JP4538666B2 - 薬物内包アクティブターゲット型高分子ミセル、医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、腫瘍細胞、炎症細胞、免疫担当細胞、新生血管および血管内皮といった投薬対象物に指向性を有する、アクティブターゲット型である薬物内包高分子ミセルと、当該ミセルを利用した医薬組成物に関する。

経口や静脈内注射によって薬物を全身投与すると、投薬対象物としての病巣部位だけでなく、正常組織にも薬物が供給される。この結果、薬物投与による副作用が認められ、治療方法の変更や中断が必要になる場合がある。副作用の低減を目的として、投薬対象物の固有の受容体、リガンドおよび酵素といった分子マーカーに特異的に結合する能力を有した、分子標的薬と呼ばれる薬物が開発されている（非特許文献１参照）。しかし、現在のところ、こうした分子標的薬は、ゲフィチニブ（Ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）の投与による間質性肺炎の発生事例として知られているように副作用を十分には低減できてはおらず、さらには、病巣部位に対する治療効果も十分ではない。

薬物を投薬対象物に選択的に供給するとともに、投薬対象物の近傍において最適な薬物濃度を維持する観点から、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）と呼ばれる技術が注目されている。特許文献１は、薬物およびリガンドが合成ポリマーに結合した状態にある、アクティブターゲット型の高分子コンジュゲートＤＤＳを開示する。

国際公開第２００２／０８７４９７号パンフレット

Ａｓａｈｉｎａ Ｈ，Ｙａｍａｚａｋｉ Ｋ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，９５，２００６，ｐ．ｐ．９９８−１００４

副作用を低減させる観点からは、投薬対象物に適切に送達されなかった薬物が、正常細胞を損傷する前に体内から除去されることが望ましい。特許文献１に記載の高分子コンジュゲートは、１つの合成ポリマー鎖に薬物とリガンドが結合しているため、対応するレセプタに結合しながらも投薬対象物としての細胞内に取り込まれなかった場合、薬物が血中に暴露され続けることになる。このため、こうした従来型のアクティブターゲット型ＤＤＳには、副作用を低減させるために、未だ改善の余地が残されている。

本発明は、標的結合部位を有する骨格ポリマーユニットαと、薬物を有し前記標的結合部位を有さない骨格ポリマーユニットβとを含み、前記骨格ポリマーユニットαおよび骨格ポリマーユニットβが、前記標的結合部位を外側に向けると共に前記薬物を内側に向けた状態で放射状に配列しており、ｉ）前記放射状の配列を維持した状態で標的に結合した場合、エンドサイトーシスによって当該標的を供給する細胞の内部に取り込まれ、前記細胞内において前記放射状の配列が崩壊することによって前記薬物が当該細胞内に放出され、ｉｉ）標的への結合以前に血中において前記放射状の配列が崩壊した場合、代謝により前記骨格ポリマーユニットβが体外に排出されることによって、前記薬物が正常細胞に損傷を与え得ることが防止された、薬物内包アクティブターゲット型高分子ミセルを提供する。

本明細書において、骨格ポリマーユニットαが含有する標的結合部位とは、生体およびウイルスに由来する物質に対し特異的に結合して当該物質と生物学的な結合対を形成し得る、生物学的な認識機能を有する部位を意味する。生体およびウイルスに由来する物質としては、生体細胞、細菌、真菌およびウイルスに存在する分子が例示できる。生体細胞としては、腫瘍細胞および新生血管細胞ならびにそれらの周辺細胞、免疫担当細胞（例えばＢ細胞）、炎症細胞（例えば白血球）、血管内皮細胞、各種臓器を構成する細胞が例示できる。骨格ポリマーユニットαは、こうした物質と結合対を形成するタンパク質、ペプチドおよび糖鎖といった化合物を含有することによって、標的結合部位を含有した状態にあってよい。

本発明は、別の側面から、上記の高分子ミセルと、製薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

本発明では、薬物と標的結合部位とを別々のポリマーユニットに含有させることにより、投薬対象物としての細胞に取り込まれる前にミセル構造が崩壊した場合には薬物を代謝によって体外に排出できるという安全機構をミセルに組み込むこととした。これにより、従来型のアクティブターゲット型ＤＤＳに比べて、副作用の発生を回避しやすくなる。

図１は、本発明の高分子ミセルによるがん細胞の損傷作用に関するデータの一例を示すためのグラフである。 図２は、本発明の高分子ミセルによるがん細胞の損傷作用に関するデータの別例を示すためのグラフである。 図３は、本発明の高分子ミセルの投与による腫瘍体積の経時変化に関するデータを示すためのグラフである。 図４は、本発明の高分子ミセルの投与による被検動物の体重の経時変化に関するデータを示すためのグラフである。 図５は、薬物非含有アクティブターゲット型高分子ミセルによるがん細胞の損傷作用に関するデータの一例を示すためのグラフである。 図６は、本発明の高分子ミセルの構造および作用を説明するための概念図である。

本発明の高分子ミセル１００は、図６のａ）に示すように、骨格ポリマーユニットα１０と骨格ポリマーユニットβ２０を有している。骨格ポリマーユニットα１０は、標的結合部位１１を有する化合物、ポリエチレングリコール鎖に代表される親水性ポリマーセグメント１２、およびポリアミノ酸鎖に代表される疎水性ポリマーセグメント１３を有している。なお、以降、ポリエチレングリコールをＰＥＧと表示する場合がある。標的結合部位１１は、親水性ポリマーセグメント１２に結合している。骨格ポリマーユニットβ２０は、薬物１４、ポリエチレングリコール鎖に代表される親水性ポリマーセグメント１２、およびポリアミノ酸鎖に代表される疎水性ポリマーセグメント１３を有している。薬物１４は、疎水性ポリマーセグメント１３にエステル結合またはアミド結合している。このように、骨格ポリマーユニットα１０は、標的結合部位１１を有する一方、薬物１４を有さず、骨格ポリマーユニットβ２０は、薬物１４を有する一方、標的結合部位１１を有さない。そして、骨格ポリマーユニットα１０と骨格ポリマーユニットβ２０は、標的結合部位１１を外側に向け、薬物１４を内側に向けた状態で放射状に配列している。高分子ミセル１００は、図６のａ）に示すように、標的結合部位１１も薬物１４も有しない、親水性ポリマーセグメント１２および疎水性ポリマーセグメント１３からなる骨格ポリマーユニットγ３０を含有していても構わない。

本明細書において、骨格ポリマーユニットα１０と骨格ポリマーユニットβ２０が放射状に配列しているとは、標的結合部位１１を外側に向け薬物１４を内側に向けて凝集した状態にあればよく、各ユニットの配列の起点が一点に集中していない、やや崩れた放射状の配列構造を有するミセルであっても構わない。高分子ミセル１００は、骨格ポリマーユニットα１０と骨格ポリマーユニットβ２０による高分子凝集体が乾燥状態にあるものであっても構わない。

高分子ミセル１００は、図６のｂ）に示すように、放射状の配列を維持した状態で標的４０に結合した場合、標的４０を供給する細胞５０の内部にエンドサイトーシスによって取り込まれ（図６のｂ）において中央に表示する）、その後、細胞５０内で放射状の配列が崩壊することによって、内包していた薬物１４を細胞５０内に放出すると考えられる。より具体的には、骨格ポリマーユニットβ２０が、細胞５０内のリソゾーム内に移行し、エステラーゼに代表される酵素によりエステル結合が切断されることによって薬物１４が放出されると考えられる。

分子量が数万以下である高分子は、原則、腎臓を介して速やかに尿中に排泄されることが知られている。このため、高分子ミセル１００の放射状の配列が図６のｃ）に示すように投薬対象物に取り込まれる前に崩壊して血液６０中に薬物１４が暴露される状態になっても、分子量が数万以下である骨格ポリマーユニットβ２０は、標的４０に固定されて薬物１４を血液６０中に暴露させ続けることはなく、代謝によって速やかに体外に排出されることとなる。こうして、高分子ミセル１００には、投薬対象物に取り込まれる前にミセル構造が崩壊してしまった場合に薬物が正常細胞に損傷を与えることを防止する安全機構が組み込まれている。

骨格ポリマーユニットαは、一般式Ｉ：Ｚ−Ａ_１−Ｂ_１で表示される、標的結合部位を有する化合物とブロック共重合体とからなり、骨格ポリマーユニットβは、一般式ＩＩ：Ａ_２−Ｂ_２（−Ｄ）で表示される、薬物とブロック共重合体とからなることが好ましい。ただし、Ｚは標的結合部位を有する化合物であり、Ａ_１およびＡ_２は互いに独立したポリエチレングリコール鎖セグメントであり、Ｂ_１およびＢ_２は互いに独立したポリアミノ酸鎖セグメントであり、Ｄは薬物である。

骨格ポリマーユニットαは、ポリエチレングリコール鎖セグメントのα末端にヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、アミノ基、メルカプト基、マレイミド基といった連結基を有するブロック共重合体と、標的結合部位を有する化合物とを、縮合または付加反応させることによって形成できる。

骨格ポリマーユニットβのポリエチレングリコール鎖セグメントのα末端は、ヒドロキシル基のような上記の連結基を有していてもよいが、炭素数が１〜１２の範囲（Ｃ_１−Ｃ_１２）にある直鎖のもしくは分岐を有するアルキル基またはアルコキシ基、もしくは水酸基を有していることが好ましい。

ポリアミノ酸鎖セグメントとしては、ポリグルタミン酸またはそのエステルもしくはアミド誘導体、ポリアスパラギン酸またはそのエステルもしくはアミド誘導体を例示できる。こうしたエステル又はアミド誘導体は、疎水性有機基を有する対応するヒドロキシ化合物またはアミノ化合物と、ポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸の反応性誘導体（例えばエステル）とを反応させることにより形成できる。疎水性有機基としては、炭素数が１〜６の範囲（Ｃ_１−Ｃ_６）にあるアルキルフェニル、コレステロール、直鎖のまたは分岐を有する炭素数が８〜１８の範囲（Ｃ_８−Ｃ_１８）にあるアルキルを例示できる。

骨格ポリマーユニットαおよび骨格ポリマーユニットβにおけるブロック共重合体は、例えば、特開平２−３００１３３号公報に記載の方法である、Ｙ−ＰＥＧ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−ＮＨ_２（Ｙは保護されていてもよい官能基または置換基を表す）を開始剤とし、脱水済みの有機溶媒中で、Ｎ−カルボキシ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタメートまたはＮ−カルボキシ−β−ベンジル−Ｌ−アスパルテートを所望の重合度となるように添加して反応させることによって形成できる。ベンジル基よりもより嵩高い疎水基を導入する場合は、Ｃ_４アルキル−フェニル基、コレステロール、Ｃ_８〜Ｃ_１８のアルキル基でベンジル基を置換すればよい。こうした疎水基は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジイソプロピルカルボジイミドのような縮合剤を用い、脱水済みの有機溶媒中で、水酸基またはアミノ基を有する疎水性化合物をポリグルタミン酸側鎖に導入すればよい。

骨格ポリマーユニットαは、下記一般式Ｉ−ａまたは一般式Ｉ−ｂで表示される構造を有し、骨格ポリマーユニットβは、下記一般式ＩＩ−ａまたは一般式ＩＩ−ｂで表示される構造を有することが好ましい。

ただし、Ｒ_１は標的結合部位を有する化合物であり、Ｒ_２は水酸基を末端に有してもよい炭素数１〜１２の範囲にあるアルキル基であり、Ｌ_１はＯ（ＣＨ_２）_ｐＮＨであり、Ｌ_２はＯ（ＣＨ_２）_ｐ−ＣＯ−であり、ｐは１〜５の範囲にある整数であり、Ｒは水素原子または疎水性有機基であり、ｑは１または２であり、ｎ_１およびｎ_２は互いに独立して４０〜４５０の範囲にある整数であり、ｍ_１およびｍ_２は互いに独立して２０〜８０の範囲にある整数であり、Ｒ_３は総数ｍ_２の少なくとも１０〜７０％が連結基を有していてもよい薬物の残基であり、存在する場合の残りの基が水素原子または疎水性有機基である。

ｎ_１およびｎ_２は、共通して、４０〜４５０の範囲にある整数であることが好ましく、７０〜３５０の範囲にある整数であることがより好ましく、１１０〜２８０の範囲にある整数であることが特に好ましい。ｍ_１およびｍ_２は、共通して、２０〜８０の範囲にある整数であることが好ましく、２５〜５０の範囲にある整数であることがより好ましい。ｎ_１、ｎ_２、ｍ_１、ｍ_２の数値は平均値である。

高分子ミセル１００では、骨格ポリマーユニットα１０と骨格ポリマーユニットβ２０とが、モル比で、１：１９〜１９：１の範囲で存在する。

標的結合部位１１を有する化合物としては、上記のとおり、生体およびウイルスに由来する物質と結合対を形成するタンパク質、ペプチドまたは糖鎖を例示できる。こうしたタンパク質としては、生体およびウイルスに由来する物質と結合する抗体およびその断片、トランスフェリンならびに上皮成長因子（ＥＧＦ）を例示できる。抗体としては、がん細胞に代表される投薬対象物の表面に高発現する受容体や細胞表面の抗原である、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０、ＶＥＧＦＲおよびＣＤ５２といった抗原を認識する抗体を例示できる。抗体はモノナール抗体であってもよいしポリクロナール抗体であってもよい。抗体の断片としては、抗原を特異的に認識できる長さを有しているものであればよく、（Ｆａｂ’）２およびＦａｂを例示できる。ペプチドとしては、インスリン、ＬＨＲＨ、ＩＧＦおよびそれらの誘導体を例示できる。糖類としては、グルコース、マンノース、ガラクトースおよびフコース残基を有する糖類を例示できる。

標的結合部位１１を有する化合物が結合対を形成すべき標的４０がウイルスに由来する物質である場合、当該物質を供給するべき細胞は、感染したウイルスによって細胞膜が破壊され細胞死した状態にあるため、エンドサイトーシスによって高分子ミセル１００を細胞内に取り込むことができない。したがって、本明細書では、標的４０がウイルスに由来する物質である場合、標的４０の周辺に存在する細胞を、標的４０を供給する細胞として取り扱うこととする。ウイルスに由来する物質が細胞外に存在する場合、こうした周辺の細胞もウイルスに感染している可能性が高いため、当該周辺細胞に薬物を供給する意義がある。

薬物１４としては、核酸誘導体、ドセタキセル、カンプトテシン類、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤおよびこれらエポチロン類の誘導体、テムシロリムス、エベロリムス、トラベクテジン、ボリノスタット、酢酸オクトレオチド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、セファレキシン、セファクロル、アンピシリン、バカアンピシリン、アモキシシリン、カナマイシン、アミカシン、アルベカシン、ジベカシン、シソマイシン、トブラマイシン。エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキタマイシン、クロラムフェニコール、バンコマイシン、フルコナゾール、ビタラビン、アシクロビル、ジダノシン、ジドブジン、ザルシダビン、ラミブジン、ザナビル、オセタミビル、ロピナビル、リトナビルを例示できる。核酸誘導体としては、ゲムシタビン、ネララビン（Ｎｅｌａｒａｂｉｎｅ）、クロフォラビン（Ｃｌｏｆａｒａｂｉｎｅ）、デシタビン（Ｄｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、ストレプトゾシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｃｉｎ）、ドキシフルリジン（Ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、フルダラビンを例示できる。核酸誘導体は塩であっても構わないが、エステル結合によって骨格ポリマーユニットβに結合させる場合は、塩ではないほうが好ましい。エポチロン類の誘導体としては、Ｐａｔｕｐｉｌｏｎｅ、Ｉｘａｂｅｐｉｌｏｎｅ、ＢＭＳ−３１０７０５、ＫＯＳ−８６２、ＺＫ−ＥＰＯを例示できる。

薬物に複数の水酸基が存在する場合、骨格ポリマーユニットβは、当該水酸基の１つ以上がポリグルタミン酸側鎖のカルボキシル基にエステル結合した構造をとり得る。本明細書では、１つの薬物がポリグルタミン酸側鎖中の複数のカルボキシル基にエステル結合した構造、そして２つ以上のブロック共重合体部分が１つの薬物を介して架橋された構造、についても骨格ポリマーユニットβに含めて取り扱うこととする。

本発明の高分子ミセルは、例えば、骨格ポリマーユニットαと骨格ポリマーユニットβとを水性溶液中で混合し、ミセル状に自己組織化させることによって形成できる。また例えば、本発明の高分子ミセルは、骨格ポリマーユニットβと骨格ポリマーユニットγとを水性溶液中で混合させミセル状に自己組織化させた後、標的結合部位を有する化合物を骨格ポリマーユニットγの親水性セグメントのα末端に結合させることによって形成することもできる。水性溶液は、例えば、エタノールおよびジメチルスルホキシドといった水混和性有機溶媒と、公知の緩衝剤とを精製水に添加することによって形成できる。互いに異なる標的結合能を有する複数種の骨格ポリマーユニットαと、互いに異なる薬物が結合している複数種の骨格ポリマーユニットβとを用意しておけば、それぞれを適宜組み合わせることによって、種々のアクティブターゲット型薬物内包高分子ミセルを容易に形成でき便利である。

特許文献１に記載の高分子コンジュゲートに代表される従来型のアクティブターゲット型ＤＤＳは、薬物がエステル結合したブロック共重合体に、標的結合部位を有する化合物を結合させることによって形成されている。しかし、ブロック共重合体に薬物を結合させる過程で、ブロック共重合体における標的結合部位を有する化合物を結合させるべき官能基または置換基が、当該化合物との結合能を失う場合がある。また、当該化合物を結合させる過程で、薬物が分解してしまう場合がある。このため、従来型のアクティブターゲット型ＤＤＳは、簡便に調製することが難しい。他方、上記のとおり、本発明の高分子ミセルは、薬剤の失活を回避しつつ、種々のアクティブターゲット型薬物内包高分子ミセルを容易に形成できる。

本発明によれば、上記の高分子ミセルと、製薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供することもできる。製薬学的に許容される担体は、目的とする投与剤型により、当該技術分野で常用されている希釈剤および賦形剤であってよいが、非経口剤である液剤、凍結乾燥製剤の調製に適した、精製水、脱イオン水、等張剤およびｐＨ調整剤が好ましい。

本発明の医薬組成物の投与ルートは、皮下、静脈、動脈、局所といった非経口投与が好ましく、静脈内注射が特に好ましい。医薬組成物の投与量は、薬物の種類、用法、患者の年齢、性別、患者の健康状態によって適宜調整されるべきではあるが、薬物換算で、１日当たり、０．１〜１００００ｍｇ／ｍ^２の範囲、好ましくは１〜１０００ｍｇ／ｍ^２の範囲とする。

以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明する。

（実施例１）
標的結合部位を有する化合物としてトランスフェリンを有し、薬物としてカンプトテシン（ＣＰＴ）を内包する高分子ミセルである、トランスフェリン結合カンプトテシンミセルを、次のようにして形成した。

まず、骨格ポリマーユニットβとして、カンプトテシンコンジュゲート（ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＣＰＴ）を、次のようにして形成した。１ｇのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−Ａｃを８０ｍＬの無水ジメチルホルムアミド（無水ＤＭＦ）に溶解させた後、３８７ｍｇのカンプトテシン（和光純薬）を添加した。なお、このＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＡｃにおけるＰＥＧ鎖長は１２ｋＤａであり、アスパラギン酸の平均残基数は４０であり、アスパラギン酸の側鎖はカルボン酸である。続いて、８２３ｍｇのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（国産化学）と、１３６ｍｇのジメチルアミノピリジン（和光純薬）とをこの順に添加し、４℃で３日間攪拌し、室温に昇温してさらに一晩攪拌した。こうして得た反応液を、透析チューブ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ^（Ｒ）分子量カットオフ３５００）に移し、精製水に対し、４℃にて透析した。白沈を除いた後、得られた黄色溶液を孔径０．８μｍのフィルター（ミリポア社製Ｍｉｌｌｅｘ^（Ｒ）−ＡＡ）でろ過した。ろ液を凍結乾燥することによって、淡黄色粉末である１．１ｇのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＣＰＴを得た。このＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＣＰＴは、カンプトテシンが、ＰＥＧ−ｐＧｌｕにエステル結合を介して結合した状態（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＣＰＴ）にある。このＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＣＰＴは、上記一般式ＩＩ−ａで表示される構造を有する。ＰＥＧの鎖長は１２ｋＤａである。

ＰＥＧ末端にマレイミド基を有するポリマー（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を用意した。当該ポリマーにおけるＰＥＧの鎖長は１２ｋＤａである。１０ｍｇのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＣＰＴと、１０ｍｇのＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡとを、サンプルバイアルに精秤し、精製水を１ｍＬ添加した。４℃で一昼夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下で１０分間超音波処理し、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製Ｍｉｌｌｅｘ^（Ｒ）ＧＰＰＥＳ）でろ過し、ろ液を回収した。ろ液をゲルろ過［ＧＥサイエンス社製ＰＤ−１０、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］し、ミセル画分（１．５ｍＬ）を回収した。当該ミセル画分には、ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＣＰＴとＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡとが放射状に配列した、ミセルが含有されている。

ヒト由来のトランスフェリン（シグマ−アルドリッチ社）（以降、トランスフェリンをＴｆと表示する場合がある）４０ｍｇに、０．２Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）と１００ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と精製水を加えてＴｆを溶解した。続いて、ホウ酸緩衝液の最終濃度が５０ｍＭになりＥＤＴＡの最終濃度が２ｍＭになるように、１０ｍｇ／ｍＬのトラウト試薬（ピアス社）を１３８μＬさらに添加して、計１ｍＬの混合液にした後、３０℃にて４５分間静置した。こうして得た反応液をゲルろ過［ＧＥサイエンス社製ＰＤ−１０、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ］し、高分子画分（１．５ｍＬ）を回収した。

この回収液０．７５ｍＬと、上記のミセル画分０．７５ｍＬとを混合し、３０℃にて２時間静置することによって、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡのマレイミド基とＴｆとを反応させ、骨格ポリマーユニットαとしてのトランスフェリン結合ポリマーを含有するミセルを形成した。このトランスフェリン結合ポリマーは、上記一般式Ｉ−ａで表示される構造を有する。ＰＥＧの鎖長は１２ｋＤａである。この反応液におけるリン酸ナトリウム緩衝液の最終濃度は２０ｍＭであり、ＥＤＴＡの最終濃度は１ｍＭである。続いて、反応液に２００ｍＭのギ酸アンモニウム緩衝液を添加し、ｐＨを５に調整した後、ゲルろ過精製［Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（１φ×３０ｃｍ）、溶離液：２０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）］することによって、未反応のＴｆを除去した。

回収したミセル画分を限外ろ過（ミリポア社製Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５）することによって約２ｍＬに濃縮した後、ＮａＨＣＯ_３−Ｎａ_２ＣＯ_３緩衝液（ｐＨ９．６）を添加してｐＨを７に調整し、さらに１００ｍＭのシステイン溶液を２０μＬ添加した状態で、室温にて１０分間静置した。こうして得た反応液をゲルろ過［ＧＥサイエンス社製ＰＤ−１０、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）］し、高分子画分（３ｍＬ）を回収した。この高分子画分に、１ＭのＦｅＣｌ_３と、１００ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３を（１００ｍＭのクエン酸にてｐＨ７．０に調整したもの）とを、それぞれ３０μＬづつ添加した。こうして得た混合液を、４℃にて一晩静置した後、限外ろ過（ミリポア社製Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５）し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）による希釈と鉄イオンの除去を繰り返すことによって、最終的に約２ｍＬに濃縮した。この濃縮液を、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製Ｍｉｌｌｅｘ^（Ｒ）ＧＶ）でろ過し、ろ液を回収することによって、トランスフェリン結合カンプトテシンミセルを含有する溶液を得た。

（実施例２）
薬物としてドセタキセル（ＤＴＸ）を使用することによって、骨格ポリマーユニットβをドセタキセルコンジュゲート（ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＤＴＸ）としたこと以外は、実施例１と同様にして、標的結合部位を有する化合物としてトランスフェリンを有し、薬物としてドセタキセルを内包する高分子ミセルである、トランスフェリン結合ドセタキセルミセルを形成した。なお、骨格ポリマーユニットαおよび骨格ポリマーユニットβのブロック共重合体部分を構成するＰＥＧの鎖長は、いずれも１０ｋＤａにした。ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＤＴＸは、ドセタキセルがＰＥＧ−ｐＧｌｕにエステル結合を介して結合した状態（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＤＴＸ）にあり、上記一般式ＩＩ−ａで表示される構造を有する。

骨格ポリマーユニットβとしてのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＤＴＸは、次のようにして形成した。ポリグルタミン酸の片末端がアセチル化された状態にある、５００ｍｇのポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−Ａｃ）を、１０ｍＬの無水ＤＭＦ（関東化学）に溶解させた後、さらに１．０６ｇのドセタキセル（ＳｃｉｎｏＰｈａｒｍ Ｔａｉｗａｎ，Ｌｔｄ）を添加した。なお、このＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＡｃにおけるＰＥＧの平均分子量は１００００であり、グルタミン酸の平均残基数は４０であり、グルタミン酸の側鎖はカルボン酸である。続いて、１６０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（和光純薬）と、２１０μＬのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（国産化学）とをこの順に添加し、室温にて一晩攪拌した。こうして得た反応液を、ヘキサンと酢酸エチルとの混合溶液（体積比１：１）５００ｍＬに滴下してポリマーを晶析させた後、当該ポリマーを減圧ろ集した。ろ集によって得たポリマーを、１００ｍＬの精製水に懸濁して高分子ミセルとし限外ろ過（ミリポア社製ラボスケールＴＦＦシステム、分子量カットオフ値：１０００００、５倍希釈後、１００ｍＬに濃縮）を行った。この限外ろ過の操作を５回繰り返し行なった後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥によって得たポリマーを、１０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解させた状態で、ヘキサンと酢酸エチルとの混合溶液（体積比１：１）５００ｍＬに滴下してポリマーを晶析させた後、当該ポリマーを減圧ろ集した。ろ集によって得たポリマーを、粉末状態のままでヘキサンと酢酸エチルとの混合溶液（体積比１：１）１００ｍＬに添加することによって洗浄した後、減圧ろ集した。ろ集したポリマーを、室温にて１晩減圧乾燥させることによって、淡黄色粉末である５３０ｍｇのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＤＴＸを得た。

１ｍｇのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＤＴＸを、精製水とエタノールの混合溶液（体積比１：１）１０ｍＬに溶解させ、波長２３３ｎｍの光線に対する吸光度からドセタキセルの含有量を測定したところ、１ポリマーあたり１４．３分子であった。このＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＤＴＸは、ドセタキセルがＰＥＧ−ｐＧｌｕ−Ａｃにエステル結合を介して結合した状態（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥ）にある。このＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥは、上記一般式ＩＩ−ａで表示される構造を有する。ＰＥＧの鎖長は１０ｋＤａである。

（実施例３）
標的結合部位を有する化合物として上皮成長因子（ＥＧＦ）を有し、薬物としてドセタキセル（ＤＴＸ）を内包する高分子ミセルである、ＥＧＦ結合ドセタキセルミセルを、次のようにして形成した。

骨格ポリマーユニットβとしてのＤＴＸコンジュゲート（ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＤＴＸ）を、実施例２と同様にして形成した。

ＰＥＧ鎖長が１０ｋＤａでありＰＥＧ末端にマレイミド基を有するポリマー（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を用意した。５ｍｇの当該ポリマーと、５ｍｇのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＤＴＸとを、サンプルバイアルに精秤し、精製水を１ｍＬ添加した後、実施例１と同様に処理し、ミセル画分（１．５ｍＬ）を回収した。当該ミセル画分には、ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＤＴＸとＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡとが放射状に配列した、ミセルが含有されている。

１ｍｇのリコンビナントヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）が入ったバイヤルに、精製水１ｍＬを添加し、１ｍｇ／ｍＬのＥＧＦ溶液を調製した。このＥＧＦ溶液０．５ｍＬに対し、０．２Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）と１００ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と精製水を加え、ホウ酸緩衝液の最終濃度が５０ｍＭになりＥＤＴＡの最終濃度が２ｍＭになるように、１０ｍｇ／ｍＬのトラウト試薬（ピアス社）を１３８μＬさらに添加して、計１ｍＬの混合液にした後、３０℃にて４５分間静置した。続いて、こうして得た反応液をゲルろ過［ＧＥサイエンス社製ＰＤ−１０、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ］し、高分子画分（１．５ｍＬ）を回収した。

この回収液１．５ｍＬと、上記のミセル画分０．５ｍＬとを混合し、３０℃にて２時間静置することによって、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡのマレイミド基とＥＧＦとを反応させ、骨格ポリマーユニットαとしてのＥＧＦ結合ポリマーを含有するミセルを形成した。このＥＧＦ結合ポリマーは、上記一般式Ｉ−ａで表示される構造を有する。こうして得た反応液をゲルろ過精製［Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（１φ×３０ｃｍ）、溶離液：２０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）］することによって、未反応のＥＧＦを除去した。

回収したミセル画分を限外ろ過（ミリポア社製Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５）することによって約２ｍＬに濃縮し、ＥＧＦ結合ドセタキセルミセルを含有する溶液を得た。

（実施例４）
標的結合部位を有する化合物として坑ＲＡＮＫＬ抗体を有し、薬物としてエベロリムス（ＥＶＥ）を内包する高分子ミセルである、坑ＲＡＮＫＬ抗体結合エベロリムスミセルを、次のようにして形成した。

まず、骨格ポリマーユニットβとしてのエベロリムスコンジュゲート（ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥ）を、次のようにして形成した。ポリグルタミン酸の片末端がアセチル化された状態にある、１４０ｍｇのポリエチレングリコール−ポリグルタミン酸ブロック共重合体（ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−Ａｃ）を、１０ｍＬの無水ＤＭＦ（関東化学）に溶解させた後、さらに１４２ｍｇのエベロリムス（ＭＯＬＣＡＮ．Ｃｏ．）を添加した。なお、このＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＡｃにおけるＰＥＧの平均分子量は１００００であり、グルタミン酸の平均残基数は４０であり、グルタミン酸の側鎖はカルボン酸である。続いて、１６．９ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（和光純薬）と、２２０μＬのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（国産化学）とをこの順に添加し、室温にて一晩攪拌した。こうして得た反応液を、ヘキサンと酢酸エチルとの混合溶液（体積比３：１）１００ｍＬに滴下してポリマーを晶析させた後、当該ポリマーを減圧ろ集した。ろ集によって得たポリマーを、無水ＤＭＦに溶解させた状態で、蒸留水１リットルに対して２日間透析［分画分子量（ＭＷＣＯ）＝３５００、蒸留水を４回交換］した後、凍結乾燥した。凍結乾燥によって得たポリマーを、１０ｍＬの無水ＤＭＦに溶解させた状態で、ヘキサンと酢酸エチルとの混合溶液（体積比３：１）１００ｍＬに滴下してポリマーを晶析させた後、当該ポリマーを減圧ろ集した。ろ集によって得たポリマーを、粉末状態のままでヘキサンと酢酸エチルとの混合溶液（体積比３：１）１００ｍＬに添加することによって洗浄した後、減圧ろ集した。ろ集したポリマーを、室温にて１晩減圧乾燥させることによって、淡黄色粉末である１８０ｍｇのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥを得た。

１ｍｇのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥを、精製水とメタノールの混合溶液（体積比１：１）２５ｍＬに溶解させ、波長２７８ｎｍの光線に対する吸光度からエベロリムスの含有量を測定したところ、１ポリマーあたり１２．６分子であった。このＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥは、エベロリムスが、ＰＥＧ−ｐＧｌｕにエステル結合を介して結合した状態（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥ）にある。このＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥは、上記一般式ＩＩ−ａで表示される構造を有する。ＰＥＧの鎖長は１０ｋＤａである。

５ｍｇのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥをサンプルバイアルに精秤し、精製水を１ｍＬ添加した。４℃で一昼夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所製Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下で１０分間超音波処理し、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製Ｍｉｌｌｅｘ^（Ｒ）ＧＰ ＰＥＳ）でろ過し、ろ液を回収した。当該ろ液には、骨格ポリマーユニットβとしてのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥが含有されている。

骨格ポリマーユニットαとしての坑ＲＡＮＫＬ抗体結合ポリマーを、次のようにして形成した。ＰＥＧ末端にマレイミド基を有するポリマー（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）を用意した。当該ポリマーにおけるＰＥＧの鎖長は１０ｋＤａである。５ｍｇのＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを、サンプルバイアルに精秤し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１ｍＬ添加した。４℃で一昼夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所製Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下で１０分間超音波処理し、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製Ｍｉｌｌｅｘ^（Ｒ）ＧＰ ＰＥＳ）でろ過し、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを含有するろ液を回収した。

５００μｇの抗ＲＡＮＫＬ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）が入ったバイヤルに、０．５ｍＬのＰＢＳを添加し、１ｍｇ／ｍＬの抗ＲＡＮＫＬ抗体溶液を調製した。この抗ＲＡＮＫＬ抗体溶液０．４ｍＬに対し、０．２Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）と１００ｍＭのＥＤＴＡと精製水を加え、ホウ酸緩衝液の最終濃度が５０ｍＭになりＥＤＴＡの最終濃度が２ｍＭになるように、１０ｍｇ／ｍＬのトラウト試薬（ピアス社）を２μＬさらに添加して、計０．６ｍＬの混合液にした後、３０℃にて４５分間静置した。続いて、こうして得た反応液をゲルろ過［ＧＥサイエンス社製ＰＤ−１０、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ］し、高分子画分（１．５ｍＬ）を回収した。

この回収液１．５ｍＬと、上記のＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを含有するろ液３８μＬとを混合し、３０℃にて２時間静置し、さらに４℃にて終夜静置することによって、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡのマレイミド基と抗ＲＡＮＫＬ抗体とを反応させ、骨格ポリマーユニットαとしての坑ＲＡＮＫＬ抗体結合ポリマーを形成した。この坑ＲＡＮＫＬ抗体結合ポリマーは、上記一般式Ｉ−ａで表示される構造を有する。こうして得た反応液をゲルろ過精製［Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（１φ×３０ｃｍ）、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）］することによって、未反応のＳＨ化抗体を除去した。

回収したミセル画分を限外ろ過（ミリポア社製Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５、分子量カットオフ値１０００００）することによって約１ｍＬに濃縮し、坑ＲＡＮＫＬ抗体結合ポリマーを含有する溶液を得た。

ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥを含有するろ液３６μＬと、坑ＲＡＮＫＬ抗体結合ポリマーを含有する溶液５００μＬとを混合し、４℃にて３日間静置することによって、坑ＲＡＮＫＬ抗体結合エベロリムスミセルを含有する溶液を得た。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて測定した、坑ＲＡＮＫＬ抗体結合エベロリムスミセルの平均粒子径は１１９ｎｍであった。

（実施例５）
標的結合部位を有する化合物としてトランスフェリンを有し、薬物としてエベロリムス（ＥＶＥ）を内包する高分子ミセルである、トランスフェリン結合エベロリムスミセルを、次のようにして形成した。

実施例４と同様にして、骨格ポリマーユニットβとしてのＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥが含有された、ろ液を得た。

骨格ポリマーユニットαとしてのトランスフェリン結合ポリマーを、次のようにして形成した。まず、実施例４と同様にして、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを含有するろ液を得た。１０ｍｇのヒトトランスフェリン（シグマ−アルドリッチ）を１ｍＬの精製水に溶解させ、トランスフェリン溶液を調製した。このトランスフェリン溶液６９６μＬに対し、０．２Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）と１００ｍＭのＥＤＴＡと精製水を加え、ホウ酸緩衝液の最終濃度が５０ｍＭになりＥＤＴＡの最終濃度が２ｍＭになるように、１０ｍｇ／ｍＬのトラウト試薬（ピアス社）を３４μＬさらに添加して、計１ｍＬの混合液にした後、３０℃にて４５分間静置した。続いて、こうして得た反応液をゲルろ過［ＧＥサイエンス社製ＰＤ−１０、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ］し、高分子画分（１．５ｍＬ）を回収した。

この回収液１．５ｍＬと、上記のＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを含有するろ液０．９ｍＬ（ポリマー濃度５ｍｇ／ｍＬ）とを混合し、３０℃にて２時間静置し（リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）の最終濃度：２０ｍＭ、ＥＤＴＡの最終濃度：１ｍＭ）、さらに４℃にて終夜静置することによって、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡのマレイミド基とトランスフェリンとを反応させ、骨格ポリマーユニットαとしてのトランスフェリン結合ポリマーを形成した。このトランスフェリン結合ポリマーは、上記一般式Ｉ−ａで表示される構造を有する。

こうして得た反応液をゲルろ過精製［Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（１φ×３０ｃｍ）、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）］することによって、未反応のＳＨ化トランスフェリンを除去した。回収したミセル画分を限外ろ過（ミリポア社製Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５、分子量カットオフ値：１０００００）することによって約２ｍＬに濃縮した後、ＮａＨＣＯ_３−Ｎａ_２ＣＯ_３緩衝液（ｐＨ９．６）を添加してｐＨを７に調整し、さらに１００ｍＭのシステイン溶液を２０μＬ添加した状態で、室温にて１０分間静置した。こうして得た反応液をゲルろ過［ＧＥサイエンス社製ＰＤ−１０、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）］し、高分子画分（３ｍＬ）を回収した。この高分子画分に、１ＭのＦｅＣｌ_３と、１００ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３を（１００ｍＭのクエン酸にてｐＨ７．０に調整したもの）とを、それぞれ３０μＬづつ添加した。こうして得た混合液を、４℃にて一晩静置した後、限外ろ過（ミリポア社製Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５、分子量カットオフ値：１０００００）し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）による希釈と鉄イオンの除去を繰り返すことによって、最終的に約３ｍＬに濃縮し、トランスフェリン結合ポリマーを含有する溶液を得た。

ＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＥＶＥを含有するろ液２００μＬと、トランスフェリン結合ポリマーを含有する溶液５００μＬとを混合し、４℃にて３日間静置することによって、トランスフェリン結合エベロリムスミセルを含有する溶液を得た。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）を用いて測定した、トランスフェリン結合エベロリムスミセルの平均粒子径は１０６ｎｍであった。

（比較例１）
標的結合部位を有する化合物を有さず薬物としてドセタキセルを内包する高分子ミセル（以降、説明を容易にするために、Ｔｆ非結合ＤＴＸミセルと呼ぶ）を、次のようにして形成した。実施例２で形成したＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＤＴＸを１０ｍｇ、サンプルバイアルに精秤し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１ｍＬ添加して懸濁した。４℃で一昼夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所製Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下で１０分間超音波処理し、孔径０．２２μｍのフィルター［ミリポア社製Ｍｉｌｌｅｘ^（Ｒ）ＧＰ ＰＥＳ］でろ過し、ろ液を回収した。このろ液をゲルろ過（ＧＥサイエンス社製ＰＤ−１０、溶離液：１０％スクロース溶液）することによって、Ｔｆ非結合ＤＴＸミセルを含有する高分子画分を得た。

（比較例２）
標的結合部位を有する化合物を有さず薬物としてカンプトテシンを内包する高分子ミセル（以降、説明を容易にするために、Ｔｆ非結合ＣＰＴミセルと呼ぶ）を、次のようにして形成した。実施例１で形成したＰＥＧ−ｐＧｌｕ−ＣＰＴを１０ｍｇ、サンプルバイアルに精秤し、精製水を１ｍＬ添加して懸濁した。４℃で一昼夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所製Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下で１０分間超音波処理し、孔径０．２２μｍのフィルター［ミリポア社製Ｍｉｌｌｅｘ^（Ｒ）ＧＰ ＰＥＳ］でろ過し、ろ液を回収した。そのろ液をゲルろ過（ＧＥサイエンス社製ＰＤ−１０、溶離液：２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））することによって、Ｔｆ非結合ＣＰＴミセルを含有する高分子画分を得た。

（比較例３）
標的結合部位を有する化合物としてＴｆを有する一方、薬物を内包しない高分子ミセル（以降、説明を容易にするために、Ｔｆ結合エンプティーミセルと呼ぶ）を、次のようにして形成した。

ＰＥＧ末端にマレイミド基を有するポリマー（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＧ）を用意した。当該ポリマーにおけるＰＥＧの鎖長は１０ｋＤａである。５ｍｇのＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＧを、サンプルバイアルに精秤し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を１ｍＬ添加した。４℃で一昼夜撹拌した後、バイオディスラプター（日本精機製作所製Ｈｉｇｈ Ｐｏｗｅｒ Ｕｎｉｔ）を用いて、氷冷下で１０分間超音波処理し、０．２２μｍのフィルター（ミリポア社製Ｍｉｌｌｅｘ^（Ｒ）ＧＰ ＰＥＳ）でろ過することによって、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＧを含有するろ液を回収した。

ヒト由来のＴｆ（和光純薬）１０ｍｇに、０．２Ｍのホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０）と１００ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）と精製水を加えてＴｆを溶解した。続いて、ホウ酸緩衝液の最終濃度が５０ｍＭになりＥＤＴＡの最終濃度が２ｍＭになるように、１０ｍｇ／ｍＬのトラウト試薬（ピアス社）を３４μＬさらに添加して、計１ｍＬの混合液にした後、３０℃にて４５分間静置した。こうして得た反応液をゲルろ過［ＧＥサイエンス社製ＰＤ−１０、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ］し、高分子画分（１．５ｍＬ）を回収した。

この回収液１．５ｍＬと、上記のＭａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＧを含有するろ液０．９ｍＬとを混合し、３０℃にて２時間静置し、さらに４℃にて終夜静置することによって、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ−ＰＢＬＧのマレイミド基とＴｆとを反応させた。こうして得た反応液をゲルろ過精製［Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−４Ｂ（２φ×３０ｃｍ）、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］することによって、未反応のＳＨ化Ｔｆを除去した。

ゲルろ過で回収した高分子画分を限外ろ過（ミリポア社製Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５、分子量カットオフ値：１０００００）し、高分子画分（４ｍＬ）を回収した。０．５ｍＬのこの高分子画分に、１００ｍＭのＦｅＣｌ_３（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ７．０になるよう１ＭのＮａ_２ＣＯ_３で調整したもの）を５０μＬ混合した。こうして得た混合液を、４℃にて２時間静置した後、ゲルろ過［ＧＥサイエンス社製ＰＤ−１０、溶離液：２０ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）］し、余剰の鉄イオンを除去することによって、Ｔｆ結合エンプティーミセルを含有する溶液を得た。

〔細胞障害性試験１〕
実施例２のＴｆ結合ＤＴＸミセルによる細胞障害性を、比較例１のＴｆ非結合ＤＴＸミセルによる細胞障害性と比較した。各ミセルによる細胞障害性を、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社を介してＥＣＡＣＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）から購入したヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用い、ＷＳＴ法に基づき次のように評価した。

９６ウェルプレートに、１ウェルあたり約５０００個のヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が含まれるように、当該細胞を９０μＬの培地に懸濁した状態で播き、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気下で一晩培養した。この培地は、ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ^ＴＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１０％ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ、ｂｉｏｗｅｓｔ）とから形成した。続いて、実施例２のミセル溶液と比較例１のミセル溶液とを種々のＤＴＸ濃度になるように培地で希釈したサンプル液を各ウェルに添加し（１ウェルあたり１０μＬ）、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気下で２時間培養した。その後、ウェル内から培地を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にてウェル内を２回洗浄した後、新鮮培地を添加し（１ウェルあたり１００μＬ）、総培養時間が７２時間になるまで引き続き培養した。その後、ＷＳＴ Ｒｅａｇｅｎｔ（同仁）を添加し（１ウェルあたり１０μＬ）、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気下で約２時間培養を続けた。各ウェルから、波長４５０ｎｍの光線に対する吸光度（Ａｂｓ４５０）を測定し、下記の数式に基づき細胞増殖率（％ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ）を算出した。なお、当該数式中のコントロールのＡｂｓ４５０値とは、ＤＴＸを含有しない培養液を使用して上記の培養を実施したウェルから得た吸光度を意味する。

図１は、ドセタキセル濃度に対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞増殖率を示すグラフである。当該グラフの横軸はサンプル液中のミセルの量をドセタキセル濃度に換算した値を示す。黒四角はＴｆ非結合ＤＴＸミセルを添加した場合のデータであり、黒三角はＴｆ結合ＤＴＸミセルを添加した場合のデータである。各データにおけるエラーバーは標準偏差（ＳＤ）である。図１のグラフに示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＴｆ結合ＤＴＸミセルの細胞傷害性は、Ｔｆ非結合ＤＴＸミセルに比べて、顕著に低いＤＴＸ濃度から発揮された。

〔細胞障害性試験２〕
細胞障害性試験２では、サンプル液を添加して実施する培養時間を７２時間に変更し、その直後にＷＳＴ Ｒｅａｇｅｎｔを１ウェルあたり１０μＬづつ添加し、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気下で約２時間培養を続けたこと以外は、細胞障害試験１と同様にして、実施例２のＴｆ結合ＤＴＸミセルと比較例１のＴｆ非結合ＤＴＸミセルによる細胞障害性を調べた。

なお、各ミセルにおけるＤＴＸ濃度は、波長２３３ｎｍの光線に対する吸光度に基づいて算出した。ただし、Ｔｆ結合ＤＴＸミセルについては、波長２３３ｎｍの光線に対する吸光度におけるＴｆ（アポ体）の寄与分を差し引いた。

図２は、ドセタキセル濃度に対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の生存率を示すグラフである。当該グラフにおける縦軸、横軸、黒四角および黒三角の表示の意味は、図１のグラフにおけるものと同様である。各データにおけるエラーバーは標準偏差（ＳＤ）である。図２のグラフに示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するＴｆ結合ＤＴＸミセルの細胞傷害性は、Ｔｆ非結合ＤＴＸミセルに比べて、顕著に低いＤＴＸ濃度から発揮された。

〔細胞障害性試験３〕
細胞障害性試験３では、細胞として、住商ファーマインターナショナル株式会社を介してＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入したヒト前立腺癌ＤＵ１４５細胞を用い、ミセルとして、実施例１のＴｆ結合ＣＰＴミセルと、比較例２のＴｆ非結合ＣＰＴミセルとを用い、サンプル液を添加して実施する培養時間を８時間に変更したこと以外は、細胞障害試験１と同様にして、各ミセルによる細胞障害性を調べた。

〔細胞障害性試験４〕
細胞障害性試験４では、細胞として、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社を介してＥＣＡＣＣから購入したヒト肝癌ＨｅｐＧ２細胞を用いたこと以外は、細胞障害試験３と同様にして、各ミセルによる細胞障害性を調べた。

〔細胞障害性試験５〕
細胞障害性試験５では、細胞としてヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いたこと以外は、細胞障害試験３と同様にして、各ミセルによる細胞障害性を調べた。

細胞障害試験３〜５の結果を表１に示す。表１の「溶液」に関するデータは、ＣＰＴをミセルに内包させず培養液に直接添加して調製したサンプル液に関するデータである。

なお、各ミセルにおけるＣＰＴ濃度は次のようにして測定した。
ａ）ＣＰＴ濃度の測定方法
ミセルサンプル１００μＬに対し、６ＮのＨＣｌを２００μＬ添加し、クライオチューブ（家田化学）にて１００℃で１時間加熱した。得られた反応液を７５μＬ回収し、６ＮのＮａＯＨを５０μＬ添加して中和した後、０．２２μｍフィルター（ミリポア社製ＭＩＬＬＥＸ^（Ｒ）−ＧＶ）でろ過した。ろ液を２５ｍＭのギ酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．０）で１０倍希釈し、この処理サンプル液をＨＰＬＣサンプルバイアルに充填し、下記の分析条件でＨＰＬＣ分析することによって、ＣＰＴ濃度を測定した。
ｂ）ＨＰＬＣ分析条件
システム：Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍ
カラム：Ｔｏｓｏｈ ＴＳＫ−ｇｅｌ ＯＤＳ−８０ＴＭ（４．６φ×１５０ｍｍ）（４０℃）
移動相：２５ｍＭのギ酸アンモニウム（ｐＨ３．０）／アセトニトリル＝７０／３０
流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
検出：蛍光（Ｅｘ：３７０ｎｍ，Ｅｍ：４２０ｎｍ）
インジェクション体積：２０μＬ

〔細胞障害性試験６〕
細胞障害性試験６では、細胞として、ＤＳファーマバイオメディカル株式会社を介してＥＣＡＣＣから購入したヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用い、ミセルとして、比較例３のＴｆ結合エンプティーミセルを用いたこと、及び薬剤と細胞の接触時間を７２時間に延長する以外は、細胞障害試験３と同様にして、各ミセルによる細胞障害性を調べた。

図５は、Ｔｆ濃度に対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の細胞増殖率を示すグラフである。当該グラフの横軸はサンプル液中のミセルの量をＴｆ濃度に換算した値を示す。黒四角はＴｆ結合エンプティーミセルを添加した場合のデータであり、黒三角はＴｆ結合ＤＴＸミセルを添加した場合のデータであり、白丸はＴｆ溶液を添加した場合のデータである。各データにおけるエラーバーは標準偏差（ＳＤ）である。図５のグラフに示すように、Ｔｆ結合ドセタキセルミセルはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して優れた細胞傷害性を示したが、Ｔｆ溶液およびＴｆ結合エンプティーミセルは細胞傷害性を有しなかった。

〔薬効評価試験〕
ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＲＰＭＩ１６４０と１０％ＦＢＳとから形成した培地を用い、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気下で、移植に必要な細胞数に増殖するまで培養した。その後、この細胞を、１００μＬの生理食塩水に懸濁した状態で、雌性ヌードマウス［Ｂａｌｂ ｎｕ／ｎｕ、５週齢、日本チャールス・リバー株式会社製］の背部皮下に接種した。１匹当たりに接種した細胞は３×１０^６個である。その後、２１日間ヌードマウスを飼育することによって、腫瘍体積が７０．８±３．７ｍｍ^３（Ａｖｅｒａｇｅ±ＳＥ）になったところで、薬物内包ミセルの投与を開始した。

投与スケジュールは４日おきに計３回の尾静脈内投与とし、以下の３群について、腫瘍体積およびマウスの体重を、週３回測定した。各群あたりのマウス数は８匹である。
（１）コントロール（無処理）
（２）比較例１のＴｆ非結合ＤＴＸミセル（１回あたりのＤＴＸの投与量：マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ）
（３）実施例２のＴｆ結合ＤＴＸミセル（１回あたりのＤＴＸの投与量：マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ）

図３は腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。当該グラフの縦軸は、試験開始時の腫瘍体積に対する相対値を示し、横軸は試験開始からの経過時間（Ｄａｙｓ）を示す。当該グラフ中の矢印は、薬物内包ミセルを投与したタイミングを示す。黒丸はコントロール群のデータであり、黒三角はＴｆ非結合ＤＴＸミセル群のデータであり、黒四角はＴｆ結合ＤＴＸミセル群のデータである。図４はマウスの体重変化を示すグラフである。図４のグラフの縦軸は、試験開始時のマウスの体重に対する相対値を示す。図４のグラフにおける横軸、矢印、黒丸、黒三角および黒四角の表示の意味は、図３のグラフにおけるものと同様である。各データにおけるエラーバーは標準誤差（ＳＥ）である。

図３および図４のグラフに示すように、Ｔｆ結合ＤＴＸミセルを投与すると、コントロールおよびＴｆ非結合ＤＴＸミセルを投与した場合に比べて、マウスの体重変化に相違がない状態を実現しつつ、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖を顕著に抑制できた。なお、図３のグラフには示していないが、Ｔｆ結合ＤＴＸミセルを投与した場合、投与２９日目でＴ／Ｃ値（薬物投与群（Ｔ）とコントロール群（Ｃ）の腫瘍体積比）を０．３３にまで低下させることができた。

Claims (4)

1. 親水性ポリマーセグメント、疎水性ポリマーセグメント、および該親水性ポリマーセグメントに結合した標的結合部位を有する骨格ポリマーユニットαと、親水性ポリマーセグメント、疎水性ポリマーセグメント、および該疎水性ポリマーセグメントに結合した薬物を有し、かつ前記標的結合部位を有さない骨格ポリマーユニットβとを含み、前記骨格ポリマーユニットαおよび骨格ポリマーユニットβが、前記標的結合部位を外側に向けると共に前記薬物を内側に向けた状態で放射状に配列しており、
   ｉ）前記放射状の配列を維持した状態で標的に結合した場合、エンドサイトーシスによって当該標的を供給する細胞の内部に取り込まれ、前記細胞内において前記放射状の配列が崩壊することによって前記薬物が当該細胞内に放出され、
   ｉｉ）標的への結合以前に血中において前記放射状の配列が崩壊した場合、代謝により前記骨格ポリマーユニットβが体外に排出されることによって、前記薬物が正常細胞に損傷を与え得ることが防止された、
   薬物内包アクティブターゲット型高分子ミセル。
2. 前記骨格ポリマーユニットαおよびβの親水性ポリマーセグメントがそれぞれポリエチレングリコール鎖であり、疎水性ポリマーセグメントがそれぞれポリアミノ酸鎖である、請求項１に記載の高分子ミセル。
3. 前記骨格ポリマーユニットαが下記一般式Ｉ−ａまたは一般式Ｉ−ｂで表示され、前記骨格ポリマーユニットβが下記一般式ＩＩ−ａまたは一般式ＩＩ−ｂで表示される、請求項２に記載の高分子ミセル。
   

   

   

   （Ｒ_１は標的結合部位を有する前記化合物であり、Ｒ_２は水酸基を末端に有してもよいＣ_１−Ｃ_１２のアルキル基であり、Ｌ_１はＯ（ＣＨ_２）_ｐＮＨであり、Ｌ_２はＯ（ＣＨ_２）_ｐ−ＣＯ−であり、ｐは１〜５の範囲にある整数であり、Ｒは水素原子または疎水性有機基であり、ｑは１または２であり、ｎ_１およびｎ_２は互いに独立して４０〜４５０の範囲にある整数であり、ｍ_１およびｍ_２は互いに独立して２０〜８０の範囲にある整数であり、Ｒ_３は総数ｍ_２の少なくとも１０〜７０％が連結基を有していてもよい前記薬物の残基であり、存在する場合の残りの基が水素原子または疎水性有機基である。）
4. 請求項１に記載の高分子ミセルと、製薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

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