WO2014084378A1 - 環状ｒｇｄ配列含有ペプチドを含む抗癌剤 - Google Patents

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dachpt
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micelle
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片岡　一則
西山　伸宏
三浦　裕
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国立大学法人 東京大学
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    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]

Definitions

  • the present invention relates to an anticancer agent. Specifically, the present invention relates to an anticancer agent having advantages such as reduced side effects such as weight loss of administration subjects.
  • Chemotherapy with anticancer agents is a major option for cancer treatment, but many anticancer active ingredients are toxic not only to tumor cells but also to normal cells, and may cause side effects.
  • conventional low-molecular-weight anticancer active ingredients are widely distributed not only to target tumor lesions but also to other normal tissues and organs, and because the blood residence time is short due to metabolism, the target site It is difficult to maintain an effective concentration in Therefore, there is a tendency to repeatedly administer a large amount of drug, and accordingly, there is a higher possibility that side effects such as weight loss will occur.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. Hei 8-188541 by a part of the present inventors discloses a capacitive coupling formed by self-organizing a block copolymer having an uncharged segment and a charged segment.
  • Type polymeric micelle drug carriers are disclosed.
  • Patent Document 2 International Publication No. 2005/056641 pamphlet
  • II diaminocyclohexaneplatinum
  • an antitumor agent that binds the antitumor component activity of
  • Patent Document 3 (WO 2006/118260) by a part of the present inventors also discloses a first block copolymer (for example, PEG-polyethylene) having an uncharged hydrophilic segment and a cationic segment. And a second block copolymer having a non-charged hydrophilic segment and an anionic segment (for example, PEG-polyanion, etc.) is self-assembled. Disclose.
  • a first block copolymer for example, PEG-polyethylene
  • a cationic segment for example, PEG-polyanion, etc.
  • Non-Patent Document 1 (Nasongkla et al., Nano Letters, (2006), 6, 11, ⁇ 2427-30) discloses an anticancer effect by binding a cRGD peptide to a hydrophilic block of doxorubicin-containing polymeric micelles. Report improvement.
  • the present inventors have used a peptide containing a cyclic arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence as a ligand for an anticancer agent, thereby reducing the gastrointestinal toxicity due to the anticancer agent and reducing the weight of the patient.
  • RGD cyclic arginine-glycine-aspartic acid
  • the gist of the present invention is as follows.
  • An anticancer agent comprising an anticancer active ingredient and a cyclic arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence-containing peptide.
  • RGD cyclic arginine-glycine-aspartic acid
  • the anticancer agent according to [1] further comprising a carrier carrying an anticancer active ingredient, wherein a cyclic RGD sequence-containing peptide is bound to the carrier.
  • the anticancer agent of the present invention accumulates and is discharged relatively rapidly from the liver to the digestive tract (small intestine). In addition to specifically inhibiting brain growth by acting on brain tumor tissue, it also exhibits growth-suppressing action specific to breast cancer cells, and greatly increases the maximum tolerated dose (MTD) against cervical cancer cells. It also has the effect of increasing.
  • MTD maximum tolerated dose
  • Example A shows 20% cRGD-DACHPt-supported micelles (Example A: “20% cRGD / m”) and 0% cRGD-DACHPt-supported micelles (Comparative Example A: “DACHPt / m”) 100 ⁇ g each (per rat) It is a graph which shows a time-dependent change of the accumulation platinum amount (microgram) discharged
  • 4 (a)-(c) show 20% cRGD-DACHPt-supported micelles (Example A: “20% cRGD / m”), 40% cRGD-DACHPt-supported micelles (Example B: “40% cRGD / m”).
  • FIG. 5 (c) It is a graph which shows quantitative value distribution of the fluorescence signal by IVCLSM in the inside solid square area. 8 (a) and 8 (b) were obtained 5 minutes and 5 hours after administration of micelles carrying 20% cRAD-DACHPt (Comparative Example B: “20% cRAD / m”), respectively, FIG. 5 (c) It is a graph which shows quantitative value distribution of the fluorescence signal by IVCLSM in the inside solid square area.
  • FIG. 5 (c) It is a graph which shows quantitative value distribution of the fluorescence signal by IVCLSM in the inside solid square area.
  • FIG. 9 shows micelles carrying 20% cRGD-DACHPt (Example A: “20% cRGD / m”), micelles carrying 40% cRGD-DACHPt (Example B: “40% cRGD / m”), and 0% cRGD.
  • FIG. 6 is a graph showing measurement results of accumulation in normal brain tissue in normal mice administered with 100 ⁇ g of each of DACHt-supported micelles (Comparative Example A: “DACHPt / m”) (DACHPt equivalent amount per mouse).
  • FIG. 6 is a graph showing measurement results of accumulation in normal brain tissue in normal mice administered with 100 ⁇ g of each of DACHt-supported micelles (Comparative Example A: “DACHPt / m”) (DACHPt equivalent amount per mouse).
  • Example 10 shows 20% cRGD-DACHPt-supported micelle (Example A: “20% cRGD / m”) 3.0 mg / kg (DACCHt equivalent per kg body weight, the same applies hereinafter), 20% cRAD-DACHPt-supported micelle (comparison)
  • Example B “20% cRAD / m”)
  • oxaliplatin Comparative Example C
  • PBS corresponds to the control example.
  • Example 11 shows 20% cRGD-DACHPt-supported micelle (Example A: “20% cRGD / m”) 3.0 mg / kg (DACCHt equivalent per 1 kg body weight, the same applies hereinafter), 20% cRAD-DACHPt-supported micelle (comparison)
  • Example B “20% cRAD / m”)
  • MDA-MB-231 tumor breast cancer
  • oxaliplatin Comparative Example C
  • FIGS. 12 (a) and 12 (b) show tumors in mice transplanted subcutaneously with Hela tumor (cervical cancer) administered with various doses of 0% cRGD-DACHPt-loaded micelles (Comparative Example A: “DACHPt / m”). It is a graph which shows a time-dependent change of a volume and a body weight.
  • FIGS. 13 (a) and (b) show in mice transplanted subcutaneously with Hela tumor (cervical cancer) administered 20% cRGD-DACHPt-loaded micelles (Example A: “20% cRGD / m”) at various doses. It is a graph which shows a time-dependent change of a tumor volume and a body weight.
  • FIGS. 13 (a) and (b) show tumors in mice transplanted subcutaneously with Hela tumor (cervical cancer) administered 20% cRGD-DACHPt-loaded micelles (Example A: “20% cRGD / m”) at various dose
  • the anticancer agent of the present invention comprises an anticancer active ingredient and a peptide containing a cyclic arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence.
  • a cyclic RGD sequence-containing peptide (hereinafter sometimes referred to as “cRGD peptide”) is a cyclic peptide having at least one arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence.
  • the anticancer agent of the present invention having cRGD peptide as a ligand, it is possible to administer a larger amount to a patient and obtain a greater therapeutic effect while suppressing the side effect of weight loss than conventional anticancer agents. Become.
  • the presence of the cRGD peptide promotes the uptake of an anticancer drug into the liver through some mechanism (for example, activation of the above-described integrin molecule) and rapid elimination to the outside of the body through bile, reducing the above-mentioned gastrointestinal toxicity, It is estimated that it contributes to the reduction of the side effects of weight loss. In any case, it is a surprising finding that cRGD peptide has an action of promoting rapid elimination of anticancer agents through bile.
  • the present inventors show that the anticancer agent of the present invention having cRGD peptide as a ligand accumulates and discharges relatively rapidly from the liver to the digestive tract (small intestine) (2.4 and the like in Examples described later).
  • the blood-brain barrier of normal brain tissue (Blood-Brain Barrier: BBB) does not pass, but it passes the blood-brain tumor barrier (Blood-Brain Tumor Barrier: BBTB) and acts specifically on the brain tumor tissue (Refer to 2.5 etc. of the below-mentioned Example), It shows a specific growth-inhibiting action also to a breast cancer cell (refer to 2.6 etc.
  • a cRGD peptide is used as a ligand for an anticancer agent.
  • a cRGD peptide is a peptide having at least one arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence and forming a cyclic structure.
  • RGD arginine-glycine-aspartic acid
  • the RGD sequence is known to have a function of binding to and activating integrin molecules (particularly ⁇ V ⁇ 3 and ⁇ V ⁇ 5 ) that are cell adhesion molecules.
  • any cRGD peptide can be used as long as it has such an RGD sequence and forms a cyclic structure.
  • sequence length of the cRGD peptide is not limited, but from the viewpoint of forming a ring structure, the number of amino acids is usually preferably 5 or more and 10 or less.
  • the amino acid constituting the cRGD peptide is preferably mainly an L-type amino acid from the viewpoint of biocompatibility, but is not composed of only an L-type amino acid from the viewpoint of forming a ring structure. It preferably contains at least one or more D-type amino acids.
  • the type of amino acid constituting the portion other than the RGD sequence is arbitrary, and in addition to the 20 types of amino acids constituting the living body, other types of natural amino acids are used as long as they do not undesirably affect the anticancer drug administration target. Or a synthetic amino acid.
  • sequences are also arbitrary, but are desirably sequences that do not substantially impair the activity of the anticancer agent and do not interfere with the function of the RGD sequence.
  • the cRGD peptide may have at least one RGD sequence, but may have two or more RGD sequences.
  • cRGD peptides include, but are not limited to, peptides having the following amino acid sequences.
  • RGDfK (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (SEQ ID NO: 1)
  • GRGDEPDG (Gly-Arg-Gly-Asp-Glu-Pro-Asp-Gly) (SEQ ID NO: 2)
  • RGDNI-NH 2 (Arg-Gly-Asp-Asn-Ile-Glu-NH 2 )
  • G-Pmc-RGDCA Gly-Pmc-Arg-Gly-Asp-Cys-Ala: Pmc is ⁇ , ⁇ -pentamethylene) (SEQ ID NO: 4)
  • G-Pen-GRGDNYCA (Gly-Pen-Gly-Arg-Gly-Asp-Asn-Tyr-Cys-Ala: Pen is penicillamine) (SEQ ID NO: 5)
  • cRGDfK is preferable as the cRGD peptide.
  • the structural formula is shown below.
  • the cRGD peptide can be synthesized by a known automatic synthesizer (for example, Applied Biosystems, Inc., Model 431A, etc.).
  • linkers may be bound to the cRGD peptide before use. Although it does not restrict
  • Anticancer active ingredient The anticancer agent of the present invention has an anticancer active ingredient in addition to the ligand cRGD peptide.
  • the anticancer active ingredient any pharmaceutically active ingredient having an anticancer effect can be used. Examples of the anti-cancer active ingredient include the following.
  • Alkylating agents for example, nitrogen mustards such as cyclophosphamide, ifosfamide, melphalan, busulfan; nitrosoureas such as nimustine, ranimustine, dacarbacin, procarbacin, temozolomide, bendamustine; cisplatin, carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, Platinum drugs such as dahaplatin.
  • nitrogen mustards such as cyclophosphamide, ifosfamide, melphalan, busulfan
  • nitrosoureas such as nimustine, ranimustine, dacarbacin, procarbacin, temozolomide, bendamustine
  • cisplatin carboplatin, oxaliplatin, nedaplatin, Platinum drugs such as dahaplatin.
  • Antifolate inhibitors for example, dihydrofolate reductase (DHFR) inhibitors; dihydropteroate synthase inhibitors such as methotrexate, trimethoprim, and pyrimethamine.
  • DHFR dihydrofolate reductase
  • dihydropteroate synthase inhibitors such as methotrexate, trimethoprim, and pyrimethamine.
  • Pyrimidine metabolism inhibitors for example, thymidylate synthase inhibitors: fluorouracil, flucytosine, etc.
  • Purine metabolism inhibitors Inosine 5'-monophosphate dehydrogenase (IMPDH) inhibitors such as 6-mercaptopurine and azathioprine; Inhibition of adenosine deaminase (ADA) such as pentostatin Medicine etc.
  • IMPDH Inosine 5'-monophosphate dehydrogenase
  • ADA adenosine deaminase
  • Nucleotide analogs Purine analogs such as thioguanine, fludarabine phosphate, and cladribine; pyrimidine analogs such as cytarabine and gemcitabine.
  • Ribonucleotide reductase inhibitor For example, hydroxyurea and the like.
  • Other antimetabolite L-asparaginase, for example.
  • Topoisomerase inhibitors For example, camptothecins such as irinotecan and nogitecan and derivatives thereof; anthracyclines such as doxorubicin; epipodophyllotoxins such as etoposide; quinolones such as levofloxacin and ciprofloxacin.
  • -Microtubule polymerization inhibitors Vinca alkaloids such as vinblastine, vincristine and vindesine; colchicine and the like.
  • -Microtubule depolymerization inhibitor For example, taxanes: paclitaxel, docetaxel, etc.
  • -Anticancer antibiotics For example, sarcomacin, mitomycin C, doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, bleomycin and the like.
  • tyrosine kinase inhibitors such as imatinib, gefitinib, erlotinib, dasatinib, vandetanib, sunitinib, lapatinib, nilotinib, crizotinib; Raf kinase inhibitors such as sorafenib; TNF- ⁇ inhibitors such as etanercept; bortezomib Proteasome inhibitors: rituximab, cetuximab, infliximab, baciliximab, tocilizumab, trastuzumab, bevacizumab, omalizumab, mepolizumab, anakinra, gemtuzumab ozogamycin, palivizumab, ritolizumab, celtrizumab Monoclonal antibodies such as golimumab and ipilimumab.
  • the anticancer agent of the present invention is not limited as long as it contains an anticancer active ingredient and a cRGD peptide as a ligand, depending on various conditions such as the type of anticancer active ingredient and the cancer to be treated. Can be set.
  • Examples of the configuration of the anticancer agent of the present invention include a configuration in which a cRGD peptide is bound to an anticancer active component directly or via a linking group (hereinafter sometimes referred to as “configuration A”), and an anticancer active component. And a configuration in which a cRGD peptide is bound to a carrier (hereinafter may be referred to as “configuration B”).
  • Configuration A (configuration in which cRGD peptide is bound to an anticancer active ingredient)
  • the cRGD peptide is bound to the anticancer active ingredient directly (that is, by a covalent bond) or via a linking group.
  • the terminal amino group or carboxyl group of the cRGD peptide is covalently bound to any group that does not inhibit the active site of the anticancer active ingredient.
  • linking group When the cRGD peptide is bound to the anticancer active ingredient via a linking group, one end of the linking group is usually bound to the amino group or carboxyl group at the end of the cRGD peptide, and the other end of the linking group is the anticancer active ingredient. It will bind to any group that does not interfere with the active site.
  • the type of the linking group is not limited and may be set according to various conditions such as the type of the anticancer active ingredient and the cancer to be treated, but as an example, a divalent or trivalent or more organic group, preferably a divalent group These organic groups are mentioned.
  • the direction of these linking groups is also arbitrary, and either side may be bound to the cRGD peptide, and any side may be
  • Configuration B (configuration in which cRGD peptide is bound to a carrier carrying an anticancer active ingredient)
  • the cRGD peptide is bound to a carrier that carries an anticancer active ingredient.
  • “supporting” means that the carrier holds the anticancer active ingredient in a manner that does not substantially prevent the anticancer active ingredient from exerting an anticancer action at least at a desired target site.
  • Specific support modes include physical retention (eg, inclusion of an anticancer active ingredient by a carrier), chemical retention (eg, covalent bond, ionic bond, coordination bond, hydrogen bond, electrostatic bond). And the like, and combinations thereof, and the like.
  • a micelle is a substantially spherical structure formed by associating amphiphilic molecules in a state where a hydrophilic part is directed to the outside and a hydrophobic part is directed to the inside.
  • the vesicle is formed of a double membrane in which amphipathic molecules are associated with the hydrophilic portion on the outside and the hydrophobic portion on the inside, and has a void surrounded by the double membrane inside. It is a spherical structure.
  • Polymer micelle The structure of the micelle used as the carrier of the anticancer agent of the present invention is arbitrary, but for example, an uncharged hydrophilic polymer disclosed in JP-A-8-188541 (Patent Document 1) or the like.
  • Patent Document 1 An uncharged hydrophilic polymer disclosed in JP-A-8-188541 (Patent Document 1) or the like.
  • a specific electrostatic bond type polymer micelle obtained by self-organizing a block copolymer having a chain segment and a charged hydrophobic polymer chain segment is preferred.
  • this electrostatic coupling type polymer micelle will be described.
  • the non-charged hydrophilic polymer chain segment of the block copolymer forming the polymer micelle includes polyalkylene glycols such as polyethylene glycol and polypropylene glycol, polyalkylene oxides, polysaccharides, poly Examples include polymer chain segments derived from acrylamide, polysubstituted acrylamide, polymethacrylamide, polysubstituted methacrylamide, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyacrylic acid ester, polymethacrylic acid ester, polyamino acid and the like.
  • the non-charged hydrophilic polymer chain segment is preferably a polymer chain segment derived from polyethylene glycol.
  • the molecular weight of the uncharged hydrophilic polymer chain segment is preferably 2,500 Da or more, more preferably 5,000 Da or more, still more preferably 8,000 Da or more, and preferably 200,000 Da or less, more preferably 20,000 Da. Hereinafter, it is more preferably 15,000 Da or less.
  • the uncharged hydrophilic polymer chain segment may contain a chargeable substituent such as an amino group or a carboxyl group as long as the formation of micelles is not hindered.
  • the cRGD peptide is preferably introduced into this uncharged hydrophilic polymer chain segment, particularly at its end (the end opposite to the charged hydrophobic polymer chain segment binding side).
  • the charged hydrophobic polymer chain segment of the block copolymer forming the polymer micelle includes a polyamino acid having a charged side chain (for example, polyaspartic acid, polyglutamic acid, polylysine, poly Arginine, polyhistidine, etc.), polymalic acid, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, polyethyleneimine, polyvinylamine, polyallylamine, polyvinylimidazole and the like.
  • the charged hydrophobic polymer chain segment is preferably a polymer chain segment derived from a polyamino acid chain having a charged side chain.
  • the number of repeating units of the charged hydrophobic polymer chain segment is desirably 10 or more, preferably 20 or more, and desirably 200 or less, preferably 100 or less, more preferably 60 or less.
  • Linking group As the block copolymer forming the polymer micelle, the terminal ends of each main chain of the above-mentioned non-charged hydrophilic polymer chain segment and charged hydrophobic polymer chain segment are bonded with a covalent bond or a linking group.
  • bonded through can be used.
  • the linking group is not limited, but includes an oxy group (—O—), a carbonyl group (—C ( ⁇ O) —), a sulfide group (—S—), and a disulfide group (—S—S—).
  • block copolymer As a block copolymer which forms a polymeric micelle, the compound represented by following formula (1) and (2) can be illustrated more specifically.
  • R 1 and R 3 are each independently a hydrogen atom, an optionally substituted linear or branched C 1-12 alkyl group, or a block copolymer The functional group derived from the catalyst at the time of manufacture of this. As will be described later, the cRGD peptide is preferably introduced at this position.
  • R 2 is a hydrogen atom, a saturated or unsaturated C 1 to C 29 aliphatic carbonyl group, or an arylcarbonyl group.
  • R 4 is a hydroxyl group, a saturated or unsaturated C 1 to C 30 aliphatic oxy group or an aryl-lower alkyloxy group.
  • x is an integer of 10 to 200
  • y is 1 or 2
  • n is an integer of 55 to 4,600
  • m is 0 to 200. It is an integer.
  • R 6 represents each amino acid in one block copolymer. Each unit is independently selected and exists at random, but when R 6 is a hydrogen atom, it is 75% or less of the entire R 6 .
  • n is preferably an integer of 110 or more, more preferably 180 or more, preferably 460 or less, more preferably 340 or less, and x is preferably 20 or more.
  • x is preferably 20 or more.
  • L 1 represents —NH—, —O—, —O—Z—NH—, —CO—, —CH 2 —, and —O—Z—S—Z—NH.
  • L 2 is -OCO-Z-CO- and -NHCO-Z-CO- ( Wherein Z is a C 1 -C 6 alkylene group).
  • L 1 represents —NH—, —O—, —O—Z—NH—, —CO—, —CH 2 —, and —O—Z—S—Z—NH.
  • L 2 is -OCO-Z-CO- and -NHCO-Z-CO- ( Wherein Z is a C 1 -C 6 alkylene group).
  • Block copolymer production method The block copolymer forming the polymer micelle is prepared, for example, by preparing polymers corresponding respectively to the non-charged hydrophilic polymer chain segment and the charged hydrophobic polymer chain segment. Or after refine
  • the block copolymer of formula (1) for example, after forming the polyethylene glycol chain by performing an anionic living polymerization using an initiator capable of imparting R 1, an amino group introduced to the growth-terminal Then, N-carboxylic acid anhydride (NCA) of protected amino acid such as ⁇ -benzyl-L-aspartate, ⁇ -benzyl-L-glutamate, N ⁇ -ZL-lysine is polymerized from the amino terminus. Can also be formed.
  • NCA N-carboxylic acid anhydride
  • other components may be used for the production of the polymer micelle.
  • other components include non-charged or charged polymers other than the above-mentioned block copolymers, charged nanoparticles, and crosslinking agents.
  • the amount of other components to be used is not limited, but it is preferable to keep it within a range that does not hinder the formation of polymer micelles or impair the physical properties of the polymer micelles to be formed. Specifically, it is usually 30% or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less, based on the total weight of the polymer micelles.
  • a manufacturing method of the polymer micelle for example, a method of dissolving or dispersing the above-mentioned block copolymer (and optionally other components) in an aqueous solvent can be mentioned.
  • the kind of aqueous solvent is not limited. Water is preferable, but a solvent in which other components are mixed with water, such as physiological saline, an aqueous buffer, a mixed solvent of water and a water-soluble organic solvent, or the like is also used as long as the formation of polymer micelles is not hindered. be able to.
  • the salt concentration can be appropriately adjusted within a range that does not interfere with the formation of polymer micelles, but is preferably 1 mM or more, more preferably 5 mM or more, and preferably 300 mM or less. More preferably, it is 150 mM or less.
  • Specific examples of the aqueous buffer include 10 mM HEPES buffer.
  • Conditions such as the concentration and pH of the block copolymer in each solution and the temperature at the time of formation are appropriately determined in consideration of conditions such as the solubility of the block copolymer in the solution and the formation efficiency of polymer micelles.
  • a time for allowing the solution containing the formed polymer micelles to stand may be provided.
  • the time for which the mixed solution is allowed to stand varies depending on conditions such as the formation efficiency of polymer micelles, but is preferably 50 hours or less, more preferably 30 hours or less.
  • no cross-linking agent is used, there is a tendency that the diameter of the formed polymer micelle tends to increase with time.
  • operations such as dialysis, dilution, concentration, and stirring may be added as appropriate.
  • Polymer vesicle used as the carrier of the anticancer agent of the present invention is arbitrary, but in the present invention, for example, non-disclosure disclosed in International Publication No. 2006/118260 (Patent Document 3) and the like.
  • An electrostatic coupling type polymer vesicle obtained by self-organizing is preferable.
  • this electrostatic coupling type polymer vesicle will be described in detail.
  • Uncharged hydrophilic polymer chain segment of the first and second block copolymers includes polyalkylene glycols such as polyethylene glycol and polypropylene glycol, and poly (2-isopropyl-2 -Oxazoline), polysaccharides, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyacrylic acid ester, polymethacrylic acid ester, polyalkylene oxide, polyvinyl pyrrolidone, polyamino acid and the like.
  • polyalkylene glycols such as polyethylene glycol and polypropylene glycol, and poly (2-isopropyl-2 -Oxazoline
  • polysaccharides polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylamide, polymethacrylamide, polyacrylic acid ester, polymethacrylic acid ester, polyalkylene oxide, polyvinyl pyrrolidone, polyamino acid and the like.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the non-charged hydrophilic polymer chain segment is preferably 500 or more, more preferably 1,000 or more, and preferably 15,000 or less, more preferably In the case of a segment derived from poly (2-isopropyl-2-oxazoline), preferably 1,000 or more, more preferably 1,000 or more, and preferably 30,000 or less, more preferably 10,000 or less.
  • the uncharged hydrophilic polymer chain segment may contain a chargeable substituent such as an amino group or a carboxyl group as long as the formation of micelles is not hindered.
  • the cRGD peptide is preferably introduced into this uncharged hydrophilic polymer chain segment, particularly at its end (the end opposite to the charged hydrophobic polymer chain segment binding side).
  • the charged polymer chain segment of the first and second block copolymers that is, the cationic polymer chain segment of the first block copolymer, and the second block copolymer
  • the anionic polymer chain segment contained preferably has substantially the same chain length and charge number.
  • the cationic polymer chain segment of the first block copolymer and the anionic polymer chain segment of the second block copolymer are polymer blocks each composed of a repeating unit having a monovalent charge.
  • the ratio of the number of repeating units of the cationic polymer chain segment of the first block copolymer to the number of repeating units of the anionic polymer chain segment of the second block copolymer is approximately 1: 1.
  • the repeating unit and the number of charges of the charged polymer chain segment can be adjusted by appropriately selecting the monomer constituting the charged polymer chain segment, the reaction conditions at the time of producing the charged polymer chain segment, and the like.
  • polyamine When polyamine is used as the cationic polymer chain segment, it is usually positively charged by adding an acid to the polyamine.
  • the type of acid to be added is appropriately determined according to the usage of vesicles and the like.
  • Preferable examples of the cationic polymer chain segment that the first block copolymer has include a polymer chain segment represented by the following formula (I).
  • R 1 represents a — (CH 2 ) 3 NH 2 group or —CONH (CH 2 ) s —X.
  • s is 0 to 20
  • X is —NH 2 , pyridyl group, morpholyl group, 1-imidazolyl group, piperazinyl group, 4- (C 1-6 alkyl) -piperazinyl group, 4- (amino C 1-6 alkyl) -piperazinyl group, pyrrolidin-1-yl group, N-methyl-N-phenylamino group, piperidinyl group, diisopropylamino group, dimethylamino group, diethylamino group, — (CH 2 ) t NH 2 , And — (NR 9 (CH 2 ) o ) p NHR 10 is at least one group selected from the group consisting of:
  • R 9 represents a hydrogen atom or a methyl group
  • R 10 represents a hydrogen atom
  • R 2 represents a hydrogen atom, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryloyl group or a methacryloyl group.
  • a is 0 to 5,000, and b is 0 to 5,000. However, a + b is 2 to 5,000.
  • R 1 represents —CONH (CH 2 ) s —X
  • X may be the same or different functional group for each repeating unit of the charged polymer chain segment. It may be.
  • R 1 represents a —CONH (CH 2 ) S —NH 2 group, s is 2 to 5, R 2 represents a hydrogen atom, a is 0 to 200, and b is It is preferably 0 to 200 and a + b is 10 to 200.
  • each repeating unit is also arbitrary, and each repeating unit may exist as a block or may exist randomly.
  • anionic polymer chain segment that the second block copolymer has include a polymer chain segment represented by the following formula (II).
  • R 2 represents a hydrogen atom, an acetyl group, a trifluoroacetyl group, an acryloyl group or a methacryloyl group.
  • each R 3 independently represents a methylene group or an ethylene group.
  • R 3 may be the same functional group or a different functional group for each repeating unit of the charged polymer chain segment.
  • each repeating unit is also arbitrary, and each repeating unit may exist as a block or may exist randomly.
  • Linking group As the first and second block copolymers, the ends of the main chains of the non-chargeable hydrophilic polymer chain segment and the anionic or cationic polymer chain segment described above are covalently bonded or linking groups. What was couple
  • the linking group is not limited, but includes an oxy group (—O—), a carbonyl group (—C ( ⁇ O) —), a sulfide group (—S—), and a disulfide group (—S—S—).
  • first block copolymer is represented by the following formula (III).
  • R 1 , R 2 , a, and b represent the same definition as in the above formula (I).
  • R 4 represents a hydrogen atom, a linear or branched C 1-12 alkyl group which may be substituted, or a functional group derived from a catalyst at the time of production of the block copolymer. To express. As will be described later, the cRGD peptide is preferably introduced at this position.
  • R 5 represents — (CH 2 ) g NH—.
  • g is 0-5.
  • e is 5 to 2,500.
  • R 1 represents a —CONH (CH 2 ) S —NH 2 group, s is 2 to 5, R 2 represents a hydrogen atom, R 4 represents a methyl group, and a represents It is preferably 0 to 200, b is 0 to 200, a + b is 10 to 200, and e is 10 to 300.
  • the first block copolymer is represented by the following formula (IV).
  • R 1 , R 2 , a and b represent the same definitions as those in the formula (I).
  • R 6 represents a hydrogen atom, a linear or branched C 1-12 alkyl group which may be substituted, or a functional group derived from a catalyst at the time of production of the block copolymer. To express. As will be described later, the cRGD peptide is preferably introduced at this position.
  • R 7 represents — (CH 2 ) h NH—.
  • h is 0-5.
  • R 8 represents a linear or branched C 1-12 alkyl group.
  • f is 5 to 2,500.
  • R 1 represents — (CH 2 ) 3 NH 2
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 6 represents a methyl group
  • R 8 represents —CH (CH 3 ) 2
  • b is 0 to 200
  • a + b is 10 to 200
  • f is preferably 10 to 300.
  • a 2nd block copolymer is what is represented by a following formula (V).
  • R 2 , R 3 , c and d represent the same definition as in the above formula (II).
  • R 4 , R 5 , and e represent the same definitions as those in formula (III).
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 3 represents a methylene group
  • R 4 represents a methyl group
  • c is 0 to 200
  • d is 0 to 200
  • c + d is 10
  • e is 200 and e is 10 to 300.
  • the second block copolymer is represented by the following formula (VI).
  • R 2 , R 3 , c and d represent the same definitions as those in formula (II).
  • R 6 , R 7 , R 8 and f represent the same definitions as in formula (IV) above.
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 3 represents a methylene group
  • R 6 represents a methyl group
  • R 8 represents —CH (CH 3 ) 2
  • c + d is 10 to 200.
  • F is preferably 10 to 300.
  • the first block copolymer is uncharged composed of polyethylene glycol or poly (2-isopropyl-2-oxazoline) A hydrophilic polymer chain segment and a charged polymer chain segment represented by formula (I), and the second block copolymer is composed of polyethylene glycol or poly (2-isopropyl-2-oxazoline) And an uncharged hydrophilic polymer chain segment represented by formula (II).
  • the first block copolymer is represented by the formula (III), and the second block copolymer is represented by the formula (V).
  • R 1 represents —CONH (CH 2 ) S —NH 2
  • s is 2 to 5
  • R 2 is A copolymer in which R 4 represents a hydrogen atom, R 4 represents a methyl group, a is 0 to 200, b is 0 to 200, and a + b is 10 to 200, and e is 10 to 300
  • R 2 and R 4 are as defined above, R 3 represents a methylene group, c is 0 to 200, and d is 0 to 200. And c + d is 10 to 200, and e is 10 to 300.
  • the first block copolymer is represented by the formula (IV), and the second block copolymer is represented by the formula (V).
  • R 1 represents — (CH 2 ) 3 NH 2
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 6 represents a methyl group.
  • R 8 represents —CH (CH 3 ) 2
  • a is 0 to 200
  • b is 0 to 200
  • a + b is 10 to 200
  • f is 10 to 300.
  • R 2 is as defined above, R 3 represents a methylene group, R 4 represents a methyl group, and c is 0 to 200, A copolymer in which d is 0 to 200, c + d is 10 to 200, and e is 10 to 300.
  • the first block copolymer is represented by the formula (III), and the second block copolymer is represented by the formula (VI).
  • R 1 represents —CONH (CH 2 ) s —NH 2
  • s is 2 to 5
  • R 2 is A copolymer in which R 4 represents a hydrogen atom, R 4 represents a methyl group, a is 0 to 200, b is 0 to 200, and a + b is 10 to 200, and e is 10 to 300
  • R 2 is as defined above, R 3 represents a methylene group, R 6 represents a methyl group, and R 8 represents —CH (CH 3 ). 2 is a copolymer in which c is 0 to 200, d is 0 to 200, c + d is 10 to 200, and f is 10 to 300.
  • the first block copolymer is represented by the above formula (IV), and the second block copolymer is represented by the formula (VI).
  • R 1 represents — (CH 2 ) 3 NH 2
  • R 2 represents a hydrogen atom
  • R 6 represents a methyl group.
  • the 1st and 2nd block copolymer which forms a polymer vesicle is manufactured according to the manufacturing method similar to the manufacturing method of the block copolymer which forms the micelle mentioned above. be able to.
  • -Other components In addition to the above-mentioned 1st and 2nd block copolymer, you may use another component for manufacture of a polymer vesicle.
  • other components include uncharged or charged polymers other than the first and second block copolymers described above, charged nanoparticles, and a crosslinking agent.
  • the amount of other components to be used is not limited, but it is preferable to keep the amount within a range that does not hinder the formation of the polymer vesicles or impair the physical properties of the polymer vesicles to be formed. Specifically, it is usually 30% or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less, based on the total weight of the polymer vesicles.
  • the above-mentioned first and second block copolymers are directly dissolved or dispersed in an aqueous solvent and mixed, or the first and second
  • a forming solution in which a block copolymer is dissolved or dispersed in an aqueous solvent is prepared, and these forming solutions are mixed.
  • the aqueous solvent the same solvent as described above for the production method of the polymer micelle can be used.
  • Another method includes a method in which the first and second block copolymers are dissolved or dispersed in a solution containing an organic solvent and mixed sufficiently, and then the organic solvent is removed by evaporation.
  • the organic solvent include acetone, dichloromethane, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, acetonitrile, tetrahydrofuran, and methanol.
  • One or more organic solvents may be used.
  • the solution may further contain a small amount of water.
  • the block copolymer unit is suspended by adding water or an aqueous solution containing an additive such as an appropriate salt or stabilizer to the obtained solid or paste and stirring. By dispersing / miniaturizing this using means such as ultrasonic irradiation, a high-pressure emulsifier or an extruder, an aqueous solution containing vesicles is formed.
  • Polymer micelle type anticancer agent of the present invention using the above-described polymer micelle or polymer vesicle as a carrier (hereinafter referred to as “polymer micelle type anticancer agent of the present invention” and “invention of the present invention, respectively”).
  • a high molecular vesicle type anticancer agent is a block copolymer in which an anticancer active ingredient is supported in a polymeric micelle or polymeric vesicle, and a cRGD peptide forms a polymeric micelle;
  • the first and second block copolymers forming the polymer vesicles hereinafter, these may be collectively referred to as “carrier forming block copolymers”).
  • the method of supporting the anti-cancer active ingredient in the polymer micelle or polymer vesicle is not limited. Examples include (i) forming an aqueous carrier during the formation of the polymer micelle or polymer vesicle.
  • a block copolymer for use and an anticancer active ingredient coexisting and mixing to form a polymeric micelle or vesicle, and at the same time, carrying the anticancer active ingredient in the polymeric micelle or vesicle (ii) )
  • the anticancer active ingredient may be physically encapsulated and held in polymer micelles or polymer vesicles. It may be held by forming a bond, or may be held by a combination of these physical inclusions and chemical bonds.
  • the anticancer active ingredient When the anticancer active ingredient is chemically bonded to the polymer micelle or polymer vesicle, examples of the chemical bond include covalent bond, ionic bond, coordinate bond, hydrogen bond, electrostatic bond, etc. It may be a combination. Moreover, the anticancer active ingredient may be directly bonded to the polymer micelle or the polymer vesicle, or may be bonded via a linking group. Examples of the linking group include, but are not limited to, an oxy group (—O—), a carbonyl group (—C ( ⁇ O) —), a sulfide group (—S—), a disulfide group (—S—S).
  • a conventionally known mode of supporting can be used as it is.
  • the present inventors have reported various antitumor agents in which an anticancer active ingredient such as a platinum-based drug is bound to the electrostatically coupled polymer micelle having the above-described configuration.
  • This configuration can be applied to the present invention as it is.
  • the above-mentioned Patent Document 2 (WO 2005/056641 pamphlet) is a high molecular weight composed of a block copolymer having a charged hydrophobic polymer chain segment (for example, a polyaspartic acid segment) containing a carboxyl group.
  • the carboxyl group of the charged hydrophobic polymer chain segment is coordinated to the platinum atom,
  • an antitumor agent in which a cancer active ingredient is supported on a polymer micelle is disclosed, such a configuration can also be applied to the present invention.
  • the method for introducing cRGD peptide into micelles or vesicles is not limited.
  • the following procedure can be used.
  • a reactive group of the cRGD peptide (or a linker linked to the cRGD peptide) at the cRGD peptide introduction site of the carrier-forming block copolymer, preferably at the end of the non-charged hydrophilic polymer chain segment.
  • a block copolymer having a reactive group capable of forming a bond (hereinafter sometimes referred to as “reactive group-introduced block copolymer”) is synthesized.
  • a reactive group may be appropriately selected according to the reactive group on the cRGD peptide side.
  • Examples thereof include a maleimide group, a hydroxyl group, an aryl group, an azide group, a carbonyl group, a thiol group, an amino group, and a succinimide group.
  • Etc. A particularly preferred specific example is a maleimide group, and in this case, the corresponding reactive group on the cRGD peptide side includes a thiol group (—SH).
  • the method for introducing the reactive group is not limited, and may be introduced by appropriately using various known addition reactions and substitution reactions according to the reactive group to be introduced.
  • a reactive group may be directly introduced into the block copolymer, it may be introduced via a linking group.
  • the linking group for example, the linking group described above for the configuration A can be applied.
  • the reactive group of the reactive group-introduced block copolymer is reacted with the reactive group of the cRGD peptide (or a linker linked to the cRGD peptide) to form a bond.
  • cRGD peptide can be introduce
  • this method by adjusting the ratio of the reactive group-introduced block copolymer to the total amount of the carrier-forming block copolymer used for forming the polymer micelle or polymer vesicle, It becomes possible to adjust the introduction ratio of cRGD peptide to molecular vesicle.
  • the introduction ratio of the cRGD peptide to the polymer micelle or polymer vesicle varies depending on the structure of the polymer micelle or polymer vesicle, the type of the anticancer active ingredient, the use of the anticancer agent, and the like.
  • the molar ratio to the coalescence is usually 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 12% or more, and usually 100% or less, particularly 70% or less, more preferably 50% or less, and particularly preferably 40% or less.
  • the introduction ratio of the cRGD peptide in the polymer micelle or the polymer vesicle can be confirmed by, for example, NMR method.
  • the timing for introducing the cRGD peptide into the carrier-forming block copolymer is also arbitrary and is not limited.
  • a carrier-forming block copolymer into which a cRGD peptide has been introduced in advance may be prepared, and then polymer micelles or polymer vesicles may be formed using the carrier copolymer and anticancer active ingredients may be supported.
  • the reactive group-introduced block copolymer is cRGD before, during or after the loading of the anticancer active ingredient.
  • the introduction may be performed by reacting with a peptide.
  • Anticancer Agents Using Other Carriers Specific electrostatic binding type polymer micelles and polymer vesicles have been described above. Examples of micelles and vesicles for anticancer agent carriers include phospholipid (polyethylene). It is also possible to use carriers such as liposomes formed by glycols or derivatives thereof; emulsions; nanohydrogel capsules; nanospheres formed from polylactic acid-polyglycolic acid copolymers.
  • the cRGD binding carrier (carrier of the present invention) in which the cRGD peptide is bound as a ligand to the various carriers described above is excellent in uptake into cells by the ligand. Demonstrate the nature.
  • a cRGD binding carrier (the carrier of the present invention)
  • it can be used as an anticancer agent having the above-described various excellent properties (the anticancer agent of the present invention).
  • Such a cRGD binding carrier (the carrier of the present invention) is also an object of the present invention.
  • the anticancer agent of the present invention exhibits an excellent anticancer effect against various cancers, gastrointestinal toxicity is reduced, and the side effect of weight loss of patients is remarkably reduced. Therefore, the anticancer agent of the present invention is useful as a therapeutic agent and / or preventive agent for various cancers in various subjects.
  • the target of the anticancer agent of the present invention includes various mammals such as humans, cows, monkeys, horses, pigs, sheep, goats, dogs, cats, guinea pigs, rats, mice, rabbits and hamsters. Of these, human is preferable.
  • the cancer targeted by the anticancer agent of the present invention may be a solid cancer or a blood cancer.
  • solid cancer include stomach cancer, esophageal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, renal cell cancer, liver cancer, uterine cancer, Non-small cell lung cancer, brain tumor, melanoma, peritoneal dissemination etc. are mentioned.
  • Specific examples of blood cancer include acute myeloid leukemia, chronic myelogenous leukemia, non-Hodgkin lymphoma, adult T-cell leukemia lymphoma, multiple myeloma and the like.
  • anticancer agent A an anticancer agent in which a cRGD peptide is bound to an anticancer active component via a linker
  • anticancer agent B a carrier carrying an anticancer active component is bound to a cRGD peptide
  • micelle or vesicle type anti-cancer agents tend to accumulate selectively and effectively in cancer by enhancing permeability of tumor blood vessels in cancer tissues and construction of undeveloped lymphatic system (EPR (Enhanced Permeability and Retention) effect). Therefore, in these embodiments, the target cancer is preferably a solid cancer.
  • the anticancer agent of the present invention may contain one or more other pharmaceutically acceptable components in addition to the above components.
  • other pharmaceutically acceptable ingredients include various organic or inorganic ingredients commonly used as pharmaceutical materials. Examples include solvents, solubilizers, suspending agents, tonicity agents, buffers, soothing agents, preservatives, antioxidants, colorants and the like.
  • solvent examples include water for injection, alcohol, propylene glycol and the like.
  • solubilizer examples include polyethylene glycol, propylene glycol, D-mannitol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate, sodium citrate and the like.
  • suspending agents include stearyl triethanolamine, sodium lauryl sulfate, laurylaminopropionic acid, lecithin, benzalkonium chloride, benzethonium chloride, glycerin monostearate, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, Examples thereof include hydrophilic polymers such as sodium carboxymethyl cellulose, methyl cellulose, hydroxymethyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, and hydroxypropyl cellulose.
  • Examples of soothing agents include benzyl alcohol.
  • Examples of preservatives include p-hydroxybenzoates, chlorobutanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, acetic anhydride, sorbic acid, and the like.
  • antioxidant examples include sulfite and ascorbic acid.
  • Other compositions and methods of use of the anticancer agent of the present invention are arbitrary, and configurations and methods of use of conventionally known anticancer agents can be applied.
  • the dose of the anticancer agent of the present invention is not limited, and is selected from a wide range according to various conditions such as the type of anticancer active ingredient, the type of cancer, the lesion site, the degree of disease, the age of the administration target, the administration route, etc. You can choose.
  • count of administration is not restrict
  • the use of a cyclic RGD sequence-containing peptide as a ligand reduces gastrointestinal toxicity and reduces side effects such as weight loss of the patient. Administration in dose is possible.
  • the administration route of the anticancer agent of the present invention is not limited, and can be appropriately selected according to various conditions such as the type of cancer, the lesion site, the degree of illness, the age of the administration target, the dose, and the number of administrations.
  • the anticancer agent of the present invention may be administered by an oral route or a parenteral route.
  • administration may be any of intravenous, intraperitoneal, intramuscular, subcutaneous, intranasal, intradermal, instillation, intracerebral, intrarectal, intravaginal, intraperitoneal, and the like.
  • maleimide-poly (ethylene glycol) -b-poly (glutamic acid) (Mal-PEG-bP (Glu) -NH 2 ) represented by the above formula: hereinafter sometimes referred to as “polymer A” .) was prepared by the following procedure.
  • the precipitate was purified by reprecipitation with dichloromethane / diethyl ether and then dried under reduced pressure to obtain 14.5 g of N 3 -PEG-THP.
  • the yield was 98%, the number average molecular weight (Mn NMR) by NMR was 12,200, and the polydispersity (PDI GPC) by GPC was 1.03.
  • ⁇ -Methoxy- ⁇ -aminopoly (ethylene glycol) (MeO-PEG-NH 2 ) 500 mg (0.0417 mmol) in dimethyl sulfoxide (8.00 mL) was added to ⁇ -benzyl L-glutamic acid N-carboxylic anhydride 230 mg.
  • a solution of (0.875 mmol) in dimethyl sulfoxide (8.0 mL) was added, and the mixture was stirred at 25 ° C. for 3 days under an argon atmosphere. The progress of the polymerization was monitored by infrared (IR) measurement.
  • IR infrared
  • the polymer obtained by the reaction was precipitated in diethyl ether, and the precipitate was vacuum-dried to obtain 680 mg of methoxy-poly (ethylene glycol) -b-poly (benzyl L-glutamic acid) (MeO-PEG-b-PBLG).
  • MeO-PEG-b-PBLG methoxy-poly (ethylene glycol) -b-poly (benzyl L-glutamic acid)
  • Benzyl group was deprotected by adding 680 mg (0.0415 mmol) of the above MeO-PEG-b-PBLG to 10 mL of 0.5N aqueous sodium hydroxide solution and stirring vigorously at room temperature for 12 hours.
  • MeO-PEG-b-P (Glu) -NH 2 polymer B
  • DACHPt-supported micelle (anticancer agent) 1.2.1) Synthesis of 20% and 40% cRGD-DACHPt-supported micelle (Examples A and B) 0.867 g (5.10 mmol) of silver nitrate (AgNO 3 ) and dichloro (1 , 2-Diaminocyclohexane) platinum (II) (DACHPtCl 2 ) 2.00 g (5.26 mmol) was stirred vigorously in 40 mL of water at room temperature for 20 hours.
  • mice transplanted with subcutaneous tumor Human glioblastoma cell U87MG obtained from the Translational Research Center, University of Tokyo Hospital
  • Fetal bovine serum (FBS) -containing Dulbecco's modified method The cells were cultured at 37 ° C. in a humidified atmosphere containing 5% carbon dioxide (CO 2 ) in an Eagle medium (Dulbecco's modified eagle's medium: DMEM), and collected when 80% confluence was reached.
  • the U87MG cells 5.0 ⁇ 10 6 cells / 50 ⁇ L were injected subcutaneously into Balb-c nu / nu mice (female, body weight 18-20 g, 6 weeks old, Charles River Japan).
  • mice prepared by the above procedure were divided into 4 groups of 6 mice each, and the first and second groups contained micelles carrying 20% cRGD-DACHPt (Example A).
  • the first and second groups contained micelles carrying 20% cRGD-DACHPt (Example A).
  • the third group contains 0% cRGD-DACHPt-loaded micelles (Comparative Example A)
  • the fourth group contains PBS was administered by intravenous injection as a control.
  • the body weight of each individual was measured every two days from the administration date, and the tumor volume (V) was measured by the above-described procedure.
  • the changes over time in the tumor volume and body weight of each group are shown in the graphs of FIGS. 1 (a) and (b), respectively.
  • the body weight in the graph of FIG. 1 (b) is shown as a relative value with the administration date as 1.
  • the group administered with 3 mg / kg of 20% cRGD-DACHPt-supported micelle (Example A) showed a better anticancer effect than the group administered with the same amount of 0% cRGD-DACHPt-supported micelle (Comparative Example A).
  • the side effect of weight loss was significantly reduced.
  • the anticancer agent of the present invention containing cRGD as a ligand, an anticancer effect superior to that of conventional anticancer agents can be obtained, while the side effect of weight loss is remarkably reduced. It can be seen that a larger amount can be administered while suppressing the side effect of weight loss than the anticancer agent.
  • cRGD-DACHPt-supported micelles (Example A) or 0% cRGD were applied to Balb-c nu / nu mice (female, body weight 18-20 g, 6 weeks old, Charles River Japan Co., Ltd.).
  • -DACHPt-loaded micelles (Comparative Example A) were each administered in an amount of 5.0 mg (converted to DACHPt per kg body weight) 3 times every other day by intravenous injection.
  • 72 hours after the final administration each individual was sacrificed, liver, small intestine and large intestine tissues were collected and fixed with a 10% formalin solution, and cut into a thickness of 10 ⁇ m with a microtome to prepare a tissue section.
  • the tissue sections were stained with hematoxylin and eosin (H & E), and the state of the tissue was observed.
  • the anticancer agent of the present invention containing cRGD as a ligand reduces the gastrointestinal toxicity of the conventional anticancer agent, and the associated poor feeding and starvation. Such an action is considered to contribute to the reduction of the above-mentioned side effects of weight loss.
  • the time course of the cumulative amount of platinum excreted in bile ( ⁇ g) in the 20% cRGD-DACHPt-supported micelle (Example A) and the 0% cRGD-DACHPt-supported micelle (Comparative Example A) was shown in FIG. Shown in the graph. The first 6 hours are shown every hour and thereafter every 6 hours.
  • the 20% cRGD-DACHPt-loaded micelle (Example A) -treated individuals had a much faster increase in the concentration of platinum in bile and the platinum was more rapidly compared to the 0% cRGD-DACHPt-loaded micelles (Comparative Example A) -treated individuals. It can be seen that it is discharged from the liver into bile.
  • Example A 20% cRGD-DACHPt-carrying micelles (Example A) are excreted in bile as micelles, whereas 0% cRGD-DACHPt-carrying micelles (Comparative Example A) undergo metabolism by the liver. Presumed to have been discharged into bile.
  • liver accumulation As shown in FIG. 4 (b), 0% cRGD-DACHPt-loaded micelles (comparative example) into which no ligand was introduced slowly accumulated in the liver and peaked at about 45 to 50 hours.
  • 0% cRGD-DACHPt-loaded micelles without a ligand (Comparative Example) slowly accumulate in the gastrointestinal tract, and about 45-50
  • the 20% cRGD-DACHPt-supported micelle (Example A) and the 40% cRGD-DACHPt-supported micelle (Example B) into which the ligand cRGD was introduced were relatively quickly compared to the peak around time. It can be seen that the gastrointestinal tract accumulates in the gastrointestinal tract, peaks after about 24 hours, and is discharged from the gastrointestinal tract.
  • FIGS. 5 (a) and 5 (b) are diagrams showing IVCLSM snapshots of the U87MG tumor site 5 minutes after administration and 5 hours after administration, respectively.
  • the blood flow was observed in yellow at 5 minutes after administration, which is considered to be due to the color development of both micelles.
  • FIG. 5 (b) a red fluorescent signal corresponding to 20% cRGD-DACHPt-loaded micelle (Example A) was clearly observed in the tumor tissue at 5 hours after administration.
  • FIG. 5 In order to quantitatively evaluate the accumulation of micelles in the tumor tissue, three different regions (regions indicated by dotted squares in the figure) shown in FIG. 5 (c) were selected, and changes in the fluorescence signal in each region were determined by IVCLSM. Evaluation was made over time over 9 hours. The change with time of the obtained fluorescence signal is shown in the graph of FIG. As is clear from FIG. 6, for the 20% cRGD-DACHPt-loaded micelle (Example A), a rapid increase in the fluorescence signal was observed in the tumor tissue over 5 hours after administration.
  • the micelle carrying 20% cRAD-DACHPt using the cRAD peptide as a ligand exhibits micelle extravasation and permeation like the cRGD peptide. No promoting effect was seen.
  • a region of the region shown in FIGS. 5C and 5D is selected, and 20% cRGD-DACHPt-supporting micelles (Example A) and 20% cRAD in the region are selected.
  • cRGD-DACHPt-supporting micelles Example A
  • 20% cRAD in the region are selected.
  • the fluorescence intensity of the DACHPt-loaded micelle (Comparative Example B) was observed by IVCLSM, and the permeability from the vasculature to the U87MG tumor stroma was quantitatively analyzed.
  • FIG. 9 The measurement results of normal brain accumulation are shown in FIG. As can be seen from FIG. 9, for normal brain tissue without tumor, 20% cRGD-DACHPt-loaded micelles (Example A), 40% cRGD-DACHPt-loaded micelles (Example B), and 0% cRGD- None of the DACHPt-supported micelles (Comparative Example A) accumulated in the brain tissue. Combining this result with the above results, cRGD ligand-introduced DACHPt-loaded micelles (Examples A and B) do not pass through the blood-brain barrier (BBB) of the normal brain, but the blood-brain tumor barrier of the tumor brain It can be seen that it passes through (BBTB) and specifically enters the tumor brain tissue.
  • BBB blood-brain barrier
  • FIG. 10 shows the change over time of the obtained tumor volume.
  • the 20% cRAD-DACHPt-supported micelle (Comparative Example B) and oxaliplatin (Comparative Example C) were not observed to have a brain tumor growth inhibitory effect, whereas the 20% cRGD-DACHPt-supported micelle (Example A) had a brain tumor.
  • a remarkable growth inhibitory effect was observed. From this result, it can be seen that the amino acid sequence of the ligand peptide is specific, and only when cRGD is used as a ligand, a remarkable growth inhibitory effect on brain tumors can be obtained.
  • mice are divided into 4 groups of 6 mice, and 20% cRGD-DACHPt-supported micelles (Example A), 20% cRAD-DACHPt-supported micelles (Comparative Example B), or 5 days after tumor inoculation, or Each 3.0 mg of oxaliplatin (Comparative Example C) (DACHPt equivalent per kg body weight) was systemically administered every other day for a total of 3 times. The remaining group received only PBS as a control. Anticancer activity was evaluated by measuring tumor volume. The tumor volume (V) was calculated by the method described in 2.1.1) after confirming tumor formation by appearance observation.
  • a subcutaneous tumor model mouse was prepared by xenotransplanting a Hela tumor (cervical cancer) tissue to a BALB / c nude mouse. Six such mice were divided and each group was treated with micelles carrying 0% cRGD-DACHPt (Comparative Example A), micelles carrying 20% cRGD-DACHPt (Example A), or 40% cRGD from 5 days after tumor inoculation.
  • Example B -DACHPt-loaded micelles
  • Example B mice were systemically administered three times every other day, with the dose varied in the range of 1 to 12 mg / kg (DACHPt equivalent per kg body weight).
  • an administration group of oxaliplatin (Comparative Example C) and PBS (Control Example) was also prepared.
  • the anticancer activity in each group was evaluated by measuring changes in tumor volume and body weight.
  • the tumor volume (V) was calculated by the method described in 2.1.1) after confirming tumor formation by appearance observation.
  • FIGS. 12 (a) and 12 (b) Changes over time in tumor volume and body weight due to administration of 0% cRGD-DACHPt-supported micelle (Comparative Example A) are shown in FIGS. 12 (a) and 12 (b), respectively, and 20% cRGD-DACHPt-supported micelle (Example A) Changes in tumor volume and body weight over time by administration are shown in FIGS. 13 (a) and (b), respectively, and changes over time in tumor volume and body weight by administration of 40% cRGD-DACHPt-loaded micelle (Example B) are shown in FIG. 14 (a) and (b). As is clear from the results of FIGS.
  • the present invention can be widely used for treatment of tumors in the medical field and has significant effects such as reducing side effects of patients, its utility value is extremely high.

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Abstract

　消化管毒性が低減され、患者の体重減少が軽減された等の利点を有する抗癌剤を提供する。　抗癌活性成分と、環状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチドとを含む抗癌剤。

Description

環状ＲＧＤ配列含有ペプチドを含む抗癌剤
　本発明は、抗癌剤に関する。具体的には、投与対象の体重減少等の副作用が低減された等の利点を有する抗癌剤に関する。
　抗癌剤による化学療法はがん治療の主要な選択肢であるが、多くの抗癌活性成分は、腫瘍細胞のみならず正常細胞に対しても毒性を及ぼし、副作用を引き起こすおそれがある。特に、従来の低分子抗癌活性成分は、標的となる腫瘍病変だけでなく、その他の正常組織・器官にも薬剤が広く分布してしまう上に、代謝により血液滞留時間が短いため、標的部位において有効な濃度を維持するのが困難である。よって、多量の薬剤を繰り返し投与しなければならない傾向があり、それに伴い体重減少等の副作用が生じる可能性もより高くなる。
　このため、副作用低減の観点から、抗癌剤を標的部位に局所的に効率的に送達する薬物送達系（Drug Delivery System：ＤＤＳ）が、種々提案されてきた。
　例えば、本発明者等の一部による特許文献１（特開平８－１８８５４１号公報）は、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体を自己組織化させてなる、静電結合型高分子ミセル薬物担体を開示する。
　また、やはり本発明者等の一部による特許文献２（国際公開第２００５／０５６６４１号パンフレット）は、上記と同様の構成の静電結合型高分子ミセル薬物担体に、ジアミノシクロヘキサン白金（II）型の抗腫瘍成分活性を結合させた抗腫瘍剤を開示する。
　また、やはり本発明者等の一部による特許文献３（国際公開第２００６／１１８２６０号パンフレット）は、非荷電親水性セグメントとカチオン性セグメントとを有する第１のブロック共重合体（例えばＰＥＧ－ポリカチオン等）と、非荷電親水性セグメントとアニオン性セグメントとを有する第２のブロック共重合体（例えばＰＥＧ－ポリアニオン等）とを自己組織化させてなる、静電結合型高分子ベシクル薬物担体を開示する。
　一方、非特許文献１（Nasongkla et al., Nano Letters, (2006), 6, 11, 2427-30）は、ｃＲＧＤペプチドをドキソルビシン含有高分子ミセルの親水性ブロックに結合させることにより、抗癌効果が改善されることを報告する。
特開平８－１８８５４１号公報 国際公開第２００５／０５６６４１号パンフレット 国際公開第２００６／１１８２６０号パンフレット
Nasongkla et al., Nano Letters, (2006), 6, 11, 2427-30
　しかしながら、抗癌剤による副作用の軽減、特に消化管毒性の低減や患者の体重減少の軽減や、腫瘍組織に対する特異性の改善、更には癌細胞に対する最大耐性量（maximum tolerated dose：ＭＴＤ）の向上等が可能な手法の開発が、依然として求められている。
　本発明者等は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、環状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチドを、抗癌剤のリガンドとして用いることにより、抗癌剤による消化管毒性が低減され、患者の体重減少の副作用が顕著に軽減されると共に、脳腫瘍や乳癌等の腫瘍組織に対する特異性が改善され、更には子宮頸癌等の腫瘍治療における最大耐性量（ＭＴＤ）も高めることができるという驚くべき知見を得、本願発明に到達した。
　従って、本発明の主旨は、以下に存する。
［１］抗癌活性成分と、環状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチドとを含む抗癌剤。
［２］環状ＲＧＤ配列含有ペプチドが抗癌活性成分に結合された［１］の抗癌剤。
［３］抗癌活性成分を担持する担体を更に含み、環状ＲＧＤ配列含有ペプチドが担体に結合された［１］の抗癌剤。
［４］担体が、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルであり、抗癌活性成分がミセル内に包有される［３］の抗癌剤。
［５］抗癌活性成分が白金錯体成分である［１］～［４］の抗癌剤。
　本発明によれば、環状ＲＧＤ配列含有ペプチドをリガンドとして用いることにより、抗癌剤による消化管毒性を低減し、患者の体重減少を軽減することが可能となる。また、本発明の抗癌剤は、肝臓から消化管（小腸）へと比較的迅速に集積して排出される。更には、脳腫瘍組織に特異的に作用して腫瘍成長を阻害する作用を有する他、乳癌細胞に特異的な成長抑制作用を示し、更には子宮頸癌細胞に対する最大耐性量（ＭＴＤ）を大幅に上昇させる等の効果も有する。
図１（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）３．０ｍｇ／ｋｇ（体重１ｋｇ当たりＤＡＣＨＰｔ換算量、以下同様）、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル６．０ｍｇ／ｋｇ、０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ：「ＤＡＣＨＰｔ／ｍ」）３．０ｍｇ／ｋｇ、及びＰＢＳを投与した皮下腫瘍移植マウス（各群ｎ＝６）における、腫瘍体積及び体重の経時変化を示すグラフである。 図２（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）及び０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ：「ＤＡＣＨＰｔ／ｍ」）各５．０ｍｇ／ｋｇ（体重１ｋｇ当たりＤＡＣＨＰｔ換算量）を投与したマウスにおける、肝臓、小腸及び大腸の各組織切片のヘマトキシリン＆エオシン染色写真である。 図３は、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）及び０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ：「ＤＡＣＨＰｔ／ｍ」）各１００μｇ（ラット１頭当たりＤＡＣＨＰｔ換算量）を投与したラットにおける、胆汁に排出された累積白金量（μｇ）の経時変化を示すグラフである。 図４（ａ）～（ｃ）は、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）、４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ：「４０％ｃＲＧＤ／ｍ」）、及び０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ：「ＤＡＣＨＰｔ／ｍ」）各１００μｇ（マウス１頭当たりＤＡＣＨＰｔ換算量）を、Hela-luc腫瘍保有マウスに投与した場合における、血中滞留性（図４（ａ））、肝臓集積性（図４（ｂ））及び消化管（小腸）集積性（図４（ｃ））の測定結果を示すグラフである。 図５（ａ）及び（ｂ）は、Alexa647（赤色）標識２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）及びDyLight488（緑色）標識２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ：「２０％ｃＲＡＤ／ｍ」）をU87MG腫瘍保有マウスに投与し、それぞれ投与５分後及び５時間後に得られたＩＶＣＬＳＭスナップショットであり、図５（ｃ）及び（ｄ）は、DyLight488（緑色）標識２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）及びAlexa647（赤色）標識２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ：「２０％ｃＲＡＤ／ｍ」）をU87MG腫瘍保有マウスに投与し、それぞれ投与５分後及び５時間後に得られたＩＶＣＬＳＭスナップショットである。 図６は、図５（ｃ）中の点線四角で示す３つの異なる領域内のＩＶＣＬＳＭによる蛍光シグナルの経時変化を示すグラフである。 図７（ａ）及び（ｂ）は、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）投与からそれぞれ５分後及び５時間後に得られた、図５（ｃ）中の実線四角領域内のＩＶＣＬＳＭによる蛍光シグナルの定量値分布を示すグラフである。 図８（ａ）及び（ｂ）は、２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ：「２０％ｃＲＡＤ／ｍ」）投与からそれぞれ５分後及び５時間後に得られた、図５（ｃ）中の実線四角領域内のＩＶＣＬＳＭによる蛍光シグナルの定量値分布を示すグラフである。 図９は、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）、４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ：「４０％ｃＲＧＤ／ｍ」）、及び０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ：「ＤＡＣＨＰｔ／ｍ」）各１００μｇ（マウス１頭当たりＤＡＣＨＰｔ換算量）を投与した正常マウスにおける、正常脳組織への集積性の測定結果を示すグラフである。 図１０は、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）３．０ｍｇ／ｋｇ（体重１ｋｇ当たりＤＡＣＨＰｔ換算量、以下同様）、２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ：「２０％ｃＲＡＤ／ｍ」）３．０ｍｇ／ｋｇ、及び、オキサリプラチン（比較例Ｃ）８．０ｍｇ/ｋｇを投与したU87MG腫瘍（脳腫瘍）皮下移植マウスにおける、腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。ＰＢＳは対照例に相当する。 図１１は、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）３．０ｍｇ／ｋｇ（体重１ｋｇ当たりＤＡＣＨＰｔ換算量、以下同様）、２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ：「２０％ｃＲＡＤ／ｍ」）３．０ｍｇ／ｋｇ、及び、オキサリプラチン（比較例Ｃ）８．０ｍｇ/ｋｇを投与したMDA-MB-231腫瘍（乳腺癌）皮下移植マウスにおける、腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。ＰＢＳは対照例に相当する。 図１２（ａ）及び（ｂ）は、０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ：「ＤＡＣＨＰｔ／ｍ」）を種々の投与量で投与したHela腫瘍（子宮頸癌）皮下移植マウスにおける、腫瘍体積及び体重の経時変化を示すグラフである。 図１３（ａ）及び（ｂ）は、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）を種々の投与量で投与したHela腫瘍（子宮頸癌）皮下移植マウスにおける、腫瘍体積及び体重の経時変化を示すグラフである。 図１４（ａ）及び（ｂ）は、４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ：「４０％ｃＲＧＤ／ｍ」）を種々の投与量で投与したHela腫瘍（子宮頸癌）皮下移植マウスにおける、腫瘍体積及び体重の経時変化を示すグラフである。
　以下、具体的な実施態様に即して、本発明を詳細に説明する。但し、本発明は決して以下の実施態様に束縛されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。
１．概要
　本発明の抗癌剤は、抗癌活性成分と、環状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチドとを含む。環状ＲＧＤ配列含有ペプチド（以降「ｃＲＧＤペプチド」という場合がある）は、少なくとも１のアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を有する環状ペプチドである。
　本発明者等は、検討の結果、このｃＲＧＤペプチドを抗癌剤のリガンドとして用いることにより、従来の抗癌剤よりも優れた抗癌効果が得られる一方で、体重減少の副作用は顕著に軽減されるとの知見を得た（後述の実施例の２．１及び図１参照）。また、更なる検討の結果、ｃＲＧＤペプチドをリガンドとして有する抗癌剤は、従来の抗癌剤と比べて消化管毒性が遥かに低く、それに伴う摂食不良や飢餓状態等が軽減されるとの知見も得た（後述の実施例の２．２及び図２参照）。よって、ｃＲＧＤペプチドをリガンドとして有する本発明の抗癌剤によれば、従来の抗癌剤よりも体重減少の副作用を抑制しながら、より多くの量を患者に投与し、より大きな治療効果を得ることが可能となる。
　なお、ｃＲＧＤペプチドをドキソルビシン含有高分子ミセルの親水性ブロックに結合させることにより、抗癌効果が改善されるとの報告はなされている（Nasongkla et al., Nano Letters, (2006), 6, 11, 2427-30）。しかし、ｃＲＧＤペプチドを抗癌剤のリガンドとして用いることにより、消化管毒性が低減され、患者の体重減少の副作用が軽減されることは、従来全く知られておらず、本発明者等が初めて見出した知見である。
　ｃＲＧＤペプチドによって消化管毒性の低減や体重減少の軽減が達成される理由は定かではないが、ＲＧＤ配列は、細胞接着分子であるインテグリン分子（特にαＶβ３やαＶβ５等）に結合し、これを活性化する機能を有することが知られており、斯かる機能が何らかの役割を果たしている可能性がある。また、本発明者等の検討によれば、ｃＲＧＤペプチドをリガンドとして用いた抗癌剤は、従来の抗癌剤と比べて、遥かに迅速に肝臓から胆汁へと排出されることが分かった（後述の実施例の２．３及び図３参照）。よって、ｃＲＧＤペプチドの存在が、何らかの機構（例えば上述のインテグリン分子の活性化）を通じて、抗癌剤の肝臓への取り込みや、胆汁を通じた体外への迅速な排出を促し、上述した消化管毒性の低減や体重減少の副作用軽減に寄与しているものと推測される。何れにせよ、ｃＲＧＤペプチドが胆汁を通じた抗癌剤の迅速排出を促進する作用を有することは、従来全く知られていなかった、驚くべき知見である。
　更に、本発明者等は、ｃＲＧＤペプチドをリガンドとして有する本発明の抗癌剤が、肝臓から消化管（小腸）へと比較的迅速に集積して排出されること（後述の実施例の２．４等参照）や、正常脳組織の血液脳関門（Blood-Brain Barrier：ＢＢＢ）は通過しないが、血液脳腫瘍関門（Blood-Brain Tumor Barrier：ＢＢＴＢ）を通過して、脳腫瘍組織に特異的に作用すること（後述の実施例の２．５等参照）、乳癌細胞にも特異的な成長抑制作用を示すこと（後述の実施例の２．６等参照）、子宮頸癌細胞に対する最大耐性量（maximum tolerated dose：ＭＴＤ）を大幅に上昇させること（後述の実施例の２．７等参照）等、種々の予想外の効果を有するとの知見も得た。これらも従来全く知られておらず、本発明者等が初めて見出した驚くべき知見である。
２．ｃＲＧＤペプチド
　本発明では、抗癌剤のリガンドとして、ｃＲＧＤペプチドを用いる。ｃＲＧＤペプチドは、少なくとも１つのアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を有し、環状構造を形成するペプチドである。上述の通り、ＲＧＤ配列は、細胞接着分子であるインテグリン分子（特にαＶβ３やαＶβ５等）に結合し、これを活性化する機能を有することが知られている。本発明では、斯かるＲＧＤ配列を有し、環状構造を形成するペプチドであれば、任意のｃＲＧＤペプチドを使用することが可能である。
　具体的に、ｃＲＧＤペプチドの配列長は、制限されるものではないが、環構造を形成する観点から、アミノ酸数が通常５以上、１０以下であることが好ましい。
　また、ｃＲＧＤペプチドを構成するアミノ酸は、生体適合性の観点から、主にＬ型アミノ酸であることが好ましいが、環構造を形成する観点からは、Ｌ型アミノ酸のみから構成されるのではなく、少なくとも１以上のＤ型アミノ酸を含むことが好ましい。
　また、ＲＧＤ配列以外の部分を構成するアミノ酸の種類は任意であり、生体を構成する２０種類のアミノ酸の他に、抗癌剤の投与対象に好ましからぬ影響を及ぼさない限りにおいて、その他の種類の天然アミノ酸や合成アミノ酸を含んでいてもよい。また、それらの配列も任意であるが、抗癌剤の活性を実質的に損なわず、また、ＲＧＤ配列の機能を妨げない配列であることが望ましい。
　また、上述のように、ｃＲＧＤペプチドは、少なくとも１つのＲＧＤ配列を有していればよいが、二以上のＲＧＤ配列を有していてもよい。
　ｃＲＧＤペプチドの具体例としては、限定されるものではないが、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられる。
・ＲＧＤｆＫ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）（配列番号１）
・ＧＲＧＤＥＰＤＧ（Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ）（配列番号２）
・ＲＧＤＮＩＥ－ＮＨ２（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－ＮＨ２）（配列番号３）
・Ｇ－Ｐｍｃ－ＲＧＤＣＡ（Ｇｌｙ－Ｐｍｃ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－Ａｌａ：Ｐｍｃはβ，β－ペンタメチレン）（配列番号４）
・Ｇ－Ｐｅｎ－ＧＲＧＤＮＹＣＡ（Ｇｌｙ－Ｐｅｎ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｌａ：Ｐｅｎはペニシラミン）（配列番号５）
・Ｇ－Ｐｅｎ－ＧＥＲＧＤＮＹＣＡ（Ｇｌｙ－Ｐｅｎ－Ｇｌｙ－Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ａｓｎ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ－Ａｌａ）（配列番号６）
・Ｇ－Ｐｅｎ－ＡＡＲＧＤＶＰＣＡＮＨ２（Ｇｌｙ－Ｐｅｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ａｌａ－ＮＨ２）（配列番号７）
・Ｇ－Ｐｅｎ－ＥＬＲＧＤＧＷＣＮＨ２（Ｇｌｙ－Ｐｅｎ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｔｒｙ－Ｃｙｓ－ＮＨ２）（配列番号８）
・Ｇ－Ｐｅｎ－ＧＦＲＧＤＥＰＣＮＨ２（Ｇｌｙ－Ｐｅｎ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－ＮＨ２）（配列番号９）
・Ｋ－Ｐｅｎ－ＧＦＲＧＤＥＰＣＲ（Ｌｙｓ－Ｐｅｎ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ）（配列番号１０）
・Ｋ－Ｐｅｎ－ＧＦＲＧＤＤＰＣＲ（Ｌｙｓ－Ｐｅｎ－Ｇｌｙ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－Ａｒｇ）（配列番号１１）
・Ａｃ－Ｐｅｎ－ＡＡＲＧＤ－Ｏｒｎ－ＰＣ－ＮＨ２（Ａｃ－Ｐｅｎ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｏｒｎ－Ｐｒｏ－Ｃｙｓ－ＮＨ２：Ｏｒｎはオルニチンを示す）（配列番号１２）
・（Ｍｐａ）－Ｒ－Ｇ－Ｄ－（ＹＯＭｅ）－（ｔ－ＢｕＧ）－Ｃ－ＮＨ２（（Ｍｐａ）－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－（ＹＯＭｅ）－（ｔ－ＢｕＧ）－Ｃｙｓ－ＮＨ２：Ｍｐａはβ－メルカプトプロピオン酸を、ＹＯＭｅはＯ－メチルチロシンを、ｔ－ＢｕＧはｔｅｒｔ－ブチルグリシンをそれぞれ示す）（配列番号１３）
・（Ｍｐａ）－Ｒ－Ｇ－Ｄ－（Ｃｈａ）－（ｔ－ＢｕＧ）－Ｃ－ＮＨ２（すなわち、（Ｍｐａ）－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－（Ｃｈａ）－（ｔ－ＢｕＧ）－Ｃｙｓ－ＮＨ２：Ｃｈａはシクロヘキシルアラニンを示す）（配列番号１４）
・ＲＧＤｆＶ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｖａｌ）（配列番号１５）
　中でも、ｃＲＧＤペプチドとしては、ｃＲＧＤｆＫが好ましい。構造式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　ｃＲＧＤペプチドは、周知の自動合成装置（例えばAppliedBiosystems, Inc., Model 431A等）によって合成することが可能である。
　また、ｃＲＧＤペプチドを抗癌活性成分や担体に結合させる観点からは、ｃＲＧＤペプチドに種々のリンカーを結合させてから使用してもよい。リンカーとしては、制限されるものではないが、他の反応性基と反応することにより２価の連結基を形成し得るリンカーが好ましい。具体的には、オキシ基（－Ｏ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、スルフィド基（－Ｓ－）、ジスルフィド基（－Ｓ－Ｓ－）、スルホキシド基（－Ｓ（＝Ｏ）－）、スルホン酸基（－Ｓ（＝Ｏ）２－）、イミノ基（－ＮＨ－）、Ｃ１～６アルキレン基、Ｃ２～６アルケニレン基、Ｃ２～６アルキニレン基、Ｃ４～８シクロアルキレン基、Ｃ６～１２アリーレン基、Ｃ４～１２ヘテロアリーレン基（酸素、窒素及び硫黄から選択される１～４のヘテロ原子を含む）、及びこれらのうち任意の２種以上の組み合わせ等の連結基を形成し得るリンカーが挙げられる。
　リンカーを有するｃＲＧＤペプチドの具体例として、ｃＲＧＤｆＫ（ＣＸ－）（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ（ＣＸ－）：Ｘ＝６－アミノカプロン酸：ε－Ａｃｐ）にシステインを連結した、ｃＲＧＤｆＫ－６－アミノカプロン酸－システインが挙げられる。その構造式を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
３．抗癌活性成分
　本発明の抗癌剤は、リガンドであるｃＲＧＤペプチドに加えて、抗癌活性成分を有する。抗癌活性成分としては、抗癌効果を有する任意の医薬活性成分を用いることが可能である。抗癌活性成分の例としては、例えば以下が挙げられる。
・アルキル化薬：例えばシクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ブスルファン等のナイトロジェンマスタード類；ニムスチン、ラニムスチン、ダカルバシン、プロカルバシン、テモゾロマイド、ベンダムスチン等のニトロソウレア類；シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ダハプラチン等の白金系薬物等。
・代謝拮抗剤：例えば５－フルオロウラシル等。
・葉酸代謝拮抗薬：例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（dihydrofolate reductase：ＤＨＦＲ）阻害薬；メソトレキセート、トリメトプリム、ピリメタミン等のジヒドロプテロイン酸シンターゼ阻害薬等。
・ピリミジン代謝阻害薬：例えばチミジル酸シンターゼ阻害薬：フルオロウラシル、フルシトシン等。
・プリン代謝阻害薬：例えば６－メルカプトプリン、アザチオプリン等のイノシン５’－リン酸脱水素酵素（Inosine 5'-monophosphate dehydrogenase：ＩＭＰＤＨ）阻害薬；ペントスタチン等のアデノシンデアミナーゼ（adenosine deaminase：ＡＤＡ）阻害薬等。
・ヌクレオチドアナログ：例えばチオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン等のプリンアナログ；シタラビン、ゲムシタビン等のピリミジンアナログ等。
・リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬：例えばヒドロキシウレア等。
・その他の代謝拮抗薬：例えばＬ－アスパラギナーゼ等。
・トポイソメラーゼ阻害薬：例えばイリノテカン、ノギテカン等のカンプトテシン及びその誘導体；ドキソルビシン等のアントラサイクリン系薬物；エトポシド等のエピポドフィロトキシン系薬物；レボフロキサシン、シプロフロキサシン等のキノロン系薬物等。
・微小管重合阻害薬：例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン等のビンカアルカロイド系薬物；コルヒチン等。
・微小管脱重合阻害薬：例えばタキサン系：パクリタキセル、ドセタキセル等。
・抗癌性抗生物質：例えばザルコマシシン、マイトマイシンＣ、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン等。
・分子標的薬：例えばイマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ダサチニブ、バンデタニブ、スニチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、クリゾチニブ等のチロシンキナーゼ阻害剤；ソラフェニブ等のRafキナーゼ阻害薬；エタネルセプト等のＴＮＦ－α阻害剤；ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤；リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブ、バシリキシマブ、トシリズマブ、トラスツズマブ、ベバシズマブ、オマリズマブ、メポリズマブ、アナキンラ、ゲムツズマブオゾガマイシン、パリビズマブ、ラニビズマブ、セルトリズマブ、オクレリズマブ、アバタセプト、モガムリズマブ、アダリムマブ、パニツムマブ、オファツムマブ、ゴリムマブ、イピリムマブ等のモノクローナル抗体等。
　本発明では、上記の抗癌活性成分の何れを使用することも可能である。しかし、ｃＲＧＤペプチドによる消化管毒性の低減効果が顕著に得られるという観点からは、副作用として消化管毒性を有する抗癌活性成分に本発明を適用することが好ましい。斯かる観点から、本発明における抗癌活性成分としては、アルキル化薬、代謝拮抗剤、葉酸代謝拮抗薬、ピリミジン代謝阻害薬、プリン代謝阻害薬、ヌクレオチドアナログ、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害薬、又はその他の代謝拮抗薬等が好ましい。中でもアルキル化薬が好ましく、特に白金系薬物がより好ましい。白金系薬物としては、例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ダハプラチン等が挙げられるが、本発明では何れを用いることも可能である。
４．抗癌剤
　本発明の抗癌剤は、抗癌活性成分と、リガンドであるｃＲＧＤペプチドとを含んでいれば、その他の構成は限定されず、抗癌活性成分の種類や治療対象癌等の種々の条件に応じて設定すればよい。本発明の抗癌剤の構成の例としては、抗癌活性成分にｃＲＧＤペプチドが直接又は連結基を介して結合された構成（以降「構成Ａ」という場合がある。）と、抗癌活性成分を担持する担体にｃＲＧＤペプチドが結合された構成（以降「構成Ｂ」という場合がある。）とが挙げられる。
４．１．構成Ａ（抗癌活性成分にｃＲＧＤペプチドが結合された構成）
　本構成では、抗癌活性成分にｃＲＧＤペプチドが直接（即ち、共有結合により）、又は連結基を介して結合される。
　抗癌活性成分にｃＲＧＤペプチドが直接結合される場合、通常はｃＲＧＤペプチドの末端のアミノ基又はカルボキシル基が、抗癌活性成分の活性部位を阻害しない任意の基に対して共有結合することになる。
　抗癌活性成分にｃＲＧＤペプチドが連結基を介して結合される場合、通常は連結基の一端がｃＲＧＤペプチドの末端のアミノ基又はカルボキシル基に結合し、連結基の他端が抗癌活性成分の活性部位を阻害しない任意の基に対して結合することになる。連結基の種類は制限されず、抗癌活性成分の種類や治療対象癌等の種々の条件に応じて設定すればよいが、例としては２価又は３価以上の有機基、好ましくは２価の有機基が挙げられる。２価の有機基としては、制限されるものではないが、オキシ基（－Ｏ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、スルフィド基（－Ｓ－）、ジスルフィド基（－Ｓ－Ｓ－）、スルホキシド基（－Ｓ（＝Ｏ）－）、スルホン酸基（－Ｓ（＝Ｏ）２－）、イミノ基（－ＮＨ－）、Ｃ１～６アルキレン基、Ｃ２～６アルケニレン基、Ｃ２～６アルキニレン基、Ｃ４～８シクロアルキレン基、Ｃ６～１２アリーレン基、Ｃ４～１２ヘテロアリーレン基（酸素、窒素及び硫黄から選択される１～４のヘテロ原子を含む）、及びこれらのうち任意の２種以上の組み合わせからなる基等が挙げられる。中でも、オキシ基、ジスルフィド基、カルボニルオキシ基（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、カルボニルイミノ基（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、Ｃ１～４アルキレン基、Ｃ２～４アルケニレン基、Ｃ１～４アルキレンオキシ基、Ｃ２～４アルケニレンオキシ基、Ｃ１～４アルキレンオキシカルボニル基、Ｃ２～４アルケニレンオキシカルボニル基、Ｃ１～４アルキレンカルボニルオキシ基、Ｃ２～４アルケニレンカルボニルオキシ基、Ｃ１～４アルキレンカルボニルイミノ基、Ｃ２～４アルケニレンカルボニルイミノ基、Ｃ１～４アルキレンイミノカルボニル基、Ｃ２～４アルケニレンイミノカルボニル基等が好ましい。なお、これらの連結基の向きも任意であり、何れの側がｃＲＧＤペプチドに結合し、何れの側が抗癌活性成分に結合していてもよい。
４．２．構成Ｂ（抗癌活性成分を担持する担体にｃＲＧＤペプチドが結合された構成）
　本構成では、抗癌活性成分を担持する担体に、ｃＲＧＤペプチドが結合される。
　ここで「担持」とは、抗癌活性成分が少なくとも所望の標的部位で抗癌作用を発揮するのを実質的に妨げないような手法で、担体が抗癌活性成分を保持することをいう。具体的な担持の態様としては、物理的な保持（例えば担体による抗癌活性成分の内包等）、化学的な保持（例えば共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、静電結合等の各種の化学結合による担体と抗癌活性成分との結合等）、これらの組み合わせ等が挙げられる。
　担体としては、制限されるものではないが、ミセル、ベシクル、ナノゲル、ナノパーティクル等が挙げられる。中でも、本発明ではミセル又はベシクルが好ましい。ミセルは、両親媒性分子が親水性部位を外側に、疎水性部位を内側に向けた状態で会合して形成される略球状の構造体である。また、ベシクルは、両親媒性分子が親水性部位を外側に、疎水性部位を内部に向けた状態で会合した二重膜により形成され、内部に前記二重膜により包囲された空隙を有する略球状の構造体である。
　以下、本発明の抗癌剤の担体として好ましい特定の高分子ミセル及び高分子ベシクルについて説明し、次いでこれらを担体とする本発明の抗癌剤について説明した上で、その他の担体を用いた本発明の抗癌剤についても説明する。
４．２．１）高分子ミセル
　本発明の抗癌剤の担体として用いるミセルの構造は任意であるが、例えば特開平８－１８８５４１号公報（特許文献１）等に開示の、非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントと荷電性疎水性ポリマー鎖セグメントとを有するブロック共重合体を自己組織化させてなる特定の静電結合型高分子ミセルが好ましい。以下、この静電結合型高分子ミセルについて説明する。
・非荷電性親水性ポリマー鎖セグメント
　高分子ミセルを形成するブロック共重合体の非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリサッカライド、ポリアクリルアミド、ポリ置換アクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ置換メタクリルアミド、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクルル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリアミノ酸等に由来するポリマー鎖セグメントが挙げられる。中でも、非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントは、ポリエチレングリコール由来のポリマー鎖セグメントであることが好ましい。非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントの分子量は、好ましくは２，５００Ｄａ以上、より好ましくは５，０００Ｄａ以上、更に好ましくは８，０００Ｄａ以上、また、好ましくは２００，０００Ｄａ以下、より好ましくは２０，０００Ｄａ以下、更に好ましくは１５，０００Ｄａ以下である。なお、非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントは、ミセルの形成を妨げない範囲において、アミノ基やカルボキシル基等の荷電性の置換基を含有していても構わない。
　なお、後述するように、ｃＲＧＤペプチドは、この非荷電性親水性ポリマー鎖セグメント、特にその末端（荷電性疎水性ポリマー鎖セグメント結合側とは反対側の末端）に導入されることが好ましい。
・荷電性疎水性ポリマー鎖セグメント
　高分子ミセルを形成するブロック共重合体の荷電性疎水性ポリマー鎖セグメントとしては、荷電性側鎖を有するポリアミノ酸（例えば、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン等）、ポリリンゴ酸、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリビニルイミダゾール等に由来するポリマー鎖セグメントが挙げられる。中でも、荷電性疎水性ポリマー鎖セグメントは、荷電性側鎖を有するポリアミノ酸鎖由来のポリマー鎖セグメントであることが好ましい。荷電性疎水性ポリマー鎖セグメントの反復単位数は、１０個以上であることが望ましく、好ましくは２０個以上であり、また、２００個以下であることが望ましく、好ましくは１００個以下、より好ましくは６０個以下である。
・連結基
　高分子ミセルを形成するブロック共重合体としては、上述の非荷電性親水性ポリマー鎖セグメント及び荷電性疎水性ポリマー鎖セグメントの各々の主鎖の末端同士を、共有結合又は連結基を介して結合させたものを用いることができる。連結基としては、制限されるものではないが、オキシ基（－Ｏ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、スルフィド基（－Ｓ－）、ジスルフィド基（－Ｓ－Ｓ－）、スルホキシド基（－Ｓ（＝Ｏ）－）、スルホン酸基（－Ｓ（＝Ｏ）２－）、イミノ基（－ＮＨ－）、Ｃ１～６アルキレン基、Ｃ２～６アルケニレン基、Ｃ２～６アルキニレン基、Ｃ４～８シクロアルキレン基、Ｃ６～１２アリーレン基、Ｃ４～１２ヘテロアリーレン基（酸素、窒素及び硫黄から選択される１～４のヘテロ原子を含む）、及びこれらのうち任意の２種以上の組み合わせからなる基等が挙げられる。中でも、オキシ基、ジスルフィド基、カルボニルオキシ基（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、カルボニルイミノ基（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、Ｃ１～４アルキレン基、Ｃ２～４アルケニレン基、Ｃ１～４アルキレンオキシ基、Ｃ２～４アルケニレンオキシ基、Ｃ１～４アルキレンオキシカルボニル基、Ｃ２～４アルケニレンオキシカルボニル基、Ｃ１～４アルキレンカルボニルオキシ基、Ｃ２～４アルケニレンカルボニルオキシ基、Ｃ１～４アルキレンカルボニルイミノ基、Ｃ２～４アルケニレンカルボニルイミノ基、Ｃ１～４アルキレンイミノカルボニル基、Ｃ２～４アルケニレンイミノカルボニル基等が好ましい。
・ブロック共重合体の具体例
　高分子ミセルを形成するブロック共重合体として、より具体的には、下記式（１）及び（２）で表示される化合物を例示できる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　式（１）及び（２）中、Ｒ1及びＲ3は、それぞれ独立して、水素原子、置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖のＣ１－１２アルキル基、又は、ブロック共重合体の製造時の触媒等に由来する官能基を表す。なお、後述するように、好ましくは、ｃＲＧＤペプチドはこの位置に導入される。
　式（１）中、Ｒ2は、水素原子、又は、飽和若しくは不飽和のＣ１～Ｃ２９脂肪族カルボニル基又はアリールカルボニル基である。
　式（２）中、Ｒ4は、水酸基、又は、飽和若しくは不飽和のＣ1～Ｃ30脂肪族オキシ基又はアリール－低級アルキルオキシ基である。
　式（１）及び（２）中、Ｒ5は、－Ｏ－又は－ＮＨ－であり、Ｒ6は、水素原子、フェニル基、ベンジル基、－（ＣＨ2)4－フェニル基、未置換の若しくはアミノ基若しくはカルボニル基で置換されたＣ4～Ｃ16アルキル基、又は、ステロール誘導体の残基である。
　式（１）及び（２）中、ｘは、１０～２００の整数であり、ｙは、１又は２であり、ｎは、５５～４，６００の整数であり、ｍは、０～２００の整数である。
　なお、ｍが１以上である場合、（ＣＯＣＨＮＨ）のユニットと（ＣＯＣＨ２ＣＨＮＨ）のユニットとはランダムに存在し、ｍが２以上である場合、Ｒ６は１つのブロック共重合体内の各アミノ酸ユニットにおいて各々独立に選択され、ランダムに存在するが、Ｒ６が水素原子である場合はＲ６全体の７５％以下である。
　式（１）及び（２）中、ｎは、好ましくは１１０以上、より好ましくは１８０以上、また、好ましくは４６０以下、より好ましくは３４０以下の整数であり、ｘは、好ましくは２０以上、また、好ましくは１００以下、より好ましくは６０以下の整数であり、ｍは、好ましくは１００以下、より好ましくは６０以下の整数である。
　式（１）及び（２）中、Ｌ1は、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｏ－Ｚ－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ2－、及び－Ｏ－Ｚ－Ｓ－Ｚ－ＮＨ－（ここで、Ｚは独立してＣ1～Ｃ6アルキレン基である。）から選ばれる連結基であり、Ｌ2は、－ＯＣＯ－Ｚ－ＣＯ－、及び－ＮＨＣＯ－Ｚ－ＣＯ－（ここで、ＺはＣ1～Ｃ6アルキレン基である）から選ばれる連結基である。
　式（１）及び（２）において、Ｌ1は、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｏ－Ｚ－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ2－、及び－Ｏ－Ｚ－Ｓ－Ｚ－ＮＨ－（ここで、Ｚは独立してＣ1～Ｃ6アルキレン基である。）から選ばれる連結基であり、Ｌ2は、－ＯＣＯ－Ｚ－ＣＯ－、及び－ＮＨＣＯ－Ｚ－ＣＯ－（ここで、ＺはＣ1～Ｃ6アルキレン基である）から選ばれる連結基である。
・ブロック共重合体の製法
　高分子ミセルを形成するブロック共重合体は、例えば、非荷電性親水性ポリマー鎖セグメント及び荷電性疎水性ポリマー鎖セグメントに夫々対応するポリマーを用意し、これらをそのまま、又は必要により分子量分布を狭くするように精製した後、公知の方法によりカップリングすることによって形成できる。また、上記式（１）のブロック共重合体については、例えば、Ｒ1を付与できる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことによりポリエチレングリコール鎖を形成した後、成長末端側にアミノ基を導入し、そのアミノ末端からβ－ベンジル－Ｌ－アスパルテート、γ－ベンジル－Ｌ－グルタメート、Ｎε－Ｚ－Ｌ－リシン等の保護されたアミノ酸のＮ－カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させることによっても形成できる。
・その他の成分
　高分子ミセルの製造には、上述のブロック共重合体に加え、その他の成分を使用してもよい。その他の成分の例としては、上述のブロック共重合体以外の非荷電又は荷電性の重合体、荷電性ナノ粒子、架橋剤等が挙げられる。その他の成分の使用量も制限されないが、高分子ミセルの形成を妨げたり、形成される高分子ミセルの物性を損なったりしない範囲に抑えることが好ましい。具体的には、高分子ミセルの総重量に対して、通常３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下とすることが望ましい。
・高分子ミセルの製法
　高分子ミセルの製法としては、例えば、上述のブロック共重合体（及び任意により他の成分）を、水性溶媒中に溶解又は分散させる手法が挙げられる。水性溶媒の種類は限定されない。好ましくは水であるが、高分子ミセルの形成を妨げない範囲で、水に他の成分を混合した溶媒、例えば生理食塩水、水性緩衝液、水と水溶性有機溶媒との混合溶媒等も用いることができる。水性緩衝液の場合、塩濃度としては、高分子ミセルの形成を妨げない範囲で適宜調整することが可能であるが、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは５ｍＭ以上であり、また、好ましくは３００ｍＭ以下、より好ましくは１５０ｍＭ以下である。水性緩衝液の具体例としては１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液等が挙げられる。
　各溶液におけるブロック共重合体の濃度やｐＨ、形成時の温度等の条件は、ブロック共重合体の溶液への溶解度、高分子ミセルの形成効率等の条件を勘案して適宜決定される。
　混合後、形成された高分子ミセルを含有する溶液を静置する時間を設けてもよい。混合液を静置する時間は、高分子ミセルの形成効率等の条件によって異なるが、好ましくは５０時間以下、より好ましくは３０時間以下である。但し、架橋剤を用いない場合、形成された高分子ミセルの径が経時的に増大する傾向があるので、静置時間を設けないことが好ましい場合もある。
　また、更に透析、希釈、濃縮、撹拌等の操作を適宜付加してもよい。
４．２．２）高分子ベシクル
　本発明の抗癌剤の担体として用いるベシクルの構造は任意であるが、本発明では、例えば国際公開第２００６／１１８２６０号パンフレット（特許文献３）等に開示の、非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントとカチオン性ポリマー鎖セグメントとを有する第１のブロック共重合体と、非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントとアニオン性ポリマー鎖セグメントとを有する第２のブロック共重合体とを自己組織化させてなる静電結合型高分子ベシクルが好ましい。以下、この静電結合型高分子ベシクルについて詳述する。
・非荷電性親水性ポリマー鎖セグメント
　第１及び第２のブロック共重合体が有する非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール、ポリ（２－イソプロピル－２－オキサゾリン）、ポリサッカライド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリアルキレンオキシド、ポリビニルピロリドン、ポリアミノ酸等に由来するポリマー鎖セグメントが挙げられる。中でも、ベシクルに生体適合性を付与する観点からは、ポリエチレングリコールであることが好ましく、ベシクルに温度応答性を付与する観点からは、ポリ（２－イソプロピル－２－オキサゾリン）であることが好ましい。非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントの重量平均分子量（Ｍｗ）は、ポリエチレングリコール由来のセグメントの場合、好ましくは５００以上、より好ましくは１，０００以上、また、好ましくは１５，０００以下、より好ましくは５，０００以下であり、ポリ（２－イソプロピル－２－オキサゾリン）由来のセグメントの場合、好ましくは１，０００以上、より好ましくは１，０００以上、また、好ましくは３０，０００以下、より好ましくは１０，０００以下である。なお、非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントは、ミセルの形成を妨げない範囲において、アミノ基やカルボキシル基等の荷電性の置換基を含有していても構わない。
　なお、後述するように、ｃＲＧＤペプチドは、この非荷電性親水性ポリマー鎖セグメント、特にその末端（荷電性疎水性ポリマー鎖セグメント結合側とは反対側の末端）に導入されることが好ましい。
・荷電性ポリマー鎖セグメント
　第１及び第２のブロック共重合体が有する荷電性ポリマー鎖セグメント、即ち、第１のブロック共重合体が有するカチオン性ポリマー鎖セグメントと、第２のブロック共重合体に含まれるアニオン性ポリマー鎖セグメントとは、鎖長及び電荷数が概ね同一であることが好ましい。具体的には、第１のブロック共重合体のカチオン性ポリマー鎖セグメント及び第２のブロック共重合体のアニオン性ポリマー鎖セグメントが、それぞれ一価の電荷を有する繰り返し単位から構成されるポリマーブロックである場合、第１のブロック共重合体のカチオン性ポリマー鎖セグメントの繰り返し単位の数と、第２のブロック共重合体のアニオン性ポリマー鎖セグメントの繰り返し単位の数との比は、概ね１：１であることが好ましい。なお、荷電性ポリマー鎖セグメントの繰り返し単位及び電荷数は、荷電性ポリマー鎖セグメントを構成するモノマーや、荷電性ポリマー鎖セグメントの製造時の反応条件等を適宜選択することにより、調整することができる。また、カチオン性ポリマー鎖セグメントとしてポリアミンを用いる場合、通常ポリアミンに酸を付加して陽性に荷電させる。付加する酸の種類は、ベシクルの用法等に従って適宜決定される。
　第１のブロック共重合体が有するカチオン性ポリマー鎖セグメントの好適な例としては、下記式（Ｉ）で表されるポリマー鎖セグメントが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　式（Ｉ）中、Ｒ１は、－（ＣＨ２）３ＮＨ２基又は－ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｓ－Ｘを表す。ここで、ｓは、０～２０であり、Ｘは、－ＮＨ２、ピリジル基、モルホリル基、１－イミダゾリル基、ピペラジニル基、４－（Ｃ１－６アルキル）－ピペラジニル基、４－（アミノＣ１－６アルキル）－ピペラジニル基、ピロリジン－１－イル基、Ｎ－メチル－Ｎ－フェニルアミノ基、ピペリジニル基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、－（ＣＨ２）tＮＨ２、及び－（ＮＲ９（ＣＨ２）ｏ）ｐＮＨＲ１０からなる群から選択される少なくとも一つの基である。ここで、Ｒ９は、水素原子又はメチル基を表し、Ｒ１０は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、ベンジルオキシカルボニル基又はｔｅｒｔ―ブトキシカルボニル基を表し、ｏは、１～５であり、ｐは、１～５であり、ｔは、０～１５である。
　式（Ｉ）中、Ｒ２は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基を表す。
　式（Ｉ）中、ａは、０～５,０００であり、ｂは、０～５,０００である。但し、ａ＋ｂは、２～５,０００である。
　式（Ｉ）中、Ｒ１が－ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｓ－Ｘを表す場合、Ｘは、荷電性ポリマー鎖セグメントの繰り返し単位毎に、同一の官能基であってもよく、又は異なる官能基であってもよい。
　式（Ｉ）において、Ｒ１が－ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｓ－ＮＨ２基を表し、かつｓが２～５であり、Ｒ２が水素原子を表し、ａが０～２００であり、ｂが０～２００であり、かつａ＋ｂが１０～２００であることが好ましい。
　式（Ｉ）において、各繰り返し単位の存在形態も任意であり、各々ブロックとして存在していてもよく、ランダムに存在していてもよい。
　第２のブロック共重合体が有するアニオン性ポリマー鎖セグメントの好適な例としては、下記式（II）で表されるポリマー鎖セグメントが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式（II）中、Ｒ２は、水素原子、アセチル基、トリフルオロアセチル基、アクリロイル基又はメタクリロイル基を表す。
　式（II）中、Ｒ３は、各々独立して、メチレン基又はエチレン基を表す。Ｒ３は、荷電性ポリマー鎖セグメントの繰り返し単位毎に、同一の官能基であってもよく、又は異なる官能基であってもよい。
　式（II）中、ｃは、０～５,０００であり、ｄは、０～５,０００である。但し、ａ＋ｂは、２～５,０００である。
　式（II）において、Ｒ２が水素原子を表し、Ｒ３がメチレン基を表し、ｃが０～２００であり、ｄが０～２００であり、かつｃ＋ｄが１０～２００であることが好ましい。
　式（II）において、各繰り返し単位の存在形態も任意であり、各々ブロックとして存在していてもよく、ランダムに存在していてもよい。
・連結基
　第１及び第２のブロック共重合体としては、上述の非荷電性親水性ポリマー鎖セグメント及びアニオン性又はカチオン性ポリマー鎖セグメントの各々の主鎖の末端同士を、共有結合又は連結基を介して結合させたものを用いることができる。連結基としては、制限されるものではないが、オキシ基（－Ｏ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、スルフィド基（－Ｓ－）、ジスルフィド基（－Ｓ－Ｓ－）、スルホキシド基（－Ｓ（＝Ｏ）－）、スルホン酸基（－Ｓ（＝Ｏ）２－）、イミノ基（－ＮＨ－）、Ｃ１～６アルキレン基、Ｃ２～６アルケニレン基、Ｃ２～６アルキニレン基、Ｃ４～８シクロアルキレン基、Ｃ６～１２アリーレン基、Ｃ４～１２ヘテロアリーレン基（酸素、窒素及び硫黄から選択される１～４のヘテロ原子を含む）、及びこれらのうち任意の２種以上の組み合わせからなる基等が挙げられる。中でも、オキシ基、ジスルフィド基、カルボニルオキシ基（－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、カルボニルイミノ基（－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、Ｃ１～４アルキレン基、Ｃ２～４アルケニレン基、Ｃ１～４アルキレンオキシ基、Ｃ２～４アルケニレンオキシ基、Ｃ１～４アルキレンオキシカルボニル基、Ｃ２～４アルケニレンオキシカルボニル基、Ｃ１～４アルキレンカルボニルオキシ基、Ｃ２～４アルケニレンカルボニルオキシ基、Ｃ１～４アルキレンカルボニルイミノ基、Ｃ２～４アルケニレンカルボニルイミノ基、Ｃ１～４アルキレンイミノカルボニル基、Ｃ２～４アルケニレンイミノカルボニル基等が好ましい。
・第１のブロック共重合体の好適例
　好ましい態様によれば、第１のブロック共重合体は、下記式（III）で表されるものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　式（III）中、Ｒ１、Ｒ２、ａ、ｂは、上記式（Ｉ）における定義と同じ定義を表す。
　式（III）中、Ｒ４は、水素原子、置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖のＣ１－１２アルキル基、又は、ブロック共重合体の製造時の触媒等に由来する官能基を表す。なお、後述するように、好ましくは、ｃＲＧＤペプチドはこの位置に導入される。
　式（III）中、Ｒ５は、－（ＣＨ２）gＮＨ－を表す。ここでｇは、０～５である。
　式（III）中、ｅは、５～２，５００である。
　式（III）において、Ｒ１が－ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｓ－ＮＨ２基を表し、かつｓが２～５であり、Ｒ２が水素原子を表し、Ｒ４がメチル基を表し、ａが０～２００であり、ｂが０～２００であり、ａ＋ｂが１０～２００であり、ｅが１０～３００であることが好ましい。
　別の好ましい態様によれば、第１のブロック共重合体は、下記式（IV）で表されるものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式（IV）中、Ｒ１、Ｒ２、ａ、ｂは、上記式（Ｉ）における定義と同じ定義を表す。
　式（IV）中、Ｒ６は、水素原子、置換されていてもよい直鎖若しくは分岐鎖のＣ１－１２アルキル基、又は、ブロック共重合体の製造時の触媒等に由来する官能基を表す。なお、後述するように、好ましくは、ｃＲＧＤペプチドはこの位置に導入される。
　式（IV）中、Ｒ７は、－（ＣＨ２）ｈＮＨ－を表す。ここでｈは、０～５である。
　式（IV）中、Ｒ８は、直鎖又は分岐鎖のＣ１－１２アルキル基を表す。
　式（IV）中、ｆは、５～２，５００である。
　式（IV）において、Ｒ１が－（ＣＨ２）３ＮＨ２を表し、Ｒ２が水素原子を表し、Ｒ６がメチル基を表し、Ｒ８が－ＣＨ（ＣＨ３）２を表し、ａが０～２００であり、ｂが０～２００であり、ａ＋ｂが１０～２００であり、ｆが１０～３００であることが好ましい。
・第２のブロック共重合体の好適例
　好ましい態様によれば、第２のブロック共重合体は、下記式（Ｖ）で表されるものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　式（Ｖ）中、Ｒ２、Ｒ３、ｃ、ｄは、上記式（II）における定義と同じ定義を表す。
　式（Ｖ）中、Ｒ４、Ｒ５、ｅは、上記式（III）における定義と同じ定義を表す。
　式（Ｖ）において、Ｒ２が水素原子を表し、Ｒ３がメチレン基を表し、Ｒ４がメチル基を表し、ｃが０～２００であり、ｄが０～２００であり、かつｃ＋ｄが１０～２００であり、ｅが１０～３００であることが好ましい。
　別の好ましい態様によれば、第２のブロック共重合体は、下記式（VI）で表されるものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　式（VI）中、Ｒ２、Ｒ３、ｃ、ｄは、上記式（II）における定義と同じ定義を表す。
　式（VI）中、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、ｆは、上記式（IV）における定義と同じ定義を表す。
　式（VI）において、Ｒ２が水素原子を表し、Ｒ３がメチレン基を表し、Ｒ６がメチル基を表し、Ｒ８が－ＣＨ（ＣＨ３）２を表し、ｃ＋ｄが１０～２００であり、ｆが１０～３００であることが好ましい。
・第１及び第２のブロック共重合体の好適な組み合わせ
　好適な態様によれば、第１のブロック共重合体が、ポリエチレングリコール又はポリ（２－イソプロピル－２－オキサゾリン）から構成される非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントと、式（Ｉ）で表される荷電性ポリマー鎖セグメントとを有し、第２のブロック共重合体が、ポリエチレングリコール又はポリ（２－イソプロピル－２－オキサゾリン）から構成される非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントと、式（II）で表される荷電性ポリマー鎖セグメントとを有する。より好適な態様によれば、第１のブロック共重合体が、式（Ｉ）において、Ｒ１が－ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｓ－ＮＨ２を表し、かつｓが２～５であり、Ｒ２が水素原子を表し、ａが０～２００であり、ｂが０～２００であり、ａ＋ｂが１０～２００である共重合体であり、第２のブロック共重合体が、式（II）において、Ｒ2が水素原子を表し、Ｒ３がメチレン基を表し、ｃが０～２００であり、ｄが０～２００であり、ｃ＋ｄが１０～２００である共重合体である。
　別の好ましい態様によれば、第１のブロック共重合体が、式（III）で表され、第２のブロック共重合体が、式（Ｖ）で表される。より好ましい態様によれば、第１のブロック共重合体が、式（III）において、Ｒ１が－ＣＯＮＨ（ＣＨ２）Ｓ－ＮＨ２を表し、かつｓが２～５であり、Ｒ２が水素原子を表し、Ｒ４がメチル基を表し、ａが０～２００であり、ｂが０～２００であり、かつa＋ｂが１０～２００である共重合体であり、eが１０～３００であり、第２のブロック共重合体が、式（Ｖ）において、Ｒ２及びＲ４が前記の通りであり、Ｒ３がメチレン基を表し、ｃが０～２００であり、ｄが０～２００であり、かつｃ＋ｄが１０～２００であり、ｅが１０～３００である共重合体である。
　別の好ましい態様によれば、第１のブロック共重合体が、式（IV）で表され、第２のブロック共重合体が、式（Ｖ）で表される。より好ましい態様によれば、第１のブロック共重合体が、式（IV）において、Ｒ１が－（ＣＨ２）３ＮＨ２を表し、Ｒ２が水素原子を表し、Ｒ６がメチル基を表し、Ｒ８が－ＣＨ（ＣＨ３）２を表し、ａが０～２００であり、ｂが０～２００であり、ａ＋ｂが１０～２００であり、ｆが１０～３００である共重合体であり、第２のブロック共重合体が、式（Ｖ）において、Ｒ２が前記の通りであり、Ｒ３がメチレン基を表し、Ｒ４がメチル基を表し、ｃが０～２００であり、ｄが０～２００であり、ｃ＋ｄが１０～２００であり、ｅが１０～３００である共重合体である。
　別の好ましい態様によれば、第１のブロック共重合体が、式（III）で表され、第２のブロック共重合体が、式（VI）で表される。より好ましい態様によれば、第１のブロック共重合体が、式（III）において、Ｒ１が－ＣＯＮＨ（ＣＨ２）ｓ－ＮＨ２を表し、かつｓは２～５であり、Ｒ２が水素原子を表し、Ｒ４がメチル基を表し、ａが０～２００であり、ｂが０～２００であり、かつａ＋ｂが１０～２００である共重合体であり、ｅが１０～３００であり、第２のブロック共重合体が、式（VI）において、Ｒ２が前記の通りであり、Ｒ３がメチレン基を表し、Ｒ６がメチル基を表し、Ｒ８が－ＣＨ（ＣＨ３）２を表し、ｃが０～２００であり、ｄが０～２００であり、ｃ＋ｄが１０～２００であり、ｆが１０～３００である共重合体である。
　別の好ましい態様によれば、第１のブロック共重合体が上記式（IV）で表され、第２のブロック共重合体が式（VI）で表される。より好ましい態様によれば、第１のブロック共重合体が、式（IV）において、Ｒ１が－（ＣＨ２）３ＮＨ２を表し、Ｒ２が水素原子を表し、Ｒ６がメチル基を表し、Ｒ８が－ＣＨ（ＣＨ３）２を表し、ａが０～２００である共重合体であり、ｂが０～２００であり、ａ＋ｂが１０～２００であり、ｆが１０～３００であり、第２のブロック共重合体が、式（VI）において、Ｒ２、Ｒ６及びＲ８が前記の通りであり、Ｒ３がメチレン基を表し、ｃが０～２００であり、ｄが０～２００であり、ｃ＋ｄが１０～２００であり、ｆが１０～３００である共重合体である。
・第１及び第２のブロック共重合体の製法
　高分子ベシクルを形成する第１及び第２のブロック共重合体は、上述したミセルを形成するブロック共重合体の製法と同様の製法に従って製造することができる。
・その他の成分
　高分子ベシクルの製造には、上述の第１及び第２のブロック共重合体に加えて、その他の成分を使用してもよい。その他の成分の例としては、上述の第１及び第２のブロック共重合体以外の非荷電又は荷電性の重合体、荷電性ナノ粒子、架橋剤等が挙げられる。その他の成分の使用量も制限されないが、高分子ベシクルの形成を妨げたり、形成される高分子ベシクルの物性を損なったりしない範囲に抑えることが好ましい。具体的には、高分子ベシクルの総重量に対して、通常３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下とすることが望ましい。
・高分子ベシクルの製法
　高分子ベシクルの製法としては、例えば、上述の第１及び第２のブロック共重合体を水性溶媒中に直接溶解又は分散させて混合する手法や、第１及び第２のブロック共重合体を各々水性溶媒に溶解又は分散させた形成用溶液を作製し、これらの形成用溶液を混合する手法が挙げられる。水性溶媒については、高分子ミセルの製法について上述したものと同様の溶媒が使用できる。
　また、別の手法として、第１及び第２のブロック共重合体を、有機溶媒を含有する溶液に溶解又は分散させ、十分に混合した後に、当該有機溶媒を蒸散除去する手法等が挙げられる。有機溶媒としては、アセトン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルフォオキシド、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、メタノールを例示できる。有機溶媒は１種でも２種以上でもよい。溶液は更に少量の水を更に含有してもよい。得られた固形物又はペーストに、水又は適当な塩若しくは安定化剤などの添加物を含んだ水溶液を加え、攪拌することによりブロック共重合体ユニットを懸濁させる。これを超音波照射、高圧乳化機又はエクストルーダーなどの手段を用いて分散・微小化することにより、ベシクルを含む水溶液が形成される。
　その他の条件については、高分子ミセルの製法について上述したものと同様の条件が使用できる。
４．２．３）高分子ミセル型又は高分子ベシクル型抗癌剤
　上述の高分子ミセル又は高分子ベシクルを担体とする本発明の抗癌剤（以降それぞれ「本発明の高分子ミセル型抗癌剤」及び「本発明の高分子ベシクル型抗癌剤」という場合がある。）は、高分子ミセル又は高分子ベシクルに、抗癌活性成分が担持されると共に、ｃＲＧＤペプチドが、高分子ミセルを形成するブロック共重合体、並びに、高分子ベシクルを形成する第１及び第２のブロック共重合体（以降これらを総称して「担体形成用ブロック共重合体」という場合がある。）に結合した構成を有する。
・抗癌活性成分の担持
　高分子ミセル又は高分子ベシクルに、抗癌活性成分を担持させる手法は制限されないが、例としては、（ｉ）高分子ミセル又は高分子ベシクルの形成時に、水性担体形成用ブロック共重合体と抗癌活性成分とを共存させて混合し、高分子ミセル又は高分子ベシクルを形成すると同時に抗癌活性成分を高分子ミセル又は高分子ベシクル内に担持させる手法と、（ii）予め形成された高分子ミセル又は高分子ベシクルと抗癌活性成分とを水性媒体中で混合し、高分子ミセル又は高分子ベシクル内に抗癌活性成分を導入し、担持させる手法が挙げられる。
　なお、上述の「担持」の定義に明らかなとおり、抗癌活性成分は、高分子ミセル又は高分子ベシクルに物理的に内包されて保持されていてもよく、高分子ミセル又は高分子ベシクルと化学結合を形成して保持されていてもよく、更にはこれらの物理的内包と化学結合との組み合わせにより保持されていてもよい。
　抗癌活性成分が高分子ミセル又は高分子ベシクルに化学結合する場合、化学結合の例としては、共有結合、イオン結合、配位結合、水素結合、静電結合等が挙げられるが、これらの何れの結合であってもよい。また、抗癌活性成分は高分子ミセル又は高分子ベシクルに直接結合していてもよく、連結基を介して結合していてもよい。連結基の例としては、制限されるものではないが、オキシ基（－Ｏ－）、カルボニル基（－Ｃ（＝Ｏ）－）、スルフィド基（－Ｓ－）、ジスルフィド基（－Ｓ－Ｓ－）、スルホキシド基（－Ｓ（＝Ｏ）－）、スルホン酸基（－Ｓ（＝Ｏ）２－）、イミノ基（－ＮＨ－）、Ｃ１～１２アルキレン基、Ｃ２～１２アルケニレン基、Ｃ２～１２アルキニレン基、Ｃ４～１２シクロアルキレン基、Ｃ６～１２アリーレン基、Ｃ４～１２ヘテロアリーレン基（酸素、窒素及び硫黄から選択される１～４のヘテロ原子を含む）、及びこれらのうち任意の２種以上の組み合わせからなる基等が挙げられる。中でも、オキシ基、ジスルフィド基、カルボニルオキシ基（エステル結合：－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－）、カルボニルイミノ基（ヒドラジド結合：－Ｃ（＝Ｏ）－ＮＨ－）、Ｃ１～６アルキレン基、Ｃ２～６アルケニレン基、Ｃ１～６アルキレンオキシ基、Ｃ２～６アルケニレンオキシ基、Ｃ１～６アルキレンオキシカルボニル基、Ｃ２～６アルケニレンオキシカルボニル基、Ｃ１～６アルキレンカルボニルオキシ基、Ｃ２～６アルケニレンカルボニルオキシ基、Ｃ１～６アルキレンカルボニルイミノ基、Ｃ２～６アルケニレンカルボニルイミノ基、Ｃ１～６アルキレンイミノカルボニル基、Ｃ２～６アルケニレンイミノカルボニル基等が好ましい。
　担体による抗癌活性成分の担持の具体的な態様として、従来知られている担持の態様をそのまま用いることも可能である。
　例えば、本発明者等は、白金系薬物等の抗癌活性成分を、上記構成の静電結合型高分子ミセルに結合させた抗腫瘍剤等を種々報告しているが、これらの抗腫瘍剤の構成をそのまま本発明に適用することが可能である。具体例として、上述の特許文献２（国際公開第２００５／０５６６４１号パンフレット）は、カルボキシル基を含有する荷電性疎水性ポリマー鎖セグメント（例えばポリアスパラギン酸セグメント等）を有するブロックコポリマーから構成される高分子ミセルを用いるとともに、ジアミノシクロヘキサン白金（II）錯体（いわゆるダハ（ＤＡＣＨ）プラチン）を抗癌活性成分として用い、荷電性疎水性ポリマー鎖セグメントのカルボキシル基を白金原子に配位させることにより、抗癌活性成分を高分子ミセルに担持させた抗腫瘍剤を開示するが、このような構成を本発明に適用することも可能である。
・ｃＲＧＤペプチドの導入
　ミセル又はベシクルへのｃＲＧＤペプチドの導入方法は、制限されないが、例えば、上記の静電結合型の高分子ミセル又は高分子ベシクルの場合、以下の手順で行うことができる。
　まず、担体形成用ブロック共重合体のｃＲＧＤペプチド導入箇所、好ましくは非荷電性親水性ポリマー鎖セグメントの末端に、ｃＲＧＤペプチド（又はｃＲＧＤペプチドに連結されたリンカー）が有する反応性基と反応して結合を形成し得る反応性基を有するブロック共重合体（以降「反応性基導入ブロック共重合体」という場合がある。）を合成する。斯かる反応性基は、ｃＲＧＤペプチド側の反応性基に応じて適宜選択すればよいが、例としては、マレイミド基、水酸基、アリール基、アジド基、カルボニル基、チオール基、アミノ基、スクシンイミド基等が挙げられる。特に好ましい具体例としては、マレイミド基が挙げられ、この場合、対応するｃＲＧＤペプチド側の反応性基としては、チオール基（－ＳＨ）が挙げられる。反応性基の導入法も制限されず、導入する反応性基等に応じて、公知の種々の付加反応や置換反応を適宜用いて導入すればよい。また、反応性基を直接ブロック共重合体に導入してもよいが、連結基を介して導入してもよい。連結基としては、例えば構成Ａについて上述した連結基が適用できる。
　その後、反応性基導入ブロック共重合体の反応性基を、ｃＲＧＤペプチド（又はｃＲＧＤペプチドに連結されたリンカー）が有する反応性基と反応させ、結合を形成させる。これにより、ｃＲＧＤペプチドを担体形成用ブロック共重合体に導入することができる。
　この手法によれば、高分子ミセル又は高分子ベシクルの形成に使用する担体形成用ブロック共重合体の総量に対する、反応性基導入ブロック共重合体の比率を調整することにより、高分子ミセル又は高分子ベシクルに対するｃＲＧＤペプチドの導入比率を調節することが可能となる。なお、高分子ミセル又は高分子ベシクルに対するｃＲＧＤペプチドの導入比率は、高分子ミセル又は高分子ベシクルの構造や、抗癌活性成分の種類、抗癌剤の用途等によっても異なるが、担体形成用ブロック共重合体に対するモル比率で、通常５％以上、中でも１０％以上、更には１２％以上、また、通常１００％以下、中でも７０％以下、更には５０％以下、特に４０％以下の範囲が好ましい。なお、高分子ミセル又は高分子ベシクルにおけるｃＲＧＤペプチドの導入比率は、例えばＮＭＲ法等により確認することができる。
　ｃＲＧＤペプチドを担体形成用ブロック共重合体に導入する時機も任意であり、制限されない。例として、予めｃＲＧＤペプチドを導入した担体形成用ブロック共重合体を作製してから、これを用いた高分子ミセル又は高分子ベシクルの形成及び抗癌活性成分の担持を行ってもよい。或いは、反応性基導入ブロック共重合体を用いて高分子ミセル又は高分子ベシクルを形成した後、抗癌活性成分の担持前、担持中、又は担持後に、反応性基導入ブロック共重合体をｃＲＧＤペプチドと反応させ、導入を行ってもよい。
４．２．４）その他の担体を用いた抗癌剤
　以上、特定の静電結合型の高分子ミセル及び高分子ベシクルについて説明したが、抗癌剤担体用のミセルやベシクルとしては、例えば、リン脂質（ポリエチレングリコールまたはその誘導体によって修飾 されていてもよい）によって形成されるリポソーム；エマルジョン；ナノハイドロゲルカプセル；ポリ乳酸－ポリグリコール酸共重合体から形成されるナノスフェアといった担体を用いることも可能である。
４．２．５）ｃＲＧＤペプチドをリガンドとして有する担体
　なお、上述した各種の担体に、ｃＲＧＤペプチドをリガンドとして結合させたｃＲＧＤ結合担体（本発明の担体）は、リガンドによる細胞への取り込みに優れた性質を発揮する。斯かるｃＲＧＤ結合担体（本発明の担体）に、各種の抗癌成分を担持させることにより、前述した各種の優れた性質を有する抗癌剤（本発明の抗癌剤）として使用可能である。斯かるｃＲＧＤ結合担体（本発明の担体）も、本発明の対象となる。
４．３．その他
　本発明の抗癌剤は、各種の癌に対して優れた抗癌効果を示す一方で、消化管毒性が低減され、患者の体重減少の副作用が顕著に軽減される。よって、本発明の抗癌剤は、各種の対象における各種の癌の治療剤及び／又は予防剤として有用である。
　具体的に、本発明の抗癌剤の対象としては、ヒト、ウシ、サル、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター等の各種の哺乳動物が挙げられるが、中でもヒトが好ましい。
　本発明の抗癌剤が標的とする癌は、固形癌であっても血液癌であってもよい。固形癌の具体例としては、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、胆道癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝癌、子宮癌、非小細胞肺癌、脳腫瘍、黒色腫、腹膜播腫等が挙げられる。血液癌の具体例としては、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫、多発性骨髄腫等が挙げられる。
　但し、本発明の抗癌剤の好適な態様である、抗癌剤Ａ（抗癌活性成分にｃＲＧＤペプチドがリンカーを介して結合された抗癌剤）や抗癌剤Ｂ（抗癌活性成分を担持する担体にｃＲＧＤペプチドが結合された、例えばミセル又はベシクル型の抗癌剤）は、癌組織における腫瘍血管の透過性の亢進と未発達なリンパ系の構築によって、癌に選択的かつ効果的に集積する傾向がある（ＥＰＲ（Enhanced Permeability and Retention）効果）。よって、これらの態様の場合、標的とする癌は固形癌であることが好ましい。
　なお、本発明の抗癌剤は、前記の成分以外に、医薬的に許容し得る１又は２以上の他の成分を含んでいてもよい。医薬的に許容し得る他の成分としては、製剤材料として慣用されている各種の有機又は無機の成分が挙げられる。例としては、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤等が挙げられる。
　溶剤の例としては、注射用水、アルコール、プロピレングリコール等が挙げられる。
　溶解補助剤の例としては、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ－マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等が挙げられる。
　懸濁化剤の例としては、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤や、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等の親水性高分子等が挙げられる。
　等張化剤の例としては、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ－マンニトール等が挙げられる。
　緩衝剤の例としては、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられる。
　無痛化剤の例としては、ベンジルアルコール等が挙げられる。
　防腐剤の例としては、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、無水酢酸、ソルビン酸等が挙げられる。
　抗酸化剤の例としては、亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられる。
　本発明の抗癌剤のその他の組成や使用方法は任意であり、従来公知の抗癌剤の構成や使用方法等を適用可能である。
　本発明の抗癌剤の投与量は制限されず、抗癌活性成分の種類、癌の種類、病変部位、疾病の程度、投与対象の年齢、投与経路等の各種条件に応じて、広い範囲の中から選択することができる。また、投与回数も制限されず、単回投与でも持続投与でも複数回投与でもよい。持続投与や複数回投与の場合、その投与期間や投与間隔は、種々の状況に応じて適宜決定すればよい。
　但し、本発明の抗癌剤によれば、上述のように、環状ＲＧＤ配列含有ペプチドをリガンドとして用いることにより消化管毒性が低減され、患者の体重減少等の副作用が軽減されるので、従来よりも高用量での投与が可能となる。具体的に、例えば抗癌活性成分としてシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン、ダハプラチン等の白金系薬物を使用し、且つ、抗癌剤を静脈投与する場合には、一日当たりの抗癌活性成分の投与量が、対象の体重１ｋｇあたり通常１ｍｇ以上、中でも１．２ｍｇ以上、更には１．５ｍｇ以上、また、通常４０ｍｇ以下、中でも３０ｍｇ以下、更には２０ｍｇ以下となるように、投与量及び投与回数を選択することが好ましい。
　本発明の抗癌剤の投与経路も制限されず、癌の種類、病変部位、疾病の程度、投与対象の年齢、投与量及び投与回数等の各種条件に応じて、適宜選択することが可能である。具体的に、本発明の抗癌剤は、経口経路で投与しても、非経口経路で投与してもよい。非経口経路の場合には、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、点眼、脳内、直腸内、腟内及び腹腔内等の何れで投与してもよい。
　本発明の抗癌剤の剤形も制限されず、癌の種類、病変部位、疾病の程度、投与対象の年齢、投与量及び投与回数、投与経路等の各種条件に応じて、適宜選択することが可能である。具体例としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、被覆剤、カプセル剤、溶液剤、乳化剤、懸濁剤、座剤、注射溶液、軟膏、クリーム、座薬等が挙げられる。
　以下、実施例を示し、本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は決して以下の実施例に限定されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。
１．抗癌剤の調製
１．１．担体材料ポリマーの合成
１．１．１）ポリマーＡ（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ｂ－Ｐ（Ｇｌｕ）－ＮＨ２、リガンド担持用ポリマー）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　リガンド担持用ポリマーとして、上記式で表されるマレイミド－ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（グルタミン酸）（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ｂ－Ｐ（Ｇｌｕ）－ＮＨ２：以降「ポリマーＡ」という場合がある。）を、以下の手順で調製した。
　・ａ）ポリマー（ａ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　α－テトラヒドロピラニルオキシ－ω－メタンスルホニルポリ（エチレングリコール）（ＴＨＰ－ＰＥＧ－Ｍｓ、１２，３００ｇ／ｍｏｌ、日油株式会社製）１５．０ｇ（１．２２ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１００ｍＬ）溶液に、アジ化ナトリウム１．６３ｇ（２５．１ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で３日間攪拌した後、水を加えて更に室温で１時間攪拌した。混合物をジクロロメタン２００ｍＬで５度抽出し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過した。濾液を濃縮した後、大容量の冷ジエチルエーテルに注ぎ入れた。沈殿物をジクロロメタン／ジエチルエーテルによる再沈殿で精製した後、減圧下で乾燥することにより、Ｎ３－ＰＥＧ－ＴＨＰ１４．５ｇを得た。収率９８％、ＮＭＲによる数平均分子量（Ｍｎ ＮＭＲ）は１２，２００、ＧＰＣによる多分散度（ＰＤＩ ＧＰＣ）は１．０３であった。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：σ(ppm) = 1.44-1.92 (m, 6H, THPのCH-(CH2)3-CH2), 3.46 (t, 2H, -CH2-N3), 3.66 (m, 1090H, -CH2-CH2-O-ポリマー骨格), 3.88 (t, 2H, THPのCH-(CH2)3-CH2-O), 4.64 (t, 1H, THPのO-CH-O).
　上記Ｎ３－ＰＥＧ－ＴＨＰ１４．５ｇ（１．１９ｍｍｏｌ）のメタノール（約２００ｍＬ）溶液に、１ｍｏｌ／Ｌ塩酸２４．０ｍＬを加え、室温で約４時間攪拌した。溶液を濃縮した後、大容量の冷ジエチルエーテルに注ぎ入れた。沈殿物をジクロロメタン／ジエチルエーテルによる再沈殿で精製した後、減圧下で乾燥することにより、Ｎ３－ＰＥＧ－ＯＨ１４．０ｇを得た。収率９７％、Ｍｎ ＮＭＲ＝１２，１００、ＰＤＩ ＧＰＣ＝１．０４。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：σ(ppm) = 3.40 (t, 2H, -CH2-N3), 3.42-3.92 (m, 1090H, -CH2-CH2-O-ポリマー骨格).
　上記Ｎ３－ＰＥＧ－ＯＨ１４．０ｇ（１．１６ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン８９０μＬ（６．３９ｍｍｏｌ）の混合物のテトラヒドロフラン（１２０ｍＬ）溶液に、塩化メタンスルホニル５４０ｍＬ（６．９８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１２０ｍＬ）溶液を、乾燥アルゴン雰囲気下、０℃で３０分かけてゆっくりと加えた。反応混合物を更に０℃で３０分、続いて室温で３時間攪拌した。溶液を濃縮した後、大容量の冷ジエチルエーテルに注ぎ入れた。沈殿物をジクロロメタン／ジエチルエーテルによる再沈殿で精製した後、減圧下で乾燥することにより、Ｎ３－ＰＥＧ－Ｍｓ１３．２ｇを得た。収率９３％、Ｍｎ ＮＭＲ＝１２，２００、ＰＤＩ ＧＰＣ＝１．０２。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：σ(ppm) = 2.79 (s, 3H, -O2SCH3), 3.38 (t, 2H, -CH2-N3), 3.42-3.90 (m, 1090H, -CH2-CH2-O-ポリマー骨格), 3.76 (t, 2H, -CH2-CH2-O-SO2), 4.38 (t, 2H, -CH2-O-SO2).
　上記Ｎ３－ＰＥＧ－Ｍｓ３．５０ｇ（０．２８７ｍｍｏｌ）を２５％アンモニア水溶液４００ｍＬに溶解させ、室温で３日間攪拌した。溶液を蒸発濃縮し、０．１２５％アンモニア溶液及び蒸留水を用いて透析した後、凍結乾燥することにより、上記式で表されるポリマー（ａ）（α－アミノ－ω－アジド終端ポリ（エチレングリコール）：ＮＨ２－ＰＥＧ－Ｎ３）３．１５ｇを得た。収率９１％。ＨＰＬＣにより決定された－ＮＨ２転換率は９８．８％であった。Ｍｎ ＮＭＲ＝１２，１００、ＰＤＩ ＧＰＣ＝１．０３。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：σ(ppm) = 2.86 (t, 2H, -CH2-NH2), 3.38 (t, 2H, -CH2-N3), 3.44-3.90 (m, 1090H, -CH2-CH2-O-ポリマー骨格). 
　・ｂ）ポリマー（ｂ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　上記ポリマー（ａ）３．０３ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（４５．０ｍＬ）溶液に、γ－ベンジルＬ－グルタミン酸のＮ－カルボン酸無水物１．３２ｇ（５．０１ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（４５ｍＬ）溶液を加え、アルゴン雰囲気下、２５℃で３日間攪拌した。重合の進行を赤外線（ＩＲ）測定によりモニターした。反応物をジエチルエーテル中で沈殿させ、沈殿物を真空乾燥した。得られたジブロックコポリマー、無水酢酸１８０μＬ（１．９０ｍｍｏｌ）、ジメチルヒドロフラン４０．０ｍＬ、及びトリエチルアミン１３５μＬ（０．９６９ｍｍｏｌ）の混合物を、４０℃で一晩攪拌した。アセチル化反応の進行をKaiser試験キット（シグマアルドリッチ（Sigma-Aldrich）社製）でモニターした。反応混合物をジエチルエーテルに注ぎ入れることにより、上記式で表されるポリマー（ｂ）４．１６ｇを得た。収率＞９９％、Ｍｎ ＮＭＲ＝１６，６００、ＰＤＩ ＧＰＣ＝１．０４、ポリ（ベンジルＬ－グルタミン酸）ブロックの重合度（ＤＰ ＰＢＬＧ）は２１であった。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）：σ(ppm) = 1.70-2.70 (m, 84H, -CH2-CH2-PBLG側鎖), 3.39 (t, 2H, -CH2-N3), 3.42-3.80 (m, 1090H, -CH2-CH2-O-PEG骨格), 3.80-4.13 (m, 21H, -CH-PBLG骨格), 4.80-5.30 (m, 42H, -CH2-(CH2)6-PBLG側鎖), 7.02-7.50 (m, 105H, -CH2-(CH2)6-PBLG側鎖).
　・ｃ）ポリマー（ｃ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　ポリマー（ｂ）１．００ｇ（０．０６０２ｍｍｏｌ）の０．５Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液１５．０ｍＬを、室温で激しく１２時間攪拌した。得られたポリマーを、透析膜（Spectra/Pro 6メンブラン：ＭＷＣＯ＝３５００）を用いて水で透析することにより精製した。透析後、残留物を凍結乾燥することにより、上記式で表されるポリマー（ｃ）０．８４８ｇを得た。収率９３％、Ｍｎ ＮＭＲ＝１５，２００、ＰＤＩ ＧＰＣ＝１．０６、ポリ（Ｌ－グルタミン酸）ブロックの重合度（ＤＰ Ｐ（Ｇｌｕ））は２１であった。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：σ(ppm) = 1.80-2.60 (m, 84H, -CH2-CH2-P(Glu)側鎖), 3.51 (t, 2H, -CH2-N3), 3.54-3.94 (m, 1090H, -CH2-CH2-O-ＰＥＧ骨格), 4.24-4.46 (m, 21H, -CH-P(Glu)骨格).
　・ｄ）ポリマー（ｄ）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　上記ポリマー（ｃ）０．８４８ｇ（０．０５５８ｍｍｏｌ）、パラジウム微粒子（ＰｄＮＰｓ、一般財団法人川村理化学研究所）１７０ｍｇ、及びエタノール／水混合溶媒（体積比１／１）５０ｍＬを、高圧ガラスシリンダー（ハイパーガラスシリンダー、耐圧硝子工業株式会社製）内に入れ、真空／水素（Ｈ２）サイクルを３回繰り返して空気を系外に排出した後、反応混合物を水素（Ｈ２）雰囲気（１気圧）下、４０℃で４日間攪拌した。反応混合物を蒸留水で透析した後、凍結乾燥することにより、上記式で表されるポリマー（ｄ）０．６７８ｇを得た。収率８１％、Ｍｎ、ＮＭＲ＝１５，０００、ＰＤＩ ＧＰＣ＝１．０６、ＤＰ Ｐ（Ｇｌｕ）＝２１。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：σ(ppm) = 1.80-2.60 (m, 84H, -CH2-CH2-P(Glu)側鎖), 3.23 (t, 2H, -CH2-NH2), 3.48-4.00 (m, 1090H, -CH2-CH2-O-ＰＥＧ骨格), 4.25-4.45 (m, 21H, -CH-P(Glu)骨格). 
　・ｅ）ポリマーＡの合成
　上記ポリマー（ｄ）０．３９２ｇ（０．０２６１ｍｍｏｌ）及びＮ－（４－マレイミドブチリロキシ）スルホスクシンイミドナトリウム塩０．１００ｇ（０．２６１ｍｍｏｌ）を水１４．０ｍＬに溶解させた。室温で２４時間攪拌した後、ポリマーを透析膜（Spectra/Pro 6メンブラン：ＭＷＣＯ＝３５００）を用いて水で透析して精製し、凍結乾燥することにより、最終目的物であるマレイミド－ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（グルタミン酸）（Ｍａｌ－ＰＥＧ－ｂ－Ｐ（Ｇｌｕ）－ＮＨ２：ポリマーＡ）０．３４４ｇを得た。収率８７％、Ｍｎ ＮＭＲ＝１５，１００、ＰＤＩ ＧＰＣ＝１．０４、ＤＰ Ｐ（Ｇｌｕ）＝２１。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：σ(ppm) = 1.70-2.70 (br, 84H, -CH2-CH2-Ｐ(Glu)側鎖), 1.91 (t, 2H, マレイミド-CH2-CH2-CH2-CO), 2.28 (t, 2H, マレイミド-(CH2)2 -CH2-CO), 3.35 (t, 2H, -(CH2)3-CO-NH-CH2-), 3.48 - 3.96(m, 1090H, -CH2-CH2-O-PEG骨格), 4.12-4.46 (m, 21H, -CH-P(Glu)骨格), 6.85 (s, 2H, -CH=CH-マレイミド基).
１．１．２）ポリマーＢ（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ｂ－Ｐ（Ｇｌｕ）－ＮＨ２、リガンド非担持用ポリマー）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　リガンドを担持しないポリマーとして、上記式で表されるメトキシ－ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（グルタミン酸）（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ｂ－Ｐ（Ｇｌｕ）－ＮＨ２：以降「ポリマーＢ」という場合がある。）を、以下の手順で調製した。
　α－メトキシ－ω－アミノポリ（エチレングリコール）（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ＮＨ２）５００ｍｇ（０．０４１７ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（８．００ｍＬ）溶液に、γ－ベンジルＬ－グルタミン酸のＮ－カルボン酸無水物２３０ｍｇ（０．８７５ｍｍｏｌ）のジメチルスルホキシド（８．０ｍＬ）溶液を加え、アルゴン雰囲気下、２５℃で３日間攪拌した。重合の進行を赤外線（ＩＲ）測定によりモニターした。反応により得られたポリマーをジエチルエーテル中で沈殿させ、沈殿物を真空乾燥することにより、メトキシ－ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（ベンジルＬ－グルタミン酸）（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＬＧ）６８０ｍｇを得た。収率＞９９％、Ｍｎ ＮＭＲ＝１６，４００、ＰＤＩ ＧＰＣ＝１．０２、ＤＰ ＰＢＬＧ＝２０。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ジメチルスルホキシド、８０℃）：σ(ppm)=1.50-2.80 (m, 80H, -CH2-CH2-PBLG側鎖), 3.25 (s, 3H, -O-CH3), 3.28-3.74 (m, 1090H, -CH2-CH2-O-PEG骨格), 3.85-4.34 (m, 20H, -CH-PBLG骨格), 4.78-5.26 (m, 40H, -CH2-(CH2)6-PBLG側鎖), 7.00-7.40 (m, 100H, -CH2-(CH2)6-PBLG側鎖).
　上記ＭｅＯ－ＰＥＧ－ｂ－ＰＢＬＧ６８０ｍｇ（０．０４１５ｍｍｏｌ）を、０．５Ｎ 水酸化ナトリウム水溶液１０ｍＬに加え、室温で１２時間激しく攪拌することにより、ベンジル基を脱保護した。得られたポリマーを、透析膜（Spectra/Pro 6 メンブラン：ＭＷＣＯ＝３５００）を用い、水に対して透析することにより精製した。透析後、残留物を凍結乾燥することにより、最終目的物であるメトキシ－ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（グルタミン酸）（ＭｅＯ－ＰＥＧ－ｂ－Ｐ（Ｇｌｕ）－ＮＨ２：ポリマーＢ）５５０ｍｇを得た。収率８８％、Ｍｎ ＮＭＲ＝１５，０００、ＰＤＩ ＧＰＣ＝１．０５、ＤＰ Ｐ（Ｇｌｕ）＝２０。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：σ(ppm) = 1.70-2.66 (m, 80H, -CH2-CH2-P(Glu)側鎖), 3.40 (s, 3H, -O-CH3), 3.48-4.04 (m, 1090H, -CH2-CH2-O-PEG骨格), 4.24-4.48 (m, 2H, -CH-P(Glu)骨格).
１．２．ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（抗癌剤）の調製
１．２．１）２０％及び４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ、Ｂ）の合成
　硝酸銀（ＡｇＮＯ３）０．８６７ｇ（５．１０ｍｍｏｌ）及びジクロロ（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（II）（ＤＡＣＨＰｔＣｌ２）２．００ｇ（５．２６ｍｍｏｌ）を、水４０ｍＬ中、室温で２０時間に亘って激しく攪拌した。塩化銀（Ｉ）（ＡｇＣｌ）沈殿物を珪藻土（セライト（登録商標））で濾別し、濾液を凍結乾燥することにより、クロロ（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（II）硝酸エステル（ＤＡＣＨＰｔ（ＮＯ３）Ｃｌ、６０％）１．２９ｇ（３．１７ｍｍｏｌ）を得た。
　得られたクロロ（１，２－ジアミノシクロヘキサン）白金（II）硝酸エステル（ＤＡＣＨＰｔ（ＮＯ３）Ｃｌ）１０２ｍｇ（０．２５ｍｍｏｌ）を、水５０．０ｍＬ中、７５℃で１時間攪拌した。得られた均一溶液を、孔径０．２２μｍの膜（MILLEX-GV、Millipore）で濾過し、ポリマーＡ（リガンド担持用ポリマー）及びポリマーＢ（リガンド非担持用ポリマー）を１／１のモル比で有するフラスコに加えた（［Ｇｌｕ］＝５ｍｍｏｌ／Ｌ、［ＤＡＣＨＰｔ］／［Ｇｌｕ］＝１．０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。３７℃で１２０時間攪拌後、反応混合物をセロファン チューブ（Spectra/Pro 6 膜：ＭＷＣＯ＝３，５００）に移送し、蒸留水に対して１日透析し、限外濾過（ＭＷＣＯ＝３０，０００）することにより、マレイミド官能化ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル溶液２０．０ｍＬを得た。動的レーザー光散乱（dynamic laser light scattering：ＤＬＳ）測定により決定されたミセルのサイズは３２ｎｍ、分散は０．１０５であった。
　このマレイミド官能化ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル溶液（２０．０ｍＬ）に、リンカー含有ｃＲＧＤペプチドとして、アミノ酸配列ＲＧＤｆＫを有するｃＲＧＤｆＫ（ＣＸ－）（Ｘ＝６－アミノカプロン酸：ε－Ａｃｐ、株式会社ペプチド研究所社製）にシステインを結合させたｃＲＧＤｆＫ－６－アミノカプロン酸－システイン１０．５ｍｇ（０．０１２８ｍｍｏｌ、マレイミド基に対し２．０当量）を加え、室温でインキュベートした。１８時間後、ミセル溶液を限外濾過（ＭＷＣＯ＝１００，０００）で精製することにより、２０％ｃＲＧＤ導入ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ：図中「２０％ｃＲＧＤ／ｍ」）の溶液を得た。サイズ＝３０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．０９９、［Ｐｔ］／［ＣＯＯ］＝０．５２（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。また、ｃＲＧＤの導入比率を変更した他は上記と同様の手順により、４０％ｃＲＧＤ導入ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ：図中「４０％ｃＲＧＤ／ｍ」）の溶液を得た。サイズ＝３０ｎｍ、ＰＤＩ＝０．１００、［Ｐｔ］／［ＣＯＯ］＝０．５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。最後に各ミセル溶液の体積を２０．０ｍＬに調整し、その後の試験に使用した。
　なお、ポリマーＡ（リガンド担持用ポリマー）とｃＲＧＤｆＫ－６－アミノカプロン酸－システインを反応させることにより、以下の式に示すように、ポリマーＡが有するマレイミド基と、ｃＲＧＤｆＫ－６－アミノカプロン酸－システインが有するチオール基とが結合を形成し、ｃＲＧＤペプチドがポリマーに導入される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　得られたミセル溶液におけるｃＲＧＤ導入率は、以下の手順で確認した。ミセル溶液２．０ｍＬに、QuadraSil（登録商標）MP（和光純薬工業株式会社製）３８ｍｇ及び食塩水２．０ｍＬをこの加え、３７℃で７２時間攪拌した。反応溶液を孔径０．２２μｍの膜（MILLEX-GV、ミリポア（Millipore）社製）で精製し、凍結乾燥させることにより、ポリマー混合物を得た。ポリマー混合物の１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）スペクトルをＤ２Ｏ中、室温で測定し、７．１５～７．４５ｐｐｍにおけるｃＲＧＤ残基への芳香族プロトンの組み込みを、３．３８ｐｐｍにおけるポリマーＢの－Ｏ－ＣＨ３ピーク、及び、５．９８及び６．３２ｐｐｍにおけるポリマーＡの加水分解されたマレイミドピークと比較した。その結果、ミセルを構成する全ポリマーの約２０モル％（ポリマーＡの約４０モル％）にｃＲＧＤが導入されたことが確認された。
１．２．２）０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例）の合成
　上記１．２．１）の手順において、ポリマーＡ（リガンド担持用ポリマー）及びポリマーＢ（リガンド非担持用ポリマー）を１／１のモル比で使用する代わりに、ポリマーＡ（リガンド担持用ポリマー）を使用せず、使用するポリマーの全量をポリマーＢ（リガンド非担持用ポリマー）とした他は、上記１．２．１）と同様の手順により、０％ｃＲＧＤ（ｃＲＧＤ非導入）－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ：図中「ＤＡＣＨＰｔ／ｍ」）の溶液を得た。
１．２．３）２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例）の合成
　上記１．２．１）の手順において、ｃＲＧＤの代わりに、アミノ酸配列ＲＡＤｆＫを有するｃＲＡＤｆＫ（ＣＸ－）（Ｘ＝６－アミノカプロン酸：ε－Ａｃｐ、株式会社ペプチド研究所社製）にシステインを結合させたｃＲＡＤｆＫ－６－アミノカプロン酸－システイン１０．５ｍｇ（０．０１２８ｍｍｏｌ、マレイミド基に対し２．０当量）を用いた他は、上記１．２．１）と同様の手順により、２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ：図中「２０％ｃＲＡＤ／ｍ」）の溶液を得た。
２．ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（抗癌剤）の評価
　上記手順で得られた２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）及び０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）について、以下の動物実験による評価を行った。なお、動物実験は、何れも東京大学動物実験実施規則及び同マニュアルに従って実施した。
２．１．腫瘍体積及び体重の経時変化の評価
　皮下腫瘍移植マウスに対し、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）又は０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）を投与し、腫瘍体積及び体重の経時変化を評価した。
２．１．１）皮下腫瘍移植マウスの調製
　ヒト膠芽腫細胞Ｕ８７ＭＧ（東京大学医学部附属病院トランスレーショナルリサーチセンターより入手）を、１０％ウシ胎仔血清（Fetal bovine serum：ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco's modified eagle's medium：ＤＭＥＭ）中、５％二酸化炭素（ＣＯ２）含有加湿雰囲気下、３７℃で培養し、８０％のコンフルエンスに達した時点で回収した。このＵ８７ＭＧ細胞５．０×１０６細胞／５０μＬを、Balb-c nu/nuマウス（雌、体重１８～２０ｇ、６週齢、日本チャールス・リバー株式会社）に皮下注射した。外観観察により腫瘍形成を確認した上で、腫瘍形状をノギス（ベルニエマイクロキャリパー：vernier micro caliper）で測定し、腫瘍体積（Ｖ）を式Ｖ＝ａ×ｂ２／２により算出した。式中、ａ及びｂはそれぞれ、ノギスにより測定した腫瘍の長軸及び短軸を意味する。移植後５～６日経過し、腫瘍体積（Ｖ）が約３５～５０ｍｍ３に達した時点で、以下の試験に供し、評価を行った。
２．１．２）ミセルの投与及び評価
　上記手順により調製された皮下腫瘍移植マウスを６頭ずつ４群に分け、第１及び第２の群には２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）をそれぞれ３．０ｍｇ及び６．０ｍｇ（体重１ｋｇ当たりＤＡＣＨＰｔ換算量、以下同様）、第３の群には０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）を３．０ｍｇ、第４の群には対照としてＰＢＳを、それぞれ静脈注射により投与した。投与日から２日おきに、各個体の体重を測定すると共に、上述の手順で腫瘍体積（Ｖ）を測定した。
　各群の腫瘍体積及び体重の経時変化を、それぞれ図１（ａ）及び（ｂ）のグラフに示す。図１（ｂ）のグラフにおける体重は、投与日を１とした相対値で示す。３ｍｇ／ｋｇの２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）投与群では、同量の０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）投与群と比べて、より優れた抗癌効果が得られた一方で、体重減少の副作用が顕著に軽減された。また、倍量である６ｍｇ／ｋｇの２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）投与群では、抗癌効果は３ｍｇ／ｋｇの同ミセル投与群と比べて更に向上した一方で、体重減少は３ｍｇ／ｋｇの同ミセル投与群と比べれば若干悪化したものの、それでも半分量である３ｍｇ／ｋｇ０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）投与群よりも軽減されていた。
　これらの結果から、ｃＲＧＤをリガンドとして含有する本発明の抗癌剤によれば、従来の抗癌剤よりも優れた抗癌効果が得られる一方で、体重減少の副作用は顕著に軽減されること、ひいては、従来の抗癌剤よりも体重減少の副作用を抑制しながら、より多くの量を投与することが可能となることが分かる。
２．２．各臓器の毒性の評価
　マウスに対し、２０％ｃＲＧＤ導入ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）又は０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）を投与した後、各臓器を染色して、各ミセルによる毒性を評価した。
　具体的には、Balb-c nu/nuマウス（雌、体重１８～２０ｇ、６週齢、日本チャールス・リバー株式会社）に対し、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）又は０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）をそれぞれ５．０ｍｇ（体重１ｋｇ当たりＤＡＣＨＰｔ換算量）ずつ、静脈注射により１日おきに３回投与した。最終投与から７２時間後、各個体を屠殺し、肝臓、小腸及び大腸の組織を採取して１０％ホルマリン溶液で固定し、ミクロトームで１０μｍ厚に切削して組織切片を作製した。この組織切片にヘマトキシリン・エオシン（hematoxylin and eosin：Ｈ＆Ｅ）染色を施し、組織の状態を観察した。
　２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）投与個体及び０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）投与個体における、肝臓、小腸及び大腸の各組織切片のＨ＆Ｅ染色写真を、それぞれ図２（ａ）及び（ｂ）に示す。２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）投与個体は、何れの臓器についても、正常個体との差は見られなかった。一方、０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）投与個体では、正常個体よりも消化管（小腸及び大腸）の襞が減少し、形質の変化が観察されたことから、０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）には消化管毒性があることが分かる。また、肝臓にはグリコーゲンが蓄積した形跡が見られたが、これは消化管毒性により生じた摂食不良及び飢餓状態が原因であると考えられる。
　これらの結果から、ｃＲＧＤをリガンドとして含有する本発明の抗癌剤は、従来の抗癌剤の消化管毒性を低減し、それに伴う摂食不良や飢餓状態等を軽減することが分かる。斯かる作用が、上述した体重減少の副作用の軽減に寄与しているものと考えられる。
２．３．胆汁への移行性の評価
　ラットに対し、２０％ｃＲＧＤ導入ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）又は０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）を投与した後、胆汁を経時的に採集して、胆汁への移行性を評価した。
　具体的には、ＳＤ（Sprague-Dawley）ラット（４週齢、日本チャールス・リバー株式会社）をイソフルラン（マイラン製薬株式会社製）で麻酔し、胆管へキャピラリーを挿入した上で、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）又は０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）をそれぞれ１００μｇ（ＤＡＣＨＰｔ換算量、ラット１頭当たり）ずつ、静脈注射により投与した。投与から１時間毎に胆汁を採取し、胆汁中の白金量を誘導結合プラズマ質量分析法（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry：ＩＣＰ－ＭＳ）により測定した。
　２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）投与個体及び０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）投与個体における、胆汁に排出された累積白金量（μｇ）の経時変化を、図３のグラフに示す。最初の６時間は１時間毎、その後は６時間毎に示す。２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）投与個体では、０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）投与個体に比べて、胆汁中の白金濃度の上昇が遥かに速く、白金がより迅速に肝臓から胆汁へと排出されていることが分かる。ここから、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）はミセルのままで胆汁に排出されるのに対し、０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）は肝臓による代謝を受けた上で胆汁に排出されているものと推測される。
　これらの結果から、ｃＲＧＤをリガンドとして含有する本発明の抗癌剤は、従来の抗癌剤と比べて、遥かに迅速に肝臓から胆汁へと排出されることが分かる。斯かる作用が、上述した体重減少の副作用の軽減に寄与しているものと考えられる。
２．４．肝臓及び消化管集積性の評価
　ＤＡＣＨＰｔ／ｍのインビボにおける腫瘍集積性を評価するべく、Hela-luc腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝６）に対して、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）、４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ）、及び０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）を、マウス１頭当たりＤＡＣＨＰｔ換算で１００ｍｇの用量となるように静脈内投与した。投与後１、４、８、２４、４８、及び７２時間の時点でマウスを屠殺し、各組織（肝臓、小腸）を切除し、ＰＢＳで洗浄し、余剰の流体を除去した上で秤量した。約１．０ｍＬの濃硝酸（ＨＮＯ３）を用いて全サンプルを２００℃で酸消化し、乾燥した上で、１体積％の硝酸水溶液（１．０ｍＬ）に溶解し、誘導結合プラズマ質量分析法（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry：ＩＣＰ－ＭＳ）で各組織（肝臓、小腸）の白金濃度を測定して、肝臓集積性及び消化管（小腸）集積性の指標とした。
　また、各マウスの屠殺直後に、下大静脈から血液２００μｌを採取した。採取した血液を４℃、２０００×ｇで１０分遠心し、上清から８０μｌの血漿を得た。約１．０ｍＬの濃硝酸（ＨＮＯ３）を用いて全サンプルを２００℃で酸消化し、乾燥した上で、１体積％の硝酸水溶液（１．０ｍＬ）に溶解し、誘導結合プラズマ質量分析法（Inductively Coupled Plasma-Mass Spectrometry：ＩＣＰ－ＭＳ）で血中に残存するの白金濃度を測定して、血中滞留性の指標とした。
　血中滞留性、肝臓集積性及び消化管（小腸）集積性の測定結果を、それぞれ図４（ａ）～（ｃ）に示す。
　血中滞留性については、図４（ａ）に示すように、０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）に比べて、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）では短縮され、４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ）では更に短縮された。即ち、リガンドであるｃＲＧＤの導入に従って、血中滞留性が徐々に短くなることが分かる。
　肝臓集積性については、図４（ｂ）に示すように、リガンドの導入されていない０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例）はゆっくりと肝臓へ蓄積され、約４５～５０時間前後でピークを迎えるのに対して、リガンドであるｃＲＧＤが導入された２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）及び４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ）は、速やかに肝臓へ集積し、約８時間後にピークを迎えた後、速やかに肝臓から排出されることが分かる。
　消化管（小腸）集積性については、図４（ｃ）に示すように、リガンドの導入されていない０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例）はゆっくりと消化管へ蓄積され、約４５～５０時間前後でピークを迎えるのに対して、リガンドであるｃＲＧＤが導入された２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）及び４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ）は、比較的速やかに消化管へ集積し、約２４時間後にピークを迎えた後、消化管から排出されることが分かる。
　以上のｃＲＧＤ導入ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ、Ｂ）の肝臓からの排出挙動と消化管への集積・排出挙動とを総合的に勘案すると、ｃＲＧＤ導入ＤＡＣＨＰｔ担持ミセルが肝臓から消化管へ移行したものと考えることができる。
２．５．脳腫瘍に対する集積性及び抗腫瘍活性の評価
２．５．１）脳腫瘍に対する集積性の評価
　２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）及び２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ）を、それぞれAlexa647（赤色）及びDyLight488（緑色）蛍光プローブで標識し、U87MG腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝６）に対して同時に静脈内投与した。腫瘍内の蛍光信号を生体共焦点レーザー顕微鏡（intravital confocal laser scanning microscopy：ＩＶＣＬＳＭ）で測定することにより、ミセルの血管外漏出及び透過をリアルタイムに評価した。
　図５（ａ）及び（ｂ）は、それぞれ投与５分後及び投与５時間後におけるU87MG腫瘍部位のＩＶＣＬＳＭスナップショットを示す図である。図５（ａ）に示すように、投与５分後の時点では血流が黄色に観察されたが、これは両ミセルの発色によるものと考えられる。図５（ｂ）に示すように、投与５時間後の時点では、腫瘍組織内に、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）に相当する赤色の蛍光シグナルが明確に観察された。
　この現象を更に検証するために、蛍光プローブの組み合わせを逆にし、即ち、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）及び２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ）を、それぞれDyLight488（緑色）及びAlexa647（赤色）蛍光プローブで標識した上で同様に実験を行い、ＩＶＣＬＳＭ観察を行った。投与５分後及び投与５時間後に得られたU87MG腫瘍部位のＩＶＣＬＳＭスナップショットをそれぞれ図５（ｃ）及び（ｄ）に示す。図５（ｃ）及び（ｄ）から明らかなように、腫瘍組織において２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）に相当する緑色蛍光の経時的な上昇が観察された。
　腫瘍組織におけるミセルの集積を定量評価するために、図５（ｃ）に示す部位の３つの異なる領域（図中点線四角で示す領域）を選択し、各領域内の蛍光シグナルの変化をＩＶＣＬＳＭにより９時間に亘って経時的に評価した。得られた蛍光シグナルの経時変化を図６のグラフに示す。図６から明らかなように、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）については、投与後５時間に亘って、腫瘍組織において蛍光シグナルの急速な上昇が観察された。一方、アミノ酸配列には僅かな差異しかないにも関わらず、ｃＲＡＤペプチドをリガンドとした２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ）では、ｃＲＧＤペプチドのように、ミセルの血管外漏出及び透過を促進する効果は見られなかった。
　また、図５（ｃ）及び（ｄ）に示す部位の一領域（図中実線四角で示す領域）を選択し、当該領域内における２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）及び２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ）の蛍光強度をＩＶＣＬＳＭにより観察し、血管系からU87MG腫瘍間質への透過性を定量的に分析した。
　２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）投与５分後及び５時間後に得られた蛍光シグナルの、腫瘍血管から腫瘍組織に至る横断面における定量値分布を、それぞれ図７（ａ）及び（ｂ）のグラフに示す。図７（ａ）から明らかなように、投与５分後の時点では、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）の蛍光シグナルが腫瘍血管に沿って観察されたが、腫瘍組織内には観察されなかった。一方、図７（ｂ）から明らかなように、投与５時間後の時点では、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）の蛍光シグナルは、腫瘍組織内でも約１５０まで上昇した。以上の結果から、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）は、血液脳腫瘍関門（Blood-Brain Tumor Barrier：ＢＢＴＢ）を通過して、脳腫瘍組織内に侵入することが分かる。
　一方、２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ）投与５分後及び５時間後に得られた蛍光シグナルの、腫瘍血管から腫瘍組織に至る横断面における定量値分布を、それぞれ図８（ａ）及び（ｂ）のグラフに示す。図８（ａ）及び（ｂ）から明らかなように、投与５分後及び投与５時間後の何れの時点でも、２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ）の蛍光シグナルが腫瘍血管に沿って観察されたが、腫瘍組織内には観察されなかった。以上の結果から、２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ）は、血液脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）を通過できず、腫瘍組織内に侵入できないことが分かる。
　また、腫瘍を有さない正常脳に対する集積性を評価するべく、以下の実験を行った。正常ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝４）に対して、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）、４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ）、及び０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）を、マウス１頭当たりＤＡＣＨＰｔ換算で１００ｍｇの用量となるように静脈内投与した。投与後１、４、８、及び２４時間の時点でマウスを屠殺し、脳組織を切除し、ＰＢＳで洗浄し、余剰の流体を除去した上で秤量した。約１．０ｍＬの濃硝酸（ＨＮＯ３）を用いて全サンプルを２００℃で酸消化し、乾燥した上で、１体積％の硝酸水溶液（１．０ｍＬ）に溶解し、誘導結合プラズマ質量分析法（ＩＣＰ－ＭＳ）で脳組織内の白金濃度を測定して、正常脳集積性の指標とした。
　正常脳集積性の測定結果を図９に示す。図９から明らかなように、腫瘍を有さない正常脳組織については、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）、４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ）、及び０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）の何れも、脳組織内への集積は見られなかった。この結果を前記結果と考え合わせると、ｃＲＧＤリガンド導入ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ、Ｂ）は、正常脳の血液脳関門（Blood-Brain Barrier：ＢＢＢ）は通過しないが、腫瘍脳の血液脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）を通過し、腫瘍脳組織内に特異的に侵入することが分かる。
２．５．２）脳腫瘍に対する抗腫瘍活性の評価
　ｃＲＧＤリガンド導入ＤＡＣＨＰｔ担持ミセルの脳腫瘍特異的な腫瘍成長阻害効果を検証するために、以下の実験を行った。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに対してU87MG腫瘍（脳腫瘍）組織を異種移植した皮下腫瘍モデルマウスを用意した。斯かるマウスを６頭ずつ４群に分け、各群に対し、腫瘍接種５日後から、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）、２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ）又はオキサリプラチン（比較例Ｃ）各３．０ｍｇ（体重１ｋｇ当たりＤＡＣＨＰｔ換算量）を、一日おきに計三回全身投与した。残る一群には対照例としてＰＢＳのみを投与した。抗癌活性の評価は腫瘍体積を測定することにより行った。腫瘍体積（Ｖ）は、外観観察により腫瘍形成を確認した上で、前記２．１．１）に記載の手法で算出した。
　得られた腫瘍体積の経時変化を図１０に示す。２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ）及びオキサリプラチン（比較例Ｃ）には脳腫瘍の成長抑制効果は観察されなかったのに対し、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）では脳腫瘍の顕著な成長阻害効果が観察された。この結果から、リガンドペプチドのアミノ酸配列には特異性があり、ｃＲＧＤをリガンドとして用いた場合にのみ、脳腫瘍の顕著な成長抑制効果が得られることが分かる。
２．６．乳腺癌細胞に対する抗癌活性の評価
　ｃＲＧＤリガンド導入ＤＡＣＨＰｔ担持ミセルの乳腺癌細胞に対する抗腫瘍効果を評価するために、以下の実験を行った。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに対してMDA-MB-231腫瘍（乳腺癌）組織を異種移植した皮下腫瘍モデルマウスを用意した。斯かるマウスを６頭ずつ４群に分け、各群に対し、腫瘍接種５日後から、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）、２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ）、又はオキサリプラチン（比較例Ｃ）各３．０ｍｇ（体重１ｋｇ当たりＤＡＣＨＰｔ換算量）を、一日おきに計三回全身投与した。残る一群には対照例としてＰＢＳのみを投与した。抗癌活性の評価は腫瘍体積を測定することにより行った。腫瘍体積（Ｖ）は、外観観察により腫瘍形成を確認した上で、前記２．１．１）に記載の手法で算出した。
　得られた結果を図１１に示す。２０％ｃＲＡＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ｂ）及びオキサリプラチン（比較例Ｃ）には乳腺癌の成長抑制効果は観察されなかったのに対し、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）では乳腺癌の顕著な成長阻害効果が観察された。この結果から、リガンドペプチドのアミノ酸配列には特異性があり、ｃＲＧＤをリガンドとして用いた場合にのみ、乳腺癌腫瘍の顕著な成長抑制効果が得られることが分かる。
２．７．子宮頸癌細胞に対する抗癌効果
　ｃＲＧＤリガンド導入ＤＡＣＨＰｔ担持ミセルの子宮頸癌細胞に対する抗腫瘍効果を評価するために、以下の実験を行った。ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに対してHela腫瘍（子宮頸癌）組織を異種移植した皮下腫瘍モデルマウスを用意した。斯かるマウスを６頭ずつ分け、各群に対し、腫瘍接種５日後から、０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）、又は４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ）を、それぞれ投与量を１～１２ｍｇ／ｋｇ（体重１ｋｇ当たりＤＡＣＨＰｔ換算量）の範囲で変動させて、一日おきに計三回全身投与した。また、オキサリプラチン（比較例Ｃ）及びＰＢＳ（対照例）の投与群も作製した。各群における抗癌活性の評価は、腫瘍体積及び体重の変化を測定することにより行った。腫瘍体積（Ｖ）は、外観観察により腫瘍形成を確認した上で、前記２．１．１）に記載の手法で算出した。
　０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）の投与による腫瘍体積及び体重の経時変化を、それぞれ図１２（ａ）及び（ｂ）に示し、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）の投与による腫瘍体積及び体重の経時変化を、それぞれ図１３（ａ）及び（ｂ）に示し、４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ）の投与による腫瘍体積及び体重の経時変化を、それぞれ図１４（ａ）及び（ｂ）に示す。図１２（ａ）及び（ｂ）の結果から明らかなように、０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（比較例Ａ）投与群では、４ｍｇ／ｋｇの投与でマウスが死亡してしまったことから、リガンドを結合しないＤＡＣＨＰｔ担持ミセルの最大耐性量（maximum tolerated dose：ＭＴＤ）は約３ｍｇ／ｋｇ前後であると考えられる。一方、図１３（ａ）及び（ｂ）の結果から明らかなように、２０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ａ）では、８ｍｇ／ｋｇまでの投与が可能であり、リガンドの導入により２倍以上の最大耐性量（ＭＴＤ）が達成されることが分かる。更に、図１４（ａ）及び（ｂ）の結果から明らかなように、４０％ｃＲＧＤ－ＤＡＣＨＰｔ担持ミセル（実施例Ｂ）の場合には、最高１２ｍｇ／ｋｇまで最大耐性量（ＭＴＤ）を増加させることが可能となる。
　本発明は医療分野において、腫瘍の治療に広範に利用でき、且つ、患者の副作用を軽減する等の顕著な効果を有するので、その利用価値は極めて高い。

Claims (5)

  1. 　抗癌活性成分と、環状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチドとを含む抗癌剤。
  2. 　環状ＲＧＤ配列含有ペプチドが抗癌活性成分に結合された、請求項１に記載の抗癌剤。
  3. 　抗癌活性成分を担持する担体を更に含み、環状ＲＧＤ配列含有ペプチドが担体に結合された、請求項１に記載の抗癌剤。
  4. 　担体が、非荷電性セグメントと荷電性セグメントとを有するブロック共重合体からなる静電結合型高分子ミセルであり、抗癌活性成分がミセル内に包有される、請求項３に記載の抗癌剤。
  5. 　抗癌活性成分が白金錯体成分である、請求項１～４の何れか一項に記載の抗癌剤。
PCT/JP2013/082272 2012-11-29 2013-11-29 環状ｒｇｄ配列含有ペプチドを含む抗癌剤 WO2014084378A1 (ja)

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