CN110078915B - 用硝基苯硼酸组合物稳定的纳米粒子 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用硝基苯硼酸组合物稳定的纳米粒子。本申请描述了载体纳米粒子，其包含与含硼酸的聚合物相偶联的含多元醇的聚合物，所述纳米粒子被构造为将所述含硼酸的聚合物暴露于所述纳米粒子外部的环境。还描述了所述纳米粒子的靶向形式，以及相关组合物、方法和系统。

Description

用硝基苯硼酸组合物稳定的纳米粒子
本申请是申请日为2013年03月01日，申请号为201380073870.5，发明名称为“用硝基苯硼酸组合物稳定的纳米粒子”的申请的分案申请。
政府权利
本发明是在美国政府支持下、由美国国家癌症研究所(National CancerInstitute)资助进行的，项目编号CA 119347。美国政府对本发明拥有特定权利。
技术领域
本发明涉及载体纳米粒子，具体而言涉及适用于递送所关注化合物的纳米粒子以及相关组合物、方法和体系。
背景技术
将所关注化合物有效递送到细胞、组织、器官和生物体已成为生物医学、成像和其他需要将具有各种尺寸和维度的分子递送到预定靶标的领域的挑战。
无论是在病理检查、治疗处理还是基础生物学研究领域，目前已知有若干方法可用于递送与所关注的生物和/或化学活性典型相关的多类生物材料和生物分子。
事实证明，随着适合用作化学或生物试剂(例如，药物、生物制剂、治疗剂或成像剂)的分子数量的不断增加，开发适合与具有不同的复杂性、维度和化学性质的化合物一同使用的递送体系也变得非常具有挑战性。
由于其结构，纳米粒子很适合作为采用多种递送方法递送试剂的载体。目前已存在若干纳米粒子递送体系，它们利用多种不同的方案进行包装、转运并将试剂递送到特定靶标。
发明内容
本文提供了纳米粒子及相关组合物、方法和体系。在一些实施例中，它们提供了对所关注化合物进行有效且特异性递送的多功能工具。具体而言，在一些实施例中，本文所述的纳米粒子可用作柔性体系，将具有不同尺寸、维度和化学性质的多种分子运载并递送到预定靶标。
根据一个方面，本文描述了一种包括含多元醇的聚合物和含硼酸的聚合物的纳米粒子。在该纳米粒子中，含硼酸的聚合物与含多元醇的聚合物相偶联，并且该纳米粒子被构造为将含硼酸的聚合物暴露于该纳米粒子外部环境的结构。该纳米粒子可运载一种或多种所关注化合物。这些化合物可作为含多元醇的聚合物和/或含硼酸的聚合物的一部分或附接到所述聚合物。
根据另一个方面，本文描述了一种组合物。该组合物包含本文所述的纳米粒子以及合适的载体和/或赋形剂。
根据另一个方面，本文描述了一种将化合物递送到靶标的方法。该方法包括让靶标与本文所述的纳米粒子接触，其中该化合物包含于本文所述的纳米粒子内含多元醇的聚合物或含硼酸的聚合物中。
根据另一个方面，本文描述了一种将化合物递送到靶标的体系。该体系至少包括含多元醇的聚合物和含硼酸的聚合物，它们能够通过可逆共价键相互结合，并装配到本文所述的包含该化合物的纳米粒子中。
根据另一个方面，本文描述了一种对个体施用化合物的方法。该方法包括对个体施用有效量的本文所述纳米粒子，其中所述化合物则包含于含多元醇的聚合物和/或含硼酸的聚合物中。
根据另一个方面，本文描述了一种用于对个体施用化合物的体系。该体系至少包括含多元醇的聚合物和含硼酸的聚合物，它们能够通过可逆共价键相互结合，并组装到附接于根据本文所述方法施用给个体的化合物的本文所述纳米粒子中。
根据另一个方面，本文描述了一种制备包括含多元醇的聚合物和含硼酸的聚合物的纳米粒子的方法。该方法包括让含多元醇的聚合物与含硼酸的聚合物在一定条件下接触一段时间，使两者偶联。
根据另一个方面，本文描述了若干含硼酸的聚合物，它们在本发明的后续部分有详细阐述。
根据另一个方面，本文描述了若干含多元醇的聚合物，它们在本发明的后续部分有详细阐述。
本文还描述了具有含多元醇的聚合物的纳米粒子。所述含多元醇的聚合物与具有硝基苯硼酸基团的聚合物相结合，并通过降低其pKa以增强该纳米粒子的稳定性。
本发明的另一个方面提供了靶向纳米粒子的描述。在一些实施例中，该靶向纳米粒子可仅具有一个单一靶向配体，该靶向配体能够协助将纳米粒子递送到特定靶标，诸如表达该粒子靶向配体结合伴侣的细胞。相比于具有多个靶向配体的纳米粒子，这类靶向纳米粒子具有一些优点，例如，由于表面配体更少而具有更小的总尺寸，并且由于依靠的是亲合力为基础的而非亲和力为基础的相互作用，因此介导非特异性结合的配体也更少。另外，含有或运载治疗剂的纳米粒子可仅使用单一靶向配体成功定位于所关注的位置(例如细胞或组织)，从而以非常高的靶向配体/治疗剂比将治疗剂递送到靶标。所述纳米粒子的这一方面可显著提高制备此类疗法的效率，同时也降低了采用大量昂贵抗体介导靶向定位的需要。
在一些实施例中，本文所述纳米粒子以及相关组合物、方法和体系可用作适用于运载具有各种尺寸、维度和化学性质的化合物的柔性分子结构。
在一些实施例中，本文所述纳米粒子以及相关组合物、方法和体系可用作递送体系，保护被运载化合物免于降解、被免疫系统识别以及由于与血清蛋白或血细胞结合而造成的损耗。
在一些实施例中，本文所述纳米粒子以及相关组合物、方法和体系可用作递送体系，其特征在于空间位阻稳定和/或将化合物递送到特定靶标 (例如组织、某组织内的特定细胞类型甚至某些细胞类型中特定的细胞内位置)的能力。
在一些实施例中，本文所述纳米粒子以及相关组合物、方法和体系可设计为用可控方式释放被运载化合物，包括以不同速率和/或时间控释同一纳米粒子中的多个化合物。
在一些实施例中，本文所述纳米粒子以及相关组合物、方法和体系可用于递送相比于本领域某些系统在靶向过程中具有提高的特异性和/或选择性和/或通过靶标提高化合物识别的化合物。
在一些实施例中，本文所述纳米粒子以及相关组合物、方法和体系可与需要控制其中递送的所关注化合物的应用结合使用。此类应用包括但不限于医学应用，例如治疗、诊断和临床应用。其他的应用包括生物分析、兽医应用以及在除动物外的生物体(特别是植物)体内递送所关注化合物。
本申请提供如下内容：
1).一种纳米粒子，所述纳米粒子包括含多元醇的聚合物和含硝基苯硼酸的聚合物，
其中所述含硝基苯硼酸的聚合物通过可逆共价键偶联至所述含多元醇的聚合物；并且
其中所述纳米粒子被构造为将所述含硝基苯硼酸的聚合物暴露于所述纳米粒子外部的环境。
2).根据项目1)所述的纳米粒子，其中所述含多元醇的聚合物包含至少一种以下结构单元中的一种或多种：
Figure GDA0003177262620000041
其中
A为下式的有机部分：
Figure GDA0003177262620000042
其中
R1和R2独立地选自分子量为约10kDa或更小的任何碳基或有机基团；
X独立地选自含有-H、-F、-C、-N或-O中的一种或多种的脂族基团；并且
Y独立地选自-OH或提供-OH的有机部分；
并且
B为连接所述聚合物中第一所述部分A的R1和R2中之一与第二所述部分A的R1和R2中之一的有机部分。
3).根据项目2)所述的纳米粒子，其中R1和R2独立地具有下式：
Figure GDA0003177262620000051
其中
d为0至100；
e为0至100；
f为0至100；
Z为连接一个有机部分与另一个有机部分的共价键，并且
Z1独立地选自-NH2、-OH、-SH以及-COOH。
4).根据项目2)或3)所述的纳米粒子，
其中
X为CnH2n+1，其中n为0-5；并且
其中
Y为-OH。
5).根据项目2)至4)中任一项所述的纳米粒子，其中A独立地选自由以下组成的组：
Figure GDA0003177262620000052
Figure GDA0003177262620000061
其中
所述间隔基独立地选自任何有机基团；
所述氨基酸选自具有游离氨基和游离羧酸基团的任何有机基团；
n为1-20；并且
Z1独立地选自-NH2、-OH、-SH以及-COOH。
6).根据项目2)至5)中任一项所述的纳米粒子，其中A独立地选自：
Figure GDA0003177262620000062
Figure GDA0003177262620000071
7).根据项目2)至6)中任一项所述的纳米粒子，其中B为：
Figure GDA0003177262620000072
其中
q为1-20；
p为20-200；并且
L为离去基团。
8).根据项目2)所述的纳米粒子，其中式(I)的结构单元为：
Figure GDA0003177262620000073
9).根据项目2)所述的纳米粒子，其中式(II)的结构单元为：
Figure GDA0003177262620000074
10).根据项目2)所述的纳米粒子，其中式(III)的结构单元为：
Figure GDA0003177262620000081
其中
n为1-20。
11).根据项目1)所述的纳米粒子，其中所述含多元醇的聚合物为
Figure GDA0003177262620000082
12).根据项目1)至11)中任一项所述的纳米粒子，其中所述含硝基苯硼酸的聚合物含有至少一个末端硝基苯硼酸基团，并且具有通式：
Figure GDA0003177262620000083
其中
R3和R4独立地为亲水性有机聚合物；
X1为含有-C、-N或-B中的一种或多种的有机部分；
Y1为具有一个或多个硝基的苯基
r为1-1000；
a为0-3；并且
b为0-3。
13).根据项目12)所述的纳米粒子，其中R3和R4为(CH2CH2O)t，其中t为2至2000。
14).根据项目12)或13)所述的纳米粒子，其中X1为-NH-C(＝O)- 、-S-S-、-C(＝O)-NH-、-O-C(＝O)-或-C(＝O)-O-，并且Y1为具有一个或多个硝基的苯基。
15).根据项目12)至14)中任一项所述的纳米粒子，其中r＝1、 a＝0并且b＝1。
16).根据项目12)至15)中任一项所述的纳米粒子，其中官能团1 和官能团2是相同或不同的，并且独立地选自-B(OH)2、-OCH3、-OH。
17).根据项目12)-16)中任一项所述的纳米粒子，其中所述含硝基苯硼酸的聚合物为：
Figure GDA0003177262620000091
其中s＝20-300。
18).根据项目1)至17)中任一项所述的纳米粒子，还包含化合物，其中所述化合物形成所述含多元醇的聚合物和/或所述含硝基苯硼酸的聚合物的一部分。
19).根据项目1)至17)中任一项所述的纳米粒子，还包含化合物，其中所述化合物附接至所述含多元醇的聚合物和/或所述含硝基苯硼酸的聚合物。
20).根据项目1)至19)中任一项所述的纳米粒子，还包含化合物，其中所述化合物为治疗剂。
21).根据项目20)所述的纳米粒子，其中所述治疗剂为小分子化学治疗剂或多核苷酸。
22).根据项目21)所述的纳米粒子，其中所述多核苷酸为干扰 RNA。
23).根据项目1)至22)中任一项所述的纳米粒子，还包含一种或多种化合物，其中至少一种化合物为靶向配体。
24).根据项目23)所述的纳米粒子，其中所述靶向配体为蛋白质、适配体、小分子、抗体或抗体片段。
25).根据项目23)或24)所述的纳米粒子，其中所述靶向配体为一个单一抗体。
26).根据项目25)所述的纳米粒子，其中所述一个单一抗体缀合至所述含硝基苯硼酸的聚合物的末端部分。
27).根据项目23)所述的纳米粒子，其中所述靶向配体选自转铁蛋白、蛋白质、适配体、小分子、抗体或抗体片段，并且所述纳米粒子还包含选自喜树碱、埃博霉素、紫杉烷或多核苷酸或其任何组合的治疗剂。
28).一种组合物，包含根据项目1)至27)中任一项所述的纳米粒子以及合适媒介物和/或赋形剂。
29).根据项目28)所述的组合物，其中所述组合物为药物组合物，并且所述合适媒介物和/或赋形剂为药用媒介物和/或赋形剂。
30).根据项目29)所述的组合物，其中所述纳米粒子还包含10B作为至少一种含硝基苯硼酸的聚合物的一部分，所述组合物被配制用于体内硼中子活化疗法。
31).一种将化合物递送至靶标的方法，所述方法包括使所述靶标与根据项目1)至27)中任一项所述的纳米粒子接触。
32).根据项目31)所述的方法，其中所述靶标为哺乳动物体内的癌细胞。
33).一种将化合物递送至靶标的系统，所述系统包含根据项目1) 至27)中任一项所述的纳米粒子，所述纳米粒子用于将所述化合物递送至所述靶标。
34).一种将化合物施用至个体的方法，所述方法包括向所述个体施用根据项目1)至27)中任一项所述的纳米粒子，所述纳米粒子还包含所述化合物。
35).一种将化合物施用至个体的系统，所述系统包含能够通过可逆共价键联相互结合的至少一种含多元醇的聚合物和至少一种含硝基苯硼酸的聚合物，所述至少一种含多元醇的聚合物和含硝基苯硼酸的聚合物与根据项目1)至27)中任一项所述的纳米粒子中的化合物组装，然后施用至所述个体。
36).一种下式的含硝基苯硼酸的聚合物：
Figure GDA0003177262620000111
其中
R3和R4独立地为亲水性有机聚合物；
X1为包含-CH、-N或-B中的一种或多种的有机部分；
Y1为具有一个或多个硝基的苯基；
r为1-1000；
a为0-3；并且
b为0-3。
37).根据项目36)所述的聚合物，其中R3和R4独立地为 (CH2CH2O)t，其中t为2至2000。
38).根据项目36)或37)所述的聚合物，其中X1为-NH-C(＝O)-、- S-S-、-C(＝O)-NH-、-O-C(＝O)-或-C(＝O)-O-，并且Y1为硝基苯基苯基。
39).根据项目36)、37)或38)所述的聚合物，其中r为1，a为0 并且b为1。
40).根据项目36)至39)中任一项所述的聚合物，其中所述官能团 1和官能团2是相同或不同的，并且独立地选自-B(OH)2、-OCH3、-OH。
41).根据项目36)至40)中任一项所述的聚合物，还包含靶向配体。
42).根据项目41)所述的聚合物，其中所述靶向配体为抗体。
43).根据项目41)所述的聚合物，其中所述靶向配体为一个单一抗体。
44).根据项目41)或42)所述的聚合物，其中所述抗体缀合至所述含硝基苯硼酸的聚合物的末端部分。
45).一种用于制备根据项目1)至27)中任一项所述的纳米粒子的方法，所述方法包括在允许将所述含多元醇的聚合物与所述含硝基苯硼酸的聚合物偶联的条件下使所述含多元醇的聚合物与所述含硝基苯硼酸的聚合物接触一段时间。
46).根据项目45)所述的方法，所述纳米粒子被构造为将所述含硝基苯硼酸的聚合物暴露于所述纳米粒子外部的环境。
47).根据项目45)或46)所述的方法，其中所述含多元醇的聚合物为粘酸聚合物。
48).根据项目45)至47)中任一项所述的方法，其中所述含硝基苯硼酸的聚合物为以下任一种：
Figure GDA0003177262620000131
其中s＝20-300。
49).一种用于产生根据项目1)至27)中任一项所述的纳米粒子的试剂盒，所述试剂盒包括包含含多元醇的聚合物、含硝基苯硼酸的聚合物的纳米粒子；以及有关如何缀合包含含多元醇的聚合物与所述含硝基苯硼酸的聚合物的所述纳米粒子的说明书。
50).根据项目49)所述的试剂盒，其中所述含多元醇的聚合物为粘酸聚合物。
51).根据项目49)或50)所述的试剂盒，其中所述含硝基苯硼酸的聚合物为以下任一种：
Figure GDA0003177262620000132
Figure GDA0003177262620000141
其中s＝20-300。
本发明的一个或多个实施例的细节在以下附图和具体实施方式以及实例中示出。通过具体实施方式、实例和附图，以及通过所附权利要求书，其他特征、目的和优点将是显而易见的。
附图说明
附图并入本说明书并且构成本说明书一部分，示出了本发明的一个或多个实施例，并且与具体实施方式和实例一起用于说明本发明的原理和具体实施。
图1示出了纳米粒子以及用于在不存在含硼酸化合物的情况下进行相关形成的相关方法的示意图。图板1A示出了根据本文所述实施例中含多元醇的聚合物(MAP,4)和所关注化合物(核酸)的示意图。图板1B示出了含多元醇的聚合物和图板1A中所示化合物组装后形成的纳米粒子。
图2示出了根据本发明的实施例中所述，纳米粒子以及相关制造方法的示意图。图板2A示出了根据本发明的实施例中所述，含多元醇的聚合物 (MAP,4)和含硼酸的聚合物(BA-PEG,6)以及所关注分子(核酸)。图板2B 示出了图板2A中所示聚合物和化合物组装后形成的BA-聚乙二醇化稳定的纳米粒子。
图3示出了根据本文所述实施例中，包括含多元醇的聚合物和所关注化合物的复合物的形成。具体而言，图3示出了根据本发明的实施例中所述，用质粒DNA进行MAP凝胶阻滞试验的结果。泳道1中加载的是DNA 梯状条带。泳道2-8示出了与具有递增电荷比的MAP结合的质粒DNA。电荷比定义为MAP上的正电荷量除以核酸上的负电荷量。
图4示出了根据本文所述实施例中，包括含多元醇的聚合物和所关注化合物的复合物的形成。具体而言，图4示出了根据本发明的实施例中所述，用siRNA进行MAP凝胶阻滞试验的结果。泳道1中加载的是DNA梯状条带。泳道2-8示出了与具有递增电荷比的MAP结合的siRNA。
图5示出了根据本文所述的一些实施例中纳米粒子的性质。具体而言，图5的示意图示出了根据本发明的实施例中MAP-质粒纳米粒子的粒径 (通过动态光散射(DLS)测量值测定)相对于电荷比以及界面动电势(与纳米粒子的表面电荷相关的性质)相对于电荷比的散点图。
图6示出了根据本文所述的一些实施例中纳米粒子的性质。具体而言，图6示的示意图示出了根据本发明的实施例中BA-PEG化的MAP-质粒纳米粒子的粒径(DLS)相对于电荷比以及界面动电势相对于电荷比的散点图。
图7示出了根据本文所公开的实施例中BA-PEG化的MAP-质粒纳米粒子的耐盐稳定性。散点图7A：5:1BA-PEG+np+1X PBS，5分钟后；散点图7B：5:1BA-PEG+np，100kDa透析3X+1XPBS，5分钟后；散点图 7C：5:1BA-PEG预PEG化的+1X PBS，5分钟后；散点图7D：5:1BA- PEG预PEG化的，100kDa透析3X+PBS，5分钟后。
图8示出了用根据本文所述实施例中的纳米粒子，在体外条件下将试剂递送到人类细胞的过程。具体而言，图8的示意图示出了根据本发明的实施例中相对光单位(RLU)(根据已递送到细胞的pGL3质粒所表达的荧光素酶蛋白量测得)相对于MAP/pGL3转染到海拉细胞中的电荷比的柱形图。
图9示出了用根据本文所述实施例中的纳米粒子将试剂递送到靶标的过程。具体而言，图9的示意图示出了根据本发明的实施例，在 MAP/pGL3转染后细胞存活率相对于电荷比的折线图。存活率数据用于图8 中所示实验。
图10示出了用根据本文所述实施例的纳米粒子将多个化合物递送到靶标的过程。具体而言，图10的示意图示出了根据本文所述实施例中相对光单位(RLU)相对于含pGL3和siGL3的MAP粒子以5+/-的电荷比共转染到海拉细胞中的粒子类型的柱形图。用语siCON是指具有对照序列的 siRNA。
图11示出了用根据本文所述实施例的纳米粒子将化合物递送到靶标的过程。具体而言，图11示出了相对光单位(RLU)相对于将MAP/siGL3以 5+/-的电荷比递送到HeLa-Luc细胞后的siGL3浓度的柱形图。
图12示出了根据本文所述的一些实施例中提供靶向配体的含硼酸的聚合物的合成示意图。具体而言，图12示出了根据本发明实施例中硼酸-PEG 二硫转铁蛋白的合成示意图。
图13示出了根据本文所述的一些实施例中纳米粒子的合成示意图。具体而言，图13示出了根据本发明实施例，在水中用喜树碱粘酸聚合物 (CPT-粘酸聚合物)形成纳米粒子的过程的示意图。
图14示出了根据本发明实施例制备、由结合到水中的CPT-粘酸聚合物形成的纳米粒子粒径和界面动电势的汇总表。
图15示出了根据本文所述的一些实施例中纳米粒子的合成示意图。具体而言，图15示出了根据本发明实施例，在水中用CPT-粘酸聚合物和硼酸-二硫化物-PEG5000形成硼酸-PEG化纳米粒子的过程。
图16示出了用不含PEG的硝基PEG-PEG和0.25摩尔％Herceptin- PEG-硝基PBA稳定的MAP-4/siRNA的耐盐稳定性。以电荷比3(+/-)配制，在5分钟时加入10x PBS，使得所得溶液处于1x PBS。
图17A和17B示出了：(A)在递增的
Figure GDA0003177262620000161
-PEG-硝基PBA/纳米粒子比率下靶向MAP-CPT纳米粒子在BT-474中的细胞摄入；(B)中MAP- CPT纳米粒子或靶向MAP-CPT纳米粒子(含有或不含游离
Figure GDA0003177262620000162
(10mg/ml))在BT-474(阴影柱)和MCF-7(空白柱)细胞系中的细胞摄入。
图18A和18B示出了短、中和长MAP-CPT纳米粒子和靶向MAP- CPT纳米粒子在以10mg CPT/kg的注射量注入BALB/c小鼠后的血浆药代动力学结果，并选用以10mg/kg的注射量注入CD2F1小鼠体内的游离CPT 作为对比。(A)聚合物键合CPT血浆浓度的时间函数。(B)非结合CPT血浆浓度的时间函数。
图19A至19D示出了MAP-CPT(5mg CPT/kg)和靶向MAP-CPT(5mg CPT/kg,29mg
Figure GDA0003177262620000171
/kg)纳米粒子在处理4h和24h后的生物分布。(A) 每克肿瘤、心、肝、脾、肾或肺组织中总CPT的注射剂量(ID)百分比。(B) 肿瘤、心、肝、脾、肾和肺中未结合到对应器官的总CPT百分比。(C)血浆中的CPT总浓度。(D)未结合到血浆中的总CPT百分比。
图20示出了经过以下方法获得的NCr裸鼠的BT-474肿瘤切片的共焦免疫荧光显微镜图像：(20A)用MAP-CPT(5mg CPT/kg)处理4h后观察； (20B)用MAP-CPT(5mg CPT/kg)处理24h后观察；(20C)用靶向MAP-CPT (5mg CPT/kg,29mg
Figure GDA0003177262620000172
/kg)处理4h后观察；(20D)用靶向MAP-CPT (5mg CPT/kg,29mg
Figure GDA0003177262620000173
/kg)处理24h后观察。第一列图发出440nm光 (CPT，粉红)，第二列发出519nm光(MAP，绿)，第三列发出647nm 光(
Figure GDA0003177262620000174
蓝)，第四列为前三列图像的重叠。
图21示出了在具有BT-474移植瘤的NCr裸鼠身上进行的抗肿瘤功效研究。图为平均肿瘤体积的时间函数，含有Herceptin的组接受2周的剂量，其余组接受3周的剂量。
图22示出了经过(22A)Herceptin，以5.9mg/kg处理；(22B)靶向MAP- CPT纳米粒子(5.9mg
Figure GDA0003177262620000175
/kg和1mg CPT/kg)处理的NCr裸鼠的抗肿瘤功效分析结果。
示例性实施例的具体实施方式
本文提供了纳米粒子以及可组合用于递送该纳米粒子中包含的所关注化合物(本文也称为货物)的相关组合物、方法和体系、用于制备所述纳米粒子的方法、用所述纳米粒子治疗的方法，以及用于组装所述纳米粒子的试剂盒。
本文所用的术语“纳米粒子”是指纳米级尺度的复合结构。具体而言，纳米粒子通常是尺寸在约1至约1000nm的范围内的粒子，并且通常是球形，但根据纳米粒子的组成，可能呈现不同的形态。纳米粒子上，与纳米粒子外部环境接触的部分通常被称为该纳米粒子的表面。在本文所述纳米粒子中，尺寸限制可仅限于二维，因此本文所述纳米粒子包括直径为约1 至约1000nm的复合结构，其中具体直径取决于纳米粒子的组成和实验设计中纳米粒子的预期用途。例如，用于某些治疗应用中的纳米粒子的尺寸通常为约200nm或更小。具体而言，用于递送癌症治疗相关药物的纳米粒子直径通常为约1至约100nm。术语“靶向纳米粒子”是指结合了靶向试剂或配体的纳米粒子。
纳米粒子的其他所需性质，例如表面电荷和空间位阻稳定，也可因所关注的具体应用而变化。并且已有科技文献描述过某些在诸如癌症治疗的临床应用中可能用到的示例性性质。技术人员在阅读本发明后应当能够辨认另外的性质。纳米粒子尺寸和性质可通过本领域已知的技术进行检测。用于检测粒子尺寸的示例性技术包括但不限于动态光散射(DLS)和多种显微镜，例如透射电子显微镜(TEM)和原子力显微镜(AFM)。用于检测粒子形态的示例性技术包括但不限于TEM和AFM。用于检测纳米粒子的表面电荷的示例性技术包括但不限于界面动电势法。适于检测其他化学性质的其他技术包括通过1H、11B以及13C和19FNMR、紫外-可见光谱法、红外/拉曼光谱法、荧光光谱法(当纳米粒子与荧光标记物结合使用时)以及技术人员可辨认的其他技术。
本文所述的纳米粒子以及相关组合物、方法和体系可用于将所关注化合物，具体而言，将试剂递送到预定靶标。
本文所用的术语“递送”是指影响化合物的空间位置的活动，具体而言，是指调控所述位置的活动。因此，就本发明的意义而言，递送化合物是指在特定时间在一组特定条件下影响化合物的定位和移动，并使得该化合物在这些条件下的定位和移动相对于化合物在其他条件下将具有的定位和移动发生变化的能力。
具体而言，相对于参考端点递送化合物是指控制化合物的定位和移动，使得化合物最终定位在选定的参考端点的能力。在体外体系中，递送化合物通常与化合物的化学和/或生物学可检测性质和活性的对应修饰相关。在体外系统中，递送化合物通常还与化合物的药代动力学修饰相关，并且可能与化合物的药效动力学修饰相关。
化合物的药代动力学是指化合物的吸收、分布、代谢和从系统排出的数据，通常由生物个体的身体提供。具体而言，术语“吸收”是指物质进入体内的过程，术语“分布”是指物质经由体液和体内组织进行分散或散布，术语“代谢”是指亲代化合物向子代代谢物的不可逆转化，并且术语“排出”是指物质从体内消除的过程。如果化合物是制剂的一部分，药代动力学还包括该化合物从制剂中解放，即化合物(通常为药物)从制剂中释放的过程。术语“药效动力学”是指化合物对生物本身或对体内或身体上的微生物或寄生生物产生的生理效应和药物作用机制，以及药物浓度与效果之间的关系。技术人员应当能够识别适于检测所关注化合物(具体而言应为所关注试剂，例如药物)的药代动力学和药效动力学特征和性质的技术和工序。
本文所用的术语“试剂”是指能够表现与靶标相关的化学或生物活性的化合物。本文所用的术语“化学活性”是指分子进行化学反应的能力。本文所用的术语“生物活性”是指分子影响生命物质的能力。试剂的示例性化学活性包括形成共价或静电相互作用。试剂的示例性生物活性包括内源性分子的生成和分泌/内源性或外源性分子的吸收和代谢以及基因表达 (包括所关注基因的转录和翻译)的活化和失活。
本文所用的术语“靶标”是指所关注生物体系，包括单细胞或多细胞生物体及其任何部分，并且包括体外或体内生物体系及其任何部分。
本文所述的纳米粒子中，含硼酸的聚合物与含多元醇的聚合物相偶联，并被布置在纳米粒子中，以提供到该纳米粒子的外部环境中。
本文所用的术语“聚合物”是指由通常通过共价化学键连接的重复结构单元构成的大分子。合适的聚合物可为直链和/或支链，并且可表现为均聚物或共聚物形式。如果采用共聚物，则可为无规共聚物或支链共聚物。示例性聚合物包括水分散性的，具体而言，包括水溶性的聚合物。例如，合适的聚合物包括但不限于多糖、聚酯、聚酰胺、聚醚、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯等。就治疗和/或医药用途和应用而言，聚合物应为低毒，具体而言，不应具有毒性或细胞毒性。合适的聚合物包括分子量为约500,000或更低的聚合物。具体而言，合适的聚合物的分子量可为约100,000和更低。
本文所用的术语“含多元醇的聚合物”或“多元醇聚合物”是指提供多个羟基官能团的聚合物。具体而言，适于形成本文所述纳米粒子的含多元醇的聚合物中，包含提供的羟基官能团至少有一部分与含硼酸的聚合物的至少一个硼酸相偶联的聚合物。
本文中与化合物或官能团结合使用的术语“提供”是指连接后能保持化合物或官能团化学反应性的连接方式。因此，存在于表面的官能团，能够在适当条件下进行一种或多种可对官能团进行化学表征的化学反应。
形成含多元醇的聚合物的结构单元包括单体多元醇，例如季戊四醇、乙二醇和甘油。示例性的含多元醇的聚合物包括聚酯、聚醚和多糖。示例性的适用聚醚包括但不限于二醇，具体而言通式为HO-(CH2CH2O)p-H(其中p≥1)的二醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇和聚四亚甲基醚二醇。示例性的适用多糖包括但不限于环糊精、淀粉、糖原、纤维素、甲壳质和β-葡聚糖。示例性的适用聚酯包括但不限于聚碳酸酯、聚丁酸酯和聚对苯二甲酸乙二醇酯，它们全部以羟基端基为末端。示例性的含多元醇的聚合物包括分子量为约500,000或更低(具体而言约300至约100,000)的聚合物。
一些含多元醇的聚合物可商购和/或可用能被技术人员识别的技术和工序制备。用于合成示例性多元醇聚合物的示例性工序先前已在科技文献中有所描述，其他的内容则示于实例1至实例4中。技术人员应当能够根据本发明识别用于制备含多元醇的聚合物的其他工序。
本文所用的术语“含硼酸的聚合物”或“BA聚合物”是指，提供的硼酸基团中至少有一个与含多元醇的聚合物上的羟基相连的聚合物。具体而言，本文所述纳米粒子中含硼酸的聚合物包括在至少一个结构单元中含有含碳-硼化学键的烷基或芳基取代硼酸的聚合物。合适的BA聚合物包括硼酸位于末端结构单元或其他任何合适位置并为所得聚合物提供亲水性的聚合物。示例性的含多元醇的聚合物包括分子量为约40,000或更低(具体而言约20,000或更低、或约10,000或更低)的聚合物。
一些含硼酸的聚合物可商购和/或可用能被技术人员识别的技术和工序制备。用于合成示例性多元醇聚合物的示例性工序先前已在科技文献中有所描述，而其他新的工序则示于实例5-8中。技术人员应当能根据本发明识别用于制备BA聚合物的其他工序。
在本文所述纳米粒子中，多元醇聚合物与BA聚合物相偶联。本文中结合两个分子间的连接所用的术语“偶联的”或“偶联”，是指形成可逆共价键的相互作用。具体而言，在存在合适介质的情况下，在BA聚合物上提供的硼酸通过快速和可逆的成对共价相互作用，与多元醇的羟基相互作用，并在合适的介质中形成硼酸酯。合适的介质包括水和若干水溶液以及技术人员可识别的某些有机介质。具体而言，在水介质中接触时，BA聚合物和多元醇聚合物相互反应，生成副产物水。水溶液通常更有利于硼酸与多元醇的相互作用，但已知该反应也可在有机介质中进行。此外，1,2-二醇和1,3-二醇形成的环状酯通常比对应的非环状酯更稳定。
因此，在本文所述纳米粒子中，含硼酸的聚合物中至少有一个硼酸与含多元醇的聚合物的羟基以可逆共价键相连。BA聚合物和多元醇聚合物之间硼酸酯的形成可通过技术人员可识别的方法和技术检测，例如硼-11核磁共振(11B NMR)、电位滴定、紫外-可见光谱和荧光检测技术，其中所选的技术取决于组成纳米粒子的硼酸和多元醇的具体化学性质和性能。
由本文所述BA聚合物与本文所述多元醇聚合物相互偶联所得的纳米粒子可在其表面提供BA聚合物。在一些实施例中，纳米粒子可为直径约1 至约1000nm的球形形态，但粒子的尺寸和形态主要由用于形成纳米粒子的具体BA聚合物和多元醇聚合物以及本发明的纳米粒子上运载的化合物决定。
在一些实施例中，纳米粒子运载的所关注化合物可构成BA聚合物和/ 或多元醇聚合物的一部分。提供此类实施例范例的纳米粒子中，聚合物的一个或多个原子被特定同位素(例如19F和10B)取代，因此适合作为对靶标成像和/或向靶标提供放射治疗的试剂。
在一些实施例中，纳米粒子运载的所关注化合物通过共价键或非共价键连接到聚合物(通常是多元醇聚合物)。提供此类实施例范例的纳米粒子中，多元醇聚合物和BA聚合物中至少一者的一个或多个部分可与一种或多种所关注化合物相连接。
本文所用的术语“连接”是指通过化学键或作用力的连接或结合作用，让两种或更多种组分保持在一起。该术语涵盖了直接与间接的连接方式，例如第一化合物和第二化合物之间的直接连接，以及通过一种或多种中间化合物(具体为某些特定分子)连接第一化合物和第二化合物的实施例。
具体而言，在一些实施例中，化合物可通过化合物与聚合物合适部分之间的共价键附接到多元醇聚合物或BA聚合物。示例性的共价键示于实例19和实例9中。实例19中药物喜树碱和粘酸聚合物的附接通过可生物降解酯键实施；实例9中则通过转铁蛋白的聚乙二醇化完成转铁蛋白和 BA-PEG5000之间的附接。
在一些实施例中，聚合物可经过设计或改性，连接到某个特定的所关注化合物，例如通过加入一种或多种官能团，特异性地结合到所关注化合物上的对应官能团。例如，在一些实施例中，可以用BA-PEG-X对纳米粒子进行PEG化。其中X可以是马来酰亚胺或碘乙酰基，或可与硫醇进行特异性反应或与胺进行非特异性反应的任何离去基团。然后待附接的化合物可在修饰后表达硫醇官能团，与马来酰亚胺或碘代乙酰基反应。待附接的化合物还可用醛类或酮基修饰。此类化合物可通过与多元醇上的二醇进行缩合反应，生成缩醛或缩酮。
在一些实施例中，所关注化合物可通过待连接化合物与聚合物的合适部分之间的非共价键，例如离子键和分子间相互作用，附接到多元醇聚合物或BA聚合物。示例性的非共价键示于实例10中。
所关注化合物可在纳米粒子形成之前、形成时或形成之后附接到纳米粒子上，例如经由粒子复合物上的聚合物和/或任何附接化合物的修饰。可进行化合物和纳米粒子附接的示例性工序将示于实例部分中。技术人员在阅读本发明后，应当能够识别用于将化合物附接到BA聚合物或多元醇聚合物或本文所述纳米粒子的其他组分(例如，预先引入的所关注化合物) 的其他工序。
在一些实施例中，附接到本文所述纳米粒子提供的BA聚合物上的所关注化合物中，至少有一种是可用作靶向配体的试剂。具体而言，在一些实施例中，纳米粒子可在BA聚合物上附接一种或多种可用作靶向配体的试剂，并且在多元醇聚合物和/或BA聚合物上附接一种或多种待递送到所选靶标的试剂。
本发明所用的术语“靶向配体”或“靶向试剂”是指存在于纳米粒子表面并用于与特定靶标接合(具体为特定细胞的识别，例如纳米粒子的细胞受体连接)的任何分子。合适配体的例子包括但不限于维生素(例如叶酸)、蛋白质(例如转铁蛋白和单克隆抗体)、单糖(例如半乳糖)、肽以及多糖。具体而言，靶向配体可以是某些细胞表面受体的抗体(例如抗-VEGF)、小分子(例如叶酸)和其他蛋白质(例如全铁转铁蛋白)。
正如普通技术人员的认识，配体的选择可以根据所需递送的类型而变化。又如，配体可以是膜渗透剂或膜的可透性试剂，例如HIV-1的TAT蛋白。TAT蛋白是病毒转录的活化蛋白，可主动进入细胞核。Torchilin,V.P. 等人，PNAS.98,8786 8791,(2001)。附接到BA聚合物的合适靶向配体通常包括柔性间隔基，例如其远端连接有硼酸的聚环氧乙烷(参见实例9)。
在一些实施例中，包含或附接于多元醇聚合物和/或BA聚合物的化合物中至少一者(包括靶向配体)可以是待递送到靶标(例如个体)的试剂，具体为药物，能对所述个体发挥化学或生物活性(例如治疗活性)。
可根据所关注化合物和靶标选择适于形成本文所述纳米粒子的多元醇聚合物和BA聚合物。具体而言，根据本发明的意义，通过提供候选多元醇聚合物和BA聚合物，并选择能够形成偶联相互作用的多元醇聚合物和 BA聚合物，可选择合适的含多元醇的聚合物和合适的BA聚合物以形成本文所述纳米粒子。其中，考虑到包含或附接于多元醇聚合物和/或BA聚合物的所关注化合物和靶向配体，选定的BA聚合物和多元醇聚合物的化学组成必须保证，多元醇聚合物的亲水性比BA聚合物的亲水性低。如实例 12所示，通过检测界面动电势，显示纳米粒子的表面的修饰，可检测纳米粒子表面上的BA聚合物及其在纳米粒子外部环境的相关呈现状况。(具体而言参见图6)用于检测粒子表面电荷和粒子在盐溶液中稳定性的其他程序，包括检测粒径的变化例如实例12中举例说明的(具体而言参见图 7)，以及技术人员可识别的其他程序。
在一些实施例中，含多元醇的聚合物包括以下至少一种结构单元中的一种或多种：
Figure GDA0003177262620000231
其中
A为下式的有机部分：
Figure GDA0003177262620000241
其中
R1和R2独立地选自分子量为约10kDa或更小的任何碳基或有机基团；
X独立地选自含有-H、-F、-C、-N或-O中的一种或多种的脂族基团；并且
Y独立地选自-OH或具有羟基(-OH)的有机基团，包括但不限于- CH2OH、-CH2CH2OH、-CF2OH、-CF2CF2OH和 C(R1G1)(RG2)(R1G3)OH，其中R1G1、R1G2和R1G3为独立的有机官能团，
并且
B是连接第一个部分A中R1和R2中之一，与第二个部分A中R1和R2中之一的有机部分。
本文所用的术语“部分”是指构成一种较大分子或一类分子中一部分的一组原子。具体而言，部分是指重复的聚合物结构单元的组分。示例性部分包括酸或碱物质、糖、碳水化合物、烷基、芳基以及可用于形成聚合物结构单元的任何其他分子组分。
本文所用的术语“有机部分”是指含有碳原子的部分。具体而言，有机基团包括天然化合物和合成化合物，以及包括杂原子的化合物。示例性的天然有机部分包括但不限于绝大多数糖、一些生物碱和萜类化合物、碳水化合物、脂类和脂肪酸、核酸、蛋白质、肽和氨基酸、维生素以及脂肪与油类。合成有机基团是指通过与其他化合物的反应制备的化合物。
在一些实施例中，一种或多种所关注化合物可附接到(A)、到(B)或到 (A)和(B)。
在一些实施例中，R1和R2独立地具有下式：
Figure GDA0003177262620000251
其中
d为0至100
e为0至100
f为0至100，
Z为连接一个有机部分与另一个有机部分的共价键，具体为另一个本文所定义的部分A或部分B。并且
Z1独立地选自-NH2、-OH、-SH和-COOH
在一些实施例中，Z可独立地选自-NH-、-C(＝O)NH-、-NH-C(＝O)、- SS-、-C(＝O)O-、-NH(＝NH2 +)-或-O-C(＝O)-。
在一些实施例中，含多元醇的聚合物的结构单元A具有式(IV)，则X 可以是CvH2v+1，其中v可为0至5，并且Y可以是-OH。
在一些实施例中，R1和/或R2的具有式(V)，其中Z为-NH(＝NH2 +)-并且/或者Z1为NH2。
在一些实施例中，本文所述粒子的含多元醇的聚合物中，(A)可独立地选自式
Figure GDA0003177262620000252
Figure GDA0003177262620000253
并且
Figure GDA0003177262620000261
其中
间隔基独立地选自任何有机部分，具体而言可包括含有任何杂原子 (例如硫、氮、氧或氟)的烷基、苯基或烷氧基；
氨基酸选自具有游离氨基和游离羧酸基的任何有机基团；
n为1至20；并且
Z1独立地选自-NH2、-OH、-SH以及-COOH。
在一些实施例中，Z1为NH2，并且/或者糖可以是任何单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖醇、蔗糖、半乳糖、山梨醇、木糖或半乳糖。
在一些实施例中，在本文所述粒子的含多元醇的聚合物中，一种或多种结构单元(A)独立地具有下式：
Figure GDA0003177262620000262
在一些实施例中，(B)可由通过官能团连接两个(A)部分的任何直链、支链、对称或不对称化合物形成。
在一些实施例中，(B)可由通过至少两个可交联基团连接两个(A)部分的化合物形成。
在一些实施例中，(B)含有中性、阳离子或阴离子有机基团，其性质和组成取决于与之共价或非共价结合的化合物的化学性质。
用于与阴离子货物一起使用的(B)的示例性阳离子部分包括但不限于具有脒基、季铵、伯胺基、仲胺基、叔胺基(在其pKa以下质子化)以及咪唑
Figure GDA0003177262620000273
的有机基团。
用于与阳离子货物一起使用的(B)示例性阴离子部分包括但不限于具有式中磺酸根、式中硝酸根、式中羧酸根以及膦酸根的有机基团。
具体而言，分别用于与阴离子货物和阳离子货物一起使用的一个或多个阳离子或阴离子部分(B)可独立地具有以下通式：
Figure GDA0003177262620000271
其中如果A含有亲核基团，则R5为可共价连接到A的亲电子基团。在这种情况下，R5的例子包括但不限于-C(＝O)OH、-C(＝O)Cl、- C(＝O)NHS、-C(＝NH2 +)OMe、-S(＝O)OCl-、-CH2Br、烷基和芳香酯、末端炔烃、甲苯磺酸盐和甲磺酸盐以及若干其他基团。在部分A含有亲电子端基的情况下，R5会具有亲核基团，例如-NH2(伯胺)、-OH、-SH、N3和仲胺。
具体而言，当部分(B)是用于与阴离子货物一起使用的阳离子部分(B) 时，“有机基团”是可具有主链(通式为CmH2m，且其中m≥1)和其他杂原子的有机部分，并且一定含有至少一个以下官能团，包括式(XIII)的脒、式(XIV)的季铵、式(XV)的伯胺基、式(XVI)的仲胺基、式(XVII)的叔胺基 (在其pKa以下质子化)以及式(XVIII)的咪唑
Figure GDA0003177262620000274
Figure GDA0003177262620000272
在实施例中，当部分(B)为用于与阳离子货物一起使用的阴离子部分(B) 时，“有机基团”可具有主链(通式为CmH2m，且其中m≥1)和其他杂原子，并且一定含有至少一个以下官能团，包括式(XIX)的磺酸根、式(XX)的硝酸根、式(XXI)的羧酸根以及式(XXII)的膦酸根。
Figure GDA0003177262620000281
在(B)由羧酸盐(XXI)构成的实施例中，含伯胺基或羟基的化合物还可通过形成肽键或酯键而附接。
在(B)由式(XV)的伯胺基和/或式(XVI)的仲胺基构成的实施例中，含羧酸基团的化合物还可通过形成肽键而附接。
在一些实施例中，部分(B)可独立地选自
Figure GDA0003177262620000282
其中
q为1至20，具体可为5；
p为20至200；并且
L为离去基团。
本文所用的术语“离去基团”是指在异裂中与一对电子一同脱离的分子片段。具体而言，离去基团可以是阴离子或中性分子，并且离去基团的脱离能力与共轭酸的pKa 相关，pKa越低则离去基团的脱离能力越强。示例性的阴离子离去基团包括卤素离子，例如Cl-、Br-和I-，以及磺酸根，例如对甲苯磺酸根或“甲苯磺酸根”(TsO-)。示例性的中性分子离去基团为水 (H2O)、氨气(NH3)和醇类(ROH)。
具体而言，在一些实施例中，L可以是氯(Cl)、甲氧基(OMe)、叔丁氧基(OtBU)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
在一些实施例中，式(I)中结构单元的式可为
Figure GDA0003177262620000291
在一些实施例中，式(II)中结构单元的式可为
Figure GDA0003177262620000292
在一些实施例中，式(III)中结构单元的式可为
Figure GDA0003177262620000293
其中
n为1至20，具体而言，为1至4。
在一些实施例中，含多元醇的聚合物的式可为
Figure GDA0003177262620000301
在一些实施例中，含硼酸的聚合物含有至少一个末端硼酸基团并且具有以下结构：
Figure GDA0003177262620000302
其中
R3和R4可独立地选自任何亲水性有机聚合物，具体而言，可独立地选自任何聚环氧乙烷，以及两性离子聚合物。
X1可以是含有-CH、-N或-B中的一种或多种的有机部分
Y1可以是具有式-CmH2m-(其中m≥1)的烷基，并且可以含有烯烃基团或炔基、或芳族基团例如苯基、联苯基、萘基或蒽基
r为1至1000，
a为0至3，并且
b为0至3
并且其中官能团1和官能团2可以相同或不同并且都能够结合到靶向配体，具体而言，结合到蛋白质、抗体或肽，或者是端基，例如-OH、- OCH3或-(X1)-(Y1)-B(OH)2-
在一些实施例中，R3和R4为(CH2CH2O)t，其中t为2至2000，具体为 100至300。
在一些实施例中，X1可以是-NH-C(＝O)-、-S-S-、-C(＝O)-NH-、-O- C(＝O)-或-C(＝O)-O-并且/或者Y1可以是苯基。
在一些实施例中，r可为1，a可为0而b可为1。
在一些实施例中，官能团1和官能团2可以相同或不同并且独立地选自-B(OH)2、-OCH3、-OH。
具体而言，式(XXXI)的官能团1和/或2可以是能够结合货物(具体为靶向配体，例如蛋白质、抗体或肽)的官能团，或者可以是端基，例如- OH、-OCH3或-(X)-(Y)-B(OH)2。
本文所用的术语“官能团”是指在分子结构或其部分中，进行该结构或该部分的特征化学反应的特定原子组。示例性的官能团包括烃、含卤素基团、含氧基团、含氮基团以及含磷和硫的基团，所有此类基团均可被技术人员识别。具体而言，根据本发明的意义，官能团包括羧酸、氨基、三芳基膦、叠氮化物、炔烃、磺酰叠氮、硫代酸和醛。具体而言，例如，能够结合靶向配体中的对应官能团的官能团可包括以下结合伴侣：羧酸基和氨基、叠氮化物和乙炔基、叠氮化物和三芳基膦基团、磺酰叠氮和硫代酸以及醛和伯胺。技术人员在阅读本发明后应当能够识别其他官能团。本文所用的术语“对应官能团”是指可与另一个官能团反应的官能团。因此，能相互反应的官能团即可称为对应官能团。
端基是指大分子或低聚物分子末端的结构单元。例如，PET聚酯的端基可以是醇基或羧酸基。端基可用于测定摩尔质量。示例性端基包括-OH、 -COOH、NH2和OCH3。
在一些实施例中，含硼酸的聚合物的式可为
Figure GDA0003177262620000311
其中s为20至300。
可附接到本发明纳米粒子的示例性试剂和靶向配体囊括了有机或无机分子，包括多核苷酸、核苷酸、适配体多肽、蛋白质、多糖大分子复合物(包括但不限于含有蛋白质和多核苷酸、糖类和/或多糖、病毒、具有放射性同位素的分子、抗体或抗体片段的混合物的复合物)。
本文所用的术语“多核苷酸”是指由两种或更多种包括核苷酸、核苷或它们的类似物在内的单体构成的有机聚合物。术语“核苷酸”是指由接合至嘌呤或嘧啶碱基以及磷酸基的核糖或脱氧核糖组成，并且为核酸基本结构单元的若干化合物。术语“核苷”是指由脱氧核糖或核糖与嘌呤或嘧啶碱基结合组成并且主要存在于核酸中的化合物(诸如鸟苷或腺苷)。术语“核苷酸类似物”或“核苷类似物”分别指其中一个或多个独立原子被不同原子或不同官能团取代的核苷酸或核苷。因此，术语“多核苷酸”包括任何长度的核酸，具体为DNA、RNA、类似物以及它们的片段。三个或更多个核苷酸形成的多核苷酸也称为“核苷酸低聚物”或“低聚核苷酸”。
本文所用的术语“适配体”是指结合特定靶标的低聚核酸或肽分子。具体而言，适配体可包括，例如通过多次进行体外选择或等同的SELEX (配体指数增强系统进化技术)工程改造并结合到各种分子靶标(例如小分子、蛋白质、核酸，甚至细胞、组织和生物体)的核酸物质。适配体在生物技术和治疗应用方面非常有用，因为它们提供能与抗体分子识别特性竞争的分子识别特性。肽类适配体为设计用于特异性结合到细胞并干扰细胞内的蛋白质相互作用的肽。具体而言，例如，可根据源于酵母双杂交 (Y2H)系统的选择策略设计肽类适配体。具体而言，可根据这一策略，从附接到转录因子结合域的可变肽适配体环中，筛选出附接到转录因子激活域的靶标蛋白。肽类适配体与通过该选择策略筛选出的靶标之间的体内结合，可通过下游酵母标志基因的表达来进行检测。
本文所用的术语“多肽”是指由两个或更多氨基酸单体和/或它们的类似物构成的有机直链、环状或支链聚合物。术语“多肽”包括任何长度的氨基酸聚合物，包括全长蛋白质和肽以及它们的类似物和片段。三个或更多个氨基酸形成的多肽也称为蛋白质低聚物、肽或低聚肽。具体而言，术语“肽”和“低聚肽”通常是指具有小于50个氨基酸单体的多肽。本文所用的术语“氨基酸”、“氨基酸单体”或“氨基酸残基”是指20种天然氨基酸、非天然氨基酸和人工氨基酸中的任何一种，并且包括D和L两种光学异构体。具体而言，非天然氨基酸包括天然氨基酸的D-立体异构体(这些包括可用的配体结构单元，因为它们不易受酶促降解影响)。术语“人工氨基酸”是指易于通过标准氨基酸偶联化学方法进行偶联，但分子结构与天然氨基酸不相似的分子。术语“氨基酸类似物”是指其中一个或多个独立原子被不同原子、同位素或不同官能团取代，但其他部位与衍生该类似物的原始氨基酸相同的氨基酸。所有此类氨基酸可使用标准氨基酸偶联化学方法，合成到肽或多肽中。本文所用的术语“多肽”包括含一个或多个单体或氨基酸单体之外结构单元的聚合物。术语“单体”、“亚单元”或“结构单元”是指在适当条件下可通过化学方法结合至具有相同或不同化学性质的另一个单体以形成聚合物的化合物。术语“多肽”还旨在包括其中一个或多个结构单元通过除酰胺或肽键之外的化学键，与另一个结构单元共价结合的聚合物。
本文所用的术语“蛋白质”是指具有特定二级结构和三级结构的多肽，所述结构可参与但不限于与其他生物分子(包括其他蛋白质、DNA、 RNA、脂类、代谢物、激素、趋化因子和小分子)的相互作用。本文所述的示例性蛋白质是抗体。
本文所用的术语“抗体”是指在抗原刺激后由激活的B细胞产生，并且可特异性结合至促进了生物系统免疫应答的抗原的蛋白质。完整抗体通常由四个亚单元组成，包括两条重链和两条轻链。术语“抗体”包括天然抗体和合成抗体，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体或它们的片段。示例性抗体包括IgA、IgD、IgG1、IgG2、IgG3、IgM等等。示例性片段包括Fab Fv、Fab’F(ab’)2等等。单克隆抗体是特异性结合至另一个生物分子 (称为“表位”)的单个特定空间和极性结构，并且因此被定义为与该生物分子互补的抗体。某些形式的单克隆抗体还可具有相同结构。多克隆抗体是指不同单克隆抗体的混合物。某些形式的多克隆抗体可以是单克隆抗体的混合物，其中至少包含两种结合至不同抗原表位的单克隆抗体。不同抗原表位可位于相同靶标和/或不同靶标。抗体可通过本领域熟知的技术制备，例如通过宿主的免疫系统和血浆收集(多克隆)或通过制备连续杂交瘤细胞系并收集分泌蛋白(单克隆)。
在一些实施例中，根据图1和2的示意图，多元醇聚合物与一种或多种待递送的所关注化合物形成非共价复合物或非共价连接。
在一些实施例中，纳米粒子结构包括含多元醇的试剂和聚合物，其中试剂通过共价键连接至多元醇聚合物。与试剂缀合的多元醇聚合物的例子将在实例16至实例21中详细描述。在此类实施例中，与试剂缀合的多元醇聚合物(本文称为“多元醇聚合物-试剂缀合物”)形成纳米粒子，在其结构表面提供了与BA分子相互作用的位点。
在一些此类实施例中，纳米粒子还包含被构造用于为该纳米粒子提供空间位阻稳定和/或靶向功能的BA聚合物。具体而言，在此类实施例中，添加的BA聚合物可让自聚集和与其他纳米粒子的非所需相互作用降低到最低程度，从而提供较高的盐和血清稳定性。例如，本文通过具有PEG的 BA聚合物提供立体稳定，如实例12中所述的示例性纳米粒子所示。
在此类实施例中，该纳米粒子的结构相比于现有技术的试剂递送方法还具备若干优点，例如对一种或多种试剂进行控释的能力。该特征可通过例如在试剂与多元醇聚合物之间使用可生物降解的酯键来实现。本领域的技术人员应当能够认识到适于本目的的其他可能的连接方法。在此类实施例中，另一个优点是通过BA聚合物部分提供试剂的特异性靶向定位的能力。
在一些实施例中，BA聚合物可以包含能够用作MRI或其他类似技术中的成像剂的氟化硼酸(实例7)或氟化的可裂解硼酸(实例8)。此类成像剂可用于跟踪由纳米粒子递送的试剂的药代动力学或药效动力学特征。
在一些实施例中，纳米粒子结构包括试剂和多元醇聚合物，其中该纳米粒子为经过修饰的脂质体。在此类实施例中，经过修饰的脂质体包含通过共价键与多元醇聚合物缀合，并且能让脂质体的表面提供多元醇聚合物的脂类。在此类实施例中，经修饰脂质体的形成可让待递送试剂包含于脂质体纳米粒子中。
本文所用的术语“脂质体”是指由脂类构成的多孔结构。脂类通常具有包含长烃链的尾部基团和亲水性头部基团。脂类经排列形成具有适于包含待递送试剂的内部水环境的脂质双分子层。此类脂质体所提供的外表面可包括合适的靶向配体或分子，可用于细胞表面受体或其他所关注靶标的特异性识别。
本文所用的术语“缀合”或“共轭”是指一个分子与第二个分子形成共价键，并且其中原子以交替的单键和多键(例如双键)(例如C＝C-C＝C- C)共价结合并且相互影响以产生电子离域的连接。
在本发明的其他实施例中，纳米粒子结构包括试剂和多元醇，其中该纳米粒子是经过修饰的胶束。在此类实施例中，经过修饰的胶束包含经修饰后含有疏水性聚合物嵌段的多元醇聚合物。
本发明所用的术语“疏水性聚合物嵌段”是指自身具有疏水性的聚合物的片段。
本文所用的术语“胶束”是指一种分散于液体中的分子的聚集体。水溶液中的胶束通常会由接触周围溶剂的亲水性“头部”区域形成聚集体，从而将胶束内的单一疏水性尾部区域与水隔绝。在本发明中，头部区域可以是例如多元醇聚合物的表面区域，而尾部区域可以是例如多元醇聚合物的疏水性聚合物嵌段区域。
在此类实施例中，当与待递送试剂混合时，具有疏水性聚合物嵌段的多元醇聚合物会排列形成纳米粒子。此时该纳米粒子即为经修饰的胶束，内含待递送试剂。此类纳米粒子实施例会在其表面上提供适于与BA聚合物(具有或不具有前述实施例所述的靶向功能)相互作用的多元醇聚合物。在此类实施例中，能够用于该目的的BA聚合物包括与式(I)或(II)中的亲水性A和疏水性B结合的聚合物。该相互作用具有与上述其他纳米粒子实施例中提供的相同或类似优点。
在一些实施例中，纳米粒子或相关组分可与可接受媒介物一起包含于组合物中。本文所用的术语“媒介物”是指作为活性成分包含于组合物中纳米粒子的多种介质中的任何一种，所述介质通常用作溶剂、载体、粘结剂、赋形剂或稀释剂。
在需要给个体施用组合物的一些实施例中，该组合物可以是药物组合物并且可接受媒介物可以是药用媒介物。
在一些实施例中，纳米粒子可与赋形剂或稀释剂一起包含于药物组合物中。具体而言，在一些实施例中，公开的药物组合物含有纳米粒子，并且与一种或多种相容可接受媒介物和药用媒介物组合，具体为与药用稀释剂或赋形剂组合。
本文所用的术语“赋形剂”是指用作药物活性成分载体的失活物质。适用于本文所公开的药物组合物的赋形剂包括可提高个体的身体对纳米粒子的吸收能力的任何物质。合适的赋形剂还包括能让具有纳米粒子的制剂体积增大以便准确地控制剂量的任何物质。除了确定单次剂量外，在制造过程中使用赋形剂还有助于对纳米粒子的处理。根据给药途径和药物形式，可以使用不同的赋形剂。示例性的赋形剂包括但不限于抗粘合剂、粘结剂、包衣分解质、填充剂、风味剂(例如甜味剂)和着色剂、助流剂、润滑剂、防腐剂、吸附剂。
本文所用的术语“稀释剂”是指用于稀释或运载组合物中活性成分的稀释试剂。合适的稀释剂包括可降低药物制剂的粘度的任何物质。
在某些实施例中，可配制用于全身用药的组合物，具体为药物组合物，其中包括非肠道给药，更确切地讲，包括静脉注射、皮内注射和肌内注射给药。
用于非肠道给药的示例性组合物包括但不限于包含纳米粒子的无菌水溶液、注射溶液或悬浮液。在一些实施例中，用于非肠道给药的组合物在使用时，可通过将预制的冻干形式粉末组合物溶于生物相容性水性液体 (蒸馏水、生理溶液或其他水溶液)的方法制备。
术语“冻干”(也称为冷冻干燥法或冷冻干燥)是指常用于保存易腐败材料或制备更便于运送的材料的脱水方法。冷冻干燥的工序为：冷冻材料，然后降低周围气压并施加足够热量，让材料中的冷冻水直接从固相升华为气体。
在药物应用中，冷冻干燥通常用于延长产品(例如疫苗和其他注射剂)的储存寿命。将水从材料移除并将材料密封在小瓶中后，材料便易于保存、运送并且可随后重组为用于注射的原型。
在一些实施例中，本文所述的纳米粒子会被递送至预定靶标。在一些实施例中，靶标是体外生物系统并且方法包括使靶标与本文所述纳米粒子接触。
一些实施例提供了用于将试剂递送到个体的方法，包括根据本发明所公开的若干实施例配制合适纳米粒子的方法。纳米粒子还可以根据本发明所公开的若干实施例配制成药用组合物。该方法还包括将纳米粒子递送到受试者。要将纳米粒子递送到个体，纳米粒子或纳米粒子制剂可通过口服、非肠道、局部或直肠等途径给药。给药时应选择适于每种施用途径的纳米粒子形式。例如，纳米粒子组合物可通过片剂或胶囊剂形式、注射、吸入、眼用洗剂、油膏剂、栓剂、输液给药；通过洗剂或油膏剂局部给药；以及通过栓剂直肠给药。
本文所用的术语“个体”包括单个生物有机体，包括但不限于植物或动物，具体为高等动物，更具体为脊椎动物，例如哺乳动物，具体为人类。
本文所用的术语“非肠道给药”和“非肠道施用”意指除肠内和局部给药之外的给药模式，通常通过注射给药，并且包括但不限于静脉、肌内、动脉、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹腔、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输液。
本文所用的术语“全身给药”、“全身施用”、“外周给药”和“外周施用”意指除直接施用到中枢神经系统中之外的纳米粒子或其组合物给药方法。该方法可使其进入个体的全身，从而经历代谢和其他类似过程，例如皮下给药。
本文所述药物组合物中的活性成分或活性剂的实际剂量水平可以调整，以便在不会导致个体中毒的前提下，获得针对特定个体、组合物和给药模式并且可实现所需的治疗相应的活性成分有效用量。
这些治疗聚合物的缀合物可通过任何合适的给药途径施用给人和其他动物，包括口服、鼻腔(例如通过喷雾剂)、直肠、阴道、非肠道、脑池内以及局部给药(例如通过粉剂、油膏剂或滴剂，包括口腔和舌下)。
不管选择何种给药途径，均可通过本领域技术人员已知的常规方法，将治疗聚合物的缀合物(可采用合适的水合物形式)和/或本发明的药物组合物配制成药用剂型。
具体而言，在一些实施例中，所递送化合物为用于治疗或预防个体病症的药物。
术语“药物”或“治疗剂”是指可用于治疗、预防或诊断个体病症或以其他方式提高个体的生理或心理健康的活性剂。
本文所用的术语“病症”通常是指一种个体的身体整体或其中一个或多个部位的生理状态。该生理状态与生理、心理和可能的社交方面完全健康的个体整体或其一个或多个部位的生理状态不符合。本文所述病症包括但不限于障碍和疾病，其中术语“障碍”是指身体或其任何部位的功能异常的生命个体病症，而术语“疾病”是指损害身体或其任何部位的正常功能并且通常可通过分辨病征和症状来证明的生命个体病症。示例性病症包括但不限于损伤、残疾、障碍(包括心理和生理障碍)、综合征、感染、个体的异常行为以及个体的身体或其部位的结构和功能的非典型变化。
本文所用的术语“治疗”是指医疗护理或通过药物或手术对病症进行处理的任何行为。
本文所用的术语“预防”是指降低个体病症所导致的死亡率或发病率负担的任何行为。这一行为分为一级预防、二级预防和三级预防水平，其中：a)一级预防避免疾病的发展；b)二级预防行为以早期疾病治疗为目的，从而增加阻止疾病加重和相关症状出现的机率；以及c)三级预防通过恢复功能和减少疾病相关并发症来降低已确诊疾病的负面影响。
可通过本文所述纳米粒子递送并且适于作为药物的示例性化合物包括能够发出待可用于放射治疗(例如硼中子捕获疗法)的电磁辐射的化合物 (例如10B同位素)。其他治疗剂包括任何亲脂性或亲水性、合成或天然的生物活性治疗剂，包括本领域已知的治疗剂。Merck Index,An Encyclopedia of Chemicals,Drugs,and Biologicals,13th Edition,2001,Merck and Co.,Inc., Whitehouse Station,N.J.(《默克索引：化合物、药物和生物制品百科全书》，第13版，2001年，新泽西州怀特豪斯站默克集团)。此类治疗剂的例子包括但不限于小分子药物、抗生素、类固醇、多核苷酸(例如基因组 DNA、cDNA、mRNA、siRNA、shRNA、miRNA、反义低聚核苷酸、病毒和嵌合多核苷酸)、质粒、肽、肽片段、小分子(例如阿霉素)、螯合剂 (例如去铁胺(DESFERAL)、乙二胺四乙酸(EDTA))、天然产物(例如紫杉醇、两性霉素)以及其他生物活性大分子，例如蛋白质和酶。还可参见美国专利No.6,048,736，该专利列出了可用作与本文所述纳米粒子相结合的治疗剂的活性剂(治疗剂)。小分子治疗剂不仅可以是复合物粒子中的治疗剂，在另一个实施例中，还可以共价结合至复合物中的聚合物。在一些实施例中，共价键是可逆的(例如，前药形式形成的共价键或可生物降解的共价键例如二硫键)并且提供另一种递送治疗剂的方式。在一些实施例中，可用本文所述纳米粒子递送的治疗剂包括化学治疗剂(例如埃博霉素、喜树碱类药物、紫杉醇)或核酸(例如质粒、siRNA、shRNA、 miRNA、反义低聚核苷酸配体或它们的组合)，以及技术人员在阅读本发明后可识别的其他药物。
在一些实施例中，所递送化合物是适用于对个体的细胞或组织成像的化合物。可通过本文所述纳米粒子递送并且适用于成像的示例性化合物包括含有同位素(例如用于MR成像的19F同位素、用于PET成像的18F或64Cu等)的化合物。
具体而言，本文所述纳米粒子可被构造为含有含19F的BA聚合物。例如，19F原子可结合到不可裂解或可裂解BA聚合物化合物中。19F原子的其他位置可能位于BA聚合物组分、多元醇聚合物组分或待递送试剂上。上述及其他变型形式对本领域技术人员而言应当是显而易见的。
在一些实施例中，本文所述纳米粒子可用于递送农业中所用的化学品。在本发明的另一个实施例中，通过本文所述纳米粒子递送的试剂是具有微生物和农业实用性的生物活性化合物。此类生物活性化合物包括本领域已知的化合物。例如，合适的农业生物活性化合物包括但不限于肥料、杀真菌剂、除草剂、杀虫剂和防霉剂。灭菌剂也可用于水处理，以处理城市供水和工业用水系统，例如冷却水、造纸业中的白色水域系统。易受微生物污染或微生物降解影响的水系统还见于皮革行业、纺织行业以及涂料或油漆行业中。此类微生物及其应用的例子单独和组合地描述于美国专利 No.5,693,631、6,034,081和6,060,466中。这些专利以引用方式并入本文中。含有诸如上述的活性剂的组合物可以通过与活性成分本身相同的已知方法使用。值得注意的是，因为此类应用不是药物应用，复合物的聚合物无须满足药物应用所需的毒性分布。
在某些实施例中，包含多元醇聚合物和BA聚合物的纳米粒子还可包含于适用于使用纳米粒子递送本文指出的化合物(具体地讲试剂)中任何一种的系统中。在该体系的一些实施例中，与纳米粒子一同提供的还有适用于制备施用给个体的纳米粒子的组分。
本文所公开的体系可通过包含多个部分的试剂盒的形式提供。例如，多元醇聚合物和/或BA聚合物可通过单独分子的形式或者以赋形剂、媒介物或稀释剂形式，包含于其中。
在多部分的试剂盒中，多元醇聚合物、BA聚合物和/或待递送试剂独立地包含于试剂盒中，并且可与合适的载体或辅剂一起包含于组合物中。例如，多元醇聚合物和/或BA聚合物可单独地包含于一个或多个组合物中并且/或者包含于合适的媒介物中。另外，待递送试剂可与合适的载体或助剂一起包含于组合物中。或者，试剂可由最终用户提供并且可不存在于多部分的试剂盒中。此外，多元醇聚合物、BA聚合物和/或试剂还可通过各种适于结合到纳米粒子的形式包含于试剂盒内。
试剂盒还可以包含另外的组分，包括微流体芯片、参考标样、缓冲液，以及技术人员在阅读本发明后可识别的其他组分。
在本文所公开的多部分试剂盒中，试剂盒提供的组分可具有相应的介绍和其他必要试剂，以便进行本文所公开的方法。在一些实施例中，试剂盒中的组合物可分装于单独的容器中。试剂盒中还可以包含纸质或电子载体(例如磁带或CD-ROM)的用于指导分析的介绍(例如书面介绍或音频介绍)。根据所用的具体方法，试剂盒还可包含其他包装好的试剂和材料 (例如清洗缓冲液等等)。
本领域技术人员在阅读本发明后，应当能够识别用于分辨组合物的合适载体试剂或助剂的其他详细信息，一般而言为试剂盒的制造和包装。
在一些实施例中，可以通过如下方式制备纳米粒子：制备纳米粒子的各个组分，然后按不同的顺序混合所述组分，得到所需的复合纳米粒子结构。组分的制备和混合可在本领域技术人员已知的合适溶液中进行。
本文所用的术语“混合”是指一种包含所关注分子的溶液与另一种包含所关注分子的溶液的共通添加过程。例如，结合本发明的内容，可将多元醇聚合物的水溶液与BA聚合物的水溶液混合。
本文所用的术语“溶液”是指含有所关注分子的任何液相样品。例如，多元醇聚合物的水溶液可以包含，在水或任何缓冲溶液(具体为水溶液)中稀释的多元醇聚合物。
在一些实施例中，可通过如下方式制备纳米粒子：将多元醇聚合物与待递送试剂混合(图1和2)，形成多元醇聚合物-试剂纳米粒子。在其他实施例中，可通过进一步将BA聚合物与多元醇聚合物-试剂纳米粒子混合来制备纳米粒子。在其他实施例中，通过将多元醇聚合物与BA聚合物混合，然后混合待递送试剂来制备纳米粒子。在其他实施例中，通过同时混合多元醇聚合物、BA聚合物和待递送试剂来制备纳米粒子。
在一些实施例中，通过如下方式制备纳米粒子：根据本发明的多个实施例，形成多元醇聚合物-试剂缀合物，从而制备由多元醇聚合物-试剂缀合物构成的纳米粒子。在其他实施例中，可以通过将纳米粒子溶解于合适的水溶液来制备由多元醇聚合物-试剂缀合物构成的纳米粒子。在其他实施例中，可以通过将多元醇聚合物-试剂缀合物与提供或不提供靶向配体的BA 聚合物混合，来制备由多元醇聚合物-试剂缀合物构成的纳米粒子。
在一些实施例中，可通过如下方式制备纳米粒子：将具有疏水性聚合物嵌段的多元醇聚合物与待递送试剂混合，从而制备本发明实施例中的经修饰的胶束。在其他实施例中，可通过进一步将经修饰的胶束与BA聚合物混合来制备纳米粒子。在其他实施例中，可以通过如下方式制备纳米粒子：将多元醇聚合物与BA聚合物混合，然后再与待递送试剂混合，从而制备经修饰胶束形式的纳米粒子。
在本发明的一些实施例中，可以通过如下方式制备纳米粒子：将与多元醇聚合物缀合的脂类与BA聚合物和/或待递送试剂混合，从而制备经修饰的脂质体。在多个实施例中，可以通过如下方式制备纳米粒子：将与多元醇聚合物缀合的脂类与BA聚合物混合，然后再与待递送试剂混合。在其他实施例中，可以通过将与多元醇聚合物缀合的脂类与待递送试剂混合来制备纳米粒子。在其他实施例中，可以通过如下方式制备纳米粒子：将与多元醇聚合物缀合的脂类与待递送试剂混合，然后与BA聚合物混合，从而制备经修饰脂质体形式的纳米粒子。
可用本领域技术人员已知的技术和程序分析本发明的若干实施例所述的纳米粒子的形成过程。例如，在一些实施例中，使用凝胶阻滞试验监测和测量纳米粒子中核酸试剂的结合(实例10)。在一些实施例中，可使用已知方法选择合适的纳米粒子尺寸和/或界面动电势(实例11)。
本领域技术人员在阅读本发明后，应当能够识别用于分辨组合物的合适载体试剂或助剂的其他详细信息，一般而言为试剂盒的制造和包装。
具有含硝基苯硼酸聚合物的纳米粒子
本文描述了具有含多元醇的聚合物的纳米粒子，所述含多元醇聚合物与含硝基苯硼酸的聚合物缀合。含所述靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物可具有一个或多个以下任何一种结构单元：
Figure GDA0003177262620000421
其中A是式
Figure GDA0003177262620000422
(IV)的有机部分。
其中R1和R2独立地选自分子量为约10kDa或更小的任何碳基或有机基团；X独立地选自含有-H、-F、-C、-N或-O中一种或多种的脂族基团；而 Y则独立地选自-OH或提供-OH的有机部分，并且B是连接聚合物中的第一个部分A的R1和R2中之一，与第二个部分A的R1和R2中之一的有机部分。在一些实施例中，X可以是CnH2n+1，其中n为0-5的任何单个数字并且Y是-OH。在一些实施例中，A可以是以下任何一种：
Figure GDA0003177262620000423
Figure GDA0003177262620000431
其中间隔基独立地选自任何有机基团；氨基酸选自具有游离氨基和游离羧酸基的任何有机基团；n为1至20的任何单个数字；并且Z1独立地选自- NH2、-OH、-SH和-COOH；R1和R2独立地可具有式：
Figure GDA0003177262620000432
Figure GDA0003177262620000441
其中d为0至100的任何单个数字，e为0至100的任何单个数字，f为0 至100的任何单个数字，Z为连接一个有机部分与另一个有机部分的共价键，并且Z1独立地选自-NH2、-OH、-SH和-COOH；B可以是以下任何一种：
Figure GDA0003177262620000442
其中q为1-20的任何单个数字；p为20-200的任何单个数字；并且L 是离去基团。这些B亚单元与上述任何一种A亚单元配对。在更具体的实施例中，式(I)结构单元所示含靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物可以是：
Figure GDA0003177262620000443
式(II)结构单元所示含靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物可以是：
Figure GDA0003177262620000444
Figure GDA0003177262620000445
并且
式(III)结构单元所示含靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物可以是：
Figure GDA0003177262620000451
其中n为1至20的任何单个数字。在所述靶向纳米粒子的一些实施例中，含多元醇的聚合物为：
Figure GDA0003177262620000452
概括地说，子部分A的式(式VI、VII或VIII)中任何一种均可与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种组合，形成所述纳米粒子中含多元醇的聚合物。在本文所述的某些方面，纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物。
在一些实施例中，含硝基苯硼酸的聚合物包含硝基苯硼酸基团并且具有通式：
Figure GDA0003177262620000461
其中R3和R4独立地为亲水性有机聚合物，X1为含有-C、-N或-B中一种或多种的有机部分，Y1是具有式-CmH2m-的烷基(其中m为≥1)或芳族基团，r为1至1000的任何单个数字，a为0至3的任何单个数字，b为0至 3的任何单个数字，并且官能团1和官能团2可以相同或不同并可独立地选自-B(OH)2、-OCH3或-OH中任何一种。在一些实施例中，所述含硝基苯硼酸的聚合物的这些可变子部分可选自以下：R3和R4可以是(CH2CH2O)t，其中t为2至2000的任何单个数字；X1为-NH-C(＝O)-、-S-S-、-C(＝O)-NH-、 -O-C(＝O)-或-C(＝O)-O-中任何一种并且Y1为硝基苯基。在一些实施例中，所述含硝基苯硼酸的聚合物的这些可变子部分可选自以下：R3和R4可以是 (CH2CH2O)t，其中t为2至2000的任何单个数字；X1为-NH-C(＝O)-、-S-S-、-C(＝O)-NH-、-O-C(＝O)-或-C(＝O)-O-中的任何一种并且Y1为硝基苯基，并且r的值可为1，a的值可为0而b的值可为1。在含硝基苯硼酸的聚合物的每个实施例中，硝基可位于苯环上硼酸基团的邻位、间位或对位。但依然有其他实施例中，含硝基苯硼酸的聚合物的苯环上可以具有其他基团，例如甲基。在一个具体实施例中，本文所述靶向纳米粒子可包括具有以下式中任何一种的含硝基苯硼酸的聚合物：
Figure GDA0003177262620000462
Figure GDA0003177262620000471
其中s为20至300的任何单个数字。式XXXIII、XXXIV和XXXV的聚合物可进行进一步修饰，将PEG在苯环上的位置改变为相对于硼酸基团的邻位、间位或对位。
概括地说，子部分A的化学式(化学式VI、VII或VIII)中任何一种均可与子部分B的化学式(化学式XXIII或XIV)中任何一种组合，形成所述纳米粒子中含多元醇的聚合物纳米粒子片段，然后所得含多元醇的聚合物可偶联到含硝基苯硼酸的聚合物。在一些实施例中，所述含多元醇的聚合物和所述含硝基苯硼酸的聚合物之间的缀合会通过硼酸基团上至少一个羟基介导。在本文所述的某些方面，纳米粒子可具有由子部分A的式 (IX、X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可与具有式 XXX的含硼酸的聚合物偶联。在本文所述的一些实施例中，纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII 或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可偶联到对应式XXXIII、XXXIV或XXXV中任何一种的含硼酸的聚合物。
本文所述纳米粒子还可包括化合物。在一些实施例中，所述化合物可为一种或多种治疗剂，例如小分子化学治疗剂或多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸可为DNA、RNA或干扰RNA(例如shRNA、siRNA或 miRNA)中的任何一种或多种。在一些实施例中，小分子化学治疗剂可以是喜树碱、埃博霉素或紫杉烷中的一种或多种。本文所述纳米粒子还可包括一种或多种多核苷酸与一种或多种小分子化学治疗剂的组合。就这一点而言，子部分A(式VI、VII或VIII)的聚合物中任何一种可与子部分B(式 XXIII或XIV)的聚合物中任何一种组合，形成含所述纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物，然后所得含多元醇的聚合物可偶联到含硝基苯硼酸的聚合物，并且子部分A、子部分B的聚合物或具有硝基苯硼酸的聚合物可用一种或多种治疗剂(例如小分子化学治疗剂或多核苷酸)形成。在一些实施例中，子部分A(式VI、VII或VIII)的聚合物可与子部分B(式 XXIII或XIV)的聚合物中任何一种组合，形成含所述纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物，然后所得含多元醇的聚合物可偶联到含硝基苯硼酸的聚合物，并且子部分A、子部分B的聚合物或具有硝基苯硼酸的聚合物可用DNA、RNA或干扰RNA(例如shRNA、siRNA或miRNA)中的一种或多种形成。在一些实施例中，子部分A(式VI、VII或VIII)的聚合物可与子部分B(式XXIII或XIV)的聚合物中任何一种组合，形成含所述纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物，然后所得含多元醇的聚合物可偶联到含硝基苯硼酸的聚合物，并且子部分A、子部分B的聚合物或具有硝基苯硼酸的聚合物可用一种或多种化学治疗剂形成。在一些实施例中，子部分A(式VI、VII或VIII)的聚合物可与子部分B(式XXIII或XIV) 的聚合物中任何一种组合，形成含所述纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物，然后所得含多元醇的聚合物可偶联到含硝基苯硼酸的聚合物，并且子部分A、子部分B的聚合物或具有硝基苯硼酸的聚合物可用DNA、 RNA或干扰RNA(例如shRNA、siRNA或miRNA)中的一种或多种形成。在一些实施例中，所述含多元醇的聚合物和所述含硝基苯硼酸的聚合物之间的缀合将通过硝基苯硼酸基团的至少一个羟基介导。在本文所述的一些实施例中，结合治疗剂或多核苷酸的靶向纳米粒子可具有由子部分A 的式(IX、X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可偶联到对应式XXXIII、XXXIV或XXXV中任何一种的含硝基苯硼酸的聚合物。
靶向纳米粒子
本文描述了具有与1至5个靶向配体缀合的含多元醇的聚合物的靶向纳米粒子。含所述靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物可具有一个或多个以下任何一种结构单元：
Figure GDA0003177262620000491
其中A是式
Figure GDA0003177262620000492
(IV)的有机部分。
其中R1和R2独立地选自分子量为约10kDa或更小的任何碳基或有机基团；X独立地选自含有-H、-F、-C、-N或-O中一种或多种的脂族基团；而 Y则独立地选自-OH或提供-OH的有机部分，并且B是连接聚合物中的第一个部分A的R1和R2中之一，与第二个部分A的R1和R2中之一的有机部分。在一些实施例中，X可以是CnH2n+1，其中n为0-5的任何单个数字并且Y是-OH。在一些实施例中，A可以是以下任何一种：
Figure GDA0003177262620000493
Figure GDA0003177262620000501
其中间隔基独立地选自任何有机基团；氨基酸选自具有游离氨基和游离羧酸基的任何有机基团；n为1至20的任何单个数字；并且Z1独立地选自- NH2、-OH、-SH和-COOH；R1和R2独立地可具有式：
Figure GDA0003177262620000502
其中d为0至100的任何单个数字，e为0至100的任何单个数字，f为0 至100的任何单个数字，Z为连接一个有机部分与另一个有机部分的共价键，并且Z1独立地选自-NH2、-OH、-SH和-COOH；B可以是以下任何一种：
Figure GDA0003177262620000511
其中q为1-20的任何单个数字；p为20-200的任何单个数字；并且L是离去基团。这些B亚单元与上述任何一种A亚单元配对。在更具体的实施例中，式(I)结构单元所示含靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物可以是：
Figure GDA0003177262620000512
式(II)结构单元所示含靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物可以是：
Figure GDA0003177262620000513
Figure GDA0003177262620000514
并且
式(III)结构单元所示含靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物可以是：
Figure GDA0003177262620000521
其中n为1至20的任何单个数字。在所述靶向纳米粒子的一些实施例中，含多元醇的聚合物为：
Figure GDA0003177262620000522
概括地说，子部分A的式(式VI、VII或VIII)中任何一种均可与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种组合，形成所述靶向纳米粒子中含多元醇的聚合物。在本文所述的某些方面，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或 XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物。
所述靶向的纳米粒子还可具有含硼酸的聚合物，并且该含硼酸的聚合物通过可逆共价键联偶联至含多元醇的聚合物。在一些实施例中，纳米粒子会被配置用于将含硼酸的聚合物提供至该纳米粒子外部的环境。在另外的实施例中，含硼酸的聚合物与靶向配体在其相对于纳米粒子的末端缀合。在一些实施例中，含硼酸的聚合物包含至少一个末端硼酸基团，并且具有通式：
Figure GDA0003177262620000531
其中R3和R4独立地为亲水性有机聚合物，X1为含有-C、-N或-B中一种或多种的有机部分，Y1是具有式-CmH2m-的烷基(其中m为≥1)或芳族基团，r为1至1000的任何单个数字，a为0至3的任何单个数字，b为0至 3的任何单个数字，并且官能团1和官能团2可以相同或不同并可独立地选自-B(OH)2、-OCH3或-OH中任何一种。在一些实施例中，所述含硼酸的聚合物中这些可变子部分可选自以下：R3和R4可以是(CH2CH2O)t，其中t为 2至2000的任何单个数字；X1为-NH-C(＝O)-、-S-S-、-C(＝O)-NH-、-O- C(＝O)-或-C(＝O)-O-中任何一种并且Y1为苯基。在一些实施例中，所述含硼酸的聚合物中这些可变子部分可选自以下：R3和R4可以是(CH2CH2O)t，其中t为2至2000的任何单个数字；X1为-NH-C(＝O)-、-S-S-、-C(＝O)-NH-、 -O-C(＝O)-或-C(＝O)-O-中的任何一种并且Y1为苯基，并且r的值可为1，a 的值可为0而b的值可为1。在特定实施例中，本文所述的靶向纳米粒子可包含具有以下式的含硼酸的聚合物：
Figure GDA0003177262620000532
其中s为20至300的任何单个数字。
在一些实施例中，含硼酸的聚合物具有硝基苯硼酸。在一些实施例中，含硝基苯硼酸的聚合物包含硝基苯硼酸基团并且具有通式：
Figure GDA0003177262620000541
其中R3和R4独立地为亲水性有机聚合物，X1为含有-C、-N或-B中一种或多种的有机部分，Y1是具有式-CmH2m-的烷基(其中m为≥1)或芳族基团，r为1至1000的任何单个数字，a为0至3的任何单个数字，b为0至 3的任何单个数字，并且官能团1和官能团2可以相同或不同并可独立地选自-B(OH)2、-OCH3或-OH中任何一种。在一些实施例中，所述含硼酸的聚合物中这些可变子部分可选自以下：R3和R4可以是(CH2CH2O)t，其中t为 2至2000的任何单个数字；X1为-NH-C(＝O)-、-S-S-、-C(＝O)-NH-、-O- C(＝O)-或-C(＝O)-O-中任何一种并且Y1为硝基苯基。在一些实施例中，所述含硝基苯硼酸的聚合物的这些可变子部分可选自以下：R3和R4可以是 (CH2CH2O)t，其中t为2至2000的任何单个数字；X1为-NH-C(＝O)-、-S-S- 、-C(＝O)-NH-、-O-C(＝O)-或-C(＝O)-O-中的任何一种并且Y1为硝基苯基，并且r的值可为1，a的值可为0而b的值可为1。在含硝基苯硼酸的聚合物的每个实施例中，硝基可位于苯环上硼酸基团的邻位、间位或对位。但依然有其他实施例中，含硝基苯硼酸的聚合物的苯环上可以具有其他基团，例如甲基。在一个具体实施例中，本文所述靶向纳米粒子可包括具有以下式中任何一种的含硼酸的聚合物：
Figure GDA0003177262620000542
Figure GDA0003177262620000551
其中s为20至300的任何单个数字。式XXXIII、XXXIV和XXXV的聚合物可进行进一步修饰，将PEG在苯环上的位置改变为相对于硼酸基团的邻位、间位或对位。
概括地说，子部分A的式(式VI、VII或VIII)中任何一种均可与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种组合，形成含所述靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物，然后所得含多元醇的聚合物可偶联至含硝基苯硼酸的聚合物，其中含硼酸的聚合物为苯硼酸或硝基苯硼酸。在一些实施例中，所述含多元醇的聚合物和所述含硼酸的聚合物之间的缀合会通过硼酸基团上至少一个羟基介导。在本文所述的某些方面，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、X或XI)中任何一种与子部分B的式 (式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可与具有式XXX的含硼酸的聚合物偶联。在本文所述的一些实施例中，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可偶联到对应式XXXI、 XXXIII、XXXIV或XXXV中任何一种的含硼酸的聚合物。
在本文所述的一些方面，本文所述的含多元醇纳米粒子片段的聚合物形成的纳米粒子，或含多元醇纳米粒子片段的聚合物与含硼酸的聚合物的组合形成的纳米粒子，会缀合至靶向配体形成靶向配体与纳米粒子比为3:1 的靶向纳米粒子。在本文所述的一些方面，本文所述的含多元醇纳米粒子片段的聚合物形成的纳米粒子，或含多元醇纳米粒子片段的聚合物与含硼酸的聚合物的组合形成的纳米粒子，会缀合至靶向配体形成靶向配体与纳米粒子比为1:1的靶向纳米粒子。在本文所述的一些方面，本文所述的含多元醇纳米粒子片段的聚合物形成的纳米粒子，或含多元醇纳米粒子片段的聚合物与含硼酸的聚合物的组合形成的纳米粒子，会缀合至单一靶向配体形成靶向纳米粒子。在一些方面，所述靶向配体缀合至含硼酸的聚合物上与硼酸反向的末端。缀合至所述靶向纳米粒子的靶向配体可为以下各项中任何一种：蛋白质、蛋白质片段、氨基酸肽，或来自氨基酸或多核苷酸的适配体，或已知可结合所关注靶标的其他高亲和力分子。在一些实施例中，蛋白质或蛋白质片段形式的靶向配体可为以下各项中的任何一种：抗体、细胞受体、针对细胞受体的配体(例如转铁蛋白)，或具有以上各项部分结构的蛋白质或嵌合蛋白。当靶向配体为抗体时，抗体可为人、鼠类、兔、非人的灵长类、犬、或啮齿动物抗体，或由任何两种上述抗体组成的嵌合抗体。此外，抗体可被人源化，使得仅CDR片段或一小部分包含 CDR片段的可变区为非人的，抗体的剩余部分均为人的。本文所述的抗体可为任何同种型抗体，例如IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY或认为由哺乳动物产生的另一类型的同种型。在一些实施例中，靶向配体可仅包括来自抗体、细胞受体、负责结合靶标的细胞受体的配体的氨基酸肽。
在一些方面，纳米粒子通过以下方法形成：子部分A的式(式VI、 VII或VIII)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种组合，形成含所述靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物，再进一步与1至5个含硼酸(例如苯硼酸或缀合至靶向配体的硝基苯硼酸)的聚合物偶联。
在一些方面，纳米粒子通过以下方法形成：子部分A的式(式VI、 VII或VIII)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种组合，形成含所述靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物，再进一步与单个含硼酸(例如苯硼酸或缀合至靶向配体的硝基苯硼酸)的聚合物偶联。
在本文所述的某些方面，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、 X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可与1至5个具有式XXX的含硼酸的聚合物偶联。其中含硼酸的聚合物上与硼酸反向的末端与靶向配体偶联。
在本文所述的某些方面，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、 X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可与单个具有式 XXX的含硼酸的聚合物偶联。其中含硼酸的聚合物上与硼酸反向的末端与靶向配体偶联。
在一些方面，纳米粒子通过以下方法形成：子部分A的式(式VI、 VII或VIII)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种组合，形成含所述靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物，再进一步与1至5个含硼酸(例如苯硼酸或缀合至靶向配体的硝基苯硼酸)的聚合物偶联。所得的靶向纳米粒子仅与单个靶向配体缀合。
在一些方面，纳米粒子通过以下方法形成：子部分A的式(式VI、 VII或VIII)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种组合，形成含所述靶向纳米粒子的多元醇纳米粒子片段的聚合物，再进一步与单个含硼酸(例如苯硼酸或缀合至靶向配体的硝基苯硼酸)的聚合物偶联。所得的靶向纳米粒子仅与单个靶向配体缀合。
在本文所述的某些方面，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、 X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可与1至5个具有式XXX的含硼酸的聚合物偶联。其中含硼酸的聚合物上与硼酸反向的末端与靶向配体偶联。所得的靶向纳米粒子仅与单个靶向配体缀合。
在本文所述的某些方面，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、 X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可与单个具有式 XXX的含硼酸的聚合物偶联。其中含硼酸的聚合物上与硼酸反向的末端与靶向配体偶联。所得的靶向纳米粒子仅与单个靶向配体缀合。
在一些实施例中，本文所述的靶向纳米粒子与任何靶向配体缀合。在一些实施例中，本文所述的靶向纳米粒子与单一靶向配体缀合。在本文所述的一些实施例中，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、X或XI) 中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可偶联到1至5个对应式XXXI、XXXIII、XXXIV或XXXV中任何一种的含硼酸的聚合物，而含硼酸的聚合物则进一步与选自蛋白质、蛋白质片段、氨基酸肽或适配体中一种或多种的靶向配体缀合。
在一些实施例中，本文所述的靶向纳米粒子与单一靶向配体缀合。在本文所述的一些实施例中，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、X 或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可偶联到对应式 XXXI、XXXIII、XXXIV或XXXV中任何一种的含硼酸的聚合物，而含硼酸的聚合物则进一步与选自蛋白质、蛋白质片段、氨基酸肽或适配体中一种或多种的靶向配体缀合。
在一些实施例中，本文所述的靶向纳米粒子与单一靶向配体缀合。在本文所述的一些实施例中，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、X 或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可偶联到1至5个对应式XXXI、XXXIII、XXXIV或XXXV中任何一种的含硼酸的聚合物，而含硼酸的聚合物则进一步与抗体、细胞受体、针对细胞受体的配体(例如转铁蛋白)，或具有以上各项部分结构的蛋白质或嵌合蛋白缀合。
在本文所述的一些实施例中，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式 (IX、X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可偶联到单个对应式XXXI、XXXIII、XXXIV或XXXV中任何一种的含硼酸的聚合物，而含硼酸的聚合物则进一步与单一抗体、细胞受体、针对细胞受体的配体(例如转铁蛋白)，或具有以上各项部分结构的蛋白质或嵌合蛋白缀合。
在一些实施例中，本文所述的靶向纳米粒子与单一靶向配体缀合。在本文所述的一些实施例中，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、X 或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可偶联到对应式 XXXI、XXXIII、XXXIV或XXXV中任何一种的含硼酸的聚合物，而含硼酸的聚合物则进一步与选自蛋白质、蛋白质片段、氨基酸肽或适配体中一种或多种的靶向配体缀合。所得的靶向纳米粒子仅与单个靶向配体缀合。
在一些实施例中，本文所述的靶向纳米粒子与单一靶向配体缀合。在本文所述的一些实施例中，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式(IX、X 或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可偶联到1至5个对应式XXXI、XXXIII、XXXIV或XXXV中任何一种的含硼酸的聚合物，而含硼酸的聚合物则进一步与抗体、细胞受体、针对细胞受体的配体(例如转铁蛋白)，或具有以上各项部分结构的蛋白质或嵌合蛋白缀合。所得的靶向纳米粒子仅与单个靶向配体缀合。
在本文所述的一些实施例中，靶向纳米粒子可具有由子部分A的式 (IX、X或XI)中任何一种与子部分B的式(式XXIII或XIV)中任何一种的组合形成的含多元醇的聚合物，然后该含多元醇的聚合物可偶联到单个对应式XXXI、XXXIII、XXXIV或XXXV中任何一种的含硼酸的聚合物，而含硼酸的聚合物则进一步与单一抗体、细胞受体、针对细胞受体的配体(例如转铁蛋白)，或具有以上各项部分结构的蛋白质或嵌合蛋白缀合。所得的靶向纳米粒子仅与单个靶向配体缀合。
本文所述的靶向纳米粒子还可包括化合物。在一些实施例中，所述化合物可为一种或多种治疗剂，例如小分子化学治疗剂或多核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸可为DNA、RNA或干扰RNA(例如shRNA、siRNA 或miRNA)中的任何一种或多种。在一些实施例中，小分子化学治疗剂可以是喜树碱、埃博霉素或紫杉烷中的一种或多种。本文所述靶向纳米粒子还可包括一种或多种多核苷酸与一种或多种小分子化学治疗剂的组合。
由于已讨论了可使用本文所述的组分制备的各种类型的纳米粒子以及靶向纳米粒子，因此可产生以下特定实施例。在一个实施例中，所述靶向纳米粒子具有含粘酸的聚合物，选自喜树碱、埃坡霉素、紫杉烷或干扰 RNA序列的治疗剂，具有式XXXI、XXXIII、XXXIV或XXXV并通过可逆共价键偶联至粘酸聚合物的含苯硼酸的聚合物，并且靶向纳米粒子被配置用于将含苯硼酸的聚合物提供至纳米粒子外部的环境。其中含苯硼酸的聚合物上与纳米粒子反向的末端与靶向配体缀合，而靶向纳米粒子包含单一靶向配体。
在一个实施例中，所述靶向纳米粒子具有含粘酸的聚合物，选自喜树碱、埃坡霉素、紫杉烷或干扰RNA序列的治疗剂，具有式XXXI、 XXXIII、XXXIV或XXXV并通过可逆共价键偶联至粘酸聚合物的含苯硼酸的聚合物，并且靶向纳米粒子被配置用于将含苯硼酸的聚合物提供至纳米粒子外部的环境。其中含苯硼酸的聚合物上与纳米粒子反向的末端与抗体缀合，而靶向纳米粒子包含单一抗体。
在一个实施例中，所述靶向纳米粒子具有含粘酸的聚合物，选自喜树碱、埃坡霉素、紫杉烷或干扰RNA序列的治疗剂，具有式XXXI、 XXXIII、XXXIV或XXXV并通过可逆共价键偶联至粘酸聚合物的含苯硼酸的聚合物，并且靶向纳米粒子被配置用于将含苯硼酸的聚合物提供至纳米粒子外部的环境。含苯硼酸的聚合物上与纳米粒子反向的末端缀合至人、鼠类、兔、非人的灵长类、犬、或啮齿动物抗体中任何一种，或由任何两种上述抗体组成的嵌合抗体，其中抗体为IgG、IgM、IgA、IgD、IgE 或IgY同种型中任何一种，而靶向纳米粒子包含单一抗体。
在一个实施例中，所述靶向纳米粒子具有含粘酸的聚合物，选自喜树碱、埃坡霉素、紫杉烷或干扰RNA序列的治疗剂，具有式XXXI、 XXXIII、XXXIV或XXXV并通过可逆共价键偶联至粘酸聚合物的含苯硼酸的聚合物，并且靶向纳米粒子被配置用于将含苯硼酸的聚合物提供至纳米粒子外部的环境。其中含苯硼酸的聚合物上与纳米粒子反向的末端与细胞受体缀合，而靶向纳米粒子包含单一细胞受体。
在一个实施例中，所述靶向纳米粒子具有含粘酸的聚合物，选自喜树碱、埃坡霉素、紫杉烷或干扰RNA序列的治疗剂，具有式XXXI、 XXXIII、XXXIV或XXXV并通过可逆共价键偶联至粘酸聚合物的含苯硼酸的聚合物，并且靶向纳米粒子被配置用于将含苯硼酸的聚合物提供至纳米粒子外部的环境。其中含苯硼酸的聚合物上与纳米粒子反向的末端与受体的配体缀合，而靶向纳米粒子包含单一的受体配体。
实例
以下实例会进一步说明本文所述的方法系统，并且所有实例均为说明形式，不具有限制性。本领域技术人员将会了解针对核酸和其他靶标(例如蛋白质、抗原、真核或原核细胞等等)的检测方法的详细描述及其特征的适用性。
所有化学试剂均购自商业供应商，并且不经进一步纯化直接使用。使用配备了TDA302三重检测器阵列的Viscotek GPC系统分析聚合物样品，所述三重检测器阵列由差示折光率(RI)检测器、差示粘度计以及小角度光散射检测器组成。使用7.5％的乙酸溶液作为洗脱剂，流速为1mL/min。
从表达pGL3的细菌中提取并且纯化pGL3(一种含有萤火虫萤光素酶基因的质粒)。siGL3购自集成DNA技术公司(Integrated DNA Technologies) (下文提供序列)。siCON1(下文提供序列)购自Dharmacon公司。使用 HeLa细胞测定阳离子型粘酸二胺-DMS聚合物递送pDNA或siRNA的功效。
表1：siRNA序列
Figure GDA0003177262620000611
实例1：合成粘酸二甲基酯，(1)
将5g(22.8mmol)粘酸(奥德里奇(Aldrich))添加至含有120mL甲醇和 0.4mL浓硫酸的500mL圆底烧瓶。此混合物在85℃和连续搅拌下回流过夜。随后将混合物过滤、用甲醇洗涤并且然后在80mL甲醇与0.5mL三乙胺的混合物中重结晶。在真空条件下干燥过夜后，获得8.0g(33.6mmol, 71％)粘酸二甲酯。1H NMR((CD3)2SO)δ4.88-4.91(d,2H),4.78-4.81(m,2H), 4.28-4.31(d,2H),3.77-3.78(d,2H),3.63(s,6H)。ESI/MS(m/z):261.0[M+Na]+
Figure GDA0003177262620000621
实例2：合成由N-BOC保护的粘酸二胺，(2)
用500mL圆底烧瓶将8g(33.6mmol)粘酸二甲酯(1；实例1)、 12.4mL(88.6mmol)三乙胺以及160mL甲醇的混合物在85℃和连续搅拌的条件下回流加热0.5h，之后添加溶于甲醇(32mL)中的14.2g(88.6mmol)N- BOC二胺(Fluka公司)。然后将此反应悬浮液返回至回流装置。回流过夜后，将混合物过滤，用甲醇洗涤，在甲醇中重结晶然后在真空条件下干燥，得到9.4g(19mmol，57％)由N-BOC保护的粘酸二胺。1H NMR ((CD3)2SO)δ7.66(m,2H),6.79(m,2H),5.13-5.15(d,2H),4.35-4.38(d,2H), 4.08-4.11(m,2H),3.78-3.80(d,2H),2.95-3.15(m,8H),1.38(s,18)。ESI/MS (m/z):517.1[M+Na]+
Figure GDA0003177262620000622
实例3：合成粘酸二胺，(3)
将8g(16.2mmol)N-BOC保护的粘酸二胺(2；实例2)转移至装有含 3M HCl的甲醇(160mL)的500mL圆底烧瓶中并且在85℃和连续搅拌的条件下回流过夜。随后收集沉淀，用甲醇洗涤并真空干燥过夜，得到5.7g (15.6mmol，96％)粘酸二胺。1H NMR((CD3)2SO)δ7.97(m,8H),5.35- 5.38(m,2H),4.18-4.20(m,2H),3.82(m,2H),3.35-3.42(m,8H),2.82-2.90(m, 4H)。ESI/MS(m/z):294.3[M]+,317.1[M+Na]+,333.0[M+K]+
Figure GDA0003177262620000623
实例4：粘酸二胺-DMS共聚物(MAP)，(4)
向1.5mL eppendorff管装入含85.5mg(0.233mmol)实例3(3)中二(盐酸)盐的0.8mL 0.1M NaHCO3溶液。添加二甲基辛二亚氨酸酯π2HCl (DMS，皮尔斯化学公司(PierceChemical Co.)，63.6mg，0.233mmol)，并且将溶液漩涡振荡并离心以溶解其中组分。将所得混合物在室温下搅拌 15h。然后将混合物用水稀释至8mL，并且添加1N HCl，将pH调节为4。然后用3500MWCO透析膜(3500MWCO dialysis membrane)(皮尔斯折叠透析管(Piercepleated dialysis tubing))在ddH2O中将此溶液透析24h。将透析获得的溶液冻干，得到49mg白色蓬松粉末。1H NMR(500MHz,dDMSO) δ9.15(bs),7.92(bs),5.43(bs),4.58(bs),4.17(bs),3.82(bs),3.37(bs),3.28(bs), 2.82(bs),2.41(bs),1.61(bs),1.28(bs)。13CNMR(126MHz,dDMSO)δ174.88 (s,1H),168.38(s,1H),71.45(s,4H),71.22(s,3H),42.34(s,2H),36.96(s,3H), 32.74(s,3H),28.09(s,4H),26.90(s,4H)。Mw[GPC]＝2520，Mw/Mn＝1.15。
Figure GDA0003177262620000631
聚合物4为含多元醇的阳离子A-B型(重复结构为ABABAB...)聚合物的例子。
实例5：硼酸-酰胺-PEG5000，(5)
当实例4的聚合物与核酸例如siRNA一起装配时，就会形成纳米粒子。这些纳米粒子需具有空间位阻稳定性，才可用于哺乳动物中，并且任选地，可包含靶向试剂。为执行这两种功能，可用PEG修饰纳米粒子，提供空间位阻稳定和PEG-靶向配体。为此，需制备含硼酸的PEG化合物。例如，可根据以下实例合成含硼酸的PEG。
将332mg 4-羧基苯硼酸(2mmol)溶于8mL SOCl2中。向该溶液添加数滴DMF并且使混合物在氩环境中回流2h。在减压条件下除去过量SOCl2，并且将所得固体溶于10mL无水二氯甲烷中。在0℃的氩环境下，向此溶液添加溶于5mL二氯甲烷中的50mg PEG5000-NH2(2mmol)和418μL三乙胺 (60mmol)。将所得混合物升温至室温并且继续搅拌过夜。在减压条件下除去二氯甲烷溶剂，并且用20mL二乙醚沉淀所得液体。将沉淀滤出、干燥并且再溶解于ddH2O中。然后用0.45μm过滤器过滤水溶液，并且用3500 MWCO透析膜(3500MWCO dialysismembrane)(皮尔斯折叠透析管(Pierce pleated dialysis tubing))在ddH2O中透析24h。将透析后的溶液冻干。1H NMR(300MHz,dDMSO)δ7.92-7.77(m),4.44(d),4.37(t),3.49(m),2.97 (s)。
Figure GDA0003177262620000641
实例6：硼酸-二硫化物-PEG5000，(6)
实例5中PEG化合物的可裂解形式(在还原条件下)还可通过如下方法合成。
将250mg PEG5000-SH(0.05mmol，LaySanBio公司)添加至配有搅拌棒的玻璃瓶中。向其中添加溶于4mL甲醇中的110mg 2,2'-二硫二吡啶 (0.5mmol，奥德里奇(Aldrich))。将溶液在室温下搅拌2h，此后添加溶于 1mL甲醇中的77mg巯基苯硼酸(0.5mmol，奥德里奇(Aldrich))。将所得溶液在室温下再搅拌2小时。在真空条件下除去甲醇，并且将残余物再溶于2mL二氯甲烷中。将18mL二乙醚添加至二氯甲烷溶液，并且将混合物静置1h。经由离心收集所得沉淀物，用二乙醚洗涤数次并干燥。将干燥后固体再溶解于水中，用0.45μm过滤器过滤，并且用3500MWCO透析膜 (3500MWCO dialysis membrane)(皮尔斯折叠透析管(Pierce pleated dialysis tubing))在ddH2O中透析15h。将透析后的溶液冻干。1H NMR(300MHz, dDMSO)δ8.12-8.00(m),7.83-7.72(m),7.72-7.61(m),7.61-7.43(m),3.72 (d,J＝5.4),3.68-3.15(m),3.01-2.83(m)。
Figure GDA0003177262620000651
实例7：合成(2,3,5,6)-四氟苯硼酸-PEG5000，(7)
可合成实例5中含硼酸的PEG化合物的氟化形式并用作治疗性纳米粒子的成像剂。用于成像的氟原子可按照以下描述和说明的方式加入。
将(2,3,5,6)-氟羧基苯硼酸溶于过量SOCl2(约100eq)中，并且添加数滴DMF。将混合物在氩环境下回流2h。在减压条件下除去过量SOCl2，并且将所得残余物溶于无水二氯甲烷中。在0℃的氩环境下，向此溶液添加溶于二氯甲烷中的PEG5000-NH2(1eq)和三乙胺(30eq)。将所得混合物升温至室温并且继续搅拌过夜。在减压条件下除去二氯甲烷溶剂，并用二乙醚沉淀所得液体。将沉淀滤出、干燥并且再溶解于ddH2O中。然后用0.45μm过滤器过滤水溶液，并且用3500MWCO透析膜(3500MWCO dialysis membrane) (皮尔斯折叠透析管(Pierce pleated dialysis tubing))在ddH2O中透析24h。将透析后的溶液冻干。
Figure GDA0003177262620000652
含氟化合物可用于在纳米粒子中提供19F。19F可通过磁共振光谱法使用标准患者MRI进行检测。添加19F可让纳米粒子成像(可仅用于成像，或添加治疗剂，同时进行成像和治疗)。
实例8：合成(2,3,5,6)-四氟苯硼酸-二硫化物-PEG5000，(8)
可合成实例5中含硼酸的可裂解PEG化合物的氟化形式并用作治疗性纳米粒子的成像剂。用于成像的氟原子可按照以下描述和说明的方式加入。
将250mg PEG5000-SH(0.05mmol，LaySanBio公司)添加至配有搅拌棒的玻璃瓶中。向其中添加溶于4mL甲醇中的110mg 2,2'-二硫二吡啶 (0.5mmol，奥德里奇(Aldrich))。将溶液在室温下搅拌2h，此后添加溶于 1mL甲醇中的77mg(2,3,5,6)-氟-4-巯基苯硼酸(0.5mmol)。将所得溶液在室温下再搅拌2小时。在真空条件下除去甲醇，并且将残余物再溶于2mL二氯甲烷中。将18mL二乙醚添加至二氯甲烷溶液，并且将混合物静置1h。经由离心收集所得沉淀物，用二乙醚洗涤数次并干燥。将干燥后固体再溶解于水中，用0.45μm过滤器过滤，并且用3500MWCO透析膜(3500 MWCO dialysis membrane)(皮尔斯折叠透析管(Piercepleated dialysis tubing))在ddH2O中透析15h。将透析后的溶液冻干。
Figure GDA0003177262620000661
实例9：合成硼酸-PEG5000-转铁蛋白，(9)
在实例5到8的化合物中，例如根据图12中关于转铁蛋白附接的示意性的方法，靶向试剂可置于PEG上不同于硼酸的其他末端。
因此，含作为治疗剂的核酸的体系组分可为(可为蛋白质的靶向配体如转铁蛋白(图12)、抗体或抗体片段、肽如RGD或LHRH、小分子如叶酸或半乳糖等)。硼酸PEG化靶向试剂可通过以下方法合成。
具体而言，为根据图12中示意性的方法合成硼酸PEG5000-转铁蛋白，需执行以下程序。将10mg(0.13μmol)人全铁转铁蛋白(富铁)(西格玛奥德里奇(Sigma Aldrich))的1mL0.1M PBS缓冲液(p.H.7.2)溶液添加至3.2mg OPSS-PEG5000-SVA(5eq，0.64μmol，LaysanBio公司)中。将所得溶液在室温下搅拌2h。使用Ultracel 50,000MWCO(Amicon Ultra-4，密理博公司 (Millipore))自未反应的OPSS-PEG5000-SVA中，并使用凝胶过滤柱 G3000SWxl(gelfiltration column G3000SWxl)(Tosoh Biosep公司)自未反应的转铁蛋白中，纯化PEG化转铁蛋白(由HPLC和MALDI-TOF分析确认)。然后在室温下将100μL的100μg OPSS-PEG5000PEG化转铁蛋白与 20μL 4-巯基苯硼酸(1μg/μL，20μg，100eq)一起温育1h。温育后，用 YM-30,000NMWI装置(密理博公司)将溶液透析两次，除去过量4-巯基苯硼酸和吡啶基-2-硫酮副产物。
实例10：MAP-核酸颗粒的配制—凝胶阻滞试验
如图1所图示，将溶于不含DNA酶和RNA酶的水中的1μg质粒DNA 或siRNA(0.1μg/μL，10μL)与以多种浓度溶于不含DNA酶和RNA酶的水中的10μL MAP进行混合，得到电荷比(聚合物上的“+”电荷：核酸上的“-”电荷)为0.5、1、1.5、2、2.5以及5的溶液。将所得混合物在室温下温育30分钟。将20μL溶液中的10μL与3.5μL上样缓冲液一起上样到 1％琼脂糖凝胶上，并且如图3和图4所示，在80V下对凝胶进行电泳45 分钟。未包含在纳米粒子中的核酸将在凝胶上迁移。这些结果给出有关将核酸包含在纳米粒子中所需的电荷比的指导。
实例11：MAP-核酸粒子的粒径和ζ电位
将溶于不含DNA酶和RNA酶的水中的1μg质粒DNA(0.1μg/μL, 10μL)与溶于不含DNA酶和RNA酶的水中的各种浓度的10μL MAP进行混合，以得到电荷比0.5、1、1.5、2、2.5以及5。将所得混合物在室温下温育30分钟。用不含DNA酶和RNA酶的水将20μL混合物稀释至70μL，以供粒径测量。然后，用1mM KCl将此70μL溶液稀释至1400μL，以供ζ电位测量。在ZetaPals动态光散射(DLS)仪器(布鲁克海文仪器公司 (Brookhaven Instruments))上进行粒径和ζ电位测量。结果示于图5中。
实例12：通过用硼酸PEG5kPEG化进行粒径稳定
如图2所示，将溶于不含DNA酶和RNA酶的水中的2μg质粒DNA (0.45μg/μL,4.4μL)在不含DNA酶和RNA酶的水中稀释至80μL。将此质粒溶液与也在不含DNA酶和RNA酶的水中稀释至80μL的4.89μg MAP (0.5μg/μL,9.8μL)进行混合，以得到3+/-的电荷比和0.0125μg/μL的最终质粒浓度。将所得混合物在室温下温育30分钟。向此溶液添加480μg硼酸 PEG5K(化合物6；实例6)(20μg/μL,24μL)。然后将此混合物进一步温育 30分钟，在不含DNA酶和RNA酶的水中用0.5mL 100,000MWCO膜 (BIOMAX，密理博公司(Millipore Corporation))透析两次，并且在160μL 不含DNA酶和RNA酶的水中复原。用1.4mL的1mM KCl稀释一半溶液，以供ζ电位测量(图6)。应注意，含BA的纳米粒子的ζ电位示出与不含 BA的纳米粒子相比较低的ζ电位。这些结果支持以下结论：含BA的纳米粒子具有定位于纳米粒子外部的BA。另一半溶液用于测量粒径。持续5分钟每分钟测量粒径，此后添加10.2μL的10X PBS，使得最终90.2μL溶液处于1X PBS中。然后，如图7所示，持续另外10分钟再次每分钟测量粒径。与非粒子组分(通过过滤)分离的含BA的纳米粒子在PBS中是稳定的，而不含BA的粒子则不稳定。这些数据支持以下结论：含BA的纳米粒子具有定位于纳米粒子外部的BA，因为其在PBS中稳定而不聚集。
实例13：MAP/pDNA粒子转染到HeLa细胞中
转染前48h，将HeLa细胞以20,000个细胞/孔接种到24孔板中，并且使其在补充有10％FBS的培养基中生长。将MAP粒子配制成在各种聚合物：pDNA电荷比下(参考实例9)，在200μL Opti-MEM I中含1μg pGL3。移除生长培养基，用PBS洗涤细胞，并且添加粒子制剂。随后将细胞在37℃和5％CO2下温育5h，之后添加补充有10％FBS的800μL生长培养基。温育48h后，使用MTS测定法分析一部分细胞的细胞存活力。使剩余细胞在100μL 1X荧光素酶细胞培养裂解试剂中裂解。通过将100μL荧光素酶测定试剂添加至10μl细胞裂解液来测定荧光素酶活性，并且使用Monolight光度计对生物发光定量。荧光素酶活性随后报告为每10,000个细胞的相对光单位(RLU)。结果示于图8和图9中。
实例14：MAP/pDNA和/或siRNA粒子共转染到HeLa细胞中
转染前48h，将HeLa细胞以20,000个细胞/孔接种到24孔板中，并且使其在补充有10％FBS的培养基中生长。将MAP粒子配制成在5+/-的电荷比下，在200μL Opti-MEM I中含有1μg pGL3和50nM siGL3。仅含 pGL3或pGL3和siCON的粒子用作对照。移除生长培养基，用PBS洗涤细胞，并且添加粒子制剂。随后将细胞在37℃和5％CO2下温育5h，之后添加补充有10％FBS的800μL生长培养基。温育48h后，如实例12所述测定细胞的荧光素酶活性和细胞存活力。结果示于图10中。由于RLU在用 siGL3(正确序列)的转染中降低，因此siGL3与pGL3两者必须共递送。
实例15：MAP/siGL3转染到HeLa-LUC细胞中
转染前48h，将HeLa-LUC细胞(含有编码萤火虫荧光素酶蛋白的基因)以20,000个细胞/孔接种到24孔板中，并且使其在补充有10％FBS的培养基中生长。将MAP粒子配制成在5+/-的电荷比下，在200μL Opti- MEM I中含有50nM和100nM siGL3。移除生长培养基，用PBS洗涤细胞，并且添加粒子制剂。随后将细胞在37℃和5％CO2下温育5h，之后添加补充有10％FBS的800μL生长培养基。温育48h后，如实例12所述测定细胞的荧光素酶活性和细胞存活力。结果示于图11中。由于RLU随着 siGL3浓度增加而下降，因此这些数据表明可发生对内源性基因的抑制。
实例16：合成粘酸二碘化物，(10)
在250mL圆底烧瓶中将1g(2.7mmol)粘酸二胺(实例3)与3.8mL (27.4mmol)三乙胺和50mL无水DMF进行混合，随后逐滴添加1.2mL (13.7mmol)碘乙酰基氯。允许此混合物在恒定搅拌下在室温下反应过夜。随后通过真空泵移除溶剂，过滤产物、用甲醇洗涤并且在真空下干燥以得到 0.8g(1.3mmol,46％)粘酸二碘化物。1H NMR((CD3)2SO)δ8.20(s 2H),2H),7.77(s,2H),4.11(m,2H),4.03(m,2H),3.79(m,2H),3.11-3.17(m,2H),1.78 (d,2H)。ESI/MS(m/z):652.8[M+Na]+
Figure GDA0003177262620000701
实例17：合成粘酸胱氨酸，(11)
向7mL 0.1M脱气碳酸钠添加17mg L-半胱氨酸和0.4g粘酸二碘化物。使所得悬浮液在150℃下回流5h，直到溶液变澄清。然后，将此混合物冷却至室温，并且经由1N HCl调节至pH 3。然后，采用缓慢添加丙酮来沉淀产物。过滤后，用丙酮洗涤并且真空干燥，获得60mg粗产物。
Figure GDA0003177262620000702
实例17：合成粘酸胱氨酸，(11)
向50mL圆底烧瓶中的20mL 0.1M脱气磷酸钠缓冲液(pH 7.5)添加 0.38g L-半胱氨酸(3.2mmol)和0.40g(0.6mmol)粘酸二碘化物。允许所得悬浮液在75℃下回流过夜，冷却至室温并且冻干。随后，将80mL DMF添加至此冻干的淡棕色粉末，并且通过过滤实现不溶性过量试剂和磷酸盐自可溶性产物的分离。在减压下移除DMF，并且真空干燥产物以得到12mg(0.02mmol,3％)粘酸胱氨酸。
Figure GDA0003177262620000703
实例18：聚合物合成(聚(粘酸-胱氨酸-PEG))，(12)
在10mL的2颈圆底烧瓶中在真空下干燥12mg(21.7μmol)粘酸胱氨酸和74mg(21.7μmol)PEG-DiSPA 3400，之后在氩气氛围下添加0.6mL无水 DMSO。搅拌10分钟后，将9μL(65.1μmol)无水DIEA在氩气氛围下转移至反应容器。将此混合物在氩气氛围下搅拌过夜。然后使用10kDa膜离心装置透析含聚合物的溶液，并且冻干以得到47mg(58％)聚(粘酸-胱氨酸-PEG)。
Figure GDA0003177262620000711
此含多元醇的聚合物为阴离子型AB聚合物。
实例19：将药物(喜树碱，CPT)共价附接至粘酸聚合物，(13)
在玻璃广口瓶中，将10mg(2.7μmol重复单元)聚(粘酸-胱氨酸-PEG) 溶解在1.5mL无水DMSO中。搅拌10分钟后，将1.1μL DIEA(6.3μmol)、 3.3mg(6.3μmol)TFA-Gly-CPT、1.6mg(8.1μmol)EDC以及0.7mg(5.9μmol) NHS添加至反应混合物。搅拌8h后，添加1.5mL乙醇并且在减压下移除溶剂。将沉淀物溶解于水中，并且通过0.2μm过滤器过滤来移除不溶性物质。然后，经由10kDa膜用水透析聚合物溶液，并且随后冻干以提供聚(粘酸-胱氨酸-PEG)-CPT缀合物。
Figure GDA0003177262620000721
实例20：在水中用CPT-粘酸聚合物(13)配制纳米粒子，(20)
通过将聚合物配制到重蒸馏水(0.1-10mg/mL)中来测量聚(粘酸-胱氨酸- PEG)和聚(粘酸-胱氨酸-PEG)-CPT缀合物的有效直径，并且使用ZetaPALS (布鲁克海文仪器公司(Brookhaven Instrument Co))仪器通过动态光散射 (DLS)进行评估。随后记录3个各1分钟的连续运行，并且取平均值。在 1.1mM KCl溶液中使用ZetaPALS(布鲁克海文仪器公司(Brookhaven Instrument Co))仪器测量两种化合物的ζ电位。然后在0.012的靶残值(target residual)下进行10个连续自动运行，并且将结果取平均值(图 14)。具体来说，对于聚(粘酸-胱氨酸-PEG)-CPT缀合物测量出两个粒径分布，主要分布为57nm(占总粒子数的60％)。还在233nm下测量到第二次要分布。
实例21：用CPT-粘酸聚合物(13)和硼酸-二硫化物-PEG5000(6)在水中配制硼酸- PEG化的纳米粒子
通过将聚合物以0.1mg/mL的浓度溶解于重蒸馏水中，之后添加也溶于水中的聚合物6(BA-PEG)，使得PBA-PEG与聚(粘酸-胱氨酸-PEG)-CPT缀合物中粘酸糖上的二醇的比率为1:1，来配制硼酸PEG化的聚(粘酸-胱氨酸 -PEG)-CPT纳米粒子。将混合物温育30分钟，此后使用ZetaPALS(布鲁克海文仪器公司(Brookhaven Instrument Co))仪器测量有效直径和ζ电位。
实例22：供在小鼠中递送pDNA的靶向纳米粒子。
质粒pApoE-HCRLuc含有表达荧光素酶的基因，并且处于肝特异性启动子控制下。在5mL水中混合聚合物(MAP)4(0.73mg)、聚合物6(73mg) 以及聚合物9(0.073mg)，然后添加含pApoE-HCRLuc质粒的1.2mL水(得到聚合物4与质粒的电荷比+3)。通过连续旋转过滤并随后添加D5W(从溶于水的初始制剂开始)来将粒子置于D5W(5％溶于水的葡萄糖)中。将Hepa-1-6肝癌细胞植入裸小鼠，并且使肿瘤生长直到约200mm3的大小。在尾静脉中以等于5mg质粒/kg小鼠的量进行靶向纳米粒子的静脉注射。注射后24小时，对小鼠进行成像。小鼠未表现出毒性症状，并且在肿瘤区域中而未在肝脏区域中检测到萤光素酶表达。
实例23：合成PBA-PEG和硝基PBA-PEG并且测定pKa
为制备稳定且靶向的纳米粒子，使用硼酸与MAP(含二醇)之间的共价可逆结合特性。苯硼酸(PBA)的pKa较高，为8.8。为减小pKa，采用在苯基环上具有吸电子基的PBA来增大硼原子的酸性。使用草酰氯将商购的 3-羧基PBA和3-羧基5-硝基PBA转化成酰基氯。这些酰基氯物质然后与 NH2-PEG反应以分别形成PBA-PEG和硝基PBA-PEG。为了使合成反应能够进行，需要添加碱DMF和DIPEA。然而，这些碱的存在导致与酸性 PBA形成四面体加合物。为移除这些加合物，在0.5N HCl中进行处理，随后通过用水透析平衡至中性pH。
对于PBA-PEG的合成，在氩气氛围下向溶解于5ml无水四氢呋喃中的 200mg(1.21mM)3-羧基苯硼酸添加18.7μl(0.24mM)无水二甲基甲酰胺。将此反应容器转移到冰浴中，并且在氩气氛围下缓慢添加195μl(2.89mM)草酰氯。允许反应在室温下在通风和恒定搅拌下进行2h。在真空下移除溶剂和过量试剂。在氩气氛围下将37mg(0.2mM)所得干燥酰基氯化合物溶解于 15ml无水二氯甲烷中。然后，在氩气氛围下添加500mg(0.1mM)NH2-PEG5kDa-CO2H和52μl(0.3mM)干燥DIPEA。在恒定搅拌下反应过夜后，在真空下移除溶剂并且将所干燥的产物在0.5N HCl中复原。使此溶液通过 0.2μm过滤器
Figure GDA0003177262620000743
并且用水通过3kDa MWCO膜过滤装置 (AmiconTM)进行透析，直到获得恒定pH。然后用0.2μm过滤器
Figure GDA0003177262620000744
过滤上清液，并且冻干以得到377mg(73％)PBA-PEG-CO2H。1H NMR ((CD3)2SO)δ12.52(s,1H),8.39(t,1H),8.22(s,1H),8.14(s,2H),7.88(d,1H), 7.82(d,1H),7.39(t,1H),3.99(s,2H),3.35-3.62(PEG峰)。MALDI-TOF (m/z):5600g/mol(NH2-PEG5kDa-CO2H,5400g/mol)。
Figure GDA0003177262620000741
按与PBA-PEG-CO2H相同的方式进行硝基PBA-PEG-CO2H的合成，不同的是起始材料为3-羧基5-硝基苯硼酸。反应得到393mg(76％)硝基 PBA-PEG-CO2H。1H NMR((CD3)2SO)δ12.52(s,1H),8.89(t,1H),8.72(s, 1H),8.68(s,1H),8.64(s,1H),8.61(s,2H),3.99(s,2H),3.35-3.62(PEG 峰)。MALDI-TOF(m/z):5600g/mol(NH2-PEG5kDa-CO2H,5400g/mol)。
Figure GDA0003177262620000742
通过测量PBA从三面体(在低pH下)转化成四面体(在高pH下) 构象时其吸光度的变化来得到所合成PBA化合物的pKa。对于PBA溶于 0.1M PBS中的10-3M溶液，用1N NaOH滴定至pH 7.4。记录pH值，并且移除对应样品用于在268nm下进行吸光度测量。
表2.PBA化合物的pKa和结合常数
化合物 pKa 与MAP的结合常数(M<sup>-1</sup>)
PBA 8.8 20
PBA-PEG-CO<sub>2</sub>H 8.3 520
硝基PBA-PEG-CO<sub>2</sub>H 6.8 1420
实例24：抗体缀合至硝基PBA-PEG
在产生硝基PBA-PEG之后，将所得化合物缀合至抗体。对于缀合，将36mg(6.4μM)硝基PBA-PEG-CO2H、12.3mg(64μM)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)以及11.1mg(96μM)NHS溶解于2.4ml 0.1M MES缓冲液(pH 6.0)中。将此混合物在室温下在旋转振荡器上反应15分钟。用 3kDa截留分子量的膜过滤装置(AmiconTM)将过量的反应物透析走。将此活化的羧酸PEG化合物添加至处于0.1M PBS(pH 7.2)中的20mg(0.14mM)人 IgG1抗体
Figure GDA0003177262620000751
反应在室温下在旋转振荡器上进行2h，然后使用 50kDa截留分子量的膜过滤装置(AmiconTM)并用pH 7.4的1x PBS透析4 次。通过质谱(MALDI-TOF)分析缀合物显示每个抗体平均缀合1至2个硝基PBA-PEG化合物。
实例26：靶向的MAP纳米粒子的形成和表征
检查PBA-PEG和硝基PBA-PEG对纳米粒子形成和稳定性的影响。在 pH 7.4的磷酸盐缓冲液中将PBA-PEG溶液以3+/-电荷比(针对每个来自 siRNA的负电荷，来自MAP的正电荷)添加至MAP溶液。使此混合物在室温下静置10分钟，以供PBA-PEG与含二醇的MAP络合。然后将其添加至等体积的溶于水中的siRNA，并且通过吸移混合。10分钟后，进行测试和表征。以相同方式配制用硝基PBA-PEG稳定并且处于不同电荷比下的粒子。PBA-PEG的缀合形成尺寸为150-300nm的MAP/siRNA粒子。MAP-4 (表示电荷中心(脒)与结合位点(多元醇)之间有4个亚甲基单元)产生比使用MAP-2时小的纳米粒子。然而，在添加盐时，所有粒子聚集，表明PBA-PEG不能够为纳米粒子提供充分的稳定性。在使用硝基PBA-PEG 时，在测试的所有电荷比(1和3(+/-))下的粒子均证明纳米粒子稳定。通过PBA-PEG和硝基PBA-PEG赋予的粒子稳定性差异指示对PEG化硼酸化合物进行改性以具有与多元醇更强的结合的重要性。
对于在不存在稳定剂PEG时与MAP-4缩合的siRNA，在+32mV的高ζ电位下观察到640nm的粒径。当添加硝基PBA-PEG以使粒子稳定时，直径在-4mV的负表面电荷存在下减小至130nm。此负电荷为硼酸与二醇之间结合的结果。当引入0.25mol％的
Figure GDA0003177262620000761
缀合的硝基PBA-PEG 时，有趣的是，粒径进一步减小至82nm，而ζ电位保持相似。
评定连接有各种PEG基团的MAP-4/siRNA纳米粒子的盐稳定性。使用ζ电位分析仪(DLS ZetaPALS仪器，纽约州霍特斯维尔的布鲁克海文仪器公司(BrookhavenInstruments,Holtsville,NY))在1分钟时记录5个运行的粒径。停止测量以允许添加10xPBS溶液至粒子制剂，使得所得粒子制剂含有1x PBS。随后，再次开始测量并且记录10个各1分钟的连续运行，以研究添加盐对粒子稳定性的影响。如图16所示，在不存在稳定剂PEG时，粒子聚集。当硝基PBA-PEG存在时，粒子在盐条件下保持稳定。
实例27：靶向的MAP-CPT纳米粒子的配制和表征
为制备靶向的MAP-CPT纳米粒子，使用硼酸与MAP(含二醇)之间的共价可逆结合特性。PBA与MAP之间的结合常数很低，为约20M-1。为增大结合常数，采用在苯基环上具有吸电子基的PBA来增大硼原子的酸性并且因此提高与MAP的结合常数。使用草酰氯将商购的3-羧基PBA和3- 羧基5-硝基PBA转化成酰基氯。这些酰基氯物质然后与NH2-PEG-CO2H 反应以分别形成PBA-PEG-CO2H和硝基PBA-PEG-CO2H。为了使合成反应能够进行，需要添加碱DMF和DIPEA。然而，这些碱的存在导致与酸性 PBA形成四面体加合物。为移除这些加合物，在0.5NHCl中进行处理，随后通过用水透析平衡至中性pH。
通过吸光度变化测定改性的PBA的pKa值，吸光度变化是由于PBA 随着pH增大，构象从三面体变化成四面体形式(表2)。具有吸电子基的 PBA导致较低pKa值，而硝基PBA-PEG-CO2H具有最低pKa 6.8。因此，在生理pH下，大多数PBA以反应性阴离子四面体形式存在。通过在0.1M PBS(pH 7.4)中与茜素红S的竞争性结合得到PBA与MAP之间的结合常数。由于对于硝基PBA-PEG-CO2H观察到低pKa值和与MAP的高结合常数，因此选择其作为
Figure GDA0003177262620000771
与MAP-CPT纳米粒子之间的连接基。
Figure GDA0003177262620000772
与硝基PBA-PEG-CO2H之间的缀合反应经由EDC偶联(如上所述)进行。每个
Figure GDA0003177262620000773
抗体平均连接1至2个PEG。
表3.MAP、MAP-CPT缀合物、MAP-CPT纳米粒子以及靶向的MAP-CPT纳米粒子的表征
Figure GDA0003177262620000774
a粘酸二(Asp-胺)中每个胺基团添加的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)的当量。bMW：分子量，测定为(Mw+Mn)/2；Mw：重均分子量；Mn：数均分子量。c多分散度，测定为 Mw/Mn。
通过DLS和冷冻电镜对于靶向的MAP-CPT纳米粒子观察到约40nm 的平均尺寸(表3)。非靶向的纳米粒子尺寸增大约10nm，这表明IgG
Figure GDA0003177262620000776
与纳米粒子的附接(附接量为每个纳米粒子约1个
Figure GDA0003177262620000777
抗体)。实际上，根据冷冻电镜图像，靶向的纳米粒子不是球形的，而是看起来具有突起，指示抗体的附接。靶向的MAP-CPT纳米粒子的表面电荷略高于MAP-CPT纳米粒子，这是由于在pH 7.4下存在带正电的Herceptin (
Figure GDA0003177262620000778
的pI为9.2)。
实例28：细胞摄取研究
使用过表达人乳腺癌细胞系(BT-474)的HER2来检查
Figure GDA0003177262620000783
靶向的 MAP-CPT纳米粒子对比非靶向的纳米粒子的细胞摄取。使用HER2阴性乳腺癌细胞系(MCF-7)作为阴性对照。对于这些研究，将24孔板用BT-474 (处于补充有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中)或MCF-7(处于补充有10％胎牛血清的达尔伯克氏改良伊格尔培养基中)(弗吉尼亚州马纳萨斯的Cellgro公司(Cellgro,Manassas,VA))以20,000个细胞/孔接种并且在 37℃下保持在具有5％CO2的加湿恒温器中。40h后，用0.3ml新鲜培养基更换培养基，所述新鲜培养基含有中等MAP-CPT(40μg CPT/ml)、具有 10mg/ml游离
Figure GDA0003177262620000782
的中等MAP-CPT、不同靶向密度下的靶向的 MAP-CPT(40μg CPT/ml)或具有10mg/ml游离
Figure GDA0003177262620000781
的靶向的MAP-CPT。转染在37℃下进行30分钟。然后移除制剂并且用冷PBS洗涤细胞两次。每孔添加200μlRIPA缓冲液，用于细胞脱离和裂解。然后将裂解的细胞在4℃下温育15分钟，并且在4℃下以14,000g离心10分钟。上清液的一部分用于经由BCA测定进行蛋白质定量。向另一部分添加等量的0.1N NaOH，将其在室温下温育过夜，并且在370/440nm下使用已知浓度的 MAP-CPT作为标准来测量荧光。
观察到与非靶向的纳米粒子相比，每个纳米粒子一个
Figure GDA0003177262620000786
-PEG- 硝基PBA足以在BT-474细胞系中实现约70％更大的摄取(图17A)。靶向的MAP-CPT在BT-474细胞中的摄取显示出在游离
Figure GDA0003177262620000785
存在下的抑制作用(图17B)。相比之下，MAP-CPT纳米粒子在MCF-7中的摄取表现出不依赖于靶向或不依赖于游离
Figure GDA0003177262620000784
的存在(图17B )。这些数据表明，在BT-474细胞中存在由靶向的MAP-CPT纳米粒子通过结合 HER2受体进行的受体介导的摄取。靶向的和非靶向的MAP-CPT纳米粒子两者的细胞摄取还通过非特异性液相内吞进行。
实例29：体外释放研究
进行实验来评定CPT自短、中等、长MAP-CPT纳米粒子以及靶向的 MAP-CPT纳米粒子的释放。在如下条件下进行这些研究：使用0.32mg CPT/ml在pH 6.5、7或7.4的1x PBS中进行；使用BALB/c小鼠血浆、人血浆以及含3mg/ml低密度脂蛋白(LDL)或100单位/ml丁酰胆碱酯酶(BCHE) 或LDL与BCHE的组合的1x PBS(pH 7.4)。
将移取到96孔板中的培养基在37℃下在加湿恒温器中温育2h达到平衡。将制剂混合到相关培养基中并且放回到恒温器中。在预定时间点取出样品，并且在-80℃下迅速冷冻，直到用于分析的时间。对于BALB/c小鼠血浆和人血浆中的释放，在增湿恒温器中于37℃、5％CO2下进行温育以维持碳酸/碳酸氢盐缓冲体系，即在生理pH水平下血浆中的主要pH缓冲体系。
通过首先混合10μl样品与10μl 0.1N HCl并且在室温下温育30分钟测定未缀合的CPT的量。然后添加80μl甲醇，并且将混合物在室温下温育 3h用于蛋白质沉淀。将此混合物在4℃下以14,000g离心10分钟，用 0.45μm过滤器(Millex-LH)过滤上清液，用甲醇稀释20倍并且将10μl所得溶液注射到HPLC中。将(7.8分钟时)所洗脱CPT的峰面积与对照的峰面积进行比较。为测量CPT的总量，将10μl样品与6.5μl 0.1N NaOH相混合。将此溶液在室温下温育1h，以供CPT自母体聚合物释放。然后添加 10μl 0.1N HCl，以将羧酸酯CPT形式转化成内酯形式。随后添加73.5μl甲醇，并且将混合物在室温下温育3h。然后离心样品并且如上所述处理。根据总CPT浓度与未缀合的CPT浓度之间的差确定聚合物结合的CPT浓度。
CPT自短、中等以及长MAP-CPT纳米粒子以及自靶向的MAP-CPT纳米粒子的释放均表现出一级动力学。CPT自短、中等以及长MAP-CPT纳米粒子的释放半衰期在所有测试条件下均极为类似，而对于靶向的MAP- CPT观察到更长的半衰期(表4)。观察到释放速率对pH存在强依赖关系。随着pH从6.5增大至7.4，释放半衰期对于短、中等以及长MAP-CPT 纳米粒子从338h降低至58h。这些数据表明，水解在CPT释放中起重要作用。在BALB/c小鼠血浆中观察到59h的释放半衰期，而在人血浆中对于短、中等以及长MAP-CPT纳米粒子获得38h的显著更短半衰期。已知小鼠血浆含有比人血浆更大的酯酶活性，而人血浆含有比小鼠血浆更多的“脂肪”。因此，为了解人与小鼠血浆之间的释放速率差异，单独测试酯酶和脂肪对CPT释放速率的贡献。丁酰胆碱酯酶(BCHE)在小鼠和人血浆中均存在，并且用来测试酯酶对释放速率的贡献。选择低密度脂蛋白(LDL)来测试“脂肪”对释放速率的贡献。把这些组分溶解在PBS(pH 7.4)中，配成PBS溶液。发现BCHE的存在不影响释放速率(对于短、中等以及长 MAP-CPT纳米粒子，在PBS(pH 7.4)中半衰期为61h对比58h)。然而，添加LDL使释放速率急剧增大。可能是由于由竞争性疏水相互作用所致的纳米粒子破裂而产生此影响。因此，由“脂肪”存在所致的纳米粒子破裂以及随后由水解所致的CPT裂解似乎是CPT自MAP-CPT纳米粒子释放的另一主要机制。自
Figure GDA0003177262620000802
靶向的MAP-CPT纳米粒子的体外释放显示出比非靶向形式更长的半衰期。pI为9.2的
Figure GDA0003177262620000803
的存在有可能通过静电相互作用使带负电的纳米粒子的稳定性增大，并且因此保护纳米粒子免受一些竞争性疏水相互作用影响。
表4.在各种培养基中CPT自短、中等以及长MAP-CPT纳米粒子和自靶向的MAP-CPT 纳米粒子的体外释放半衰期(t1/2)
Figure GDA0003177262620000801
缩写：PBS：磷酸盐缓冲盐水；LDL：低密度脂蛋白；BCHE：丁酰胆碱酯酶。aPBS， pH7.4，含3mg/ml LDL。bPBS，pH 7.4，含100单位/ml BCHE。cPBS，pH 7.4，含 3mg/ml LDL和100单位/ml BCHE。
实例30：细胞毒性测定
在两种HER2+乳腺癌细胞系(BT-474,SKBR-3)和两种HER2-乳腺癌细胞系(MCF-7,MDA-MB-231)中评估中等MAP、硝基PBA-PEG、CPT、中等MAP-CPT纳米粒子、靶向的MAP-CPT纳米粒子以及
Figure GDA0003177262620000804
的体外细胞毒性(表5)。对于这些研究，细胞在37℃下保持在具有5％CO2的增湿恒温器中。分别在RPMI-1640培养基、达尔伯克氏改良伊格尔培养基、 McCoy5A改良培养基和达尔伯克氏改良伊格尔培养基(全部补充有10％胎牛血清)中温育BT-474、MCF-7、SKBR-3以及MDA-MB-231细胞系。按 3,000个细胞/孔接种96孔板。24小时后，移除培养基并且更换为新鲜培养基，所述新鲜培养基含有不同浓度的中等MAP、硝基PBA-PEG、CPT、中等MAP-CPT纳米粒子、靶向的MAP-CPT纳米粒子或
Figure GDA0003177262620000811
温育 72h后，用新鲜培养基更换制剂，并且每孔添加20μl CellTiter
Figure GDA0003177262620000812
细胞增殖测定用水性单溶液(普洛麦格公司(Promega))。将其在增湿恒温器中在 37℃、5％CO2下温育2小时，随后在490nm测量吸光度。含有未处理的细胞的孔用作对照。
中等MAP和硝基PBA-PEG分别给出高于500μM和1000μM(所测试最高浓度)的IC50值，指示最小毒性。CPT、中等MAP-CPT纳米粒子以及靶向的MAP-CPT纳米粒子的IC50浓度基于CPT的含量。应注意CPT是从中等MAP-CPT纳米粒子和靶向的MAP-CPT纳米粒子逐渐释放的(参见体外释放研究)。另外，细胞对纳米粒子的摄取导致释放时间长，这是由于内体的酸性本质。这些因素造成了与CPT相比，观察到的中等MAP-CPT 纳米粒子和靶向的MAP-CPT纳米粒子具有较高IC50值(表5)。在 HER2+细胞系中，与单独的MAP-CPT相比靶向的MAP-CPT纳米粒子给出较低IC50值，而在HER2-细胞系中，靶向不影响IC50。BT-474是对CPT并且因此对中等MAP-CPT纳米粒子抗性最大的细胞系。与未处理的对照相比，向BT-474或SKBR-3细胞添加浓度为0.001-0.5μM的Herceptin得到约 60％的恒定细胞存活力。先前已观察到对于这些细胞系缺少此浓度范围内的真实IC50值(Phillips,et al.,Cancer Res.68,9280-9290(2008)(Phillips等人，《癌症研究》，第68卷，第9280-9290页，2008年))。在高达 0.5μM的Herceptin浓度下，在HER2-细胞系中未观察到任何影响。
表5.对于一系列乳腺癌细胞系，中等MAP、硝基PBA-PEG、CPT、中等MAP-CPT纳米粒 子、靶向的MAP-CPT纳米粒子以及Herceptin的IC50值。
Figure GDA0003177262620000821
a没有值，在0.001-0.5μM浓度范围内未获得IC50值。
实例31：药代动力学研究
在雌性BALB/c小鼠中进行短、中等、长MAP-CPT纳米粒子以及靶向的MAP-CPT纳米粒子在10mg/kg(基于CPT)注射剂量下的血浆药代动力学研究(图18)。对于这些研究，经由尾部静脉弹丸式注射到12-16周龄雌性BALB/c小鼠中来施用配制在0.9重量％NaCl(非靶向的纳米粒子)或 PBS(靶向的MAP-CPT纳米粒子)中的纳米粒子。在预定时间点，经由隐静脉放血用采血管(Microvette CB 300EDTA，莎斯特公司(Sarstedt))收集血液。将样品立即在4℃下以10,000g离心15分钟，然后移除上清液并储存在-80℃下，直到用于分析的时间。对未缀合的和与聚合物结合的CPT的分析如下。通过首先混合10μl样品与10μl 0.1N HCl并且在室温下温育30 分钟测定未缀合的CPT的量。然后添加80μl甲醇，并且将混合物在室温下温育3h用于蛋白质沉淀。将此混合物在4℃下以14,000g离心10分钟，用 0.45μm过滤器(Millex-LH)过滤上清液，用甲醇稀释20倍并且将10μl所得溶液注射到HPLC中。将(7.8分钟时)所洗脱CPT的峰面积与对照的峰面积进行比较。为测量CPT的总量，将10μl样品与6.5μl0.1N NaOH相混合。将此溶液在室温下温育1h，以供CPT自母体聚合物释放。然后添加 10μl0.1N HCl，以将羧酸酯CPT形式转化成内酯形式。随后添加73.5μl甲醇，并且将混合物在室温下温育3h。然后离心样品并且如上所述处理。根据总CPT浓度与未缀合的CPT浓度之间的差确定聚合物结合的CPT浓度。由科罗拉多州蒙特罗斯县的顶峰研究服务公司(SummitResearch Services(Montrose,CO))提供的非室模拟软件PK解决方案2.0用于药代动力学数据分析。所有动物均根据美国国立卫生研究院动物护理指南(National Institute ofHealth Guidelines for Animal Care)来处理，并且经加州理工学院动物护理和使用委员会(California Institute of Technology Institutional Animal Care and UseCommittee)批准。
所有纳米粒子的聚合物结合的CPT均表现出两阶段特征，即快速再分布阶段(α)和长消除阶段(β)(图18A)。中等和长MAP-CPT纳米粒子的消除阶段是尤其长的，半衰期分别为16.6h和17.6h，并且分别给出高曲线下面积(AUC)值2298μg*h/ml和3636μg*h/ml。另外，它们还表现出低分布容量和清除速率。注射后24h，中等MAP-CPT纳米粒子的注射剂量的11.3％和长MAP-CPT纳米粒子的注射剂量的20.5％仍在血浆中作为聚合物结合的 CPT循环。相比之下，单独注射10mg/kg CPT的小鼠表现出快速清除， AUC仅为1.6μg*h/ml，并且8h后，注射剂量的0.01％留在循环中。中等 MAP-CPT纳米粒子的靶向通过增加再分布阶段并延长消除阶段至21.2h影响药动学特征，消除阶段具有2766μg*h/ml的高AUC值。对于所有纳米粒子，血浆中未结合CPT的量在所有时间点均为低的(图18B)。
实例32：在裸小鼠中测定最大耐受剂量(MTD)
在雌性NCr裸小鼠中测定MTD值并且将其定义为导致小于15％的体重损失并且没有处理相关死亡的最高剂量。在这些实验中，将12周龄雌性 NCr裸小鼠随机分成13组，每组包括5只小鼠。在第0天和第7天经由尾部静脉注射施用制剂：200mg/kg中等MAP或硝基PBA-PEG，10、15或 20mg/kg(基于CPT)短MAP-CPT纳米粒子，8、10或15mg/kg(基于 CPT)中等MAP-CPT纳米粒子，5、8或10mg/kg(基于CPT)长MAP- CPT纳米粒子以及8或10mg/kg(基于CPT)靶向的MAP-CPT纳米粒子。所有注射液均在0.9w/v％盐水中配制，不同的是在PBS(pH 7.4)中配制的靶向的MAP-CPT。在开始处理后，记录小鼠的体重和健康并且每日监控，持续2周。MTD定义为导致小于15％的体重损失并且没有处理相关死亡的最高剂量。当超出MTD标准或在研究结束时，通过CO2窒息使动物安乐死。
在第0天和第7天的两个每周剂量后，将用中等MAP、硝基PBA- PEG、短、中等以及长MAP-CPT和靶向的MAP-CPT处理的小鼠称重并且监控其健康(表6)。小鼠的体重和健康不受在高剂量的中等MAP或硝基PBA-PEG下处理的影响，指示这些聚合物组分的最小毒性。对于含有CPT 的组，最大体重损失出现在各处理的3至5天后。大多数组得回损失的体重。如果体重损失继续并且超过平均值15％，那么研究结束。用15mg/kg 中等MAP-CPT和10mg/kg长MAP-CPT处理的组中一些小鼠表现出腹泻并且表现虚弱。所有其他小鼠表现健康。对于短、中等、长MAP-CPT以及靶向的MAP-CPT，发现MTD值分别为20、10、8以及8mg/kg(基于CPT) (表6)。
表6.最大耐受剂量(MTD)研究的处理响应
Figure GDA0003177262620000841
a所有含MAP-CPT的组均基于mg CPT/kg。b最大体重损失百分比。c动物由于体重损失超过15％而被剔除。
实例33：裸小鼠中的生物分布
为评定生物分布，用17β-雌二醇团粒皮下移植小鼠(7周龄NCr裸小鼠)中的靶向的纳米粒子。2天后，将悬浮在RPMI-1640培养基中的BT- 474恶性肿瘤细胞以1×107个细胞/动物皮下注射到右前侧。在肿瘤达到 260mm3的平均尺寸1天后，开始处理。将动物随机分成两组，每组6只小鼠，并且经由尾部静脉注射5mg CPT/kg(在PBS中，pH 7.4)的MAP- CPT纳米粒子或5mg CPT/kg的靶向的MAP-CPT纳米粒子以及29mg
Figure GDA0003177262620000851
/kg(在PBS中，pH7.4)进行处理。4h和24h后，经由隐静脉放血从各组的三只动物收集血液。然后通过CO2窒息使动物安乐死，并且灌注PBS。收获肿瘤、肺、心脏、脾、肾以及肝脏并且切片成等同大小的两片。将一片包埋到
Figure GDA0003177262620000852
OCT(奥樱公司(Sakura))中，而另一片收集在Eppendorf管中，两者均立即冷冻在-80℃下，直到用于处理的时间。
将器官称重，并且将各100mg置于含有所添加的1/4英寸陶瓷球粒(俄亥俄州梭伦的MP生物医学公司(MP Biomedicals,Solon,Ohio))的裂解基质 A均质器管中。添加1mlRIPA裂解缓冲液(赛默科技公司(Thermo Scientific))，并且使用
Figure GDA0003177262620000853
-24均质器(俄亥俄州梭伦的MP生物医学公司(MP Biomedicals,Solon,Ohio))在6m/s下将组织均质化30s。将此举重复3次，每轮次之间有1分钟的冰上冷却。然后将样品在4℃下以 14,000g离心15分钟。通过首先混合10μl上清液与10μl 0.1N HCl并且在室温下孵育30分钟测定未缀合的CPT的量。然后添加80μl甲醇，并且将混合物在室温下孵育3h用于蛋白质沉淀。将此混合物在4℃下以14,000g离心10分钟，用0.45μm过滤器(Millex-LH)过滤上清液，并且将10μl所得混合物注射到HPLC中。将(7.8分钟时)所洗脱CPT的峰面积与对照的峰面积进行比较。为测量CPT的总量，将10μl样品与6.5μl 0.1N NaOH相混合。将此溶液在室温下温育1h，以供CPT自母体聚合物释放。然后添加 10μl 0.1N HCl，以将羧酸酯CPT形式转化成内酯形式。随后添加73.5μl甲醇，并且将混合物在室温下温育3h。然后离心样品并且如上所述处理。
每克肿瘤、心、肝、脾、肾以及肺的总CPT的平均注射剂量(ID)百分比示于图19A中。给药后4h，在用MAP-CPT纳米粒子和靶向的MAP-CPT 纳米粒子处理的小鼠中，每克肿瘤中分别存在5.3％和5.2％ID的总CPT。处理后24h，对于用MAP-CPT纳米粒子处理的小鼠，每克肿瘤残留2.6％ ID的总CPT，而对于接受靶向的MAP-CPT纳米粒子的小鼠，每克肿瘤发现3.2％ID的总CPT。这些数据显示，相对于非靶向形式，未靶向形式的基本上具有相同尺寸和表面电荷的靶向纳米粒子不会增大肿瘤定位，并且这与其他人报告的观察结果一致。用MAP-CPT纳米粒子和靶向的MAP- CPT纳米粒子处理的动物在心、肝、肾以及肺中给出相似CPT分布。然而，靶向的MAP-CPT与非靶向的MAP-CPT相比，在24h时在脾中存在相当显著量的总CPT积累。先前已观察到小鼠中人源化抗体的这种影响。
图19B示出肿瘤、心、肝、脾、肾以及肺各器官中，未缀合CPT的平均百分比。心、肝、脾、肾以及肺中未缀合CPT的百分比在4h和24h时是低的，指示游离CPT从这些器官快速清除。在肿瘤中在24h时，与在4h时相比，对于MAP-CPT纳米粒子和靶向的MAP-CPT纳米粒子存在显著较高百分比的未缀合CPT。游离CPT保留在肿瘤中表明CPT的细胞积累。在 4h和24h时，靶向的纳米粒子相较于非靶向的纳米粒子显示出在小鼠的肿瘤中略高的未缀合CPT的百分比。
血浆中CPT的总浓度和血浆中未缀合的总CPT的百分比对于MAP- CPT纳米粒子和靶向的MAP-CPT纳米粒子来说是相似的(图19C)。4h 后，对于MAP-CPT纳米粒子和靶向的MAP-CPT纳米粒子来说，分别有 17μg/ml和20μg/ml的总CPT残留在血浆中。24h后，血浆中残留的总CPT 的量对于MAP-CPT纳米粒子和靶向的MAP-CPT纳米粒子来说是相同的，为12μg/ml。所有条件下血浆中未缀合总CPT的百分比均低于3％，指示未缀合CPT从血浆的小释放和快速清除(图19D)。
实例33：用靶向的纳米粒子处理肿瘤
用MAP-CPT(5mg CPT/kg)或靶向的MAP-CPT(5mg CPT/kg，29mg Herceptin/kg)处理带有BT-474肿瘤的NCr裸小鼠。4h和24h后，使小鼠安乐死，取出肿瘤并使用冰冻切片机切片成20-30μm的厚度。将肿瘤切片放置在Superfrost Plus载玻片(新罕布什尔州汉普顿的飞世尔科技公司(Fisher Scientific,Hampton,NH))上，并且储存在-80℃下，直到用于处理的时间。将载玻片解冻，并且用10％福尔马林溶液将组织切片直接固定在载玻片上 15分钟。然后，用PBS将载玻片洗涤3次，每次5分钟，并且在5％山羊血清封闭缓冲液中封闭1h。CPT在440nm下天然发射荧光。为确定MAP 的位置，用大鼠抗PEG一抗将MAP内的PEG染色，所述抗体在14μg/ml 下识别内部PEG单元，并且在4℃下温育过夜。之后进行三次PBS洗涤，然后用2μg/ml Alexa
Figure GDA0003177262620000863
488山羊抗大鼠IgM二抗温育1h。然后将载玻片用PBS洗涤三次，并且用2μg/ml Alexa
Figure GDA0003177262620000861
633山羊抗人IgG二抗温育1h，以用于使
Figure GDA0003177262620000862
显影。将载玻片用PBS再洗涤三次，装入Prolong Gold抗淬灭试剂并且储存在4℃下，直至用于成像的时间。用蔡司 LSM 510Meta共聚焦显微镜(德国的卡尔蔡司公司(Carl Zeiss,German))使用63x Plan-Neofluar油物镜获得图像。使用在720nm下的2-光子激发(发射滤波器BP390-465nm)来检测CPT。分别使用在488nm(发射滤波器 LP 530)和633nm(发射滤波器BP645-700nm)下的激发来检测PEG和 Herceptin。在成像开始时设定所有激光和增益设置，并且保持不变。在蔡司lsm图像浏览器(Zeiss lsm image browser)上进行图像分析。
图20A示出4h后用MAP-CPT纳米粒子处理的小鼠的肿瘤切片。CPT 信号消散。在合并的图像中，CPT信号和MAP信号表现出共定位。注射后 24h，存在点状斑点形式的CPT信号积累(图20B)。所合并的图像表明 CPT和MAP共定位。对于用靶向的MAP-CPT纳米粒子处理的小鼠，处理 4h和24h后观察到指示CPT积累的斑点(图20C和图20D)。在所合并的图像中，CPT信号和MAP信号共定位。与非靶向形式中的弱背景信号相比，Herceptin通道中的强蓝色信号指示Herceptin在靶向的MAP-CPT纳米粒子中的存在。
实例33：在裸小鼠中进行的抗肿瘤功效研究
BT-474是对包括喜树碱在内的抗癌药物最具抗性的乳腺瘤之一。为促进裸小鼠中的肿瘤生长，在植入BT-474肿瘤细胞前2天，将17β-雌二醇团粒植入到7周龄NCr裸小鼠中。在第0天(植入后5天)，各组的肿瘤尺寸平均为250mm。处理从第1天开始。将动物随机分成9组，每组6至8 只小鼠，并且用1mg或8mg/kg MAP-CPT纳米粒子(基于CPT，在PBS 中，pH7.4)，或8mg/kg CPT(溶解在20％DMSO、20％PEG 400、30％乙醇以及30％10mM pH3.5磷酸中)、80mg/kg伊立替康(在5w/v％右旋糖溶液中，D5W)、2.9或5.9mg/kg
Figure GDA0003177262620000871
(在PBS中，pH 7.4)、 0.5mg CPT/kg靶向的MAP-CPT纳米粒子以及2.9mg
Figure GDA0003177262620000872
/kg或1mgCPT/kg和5.9mg
Figure GDA0003177262620000873
/kg(在PBS中，pH 7.4)或盐水进行处理。所有处理剂均新鲜制备并且经由尾部静脉注射给予。注射液标准化为 150μl/20g小鼠体重。含
Figure GDA0003177262620000874
的处理剂每周给予一次，持续2周，所有其他组均每周给予一次，持续3周。使用卡尺测量一周记录肿瘤尺寸 (长度×宽度2/2)三次，并且继续监控动物的健康。当肿瘤体积超过1000mm3时，使动物安乐死。开始处理6周后，通过CO2窒息使动物安乐死。此研究的结果呈现在图21和表7中。
施用盐水的对照组的肿瘤快速生长(图21)。28天后，8只小鼠中有 5只的肿瘤超过1000mm3的尺寸限制。此时使此组中的所有动物安乐死。
与对照组相比，用CPT(8mg/kg)处理的组未产生肿瘤抑制(P>0.05)。在第9天和第16天分别记录一起和三起处理相关死亡，以及在第28天由于超过肿瘤尺寸限制的四起安乐死。没有动物存活至研究结束。
与对照组相比，用80mg/kg伊立替康处理的小鼠表现出不显著的肿瘤抑制(P>0.05)。在第11天发生一起处理相关死亡。截至研究结束时，肿瘤尺寸达到平均575mm3。
与对照组相比，接受8mg CPT/kg MAP-CPT纳米粒子的动物表现出高度显著的肿瘤抑制(P<0.01)。截至研究结束时，平均肿瘤尺寸减小至 63mm3，并且所处理8只小鼠中的3只的肿瘤尺寸归零。虽然在使用以 8mg CPT/kg MAP-CPT处理的非肿瘤携带NCr裸小鼠的MTD研究中未发生死亡，但在这一研究中在第21天由于体重损失发生一起死亡。这可能是由于在这一研究中所增加的肿瘤负荷，和/或由于这一研究中所使用的小鼠是 7周龄，而在MTD研究中，使用的是12周龄小鼠。
与对照组相比，用5.9mg/kg
Figure GDA0003177262620000881
处理的动物表现出高度显著的肿瘤抑制(P<0.01)。在处理的第11天，所处理8只动物中的7只的肿瘤归零。然而，截至研究结束时，退行肿瘤中的两个复发，导致总计5只动物的肿瘤为零体积并且组平均肿瘤体积为60mm3(图22)。由于未观察到抗肿瘤影响，及早终止了用1mg CPT/kg MAP-CPT纳米粒子处理的小鼠。然而，当
5.9mg/kg的
Figure GDA0003177262620000882
被作为靶向剂经由硝基PBA-BA连接基添加到 1mg/kg的低CPT剂量的MAP-CPT纳米粒子(靶向的MAP-CPT纳米粒子为5.9mg
Figure GDA0003177262620000883
/kg和1mg CPT/kg)上时，在处理的第9天，所有肿瘤均归零，并且截至研究结束时保持为零(图22)。在第37天发生一起非处理相关死亡。与对照组相比，这一结果是高度显著的(P<0.01)。对于这三组观察到的结果的组合表明，通过添加
Figure GDA0003177262620000884
靶向剂，除了改善了
Figure GDA0003177262620000885
的内在活性外，还提高了MAP-CPT纳米粒子的功效。
用2.9mg/kg
Figure GDA0003177262620000891
处理动物使得两只动物的肿瘤在研究结束时归零。然而，平均肿瘤尺寸从研究开始时增大至278mm3。与对照组相比，这一结果是显著的(0.01≤P≤0.05)。当用含0.5mg CPT/kg和2.9mg
Figure GDA0003177262620000892
/kg的靶向的MAP-CPT纳米粒子处理动物时，两个肿瘤归零。截至研究结束时，平均肿瘤尺寸减小至141mm3。与对照组相比，这一结果是高度显著的(P<0.01)。这些结果进一步表明靶向在肿瘤抑制中的益处。
17β-雌二醇团粒植入后5周，观察到数只小鼠(而不管处理组)具有膀胱膨胀和腹部气胀。这可能是由于17β-雌二醇团粒的使用在无胸腺裸小鼠中引起肾盂积水和尿潴留。处理6周后，情况变差并且观察到更多小鼠患有膀胱膨胀和腹部气胀，因此使动物安乐死并且终止实验。
表7.带有BT-474异种移植肿瘤的NCr裸小鼠中的抗肿瘤功效研究
Figure GDA0003177262620000893
aN开始为研究开始时动物的数量，N结束为存活至研究结束时动物的数量。bN处理为处理相关死亡的数量，N非处理为非处理相关死亡的数量，N安乐死为由于超过肿瘤尺寸限制 1000mm3而安乐死的动物数量。cN退行至零为研究结束时肿瘤退行至零的动物的数量。
提供以上阐述的实例来向本领域普通技术人员给出如何制得和使用本公开的粒子、组合物、系统以及方法的实施例的完整公开和说明，并且不旨在限制本发明人视为其公开内容的范围。本领域技术人员显而易见地想到的对上文所描述的本发明实施方式的修改，也视为落入以下权利要求书的范围内。说明书中提及的所有专利和公布均指示本发明所属领域技术人员的技术水平。本发明中引用的所有参考文献均以引用方式并入，就如同单独地已将每个参考文献全文以引用方式并入。
背景技术、发明内容、具体实施方式和实例中所引用的每篇文献(包括专利、专利申请、期刊论文、摘要、实验室手册、书籍或其他公开内容)的全部公开内容均据此以引用的方式并入本文。
应当理解本发明不限于具体组合物或生物学系统，其当然可以有所差别。还应当理解，本文所使用的术语是仅出于描述具体实施例的目的，并不意在进行限制。如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括多个指代物，除非内容明确指明并非如此。术语“多个”包括两个或更多个指代物，除非内容明确指明并非如此。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
虽然任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料均可在实践中使用以供测试具体例子，但本文描述了适当的方法和材料。
已描述了本发明的多个实施例。然而，应理解可在不背离本发明的精神和范围的情况下作出各种修改。因此，其他实施例均在以下权利要求书的范围内。
序列表
<110> 马克·E·戴维斯
寒·韩
<120> 用硝基苯硼酸组合物稳定的纳米粒子
<130> CTEK-0116
<140> PCT/US2013/028681
<141> 2013-03-01
<160> 4
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> 脱氧胸腺嘧啶核苷
<400> 1
gugccagagu ccuucgauat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<220>
<223> 组合DNA/RNA分子的描述：合成寡核苷酸
<220>
<221> modified_base
<222> (20)..(21)
<223> 脱氧胸腺嘧啶核苷
<400> 2
uaucgaagga cucuggcact t 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 3
uagcgacuaa acacaucaau u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成寡核苷酸
<400> 4
uugauguguu uagucgcuau u 21

Claims (43)

1.一种纳米粒子，所述纳米粒子包括含多元醇的聚合物和含硝基苯硼酸的聚合物，其中所述含硝基苯硼酸的聚合物通过所述含硝基苯硼酸的聚合物的硝基苯硼酸部分和所述含多元醇的聚合物的至少一对邻位二醇之间的硼酸酯缩合键可逆地偶联至所述含多元醇的聚合物；
其中所述含多元醇的聚合物包含以下式的结构单元：
Figure FDA0003144032500000011
其中n是1-20；并且
其中所述含硝基苯硼酸的聚合物为：
Figure FDA0003144032500000012
其中
t为在从2至2000的范围内的数值；
L为苯环和聚环氧乙烷键之间的连接基团，所述连接基团包括酰胺、碳酸酯、酯或二硫化物基团；并且
X5为任选地被官能团2取代的C1-6烷基，所述官能团2包括-B(OH)2、–OCH3、-COOH、-NH2或–OH基团。
2.如权利要求1所述的纳米粒子，其中所述含多元醇的聚合物包含下式的单元：
Figure FDA0003144032500000021
其中n为1且p为1。
3.如权利要求1所述的纳米粒子，其中所述含多元醇的聚合物包含下式的单元：
Figure FDA0003144032500000022
其中n为1且p为1。
4.如权利要求1所述的纳米粒子，其中所述含多元醇的聚合物包含下式的单元：
Figure FDA0003144032500000023
其中p为1。
5.如权利要求1所述的纳米粒子，其中所述含硝基苯硼酸的聚合物为：
Figure FDA0003144032500000024
Figure FDA0003144032500000031
其中
t为从2至2000的数值；
X1为-NH-C(＝O)-、-S-S-、-C(＝O)-NH-、-O-C(＝O)-或-C(＝O)-O-；并且
官能团2包括-B(OH)2、-OCH3、-COOH、-NH2或-OH基团。
6.如权利要求1至5中任一项所述的纳米粒子，还包括至少一个靶向配体。
7.如权利要求6所述的纳米粒子，其中所述靶向配体中的至少一个为蛋白质或小分子。
8.如权利要求6所述的纳米粒子，其中所述靶向配体中的至少一个为抗体或抗体片段。
9.如权利要求6所述的纳米粒子，其中所述靶向配体中的至少一个为适配体。
10.如权利要求6所述的纳米粒子，其中所述靶向配体中的至少一个为转铁蛋白。
11.如权利要求6所述的纳米粒子，其中所述靶向配体中的至少一个是一个单一抗体。
12.如权利要求11所述的纳米粒子，其中所述一个单一抗体缀合至所述含硝基苯硼酸的聚合物的末端部分。
13.如权利要求1至5和7至10中任一项所述的纳米粒子，还包括至少一种治疗剂。
14.如权利要求6所述的纳米粒子，还包括至少一种治疗剂。
15.如权利要求13所述的纳米粒子，其中所述治疗剂中的至少一种是小分子化疗剂或多核苷酸。
16.如权利要求14所述的纳米粒子，其中所述治疗剂中的至少一种是小分子化疗剂或多核苷酸。
17.如权利要求15或16所述的纳米粒子，其中所述多核苷酸是干扰RNA。
18.如权利要求13所述的纳米粒子，其中所述治疗剂中的一种或更多种为化疗剂。
19.如权利要求14所述的纳米粒子，其中所述治疗剂中的一种或更多种为化疗剂。
20.如权利要求18或19所述的纳米粒子，其中所述化疗剂中的至少一种为蛋白质。
21.如权利要求18或19所述的纳米粒子，其中所述化疗剂中的至少一种为人IgG1抗体。
22.如权利要求18或19所述的纳米粒子，其中所述化疗剂中的至少一种为单克隆抗体。
23.如权利要求18或19所述的纳米粒子，其中所述化疗剂中的至少一种为Herceptin。
24.如权利要求15或16所述的纳米粒子，其中所述小分子化疗剂是喜树碱、埃博霉素、紫杉烷或其任何组合。
25.如权利要求18或19所述的纳米粒子，其中所述治疗剂中的至少一种为喜树碱。
26.一种组合物，所述组合物包含多于一种如权利要求1所述的纳米粒子以及合适媒介物和/或赋形剂，其中所述纳米粒子各自还包括：
(a)至少一个靶向配体；
(b)一种或更多种治疗剂，所述治疗剂中的至少一种为化疗剂；或
(c)所述至少一个靶向配体和所述一种或更多种治疗剂两者，所述治疗剂中的至少一种为化疗剂。
27.如权利要求26所述的组合物，包含至少一个靶向配体，所述至少一个靶向配体为蛋白质或小分子。
28.如权利要求26所述的组合物，包含至少一个靶向配体，所述至少一个靶向配体为抗体或抗体片段。
29.如权利要求26所述的组合物，包含至少一个靶向配体，所述至少一个靶向配体为适配体。
30.如权利要求26所述的组合物，包含至少一个靶向配体，所述至少一个靶向配体为转铁蛋白。
31.如权利要求26所述的组合物，包含至少一个靶向配体，所述至少一个靶向配体是一个单一抗体。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述一个单一抗体缀合至所述含硝基苯硼酸的聚合物的末端部分。
33.如权利要求26所述的组合物，其中至少一种化疗剂为蛋白质。
34.如权利要求26所述的组合物，其中至少一种化疗剂为人IgG1抗体。
35.如权利要求26所述的组合物，其中至少一种化疗剂为单克隆抗体。
36.如权利要求26所述的组合物，其中至少一种化疗剂为Herceptin。
37.如权利要求26所述的组合物，其中至少一种化疗剂为喜树碱、埃博霉素、紫杉烷或其任何组合。
38.如权利要求26所述的组合物，其中至少一种化疗剂为喜树碱。
39.如权利要求26所述的组合物，其中所述至少一个靶向配体为转铁蛋白且至少一种化疗剂为Herceptin。
40.如权利要求26所述的组合物，其中所述至少一个靶向配体为转铁蛋白且至少一种化疗剂为喜树碱。
41.如权利要求26所述的组合物，其中所述组合物为药物组合物，并且所述合适媒介物和/或赋形剂为药学上可接受的媒介物和/或赋形剂。
42.如权利要求26至41中任一项所述的组合物在制备用于治疗具有疾病病症且需要用至少一种治疗剂进行治疗的患者的药物中的用途，其中当所述药物被使用时，所述组合物被给予至所述患者。
43.如权利要求42所述的用途，其中所述疾病病症为癌症。
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