CN113905786A - 复合物、药物、癌症治疗剂、试剂盒和缀合物 - Google Patents

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Abstract

一种复合物，其包含缀合物和与所述缀合物复合的物质，所述缀合物由具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物连接得到。

Description

复合物、药物、癌症治疗剂、试剂盒和缀合物
技术领域
本发明涉及一种复合物、药物、癌症治疗剂、试剂盒和缀合物。
本申请基于2019年5月29日在日本提出申请的特愿2019-100395号主张优先权，并将其内容引用到本文中。
背景技术
生物药品等生理活性蛋白质被高度期待作为针对以癌症为首的疑难杂症的划时代治疗药。然而，由于尺寸小于肾小球滤过阈值的蛋白质会被迅速地排出体外，所以血中滞留性有所不足，且由于在血液中会遭受酶降解，所以血中稳定性也未必足够，实际情况是并没有获得预期的药理效应。进而，为了将生理活性蛋白质应用于癌症治疗，有时需要具有对于肿瘤的选择蓄积性。
为了提高血中滞留性及血中稳定性，临床应用经作为生物相容性高分子的聚乙二醇(PEG)化学修饰的PEG修饰蛋白质，并获得了一定效果，但也有担心因PEG修饰而导致药理活性降低的情况。
另外，根据非专利文献1，示出了以下技术：使用作为生理活性蛋白质的抗体，用带负电的pH响应分子修饰抗体所具有的氨基后，与带正电的高分子化合物形成聚离子复合物(PIC)。据此，认为pH响应分子会在细胞内pH下解离，而导致PIC崩解，由此能够在细胞内特异性地释放抗体。
另一方面，还已知在不对蛋白质进行化学修饰的情况下与其它分子形成复合物的方法。
在非专利文献2中示出了使引入儿茶酚结构的高分子包封蛋白质的技术。作为具有儿茶酚结构的分子，例如已知有鞣酸。
已知鞣酸能通过疏水性相互作用及氢键而与蛋白质结合，形成复合物(非专利文献3～4)。通过鞣酸与蛋白质等的结合，能够不利用化学修饰而形成复合物。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：“Intracellular Delivery of Charge-Converted MonoclonalAntibodies by Combinatorial Design of Block/Homo Polyion Complex Micelles”,A.Kim,Y.Miura,T.Ishii,O.F.Mutaf,N.Nishiyama,H.Cabral,and K.Kataoka,Biomacromolecules,17(2),446-453(2016)。
非专利文献2：“Self-assembled micellar nanocomplexes comprising greentea catechin derivatives and protein drugs for cancer therapy”,J.E.Chung,S.Tan,S.J.Gao,N.Yongvongsoontorn,S.H.Kim,J.H.Lee,H.S.Choi,H.Yano,L.Zhuo,M.Kurisawa,and J.Y.Ying,Nat.Nanotech.9(11),907-912(2014)。
非专利文献3：“Formation of complexes between protein and tannic acid”J.P.Van Buren,and W.B.Robinson,J.Agric.Food Chem.17(4),772-777(1969)。
非专利文献4：“Gallic acid:Molecular rival of cancer”V.Sharad,S.Amit,and M.Abha,Env.Tox.and pharm.35(3),473-485(2013)。
发明内容
发明要解决的问题
然而，在非专利文献1的方法中，由于对抗体进行化学修饰，所以担心与PEG修饰同样地，抗体的药理活性降低。
另外，并没有报告通过非专利文献2～4中所示的蛋白质的复合物化，使得蛋白质的血中滞留性及血中稳定性提高，或发挥出肿瘤蓄积性。
本发明是为了解决上述问题而作出的，其目的在于提供一种血中滞留性优异，进而具有pH响应的复合物。
解决问题的手段
即，本发明具有以下实施方式。
＜1＞一种复合物，其包含缀合物和与所述缀合物复合的物质，所述缀合物由具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物连接得到。
＜2＞根据前述＜1＞所述的复合物，其中与所述缀合物复合的物质选自蛋白质、病毒、无机粒子、核酸和低分子药物中的至少一种。
＜3＞根据前述＜1＞或＜2＞所述的复合物，其包含缀合物和蛋白质，所述缀合物由具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物连接得到。
＜4＞根据前述＜1＞至＜3＞中任一项所述的复合物，其中所述具有二醇结构的化合物为多酚。
＜5＞根据前述＜1＞至＜4＞中任一项所述的复合物，其中所述具有二醇结构的化合物选自鞣酸、没食子酸和这些的衍生物中的至少一种。
＜6＞根据前述＜1＞至＜5＞中任一项所述的复合物，其中所述高分子具有2个以上的硼酸基。
＜7＞根据前述＜1＞至＜6＞中任一项所述的复合物，其中所述硼酸基是可具有取代基的苯硼酸基，或可具有取代基的吡啶硼酸基。
＜8＞根据前述＜1＞至＜7＞中任一项所述的复合物，其中所述硼酸基是下述通式(I)所示的苯硼酸基，或下述通式(II)所示的吡啶硼酸基：
[化1]
Figure BDA0003371915900000031
(式中，X表示卤素原子或硝基，na是0～4的整数。)。
＜9＞根据前述＜1＞至＜8＞中任一项所述的复合物，其中所述高分子为选自聚乙二醇、丙烯酸类树脂、聚氨基酸、聚乙烯胺、聚烯丙胺、多核苷酸、聚丙烯酰胺、聚醚、聚酯、聚氨基甲酸酯、多糖类、和这些的共聚物中的至少一种生物相容性高分子。
＜10＞根据前述＜1＞至＜9＞中任一项所述的复合物，其中所述具有硼酸基的高分子包含第1生物相容性高分子链和与所述第1生物相容性高分子链不同的第2生物相容性高分子链。
＜11＞根据前述＜10＞所述的复合物，其中所述第2生物相容性高分子链是聚氨基酸，所述硼酸基被引入到所述聚氨基酸的侧链。
＜12＞根据前述＜10＞或＜11＞所述的复合物，其中所述第1生物相容性高分子链是聚乙二醇。
＜13＞根据前述＜10＞至＜12＞中任一项所述的复合物，其中所述具有硼酸基的高分子包含下述通式(1)或(1-1)所示的结构：
[化2]
Figure BDA0003371915900000032
(式(1)～(1-1)中，
A表示所述第1生物相容性高分子链，
L表示连接子部分，
B表示具有硼酸基的所述第2生物相容性高分子链，其包含下述(b2)所示的重复结构，或者(b1)所示的重复结构和(b2)所示的重复结构。。)
[化3]
Figure BDA0003371915900000033
(式(b1)～(b2)中，
R1表示氨基酸侧链，
R2是在氨基酸侧链引入所述硼酸基的侧链，
n表示(b1)和(b2)的总数，n是1～1000的整数，m是1～1000的整数(其中m≤n)，当n-m是2以上时，多个R1彼此可以相同或不同，当m是2以上时，多个R2彼此可以相同或不同。)。
＜14＞根据前述＜1＞至＜13＞中任一项所述的复合物，其中通过动态光散射法(DLS)或荧光相关光谱法(FCS)所求出的平均粒径为5nm以上200nm以下。
＜15＞根据前述＜1＞至＜14＞中任一项所述的复合物，其中所述具有硼酸基的高分子的数均分子量为2,000～200,000。
＜16＞一种药物，其含有根据前述＜1＞至＜15＞中任一项所述的复合物作为有效成分。
＜17＞一种癌症治疗剂，其含有根据前述＜1＞至＜16＞中任一项所述的复合物作为有效成分。
＜18＞一种试剂盒，其具备具有硼酸基的高分子和具有二醇结构的化合物。
＜19＞一种缀合物，其由具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物连接得到。
发明的效果
根据本发明，可提供一种血中滞留性优异，进而具有pH响应的复合物。
附图说明
图1是表示实施方式的复合物的概略性构成的一例的示意图。
图2是表示实施方式的复合物在体内的构成的一例的示意图。
图3是实施例中制备的PEG-PLys(TFA)20的GPC曲线。
图4是实施例中制备的PEG-PLys(TFA)40的GPC曲线。
图5是实施例中制备的PEG-PLys20的1HNMR谱。
图6是实施例中制备的PEG-PLys40的1HNMR谱。
图7是实施例中制备的PEG-P[Lys(FPBA)10]20的1HNMR谱。
图8是实施例中制备的PEG-P[Lys(FPBA)20]40的1HNMR谱。
图9是PEG-P[Lys(FPBA)10]20的GPC曲线。
图10是PEG-P[Lys(FPBA)20]40的GPC曲线。
图11是PEG-FPBA的1HNMR谱。
图12是PEG-FPBA的GPC曲线。
图13是PEG-P[Lys(FPBA10/Cy5)]20的FP谱。
图14是引入GFP、GFP/TA、GFP/TA/硼酸的高分子的粒径测定结果。
图15是GFP、GFP/TA、GFP/PEG-P[Lys(FPBA)10]20、GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20的粒径测定结果。
图16是葡萄糖溶液中的GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20的粒径测定结果。
图17是FBS溶液中的GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20的粒径测定结果。
图18是各种pH下的GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20的粒径测定结果。
图19是表示GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20的细胞内分布的共聚焦显微镜的观察图像。
图20是表示在CT26皮下肿瘤模型小鼠中，对GFP、GFP/TA和GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20的血中滞留性进行比较所得的结果的图。
图21是表示在CT26皮下肿瘤模型小鼠中，对GFP、GFP/TA和GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20的肿瘤蓄积性进行比较所得的结果的图。
图22是在模型小鼠中，对孟加拉玫瑰红、孟加拉玫瑰红/TA复合物和孟加拉玫瑰红三元系复合物的血中滞留性进行比较所得的结果。
图23A是表示通过吸光度测定获得的TA溶液和TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液的氧化的经时变化的结果。
图23B是将TA溶液与TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液培养24小时后的照片。
图23C是表示根据粒径和荧光强度的测定获得的显示GFP三元系复合物在溶液中的稳定性的结果。
图24是在ATP溶液中的GFP三元系复合物的粒径测定结果。
图25A是使用GlycoGREEN-βGal测定βGal、βGal/TA复合物和βGal三元系复合物的经时活性变化所得的结果。
图25B是使用GlycoGREEN-βGal测定βGal、βGal/TA复合物和βGal三元系复合物的最大活性值所得的结果。
图26A是测定Alexa647-βGal、Alexa647-βGal/TA复合物和Alexa647-βGal三元系复合物摄入到CT26细胞的摄入量所得的结果。
图26B是使用GlycoGREEN-βGal测定βGal、βGal/TA复合物和βGal三元系复合物在CT26细胞内的活性所得的结果。
图26C是表示用使用GlycoGREEN-βGal获得的βGal、βGal/TA复合物和βGal三元系复合物在CT26细胞内的活性除以摄入量所得的结果的图。
图27是表示在CT26皮下肿瘤模型小鼠中，对Alexa647-βGal和Alexa647-βGal三元系复合物的血中滞留性和在各器官中的蓄积性进行比较所得的结果的图。
图28是对AAV、AAV/TA复合物和AAV三元系复合物在CT26细胞中的基因表达效率进行评价所得的结果。
图29是表示在CT26皮下肿瘤模型小鼠中，将AAV单体时的基因表达量设为1的情形时，AAV、AAV/TA复合物和AAV三元系复合物在各器官中的基因表达量的结果的图。
图30A是在CT26皮下肿瘤模型小鼠中，测定给予AAV、AAV/TA复合物或AAV三元系复合物时的血中的ALT量所得的结果。
图30B是在CT26皮下肿瘤模型小鼠中，测定给予AAV、AAV/TA复合物或AAV三元系复合物时的血中的AST量所得的结果。
图31是对由添加AAV抗体导致的AAV、AAV/TA复合物或AAV三元系复合物在CT26细胞中的基因表达效率的变化进行评价所得的结果。
图32是在模型小鼠中利用体内共聚焦激光显微镜，经时对TUG1、TUG1/TA复合物和TUG1三元系复合物的血中滞留性进行比较所得的结果。。
附图标记说明
1…复合物，2…具有硼酸基的高分子，3…具有二醇结构的化合物，40…与缀合物复合的物质(复合要素)，4…蛋白质，10…缀合物。
具体实施方式
以下，对本发明的一种实施方式中的复合物、药物、癌症治疗剂、试剂盒和缀合物进行说明。
《复合物》
实施方式的复合物可以包含缀合物和与所述缀合物复合的物质(以下，有时称为“复合要素”)，所述缀合物由具有硼酸基的高分子和具有二醇结构的化合物连接得到；所述高分子可以是生物相容性高分子。
实施方式的复合物包含缀合物和与所述缀合物复合的物质，所述缀合物由具有硼酸基的生物相容性高分子与具有二醇结构的化合物连接得到。。
图1是表示实施方式的复合物的概略性构成的一例的示意图。实施方式的复合物1包含缀合物10和与缀合物10复合的物质40。
作为与缀合物10复合的物质，可例举选自蛋白质、病毒、无机粒子、核酸和低分子药物中的至少一种。
当与缀合物复合的物质是蛋白质时，作为复合物的一个实施方式可以举出蛋白质复合物。
实施方式的蛋白质复合物可以包含缀合物和蛋白质，所述缀合物由具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物连接得到。在本说明书中“二醇结构”是指2个羟基分别与不同的碳原子键合的结构，可以是2个羟基分别与相邻的碳原子键合的结构。具有二醇结构的化合物并不限定于脂肪族化合物。
图1中，当与缀合物10复合的物质40是蛋白质4时，实施方式的蛋白质复合物1包含缀合物10和蛋白质4。
缀合物10是由具有硼酸基的高分子2与具有二醇结构的化合物3连接得到的。例如，下述式(10a)所示的二醇结构与下述式(10b)所示的硼酸基能够形成下述式(10c)所示的硼酸二醇连接。也就是说，实施方式的复合物1中的缀合物10可以是具有硼酸基的高分子2与具有二醇结构的化合物3形成硼酸二醇连接后所得的缀合物。
[化4]
Figure BDA0003371915900000061
具有二醇结构的化合物3能够与具有硼酸基的高分子2形成缀合物10，同时，如图1所示，也与蛋白质4等复合要素40结合而形成复合物。认为具有二醇结构的化合物3与蛋白质4(复合要素40)可以通过疏水性相互作用和/或氢键来结合，即便不对蛋白质4(复合要素40)实施化学修饰，也能够实现制成复合物。也就是说，蛋白质4(复合要素40)经由具有二醇结构的化合物3(即，经由缀合物10的来自具有二醇结构的化合物3的部分)附加上具有硼酸基的高分子2的形式。因此，对于实施方式的复合物1来说，不对蛋白质等复合要素实施化学修饰便能够与缀合物10形成复合物。
根据上述说明的复合物的形成方式，实施方式的复合物可以采用如下形式：以蛋白质等复合要素作为核心，在其周围像壳一样配置有缀合物。更详细来说，可以采用如下形态：以蛋白质等复合要素作为核心，在其周围配置有缀合物的一部分即来自具有二醇结构的化合物的部分，进而在其外侧配置有高分子的部分。因此，复合要素被缀合物包封而受到保护，所以可抑制蛋白质等复合要素参与非预期的生物反应。作为非预期的生物反应的例子，例如免疫反应。
关于具有二醇结构的化合物所具有的性质，有易与蛋白质等发生相互作用的性质，在非专利文献2～4所示的现有技术中，具有二醇结构的化合物可能导致在生物体内产生的非预期的相互作用。另一方面，由于实施方式的复合物可采用在来自具有二醇结构的化合物的部分的外侧配置有高分子的部分的形态，所以认为与现有技术相比，可抑制生物体内的非预期的相互作用，且与直接使用具有二醇结构的化合物的情况相比，物质递送的稳定性较为优异。
此外，在实施方式的复合物1中，具有硼酸基的高分子2与具有二醇结构的化合物3结合而形成硼酸二醇连接，因此复合物1也可以不包含硼酸基和二醇结构。
该硼酸二醇连接可以是可逆共价键。由于上述硼酸基与二醇结构的连接根据pH条件是可逆的，所以通过转移到低pH条件下，硼酸二醇连接会发生解离而再次成为二醇结构(10a)与硼酸基(10b)。
图2是表示实施方式的复合物在体内的构成的一例的示意图。一般来说，血液中的pH在7.4左右，细胞内的(特别是内体、溶酶体等酸性细胞器内的)pH在5.5左右。例如，关于实施方式的复合物1，在血液中(pH约7.4)，缀合物10与蛋白质4(复合要素40)可以复合物化，而提高血中滞留性、血中稳定性，在细胞内(pH约5.5)或肿瘤周边(pH约6.6)，硼酸二醇连接会发生解离，由此导致具有硼酸基的高分子2脱离，蛋白质4(复合要素40)被释放，而可成为容易发挥蛋白质4(复合要素40)原本功能的状态。
另外，已知多酚类等具有二醇结构的化合物3在细胞内会从蛋白质4解离。
如此，实施方式的复合物可具有pH响应。在本说明书中，复合物的pH响应是指构成复合物的缀合物的具有二醇结构的化合物3与具有硼酸基的高分子2的连接根据周围的pH环境而发生解离的性质。所述pH响应也可以是如下性质：随着pH变低，构成复合物的缀合物的具有二醇结构的化合物3与具有硼酸基的高分子2的连接发生解离。
实施方式的复合物可具有ATP响应。本说明书中，复合物可具有的ATP响应是指随着周围的ATP浓度变高，构成复合物的缀合物10的具有二醇结构的化合物3与具有硼酸基的高分子2的连接发生解离的性质。
由于复合物具有ATP响应，所以如果在血液中(pH约7.4)，那么缀合物10与蛋白质4(复合要素40)可以复合物化，而提高血中滞留性、血中稳定性，如果在细胞质内，那么硼酸二醇连接会发生解离，由此导致具有硼酸基的高分子2脱离，蛋白质4(复合要素40)被释放，而可成为容易发挥蛋白质4(复合要素40)原本功能的状态。
关于上述连接和其解离，例如可通过茜素红法进行测定。关于茜素红法，可使用下述实施例中所示的方法。
或者，关于上述连接和其解离，例如，如实施例中所记载，在不同pH环境下对复合物粒子(也包括复合物的一部分或全部的构成要素发生解离的情况)的粒径进行测定，如果在比某一pH条件更低的pH条件下确认粒子尺寸变小，那么可以判断，在如此更低的pH条件下，缀合物的具有二醇结构的化合物3与具有硼酸基的高分子2的连接发生解离，复合物具有pH响应。
粒径的确认可利用公知的方法来进行，例如可使用实施例中记载的荧光相关光谱法、动态光散射法。
此外，本说明书中通过荧光相关光谱法所求出的粒径是使用爱因斯坦-斯托克斯方程所求出的粒径的个数基准的算术平均直径。
此外，本说明书中通过动态光散射法所求出的粒径是使用爱因斯坦-斯托克斯方程所求出的粒径的个数基准的算术平均直径。
上述解离无需存在于pH环境下的所有实施方式的复合物均发生。复合物是否具有pH响应，例如可基于对多个复合物进行分析所得的值(例如平均值)进行判断。
基于将复合要素有效地递送到生物体内靶部位的观点，实施方式的复合物优选具有如下pH响应：例如在pH7.4时复合要素与缀合物会形成复合物，例如在小于pH7.4、pH6.6以下、pH5.5以下等时，上述具有二醇结构的化合物3与具有硼酸基的高分子2的连接会发生解离。
基于将蛋白质有效地递送到生物体内靶部位的观点，实施方式的复合物优选具有如下pH响应：例如在pH7.4时蛋白质与缀合物会形成复合物，例如在小于pH7.4、pH6.6以下、pH5.5以下等时，上述具有二醇结构的化合物3与具有硼酸基的高分子2的连接会发生解离。
实施方式的复合物优选具有如下pH响应：例如在小于pH7.4、pH6.6以下、pH5.5以下等时，与比这些pH更高的pH条件(例如pH7.4)相比可确认粒子尺寸降低。
如上所述，血液中的pH环境已知约为pH7.4，肿瘤周边的pH环境已知约为pH6.6，细胞内的pH环境已知约为pH5.5。
关于具有与pH7.4以上时相比，在小于pH7.4时可确认粒子尺寸降低的pH响应的实施方式的复合物，由于在血液中会形成复合物而使得血中滞留性和血中稳定性优异，且在肿瘤周边或细胞内等蛋白质等复合要素的递送目标部位，复合物会发生解离而释放蛋白质等，所以在递送目标部位可以更有效地发挥蛋白质等的原本功能。
关于具有与pH7.4以上时相比，在pH6.6以下时可确认粒子尺寸降低的pH响应的实施方式的复合物，由于在血液中会形成复合物而使得血中滞留性和血中稳定性优异，且在肿瘤周辺和细胞内，复合物会发生解离而释放蛋白质等复合要素，所以在肿瘤周边和细胞内可以更有效地发挥蛋白质等复合要素的原本功能。
关于具有与pH7.4以上时相比，在pH5.5以下时可确认粒子尺寸降低的pH响应的实施方式的复合物，由于在血液中会形成复合物而使得血中滞留性和血中稳定性优异，且在细胞内复合物会发生解离而释放蛋白质等复合要素，所以在细胞内可以更有效地发挥蛋白质等复合要素的原本功能。
此外，虽然对与实施方式的复合物的pH响应相关的pH如上述进行了例示，但由于与pH响应相关的硼酸基的pKa能够通过改变硼酸基所连接的结构等来适当调整，所以与实施方式的复合物的pH响应相关的pH并不限定在上述例示的pH。
另外，缀合物的具有二醇结构的化合物3与具有硼酸基的高分子2的连接和解离或上述粒径的确认并不限定在下述实施例中所示的条件下的测定，可根据使用实施方式的复合物的环境来适当决定。即便在某些条件下没有确认上述解离，也建议长时间进行测定，或在更接近使用环境和递送环境的条件下进行确认。
另外，在递送环境下的pH响应的程度(例如复合物粒子尺寸的降低率的程度)能够通过调整与pH响应相关的硼酸基的pKa而任意地调整。另外，即便在递送环境下的pH响应的程度(例如复合物粒子尺寸的降低率的程度)不足，也不否认本发明实施方式的复合物的有用性。反倒是这种复合物被认为能够发挥蛋白质等复合要素的缓释性，有可能适宜用于长期的物质递送。
实施方式的复合物的平均粒径例如优选5nm以上200nm以下，更优选10nm以上150nm以下，进而优选15nm以上100nm以下。复合物的粒径可通过动态光散射法(DLS)或荧光相关光谱法(FCS)，根据下述实施例中记载的测定条件来进行测定。
通过使实施方式的复合物的粒径为上述范围，能适度提高复合物的血中滞留性、对于肿瘤组织的蓄积性，另外，能防止向肝脏等正常组织蓄积。其结果是能够将蛋白质等复合要素高效地递送到肿瘤组织。
关于复合物的肿瘤蓄积性，被认为是通过利用肿瘤的血管渗透增强有选择地蓄积到肿瘤，即通过高渗透长滞留效应(EPR效应)而得到发挥，通过有选择地递送到肿瘤，而达到更优异的抗肿瘤效果。
实施方式的复合物中所包含的缀合物10与复合要素40的比率没有特别限制，例如复合要素每1个分子，可与1个以上的缀合物复合物化，也可与2个以上的缀合物复合物化，也可与5个以上的缀合物复合物化，也可与1～100个缀合物复合物化，也可与2～50个缀合物复合物化，也可与5～20个缀合物复合物化。
当实施方式的复合物包含蛋白质时，复合物所包含的缀合物10与蛋白质4的比率没有特别限制，例如蛋白质每1个分子，可与1个以上的缀合物复合物化，也可与2个以上的缀合物复合物化，也可与5个以上的缀合物复合物化，也可与1～100个缀合物复合物化，也可与2～50个缀合物复合物化，也可与5～20个缀合物复合物化。
以下，对实施方式的复合物所包含的各要素的详情进行说明。。
(具有二醇结构的化合物)
本发明实施方式的具有二醇结构的化合物3与具有硼酸基的高分子形成缀合物，并且与蛋白质等复合要素形成复合物，也就是作为两者间的介体而有助于形成复合物。
本发明实施方式的具有二醇结构的化合物只要在分子内具有1个以上的二醇结构即可，没有特别限制，基于连接稳定性的观点，优选在分子内具有1个以上的儿茶酚结构和/或没食子酰基结构。当该化合物具有儿茶酚结构和/或没食子酰基结构时，通过与该结构中的苯环的疏水性相互作用，而更加促进与蛋白质等复合要素的复合物化，因此是优选的。
作为儿茶酚结构，可例示下述式(3a)所示的结构。作为没食子酰基结构，可例示下述式(3b)所示的结构。下述所示的结构中，下述式(3b)所示的没食子酰基结构通过与羟基的氢键而更加促进与蛋白质等复合要素的复合物化，因此是优选的。
[化5]
Figure BDA0003371915900000101
本发明实施方式的化合物3所具有的二醇结构的个数为1以上，可以为2以上，可以为5以上。本发明实施方式的化合物中的二醇结构的个数的上限值没有特别限制，例如可以为30以下，可以为15以下，可以为13以下。关于上述数值的数值范围的一例，本发明实施方式的化合物3所具有的二醇结构的个数例如可以为1～30的整数，可以为2～15的整数，可以为5～13的整数。。
考虑到二醇结构中的解离与连接的平衡状态时，通过使化合物3具有多个(2个以上)二醇结构，从而即便其中一个二醇结构的连接发生解离，也可以连接其他二醇结构。如此，本发明实施方式的具有二醇结构的化合物中二醇结构的个数越多，具有二醇结构的化合物与具有硼酸基的高分子间的表观结合力越会飞跃性地提升。
具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物间的上述结合力例如可通过茜素红法进行测定。关于茜素红法，可使用下述实施例中所示的方法。
作为所述具有二醇结构的化合物，可例举属于多酚的化合物。作为多酚，可例举具有在芳香烃中2个以上的氢原子被取代为羟基的结构的化合物。天然多酚已知由植物生产。作为这种多酚，可例举：没食子酸、儿茶素类(儿茶素及其衍生物)、表儿茶素类(表儿茶素及其衍生物)、原花青素、花青素、没食子酰化儿茶素类(没食子酰化儿茶素及其衍生物)、黄酮类(フラボノイド)、异黄酮类、新黄酮类、黄酮(フラボン)、单宁、鞣酸、这些的衍生物等。作为所述具有二醇结构的化合物，优选选自鞣酸、没食子酸和这些的衍生物中的至少一种。作为上述衍生物，可例举在具有二醇结构的化合物中1个以上的氢原子或基团被其以外的基团(取代基)取代的化合物。另外，在具有二醇结构的化合物上也可以附加氢原子或使氢原子脱离。本文中作为取代基，可例举：羟基、氨基、碳数1～4的1价链状饱和烃基、卤素原子等。作为碳数1～4的1价链状饱和烃基，例如可例举甲基、乙基、丙基、丁基等。作为卤素原子，可例举氟原子、氯原子等。
(具有硼酸基的高分子)
以下，对本发明实施方式的具有硼酸基的高分子2进行说明。
所述高分子可为生物相容性高分子。生物相容性高分子是指在已对生物体给药的情况下，不会造成或不易造成强烈炎症反应或损伤等显著副作用和不良影响的聚合物。
作为具有硼酸基的生物相容性高分子，只要可获得本发明的效果便没有特别限制，例如可例举：向聚乙二醇(PEG)、丙烯酸类树脂(包含来自(甲基)丙烯酸酯的结构单元的树脂)、聚氨基酸、聚乙烯胺、聚烯丙胺、多核苷酸、聚丙烯酰胺、聚醚、聚酯、聚氨基甲酸酯、多糖类、这些的共聚物等中引入硼酸基后所得的高分子。具有硼酸基的生物相容性高分子还可具有在其合成过程中被引入到一部分中的任意基团。作为这种基团，例如可例举聚合引发剂的一部分等。
所述高分子的分散度(Mw/Mn)优选1.0以上且小于2.0，更优选1.0～1.5，进一步优选1.0～1.3。为了更有效地发挥优异的肿瘤蓄积性，实施方式的复合物优选高分子的分散度处在上述范围内。
本说明书中，高分子的数均分子量可采用根据利用1HNMR谱获得的波峰积分值的比算出的值。作为算出方法，例如可以如下方式算出：如下述实施例中所示，根据存在于高分子链末端的来自引发剂的结构的波峰积分值与算出对象部分的来自单体的结构的波峰积分值的比算出单体的聚合度，将来自聚合后的单体的结构的合计分子量与来自引发剂的结构的分子量相加，由此能够算出引入硼酸基前的高分子的数均分子量。
关于具有硼酸基的高分子的数均分子量，也可采用根据利用1HNMR谱获得的波峰积分值的比算出的值。作为算出方法，例如可以如下方式算出：如下述实施例中所示，根据存在于高分子链末端的来自引发剂的结构的波峰积分值与算出对象部分的来自硼酸基的结构的波峰积分值的比算出硼酸基的连接数，将来自已结合的硼酸基的结构的合计分子量与高分子链的数均分子量相加，由此能够算出具有硼酸基的高分子的数均分子量。
本发明实施方式的具有硼酸基的高分子优选通过1HNMR算出的数均分子量(Mn)为2,000～200,000，例如可以为5,000～100,000，也可以为10,000～50,000，也可以为12,000～45,000。
通过使具有硼酸基的高分子的数均分子量为上述范围，能适度提高复合物的血中滞留性，对于肿瘤组织的蓄积性，另外，能防止向肝脏等正常组织蓄积。其结是能够将蛋白质等复合要素高效地递送到肿瘤组织。
关于复合物的肿瘤蓄积性，被认为是通过利用肿瘤的血管渗透增强有选择地蓄积到肿瘤，即通过高渗透长滞留效应(EPR效应)而得到发挥，通过有选择地递送到肿瘤，而达到更优异的抗肿瘤效果。
另外，在复合物中，具有硼酸基的高分子可形成高分子胶束，也可为高分子囊胞的形态。
本发明实施方式的具有硼酸基的高分子优选为生物降解性。
生物降解性是指在生物体内可被吸收或降解的性质。作为生物降解性的生物相容性聚合物没有特别限制，只要可获得本发明的效果即可，例如可例举：聚氨基酸、聚酯、多核苷酸、多糖类等。
在本说明书中，具有硼酸基的高分子是生物降解性意味着具有硼酸基的高分子的至少一部分是生物降解性。因此，聚氨基酸、聚酯、多核苷酸、多糖类等、与PEG、丙烯酸类树脂(包含来自(甲基)丙烯酸酯的结构单元的树脂)、聚丙烯酰胺、聚醚、聚氨基甲酸酯等的嵌段共聚物等也符合生物降解性的生物相容性高分子。
通过使用生物降解性的聚合物，能抑制缀合物或复合物在体内蓄积，而能减少副作用。
在本说明书中，生物稳定性是指在生物体内不会立即被吸收或立即被降解而有可能存在。高分子具有生物降解性且生物稳定性意味着在生物体内被吸收或降解之前的期间有可能存在于生物体内。
在本说明书中，所谓高分子具有生物稳定性，意味着高分子的至少一部分具有生物稳定性。因此，聚氨基酸、聚酯、多核苷酸、多糖类等、与PEG、丙烯酸类树脂(包含来自(甲基)丙烯酸酯的结构单元的树脂)、聚丙烯酰胺、聚醚、聚氨基甲酸酯等的嵌段共聚物等也符合生物稳定性的生物相容性高分子。
具有硼酸基的高分子可具有第1生物相容性高分子链和第2生物相容性高分子链。此外，所述第1生物相容性高分子链与第2生物相容性高分子链不同，本发明实施方式的生物相容性高分子可以包含第1生物相容性高分子链的嵌段和第2生物相容性高分子链的嵌段的嵌段共聚物的形式提供。另外，本发明实施方式的生物相容性高分子除第1生物相容性高分子链和第2生物相容性高分子链以外，还可包含其它高分子链。
本发明实施方式中，“嵌段共聚物”是多种嵌段(重复连接有同种的结构单元的部分构成成分)连接而成的高分子。构成嵌段共聚物的嵌段可以是2种，也可以是3种以上。
基于生物相容性和通用性优异的观点，第1生物相容性高分子链或第2生物相容性高分子链优选聚乙二醇(PEG)。
基于生物相容性和生物稳定性与生物降解性的平衡性优异的观点，第1生物相容性高分子链或第2生物相容性高分子链优选聚氨基酸。
作为生物相容性高分子所包含的第1生物相容性高分子链与第2生物相容性高分子链的组合，例如优选第1生物相容性高分子链是聚乙二醇且第2生物相容性高分子链是聚氨基酸的组合。
包含第1生物相容性高分子链与第2生物相容性高分子链的生物相容性高分子的制备方法没有特别限制。例如能通过如下方法进行制备：通过公知的聚合反应合成第1生物相容性高分子链后，使第2生物相容性高分子链的单体聚合至第1生物相容性高分子链。通过聚合反应所获得的所述高分子链可以分别是前体物(例如具有保护基)的状态，也可针对通过聚合反应所获得的前体物进行由本领域技术人员选择的通常处理，而制备第1生物相容性高分子链和第2生物相容性高分子链。
或者，能通过公知的反应，使预先以聚合物的形式提供的第1生物相容性高分子链或其前体物与第2生物相容性高分子链或其前体物连接。此时，也可利用反应性官能团彼此的连接而使两者结合。在使用前体物的情况下，同样地进行适当处理，能制备第1生物相容性高分子链和第2生物相容性高分子链。
实施方式的高分子具有硼酸基。硼酸基可以是上述式(10b)所示的结构，基于即便在生物体内环境等中性附近的pH条件下，也能够有效地形成硼酸二醇连接的观点，所述硼酸基优选可具有取代基的苯硼酸基或可具有取代基的吡啶硼酸基。关于苯硼酸基和吡啶硼酸基，也能举出和引用现有报告(WO2013/073697，日本专利特开2018-142115等)中公开的那些。
基于能够更有效地形成硼酸二醇连接，能够更容易地表现出上述pH响应的观点，所述硼酸基优选下述通式(I)所示的苯硼酸基，或下述通式(II)所示的吡啶硼酸基。
[化6]
Figure BDA0003371915900000141
(式中，X表示卤素原子或硝基，na是0～4的整数。)。
X的所述卤素原子是F、Cl、Br、I等在周期表中属于第17族的元素，优选F。
通式(I)所示的苯硼酸基优选下述通式(I-1)或通式(I-2)所示的基团。通式(II)所示的吡啶硼酸基优选下述通式(II-1)所示的基团。
[化7]
Figure BDA0003371915900000142
(式中，X表示卤素原子或硝基。)。
由于在通式(I-1)和通式(I-2)中，X连接在相关位置上，所以认为X作为吸电子基团有效地发挥作用，从而有助于上述式(10c)所示的硼酸二醇连接的稳定化。因此，即便在生物体内的中性附近的pH环境下，也容易形成硼酸二醇连接，所以能够更容易地表现出所述pH响应。
通式(I-1)所示的基团优选下述通式(I-1-1)所示的基团，通式(I-2)所示的基团优选下述通式(I-2-1)所示的基团。通式(II-1)所示的基团优选下述通式(II-1-1)所示的基团。
[化8]
Figure BDA0003371915900000143
通过使上述通式(I-1-1)、通式(I-2-1)和通式(II-1-1)所示的基团具有酰胺键，而起到使硼酸基的表观pKa降低的作用。
实施方式的高分子中，1个以上的硼酸基被引入到高分子中即可，也可引入2个以上，也可引入5个以上。
本发明实施方式的高分子中的硼酸基的个数的上限值没有特别限制，例如可以是1000以下，可以是100以下，可以是50以下。关于所述数值的数值范围的一例，本发明实施方式的高分子所具有的硼酸基的个数例如可以是1～1000的整数，可以是2～100的整数，可以是5～50的整数。
通过使上述个数为上述下限值以上，由硼酸基带来的缀合物的形成作用会得到良好地发挥，因此是优选的。
考虑到硼酸基的解离与连接的平衡状态时，通过使高分子具有多个(2个以上)硼酸基，从而即便其中一个硼酸基的连接发生解离，也可以连接另一个硼酸基。如此，本发明实施方式的高分子中的硼酸基的个数越多，具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物间的表观结合力越会飞跃性地提升。
因此，基于提升两者的结合力的观点，更优选使用具有2个以上的二醇结构的化合物与具有2个以上的硼酸基的高分子的组合。当二醇结构和硼酸基的个数各2个以上时，可以分别例举上文中所举出的那些。
所述具有硼酸基的高分子可以在高分子中引入硼酸基而获得。
在本发明实施方式的高分子中，硼酸基能够被引入到高分子中的任一部位。硼酸基也可被引入到第1生物相容性高分子链和/或第2生物相容性高分子链。
例如也可利用高分子与“具有硼酸基的化合物”相互间具有反应性的官能团彼此的键合而引入硼酸基。反应性的官能团可以是高分子本来就具有的，也可以是通过修饰或者引入而获得。
在高分子与具有硼酸基的化合物的结合中，只要可以获得本发明的效果，具有硼酸基的化合物和高分子都可以分别经历它们结合所需的结构变化。
例如，具有硼酸基的化合物可与高分子所具有的官能团键合，也可与第1生物相容性高分子链和/或第2生物相容性高分子链所具有的官能团键合。
例如，具有硼酸基的化合物可与高分子的侧链的官能团键合，也可与第1生物相容性高分子链和/或第2生物相容性高分子链的侧链的官能团键合。
所述硼酸基可以是在高分子的侧链经由2价连接基团引入的。作为该二价的连接基团，例如可例举：酰胺键、氨基甲酰键、烷基键、醚键、酯键、硫酯键、硫醚键、磺酰胺键、氨基甲酸酯键、磺酰基键、胸腺嘧啶键、脲键、硫脲键。
本文中，将要引入硼酸基的目标高分子优选在侧链具有阳离子基团。即便硼酸基被引入到高分子的侧链，剩下的没有引入硼酸基的侧链的阳离子基团也可通过与上述式(10c)所示的阴离子基团的相互作用而使该缀合物的结合稳定。
因此，本发明实施方式的高分子可以具有硼酸基和阳离子基团，第1生物相容性高分子链和/或第2生物相容性高分子链可以具有硼酸基和阳离子基团。
在高分子具有硼酸基和阳离子基团的情况下，硼酸基与阳离子基团的摩尔比(阳离子基团：硼酸基)可以是10：1～1：10，可以是10：3～3：1，可以是10：8～8：10。
作为所述阳离子基团，优选氨基。通过在侧链具有氨基，可以使该氨基在水性介质中配位于硼酸的硼，从而使该缀合物的结合更进一步稳定。
作为在分子内具有氨基的生物相容性高分子链，可例举：聚氨基酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯胺、聚烯丙胺等，优选聚氨基酸。聚氨基酸更优选在侧链具有阳离子基团，更优选在侧链具有氨基。
在将要引入硼酸基的目标生物相容性高分子具有氨基的情况下，该氨基也可以是由保护基保护的氨基。
在使用不具有氨基或由保护基保护的氨基的生物相容性高分子链的情况下，能通过公知的方法，例如引入乙二胺和肼、贝尚还原、羟基的直接氨基化法、氨解、柯提斯重排反应等，而将氨基引入到生物相容性高分子。
在与所述氨基形成键的情况下，基于与氨基的结合稳定性和合成容易性的观点，上述具有硼酸基的化合物优选具有羧基。可由将要引入硼酸基的目标生物相容性高分子的氨基与具有硼酸基的化合物的羧基形成酰胺键，而将硼酸基引入到生物相容性高分子。另外，所形成的酰胺键也起到使硼酸基的表观pKa降低的作用。
作为具有硼酸基和羧基的化合物，例如可使用4-羧基-苯硼酸、3-羧基-4-氟苯硼酸、4-羧基-2-氟苯硼酸、4-羧基-3-氟苯硼酸(FPBA)、3-羧基-4-氯苯硼酸、4-羧基-2-氯苯硼酸、4-羧基-3-氯苯硼酸等。
作为由羧基与氨基形成酰胺键的方法，例如可例举：使具有氨基的生物相容性高分子链与具有硼酸基和羧基的化合物在DMT-MM等缩合剂的存在下进行缩合反应。另外，在具有由保护基保护的氨基的生物相容性高分子链的情况下，可利用公知的反应对保护基进行脱保护，获得具有氨基的生物相容性高分子链后，同样地进行缩合反应。
另外，硼酸基也可以仅被引入到第1生物相容性高分子链或第2生物相容性高分子链中的任一生物相容性高分子链中。例如硼酸基可被引入到第2生物相容性高分子链。图1中，具有硼酸基的生物相容性高分子2包含：具有硼酸基的第2生物相容性高分子链22和不具有硼酸基的第1生物相容性高分子链21。例如，可以第2生物相容性高分子链具有侧链，硼酸基被引入到第2生物相容性高分子链的侧链。
作为本发明实施方式的具有硼酸基的高分子的一例，可例举包含下述通式(1)或(1-1)所示的结构的高分子。
[化9]
Figure BDA0003371915900000171
(式(1)～(1-1)中，A表示所述第1生物相容性高分子链，L表示连接子部分，B表示具有硼酸基的所述第2生物相容性高分子链。)
所述连接子部分优选碳原子数1～20的亚烷基，优选碳原子数1～20的直链亚烷基，更优选碳原子数1～5的直链亚烷基。该亚烷基中的1个或2个以上的-CH2-可以各自独立地被-CH＝CH-、-O-、-CO-、-S-、-NH-、或-CONH-所取代。作为亚烷基，可举出亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基等。
所述第2生物相容性高分子链优选聚氨基酸。
在第2生物相容性高分子链是聚氨基酸，且所述硼酸基被引入到所述聚氨基酸的侧链的情况下，作为上述通式(1)或(1－1)中的B，优选以下。
B表示具有硼酸基的所述第2生物相容性高分子链，第2生物相容性高分子链优选包含下述(b2)所示的重复结构，或(b1)所示的重复结构和(b2)所示的重复结构。
[化10]
Figure BDA0003371915900000172
(式(b1)～(b2)中，
R1表示氨基酸侧链，
R2是在氨基酸侧链引入所述硼酸基的侧链，
n表示(b1)和(b2)的总数，n是1～1000的整数，m是1～1000的整数(其中m≤n)，在n-m是2以上的情况下，多个R1彼此可以相同或不同，在m是2以上的情况下，多个R2彼此可以相同或不同。)。
作为R1和R2中的氨基酸，优选天然存在的氨基酸，例如可举出缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸等。
氨基酸侧链是指可以该领域中通常的含义来使用，与多肽的酰胺键相关的除氨基与羧基以外的结构，例如在甘氨酸时是氢原子，在丙氨酸时是甲基，在缬氨酸时是异丙基。
在第2生物相容性高分子链包含(b1)所示的重复结构和(b2)所示的重复结构的情况下，(b1)与(b2)的排列可以是随机的。m表示第2生物相容性高分子链中的(b2)的总数，n-m表示第2生物相容性高分子链中的(b1)的总数。n-m也可以是0(即，第2生物相容性高分子链也可以仅具有(b1)和(b2)中引入有硼酸基的(b2)。)。
第2生物相容性高分子链可以是由上述(b2)所示的重复结构，或(b1)所示的重复结构和(b2)所示的重复结构所构成。
另外，R1的氨基酸侧链与R2的氨基酸侧链彼此可以相同或不同。
式(b1)～(b2)中，n是1～1000的整数，可以是10～500的整数，可以是15～100的整数。通过使上述n的值在上述范围内，第2生物相容性高分子链的分子量的值变得适宜，因此是优选的。
式(b1)～(b2)中，m是1～1000的整数，可以是3～100的整数，可以是5～50的整数。通过使上述m的值在上述下限值以上，由硼酸基带来的缀合物的形成作用得到良好地发挥，因此是优选的。
此外，本文中，虽然还举出了n大于m的情况下的数值范围，，但n与m可以是同一数字。
向聚氨基酸引入硼酸基的方式没有特别限定，优选聚氨基酸的氨基酸侧链与具有硼酸基的化合物的连接。作为使具有硼酸基的化合物与聚氨基酸的氨基酸侧链结合的方法，可例举：使天冬酰胺酸侧链或谷氨酰胺酸侧链与羧基形成酰胺键，使半胱氨酸的侧链与巯基形成二硫键的方法等。但是，如上所述，，通过使第2生物相容性高分子链在侧链具有氨基，可以使该氨基在水性介质中配位于硼酸的硼，从而使缀合物的结合更进一步稳定，因此，优选由具有氨基的氨基酸侧链与具有硼酸基和羧基的化合物的羧基形成酰胺键的方法。
关于具有氨基的氨基酸侧链，可以是赖氨酸侧链、精氨酸侧链、天冬酰胺侧链、或谷氨酰胺侧链等具有氨基的天然氨基酸侧链，也可以是在任意氨基酸侧链引入氨基后所得的氨基酸侧链，基于生物相容性等观点，优选赖氨酸侧链。
上述(b2)所示的重复结构优选包含如下结构作为结构单元，，即R2是在具有阳离子基团的氨基酸侧链引入硼酸基的侧链的结构，更优选包含如下结构作为结构单元，即R2是在具有氨基的氨基酸侧链引入硼酸基的侧链的结构，进一步优选包含如下结构作为结构单元，即R2是在赖氨酸侧链引入硼酸基的侧链的结构。
在n-m是1以上的情况下，上述(b1)所示的重复结构优选包含如下结构作为结构单元，即R1是具有阳离子基团的氨基酸侧链的结构，更优选包含如下结构作为结构单元，即R1是具有氨基的氨基酸侧链的结构，进一步优选包含如下结构作为结构单元，即R1是赖氨酸侧链的结构。
第1生物相容性高分子链优选聚乙二醇。
在第1生物相容性高分子链是聚乙二醇，第2生物相容性高分子链是聚氨基酸的情况下，作为上述通式(1)所表示的结构，优选下述通式(1-2)所示的结构。
[化11]
Figure BDA0003371915900000181
(式(1-2)中，
l是1～1500的整数，B表示具有硼酸基的第2生物相容性高分子链，第2生物相容性高分子链包含下述(b2)所示的重复结构，或者(b1)所示的重复结构和(b2)所示的重复结构。)
式(1-2)中，l是1～1500的整数，可以是10～1000的整数，可以是100～500的整数。
[化12]
Figure BDA0003371915900000191
(式(b1)～(b2)中，R1、R2、n、和m表示与前述相同的含义)。
(与缀合物复合的物质)
本发明实施方式的复合物中的与缀合物复合的物质没有特别限制，只要能够与所述缀合物复合而形成复合物即可，可以是任何物质。
与缀合物复合的物质能经由缀合物的来自具有二醇结构的化合物的部分与所述缀合物复合。
某种物质能经由缀合物的来自具有二醇结构的化合物的部分与所述缀合物复合，例如能通过如下方式预先确认：在包含该物质与具有二醇结构的化合物的组合物中两者能够形成复合物。例如，如果在包含蛋白质与多酚的组合物中两者能够形成复合物，那么蛋白质有很大可能经由缀合物的来自多酚的部分与所述缀合物复合。复合能通过如下方式来判断，即组合物中所包含的粒子的粒子尺寸变得大于该物质单体时的粒子尺寸。
某种物质与缀合物复合，例如能通过如下方式来评价，即确认在包含该物质与缀合物的组合物中两者能够形成复合物。复合物的形成能通过如下方式来判断，即组合物中所包含的粒子的粒子尺寸变得大于该物质单体时的粒子尺寸。
与缀合物复合的物质的尺寸没有特别限制，例如该物质的粒径可以为500nm以下，可以为0.1nm以上500nm以下，可以为0.2nm以上100nm以下，可以为0.3nm以上50nm以下。粒径可通过动态光散射法(DLS)或荧光相关光谱法(FCS)，根据下述实施例中记载的测定条件来进行测定。
关于与缀合物复合的物质的一例，可举出选自蛋白质、病毒、无机粒子、核酸和低分子药物中的至少一种。本文中，举出的概念中所包括的物质可以包括在多个所述概念中。
·蛋白质
本发明实施方式的复合物中作为复合要素的蛋白质没有特别限制，只要能够与所述缀合物复合而形成复合物即可，可以是任何蛋白质。
由于本发明实施方式的复合物需要血中滞留性优异，进而具有pH响应，会发挥肿瘤蓄积性等，能够适宜地用于生物体内的药物递送用途，因此本发明实施方式的复合物中的蛋白质优选生理活性蛋白质。生理活性蛋白质优选具有药理作用，优选包含蛋白质型药物。
蛋白质型药物是以蛋白质或包含蛋白质作为构成要素的成分作为有效成分的药物，例如可例举：赫赛汀、阿瓦斯汀、雷莫芦单抗(サイラムザ)等抗体药物；透明质酸酶等各种酶；胰岛素；细胞因子；干扰素；病毒载体等。作为病毒载体，可举出包含腺相关病毒(AAV)的病毒载体等。
另外，在本说明书中，蛋白质的概念包括肽。作为肽，也可以优选举出膜透性肽。
本发明实施方式的复合物优选发挥肿瘤蓄积性，该复合物中的蛋白质优选具有抗肿瘤作用。
作为具有抗肿瘤作用的蛋白质型药物，例如可例举抗体药物、干扰素、病毒载体等。
·病毒
本发明实施方式的复合物中作为复合要素的病毒没有特别限制，只要能够与所述缀合物复合而形成复合物即可，可以是任何病毒。
由于本发明实施方式的复合物需要血中滞留性优异，进而具有pH响应，会发挥肿瘤蓄积性等，能够适宜地用于生物体内的药物递送用途，因此本发明实施方式的复合物中的病毒优选作为病毒载体的用于疾病治疗(病毒疗法)的治疗用病毒，更优选用于癌症治疗的癌症治疗用病毒。
治疗用病毒可以在病毒载体中包含具有药理作用的核酸，还可以包含编码具有药理作用的蛋白质的核酸。
治疗用病毒可以包含为治疗疾病而引入的核酸，还可以包含为治疗癌症而引入的核酸。
上述核酸可包含有效连接的启动子序列，以使该核酸中所包含的序列表达。
作为治疗用病毒，可例举能够用作人类病毒载体的各种病毒或人工病毒，作为病毒载体的病毒种类，可举出腺相关病毒、腺病毒、疱疹病毒、仙台病毒、逆转录病毒、慢病毒等。
作为腺相关病毒(AAV)，可举出AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11等。
本发明实施方式的复合物优选发挥肿瘤蓄积性，该复合物中的病毒优选具有抗肿瘤作用。
·无机粒子
本发明实施方式的复合物中作为复合要素的无机粒子没有特别限制，只要能够与所述缀合物复合而形成复合物即可，可以是任何无机粒子。
无机粒子是包含无机材料的粒子，可举出金粒子、银粒子、铂粒子、铁粒子、氧化钛粒子等金属粒子；二氧化硅粒子；量子点等半导体粒子；含有碳纳米管、石墨烯等的碳粒子等。
无机粒子优选纳米粒子。纳米粒子是指粒径为1～100nm的粒子。粒子的粒径可通过动态光散射法(DLS)或荧光相关光谱法(FCS)，根据下述实施例中记载的测定条件进行测定。
无机粒子可以进一步经由选自上述蛋白质、病毒、核酸和低分子药物中的至少一种修饰。
·核酸
本发明实施方式的复合物中作为复合要素的核酸没有特别限制，只要能够与所述缀合物复合而形成复合物即可，可以是任何核酸。
由于本发明实施方式的复合物需要血中滞留性优异，进而具有pH响应，会发挥肿瘤蓄积性等，能够适宜地用于生物体内的药物递送用途，因此本发明实施方式的复合物中的核酸优选具有生理活性的核酸。具有生理活性的核酸优选具有药理作用，优选包含核酸药物。
本发明实施方式的复合物中作为复合要素的核酸优选用于治疗疾病的核酸药物。
作为核酸药物，可例举在人体内具有生理活性的各种核酸，可举出DNA、RNA、LNA等人工核酸等，作为核酸的种类，可举出siRNA、miRNA、反义核酸、核酸适配体、核酶等。
本发明实施方式的复合物优选发挥肿瘤蓄积性，该复合物中的核酸优选具有抗肿瘤作用。
作为具有抗肿瘤作用的核酸，可举出TUG1(taurine upregulated gene 1)反义核酸、PLK1(polo-like kinase 1)siRNA、VEGF(vascular endothelial growth factor)siRNA等。
·低分子药物
本发明实施方式的复合物中作为复合要素的低分子药物没有特别限制，只要能够与所述缀合物复合而形成复合物即可，可以是任何低分子药物。
本发明实施方式的复合物的血中滞留性优异，进而具有pH响应，会发挥肿瘤蓄积性等，能够适宜地用于生物体内的药物递送用途。
本说明书中的“低分子药物”是指分子量1000以下的药物，优选分子量500以下的药物，例如可以是分子量200～1000的药物，可以是分子量300～500的药物。下述实施例中所使用的脂质异常症治疗药的匹伐他汀的分子量约为421。
本发明实施方式的复合物优选发挥肿瘤蓄积性，该复合物中的低分子药物优选具有抗肿瘤作用。
作为具有抗肿瘤作用的低分子药物，可举出：博来霉素或其盐等抗癌剂、孟加拉玫瑰红等声敏剂、氯6等光敏剂、硼簇等放射线增感剂等。
根据本发明实施方式的复合物，可不对蛋白质等复合要素实施化学修饰而与缀合物形成复合物，且通过利用缀合物的高分子而高分子化，使得血中滞留性得到提高。另外，该缀合物由具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物连接得到，具有缀合物根据靶部位的pH环境而发生解离的pH响应。
因此，本发明实施方式的复合物是极具划时代意义的，能够期待血中滞留性优异，且在目标递送部位缀合物会有选择地发生解离，而使蛋白质等复合要素的功能显现。
《药物》
本发明的一个实施方式是提供一种药物，其含有实施方式的复合物作为有效成分。实施方式的复合物能具有对于疾病的药理效应。该实施方式中，本发明实施方式的复合物中的蛋白质等复合要素是有效成分，适宜于具有药理作用的情况，例如能使用具有药理作用的任意蛋白质、蛋白质型药物、治疗用病毒、核酸、核酸药物、低分子药物等。
本发明的一个实施方式是提供一种癌症治疗剂，其含有实施方式的复合物作为有效成分。本发明的一个实施方式是提供一种用以治疗癌症的实施方式的复合物。本发明的一个实施方式是提供一种实施方式的复合物的用途，其用以制备癌症治疗药。实施方式的复合物能具有癌症治疗效果。该实施方式中，本发明实施方式的复合物中的蛋白质等复合要素是有效成分，适宜于具有抗肿瘤作用的情况，例如能使用可发挥抗肿瘤效果的各种蛋白质、蛋白质型药物、治疗用病毒、核酸、核酸药物、低分子药物等。
作为期待癌症治疗效果的目标疾病，例如可例举血癌、实体癌等，当本发明实施方式的复合物具有肿瘤蓄积性时，适宜于实体癌。作为人实体癌，例如可例举：脑癌、头颈部癌、食道癌、甲状腺癌、小细胞癌、非小细胞癌、乳腺癌、胃癌、胆囊/胆管癌、肺癌、肝癌、肝细胞癌、胰腺癌、结肠癌、直肠癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫体癌、子宫颈癌、肾盂/输尿管癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、睾丸癌、胚胎性癌、威廉姆斯癌、皮肤癌、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、骨肉瘤、尤文氏瘤、软组织肉瘤等。
作为本发明实施方式的癌症治疗剂的制剂例，可例举：以根据需要实施包衣后所得的片剂、胶囊剂、酏剂、微胶囊剂的形式用于口服的口服剂。
或者，可例举：以与水或其以外的药学上可接受的液体的无菌性溶液、或悬浮液的注射剂的形式用于非口服的非口服剂。进而可例举通过如下方式进行制剂化所得的制剂：与药理学上可接受的载体或介质，具体来说与灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、载体、防腐剂、粘合剂等适当组合，并以普遍认可的制药实践所需的单位剂量形式混和。
作为能与片剂、胶囊剂混和的添加剂，例如可使用诸如明胶、玉米淀粉、黄芪胶、阿拉伯胶的粘合剂；诸如结晶性纤维素的赋形剂；诸如玉米淀粉、明胶、海藻酸的膨化剂；诸如硬脂酸镁的润滑剂；诸如蔗糖、乳糖或糖精的甜味剂；诸如胡椒薄荷、白株树油或樱桃的香味剂。当配药单位形式是胶囊时，可在上述材料中进一步含有诸如油脂的液体载体。用以注射的无菌组合物可使用诸如注射用蒸馏水的载体，依据通常的制剂实践来进行调配。
作为注射用水溶液，例如可例举包含生理盐水、葡萄糖和其它辅助用药的等渗溶液，例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠，还可与适当的增溶剂，例如醇，具体来说乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇，非离子性表面活性剂，例如聚山梨醇酯80(TM)、HCO-50并用。
作为油性液，可例举芝麻油、大豆油，也可与作为增溶剂的苯甲酸苄酯、苄醇并用。另外，还可与缓冲液，例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液；镇痛剂，例如盐酸普鲁卡因；稳定剂，例如苄醇、苯酚；抗氧化剂进行调配。制备好的注射液通常被填充到适当的安瓿中。
关于对患者的给药，例如可以通过本领域技术人员所公知的方法，进行动脉内注射给药、静脉内注射给药、皮下注射给药等、以及鼻腔内给药、经支气管给药、肌内给药、经皮给药、或口服给药。给药量会根据患者的体重、年龄和给药方法等而产生变化，但本领域技术人员能够适当选择适宜的给药量。给药量、给药方法会根据患者的体重、年龄和症状等而产生变化，但本领域技术人员能够适当选择。
实施方式的癌症治疗剂还可含有其它抗癌剂等。通过这种构成，可期待对于癌症治疗的协同效应。
《试剂盒》
本发明实施方式的试剂盒具备具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物。所述高分子可以是生物相容性高分子。实施方式的试剂盒可以具备具有硼酸基的生物相容性高分子与具有二醇结构的化合物。
本发明实施方式的试剂盒可用于形成所述实施方式的复合物。本发明实施方式的试剂盒也可以进一步具备与缀合物复合的物质(复合要素)。
作为实施方式的试剂盒的其它例，可举出具备实施方式的缀合物和与所述缀合物复合的物质的试剂盒。
作为与缀合物复合的物质，可举出选自蛋白质、病毒、无机粒子、核酸、和低分子药物中的至少一种。
关于具有硼酸基的高分子，具有二醇结构的化合物，以及选自蛋白质病毒、无机粒子、核酸和低分子药物中的至少一种等与缀合物复合的物质，可采用上述《复合物》中所举出的，而在此省略说明。
本发明实施方式的试剂盒也可以进一步具备溶液、缓冲液等试剂、反应容器、和操作说明书等。
本发明实施方式的试剂盒可以通过与任意的上述蛋白质等复合要素组合而形成包含任意的蛋白质等复合要素的实施方式的复合物，通用性优异。
《缀合物》
本发明实施方式的缀合物是由具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物连接得到。所述高分子可以是生物相容性高分子。实施方式的缀合物可以是具有硼酸基的生物相容性高分子与具有二醇结构的化合物连接得到。本发明实施方式的缀合物可用于形成所述实施方式的复合物。
关于具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物，可采用上述《复合物》中所举出的，而在此省略说明。
根据实施方式的缀合物，具有二醇结构的化合物与高分子结合，由此能抑制具有二醇结构的化合物在生物体内的非预期相互作用，与直接使用具有二醇结构的化合物的情况相比，物质递送的稳定性优异。
根据实施方式的缀合物，具有二醇结构的化合物与高分子结合，由此能抑制具有二醇结构的化合物的氧化，与直接使用具有二醇结构的化合物的情况相比，品质稳定性优异。
实施例
接下来示出实施例，进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于以下实施例。
此外，添加物质X和Y所获得的溶液或复合物有时称为X/Y溶液、X/Y复合物，或简称为“X/Y”等。同样地，添加物质X、Y和Z所获得的溶液或复合物有时称为X/Y/Z溶液、X/Y/Z复合物、或简称为“X/Y/Z”、X三元复合物、三元复合物等。
另外，PEG-P[Lys(FPBA)m]n有时简称为聚合物。
1.PEG10k-聚[L-赖氨酸(氟-苯硼酸)m]n的合成
＜1.1.概述＞
对实施例中所制备的PEG10k-聚[L-赖氨酸(氟-苯硼酸)m]n(以下称为PEG-P[Lys(FPBA)m]n，合成方案(1)中，n表示Lys的聚合度，m表示FPBA的引入数)的合成法进行描述。
[化13]
Figure BDA0003371915900000251
通过以PEG10k-NH2作为引发剂且以Lys(TFA)-NCA作为单体的N-羧基内酸酐(NCA)聚合而合成PEG-P[Lys(TFA)]n。在碱性条件下对侧链的TFA基进行脱保护，而获得PEG-PLysn。然后，使3-羧基-4-氟-苯硼酸(FPBA)的羧基与PEG-PLysn的氨基键合，而获得PEG-P[Lys(FPBA)]n。
＜1.2.试剂＞
没有特别描述的试剂、溶剂直接使用市售品。
·α-甲氧基-ω-氨基-聚(乙二醇)(PEG-NH2)[Mn：10K]：日本油脂公司(NOF Co,Inc.)
·苯：日本半井试剂公司(Nacalai Tesque Inc.)
·N-ε-三氟乙酰基-L-赖氨酸-N-羧基内酸酐(Lys(TFA)-NCA)：日本中央化成品公司(Chuo Kaseihin Co.,Inc.)
·二甲基亚砜(DMSO)：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.)
在氩气氛下进行蒸馏来使用。(b.p.189℃)
·乙醚：日本关东化学公司(Kanto Chemical CO.,Inc.)
·甲醇：日本关东化学公司(Kanto Chemical CO.,Inc.)
·5mol/L NaOH：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·二甲基亚砜(DMSO)：日本半井试剂公司(Nacalai Tesque Inc.)
·4-羧基-3-氟苯硼酸(FPBA)：Combi-Blocks
·碳酸氢钠：日本东京化成工业公司
·D-山梨醇：日本东京化成工业公司
·4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)：Dojinbo
·氯化钠(NaCl)：日本和光纯药公司(Wako pure chemical)
·Cy5-NHS：Lumiprobe
·1-甲基-2-吡咯烷酮：美国西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich Co.,llc.)
·溴化锂：美国西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich Co.,llc.)
＜1.3.测定仪器＞
·NMR(Nuclear Magnetic Resonance，核磁共振)：BRUKER AVANCEIII400(400MHz，德国布鲁克拜厄斯宾(BRUKER BioSpin))
·GPC(Gel Permeation Chromatography，凝胶渗透色谱法)：日本佳司科国际公司(Jasco International Co.,Ltd.)
柱：TSK-gel superAW3000(日本东曹公司(Tosoh Corporation))，
Superdex 200Increase 10/300GL(美国通用电气医疗集团(GE Healthcare))
检测器：RI-2031、UV-2030
·荧光光度计FP-8300：日本佳司科国际公司(Jasco International Co.,Ltd.)
＜1.4.合成方法＞
[PEG-P[Lys(TFA)]n的合成]
在300mL两口茄形烧瓶中量取500mg(0.050mmol)的PEG-NH2，使之溶解于2.0mL的苯中后，进行冷冻干燥。在氩气氛下，在100mL两口茄形烧瓶中量取321mg(1.2mmol、24当量)(n＝20)和643mg(2.4mmol、48当量)(n＝40)的Lys(TFA)-NCA。在PEG-NH2中加入5mL的DMSO。另外，在Lys(TFA)-NCA中分别加入10mL的DMSO并使之溶解。将Lys(TFA)-NCA溶液加入到PEG-NH2溶液中，在氩气氛下以室温搅拌72小时。将反应溶液分别滴加到300mL的乙醚中，通过再沉淀进行纯化。其后，在减压下进行干燥，以产量745mg(n＝20)和987mg(n＝40)，产率91％(n＝20)和86％(n＝40)获得白色固体PEG-PLys(TFA)。GPC曲线(在色谱柱：TSK-gelsupe rAW3000，洗脱液：NMP(50mM LiBr)，流速：0.30mL/min，检测器：RI-2031，测定温度：40℃的条件下获得)示于图3和图4。
[PEG-P[Lys(TFA)]n的脱保护]
在50mL茄形烧瓶中分别量取500mg(0.0194mmol)的PEG-P[Lys(TFA)]20和500mg(0.0194mmol)的PEG-P[Lys(TFA)]40，加入到2mL的5M NaOH与8mL的甲醇混合液中并在室温搅拌过夜。将反应溶液装到透析膜(MWCO＝3.5kDa)，分别利用2L的0.1M HCl，然后是2L的纯水各透析2次。对溶液进行冷冻干燥，分别以产量367mg(n＝20)和331mg(n＝40)，产率92％(n＝20)和90％(n＝40)获得白色固体PEG-PLysn。1H NMR谱(溶剂：D2O)示于图5和图6。
·PEG-PLys20的1H NMR谱
1H NMR(25℃的D2O)：δ3.4-3.9(909H,-CH2CH2O-),δ1.25-1.99(120H,-CH2CH2CH2CH2NH3),δ2.97(40H,-CH2CH2NH3),δ4.30(20H,-COCHNH-)。
PEG-PLys40的1H NMR谱
1H NMR(25℃的D2O)：归属与上述PEG-PLys20的1H NMR谱相同
[FPBA与PEG-PLysn的结合]
在50mL茄形烧瓶中分别量取100mg(7.8μmol)的PEG-PLys20和100mg(6.3μmol)的PEG-PLys40，并使其溶解于pH8.5的10mL 50mM NaHCO3中。向其中加入61.2mg(0.22mmol)(n＝20)或100mg(0.36mmol)(n＝40)的DMT-MM、42mg(0.23mmol)(n＝20)或69mg(0.38mmol)(n＝40)的D-山梨醇、14.3mg(0.078mmol)(n＝20)或23.3mg(0.13mmol)(n＝40)的溶解于1mL甲醇中的FPBA，并在室温搅拌过夜。将反应溶液装到透析膜(MWCO＝3.5kD)，分别利用2L的0.1M NaOH、2L的0.1M HCl、然后是2L的纯水各透析2次。对所获得的溶液进行冷冻干燥，以产量126mg(n＝20)和144g(n＝40)，产率87％(n＝20)和80％(n＝40)获得白色固体PEG-P[Lys(FPBA)m]n。1H-NMR谱(溶剂：D2O和180mg/ml的D-山梨醇)示于图7和图8，GPC曲线(根据如下条件获得，色谱柱：Superdex 200increase 10/300GL，洗脱液：10mM HEPES、140mMNaCl 500mM D-山梨醇(pH7.4)，流速：0.75mL/min，检测器：UV-2030，测定温度：室温)示于图9和图10。
PEG-P[PEG-P[Lys(FPBA)10]20的1H NMR谱
1H NMR(25℃的D2O和180mg/mL的D-山梨醇)：δ0.87-2.22(120H,-CH2CH2CH2CH2NH3)δ7.00-7.70(3H,-C6H3FB(OH)2)。
PEG-P[PEG-P[Lys(FPBA)20]40的1H NMR谱
1H NMR(25℃下D2O和180mg/mL的D-山梨醇)：归属与上述PEG-P[PEG-P[Lys(FPBA)10]20的1H NMR谱相同。
[向PEG-P[Lys(FPBA)m]n引入Cy5]
在50mL茄形烧瓶中分别量取15mg(11μmol)的PEG-P[Lys(FPBA)10]20，并使其溶解于pH8.5的10mL 50mM NaHCO3中。向其中加入8mg(0.04mmol)的D-山梨醇、0.7mg(11μmol)的溶解于DMSO中的Cy5-NHS，并在室温搅拌过夜。将反应溶液用纯水透析(Mwco：3.5kDa)4次后，进行冷冻干燥。然后，利用PD-10色谱柱(溶剂为1M NaCl)将未反应的Cy5-NHS去除后，在水中透析(Mwco：3.5kDa)3次。最后进行冷冻干燥，而回收PEG-P[Lys(FPBA10/Cy5)]20。产率约为65％。荧光光谱(Ex：560nm)示于图13。
＜1.5.解析＞
[PEG-P[Lys(TFA)]]
根据GPC曲线，关于所获得的聚合物的Mw/Mn，PEG-P[Lys(TFA)]20和PEG-P[Lys(TFA)]40分别为1.25、1.29，确认具有窄分子量分布。
[PEG-PLysn]
根据1H NMR谱的来自引发剂的波峰δ3.4-3.9(909H,-CH2CH2O-)与来自Lys的波峰[δ1.25-1.99(120H,-CH2CH2CH2CH2NH3),δ2.97(40H,-CH2CH2NH3),δ4.30(20H,-COCHNH-)]的积分值比，算出PLys的聚合度为DP＝20和DP＝40。
[PEG-P[Lys(FPBA)m]n]
根据1H NMR谱的来自PLys的波峰[δ1.25-1.99(120H,-CH2CH2CH2CH2NH3)]与来自FPBA的波峰[δ7.00-7.70(3H,-C6H3FB(OH)2)]的积分值比，求出FPBA的引入数为10(n＝20)和20(n＝40)，数均分子量为Mn＝14,000(n＝20)和Mn＝17,900(n＝40)。另外，根据GPC曲线，确认所获得的聚合物具有窄单峰分子量分布。
2.PEG10k-FPBA的合成
＜2.1.概述＞
对实施例中所制备的PEG10k-氟苯硼酸(以下PEG-FPBA，合成方案(2)中)的合成法进行描述。
[化14]
Figure BDA0003371915900000291
＜2.2.试剂＞
没有特别描述的试剂、溶剂是直接使用市售品。
·α-甲氧基-ω-氨基-聚(乙二醇)(PEG-NH2)[Mw：10K]：日本油脂公司(NOF Co,Inc.)
·5mol/L NaOH：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·4-羧基-3-氟苯硼酸(FPBA)：Combi-Blocks
·碳酸氢钠：日本东京化成工业公司
·D-山梨醇：日本东京化成工业公司
·4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)：Dojinbo
·氯化钠(NaCl)：日本和光纯药公司(Wako pure chemical)
＜2.3.测定仪器＞
·NMR(Nuclear Magnetic Resonance，核磁共振)：BRUKER AVANCEIII400(400MHz，德国布鲁克拜厄斯宾(BRUKER BioSpin))
·GPC(Gel Permeation Chromatography，凝胶渗透色谱法)：日本佳司科国际公司(Jasco International Co.,Ltd.)
色谱柱：Superdex 200 Increase 10/300GL(美国通用电气医疗集团(GEHealthcare))
检测器：UV-2030
＜2.4.合成方法＞
[FPBA与PEG-NH2的结合]
在50mL茄形烧瓶中量取100mg(0.01mmol)的PEG-NH2，并使其溶解于pH8.5的10mL50mM NaHCO3中。向其中添加13.8mg(0.05mmol)的DMT-MM、27mg(0.15mmol)的D-山梨醇、9.2mg(0.05mmol)的溶解于1mL的甲醇中的FPBA，并在室温搅拌过夜。将反应溶液装到透析膜(MWCO＝3.5kD)，分别利用2L的0.1M NaOH、2L的0.1M HCl、然后是2L的纯水各透析2次。对所获得的溶液进行冷冻干燥，以产量90mg，产率88％获得白色固体PEG-P[Lys(FPBA)m]n。1H-NMR谱示于图11，GPC曲线(根据如下条件取得，色谱柱：Superdex 200increase 10/300GL，洗脱液：10mM HEPES、140mM NaCl 500mM D-山梨醇(pH7.4)，流速：0.75mL/min，检测器：UV-2030，测定温度：室温)示于图12。
·PEG-FPBA的1H NMR谱
·PEG-P[PEG-P[Lys(FPBA)10]20的1H NMR谱
1H NMR(25℃的d-DMSO)：δ3.4-3.9(909H,-CH2CH2O-),δ7.00-7.70(3H,-C6H3FB(OH)2)。
＜2.5.解析＞
[PEG-FPBA]
根据1H NMR谱的来自PEG的波峰[δ3.4-3.9(909H,-CH2CH2O-)]与来自FPBA的波峰[δ7.00-7.70(3H,-C6H3FB(OH)2)]的积分值比，求出FPBA的引入率为100％。另外，根据GPC曲线，确认所获得的聚合物具有窄单峰分子量分布。
3.三元复合物的物理化学性质的评价
＜3.1.概述＞
如果形成蛋白质、鞣酸(TA)和引入硼酸的高分子的三元复合物，粒径会增大。因此，使用绿色荧光蛋白质(GFP)作为模型蛋白质，利用荧光相关光谱法进行粒径测定。实施例中，使用PEG-P[Lys(FPBA)m]n和PEG-FPBA。同时，使用超速离心机对PEG-P[Lys(FPBA)m]n的缔合数进行评价。另外，还测定在FBS和葡萄糖溶液中的粒径变化，以评价在血液环境中的稳定性。进一步，还测定pH变化时的粒径变化，以确认肿瘤周边和细胞内的pH响应。
＜3.2.试剂＞
没有特别描述的试剂、溶剂是直接使用市售品。
·绿色荧光蛋白质(rGFP Protein，Mw：33k Da)：Clontech
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20(Mn＝14,000)
·PEG-P[Lys(FPBA)20]40(Mn＝17,900)
·鞣酸：(Mw＝1,701)日本和光纯药公司(Wako Pure Chemical.,Ltd.)
·D-PBS(-)：日本和光纯药公司(Wako Pure Chemical.,Ltd.)
·5mol/L HCl：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
＜3.3.测定仪器＞
·LSM710：德国卡尔蔡司公司(Carl Zeiss Co.,Ltd.)
·CS 150GX：日本日立公司
·荧光光度计FP-8300：日本佳司科国际公司(Jasco International Co.,Ltd.)
＜3.4.评价通过引入硼酸的高分子的添加来形成复合物＞
[GFP、TA、PEG-FPBA、PEG-P[Lys(FPBA)m]n的最终浓度]
·GFP：0.5μM
·鞣酸：40μM(制备浓度：82.5μM)
·PEG-P[Lys(FPBA)m]n(n＝20、m＝10或n＝40、m＝20)中所包含的来自FPBA的结构：250μM或500μM(以FPBA浓度算出)
·PEG-FPBA：250μM或500μM
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
使GFP溶液与鞣酸溶液混合，并使用超滤膜(Mwco：10kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备GFP/TA溶液。然后，另外向GFP/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20、PEG-P[Lys(FPBA)20]40、或PEG-FPBA溶液，制备GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)m]n(n＝20、m＝10或n＝40、m＝20)溶液、GFP/TA/PEG-FPBA溶液。使用共聚焦显微镜LSM710(Carl Zeiss制造)，通过荧光相关光谱法测定各溶液中所包含的粒子的粒径(个数基准的算术平均直径)。
首先，利用共聚焦显微镜，算出要测定的荧光分子的扩散时间。由于扩散系数×扩散时间是固定的，所以同时测定扩散系数是公知的罗丹明6G(扩散系数：4.14×10-10m2/sec、25℃)的扩散时间，从而算出要测定的荧光分子的扩散系数。将之代入到爱因斯坦-斯托克斯方程中，算出粒径。爱因斯坦-斯托克斯方程如下所述。
D＝KBT/6πηr
D：扩散系数
KB：玻耳兹曼常数(1.38×10-23m2·kg/s2·K)
T：温度(298K)
η：粘度(0.00089Pa·s)
r：粒子半径(nm)
结果示于图14。
GFP/TA/PEG-FPBA溶液和GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)m]n(n＝20或n＝40、m＝10或m＝20)溶液中所包含的粒子的粒径与GFP溶液和GFP/TA溶液中所包含的粒子的粒径相比，各自有所增大，因此提示形成GFP、TA和引入硼酸的高分子的三元复合物。
其中，由于GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)m]n(n＝20、m＝10或n＝40、m＝20)溶液中所包含的粒子的粒径大幅增大，所以提示显著形成这些三元复合物。
＜3.5.评价通过添加鞣酸来形成三元复合物＞
[GFP、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·GFP：0.5μM
·鞣酸：40μM(制备浓度：82.5μM)
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20中所包含的来自FPBA的结构：250μM(以FPBA浓度算出)
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
使GFP溶液与鞣酸溶液混合，并使用超滤膜(Mwco：3.5kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备GFP/TA溶液。然后，另外向GFP/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液，向GFP溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备GFP/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液。使用LSM710，利用荧光相关光谱法测定各溶液中所包含的粒子的粒径，将所测得的结果示于图15。
GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液中所包含的粒子的粒径与GFP溶液、GFP/TA溶液、GFP/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液中所包含的粒子的粒径相比，各自大幅增大，因此确认GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)m]n复合物是由这些的三元体系所形成。
＜3.6.评价葡萄糖中的复合物形成＞
[GFP、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·GFP：0.5μM
·鞣酸：40μM(制备浓度：82.5μM)
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20中所包含的来自FPBA的结构：250μM(以FPBA浓度算出)
这些是分别溶解于D-PBS(-)、0.1mg/ml、1.0mg/ml或10.0mg/ml的包含葡萄糖的D-PBS(-)溶液中来制备。
使GFP溶液与鞣酸溶液混合，并使用超滤膜(Mwco：3.5kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备GFP/TA溶液。然后，另外向GFP/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，将GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液制备成上述葡萄糖浓度。针对这些溶液，利用LSM710，根据荧光相关光谱法测定各溶液中所包含的粒子的粒径，将所测得的结果示于图16。
由于GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液中所包含的粒子的粒径在各浓度的葡萄糖溶液中没有产生显著变化，所以确认GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20三元复合物在葡萄糖溶液中是稳定的。
＜3.7.评价FBS中的复合物形成＞
[GFP、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·GFP：0.5μM
·鞣酸：40μM(制备浓度：82.5μM)
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20中所包含的来自FPBA的结构：250μM(以FPBA浓度算出)
这些是分别溶解于D-PBS(-)中制备后，以成为上述最终浓度的方式加入到将FBS/D-PBS(-)以如下体积比(5/95、10/90、30/70、50/50、75/25(vol))混合而成的混合溶液中来制备。
使GFP溶液与鞣酸溶液混合，并使用超滤膜(Mwco：10kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备GFP/TA溶液。然后，另外向GFP/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，将GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液制备成上述FBS浓度。针对这些溶液，利用LSM710，根据荧光相关光谱法，测定各溶液中所包含的粒子的粒径，将所测得的结果示于图17。
由于GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液中所包含的粒子的粒径在各浓度的FBS溶液中没有产生显著变化，所以确认GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20三元复合物在FBS溶液中是稳定的。
＜3.8.评价复合物的pH响应＞
[GFP、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·GFP：0.5μM
·鞣酸：40μM(制备浓度：82.5μM)
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20中所包含的来自FPBA的结构：250μM(以FPBA浓度算出)
这些是分别溶解于经HCl调节的pH7.4 D-PBS(-)、pH6.6 D-PBS(-)、pH5.5D-PBS(-)中来制备。
使GFP溶液与鞣酸溶液混合，并使用超滤膜(Mwco：10kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备GFP/TA溶液。然后，另外向GFP/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，将GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液调节成上述pH。针对这些溶液，利用LSM710，根据荧光相关光谱法，测定各溶液中所包含的粒子的粒径，将所测得的结果示于图18。
调节成pH6.6的GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液中所包含的粒子的粒径相较于调节成pH7.4的GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液中所包含的粒子的粒径有所减少。另外，调节成pH5.5的GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液中所包含的粒子的粒径与GFP的粒径是同等的，因此认为GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20三元复合物在肿瘤周边pH(pH6.6)和细胞内pH(pH5.5)，GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20发生脱离，从而确认复合物的形成状态根据pH产生变化的pH响应。
＜3.9.评价复合物中的PEG-P[Lys(FPBA10/Cy5)]20的缔合数＞
[GFP、TA、PEG-P[Lys(FPBA10/Cy5)]20的最终浓度]
·GFP：0.5μM
·鞣酸：40μM(制备浓度：82.5μM)
·PEG-P[Lys(FPBA10/Cy5)]20中所包含的来自FPBA的结构：250μM(以FPBA浓度算出)
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
使GFP溶液与鞣酸溶液混合，并使用超滤膜(Mwco：10kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备GFP/TA溶液。然后，另外向GFP/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA10/Cy5)]20溶液，制备GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA10/Cy5)]20溶液。针对该溶液，利用超速离心机(CS150GX)，以50,000g×1h进行超速离心，由此生成沉淀物。沉淀物中选择性地含有沉淀系数较大的GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA10/Cy5)]20复合物。使沉淀物溶解于1ml的D-PBS(-)中，测定荧光光谱(Ex：640nm/Em：680nm)并算出浓度，由此测定GFP每1个分子的PEG-P[Lys(FPBA10/Cy5)]20的缔合数。其结果如表1所示。
[表1]
Figure BDA0003371915900000341
确认在GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA10/Cy5)]20复合物中，于GFP的1个分子上平均缔合有8.9个PEG-P[Lys(FPBA10/Cy5)]20。
4.通过茜素红法来评价鞣酸与PEG-P[Lys(FPBA)m]n的结合力
＜4.1.概述＞
通过被确立为定量硼酸与二醇结构的结合力的方法的茜素红法来评价其结合力。以下，以本实施例中所实施的方法为例来简单地表示茜素红法的原理。
[化15]
Figure BDA0003371915900000351
＜4.2.试剂＞
·绿色荧光蛋白质(rGFP Protein)：Clontech
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20(Mn＝14,000)
·PEG-P[Lys(FPBA)20]40(Mn＝17,900)
·鞣酸：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·D-PBS(-)：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·没食子酸：日本和光纯药公司(Wako Pure Chemical.,Ltd.)
·茜素红S：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
＜4.3.测定仪器＞
·荧光光度计FP-8300：日本佳司科国际公司(Jasco Internatiional Co.,Ltd.)
＜4.4.评价复合物形成＞
[GFP、TA、PEG-FPBA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·溶液A：ARS(9.0×10-6M)
·溶液B：ARS(9.0×10-6M)+PEG-FPBA(FPBA浓度：2.0×10-3M)
·溶液C：ARS(9.0×10-6M)+PEG-P[Lys(FPBA)10]20(FPBA浓度：2.0×10-3M)
·溶液D：ARS(9.0×10-6M)+PEG-FPBA(FPBA浓度：2.0×10-3M)+鞣酸(二醇浓度＝5.0×10-4M)
·溶液E：ARS(9.0×10-6M)+PEG-FPBA(2.0×10-3M)+没食子酸(二醇浓度＝5.0×10-4M)
·溶液F：ARS(9.0×10-6M)+PEG-P[Lys(FPBA)10]20(FPBA浓度：2.0×10-3M)+鞣酸(二醇浓度＝5.0×10-4M)
·溶液G：ARS(9.0×10-6M)+PEG-P[Lys(FPBA)10]20(FPBA浓度：2.0×10-3M)+没食子酸(二醇浓度＝5.0×10-4M)
将溶液A与溶液B或溶液C以各种比率加以混合，使用一次性池进行荧光测定(Ex＝468nm，Em＝572nm)。将所获得的荧光强度、各FPBA浓度代入到以下式(1)中，通过最小平方法制作校准曲线后，根据校准曲线的斜率算出ARS-FPBA体系的平衡常数K0。然后，将溶液B或溶液C与包含各二醇化合物的溶液D、E、F、或G以B+D、B+E、C+F、C+G的组合分别以各种比率加以混合，使用一次性池进行荧光测定(Ex＝468nm、Em＝572nm)。将所获得的荧光强度与各二醇化合物的浓度代入到以下式(2)中，通过最小平方法制作校准曲线后，根据校准曲线的斜率算出各二醇化合物-BPA体系的平衡常数K1。将根据校准曲线获得的平衡常数作为相对平衡常数示于表2。
[数1]
Figure BDA0003371915900000361
Figure BDA0003371915900000362
Figure BDA0003371915900000363
[L0]＝所添加的FPBA浓度
[S0]＝所添加的二醇浓度
[I0]＝ARS浓度
ΔIf＝Ifs-Ifa
ΔIfc＝由ARS-FPBA体系制作的图的截取倒数
Ifs＝ARS-FPBA的萤光强度
Ifa＝溶液A的萤光强度
K0＝ARS-FPBA的平衡常数
K1＝二醇化合物-FPBA的平衡常数
[表2]
没食子酰基 PEG-FPBA PEG10k-P[Lys(FPBA)<sub>10</sub>]<sub>20</sub>
没食子酸 2,030 5,112
鞣酸(TA) 1,877 8,827
没食子酸与PEG-P[Lys(FPBA)10]20的结合常数比没食子酸与PEG-FPBA的结合常数高2.5倍。另外，鞣酸与PEG-P[Lys(FPBA)10]20的结合常数比鞣酸与PEG-FPBA的结合常数高5倍。
5.对培养细胞的评价
＜5.1.概述＞
通过共聚焦显微镜来观察GFP的细胞内分布，确认细胞内摄入路径。
＜5.2.试剂和细胞株＞
没有特别描述的试剂是直接使用市售品。
·绿色荧光蛋白质(rGFP Protein，Mw：33kDa)：Clontech
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20(Mn＝14,000)
·鞣酸：(Mw＝1,701)日本和光纯药公司(Wako Pure Chemical.,Ltd.)
·D-PBS(-)：日本和光纯药公司(Wako Pure Chemical.,Ltd.)
·洛斯维帕克纪念研究所培养基(RPMI)：美国西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich Co.,llc.)
·牛胎儿血清(FBS)：BioseraInc.
·胰蛋白酶-EDTA溶液：美国西格玛生命科学公司(Sigma life science Co.,Ltd.)
·青霉素/链霉素：美国西格玛生命科学公司(Sigma life science Co.,Ltd.)
·5mol/L HCl：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·CT26细胞(小鼠结肠癌细胞系)：美国模式培养物集存库(American TypeCulture Collection.)
·LysoTracker(注册商标)red DND-99：美国赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific Inc.)
·Hoechst 33342：美国赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.)
·多聚甲醛：日本半井试剂公司(Nacalai Tesque Inc.)
制成4％多聚甲醛/D-PBS(-)溶液来使用。
＜5.3.测定仪器＞
·Countess：美国赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.)
·LSM710：德国卡尔蔡司公司(Carl Zeiss Co.,Ltd.)
＜5.4.通过共聚焦显微镜来观察GFP的细胞内分布＞
[GFP、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·GFP：0.5μM
·鞣酸：40μM(制备浓度：82.5μM)
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20中所包含的来自FPBA的结构：250μM(以FPBA浓度算出)
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
使GFP溶液与鞣酸溶液混合，并使用超滤膜(Mwco：10kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备GFP/TA溶液。然后，另外向GFP/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液，制备GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液。
[通过共聚焦显微镜来观察]
在35mm2玻璃底培养皿中将CT26细胞以5.0×104个细胞/培养皿的方式进行接种，在37℃、5％CO2预培养24小时。向各培养皿中添加200μL的上述GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液，培养6小时。利用1mL的D-PBS(-)洗涤后，加入100nM LysoTracker(注册商标)red DND-99/(D-PBS(-)：RPMI＝1：9)溶液1mL，培养30分钟。利用1mL的D-PBS(-)洗涤后，利用4％多聚甲醛/D-PBS(-)溶液培养4分钟。利用1mL的D-PBS(-)洗涤后，加入5.0μg/mLHoechst/D-PBS(-)溶液1mL，并培养5分钟。利用1mL的D-PBS(-)洗涤2次后，加入2mL的RPMI，并利用CLSM进行观察。所获得的结果示于图19。
由于GFP局部存在于内体/溶酶体中，所以提示是通过内噬作用而摄入到细胞中。
5.对于皮下肿瘤模型小鼠的效果(血中滞留性、肿瘤蓄积性)
＜5.1.概述＞
评价GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20复合物在CT26(小鼠大肠癌细胞)皮下肿瘤模型小鼠中的体内动态。
＜5.2.试剂、细胞和动物＞
·绿色荧光蛋白质(rGFP Protein，Mw：33kDa)：Clontech
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20(Mn＝14,000)
·鞣酸：(Mw＝1,701)日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.)
·CT-26细胞(小鼠结肠癌细胞系)：美国模式培养物集存库(American TypeCulture Collection.)
·BALB/c小鼠：查尔斯河日本公司(Charles River Japan Inc.)
·GFP ELISA试剂盒(ab171581)：美国艾博抗公司(abcam)
包含提取缓冲液、96孔板、抗体溶液、洗涤缓冲液、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、终止液。
＜5.3.仪器、设备＞
·Countess：美国赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.)
·iMark：BioRAD
＜5.4.GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20复合物的体内动态＞
为了对GFP、GFP/TA和GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20的血中滞留性和肿瘤蓄积性进行评价，将GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20静脉注射到CT26皮下肿瘤模型小鼠，利用ELISA来测定经过一定时间后的血液和肿瘤的GFP含量。
[GFP、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·GFP：2.2μM
·鞣酸：350μM
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20中所包含的来自FPBA的结构：1mM(以FPBA浓度算出)
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
使GFP溶液与鞣酸溶液混合，并使用超滤膜(Mwco：10kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备GFP/TA溶液。然后，另外向GFP/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液，制备GFP、GFP/TA和GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液。
[CT26皮下肿瘤模型小鼠的制作]
将100μl的CT26细胞悬浮液(1.0×106细胞/ml)皮下注射到BALB/c小鼠。
[体内动态的评价]
对肿瘤尺寸约达200mm3的模型小鼠尾静脉给药100μl的上述制备溶液。在样品给药后的2、6、24小时后进行解剖，回收血液和各种器官，加入5倍重量的细胞提取缓冲液，在冰上培养20分钟。然后，在4℃以18,000g×20分钟进行离心分离，利用细胞提取缓冲液稀释上清液，并将50μl加入到GFP ELISA试剂盒的96孔板中，添加抗体溶液，在常温以1h×400rpm进行振荡。然后，利用350μl的洗涤缓冲液洗涤3次后，加入100μl的TMB，在常温振荡10分钟，添加终止液。然后，利用读板仪测定450nm的吸光度，根据校准曲线算出GFP的浓度，并评价体内动态。其结果示于图20、图21。
GFP和GFP/TA的血药浓度在给药后的2、6小时后约为5.0％、1.5％，表现为从血中迅速地消失，另一方面，GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20在给药后的6小时后为15％，在给药后的24小时后仍为3.8％，显示明显高的血药浓度。进一步地，GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20在2、6、24小时后的时间点，显示比GFP高2.5倍、5.5倍、10倍的肿瘤蓄积。根据这些结果显示，通过由GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20构成的蛋白质递送系统，除提高血中滞留性以外，还成功赋予了肿瘤蓄积性和滞留性。
6.确认形成包封各种物质的三元复合物
＜6.1.概述＞
除使用GFP蛋白质以外，还使用低分子药物、肽、腺相关病毒、无机粒子、核酸等，形成三元复合物，对粒径变化进行测定。测定方法使用动态光散射法(DLS)或荧光相关光谱法(FCS)。
＜6.2.试剂＞
没有特别描述的试剂、溶剂是直接使用市售品。
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20(Mn＝14,000)
·鞣酸：(Mw＝1,701)日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.)
·D-PBS(-)：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·博来霉素硫酸盐(简称为博来霉素)：1513.6g/mol，日本东京化成工业公司(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)
·孟加拉玫瑰红：973.67g/mol，日本东京化成工业公司(Tokyo ChemicalIndustry Co.,Ltd.)
·氯e6：596.7g/mol，开曼化学公司(Cayman Chemical Co.,Ltd.)
·匹伐他汀钙(简称为匹伐他汀)：880.98g/mol，日本和光纯药工业公司(WakoPure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·白树毒素：Mw～30kDa，恩佐生命科学公司(Enzo Life Sciences,Inc.)
·绿脓杆菌外毒素A(PE)：Mw～60kDa，美国西格玛奥德里奇公司(Sigma AldrichCo.,llc.)
·绿色荧光蛋白质(rGFP)Protein：Mw 33k Da,Clontech
·β-D-半乳糖苷酶(βGal)：Mw540 kDa，日本和光纯药工业公司(Wako PureChemical Industries Co.,Ltd.)
·FITC-LC-黑腹果蝇触足肽(简称为肽)：2748.3g/mol，Anaspec Inc.
·AAV9-CMV-Luc(简称为AAV)：美国思科生物公司(SignaGen Laboratories.)
·金纳米粒子(AuNP)：粒径：15nm，0.050mg/ml，2.3nM，BBI溶液.
·Alexa Fluor647-TUG1(TUG1反义核酸，简称为TUG1)：8058.7g/mol，GeneDesign,Inc.
＜6.3.测定仪器＞
(荧光相关光谱法)
·LSM710：德国卡尔蔡司公司(Carl Zeiss Co.,Ltd.)
温度：25℃，测定时间：10秒钟，累计次数：10次
(动态光散射法)
·激光粒度仪(Zetasizer Nano ZS)(Zetasizer)：英国马尔文仪器公司(MalvernInstruments)
温度：25℃，测定时间：10秒钟，累计次数：10次
动态光散射的测定方法如以下所述。使用动态光散射(DLS激光粒度仪(英国马尔文仪器公司制备)，检测角度173°和温度25℃，进行DLS测定。使用He-Ne激光(633nm)作为入射光束。将各复合物溶液加入到小玻璃比色管(容量12μL，ZEN2112，英国马尔文仪器公司制备)中。利用累积法(キュムラント法)，对根据光子相关函数中的衰减率获得的数据进行分析，然后，通过上述爱因斯坦-斯托克斯方程，算出各复合物的流体力学直径(个数基准的算术平均直径)。
＜6.4.博来霉素三元复合物形成的评价＞
[博来霉素、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·博来霉素：0.02mg/mL
·鞣酸：0.2mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：3.3mg/mL
这些是分别溶解在D-PBS(-)中来制备。
将博来霉素溶液与鞣酸溶液混合，制备博来霉素/TA溶液。然后，向博来霉素/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备博来霉素/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20(博来霉素三元复合物)溶液。使用激光粒度仪(Zetasizer)来测定粒径，将所测得的结果示于表3。
由于博来霉素三元复合物的粒径与博来霉素单体时的粒径相比明显增大，所以确认形成博来霉素三元复合物。
＜6.5.孟加拉玫瑰红三元复合物形成的评价＞
[孟加拉玫瑰红、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·孟加拉玫瑰红：0.02mg/mL
·鞣酸：0.2mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：3.3mg/mL
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
实施例中所使用的孟加拉玫瑰红的结构如下所示。
[化16]
Figure BDA0003371915900000411
将孟加拉玫瑰红溶液与鞣酸溶液混合，制备孟加拉玫瑰红/TA溶液。然后，向孟加拉玫瑰红/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备孟加拉玫瑰红/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20(孟加拉玫瑰红三元复合物)溶液。使用激光粒度仪(Zetasizer)测定粒径，将所测得的结果示于表3。
由于孟加拉玫瑰红三元复合物的粒径与孟加拉玫瑰红单体时的粒径相比明显增大，所以确认形成孟加拉玫瑰红三元复合物。
＜6.6.氯e6三元复合物形成的评价＞
[氯e6、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·氯e6：1μM
·鞣酸：15μM
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：30μM
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将氯e6溶液与鞣酸溶液混合，制备氯e6/TA溶液。然后，向氯e6/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备氯e6/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20(氯e6三元复合物)溶液。使用LSM710，并利用FCS测定粒径，将所测得的结果示于表3。
由于氯e6三元复合物的粒径与氯e6单体时的粒径相比明显增大，所以确认形成氯e6三元复合物。
＜6.7.匹伐他汀三元复合物形成的评价＞
[匹伐他汀、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·匹伐他汀：0.02mg/mL
·鞣酸：0.2mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：3.3mg/mL
匹伐他汀是溶解于含有5％THF的D-PBS(-)中来制备，TA和PEG-P[Lys(FBPA)10]20是溶解于D-PBS(-)中来制备。
使匹伐他汀溶液与鞣酸溶液混合制备匹伐他汀/TA溶液。然后，向匹伐他汀/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备匹伐他汀/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20(匹伐他汀三元复合物)溶液。使用激光粒度仪(Zetasizer)来测定粒径，将所测得的结果示于表3。
由于在匹伐他汀溶液中凝集的匹伐他汀(作为测定值为4586nm)在匹伐他汀/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液中粒径达60.2nm，所以确认形成匹伐他汀三元复合物。
＜6.8.白树毒素三元复合物形成的评价＞
[白树毒素、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·白树毒素：0.5μM
·鞣酸：82.5μM
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：50μM
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将白树毒素溶液与鞣酸溶液混合，并使用超滤膜(Mwco：3.5kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备白树毒素/TA溶液。然后，向白树毒素/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备白树毒素/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(白树毒素三元复合物溶液)。使用激光粒度仪(Zetasizer)来测定粒径，将所测得的结果示于表3。
由于白树毒素三元复合物的粒径与白树毒素单体时的粒径相比明显增大，所以确认形成白树毒素三元复合物。
＜6.9.PE三元复合物形成的评价＞
[PE、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·PE：0.25μM
·鞣酸：82.5μM
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：50μM
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将PE溶液与鞣酸溶液混合，并使用超滤膜(Mwco：3.5kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备PE/TA溶液。然后，向PE/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备PE/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(PE三元复合物溶液)。使用激光粒度仪(Zetasizer)来测定粒径，将所测得的结果示于表3。
由于PE三元复合物的粒径与PE单体时的粒径相比明显增大，所以确认形成PE三元复合物。
＜6.10.rGFP三元复合物形成的评价＞
以与上述3.4.的复合物形成的评价相同的方式测定粒径，将所测得的结果示于表3。
＜6.11.βGal三元复合物形成的评价＞
[βGal、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·βGal：0.1mg/mL
·鞣酸：0.37mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：3.95mg/mL
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将βGal溶液与鞣酸溶液混合，制备βGal/TA溶液。然后，向βGal/TA溶液添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备βGal/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(βGal三元复合物溶液)。使用激光粒度仪(Zetasizer)来测定粒径，将所测得的结果示于表3。
由于βGal三元复合物的粒径与βGal单体时的粒径相比明显增大，所以确认形成βGal三元复合物。
＜6.12.肽三元复合物形成的评价＞
[肽、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·肽：1μM
·鞣酸：8μM
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：15μM
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将肽溶液与鞣酸溶液混合，制备肽/TA溶液。然后，向肽/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备肽/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20(肽三元复合物)溶液。使用LSM710，并利用FCS测定粒径，将测得的结果示于表3。
由于肽三元复合物的粒径与肽单体时的粒径相比明显增大，所以确认形成肽三元复合物。
＜6.13.AAV三元复合物形成的评价＞
[AAV、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·AAV：2.0×1010vL/mL
·鞣酸：2.04×10-4mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：0.0022mg/mL
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将AAV溶液与鞣酸溶液混合，制备AAV/TA溶液。然后，向AAV/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备AAV/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(AAV三元复合物溶液)。使用激光粒度仪(Zetasizer)来测定粒径，将所测得的结果示于表3。
由于AAV三元复合物的粒径与AAV单体时的粒径相比明显增大，所以确认形成AAV三元复合物。
＜6.14.AuNP三元复合物形成的评价＞
[AuNP、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·AuNP：1.0nM
·鞣酸：1μM
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：2μM
这些是分别溶解于超纯水中来制备。
将AuNP溶液与鞣酸溶液混合，使用超滤膜(Mwco：10kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备AuNP/TA溶液。然后，向AuNP/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备AuNP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(AuNP三元复合物溶液)。使用激光粒度仪(Zetasizer)来测定粒径，将所测得的结果示于表3。
由于AuNP三元复合物的粒径与AuNP单体时的粒径相比明显增大，所以确认形成AuNP三元复合物。
＜6.15.TUG1三元复合物形成的评价＞
[TUG1、TA、PEG-P[Lys(FPBA)m]n的最终浓度]
·TUG1：100nM
·鞣酸：5μM
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：10μM
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将TUG1溶液与鞣酸溶液混合，制备TUG1/TA溶液。然后，向TUG1/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备TUG1/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20(TUG1三元复合物)溶液。使用LSM710，并利用FCS测定粒径，将所测得的结果示于表3。
由于TUG1复合物的粒径与TUG1单体时的粒径相比明显增大，所以确认形成TUG1复合物。
[表3]
Figure BDA0003371915900000451
*利用DLS动态光散射法进行测量
**利用FCS荧光相关光谱法进行测量
7.孟加拉玫瑰红三元复合物的功能性评价
＜7.1.概述＞
通过孟加拉玫瑰红三元复合物动物实验来评价血中滞留性。
＜7.2.试剂＞
没有特别描述的试剂是直接使用市售品。
·孟加拉玫瑰红：(973.67g/mol)日本东京化成工业公司(Tokyo ChemicalIndustry Co.,Ltd.)
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20(Mn＝14,000)
·鞣酸：(Mw＝1,701)日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.)
·D-PBS(-)：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·BALB/c小鼠：查尔斯河日本公司(Charles River Japan Inc.)
·被动裂解缓冲液：美国普洛麦格公司(Promega corporation.)
＜7.3.测定仪器＞
·Guava(注册商标)easyCyte流式细胞仪(Guava easyCyte Flow Cytometry)(FCM)：德国默克密理博公司(Merck Millipore)
·Spark：瑞士帝肯公司(Tecan Group Ltd.)
＜7.4.孟加拉玫瑰红三元复合物的体内动态＞
[孟加拉玫瑰红、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·孟加拉玫瑰红：0.1mg/mL
·鞣酸：1.0mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：16.5mg/mL
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将孟加拉玫瑰红溶液与鞣酸溶液混合，制备孟加拉玫瑰红/TA溶液。然后，向孟加拉玫瑰红/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备孟加拉玫瑰红溶液、孟加拉玫瑰红/TA复合物溶液、和孟加拉玫瑰红/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20(孟加拉玫瑰红三元复合物)溶液。
[体内动态的评价]
针对模型小鼠，尾静脉给药200μl的上述制备溶液。在样品给药后的1、3小时后进行解剖，回收血液，在20℃以5,000g×10分钟进行离心分离，回收100μl的血浆成分，加入700μl的被动裂解缓冲液。然后，利用Spark测定血浆成分和给药的样品的荧光强度(Ex/Em：520nm/570nm)，评价血中滞留性。其结果示于图22。图中，将孟加拉玫瑰红/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20记为孟加拉玫瑰红/TA/聚合物。
给药3小时后的孟加拉玫瑰红和孟加拉玫瑰红/TA复合物的血药浓度分别约为0.22％、1.02％。另一方面，关于孟加拉玫瑰红三元复合物的血药浓度，在给药后的3小时后为2.2％，显示出比孟加拉玫瑰红单体时高约10倍的血药浓度。根据该结果显示，孟加拉玫瑰红三元复合物与孟加拉玫瑰红单体时和孟加拉玫瑰红/TA相比，达到了血中滞留性的提高。
8.GFP三元复合物的功能性评价
＜8.1.概述＞
对GFP三元复合物实施功能性评价。具体而言，对溶液中的鞣酸的氧化相关的稳定性进行评价，且对GFP三元复合物的细胞内分子即三磷酸腺苷(ATP)响应进行评价。
＜8.2.试剂＞
没有特别描述的试剂、溶剂是直接使用市售品。
·绿色荧光蛋白质(rGFP Protein)：Mw＝33k Da，Clontech
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20(Mn＝14,000)
·鞣酸：(Mw＝1,701)日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.)
·D-PBS(-)：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·三磷酸腺苷(ATP)：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.)
＜8.3.测定仪器＞
·LSM710：德国卡尔蔡司公司(Carl Zeiss Co.,Ltd.)
·荧光光度计FP-8300：日本佳司科国际公司(Jasco International Co.,Ltd.)
·吸收比色计(V-650，JASCO,Tokyo,Japan)
＜8.4.评价通过添加引入硼酸的高分子来抑制TA的氧化＞
[TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·鞣酸：0.5mg/ml
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20：2.2mg/ml
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将鞣酸溶液与PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液混合，制备TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液。
[溶液中的TA的氧化抑制的评价]
将所制备的TA溶液、TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液在37℃培育固定时间后，利用吸光度计，测定来自作为TA的氧化物的醌的吸光波长(380nm)的吸光度增加。所获得的结果示于图23A，24小时后的各溶液的照片示于图23B。
根据图23A和图23B所示的结果显示，TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液的吸光度的经时增加和24小时后的颜色变化相较于TA溶液，得到大幅抑制。由此可知，通过添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，使得鞣酸的氧化得到大幅抑制。
＜8.5.GFP三元复合物的经时稳定性评价＞
[GFP、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·GFP：0.5μM
·鞣酸：82.5μM
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20的FBPA：250μM
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将GFP溶液与鞣酸溶液混合，使用超滤膜(Mwco：3.5kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备GFP/TA溶液。然后，向GFP/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液，制备GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20复合物(GFP三元复合物)溶液。
[GFP三元复合物的稳定性评价]
将所制备的GFP三元复合物在37℃培育固定时间后，使用LSM710，并利用FCS测定粒径，将所测得的结果示于图23C。另外，使用FP-8300测定荧光强度，将所测得的结果同样地示于图23C。
即便在24小时后，仍没有观察到粒径和荧光强度的明显变化，因此可知，GFP三元复合物稳定地形成了复合物。
＜8.6.在ATP溶液中的GFP三元复合物的稳定性评价＞
[GFP、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·GFP：0.5μM
·鞣酸：82.5μM
·PEG-P[Lys(FPBA)10]20的FBPA：250μM
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将GFP溶液与鞣酸溶液混合，使用超滤膜(Mwco：3.5kDa)，以10,000g×5分钟进行2次离心，制备GFP/TA溶液。然后，向GFP/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液，制备GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20复合物(GFP三元复合物)溶液。
[ATP溶液中的GFP三元复合物的稳定性评价]
使所制备的GFP三元复合物与固定浓度的ATP溶液混合后，使用LSM710，利用FCS测定粒径。将结果示于图24。
由于随着ATP的浓度增加，观察到粒径明显减少，所以确认，GFP三元复合物具有随着ATP的浓度增加，鞣酸与PEG-P[Lys(FPBA)10]20的结合发生解离的ATP响应。
9.βGal三元复合物形成的功能性评价
＜9.1.概要＞
实施βGal三元复合物的功能性评价。具体来说，对βGal三元复合物在溶液中和细胞内的酶活性进行评价，且通过动物实验对体内动态进行评价。
＜9.2.试剂＞
没有特别描述的试剂是直接使用市售品。
·β-D-半乳糖苷酶(βGal)：Mw 540kDa，日本和光纯药工业公司(Wako PureChemical Industries Co.,Ltd.)
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20(Mn＝14,000)
·鞣酸：(Mw＝1,701)日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.)
·Alexa Fluor647-NHS：Mw＝1250，美国赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific Inc.)
·D-PBS(-)：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·GlycoGREEN(注册商标)-βGal：日本五稜化药股份有限公司(GORYO Chemical,Inc.)
·洛斯维帕克纪念研究所培养基(RPMI)：美国西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich Co.,llc.)
·牛胎儿血清(FBS)：BioseraInc.
·胰蛋白酶-EDTA溶液(Trp)：美国西格玛生命科学公司(Sigma life scienceCo.,Ltd.)
·青霉素/链霉素(PS)：美国西格玛生命科学公司(Sigma life science Co.,Ltd.)
·CT26细胞(小鼠结肠癌细胞系)：美国模式培养物集存库(American TypeCulture Collection.)
·BALB/c小鼠：查尔斯河日本公司(Charles River Japan Inc.)
·被动裂解缓冲液：美国普洛麦格公司(Promega corporation.)
·二甲基亚砜(DMSO)：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.)
＜9.3.测定仪器＞
·LSM710：德国卡尔蔡司公司(Carl Zeiss Co.,Ltd.)
·荧光光度计FP-8300：日本佳司科国际公司(Jasco International Co.,Ltd.)
·吸收比色计V-650：日本佳司科国际公司(Jasco International Co.,Ltd.)
＜9.4.βGal三元复合物在溶液中的活性评价＞
[βGal、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·βGal：0.1mg/mL
·鞣酸：0.37mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：3.95mg/mL
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将βGal溶液与鞣酸溶液混合，制备βGal/TA溶液。然后，向βGal/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备βGal/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(βGal三元复合物溶液)。
[GlycoGREEN-βGal的最终浓度]
·GlycoGREEN-βGal 1mM
其是溶解于DMSO中来制备。
[βGal三元复合物在溶液中的活性评价]
向所制备的20μl的βGal溶液、βGal/TA溶液、和βGal三元复合物溶液中分别加入1μl的1mM GlycoGREEN-βGal溶液，利用FP-8300，经时测定在GlycoGREEN-βGal与βGal发生酶促反应时所检测到的荧光(Ex/Em：480/510nm)。所获得的结果示于图25A。另外，各溶液的最大荧光强度示于图25B。图中，将βGal/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20记为β半乳糖苷酶/TA/聚合物。
根据图25A和图25B所示的结果显示，βGal三元复合物的酶促反应与βGal单体时的酶促反应相比，得到抑制，可知通过使复合物包封βGal，而使得表观酶活性降低。
＜9.5.βGal三元复合物在细胞内的活性评价＞
[向βGal复合物引入Alexa647]
·βGal：10mg
·Alexa Flour647-NHS：0.12mg
在20mL拜耳瓶(バイヤル瓶)中量取10mg的βGal，使其溶解于pH8.0的10mL 50mMNaHCO3中。加入0.12mg的溶解于DMSO中的Alexa Flour647-NHS，并在室温搅拌4小时。对于反应溶液，使用D-PBS(-)进行2次超过滤(Mwco：10kDa)后，利用PD-10色谱柱(溶剂是D-PBS(-))将未反应的Alexa Flour647-NHS去除后，再次使用D-PBS(-)进行2次超过滤(Mwco：10kDa)，在溶液状态下回收Alexa Flour647修饰βGal(Alexa647-βGal)。然后，根据来自蛋白质的吸收波长280nm的吸光度算出βGal浓度。
[βGal、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·βGal：0.1mg/mL
·Alexa647-βGal：0.1mg/ml
·鞣酸：0.37mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：3.95mg/mL
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将βGal溶液与鞣酸溶液混合，制备βGal/TA溶液。然后，向βGal/TA溶液添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，分别制备βGal、βGal/TA、和βGal/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(βGal三元复合物溶液)。
使用Alexa647-βGal代替βGal，进行同样的操作，分别制备Alexa647-βGal、Alexa647-βGal/TA复合物、和Alexa647-βGal/TAβGal/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(Alexa647-βGal三元复合物溶液)。
[GlycoGREEN-βGal的最终浓度]
·GlycoGREEN-βGal 1mM
其是溶解于DMSO中来制备。
[βGal三元复合物摄入到细胞内的摄入量的评价]
在RPMI中混合FBS和PS以使各自达到10wt％、2wt％，制备细胞用培养基。使CT26细胞悬浮在细胞用培养基中，制备1.25×105细胞/ml的细胞悬浮液。将该细胞悬浮液400μl接种至24孔板(每孔有5.0×104个细胞)，在37℃培养24小时。将培养基去除后，利用D-PBS(-)洗涤1次后，加入400μl的使用Alexa647-βGal所制备的各溶液，在37℃培养6小时。培养固定时间后，将溶液去除，利用D-PBS(-)洗涤2次，加入150μl的Trp，在37℃培养7分钟后，加入150μl的D-PBS(-)+10％FBS，利用流式细胞仪(FCM)测定来自Alexa647的荧光强度(Ex/Em：642/664nm)，评价各样品的细胞摄入量。所获得的结果示于图26A。
[βGal三元复合物在细胞中的活性评价]
使CT26细胞悬浮在细胞用培养基中，制备1.25×105细胞/ml的细胞悬浮液。将该细胞悬浮液400μl接种到24孔板中(每孔有5.0×104个细胞)，在37℃培养24小时。将培养基去除后，利用D-PBS(-)洗涤1次后，加入400μl的使用βGal所制备的各溶液，在37℃培养6小时。培养固定时间后，将溶液去除，利用D-PBS(-)洗涤2次后，加入400μl的制备成1μM的GlycoGREEN-βGal，培养30分钟。然后，将溶液去除，利用D-PBS(-)洗涤2次后，加入150μl的Trp，在37℃培养7分钟后，加入150μl的D-PBS(-)+10％FBS，利用流式细胞仪(FCM)测定GlycoGREEN-βGal与βGal发生酶促反应时所检测到的来自活性的荧光强度(Ex/Em＝488nm/525nm)。所获得的结果示于图26B。另外，用所获得的来自活性的荧光强度除以与上述细胞内摄入量对应的荧光强度，所得的结果示于图26C。
根据图26C所示的结果可知，βGal三元复合物在细胞内的活性与βGal单体时等同。
＜9.6.βGal三元复合物的体内动态＞
[Alexa647-βGal、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·Alexa647-βGal：0.5mg/ml
·鞣酸：1.85mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：19.74mg/mL
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将Alexa647-βGal溶液与鞣酸溶液混合，制备Alexa647-βGal/TA溶液。然后，向Alexa647-βGal/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备Alexa647-βGal和Alexa647-βGal/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(Alexa647-βGal三元复合物溶液)。
[CT26皮下肿瘤模型小鼠的制作]
对于Balb/c小鼠，皮下注射100μl的CT26细胞悬浮液(1.0×106细胞/ml)。
[体内动态的评价]
对于肿瘤尺寸约达200mm3的模型小鼠，尾静脉给药200μl的上述制备溶液。在样品给药后的6小时后进行解剖，回收血液和器官。对于血液，在20℃以5,000g×10分钟进行离心分离，回收100μl的血浆成分，加入700μl的被动裂解缓冲液。器官是分别测量重量，加入8倍重量的被动裂解缓冲液后，进行均质化。然后，以10,000g×5分钟进行离心分离，利用TECAN测定上清液的荧光强度(Ex/Em：640nm/680nm)，评价血中滞留性和体内动态。其结果示于图27。在图中，将Alexa647-βGal记为β半乳糖苷酶，将Alexa647-βGal/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20记为β半乳糖苷酶/TA/聚合物。
Alexa647-βGal三元复合物的血中滞留性和肿瘤蓄积性比Alexa647-βGal分别高4倍、15倍。另一方面，Alexa647-βGal三元复合物在作为正常组织的肝脏、肾脏、肺中的蓄积性比Alexa647-βGal分别高1.4倍、5.0倍、0.2倍，与在肿瘤中的蓄积性相比，得到大幅抑制。
10.AAV三元复合物形成的功能性评价
＜10.1.概述＞
实施AAV三元复合物的功能性评价。具体来说，通过细胞实验和动物实验来评价AAV三元复合物的基因表达效率。
＜10.2.试剂＞
没有特别描述的试剂是直接使用市售品。
·AAV9-CMV-Luc(AAV)：美国思科生物公司(SignaGen Laboratories.)
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20(Mn＝14,000)
·鞣酸：(Mw＝1,701)日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.)
·D-PBS(-)：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·D-PBS(+)：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·洛斯维帕克纪念研究所培养基(RPMI)：美国西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich Co.,llc.)
·牛胎儿血清(FBS)：BioseraInc.
·胰蛋白酶-EDTA溶液(Trp)：美国西格玛生命科学公司(Sigma life scienceCo.,Ltd.)
·青霉素/链霉素(PS)：美国西格玛生命科学公司(Sigma life science Co.,Ltd.)
·CT26细胞(小鼠结肠癌细胞系)：美国模式培养物集存库(American TypeCulture Collection.)
·BALB/c小鼠：查尔斯河日本公司(Charles River Japan Inc.)
·被动裂解缓冲液：美国普洛麦格公司(Promega corporation.)
·荧光素酶检测系统(荧光素溶液)：美国普洛麦格公司(Promega corporation.)
·抗-AAV-9，小鼠单克隆：PROGEN
＜10.3.测定仪器＞
·GloMax多功能检测系统：美国普洛麦格公司(Promega corporation.)
·富士DRI-CHEM NX500：日本富士胶片公司
＜10.4.通过细胞实验来评价AAV三元复合物的基因表达效率＞
[AAV、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·AAV9-CMV-Luc(简称为AAV)：2.0×1010vL/mL
·鞣酸：2.0×10-4mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：2.2×10-3mg/mL
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将AAV溶液与鞣酸溶液混合，制备AAV/TA溶液。然后，向AAV/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备AAV、AAV/TA、和AAV/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(AAV三元复合物溶液)。
[AAV三元复合物在细胞中的摄入量的评价]
在RPMI中混合FBS和PS以使各自达到10wt％、2wt％，制备细胞用培养基。使CT26细胞悬浮在细胞用培养基中，制备2.0×105细胞/ml的细胞悬浮液。将25μl的该细胞悬浮液接种到96孔板中(每孔有5.0×103个细胞)，加入25μl的制备的各溶液，在37℃培养72小时。培养固定时间后，将溶液去除，利用D-PBS(+)洗涤1次，加入50μl的被动裂解缓冲液，在37℃培养15分钟后，将20μl的各细胞悬浮液转移到发光测定用白色板96F(MS-8096W，日本住友电木公司)中，使用GloMax多功能检测系统，加入100μl的荧光素溶液来测定发光强度。所获得的结果示于图28。图中，将AAV/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20记为AAV/TA/聚合物。
根据图28所示的结果可知，使用AAV三元复合物时的Luc基因表达效率与使用AAV单体时相比，明显提升。
＜10.5.通过动物实验来评价AAV三元复合物的基因表达效率＞
[AAV、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·AAV9-CMV-Luc(简称为AAV)：2.0×1012vL/mL
·鞣酸：2.0×10-2mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：2.2×10-1mg/mL
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将AAV溶液与鞣酸溶液混合，制备AAV/TA溶液。然后，向AAV/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备AAV、AAV/TA、和AAV/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(AAV三元复合物溶液)。
[CT26皮下肿瘤模型小鼠的制作]
对于Balb/c小鼠，皮下注射100μl的CT26细胞悬浮液(1.0×106细胞/ml)。
[体内动态的评价]
对于肿瘤尺寸约达200mm3的模型小鼠，尾静脉给药100μl的上述制备溶液。在样品给药后的2周后进行解剖，回收血液和器官。器官是各自测量重量，加入1至3倍重量的被动裂解缓冲液后，进行均质化。然后，在20μl的经过均质化的悬浮液中加入100μl的荧光素溶液，使用GloMax多功能检测系统，测定各器官的基因表达量。关于各器官的Luc基因表达量，将各器官的AAV单体时的Luc基因表达量设为1的基因表达比率的结果示于图29。图中，将AAV/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20记为AAV/TA/聚合物。
根据图29的各器官中的基因表达比率的结果可知，AAV三元复合物在肝脏、肾脏、心脏等正常组织内的基因表达比率与AAV单体时相比分别为0.80倍、0.02倍、0.27倍，得到大幅抑制。另一方面，肿瘤中的AAV三元复合物的基因表达比率比AAV单体时高6.16倍。
对于另外回收的血液，在20℃以5,000g×10分钟进行离心分离，回收血浆成分，使用富士DRI-CHEM NX500，测定ALT和AST并评价肝脏毒性。所获得的结果示于图30A和30B。
根据图30A、30B所示的结果，在AAV/TA复合物的情况下，由于ALT和AST上升，所以观察到肝脏毒性，但在AAV三元复合物的情况下未观察到肝脏毒性。
＜10.6.通过细胞实验来评价使用AAV9抗体时AAV三元复合物的基因表达效率抑制＞
[AAV、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·AAV9-CMV-Luc(简称为AAV)：2.0×1010vL/mL
·鞣酸：2.0×10-4mg/mL
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：2.2×10-3mg/mL
抗AAV-9，小鼠单克隆(简称为AAV抗体)：稀释到105、107倍
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
使AAV溶液与鞣酸溶液混合，制备AAV/TA溶液。然后，添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备AAV、AAV/TA、AAV/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20溶液(AAV三元复合物溶液)。
[AAV三元复合物在细胞中的摄入量的评价]
使CT26细胞悬浮在RPMI中，制备2.0×105细胞/ml的细胞悬浮液。将25μl的该细胞悬浮液接种到96孔板中(每孔有5.0×103个细胞)，加入1μl的所制备的各AAV溶液、25μl的AAV抗体溶液，在37℃培养48小时。培养固定时间后，将溶液去除，利用D-PBS(+)洗涤1次，加入50μl的被动裂解缓冲液，在37℃培养15分钟后，将20μl的各细胞悬浮液转移到发光测定用白色板96F(MS-8096W，日本住友电木公司)，使用GloMax多功能检测系统，加入100μl的荧光素溶液来测定发光强度。所获得的结果示于图31。此时，将不加入AAV抗体而只是使各AAV溶液样品与CT26细胞培养时的发光强度算作100％。图中，将AAV/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20记为AAV/TA/聚合物。
根据图31所示的结果可知，在AAV单体和AAV/TA复合物时，与不添加AAV9抗体时相比，添加AAV9抗体会使基因表达效率降低，但在AAV三元复合物时，即便添加AAV9抗体也不会使基因表达效率降低。
11.TUG1三元复合物的药代动力学的评价
＜11.1.概述＞
实施TUG1三元复合物的功能性评价。具体来说，利用动物实验来评价TUG1三元复合物的血中滞留性。
＜11.2.试剂和细胞株＞
没有特别描述的试剂是直接使用市售品。
·Alexa647-TUG1(简称为TUG1)：8058.7g/mol，GeneDesign,Inc.
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20(Mn＝14,000)
·鞣酸：(Mw＝1,701)日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical IndustriesCo.,Ltd.)
·D-PBS(-)：日本和光纯药工业公司(Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd.)
·BALB/c小鼠：查尔斯河日本公司(Charles River Japan Inc.)
·被动裂解缓冲液：美国普洛麦格公司(Promega corporation.)
＜11.3.测定仪器＞
·Nikon A1R：日本尼康公司(Nikon Corporation)
·ECLIPSE FN1：日本尼康公司(Nikon Corporation)
·Spark：瑞士帝肯公司(Tecan Group Ltd.)
将Nikon A1R与ECLIPSE FN1组合，作为体内共聚焦激光显微镜来使用。
＜11.4.利用体内共聚焦激光显微镜测定TUG1的血中滞留性＞
[TUG1、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·TUG1：6.25μM
·鞣酸：312.5μM
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：625μM
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将TUG1溶液与鞣酸溶液混合，制备TUG1/TA溶液。然后，向TUG1/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备TUG1/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]2(TUG1三元复合物)溶液。
[利用体内共聚焦激光显微镜测定TUG1的血中滞留性]
对于模型小鼠，尾静脉给药200μl的上述制备溶液。然后，使用体内共聚焦激光显微镜，测定固定时间的TUG1的血中滞留性。所获得的结果示于图32和表4。图中，将TUG1/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20记为TUG1/TA/聚合物。
[表4]
样品 10％时间(min)
TUG1 28.3
TUG VTA 49.6
TUG1/TA/聚合物 171.4
所获得的结果表明，与TUG1和TUG1/TA相比，TUG1三元复合物的血中滞留性显著延长。
＜11.5.通过采集血液来测定TUG1的血中滞留性＞
[TUG1、TA、PEG-P[Lys(FPBA)10]20的最终浓度]
·TUG1：6.25nM
·鞣酸：312.5μM
·PEG-P[Lys(FBPA)10]20：625μM
这些是分别溶解于D-PBS(-)中来制备。
将TUG1溶液与鞣酸溶液混合，制备TUG1/TA溶液。然后，向TUG1/TA溶液中添加PEG-P[Lys(FPBA)10]20，制备TUG1/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20(TUG1三元复合物)溶液。
[通过采集血液来测定TUG1的血中滞留性]
对于模型小鼠，尾静脉给药200μl的上述制备溶液。在样品给药后的3小时后进行解剖，回收血液。对于血液，在20℃以5,000g×10分钟进行离心分离，回收100μl的血浆成分，加入700μl的被动裂解缓冲液。然后，利用Spark测定溶液和样品的荧光强度(Ex/Em：640nm/680nm)，评价TUG1的血中滞留性。其结果如表5所示。
[表5]
血中滞留性 ％ID/g组织
TUG1 1 0.11
TUG1/TA 1.65 0.18
TUG1/TA/聚合物 40.7 4.41
所获得的结果表明，TUG1三元复合物的血中滞留性比TUG1和TUG1/TA约高40倍，TUG1三元复合物的血中滞留性显著延长。
12.总结
为了提高生理活性蛋白质的血中滞留性和血中稳定性，在本实施例中，在由蛋白质与鞣酸形成的复合物中进一步加入引入硼酸的高分子而构建三元体系的蛋白质递送系统。使用GFP作为模型蛋白质的GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20表现出pH响应和ATP响应。确认GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20在血中环境(pH：～7.4)下会形成稳定的复合物。另外，确认与PEG-FPBA相比，PEG-P[Lys(FPBA)10]20以高结合力与鞣酸结合。进一步测定细胞内分布，结果溶酶体与GFP共定位，由此表明GFP因内噬作用而被摄入。显示由GFP/TA/PEG-P[Lys(FPBA)10]20构成的蛋白质递送系统与GFP单体时和GFP/TA时相比，除提高了血中滞留性以外，也提高了肿瘤蓄积性和滞留性。
另外，如表3所示，确认上述蛋白质递送系统也可以包封除蛋白质以外的分子而形成三元复合物。另外，表明通过使用本发明递送系统，可以改善被包封的包封物的体内动态。三元复合物中所包封的TUG1(核酸)与TUG1单体时和TUG1/TA时相比，观察到显著的血中滞留性。孟加拉玫瑰红(低分子药物)与孟加拉玫瑰红单体时和孟加拉玫瑰红/TA时相比，观察到显著的血中滞留性。
对三元复合物中所包封的βGal(蛋白质)的细胞内活性进行评价，结果显示出与βGal单体时等同的活性。另外，使用三元复合物中所包封的AAV(病毒载体)，测定细胞的基因表达效率，结果确认通过制成三元复合物会提高引入的基因的表达效率。
各实施方式中的各构成和其组合等是举例，能够在不脱离本发明的主旨的范围内进行构成的附加、省略、替换、和其它改变。另外，本发明不受各实施方式限定，而是仅受权利要求书(claim)所限定。

Claims (19)

1.一种复合物，其包含缀合物和与所述缀合物复合的物质，所述缀合物由具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物连接得到。
2.根据权利要求1所述的复合物，其中与所述缀合物复合的物质选自蛋白质、病毒、无机粒子、核酸和低分子药物中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的复合物，其包含缀合物和蛋白质，所述缀合物由具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物连接得到。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的复合物，其中所述具有二醇结构的化合物为多酚。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的复合物，其中所述具有二醇结构的化合物选自鞣酸、没食子酸和这些的衍生物中的至少一种。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的复合物，其中所述高分子具有2个以上的硼酸基。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的复合物，其中所述硼酸基是可具有取代基的苯硼酸基，或可具有取代基的吡啶硼酸基。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的复合物，其中所述硼酸基是下述通式(I)所示的苯硼酸基，或下述通式(II)所示的吡啶硼酸基：
[化1]
Figure FDA0003371915890000011
(式中，X表示卤素原子或硝基，na是0～4的整数)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的复合物，其中所述高分子为选自聚乙二醇、丙烯酸类树脂、聚氨基酸、聚乙烯胺、聚烯丙胺、多核苷酸、聚丙烯酰胺、聚醚、聚酯、聚氨基甲酸酯、多糖类、和这些的共聚物中的至少一种生物相容性高分子。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的复合物，其中所述具有硼酸基的高分子包含第1生物相容性高分子链和与所述第1生物相容性高分子链不同的第2生物相容性高分子链。
11.根据权利要求10所述的复合物，其中所述第2生物相容性高分子链是聚氨基酸，所述硼酸基被引入到所述聚氨基酸的侧链。
12.根据权利要求10或11所述的复合物，其中所述第1生物相容性高分子链是聚乙二醇。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的复合物，其中所述具有硼酸基的高分子包含下述通式(1)或(1-1)所示的结构：
[化2]
Figure FDA0003371915890000021
(式(1)～(1-1)中，
A表示所述第1生物相容性高分子链，
L表示连接子部分，
B表示具有硼酸基的所述第2生物相容性高分子链，其包含下述(b2)所示的重复结构，或者(b1)所示的重复结构和(b2)所示的重复结构)
[化3]
Figure FDA0003371915890000022
(式(b1)～(b2)中，
R1表示氨基酸侧链，
R2是在氨基酸侧链引入所述硼酸基的侧链，
n表示(b1)和(b2)的总数，n是1～1000的整数，m是1～1000的整数(其中m≤n)，当n-m是2以上时，多个R1彼此可以相同或不同，当m是2以上时，多个R2彼此可以相同或不同)。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的复合物，其通过动态光散射法(DLS)或荧光相关光谱法(FCS)所求出的平均粒径为5nm以上200nm以下。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的复合物，其中所述具有硼酸基的高分子的数均分子量为2,000～200,000。
16.一种药物，其含有根据权利要求1至15中任一项所述的复合物作为有效成分。
17.一种癌症治疗剂，其含有根据权利要求1至16中任一项所述的复合物作为有效成分。
18.一种试剂盒，其具备具有硼酸基的高分子和具有二醇结构的化合物。
19.一种缀合物，其由具有硼酸基的高分子与具有二醇结构的化合物连接得到。
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