TW201737897A - 高分子微胞醫藥組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種與作為哈米特林(hemiasterlin)衍生物之一種的藥物(E7974)相比，顯著地顯示出效果增強之高分子微胞醫藥組成物。本發明提供一種高分子微胞醫藥組成物，其分別經由化學鍵搭載有下述式(i)所表示之E7974、具有與曲妥珠單抗(Trastuzumab)或西妥昔單抗(Cetuximab)所具有之CDR序列相同之CDR序列的抗體或者其片段。於該組成物中，E7974鍵結於構成高分子微胞之嵌段共聚物之還原型天冬胺酸殘基之側鏈，抗體或其片段鍵結於另一嵌段共聚物之聚乙二醇鏈段之自由端側。□

Description

高分子微胞醫藥組成物
本發明係關於一種高分子微胞醫藥組成物。
作為對若干種類之細胞株顯示出抗腫瘤活性之化合物，已知有哈米特林(hemiasterlin)。其中，有報告稱既定之作為哈米特林衍生物之藥物(例如稱為開發編碼E7974之藥物)有用(專利文獻1)。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利第5042444號公報
本發明之主要目的例如係藉由藥物遞送而擴大安全範圍，而進一步增強E7974之藥效。
根據本發明，提供一種包含嵌段共聚物且搭載有藥物及抗體或其片段之高分子微胞醫藥組成物。上述藥物係以下述式(i)表示。
[化1]
上述抗體具有與曲妥珠單抗(Trastuzumab)或西妥昔單抗(Cetuximab)所具有之CDR(Complementarity Determining Region，互補決定區)序列相同之CDR序列。
上述嵌段共聚物包含下述式(I)所表示之嵌段共聚物單元α與下述式(II)所表示之嵌段共聚物單元β。
上述式(I)中，X表示直接或經由連結基而鍵結之上述藥物之殘基，m為30~20,000之整數，x為5~100之整數，a為0~100之整數，b為0~100之整數，c為0~100之整數，d為0~100之整數，a與c之和為1~200之整數，共聚胺基酸鏈段中之各重複單位之鍵結順序為任意。
[化3]
上述式(II)中，A表示上述抗體或其片段之殘基，n為30~20,000之整數，q為5~100之整數。
根據本發明，可提供與未微胞化之E7974組成物相比，顯著地顯示出效果增強之高分子微胞醫藥組成物。
圖1係表示實施例1、比較例1及比較例2中之細胞毒性試驗1之結果的圖表。
圖2係表示實施例1、比較例1及比較例2中之細胞毒性試驗2之結果的圖表。
圖3係表示於實施例1、比較例1及比較例2中之抗腫瘤效果確認試驗1中，對裸小鼠之腫瘤體積進行測定而獲得之結果的圖表。
圖4係表示於實施例1、比較例1及比較例2中之抗腫瘤效果確認試驗1中，對裸小鼠之體重進行測定而獲得之結果的圖表。
圖5係表示於實施例2、比較例1及比較例2中之抗腫瘤效果確認試驗2中，對裸小鼠之腫瘤體積進行測定而獲得之結果的圖表。
圖6係表示於實施例2、比較例1及比較例2中之抗腫瘤效果確認試驗2中，對裸小鼠之體重進行測定而獲得之結果的圖表。
[1.高分子微胞醫藥組成物之整體構成]
以下，對本發明之一實施形態之高分子微胞醫藥組成物進行說明。上述高分子微胞醫藥組成物包含嵌段共聚物，且搭載有藥物及抗體或其片段。上述藥物係以下述式(i)表示。上述抗體具有與曲妥珠單抗或西妥昔單抗所具有之CDR序列相同之CDR序列。
上述嵌段共聚物包含嵌段共聚物單元α與嵌段共聚物單元β。上述嵌段共聚物亦可進而含有嵌段共聚物單元γ。
嵌段共聚物單元α係以下述式(I)表示。
[化5]
上述式(I)中，X表示直接或經由連結基而鍵結之上述藥物之殘基。m為30~20,000之整數。x為5~100之整數。a為0~100之整數。b為0~100之整數。c為0~100之整數。d為0~100之整數。a與c之和為1~200之整數。共聚胺基酸鏈段中之各重複單位之鍵結順序為任意。
嵌段共聚物單元β係以下述式(II)表示。
上述式(II)中，A表示上述抗體或其片段之殘基。n為30~20,000 之整數。q為5~100之整數。
嵌段共聚物單元γ係以下述式(III)表示。
s為30~20,000之整數。t為5~100之整數。u為0~30之整數。共聚胺基酸鏈段中之各重複單位之鍵結順序為任意。
代表性而言，於上述高分子微胞醫藥組成物中，嵌段共聚物單元α、β及存在之情形時之γ係將聚乙二醇鏈段於朝向外側之狀態下排列為放射狀。於本說明書中，所謂嵌段共聚物排列為放射狀，只要為使聚乙二醇鏈段朝向外側並且使共聚胺基酸鏈段朝向內側而凝集之狀態即可，可為具有各嵌段共聚物之排列之起點未集中於一點而略微變形之放射狀之排列構造之微胞。高分子微胞醫藥組成物可為由嵌段共聚物所形成之高分子凝集體處於乾燥狀態者。
上述高分子微胞醫藥組成物之微胞之平均粒徑(Z-Average)可採用任意之適當值。上述平均粒徑例如可為10nm以上、進而20nm以上。又，上述平均粒徑例如可為300nm以下、進而200nm以下。
上述高分子微胞醫藥組成物之多分散指數(PDI，Polydispersity Index)可採用任意之適當值。上述多分散指數例如可為0.01以上、進而0.02以上。又，上述多分散指數例如可為0.8以下、進而0.5以下。
作為上述高分子微胞醫藥組成物中之嵌段共聚物單元α之含量，可採用任意之適當值。作為上述含量，例如為20重量%以上，又，例如為30重量%以上。藉由使上述含量為既定值以上，變得更容易於高分子微胞醫藥組成物上搭載充分量之藥物。另一方面，作為上述含量，例如為90重量%以下，又，例如為80重量%以下，又，例如為70重量%以下。
作為上述高分子微胞醫藥組成物中之嵌段共聚物單元β之含量，可採用任意之適當值。作為上述含量，例如為2.5重量%以上，又，例如為5重量%以上。另一方面，作為上述含量，例如為50重量%以下，又，例如為40重量%以下，又，例如為30重量%以下。
於上述嵌段共聚物進而包含嵌段共聚物單元γ之情形時，作為上述高分子微胞醫藥組成物中之嵌段共聚物單元γ之含量，可採用任意之適當值。作為上述含量，例如為5重量%以上，又，例如為20重量%以上。另一方面，作為上述含量，例如為70重量%以下，又，例如為60重量%以下。
上述嵌段共聚物可分別含有2種以上之上述各嵌段共聚物單元α、β及存在之情形時之γ。
根據上述高分子微胞醫藥組成物，可大幅度提高既定之作為哈米特林衍生物的藥物之藥效。獲得此種效果之機制雖然尚不確定，但推測如下。首先，高分子微胞具有如下性質：藉由因其粒子尺寸引起之增強滲透及滯留(EPR，Enhanced Permeability And Retention)效應，而容易滯留於靶細胞周邊。進而，藉由在高分子微胞醫藥組成物上搭載有抗體或其片段，容易使滯留於靶細胞周邊之高分子微胞朝向該靶細胞進而局部地集聚。進而認為，藉由使上述藥物鍵結於嵌段共聚物單元α之還原型天冬胺酸側鏈，上述藥物可更有效率地到達靶細胞。進而，藉由使上述藥物鍵結於嵌段共聚物單元α，且使上述抗體或其片段鍵結於嵌段共聚物單元β，而變得無需使上述藥物與上述抗體或其片段之兩者鍵結於同一嵌段共聚物單元。其結果為，於高分子微胞醫藥組成物之微胞構造崩解之情形時，可藉由代謝將藥物排出至體外，而變得容易避免產生副作用。進而，變得容易避免合成嵌段共聚物時藥劑或抗體等之失活。
於一實施形態中，藉由使上述嵌段共聚物進而包含嵌段共聚物單元γ，可進一步提高上述藥物之藥效。利用上述嵌段共聚物單元γ進一步提高上述藥物之藥效之機制雖然尚不確定，但推測如下。認為於上述高分子微胞醫藥組成物中，嵌段共聚物單元γ容易先自微胞脫離。利用自滯留於靶細胞周邊之微胞脫離之嵌段共聚物單元γ，位於滯留微胞附近之靶細胞之細胞膜變得容易受到刺激，該靶細胞之內噬作用變得活躍。其結果為，認為高分子微胞醫藥組成物向靶細胞之到達性提高，上述藥物之藥效進一步提高。
上述抗體具有與曲妥珠單抗或西妥昔單抗所具有之互補決定區(CDR)序列相同之CDR序列。更具體而言，上述抗體只要具有與於曲妥珠單抗或西妥昔單抗中存在之6個CDR序列中之至少1個相同之CDR序列即可，更嚴格而言，具有與於曲妥珠單抗或西妥昔單抗之重鏈或輕鏈中存在之3個CDR序列完全相同之CDR序列。上述抗體可為曲妥珠單抗或西妥昔單抗，亦可為3個CDR序列以外之序列部分處於至少一部分不同之狀態之類曲妥珠單抗抗體或類西妥昔單抗抗體。再者，於本發明之高分子微胞醫藥組成物中，上述抗體主要僅係作為對靶細胞之靶向因子而搭載，並非強烈地期待發揮出抗體依賴性細胞毒性(ADCC，Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity)活性。因此，下述實施例中雖然記載了搭載有曲妥珠單抗及西妥昔單抗之態樣，但原理上只要為具有與曲妥珠單抗或西妥昔單抗所具有之CDR序列相同之CDR序列之抗體或其片段，則可發揮出本發明之作用效果。
[2.嵌段共聚物單元α]
嵌段共聚物單元α係以上述式(I)表示。
上述式(I)中，m如上所述為30~20,000之整數。m例如可為50以上之整數、進而100以上之整數，又，例如可為5,000以下之整數、進而500以下之整數。聚乙二醇鏈段之分子量例如可為500以上、進而2,000以上，又，例如可為50,000以下、進而20,000以下。
上述式(I)中，x如上所述為5~100之整數。x例如可為10以上之整數、進而15以上之整數，又，例如可為60以下之 整數、進而40以下之整數、進而25以下之整數。
上述式(I)中，a如上所述為0~100之整數。a例如可為1以上之整數、進而5以上之整數，又，例如可為60以下之整數、進而40以下之整數。
上述式(I)中，b如上所述為0~100之整數。b例如可為1以上之整數、進而5以上之整數，又，例如可為60以下之整數、進而40以下之整數。
上述式(I)中，c如上所述為0~100之整數。c例如可為1以上之整數、進而5以上之整數，又，例如可為60以下之整數、進而40以下之整數。
上述式(I)中，d如上所述為0~100之整數。d例如可為1以上之整數、進而5以上之整數，又，例如可為60以下之整數、進而40以下之整數。
上述式(I)中，a與c之和如上所述為1~200之整數。a與c之和例如可為2以上之整數、3以上之整數、進而4以上之整數，又，例如可為40以下之整數、進而20以下之整數。
上述式(I)中，x與a與b與c與d之和例如可為10以上、進而20以上，又，例如可為200以下、進而100以下。
上述式(I)中，x：(a+b+c+d)例如為90：10~10：90，又，例如為80：20~20：80。
上述式(I)中，x：(b+d)例如為20：80~80：20，又，例如為35：75~75：35，又，例如為30：70~70：30。
上述式(I)中，(a+c)相對於(x+a+b+c+d)之比率(%)例如可為2%以上、進而7%以上，又，例如可為50%以下、進而 35%以下。
上述式(I)中，(a+c)：(b+d)例如為90：10~30：70，又，例如為80：20~40：60。
上述式(I)中，x/(a+c)例如可為0.5以上、進而1以上，又，例如可為15以下、進而10以下。
以下，對嵌段共聚物單元α之製造方法之具體例進行說明。
上述製造方法例如可具有酯鍵形成步驟，即，使聚乙二醇-共聚麩胺酸苄酯-聚還原型天冬胺酸(PEG-PBLG-pAsp(red))之共聚胺基酸鏈段之側鏈之羥基之全部或一部分與藥物之羧基進行反應而形成酯鍵。再者，上述酯鍵之形成可藉由藥物固有之羧基與羥基之反應而進行，亦可藉由經由連結基對該藥物另外導入之羧基與羥基之反應而進行。
上述製造方法可進而具有準備聚乙二醇-共聚麩胺酸苄酯-聚天冬胺酸(PEG-PBLG-pAsp)之步驟。於上述共聚胺基酸鏈段中，任意地配置有側鏈經苄酯化之麩胺酸殘基與天冬胺酸殘基。
上述製造方法可進而具有將PEG-PBLG-pAsp之天冬胺酸側鏈之羧基加以還原而形成羥基之步驟。其結果為，可獲得於聚乙二醇-共聚胺基酸中任意地配置有側鏈經苄酯化之麩胺酸殘基與還原型天冬胺酸殘基之共聚物(即，PEG-PBLG-pAsp(red))。
(酯鍵形成步驟)
作為使上述羥基與上述具有羧基之藥物進行反應而形成酯鍵之方法，可採用任意之適當方法。
(PEG-PBLG-pAsp準備步驟)
作為準備PEG-PBLG-pAsp之方法之一例，可列舉藉由任意之適當方法使聚乙二醇(PEG)與共聚麩胺酸苄酯-聚天冬胺酸(PBLG-pAsp)進行偶合之方法。
作為準備PEG-PBLG-pAsp之方法之另一例，可列舉如下方法：將單一末端受到保護且另一末端為胺基之聚乙二醇作為起始劑，添加天冬胺酸酐(Asp-NCA)及N-羧基-γ-苄基-L-麩胺酸酐(BLG-NCA)而使之反應。更具體而言，例如可列舉如下方法：使用MeO-PEG-CH2CH2CH2-NH2作為上述起始劑，向經脫水之有機溶劑中，以成為所需之聚合度(胺基酸單元數)之方式添加Asp-NCA及BLG-NCA而使之反應。
(PEG-PBLG-pAsp還原步驟)
作為將天冬胺酸側鏈之羧基還原而形成羥基之方法，可採用任意之適當方法。
[3.嵌段共聚物單元β]
嵌段共聚物單元β係以上述式(II)表示。
上述式(II)中，n如上所述為30~20,000之整數。n例如可為50以上之整數、進而100以上之整數，又，例如可為5,000以下之整數、進而1,000以下之整數。
上述式(II)中，q如上所述為5~100之整數。q例如可為10以上之整數、進而20以上之整數，又，例如可為80以下 之整數、進而60以下之整數。
嵌段共聚物單元β例如可藉由使於α末端具有順丁烯二醯亞胺基之聚乙二醇-聚麩胺酸苄酯(Maleimide-PEG-PBLG)與具有硫醇基之抗體或其片段進行反應而獲得。
[4.嵌段共聚物單元γ]
嵌段共聚物單元γ係以上述式(III)表示。
上述式(III)中，s如上所述為30~20,000之整數。s例如可為50以上之整數、進而100以上之整數，又，例如可為5,000以下之整數、進而1,000以下之整數。
上述式(III)中，t如上所述為5~100之整數。t例如可為20以上之整數、進而30以上之整數，又，例如可為90以下之整數、進而80以下之整數。
上述式(III)中，u如上所述為0~30之整數。u例如可為2以上之整數、進而4以上之整數，又，例如可為20以下之整數、進而15以下之整數、進而12以下之整數。
嵌段共聚物單元γ例如可藉由利用任意之適當方法使聚乙二醇(PEG)與共聚麩胺酸苄酯-聚麩胺酸(PBLG-pGlu)進行偶合而獲得。
又，嵌段共聚物單元γ例如可藉由將於α末端受到保護且ω末端為胺基之聚乙二醇作為起始劑，添加麩胺酸酐(Glu-NCA)及N-羧基-γ-苄基-L-麩胺酸酐(BLG-NCA)，並使之反應而獲得。
[5.高分子微胞醫藥組成物之製造方法]
本發明之高分子微胞醫藥組成物例如可藉由如下方式形成：使嵌段共聚物單元α與嵌段共聚物單元β溶解於有機溶劑中，或使嵌段共聚物單元α、嵌段共聚物單元β及嵌段共聚物單元γ溶解於有機溶劑中，加以混合使之均一化而獲得溶液，對該溶液進行減壓蒸餾去除，對所獲得之聚合物之膜添加水並進行混合，使之自組裝為微胞狀。又，例如亦可藉由將該等嵌段共聚物單元混合至水性溶液中，使之自組裝為微胞狀而形成。進而，例如本發明之高分子微胞醫藥組成物亦可藉由如下方式形成：使嵌段共聚物單元α與嵌段共聚物單元β前驅物溶解於有機溶劑中，或使嵌段共聚物單元α、嵌段共聚物單元β前驅物及嵌段共聚物單元γ溶解於有機溶劑中，加以混合使之均一化而得溶液，對該溶液進行減壓蒸餾去除，向所獲得之聚合物之膜添加水並進行混合，使之自組裝為微胞狀後，使上述抗體或其片段鍵結於嵌段共聚物單元β前驅物之聚乙二醇鏈段之α末端，成為嵌段共聚物單元β。進而，例如亦可藉由如下方式形成：於使該等嵌段共聚物單元混合至水性溶液中，使之自組裝為微胞狀後，使上述抗體或其片段鍵結於嵌段共聚物單元β前驅物之聚乙二醇鏈段之α末端，成為嵌段共聚物單元。作為上述有機溶劑，例如可列舉甲醇及丙酮。上述水性溶液例如可藉由將乙醇及二甲基亞碸等水溶性有機溶劑與公知之緩衝劑添加至純化水中而形成。
[實施例]
以下，藉由實施例更詳細地說明本發明。本發明並不受該等實施例之任何限定。
(實施例1)
藉由如下方式形成搭載有曲妥珠單抗及上述藥物(以下，有稱為E7974之情形)之高分子微胞醫藥組成物。
(嵌段共聚物單元α)
藉由如下方式製造上述高分子微胞醫藥組成物之嵌段共聚物單元α。作為PEG-PBLG-pAsp(red)，使用將共聚胺基酸之單末端進行乙醯化而成者。使PEG-PBLG-pAsp(red)之還原型天冬胺酸殘基之側鏈之羥基與E7974之羧基進行反應而形成酯鍵。其結果為，使用所獲得之共聚物作為嵌段共聚物單元α。共聚胺基酸之平均殘基數為40，上述嵌段共聚物單元α之PEG之平均分子量(Da)為10000，上述式(I)中，x：(a+b+c+d)之平均值為約50：50，(a+c)：(b+d)之平均值為約2：3，a+c之平均值為約8。
(嵌段共聚物單元γ)
準備γ1、γ2之2種共聚物作為嵌段共聚物單元γ。
γ1係上述式(III)所表示之共聚物，係PEG之平均分子量(Da)為10,000，t為60，u為8之共聚物，γ2雖然為同樣之聚合物，但係t為24，u為16之共聚物。
(鍵結有順丁烯二醯亞胺之聚合物(嵌段共聚物單元β前驅物))
準備於PEG末端具有順丁烯二醯亞胺基之順丁烯二醯亞胺-聚乙二醇-聚麩胺酸苄酯共聚合體(以下，有稱為順丁烯二醯亞胺-PEG-PBLG之情形)。上述順丁烯二醯亞胺-PEG-PBLG中，聚麩胺酸苄酯之單末端經乙醯化，PEG之平均分子量(Da)為10,000，麩胺 酸之平均殘基數為40，側鏈之羧酸之氫原子全部被取代為苄基。
(微胞之形成)
分別以莫耳比5：1：4個別地精確稱量嵌段共聚物單元α、鍵結有順丁烯二醯亞胺之聚合物(嵌段共聚物單元β前驅物)及嵌段共聚物單元γ2並置於小玻璃瓶中，添加甲醇或丙酮進行溶解。於將各溶液混合後，利用旋轉蒸發器(BUCHI製造，Rotavapor R-205、Vac(R) V-513)進行溶劑蒸餾去除而形成混合聚合物之膜，進而乾燥一晝夜。於添加100mM磷酸鹽緩衝液(PBS，Phosphate Buffer Solution)(pH值7.4)使膜分散後，使用NanoVater(吉田機械興業製造，NM2-L200)進行高壓分散處理，而獲得微胞。該微胞組分中含有使嵌段共聚物單元α、鍵結有順丁烯二醯亞胺之聚合物及嵌段共聚物單元γ2排列為放射狀而成之微胞。
(曲妥珠單抗與順丁烯二醯亞胺之反應)
向加入有相對於順丁烯二醯亞胺-PEG-PBLG之莫耳比為0.4之曲妥珠單抗的小玻璃瓶中添加純化水，而製備曲妥珠單抗溶液。使該曲妥珠單抗溶液之硼酸緩衝液之最終濃度成為50mM，且使乙二胺四乙酸(EDTA，Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)之最終濃度成為1mM，進而添加10mg/mL之Traut試劑(Pierce公司)後，於30℃下靜置45分鐘。繼而，對如此獲得之反應液進行凝膠過濾純化[GE Science公司製造之PD-10、洗提液：100mM之磷酸鈉緩衝液(pH值7.4)、1mM之EDTA]，並將高分子組分加以回收。
將該回收液與上述微胞組分混合，於30℃下靜置2 小時，藉此使順丁烯二醯亞胺-PEG-PBLG之順丁烯二醯亞胺基與曲妥珠單抗進行反應。對如此獲得之反應液進行超過濾純化(Millipore公司製造、Amicon Ultra-15、膜組分：300,000)，藉此去除未反應之曲妥珠單抗，而獲得含有高分子微胞醫藥組成物之溶液，該高分子微胞醫藥組成物包含嵌段共聚物單元α、β及γ2且搭載有曲妥珠單抗及E7974。
(比較例1)
不使用曲妥珠單抗，除此以外，以與實施例1相同之方式獲得抗體非結合型高分子微胞。
(比較例2)
製備與實施例1相同濃度之E7974溶液。再者，介質(Vehicle)均使用10%(w/v)蔗糖溶液。
[細胞毒性試驗1]
將因實施例1之高分子微胞醫藥組成物引起之細胞毒性與因比較例1之抗體非結合型高分子微胞及比較例2之E7974溶液引起之細胞毒性加以比較。對於因各樣品引起之細胞毒性，使用經由Summit Pharmaceuticals International Corporation而自美國菌種保存中心(ATCC，American Type Culture Collection)購買之源自人類攝護腺癌之PC-3細胞(第二型人類表皮生長因子受體(HER2，Human Epidermal Receptor 2)陰性)，基於WST法藉由如下方式進行評價。再者，HER2為曲妥珠單抗之靶分子。
於96孔板中，以每1孔包含約5000個PC-3細胞之方式，於將該細胞懸浮於90μL之培養基中之狀態下加以接種細胞，並於37℃、5%CO2之氣氛下培養一晚。使用RPMI1640(GibcoTM，Invitrogen)與10%胎牛血清(FBS，Fetal Bovine Serum)(biowest公司)作為培養基。繼而，以成為各種E7974濃度之方式利用培養基對各樣品進行稀釋，將所獲得之溶液添加至各孔中(每1孔10μL)，並於37℃、5%CO2之氣氛下培養72小時。其後，添加WST試劑(WST Reagent)(同仁)(每1孔10μL)，並於37℃、5%CO2之氣氛下持續培養約2小時。自各孔測定針對波長450nm之光線的吸光度(Abs450)，並基於下述數式算出細胞增殖率(% Cell Growth)。再者，該數式中之所謂對照之Abs450值係指自使用不含E7974之培養液實施上述培養而獲得之孔所獲得之吸光度。
將細胞毒性試驗1之結果示於圖1之圖表。上述圖表之縱軸表示上述細胞增殖率之平均值(% Cell Growth)，橫軸表示E7974濃度(μg/mL)，圖表之條表示標準偏差。根據圖1之結果得知，對於不具有抗體之靶分子之細胞，實施例1之高分子微胞醫藥組成物之細胞毒性與比較例1之抗體非結合型高分子微胞之細胞毒性之間並無差異。
[細胞毒性試驗2]
使用經由Summit Pharmaceuticals International Corporation自ATCC購買之源自人類胃癌之NCI-N87細胞(HER2陽性)，設為每1孔約10000個NCI-N87細胞，以及於37℃、5%CO2之氣氛下培養1小時，其後自孔內去除培養基，利用磷酸緩衝生理鹽水(PBS)將孔內洗淨2次後，添加新鮮培養基(每1孔100μL)，並繼續培養直至總培養時間達到72小時，除此以外，進行與細胞毒性試驗1相同之實驗。將結果示於圖2之圖表。
圖2之圖表之縱軸表示上述細胞增殖率之平均值(% Cell Growth)，橫軸表示E7974濃度(μg/mL)。根據圖2之結果得知，對於具有抗體之靶分子之細胞，實施例1之高分子微胞醫藥組成物之細胞毒性與比較例1之抗體非結合型高分子微胞之細胞毒性相比顯著較高。
[抗腫瘤效果確認試驗1]
自AddexBio公司(聖地牙哥、美國)購買源自人類乳癌之JIMT-1細胞(HER2陽性)。JIMT-1細胞雖然為HER2陽性，但已知僅單獨投予曲妥珠單抗不會產生細胞毒性。使用DMEM/Ham's F12+10%FBS+50μg/mL建它黴素+10μg/mL胰島素培養基，於5%CO2下，於37℃下培養JIMT-1細胞，並使之增殖直至達到移植所需之細胞數。向使細胞懸浮於生理鹽水中而獲得之細胞懸浮液中添加等量之經冰浴冷卻之細胞培養用受質(Japan Becton Dickinson股份有限公司製造，商品名「BD Matrigel」(註冊商標))後接種至雌性裸小鼠(Balb nu/nu、6週齡、Charles River Japan股份有限公司製造)之背部皮下。將裸小鼠飼養15天，於腫瘤體積成為約100mm3時投 予藥劑。藥劑係以E7974換算計每週1次共計3次尾靜脈內投予0.5mg/kg。實施例1之高分子微胞醫藥組成物之最大耐受量(MTD，Maximum Tolerated Dose)為2.5mg/kg。比較例1之抗體非結合型高分子微胞之最大耐受量為2.5mg/kg。比較例2之E7974溶液之最大耐受量為0.75mg/kg。因此，以E7974換算計0.5mg/kg之投予量相當於實施例1之高分子微胞醫藥組成物之最大耐受量之1/5，相當於比較例1之抗體非結合型高分子微胞之最大耐受量之1/5。進而，上述投予量相當於比較例2之E7974溶液之最大耐受量之2/3。再者，於抗腫瘤效果確認試驗1~3中，所謂最大耐受量，於每週一次共計3次向健康之小鼠尾靜脈內投予藥劑之情形時，係定義為小鼠未因該藥劑而死亡且未引起超過20%之體重減少的最大E7974換算投予量。進而，作為比較例3，投予作為介質之10%蔗糖液，並對裸小鼠之腫瘤體積及體重進行測定。於各實施例及各比較例中，使用6例動物作為1群。將對腫瘤體積進行測定而獲得之結果示於圖3之圖表，將對體重進行測定而獲得之結果示於圖4之圖表。
圖3之圖表之縱軸表示小鼠之腫瘤體積之平均值(mm3)，橫軸表示最初投予藥劑後經過之天數，圖表之條表示標準誤差。圖3之向上之箭頭分別表示投予藥劑之第0天、第7天、及第14天(以下，於圖4及圖6中相同)。根據圖3之結果得知，實施例1之高分子微胞醫藥組成物與比較例1之抗體非結合型高分子微胞、比較例2之E7974溶液、及比較例3之對照群相比，可顯著地抑制源自人類乳癌之JIMT-1細胞之增殖。
圖4之圖表之縱軸表示投予藥劑時之小鼠之體重相 對於即將投予藥劑前之小鼠之體重之相對值的平均值(%)，橫軸表示最初投予藥劑後經過之天數，圖表之條表示標準誤差。於實施例1之高分子微胞醫藥組成物、比較例1之抗體非結合型高分子微胞、比較例2之E7974溶液、及比較例3之對照群之任一情形時，於小鼠之體重變化方面均並無較大差異。
(實施例2)
使用西妥昔單抗代替曲妥珠單抗，除此以外，以與實施例1相同之方式形成高分子微胞醫藥組成物。
[抗腫瘤效果確認試驗2]
使用實施例2之高分子微胞醫藥組成物代替實施例1之高分子微胞醫藥組成物，使用經由Summit Pharmaceuticals International Corporation自ATCC購買之源自人類胰腺癌之BxPC-3細胞(表皮生長因子受體(EGFR，Epidermal Growth Factor Receptor)陽性)，以E7974換算計投予藥劑0.25mg/kg，除此以外，進行與抗腫瘤效果確認試驗1相同之實驗。再者，EGFR為西妥昔單抗之靶分子。以E7974換算計0.25mg/kg之投予量相當於實施例1之高分子微胞醫藥組成物及比較例1之抗體非結合型高分子微胞之最大耐受量之1/10。進而，上述投予量相當於比較例2之E7974溶液之最大耐受量之1/3。將對腫瘤體積進行測定而獲得之結果示於圖5之圖表，將對體重進行測定而獲得之結果示於圖6之圖表。
圖5之圖表之縱軸表示小鼠之腫瘤體積之平均值(mm3)，橫軸表示最初投予藥劑後經過之天數，圖表之條表示標準 誤差。圖5之向下之箭頭分別表示投予藥劑之第0天、第7天、及第14天。根據圖5之結果得知，實施例2之高分子微胞醫藥組成物與比較例1之抗體非結合型高分子微胞、比較例2之E7974溶液、及比較例3之對照群相比，可顯著地抑制源自人類胰腺癌之BxPC-3細胞之增殖。
圖6之圖表之縱軸表示投予藥劑時之小鼠之體重相對於即將投予藥劑前之小鼠之體重之相對值的平均值(%)，橫軸表示最初投予藥劑後經過之天數，圖表之條表示標準誤差。於實施例2之高分子微胞醫藥組成物、比較例1之抗體非結合型高分子微胞、比較例2之E7974溶液、及比較例3之對照群之任一情形時，於小鼠之體重變化方面均並無較大差異。
[抗腫瘤效果確認試驗3]
對實施例2之高分子微胞醫藥組成物(結合有西妥昔單抗之抗體藥物結合型微胞(ADCM，Antibody Drug Conjugated Micelle))、比較例1之抗體非結合型高分子微胞(非靶向微胞(Untargeted micelles))、及比較例2之E7974溶液，以如下之方式求出與抗腫瘤效果確認試驗2相關之50%有效劑量(ED50)及治療指數(Therapeutic index)。50%有效劑量於每週一次合計3次向小鼠尾靜脈內投予藥劑之情形時，係定義為用以將腫瘤體積之增加抑制50%之E7974換算必需量，係藉由投予各種濃度之藥劑而確定。最大耐受量(MTD)之定義如上所述，治療指數係將最大耐受量除以50%有效劑量而獲得之值。進而，算出實施例2之高分子微胞醫藥組成物及比較例1之抗體非結合型高分子微胞之治療指數相對於比較例2之E7974溶 液之治療指數之比率(Ratio to E7974)。將結果示於表1。
根據表1之結果得知，實施例2之高分子微胞醫藥組成物具有遠優於比較例1之抗體非結合型高分子微胞及比較例2之E7974溶液的藥效。
(產業上之可利用性)
本發明可適宜地用於抗癌劑等醫藥製劑等領域。

Claims (3)

  1. 一種高分子微胞醫藥組成物，其係包含嵌段共聚物，且搭載有藥物及抗體或其片段者，該藥物係以下述式(i)表示， 該抗體具有與曲妥珠單抗(Trastuzumab)或西妥昔單抗(Cetuximab)所具有之CDR序列相同之CDR序列，該嵌段共聚物包含下述式(I)所表示之嵌段共聚物單元α與下述式(II)所表示之嵌段共聚物單元β， 上述式(I)中，X表示直接或經由連結基而鍵結之該藥物之殘基，m為30~20,000之整數，x為5~100之整數，a為0~100之整數，b為0~100之整數，c為0~100之整數，d為0~100之整數，a與c之和為1~200之整數，共聚胺基酸鏈段中之各重複單位之鍵結順序為任意， 上述式(II)中，A表示該抗體或其片段之殘基，n為30~20,000之整數，q為5~100之整數。
  2. 如請求項1之高分子微胞醫藥組成物，其中，上述嵌段共聚物進而包含下述式(III)所表示之嵌段共聚物單元γ，[化4] 上述式(III)中，s為30~20,000之整數，t為5~100之整數，u為0~30之整數，共聚胺基酸鏈段中之各重複單位之鍵結順序為任意。
  3. 如請求項2之高分子微胞醫藥組成物，其中，u為0~20之整數。
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