RU2771104C2 - Улучшенные полиэтилениминовые полиэтиленгликолевые векторы - Google Patents
Улучшенные полиэтилениминовые полиэтиленгликолевые векторы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2771104C2 RU2771104C2 RU2016146389A RU2016146389A RU2771104C2 RU 2771104 C2 RU2771104 C2 RU 2771104C2 RU 2016146389 A RU2016146389 A RU 2016146389A RU 2016146389 A RU2016146389 A RU 2016146389A RU 2771104 C2 RU2771104 C2 RU 2771104C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cancer
- polyplex
- cells
- peg
- conjugate
- Prior art date
Links
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title claims abstract description 86
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 title claims abstract description 61
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 title claims abstract description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 16
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 63
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 54
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 50
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 31
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 claims abstract description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 14
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 110
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 claims description 39
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 18
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 claims description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 14
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 13
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 13
- SOAPXKSPJAZNGO-WDSKDSINSA-N (2s)-2-[[(1s)-1,3-dicarboxypropyl]carbamoylamino]pentanedioic acid Chemical group OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O SOAPXKSPJAZNGO-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 11
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 claims description 11
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 claims description 11
- 125000002993 cycloalkylene group Chemical group 0.000 claims description 11
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 11
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 10
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 229960000575 trastuzumab Drugs 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 7
- 125000004450 alkenylene group Chemical group 0.000 claims description 7
- 125000004419 alkynylene group Chemical group 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 229940022353 herceptin Drugs 0.000 claims description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 125000000041 C6-C10 aryl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 5
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 claims description 5
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 claims description 4
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 claims description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 claims description 4
- 125000005218 alkyleneheteroaryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims description 4
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 210000003171 tumor-infiltrating lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000004209 (C1-C8) alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 101000851196 Mus musculus Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 claims description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940115272 polyinosinic:polycytidylic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 claims description 2
- 208000000102 Squamous Cell Carcinoma of Head and Neck Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 2
- 201000003914 endometrial carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 claims description 2
- 201000000459 head and neck squamous cell carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 claims description 2
- 208000016691 refractory malignant neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 claims 1
- RJSZPKZQGIKVAU-UXBJKDEOSA-N peptide f Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 RJSZPKZQGIKVAU-UXBJKDEOSA-N 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 abstract description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 abstract description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract 1
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 81
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- -1 poly(ethylene oxide) Polymers 0.000 description 45
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 32
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 29
- 101100314454 Caenorhabditis elegans tra-1 gene Proteins 0.000 description 28
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 28
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 25
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 18
- 229920001601 polyetherimide Polymers 0.000 description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 16
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 15
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 14
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 14
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 13
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 12
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical group C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 11
- 101000851176 Homo sapiens Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 9
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 9
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 9
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 8
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 8
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 7
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 7
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 7
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 6
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 6
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 6
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 5
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 101710098940 Pro-epidermal growth factor Proteins 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 5
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin-5-ium Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 RBTBFTRPCNLSDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 239000007821 HATU Substances 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000034994 death Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229960000907 methylthioninium chloride Drugs 0.000 description 4
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- ADOHASQZJSJZBT-SANMLTNESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]indol-3-yl]propanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C(=O)OC(C)(C)C)C=C1C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 ADOHASQZJSJZBT-SANMLTNESA-N 0.000 description 3
- SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-phenylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)C1=CC=CC=C1 SJVFAHZPLIXNDH-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 3
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)NCC(=O)O)C3=CC=CC=C3C2=C1 NDKDFTQNXLHCGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UQXNEWQGGVUVQA-UHFFFAOYSA-N 8-aminooctanoic acid Chemical compound NCCCCCCCC(O)=O UQXNEWQGGVUVQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 125000002837 carbocyclic group Chemical group 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 3
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 238000012637 gene transfection Methods 0.000 description 3
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- KLBPUVPNPAJWHZ-UMSFTDKQSA-N (2r)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-tritylsulfanylpropanoic acid Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21)SC(C=1C=CC=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 KLBPUVPNPAJWHZ-UMSFTDKQSA-N 0.000 description 2
- FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N 0.000 description 2
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 3',5'-di-O-methyltricetin Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C=2)=C1 HRGUSFBJBOKSML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WDYVUKGVKRZQNM-UHFFFAOYSA-N 6-phosphonohexylphosphonic acid Chemical compound OP(O)(=O)CCCCCCP(O)(O)=O WDYVUKGVKRZQNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N Ala-Phe-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RUXQNKVQSKOOBS-JURCDPSOSA-N 0.000 description 2
- WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WVNFNPGXYADPPO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZKDJRSZWLPJNI-SRVKXCTJSA-N His-His-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BZKDJRSZWLPJNI-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- YVCGJPIKRMGNPA-LSJOCFKGSA-N His-Met-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YVCGJPIKRMGNPA-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N L-homophenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC1=CC=CC=C1 JTTHKOPSMAVJFE-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- VCSBGUACOYUIGD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asn-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VCSBGUACOYUIGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RRVCZCNFXIFGRA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N Leu-Ser-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O JIHDFWWRYHSAQB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N Met-Gly-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O LRALLISKBZNSKN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N Piscigenin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(C3=C(O)C=C(O)C=C3OC=2)=O)=C1 IDDMFNIRSJVBHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 229920000463 Poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol) Polymers 0.000 description 2
- SEZGGSHLMROBFX-CIUDSAMLSA-N Pro-Ser-Gln Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O SEZGGSHLMROBFX-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- CRZRTKAVUUGKEQ-ACZMJKKPSA-N Ser-Gln-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CRZRTKAVUUGKEQ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N Ser-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- LFEYMWCCUAOUKZ-FVGYRXGTSA-N [(2s)-1,5-bis[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-1,5-dioxopentan-2-yl]azanium;chloride Chemical compound Cl.CC(C)(C)OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)OC(C)(C)C LFEYMWCCUAOUKZ-FVGYRXGTSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 2
- 229920006187 aquazol Polymers 0.000 description 2
- 239000012861 aquazol Substances 0.000 description 2
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 2
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 2
- 108010028295 histidylhistidine Proteins 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 229960001375 lactose Drugs 0.000 description 2
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 2
- 108040007771 luciferin monooxygenase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 150000003335 secondary amines Chemical class 0.000 description 2
- VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M sodium;1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 VUFNRPJNRFOTGK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silicon Chemical compound CC(C)[Si](C(C)C)C(C)C ZGYICYBLPGRURT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N tricin Natural products COc1cc(OC)c(O)c(c1)C2=CC(=O)c3c(O)cc(O)cc3O2 BMCJATLPEJCACU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UCPYLLCMEDAXFR-UHFFFAOYSA-N triphosgene Chemical compound ClC(Cl)(Cl)OC(=O)OC(Cl)(Cl)Cl UCPYLLCMEDAXFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXGMVGOVILIERA-UHFFFAOYSA-N (2R,3S)-2,3-diaminobutanoic acid Natural products CC(N)C(N)C(O)=O SXGMVGOVILIERA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- NMDDZEVVQDPECF-LURJTMIESA-N (2s)-2,7-diaminoheptanoic acid Chemical compound NCCCCC[C@H](N)C(O)=O NMDDZEVVQDPECF-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- FMUMEWVNYMUECA-LURJTMIESA-N (2s)-2-azaniumyl-5-methylhexanoate Chemical compound CC(C)CC[C@H](N)C(O)=O FMUMEWVNYMUECA-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 125000004529 1,2,3-triazinyl group Chemical group N1=NN=C(C=C1)* 0.000 description 1
- DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 1,2-dichloro-1,1,2,2-tetrafluoroethane Chemical compound FC(F)(Cl)C(F)(F)Cl DDMOUSALMHHKOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003363 1,3,5-triazinyl group Chemical group N1=C(N=CN=C1)* 0.000 description 1
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 4-[[(3ar,5ar,5br,7ar,9s,11ar,11br,13as)-5a,5b,8,8,11a-pentamethyl-3a-[(5-methylpyridine-3-carbonyl)amino]-2-oxo-1-propan-2-yl-4,5,6,7,7a,9,10,11,11b,12,13,13a-dodecahydro-3h-cyclopenta[a]chrysen-9-yl]oxy]-2,2-dimethyl-4-oxobutanoic acid Chemical compound N([C@@]12CC[C@@]3(C)[C@]4(C)CC[C@H]5C(C)(C)[C@@H](OC(=O)CC(C)(C)C(O)=O)CC[C@]5(C)[C@H]4CC[C@@H]3C1=C(C(C2)=O)C(C)C)C(=O)C1=CN=CC(C)=C1 QCQCHGYLTSGIGX-GHXANHINSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N Ala-Lys-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O MFMDKJIPHSWSBM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)CCCCN PMQXMXAASGFUDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KQESEZXHYOUIIM-CQDKDKBSSA-N Ala-Lys-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KQESEZXHYOUIIM-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N Alpha-lactose monohydrate Chemical compound O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N Arg-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CLICCYPMVFGUOF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JNCRAQVYJZGIOW-QSFUFRPTSA-N Asn-Val-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JNCRAQVYJZGIOW-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N Asp-Cys Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FKBFDTRILNZGAI-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N Asp-Gly-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O WSGVTKZFVJSJOG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- PFAQXUDMZVMADG-AVGNSLFASA-N Cys-Gln-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O PFAQXUDMZVMADG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- CYHMMWIOEUVHHZ-IHRRRGAJSA-N Cys-Met-Tyr Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CYHMMWIOEUVHHZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ALTQTAKGRFLRLR-GUBZILKMSA-N Cys-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N ALTQTAKGRFLRLR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000004338 Dichlorodifluoromethane Substances 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MADFVRSKEIEZHZ-DCAQKATOSA-N Gln-Gln-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N MADFVRSKEIEZHZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ROHVCXBMIAAASL-HJGDQZAQSA-N Gln-Met-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O ROHVCXBMIAAASL-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N Glu-Ala-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O JJKKWYQVHRUSDG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N Gly-Glu-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DHDOADIPGZTAHT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N Gly-Tyr-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KOYUSMBPJOVSOO-XEGUGMAKSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N His-Asp-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)NCC(=O)O)N LSQHWKPPOFDHHZ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VAXBXNPRXPHGHG-BJDJZHNGSA-N Ile-Ala-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N VAXBXNPRXPHGHG-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- BOTVMTSMOUSDRW-GMOBBJLQSA-N Ile-Arg-Asn Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BOTVMTSMOUSDRW-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- WZDCVAWMBUNDDY-KBIXCLLPSA-N Ile-Glu-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N WZDCVAWMBUNDDY-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N L-tryptophan-L-tyrosine Natural products C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 TYYLDKGBCJGJGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150045914 LPE1 gene Proteins 0.000 description 1
- MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN MYGQXVYRZMKRDB-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N Leu-Leu-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(O)=O XVZCXCTYGHPNEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AEDWWMMHUGYIFD-HJGDQZAQSA-N Leu-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AEDWWMMHUGYIFD-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N Leu-Thr-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O VDIARPPNADFEAV-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QBGPXOGXCVKULO-BQBZGAKWSA-N Lys-Cys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O QBGPXOGXCVKULO-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- BLIPQDLSCFGUFA-GUBZILKMSA-N Met-Arg-Asn Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BLIPQDLSCFGUFA-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101500025418 Mus musculus Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N N-L-alanyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C)C(O)=O)=CNC2=C1 WUGMRIBZSVSJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)CN)C(O)=O)=CNC2=C1 AJHCSUXXECOXOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016978 Orphan receptors Human genes 0.000 description 1
- 108070000031 Orphan receptors Proteins 0.000 description 1
- OVJMCXAPGFDGMG-HKUYNNGSSA-N Phe-Gly-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O OVJMCXAPGFDGMG-HKUYNNGSSA-N 0.000 description 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YAZNFQUKPUASKB-DCAQKATOSA-N Pro-Lys-Cys Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O YAZNFQUKPUASKB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N Ser-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SRTCFKGBYBZRHA-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- GYXVUTAOICLGKJ-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N GYXVUTAOICLGKJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- LALNXSXEYFUUDD-GUBZILKMSA-N Ser-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LALNXSXEYFUUDD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N Ser-Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052581 Si3N4 Inorganic materials 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004584 Somatomedin Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010017622 Somatomedin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- LKJCABTUFGTPPY-HJGDQZAQSA-N Thr-Pro-Gln Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LKJCABTUFGTPPY-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- BRBCKMMXKONBAA-KWBADKCTSA-N Trp-Ala-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)=CNC2=C1 BRBCKMMXKONBAA-KWBADKCTSA-N 0.000 description 1
- CZWIHKFGHICAJX-BPUTZDHNSA-N Trp-Glu-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 CZWIHKFGHICAJX-BPUTZDHNSA-N 0.000 description 1
- MHCLIYHJRXZBGJ-AAEUAGOBSA-N Trp-Gly-Cys Chemical compound N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C12)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O MHCLIYHJRXZBGJ-AAEUAGOBSA-N 0.000 description 1
- IYHRKILQAQWODS-VJBMBRPKSA-N Trp-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N IYHRKILQAQWODS-VJBMBRPKSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- QJBWZNTWJSZUOY-UWJYBYFXSA-N Tyr-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N QJBWZNTWJSZUOY-UWJYBYFXSA-N 0.000 description 1
- ZWZOCUWOXSDYFZ-CQDKDKBSSA-N Tyr-Ala-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ZWZOCUWOXSDYFZ-CQDKDKBSSA-N 0.000 description 1
- BEIGSKUPTIFYRZ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asp-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O BEIGSKUPTIFYRZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N Tyr-Cys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 YLRLHDFMMWDYTK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- NMKJPMCEKQHRPD-IRXDYDNUSA-N Tyr-Gly-Tyr Chemical compound C([C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 NMKJPMCEKQHRPD-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- SFSZDJHNAICYSD-PMVMPFDFSA-N Tyr-His-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CN=CN3)NC(=O)[C@H](CC4=CC=C(C=C4)O)N SFSZDJHNAICYSD-PMVMPFDFSA-N 0.000 description 1
- XTOCLOATLKOZAU-JBACZVJFSA-N Tyr-Trp-Glu Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC3=CC=C(C=C3)O)N XTOCLOATLKOZAU-JBACZVJFSA-N 0.000 description 1
- HZYOWMGWKKRMBZ-BYULHYEWSA-N Val-Asp-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N HZYOWMGWKKRMBZ-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 101150036080 at gene Proteins 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 238000000089 atomic force micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000003785 benzimidazolyl group Chemical group N1=C(NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000004618 benzofuryl group Chemical group O1C(=CC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000001164 benzothiazolyl group Chemical group S1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000004196 benzothienyl group Chemical group S1C(=CC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000004541 benzoxazolyl group Chemical group O1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960004424 carbon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000012578 cell culture reagent Substances 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005889 cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- PBHVCRIXMXQXPD-UHFFFAOYSA-N chembl2369102 Chemical compound C1=CC(S(=O)(=O)O)=CC=C1C(C1=CC=C(N1)C(C=1C=CC(=CC=1)S(O)(=O)=O)=C1C=CC(=N1)C(C=1C=CC(=CC=1)S(O)(=O)=O)=C1C=CC(N1)=C1C=2C=CC(=CC=2)S(O)(=O)=O)=C2N=C1C=C2 PBHVCRIXMXQXPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N dichlorodifluoromethane Chemical compound FC(F)(Cl)Cl PXBRQCKWGAHEHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019404 dichlorodifluoromethane Nutrition 0.000 description 1
- 229940042935 dichlorodifluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 229940087091 dichlorotetrafluoroethane Drugs 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000005678 ethenylene group Chemical group [H]C([*:1])=C([H])[*:2] 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 229910021485 fumed silica Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000005946 imidazo[1,2-a]pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002183 isoquinolinyl group Chemical group C1(=NC=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 125000001786 isothiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000842 isoxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 229960001021 lactose monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 208000010658 metastatic prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108010016686 methionyl-alanyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- WLGOTMXHWBRTJA-GACYYNSASA-N murodermin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N1)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC=2NC=NC=2)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(=O)N2)C(C)C)=O)CSSC1)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WLGOTMXHWBRTJA-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000003136 n-heptyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- NISOCYUAQBTSBZ-UHFFFAOYSA-N n-methyl-n-(2-phenylethyl)prop-2-yn-1-amine Chemical compound C#CCN(C)CCC1=CC=CC=C1 NISOCYUAQBTSBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004957 naphthylene group Chemical group 0.000 description 1
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 1
- 125000001971 neopentyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 231100001222 nononcogenic Toxicity 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 125000002971 oxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 125000000843 phenylene group Chemical group C1(=C(C=CC=C1)*)* 0.000 description 1
- 238000005375 photometry Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229920002851 polycationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000003380 propellant Substances 0.000 description 1
- 125000006410 propenylene group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 125000003373 pyrazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003226 pyrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- FFISLTWEISOMFC-UHFFFAOYSA-N pyridin-2-yl propanedithioate Chemical compound CCC(=S)SC1=CC=CC=N1 FFISLTWEISOMFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 125000002943 quinolinyl group Chemical group N1=C(C=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000004305 thiazinyl group Chemical group S1NC(=CC=C1)* 0.000 description 1
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012876 topography Methods 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029284 trichlorofluoromethane Drugs 0.000 description 1
- 108010044292 tryptophyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010079202 tyrosyl-alanyl-cysteine Proteins 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 238000000733 zeta-potential measurement Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/17—Immunomodulatory nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/50—Physical structure
- C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к невирусному вектору — полиплексу, и может быть использовано в медицине. Изобретение позволяет получить полимерный конъюгат, состоящий из линейного полиэтиленимина, ковалентно связанного с одним или более фрагментами полиэтиленгликоля (PEG), при этом каждый PEG-фрагмент конъюгирован посредством линкера с нацеливающимся фрагментом, способным к связыванию с антигеном рака. Настоящее изобретение способно связывать и конденсировать молекулы нуклеиновых кислот — ДНК или РНК — и служить в качестве невирусного вектора для направленной доставки терапевтических агентов в клетки/ткани организма потенциального пациента, страдающего от рака предстательной железы или иных типов рака, клетки которого гиперэкспрессируют EGFR или HER2, для осуществления генной терапии указанных заболеваний. 7 н. и 22 з.п. ф-лы, 19 ил., 14 пр.
Description
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Настоящее изобретение относится к невирусным полиплексам на основе полиэтиленимина, конъюгированным с нацеливающимся фрагментом, способным к связыванию с раковым антигеном.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Одним из препятствий, с которым сталкивается молекулярная медицина, является направленная доставка терапевтических агентов, таких как молекул ДНК или РНК. Перспективной стратегией является конструирование невирусных векторов, таких как катионные полимеры и катионные липиды, которые связывают и конденсируют нуклеиновые кислоты. Данные невирусные катионные векторы обладают многими преимуществами по сравнению с вирусными векторами гена, так как они не иммуногенны, не онкогенны и их легко синтезировать [1-4]. В настоящее время разрабатываются несколько синтетических поликатионных полимеров для доставки нуклеиновой кислоты. Среди них полиэтиленимины (PEI) рассматриваются в качестве перспективных агентов для доставки генов [5].
[0003] PEI представляют собой водорастворимые органические макромолекулы, которые доступны как в качестве линейных, так и разветвленных структур [6]. PEI меняют свою степень ионизации в широком диапазоне рН, поскольку каждый третий атом в их основной цепи представляет собой аминоазот, который может быть протонирован. Приблизительно 55% атомов азота в PEI протонируются при физиологическом значении рН [7]. Они обладают высокой катионной плотностью заряда и, таким образом, способны образовывать нековалентные комплексы с нуклеиновыми кислотами. Более того, их физико-химические и биологические свойства можно изменять при помощи различных химических модификаций [8]. Комплексы на основе PEI (также известные как полиплексы) могут быть эндоцитированы многими типами клеток [9]. После интернализации полиплексов, "эффект протонной губки" диктует высвобождение эндосом и перенос генов высокой эффективности [10]. Способность PEI конденсировать ДНК, по всей видимости, является важным фактором в доставке больших ДНК-конструкций во многие типы клеток.
[0004] Основной проблемой использования PEI в качестве носителей для доставки является токсичность вследствие их высокого положительного поверхностного заряда, что может привести к неспецифическому связыванию [11]. Недавние попытки осуществлялись для того, чтобы улучшить селективность и биосовместимость невирусных векторов. Это привело к модификации молекул PEI с полиэтиленгликолем (PEG) в целях экранирования частицы PEI [12]. Конъюгация гетеробифункциональных PEG-групп с PEI облегчает связывание PEI с нацеливающимся лигандом, который обеспечивает эффективную доставку генов в клетки, несущие когнатный рецептор [12]. Авторы настоящего изобретения ранее уже описывали поколение нацеливающихся векторов, демонстрируя разницу между разветвленным PEI (brPEI-EGF) и линейным PEI (LPEI), прикрепленных к EGF в качестве нацеливающихся векторов [13, WO 2004/045491, WO 2010/073247]. Недостаток современных способов синтеза заключается в том, что они приводят к образованию недостаточно гомогенных продуктов. Таким образом, существует острая потребность в разработке способов, которые могут обеспечить эффективную конъюгацию нацеливающихся фрагментов с LPEI-PEG воспроизводимым образом, для того чтобы образовывать гомогенные партии продуктов, надежно применяемых в способах для лечения рака.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0005] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к полиплексу двухцепочечной РНК (дцРНК) и полимерного конъюгата, при этом указанный полимерный конъюгат состоит из линейного полиэтиленимина (LPEI), ковалентно связанного с одним или более фрагментами полиэтиленгликоля (PEG), каждый PEG-фрагмент конъюгирован посредством линкера с нацеливающимся фрагментом, способным к связыванию с раковым антигеном при условии, что нацеливающийся фрагмент не представляет собой EGF мыши (mEGF) или пептид согласно последовательности YHWYGYTPQNVI (GE11) (SEQ ID №: 1).
[0006] В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемый носитель и полиплекс по настоящему изобретению, определенный в настоящем описании.
[0007] В еще одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает полиплекс по настоящему изобретению, определенный в настоящем описании, или фармацевтическую композицию, содержащую полиплекс, для применения для лечения рака, выбранного из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспессирующими EGFR (рецептор эпидермального фактора роста), рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.
[0008] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы, способу, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, полиплекса по настоящему изобретению, определенного в настоящем описании.
[0009] В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и полиплекс по настоящему изобретению, для лечения рака, выбранного из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.
[0010] Полиплекс по настоящему изобретению можно применять в комбинации с иммунными клеткам.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0011] На Фигуре 1 представлено, что конъюгация LPEI (~22 кДа) с NHS-PEG-OPSS (~ 2 кДа) в основном позволяет получить две сополимерные сетки, которые различаются по степени РЕGилирования. Сополимер LPEI-(PEG2k-OPSS)3 ("ди-конъюгат 1:3") состоял в среднем из 1 моль LPEI и 3 моль PEG, в то время как сополимер LPEI-PEG2k-OPSS ("ди-конъюгат 1:1") состоял в среднем из 1 мольного соотношения LPEI и 1 моль PEG. (соотношения LPEI:PEG определяли при помощи анализа ПМР (1H-NMR)).
[0012] На Фигуре 2 представлен ПМР-анализ двух ди-конъюгатов, LPEI-PEG2k-OPSS (ди-конъюгат 1:1) и LPEI-(PEG2k-OPSS)3 (ди-конъюгат 1:3). На присоединение PEG-групп к LPEI указывало наличие химических сдвигов, которые коррелируют с водородами этиленгликоля (а) при 3,7 ppm и водородами этиленимина при ~ 3,0 ppm (b). Интегральные значения данных пиков обеспечивают молярные соотношения PEG к LPEI, по которым вывели указанные проиллюстрированные структуры ди-конъюгата 1:1 (А) и ди-конъюгата 1:3 (В).
[0013] На Фигуре 3 представлена схема для конъюгации сополимерных сеток (ди-конъюгат 1:1 и ди-конъюгат 1:3) с аффителом ("Her-2") посредством дисульфидного обмена, приводящего к образованию двух различно РЕGилированных три-конъюгатов [20].
[0014] На Фигуре 4 изображен ДСН-ПААГ-электрофорез очищенного аффитела, ди-конъюгата и три-конъюгата в отсутствие и в присутствии ДТТ. В присутствии ДТТ аффитело высвобождается из три-конъюгата и мигрирует наряду с очищенным аффителом (чуть выше 10 кДа).
[0015] На Фигуре 5 представлено измерение размеров частиц с применением измерений DLS (динамического светорассеяния) LPEI, ди-конъюгатов и три-конъюгатов, находящихся в комплексе с плазмидой pGreenfire 1 в HBG буфере рН 7,4.
[0016] На Фигуре 6 изображены распределения ξ-потенциалов LPEI, ди-конъюгатов и три-конъюгатов, находящихся в комплексе с плазмидой pGreenfire1. ξ-потенциалы измеряли при помощи DLS и рассчитывали по уравнению Смолуховского.
[0017] На Фигурах 7А-В представлены изображения атомно-силовой микроскопии (АСМ), полученные от измерений, выполненных в HBG-буфере рН 7,4 для обоих полиплексов. (А) три-конъюгатный 1:1 полиплекс (В) три-конъюгатный 1:3 полиплекс. Масштабная отметка равна 1 мкм.
[0018] На Фигуре 8 изображен агар-гель, показывающий, что дифференциально РЕGилированные полиплексы защищают плазмиду pGreenFire1 от разложения ДНКазой I. 1 мкг плазмиды (pGreenFire1) по отдельности или в три-конъюгатных полиплексах: 1:1 и 1:3 обрабатывали в присутствии или без ДНКазы I (2 ME). Суперспиральная плазмида (s.c), открытая кольцевая плазмида (о.с).
[0019] На Фигурах 9А-С представлен HER-2-опосредованный перенос pGFP-LUC гена с применением три-конъюгатного 1:1 полиплекса и три-конъюгатного 1:3 полиплекса, содержащих соотношение LPELPEG 1:1 и 1:3 соответственно. 10000 ВТ474 и MDA-MB-231 клеток рака молочной железы на лунку обрабатывали в течение 48 ч с три-конъюгатами 1:1 и 1:3, находящимися в комплексе с pGFP-LUC (1 мкг/мл), чтобы образовать два полиплекса. Соотношение азот PEI/фосфат ДНК равнялось 6 (N/P=6) в HBS. (А) Измерения активности люциферазы демонстрируют значимую уменьшенную доставку pGreenFire1 в MDA МВ-231 клетки по сравнению с ВТ474 и пониженную доставку генов, опосредованную три-конъюгатными 1:3 полиплексами по сравнению с три-конъюгатными 1:1 (*р<0,001). Активность люциферазы измеряли в трех повторах через 48 ч., представленную в виде относительных люциферазных единиц (RLU) как среднее значение + стандартное отклонение. (В) Флуоресцентные изображения клеток, обработанные полиплексами. Изображения представлены при десятикратном увеличении и являются примерами трех проведенных экспериментов. (С) Анализ метиленовым синим изображает процент выживаемости клеток по сравнению с необработанными (UT) клетками.
[0020] На Фигуре 10 представлено, что PEI-РЕС-Неr2Аффитело (РРНА), находящееся в комплексе с PolyIC, ингибирует ВТ474 клетки рака молочной железы, гиперэкспрессирующие Her2. Комплексный вектор ингибирует клетки, гиперэкспрессирующие Her2, включая клетки, резистентные к Герцептину/трастузумабу.
[0021] На Фигуре 11 представлено ингибирование MCF7 клеток, гиперэкспрессирующих Her2, инъецированных бестимусным мышам.
[0022] На Фигурах 12А-В представлена эффективность (А) PEI-PEG-ЕGFRAффитела (РРЕАффитела) в сравнении с активностью (В) РРЕ.
[0023] На Фигуре 13 представлена активность PolyIC/РРЕАффитела in vivo по сравнению с необработанными (UT), pIC/PPE, pI/РРЕ, pI/РРЕА и низким pIC/PPEA (0,1 мкг/мкл pIC в комплексе).
[0024] На Фигуре 14 представлена выживаемость U87MG, U87MGwtEGFR клеток после применения различных концентраций PolyIC/LPEI-PEG-hEGF комплекса по сравнению с применением PolyIC/mPPE (мыши), описанного в Schaffert D, Kiss М, Rodl W, Shir A, Levitzki A, Ogris M, Wagner E. (2011) Poly(I:C)-mediated tumor growth suppression in EGF-receptor overexpressing tumors using EGF-polyethylene glycol-linearpolyethylenimine as carrier. Pharm Res. 28:731-41.
[0025] На Фигуре 15 представлено, что PEI-PEG(PP)-DUPA(PPD)/PolyIC является высоко эффективным против LNCaP и VCAP клеток. Жизнеспособность измеряли после 96 часов воздействия.
[0026] На Фигурах 16А-В представлено образование цитокинов (A) IP-10, (В) RANTES LNCaP клеткой, трансфицированной PolyIC/PPD.
[0027] На Фигуре 17 представлено, что среда, кондиционированная LNCaP клетками, стимулирует экспрессию цитокинов в МКПК. Экспрессия после 24 ч инкубации.
[0028] На Фигуре 18 представлено, что совместная инкубация обработанных PolyIC/PPD LNCaP клеток с РС3-люциферазными клетками, которые не экспрессируют PSMA, приводит к более 70% гибели РС3-люциферазных клеток через эффект "свидетеля". Добавление здоровых МКПК человека резко улучшает эффект и приводит к гибели 90% РС3-клеток.
[0029] На Фигуре 19 представлено воздействие PolyIC/PPD на подкожные LNCaP опухоли in vivo. UT, необработанные.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0030] Поликатионы, в особенности PEI, интенсивно исследовались в качестве агентов для трансфекции генов. Оптимальные эффекты от трансфекции получают, когда полимерные комплексы наночастиц обладают общим положительным зарядом, который позволяет им связываться с отрицательно заряженными гепаринсульфатпротеогликанами на клеточной поверхности [28]. Предыдущие исследования показали, что линейный PEI (LPEI) является более эффективным при трансфекции генов, чем разветвленный PEI (brPEI) [29-31] [32, 33, WO 2010/073247], однако LPEI имеет более высокий положительный заряд и, следовательно, является более токсичным. Осуществляли конъюгацию различных объектов экранирования, таких как PEG [12], поли-(этиленоксид)-поли(пропиленоксид)-поли(этиленоксид) (ПЭО-ППО-ПЭО) [18, 34] и поли(этиленоксид) [35], с катионными полимерами в попытке снизить положительный заряд и, как следствие, токсичность. Экранирование PEI PEG-группами различной длины действительно значимо снижало токсичность при сохранении эффективности трансфекции [12, 13, 36].
[0031] В соответствии с настоящим изобретением было установлено, что конъюгация LPEI с PEG2k позволяет получить ди-конъюгатные сополимеры, содержащие различные соотношения LPEI к PEG2k. Данные ди-конъюгаты можно отделить друг от друга, применяя катионообменную хроматографию из-за различий в заряде, которые отображают различное число конъюгированных PEG2k-групп. ПМР-анализ подтвердил, что ди-конъюгаты отличались друг от друга по среднему числу PEG2k-единиц на единицу LPEI, где ди-конъюгат 1:1 обладал соотношением LPEI:PEG2k 1:1 и ди-конъюгат 1:3 обладал соотношением LPEI:PEG2k 1:3. Конъюгация Her-2-нацеливающегося аффитела с каждым из очищенных ди-конъюгатов позволяет получить три-конъюгатный продукт соответствующей молекулярной массы, т.е. из ди-конъюгата 1:1 авторы настоящего изобретения получили "три-конъюгат 1:1" с LPEI:PEG2k:Her-2 равным 1:1:1 и из ди-конъюгата 1:3 авторы настоящего изобретения получили "три-конъюгат 1:3" с соотношением 1:3:3. Данный протокол позволил авторам настоящего изобретения получить однородные продукты при почти полной конъюгации нацеливающегося аффитела с LPEI-PEG воспроизводимым образом.
[0032] Авторы настоящего изобретения наблюдали, что РЕGилирование сильно влияет на размер полиплексных частиц, получаемых при комплексообразовании ди-конъюгатов или три-конъюгатов с плазмидной ДНК. Как ди-конъюгатные 1:3, так и три-конъюгатные 1:3 полиплексы обладали средним размером частиц больше, чем ди-конъюгатные 1:1 и три-конъюгатные 1:1 полиплексы. Авторы настоящего изобретения считают, что увеличение количества РЕGилирований на одиночной катионной цепи приводит к стерическому затруднению, что предотвращает полимерную цепь от конденсации указанной плазмиды в более маленькую частицу. Это согласуется с обнаруженным фактом, что полиплекс с оголенным LPEI обладал самыми маленькими частицами. К тому же, в то время как три-конъюгаты 1:1 и 1:3 защищали комплексную плазмиду от ДНКазы I, три-конъюгатный 1:3 полиплекс обеспечивал лучшую защиту, возможно вследствие увеличенных стерических затруднений.
[0033] Предыдущие исследования показали, что увеличение молекулярной массы PEG-единиц, конъюгированных с катионными полимерами, приводило к уменьшенному поверхностному заряду полиплексов, полученных при комплексообразовании с нуклеиновыми кислотами [13]. Данные авторов настоящего изобретения показывают, что увеличение числа PEG-групп схожих молекулярных масс приводит к уменьшенному поверхностному заряду, определенному при помощи распределения ξ-потенциала. Самый высокий поверхностный заряд действительно показал оголенный LPEI, находящийся в комплексе с плазмидой. Данные результаты подтверждают идею о том, что чем больше нейтральных объектов присутствуют в химическом векторе, тем меньше поверхностный заряд. Неожиданно три-конъюгатные полиплексы, конъюгированные с аффителами, обладали более низким поверхностным зарядом, нежели чем ди-конъюгатные полиплексы, представляя, что Her-2 аффитело (которое само по себе обладает небольшим положительным зарядом) также снижало поверхностный заряд частиц. Авторы настоящего изобретения подозревают, что Her-2 аффитело изменяет топографию частицы с более нацеливающимися фрагментами, маскирующими заряд на поверхности, что приводит к уменьшению поверхностного заряда.
[0034] Форма полиплекса оказывает существенное влияние на его показатели работы в качестве кандидата для доставки лекарственного средства [37,38], хотя пока не известно, какие полиплексные формы являются желательными для эффективной доставки лекарственного средства. Воздействие РЕGилирования на полиплексную форму, насколько известно авторам настоящего изобретения, до сих пор не исследовали. В АСМ-изображениях, три-конъюгатный 1:1 полиплекс, который был более эффективным в доставке генов, представлял гомогенность формы, в то время как три-конъюгатный 1:3 был более гетерогенным со множеством асимметричных, эллипсоидальных частиц.
[0035] Селективный перенос генов с применением катионных полимеров остается серьезной проблемой. Предыдущие исследования показали, что нацеливание LPEI и LPEI-PEG конъюгатов с EGF или трансферрином повышало их селективность и снижало неспецифичные взаимодействия как in vitro, так и in vivo [39, 40]. Например, для изучения селективности исследуемых Her-2-нацеливающихся три-конъюгатных 1:1 и 1:3 полиплексов, авторы настоящего изобретения использовали две клеточных линии рака молочной железы, которые дифференцированно экспрессируют Her-2. Доставка генов, представленная активностью люциферазы и экспрессией GFP, была значительно выше в ВТ474 клетках, который сильно гиперэкспрессируют Her-2-рецептор, чем в MDA-MB-231 клетках, которые экспрессируют 100-кратно меньше Her-2-рецепторов на клеточной поверхности. Таким образом данные показывают, что оба три-конъюгата 1:1 и 1:3 являются высоко селективными для клеток, гиперэкспрессирующих Her-2 (Фигура 10).
[0036] Предыдущие исследования показали, что высокие уровни РЕGилирования могут привести к пониженной трансфекции генов [41]. Данные результаты находятся в соответствии с наблюдением авторов настоящего изобретения, что высоко РЕGилированный три-конъюгатный 1:3 полиплекс продемонстрировал значимое снижение в доставке генов по сравнению с менее РЕGилированным три-конъюгатным 1:1 полиплексом, представленное посредством активности люциферазы и экспрессии GFP. Увеличенная доставка генов при помощи менее РЕGилированного три-конъюгатного 1:1 полиплекса сопровождалась небольшой клеточной токсичностью, скорее всего, вследствие его более высокого поверхностного заряда.
[0037] До участия в данном исследовании, рабочая гипотеза авторов настоящего изобретения заключалась в том, что увеличение числа нацеливающихся фрагментов на единицу LPEI должно было привести к улучшенной доставке генов и/или селективности. Авторы настоящего изобретения предполагали, что три-конъюгат 1:3, который обладает 3 моль молекул Her-2 аффитела, конъюгированных на моль LPEI, будет демонстрировать увеличенную рецептор-опосредованную интернализацию частиц. Тем не менее, три-конъюгатные 1:3 полиплексы показали более низкий ξ-потенциал, более значительный размер частиц и гетерогенную несферическую форму, все характеристики из которых могли способствовать реально наблюдаемым уменьшенным трансфекционным эффективностям. Результаты авторов настоящего изобретения показывают, что менее РЕGилированный три-конъюгат 1:1 превосходит более РЕGилированный три-конъюгат 1:3 в опосредовании селективной и эффективной доставки генов в клетки, гиперэкспрессирующих Her-2.
[0038] В соответствии с настоящим изобретением было установлено, что РЕСилирование полиплексов на основе LPEI приводит к уменьшенному поверхностному заряду, увеличенному размеру полиплекса и увеличенной гетерогенности формы, и что данные свойства могут оказать сильное воздействие на нацеленную доставку генов. Упрощенный синтез авторов настоящего изобретения допускает очистку гомогенных продуктов воспроизводимым образом, который теперь может быть расширен для того, чтобы образовать различные три-конъюгаты, применяя различные нацеливающиеся фрагменты.
[0039] С учетом вышесказанного настоящее изобретение в одном аспекте обеспечивает полиплекс двухцепочечной РНК (дцРНК) и полимерного конъюгата, при этом указанный полимерный конъюгат состоит из линейного полиэтиленимина (LPEI), ковалентно связанного с одним или более фрагментами полиэтиленгликоля (PEG), каждый PEG-фрагмент конъюгирован через линкер с нацеливающимся фрагментом, способным к связыванию с раковым антигеном, при условии, что нацеливающийся фрагмент не является mEGF или пептидом согласно последовательности YHWYGYTPQNVI (GE11) (SEQ ID №: 1).
[0040] В определенных вариантах реализации указанный раковый антиген может представлять собой, но не ограничиваться этим, рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2), простатический специфический мембранный антиген (PSMA), рецептор инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R), рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR), рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR) или рецептор фактора роста фибробластов (FGFR). Нацеливающийся фрагмент может быть нативным, природным или модифицированным лигандом или его паралогом, или ненативным лигандом, таким как антитело, одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv) или миметиком антитела, таким как аффитело, к любым раковым антигенам. Основу аффител составляет Z-домен (иммуноглобулин-G-связывающий домен) белка А, и уникальные свойства связывания приобретаются посредством рандомизации 13 аминокислот, расположенных в двух альфа-спиралях, вовлеченных в активность связывания домена родительского белка.
[0041] В определенных вариантах реализации настоящего изобретения дцРНК представляет собой двухцепочечную РНК полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (polyI:C), полимерный конъюгат состоит из LPEI, ковалентно связанного с одним PEG-фрагментом (LPEI-PEG 1:1) или тремя PEG-фрагментами (LPEI-PEG 1:3), и раковый антиген представляет собой EGFR, HER2 или PSMA.
[0042] Молекулярная масса PEG может находиться в диапазоне от 2 до 8 кДа, в частности, 2 кДа; молекулярная масса LPEI может находиться в диапазоне от 10 до 30 кДа, в частности, 22 кДа; и polyI:C полиплекса по настоящему изобретению можно сформировать из РНК нитей, каждая из которых содержит по меньшей мере 22, предпочтительно по меньшей мере 45 рибонуклеотидов. В определенных вариантах реализации каждая нить содержит число рибонуклеотидов в диапазоне от 20 до 300.
[0043] В определенных вариантах реализации один или более PEG-фрагментов каждый независимо образует -NH-CO- связь с LPEI и связь с линкером, выбранную из -NH-CO-, -СО-NH-, -S-C-, -S-S-, -О-СО- или -СО-O-. В частности, каждый из одного или более PEG-фрагментов образует -NH-CO- связи с LPEI и линкером.
[0044] В определенных вариантах реализации линкер образует -S-S-, NH-CO-, -CO-NH-, -S-C-, О-СО-, -СО-О- или мочевинную (-NH-CO-NH) связь с нацеливающимся фрагментом. Линкер можно выбрать из -CO-R2-Rx-R3 или пептидного фрагмента, состоящего из 3 до 7 аминокислотных остатков, при этом
R2 выбран из (С1-С8)алкилена, (С2-С8)алкенилена, (С2-С8)алкинилена, (С6-С10)арилендиила или гетероарилендиила;
Rx отсутствует или представляет собой -S-;
R4 выбран из (С1-С8)алкилена, (С2-С8)алкенилена, (С2-С8)алкинилена, (С1-С8)алкилен-(С3-С8)циклоалкилена, (С2-С8)алкенилен-(С3-С8)циклоалкилена, (С2-С8)алкинилен-(С3-С8)циклоалкилена, (С6-С10)арилендиила, гетероарилендиила, (С1-С8)алкилен-(С6-С10)арилендиила или (С1-С8)алкиленгетероарилендиила;
при этом каждый из указанного (С1-С8)алкилена, (С2-С8)алкенилена или (С2-С8)алкинилена необязательно замещен одной или более группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, -COR5, -COOR5, -OCOOR5, - OCON(R5)2, -CN, -NO2, -SR5, -OR5, -N(R5)2, -CON(R5)2, -SO2R5, -SO3H, -S(=O)R5, (С6-С10)арила, (С1-С4)алкилен-(С6-С10)арила, гетероарила или (С1-С4)алкиленгетероарила, а также необязательно прерван одним или более одинаковыми или различными гетероатомами, выбранными из S, О или N и/или по меньшей мере одной группой, каждая из которых независимо выбрана из -NH-CO-, -CO-NH-, -N(R5)-, -N(С6-С10арил)-, (С6-С10)арилендиила или гетероарилендиила; и
R5 представляет собой Н или (С1-С8)алкил.
[0045] В определенных вариантах реализации R2 выбран из (С1-С8)алкилена, предпочтительно (С1-С4)алкилена, необязательно замещенного одной или более группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, -СОН, -СООН, -ОСООН, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -ОН, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, (С6-С10)арила, (С1-С4)алкилен-(С6-С10)арила, гетероарила или (C1-С4)алкиленгетероарила, а также необязательно прерванного одним или более одинаковыми или различными гетероатомами, выбранными из S, О или N, и/или по меньшей мере одной группой, каждая из которых независимо выбрана из -NH-CO-, -CO-NH-, -NH-, -N(С1-С8алкил)-, -N(C6-С10арил)-, (С6-С10)арилендиила или гетероариледиила. В частности R2 выбран из (С1-С8)алкилена, предпочтительно (С1-С4)алкилена.
[0046] В определенных вариантах реализации Rx представляет собой -S-.
при этом
R4 представляет собой (С1-С8)алкилен-(С3-С8)циклоалкилен, предпочтительно (C1-С4)алкилен-(С5-С6)циклоалкилен.
[0048] В определенных вариантах реализации в полиплексе, определенном выше, R2 представляет собой -СН2-СН2-; Rx представляет собой -S-, a R3 отсутствует или представляет собой , при этом R4 представляет собой
[0049] В определенных вариантах реализации линкер представляет собой пептидный фрагмент, содержащий по меньшей мере один, в частности, два или три остатка ароматических аминокислот, таких как фенилаланина, триптофана, тирозина или гомофенилаланина. В определенных вариантах реализации пептидный фрагмент представляет собой -(NH-(CH2)7-CO)-Phe-Gly-Trp-Trp-Gly-Cys- (SEQ ID №: 2) или -(NH-(CH2)7-CO)-Phe-Phe-(NH-CH2-CH(NH2)-CO)-Asp-Cys- (SEQ ID №: 3), связанный через свою меркаптогруппу с нацеливающимся фрагментом.
[0050] В определенных вариантах реализации изобретения полимерный конъюгат представляет собой ди-конъюгат согласно формуле (i)-(viii), связанный с нацеливающимся фрагментом/фрагментами:
(iii) -(NH-(CH2)7-CO)-Phe-Phe-(NH-CH2-CH(NH2)-CO)-Asp-Cys-PEG2k-LPEI;
(iv) -(NH-(CH2)7-CO)-Phe-Gly-Trp-Trp-Gly-Cys-PEG2k-LPEI;
где R6 представляет собой
где R7 представляет собой
[0051] В конкретных вариантах реализации указанный полиплекс выбран из
(a) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HER2 аффитело, и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (i), и HER2 аффитело связано через его меркаптогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как LPEI-PEG2k-HER2;
(b) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HER2 аффитело, и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (v), и HER2 аффитело связано через его меркаптогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как к LPEI-(PEG2k-HER2)3;
(c) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой EGFR аффитело, и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (i), и EGFR аффитело связано через его меркаптогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как LPEI-PEG2k-EGFR;
(d) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой EGFR аффитело, и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (у), и EGFR аффитело связано через его меркаптогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как LPEI-(PEG2k-EGFR)3;
(e) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой EGF человека (hEGF). и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (ii), при этом указанный hEGF связан через его аминогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как LPEI-PEG2k-hEGF;
(f) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой hEGF, и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (vi), при этом указанный hEGF связан через его аминогруппу, в настоящем описании также упоминаемого как LPEI-(PEG2k-hEGF)3;
(g) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HOOC(CH2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO- (DUPA-остаток), и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (iii);
(h) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HOOC(CH2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO- (DUPA-остаток), и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (vii);
(i) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HOOC(CH2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO- (DUPA-остаток), и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (iv); или
(j) полиплекса, при этом нацеливающийся фрагмент представляет собой HOOC(CH2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO- (DUPA-остаток), и полимерный конъюгат представлен вышеуказанной формулой (viii).
[0052] Размер наночастиц, сформированных при помощи полиплекса по настоящему изобретению, может находиться в диапазоне от 120 до 150 нм, в частности 135-148 нм или 142 нм.
[0053] Не ограничивающие примеры процедур для получения полимерных конъюгатов, применяемых в настоящем изобретении, представлены в приведенных ниже Примерах.
[0054] В конкретных вариантах реализации EGFR аффителу соответствует аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID №: 4, HER2 аффителу соответствует аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID №: 5, и hEGF соответствует аминокислотная последовательность, указанная в SEQ ID №: 6.
[0055] В другом аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и полиплекс, определенный выше.
[0056] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен полиплекс по настоящему изобретению, определенный в настоящем описании, или фармацевтическая композиция, содержащая полиплекс, для применения для лечении рака, выбранного из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.
[0057] В определенных вариантах реализации рак, характеризующийся клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, выбран из немелкоклеточной легочной карциномы, рака молочной железы, глиобластомы, плоскоклеточного рака головы и шеи, колоректального рака, аденокарциномы, рака яичников, рака мочевого пузыря или рака предстательной железы и их метастаз. В определенных вариантах реализации полиплекс, применяемый для лечения рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, выбран из полиплексов (с), (d), (е) или (f), определенных выше.
[0058] В определенных вариантах реализации рак, характеризующийся клетками, гиперэкспрессирующими HER2, выбран из рака молочной железы, рака яичников, рака желудка и агрессивных форм рака матки, таких как серозная эндометриальная карцинома матки. В определенных вариантах реализации настоящего изобретения клетки, гиперэкспрессирующие Her2, представляют собой клетки, резистентные к Герцептину/трастузумабу. Таким образом полиплекс по настоящему изобретению можно применять для лечении рака, резистентного к Герцептину/трастузумабу, т.е. рака, содержащего клетки, которые не реагируют или реагируют в меньшей степени на воздействие Герцептина/трастузумаба.
[0059] В частности полиплекс, применяемый для лечения рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, выбран из полиплексов (а), (b), (е) или (f), определенных выше.
[0060] В определенных вариантах реализации рак представляет собой рак предстательной железы, и полиплекс, применяемый для лечения рака предстательной железы, выбран из (g), (h), (i) или (j), определенных выше.
[0061] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы, указанному способу, включающему введение субъекту, нуждающемуся в этом, полиплекса по настоящему изобретению, определенному в настоящем описании.
[0062] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель и полиплекс по настоящему изобретению, для лечения рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.
[0063] В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к полиплексу, способу или фармацевтической композиции по настоящему изобретению для применения в комбинации с иммунными клетками.
[0064] В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к полиплексу, определенному выше в настоящем описании, в котором дцРНК заменена молекулой ДНК, такой как плазмида, содержащей белок-кодирующие последовательности нуклеиновых кислот, функционально связанные с регуляторными элементами, такими как соответствующие промоторы и терминаторы.
[0065] В определенных вариантах реализации иммунные клетки представляют собой проникающие в опухоль Т-клетки (T-TILs), сконструированные опухолевоспецифичные Т-клетки или мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК).
[0066] В контексте настоящего описания термин "полиплекс" относится к комплексу между нуклеиновой кислотой и полимером. Нуклеиновая кислота связана с полимером посредством нековалентных или ковалентных связей, в частности электростатических связей. Термин "полиплекс" относится к вектору, т.е. невирусному вектору, подходящему для осуществления переноса и доставки нуклеиновых кислот в клетки.
[0067] Термин "пациент", "субъект", или "индивидуум" применяют взаимозаменяемо и относят либо к человеку, либо к животному, не относящемуся к человеку.
[0068] В контексте настоящего описания термин "(С1-С8)алкил", как правило, означает линейный или разветвленный углеводородный радикал, имеющий 1-8 углеродных атомов, и включает, к примеру, метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, втор-бутнп, изобутил, трет-бутил, н-пентил, 2,2-диметилпропил, н-гексил, н-гептил, н-октил и т.п.
[0069] Термин "(С1-С8)алкилен" относится к прямому или разветвленному двухвалентному углеводородному радикалу, имеющему 1-8 углеродных атомов, и включает, к примеру, метилен, этилен, пропилен, бутилен, пентанилен, гексанилен, гептанилен, октанилен и т.п. Термины "(С2-С8)алкенилен" и "(С2-С8)алкинилен", как правило, означают линейные или разветвленные двухвалентные углеводородные радикалы, имеющие 2-8 углеродных атомов и одну или более двойных или тройных связей соответственно. Не ограничивающие примеры таких радикалов включают этенилен, пропенилен, 1- и 2-бутенилен, 1- и 2-пентенилен, 1-, 2- и 3-гексенилен, 1-, 2- и 3-гептенилен, 1-, 2 -, 3- и 4-октенилен, этинилен, пропинилен, 1- и 2-бутинилен, 2-метилпропилен, 1- и 2-пентинилен, 2-метилбутилен, 1-, 2- и 3-гексинилен, 1-, 2-и 3-гептинилен, 1-, 2-, 3- и 4-октинилен и т.п.
[0070] Термин "(С6-С10)арил" обозначает ароматическую карбоциклическую группу, имеющую 6-10 углеродных атомов, состоящую из одного кольца или нескольких конденсированных колец, такую как, но не ограничиваясь ими, фенил и нафтил; термин "(С6-С10) арилендиил" обозначает двухвалентную ароматическую карбоциклическую группу, имеющую 6-10 углеродных атомов, состоящую из либо одного кольца, либо из нескольких конденсированных колец, такую как, но не ограничиваясь ими, фенилен и нафтилен.
[0071] Термин "гетероарил" относится к радикалу, полученному из 5-10-членного моно- или полициклического гетероароматического кольца, содержащего от одного до трех, предпочтительно 1-2, гетероатомов, выбранных из N, О или S. Примеры моноциклических гетероарилов включают, не ограничиваются ими, пирролил, фурил, тиенил, тиазинил, пиразолил, пиразинил, имидазолил, оксазолил, изоксазолил, тиазолил, изотиазолил, пиридил, пиримидинил, 1,2,3-триазинил, 1,3,4-триазинил и 1,3,5-триазинил. Полициклические гетероарильные радикалы предпочтительно состоят из двух колец, такие как, но не ограничиваясь ими, бензофурил, изобензофурил, бензотиенил, индолил, хинолинил, изохинолинил, имидазо[1,2-а]пиридил, бензимидазолил, бензтиазолил, бензоксазолил, пиридо[1,2-а]пиримидинил и 1,3-бензодиоксинил. Гетероарил может быть необязательно замещен одной или более группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, -ОН, -СООН, -CN, -NO2, -SH или -CONH2. Следует понимать, что, когда полициклический гетероарил замещен, то замещение может быть в любом из карбоциклических и/или гетероциклических колец. Термин "гетероариледиил" означает двухвалентный радикал, полученный из "гетероарила", определенного в настоящем описании, путем удаления двух водородных атомов из любых кольцевых атомов.
[0072] В контексте настоящего описания термин "галоген" относится к фтору, хлору, брому или йоду.
[0073] Термин "(С3-С8)циклоалкилен" обозначает моно- или бициклический насыщенный двухвалентный циклический углеводородный радикал, содержащий от трех до восьми атомов углерода. Не ограничивающие примеры таких радикалов включают 1,2-циклопропандиил, 1,2-циклобутандиил, 1,3-циклобутандиил, 1,2-циклопентандиил, 1,3-циклопентан-диил, 1,2-циклогександиил, 1,3-циклогександиил, 1,4-циклогександиил, 1,2-циклогептандиил, 1,3-циклогептандиил, 1,4-циклогепта-диил, 1,2-циклооктандиил, 1,3-циклооктандиил, 1,4-циклооктандиил, 1,5-циклооктандиил и т.п.
[0074] В контексте настоящего описания термин "аминокислотный остаток" относится к любому природному или синтетическому, т.е. неприродному, аминокислотному остатку в его обоих L- и D-стереоизомерах. В то время как природная аминокислота представляет собой любую одну из двадцати аминокислотных остатков, обычно встречающихся в белках, термин синтетическая/неприродная аминокислота относится к любой аминокислоте, модифицированной аминокислоте и/или ее аналогу, которая не является одной из двадцати природных аминокислот. Не ограничивающие примеры природных аминокислот включают глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, лизин, валин, фенилаланин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, аспарагин, глутамин, аргинин, гистидин, пролин, серии, тирозин, метионин, треонин, и триптофан. Примеры неприродных аминокислот, не будучи ими ограниченными, включают орнитин, гомолизин, 2,4-диаминобутановую кислоту (DABA), 2,3-диаминопропионовую кислоту (DAP), 8-аминооктановую кислоту (ЕАО), гомофенилаланин, гомовалин, гомолейцин и т.п.
[0075] Фармацевтические композиции в соответствии с настоящим описанием можно приготовить обычным образом, применяя один или более физиологически приемлемых носителей и/или вспомогательных веществ. Носитель(-ли) должен быть "приемлемым" в смысле совместимости с другими ингредиентами композиции и безвредности по отношению к его реципиенту.
[0076] Следующие иллюстративные примеры носителей, способов введения, лекарственных форм и т.д., перечислены в качестве известных возможностей, из которых носители, способы введения, лекарственные формы и т.д., можно выбрать для применения с настоящим изобретением. Специалисту среднего уровня в данной области техники будет, однако, понятно, что любой рассматриваемый состав и выбранный способ введения должен быть сначала исследован для того, чтобы определить, что он достигает желаемых результатов.
[0077] Способы введения включают, но не ограничиваются ими, парентеральный, например, внутривенный, внутрибрюшинный, внутримышечный, подкожный, мукозальный (например, пероральный, интраназальный, буккальный, вагинальный, ректальный, внутриглазной), интратекальный, местный и внутрикожный способы. Введение может быть системным или локальным. В определенных вариантах реализации фармацевтическую композицию адаптируют для введения внутрь мозга.
[0078] Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, наполнителю или переносящей среде, с которой вводят активный агент. Носители в фармацевтической композиции могут содержать связующее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, поливинилпирролидон (поливидон или повидон), камедь трагаканта, желатин, крахмал, лактоза или моногидрат лактозы; дезинтегрирующий агент, такой как альгиновая кислота, кукурузный крахмал и т.п.; смазывающее вещество или поверхностно-активное вещество, такое как стеарат магния или лаурилсульфат натрия; и глидант, такой как коллоидальный диоксид кремния.
[0079] Композиции можно приготовить для парентерального введения путем инъекции, к примеру, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Составы для инъекции могут быть представлены в лекарственной форме с однократной дозировкой, к примеру, в ампулах, или в упаковках с многократными дозами с добавленным консервантом. Композиции могут принимать такие формы, как суспензий, растворов или эмульсий в масляных или водных переносящих средах, а также могут содержать вспомогательные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В качестве альтернативы активный ингредиент может быть в форме порошка для приготовления раствора с подходящей переносящей средой, например, стерильной водой, свободной от пирогенов, перед применением.
[0080] Для введения посредством ингаляции, к примеру, для назального введения, композиции согласно настоящему изобретению обычно поставляют в форме выпуска в виде аэрозольного спрея из баллончиков под давлением или распылителя с применением подходящего пропеллента, к примеру, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением единицу дозирования можно определить при помощи клапана, чтобы обеспечить доставку отмеренного количества. Капсулы и картриджи, к примеру, желатина, для применения в ингаляторе или инсуффляторе можно приготовить с содержанием порошкообразной смеси соединения и подходящей порошкообразной основы, такой как лактозы или крахмала.
[0081] В определенных вариантах реализации фармацевтическую композицию приготавливают для введения любым известным способом, описанным выше. Конкретные способы введения, рассматриваемые здесь, представляют собой внутривенное введение и введение внутрь мозга (внутрицеребральное).
[0082] Фармацевтическую композицию согласно любому одному из вариантов реализации, определенному выше, можно приготовить для внутривенного, внутримозгового (внутрицеребрального), перорального, внутрикожного, внутримышечного, подкожного, трансдермального, трансмукозального, интраназального или внутриглазного введения.
[0083] Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано следующими неограничивающими Примерами.
ПРИМЕРЫ
Материалы и способы (М&М)
Химические реагенты
[0084] NHS-PEG-OPSS (эфир ортопиридилдисульфид-полиэтиленгликоль-N-гидросукцинимида), также называемый PDP-PEG-NHS (PDP: пиридилдитиопропионат), с молекулярной массой ~ 2 кДа приобретали у Creative PEGworks (Уинстон, США). Поли(2-этил-2-оксазолин), средняя молекулярная масса (Mn) ~ 50 кДа, и безводный диметилсульфоксид (ДМСО) приобретали у Sigma Aldrich (Израиль). Абсолютный этанол приобретали у Romical (Израиль). Все растворители применяли без дальнейшей очистки.
Синтез ~22 кДа LPEI (основная форма)
[0085] Катионный полимер линейного полиэтиленимина (LPEI) синтезировали, как описано ранее [16]. Вкратце, 8,0 г (0,16 ммоль) поли(2-этил-2-оксазолина) гидролизовали со 100 мл концентрированной HCl (37%) и нагревали с обратным холодильником в течение 48 ч, получая белый осадок. Избыток HCl удаляли при пониженном давлении и оставшееся твердое вещество растворяли в 50 мл воды и лиофилизировали (5 г, 78%, ПМР, D2O-d6, 400 МГц: синглет 3,5 ppm). Полученную гидрохлоридную соль LPEI (4,5 г) подщелачивали путем добавления водного раствора NaOH (3 М), а полученный белый осадок фильтровали и промывали водой до нейтрального состояния. Затем твердое вещество растворяли в воде и далее лиофилизировали для того, чтобы получить белое твердое вещество (2 г, 81%).
Синтез ди-конъюгата LPEI-PEG2k-OPSS
[0086] 174 мг (8 мкмоль) LPEI растворяли в 2,7 мл абсолютного этанола и перемешивали при комнатной температуре в течение 15 минут. 5-кратный молярный избыток OPPS-PEG2k-CONHS (79 мг, 39,5 мкмоль) растворяли в 500 мкл безводном ДМСО и вводили небольшими порциями в смесь LPEI. Реакционную смесь перемешивали при ~ 800 оборотах в минуту на вихревой мешалке при температуре окружающей среды в течение 3 ч. Различные PEG-замещенные LPEI разделяли при помощи катионообменной хроматографии, применяя HR10/10 колонку, заполненную ионообменной смолой MacroPrep High S (BioRad). Чистоту элюированных фракций ди-конъюгатов оценивали, применяя ВЭЖХ с обращенной фазой, оборудованную аналитической Vydac С-8 мономерной 5 мкм колонкой (300 ангстрем, 4,6×150 мм), применяя линейный градиент 5%-95% ацетонитрила в течение 25 мин при скорости потока 1 мл/мин. Объединяли фракции с чистотой 95% или выше. Далее проводили диализ объединенных фракций против 20 мМ HEPES рН 7,4. Соотношение конъюгированных с LPEI PEG2k-групп в ди-конъюгатах определяли при помощи ПМР. Интегральные значения водородов из полиэтилена -(СН2-СН2-О)- и из LPEI-(CH2-CH2-NH)- применяли для того, чтобы определить соотношение между двумя конъюгированными сополимерами. Из различных продуктов, полученных из катионообмена, выбрали два продукта, LPEI-PEG2k-OPSS (ди-конъюгат 1:1 с молярным соотношением LPEI к PEG ~ 1:1) и LPEI-(PEG2k)3-(OPSS)3 (ди-конъюгат 1:3 с молярным соотношением ~ 1:3) для образования три-конъюгатов. Применяли анализ на медь, чтобы оценить концентрацию сополимера [17]. Вкратце, сополимеры инкубировали с CuSO4 (23 мг, растворенные в 100 мл ацетатного буфера) в течение 20 минут и измеряли их оптическую плотность при 285 нм.
Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ)
[0087] Образцы (30 мкл) разводили в ДСН-буфере для образца белка с добавлением или без 100 мМ ДТТ и далее наносили на Трицин-гель (13% полиакриламида). Электрофорез проводили, применяя катодный буфер (0,1 М Tris, 0,1 М Трицина и 0,1% ДСН рН 8,25) и анодный буфер (0,21 М Tris рН 8,9) и полосы белка визуализировали путем окрашивания InstantBlue™.
Экспрессия и очистка аффитела
[0088] Ген Her-2 аффитела клонировали в плазмиду рЕТ28а, образуя вектор, кодирующий Z:2891 аффитело, слитое с гексагистидиновой (His6) меткой на N-конце и Cys-остатком на С-конце. Экспрессию аффитела осуществляли в E.coli BL21 (DE3) следующим образом: Клетки выращивали при 37°С до OD600 ~ 0,7. Добавляли IPTG до конечной концентрации 0,5 мМ с последующей инкубацией при 30°С в течение 4 ч. Клеточный осадок хранили при -80°С. Для того, чтобы очистить аффитело, клеточный осадок ресуспендировали в буфере А (20 мМ HEPES рН 7,4, 500 мМ NaCl, 10% глицерина, 10 мМ имидазола и 2 мМ β-меркаптоэтанола) и разрушали, применяя технологическую установку Micro fluid izer M-110EHI согласно инструкции изготовителя. Растворимую фракцию выделяли при помощи центрифугирования при 12000 × g в течение 10 мин при температуре 4°С. Полученную фракцию наносили на никелевую колонку для аффинной хроматографии (Clontech, Маунтин-Вью, Калифорния). Колонку промывали буфером А в объеме 14 колонок (cv). После этого стадию градиентной элюции проводили, применяя возрастающие концентрации буфера В (20 мМ HEPES рН 7,4, 500 мМ NaCl, 10% глицерина, 500 мМ имидазола и 2 мМ β-меркаптоэтанола); 6% буфера В в объеме 5 колонок, 10%) буфера В в объеме 1,5 колонок, 30% буфера В в объеме 2 колонок. Связанный белок элюировали 100% буфером В в объеме 5 колонок (установка очистки белка, центр Wolfson, Израиль). Далее элюированные фракции концентрировали с фильтром Amicon (с пороговым значением в 3 кДа) и наносили на гель-фильтрационную колонку Superdex 30 prep grade (120 мл) (GE Healthcare). Далее очищенные белки анализировали при помощи ДСН-ПААГ и подтверждали при помощи вестерн-блоттинга с антителом против аффитела (Abeam). Чистоту также оценивали посредством ВЭЖХ с обращенной фазой (Merck-Hitachi модель L-7100), описанной ранее.
Синтез аффитела с PEI-PEG лигандом (три-конъюгата 1:1 и 1:3)
[0089] 4,97 мг каждого ди-конъюгата (1:1 и 1:3) растворяли в 940 мкл 20 мМ HEPES рН 7,4. Далее 3,4 мг Her-2 аффитела в HBS добавляли по каплям к реакционной смеси. Для увеличения растворимости в реакционную смесь вводили 4 мл 20 мМ HEPES совместно с 700 мкл ацетонитрила (с квалификацией «для ВЭЖХ»). Далее реакционную смесь встряхивали (800 оборотов в минуту) при комнатной температуре до тех пор, пока А343 не показало полное обновление. Полученные три-конъюгаты очищали при помощи катионообменной хроматографии на HR10/10 колонке, заполненной ионообменной смолой MacroPrep High S (BioRad) (применяя трехстадийную градиентную элюцию 20 мМ HEPES рН 7,4 до 20 мМ HEPES, содержащего 3 М NaCl). Элюированные фракции вводили в аналитический ВЭЖХ-хроматограф с обращенной фразой, чтобы оценить чистоту три-конъюгатов, фракции с чистотой 95% и выше объединяли и содержали при -80°С. Концентрацию три-конъюгата определяли при помощи анализа на медь (указано выше). Количество конъюгированного белка определяли при помощи А280, применяя Nano-Drop 2000.
Проверка и чистота химических векторов, конъюгированных с нацеливающимся белком.
[0090] Три-конъюгаты подвергали ДСН-ПААГ-электрофорезу и окрашивали InstantBlue™, чтобы подтвердить конъюгацию аффитела с LPEI-PEG2k. Чистоту три-конъюгатов подтверждали при помощи ВЭЖХ с обращенной фазой, применяя аналитическую Vydac С-8 мономерную 5 мкм колонку (300 ангстрем, 4,6 х 150 мм) при 1 мл/мин, одновременно отслеживая при 220 нм. Для ВЭЖХ-анализа применяли градиентную элюцию с ацетонитрилом 5%-95% через 25 мин с троекратно дистиллированной водой (TDW), содержащей 0,1% ТФУ в качестве подвижной фазы.
Образование полиплекса
[0091] Плазмиду pGreenFirel, кодирующую люциферазу светлячков и зеленый флуоресцентный белок (GFP) (System Biosciences, Inc), амплифицировали в E.coli и очищали при помощи набора Qiagen Plasmid Maxi Kits (Qiagen, Валенсия, Калифорния, США) согласно протоколу производителя. Три-конъюгат 1:1 или три-конъюгат 1:3 связывали в комплекс с плазмидой при соотношении N/P= 6 в HEPES-буфере глюкозы (где N = азот из LPEI и Р = фосфат из ДНК) с образованием двух полиплексов. Для того, чтобы осуществить полное образование частиц полиплексов, образцы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Конечная концентрация плазмиды в образцах полиплексов составляла 100 мкг/мл, тогда как для анализа защиты от ДНКазы и анализа люциферазы, конечная концентрация плазмиды составляла 10 мкг/мл.
Измерения ξ-потенциала и размеров
[0092] Размеры полиплексных частиц, полученных после диспергирования в HBG буфере, измеряли при 25°С при помощи динамического светорассеяния, применяя nano-ZS Zetasizer (Malvern, Великобритания), применяя расчет распределения объема. Прибор оснащен 633 нм лазером и светорассеяние обнаруживается при 173° по технологии обратного рассеяния (NIBS, неинвазивного обратного рассеяния). Каждый образец запускали в трех повторах. Измерения ζ-потенциала также проводили при 25°С, применяя nano-ZS Zetasizer (Malvern, Великобритания), ζ-потенциал оценивали после инкубации полиплексов в HBG-буфере (рН 7,4). Светорассеяние от движущихся частиц обнаружили при 17° и применяли модель Смолуховского для определения значения функции Генри.
Лтомно-силовая микроскопия
[0093] Для АСМ-измерений полиплексы размещали на свежеотколотых слюдяных дисках (VI 12 мм, Ted Pella США). Визуализацию проводили в HBG-буфере при 250°С, применяя коммерческий ACM, NanoWizard® 3 (JPK instrument, Берлин, Германия) с режимом QI™. Кантеливеры Si3N4 (серия MSNL-10, Bruker) с пружинными константами, отранжированными от 10 до 30 пН нм-1, калибровали при помощи термофлуктуационного способы (входит в состав программного обеспечения АСМ) с абсолютной погрешностью приблизительно 10%. Настройки QI™ были следующими: Z-длина: 0,1 мкм; приложенная сила: 0,5 нН; скорость: 50 мкм/с.
Анализ защиты от ДНКазы
[0094] Анализы защиты от ДНКазы I проводили так, как описано ранее [18]. Вкратце, 1 мкг отдельной ДНК pGreenFirel, с полиплексом 1:1 или с полиплексом 1:3 смешивали в конечном объеме 50 мкл в HBS-растворе. После 30 минут инкубации при комнатной температуре 2 мкл ДНКазы I (2 единицы) или PBS добавляли к 10 мкл каждого образца и инкубировали в течение 15 мин при 37°С. Активность ДНКазы I останавливали путем добавления 5 мкл 100 мМ ЭДТА в течение 10 мин при комнатной температуре. Для того, чтобы диссоциировать плазмиды от три-конъюгатов, добавляли 10 мкл 5 мг/мл гепарина (Sigma, Сент-Луис, Миссури) и инкубировали пробирки в течение 2 ч при комнатной температуре. Проводили электрофорез образцов на 0,8% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием. Изображения получали, применяя Gel Doc EZ Imager (Bio Rad Laboratories, Inc).
Клеточная культура
[0095] ВТ474 клетки, гиперэкспрессирующие Her-2, культивировали в RPMI-среде, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 104 Ед/л пенициллином и 10 мг/л стрептомицином, при 37°С в 5% СО2. MDA-MB-231 клетки карциномы молочной железы человека культивировали в среде Лейбовиц L-15 с 10%) FBS, 104 Ед/л пенициллином и 10 мг/л стрептомицином при 37°С в 5% СО2. Клеточные линии были из АТСС, а реагенты клеточных культур были из Biological Industries, Bet Ha'emek, Израиль.
Анализ люциферазы и конфокальная микроскопия
[0096] 10000 ВТ474 и MDA-MB-231 клеток высевали в трех повторах в 96-луночных планшетах. Клетки обрабатывали три-конъюгатом 1:1 и три-конъюгатом 1:3, находящихся в комплексе с плазмидой. Через 48 ч после обработки клетки промывали PBS и лизировали с 30 мкл буфером клеточного лизиса (Promega, Мангейм, Германия) на лунку. Активность люциферазы измеряли в 25 мкл образцах лизатов, применяя систему анализа люциферазы (Luciferase Assay system) (Promega) согласно рекомендаций производителя. Измерения проводили, применяя восходящий микропланшетный люминометр Luminoskan™ (Thermo Scientific). Значения в относительных световых единицах (RLU) представлены как среднее и стандартное отклонение активности люциферазы из трех параллельных образцов. Конфокальную микроскопию (FV-1200 Olympus) применяли, чтобы визуализировать GFP, который брали для того, чтобы отразить интернализацию плазмиды pGreenFirel. Фотографии были сделаны при десятикратном (×10) увеличении.
Количественное определение жизнеспособности клеток
[0097] Жизнеспособность клеток измеряли посредством колориметрического анализа, применяя метиленовый синий, описанного ранее [19]. Вкратце, 10000 ВТ474 и MDA-MB-231 клеток высевали в трех повторах в 96-луночные планшеты. Клетки обрабатывали полиплексами 1:1 и 1:3, содержащими 1 мкг/мл pGreenFire1. Через 48 ч после обработки клетки фиксировали с 1% формальдегидом в PBS (рН 7,4), промывали DDW и далее окрашивали 1% раствором (масс/объем) метиленового синего в боратного буфере в течение 1 ч. После этого пятно экстрагировали при помощи 0,1 М HCl, и оптическую плотность раствора красителя считывали при 630 нм в считывающем устройстве для микропланшетов (ELx800 BIO-ТЕХ Instruments Inc.).
Пример 1. Синтез тиолреактивных сополимеров
[0098] 3.1. Предыдущие исследования продемонстрировали РЕGилирование LPEI и его конъюгатов с EGFR-нацеливающимся фрагментом [13]. Тем не менее, количество ПЭГилирований на одиночную цепь LPEI полностью не охарактеризовано. Для того, чтобы образовать дифференцированно РЕСилированные сополимеры, вторичные амины на LPEI конъюгировали с концевой ортогональной защитной группой NHS-эфира на PEG. Эфир N-гидроксисукцинимида (NHS) спонтанно реагирует с вторичными аминами основной цепи LPEI, обеспечивая эффективное РЕGилирование LPEI. Кроме того, реакция NHS-PEG-OPSS с аминами PEI приводит к образованию стабильных необратимых амидных связей (Фигура 1).
[0099] Продукты РЕGилирования очищали при помощи катионообменной хроматографии. Два пика элюировали при высоких концентрациях NaCl, один при 120 мСм/см, а другой при 132 мСм/см (данные не показаны). Предположительно оба продукта отличались по своим соотношениям LPELPEG и, следовательно, по своим чистым положительным зарядам. ПМР-спектры анализировали, применяя относительные интегральные значения водородных атомов на PEG (-СН2-СН2-О-) (Фигура 2) и интегральные значения водородных атомов на LPEI (-СН2-CH2-NH-) (Фигура 2). Данный анализ показал, что материал, элюированный в первом пике, состоял из сополимера, в котором каждый моль LPEI был сконъюгирован с приблизительно тремя молями PEG. Данный продукт назвали LPEI-(PEG2k)3-(OPPS)3 ("ди-конъюгат 1:3"). Второй пик состоял из сополимера, в котором равные моли PEG были сконъюгированы с LPEI, и его назвали LPEI-PEG2k-OPSS ("ди-конъюгат 1:1") (Фигура 2).
Пример 2. Синтез три-конъюгатов, LPEI-PEG2k-Her2 аффитела (три-конъюгат 1:1) и LPEI-(PEG2k)-(Her2)3 аффитела (три-конъюгат 1:3)
[00100] Основная цель данного исследования состояла в том, чтобы разработать катионный полимер, который бы нацеливался на опухолевые клетки, гиперэкспрессирующие Her-2. Поскольку Her-2 представляет собой "сиротский рецептор", молекулы аффитела, нацеливающиеся на Her-2-рецептор (нежели чем лиганд), применяли для образования три-конъюгатов, нацеливающихся на Her-2. Авторы настоящего изобретения экспрессировали и очищали Her-2 аффитело с Cys-остатком на С-концевой области для того, чтобы обеспечить дальнейшую конъюгацию. Тиолреактивные сополимеры, ди-конъюгаты 1:1 и 1:3, конъюгировали с Her-2 аффителом через свой концевой Cys-остаток, образуя три-конъюгаты 1:1 и 1:3 соответственно (Фигура 3). Для того, чтобы образовать три-конъюгаты, реакцию следовало проводить с низкой концентрацией аффитела (для того, чтобы предотвратить агрегацию) и в присутствии 10% ацетонитрила (ACN) в качестве органического полярного растворителя для повышенной растворимости. Выход реакции для обеих три-конъюгатных реакций составлял приблизительно 33%, определенный анализом на медь. Для того, чтобы подтвердить конъюгацию аффитела с ди-конъюгатом, три-конъюгатные продукты восстанавливали с ДТТ и разделяли ДСН-ПААГ-электрофорезом. Окрашивание с кумасси голубым подтверждало, что восстановленный три-конъюгат высвобождал аффитело (Фигура 4). Количество Her-2 аффитела, присутствующего в три-конъюгатах, определяли путем измерения А280. Применяя анализ на медь, авторы настоящего изобретения количественно определили LPEI. Как было описано выше, ПМР-анализ показал, что соотношение LPELPEG в очищенных ди-конъюгатах составляло 1:1 или 1:3. Сравнивая молярные соотношения Her-2 аффитела и LPEI, авторы настоящего изобретения определили, что среднее соотношение Her-2 аффитела к LPEI в три-конъюгате 1:1 составляло 1:1, а в три-конъюгате 1:3 среднее соотношение составляло 3:1. Таким образом, авторы настоящего изобретения сделали вывод, что была достигнута почти полная конъюгация аффитела к LPEI-PEG.
[00101] Для того, чтобы образовать полиплексы, чистые ди-конъюгаты и три-конъюгаты (1:1 и 1:3) соединяли в комплекс с плазмидной ДНК, как описано в Материалах и Способах (Фигура 3).
Пример 3. ξ-потенциал и определение размера полиплексов
[00102] Далее авторы настоящего изобретения охарактеризовали полиплексы по размеру и поверхностному заряду, применяя динамическое светорассеяние (DLS). Размер полиплекса оказывает существенное влияние на его свойства доставки [21]. Для того, чтобы исследовать воздействие нацеливающегося лиганда на размер полиплекса, авторы настоящего исследования решили образовать комплекс обоих ди-конъюгатов 1:1 и 1:3 с плазмидой и измерить их размер. Ди-конъюгат 1:1 обладал средним размером частиц 115,2±8,2 нм и ди-конъюгат 1:3 обладал средним размером частицы 253,1±9,5 нм. Полиплекс, образованный из три-конъюгата 1:1 с плазмидой, приводил к получению среднего размера частиц 141±5,8 нм, в то время как три-конъюгат 1:3, находящийся в комплексе с плазмидой, обладал средним размером частицы 256±24,2 нм (Фигура 5). Мельчайшие частицы (73,9±3,0 нм) получали в полиплексах, образованных путем комплексообразования плазмиды только с LPEI. Конъюгация аффитела с ди-конъюгатами обладала лишь незначительным воздействием на размер частиц. Число PEG-групп, тем не менее, действительно влияло на размер частицы, подтверждая, что PEG-группы вызывают стерические затруднения, препятствуя плазмидной конденсации.
[00103] Положительный поверхностный заряд способствует связыванию полиплекса с отрицательно заряженной клеточной поверхностью, однако чрезмерный положительный заряд может привести к неспецифичному связыванию и значимой токсичности [12]. ξ-потенциалы различных комплексов, представленных на Фигуре 6, согласуются с предыдущими исследованиями, которые показали понижение ξ-потенциала в увеличенном числе PEG-единиц [13]. Для того чтобы оценить воздействие PEG-групп на поверхностный заряд исследуемых химических векторов, авторы настоящего изобретения измеряли ξ-потенциалы полиплексов, сформированных путем комплексообразования плазмидной ДНК с предшественниками, ди-конъюгатами 1:1 и 1:3, и с три-конъюгатами 1:1 и 1:3. Ди-конъюгатный полиплекс 1:1 обладал средним ξ-потенциалом 27,0±0,1 мВ, а ди-конъюгатный полиплекс 1:3 обладал средним ξ-потенциалом 20,0±1,0 мВ. Три-конъюгатный полиплекс 1:1 показал ξ-потенциал в среднем 17,1±0,7 мВ, в то время как три-конъюгатный полиплекс 1:3 показал средний 10,2±0,44 мВ (Фигура 6). В отличие от размеров, на ξ-потенциалы полиплексов влияло как число PEG-групп, так и конъюгация Her-2 аффитела. Хотя самые маленькие, наиболее положительно заряженные полиплексы получали с оголенным LPEI, данные частицы являются чрезвычайно токсичными [22]. Авторы настоящего изобретения ожидали, что добавление PEG-групп и нацеливающегося фрагмента приведет к снижению токсичности, однако в связи с тем, что полиплексы все еще были относительно небольшими по размеру, авторы настоящего изобретения рассчитывали на то, что их эффективность в качестве векторов для доставки нуклеиновой кислоты не будет поставлена под угрозу.
Пример 4. Оценка полиплексной формы с применением атомно-силовой микроскопии
[00104] Получает признание важность формы частицы и ее влияние на свойства доставки [23]. Авторы настоящего изобретения анализировали морфологию полиплексов, полученных с три-конъюгатами в растворе, применяя атомно-силовую микроскопию (АСМ). Диаметры обоих три-конъюгатных 1:1 и 1:3 полиплексов находились в диапазоне наноразмеров (Фиг. 7А-В), что согласуется с результатами, полученными при помощи DLS. Три-конъюгатный 1:1 полиплекс отображает в основном эллиптические частицы. Диаметр большинства частиц составлял от 101 нм до 178 нм со средним диаметром частицы 142 нм. Несколько частиц были исключительно велики, некоторые даже достигали >250 нм (Фиг. 7А). Три-конъюгатный 1:3 полиплекс был более гетерогенным по форме, и, более того, позволял получить крупные агрегаты с частицами неопределенной формы (Фиг. 7 В). Их длина составляла от 150 нм до 650 нм при средней длине частиц 312 нм, а их ширина составляла от 85 нм до 400 нм при средней ширине 175 нм.
Пример 5. Анализ защиты от ДНКазы
[00105] Успешная доставка генов in vivo зависит от эффективной защиты от нуклеаз. Для того, чтобы определить способность три-конъюгатов обеспечивать защиту плазмид от разложения и позволять осуществлять эффективную доставку гена, полиплексы обрабатывали ДНКазой 1 и анализировали, применяя гель-электрофорез. Как показано на Фигуре 8, ДНК оголенной плазмиды pGreenFire1 была полностью разложена после 10-минутной инкубации с 2 единицами ДНКазы I. В противоположность этому, когда полиплексы образовывали путем смешивания плазмиды с три-конъюгатами, плазмиду защищали от разложения ДНКазой I. Полную защиту плазмиды наблюдали для три-конъюгатного полиплекса 1:3, в то время как несколько никований происходили для три-конъюгатного полиплекса 1:1, что показано переходом от суперспиральной (s.c.) к открытой кольцевой форме (о.с) плазмиды. Более сильная защита от ДНКазы I, обеспечиваемая три-конъюгатным полиплексом 1:3, может быть связана с увеличенным стерическим затруднением, которое обеспечивается дополнительными PEG-белковыми единицами в данных комплексах. Предыдущие исследования действительно показали, что РЕGилирование PEI может обеспечить стабилизацию полиплексов и увеличить их циркуляцию в крови, препятствуя их взаимодействиям с ферментами и сывороточными факторами [24, 25].
Пример 6. Биологическая активность нацеливающихся три-конъюгатных полиплексов
[00106] Размер полиплекса и ξ-потенциал влияют на эффективность направленной доставки ДНК и экспрессию генов, однако влияние размера, по всей видимости, зависит от конкретного конъюгата [2] [21]. Для того, чтобы оценить специфичность и эффективность трансфекции три-конъюгатных полиплексов 1:1 и 1:3, использовали две клеточные линии рака молочной железы, которые дифференцированно экспрессируют Her-2. Полиплексы три-конъюгатов 1:1 и 1:3 формировали с pGreenFire1 и трансфицировали в MDA-MB-231 клетки (экспрессирующие приблизительно 9×103 Her-2-рецепторов на клетку [26]) и ВТ474 клетки (экспрессирующие приблизительно 1×106 Her-2-рецепторов на клетку [27). Дифференциальную активность люциферазы наблюдали через 48 ч после трансфекции. Оба три-конъюгатных полиплекса 1:1 и 1:3 привели к более 300-кратно высокой активности люциферазы в ВТ474 клетках, нежели чем в MDA-MB-231 (*р<0,001) (Фигура 9А). Более эффективная доставка генов в ВТ474 подтверждалась экспрессией GFP, как это показано при помощи конфокальной микроскопии (Фигура 9 В). Данные результаты показывают, что селективность полиплекса зависит от экспрессии Her-2.
[00107] Направленная доставки в ВТ474 клетки три-конъюгатным полиплексом 1:1 была в 10 раз более эффективной, нежели чем доставка три-конъюгатным полиплексом 1:3 (Фигура 9А, В), даже если три-конъюгат 1:3 обладал более нацеливающимися фрагментами. Это может находить отражение в более высоком ξ-потенциале и более низком размере три-конъюгатного полиплекса 1:1.
[00108] Положительно заряженные химические векторы на основе LPE1 связывают со значимой токсичностью. Таким образом авторы настоящего исследования следующим исследовали выживаемость MDA-MB-231 и ВТ474 клеток после обработки с три-конъюгатными полиплексами 1:1 и 1:3. Ни один из полиплексов не показал цитотоксических эффектов в MDA-MB-231 клетках при анализе с метиленовом синим. Аналогичные результаты наблюдали в ВТ474клетках, обработанных три-конъюгатным полиплексом 1:3. Тем не менее небольшое увеличение клеточной цитотоксичности наблюдалось в ВТ474 клетках, обработанных три-конъюгатным полиплексом 1:1 (Фигура 9С). В целом данные результаты указывают на то, что малый размер и более высокий ξ-потенциал три-конъюгатного полиплекса 1:1 обеспечивают свойства эффективной направленной доставки с только небольшим увеличением токсичности. Таким образом полиплекс три-конъюгата 1:1 в доставке генов превосходит более экранированный три-конъюгатный полиплекс 1:3.
Пример 7. Противоопухолевая активность PEI-РЕС-Неr2Аффитела
[00109] PEI-РЕС-Неr2ААффитело (РРНА), находящееся в комплексе с Полиинозин/Полицитозин (PolyIC), обладает сильной противоопухолевой активностью. Было обнаружено, что клеточные линии рака молочной железы, гиперэкспрессирующие Her-2, сильно ингибируются комплексом PEI-РЕО-Неr2ААффитела с PolyIC. Сильное ингибирование также наблюдали в отношении трастузумаб-резистентных клеточных линий рака молочной железы, гиперэкспрессирующих Her2.
[00110] На Фигуре 10 представлено, что вектор/полиплекс ингибирует клетки, гиперэкспрессирующие Her2, включая клетки, резистентные к Герцептину/трастузумабу.
[00111] Инъекцию 0,5×106 MCF-7 HER-2 клеток подкожно осуществляли бестимусным мышам. Лечение начинали после того, как опухоли в среднем достигали 100 мм3. Каждые 24 часа осуществляли в.в инъекцию 1 мг/кг pIC/PPHA. Трастузумаб вводили в.в. один раз в неделю (указано стрелками) двум группам мышей. Рост опухоли измеряли два раза в неделю. Было обнаружено, что комплекс PolyIC/PPHA обладает сильной противоопухолевой активностью в мышиных моделях, в которые осуществляли имплантацию данных клеточных линий бестимусным мышам, проиллюстрированной на Фигуре 11.
Пример 8. Синтез LPEI-PEG-EGFR аффитела
[00112] 5 мг (2×10-4 ммоль) LPEI-PEG2k-OPSS (ди-конъюгат 1:1) растворяли в 1 мл 20 мМ HEPES рН 7,4. Далее 3,4 мг (3,8×10-4 ммоль, ~ 2 экв) EGFR аффитела в HBS добавляли по каплям к реакционной смеси. 4 мл 20 мМ HEPES плюс 700 мкл ацетонитрила (в квалификации для «ВЭЖХ») вводили в реакционную смесь для увеличенной растворимости. Далее реакционную смесь встряхивали (800 оборотов в минуту) при комнатной температуре и в условиях темноты до тех пор, пока А343 не показало полное обновление. Полученный в результате три-конъюгат очищали при помощи катионообменной хроматографии на HR10/10 колонке, заполненной ионообменной смолой MacroPrep High S (BioRad) (применяя трехстадийную градиентную элюцию 20 мМ HEPES рН 7,4 до 20 мМ HEPES, содержащего 3 М NaCl). Элюированные фракции вводили в аналитический ВЭЖХ-хроматограф с обращенной фразой, чтобы оценить чистоту LPEI-PEG-EGFR три-конъюгата, фракции с чистотой 95% и выше объединяли и содержали при -80°С. Концентрацию три-конъюгата определяли при помощи анализа на медь. Количество конъюгированного белка определяли при помощи А280, применяя Nano-Drop 2000.
Пример 9. Противоопухолевая активность PEI-PEG-EGFR аффитела
[00113] PEI-PEG-EGFRAффитeлo (РРЕА), находящееся в комплексе с PolyIC, обладает сильной противоопухолевой активностью. Было обнаружено, что разнообразные клеточные линии, гиперэкспрессирующие EGFR, сильно ингибируются комплексом PEI-PEG-ЕGFRАффитело (РРЕА) в комплексе с Полиинозином/Полицитозином (PolyIC). Можно увидеть, что эффективность РРЕА выше, чем активность у РРЕ (Фигура 12).
[00114] Было обнаружено, что комплекс PolyIC/PPEA обладает сильной противоопухолевой активностью в мышиных моделях, в которые осуществляли имплантацию данных клеточных линий бестимусным мышам.
[00115] Инъекцию 2 млн А431 клеток осуществляли подкожно 65 самкам бестимусных мышей в возрасте 5 недель. Семь дней спустя выросли опухоли среднего объема 136 мм3, и мышей разделили на 6 групп (7-8 мышей в группе) следующим образом: UT; pIC/PPEA, 0,75 мг/кг = 250 мкл pIC для 25 гр мыши, IC, 6/неделю; pI/РРЕА, 0,75 мг/кг IV, 6/неделю; pIC/PPEA низкий, 0,1 мг/кг = 250 мкл 0,01 мкг/мкл pf pIC 25 гр мыши, IC, 6/неделю. pIC, pI и РРЕ и РРЕА разбавляли перед смешиванием, чтобы получить концентрацию в комплексе pIC ниже обычной (0,1 мкг/мкл). На Фигуре 13 представлена активность PolyIC/РРЕАффитела in vivo. В этом же случае эффективность PPEA/PolyIC выше, чем у PolyIC/PPE.
Пример 10. Синтез LPEI-PEG-h/mEGF
10.1. Синтез LPEI-PEG-SH интермедиата
[00116] К 5 мг LPEI-PEG-OPSS (0,2 мкмоль, что соответствует 24000 г/моль) в 5 мл 20 мМ HEPES (рН 7,4) буфера добавляли 50-кратный молярный избыток дитиотреитола (DTT (ДТТ), 0,1 ммоль, 1,5 мг) и перемешивали при помощи вихревой мешалки в течение 20 мин при комнатной температуре в 15 мл пластиковой центрифужной пробирке. Восстановленный ди-конъюгат разделяли на колонке Sephadex G-25 (20 мл, 4×5 мл), применяя 5 мл пробоотборные петли, и осуществляли элюирование с 20 мМ HEPES рН 7,4 при скорости потока 1,0 мл/мин и анализировали при помощи ВЭЖХ, применяя те же условия и способы, описанные выше.
[00117] Анализ Эллмана применяли, чтобы оценить концентрацию сульфгидрильной группы в LPEI-PEG-SH интермедиате. Концентрация SH-групп прямо пропорциональна концентрации хромофор-6-нитро-3-тиоксоциклогеска-1,4-диен-1-карбоновой кислоты, высвобождаемой при помощи свободных тиолов, которые в количественном соотношении вступают в реакцию с реагентом Эллмана. Хромофор измеряли посредством оптической плотности в 412 нм без какого-либо вмешательства со стороны образца или реагента в Эллмана.
10.2 Синтез m/h EGF-MCC интермедиата
[00118] Основные принципы синтеза. Указанный h/mEGF (человеческий/мышиный Эпидермальный Фактор Роста) модифицировали в h/mEGF-MCC (EGF-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоновая кислота; МСС) и очищали, чтобы впоследствии применить для конъюгации с LPEI-PEG-SH. Активация h/mEGF путем присоединения МСС-группы позволяет устранить уменьшение белка ДТТ и позволяет не подвергать h/mEGF-MCC воздействию суровых условий. Таким образом, эффективность реакции конъюгации улучшается, и более того, EGF-MCC является стабильным материалом, который можно хранить при температуре -80°С в течение нескольких недель.
[00119] Синтез hEGF-MCC: 1 мг hEGF (160 нмоль) ресуспендировали в 0,5 мл воды, далее дегазировали аргоном. Количество hEGF определяли при длине волны 280 нм, применяя nano-drop 2000. Раствор добавляли к 0,5 мл 200 мМ натрий-ацетатного буфера рН 6,0 и 60% этанола при энергичном перемешивании. Раствор смешивали с 10 эквивалентами 4-натриевой соли 3-сульфо-М-гидроксисукцинимид эфира (N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоновой кислоты в 0,5 мл 100% этанола в атмосфере аргона. Слегка кислый рН реакционной смеси (рН 6) был необходим для того, чтобы избирательно модифицировать N-концевую аминогруппу hEGF. После 4 ч при комнатной температуре функционализованный пептид очищали при помощи диализных мешков (с пороговым значением в 3,5k) против HBS (100 мМ), три раза в 1 л в течение 1 ч, далее в 1 л в течение ночи. Указанный hEGF-MCC анализировали, применяя ВЭЖХ-масс-спектры (МС), и он обладал молекулярной массой 6435,7 г/моль, что указывает на наличие одной конъюгации сульфо-SMCC с hEGF. Анализ методом ВЭЖХ-МС проводили, применяя Thermo SCIENTIFIC/ LCQ FLEET, оборудованный С-18 колонкой с обращенной фазой (Phenomenex, Aeris, 3,6 мкм, 2,1 мм × 50 мм, 100 ангстрем).
[00120] Синтез mEGF-MCC: 0,5 мг (0,088 мкмоль общего количества) мышиного EGF (PeproTech) растворяли в 2100 мкл 20 мМ HEPES буфера с образованием прозрачного вязкого раствора. Один мг сульфо-SMCC (30 экв., Орнат, Иллинойс) растворяли в 0,9 мл абсолютного этанола и медленно смешивали с раствором EGF, чтобы достичь конечной концентрации 30% этанола в общем 3,0 мл объеме. Кратковременное перемешивание привело к получению прозрачного раствора. Далее реакционный сосуд встряхивали при температуре окружающей среды в течение 4-х часов. По истечении данного периода времени раствор оставался прозрачным. mEGF-MCC отделяли первым на G-25 колонке Sephadex (4×5 мл) и осуществляли элюирование 20 мМ HEPES рН 7,4 при скорости потока 1,0 мл/мин, а также очищали и анализировали при помощи ВЭЖХ, применяя те же условия и стандартный способ, описанный выше для LPEI-PEG-OPSS.
10.3 Синтез LPEI-PEG-h/mEGF
[00121] Один с половиной эквивалента hEGF-MCC или mEGF-MCC смешивали с 1,0 эквивалентом LPEI-PEG-SH. Реакционную смесь сначала перемешивали при комнатной температуре в течение 2-х часов, а далее инкубировали в течение 4 дней при температуре +4°С при медленном встряхивании. Продукт реакции (LPEI-PEG-hEGF или LPEI-PEG-mEGF) отделяли при помощи катионообменной хроматографии (7,8 см ионообменная смола MacroPrep High S (BioRad) в 10/1 см колонке Tricorn GE Healthcare), применяя градиентный насос через входное отверстие для буфера А18 при скорости потока 0,5 мл/мин и применяя растворитель А: 20 мМ HEPES рН 7,4 и растворитель В: 20 мМ HEPES рН 7,4, NaCl 3,0 М. Очищенный LPEI-PEG-hEGF или LPEI-PEG-mEGF три-конъюгат анализировали при помощи ВЭЖХ и количественно определяли концентрации [LPEI] и [EGF] при помощи "анализа на медь" и EGF-фотометрического анализа соответственно.
10.4 Биологическая активность LPEI-PEG-hEGF
[00122] Применяя клеточный анализа, который авторы настоящего исследования обычно использовали, авторы настоящего изобретения сравнивали активность PolyIC/LPEI-PEG-hEGF комплекса (PPEm) с PolyIC/MPPE (мыши), описанного в Schaffert D, Kiss М, Rodl W, Shir A, Levitzki A, Ogris M, Wagner E., 2011 (Poly(I:C)-mediated tumor growth suppression in EGF-receptor overexpressing tumors using EGF-polyethylene glycol-linear polyethylenimine as carrier. Pharm Res. 28:731-41). Можно видеть, что новый HEGF-конъюгат является более эффективным при гибели клеток, гиперэкспрессирующих EGFR (Фигура 14). Клетки, которые экспрессируют умеренное количество молекул EGFR на своей поверхности (U87MG клетки экспрессируют 80000 EGFR на клетку), менее чувствительны к обработке, нежели чем клетки, гиперэкспрессирующие огромное количество (U87MGwtEGFR клетки экспрессируют 1000000 EGFR на клетку).
Пример 11. Синтез DUPA-аналога - DyLight 680
[00123] Пептид синтезировали, применяя стандартные процедуры Fmoc-твердофазного пептидного синтеза (ТФПС) на Fmoc-Cys(trt) смоле Ванга в качестве твердой подложки. Набухание: смола набухала в течение по меньшей мере 2 ч в дихлорметане. Fmoc-удаление: сначала смолу обрабатывали раствором 20% пиперидина в диметилформамиде (ДМФА) (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5×2 мин). Связывание Fmoc-Asp(OtBu)-OH: 3 экв. Fmoc-Asp(OtBu)-OH, 3 экв. (гексафторфосфат 1-[бис(диметиламино)метилен]-1Н-1,2,3-триазоло[4,5-b]пиридиний-3-оксида) (HATU) растворяли в 15 мл ДМФА и 8 экв. N,N-диизопропилэтиламин (DIEA или DIPEA) добавляли к смеси. Раствор перемешивали (предварительно активированный) в течение 10 минут при комнатной температуре до того, как его добавляли к смоле в течение 1 часа. Присоединение повторяли дважды с новой смесью для того, чтобы обеспечить полное присоединение аспарагиновой кислоты. Тест Кайзера проводили для того, чтобы обеспечить полное присоединение. Смолу промывали ДМФА (3×2 мин) и дихлорметаном (ДХМ) (2×2 мин). Кэширование: смолу обрабатывали раствором уксусного ангидрида (10 экв.) и DIPEA (8 экв.) в ДМФА в течение 20 мин и промывали ДМФА (3×2 мин). Fmoc-удаление: смолу сначала обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5x2 мин). Присоединение Fmoc-диаминопропионовой (ДАП) кислоты: 3 экв. Fmoc-диаминопропионовой (ДАП) кислоты, 3 экв. HATU и 8 экв. DIEA растворяли в 15 мл ДМФА. Раствор перемешивали (предварительно активированный) в течение 10 минут при комнатной температуре до того, как его добавляли к смоле в течение 1 часа. Тест Кайзера проводили для того, чтобы обеспечить полное присоединение. Смолу промывали ДМФА (3×2 мин) и ДХМ (2×2 мин). Удлинение пептида: следующие соединения присоединяли к смоле в следующем порядке (1) Fmoc-Phe-OH, (2) Fmoc-Phe-OH, (3) Fmoc-8-аминооктановая (ЕАО) кислота и (4) OtBu-Glu(Fmoc)-OH. Fmoc-удаление: смолу обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5×2 мин) и ДХМ (3×2 мин). Присоединение DUPA-лиганда: 0,9 мл триэтиламина (6,6 ммоль) соединяли с 0,9 г (3 ммоль) гидрохлорида ди-трет-бутилового эфира L-глутаминовой кислоты в 15 мл ДХМ. Данный раствор по каплям добавляли в течение 45 минут к раствору 5 мл ДХМ и трифосгена (0,35 г, 1,1 ммоль) при 0°С. После перемешивания в течение дополнительных 50 мин смесь добавляли к смоле с дополнительными 0,9 мл триэтиламина. Реакционную смесь со смолой встряхивали в течение 3 ч и промывали ДМФА (3×2 мин). Полное расщепление: смолу промывали ДХМ (3×2 мин) и сушили в вакууме. Добавляли раствор 2,5% TDW и 2,5% триизопропилсилана в трифторуксусной кислоте (ТФУ) при температуре 0°С. Реакцию проводили в течение 4 ч при комнатной температуре, фильтровали и обрабатывали охлажденным раствором эфир/гексан 1:1, и осаждали пептиды центрифугированием. Неочищенные пептиды растворяли в растворе ацетонитрил/TDW 1:1 и подвергали лиофилизации. Сырой продукт очищали при помощи препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (ОФ). Присоединение DyLight 680: в атмосфере аргона 1 мг DyLight™ 680 (Life Technologies., Cat №46418) растворяли в безводном диметилсульфоксиде (ДМСО, 100 мкл), содержащем 50 эквивалентов безводного диизопропилэтиламина. Двукратный молярный избыток DUPA-пептидного линкера, растворенного в безводном ДМСО (100 мкл), добавляли к указанной выше смеси и перемешивали при комнатной температуре. Образование продуктов подтверждали при помощи жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (LC-MS). Неочищенные DUPA-пробы ближней ИК области спектра (NIR) далее очищали при помощи препаративной ОФ-ВЭЖХ.
Пример 12. Синтез DUPA-аналога - Носителя лекарственного средства
[00124] Пептид синтезировали, применяя стандартные процедуры Fmoc-ТФПС на Fmoc-Cys(trt) смоле Ванга в качестве твердой подложки. Набухание: смола набухала в течение по меньшей мере 2 ч в дихлорметане. Fmoc-удаление: смолу обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5×2 мин). Связывание Fmoc-Gly-ОН: 3 экв. Fmoc-Gly-OH и 3 экв. HATU растворяли в 15 мл ДМФА с последующим добавлением 8 экв. DIEA. Раствор перемешивали (предварительно активированный) в течение 10 минут при комнатной температуре до того, как его добавляли к смоле в течение 1 часа. Присоединение повторяли дважды с новой смесью. Тест Кайзера проводили для того, чтобы обеспечить полное присоединение. Смолу промывали ДМФА (3×2 мин) и дихлорметаном (ДХМ) (2×2 мин). Кэппирование: смолу обрабатывали раствором уксусного ангидрида (10 экв.) и DIPEA (8 экв.) в ДМФА в течение 20 мин и промывали ДМФА (3×2 мин). Fmoc-удаление: смолу обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5×2 мин). Присоединение Fmoc-Trp(Boc)-OH: 3 экв. Fmoc-Trp(Boc)-OH, 3 экв. HATU и 8 экв. DIEA растворяли в 15 мл ДМФА. Раствор перемешивали (предварительно активированный) в течение 10 минут при комнатной температуре до того, как его добавляли к смоле в течение 1 часа. Тест Кайзера проводили для того, чтобы обеспечить полное присоединение. Смолу промывали ДМФА (3×2 мин) и ДХМ (2×2 мин). Удлинение пептида: следующие соединения присоединяли к смоле в следующем порядке (1) Fmoc-Trp(Boc)-OH, (2) Fmoc-Gly-OH, (3) Fmoc-Phe-OH и (4) Fmoc-8-аминооктановая (ЕАО) кислота и (5) OtBu-Glu(Fmoc)-OH. Fmoc-удаление: смолу обрабатывали раствором 20% пиперидина в ДМФА (2×20 мин), далее промывали ДМФА (5×2 мин) и ДХМ (3×2 мин). Присоединение DUPA-лиганда: 0,9 мл триэтиламина (6,6 ммоль) соединяли с 0,9 г (3 ммоль) гидрохлорида ди-трет-бутилового эфира L-глутаминовой кислоты в 15 мл ДХМ. Данный раствор по каплям добавляли в течение 45 минут к раствору 5 мл ДХМ и трифосгена (0,35 г, 1,1 ммоль) при 0°С. После перемешивания в течение дополнительных 50 мин смесь добавляли к смоле с дополнительными 0,9 мл триэтиламина. Реакционную смесь со смолой встряхивали в течение 3 ч и промывали ДМФА (3×2 мин). Полное расщепление: смолу промывали ДХМ (3x2 мин) и сушили в вакууме. Добавляли раствор 2,5% TDW и 2,5% триизопропилсилана в трифторуксусной кислоте (ТФУ) при температуре 0°С. Реакцию проводили в течение 4 ч при комнатной температуре, фильтровали и обрабатывали охлажденным раствором эфир/гексан 1:1, и пептиды, содержащие DUPA-аналог, осаждали центрифугированием. Неочищенные пептиды растворяли в растворе ацетонитрил/TDW 1:1 и подвергали лиофилизации. Сырой продукт очищали при помощи препаративной ОФ-ВЭЖХ. Синтез PEI-PEG-DUPA-аналога: 4,37 мг (1,2×10-4 ммоль) ди-конъюгата 1:1 или 1:3 (полученного, как описано выше в Примере 1 настоящего описания) растворяли в 940 мкл 20 мМ HEPES рН 7.4. Далее 1 мг (9,1×10-4 ммоль, ~ 5 экв) DUPA-аналога, растворенного в 2 мл ацетонитрила (ACN; в квалификации для «ВЭЖХ»)/(20 мМ HEPES рН 7,4) в соотношении 1:1, по каплям добавляли к реакционной смеси. Далее чтобы достичь приблизительно ~ 10% общей концентрации ACN в реакции, в реакционную смесь вводили дополнительные 4 мл 20 мМ. Реакционную смесь также перемешивали (800 оборотов в минуту) на вихревой мешалке в темноте при комнатной температуре до тех пор, пока полное поглощение при длине волны 343 (А343) не указало на полное обновление. Полученный в результате три-конъюгат очищали при помощи катионообменной хроматографии на HR10/10 колонке, заполненной ионообменной смолой MacroPrep High S (BioRad) (применяя трехстадийную градиентную элюцию 20 мМ HEPES рН 7,4 до 20 мМ HEPES, содержащего 3 М NaCl). Элюированные фракции вводили в аналитический ОФ-ВЭЖХ-хроматограф для того, чтобы оценить чистоту три-конъюгата. Фракции с чистотой 95% и выше объединяли и содержали при -80°С. Концентрацию три-конъюгата определяли при помощи анализа на медь. Количество конъюгированного DUPA-аналога определяли при помощи хромофорного (аминокислота Trp) поглощения.
Пример 13. PolyIC/LPEI-PEG-DUPA нацеливается на рак предстательной железы
[00125] Простатический специфический мембранный антиген (PSMA) гиперэкспрессируется в метастатическом раке предстательной железы. Его также обнаруживают в новообразованных сосудах большинства солидных опухолей. Поскольку интернализация PSMA происходит непосредственно после связывания лиганда, авторы настоящего изобретения выбрали его в качестве мишени для разработки и синтезирования PolyIC PSMA-нацеливающегося вектора. В самом деле, интернализация Dupa-Daylight680 происходит в отношении клеток, гиперэкспрессирующих PSMA (LNCaP), но не MCF7 (гиперэкспрессирующих Her2) (не показано).
[00126] На Фигуре 15 представлено, что PEI-PEG-DUPA (PPD)/PolyIC является высоко эффективным против LNCaP и VCAP клеток. Жизнеспособность измеряли после 96 часов воздействия. PPD также индуцирует образование цитокинов (Фигура 16). На Фигуре 17 показано, что среда, кондиционированная LNCaP клетками, стимулирует экспрессию цитокинов ИФН-γ, ИЛ-2 и ФНО-α в МКПК, выращенных в кондиционированной среде. Далее было показано, что совместное инкубирование PolyIC/PPD, обработанного LNCaP клетками, с РС3-люциферазными клетками, которые не экспрессируют PSMA, приводит к более 70% гибели РС3-люциферазных клеток через эффект свидетеля. Добавление здоровых человеческих МКПК сильно улучшает эффект и приводит к гибели 90% РС3-клеток (Фигура 18).
Пример 14. Лечение рака in vivo
[00127] PolyIC/PPD обладает значимыми противоопухолевыми воздействиями при испытании на мышах с ТКИН (Фигура 19). Ингибирование опухоли не является полным в связи с отсутствием иммунной системы у подопытных мышей.
ССЫЛКИ
1. Boussif, О. и др. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(16): p. 7297-301.
2. Wagner, E. и др. Transferrin-polycation-DNA complexes: the effect of polycations on the structure of the complex and DNA delivery to cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88(10): p. 4255-9.
3. Little, S.R. и др. Poly-beta amino ester-containing microparticles enhance the activity of nonviral genetic vaccines. Proc Natl Acad Sci USA, 2004. 101(26): p. 9534-9.
4. Davis, M.E., Z.G. Chen, and D.M. Shin, Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nat Rev Drug Discov, 2008. 7(9): p. 771-82.
5. Remy, J.S. и др. Targeted gene transfer into hepatoma cells with lipopolyamine-condensed DNA particles presenting galactose ligands: a stage toward artificial viruses. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(5): p. 1744-8.
6. Jager, M. и др. Branched and linear poly(ethylene imine)-based conjugates: synthetic modification, characterization, and application. Chem Soc Rev, 2012. 41(13): p. 4755-67.
7. Ziebarth, J.D. and Y. Wang, Understanding the protonation behavior of linear polyethylenimine in solutions through Monte Carlo simulations. Biomacromolecules, 2010. 11(1): p. 29-38.
8. Hobel, S. и др. Maltose- and maltotriose-modified, hyperbranched poly(ethylene imine)s (OM-PEIs): Physicochemical and biological properties of DNA and siRNA complexes. J Control Release, 2011. 149(2): p. 146-58.
9. Rejman, J., A. Bragonzi, and M. Conese, Role of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis in gene transfer mediated by lipo- and polyplexes. Mol Ther, 2005. 12(3): p. 468-74.
10. Behr, J.P., The proton sponge: A trick to enter cells the viruses did not exploit. Chimia, 1997. 51(1-2): p. 34-36.
11. Suh, J., H.J. Paik, and B.K. Hwang, Ionization of Poly(Ethylenimine) and Poly(Allylamine) at Various Phs. Bioorganic Chemistry, 1994. 22(3): p. 318-327.
12. Ogris, M. и др. PEGylated DNA/transferrin-PEI complexes: reduced interaction with blood components, extended circulation in blood and potential for systemic gene delivery. Gene Ther, 1999. 6(4): p. 595-605.
13. Schaffert, D. и др. Poly(I:C)-mediated tumor growth suppression in EGF-receptor overexpressing tumors using EGF-polyethylene glycol-linear polyethylenimine as carrier. Pharm Res, 2011. 28(4): p. 731-41.
14. Nilsson, В. и др. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein A. Protein Eng, 1987. 1(2): p. 107-13.
15. Lofblom, J. и др. Affibody molecules: engineered proteins for therapeutic, diagnostic and biotechnological applications. FEBS Lett, 2010. 584(12): p. 2670-80.
16. Brissault, В. и др. Synthesis, characterization, and gene transfer application of poly(ethylene glycol-b-ethylenimine) with high molar mass polyamine block. Biomacromolecules, 2006. 7(10): p. 2863-70.
17. Ungaro, F. и др. Spectrophotometric determination of polyethylenimine in the presence of an oligonucleotide for the characterization of controlled release formulations. J Pharm Biomed Anal, 2003. 31(1): p. 143-9.
18. Gebhart, C.L. и др. Design and formulation of polyplexes based on pluronic-polyethyleneimine conjugates for gene transfer. Bioconjug Chem, 2002. 13(5): p. 937-44.
19. Dent, M.F. и др. The methylene blue colorimetric microassay for determining cell line response to growth factors. Cytotechnology, 1995. 17(1): p. 27-33.
20. Eigenbrot, С.и др. Structural basis for high-affinity HER2 receptor binding by an engineered protein. Proc Natl Acad Sci U S A, 2010. 107(34): p. 15039-44.
21. Ogris, M. и др. The size of DNA/transferrin-PEI complexes is an important factor for gene expression in cultured cells. Gene Ther, 1998. 5(10): p. 1425-33.
22. Chollet, P. и др. Side-effects of a systemic injection of linear polyethylenimine-DNA complexes. J Gene Med, 2002. 4(1): p. 84-91.
23. Champion, J.A., Y.K. Katare, and S. Mitragotri, Particle shape: A new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. Journal of Controlled Release, 2007. 121(1-2): p. 3-9.
24. Kleemann, E. и др. Nano-carriers for DNA delivery to the lung based upon a TAT-derived peptide covalently coupled to PEG-PEL J Control Release, 2005. 109(1-3): p. 299-316.
25. Rudolph, С.и др. Nonviral gene delivery to the lung with copolymer-protected and transferrin-modified polyethylenimine. Biochim Biophys Acta, 2002. 1573(1): p. 75-83.
26. Aguilar, Z. и др. Biologic effects of heregulin/neu differentiation factor on normal and malignant human breast and ovarian epithelial cells. Oncogene, 1999. 18(44): p. 6050-62.
27. Park, J.W. и др. Anti-HER2 immunoliposomes: enhanced efficacy attributable to targeted delivery. Clin Cancer Res, 2002. 8(4): p. 1172-81.
28. Rabenstein, D.L., Heparin and heparan sulfate: structure and function. Nat Prod Rep, 2002. 19(3): p. 312-31.
29. Seib, F.P., A.T. Jones, and R. Duncan, Comparison of the endocytic properties of linear and branched PEIs, and cationic РАМАМ dendrimers in В 16f 10 melanoma cells. J Control Release, 2007. 117(3): p. 291-300.
30. Jeong, G.J. и др. Biodistribution and tissue expression kinetics of plasmid DNA complexed with polyethylenimines of different molecular weight and structure. J Control Release, 2007. 118(1): p. 118-25.
31. Kawakami, S. и др. Evaluation of proinflammatory cytokine production induced by linear and branched polyethylenimine/plasmid DNA complexes in mice. J Pharmacol Exp Ther, 2006. 317(3): p. 1382-90.
32. Goula, D. и др. Polyethylenimine-based intravenous delivery of transgenes to mouse lung. Gene Ther, 1998. 5(9): p. 1291-5.
33. Bragonzi, А. и др. Comparison between cationic polymers and lipids in mediating systemic gene delivery to the lungs. Gene Ther, 1999. 6(12): p. 1995-2004.
34. Lee, К. и др., Pluronic/polyethylenimine shell crosslinked nanocapsules with embedded magnetite nanocrystals for magnetically triggered delivery of siRNA. Macromol Biosci, 2010. 10(3): p. 239-45.
35. Zheng, M. и др. Poly(ethylene oxide) grafted with short polyethylenimine gives DNA polyplexes with superior colloidal stability, low cytotoxicity, and potent in vitro gene transfection under serum conditions. Biomacromolecules, 2012. 13(3): p. 881-8.
36. Petersen, H. и др. Polyethylenimine-graft-poly(ethylene glycol) copolymers: influence of copolymer block structure on DNA complexation and biological activities as gene delivery system. Bioconjug Chem, 2002. 13(4): p. 845-54.
37. Champion, J.A., Y.K. Katare, and S. Mitragotri, Particle shape: a new design parameter for micro- and nanoscale drug delivery carriers. J Control Release, 2007. 121(1-2): p. 3-9.
38. Liu, Y. и др. The shape of things to come: importance of design in nanotechnology for drug delivery. Ther Deliv, 2012. 3(2): p. 181-94.
39. Kloeckner, J. и др. Photochemically enhanced gene delivery of EGF receptor-targeted DNA polyplexes. J Drug Target, 2004. 12(4): p. 205-13.
40. Kircheis, R. и др. Polyethylenimine/DNA complexes shielded by transferrin target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther, 2001. 8(1): p. 28-40.
41. Ogris, M. и др. DNA/polyethylenimine transfection particles: influence of ligands, polymer size, and PEGylation on internalization and gene expression. AAPS PharmSci, 2001. 3(3): p. E21.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Alex Levitzki management and holdings, Ltd
Levitzki, Alexander
Joubran, Salim
Shir, Alexei
Zigler, Maya
<120> УЛУЧШЕННЫЕ ПОЛИЭТИЛЕНИМИНОВЫЕ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕВЫЕ ВЕКТОРЫ
<130> ALEX-003 PCT
<150> 61993110
<151> 2014-05-14
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический
<400> 1
Tyr His Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Gln Asn Val Ile
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический
<220>
<221> X представляет собой 8-аминооктановую кислоту
<222> (1)..(1)
<400> 2
Xaa Phe Gly Trp Trp Gly Cys
1 5
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический
<220>
<221> X представляет собой 8-аминооктановую кислоту
<222> (1)..(1)
<220>
<221> X представляет собой диаминопропионовую кислоту
<222> (4)..(4)
<400> 3
Xaa Phe Phe Xaa Asp Cys
1 5
<210> 4
<211> 82
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический
<400> 4
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Glu Met
20 25 30
Trp Ala Ala Trp Glu Glu Ile Arg Asn Leu Pro Asn Leu Thr Gly Trp
35 40 45
Gln Met Thr Ala Phe Ile Ala Lys Leu Val Asp Asp Pro Ser Gln Ser
50 55 60
Ser Glu Leu Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro
65 70 75 80
Lys Cys
<210> 5
<211> 79
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический
<400> 5
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Glu Ala Lys Tyr Ala Lys Met Arg Asn Ala
20 25 30
Tyr Trp Glu Ile Ala Leu Leu Pro Asn Leu Thr Asn Gln Gln Lys Arg
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Lys Leu Tyr Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ser Glu Leu
50 55 60
Leu Ser Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ser Gln Ala Pro Lys Cys
65 70 75
<210> 6
<211> 53
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Asn Ser Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His
1 5 10 15
Asp Gly Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn
20 25 30
Cys Val Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys
35 40 45
Trp Trp Glu Leu Arg
50
<---
Claims (67)
1. Полиплекс двухцепочечной РНК (дцРНК) и полимерного конъюгата для доставки нуклеиновых кислот в клетки, при этом указанный полимерный конъюгат состоит из линейного полиэтиленимина (LPEI), ковалентно связанного с одним фрагментом полиэтиленгликоля (PEG) (LPEI-PEG 1:1) или тремя PEG-фрагментами (LPEI-PEG 1:3), каждый PEG-фрагмент конъюгирован посредством линкера с нацеливающимся фрагментом, способным к связыванию с раковым антигеном, причем раковый антиген представляет собой рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2) или простатический специфический мембранный антиген (PSMA), при условии, что нацеливающийся фрагмент не представляет собой EGF мыши или пептид согласно последовательности YHWYGYTPQNVI (GE11) (SEQ ID №: 1), указанный линкер образует -S-S-, NH-СО-, -СО-NH-, -S-C-, O-СО-, -СО-O- или мочевинную (-NH-CO-NH) связь с указанным нацеливающимся фрагментом и при этом указанный линкер выбран из -CO-R2-Rx-R3 или пептидного фрагмента, состоящего из от 3 до 7 аминокислотных остатков,
где R2 выбран из (С1-С8)алкилена, (С2-С8)алкенилена, (С2-С8)алкинилена, (С6-С10)арилендиила или гетероарилендиила,
Rx отсутствует или представляет собой -S-;
R3 отсутствует или представлен согласно формуле
R4 выбран из (С1-С8)алкилена, (С2-С8)алкенилена, (С2-С8)алкинилена, (С1-С8)алкилен-(С3-С8)циклоалкилена, (С2-С8)алкенилен-(С3-С8)циклоалкилена, (С2-С8)алкинилен-(С3-С8)циклоалкилена, (С6-С10)арилендиила, гетероарилендиила, (С1-С8)алкилен-(С6-С10)арилендиила или (С1-С8)алкиленгетероарилендиила;
при этом каждый из указанных (C1-C8)алкилена, (С2-С8)алкенилена или (С2-С8)алкинилена необязательно замещен одной или более группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, -COR5, -COOR5, -OCOOR5, - OCON(R5)2, -CN, -NO2, -SR5, -OR5, -N(R5)2, -CON(R5)2, -SO2R5, -SO3H, -S(=O)R5, (С6-С10)арила, (С1-С4)алкилен-(С6-С10)арила, гетероарила или (С1-С4)алкиленгетероарила, и дополнительно необязательно прерван одним или более одинаковыми или различными гетероатомами, выбранными из S, O или N, и/или по меньшей мере одной группой, каждая из которых независимо выбрана из -NH-CO-, -CO-NH-, -N(R5)-, -N(С6-C10арил)-, (С6-С10)арилендиила или гетероарилендиила; и
R5 представляет собой Н или (С1-С8)алкил.
2. Полиплекс по п. 1, отличающийся тем, что дцРНК представляет собой двухцепочечную РНК полиинозиновой-полицитидиловой кислоты (poly I:C).
3. Полиплекс по п. 1, отличающийся тем, что каждый из указанных одного или более PEG-фрагментов независимо образует -NH-CO- связь с указанным LPEI и связь, выбранную из -NH-СО-, -CO-NH-, -S-C-, -S-S-, -О-СО- или -CO-O-, с указанным линкером.
4. Полиплекс по п. 3, отличающийся тем, что каждый из указанных одного или более PEG-фрагментов образует -NH-CO- связи с указанным LPEI и указанным линкером.
5. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что R2 выбран из (С1-С8)алкилена, предпочтительно (С1-С4)алкилена, необязательно замещенного одной или более группами, каждая из которых независимо выбрана из галогена, -СОН, -СООН, -ОСООН, -OCONH2, -CN, -NO2, -SH, -ОН, -NH2, -CONH2, -SO2H, -SO3H, -S(=O)H, (С6-С10)арила, (С1-С4)алкилен-(С6-С10)арила, гетероарила или (С1-С4)алкиленгетероарила, и дополнительно необязательно прерванного одним или более одинаковыми или различными гетероатомами, выбранными из S, О или N, и/или по меньшей мере одной группой, каждая из которых независимо выбрана из -NH-CO-, -CO-NH-, -NH-, -N(С1-С8алкил)-, -N(С6-С10арил)-, (С6-С10)арилендиила или гетероарилендиила.
6. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что R2 представляет собой (С1-С8)алкилен.
7. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что R2 представляет собой (С1-С4)алкилен.
8. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что Rx представляет собой -S-.
9. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что R3 отсутствует или представляет собой
где R4 представляет собой (С1-С8)алкилен-(С3-С8)циклоалкилен.
10. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что R3 отсутствует или представляет собой
где R4 представляет собой (C1-С4)алкилен-(C5-C6)циклоалкилен.
11. Полиплекс по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что
R2 представляет собой -СН2-СН2-;
Rx представляет собой -S-; и
R3 отсутствует или представляет собой
12. Полиплекс по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что указанный пептидный фрагмент представляет собой -(NH-(CH2)7-CO)-Phe-Gly-Trp-Trp-Gly-Cys- (SEQ ID №: 2) или -(NH-(CH2)7-CO)-Phe-Phe-(NH-CH2-CH(NH2)-CO)-Asp-Cys- (SEQ ID №: 3), связанный через свою меркаптогруппу с указанным нацеливающимся фрагментом.
13. Полиплекс по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что полимерный конъюгат представляет собой диконъюгат согласно формуле (i)-(viii), связанный с указанным нацеливающимся фрагментом/фрагментами:
где R6 представляет собой
где R7 представляет собой
14. Полиплекс по п. 13, отличающийся тем, что
(а) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой HER2 аффитело, и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(i), и HER2 аффитело связано через его меркаптогруппу;
(b) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой HER2 аффитело, и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(v), и HER2 аффитело связано через его меркаптогруппу;
(c) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой EGFR аффитело, и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(i), и EGFR аффитело связано через его меркаптогруппу;
(d) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой EGFR аффитело, и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(v), и EGFR аффитело связано через его меркаптогруппу;
(e) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой hEGF и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(ii), причем hEGF связан через его аминогруппу;
(f) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой hEGF и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(vi), причем hEGF связан через его аминогруппу;
(g) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой НООС(СН2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO- (DUPA-остаток) и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(iii);
(h) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой НООС(СН2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO- (DUPA-остаток) и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(vii);
(i) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой НООС(СН2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO- (DUPA-остаток) и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(iv); или
(j) указанный нацеливающийся фрагмент представляет собой НООС(СН2)2-CH(COOH)-NH-CO-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO- (DUPA-остаток) и указанный полимерный конъюгат представлен согласно формуле 13(viii).
15. Полиплекс по п. 14, отличающийся тем, что указанному EGFR аффителу соответствует аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID №: 4, и указанному HER2 аффителу соответствует аминокислотная последовательность, представленная в SEQ ID №: 5.
16. Композиция для доставки нуклеиновых кислот в клетки, гиперэкспрессирующие EGFR или HER2, или в клетки рака предстательной железы, причем указанная композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество полиплекса по любому из пп. 1-15.
17. Полиплекс по любому из пп. 2-15 или композиция по п. 16 для применения для лечения рака, выбранного из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и раком предстательной железы.
18. Полиплекс по п. 17, отличающийся тем, что указанный рак, характеризующийся клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, выбран из немелкоклеточной легочной карциномы, рака молочной железы, глиобластомы, плоскоклеточного рака головы и шеи, колоректального рака, аденокарциномы, рака яичников, рака мочевого пузыря или рака предстательной железы и их метастаз.
19. Полиплекс по п. 18, отличающийся тем, что указанный полиплекс определен в п. 14(c), 14(d), 14(e) или 14(f).
20. Полиплекс по п. 17, отличающийся тем, что указанный рак, характеризующийся клетками, гиперэкспрессирующими HER2, выбран из рака молочной железы, рака яичников, рака желудка и агрессивных форм рака матки, таких как серозная эндометриальная карцинома матки.
21. Полиплекс по п. 20, отличающийся тем, что указанный рак, характеризующийся клетками, гиперэкспрессирующими HER2, представляет собой рак, резистентный к герцептину/трастузумабу.
22. Полиплекс по п. 20 или 21, отличающийся тем, что указанный полиплекс определен в п. 14(a), (b), (е) или (f).
23. Полиплекс по п. 17, отличающийся тем, что указанный рак представляет собой рак предстательной железы и указанный полиплекс определен в п. 14(g), (h), (i) или (j).
24. Способ для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы, причем указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полиплекса согласно любому из пп. 2-15.
25. Применение полиплекса по любому из пп. 17-23, способа по п. 24 или композиции по п. 16 в комбинации с иммунными клетками.
26. Применение по п. 25, отличающееся тем, что указанные иммунные клетки представляют собой проникающие в опухоль Т-клетки (Т-ТIL), сконструированные опухолевоспецифичные Т-клетки или мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК).
27. Применение полиплекса по любому из пп. 2-15 для приготовления лекарственного средства для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.
28. Применение полиплекса по любому из пп.2-15 для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы.
29. Фармацевтическая композиция для лечения рака, выбранного из рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими EGFR, рака, характеризующегося клетками, гиперэкспрессирующими HER2, и рака предстательной железы, причем указанная фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель и эффективное количество полиплекса по любому из пп. 2-15.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201461993110P | 2014-05-14 | 2014-05-14 | |
US61/993,110 | 2014-05-14 | ||
PCT/IL2015/050514 WO2015173824A1 (en) | 2014-05-14 | 2015-05-14 | Improved polyethyleneimine polyethyleneglycol vectors |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2016146389A RU2016146389A (ru) | 2018-06-15 |
RU2016146389A3 RU2016146389A3 (ru) | 2018-12-26 |
RU2771104C2 true RU2771104C2 (ru) | 2022-04-26 |
Family
ID=54479412
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016146389A RU2771104C2 (ru) | 2014-05-14 | 2015-05-14 | Улучшенные полиэтилениминовые полиэтиленгликолевые векторы |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (4) | US10278991B2 (ru) |
EP (1) | EP3142673A4 (ru) |
JP (3) | JP6753843B2 (ru) |
KR (2) | KR102472590B1 (ru) |
CN (3) | CN116966311A (ru) |
AU (2) | AU2015260725B2 (ru) |
BR (1) | BR112016026581A2 (ru) |
CA (1) | CA2949017A1 (ru) |
IL (2) | IL287206B2 (ru) |
MA (1) | MA39970A (ru) |
MX (2) | MX2016014881A (ru) |
NZ (1) | NZ727092A (ru) |
PH (1) | PH12016502258A1 (ru) |
RU (1) | RU2771104C2 (ru) |
SG (2) | SG10201911695SA (ru) |
WO (1) | WO2015173824A1 (ru) |
ZA (1) | ZA201608042B (ru) |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG10201911695SA (en) | 2014-05-14 | 2020-01-30 | Targimmune Therapeutics Ag | Improved polyethyleneimine polyethyleneglycol vectors |
CH713097B1 (de) | 2015-11-17 | 2019-07-15 | Bioncotech Therapeutics S L | Neue pharmazeutische Zusammensetzung umfassend Partikel umfassend einen Komplex eines doppelsträngigen Polyribonukleotids und eines Polyalkylenimins. |
TWI770010B (zh) * | 2016-03-07 | 2022-07-11 | 南韓商韓美藥品股份有限公司 | 聚乙二醇衍生物及其用途 |
CN109790225B (zh) | 2016-09-04 | 2022-09-09 | 塔尔格免疫治疗有限公司 | 用于靶向dsRNA的嵌合蛋白 |
AU2017414660A1 (en) | 2017-05-17 | 2020-01-02 | Highlight Therapeutics, S.L. | Novel pharmaceutical composition comprising particles comprising a complex of a double-stranded polyribonucleotide and a polyalkyleneimine |
AU2018342909B2 (en) * | 2017-09-27 | 2023-06-08 | Targimmune Therapeutics Ag | Castration resistant prostate cancer |
JP2021516056A (ja) * | 2018-03-08 | 2021-07-01 | ターグイミューン セラピューティクス アーゲー | 二本鎖rna結合ドメインを含む組換えタンパク質 |
CN109893657B (zh) * | 2019-02-28 | 2022-04-29 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 基因递送载体、药物复合物、抗肺纤维化药物及应用 |
CA3131535A1 (en) * | 2019-04-03 | 2020-10-08 | Targimmune Therapeutics Ag | Immunotherapy for the treatment of cancer |
WO2020263782A1 (en) * | 2019-06-24 | 2020-12-30 | North Carolina State University | Methods and compositions for modifying nucleic acids and for killing cells |
WO2021001023A1 (en) * | 2019-07-02 | 2021-01-07 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Rna formulations suitable for therapy |
WO2022074152A1 (en) | 2020-10-08 | 2022-04-14 | Targimmune Therapeutics Ag | Immunotherapy for the treatment of cancer |
WO2023079142A2 (en) | 2021-11-05 | 2023-05-11 | Targimmune Therapeutics Ag | Targeted linear conjugates comprising polyethyleneimine and polyethylene glycol and polyplexes comprising the same |
US20240091348A1 (en) * | 2022-09-20 | 2024-03-21 | Highlight Therapeutics, S.L. | Novel compositions based on polyinosinic-polycytidylic acid |
WO2024100044A1 (en) | 2022-11-07 | 2024-05-16 | Targimmune Therapeutics Ag | Polyplexes of nucleic acids and targeted conjugates comprising polyethyleneimine and polyethylene glycol |
WO2024100046A1 (en) * | 2022-11-07 | 2024-05-16 | Targimmune Therapeutics Ag | Targeted linear conjugates comprising polyethyleneimine and polyethylene glycol and polyplexes comprising the same |
WO2024100040A1 (en) | 2022-11-07 | 2024-05-16 | Targimmune Therapeutics Ag | Psma-targeting linear conjugates comprising polyethyleneimine and polyethylene glycol and polyplexes comprising the same |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004045491A2 (en) * | 2002-11-18 | 2004-06-03 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Targeted double stranded rna mediated cell killing |
WO2010073247A2 (en) * | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Egfr-homing double-stranded rna vector for systemic cancer treatment |
RU2493256C2 (ru) * | 2007-09-04 | 2013-09-20 | Куревак Гмбх | Комплексы на основе рнк и катионных пептидов для трансфекции и иммуностимуляции |
Family Cites Families (75)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1991017773A2 (de) | 1990-05-18 | 1991-11-28 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Neue protein-polykation-konjugate |
DE4104186A1 (de) | 1991-02-12 | 1992-08-13 | Genentech Inc | Neue, ueber endozytose in hoehere eukaryotische zellen aufnehmbare, nukleinsaeure enthaltende komplexe |
NZ244306A (en) | 1991-09-30 | 1995-07-26 | Boehringer Ingelheim Int | Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation |
IL103059A0 (en) | 1991-09-30 | 1993-02-21 | Boehringer Ingelheim Int | Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells |
DE19726186A1 (de) | 1997-06-20 | 1998-12-24 | Boehringer Ingelheim Int | Komplexe für den Transport von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen |
ATE473748T1 (de) | 1998-05-25 | 2010-07-15 | Nippon Shinyaku Co Ltd | Verfahren zur herstellung einer nucleinsäure enthaltenden kompositzusammenstellung |
US6652886B2 (en) | 2001-02-16 | 2003-11-25 | Expression Genetics | Biodegradable cationic copolymers of poly (alkylenimine) and poly (ethylene glycol) for the delivery of bioactive agents |
US20040043030A1 (en) | 2001-07-31 | 2004-03-04 | Immunomedics, Inc. | Polymeric delivery systems |
GB0119346D0 (en) | 2001-08-08 | 2001-10-03 | Bioclones Proprietary Ltd | Process for the maturation of dendritic cells |
AU2002365360A1 (en) | 2001-11-28 | 2003-06-10 | Biopolymed Inc. | Biologically active non-antigenic copolymer and conjugates thereof and methods for producing the same |
US7060498B1 (en) | 2001-11-28 | 2006-06-13 | Genta Salus Llc | Polycationic water soluble copolymer and method for transferring polyanionic macromolecules across biological barriers |
WO2003072636A1 (en) | 2002-02-28 | 2003-09-04 | Jong Sang Park | Cationic highly branched polyaminoester |
JP2005534696A (ja) | 2002-08-06 | 2005-11-17 | イントラディグム、コーポレイション | 干渉性rnaの導入によるターゲット遺伝子発現のイン・ビボでのダウンレギュレーション方法 |
US8969543B2 (en) | 2003-04-03 | 2015-03-03 | Bioneer Corporation | SiRNA-hydrophilic polymer conjugates for intracellular delivery of siRNA and method thereof |
WO2004087931A1 (en) | 2003-04-03 | 2004-10-14 | Korea Advanced Institute Of Science And Technology | Conjugate for gene transfer comprising oligonucleotide and hydrophilic polymer, polyelectrolyte complex micelles formed from the conjugate, and methods for preparation thereof |
US7727969B2 (en) | 2003-06-06 | 2010-06-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Controlled release nanoparticle having bound oligonucleotide for targeted delivery |
US20050118718A1 (en) | 2003-09-22 | 2005-06-02 | University Of Utah Research Foundation | Stabilization and controlled delivery of ionic biopharmaceuticals |
WO2005090570A1 (en) | 2004-03-24 | 2005-09-29 | Supratek Pharma Inc. | Therapeutic compositions and methods for treating diseases that involve angiogenesis |
CA2587676A1 (en) | 2004-11-19 | 2006-05-26 | Institut Gustave Roussy | Improved treatment of cancer by double-stranded rna |
US7893244B2 (en) | 2005-04-12 | 2011-02-22 | Intradigm Corporation | Composition and methods of RNAi therapeutics for treatment of cancer and other neovascularization diseases |
CN101287500A (zh) * | 2005-08-19 | 2008-10-15 | 恩多塞特公司 | 多药物配体缀合物 |
US20090011004A1 (en) | 2005-12-30 | 2009-01-08 | Philadelphia Health & Education Corp., D/B/A/ Drexel University Of College Of Medicine | Improved carriers for delivery of nucleic acid agents to cells and tissues |
WO2007084797A1 (en) | 2006-01-23 | 2007-07-26 | Abbott Laboratories | Chemically modified polycation polymer for sirna delivery |
US20070225213A1 (en) | 2006-03-23 | 2007-09-27 | Kosak Matthew K | Nucleic acid carriers for delivery of therapeutic agents |
JP2009534309A (ja) | 2006-03-31 | 2009-09-24 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 治療剤の標的化送達のためのシステム |
PT2136788E (pt) | 2007-03-30 | 2012-02-03 | Bind Biosciences Inc | Direccionamento a células de cancro utilizando nanopartículas |
WO2008124634A1 (en) | 2007-04-04 | 2008-10-16 | Massachusetts Institute Of Technology | Polymer-encapsulated reverse micelles |
EP3388086B1 (en) | 2007-08-17 | 2020-10-07 | Purdue Research Foundation | Psma binding ligand-linker conjugates and methods for using |
WO2014062228A1 (en) | 2012-10-16 | 2014-04-24 | William Marsh Rice University | An improved nanovector based drug delivery system for overcoming drug resistance |
MX2010003642A (es) | 2007-10-12 | 2010-08-09 | Massachusetts Inst Technology | Nanotecnologia de vacuna. |
WO2009110939A2 (en) | 2007-12-10 | 2009-09-11 | Massachusetts Institute Of Technology | Drug delivery system for pharmaceuticals and radiation |
WO2009086640A1 (en) | 2008-01-10 | 2009-07-16 | Nventa Biopharmaceuticals Corporation | Adjuvant compositions comprising poly-ic and a cationic polymer |
WO2009131435A1 (en) | 2008-04-23 | 2009-10-29 | Erasmus University Medical Center Rotterdam | Linker containing bungarotoxin and a binding peptide |
EP2113257A1 (en) | 2008-04-30 | 2009-11-04 | Consorzio per il Centro di Biomedica Moleculare Scrl | Polyelectrolyte with positive net charge for use as medicament and diagnostic for cancer |
EP2123304A1 (en) | 2008-05-23 | 2009-11-25 | Freie Universität Berlin | Compounds suited as nanocarriers for active agents and their use |
WO2009151539A1 (en) | 2008-05-24 | 2009-12-17 | Sirnaomics, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS USING siRNA MOLECULES FOR TREATMENT OF GLIOMAS |
ES2654533T3 (es) | 2008-06-16 | 2018-02-14 | Pfizer Inc. | Procedimientos para la preparación de copolímeros dibloque funcionalizados con un agente de direccionamiento para su uso en la fabricación de nanopartículas terapéuticas |
WO2010088927A1 (en) | 2009-02-09 | 2010-08-12 | Curevac Gmbh | Use of pei for the improvement of endosomal release and expression of transfected nucleic acids, complexed with cationic or polycationic compounds |
US20100266642A1 (en) | 2009-02-20 | 2010-10-21 | Bind Biosciences, Inc. | Modified cells for targeted cell trafficking and uses thereof |
JP5762307B2 (ja) | 2009-03-31 | 2015-08-12 | 国立感染症研究所長 | 経鼻投与用ワクチンを用いるインフルエンザの予防方法 |
WO2010127159A2 (en) | 2009-04-30 | 2010-11-04 | Intezyne Technologies, Incorporated | Polymeric micelles for polynucleotide encapsulation |
ES2368963B1 (es) | 2009-07-04 | 2012-10-10 | Fundación Centro Nacional De Investigaciones Oncológicas Carlos Iii | Procedimiento de identificación de agentes terapéuticos contra el melanoma y uso de agente identificado. |
CN101638484A (zh) * | 2009-08-24 | 2010-02-03 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 聚乙二醇单甲醚-聚2-甲基-2-羧基碳酸丙烯酯接枝聚乙烯亚胺共聚物与制法及应用 |
WO2011072114A1 (en) | 2009-12-09 | 2011-06-16 | Ibc Pharmaceuticals, Inc. | Dock-and-lock (dnl) complexes for delivery of interference rna |
JP5965844B2 (ja) | 2009-12-15 | 2016-08-10 | バインド セラピューティックス インコーポレイテッド | 高いガラス転移温度または高分子量のコポリマーを有する治療用ポリマーナノ粒子組成物 |
EA201290498A1 (ru) | 2009-12-15 | 2013-01-30 | Байнд Байосайенсиз, Инк. | Терапевтические полимерные наночастицы, включающие эпотилон, и способы их получения и применения |
EP2512487A4 (en) | 2009-12-15 | 2013-08-07 | THERAPEUTIC POLYMERNANOPARTICLES WITH CORTICOSTEROIDS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND USE THEREOF | |
ES2562817T3 (es) | 2010-02-24 | 2016-03-08 | Arrowhead Research Corporation | Composiciones para el suministro dirigido de ARNip |
WO2011108930A1 (en) | 2010-03-04 | 2011-09-09 | Interna Technologies Bv | A MiRNA MOLECULE DEFINED BY ITS SOURCE AND ITS DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES IN DISEASES OR CONDITIONS ASSOCIATED WITH EMT |
US20110256227A1 (en) | 2010-04-14 | 2011-10-20 | Intezyne Technologies, Inc. | Controlled polyplex assembly |
EP2395041A1 (en) | 2010-06-10 | 2011-12-14 | F. Hoffmann-La Roche AG | Polymers for delivery of nucleic acids |
WO2011154331A1 (en) | 2010-06-10 | 2011-12-15 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Polymers for delivery of nucleic acids |
NZ719520A (en) | 2010-07-06 | 2017-07-28 | Int Tech Bv | Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway |
US20120207795A1 (en) | 2010-07-13 | 2012-08-16 | The Regents Of The University Of California | Cationic polymer coated mesoporous silica nanoparticles and uses thereof |
FR2963350B1 (fr) | 2010-07-30 | 2013-11-01 | Univ D Evry Val D Essonne | Nouveaux copolymeres a bloc et leurs utilisations pour delivrer une substance active dans une cellule. |
US20130202652A1 (en) | 2010-07-30 | 2013-08-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
US8461224B2 (en) | 2011-03-04 | 2013-06-11 | National Health Research Institutes | Single monomer derived linear-like copolymer comprising polyethylenimine and poly(ethylene glycol) for nucleic acid delivery |
WO2012135592A2 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | The Johns Hopkins University | Theranostic imaging agents and methods of use |
US20140308363A1 (en) | 2011-05-31 | 2014-10-16 | Bind Therapeutics, Inc. | Drug loaded polymeric nanoparticles and methods of making and using same |
KR20150004414A (ko) | 2012-05-02 | 2015-01-12 | 노파르티스 아게 | Kras-관련 질환을 치료하기 위한 유기 조성물 |
DK3103872T3 (en) | 2012-07-12 | 2018-10-22 | Proqr Therapeutics Ii Bv | OLIGONUCLEOTIDES TO MAKE A CHANGE IN THE SEQUENCE OF A TARGET RNA MOLECULE IN A LIVING CELL |
US10201556B2 (en) | 2012-11-06 | 2019-02-12 | Interna Technologies B.V. | Combination for use in treating diseases or conditions associated with melanoma, or treating diseases or conditions associated with activated B-raf pathway |
CN108042811A (zh) | 2012-11-15 | 2018-05-18 | 恩多塞特公司 | 用于治疗由psma表达细胞引起的疾病的共轭物 |
JP6446269B2 (ja) | 2012-12-06 | 2018-12-26 | 協和発酵バイオ株式会社 | アジュバント用二重鎖リボ核酸 |
CN105579584B (zh) | 2013-06-28 | 2020-08-28 | 埃泽瑞斯公司 | 用于将rna引入细胞的组合物 |
CN104341488A (zh) | 2013-08-02 | 2015-02-11 | 复旦大学 | c(LyP-1)多肽及其构建的纳米递药系统和应用 |
US20160312218A1 (en) | 2013-11-04 | 2016-10-27 | Northeastern University | System for co-delivery of polynucleotides and drugs into protease-expressing cells |
CN105705143A (zh) | 2013-11-08 | 2016-06-22 | 达娜-法勃肿瘤研究所公司 | 用于体内试剂递送的核酸纳米结构 |
PL3116547T3 (pl) | 2014-03-14 | 2019-11-29 | Pfizer | Terapeutyczne nanocząstki zawierające środek terapeutyczny i sposoby ich wytwarzania i zastosowania |
US10273484B2 (en) | 2014-03-24 | 2019-04-30 | Riboxx Gmbh | Double-stranded RNA conjugates and their use |
JP7348708B2 (ja) | 2014-04-30 | 2023-09-21 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | 組み合わせワクチン装置および癌細胞を殺滅する方法 |
SG10201911695SA (en) | 2014-05-14 | 2020-01-30 | Targimmune Therapeutics Ag | Improved polyethyleneimine polyethyleneglycol vectors |
EP3253414A4 (en) | 2015-02-05 | 2018-07-11 | The University Of Queensland | Targeting constructs for delivery of payloads |
WO2016183447A1 (en) | 2015-05-14 | 2016-11-17 | The Johns Hopkins University | Compositions of nucleic acid-containing nanoparticles for in vivo delivery |
CH713097B1 (de) | 2015-11-17 | 2019-07-15 | Bioncotech Therapeutics S L | Neue pharmazeutische Zusammensetzung umfassend Partikel umfassend einen Komplex eines doppelsträngigen Polyribonukleotids und eines Polyalkylenimins. |
-
2015
- 2015-05-14 SG SG10201911695SA patent/SG10201911695SA/en unknown
- 2015-05-14 BR BR112016026581A patent/BR112016026581A2/pt active Search and Examination
- 2015-05-14 SG SG11201609442YA patent/SG11201609442YA/en unknown
- 2015-05-14 KR KR1020167033997A patent/KR102472590B1/ko active IP Right Grant
- 2015-05-14 CN CN202310955550.8A patent/CN116966311A/zh active Pending
- 2015-05-14 IL IL287206A patent/IL287206B2/en unknown
- 2015-05-14 WO PCT/IL2015/050514 patent/WO2015173824A1/en active Application Filing
- 2015-05-14 KR KR1020227041535A patent/KR102589295B1/ko active IP Right Grant
- 2015-05-14 JP JP2017512466A patent/JP6753843B2/ja active Active
- 2015-05-14 MX MX2016014881A patent/MX2016014881A/es active IP Right Grant
- 2015-05-14 CN CN202310954498.4A patent/CN116966310A/zh active Pending
- 2015-05-14 US US15/310,735 patent/US10278991B2/en active Active
- 2015-05-14 EP EP15793532.1A patent/EP3142673A4/en active Pending
- 2015-05-14 MA MA039970A patent/MA39970A/fr unknown
- 2015-05-14 AU AU2015260725A patent/AU2015260725B2/en active Active
- 2015-05-14 RU RU2016146389A patent/RU2771104C2/ru active
- 2015-05-14 NZ NZ727092A patent/NZ727092A/en unknown
- 2015-05-14 CN CN201580025099.3A patent/CN106687121A/zh active Pending
- 2015-05-14 CA CA2949017A patent/CA2949017A1/en active Pending
-
2016
- 2016-11-10 IL IL248890A patent/IL248890B/en unknown
- 2016-11-11 PH PH12016502258A patent/PH12016502258A1/en unknown
- 2016-11-14 MX MX2020012698A patent/MX2020012698A/es unknown
- 2016-11-21 ZA ZA2016/08042A patent/ZA201608042B/en unknown
-
2019
- 2019-03-07 US US16/296,117 patent/US11298376B2/en active Active
- 2019-03-08 US US16/297,133 patent/US10543232B2/en active Active
-
2020
- 2020-08-20 JP JP2020139643A patent/JP7406475B2/ja active Active
-
2021
- 2021-05-24 AU AU2021203336A patent/AU2021203336A1/en active Pending
-
2022
- 2022-03-02 US US17/653,221 patent/US20220339189A1/en active Pending
-
2023
- 2023-12-15 JP JP2023211790A patent/JP2024028995A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2004045491A2 (en) * | 2002-11-18 | 2004-06-03 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Targeted double stranded rna mediated cell killing |
RU2493256C2 (ru) * | 2007-09-04 | 2013-09-20 | Куревак Гмбх | Комплексы на основе рнк и катионных пептидов для трансфекции и иммуностимуляции |
WO2010073247A2 (en) * | 2008-12-22 | 2010-07-01 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Egfr-homing double-stranded rna vector for systemic cancer treatment |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
GALITH A. et al., PolyIC GELL polyplex inhibits EGFR-overexpressing tumors, IUBMB LIFE, 2012, v. 64, n. 4, p. 324-330. * |
GALITH A. et al., PolyIC GELL polyplex inhibits EGFR-overexpressing tumors, IUBMB LIFE, 2012, v. 64, n. 4, p. 324-330. SHIR A. et al., EGF receptor-targeted synthetic double-stranded RNA eliminates glioblastoma, breast cancer and adenocarcinoma tumors in mice, PLOS MED, 2006, v. 3, n. 1, p. 125-135. * |
SHIR A. et al., EGF receptor-targeted synthetic double-stranded RNA eliminates glioblastoma, breast cancer and adenocarcinoma tumors in mice, PLOS MED, 2006, v. 3, n. 1, p. 125-135. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2771104C2 (ru) | Улучшенные полиэтилениминовые полиэтиленгликолевые векторы | |
US11305024B2 (en) | Cross-linked polymer modified nanoparticles | |
Veiseh et al. | Chlorotoxin bound magnetic nanovector tailored for cancer cell targeting, imaging, and siRNA delivery | |
US8497356B2 (en) | Biomolecule polymer conjugates and methods for making the same | |
US8697667B2 (en) | Cyclodextrin-modified polyamines for delivery of therapeutic molecules | |
WO2009020270A1 (en) | Delivery system for nucleic acids using cationic polymer conjugates | |
AU2018342909B2 (en) | Castration resistant prostate cancer | |
Golan et al. | Conjugates of HA2 with octaarginine-grafted HPMA copolymer offer effective siRNA delivery and gene silencing in cancer cells | |
WO2021134026A2 (en) | Compositions and methods for nucleic acid delivery | |
KR102003239B1 (ko) | 경구투여용 간암표적성 siRNA 나노전달체 및 이의 제조방법 | |
EP2388016A1 (en) | Non-viral nucleic acid molecules delivery systems | |
NZ764423B2 (en) | Improved polyethyleneimine polyethyleneglycol vectors | |
WO2023247781A1 (en) | Peptides for intracellular delivery | |
AU2022381985A1 (en) | Targeted linear conjugates comprising polyethyleneimine and polyethylene glycol and polyplexes comprising the same | |
Nussbaumer | The protein cage Thermosome as versatile delivery platform |