WO2017170846A1 - ポリマーミセル医薬組成物 - Google Patents

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WO2017170846A1
WO2017170846A1 PCT/JP2017/013202 JP2017013202W WO2017170846A1 WO 2017170846 A1 WO2017170846 A1 WO 2017170846A1 JP 2017013202 W JP2017013202 W JP 2017013202W WO 2017170846 A1 WO2017170846 A1 WO 2017170846A1
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integer
block copolymer
polymer micelle
antibody
pharmaceutical composition
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PCT/JP2017/013202
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充訓 原田
義 井上
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ナノキャリア株式会社
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    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol

Definitions

  • the present invention relates to a polymer micelle pharmaceutical composition.
  • Hemiasterin is known as a compound exhibiting antitumor activity against several cell lines. Among these, it is reported that a drug that is a predetermined hemiasterin derivative (for example, a drug called development code E7974) is useful (Patent Document 1).
  • the main purpose of the present invention is, for example, to expand the safety range by drug delivery and further enhance the drug efficacy of E7974.
  • a polymer micelle pharmaceutical composition composed of a block copolymer and loaded with a drug and an antibody or fragment thereof.
  • the drug is represented by the following formula (i).
  • the antibody has a CDR sequence identical to that of trastuzumab or cetuximab.
  • the block copolymer includes a block copolymer unit ⁇ represented by the following formula (I) and a block copolymer unit ⁇ represented by the following formula (II).
  • X represents a residue of the drug bonded directly or via a linking group
  • m is an integer of 30 to 20,000
  • x is an integer of 5 to 100
  • A is an integer from 0 to 100
  • b is an integer from 0 to 100
  • c is an integer from 0 to 100
  • d is an integer from 0 to 100
  • a and c Is an integer of 1 to 200
  • the binding order of each repeating unit in the co-polyamino acid chain segment is arbitrary.
  • A represents a residue of the antibody or fragment thereof
  • n is an integer of 30 to 20,000
  • q is an integer of 5 to 100.
  • a polymer micelle pharmaceutical composition that exhibits a significant effect enhancement as compared to a non-micellar E7974 composition.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of cytotoxicity test 1 in Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of cytotoxicity test 2 in Example 1, Comparative Example 1 and Comparative Example 2. It is a graph which shows the result of having measured the tumor volume of the nude mouse in the anti-tumor effect confirmation test 1 in Example 1, the comparative example 1, and the comparative example 2.
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured the weight of the nude mouse in the anti-tumor effect confirmation test 1 in Example 1, the comparative example 1, and the comparative example 2.
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured the tumor volume of the nude mouse in the antitumor effect confirmation test 2 in Example 2, the comparative example 1, and the comparative example 2.
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured the body weight of the nude mouse in the antitumor effect confirmation test 2 in Example 2, the comparative example 1, and the comparative example 2.
  • the polymer micelle pharmaceutical composition is composed of a block copolymer, and is loaded with a drug and an antibody or fragment thereof.
  • the drug is represented by the following formula (i).
  • the antibody has a CDR sequence identical to that of trastuzumab or cetuximab.
  • the block copolymer includes a block copolymer unit ⁇ and a block copolymer unit ⁇ .
  • the block copolymer may further contain a block copolymer unit ⁇ .
  • the block copolymer unit ⁇ is represented by the following formula (I).
  • X represents a residue of the drug bonded directly or via a linking group.
  • m is an integer of 30 to 20,000.
  • x is an integer of 5 to 100.
  • a is an integer of 0 to 100.
  • b is an integer of 0 to 100.
  • c is an integer of 0 to 100.
  • d is an integer of 0 to 100.
  • the sum of a and c is an integer from 1 to 200.
  • the order of binding of each repeating unit in the co-polyamino acid chain segment is arbitrary.
  • the block copolymer unit ⁇ is represented by the following formula (II).
  • A represents the residue of the antibody or fragment thereof.
  • n is an integer of 30 to 20,000.
  • q is an integer of 5 to 100.
  • the block copolymer unit ⁇ is represented by the following formula (III). s is an integer of 30 to 20,000. t is an integer of 5 to 100. u is an integer of 0 to 30. The order of binding of each repeating unit in the co-polyamino acid chain segment is arbitrary.
  • the block copolymer units ⁇ and ⁇ and, if present, ⁇ are radially arranged with the polyethylene glycol chain segment facing outward.
  • the block copolymer is radially arranged as long as the polyethylene glycol chain segment is directed outward and the copolyamino acid chain segment is aggregated inward. It may be a micelle having a slightly broken radial arrangement structure in which the starting points are not concentrated at one point.
  • the polymer micelle pharmaceutical composition may be one in which a polymer aggregate of a block copolymer is in a dry state.
  • the average particle size (Z-Average) of micelles of the polymer micelle pharmaceutical composition can take any appropriate value.
  • the average particle diameter may be, for example, 10 nm or more, and further may be 20 nm or more.
  • the average particle diameter may be, for example, 300 nm or less, and may be 200 nm or less.
  • the polydispersity index (PDI) of the polymer micelle pharmaceutical composition can take any appropriate value.
  • the polydispersity index may be, for example, 0.01 or more, and may be 0.02 or more.
  • the polydispersity index may be 0.8 or less, for example, and may be 0.5 or less.
  • the content of the block copolymer unit ⁇ in the polymer micelle pharmaceutical composition can take any appropriate value. As said content, it is 20 weight% or more, for example, and is 30 weight% or more, for example. When the content is not less than the predetermined value, it becomes easier to mount a sufficient amount of drug on the polymer micelle pharmaceutical composition. On the other hand, as said content, it is 90 weight% or less, for example, is 80 weight% or less, for example, is 70 weight% or less.
  • the content of the block copolymer unit ⁇ in the polymer micelle pharmaceutical composition can take any appropriate value.
  • the content is, for example, 2.5% by weight or more, and for example, 5% by weight or more.
  • it is 50 weight% or less, for example, is 40 weight% or less, for example, is 30 weight% or less.
  • the content of the block copolymer unit ⁇ in the polymer micelle pharmaceutical composition can take any appropriate value.
  • the content is, for example, 5% by weight or more, and for example, 20% by weight or more.
  • it is 70 weight% or less, for example, and is 60 weight% or less, for example.
  • the block copolymer may contain two or more of each of the above block copolymer units ⁇ and ⁇ and, if present, ⁇ .
  • the drug efficacy of a predetermined hemiasterin derivative can be greatly improved.
  • the mechanism for obtaining such an effect is not clear, but is presumed as follows.
  • polymer micelles tend to stay around target cells due to the EPR effect due to their particle size.
  • the polymer micelle pharmaceutical composition by mounting the antibody or fragment thereof in the polymer micelle pharmaceutical composition, the polymer micelle staying around the target cell can be more easily accumulated locally toward the target cell.
  • the drug can reach the target cell more efficiently because the drug is bound to the reduced aspartic acid side chain of the block copolymer unit ⁇ .
  • both the drug and the antibody or fragment thereof are bound to the same block copolymer unit. There is no need to combine them.
  • the micelle structure of the polymer micelle pharmaceutical composition is collapsed, the drug can be excreted out of the body by metabolism, and it is easy to avoid the occurrence of side effects. Furthermore, it becomes easy to avoid the deactivation of drugs or antibodies during the synthesis of the block copolymer.
  • the block copolymer further includes a block copolymer unit ⁇ , whereby the drug efficacy of the drug can be further improved.
  • the mechanism by which the drug efficacy of the drug is further improved by the block copolymer unit ⁇ is not clear, but is presumed as follows.
  • the block copolymer unit ⁇ is considered to easily leave the micelle.
  • the block copolymer unit ⁇ released from the micelle retained around the target cell is likely to stimulate the cell membrane of the target cell in the vicinity of the retained micelle, and the endocytosis of the target cell is activated.
  • the reachability of the polymer micelle pharmaceutical composition to the target cells is improved, and the drug efficacy of the drug is further improved.
  • the above antibody has a CDR sequence identical to the complementarity determining region (CDR) sequence of trastuzumab or cetuximab. More specifically, the antibody only needs to have the same CDR sequence as at least one of the 6 CDR sequences present in trastuzumab or cetuximab, more precisely, the heavy chain of trastuzumab or cetuximab or It has the same CDR sequence as all three CDR sequences present in the light chain.
  • the antibody may be trastuzumab or cetuximab, or may be a trastuzumab-like antibody or cetuximab-like antibody in which the sequence part other than the three CDR sequences is at least partially different.
  • the above-mentioned antibody is mainly mounted only as a targeting factor to a target cell, and does not strongly expect to exhibit antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity.
  • ADCC antibody-dependent cellular cytotoxicity
  • Block copolymer unit ⁇ The block copolymer unit ⁇ is represented by the above formula (I).
  • m is an integer of 30 to 20,000 as described above.
  • m may be an integer of 50 or more, further an integer of 100 or more, and may be an integer of 5,000 or less, or an integer of 500 or less.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol chain segment may be, for example, 500 or more, further 2,000 or more, and for example, 50,000 or less, or 20,000 or less.
  • x is an integer of 5 to 100 as described above.
  • x may be an integer of 10 or more, or an integer of 15 or more, and may be an integer of 60 or less, further an integer of 40 or less, or an integer of 25 or less.
  • a is an integer of 0 to 100 as described above. a may be an integer of 1 or more, further an integer of 5 or more, for example, an integer of 60 or less, or an integer of 40 or less.
  • b is an integer of 0 to 100 as described above.
  • b may be an integer of 1 or more, further an integer of 5 or more, and may be an integer of 60 or less, or an integer of 40 or less.
  • c is an integer of 0 to 100 as described above. c may be, for example, an integer of 1 or more, or an integer of 5 or more, and may be an integer of 60 or less, or an integer of 40 or less.
  • d is an integer of 0 to 100 as described above.
  • d may be an integer of 1 or more, further an integer of 5 or more, and may be an integer of 60 or less, or an integer of 40 or less, for example.
  • the sum of a and c is an integer of 1 to 200 as described above.
  • the sum of a and c may be an integer of 2 or more, an integer of 3 or more, or an integer of 4 or more, for example, an integer of 40 or less, or an integer of 20 or less.
  • the sum of x, a, b, c and d may be, for example, 10 or more, further 20 or more, and for example, 200 or less, or 100 or less.
  • x: (a + b + c + d) is, for example, 90:10 to 10:90, and for example, 80:20 to 20:80.
  • x: (b + d) is, for example, 20:80 to 80:20, for example, 35:75 to 75:35, and for example, 30:70 to 70:30.
  • the ratio (%) of (a + c) to (x + a + b + c + d) may be 2% or more, further 7% or more, for example, 50% or less, or 35% or less.
  • (a + c) :( b + d) is, for example, 90:10 to 30:70, and for example, 80:20 to 40:60.
  • x / (a + c) may be 0.5 or more, further 1 or more, for example, 15 or less, or 10 or less.
  • the production method includes all or part of the hydroxyl groups in the side chain of the co-polyamino acid chain segment of polyethylene glycol-co-polyglutamic acid benzyl ester-polyreduced aspartic acid (PEG-PBLG-pAsp (red)).
  • an ester bond forming step of forming an ester bond by reacting with a carboxyl group of the drug The ester bond may be formed by a reaction between a carboxyl group unique to the drug and a hydroxyl group, or may be carried out by a reaction between a carboxyl group and a hydroxyl group separately introduced into the drug via a linking group. Good.
  • the above production method may further include a step of preparing polyethylene glycol-co-polyglutamic acid benzyl ester-polyaspartic acid (PEG-PBLG-pAsp).
  • PEG-PBLG-pAsp polyethylene glycol-co-polyglutamic acid benzyl ester-polyaspartic acid
  • a glutamic acid residue and an aspartic acid residue whose side chains are benzyl esterified are arbitrarily arranged.
  • the above production method may further include a step of reducing the carboxyl group of the aspartic acid side chain of PEG-PBLG-pAsp to a hydroxyl group.
  • PEG-PBLG-pAsp preparation process An example of a method for preparing PEG-PBLG-pAsp includes a method of coupling polyethylene glycol (PEG) and co-polyglutamic acid benzyl ester-polyaspartic acid (PBLG-pAsp) by any appropriate method. .
  • PEG polyethylene glycol
  • PBLG-pAsp co-polyglutamic acid benzyl ester-polyaspartic acid
  • aspartic anhydride (Asp-NCA) and N-carboxy are initiated with polyethylene glycol having one end protected and the other end being an amino group.
  • An example is a method in which - ⁇ -benzyl-L-glutamic anhydride (BLG-NCA) is added and reacted. More specifically, for example, MeO-PEG-CH 2 CH 2 CH 2 —NH 2 is used as the initiator, and Asp-NCA and BLG-NCA are converted to a desired degree of polymerization (in a dehydrated organic solvent ( The number of amino acid units) may be added and reacted.
  • PEG-PBLG-pAsp reduction step Any appropriate method can be adopted as a method of reducing the carboxyl group of the aspartic acid side chain to form a hydroxyl group.
  • Block copolymer unit ⁇ The block copolymer unit ⁇ is represented by the above formula (II).
  • n is an integer of 30 to 20,000 as described above. n may be, for example, an integer of 50 or more, further an integer of 100 or more, and may be, for example, an integer of 5,000 or less, or an integer of 1,000 or less.
  • q is an integer of 5 to 100 as described above.
  • q may be an integer of 10 or more, or an integer of 20 or more, and may be an integer of 80 or less, or an integer of 60 or less, for example.
  • the block copolymer unit ⁇ can be obtained, for example, by reacting a polyethylene glycol-polyglutamic acid benzyl ester (Maleimide-PEG-PBLG) having a maleimide group at the ⁇ -terminal with an antibody having a thiol group or a fragment thereof.
  • a polyethylene glycol-polyglutamic acid benzyl ester Moleimide-PEG-PBLG
  • Block copolymer unit ⁇ The block copolymer unit ⁇ is represented by the above formula (III).
  • s is an integer of 30 to 20,000 as described above.
  • s may be an integer of 50 or more, further an integer of 100 or more, and may be an integer of 5,000 or less, further 1,000 or less.
  • t is an integer of 5 to 100 as described above.
  • t may be an integer of 20 or more, or an integer of 30 or more, and may be an integer of 90 or less, or an integer of 80 or less.
  • u is an integer of 0 to 30 as described above.
  • u may be an integer of 2 or more, or an integer of 4 or more, and may be an integer of 20 or less, further an integer of 15 or less, or an integer of 12 or less.
  • the block copolymer unit ⁇ can be obtained, for example, by coupling polyethylene glycol (PEG) and co-polyglutamic acid benzyl ester-polyglutamic acid (PBLG-pGlu) by any appropriate method.
  • PEG polyethylene glycol
  • PBLG-pGlu co-polyglutamic acid benzyl ester-polyglutamic acid
  • block copolymer unit ⁇ is, for example, glutamic anhydride (Glu-NCA) and N-carboxy- ⁇ -benzyl-L-glutamic acid by using polyethylene glycol having an ⁇ -terminal protected and an ⁇ -terminal amino group as an initiator. It can be obtained by adding anhydride (BLG-NCA) and reacting.
  • Glu-NCA glutamic anhydride
  • BLG-NCA anhydride
  • the polymer micelle pharmaceutical composition of the present invention comprises, for example, block copolymer unit ⁇ and block copolymer unit ⁇ or block copolymer unit ⁇ , block copolymer unit ⁇ and block copolymer unit ⁇ dissolved in an organic solvent and mixed. It can be formed by adding water to a polymer film obtained by distilling off the homogenized solution under reduced pressure and mixing it, and self-organizing it into micelles. Further, for example, these block copolymer units can also be formed by mixing in an aqueous solution and self-assembling into micelles.
  • the polymer micelle pharmaceutical composition of the present invention comprises a block copolymer unit ⁇ and a block copolymer unit ⁇ precursor, or a block copolymer unit ⁇ , a block copolymer unit ⁇ precursor, and a block copolymer unit ⁇ in an organic solvent. Dissolve, mix and homogenize the solution under reduced pressure, add water to the resulting polymer film, mix and mix to form micelles, and then add the antibody or fragment thereof to the block copolymer unit. It can also be formed by binding to the ⁇ -terminal of the polyethylene glycol chain segment of the ⁇ precursor to form a block copolymer unit ⁇ .
  • the above-mentioned antibody or fragment thereof is bound to the ⁇ -terminal of the polyethylene glycol chain segment of the block copolymer unit ⁇ precursor to block. It can also be formed by using a copolymer unit ⁇ .
  • the organic solvent include methanol and acetone.
  • the aqueous solution can be formed, for example, by adding a water-miscible organic solvent such as ethanol and dimethyl sulfoxide and a known buffer to purified water.
  • Example 1 A polymer micelle pharmaceutical composition loaded with trastuzumab and the above drug (hereinafter sometimes referred to as E7974) was formed as follows.
  • Block copolymer unit ⁇ The block copolymer unit ⁇ of the polymer micelle pharmaceutical composition was produced as follows. As PEG-PBLG-pAsp (red), one obtained by acetylating one end of a co-polyamino acid was used. An ester bond was formed by reacting the hydroxyl group of the side chain of the reduced aspartic acid residue of PEG-PBLG-pAsp (red) with the carboxyl group of E7974. As a result, the obtained copolymer was used as a block copolymer unit ⁇ .
  • the average number of residues of the co-polyamino acid is 40, the average molecular weight (Da) of PEG of the block copolymer unit ⁇ is 10,000, and in the above formula (I), the average of x: (a + b + c + d) is approximately The average of (a + c) :( b + d) was approximately 2: 3 and the average of a + c was approximately 8.
  • Block copolymer unit ⁇ Two types of copolymers of ⁇ 1 and ⁇ 2 were prepared as the block copolymer unit ⁇ .
  • ⁇ 1 is a copolymer represented by the above formula (III), wherein PEG has an average molecular weight (Da) of 10,000, t is 60, u is 8, and ⁇ 2 is A copolymer which is a similar polymer but t is 24 and u is 16.
  • maleimide-linked polymer (block copolymer unit ⁇ precursor)
  • a maleimide-polyethylene glycol-polyglutamic acid benzyl ester copolymer having a maleimide group at the PEG end was prepared (hereinafter sometimes referred to as Maleimide-PEG-PBLG).
  • Maleimide-PEG-PBLG one end of polyglutamic acid benzyl ester is acetylated, the average molecular weight (Da) of PEG is 10,000, the average number of residues of glutamic acid is 40, All of the hydrogen atoms of the carboxylic acid are replaced with benzyl groups.
  • Block copolymer unit ⁇ , maleimide-linked polymer (block copolymer unit ⁇ precursor) and block copolymer unit ⁇ 2 are separately weighed separately in a molar ratio of 5: 1: 4, and dissolved by adding methanol or acetone. did. After each solution was mixed, the solvent was distilled off with a rotary evaporator (Buch, Rotavapor R-205, Vac (R) V-513) to form a mixed polymer film, which was further dried overnight.
  • the micelle fraction contains micelles in which a block copolymer unit ⁇ , a maleimide-linked polymer, and a block copolymer unit ⁇ 2 are radially arranged.
  • trastuzumab Reaction of trastuzumab with maleimide
  • Purified water was added to a vial containing trastuzumab at a molar ratio of 0.4 to Maleimide-PEG-PBLG to prepare a trastuzumab solution.
  • the final concentration of borate buffer in this trastuzumab solution is 50 mM, and the final concentration of EDTA is 1 mM.
  • 10 mg / mL trout reagent (Pierce) is further added, and the mixture is allowed to stand at 30 ° C. for 45 minutes. did.
  • reaction solution thus obtained was purified by gel filtration [GE Science, Inc., PD-10, eluent: 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), 1 mM EDTA], and the polymer fraction was recovered.
  • reaction solution ultrafiltration purification (Millipore, Amicon Ultra-15, membrane fraction: 300,000) by, removed trastuzumab unreacted comprises a block copolymer unit alpha, beta and gamma 2, A solution containing a polymer micelle pharmaceutical composition loaded with trastuzumab and E7974 was obtained.
  • Example 2 An E7974 solution having the same concentration as in Example 1 was prepared. Note that a 10% (w / v) sucrose solution was used for all the vehicles.
  • Cytotoxicity test 1 The cytotoxicity of the polymer micelle pharmaceutical composition of Example 1 was compared with the cytotoxicity of the antibody non-binding polymer micelle of Comparative Example 1 and the E7974 solution of Comparative Example 2. Cytotoxicity of each sample was evaluated based on the WST method using human prostate cancer-derived PC-3 cells (HER2 negative) purchased from ATCC via Sumisho Pharma International Co., Ltd. as follows. HER2 is a target molecule of trastuzumab.
  • the cells are seeded in a 96-well plate so that about 5000 PC-3 cells per well are suspended in 90 ⁇ L of medium and cultured overnight at 37 ° C. in an atmosphere of 5% CO 2. did.
  • As the medium RPMI1640 (Gibco TM , Invitrogen) and 10% FBS (biowest) were used.
  • a solution obtained by diluting each sample with a medium so as to have various E7974 concentrations was added to each well (10 ⁇ L per well), and cultured for 72 hours in an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 . Thereafter, WST Reagent (Dojin) was added (10 ⁇ L per well), and the culture was continued for about 2 hours in an atmosphere of 37 ° C.
  • Absorbance with respect to light having a wavelength of 450 nm was measured from each well, and the cell growth rate (% Cell Growth) was calculated based on the following formula.
  • the Abs450 value of the control in the formula means the absorbance obtained from a well in which the above culture was performed using a culture solution not containing E7974.
  • Results of the cytotoxicity test 1 are shown in the graph of FIG.
  • the vertical axis of the graph represents the average value (% Cell Growth) of the cell growth rate
  • the horizontal axis represents the E7974 concentration ( ⁇ g / mL)
  • the bar of the graph represents the standard deviation. From the results shown in FIG. 1, the cytotoxicity of the polymer micelle pharmaceutical composition of Example 1 and the cytotoxicity of the non-antibody-conjugated polymer micelle of Comparative Example 1 are shown for cells that do not have antibody target molecules. There was no difference between the two.
  • Cytotoxicity test 2 A point using human gastric cancer-derived NCI-N87 cells (HER2 positive) purchased from ATCC via Sumisho Pharma International Co., Ltd., about 10,000 NCI-N87 cells per well, and 37 ° C., 5% CO Incubate for 1 hour under the atmosphere of 2 , and then remove the medium from the well, wash the well twice with phosphate buffered saline (PBS), and then add fresh medium (100 ⁇ L per well) ), An experiment similar to the cytotoxicity test 1 was performed, except that the culture was continued until the total culture time reached 72 hours. The results are shown in the graph of FIG.
  • the vertical axis represents the average cell growth rate (% Cell Growth), and the horizontal axis represents E7974 concentration ( ⁇ g / mL). From the results of FIG. 2, the cytotoxicity of the polymer micelle pharmaceutical composition of Example 1 is significantly greater than the cytotoxicity of the non-antibody-conjugated polymer micelle of Comparative Example 1 for cells having the antibody target molecule. It turned out to be expensive.
  • JIMT-1 cells Human breast cancer-derived JIMT-1 cells (HER2 positive) were purchased from AddexBio (San Diego, USA). Although JIMT-1 cells are HER2 positive, it is known that cell damage does not occur when trastuzumab alone is administered. JIMT-1 cells are cultured in DMEM / Ham's F12 + 10% FBS + 50 ⁇ g / mL gentamicin + 10 ⁇ g / mL insulin medium at 37 ° C. under 5% CO 2 and grown until the number of cells required for transplantation is reached. It was.
  • ice-cooled cell culture substrate manufactured by Nippon Becton Dickinson Co., Ltd., trade name “BD Matrigel” (registered trademark)
  • BD Matrigel registered trademark
  • mice Female nude mice (Balb nu / nu, 6 weeks old, manufactured by Charles River Japan Co., Ltd.) were inoculated subcutaneously on the back. Nude mice were bred for 15 days, and the drug was administered when the tumor volume reached about 100 mm 3 . The drug was administered into the tail vein at 0.5 mg / kg in E7974 conversion once a week three times.
  • the maximum tolerated dose (MTD) of the polymer micelle pharmaceutical composition of Example 1 is 2.5 mg / kg.
  • the maximum tolerated amount of the antibody non-conjugated polymer micelle of Comparative Example 1 is 2.5 mg / kg.
  • the maximum tolerated amount of the E7974 solution of Comparative Example 2 is 0.75 mg / kg. Therefore, the dose of 0.5 mg / kg in terms of E7974 corresponds to 1/5 of the maximum tolerance of the polymer micelle pharmaceutical composition of Example 1, and the maximum tolerance of the antibody non-binding polymer micelle of Comparative Example 1 It corresponds to 1/5 of the quantity. Furthermore, the above dose corresponds to 2/3 of the maximum tolerated dose of the E7974 solution of Comparative Example 2.
  • the maximum tolerated dose means that when a drug is administered to healthy mice once a week three times in the tail vein, the drug does not cause the mouse to die and exceeds 20%. It is defined as the maximum E7974 equivalent dose that does not cause weight loss.
  • Comparative Example 3 a 10% sucrose solution as a medium was administered, and the tumor volume and body weight of nude mice were measured. In each example and each comparative example, 6 animals were used as one group. The result of measuring the tumor volume is shown in the graph of FIG. 3, and the result of measuring the body weight is shown in the graph of FIG.
  • the vertical axis of the graph in FIG. 3 represents the average value (mm 3 ) of the tumor volume of the mouse
  • the horizontal axis represents the number of days that have elapsed since the drug was first administered
  • the bar in the graph represents the standard error.
  • the upward arrows in FIG. 3 indicate the 0th day, the 7th day, and the 14th day when the drug is administered (hereinafter, the same applies to FIGS. 4 and 6). From the results of FIG. 3, the polymer micelle pharmaceutical composition of Example 1 was found to have a human breast cancer-derived JIMT compared to the antibody non-binding polymer micelle of Comparative Example 1, the E7974 solution of Comparative Example 2, and the control group of Comparative Example 3. -1 cell proliferation was found to be significantly suppressed.
  • the vertical axis of the graph of FIG. 4 represents the average value (%) of the relative weight of the mouse at the time of administration with respect to the weight of the mouse immediately before the drug administration, and the horizontal axis represents the number of days that have elapsed since the drug was first administered.
  • the graph bar represents the standard error.
  • Example 2 A polymer micelle pharmaceutical composition was formed in the same manner as in Example 1 except that cetuximab was used instead of trastuzumab.
  • the vertical axis of the graph in FIG. 5 represents the average value (mm 3 ) of the tumor volume of the mouse
  • the horizontal axis represents the number of days that have elapsed since the drug was first administered
  • the bar in the graph represents the standard error.
  • the downward arrows in FIG. 5 indicate the 0th day, the 7th day, and the 14th day of administration of the drug, respectively.
  • the polymer micelle pharmaceutical composition of Example 2 is derived from human pancreatic cancer as compared with the antibody non-binding polymer micelle of Comparative Example 1, the E7974 solution of Comparative Example 2, and the control group of Comparative Example 3. It was found that the proliferation of BxPC-3 cells can be remarkably suppressed.
  • the vertical axis of the graph of FIG. 6 represents the average value (%) of the relative weight of the mouse at the time of administration with respect to the weight of the mouse immediately before the drug administration, and the horizontal axis represents the number of days that have elapsed since the drug was first administered.
  • the graph bar represents the standard error.
  • [Anti-tumor effect confirmation test 3] 50% effective dose for anti-tumor effect confirmation test 2 for the polymer micelle pharmaceutical composition of Example 2 (ADCM with cetuximab), the antibody non-binding polymer micelle of Comparative Example 1 (Untargeted micelles), and the E7974 solution of Comparative Example 2 (ED 50 ) and therapeutic index were determined as follows.
  • the 50% effective dose is defined as the E7974 equivalent amount required to suppress the increase in tumor volume by 50% when the drug is administered to mice once 3 times a week by tail vein. To be determined.
  • the definition of the maximum tolerated dose (MTD) is as described above, and the therapeutic index is the value obtained by dividing the maximum tolerated dose by the 50% effective dose.
  • the present invention can be suitably used in the field of pharmaceutical preparations such as anticancer agents.

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Abstract

ヘミアスタリン誘導体の一種である薬物（Ｅ７９７４）に比較して、有意に効果増強を示すポリマーミセル医薬組成物を提供する。本発明は、下記式（ｉ）で表されるＥ７９７４と、トラスツズマブまたはセツキシマブが有するＣＤＲ配列と同一のＣＤＲ配列を有する抗体もしくはその断片とを、それぞれ化学結合を介して搭載したポリマーミセル医薬組成物を提供する。当該組成物において、Ｅ７９７４はポリマーミセルを構成するブロックコポリマーの還元型アスパラギン酸残基の側鎖に結合され、抗体またはその断片は別のブロックコポリマーのポリエチレングリコール鎖セグメントの自由端側に結合されている。

Description

ポリマーミセル医薬組成物
　本発明は、ポリマーミセル医薬組成物に関する。
　幾つかの細胞株に対し抗腫瘍活性を示す化合物としてヘミアスタリンが知られている。なかでも、所定のヘミアスタリン誘導体である薬物（例えば、開発コードＥ７９７４と呼ばれる薬物）が有用であることが報告されている（特許文献１）。
特許第５０４２４４４号公報
　本発明の主目的は、例えば、ドラッグデリバリーにより安全域を拡大し、Ｅ７９７４の薬効をさらに増強することである。
　本発明によれば、ブロックコポリマーにより構成され、薬物および抗体またはその断片を搭載したポリマーミセル医薬組成物が提供される。上記薬物は、下記式（ｉ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 　上記抗体は、トラスツズマブまたはセツキシマブが有するＣＤＲ配列と同一のＣＤＲ配列を有する。
　上記ブロックコポリマーは、下記式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーユニットαと、下記式（ＩＩ）で表されるブロックコポリマーユニットβとを含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　上記式（Ｉ）中、Ｘは、直接または連結基を介して結合されている上記薬物の残基を表し、ｍは、３０～２０，０００の整数であり、ｘは、５～１００の整数であり、ａは、０～１００の整数であり、ｂは、０～１００の整数であり、ｃは、０～１００の整数であり、ｄは、０～１００の整数であり、ａとｃとの和は、１～２００の整数であり、コ－ポリアミノ酸鎖セグメントにおける各反復単位の結合順は任意である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　上記式（ＩＩ）中、Ａは、上記抗体またはその断片の残基を表し、ｎは、３０～２０，０００の整数であり、ｑは、５～１００の整数である。
　本発明によれば、ミセル化されていないＥ７９７４組成物に比較して、有意に効果増強を示すポリマーミセル医薬組成物が提供される。
実施例１、比較例１および比較例２における細胞障害性試験１の結果を示すグラフである。 実施例１、比較例１および比較例２における細胞障害性試験２の結果を示すグラフである。 実施例１、比較例１および比較例２における抗腫瘍効果確認試験１において、ヌードマウスの腫瘍体積を測定した結果を示すグラフである。 実施例１、比較例１および比較例２における抗腫瘍効果確認試験１において、ヌードマウスの体重を測定した結果を示すグラフである。 実施例２、比較例１および比較例２における抗腫瘍効果確認試験２において、ヌードマウスの腫瘍体積を測定した結果を示すグラフである。 実施例２、比較例１および比較例２における抗腫瘍効果確認試験２において、ヌードマウスの体重を測定した結果を示すグラフである。
［１．ポリマーミセル医薬組成物の全体構成］
　本発明の１つの実施形態によるポリマーミセル医薬組成物について以下に述べる。上記ポリマーミセル医薬組成物はブロックコポリマーにより構成され、薬物および抗体またはその断片が搭載されている。上記薬物は、下記式（ｉ）で表される。上記抗体は、トラスツズマブまたはセツキシマブが有するＣＤＲ配列と同一のＣＤＲ配列を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　上記ブロックコポリマーは、ブロックコポリマーユニットαとブロックコポリマーユニットβとを含む。上記ブロックコポリマーは、ブロックコポリマーユニットγをさらに含んでいてもよい。
　ブロックコポリマーユニットαは、下記式（Ｉ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 　上記式（Ｉ）中、Ｘは直接または連結基を介して結合されている上記薬物の残基を表す。ｍは３０～２０，０００の整数である。ｘは５～１００の整数である。ａは０～１００の整数である。ｂは０～１００の整数である。ｃは０～１００の整数である。ｄは０～１００の整数である。ａとｃとの和は１～２００の整数である。コ－ポリアミノ酸鎖セグメントにおける各反復単位の結合順は任意である。
　ブロックコポリマーユニットβは、下記式（ＩＩ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 　上記式（ＩＩ）中、Ａは上記抗体またはその断片の残基を表す。ｎは３０～２０，０００の整数である。ｑは５～１００の整数である。
　ブロックコポリマーユニットγは、下記式（ＩＩＩ）で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 　ｓは３０～２０，０００の整数である。ｔは５～１００の整数である。ｕは０～３０の整数である。コ－ポリアミノ酸鎖セグメントにおける各反復単位の結合順は任意である。
　代表的には、上記ポリマーミセル医薬組成物において、ブロックコポリマーユニットα、βおよび存在する場合にはγは、ポリエチレングリコール鎖セグメントを外側に向けた状態で放射状に配列している。本明細書において、ブロックコポリマーが放射状に配列しているとは、ポリエチレングリコール鎖セグメントを外側に向けるとともに、コーポリアミノ酸鎖セグメントが内側に向けて凝集した状態にあればよく、各ブロックコポリマーの配列の起点が一点に集中していない、やや崩れた放射状の配列構造を有するミセルであっても構わない。ポリマーミセル医薬組成物は、ブロックコポリマーによる高分子凝集体が乾燥状態にあるものであっても構わない。
　上記ポリマーミセル医薬組成物のミセルの平均粒径（Z-Average）は、任意の適切な値をとり得る。上記平均粒径は、例えば１０ｎｍ以上であってよく、さらには２０ｎｍ以上であってよい。また、上記平均粒径は、例えば３００ｎｍ以下であってよく、さらには２００ｎｍ以下であってよい。
　上記ポリマーミセル医薬組成物の多分散指数（ＰＤＩ：Polydispersity　Index）は、任意の適切な値をとり得る。上記多分散指数は、例えば０．０１以上であってよく、さらには０．０２以上であってよい。また、上記多分散指数は、例えば０．８以下であってよく、さらには０．５以下であってよい。
　上記ポリマーミセル医薬組成物におけるブロックコポリマーユニットαの含有量としては、任意の適切な値をとり得る。上記含有量としては、例えば２０重量％以上であり、また例えば３０重量％以上である。上記含有量が所定値以上であることにより、ポリマーミセル医薬組成物に十分量の薬物を搭載することがより容易になる。一方、上記含有量としては、例えば９０重量％以下であり、また例えば８０重量％以下であり、また例えば７０重量％以下である。
　上記ポリマーミセル医薬組成物におけるブロックコポリマーユニットβの含有量としては、任意の適切な値をとり得る。上記含有量としては、例えば２．５重量％以上であり、また例えば５重量％以上である。一方、上記含有量としては、例えば５０重量％以下であり、また例えば４０重量％以下であり、また例えば３０重量％以下である。
　上記ブロックコポリマーがブロックコポリマーユニットγをさらに含む場合、上記ポリマーミセル医薬組成物におけるブロックコポリマーユニットγの含有量としては、任意の適切な値をとり得る。上記含有量としては、例えば５重量％以上であり、また例えば２０重量％以上である。一方、上記含有量としては、例えば７０重量％以下であり、また例えば６０重量％以下である。
　上記ブロックコポリマーは、上記の各ブロックコポリマーユニットα、βおよび存在する場合にはγをそれぞれ２種類以上含んでいてもよい。
　上記ポリマーミセル医薬組成物によれば、所定のヘミアスタリン誘導体である薬物の薬効を大幅に向上させることができる。このような効果が得られるメカニズムは定かではないが、以下のように推測される。まず、ポリマーミセルには、その粒子サイズに起因したＥＰＲ効果により、標的細胞周辺に滞留しやすい性質がある。さらに、ポリマーミセル医薬組成物に抗体またはその断片が搭載されていることにより、標的細胞周辺に滞留するポリマーミセルを、当該標的細胞に向けてさらに局所的に集積させやすくなる。さらに、ブロックコポリマーユニットαの還元型アスパラギン酸側鎖に上記薬物が結合していることにより、上記薬物がより効率的に標的細胞に到達することができると考えられる。さらに、上記薬物がブロックコポリマーユニットαに結合し、かつ上記抗体またはその断片がブロックコポリマーユニットβに結合していることにより、同一のブロックコポリマーユニットに、上記薬物と上記抗体またはその断片の双方を結合させる必要が無くなる。その結果、ポリマーミセル医薬組成物のミセル構造が崩壊した場合に薬物を代謝によって体外に排出でき、副作用の発生を回避しやすくなる。さらに、ブロックコポリマー合成時の薬剤または抗体等の失活を回避しやすくなる。
　１つの実施形態においては、上記ブロックコポリマーがブロックコポリマーユニットγをさらに含むことにより、上記薬物の薬効をさらに向上させることができる。上記ブロックコポリマーユニットγにより上記薬物の薬効がさらに向上するメカニズムは定かではないが、以下のように推測される。上記ポリマーミセル医薬組成物では、ブロックコポリマーユニットγはミセルから先行離脱しやすいと考えられる。標的細胞周辺に滞留したミセルから離脱したブロックコポリマーユニットγによって、滞留ミセル近傍にある標的細胞の細胞膜が刺激されやすくなり、当該標的細胞のエンドサイトーシスが活発化することになる。その結果、ポリマーミセル医薬組成物の標的細胞への到達性が向上し、上記薬物の薬効がさらに向上すると考えられる。
　上記抗体は、トラスツズマブまたはセツキシマブが有する相補性決定領域（ＣＤＲ）配列と同一のＣＤＲ配列を有する。上記抗体は、より具体的には、トラスツズマブまたはセツキシマブ中に６つ存在するＣＤＲ配列のうち少なくとも１つと同一のＣＤＲ配列を有していればよく、より厳密には、トラスツズマブまたはセツキシマブの重鎖または軽鎖に存在する３つのＣＤＲ配列全てと同一のＣＤＲ配列を有する。上記抗体は、トラスツズマブまたはセツキシマブであってもよいし、３つのＣＤＲ配列以外の配列部分が少なくとも一部異なった状態にあるトラスツズマブ様抗体またはセツキシマブ様抗体であってもよい。なお、本発明によるポリマーミセル医薬組成物において上記抗体は主に、標的細胞へのターゲッティング因子として搭載させるに過ぎず、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性の発揮を強力に期待するものではない。このため、後述する実施例ではトラスツズマブおよびセツキシマブを搭載した態様を記載しているが、原理的に、トラスツズマブまたはセツキシマブが有するＣＤＲ配列と同一のＣＤＲ配列を有する抗体またはその断片であれば、本発明による作用効果は発揮され得る。
［２．ブロックコポリマーユニットα］
　ブロックコポリマーユニットαは、上記式（Ｉ）で表される。
　上記式（Ｉ）中、ｍは、上述の通り３０～２０，０００の整数である。ｍは、例えば５０以上の整数さらには１００以上の整数であってよく、また例えば５，０００以下の整数さらには５００以下の整数であってよい。ポリエチレングリコール鎖セグメントの分子量は、例えば５００以上さらには２，０００以上であってよく、また例えば５０，０００以下さらには２０，０００以下であってよい。
　上記式（Ｉ）中、ｘは、上述の通り５～１００の整数である。ｘは、例えば１０以上の整数さらには１５以上の整数であってよく、また例えば６０以下の整数さらには４０以下の整数、さらには２５以下の整数であってよい。
　上記式（Ｉ）中、ａは、上述の通り０～１００の整数である。ａは、例えば１以上の整数さらには５以上の整数であってよく、また例えば６０以下の整数さらには４０以下の整数であってよい。
　上記式（Ｉ）中、ｂは、上述の通り０～１００の整数である。ｂは、例えば１以上の整数さらには５以上の整数であってよく、また例えば６０以下の整数さらには４０以下の整数であってよい。
　上記式（Ｉ）中、ｃは、上述の通り０～１００の整数である。ｃは、例えば１以上の整数さらには５以上の整数であってよく、また例えば６０以下の整数さらには４０以下の整数であってよい。
　上記式（Ｉ）中、ｄは、上述の通り０～１００の整数である。ｄは、例えば１以上の整数さらには５以上の整数であってよく、また例えば６０以下の整数さらには４０以下の整数であってよい。
　上記式（Ｉ）中、ａとｃとの和は、上述の通り１～２００の整数である。ａとｃとの和は、例えば２以上の整数、３以上の整数さらには４以上の整数であってよく、また例えば４０以下の整数さらには２０以下の整数であってよい。
　上記式（Ｉ）中、ｘとａとｂとｃとｄとの和は、例えば１０以上さらには２０以上であってよく、また例えば２００以下さらには１００以下であってよい。
　上記式（Ｉ）中、ｘ：（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）は、例えば９０：１０～１０：９０であり、また例えば８０：２０～２０：８０である。
　上記式（Ｉ）中、ｘ：（ｂ＋ｄ）は、例えば２０：８０～８０：２０であり、また例えば３５：７５～７５：３５であり、また例えば３０：７０～７０：３０である。
　上記式（Ｉ）中、（ｘ＋ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）に対する（ａ＋ｃ）の比率（％）は、例えば２％以上さらには７％以上であってよく、また例えば５０％以下さらには３５％以下であってよい。
　上記式（Ｉ）中、（ａ＋ｃ）：（ｂ＋ｄ）は、例えば９０：１０～３０：７０であり、また例えば８０：２０～４０：６０である。
　上記式（Ｉ）中、ｘ／（ａ＋ｃ）は、例えば０．５以上さらには１以上であってよく、また例えば１５以下さらには１０以下であってよい。
　ブロックコポリマーユニットαの製造方法の具体例を以下に説明する。
　上記製造方法は、例えば、ポリエチレングリコール－コ－ポリグルタミン酸ベンジルエステル－ポリ還元型アスパラギン酸（ＰＥＧ－ＰＢＬＧ－ｐＡｓｐ（ｒｅｄ））のコ－ポリアミノ酸鎖セグメントの側鎖の水酸基の全部または一部と、薬物のカルボキシル基とを反応させてエステル結合を形成させるエステル結合形成工程を有し得る。なお、上記エステル結合の形成は、薬物固有のカルボキシル基と水酸基との反応によって行われてもよく、連結基を介して該薬物に別途導入されたカルボキシル基と水酸基との反応によって行われてもよい。
　上記製造方法は、さらに、ポリエチレングリコール－コ－ポリグルタミン酸ベンジルエステル－ポリアスパラギン酸（ＰＥＧ－ＰＢＬＧ－ｐＡｓｐ）を準備する工程を有し得る。上記コ－ポリアミノ酸鎖セグメントにおいては、側鎖がベンジルエステル化されたグルタミン酸残基とアスパラギン酸残基とが任意に配置されている。
　上記製造方法は、さらに、ＰＥＧ－ＰＢＬＧ－ｐＡｓｐのアスパラギン酸側鎖のカルボキシル基を還元し、水酸基とする工程を有し得る。その結果、ポリエチレングリコール－コ－ポリアミノ酸において、側鎖がベンジルエステル化されたグルタミン酸残基と還元型アスパラギン酸残基とが任意に配置されたコポリマー（すなわち、ＰＥＧ－ＰＢＬＧ－ｐＡｓｐ（ｒｅｄ））が得られ得る。
（エステル結合形成工程）
　上記水酸基と上記カルボキシル基を有する薬物とを反応させてエステル結合を形成させる方法としては、任意の適切な方法を採用し得る。
（ＰＥＧ－ＰＢＬＧ－ｐＡｓｐ準備工程）
　ＰＥＧ－ＰＢＬＧ－ｐＡｓｐを準備する方法の一例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコ－ポリグルタミン酸ベンジルエステル－ポリアスパラギン酸（ＰＢＬＧ－ｐＡｓｐ）とを、任意の適切な方法によりカップリングする方法が挙げられる。
　ＰＥＧ－ＰＢＬＧ－ｐＡｓｐを準備する方法の他の例として、片末端が保護され、もう一方の末端がアミノ基であるポリエチレングリコールを開始剤として、アスパラギン酸無水物（Ａｓｐ－ＮＣＡ）およびＮ－カルボキシ－γ－ベンジル－Ｌ－グルタミン酸無水物（ＢＬＧ－ＮＣＡ）を添加し、反応させる方法が挙げられる。より具体的には、例えば、上記開始剤としてＭｅＯ－ＰＥＧ－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ２を用いて、脱水された有機溶媒中で、Ａｓｐ－ＮＣＡおよびＢＬＧ－ＮＣＡを所望の重合度（アミノ酸ユニット数）となるように添加し、反応させる方法が挙げられる。
（ＰＥＧ－ＰＢＬＧ－ｐＡｓｐ還元工程）
　アスパラギン酸側鎖のカルボキシル基を還元し、水酸基とする方法としては、任意の適切な方法を採用し得る。
［３．ブロックコポリマーユニットβ］
　ブロックコポリマーユニットβは、上記式（ＩＩ）で表される。
　上記式（ＩＩ）中、ｎは、上述の通り３０～２０，０００の整数である。ｎは、例えば５０以上の整数さらには１００以上の整数であってよく、また例えば５，０００以下の整数さらには１，０００以下の整数であってよい。
　上記式（ＩＩ）中、ｑは、上述の通り５～１００の整数である。ｑは、例えば１０以上の整数さらには２０以上の整数であってよく、また例えば８０以下の整数さらには６０以下の整数であってよい。
　ブロックコポリマーユニットβは、例えば、α末端にマレイミド基を有するポリエチレングリコール－ポリグルタミン酸ベンジルエステル（Maleimide－ＰＥＧ－ＰＢＬＧ）とチオール基を有する抗体またはその断片とを反応させることによって得られ得る。
［４．ブロックコポリマーユニットγ］
　ブロックコポリマーユニットγは、上記式（ＩＩＩ）で表される。
　上記式（ＩＩＩ）中、ｓは、上述の通り３０～２０，０００の整数である。ｓは、例えば５０以上の整数さらには１００以上の整数であってよく、また例えば５，０００以下の整数さらには１，０００以下の整数であってよい。
　上記式（ＩＩＩ）中、ｔは、上述の通り５～１００の整数である。ｔは、例えば２０以上の整数さらには３０以上の整数であってよく、また例えば９０以下の整数さらには８０以下の整数であってよい。
　上記式（ＩＩＩ）中、ｕは、上述の通り０～３０の整数である。ｕは、例えば２以上の整数さらには４以上の整数であってよく、また例えば２０以下の整数、さらには１５以下の整数さらには１２以下の整数であってよい。
　ブロックコポリマーユニットγは、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とコ－ポリグルタミン酸ベンジルエステル－ポリグルタミン酸（ＰＢＬＧ－ｐＧｌｕ）とを、任意の適切な方法によりカップリングすることによって得られ得る。
　また、ブロックコポリマーユニットγは、例えば、α末端が保護され、ω末端がアミノ基であるポリエチレングリコールを開始剤として、グルタミン酸無水物（Ｇｌｕ－ＮＣＡ）およびＮ－カルボキシ－γ－ベンジル－Ｌ－グルタミン酸無水物（ＢＬＧ－ＮＣＡ）を添加し、反応させることによって得られ得る。
［５．ポリマーミセル医薬組成物の製造方法］
　本発明のポリマーミセル医薬組成物は、例えば、ブロックコポリマーユニットαとブロックコポリマーユニットβとを、または、ブロックコポリマーユニットαとブロックコポリマーユニットβとブロックコポリマーユニットγとを有機溶媒に溶解し、混合して均一化された溶液を減圧留去して得られるポリマーのフィルムに水を加えて混合し、ミセル状に自己組織化させることによって形成できる。また例えば、これらのブロックコポリマーユニットを水性溶液中で混合し、ミセル状に自己組織化させることによっても形成できる。さらに例えば、本発明のポリマーミセル医薬組成物は、ブロックコポリマーユニットαとブロックコポリマーユニットβ前駆体とを、または、ブロックコポリマーユニットαとブロックコポリマーユニットβ前駆体とブロックコポリマーユニットγとを有機溶媒に溶解し、混合して均一化された溶液を減圧留去して得られるポリマーのフィルムに水を加えて混合し、ミセル状に自己組織化させた後、上記抗体またはその断片を、ブロックコポリマーユニットβ前駆体のポリエチレングリコール鎖セグメントのα末端に結合させてブロックコポリマーユニットβとすることによって形成することもできる。さらに例えば、これらのブロックコポリマーユニットを水性溶液中で混合させミセル状に自己組織化させた後、上記抗体またはその断片をブロックコポリマーユニットβ前駆体のポリエチレングリコール鎖セグメントのα末端に結合させてブロックコポリマーユニットβとすることによって形成することもできる。上記有機溶媒としては、例えば、メタノールおよびアセトンが挙げられる。上記水性溶液は、例えば、エタノールおよびジメチルスルホキシドといった水混和性有機溶媒と、公知の緩衝剤とを精製水に添加することによって形成できる。
　以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
（実施例１）
　トラスツズマブおよび上記薬物（以下、Ｅ７９７４と称することがある。）を搭載したポリマーミセル医薬組成物を次のようにして形成した。
（ブロックコポリマーユニットα）
　上記ポリマーミセル医薬組成物のブロックコポリマーユニットαを、次のようにして製造した。ＰＥＧ－ＰＢＬＧ－ｐＡｓｐ（ｒｅｄ）としては、コ－ポリアミノ酸の片末端をアセチル化したものを用いた。ＰＥＧ－ＰＢＬＧ－ｐＡｓｐ（ｒｅｄ）の還元型アスパラギン酸残基の側鎖の水酸基と、Ｅ７９７４のカルボキシル基とを反応させてエステル結合を形成させた。その結果、得られたコポリマーをブロックコポリマーユニットαとして用いた。コ－ポリアミノ酸の平均残基数は４０であり、上記ブロックコポリマーユニットαのＰＥＧの平均分子量（Ｄａ）は１００００であり、上記式（Ｉ）において、ｘ：（ａ＋ｂ＋ｃ+ｄ）の平均はおよそ５０：５０であり、（ａ＋ｃ）：（ｂ＋ｄ）の平均はおよそ２：３であり、ａ＋ｃの平均はおよそ８であった。
（ブロックコポリマーユニットγ）
　ブロックコポリマーユニットγとしてγ１、γ２の２種のコポリマーを準備した。
　γ１は、上記式（ＩＩＩ）で表されるコポリマーであって、ＰＥＧの平均分子量（Ｄａ）が１０，０００であり、ｔが６０であり、ｕが８であるコポリマーであり、γ２は同様のポリマーであるがｔが２４であり、ｕが１６であるコポリマーである。
（マレイミド結合ポリマー（ブロックコポリマーユニットβ前駆体））
　ＰＥＧ末端にマレイミド基を有する、マレイミド－ポリエチレングリコール－ポリグルタミン酸ベンジルエステル共重合体を準備した（以後、Maleimide－ＰＥＧ－ＰＢＬＧと称する場合がある。）。上記Maleimide－ＰＥＧ－ＰＢＬＧにおいて、ポリグルタミン酸ベンジルエステルの片末端はアセチル化されており、ＰＥＧの平均分子量（Ｄａ）は１０，０００であり、グルタミン酸の平均残基数は４０であり、側鎖のカルボン酸の水素原子全てがベンジル基に置換されている。
（ミセルの形成）
　ブロックコポリマーユニットαとマレイミド結合ポリマー（ブロックコポリマーユニットβ前駆体）とブロックコポリマーユニットγ２とを、それぞれモル比５：１：４でバイヤルに別々に精秤し、メタノールまたはアセトンを添加して溶解した。各溶液を混合した後、ロータリーエバポレーター（ビュッヒ製、Rotavapor　R-205、Vac(R)　V-513）で溶媒留去して混合ポリマーのフィルムを形成し、更に一昼夜乾燥した。１００ｍＭ　ＰＢＳ（pH7.4）を加えてフィルムを分散させた後、ナノヴェイタ（吉田機械興業製、NM2-L200）を用いて高圧分散処理してミセルを得た。当該ミセル画分には、ブロックコポリマーユニットαとマレイミド結合ポリマーとブロックコポリマーユニットγ２とが放射状に配列したミセルが含有されている。
（トラスツズマブとマレイミドとの反応）
　Maleimide－ＰＥＧ－ＰＢＬＧに対してモル比０．４のトラスツズマブが入ったバイヤルに、精製水を添加してトラスツズマブ溶液を調製した。このトラスツズマブ溶液のホウ酸緩衝液の最終濃度が５０ｍＭになりＥＤＴＡの最終濃度が１ｍＭになるようにし、１０ｍｇ／ｍＬのトラウト試薬（ピアス社）をさらに添加した後、３０℃にて４５分間静置した。続いて、こうして得た反応液をゲルろ過精製［GEサイエンス社製PD-10、溶離液：１００ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ］し、高分子画分を回収した。
　この回収液と、上記ミセル画分とを混合し、３０℃にて２時間静置することによって、Maleimide－ＰＥＧ－ＰＢＬＧのマレイミド基とトラスツズマブとを反応させた。こうして得た反応液を限外ろ過精製（ミリポア社製、Amicon　Ultra-15、膜分画：300,000）することによって、未反応のトラスツズマブを除去し、ブロックコポリマーユニットα、βおよびγ２を含み、トラスツズマブおよびＥ７９７４を搭載したポリマーミセル医薬組成物を含有する溶液を得た。
（比較例１）
　トラスツズマブを用いなかったこと以外は実施例１と同様にして抗体非結合型ポリマーミセルを得た。
（比較例２）
　実施例１と同一濃度のＥ７９７４溶液を調製した。なお、媒体（Ｖｅｈｉｃｌｅ）は全て１０％（ｗ/ｖ）スクロース溶液を用いた。
〔細胞障害性試験１〕
　実施例１のポリマーミセル医薬組成物による細胞障害性を、比較例１の抗体非結合型ポリマーミセル、および比較例２のＥ７９７４溶液による細胞障害性と比較した。各サンプルによる細胞障害性を、住商ファーマインターナショナル株式会社を介し、ＡＴＣＣから購入したヒト前立腺癌由来ＰＣ－３細胞（ＨＥＲ２ネガティブ）を用い、ＷＳＴ法に基づき次のように評価した。なお、ＨＥＲ２はトラスツズマブの標的分子である。
　９６ウェルプレートに、１ウェルあたり約５０００個のＰＣ－３細胞が含まれるように、当該細胞を９０μＬの培地に懸濁した状態で播き、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で一晩培養した。培地としては、RPMI1640（GibcoTM，Invitrogen）と１０％ＦＢＳ（biowest社）を用いた。続いて、各サンプルを種々のＥ７９７４濃度になるように培地で希釈した溶液を各ウェルに添加し（１ウェルあたり１０μＬ）、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で７２時間培養した。その後、WST　Reagent（同仁）を添加し（１ウェルあたり１０μＬ）、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で約２時間培養を続けた。各ウェルから、波長４５０ｎｍの光線に対する吸光度（Abs450）を測定し、下記の数式に基づき細胞増殖率（％　Cell　Growth）を算出した。なお、当該数式中のコントロールのAbs450値とは、Ｅ７９７４を含有しない培養液を使用して上記の培養を実施したウェルから得た吸光度を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
　細胞障害性試験１の結果を図１のグラフに示す。上記グラフの縦軸は上記細胞増殖率の平均値（％　Cell　Growth）を表し、横軸はＥ７９７４濃度（μg/mL）を表し、グラフのバーは標準偏差を表す。図１の結果から、抗体の標的分子を有さない細胞に対しては、実施例１のポリマーミセル医薬組成物の細胞障害性と、比較例１の抗体非結合型ポリマーミセルの細胞障害性との間には差が無いことが分かった。
〔細胞障害性試験２〕
　住商ファーマインターナショナル株式会社を介し、ＡＴＣＣから購入したヒト胃癌由来NCI-N87細胞（ＨＥＲ２ポジティブ）を用いた点、１ウェルあたり約１００００個のNCI-N87細胞とした点、ならびに３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で１時間培養し、その後、ウェル内から培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にてウェル内を２回洗浄した後、新鮮培地を添加し（１ウェルあたり１００μＬ）、総培養時間が７２時間になるまで引き続き培養した点を除き、細胞障害性試験１と同様の実験を行った。結果を図２のグラフに示す。
　図２のグラフの縦軸は上記細胞増殖率の平均値（％　Cell　Growth）を表し、横軸はＥ７９７４濃度（μg/mL）を表す。図２の結果から、抗体の標的分子を有する細胞に対しては、実施例１のポリマーミセル医薬組成物の細胞障害性は、比較例１の抗体非結合型ポリマーミセルの細胞障害性よりも有意に高いことが分かった。
［抗腫瘍効果確認試験１］
　ヒト乳癌由来JIMT-1細胞（ＨＥＲ２ポジティブ）をＡｄｄｅｘＢｉｏ社（サンディエゴ、米国）から購入した。JIMT-1細胞はＨＥＲ２ポジティブであるが、トラスツズマブを単独で投与するだけでは細胞障害が生じないことが知られている。JIMT-1細胞を、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ＋５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン＋１０μｇ／ｍＬインスリン培地を用い、5%CO2下、37℃にて培養し、移植に必要とする細胞数になるまで増殖させた。細胞を生理食塩水に懸濁して得た細胞懸濁液に、氷冷した細胞培養用基質（日本ベクトン・ディッキンソン株式会社製、商品名「ＢＤマトリゲル」（登録商標））を等量加えた後雌性ヌードマウス（Balb　nu/nu、６週齢、日本チャールス・リバー株式会社製）の背部皮下に接種した。１５日間ヌードマウスを飼育し、腫瘍体積が約１００ｍｍ３になったところで薬剤を投与した。薬剤は、Ｅ７９７４換算で０．５ｍｇ／ｋｇを週に１度３回尾静脈内投与した。実施例１のポリマーミセル医薬組成物の最大耐性量（ＭＴＤ：Maximum　Tolerated　Dose）は２．５ｍｇ／ｋｇである。比較例１の抗体非結合型ポリマーミセルの最大耐性量は２．５ｍｇ／ｋｇである。比較例２のＥ７９７４溶液の最大耐性量は０．７５ｍｇ／ｋｇである。したがって、Ｅ７９７４換算で０．５ｍｇ／ｋｇとの投与量は、実施例１のポリマーミセル医薬組成物の最大耐性量の１／５に相当し、比較例１の抗体非結合型ポリマーミセルの最大耐性量の１／５に相当する。さらに、上記投与量は、比較例２のＥ７９７４溶液の最大耐性量の２／３に相当する。なお、抗腫瘍効果確認試験１～３において最大耐性量とは、薬剤を週に１度３回健康なマウスに尾静脈内投与した場合に、その薬剤によりマウスが死亡しない、かつ２０％を超える体重減少を起こさせない最大のＥ７９７４換算投与量と定義される。さらに、比較例３として、媒体である１０％スクロース液を投与し、ヌードマウスの腫瘍体積および体重を測定した。各実施例および各比較例では、１群として６例の動物を用いた。腫瘍体積を測定した結果を図３のグラフに示し、体重を測定した結果を図４のグラフに示す。
　図３のグラフの縦軸はマウスの腫瘍体積の平均値（ｍｍ３）を表し、横軸は最初に薬剤を投与してから経過した日数を表し、グラフのバーは標準誤差を表す。図３の上向きの矢印は、それぞれ薬剤を投与した０日目、７日目、および１４日目を示す（以下、図４および図６において同じ。）。図３の結果から、実施例１のポリマーミセル医薬組成物は、比較例１の抗体非結合型ポリマーミセル、比較例２のＥ７９７４溶液、および比較例３の対照群に比べて、ヒト乳癌由来JIMT-1細胞の増殖を顕著に抑制できることが分かった。
　図４のグラフの縦軸は、薬剤投与直前のマウスの体重に対する投与時のマウスの体重の相対値の平均値（％）を表し、横軸は最初に薬剤を投与してから経過した日数を表し、グラフのバーは標準誤差を表す。実施例１のポリマーミセル医薬組成物、比較例１の抗体非結合型ポリマーミセル、比較例２のＥ７９７４溶液、および比較例３の対照群のいずれの場合でも、マウスの体重変化に大きな違いはなかった。
（実施例２）
　トラスツズマブに代えてセツキシマブを用いたこと以外は実施例１と同様にしてポリマーミセル医薬組成物を形成した。
〔抗腫瘍効果確認試験２〕
　実施例１のポリマーミセル医薬組成物に代えて実施例２のポリマーミセル医薬組成物を用いた点、住商ファーマインターナショナル株式会社を介し、ＡＴＣＣから購入したヒトすい臓癌由来BxPC-3細胞（ＥＧＦＲポジティブ）を用いた点、薬剤をＥ７９７４換算で０．２５ｍｇ／ｋｇ投与した点を除き、抗腫瘍効果確認試験１と同様の実験を行った。なお、ＥＧＦＲは、セツキシマブの標的分子である。Ｅ７９７４換算で０．２５ｍｇ／ｋｇの投与量は、実施例１のポリマーミセル医薬組成物および比較例１の抗体非結合型ポリマーミセルの最大耐性量の１／１０に相当する。さらに、上記投与量は、比較例２のＥ７９７４溶液の最大耐性量の１／３に相当する。腫瘍体積を測定した結果を図５のグラフに示し、体重を測定した結果を図６のグラフに示す。
　図５のグラフの縦軸はマウスの腫瘍体積の平均値（ｍｍ３）を表し、横軸は最初に薬剤を投与してから経過した日数を表し、グラフのバーは標準誤差を表す。図５の下向きの矢印は、それぞれ薬剤を投与した０日目、７日目、および１４日目を示す。図５の結果から、実施例２のポリマーミセル医薬組成物は、比較例１の抗体非結合型ポリマーミセル、比較例２のＥ７９７４溶液、および比較例３の対照群に比べて、ヒトすい臓癌由来BxPC-3細胞の増殖を顕著に抑制できることが分かった。
　図６のグラフの縦軸は、薬剤投与直前のマウスの体重に対する投与時のマウスの体重の相対値の平均値（％）を表し、横軸は最初に薬剤を投与してから経過した日数を表し、グラフのバーは標準誤差を表す。実施例２のポリマーミセル医薬組成物、比較例１の抗体非結合型ポリマーミセル、比較例２のＥ７９７４溶液、および比較例３の対照群のいずれの場合も、マウスの体重変化に大きな違いはなかった。
〔抗腫瘍効果確認試験３〕
　実施例２のポリマーミセル医薬組成物（ADCM　with　cetuximab）、比較例１の抗体非結合型ポリマーミセル（Untargeted　micelles）、および比較例２のＥ７９７４溶液について、抗腫瘍効果確認試験２に関する５０％有効用量（ＥＤ５０）および治療指数（Therapeutic　index）を以下のように求めた。５０％有効用量は、薬剤を週に１度３回マウスに尾静脈内投与した場合に、腫瘍体積の増加を５０％抑制するためのＥ７９７４換算必要量と定義され、種々の濃度の薬剤を投与することにより決定される。最大耐性量（ＭＴＤ）の定義は上述した通りであり、治療指数は最大耐性量を５０％有効用量で割った値である。さらに、比較例２のＥ７９７４溶液の治療指数に対する実施例２のポリマーミセル医薬組成物および比較例１の抗体非結合型ポリマーミセルの治療指数の比率（Ratio　to　E7974）を算出した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　表１の結果から、実施例２のポリマーミセル医薬組成物は、比較例１の抗体非結合型ポリマーミセルおよび比較例２のＥ７９７４溶液よりもはるかに優れた薬効を有することが分かった。
　本発明は、抗がん剤等の医薬製剤等の分野で、好適に利用することができる。

 

Claims (3)

  1. 　ブロックコポリマーにより構成され、薬物および抗体またはその断片を搭載したポリマーミセル医薬組成物であって、
    　該薬物は、下記式（ｉ）で表され、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　該抗体は、トラスツズマブまたはセツキシマブが有するＣＤＲ配列と同一のＣＤＲ配列を有し、
    　該ブロックコポリマーが、下記式（Ｉ）で表されるブロックコポリマーユニットαと、下記式（ＩＩ）で表されるブロックコポリマーユニットβとを含む、ポリマーミセル医薬組成物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　上記式（Ｉ）中、
    　Ｘは、直接または連結基を介して結合されている該薬物の残基を表し、
    　ｍは、３０～２０，０００の整数であり、
    　ｘは、５～１００の整数であり、
    　ａは、０～１００の整数であり、
    　ｂは、０～１００の整数であり、
    　ｃは、０～１００の整数であり、
    　ｄは、０～１００の整数であり、
    　ａとｃとの和は、１～２００の整数であり、
    　コ－ポリアミノ酸鎖セグメントにおける各反復単位の結合順は任意である：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　上記式（ＩＩ）中、
    　Ａは、該抗体またはその断片の残基を表し、
    　ｎは、３０～２０，０００の整数であり、
    　ｑは、５～１００の整数である。
  2. 　前記ブロックコポリマーが、下記式（ＩＩＩ）で表されるブロックコポリマーユニットγをさらに含む、請求項１に記載のポリマーミセル医薬組成物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     　上記式（ＩＩＩ）中、
    　ｓは、３０～２０，０００の整数であり、
    　ｔは、５～１００の整数であり、
    　ｕは、０～３０の整数であり、
    　コ－ポリアミノ酸鎖セグメントにおける各反復単位の結合順は任意である。
  3. 　ｕが０～２０の整数である、請求項２に記載のポリマーミセル医薬組成物。

     
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