JP7406475B2

JP7406475B2 - 改善されたポリエチレンイミンポリエチレングリコールベクター

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Publication number: JP7406475B2
Application number: JP2020139643A
Authority: JP
Inventors: レビツキ、アレックス; ジュブラン、サリム; シル、アレクセイ; ジグラー、マヤ; タルハミ、アラー; ラングット、ヤエル
Original assignee: タルグルムーネセラピウティクスエージー
Priority date: 2014-05-14
Filing date: 2020-08-20
Publication date: 2023-12-27
Anticipated expiration: 2035-05-14
Also published as: CN106687121A; US10278991B2; RU2016146389A3; KR102589295B1; ZA201608042B; WO2015173824A1; US20190262395A1; NZ727092A; US20220339189A1; EP3142673A4; EP3142673A1; US11298376B2; KR102472590B1; CA2949017A1; MX2016014881A; KR20220163536A; IL287206B1; RU2771104C2; US10543232B2; JP2017521090A

Description

本発明は、癌抗原に結合することができる標的部分に抱合された非ウイルス性ポリエチレンイミン系ポリプレックスに関する。

分子医学が直面する障害の１つは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子などの治療薬の標的送達である。新たな戦略は、核酸を結合および縮合するカチオン性ポリマーおよびカチオン性脂質などの非ウイルス性ベクターの構築である。これらの非ウイルス性カチオン性ベクターは、非免疫原性、非発癌性であり、および合成が容易であるため、ウイルス遺伝子ベクターに勝る多くの利点を有する［１～４］。現在、いくつかの合成ポリカチオン性ポリマーが核酸送達用に開発されている。これらの中でも、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、遺伝子送達の有望な薬剤と考えられている［５］。

ＰＥＩは、直鎖構造および分枝状構造の両方として利用可能な水溶性の有機巨大分子である［６］。ＰＥＩは、それらの骨格鎖中の３つ目ごとの原子がアミノ窒素であり、これがプロトン化され得るため、広範囲のｐＨにわたってそれらのイオン化度を変更する。ＰＥＩ中の約５５％の窒素が生理学的ｐＨでプロトン化される［７］。これらは、高いカチオン電荷密度を有し、したがって、核酸と非共有結合複合体を形成することができる。更に、それらの物理化学的および生物学的特性は、様々な化学修飾により変更することができる［８］。ＰＥＩ系複合体（ポリプレックスとしても知られる）は、多くの細胞型によってエンドサイトーシスにより取り込まれ得る［９］。ポリプレックスの内在化後、エンドソーム放出および高効率遺伝子導入が「プロトンスポンジ効果」により駆動される［１０］。ＰＥＩがＤＮＡを縮合する能力は、大きいＤＮＡ構築物を多くの細胞型内に送達する際の重要な要因であるように思われる。

送達担体としてＰＥＩを利用する際の主な懸念は、非特異的結合につながる可能性があるそれらの高い表面正電荷に起因する毒性である［１１］。最近、非ウイルス性ベクターの選択性および生体適合性を改善するという試みが行われてきた。これは、ＰＥＩ粒子を保護するために、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でＰＥＩ分子を修飾することにつながった［１２］。ヘテロ二機能性ＰＥＧ基のＰＥＩへの抱合は、同族受容体を保有する細胞内への効率的な遺伝子送達をもたらす、ＰＥＩの標的リガンドへの共役を容易にする［１２］。我々は、以前に、標的ベクターの生成を説明し、分枝状ＰＥＩ（ｂｒＰＥＩ－ＥＧＦ）と標的ベクターとしてＥＧＦに繋がれる直鎖ＰＥＩ（ＬＰＥＩ）との間の相違を示した［１３、国際公開第２００４／０４５４９１号、国際公開第２０１０／０７３２４７号］。現在の合成方法は、十分に均質ではない製品をもたらすという点で不十分である。よって、癌を治療するための方法において確実に使用することができる均質な製品のバッチを製造する再現可能な方法で、標的部分のＬＰＥＩ－ＰＥＧへの効率的な抱合をもたらすことができる方法が早急に必要とされる。

一態様では、本発明は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）とポリマー抱合体とのポリプレックスに関し、該ポリマー抱合体は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に共有結合された直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）からなり、各ＰＥＧ部分は、癌抗原に結合することができる標的部分にリンカーを介して抱合されているが、但し、標的部分がマウスＥＧＦ（ｍＥＧＦ）または配列ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（ＧＥ１１）（配列番号１）のペプチドでないことを条件とする。

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体および本明細書に定義される本発明のポリプレックスを含む薬学的組成物を提供する。

また別の態様では、本発明は、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌から選択される癌の治療に使用するための、本明細書で定義される本発明のポリプレックス、またはポリプレックスを含む薬学的組成物を提供する。

更に別の態様では、本発明は、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌からなる群から選択される癌を治療するための方法に関し、本方法は、本明細書に定義される本発明のポリプレックスを、必要とする対象に投与することを含む。

更なる態様では、本発明は、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌から選択される癌の治療のための、薬学的に許容される担体および本発明のポリプレックスを含む薬学的組成物に関する。

本発明のポリプレックスは、免疫細胞と組み合わせて使用され得る。

ＰＥＧ化の程度が異なる主に２つのコポリマーネットワークをもたらす、ＬＰＥＩ（約２２ｋＤａ）とＮＨＳ－ＰＥＧ－ＯＰＳＳ（約２ｋＤａ）との抱合を示す。コポリマーＬＰＥＩ－（ＰＥＧ_２ｋ－ＯＰＳＳ）_３（「二抱合体１：３」）は、平均して１モルのＬＰＥＩと３モルのＰＥＧからなり、一方、コポリマーＬＰＥＩ－ＰＥＧ_２ｋ－ＯＰＳＳ（「二抱合体１：１」）は、平均して１モル比のＬＰＥＩと１モルのＰＥＧからなった。（ＬＰＥＩ：ＰＥＧの割合は、^１Ｈ－ＮＭＲ分析により決定された。）ＬＰＥＩ－ＰＥＧ_２ｋ－ＯＰＳＳ（二抱合体１：１）およびＬＰＥＩ－（ＰＥＧ_２ｋ－ＯＰＳＳ）_３（二抱合体１：３）の２つの二抱合体の^１Ｈ－ＮＭＲ分析を示す。ＰＥＧ基のＬＰＥＩへの共役は、３．７ｐｐｍでエチレングリコールの水素（ａ）、約３．０ｐｐｍでエチレンイミンの水素（ｂ）と相関する化学シフトの存在によって示された。これらのピークの積分値は、ＰＥＧ対ＬＰＥＩのモル比を提供し、それから二抱合体１：１（Ａ）および二抱合体１：３（Ｂ）の図示される構造が推定された。２つの異なってＰＥＧ化された三抱合体の生成をもたらす、ジスルフィド交換によるコポリマーネットワーク（二抱合体１：１および二抱合体１：３）のアフィボディ（「Ｈｅｒ－２」）への抱合のスキームを示す［２０］。ＤＴＴの不在下および存在下の、精製されたアフィボディ、二抱合体、および三抱合体のＳＤＳ／ＰＡＧＥを示す。ＤＴＴの存在下で、アフィボディは、三抱合体から放出され、精製されたアフィボディと並んで移動する（１０ｋＤａよりも若干上）。ＨＢＧ緩衝液（ｐＨ７．４）中での、プラスミドｐＧｒｅｅｎｆｉｒｅ１と複合体を形成するＬＰＥＩ、二抱合体、および三抱合体のＤＬＳ測定を用いた粒子サイズ測定を示す。プラスミドｐＧｒｅｅｎｆｉｒｅ１と複合体を形成したＬＰＥＩ、二抱合体、および三抱合体のξ電位分布を示す。ゼータ電位は、ＤＬＳにより測定され、スモルコフスキー方程式により計算された。両ポリプレックスに関してＨＢＧ緩衝液（ｐＨ７．４）中で実施された測定から得た原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示す。（Ａ）三抱合体１：１ポリプレックス、（Ｂ）三抱合体１：３ポリプレックス。スケールバーは１μｍである。両ポリプレックスに関してＨＢＧ緩衝液（ｐＨ７．４）中で実施された測定から得た原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）画像を示す。（Ａ）三抱合体１：１ポリプレックス、（Ｂ）三抱合体１：３ポリプレックス。スケールバーは１μｍである。異なってＰＥＧ化されたポリプレックスがプラスミドｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１をＤＮａｓｅＩ分解から保護することを示す、寒天ゲルを示す。単独または三抱合体ポリプレックス：１：１および１：３中の１μｇのプラスミド（ｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１）を、ＤＮａｓｅＩ（２ＩＵ）と共に、またはそれなしで処理した。超らせんプラスミド（ｓ．ｃ．）、開環状プラスミド（ｏ．ｃ．）。それぞれ、１：１および１：３の割合のＬＰＥＩ：ＰＥＧを含有する三抱合体１：１ポリプレックスおよび三抱合体１：３ポリプレックスを使用した、ｐＧＦＰ－ＬＵＣのＨｅｒ－２媒介遺伝子導入を示す。２つのポリプレックスを生成するために、１００００個のＢＴ４７４およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞／ウェルを、ｐＧＦＰ－ＬＵＣ（１μｇ／ｍｌ）と複合体を形成した三抱合体１：１および１：３で４８時間処理した。ＰＥＩ窒素／ＤＮＡリン酸比はＨＢＳ中において６（Ｎ／Ｐ＝６）であった。（Ａ）ルシフェラーゼ活性の測定は、ＢＴ４７４と比較して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において大幅に減少したｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１送達、および三抱合体１：１と比較したとき、三抱合体１：３ポリプレックスにより媒介された遺伝子送達の減少を示した（^＊ｐ＜０．００１）。平均＋標準偏差として相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として示されるルシフェラーゼ活性は、４８時間後に３連で測定された。（Ｂ）ポリプレックスで処理された細胞の蛍光画像。画像は、Ｘ１０倍率で示され、実施された３つの実験を代表する。（Ｃ）メチレンブルーアッセイは、未処置（ＵＴ）細胞と比較した細胞生存のパーセントを示す。それぞれ、１：１および１：３の割合のＬＰＥＩ：ＰＥＧを含有する三抱合体１：１ポリプレックスおよび三抱合体１：３ポリプレックスを使用した、ｐＧＦＰ－ＬＵＣのＨｅｒ－２媒介遺伝子導入を示す。２つのポリプレックスを生成するために、１００００個のＢＴ４７４およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞／ウェルを、ｐＧＦＰ－ＬＵＣ（１μｇ／ｍｌ）と複合体を形成した三抱合体１：１および１：３で４８時間処理した。ＰＥＩ窒素／ＤＮＡリン酸比はＨＢＳ中において６（Ｎ／Ｐ＝６）であった。（Ａ）ルシフェラーゼ活性の測定は、ＢＴ４７４と比較して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において大幅に減少したｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１送達、および三抱合体１：１と比較したとき、三抱合体１：３ポリプレックスにより媒介された遺伝子送達の減少を示した（^＊ｐ＜０．００１）。平均＋標準偏差として相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として示されるルシフェラーゼ活性は、４８時間後に３連で測定された。（Ｂ）ポリプレックスで処理された細胞の蛍光画像。画像は、Ｘ１０倍率で示され、実施された３つの実験を代表する。（Ｃ）メチレンブルーアッセイは、未処置（ＵＴ）細胞と比較した細胞生存のパーセントを示す。それぞれ、１：１および１：３の割合のＬＰＥＩ：ＰＥＧを含有する三抱合体１：１ポリプレックスおよび三抱合体１：３ポリプレックスを使用した、ｐＧＦＰ－ＬＵＣのＨｅｒ－２媒介遺伝子導入を示す。２つのポリプレックスを生成するために、１００００個のＢＴ４７４およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌細胞／ウェルを、ｐＧＦＰ－ＬＵＣ（１μｇ／ｍｌ）と複合体を形成した三抱合体１：１および１：３で４８時間処理した。ＰＥＩ窒素／ＤＮＡリン酸比はＨＢＳ中において６（Ｎ／Ｐ＝６）であった。（Ａ）ルシフェラーゼ活性の測定は、ＢＴ４７４と比較して、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において大幅に減少したｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１送達、および三抱合体１：１と比較したとき、三抱合体１：３ポリプレックスにより媒介された遺伝子送達の減少を示した（^＊ｐ＜０．００１）。平均＋標準偏差として相対的ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）として示されるルシフェラーゼ活性は、４８時間後に３連で測定された。（Ｂ）ポリプレックスで処理された細胞の蛍光画像。画像は、Ｘ１０倍率で示され、実施された３つの実験を代表する。（Ｃ）メチレンブルーアッセイは、未処置（ＵＴ）細胞と比較した細胞生存のパーセントを示す。ＰｏｌｙＩＣと複合体を形成したＰＥＩ－ＰＥＧ－Ｈｅｒ２アフィボディ（ＰＰＨＡ）がＨｅｒ２過剰発現乳癌細胞ＢＴ４７４を阻害することを示す。複合型ベクターは、ハーセプチン／トラスツズマブ耐性細胞を含む、Ｈｅｒ２過剰発現細胞を阻害する。ヌードマウスに注入されたＨｅｒ２を過剰発現するＭＣＦ７細胞の阻害を示す。（Ｂ）ＰＰＥと比較した（Ａ）ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＥＧＦＲアフィボディ（ＰＰＥアフィボディ）の有効性を示す。（Ｂ）ＰＰＥと比較した（Ａ）ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＥＧＦＲアフィボディ（ＰＰＥアフィボディ）の有効性を示す。未処置（ＵＴ）、ｐＩＣ／ＰＰＥ、ｐＩ／ＰＰＥ、ｐＩ／ＰＰＥＡ、およびｐＩＣ／ＰＰＥＡ低（複合体において０．１μｇ／μｌｐＩＣ）と比較したときのインビボにおけるＰｏｌｙＩＣ／ＰＰＥアフィボディの活性を示す。ＳｃｈａｆｆｅｒｔＤ，ＫｉｓｓＭ，ＲoｄｌＷ，ＳｈｉｒＡ，ＬｅｖｉｔｚｋｉＡ，ＯｇｒｉｓＭ，ＷａｇｎｅｒＥ．（２０１１）Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥＧＦ－ｒｅｃｅｐｔｏｒｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｕｍｏｒｓｕｓｉｎｇＥＧＦ－ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ－ｌｉｎｅａｒｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅａｓｃａｒｒｉｅｒ．ＰｈａｒｍＲｅｓ．２８：７３１－４１に記載される、ＰｏｌｙＩＣ／ｍＰＰＥ（マウス）の適用と比較したときの、ＰｏｌｙＩＣ／ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ｈＥＧＦ複合体の異なる濃度の適用後のＵ８７ＭＧ、Ｕ８７ＭＧｗｔＥＧＦＲ細胞の生存を示す。ＰＥＩ－ＰＥＧ（ＰＰ）－ＤＵＰＡ（ＰＰＤ）／ＰｏｌｙＩＣがＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞に対して高度に有効であることを示す。生存率は曝露９６時間後に測定された。サイトカイン（Ａ）ＩＰ－１０、（Ｂ）ＰｏｌｙＩＣ／ＰＰＤをトランスフェクトされたＬＮＣａＰ細胞によるＲＡＮＴＥＳの生成を示す。サイトカイン（Ａ）ＩＰ－１０、（Ｂ）ＰｏｌｙＩＣ／ＰＰＤをトランスフェクトされたＬＮＣａＰ細胞によるＲＡＮＴＥＳの生成を示す。ＬＮＣａＰ細胞で条件付けされた培地が、ＰＢＭＣにおいてサイトカインの発現を刺激することを示す。発現は２４時間のインキュベーション後に測定された。ＰｏｌｙＩＣ／ＰＰＤ処理されたＬＮＣａＰ細胞とＰＳＭＡを発現しないＰＣ３－ルシフェラーゼ細胞の同時インキュベーションが、バイスタンダー効果により、最大７０％のＰＣ３－ルシフェラーゼ細胞の死滅をもたらしたことを示す。健康なヒトＰＢＭＣの付加は、効果を強く増強し、９０％のＰＣ３細胞の死滅につながる。インビボでの皮下ＬＮＣａＰ腫瘍に対するＰｏｌｙＩＣ／ＰＰＤの効果を示す。ＵＴ、未処置。

ポリカチオン、特にＰＥＩは、遺伝子トランスフェクションの薬剤として集中的に研究されてきた。最適なトランスフェクションの有効性は、ポリマー性ナノ粒子複合体が、全体的に、細胞表面上の負に帯電しているヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合することを可能にする正電荷を有するときに得られる［２８］。以前の研究は、直鎖ＰＥＩ（ＬＰＥＩ）が遺伝子トランスフェクションにおいて分枝状ＰＥＩ（ｂｒＰＥＩ）よりも有効であるが［２９～３１］［３２、３３、国際公開第２０１０／０７３２４７号］、ＬＰＥＩがより高い正電荷を有し、したがってより毒性であることを示した。正電荷、そして結果としての毒性を低下させようと、ＰＥＧ［１２］、ポリ－（エチレンオキシド）－ポリ（プロピレンオキシド）－ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ）［１８、３４］およびポリ（エチレンオキシド）［３５］などの様々な保護実体がカチオン性ポリマーに抱合されてきた。実際、ＰＥＩを様々な長さのＰＥＧ基で保護することにより、トランスフェクションの効率を維持する一方で、毒性が大幅に低下した［１２、１３、３６］。

本発明によると、ＬＰＥＩのＰＥＧ_２ｋとの抱合は、様々な比率のＬＰＥＩ対ＰＥＧ_２Ｋを含む二抱合体コポリマーをもたらすことが分かった。これらの二抱合体は、抱合された異なる数のＰＥＧ_２ｋ基を反映する電荷の相違により、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて互いに分離することができる。^１Ｈ－ＮＭＲ分析は、二抱合体がＬＰＥＩ単位当たりのＰＥＧ_２ｋ単位の平均数で互いに異なり、二抱合体１：１が１：１のＬＰＥＩ：ＰＥＧ_２ｋの比率を有し、二抱合体１：３が１：３のＬＰＥＩ：ＰＥＧ_２ｋの比率を有したことを裏付けた。Ｈｅｒ－２標的アフィボディの精製された二抱合体の各々への抱合は、適切な分子量の三抱合体生成物をもたらした、すなわち、二抱合体１：１から、ＬＰＥＩ：ＰＥＧ_２ｋ：Ｈｅｒ－２が１：１：１に等しい「三抱合体１：１」を得、二抱合体１：３から、１：３：３の比率の「三抱合体１：３」を得た。このプロトコルは、再現可能な方法で、標的アフィボディのＬＰＥＩ－ＰＥＧへの抱合がほぼ完了した状態で、均質な生成物を得ることを可能にした。

ＰＥＧ化が、二抱合体または三抱合体がプラスミドＤＮＡと複合体を形成する時に得られるポリプレックス粒子のサイズに強く影響を及ぼすことが観察された。二抱合体１：３および三抱合体１：３のポリプレックスは、二抱合体１：１および三抱合体１：１のポリプレックスよりも大きい平均粒子サイズを有した。我々は、単一カチオン鎖上のＰＥＧ化の量を増加することにより、ポリマー鎖がプラスミドをより小さい粒子に縮合することを防止する立体障害をもたらすと考える。これは、裸ＬＰＥＩポリプレックスが最小粒子を有した知見と一致する。更に、三抱合体１：１および１：３の両方はＤＮａｓｅＩから複合体を形成したプラスミドを保護し、３抱合された１：３ポリプレックスは、おそらく立体障害の増加により、より良い保護を提供した。

以前の研究は、カチオン性ポリマーに抱合されたＰＥＧ単位の分子量を増加させることが、核酸と複合体を形成したときに得られるポリプレックスの表面電荷の減少につながることを示唆した［１３］。我々のデータは、類似する分子量のＰＥＧ基の数の増加がξ電位分布により定義されるように、表面電荷の減少をもたらすことを示す。実際、最高表面電荷はプラスミドと複合体を形成した裸ＬＰＥＩによって示された。これらの結果は、中性実体がより多く化学ベクターに存在するほど、表面電荷が低くなるという考えを支持する。驚くべきことに、アフィボディに抱合された三抱合体ポリプレックスが二抱合体ポリプレックスよりも低い表面電荷を有し、Ｈｅｒ－２アフィボディ（それ自体がわずかに正電荷を有する）も粒子の表面電荷を減少させたことを示した。我々は、より多くの標的部分が表面上の電荷を覆うことで、Ｈｅｒ－２アフィボディが粒子のトポグラフィーを変更し、表面電荷の減少をもたらすと考えた。

ポリプレックスの形状は、薬物送達の候補としてのその性能に対して有意な効果を有するが［３７、３８］、どのポリプレックス形状が有効な薬物送達に望ましいかはまだ分かっていない。ポリプレックス形状に対するＰＥＧ化の作用は、我々の知る限りでは、今まで研究されなかった。ＡＦＭ写真では、三抱合体１：１ポリプレックス（遺伝子送達においてより有効であった）は、形状均一性を示し、一方、三抱合体１：３はより不均一であり、多くの非対称の楕円形粒子を有した。

カチオン性ポリマーを使用する選択的遺伝子導入は、主な課題のままである。以前の研究は、ＥＧＦまたはトランスフェリンでのＬＰＥＩおよびＬＰＥＩ－ＰＥＧ抱合体の標的がそれらの選択性を増加させ、インビトロおよびインビボ両方での非特異的相互作用を減少させたことを示した［３９、４０］。例えば、我々のＨｅｒ－２標的三抱合体１：１および１：３ポリプレックスの選択性を検査するために、Ｈｅｒ－２を差次的に発現する２つの乳癌細胞を利用した。ルシフェラーゼ活性およびＧＦＰ発現により示されるように、遺伝子送達は、細胞表面上に１００倍低いＨｅｒ－２受容体を発現するＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞よりも、Ｈｅｒ－２受容体を高度に過剰発現するＢＴ４７４細胞において有意に高かった。したがって、データは、三抱合体１：１および１：３の両方がＨｅｒ－２過剰発現細胞に対して高度に選択的であることを示す（図１０）。

以前の研究は、高レベルのＰＥＧ化が遺伝子トランスフェクションの減少をもたらし得ることを示した［４１］。これらの結果は、高度にＰＥＧ化された三抱合体１：３ポリプレックスが、あまりＰＥＧ化されない三抱合体１：１ポリプレックスと比較したとき、ルシフェラーゼ活性およびＧＦＰ発現によって示されるように、遺伝子送達において大幅な減少を示したという我々の観察と一致する。低ＰＥＧ化三抱合体１：１ポリプレックスによる遺伝子送達の増加は、軽度の細胞毒性により達成されたが、その高い表面電荷による可能性が高い。

この研究に従事する前の我々の作業仮説は、ＬＰＥＩ単位当たりの標的部分の数を増加させることにより、改善された遺伝子送達および／または選択性がもたらされるだろうということであった。我々は、１モルのＬＰＥＩ当たりに３モルのＨｅｒ－２アフィボディ分子を抱合させた三抱合体１：３が増加した受容体媒介粒子の内在化を示すだろうと推測した。しかしながら、三抱合体１：３ポリプレックスは、低いξ電位、大きな粒子サイズ、および不均一で非球形状を示し、その特徴のすべては、実際に観察されたトランスフェクション効率の減少の一因となった可能性がある。我々の結果は、Ｈｅｒ－２過剰発現細胞への選択的かつ効率的な遺伝子送達の媒介において、あまりＰＥＧ化されない三抱合体１：１がより多くＰＥＧ化された三抱合体１：３よりも優れていることを示す。

本発明によると、ＬＰＥＩ系ポリプレックスのＰＥＧ化は、表面電荷の減少、ポリプレックスサイズの増加、および形状不均一性の増加につながり、これらの特性が標的遺伝子送達に対して大きな作用を有し得ることが分かった。我々の簡略化された合成は、再現可能な方法で均質な生成物の精製を可能にし、これは、今や、様々な標的部分を使用して、異なる三抱合体の生成に拡大することができる。

上記を考慮して、一態様では、本発明は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）およびポリマー抱合体のポリプレックスを提供し、該ポリマー抱合体は、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分と共有結合された直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）からなり、各ＰＥＧ部分は、リンカーを介して癌抗原に結合することができる標的部分に抱合されているが、但し、標的部分が、ｍＥＧＦまたは配列ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（ＧＥ１１）（配列番号１）のペプチドでないことを条件とする。

ある特定の実施形態では、癌抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、または線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）であってよいが、これらに限定されない。標的部分は、癌抗原のうちのいずれか１つに対して、天然、自然もしくは修飾されたリガンドもしくはそのパラログ、または抗体、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、もしくはアフィボディなどの抗体模倣物などの非天然リガンドであってよい。アフィボディは、タンパク質ＡのＺドメイン（免疫グロブリンＧ結合ドメイン）に基づき、独特な結合特性は、親タンパク質ドメインの結合活性に関与する２つのアルファ－ヘリックスに位置する１３個のアミノ酸の無作為化によって取得される。

ある特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ポリイノシン－ポリシチジル酸の２本鎖ＲＮＡ（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）であり、ポリマー抱合体は、１つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ－ＰＥＧ１：１）または３つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ－ＰＥＧ１：３）に共有結合されたＬＰＥＩからなり、癌抗原は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、またはＰＳＭＡである。

ＰＥＧの分子量は、２～８ｋＤａの範囲、特に２ｋＤａであってよく、ＬＰＥＩの分子量は、１０～３０ｋＤａの範囲、特に２２ｋＤａであってよく、本発明のポリプレックスのｐｏｌｙＩＣは、各々少なくとも２２、好ましくは少なくとも４５リボヌククレオチドを含むＲＮＡ鎖から構成され得る。ある特定の実施形態では、各鎖は、２０～３００の範囲内のいくつかのリボヌククレオチドを有する。

ある特定の実施形態では、１つ以上のＰＥＧ部分は各々独立して、ＬＰＥＩと－ＮＨ－ＣＯ－結合、およびリンカーと、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、または－ＣＯ－Ｏ－から選択される結合を形成する。特に、１つ以上のＰＥＧ部分の１つ１つは、ＬＰＥＩおよびリンカーと－ＮＨ－ＣＯ－結合を形成する。

ある特定の実施形態では、リンカーは、標的部分と－Ｓ－Ｓ－、ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ－、Ｏ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、または尿素（－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ）結合を形成する。リンカーは、－ＣＯ－Ｒ_２－Ｒ_ｘ－Ｒ_３または３～７個のアミノ酸残基からなるペプチド部分から選択されてよく、式中、
Ｒ_２は、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルケニレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルキニレン、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリーレン－ジイル、またはヘテロアリーレンジイルから選択され、
Ｒ_ｘは、不在であるか、または－Ｓ－であり、
Ｒ_３は、不在であるか、または式

のものであり、
Ｒ_４は、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルケニレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルキニレン、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン－（Ｃ_３－Ｃ_８）シクロアルキレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルケニレン－（Ｃ_３－Ｃ_８）シクロアルキレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルキニレン－（Ｃ_３－Ｃ_８）シクロアルキレン、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリーレン－ジイル、ヘテロアリーレンジイル、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン－（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリーレン－ジイル、または（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン－ヘテロアリーレンジイルから選択され、
該（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルケニレン、または（Ｃ_２－Ｃ_８）アルキニレンの１つ１つは、任意に、ハロゲン、－ＣＯＲ_５、－ＣＯＯＲ_５、－ＯＣＯＯＲ_５、－ＯＣＯＮ（Ｒ_５）_２、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＳＲ_５、－ＯＲ_５、－Ｎ（Ｒ_５）_２、－ＣＯＮ（Ｒ_５）_２、－ＳＯ_２Ｒ_５、－ＳＯ_３Ｈ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒ_５、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール、（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレン－（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール、ヘテロアリール、または（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレン－ヘテロアリールから各々独立して選択される１つ以上の基によって置換され、更に任意に、Ｓ、Ｏ、もしくはＮから選択される１つ以上の同一もしくは異なるヘテロ原子、および／または－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－Ｎ（Ｒ_５）－、－Ｎ（Ｃ_６－Ｃ_１０アリール）－、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリーレン－ジイル、またはヘテロアリーレンジイルから各々独立して選択される、少なくとも１つの基によって中断され、
Ｒ_５は、Ｈまたは（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキルである。

ある特定の実施形態では、Ｒ_２は、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン、好ましくは（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレンから選択され、任意に、ハロゲン、－ＣＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＯＣＯＯＨ、－ＯＣＯＮＨ_２、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＮＨ_２、－ＳＯ_２Ｈ、－ＳＯ_３Ｈ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｈ、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール、（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレン－（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール、ヘテロアリール、または（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレン－ヘテロアリールから各々独立して選択される１つ以上の基によって置換され、更に任意に、Ｓ、Ｏ、もしくはＮから選択される１つ以上の同一もしくは異なるヘテロ原子、および／または－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_８アルキル）－、－Ｎ（Ｃ_６－Ｃ_１０アリール）－、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリーレン－ジイル、もしくはヘテロアリーレンジイルから各々独立して選択される少なくとも１つの基によって中断される。特に、Ｒ_２は、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン、好ましくは（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレンから選択される。

ある特定の実施形態では、Ｒ_ｘは－Ｓ－である。

ある特定の実施形態では、Ｒ_３は、不在であるか、または

であり、式中、
Ｒ_４は、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン－（Ｃ_３－Ｃ_８）シクロアルキレン、好ましくは（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレン－（Ｃ_５－Ｃ_６）シクロアルキレンである。

ある特定の実施形態では、上記に定義されるポリプレックスにおいて、Ｒ_２は－ＣＨ_２－ＣＨ_２－であり、Ｒ_ｘは－Ｓ－であり、Ｒ_３は、不在であるか、または

であり、式中、Ｒ_４は

である。

ある特定の実施形態では、リンカーは、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、またはホモフェニルアラニンなどの、少なくとも１個、特に、２または３個の芳香族性アミノ酸残基を含むペプチド部分である。ある特定の実施形態では、ペプチド部分は、そのメルカプト基を介して標的部分に連結される、－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－（配列番号２）または－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－（ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ（ＮＨ_２）－ＣＯ）－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－（配列番号３）である。

ある特定の実施形態では、ポリマー抱合体は、標的部分（単数／複数）に連結される、式（Ｉ）～（ＶＩＩＩ）の二抱合体である：
（Ｉ）

、
（ＩＩ）

、
（ＩＩＩ）－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－（ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ（ＮＨ_２）－ＣＯ）－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－ＰＥＧ_２ｋ－ＬＰＥＩ、
（ＩＶ）－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＰＥＧ_２ｋ－ＬＰＥＩ、
（Ｖ）

、
（ＶＩ）

、
（ＶＩＩ）

、
（式中、Ｒ_６は

である）、または
（ＶＩＩＩ）

（式中、Ｒ_７は

である）。

特定の実施形態では、ポリプレックスは、
（ａ）標的部分がＨＥＲ２アフィボディであり、ポリマー抱合体が上記の式（Ｉ）のものであり、ＨＥＲ２アフィボディがそのメルカプト基を介して連結され、本明細書において、ＬＰＥＩ－ＰＥＧ_２ｋ－ＨＥＲ２とも称される、ポリプレックス、
（ｂ）標的部分がＨＥＲ２アフィボディであり、ポリマー抱合体が上記の式（Ｖ）のものであり、ＨＥＲ２アフィボディがそのメルカプト基を介して連結され、本明細書において、ＬＰＥＩ－（ＰＥＧ_２ｋ－ＨＥＲ２）_３とも称される、ポリプレックス、
（ｃ）標的部分がＥＧＦＲアフィボディであり、ポリマー抱合体が上記の式（Ｉ）のものであり、ＥＧＦＲアフィボディがそのメルカプト基を介して連結され、本明細書において、ＬＰＥＩ－ＰＥＧ_２ｋ－ＥＧＦＲとも称される、ポリプレックス、
（ｄ）標的部分がＥＧＦＲアフィボディであり、ポリマー抱合体が上記の式（Ｖ）のものであり、ＥＧＦＲアフィボディがそのメルカプト基を介して連結され、本明細書において、ＬＰＥＩ－（ＰＥＧ_２ｋ－ＥＧＦＲ）_３とも称される、ポリプレックス、
（ｅ）標的部分がヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）であり、ポリマー抱合体が上記の式（ＩＩ）のものであり、ｈＥＧＦがそのアミノ基を介して連結され、本明細書において、ＬＰＥＩ－ＰＥＧ_２ｋ－ｈＥＧＦとも称される、ポリプレックス、
（ｆ）標的部分がｈＥＧＦであり、ポリマー抱合体が上記の式（ＶＩ）のものであり、ｈＥＧＦがそのアミノ基を介して連結され、本明細書において、ＬＰＥＩ－（ＰＥＧ_２ｋ－ｈＥＧＦ）_３とも称される、ポリプレックス、
（ｇ）標的部分がＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が上記の式（ＩＩＩ）のものである、ポリプレックス、
（ｈ）標的部分がＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が上記の式（ＶＩＩ）のものである、ポリプレックス、
（ｉ）標的部分がＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が上記の式（ＩＶ）のものである、ポリプレックス、または
（ｊ）標的部分がＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が上記の式（ＶＩＩＩ）のものである、ポリプレックスから選択される。

本発明のポリプレックスにより形成されたナノ粒子のサイズは、１２０～１５０ｎｍの範囲、特に１３５～１４８ｎｍ、または１４２ｎｍであり得る。

本発明に使用されるポリマー抱合体を調製するための手順の非限定的な方法は、以下の実施例に例示される。

ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲアフィボディは、配列番号４に記載されるようなアミノ酸配列のものであり、ＨＥＲ２アフィボディは、配列番号５に記載されるようなアミノ酸配列のものであり、ｈＥＧＦは、配列番号６に記載されるようなアミノ酸配列のものである。

別の態様では、本発明は、薬学的に許容される担体および上記に定義されるポリプレックスを含む薬学的組成物に関する。

また別の態様では、本発明は、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌から選択される癌の治療に使用するための、本明細書で定義される、本発明のポリプレックス、またはポリプレックスを含む薬学的組成物を提供する。

ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌は、非小細胞肺癌、乳癌、膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、結腸直腸癌、腺癌、卵巣癌、膀胱癌、または前立腺癌、およびこれらの転移癌から選択される。ある特定の実施形態では、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌の治療に使用されるポリプレックスは、上記に定義される（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）のポリプレックスから選択される。

ある特定の実施形態では、ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌は、乳癌、卵巣癌、胃癌、および子宮の漿液性子宮内膜癌などの侵攻性形態の子宮癌から選択される。ある特定の実施形態では、Ｈｅｒ２過剰発現細胞は、ハーセプチン／トラスツズマブ耐性細胞である。よって、本発明のポリプレックスは、ハーセプチン／トラスツズマブ耐性癌、すなわち、ハーセプチン／トラスツズマブへの曝露に応答しない、または応答の程度が低い細胞を含む癌の治療に使用するためであり得る。

特に、ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌の治療に使用されるポリプレックスは、上記に定義されるポリプレックス（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、または（ｆ）から選択される。

ある特定の実施形態では、癌は前立腺癌であり、前立腺癌の治療に使用されるポリプレックスは、上記に定義される（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、または（ｊ）から選択される。

また更なる態様では、本発明は、免疫細胞と組み合わせて使用するための、本発明のポリプレックス、方法、または薬学的組成物を目的とする。

また更なる態様では、本発明は、本明細書において上記に定義されるポリプレックスを目的とし、ｄｓＲＮＡは、適切なプロモーターおよびターミネーターなどの要素を制御するように動作可能に連結されたタンパク質コードされた核酸配列を含むプラスミドなどのＤＮＡ分子で置換される。

ある特定の実施形態では、免疫細胞は、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ－ＴＩＬ）、腫瘍特異的遺伝子操作Ｔ細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。

本明細書で使用されるとき、用語「ポリプレックス」は、核酸とポリマーとの間の複合体を指す。核酸は、非共有結合または共有結合、特に、静電結合を介してポリマーに結合される。用語「ポリプレックス」は、核酸を細胞に輸送および送達するのに有用なベクター、すなわち、非ウイルス性ベクターを指す。

用語「患者」、「対象」、または「個人」は、互換的に使用され、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。

本明細書で使用されるとき、用語「（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキル」は典型的には、１～８個の炭素原子を有する直鎖または分枝状炭化水素ラジカルを意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、２，２－ジメチルプロピル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなどを含む。

用語「（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン」は、１～８個の炭素原子を有する直鎖または分枝状の二価の炭化水素ラジカルを指し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンタニレン（ｐｅｎｔａｎｙｌｅｎｅ）、ヘキサニレン（ｈｅｘａｎｙｌｅｎｅ）、ヘプタニレン（ｈｅｐｔａｎｙｌｅｎｅ）、オクタニレン（ｏｃｔａｎｙｌｅｎｅ）などを含む。用語「（Ｃ_２－Ｃ_２）アルケニレン」および「（Ｃ_２－Ｃ_８）アルキニレン」は典型的には、２～８個の炭素原子およびそれぞれ１つ以上の２重もしくは３重結合を有する直鎖または分枝状の二価の炭化水素ラジカルを意味する。このようなラジカルの非限定的な例としては、エテニレン、プロペニレン、１－および２－ブテニレン、１－および２－ペンテニレン、１－、２－、および３－ヘキセニレン、１－、２－、および３－ヘプテニレン、１－、２－、３－、および４－オクテニレン、エチニレン、プロピニレン、１－および２－ブチニレン、２－メチルプロピレン、１－および２－ペンチニレン、２－メチルブチレン、１－、２－、および３－ヘキシニレン、１－、２－、および３－ヘプチニレン、１－、２－、３－、および４－オクチニレンなどが挙げられる。

用語「（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール」は、限定されないが、フェニルおよびナフチルなどの単環または縮合された複数の環からなる、６～１０個の炭素原子を有する芳香族炭素環式基を表し、用語「（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリーレン－ジイル」は、限定されないが、フェニレンおよびナフチレンなどの単環または縮合された複数の環のいずれかからなる、６～１０個の炭素原子を有する二価の芳香族炭素環式基を表す。

用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、Ｏ、またはＳから選択される１～３個、好ましくは１～２個のヘテロ原子を含有する５～１０員の単環式もしくは多環式芳香族複素環に由来するラジカルを指す。単環式ヘテロアリールの例としては、ピロリル、フリル、チエニル、チアジニル、ピラゾリル、ピラジニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、ピリジル、ピリミジニル、１，２，３－トリアジニル、１，３，４－トリアジニル、および１，３，５－トリアジニルが挙げられるが、これらに限定されない。多環式ヘテロアリールラジカルは、好ましくは、限定されないが、ベンゾフリル、イソベンゾフリル、ベンゾチエニル、インドリル、キノリニル、イソキノリニル、イミダゾ［１，２－ａ］ピリジル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、ベンゾキサゾリル、ピリド［１，２－ａ］ピリミジニル、および１，３－ベンゾジオキシニルなどの２つの環から構成される。ヘテロアリールは、任意に、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＳＨ、または－ＣＯＮＨ_２から各々独立して選択される１つ以上の基によって置換され得る。多環式ヘテロアリールが置換される場合、置換は、炭素環式環および／または複素環式環のいずれにあってもよいことも理解する。用語「ヘテロアリーレンジイル」は、環原子のいずれかから２個の水素原子を除去することによる、本明細書において定義される「ヘテロアリール」に由来する二価のラジカルを表す。

本明細書で使用されるとき、用語「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードを指す。

用語「（Ｃ_３－Ｃ_８）シクロアルキレン」は、３～８個の炭素を含有する単環式または２環式の飽和二価環式炭化水素ラジカルを表す。このようなラジカルの非限定的な例としては、１，２－シクロプロパン－ジイル、１，２－シクロブタン－ジイル、１，３－シクロブタン－ジイル、１，２－シクロペンタン－ジイル、１，３－シクロペンタン－ジイル、１，２－シクロヘキサン－ジイル、１，３－シクロヘキサン－ジイル、１，４－シクロヘキサン－ジイル、１，２－シクロヘプタン－ジイル、１，３－シクロヘプタン－ジイル、１，４－シクロヘプタン－ジイル、１，２－シクロオクタン－ジイル、１，３－シクロオクタン－ジイル、１，４－シクロオクタン－ジイル、１，５－シクロオクタン－ジイルなどが挙げられる。

本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸残基」は、そのＬ－およびＤ－両方の立体異性体において、任意の自然の、または合成の、すなわち、非自然のアミノ酸残基を指す。自然のアミノ酸は、典型的にはタンパク質において生じる２０個のアミノ酸残基のうちのいずれか１つであるが、用語合成／非自然アミノ酸は、２０個の自然のアミノ酸のうちの１つではない、任意のアミノ酸、修飾アミノ酸、および／またはそれらの類似体を指す。自然アミノ酸の非限定的な例としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、バリン、フェニルアラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、セリン、チロシン、メチオニン、スレオニン、およびトリプトファンが挙げられる。非自然アミノ酸の例としては、オルニチン、ホモリジン、２，４－ジアミノ酪酸（ＤＡＢＡ）、２，３－ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）、８－アミノオクタン酸（ＥＡＯ）、ホモフェニルアラニン、ホモバリン、ホモロイシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明による薬学的組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体および／または賦形剤を使用して、従来の方法で製剤化され得る。担体（複数可）は、組成物の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。

担体、投与様式、剤形などの以下の例示は、担体、投与様式、剤形などが本発明と共に使用するために選択され得る既知の可能性として列記される。しかしながら、当業者は、任意の所与の製剤および選択される投与様式が所望の結果を達成することを決定するために最初に試験されるべきであることを理解するだろう。

投与方法は、非経口、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、粘膜（例えば、口腔、鼻孔内、頬側、膣、直腸、眼内）、くも膜下腔内、局所、および皮内経路を含むが、これらに限定されない。投与は全身または局所であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、脳内投与用に適応される。

用語「担体」は、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または活性剤が投与されるビヒクルを指す。薬学的組成物中の担体は、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン（ポリビドンまたはポビドン）、トラガントガム、ゼラチン、デンプン、ラクトースもしくはラクトース一水和物などの結合剤、アルギン酸、トウモロコシデンプンなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムもしくはラウリル硫酸ナトリウムなどの滑沢剤または界面活性剤、およびコロイド状の二酸化ケイ素などの滑剤を含み得る。

組成物は、注射により、例えば、ボーラス注射または連続注入により非経口的投与用に製剤化され得る。注射用製剤は、単位剤形、例えば、アンプルまたは多投与容器で提示され得、防腐剤が添加される。組成物は、懸濁液、油中溶液もしくはエマルジョン、または水生ビヒクルなどの形態を取ることができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤用作用物質を含有し得る。別の方法としては、活性成分は、使用前に、好適なビヒクル、例えば、減菌発熱性物質除去蒸留水と構成する粉末形態であり得る。

吸入による投与に関して、例えば、鼻投与に関して、本発明による組成物は、便宜上、好適な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適なガスの使用により、加圧パックまたはネブライザからのエアロゾルスプレー供給の形態で送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、計量した量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。化合物の粉末ミックスおよびラクトースまたはデンプンなどの好適な粉末基材を含有する、吸入器または注入器において使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが製剤化され得る。

ある特定の実施形態では、薬学的組成物は、上述の任意の既知の方法による投与用に製剤化される。本明細書において想定される特定の投与方法は、静脈内および脳内（脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ））投与である。

上記に定義される実施形態のうちのいずれか１つによる薬学的組成物は、静脈内、脳内（脳内）、口腔、皮内、筋肉内、皮下、経皮、経粘膜、鼻孔内、または眼内投与用に製剤化され得る。

本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例により図示される。

材料および方法（Ｍ＆Ｍ）
化学物質
ＰＤＰ－ＰＥＧ－ＮＨＳ（ＰＤＰ：ピリジルジチオプロピオン酸塩）とも称される、ＮＨＳ－ＰＥＧ－ＯＰＳＳ（オルト－ピリジルジスルフィド－ポリエチレングリコール－Ｎ－ヒドロキシルスクシンイミドエステル）（約２ｋＤａの分子量）は、ＣｒｅａｔｉｖｅＰＥＧｗｏｒｋｓ（Ｗｉｎｓｔｏｎ，ＵＳＡ）から購入した。ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）（約５０ｋＤａの平均分子量（Ｍｎ））、および無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ（Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。無水エタノールは、Ｒｏｍｉｃａｌ（Ｉｓｒａｅｌ）から購入した。すべての溶媒は、更に精製することなく使用された。

約２２ｋＤａのＬＰＥＩ（遊離塩基形態）の合成
カチオン性ポリマーの直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）は、前述のように合成された［１６］。簡潔に、８．０ｇ（０．１６ｍｍｏｌｓ）のポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を、１００ｍｌの濃縮ＨＣｌ（３７％）で加水分解し、４８時間還流して、白色の沈殿物を得た。減圧下で過剰のＨＣｌを除去し、残りの固体を５０ｍｌの水に溶解し、凍結乾燥させた（５ｇ、７８％、^１Ｈ－ＮＭＲ、Ｄ_２Ｏ－ｄ６、４００ＭＨｚ：一重項３．５ｐｐｍ）。水性ＮａＯＨ（３Ｍ）を添加することによって、得られたＬＰＥＩ塩酸塩（４．５ｇ）をアルカリ性にし、得られた白色の沈殿物を濾過し、中性になるまで水で洗浄した。次に、固体を水に溶解し、更に凍結乾燥して、白色の固体（２ｇ、８１％）を得た。

ＬＰＥＩ－ＰＥＧ_２ｋ－ＯＰＳＳ二抱合体の合成
１７４ｍｇ（８μｍｏｌ）のＬＰＥＩを２．７ｍｌの無水ＥｔＯＨに溶解し、室温で１５分間撹拌した。５倍のモル過剰のＯＰＰＳ－ＰＥＧ_２ｋ－ＣＯＮＨＳ（７９ｍｇ、３９．５μｍｏｌ）を５００μＬの無水ＤＭＳＯに溶解し、少しずつＬＰＥＩ混合物に導入した。反応ミックスを、室温で３時間、ボルテックス撹拌機で、約８００ｒｐｍで撹拌した。ＭａｃｒｏＰｒｅｐＨｉｇｈＳ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）で充填されたＨＲ１０／１０カラムを使用して、陽イオン交換クロマトグラフィーにより、異なるＰＥＧ置換ＬＰＥＩを分離した。二抱合体の溶出画分の純度は、１ｍｌ／分の流量で２５分にわたって５％～９５％アセトニトリルの直線勾配を用いて、分析用ＶｙｄａｃＣ－８モノマー５μｍカラム（３００Å、４．６×１５０ｍｍ）を装備した逆相ＨＰＬＣを使用して評価された。９５％以上の純度の画分を組み合わせた。組み合わせた画分を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に対して更に透析した。二抱合体においてＬＰＥＩに抱合されたＰＥＧ_２ｋ基の比率は、^１Ｈ－ＮＭＲにより決定された。ポリエチレン－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ）－およびＬＰＥＩ－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ）－からの水素の積分値は、２つの抱合されたコポリマー間の比率を決定するために使用された。陽イオン交換から得られた様々な生成物のうち、ＬＰＥＩ－ＰＥＧ_２ｋ－ＯＰＳＳ（二抱合体１：１、ＬＰＥＩ対ＰＥＧのモル比は約１：１）およびＬＰＥＩ－（ＰＥＧ_２ｋ）_３－（ＯＰＳＳ）_３（二抱合体１：３、モル比は約１：３）の２つの生成物が三抱合体の生成用に選択された。コポリマーの濃度を評価するために、銅アッセイを使用した［１７］。簡潔に、コポリマーをＣｕＳＯ_４（２３ｍｇを１００ｍｌのアセテート緩衝液に溶解した）と２０分間インキュベートし、２８５ｎｍでのそれらの吸光度を測定した。

タンパク質のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
サンプル（３０μＬ）を、１００ｍＭのＤＴＴと共に、またはそれなしでＳＤＳタンパク質サンプル緩衝液中に希釈し、次に、トリシンゲル（１３％ポリアクリルアミド）に適用した。カソード緩衝液（０．１Ｍのトリス、０．１Ｍのトリシン、および０．１％のＳＤＳ（ｐＨ８．２５））およびアノード緩衝液（０．２１Ｍのトリス（ｐＨ８．９））を用いて電気泳動を実施し、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（商標）で染色することによって、タンパク質バンドを可視化した。

アフィボディ発現および精製
Ｈｅｒ－２アフィボディ遺伝子をプラスミドｐＥＴ２８ａにクローン化し、Ｎ末端ヘキサヒスチジル（Ｈｉｓ６）タグに融合されたＺ：２８９１アフィボディおよびＣ末端にＣｙｓ残基をコードするベクターを生成した。アフィボディを、以下のように大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に発現させた：３７℃で、細胞を約０．７のＯＤ_６００に成長させた。０．５ｍＭの最終濃度にＩＰＴＧを添加し、続いて３０℃で４時間インキュベートした。細胞ペレットを－８０℃で保管した。アフィボディを精製するために、細胞ペレットを緩衝液Ａ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、１０ｍＭイミダゾール、および２ｍＭ β－メルカプトエタノール）に再懸濁し、製造者の指示に従いマイクロ流動化装置プロセッサＭ－１１０ＥＨＩを用いて破砕した。４℃で１０分間、１２，０００Ｘｇで遠心分離することにより、可溶性画分を回収した。得られた画分をＮｉ親和性カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ）に充填した。カラムを１４カラム容量（ｃｖ）の緩衝液Ａで洗浄した。その後、緩衝液Ｂ（２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭＮａＣｌ、１０％グリセロール、５００ｍＭイミダゾール、および２ｍＭ β－メルカプトエタノール）、５ｃｖの６％緩衝液Ｂ、１．５ｃｖの１０％緩衝液Ｂ、２ｃｖの３０％緩衝液Ｂの増加濃度を用いて、段階的勾配溶離を実施した。結合タンパク質を５ｃｖの１００％緩衝液Ｂで溶出した（タンパク質精製施設Ｗｏｌｆｓｏｎｃｅｎｔｒｅ，Ｉｓｒａｅｌ）。次に、溶出した画分をＡｍｉｃｏｎフィルタ（３ｋＤａカットオフ）で濃縮し、ゲル濾過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ３０ｐｒｅｐグレード（１２０ｍｌ）（ＧＥｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に充填した。精製したタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで更に分析し、抗アフィボディ抗体（Ａｂｃａｍ）を用いて、ウエスタンブロット解析を使用して確認した。前述の逆相ＨＰＬＣ（Ｍｅｒｃｋ－ＨｉｔａｃｈｉモデルＬ－７１００）により、純度を更に評価した。

ＰＥＩ－ＰＥＧ－リガンドアフィボディ（三抱合体１：１および１：３）の合成
４．９７ｍｇの各二抱合体（１：１および１：３）を９４０μｌの２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。次に、ＨＢＳ中の３．４ｍｇのＨｅｒ－２アフィボディを反応物に滴下して添加した。溶解度を増加させるために、４ｍｌの２０ｍＭＨＥＰＥＳと７００μＬのアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）を反応ミックスに導入した。Ａ_３４３が完全なターンオーバーを示すまで、反応物を、室温で更にボルテックスにかけた（８００ｒｐｍ）。得られた三抱合体を、ＭａｃｒｏＰｒｅｐＨｉｇｈＳ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）で充填したＨＲ１０／１０カラム上で陽イオン交換クロマトグラフィーにより（３ＭＮａＣｌを含む、２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）～２０ｍＭＨＥＰＥＳの３段階勾配溶離を使用して）精製した。溶出した画分を分析用ＲＰ－ＨＰＬＣに導入して、三抱合体の純度を評価し、９５％以上の純度の画分は組み合わされ、－８０°Ｃに維持された。三抱合体の濃度は銅アッセイ（上記の通り）により決定された。抱合したタンパク質の量は、Ｎａｎｏ－Ｄｒｏｐ２０００を使用して、Ａ_２８０により決定された。

標的タンパク質に抱合された化学ベクターの検証および純度
三抱合体をＳＤＳ－ＰＡＧＥで電気泳動し、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（商標）で染色して、アフィボディのＬＰＥＩ－ＰＥＧ_２ｋへの抱合を確認した。三抱合体の純度は、２２０ｎｍで監視しながら、１ｍｌ／分で、分析用ＶｙｄａｃＣ－８モノマー５μｍカラム（３００Å、４．６×１５０ｍｍ）を使用して、逆相ＨＰＬＣにより確認された。移動相として０．１％ＴＦＡを含有する３回蒸留した水（ＴＤＷ）で２５分間、アセトニトリル５％～９５％での勾配溶離がＨＰＬＣ分析に使用された。

ポリプレックスの形成
ホタルのルシフェラーゼおよびＧＦＰ（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ）をコードするプラスミドｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１を、大腸菌において増幅し、製造者のプロトコルに従い、ＱｉａｇｅｎＰｌａｓｍｉｄＭａｘｉＫｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）により精製した。三抱合体１：１または三抱合体１：３は、ＨＥＰＥＳ緩衝液グルコース中Ｎ／Ｐ＝６の比率で（Ｎ＝ＬＰＥＩからの窒素、Ｐ＝ＤＮＡからのリン酸）プラスミドと複合体を形成し、２つのポリプレックスを生成した。ポリプレックス粒子の完全な形成を可能にするために、サンプルを室温で３０分間インキュベートした。ポリプレックスサンプルにおける最終プラスミド濃度は１００μｇ／ｍｌであり、一方、ＤＮａｓｅ保護アッセイおよびルシフェラーゼアッセイに関しては、プラスミドの最終濃度は１０μｇ／ｍｌであった。

ξ電位およびサイズ測定
ＨＢＧ緩衝液中への分散後に得たポリプレックス粒子のサイズは、容量分布計算を用いて、Ｎａｎｏ－ＺＳゼータ電位測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用して、動的光散乱により、２５℃で測定された。装置は６３３ｎｍレーザーを装備し、光散乱は、後方散乱技術（ＮＩＢＳ，Ｎｏｎ－ＩｎｖａｓｉｖｅＢａｃｋ－Ｓｃａｔｔｅｒ）により１７３°で検出された。各サンプルは３連で行われた。ζ電位測定もＮａｎｏ－ＺＳゼータ電位測定装置（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用して、２５℃で実施された。ζ電位は、ＨＢＧ緩衝液（ｐＨ７．４）中でポリプレックスをインキュベートした後に評価された。移動粒子からの光散乱は１７°で検出され、スモルコフスキーモデルはヘンリー関数の値を決定するために使用された。

原子間力顕微鏡
ＡＦＭ測定に関して、ポリプレックスを、新しく切断したＭｉｃａディスク（Ｖ１１２ｍｍ，ＴｅｄＰｅｌｌａＵＳＡ）上に設置した。撮像は、ＱＩ（商標）モードで、商業用ＡＦＭのＮａｎｏＷｉｚａｒｄ（登録商標）３（ＪＰＫｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、２５℃のＨＢＧ緩衝液において実行された。１０～３０ｐＮｎｍ－１の範囲のバネ定数のＳｉ_３Ｎ_４（ＭＳＮＬ－１０シリーズ、Ｂｒｕｋｅｒ）カンチレバーは、約１０％の絶対誤差の上限で熱揺動方法（ＡＦＭソフトウェアに含まれる）により較正された。ＱＩ（商標）設定は次の通りである：Ｚ長：０．１μｍ；加えた力：０．５ｎＮ；速度：５０μｍ／秒。

ＤＮａｓｅ保護アッセイ
ＤＮａｓｅＩ保護アッセイは前述のように行われた［１８］。簡潔に、単独、ポリプレックス１：１、またはポリプレックス１：３を伴う１μｇのｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１ＤＮＡを、ＨＢＳ溶液中５０μｌの最終容量に混合した。室温で３０分間インキュベートした後、２μＬのＤＮａｓｅＩ（２単位）またはＰＢＳを１０μＬの各サンプルに添加し、３７℃で１５分間インキュベートした。ＤＮａｓｅＩ活性は、室温で１０分間、５μＬの１００ｍＭＥＤＴＡを添加することにより停止された。三抱合体からプラスミドを解離するために、１０μＬの５ｍｇ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、チューブを室温で２時間インキュベートした。サンプルを０．８％アガロースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。ＧｅｌＤｏｃＥＺＩｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）を使用して、画像を取得した。

細胞培養
Ｈｅｒ－２過剰発現ＢＴ４７４細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０^４Ｕ／Ｌペニシリン、および１０ｍｇ／Ｌのストレプトマイシンで補足したＲＰＭＩ培地中で、３７℃で、５％ＣＯ_２下で培養した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌細胞を、１０％ＦＢＳ、１０^４Ｕ／Ｌペニシリン、および１０ｍｇ／Ｌストレプトマイシンを有するＬｅｉｂｏｖｉｔｚＬ－１５培地中で、ＣＯ_２なしで３７℃で培養した。細胞系はＡＴＣＣからであり、細胞培養試薬はＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，ＢｅｔＨａ'ｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌからであった。

ルシフェラーゼアッセイおよび共焦点顕微鏡
１００００個のＢＴ４７４およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、３連で、９６ウェルプレートで平板培養した。処理の４８時間後、細胞を、プラスミドと複合体を形成した三抱合体１：１および三抱合体１：３で処理し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ウェル当たり３０μｌの細胞溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で溶解した。製造者の推奨に従い、ルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を２５μｌの溶解物のサンプルにおいて測定した。Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ（商標）ＡｓｃｅｎｔＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、測定を実施した。相対的光単位（ＲＬＵ）における値は、３連サンプルからのルシフェラーゼ活性の平均および標準偏差として表される。ＧＦＰを可視化するために、共焦点顕微鏡（ＦＶ－１２００Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用し、これはプラスミドｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１の内在化を反映するためにとられた。写真は×１０倍率で撮られた。

細胞生存率の定量化
細胞生存率は、前述のメチレンブルーを用いた比色分析アッセイにより測定された［１９］。簡潔に、１００００個のＢＴ４７４およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を、３連で、９６ウェルプレートで平板培養した。細胞を、１μｇ／ｍｌのｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１を含有するポリプレックス１：１および１：３で処理した。処理の４８時間後、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１％ホルムアルデヒドで固定し、ＤＤＷで洗浄し、次に、ホウ酸塩緩衝液中１％（ｗｔ／ｖｏｌ）溶液のメチレンブルーで１時間染色した。その後、染色を０．１ＭＨＣｌで抽出し、染色溶液の光学密度を、マイクロプレートリーダー（ＥＬｘ８００ＢＩＯ－ＴＥＸｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．）において、６３０ｎｍで読み取った。

実施例１－チオール反応性コポリマーの合成
３．１．以前の研究は、ＬＰＥＩのＰＥＧ化およびＥＧＦＲ標的部分へのその抱合を示した［１３］。しかしながら、単一ＬＰＥＩ鎖上のＰＥＧ化の量は完全に特徴付けされていない。差次的にＰＥＧ化されたコポリマーを生成するために、ＬＰＥＩ上の二級アミンをＰＥＧ上の保護基に直交する末端ＮＨＳエステルに抱合した。Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、ＬＰＥＩの二次骨格アミンと自然発生的に反応性であり、ＬＰＥＩの効率的なＰＥＧ化を提供する。更に、ＰＥＩのアミンとのＮＨＳ－ＰＥＧＯＰＳＳの反応は、安定した不可逆的なアミド結合の形成をもたらす（図１）。

ＰＥＧ化された生成物は、陽イオン交換クロマトグラフィーにより精製された。１つは１２０ｍＳ／ｃｍで、もう１つは１３２ｍＳ／ｃｍでの（データ示さず）、２つのピークが高濃度のＮａＣｌで溶出された。２つの生成物は、それらのＬＰＥＩ：ＰＥＧの比率において、およびその結果としてそれらの正味の正電荷において異なると推定された。^１Ｈ－ＮＭＲスペクトルは、ＰＥＧ（－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－）上の水素原子の相対的な積分値（図２）、およびＬＰＥＩ（－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－）上の水素原子の積分値（図２）を使用して分析された。この分析は、第１ピークにおいて溶出された材料が、ＬＰＥＩの各モルがＰＥＧの約３モルに抱合されたコポリマーからなったことを示した。この生成物は、ＬＰＥＩ－（ＰＥＧ_２ｋ）_３－（ＯＰＳＳ）_３（「二抱合体１：３」）と命名された。第２のピークは、等モルのＰＥＧがＬＰＥＩに抱合されたコポリマーからなり、ＬＰＥＩ－ＰＥＧ_２ｋ－ＯＰＳＳ（「二抱合体１：１」）と命名された（図２）。

実施例２．三抱合体ＬＰＥＩ－ＰＥＧ_２ｋ－Ｈｅｒ２アフィボディ（三抱合体１：１）およびＬＰＥＩ－（ＰＥＧ_２ｋ）－（Ｈｅｒ２）_３アフィボディ（三抱合体１：３）の合成
この研究の主な目的は、Ｈｅｒ－２過剰発現腫瘍細胞を標的とするであろうカチオン性ポリマーを開発することであった。Ｈｅｒ－２は「オーファン受容体」であるため、Ｈｅｒ－２受容体を標的とするアフィボディ分子（リガンドではなく）は、Ｈｅｒ－２標的三抱合体を生成するために使用された。我々は、更なる抱合を可能にするために、Ｃ－末端にＣｙｓ残基を有するＨｅｒ－２アフィボディを発現および精製した。チオール反応性コポリマーの二抱合体１：１および１：３は、その端末Ｃｙｓ残基を通してＨｅｒ－２アフィボディに抱合され、それぞれ、三抱合体１：１および１：３を生成した（図３）。三抱合体を生成するために、反応は、低濃度のアフィボディで（凝集を阻止するため）、および溶解度増加のために有機極性溶媒として１０％アセトニトリル（ＡＣＮ）の存在下で実施されなければならなかった。両三抱合体反応の反応物収率は、銅アッセイにより決定されたとき、約３３％であった。アフィボディの二抱合体への抱合を確認するために、三抱合体生成物をＤＴＴで還元し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で分離した。クマシーブルー染色は、還元した三抱合体がアフィボディを放出したことを確認した（図４）。三抱合体中に存在するＨｅｒ－２アフィボディの量は、Ａ_２８０を測定することにより決定された。銅アッセイを使用して、我々はＬＰＥＩを定量化した。上述のように、^１Ｈ－ＮＭＲ分析は、精製した二抱合体のＬＰＥＩ：ＰＥＧの比率が１：１または１：３であったことを示した。Ｈｅｒ－２アフィボディおよびＬＰＥＩのモル比を比較することにより、我々は、三抱合体１：１におけるＨｅｒ－２アフィボディ対ＬＰＥＩの平均比率が１：１であり、三抱合体１：３では、平均比率が３：１であったと決定した。よって、我々は、アフィボディのＬＰＥＩ－ＰＥＧへのほぼ完全な抱合が達成されたと結論付けた。

ポリプレックスを生成するために、材料および方法において記載されるように、純粋な二抱合体および三抱合体（１：１および１：３）はプラスミドＤＮＡと複合体を形成した（図３）。

実施例３．ポリプレックスのξ電位およびサイズ測定
我々は、次に、動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、サイズおよび表面電荷に関してポリプレックスを特徴付けた。ポリプレックスのサイズは、その送達特性に大きな影響を有する［２１］。ポリプレックスのサイズに対する標的リガンドの作用を検証するために、我々は、二抱合体１：１および１：３の両方をプラスミドと複合体を形成させ、それらのサイズを測定することに決めた。二抱合体１：１は、１１５．２±８．２ｎｍの平均粒子サイズを有し、二抱合体１：３は、２５３．１±９．５ｎｍの平均粒子サイズを有した。プラスミドを有する三抱合体１：１から生成されたポリプレックスは、１４１±５．８ｎｍの平均粒子サイズをもたらし、一方、プラスミドと複合体を形成した三抱合体１：３は、２５６±２４．２ｎｍの平均粒子サイズを有した（図５）。最小粒子（７３．９±３．０ｎｍ）は、プラスミドをＬＰＥＩ単独と複合体を形成することにより生成されたポリプレックスにおいて得られた。アフィボディの二抱合体への抱合は、粒子サイズに対して少ししか影響がなかった。しかしながら、ＰＥＧ基の数は、粒子サイズに影響を及ぼし、ＰＥＧ基が立体障害をもたらし、プラスミド縮合に干渉することを示唆した。

表面正電荷は負に帯電している細胞表面へのポリプレックス結合を容易にするが、過剰な正電荷は非特異的結合および顕著な毒性につながる可能性がある［１２］。図６に示される様々な複合体のξ電位は、ＰＥＧ単位の数の増加に伴いξ電位の減少を示した以前の研究と一致した［１３］。我々の化学ベクターの表面電荷に対するＰＥＧ基の作用を評価するために、我々は、プラスミドＤＮＡの、前駆体である二抱合体１：１および１：３、ならびに三抱合体１：１および１：３との複合体形成により形成されたポリプレックスのξ電位を測定した。二抱合体ポリプレックス１：１は２７．０±０．１ｍＶの平均ξ電位を有し、二抱合体ポリプレックス１：３は２０．０±１．０ｍＶの平均ξ電位を有した。三抱合体ポリプレックス１：１は平均１７．１±０．７ｍＶのξ電位を示し、一方、三抱合体ポリプレックス１：３は平均１０．２±０．４４ｍＶを示した（図６）。サイズと違い、ポリプレックスのξ電位は、ＰＥＧ基の数およびＨｅｒ－２アフィボディの抱合の両方により影響を受けた。最小で、最も正に帯電しているポリプレックスが裸ＬＰＥＩで得られたが、これらの粒子は極めて毒性である［２２］。我々は、ＰＥＧ基および標的部分の付加が毒性を低減するだろうと予測したが、ポリプレックスはそれでもサイズが比較的小さいため、核酸送達ベクターとしてのそれらの効率は損なわれないだろうと期待した。

実施例４．原子間力顕微鏡を使用したポリプレックス形状の評価．
粒子形状およびその送達特性に対する影響の重要性は重要視されている［２３］。我々は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して、溶液中の三抱合体で得たポリプレックスの形態を分析した。三抱合体１：１および１：３ポリプレックスの直径は両方ともナノサイズ範囲（図７Ａ、図７Ｂ）であり、ＤＬＳにより得られた結果と一致した。三抱合体１：１ポリプレックスは、主に楕円形の粒子を示した。大半の粒子は直径が１０１ｎｍ～１７８ｎｍの範囲であり、平均粒子直径は１４２ｎｍであった。少数の粒子は格別に大きく、一部は＞２５０ｎｍにも達した（図７Ａ）。三抱合体１：３ポリプレックスは、形状がより不均一であり、更に、未定義の粒子形状を有する大きな凝集体をもたらした（図７Ｂ）。これらは、長さが１５０ｎｍ～６５０ｎｍの範囲であり、平均粒子長は３１２ｎｍであり、その幅は８５ｎｍ～４００ｎｍの範囲であり、平均幅は１７５ｎｍであった。

実施例５．ＤＮＡｓｅ保護アッセイ．
成功裏のインビボ遺伝子送達は、ヌクレアーゼからの効率的な保護に依存する。分解からプラスミドを保護し、効率的な遺伝子送達を可能にする三抱合体の能力を決定するために、ポリプレックスをＤＮａｓｅＩで処理し、ゲル電気泳動を使用して分析した。図８に示されるように、裸プラスミドｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１ＤＮＡは、２単位のＤＮａｓｅＩと共に１０分間インキュベートした後、完全に分解された。対照的に、ポリプレックスがプラスミドと三抱合体を混合することによって生成された場合、プラスミドはＤＮａｓｅＩによる分解から保護された。プラスミドの完全な保護は三抱合体ポリプレックス１：３において観察されたが、プラスミドの超らせん（ｓ．ｃ．）から開環（ｏ．ｃ．）形態へのシフトにより示されるように、ある程度のニッキングが三抱合体ポリプレックス１：１において生じた。三抱合体ポリプレックス１：３によって付与されたＤＮａｓｅＩからの強い保護は、これらの複合体における追加のＰＥＧ－タンパク質単位により提供された立体障害の増加に起因し得る。実際、以前の研究は、酵素および血清因子とのそれらの相互作用を妨げることにより、ＰＥＩのＰＥＧ化がポリプレックスを安定させ、血中におけるそれらの循環を増加させることができることを示した［２４，２５］。

実施例６．標的三抱合体ポリプレックスの生物活性
ポリプレックスのサイズおよびξ電位は、標的ＤＮＡ送達および遺伝子発現の効率に影響を及ぼすが、サイズの作用は、特定の抱合体に依存するように思われる［２］［２１］。三抱合体ポリプレックス１：１および１：３のトランスフェクションの特異性および効率を評価するために、Ｈｅｒ－２を差示的に発現する２つの乳癌細胞系が利用された。三抱合体１：１および１：３のポリプレックスは、ｐＧｒｅｅｎＦｉｒｅ１を用いて形成され、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（約９×１０^３Ｈｅｒ－２受容体／細胞を発現する［２６］）およびＢＴ４７４細胞（約１×１０^６Ｈｅｒ－２受容体／細胞を発現する［２７］）にトランスフェクトされた。異なるルシフェラーゼ活性がトランスフェクションの４８時間後に観察された。三抱合体ポリプレックス１：１および１：３の両方は、ＢＴ４７４細胞において、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１よりも３００倍を超える高いルシフェラーゼ活性をもたらした（^＊ｐ＜０．００１）（図９Ａ）。ＢＴ４７４へのより効率的な遺伝子送達は、共焦点顕微鏡により見られるように、ＧＦＰ発現によって確認された（図９Ｂ）。これらの結果は、ポリプレックスの選択性がＨｅｒ－２発現に依存することを示す。

三抱合体ポリプレックス１：１によるＢＴ４７４細胞への標的送達は、三抱合体１：３がより多くの標的部分を有したにも関わらず、三抱合体ポリプレックス１：３による送達よりも１０倍効率的であった（図９Ａ、Ｂ）。これは、三抱合体ポリプレックス１：１のより高いξ電位およびより下位サイズを反映し得る。

正に帯電しているＬＰＥＩ系化学ベクターは顕著な毒性と関係する。したがって、我々は、次に、三抱合体ポリプレックス１：１および１：３での処理後のＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＢＴ４７４細胞の生存を試験した。メチレンブルーアッセイにおいて、いずれのポリプレックスもＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞において細胞毒性作用を示さなかった。類似する結果が三抱合体ポリプレックス１：３で処理したＢＴ４７４細胞において観察された。しかしながら、細胞の細胞毒性において、わずかな増加が三抱合体ポリプレックス１：１で処理したＢＴ４７４において観察された（図９Ｃ）。まとめると、これらの結果は、サイズが小さく、ξ電位が高い三抱合体ポリプレックス１：１が、毒性のわずかな増加を伴って、効率的な標的送達特性を付与することを示す。よって、三抱合体１：１のポリプレックスは、遺伝子送達において、より保護された三抱合体ポリプレックス１：３よりも優れている。

実施例７．ＰＥＩ－ＰＥＧ－Ｈｅｒ２アフィボディの抗腫瘍活性
ポリイノシン－ポリシトシン（ＰｏｌｙＩＣ）と複合体を形成するＰＥＩ－ＰＥＧ－Ｈｅｒ２アフィボディ（ＰＰＨＡ）は強い抗腫瘍活性を有する。Ｈｅｒ－２を過剰発現する乳癌細胞系は、ＰｏｌｙＩＣとのＰＥＩ－ＰＥＧ－Ｈｅｒ２アフィボディの複合体により強く阻害されることが分かった。強い阻害は、トラスツズマブ耐性Ｈｅｒ２過剰発現乳癌細胞系のものでも観察された。

図１０は、ベクター／ポリプレックスがハーセプチン／トラスツズマブ耐性細胞を含む、Ｈｅｒ２過剰発現細胞を阻害することを示す。

０．５×１０^６ＭＣＦ－７ＨＥＲ－２細胞をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が平均１００ｍｍ^３に達した後、処置を開始した。１ｍｇ／ｋｇのｐＩＣ／ＰＰＨＡを２４時間ごとに静脈内注射した。２つのマウス群に、週に１回（矢印で示される）、トラスツズマブを静脈内投与した。腫瘍成長は週に２回測定された。複合体ＰｏｌｙＩＣ／ＰＰＨＡは、図１１に例示されるように、これらの細胞系がヌードマウスに移植されたマウスモデルにおいて、強い抗腫瘍活性を有することが分かった。

実施例８．ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ＥＧＦＲアフィボディの合成
５ｍｇ（２×１０^－４ｍｍｏｌ）のＬＰＥＩ－ＰＥＧ_２ｋ－ＯＰＳＳ（二抱合体１：１）を、１ｍｌの２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。次に、ＨＢＳ中の３．４ｍｇ（３．８×１０^－４ｍｍｏｌ、約２当量）のＥＧＦＲアフィボディを滴下して反応物に添加した。溶解度を増加させるために、４ｍｌの２０ｍＭＨＥＰＥＳと７００μＬのアセトニトリル（ＨＰＬＣグレード）を反応ミックスに導入した。Ａ_３４３が完全なターンオーバーを示すまで、反応物を室温および暗条件で更にボルテックスにかけた（８００ｒｐｍ）。ＭａｃｒｏＰｒｅｐＨｉｇｈＳ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）で充填されたＨＲ１０／１０カラム上で、陽イオン交換クロマトグラフィーにより（２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）から３ＭＮａＣｌを含有する２０ｍＭＨＥＰＥＳの３段階勾配溶離を使用する）、得られた三抱合体を精製した。溶出した画分を分析用ＲＰ－ＨＰＬＣに導入して、ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ＥＧＦＲ三抱合体の純度を評価し、９５％以上の純度の画分は組み合わされ、－８０°Ｃに維持された。三抱合体の濃度は銅アッセイにより決定された。抱合したタンパク質の量は、Ｎａｎｏ－Ｄｒｏｐ２０００を使用して、Ａ_２８０により決定された。

実施例９．ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＥＧＦＲアフィボディの抗腫瘍活性
ＰｏｌｙＩＣと複合体を形成するＰＥＩ－ＰＥＧ－ＥＧＦＲアフィボディ（ＰＰＥＡ）は強い抗腫瘍活性を有する。ＥＧＦＲを過剰発現する様々な細胞系は、ポリイノシン／ポリシトシン（ＰｏｌｙＩＣ）と複合体を形成するＰＥＩ－ＰＥＧ－ＥＧＦＲアフィボディ（ＰＰＥＡ）の複合体によって強く阻害されることが分かった。ＰＰＥＡの有効性はＰＰＥよりも高いことが分かる（図１２Ａ、図１２Ｂ）。

複合体ＰｏｌｙＩＣ／ＰＰＥＡは、これらの細胞系がヌードマウスに移植されたマウスモデルにおいて、強い抗腫瘍活性を有することが分かった。

５周齢の６５匹の雌のヌードマウスに、２００万個のＡ４３１細胞を皮下注射した。７日後、平均体積が１３６ｍｍ^３の腫瘍が成長し、以下のようにマウスを６つの群（７～８匹のマウス／群）に分けた：ＵＴ；ｐＩＣ／ＰＰＥＡ、２５グラムのマウスに関して０．７５ｍｇ／ｋｇ＝２５０μｌのｐＩＣ、ＩＣ、６／週；ｐＩ／ＰＰＥＡ、０．７５ｍｇ／ｋｇＩＶ、６／週；ｐＩＣ／ＰＰＥＡ低、２５グラムのマウスに関して０．１ｍｇ／ｋｇ＝２５０μｌの０．０１μｇ／μｌｐｆｐＩＣ、ＩＣ、６／週。ｐＩＣ、ｐＩならびにＰＰＥおよびＰＰＥＡは、複合体において通常（０．１μｇ／μｌ）よりも低い濃度のｐＩＣを得るために、混合前に希釈された。図１３は、インビボにおけるＰｏｌｙＩＣ／ＰＰＥｆｆｉｂｏｄｙの活性を示す。同じく、ＰＰＥＡ／ＰｏｌｙＩＣの有効性はＰｏｌｙＩＣ／ＰＰＥよりも高い。

実施例１０．ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ｈ／ｍＥＧＦの合成
１０．１．ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ＳＨ中間体の合成

５ｍｌの２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）緩衝液中の５ｍｇのＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ＯＰＳＳ（０．２μｍｏｌ、２４０００ｇ／ｍｏｌにより）に、５０倍モル過剰のジチオスレイトール（ＤＴＴ；０．１ｍｍｏｌ，１．５ｍｇ）を添加し、１５ｍｌのプラスチック製遠心分離チューブ中で、室温で２０分間、ボルテックスにより混合した。還元したニ抱合体を、５ｍｌのサンプルループを使用して、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５カラム（２０ｍｌ，４×５ｍｌ）上で分離し、溶出を、１．０ｍｌ／分の流量で、２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を用いて実施し、上述と同じ条件および方法を用いてＨＰＬＣにより分析した。

エルマンアッセイは、ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ＳＨ中間体におけるスルフヒドリル基濃度を評価するために使用された。ＳＨ基の濃度は、エルマン試薬と定量的に反応する遊離チオールにより放出される、発色団６－ニトロ－３－チオキソシクロヘキサ－１，４－ジエン－１－カルボン酸の濃度と正比例する。発色団は、サンプルまたはエルマン試薬からいずれの干渉もなく、４１２ｎｍでの吸光度を介して測定された。

１０．２ｍ／ｈＥＧＦ－ＭＣＣ中間体の合成
合成概要．ｈ／ｍＥＧＦ（ヒト／マウス上皮成長因子）をｈ／ｍＥＧＦ－ＭＣＣ（ＥＧＦ－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸；ＭＣＣ）に修飾し、後にＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ＳＨとの抱合に使用するために精製した。ＭＣＣ基を付加することによってｈ／ｍＥＧＦを活性化することにより、ＤＴＴによるタンパク質の減少を回避し、ｈ／ｍＥＧＦの過酷な条件への曝露を回避することを可能にする。このように、抱合反応の効率は改善され、更に、－ＥＧＦ－ＭＣＣは、数週間、－８０℃で保管することができる安定した材料である。

ｈＥＧＦ－ＭＣＣの合成：１ｍｇのｈＥＧＦ（１６０ｎｍｏｌ）を０．５ｍｌの水中で再構築し、次にアルゴンで脱気した。ｈＥＧＦの量は、ｎａｎｏ－ｄｒｏｐ２０００を使用して、２８０ｎｍで決定された。激しく混合しながら、溶液を０．５ｍｌの２００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）および６０％エタノールに添加した。アルゴン下で、溶液を、０．５ｍｌの１００％エタノール中の１０当量の４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸３－スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステルナトリウム塩（スルホ－ＳＭＣＣ）と混合した。わずかに酸性ｐＨの反応混合物（ｐＨ６）は、ｈＥＧＦのＮ末端アミノ基を選択的に修飾するために必要であった。室温で４時間後、官能化されたペプチドを、１時間１Ｌで３回、次いで一晩にわたって１Ｌで、ＨＢＳ（１００ｍＭ）に対して透析バック（３．５ｋカットオフ）により精製した。ＨＰＬＣ－質量スペクトル（ＭＳ）を使用して、ｈＥＧＦ－ＭＣＣを分析し、スルホ－ＳＭＣＣのｈＥＧＦへの抱合が１つ存在することを示す、６４３５．７ｇ／ｍｏｌの分子量を有した。ＨＰＬＣ－ＭＳ分析は、逆相Ｃ－１８カラム（ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ａｅｒｉｓ，３．６μｍ，２．１ｍｍ×５０ｍｍ，１００Ａ^０）を装備したＴｈｅｒｍｏＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ／ＬＣＱＦＬＥＥＴを使用して実施された。

ｍＥＧＦ－ＭＣＣの合成：０．５ｍｇ（０．０８８μｍｏｌ総量）のマウスＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を、２１００μＬの２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液に溶解し、透明で粘稠な溶液を形成した。１ｍｇのスルホ－ＳＭＣＣ（３０当量，Ｏｒｎａｔ，ＩＬ）を、０．９ｍＬの無水ＥｔＯＨに溶解し、合計３．０ｍｌの容量中３０％ＥｔＯＨの最終濃度を達成するように、ＥＧＦ溶液とゆっくり混合した。短時間の混合は透明な溶液をもたらした。反応槽を周囲温度で４時間振盪させた。その期間後、溶液は透明のままであった。ｍＥＧＦ－ＭＣＣを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２５カラム（４×５ｍｌ）上で最初に分離し、溶出を、１．０ｍｌ／分の流量で、２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）を用いて実施し、更に精製し、ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ＯＰＳＳに関して上述した同じ条件および標準方法を用いてＨＰＬＣにより分析した。

１０．３ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ｈ／ｍＥＧＦの合成
ｈＥＧＦ－ＭＣＣまたはｍＥＧＦ－ＭＣＣの当量の１．５を、１．０当量のＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ＳＨと混合した。反応混合物を、最初に室温で２時間撹拌し、次に、ゆっくり振盪させながら、＋４℃で４日間インキュベートした。０．５ｍｌ／分の流量で、Ａ１８緩衝液注入口を介して勾配ポンプを使用して、ならびに溶媒Ａ：２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および溶媒Ｂ：２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）ＮａＣｌ３．０Ｍを使用して、陽イオン交換クロマトグラフィー（１０／１ｃｍＴｒｉｃｏｒｎＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅカラムにおいて７．８ｃｍＭａｃｒｏＰｒｅｐＨｉｇｈＳ樹脂（ＢｉｏＲａｄ））により、反応生成物（ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ｈＥＧＦまたはＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ｍＥＧＦ）を分離した。精製したＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ｈＥＧＦまたはＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ｍＥＧＦ三抱合体をＨＰＬＣにより分析し、「銅アッセイ」およびＥＧＦ光度アッセイにより定量化して、それぞれ、［ＬＰＥＩ］および［ＥＧＦ］濃度を測定した。

１０．４ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ｈＥＧＦの生物活性．
我々が通常利用する細胞アッセイを使用して、ＰｏｌｙＩＣ／ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ｈＥＧＦ複合体（ＰＰＥｍ）の活性を、ＳｃｈａｆｆｅｒｔＤ，ＫｉｓｓＭ，ＲoｄｌＷ，ＳｈｉｒＡ，ＬｅｖｉｔｚｋｉＡ，ＯｇｒｉｓＭ，ＷａｇｎｅｒＥ．，２０１１（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｕｍｏｒｇｒｏｗｔｈｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥＧＦ－ｒｅｃｅｐｔｏｒｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｔｕｍｏｒｓｕｓｉｎｇＥＧＦ－ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ－ｌｉｎｅａｒｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅａｓｃａｒｒｉｅｒ．ＰｈａｒｍＲｅｓ．２８：７３１－４１）に記載されるＰｏｌｙＩＣ／ｍＰＰＥ（マウス）と比較した。新しいＨＥＧＦ抱合体はＥＧＦＲ過剰発現細胞の死滅においてより有効であることが分かった（図１４）。適量のＥＧＦＲ分子をそれらの表面上に発現する細胞（Ｕ８７ＭＧ細胞は８０，０００個のＥＧＦＲ／細胞を発現する）は、莫大な量を過剰発現する細胞（Ｕ８７ＭＧｗｔＥＧＦＲ細胞は１，０００，０００個のＥＧＦＲ／細胞を発現する）よりも治療にあまり感受性ではない。

実施例１１．ＤＵＰＡ類似体－ＤｙＬｉｇｈｔ６８０の合成
固体支持体としてのＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）ワング樹脂に対して標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）手順を使用して、ペプチドを合成した。膨潤：ジクロロメタン中で少なくとも２時間、樹脂を膨潤させた。Ｆｍｏｃの除去：ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％ピペリジンの溶液で樹脂を最初に処理し（２×２０分）、次に、ＤＭＦ（５×２分）で洗浄した。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨのカップリング：３当量のＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、３当量の（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート）（ＨＡＴＵ）を１５ｍｌのＤＭＦに溶解し、８当量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡまたはＤＩＰＥＡ）を混合物に添加した。１時間、樹脂に添加する前に、溶液を室温で１０分間混合した（事前活性化）。アスパラギン酸の完全なカップリングを確実にするために、新しい混合物でカップリングを２回繰り返した。完全なカップリングを確実にするために、カイザー試験を実施した。樹脂を、ＤＭＦ（３×２分）およびジクロロメタン（ＤＣＭ）（２×２分）で洗浄した。キャッピング：樹脂を無水酢酸（１０当量）およびＤＭＦ中のＤＩＰＥＡ（８当量）の溶液で２０分間処理し、ＤＭＦ（３×２分）で洗浄した。Ｆｍｏｃの除去：ＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で樹脂を最初に処理し（２×２０分）、次に、ＤＭＦで洗浄した（５×２分）。Ｆｍｏｃ－ジアミノプロピオン（ＤＡＰ）酸のカップリング：３当量のＦｍｏｃ－ジアミノプロピオン（ＤＡＰ）酸、３当量のＨＡＴＵ、および８当量のＤＩＥＡを、１５ｍｌのＤＭＦに溶解した。１時間、樹脂に添加する前に、溶液を室温で１０分間混合した（事前活性化）。完全なカップリングを確実にするために、カイザー試験を実施した。樹脂を、ＤＭＦ（３×２分）およびＤＣＭ（２×２分）で洗浄した。ペプチド伸長：次の化合物を以下の順序で樹脂にカップリングした：（１）Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、（２）Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、（３）Ｆｍｏｃ－８－アミノオクタン（ＥＡＯ）酸、および（４）ＯｔＢｕ－Ｇｌｕ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ。Ｆｍｏｃの除去：ＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で樹脂を処理し（２×２０分）、次に、ＤＭＦ（５×２分）およびＤＣＭ（３×２分）で洗浄した。ＤＵＰＡリガンドのカップリング：０．９ｍＬのトリエチルアミン（６．６ｍｍｏｌ）を、１５ｍＬのＤＣＭ中の０．９グラム（３ｍｍｏｌ）のＬ－グルタミン酸ジ－ｔｅｒｔブチルエステル塩酸塩と組み合わせた。この溶液を、４５分にわたって０℃の５ｍＬのＤＣＭおよびトリホスゲン（０．３５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して添加した。更に５０分間撹拌した後、混合物を追加の０．９ｍＬのトリエチルアミンと共に樹脂に添加した。樹脂を含む反応混合物を３時間振盪し、ＤＭＦ（３×２分）で洗浄した。完全な切断：樹脂をＤＣＭで洗浄し（３×２分）、真空下で乾燥させた。０℃のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の２．５％ＴＤＷおよび２．５％トリイソプロピルシランの溶液を添加した。反応を室温で４時間進ませ、濾過し、エーテル／ヘキサン１：１の冷却した溶液で処理し、遠心分離によりペプチドを沈殿させた。粗ペプチドをアセトニトリル／ＴＤＷ１：１溶液に溶解し、凍結乾燥させた。分取逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣにより、粗生成物を精製した。ＤｙＬｉｇｈｔ６８０カップリング：アルゴン雰囲気下で、１ｍｇのＤｙＬｉｇｈｔ（商標）６８０（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号４６４１８）を、５０当量の無水ジイソプロピルエチルアミンを含有する無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；１００μＬ）に溶解した。無水ＤＭＳＯ（１００μＬ）に溶解された２倍モル過剰のＤＵＰＡペプチドリンカーを上記の混合物に添加し、室温で撹拌した。生成物の形成は、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）により確認された。次に、粗ＤＵＰＡ近赤外（ＮＩＲ）プローブを分取ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。

実施例１２．Ｄｕｐａ類似体－薬物リードの合成
固体支持体としてのＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔｒｔ）ワング樹脂に対して標準的なＦｍｏｃＳＰＰＳ手順を使用して、ペプチドを合成した。膨潤：ジクロロメタン中で少なくとも２時間、樹脂を膨潤させた。Ｆｍｏｃの除去：ＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で樹脂を処理し（２×２０分）、次に、ＤＭＦで洗浄した（５×２分）。Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨのカップリング：３当量のＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨおよび３当量のＨＡＴＵを１５ｍｌのＤＭＦに溶解し、続いて８当量のＤＩＥＡを添加した。１時間、樹脂に添加する前に、溶液を室温で１０分間混合した（事前活性化）。新しい混合物でカップリングを２回繰り返した。完全なカップリングを確実にするために、カイザー試験を実施した。樹脂を、ＤＭＦ（３×２分）およびＤＣＭ（２×２分）で洗浄した。キャッピング：樹脂を無水酢酸（１０当量）およびＤＭＦ中のＤＩＰＥＡ（８当量）の溶液で２０分間処理し、ＤＭＦ（３×２分）で洗浄した。Ｆｍｏｃの除去：ＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で樹脂を処理し（２×２０分）、次に、ＤＭＦで洗浄した（５×２分）。Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨのカップリング：３当量のＦｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、３当量のＨＡＴＵ、および８当量のＤＩＥＡを１５ｍｌのＤＭＦに溶解した。１時間、樹脂に添加する前に、溶液を室温で１０分間混合した（事前活性化）。完全なカップリングを確実にするために、カイザー試験を実施した。樹脂を、ＤＭＦ（３×２分）およびＤＣＭ（２×２分）で洗浄した。ペプチド伸長：次の化合物を以下の順序で樹脂にカップリングした：（１）Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、（２）Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、（３）Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、（４）Ｆｍｏｃ－８－アミノオクタン（ＥＡＯ）酸、および（５）ＯｔＢｕ－Ｇｌｕ（Ｆｍｏｃ）－ＯＨ。Ｆｍｏｃの除去：ＤＭＦ中２０％ピペリジンの溶液で樹脂を処理し（２×２０分）、次に、ＤＭＦ（５×２分）およびＤＣＭ（３×２分）で洗浄した。ＤＵＰＡリガンドのカップリング：０．９ｍＬのトリエチルアミン（６．６ｍｍｏｌ）を、１５ｍＬのＤＣＭ中の０．９グラム（３ｍｍｏｌ）のＬ－グルタミン酸ジ－ｔｅｒｔブチルエステル塩酸塩と組み合わせた。この溶液を、４５分にわたって０℃の５ｍＬのＤＣＭおよびトリホスゲン（０．３５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して添加した。更に５０分間撹拌した後、混合物を追加の０．９ｍＬのトリエチルアミンと共に樹脂に添加した。樹脂を含む反応混合物を３時間振盪し、ＤＭＦ（３×２分）で洗浄した。完全な切断：樹脂をＤＣＭで洗浄し（３×２分）、真空下で乾燥させた。０℃のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中の２．５％ＴＤＷおよび２．５％トリイソプロピルシランの溶液を添加した。反応を室温で４時間進ませ、濾過し、エーテル／ヘキサン１：１の冷却した溶液で処理し、遠心分離によりＤＵＰＡ類似体を含有するペプチドを沈殿させた。粗ペプチドをアセトニトリル／ＴＤＷ１：１溶液に溶解し、凍結乾燥させた。粗生成物を分取ＲＰ－ＨＰＬＣにより精製した。ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＤＵＰＡ類似体の合成：４．３７ｍｇ（１．２×１０^－４ｍｍｏｌ）の二抱合体１：１または１：３（上記の本明細書の実施例１に説明されるように調製された）を、９４０μｌの２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に溶解した。次に、１：１の比率の２ｍｌのアセトニトリル（ＡＣＮ；ＨＰＬＣグレード）／（２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））に溶解した、１ｍｇ（９．１×１０^－４ｍｍｏｌ、約５当量）のＤＵＰＡ類似体を、反応物に滴下して添加した。次に、反応物中概算約１０％全濃度のＡＣＮに達するように、追加の４ｍＬの２０ｍＭを反応混合物に導入した。波長３４３（Ａ_３４３）での吸収が完全なターンオーバーを示すまで、室温の暗所で、反応物を更にボルテックスにかけた（８００ｒｐｍ）。ＭａｃｒｏＰｒｅｐＨｉｇｈＳ樹脂（ＢｉｏＲａｄ）で充填されたＨＲ１０／１０カラム上で、陽イオン交換クロマトグラフィーにより（２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）から３ＭＮａＣｌを含有する２０ｍＭＨＥＰＥＳの３段階勾配溶離を使用する）、得られた三抱合体を精製した。溶出した画分を分析用ＲＰ－ＨＰＬＣに導入して、三抱合体の純度を評価した。９５％以上の純度を有する画分は組み合わされ、－８０°Ｃで維持された。三抱合体の濃度は銅アッセイにより決定された。抱合されたＤＵＰＡ類似体の量は、発色団（Ｔｒｐアミノ酸）吸収により決定された。

実施例１３．ＰｏｌｙＩＣ／ＬＰＥＩ－ＰＥＧ－ＤＵＰＡは前立腺癌を標的とする．
前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）は、転移性前立腺癌において過剰発現される。これは大半の固形腫瘍の新生血管系においても見られる。ＰＳＭＡはリガンド結合時に内在化されるため、我々は、これを標的として選択し、ＰｏｌｙＩＣＰＳＭＡ標的ベクターを設計および合成する。実際、ＤＵＰＡ－Ｄａｙｌｉｇｈｔ６８０は、ＰＳＭＡ過剰発現細胞（ＬＮＣａＰ）に内在化されるが、ＭＣＦ７（過剰発現Ｈｅｒ２）（図示せず）には内在化されない。

図１５は、ＰＥＩ－ＰＥＧ－ＤＵＰＡ（ＰＰＤ）／ＰｏｌｙＩＣがＬＮＣａＰおよびＶＣａＰ細胞に対して高度に有効であることを示す。生存率は曝露の９６時間後に測定された。ＰＰＤはサイトカインの生成も誘導する（図１６Ａ、図１６Ｂ）。図１７において、ＬＮＣａＰ細胞により条件付けされた培地が、条件付けされた倍中で成長したＰＢＭＣにおいて、サイトカインＩＮＦ－γ、ＩＬ－２、およびＴＮＦ－αの発現を刺激することを示す。その後、ＰｏｌｙＩＣ／ＰＰＤ処理されたＬＮＣａＰ細胞と、ＰＳＭＡを発現しないＰＣ３－ルシフェラーゼ細胞の同時インキュベーションが、バイスタンダー効果により、最大７０％のＰＣ３－ルシフェラーゼ細胞の死滅をもたらしたことを示した。健康なヒトＰＢＭＣの付加は、効果を強く増強し、９０％のＰＣ３細胞の死滅につながる（図１８）。

実施例１４．インビボでの癌治療．
ＰｏｌｙＩＣ／ＰＰＤは、ＳＣＩＤマウスで試験された際、顕著な抗腫瘍作用を有する（図１９）。腫瘍阻害は、実験マウスにおける免疫系の欠如により完了していない。

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［項目１］
２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）とポリマー抱合体とのポリプレックスであって、ポリマー抱合体が、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に共有結合された直鎖ポリエチレンイミン（ＬＰＥＩ）からなり、各ＰＥＧ部分が、癌抗原に結合することができる標的部分にリンカーを介して抱合されているが、但し、標的部分が、マウスＥＧＦまたは配列ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ（ＧＥ１１）（配列番号１）のペプチドでないことを条件とする、ポリプレックス。
［項目２］
ｄｓＲＮＡが、ポリイノシン－ポリシチジル酸の２本鎖ＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）であり、ポリマー抱合体が、１つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ－ＰＥＧ１：１）または３つのＰＥＧ部分（ＬＰＥＩ－ＰＥＧ１：３）に共有結合されたＬＰＥＩからなり、癌抗原が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、または前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）である、項目１に記載のポリプレックス。
［項目３］
１つ以上のＰＥＧ部分が各々独立して、ＬＰＥＩと－ＮＨ－ＣＯ－結合、およびリンカーと、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ－、－Ｓ－Ｓ－、－Ｏ－ＣＯ－、または－ＣＯ－Ｏ－から選択される結合を形成する、項目１に記載のポリプレックス。
［項目４］
１つ以上のＰＥＧ部分の１つ１つが、ＬＰＥＩおよびリンカーと－ＮＨ－ＣＯ－結合を形成する、項目３に記載のポリプレックス。
［項目５］
リンカーが、標的部分と－Ｓ－Ｓ－、ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－Ｓ－Ｃ－、Ｏ－ＣＯ－、－ＣＯ－Ｏ－、または尿素（－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ）結合を形成する、項目１から項目４のいずれか一項に記載のポリプレックス。
［項目６］
リンカーが、－ＣＯ－Ｒ_２－Ｒ_ｘ－Ｒ_３、または３～７個のアミノ酸残基からなるペプチド部分から選択され、
式中、
Ｒ_２が、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルケニレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルキニレン、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリーレン－ジイル、またはヘテロアリーレンジイルから選択され、
Ｒ_ｘが、不在であるか、または－Ｓ－であり、
Ｒ_３が、不在であるか、または式
［化１］

のものであり、
Ｒ_４が、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルケニレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルキニレン、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン－（Ｃ_３－Ｃ_８）シクロアルキレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルケニレン－（Ｃ_３－Ｃ_８）シクロアルキレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルキニレン－（Ｃ_３－Ｃ_８）シクロアルキレン、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリーレン－ジイル、ヘテロアリーレンジイル、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン－（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリーレン－ジイル、または（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン－ヘテロアリーレンジイルから選択され、
（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン、（Ｃ_２－Ｃ_８）アルケニレン、または（Ｃ_２－Ｃ_８）アルキニレンの１つ１つが、任意に、ハロゲン、－ＣＯＲ_５、－ＣＯＯＲ_５、－ＯＣＯＯＲ_５、－ＯＣＯＮ（Ｒ_５）_２、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＳＲ_５、－ＯＲ_５、－Ｎ（Ｒ_５）_２、－ＣＯＮ（Ｒ_５）_２、－ＳＯ_２Ｒ_５、－ＳＯ_３Ｈ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒ_５、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール、（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレン－（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール、ヘテロアリール、または（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレン－ヘテロアリールから各々独立して選択される１つ以上の基によって置換され、更に任意に、Ｓ、Ｏ、もしくはＮから選択される１つ以上の同一もしくは異なるヘテロ原子、および／または－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－Ｎ（Ｒ_５）－、－Ｎ（Ｃ_６－Ｃ_１０アリール）－、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリーレン－ジイル、もしくはヘテロアリーレンジイルから各々独立して選択される少なくとも１つの基によって中断され、
Ｒ_５が、Ｈまたは（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキルである、項目５に記載のポリプレックス。
［項目７］
Ｒ_２が、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン、好ましくは（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレンから選択され、任意に、ハロゲン、－ＣＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＯＣＯＯＨ、－ＯＣＯＮＨ_２、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＳＨ、－ＯＨ、－ＮＨ_２、－ＣＯＮＨ_２、－ＳＯ_２Ｈ、－ＳＯ_３Ｈ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｈ、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール、（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレン－（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリール、ヘテロアリール、または（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレン－ヘテロアリールから各々独立して選択される１つ以上の基によって置換され、更に任意に、Ｓ、Ｏ、もしくはＮから選択される１つ以上の同一もしくは異なるヘテロ原子、および／または－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＯ－ＮＨ－、－ＮＨ－、－Ｎ（Ｃ_１－Ｃ_８アルキル）－、－Ｎ（Ｃ_６－Ｃ_１０アリール）－、（Ｃ_６－Ｃ_１０）アリーレン－ジイル、もしくはヘテロアリーレンジイルから各々独立して選択される少なくとも１つの基によって中断される、項目６に記載のポリプレックス。
［項目８］
Ｒ_２が、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン、好ましくは（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレンから選択される、項目７に記載のポリプレックス。
［項目９］
Ｒ_ｘが、－Ｓ－である、項目６に記載のポリプレックス。
［項目１０］
Ｒ_３が、不在であるか、または
［化２］

であり、式中、
Ｒ_４が、（Ｃ_１－Ｃ_８）アルキレン－（Ｃ_３－Ｃ_８）シクロアルキレン、好ましくは（Ｃ_１－Ｃ_４）アルキレン－（Ｃ_５－Ｃ_６）シクロアルキレンである、項目６に記載のポリプレックス。
［項目１１］
Ｒ_２が、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－であり、
Ｒ_ｘが、－Ｓ－であり、
Ｒ_３が、不在であるか、または
［化３］

であり、式中、Ｒ_４が、
［化４］

である、項目６から項目１０のいずれか一項に記載のポリプレックス。
［項目１２］
ペプチド部分が、そのメルカプト基を介して標的部分に連結される、－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－（配列番号２）または－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－（ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ（ＮＨ_２）－ＣＯ）－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－（配列番号３）である、項目６に記載のポリプレックス。
［項目１３］
ポリマー抱合体が、標的部分（単数／複数）に連結される、式（Ｉ）～（ＶＩＩＩ）の二抱合体である、項目１から項目１２のいずれか一項に記載のポリプレックス：
（Ｉ）
［化５］

、
（ＩＩ）
［化６］

、
（ＩＩＩ）－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－（ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ（ＮＨ_２）－ＣＯ）－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－ＰＥＧ_２ｋ－ＬＰＥＩ、
（ＩＶ）－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＰＥＧ_２ｋ－ＬＰＥＩ、
（Ｖ）
［化７］

、
（ＶＩ）
［化８］

、
（ＶＩＩ）
［化９］

（式中、Ｒ_６が、
［化１０］

である）、または
（ＶＩＩＩ）
［化１１］

（式中、Ｒ_７が、
［化１２］

である）。
［項目１４］
（ａ）標的部分が、ＨＥＲ２アフィボディであり、ポリマー抱合体が、式（Ｉ）のものであり、ＨＥＲ２アフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｂ）標的部分が、ＨＥＲ２アフィボディであり、ポリマー抱合体が、式（Ｖ）のものであり、ＨＥＲ２アフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｃ）標的部分が、ＥＧＦＲアフィボディであり、ポリマー抱合体が、式（Ｉ）のものであり、ＥＧＦＲアフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｄ）標的部分が、ＥＧＦＲアフィボディであり、ポリマー抱合体が、式（Ｖ）のものであり、ＥＧＦＲアフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｅ）標的部分が、ｈＥＧＦであり、ポリマー抱合体が、式（ＩＩ）のものであり、ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される、
（ｆ）標的部分が、ｈＥＧＦであり、ポリマー抱合体が、式（ＶＩ）のものであり、ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される、
（ｇ）標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が、式（ＩＩＩ）のものである、
（ｈ）標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が、式（ＶＩＩ）のものである、
（ｉ）標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が、式（ＩＶ）のものである、あるいは
（ｊ）標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が、式（ＶＩＩＩ）のものである、項目１３に記載のポリプレックス。
［項目１５］
ＥＧＦＲアフィボディが、配列番号４に記載されるアミノ酸配列のものであり、ＨＥＲ２アフィボディが、配列番号５に記載されるアミノ酸配列のものである、項目１４に記載のポリプレックス。
［項目１６］
薬学的に許容される担体および項目１から項目１５のいずれか一項に記載のポリプレックスを含む、薬学的組成物。
［項目１７］
ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌から選択される癌の治療に使用するための、項目１４または項目１５に記載のポリプレックス。
［項目１８］
ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌から選択される癌の治療に使用するための、項目１６に記載の薬学的組成物。
［項目１９］
ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌が、非小細胞肺癌、乳癌、膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、結腸直腸癌、腺癌、卵巣癌、膀胱癌、または前立腺癌、およびこれらの転移癌から選択される、項目１７に記載のポリプレックス。
［項目２０］
ポリプレックスが、下記（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）において定義される通りである、項目１９に記載のポリプレックス：
（ｃ）標的部分が、ＥＧＦＲアフィボディであり、ポリマー抱合体が、下記式（Ｉ）
（Ｉ）
［化１３］

のものであり、ＥＧＦＲアフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｄ）標的部分が、ＥＧＦＲアフィボディであり、ポリマー抱合体が、下記式（Ｖ）
（Ｖ）
［化１４］

のものであり、ＥＧＦＲアフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｅ）標的部分が、ｈＥＧＦであり、ポリマー抱合体が、下記式（ＩＩ）
（ＩＩ）
［化１５］

のものであり、ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される、
（ｆ）標的部分が、ｈＥＧＦであり、ポリマー抱合体が、下記式（ＶＩ）
（ＶＩ）
［化１６］

のものであり、ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される。
［項目２１］
ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌が、乳癌、卵巣癌、胃癌、および子宮の漿液性子宮内膜癌などの侵攻性形態の子宮癌から選択される、項目１７に記載のポリプレックス。
［項目２２］
ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌が、ハーセプチン／トラスツズマブ耐性癌である、項目２１に記載のポリプレックス。
［項目２３］
ポリプレックスが、下記（ａ）、（ｂ）、（ｅ）、または（ｆ）において定義される通りである、項目２１または項目２２に記載のポリプレックス：
（ａ）標的部分が、ＨＥＲ２アフィボディであり、ポリマー抱合体が、下記式（Ｉ）
（Ｉ）
［化１７］

のものであり、ＨＥＲ２アフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｂ）標的部分が、ＨＥＲ２アフィボディであり、ポリマー抱合体が、下記式（Ｖ）
（Ｖ）
［化１８］

のものであり、ＨＥＲ２アフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｅ）標的部分が、ｈＥＧＦであり、ポリマー抱合体が、下記式（ＩＩ）
（ＩＩ）
［化１９］

のものであり、ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される、
（ｆ）標的部分が、ｈＥＧＦであり、ポリマー抱合体が、下記式（ＶＩ）
（ＶＩ）
［化２０］

のものであり、ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される。
［項目２４］
癌が、前立腺癌であり、ポリプレックスが、下記（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、または（ｊ）において定義される通りである、項目１７に記載のポリプレックス：
（ｇ）標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が、下記式（ＩＩＩ）
（ＩＩＩ）－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－（ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ（ＮＨ_２）－ＣＯ）－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－ＰＥＧ_２ｋ－ＬＰＥＩ
のものである、
（ｈ）標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が、下記式（ＶＩＩ）
（ＶＩＩ）
［化２１］

（式中、Ｒ_６が、
［化２２］

である）のものである、
（ｉ）標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が、下記式（ＩＶ）
（ＩＶ）－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＰＥＧ_２ｋ－ＬＰＥＩ
のものである、
（ｊ）標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、ポリマー抱合体が、下記式（ＶＩＩＩ）
（ＶＩＩＩ）
［化２３］

（式中、Ｒ_７が、
［化２４］

である）のものである。
［項目２５］
項目２から項目１５のいずれか一項に記載のポリプレックスであって、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌からなる群から選択される癌を治療するために、必要とする対象に投与される、ポリプレックス。
［項目２６］
ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、ＨＥＲ２過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌から選択される癌を治療するための、薬学的に許容される担体および項目２から項目１５のいずれか一項に記載のポリプレックスを含む、薬学的組成物。
［項目２７］
免疫細胞と組み合わせて使用するための、項目１７および項目１９から項目２４のいずれか一項に記載のポリプレックス。
［項目２８］
免疫細胞と組み合わせて使用するための、項目２６に記載の薬学的組成物。
［項目２９］
免疫細胞が、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ－ＴＩＬ）、腫瘍特異的遺伝子操作Ｔ細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、項目２７に記載のポリプレックス。
［項目３０］
免疫細胞が、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ－ＴＩＬ）、腫瘍特異的遺伝子操作Ｔ細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、項目２８に記載の薬学的組成物。

Claims

２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）とポリマー抱合体とのポリプレックスであって、前記ｄｓＲＮＡが、ポリイノシン－ポリシチジル酸の２本鎖ＲＮＡ（ポリＩ：Ｃ）であり、各ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分が、癌抗原に結合することができる標的部分にリンカーを介して抱合されており、前記癌抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、または前立腺表面膜抗原（ＰＳＭＡ）であり、
前記ポリマー抱合体が、前記標的部分（単数／複数）に連結される、式（Ｉ）～（ＶＩＩＩ）の二抱合体であり、
（Ｉ）

、
（ＩＩ）

、
（ＩＩＩ）－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－（ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ（ＮＨ_２）－ＣＯ）－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－ＰＥＧ_２ｋ－ＬＰＥＩ、
（ＩＶ）－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＰＥＧ_２ｋ－ＬＰＥＩ、
（Ｖ）

、
（ＶＩ）

、
（ＶＩＩ）

（式中、Ｒ_６が、

である）、または
（ＶＩＩＩ）

（式中、Ｒ_７が、

である）であり、ｍは２３３～６９７、ｎは４６～１８０であり、
（ｃ）前記標的部分が、ＥＧＦＲアフィボディであり、前記ポリマー抱合体が、前記式（Ｉ）のものであり、前記ＥＧＦＲアフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｄ）前記標的部分が、ＥＧＦＲアフィボディであり、前記ポリマー抱合体が、前記式（Ｖ）のものであり、前記ＥＧＦＲアフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｅ）前記標的部分が、ｈＥＧＦであり、前記ポリマー抱合体が、前記式（ＩＩ）のものであり、前記ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される、
（ｆ）前記標的部分が、ｈＥＧＦであり、前記ポリマー抱合体が、前記式（ＶＩ）のものであり、前記ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される、
（ｇ）前記標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、前記ポリマー抱合体が、前記式（ＩＩＩ）のものである、
（ｈ）前記標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、前記ポリマー抱合体が、前記式（ＶＩＩ）のものである、
（ｉ）前記標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、前記ポリマー抱合体が、前記式（ＩＶ）のものである、あるいは
（ｊ）前記標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、前記ポリマー抱合体が、前記式（ＶＩＩＩ）のものである、ポリプレックス。
前記ＥＧＦＲアフィボディが、配列番号４に記載されるアミノ酸配列のものである、請求項１に記載のポリプレックス。
薬学的に許容される担体および請求項１または２に記載のポリプレックスを含む、薬学的組成物。
ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌から選択される癌の治療に使用するための、請求項１または２に記載のポリプレックス。
ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌から選択される癌の治療に使用するための、請求項３に記載の薬学的組成物。
前記ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌が、非小細胞肺癌、乳癌、膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、結腸直腸癌、腺癌、卵巣癌、膀胱癌、または前立腺癌、およびこれらの転移癌から選択される、請求項４に記載のポリプレックス。
前記ポリプレックスが、下記（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、または（ｆ）において定義される通りである、請求項６に記載のポリプレックス：
（ｃ）前記標的部分が、ＥＧＦＲアフィボディであり、前記ポリマー抱合体が、下記式（Ｉ）
（Ｉ）

のものであり、前記ＥＧＦＲアフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｄ）前記標的部分が、ＥＧＦＲアフィボディであり、前記ポリマー抱合体が、下記式（Ｖ）
（Ｖ）

のものであり、前記ＥＧＦＲアフィボディが、そのメルカプト基を介して連結される、
（ｅ）前記標的部分が、ｈＥＧＦであり、前記ポリマー抱合体が、下記式（ＩＩ）
（ＩＩ）

のものであり、前記ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される、
（ｆ）前記標的部分が、ｈＥＧＦであり、前記ポリマー抱合体が、下記式（ＶＩ）
（ＶＩ）

のものであり、前記ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される。
前記ポリプレックスが、下記（ｅ）、または（ｆ）において定義される通りである、請求項４に記載のポリプレックス：
（ｅ）前記標的部分が、ｈＥＧＦであり、前記ポリマー抱合体が、下記式（ＩＩ）
（ＩＩ）

のものであり、前記ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される、
（ｆ）前記標的部分が、ｈＥＧＦであり、前記ポリマー抱合体が、下記式（ＶＩ）
（ＶＩ）

のものであり、前記ｈＥＧＦが、そのアミノ基を介して連結される。
前記癌が、前立腺癌であり、前記ポリプレックスが、下記（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、または（ｊ）において定義される通りである、請求項４に記載のポリプレックス：
（ｇ）前記標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、前記ポリマー抱合体が、下記式（ＩＩＩ）
（ＩＩＩ）－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－（ＮＨ－ＣＨ_２－ＣＨ（ＮＨ_２）－ＣＯ）－Ａｓｐ－Ｃｙｓ－ＰＥＧ_２ｋ－ＬＰＥＩ
のものである、
（ｈ）前記標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、前記ポリマー抱合体が、下記式（ＶＩＩ）
（ＶＩＩ）

（式中、Ｒ_６が、

である）のものである、
（ｉ）前記標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、前記ポリマー抱合体が、下記式（ＩＶ）
（ＩＶ）－（ＮＨ－（ＣＨ_２）_７－ＣＯ）－Ｐｈｅ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ｔｒｐ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－ＰＥＧ_２ｋ－ＬＰＥＩ
のものである、
（ｊ）前記標的部分が、ＨＯＯＣ（ＣＨ_２）_２－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－ＮＨ－ＣＯ－ＮＨ－ＣＨ（ＣＯＯＨ）－（ＣＨ_２）_２－ＣＯ－（ＤＵＰＡ残基）であり、前記ポリマー抱合体が、下記式（ＶＩＩＩ）
（ＶＩＩＩ）

（式中、Ｒ_７が、

である）のものである。
請求項１または２に記載のポリプレックスであって、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌からなる群から選択される癌を治療するために、必要とする対象に投与される、ポリプレックス。
ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌、および前立腺癌から選択される癌を治療するための、薬学的に許容される担体および請求項１または２に記載のポリプレックスを含む、薬学的組成物。
免疫細胞と組み合わせて使用するための、請求項４および請求項６から請求項９のいずれか一項に記載のポリプレックス。
免疫細胞と組み合わせて使用するための、請求項１１に記載の薬学的組成物。
前記免疫細胞が、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ－ＴＩＬ）、腫瘍特異的遺伝子操作Ｔ細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項１２に記載のポリプレックス。
前記免疫細胞が、腫瘍浸潤Ｔ細胞（Ｔ－ＴＩＬ）、腫瘍特異的遺伝子操作Ｔ細胞、または末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である、請求項１３に記載の薬学的組成物。