷胺基，或可列舉：縮醛化甲醯基、甲醯基、鹵原子(例如氯及氟)。此處，例如C1-6的表示係指碳數1~6，以下使用同樣的涵義表示。又，碳數1~24的未取代或取代直鏈或分支狀烷基羰基內，碳數1~12的未取代或取代直鏈或分支狀烷基部分係可參考上述例示，碳數13以上的烷基部分係可列舉例如：十三烷基、十四烷基、十五烷基、十九烷基、廿二烷基及廿四烷基等。
具有R3a、R3b、R4a、及R4b基的重複單元的鍵結順序係任意，可為無規結構、亦可為嵌段結構。當R3a及R3b二者均表示伸乙基的情況，具代表性的係表示n'為整數0、或m'-n'為整數0的聚胺基酸。前者係例如表示利用麩胺酸γ-苄酯的N-羧酸酐聚合而獲得的聚-α-麩胺酸，後者係例如表示生產納豆菌等細菌芽孢桿菌(Bacillus)屬菌株的聚-γ-麩胺酸。另一方面，當R3a及R3b二者均表示亞甲基的情況，可了解係具有該等基的各個重複單元能共存者。關於R4a及R4b亦同。就製造效率的觀點，較佳係R3a及R3b為伸乙基、R4a及R4b為亞甲基。
當針對R6a及R6b基所定義的脂肪族烴基係飽和的情況，上述飽和的脂肪族烴基係相當於碳數6~27的烷基。上述烷基係可列舉例如：己基(例如正己基)、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、廿烷基(icosyl)、廿烷基(eicosyl)、廿一烷基(henicosyl)、廿一烷基、廿二烷基、廿三烷基、廿四烷基、廿五烷基、廿六烷基、及廿七烷基。當針對R6a及R6b基所定義的脂肪族烴基係不飽和的情況，上述不飽和的脂肪族烴基係可列舉例如上述所例示之烷基鏈中，1~5個碳-碳單鍵成為碳-碳雙鍵之基。
針對R6a及R6b基所定義的碳數6~27之芳香族烴基係可列舉：芳基、芳烷基等。該等的較佳具體例係可列舉：苯基、萘基、甲苯基、二甲苯基、苄基、苯乙基等。
針對R6a及R6b基所定義之源自固醇基的固醇，係指以環戊酮氫菲環(C17H28)為基礎的天然、半合成或合成化合物、以及該等的衍生物。天然的固醇並無限定，可列舉例如：膽固醇、膽甾烷醇、二氫膽固醇(dihydrocholesterol)、膽酸、菜油固醇(campesterol)、植物固醇(sitosterol)等。半合成或合成的固醇係可列舉例如上述天然固醇的合成先質(當視需要而存在的情況，包括有既定官能基、羥基之一部分或全部，利用該技術領域已知的羥保護基進行保護、或羧基經利用羧保護進行保護的化合物)。又，固醇衍生物於不致對本發明目的造成不良影響之範圍內，亦可在環戊酮氫菲環中導入C1-12烷基、及/或鹵原子(例如氯、溴、氟)。該環系係可為飽和、亦可為部分不飽和。上述源自固醇基的固醇 較佳係膽固醇、膽甾烷醇、二氫膽固醇、膽酸、菜油固醇、植物固醇等源自動植物油的固醇，更佳係膽固醇、膽甾烷醇、二羥膽固醇，特佳係膽固醇。
針對R7a及R7b基所定義之從-NH-(CH2)p1-〔NH-(CH2)q1-〕r1NH2 (i)；-NH-(CH2)p2-N〔-(CH2)q2-NH2〕2 (ii)；-NH-(CH2)p3-N{〔-(CH2)q3-NH2〕〔-(CH2)q4-NH-〕r2H} (iii)；及-NH-(CH2)p4-N{-(CH2)q5-N〔-(CH2)q6-NH2〕2}2 (iv)所構成之群組中選擇的基，較佳係相同的基，更佳係式(i)的基。又，p1~p4及q1~6較佳係分別相互獨立的2或3、更佳係2。另一方面，r1及r2較佳係分別相互獨立的1~3的整數。
m'-n'及n'係表示疏水性胺基酸殘基的重複數，x'-y'、y'、及z'係表示陽離子性胺基酸殘基的重複數。陽離子性胺基酸殘基的重複數(x'+z')相對於胺基酸殘基的重複數總數(m'+x'+z')的比例，係例如20%以上、較佳係35%以上。上述比例係例如80%以下、較佳係60%以下、更佳係50%以下。x'較佳係1~20、進而較佳係1~15、更佳係1~10、特佳係1~5。當x'達1以上的情況，本發明的聚胺基酸成為至少具有上述R7a或R7b基。該結構的骨架高分子單元α若被導入於胞內體(endosome)內(pH5.5)而導致pH下降，便會更加進行陽離子性聚胺基酸的質子化，藉由發揮緩衝效應(或質子海綿效應)，便可促進由利用細胞吞噬作用同時導入的高分子微胞醫藥組成物，所造成之輸送對象藥物的胞內體脫離(endosome escape)。
式(III)及(IV)所示之骨架高分子單元α的聚胺基酸鏈段中，各重複單元的鍵結順序係任意，可為無規結構、亦可為嵌段結構。若陽離子性聚胺基酸係屬於含有由上述陽離子性胺基酸殘基所構成之鏈段、與由疏水性胺基酸殘基所構成之鏈段的嵌段型，便會形成分別使會誘發細胞吞噬作用的機能單元、與會誘發胞內體脫離的機能單元集合的大機能單元群，故能更確實地誘發機能。
上述L1'及L3'係相互獨立的-S-S-或價鍵。另一方面，L2'係-NH-、-O-、-O(CH2)p5-NH-、或-L2a-(CH2)q7-L2b-，其中，p5及q7係相互獨立的1~5整數；L2a係OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH或COO；L2b係NH或O。又，L4'係-OCO-(CH2)p6-CO-、-NHCO-(CH2)p7-CO-、或-L4a-(CH2)q8-CO-，其中，p6、p7、及q8係相互獨立的1~5整數；L4a係OCONH、-CH2NHCO-、NHCOO、NHCONH、CONH或COO。上述定義中，L1'及L2'的組合、以及L3'及L4'的組合必須係能一起成為1個連接基的組合。例如當L2'為-NH-的情況，L1'便非為-S-S-，而是價鍵。上述組合較佳係當L1'或L3'為-S-S-時形成連接基之組合。
由R9'及R10'基所定義之碳數1~12的直鏈或分支狀烷基，係可列舉與由R1'及R2'基所定義之碳數1~12的直鏈或分支狀烷氧基、烷基取代亞胺基、及烷基之烷基部分為同樣的基。又，其取代基亦同。
表示乙二醇(或氧乙烯)之重複數的k'係表示例如30~20,000、較佳 係40~2,000、更佳係50~1,000的整數。
骨架高分子單元α係例如將上述陽離子性聚胺基酸與親水性聚合物，直接、或視需要依使分子量分佈變狹窄的方式進行精製後，再利用公知的方法進行偶合便可形成。又，例如一般式(III)的嵌段共聚物係藉由使用能賦予R9'的起始劑進行陰離子活性聚合，而形成聚乙二醇鏈後，於成長末端側導入胺基，再從該胺基末端使β-苄基-L-天冬胺酸鹽、γ-苄基-L-麩胺酸鹽、Nε-Z-L-離胺酸等受保護之胺基酸的N-羧酸酐(NCA)進行聚合，再於所獲得之聚胺基酸的側鏈導入陽離子性基便可製造。另外，如上述，在陽離子性聚胺基酸的合成過程中，會有胺基酸酯殘基之一部分產生因聚胺的親核性攻擊(nucleophilic attack)所造成之結構變化(例如因胺基酸酯殘基的脫醇而形成醯亞胺環)的情況，但本說明書中，關於含有經由此種結構變化之殘基的嵌段共聚物，亦視同包括於上述一般式(III)及(IV)內。又，陽離子性胺基酸殘基中之一部分的NH基及NH2基，會有因合成過程中酸的使用(主要為鹽酸)而成為鹽(主要為鹽酸鹽)的情況，但本說明書中關於含有此種結構的嵌段共聚物亦視同包括於上述一般式(III)及(IV)內。
一般式(III)及(IV)所示之骨架高分子單元α的聚胺基酸鏈鏈段，係例如利用其本身公知的β-苄基-L-天冬胺酸鹽、γ-苄基-L-麩胺酸鹽、Nε-Z-L-離胺酸等受保護之胺基酸的N-羧酸酐(NCA)之聚合，而製造聚胺基酸酯，接著使用R7a、R7b、及R8'基所對應的聚胺進行胺解，而在聚胺基酸的側鏈導入陽離子性基，藉此便可製造。
一實施形態係在將γ-苄基-L-麩胺酸鹽進行聚合後，再使β-苄基-L-天冬胺酸鹽進行聚合，接著藉由與二伸乙三胺(DET)等胺化合物進行反應，而優先對聚(β-苄基-L-天冬胺酸鹽)進行酯醯胺交換反應，便在天冬胺酸側鏈導入DET基等胺殘基。其結果可獲得由源自側鏈經導入陽離子性基的天冬胺酸之陽離子性胺基酸殘基鏈段、與源自側鏈經導入苄基的麩胺酸之疏水性胺基酸殘基鏈段構成的嵌段型陽離子性聚胺基酸。另一方面，若使β-苄基-L-天冬胺酸鹽與γ-苄基-L-麩胺酸鹽同時進行聚合，接著再與二伸乙三胺(DET)等胺化合物進行反應，便可獲得源自側鏈經導入陽離子性基的天冬胺酸之陽離子性胺基酸殘基、與源自側鏈經導入苄基的麩胺酸之疏水性胺基酸殘基，係呈任意配置的無規型陽離子性聚胺基酸。
另外，上述合成過程中，會有胺基酸酯殘基之一部分產生因胺的親核性攻擊而造成之結構變化(例如因胺基酸酯殘基的脫醇而形成醯亞胺環)的情況，但本說明書中，關於含有此種經由結構變化的殘基之嵌段共聚物，亦視同包括於上述一般式(III)及(IV)中。此情況，經由上述結構變化的殘基數，並未包含於陽離子性聚胺基酸殘基數及疏水性胺基酸殘基數中。又，陽離子性胺基酸殘基中之一部分的NH基及NH2基，會有因合成過程中酸的使用(主要為鹽酸)而成為鹽(主要為鹽酸鹽)的情況，但本說明書中，關於含有此種經由結構變化的殘基之嵌段共聚物，亦視同含於上述一般式(III)及(IV)中。即，R7a、R7b、及R8'基中之一部分的NH基及NH2基，亦可成為鹽(例如鹽酸鹽)。
[3.骨架高分子單元β]
骨架高分子單元β係具備有：親水性高分子鏈鏈段與疏水性高分子鏈鏈段，且依該親水性高分子鏈鏈段朝向外側、且該疏水性高分子鏈鏈段朝向內側的狀態呈輻射狀排列。高分子微胞醫藥組成物亦可含有2種以上的骨架高分子單元β。
骨架高分子單元β係可具有結合於疏水性高分子鏈鏈段上的藥物。
骨架高分子單元β較理想係具有較骨架高分子單元α高的疏水性。上述高疏水性係可因上述藥物而引起。例如骨架高分子單元β雖具有較骨架高分子單元α更多的親水性基，但亦可因上述藥物而造成具有較骨架高分子單元α更高的疏水性。
骨架高分子單元β亦可係一般式：A2-B2(-D)所示之藥物與嵌段共聚合體的複合體。A2係聚乙二醇鏈鏈段，B2係聚胺基酸鏈鏈段，D係藥物。
骨架高分子單元β的聚乙二醇鏈鏈段及聚胺基酸鏈鏈段係可例示與骨架高分子單元α的情況為相同者。但，骨架高分子單元β的聚胺基酸鏈鏈段亦可側鏈未具有親水性基。
骨架高分子單元β雖未排除具有標的結合部位之狀態，但具代表性的係含有藥物且未具有標的結合部位之狀態。若高分子微胞醫藥組成物係呈藥物與標的結合部位含於各自之高分子單元中的狀態，當高 分子微胞醫藥組成物在血流中移動至標的細胞附近之前，微胞結構便已崩壞時，便可利用代謝將藥物排出於體外，俾能輕易迴避副作用的產生。又，因為沒有必要在同一嵌段共聚合體上結合著具有標的結合部位之化合物與藥物二者，因而可輕易迴避合成時藥劑或標的結合用化合物的去活化。另外，當使骨架高分子單元β搭載標的結合部位時，較理想係使結合於親水性高分子鏈鏈段的突出末端。
骨架高分子單元β的較佳具體例係可列舉上述一般式(I)及(II)所示之嵌段共聚物。但，關於上述一般式(I)及(II)中的R6，係總數(m+x)的10%以上之R6亦可具有連接基的藥物殘基，有存在時的其餘基係氫原子或疏水性有機基。亦可具有相對於總數(m+x)之連接基的藥物殘基比例較佳係10%~100%、更佳係10%~70%。R6係在1個嵌段共聚物內的各胺基酸單元中各自獨立選擇。骨架高分子單元β的聚胺基酸鏈段中，各重複單元的鍵結順序係任意。
上述藥物係可例示如：核酸(例如：核苷(nucleoside)、DNA、RNA、siRNA及microRNA)、核酸衍生物、疫苗、具有藥理活性的抗體(所謂抗體醫藥)、剋癌易、喜樹鹼(Camptothecin)類、埃博黴素A(Epothilone A)、埃博黴素B、埃博黴素C、埃博黴素D及該等埃博黴素類的衍生物、特癌適(Temsirolimus)、癌伏妥(Everolimus)、曲貝替定(Trabectedin)、伏立諾他(Vorinostat)、醋酸奧曲肽(Octreotide acetate)、邁杜蔥酮(Mitoxantrone，MITX)、長春新鹼(Vincristine)、頭孢力新(Cephalexin)、頭孢可若(Cefaclor)、胺苄青黴素(Ampicillin)、巴氨西林(Bacampicillin)、羥胺芐青黴素(Amoxicillin)、康黴素(Kanamycin)、艾 米康絲菌素(Amikacin)、阿貝卡星(Arbekacin)、待貝卡信(Dibekacin)、希索黴素(Sisomicin)、泰百黴素(Tobramycin)、紅黴素、克拉黴素(Clarithromycin)、洛其他黴素(Rokitamycin)、氯黴素(Chloramphenicol)、梵谷黴素(Vancomycin)、氟康那唑(Fluconazole)、阿糖腺苷(Vidarabine)、阿塞維爾(Acyclovir)、去羥肌苷(Didanosine)、齊多夫定(Zidovudine)、扎西他濱(Zalcitabine)、拉美夫定(Lamivudine)、扎那米韋(zanavir)、奧司他韋(Oseltamivir)、洛匹那韋(Lopinavir)、利托那韋(Ritonavir)。埃博黴素類的衍生物係可例示如：Patupilone、Ixabepilone、BMS-310705、KOS-862、ZK-EPO。
核酸衍生物係可例示如：吉西他濱(Gemcitabine)、奈拉濱(Nelarabine)、氯法拉濱(Clofarabine)、地西他濱(Decitabine)、鏈黴佐菌素(Streptozocin)、去氧氟尿苷(Doxifluridine，5'-去氧-5-氟尿苷)、氟達拉濱(Fludarabine)。核酸係經由例如共價鍵及/或靜電鍵(electrostatic bond)能與骨架高分子單元β結合。核酸衍生物亦可為鹽，但當利用酯鍵而結合於骨架高分子單元β時，較佳係不要為鹽。
上述藥物與嵌段共聚物單元係可經由例如共價鍵及/或靜電鍵相結合。上述共價鍵係可列舉例如單鍵及2價連接基。上述2價連接基係可列舉例如亦可含有醯胺鍵、酯鍵、醚鍵、及/或醯肼鍵的碳數0~5之2價連接基。上述2價連接基較佳係酯鍵、醯胺鍵、及醯肼鍵。
上述鍵結態樣係1個上述藥物與1個嵌段共聚物單元，可經由1個共價鍵或靜電鍵相結合，亦可經由2個以上的共價鍵及/或靜電鍵相 結合。又，亦可1個上述藥物與2個以上的嵌段共聚物單元，依經由2個以上共價鍵及/或靜電鍵的狀態相結合(即2個以上嵌段共聚物單元係依經由1個藥物交聯的狀態相結合)。
當藥物中存在有複數羥基的情況，骨架高分子單元β係可形成該羥基之1個以上利用酯鍵結於聚胺基酸側鏈之羧基上的結構。本說明書中，關於1個藥物利用酯鍵結於聚胺基酸側鏈中之複數羧基上的結構、以及2個以上嵌段共聚合體部分經由1個藥物交聯的結構，均視同包含於骨架高分子單元β內。
上述酯鍵係可列舉例如：利用具有羥基的藥物、與具有羧基的嵌段共聚物單元間之反應而形成的酯鍵、以及利用具有羧基的藥物、與具有羥基的嵌段共聚物單元間之反應而形成的酯鍵。
上述醯胺鍵係可列舉例如：利用屬於胺的藥物、與具有酯基的嵌段共聚物單元間之反應而形成的醯胺鍵、以及利用具有胺基的藥物、與具有羧基的嵌段共聚物單元間之反應而形成的醯胺鍵。
上述醯肼鍵係可列舉例如利用在嵌段共聚物單元的醯肼基上結合具有酮結構之藥物而形成的醯肼鍵。
[4.骨架高分子單元γ]
上述高分子微胞醫藥組成物亦可更進一步含有：具備標的結合部位所結合的親水性高分子鏈鏈段、與疏水性高分子鏈鏈段，且依該親 水性高分子鏈鏈段朝外側、該疏水性高分子鏈鏈段朝內側的狀態，一起與上述嵌段共聚物單元α及β呈輻射狀排列的嵌段共聚物單元γ(骨架高分子單元γ)。骨架高分子單元γ係可依上述標的結合部位朝外側的狀態排列。
骨架高分子單元γ較理想係具有能形成高分子微胞之粒子骨架程度的疏水性力(硬度)，更具體而言，較理想係具有與骨架高分子單元β相同程度的疏水性力(疏水性結構)。
骨架高分子單元γ的親水性高分子鏈鏈段及疏水性高分子鏈鏈段，分別可例示與骨架高分子單元α的情況為相同者。但，骨架高分子單元γ的疏水性高分子鏈鏈段亦可在側鏈未具有親水性基。
骨架高分子單元γ可係一般式：Z-A3-B3所示之具有標的結合部位之化合物與嵌段共聚合體的複合體。Z係具有標的結合部位之化合物，A3係聚乙二醇鏈鏈段，B3係聚胺基酸鏈鏈段。
具有標的結合部位之化合物係如上述，可例示如：與源自活體及病毒的物質形成鍵結對之蛋白質、肽或糖鏈。此種蛋白質係可例示如：與源自活體及病毒的物質相結合的抗體及其片段、運鐵蛋白、以及上皮生長因子(Epidermal Growth Factor，EGF)。抗體係可例示認知在癌細胞所代表的投藥對象物表面呈高表現的受體、或屬於細胞表面之抗原的EGFR、Her2、CD20、VEGFR及CD52等抗原的抗體。抗體係可為單株抗體、亦可為多株抗體。抗體的片段係只要具有能特異性認知 抗原的長度便可，可例示如(Fab')2及Fab。肽係可例示如：胰島素、LHRH、IGF及該等的衍生物。糖類係可例示如：葡萄糖、甘露糖、半乳糖、及具有海藻糖殘基的糖類。具有標的結合部位之化合物亦可係其本身便能發揮藥理活性的化合物(例如抗體醫藥及疫苗)。
當具有標的結合部位之化合物能形成鍵結對之標的係屬於源自病毒之物質的情況，原本應供應該物質的細胞由於受感染病毒導致細胞膜遭破壞而呈細胞死的狀態，因而無法利用細胞吞噬作用將高分子微胞醫藥組成物導入細胞內。因此，本說明書中，當標的係屬於源自病毒之物質的情況，將在標的周邊所存在的細胞視同供應標的之細胞。當源自病毒的物質係存在於細胞外的情況，由於此種周邊細胞感染病毒的可能性高，因而具有對該周邊細胞供應藥物的意義。
骨架高分子單元γ的聚乙二醇鏈鏈段及聚胺基酸鏈鏈段係可例示與骨架高分子單元α及β的情況為同樣者，形成方法亦同。
骨架高分子單元γ的較佳具體例係可列舉上述一般式(I)及(II)所示之嵌段共聚物。本發明的高分子微胞醫藥組成物亦可含有2種以上的骨架高分子單元γ。但，上述一般式(I)及(II)中，R1及R3係表示具有上述標的結合部位之化合物。又，R6係表示氫原子或疏水性有機基，氫原子相對於總數(m+x)的比例係例如0%~60%、較佳係0%~20%，其餘係疏水性有機基。
骨架高分子單元γ係使聚乙二醇鏈鏈段的α末端具有羥基、羧 基、醛基、胺基、硫醇基、順丁烯二醯亞胺基等連接基的嵌段共聚合體、與具有標的結合部位之化合物，利用縮合或加成反應便可形成。
[5.高分子微胞醫藥組成物之製造方法]
本發明的高分子微胞醫藥組成物係例如將骨架高分子單元α與骨架高分子單元β、或者將骨架高分子單元α與骨架高分子單元β及骨架高分子單元γ溶解於有機溶劑中，將混合而呈均勻化的溶液減壓餾除，在所獲得的聚合物薄膜添加水並混合，藉由自組織化呈微胞狀便可形成。又，例如藉由將該等骨架高分子單元在水性溶液中混合，並自組織化為微胞狀亦可形成。又，例如本發明的高分子微胞醫藥組成物係將骨架高分子單元α、骨架高分子單元β及骨架高分子單元γ先質，溶解於有機溶劑中，將混合而呈均勻化的溶液減壓餾除，在所獲得的聚合物薄膜添加水並混合，自組織化呈微胞狀後，再使具有標的結合部位之化合物鍵結於骨架高分子單元γ先質的親水性鏈段之α末端，而成為骨架高分子單元γ，藉此亦可形成。又，例如使該等骨架高分子單元在水性溶液中混合並自組織化呈微胞狀後，再使具有標的結合部位之化合物結合於骨架高分子單元γ先質的親水性鏈段之α末端，而形成骨架高分子單元γ，藉此亦可形成。上述有機溶劑係可列舉例如甲醇及丙酮。上述水性溶液係例如將乙醇及二甲亞碸等水混合性有機溶劑、與公知的緩衝劑添加於精製水中便可形成。
[實施例]
以下，利用實施例針對本發明進行更詳細說明。本發明並不因該等實施例而受任何限定。
(實施例1)
具有標的結合部位之化合物係具有賀癌平(Herceptin)，而藥物係內含有剋癌易(docetaxel，DTX)，屬於高分子微胞製劑的賀癌平結合剋癌易(DTX)微胞，依下述的方式形成。
(骨架高分子單元α)
骨架高分子單元α係使用聚乙二醇-聚麩胺酸苄酯共聚合體(但，將聚麩胺酸的單邊末端施行乙醯化者、PEG的平均分子量(Da)為10000、麩胺酸的平均殘基數為40、側鏈羧酸的氫原子中有60%被苯基取代。以下有稱為「PEG-PBLG(OBn：60%)」的情況)。
(骨架高分子單元β)
作為骨架高分子單元β的PEG-pAsp-DTX係依下述的方式製造。使聚天冬胺酸的單邊末端呈被乙醯化狀態的500mg聚乙二醇-聚天冬胺酸嵌段共聚合體(PEG-pAsp-Ac)，溶解於10mL無水DMF(關東化學)後，進一步添加1.06g剋癌易(ScinoPharm Taiwan Ltd.)。另外，該PEG-pAsp-Ac中PEG的平均分子量(Da)係10000、天冬胺酸的平均殘基數係40、天冬胺酸的側鏈係羧酸。接著，依照160mg的4-二甲胺基吡啶(和光純藥)、210μL的N,N'-二異丙基碳二醯亞胺(國產化學)之順序添加，於室溫中攪拌一晚。將依此獲得的反應液滴下於己烷與醋酸乙酯的混合溶液(體積比1：1)500mL中，而使聚合物晶析後，將該聚合物施行減壓濾集。將利用濾集獲得的聚合物懸浮於100mL精製水中而形成高分子微胞，再施行超過濾(Millipore公司製實驗室規模TFF系 統、分子量截取值：100000，經稀釋5倍後，濃縮為100mL)。重複施行該超過濾操作計5次後，施行凍結乾燥。將利用凍結乾燥而獲得的聚合物，依溶解於10mL無水DMF的狀態滴下於己烷與醋酸乙酯的混合溶液(體積比1：1)500mL中，而使聚合物晶析後，將該聚合物施行減壓濾集。經濾集而獲得的聚合物在維持粉末狀態下，添加於己烷與醋酸乙酯的混合溶液(體積比1：1)100mL中，藉此洗淨後，施行減壓濾集。將利用濾集的聚合物於室溫中施行1晚減壓乾燥，藉此便獲得淡黃色粉末的530mg之PEG-pAsp-DTX。
使1mg的PEG-pAsp-DTX溶解於精製水與乙醇的混合溶液(體積比1：1)10mL中，從相對於波長233nm光線的吸光度測定剋癌易含有量的結果，每1聚合物係14.3分子。該PEG-pAsp-DTX係呈剋癌易經由酯鍵結合於PEG-pAsp-Ac的狀態。PEG的鏈長係10kDa。
(順丁烯二醯亞胺鍵結聚合物)
準備PEG末端具有順丁烯二醯亞胺基的順丁烯二醯亞胺-聚乙二醇-聚麩胺酸共聚合體(但，將聚麩胺酸的單邊末端施行乙醯化者、PEG的平均分子量(Da)為10000、麩胺酸的平均殘基數為40、側鏈羧酸的氫原子全部被苯基取代)。以下有稱為「Maleimide-PEG-PBLG」的情況。
(微胞之形成)
將PEG-PBLG(OBn：60%)、PEG-pAsp-DTX、及Maleimide-PEG-PBLG，依重量比4：5：1分別精秤於小玻璃瓶中，添加甲醇或丙酮並溶解。將各溶液混合後，利用旋轉式蒸發器(BUCHI 製、Rotavapor R-205、Vac(R)V-513)施行溶劑餾除而形成混合聚合物的薄膜，進一步進行一晝夜乾燥。添加100mM PBS(pH7.4)而使薄膜分散後，使用Nanovater(吉田機械興業製、NM2-L200)施行高壓分散處理而獲得微胞。該微胞分層中含有由PEG-PBLG(OBn：60%)、PEG-pAsp-DTX、及Maleimide-PEG-PBLG呈輻射狀排列的微胞。
(賀癌平與順丁烯二醯亞胺的反應)
在相對於Maleimide-PEG-PBLG裝入莫耳比0.4之賀癌平的小玻璃瓶中，添加精製水而製備賀癌平溶液。依該賀癌平溶液的硼酸緩衝液之最終濃度成為50mM、EDTA之最終濃度成為1mM的方式，更進一步添加10mg/mL的Traut試劑(Pierce公司)後，於30℃下靜置45分鐘。接著，將依此獲得的反應液施行凝膠過濾精製[GE Sciences公司製PD-10、析出液：100mM磷酸鈉緩衝液(pH7.4)、1mMEDTA]，並回收高分子分層。
將該回收液與上述微胞分層混合，藉由於30℃下靜置2小時，使Maleimide-PEG-PBLG的順丁烯二醯亞胺基與賀癌平產生反應，而形成含有作為骨架高分子單元γ之賀癌平結合聚合物的微胞。藉由依此所獲得之膜分級反應液施行超過濾精製(Millipore公司製、Amicon Ultra-15、濾過分數：300,000)而除去未反應的賀癌平，獲得含有具PEG-PBLG(OBn：60%)之賀癌平結合剋癌易微胞的溶液。微胞溶液中的剋癌易含量係2.154mg/mL。
(比較例1)
除PEG-pAsp-DTX與Maleimide-PEG-PBLG係使用重量比9：1，且未使用PEG-PBLG(OBn：60%)之外，其餘均與實施例1同樣地獲得含有賀癌平結合剋癌易微胞的溶液。微胞溶液中的剋癌易含量係1.273mg/mL。
(比較例2)
僅使用PEG-pAsp-DTX獲得含有剋癌易微胞的10%蔗糖溶液。微胞溶液中的剋癌易含量係3.486mg/mL。
〔細胞毒性試驗1〕
針對由實施例1之具有PEG-PBLG(OBn：60%)的賀癌平結合剋癌易微胞所造成之細胞毒性、與由比較例1的賀癌平結合剋癌易微胞、及比較例2的剋癌易微胞所造成之細胞毒性進行比較。由各樣品所造成的細胞毒性係使用透過住商醫藥國際股份有限公司，從ATCC購買之源自人類前列腺癌的PC-3細胞(HER2陰性)，根據WST法依下述的方式進行評價。
在96孔培養盤中，依每1孔含有約5000個PC-3細胞的方式，將該細胞依懸浮於90μL培養基的狀態傳代，在37℃、5%CO2的環境下培養一晚。培養基係使用RPMI1640(GibCoTM Invitrogen)與10%FBS(biowest公司)。接著，將各樣品依成為各種剋癌易濃度的方式，將經培養基稀釋過的溶液添加於各孔中(每1孔為10μL)，於37℃、5%CO2的環境下培養72小時。其後，添加WST Reagent(同仁)(每1孔為10μL)。於37℃、5%CO2的環境下持續培養約2小時。從各孔測定 相對於波長450nm光線的吸光度(Abs450)，根據下述數式計算出細胞生長率(% Cell Growth)。另外，該數式中控制的Abs450值係指使用未含剋癌易的培養液，而從實施上述培養的孔所獲得的吸光度。
剋癌易濃度係設定為0.05ng/mL、0.14ng/mL、0.41ng/mL、1.23ng/mL、3.7ng/mL、11.1ng/mL、33.3ng/mL、及100ng/mL。縱軸係細胞生長率(%)、橫軸係剋癌易濃度(ng/mL)，將結果施行對數近似，計算出IC25(25%抑菌濃度(ng/mL)。將結果示於表1。
另外，以下記載細胞毒性試驗1的數據具體例。
(剋癌易換算濃度3.7ng/mL的情況)
PC-3細胞的細胞生長率(%)係81.9%(實施例1)、106%(比較例1)、109%(比較例2)。
(剋癌易換算濃度11.1ng/mL的情況)
PC-3細胞的細胞生長率(%)係46.5%(實施例1)、59.6%(比較例1)、62.4%(比較例2)。
(剋癌易換算濃度33.3ng/mL的情況)
PC-3細胞的細胞生長率(%)係24.6%(實施例1)、30.0%(比較例1)、33.9%(比較例2)。
〔細胞毒性試驗2〕
除：使用透過住商醫藥國際股份有限公司，從ATCC購買的源自人類胃癌之NCI-N87細胞(HER2陽性)，及每1孔設為約10000個NCI487細胞，及將剋癌易濃度設為0.5ng/mL、1.4ng/mL、4.1ng/mL、12.4ng/mL、37.0ng/mL、111.1ng/mL、333.3ng/mL、及1000.0ng/mL，以及在37℃、5%CO2的環境下培養1小時，其後從孔內除去培養基，利用磷酸緩衝生理食鹽水(PBS)將孔內洗淨2次後，再添加新鮮培養基(每1孔為100μL)，持續培養直到總培養時間成為72小時為止之外，其餘均施行與細胞毒性試驗1同樣的實驗，並計算出IC25(25%抑菌濃度(ng/mL))。將結果示於表1。
另外，以下記載細胞毒性試驗2的數據具體例。
(剋癌易換算濃度37.0ng/mL的情況)
NCI-N87細胞的細胞生長率(%)係82.6%(實施例1)、92.9%(比較例1)。
(剋癌易換算濃度111.1ng/mL的情況)
NCI-N87細胞的細胞生長率(%)係73.0%(實施例1)、88.0%(比較例1)。
由上述結果得知，具有PEG-PBLG(OBn：60%)的高分子微胞醫藥 組成物(實施例1)，相較於未具有PEG-PBLG(OBn：60%)的高分子微胞醫藥組成物(比較例1及2)之下，可依特別低濃度域發揮殺細胞效果。因為上述結果係無關細胞的賀癌平抗原有無而進行觀察，因而由PEG-PBLG(OBn：60%)的混合所造成之有利作用，可認為並非因具有標的結合部位之骨架高分子單元γ的有無而發揮。又，由於高分子微胞醫藥組成物的粒子結構之維持/崩壞被認為係屬作用機制的關鍵，因而認為對內含的藥物並沒有特別限制。
[抗腫瘤效果確認試驗]
HER2陽性人類胃癌NCI-N87細胞係從ATCC透過住商醫藥國際股份有限公司購買。使用RPMI1640+10%FBS培養基，在5% CO2下，於37℃中進行培養，使生長至移植所必要的細胞數為止。將細胞懸浮於生理食鹽水中，調製成為6.0×107cells/mL。在該細胞懸浮液中等量添加冰冷的細胞培養用基質(日本Becton,Dickinson股份有限公司製、商品名「BD Matrigel」(註冊商標))(細胞濃度：3.0×107cells/mL)。依雄性裸鼠(Balb nu/nu、6週齡、Charles River Laboratories Japan股份有限公司製)每1隻為3.0×106個/100μL的方式接種於右側腹部皮下。其後，飼養裸鼠15天，在腫瘤體積成為約130mm3時投給藥劑。依剋癌易換算為7mg/kg的投藥量，將實施例1的微胞與比較例1的微胞施行單次尾靜脈內投藥。又，比較例3係投藥屬於介質的10%蔗糖液。各實施例及各比較例均使用1組為5例的動物。在微胞製劑剛投藥前及經投藥後第10天，測定裸鼠的腫瘤體積及體重，並測定經投藥後第10天相對於微胞製劑剛投藥前的腫瘤體積及體重之相對值。將結果示於表2。
由表2所示結果得知，若投藥具有PEG-PBLG(OBn：60%)的高分子微胞醫藥組成物(實施例1)，相較於投藥未具有PEG-PBLG(OBn：60%)的高分子微胞醫藥組成物(比較例1)之情況、及投藥介質的情況(比較例3)下，在實現小鼠的體重變化沒有差異之狀態的同時，能明顯抑制人類胃癌NCI-N87細胞的生長。
(試驗例1) (經Alexa488標幟的SH化賀癌平之調製)
在1.5mL微管中分取賀癌平製劑(22mg/mL)1mL。為除去製劑中所含的組胺酸，而施行凝膠過濾精製(GEGE Healthcare Japan股份有限公司製、商品名「PD-10」)。使用分光光度計，施行280nm下抗體的濃度測定，以成為10mg/mL的方式調製。使用Alexa488標幟化套組(Life Technologies公司製、商品名「Alexa Fluor 488 Protein Labeling Kit」)，依照附錄所記載的協定(protocol)將抗體中的胺基標幟化。未反應的標幟試藥(螢光素衍生物)係使用PD-10除去，再度利用分光光度計施行抗體的濃度計算(280nm及494nm)。相對於經Alexa488標幟的賀癌平100重量份，添加20當量的10mg/mL Traut's Reagent溶液(1mM EDTA硼酸緩衝液(pH8.0))。利用Traut's Reagent進行的SH化反應係在水浴中，於30℃下施行45分鐘，待反應結束後，使用PD-10除去過剩量的Traut's Reagent。以下將此狀態下經Alexa488標幟的SH化賀癌平，記為「Alexa-Hereeptin-SH」。
(微胞之形成)
計量PEG-PBLG(OBn：100%)90mg與Maleimide-PEG-PBLG 10mg(依序含有量9：1)，利用甲醇或丙酮溶解各聚合物。各聚合物溶液在100mL茄型燒瓶中混合及均勻化，利用蒸發器餾除有機溶劑，便獲得混合聚合物的薄膜狀非晶質。在所獲得的聚合物薄膜約100mg中添加10mL的PBS，並使用超音波裝置使溶解。上述溶液使用高壓分散裝置(吉田機械興業股份有限公司製：Nanovater NM2-L200)施行高分子微胞化，獲得10mg/mL混合高分子微胞溶液。針對利用高壓分散處理所獲得的該微胞溶液，利用動態光散射光度計施行粒徑測定。
(Alexa-Hereeptin-SH與順丁烯二醯亞胺的反應)
依上述所獲得之Alexa-fiercepurl-SH溶液0.75mL(賀癌平係1.5mg分)、與上述10mg/mL的混合高分子微胞溶液4mL，使用冷凍小瓶(cryogenic vial)混合，於30℃下進行2小時反應(Maleimide-PEG-PBLG中的順丁烯二醯亞胺與SH化賀癌平的加成反應)。待反應後，於4℃下保管一晚後，施行粒徑測定。為除去反應液中所含之未反應的Alexa-fierceptin-SH，便使用離心超過濾過濾器(Merck Millipore公司製、商品名「Amicon Ultra Ultraeel-100k：100,000MWCO」)，於4℃下，依3000rpm施行5倍濃縮計3次。在經離心超過濾後的上澄液中，相對於理論量的順丁烯二醯亞胺，添加5當量的10mg/mL L-半胱胺酸PBS溶液，於室溫下進行30分鐘反應，而施行微胞中未反應的順丁烯 二醯亞胺部分之驟冷(quench)。為除去過剩量的L-半胱胺酸，便施行凝膠過濾精製(GE Healthcare Japan股份有限公司製、商品名「PD-10」)。此時利用作為析出液的10%蔗糖水溶液(w/v)施行溶液取代，俾防止微胞凝聚。針對所獲得之抗體結合微胞溶液，施行過濾滅菌(過濾器孔洞尺寸：0.22μm)及分注操作，而結束經Alexa488標幟的賀癌平結合微胞製劑的調製。最終製劑的粒徑係使用動態光散射光度計實施。該微胞製劑係相當於骨架高分子單元α含有率為0質量%、骨架高分子單元β含有率為90質量%、骨架高分子單元γ含有率為10質量%的態樣。另外，亦可另稱為含有疏水性鏈段鏈之親水性基保有率0%的擬似單元α 40質量%、含有單元β為50質量%的態樣。
(試驗例2)
除使用PEG-PBLG(OBn：76.8%)10mg、與PEG-PBLG(OBn：100%)80mg、及Maleimide-PEG-PBLG 10mg(依序含有量1：8：1)之外，其餘均與試驗例1同樣地調製經Alexa488標幟的賀癌平結合微胞製劑。該微胞製劑係相當於骨架高分子單元α含有率為10質量%、單元α的疏水性鏈段鏈之親水性基保有率為23.2%的態樣。又，該微胞製劑係與下述試驗例4同樣地相當於骨架高分子單元β含有率為80質量%、骨架高分子單元γ含有率為10質量%的態樣。
(試驗例3)
除使用PEG-PBLG(OBn：76.8%)40mg、PEG-PBLG(OBn：100%)50mg、及Maleimide-PEG-PBLG 10mg(依序含有量4：5：1)之外，其餘均與試驗例1同樣地調製經Alexa488標幟的賀癌平結合微胞製 劑。該微胞製劑係相當於骨架高分子單元α含有率為40質量%、單元α的疏水性鏈段鏈之親水性基保有率為23.2%的態樣。又，該微胞製劑係與下述試驗例5同樣地相當於骨架高分子單元β含有率為50質量%、骨架高分子單元γ含有率為10質量%的態樣。
(試驗例4)
除使用PEG-PBLG(OBn：60.6%)10mg、PEG-PBLG(OBn：100%)80mg、及Maleimide-PEG-PBLG 10mg(依序含有量1：8：1)之外，其餘均與試驗例1同樣地調製經Alexa488標幟的賀癌平結合微胞製劑。該微胞製劑係相當於骨架高分子單元α含有率為10質量%、單元α的疏水性鏈段鏈之親水性基保有率為39.4%的態樣。
(試驗例5)
除使用PEG-PBLG(OBn：60.6%)40mg、PEG-PBLG(OBn：100%)50mg、及Maleimide-PEG-PBLG 10mg(依序含有量4：5：1)之外，其餘均與試驗例1同樣地調製經Alexa488標幟的賀癌平結合微胞製劑。該微胞製劑係相當於骨架高分子單元α含有率為40質量%、單元α的疏水性鏈段鏈之親水性基保有率為39.4%的態樣。
(試驗例6)
除使用PEG-PBLG(OBn：60.6%)20mg、PEG-PBLG(OBn：100%)70mg、及Maleimide-PEG-PBLG 10mg(依序含有量2：7：1)之外，其餘均與試驗例1同樣地調製經Alexa488標幟的賀癌平結合微胞製劑。該微胞製劑係相當於骨架高分子單元α含有率為20質量%、單元 α的疏水性鏈段鏈之親水性基保有率為39.4%的態樣。又，該微胞製劑係相當於骨架高分子單元β含有率為70質量%、骨架高分子單元γ含有率為10質量%的態樣。
(微胞製劑導入於細胞的試驗)
依每1.5mL微管含有約250000個NCI-N87細胞的方式，將該細胞依懸浮於90μL培養基的狀態添加。培養基係使用RPMI1640(GibcoTM,Invitrogen)與10%FBS(biowest公司)。依賀癌平的最終濃度成為4μg/mL的方式，在各試管中添加試驗例1~6的微胞製劑，於37℃、5%CO2的環境下培養2小時。細胞利用PBS洗淨2次，再利用2%三聚甲醛/PBS固定細胞，使用流式細胞儀(日本Becton,Dickinson股份有限公司製、商品名「BD AccuriTM C6流式細胞儀」)，測定螢光強度(FL1-A)。將所獲得之螢光強度值修正為高分子微胞濃度整合至一定的數值，評價微胞製劑朝各細胞的到達量，更具體而言，係評價朝細胞表面的結合量、及朝細胞內的取入量總量。將結果示於圖2。另外，圖2圖表的縱軸係將試驗例1所計算之螢光強度的中央值(median value)設為100%時的相對值。如圖2所示，藉由將因單元α所造成之微胞製劑中疏水性結構部分之親水性程度限制於既定範圍，便可更確實提升微胞製劑朝標的細胞的到達性。
(產業上之可利用性)
本發明係可適當地利用於抗癌劑(anticancer drug)等醫藥製劑等的領域。
11、21、31‧‧‧親水性高分子鏈鏈段
12、22、32‧‧‧疏水性高分子鏈鏈段
23‧‧‧藥物
33‧‧‧標的結合部位
100‧‧‧高分子微胞醫藥組成物

Claims (11)

  1. 一種高分子微胞醫藥組成物，係含有：具親水性高分子鏈鏈段與疏水性高分子鏈鏈段的嵌段共聚物單元α、以及具親水性高分子鏈鏈段與疏水性高分子鏈鏈段的嵌段共聚物單元β；其中，該嵌段共聚物單元α及該嵌段共聚物單元β係依該親水性高分子鏈鏈段朝向外側、且該疏水性高分子鏈鏈段朝向內側的狀態呈輻射狀排列；該嵌段共聚物單元α的該疏水性高分子鏈鏈段係由具有側鏈的重複單元構成；且該側鏈之至少1者係具有親水性基。
  2. 如申請專利範圍第1項之高分子微胞醫藥組成物，其中，上述嵌段共聚物單元α的疏水性高分子鏈鏈段之側鏈20%~80%係具有親水性基。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之高分子微胞醫藥組成物，其中，上述嵌段共聚物單元α係含有15重量%~80重量%。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之高分子微胞醫藥組成物，其中，上述嵌段共聚物單元α及β的親水性高分子鏈鏈段係聚乙二醇鏈，且疏水性高分子鏈鏈段係聚胺基酸鏈。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項之高分子微胞醫藥組成物，其中，更進一步含有：具有標的結合部位所結合之親水性高分子鏈鏈段、與疏水性高分子鏈鏈段的嵌段共聚物單元γ；該嵌段共聚物單元γ係依該親水性高分子鏈鏈段朝向外側、且該疏水性高分子鏈鏈段朝向內側的狀態，一起與上述嵌段共聚物單元α及β呈輻射狀排列。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項之高分子微胞醫藥組成 物，其中，上述嵌段共聚物單元α係以上述疏水性高分子鏈鏈段的側鏈所具有之親水性基為起因而疏水性較上述嵌段共聚物單元β低。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之高分子微胞醫藥組成物，其中，上述嵌段共聚物單元β的疏水性高分子鏈鏈段係由具有側鏈的重複單元構成；上述嵌段共聚物單元α的疏水性高分子鏈鏈段之側鏈所具有之親水性基數，係較上述嵌段共聚物單元β的疏水性高分子鏈鏈段之側鏈所具有之親水性基數多。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項之高分子微胞醫藥組成物，其中，上述嵌段共聚物單元β係結合著藥物。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項之高分子微胞醫藥組成物，其中，上述嵌段共聚物單元α係均未具有標的結合部位及藥物。
  10. 如申請專利範圍第8項之高分子微胞醫藥組成物，其中，上述嵌段共聚物單元β係以上述藥物為起因而疏水性較上述嵌段共聚物單元α高。
  11. 如申請專利範圍第8項之高分子微胞醫藥組成物，其中，上述嵌段共聚物單元β雖具有較上述嵌段共聚物單元α更多的親水性基，但以上述藥物為起因而疏水性較上述嵌段共聚物單元α高。
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