CN107073090A - 结合的疫苗装置和杀死癌细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于增加针对癌症的内源性免疫反应的组合物、方法和装置。装置和方法为抗癌主体提供治疗免疫性。

Description

结合的疫苗装置和杀死癌细胞的方法
相关申请
根据美国法典35U.S.C.§119(e)，本申请要求2014年4月30日递交的美国临时申请第61/986,600的优先权，该申请通过引证在此全部并入本文。
政府支持
本发明在国家卫生研究院赞助的政府支持下完成，授权号R01EB015498。政府享有本发明的某些权利。
背景技术
许多癌症能够指派宿主免疫系统并避开内源性的抗肿瘤免疫反应，因此对治疗是有反抗力的。癌细胞避开免疫系统的一个机理是上调免疫-抑制性蛋白质。因此，能够阻断这些免疫-抑制性蛋白质的试剂已经被作为一种潜在的治疗剂被开发，这种治疗剂可以使内源性抗肿瘤免疫反应重新起作用。但是，当这些试剂被单独使用时不能有效的杀死免疫原性较差的肿瘤。因此，对能够通过促进内源性抗肿瘤免疫反应预防或者治疗癌症的组合物和方法存在需求，尤其是在免疫原性较差的肿瘤中。本发明解决了这一需要。
发明内容
本发明的特征在于基于材料的癌症疫苗(例如，癌症疫苗装置)与免疫检验点抗体相结合促进T细胞活性和抗-肿瘤免疫反应。
本发明的装置包括免疫-抑制性蛋白质的抑制剂；脚手架组合物；募集细胞的组合物；和一种生物活性组合物，其中，所述生物活性组合物被整合入脚手架组合物中或者包覆在所述脚手架组合物上，并且，其中所述生物活性组合物引起所述装置中的细胞或者所述装置中募集的细胞的修饰作用。
例如，免疫-抑制性蛋白质是能够减少和/或抑制免疫细胞活性的蛋白质。例如，免疫-抑制性蛋白质减少和/或抑制T细胞，B细胞，NK细胞，或者树突状细胞的活性。例如，T细胞、B细胞、NK细胞、或者树突状细胞的活性或者抑制能力的下降导致针对抗原(例如，一种癌细胞抗原)的内源性免疫反应下降。例如，所述免疫-抑制性蛋白质降低和/或抑制T细胞效应因子的活性和/或NK细胞的致死活性。有时候，免疫-抑制性蛋白质减少或者抑制细胞毒素T-淋巴细胞(CTL)的活性。例如，免疫-抑制性蛋白质减少或者抑制细胞毒素T-淋巴细胞(CTL)调解的靶细胞溶解。例如，免疫-抑制性蛋白质是一种免疫检验点蛋白质(例如，CTLA4或者PD1)。例如，免疫-抑制性蛋白质(例如，CTLA4)与CD28竞争结合CD80和/或CD86，从而干扰T细胞活化作用。(参见，例如，Pardoll et al.Nat.Reviews Cancer.(2012)12:252-264,通过引证在此全部并入本文。例如，免疫抑制的蛋白质(例如，PD1、PDL1或者PDL2)抑制T细胞活化作用中涉及的激酶或者磷酸酶(例如，SHP2)。例如，免疫抑制性蛋白质调节T细胞-抗原递呈细胞(APC)接触或者T细胞-靶细胞接触的持续时间。例如，免疫-抑制性蛋白质(例如，CTLA4或者PD1)增加了Treg细胞的免疫抑制功能。
在一些实施方案中，所述免疫-抑制性蛋白质是细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)、程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、B7-H3、B7-H4或者T细胞膜蛋白质3(TIM3)。例如，所述免疫-抑制性蛋白质是细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)。在其他实施例中，所述免疫-抑制性蛋白质是程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)。
有时候，所述装置包括细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抑制剂和程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抑制剂。例如，所述抑制剂包括蛋白质、肽、或者核酸，例如，抗体或其片段。在一些实施例中，所述抗体或者其片段结合细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)。示范性的抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体或其片段包括易普利姆玛(Ipilimumab)、替西木单抗(Tremelimumab)或其片段。在其他实施例中，所述抑制剂结合程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)，并且所述抑制剂是一种蛋白质，例如，MDX-1106、MK3475、CT-011、AMP-224或其片段。有时候，所述抑制剂是PDL2-免疫球蛋白(Ig)融合的蛋白质。
在一些实施方案中，所述抑制剂是一种蛋白质，并且所述抑制剂，例如，MDX-1105，结合程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)。
其他示范性的抑制剂是能够与淋巴细胞活化基因3(LAG3)结合的蛋白质，例如，淋巴细胞活化基因3(LAG3)-免疫球蛋白融合蛋白质，比如IMP321；或者能够与B7-H3结合的蛋白质，例如，MGA271。
所述装置中募集细胞的组合物募集免疫细胞。所述免疫细胞包括一种抗原递呈细胞，例如，树突状细胞，巨噬细胞，T细胞，B细胞，或者天然致死(NK)细胞。
所述装置包含一种脚手架，所述脚手架包括开放的，相互连接的大孔。所述装置进一步包括能够诱导或者促进细胞迁移的调配信号，其中，在一些实施例中，所述调配信号包括一种蛋白质、肽或者核酸。例如，所述调配信号包括：i)一种或者一种以上能够诱导细胞迁移并具有梯度或者能够形成梯度的因子；ii)一种编码能够诱导细胞从所述装置中迁移出来的蛋白质的核酸；或者iii)募集细胞的组合物的耗尽或者扩散。
示范性的募集细胞的组合物包括一种细胞因子、趋化因子，或者生长因子。例如，所述募集细胞的组合物包括粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L，或者CCL20。
有时候，装置的生物活性组合物包括一种目标抗原组合物。
在一些实施方案中，所述募集细胞的组合物将免疫细胞募集到所述装置，在装置中，所述免疫细胞遭遇目标抗原，并且在这里，所述免疫细胞存留，直到调配信号诱导所述免疫细胞流出到装置外的淋巴结组织。
在一些实施例中，流出的免疫细胞免疫活化作用水平大于进入所述装置之前的水平。
例如，流出的免疫细胞是抗原-激发的，与进入装置之前的激发水平相比。有时候，募集到装置中的免疫细胞在装置中存留2小时到4周，例如，2小时到24小时，2天到6天，或者1到4周。
在一些情况下，装置中的目标抗原组合物包括癌症抗原或者癌症衍生的抗原。所述癌症抗原、癌症衍生的抗原或者癌症细胞是，例如，来源于黑素瘤、中枢神经系统(CNS)癌症、中枢神经系统(CNS)生殖细胞肿瘤、肺癌、白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、恶性的神经胶质瘤、髓母细胞瘤(Medulloblatoma)、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、胰腺癌、胃癌、头和颈部癌症，或者结肠直肠癌。例如，癌细胞来源于固体癌症或者血液学癌症。所述血液学癌症是，例如，白血病或者淋巴瘤。白血病是急性淋巴母细胞性白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，慢性淋巴细胞性白血病(CLL)，小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)，慢性粒性白血病(CML)，或者急性单核细胞性白血病(AMoL)。淋巴瘤是滤泡性淋巴瘤，霍金氏淋巴瘤(例如，小节硬化症的亚类，混合细胞含量亚类，富含淋巴细胞的亚类，或者淋巴细胞耗尽亚类)，或者非霍金氏淋巴瘤。示范性的固体癌症包括但是不局限于黑素瘤(例如，不可切除的、转移性的黑素瘤)、肾癌(例如，肾细胞癌)、前列腺癌症(例如，转移性的阉割抵抗性前列腺癌症)、卵巢癌症(例如，上皮卵巢癌症，例如转移性的上皮细胞卵巢癌症)、乳腺癌(例如，三阴性乳腺癌)，和肺癌(例如，非小细胞性肺癌)。
所述装置被施用给需要的主体，例如，所述主体是哺乳动物，例如是人。在施用本发明的装置/疫苗和/或抑制剂之前，主体首先经过癌症治疗(例如，对于NSCLC、转移性黑素瘤或者RCC)处理。例如，主体预先被本发明的抑制剂处理。例如，主体预先被本发明的一种或者一种以上抑制剂处理。例如，在不存在共同施用癌症疫苗(例如，本发明的癌症疫苗装置)的情况下，主体首先用本发明的抑制剂处理。所述哺乳动物是任何哺乳动物，例如，人、灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马，以及家禽或者为了食肉而饲养的动物，例如，牛、羊、猪、鸡和山羊。在一种优选的实施方案中，所述哺乳动物是人类。
在一些情况下，所述装置包含癌症衍生的抗原。示范性的癌症衍生的抗原如这里所描述的。例如，癌症衍生的抗原/肿瘤抗原包括肿瘤细胞独有的抗原和/或突变产生的抗原，例如，表1中所显示的抗原。在另一个实施例中，癌症衍生的抗原包括共享抗原，例如，肿瘤特异抗原、分化作用抗原和/或过表达抗原，例如，在表2-4中所显示的。在一些实施例中，癌症衍生的抗原包括一种肽，所述肽的氨基酸序列选自由SEQ ID NOs:35-434所组成的组中。
例如：癌症衍生的抗原选自由以下所组成的组中：MAGE系列抗原(例如MAGE-1)、MART-1/梅拉纳、酪氨酸酶、神经节苷脂、gp100、GD-2、O-乙酰化GD-3、GM-2、MUC-1、Sos1、蛋白激酶C-结合蛋白、反转录酶蛋白质、AKAP蛋白质、VRK1、KIAA1735、T7-1、T11-3、T11-9、现代人端粒酶发酵产物(hTRT)、细胞角蛋白-19(CYFRA21-1)、鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)、(蛋白质T4-A)、鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)、卵巢癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)、粘蛋白1(肿瘤相关的粘蛋白)、癌-相关的粘蛋白)、(多形态上皮细胞粘蛋白)、(PEM)、(PEMT)、(EPISIALIN)、(肿瘤相关的上皮细胞膜抗原)、(EMA)、(H23AG)、(花生反应性的尿粘蛋白)、(PUM)、(乳腺癌相关的抗原DF3)、CTCL肿瘤抗原se1-1、CTCL肿瘤抗原se14-3、CTCL肿瘤抗原se20-4、CTCL肿瘤抗原se20-9、CTCL肿瘤抗原se33-1、CTCL肿瘤抗原se37-2、CTCL肿瘤抗原se57-1、CTCL肿瘤抗原se89-1、前列腺特异性膜抗原、5T4癌坯滋养层糖蛋白、Orf73皮肤多发性出血性肉瘤相关的疱疹病毒、MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原)(DAM10)、MAGE-B2抗原(DAM6)、MAGE-2抗原、MAGE-4a抗原、MAGE-4b抗原、结肠癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12变体A、癌症相关的表面抗原、腺癌抗原ART1、伴生肿瘤相关的脑-睾丸-癌症抗原(旁瘤抗原MA2；伴生肿瘤神经元抗原)、神经肿瘤腹部抗原2(NOVA2)、肝细胞癌抗原基因520、肿瘤相关的抗原CO-029、肿瘤相关的抗原MAGE-X2、滑膜肉瘤、X断点2、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原、血清学检测的结肠癌抗原1、血清学检测的乳癌抗原NY-BR-15、血清学检测的乳癌抗原NY-BR-16、嗜铬粒蛋白A；甲状旁腺分泌的蛋白质1、DUPAN-2、CA19-9、CA72-4、CA195、癌胚抗原(CEA)。
在其它情况下，装置中的生物活性组合物包括肿瘤溶解产物，例如，包括来源于黑素瘤肿瘤的溶解产物。在其它情况下，所述生物活性组合物包括照射的肿瘤细胞，例如，包括黑素瘤细胞(例如B16-F10细胞)。
所述生物活性组合物还可以包括一种癌细胞表面抗原，或者一种病毒或者细菌抗原。
在一些实施方案中，所述装置进一步地包括辅料，例如，富集CpG的低聚核苷酸，例如浓缩的CpG低聚核苷酸。示范性的浓缩CpG低聚核苷酸包括聚(氮丙啶)(PEI)-CpG。
在一些实施例中，所述脚手架进一步地包括RGD-修饰的藻酸盐。在其它情况下，本发明进一步地提供了一种装置，该装置包括一种Toll样受体(TLR)激动剂，例如能够优选结合TLR3的Toll样受体(TLR)激动剂。例如，所述Toll样受体(TLR)激动剂包括一种TLR3激动剂，例如，聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I:C))或者聚(氮丙啶)(PEI)-聚(I:C)。
在一些情况下，所述脚手架包括一种水凝胶或者多孔聚合物，所述脚手架包括一种聚合物或者聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，藻酸盐，明胶，胶原蛋白，琼脂糖，聚(赖氨酸)，聚羟基丁酯，聚ε己内酯，聚膦嗪，聚(乙烯醇)，聚(氧化烯)，聚(环氧乙烷)，聚(烯丙胺)，聚(丙烯酸酯)，聚(4-氨基甲基苯乙烯)，普卢兰尼克多元醇，泊洛沙姆(polyoxamer)，聚(糖醛酸)，聚(酸酐)或者聚(乙烯基吡硌烷酮)的共聚物。例如，优选的聚合物是聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)或者藻酸盐。
例如，所述多孔聚合物是通过气体-泡沫产生的。
在一些情况下，所述装置以小珠、丸状、片状或者圆盘状的形式存在。
本发明的特征还在于在需要的主体内杀死癌细胞的方法，包括施用这里所描述的装置。
另外，本发明提供了一种杀死所需要的主体中癌细胞的方法，包括施用：a)免疫-抑制性蛋白质的抑制剂；和b)装置，包括i)脚手架组合物，ii)募集细胞的组合物，和
iii)一种生物活性组合物，其中，所述生物活性组合物被整合入所述脚手架组合物中或者包覆在脚手架组合物上，并且，其中，所述生物活性组合物造成装置中的细胞或者募集到装置中的细胞的修饰作用。
例如，所述脚手架包括开放的相互连接的大孔，并且，其中，通过开放的、相互联系的大孔并且通过调配信号可以促进被修饰的细胞向身体内另一个位点的迁移。
有时候，身体内的另一个位点是组织目标附近或者较远的地方。
例如，所述抑制剂存在于所述装置中或者在装置上。做为选择，或者另外，
所述抑制剂包覆层于所述脚手架组合物中或者在脚手架组合物上。
在一些情况下，抑制剂不存在于装置中或者装置上，例如，所述抑制剂不包覆所述脚手架组合物或者不在所述脚手架组合物上。例如，所述抑制剂和所述装置被分别配制。
在其它情况下，所述抑制剂和所述装置被共同配制。
在一些实施例中，所述抑制剂和所述装置被同时施用给主体。做为选择，所述抑制剂和所述装置被顺序施用给主体。
在一些实施方案中，所述装置被皮下植入主体中。例如，所述抑制剂被静脉给药、腹腔内给药、皮下给药、口服给药、皮内给药、吸入给药、肌肉内给药或者直肠给药。例如，所述抑制剂被注射给药、输液或者吸入。
在一些情况下，所述抑制剂以0.01-10毫克/千克(例如，0.01、0.05、0.1、0.5、1、5或者10毫克/千克)体重的剂量被施用。例如，所述抑制剂以0.01-30毫克(例如，0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20或者30毫克)每剂量的量被施用。
在本发明的一些方法中，所述主体包括癌细胞，其中，所述癌细胞具有较差的免疫原性。例如，所述癌细胞抵抗细胞毒素T-淋巴细胞(CTL)调解的溶解和/或抵抗天然致死(NK)细胞调节的致死作用。在其他实施例中，主体不包括自身抗体。例如，自身抗体是个体免疫系统针对一种或者一种以上个体自己的蛋白质产生的抗体，例如，无论个体是否被肿瘤溶解产物或者特异性纯化的抗原免疫。例如，所述自身抗体针对癌细胞。有时候，主体不包括针对癌细胞的自身抗体。
有时候，本发明提供了一种方法，这种方法利用癌症疫苗装置和免疫-抑制性蛋白质抑制剂的组合。例如，所述免疫-抑制性蛋白质抑制剂包括细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抑制剂和程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抑制剂。有时候，所述细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抑制剂包括抗CTLA-4抗体，并且程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抑制剂包括抗PD1抗体。优选的，给药疫苗和抗体之后肿瘤内细胞毒性T细胞相对于免疫抑制性Treg细胞有所增加。也就是说，与免疫抑制性细胞，例如Treg细胞相比，使用癌症疫苗装置与免疫-抑制性蛋白质抑制剂的组合会导致肿瘤内效应因子T细胞(例如，细胞毒性T细胞)的优先产生和扩张。例如，这里所描述的方法导致CD8(+)效应因子T细胞与Treg细胞的肿瘤内比例至少是只使用疫苗的2倍。在其他实施例中，所述癌症疫苗装置和免疫-抑制性蛋白质抑制剂导致CD8(+)效应因子T细胞与Treg细胞的肿瘤内比例至少增加2倍，例如，CD8(+)效应因子T细胞与Treg细胞的肿瘤内比例至少增加3倍、至少增加4倍、至少增加5倍、至少增加6倍、至少增加7倍、至少增加8倍、至少增加9倍、至少增加10倍、至少增加11倍、至少增加12倍、至少增加13倍、至少增加14倍、至少增加15倍、至少增加16倍、至少增加17倍、至少增加18倍、至少增加19倍、至少增加20倍
有时候，免疫-抑制性蛋白质的抑制剂在癌症疫苗装置被给药之前、同时和/或之后被给药，从而维持效力和肿瘤抑制作用。优选的，在癌症疫苗装置被给药之后继续进行抗体治疗。例如，在癌症疫苗装置被给药之后，抗体治疗持续至少1天、例如，至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少2周、至少3周、至少4周、至少2个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少2年、至少3年、至少4年或者至少五年。
有时候，所述脚手架包括一种水凝胶或者多孔聚合物，例如，一种聚合物或者聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)的共聚物
本发明的组合物和制备疫苗的方法描述在美国申请第13/741,271号、公开号2013-0202707和美国专利第8,067,237中，这些专利申请通过引证在此全部并入本文。
本发明提供了一种用于原位刺激免疫细胞(例如，树突状细胞)的装置和方法。例如，在所述装置内容中Toll样受体(TLR)激动剂的呈递可以用作癌症疫苗接种。嵌合在结构聚合装置中的Toll样受体(TLR)激动剂的整合和呈递能够特异性的刺激CD8(+)树突状细胞(DC)(相当于人体中的CD141+树突状细胞(DC))和浆样树突状细胞(DC)，这两个树突状细胞(DC)子集对于癌症疫苗接种也就是说至关重要的。
因此，本发明提供了一种装置，该装置包括一种多孔聚合结构组合物，一种肿瘤抗原和一种Toll样受体(TLR)激动剂。例如，所述装置包括一种聚合结构组合物，一种肿瘤抗原和一种Toll样受体(TLR)激动剂的组合，其中所述Toll样受体(TLR)激动剂选自由Toll样受体(TLR)1、Toll样受体(TLR)2、Toll样受体(TLR)3、Toll样受体(TLR)4、Toll样受体(TLR)5、Toll样受体(TLR)6、Toll样受体(TLR)7、Toll样受体(TLR)8、Toll样受体(TLR)9、Toll样受体(TLR)10、Toll样受体(TLR)11、Toll样受体(TLR)12和Toll样受体(TLR)13所组成的组中。例如，所述聚合结构包括聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)。示范性的Toll样受体(TLR)激动剂包括病原体相关的分子类型(PAMP)，例如，一种感染-模拟性组合物，例如，细菌衍生的免疫调节剂。Toll样受体(TLR)激动剂包括核酸或者脂类组合物(例如，单磷酸脂A(MPLA))。
某些核酸可以起到Toll样受体(TLR)激动剂(Toll样受体(TLR)1激动剂、Toll样受体(TLR)2激动剂、Toll样受体(TLR)3激动剂、Toll样受体(TLR)4激动剂、Toll样受体(TLR)5激动剂、Toll样受体(TLR)6激动剂、Toll样受体(TLR)7激动剂、Toll样受体(TLR)8激动剂、Toll样受体(TLR)9激动剂、Toll样受体(TLR)10激动剂、Toll样受体(TLR)11激动剂、Toll样受体(TLR)12激动剂和Toll样受体(TLR)13激动剂)的作用。在一个实施例中，Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR9激动剂，例如，一种胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)、一种聚(氮丙啶)(PEI)-浓缩的低聚核苷酸(ODN)(例如，聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))、或者双链脱氧核糖核酸(DNA)。TLR9激动剂可以有效用于刺激浆样树突状细胞(DC)。例如，所述装置包括5微克、10微克、25微克、50微克、100微克、250微克或者500微克的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。
在另一个实施例中，Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR3激动剂，例如，聚肌苷-聚胞苷酸(聚I:C)、一种聚(氮丙啶)(PEI)-聚(I:C)、聚腺尿苷酸(聚(A:U))、聚(氮丙啶)(PEI)-聚(A:U)、或者双链核糖核酸(DNA)。
TLR3激动剂能够有效用于刺激小鼠体内的CD8+树突状细胞(DC)和人体的CD141+树突状细胞(DC)。一系列Toll样受体(TLR)激动剂，例如TLR3激动剂(比方说聚I:C)和TLR9激动剂(比方说CpG)协同作用活化抗肿瘤免疫反应。例如，所述装置包括一种TLR3激动剂(例如聚(I:C))和TLR9激动剂(胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))或者聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。优选的，Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR3激动剂、聚(I:C)和TLR9激动剂、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。与单独整合胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)或者聚(I:C)的疫苗相比，聚(I:C)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的结合能够起到协同作用。
在有些情况下，所述Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR4激动剂，所述TLR4激动剂选自由以下所组成的组中：脂多糖(LPS)、单磷酸脂A(MPLA)、热休克蛋白、纤维蛋白原、硫酸肝素或者其片段、透明质酸或者其片段、镍、阿片肽、α1-酸性糖蛋白(AGP)、RC-529、鼠β-防御素2、和完全弗氏佐剂(CFA)。在其它情况下情况下，Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR5激动剂，其中所述TLR5激动剂是鞭毛蛋白。其他适当的Toll样受体(TLR)激动剂包括TRL7激动剂，所述TRL7激动剂选自由单链RNA、鸟嘌呤核苷类似物、咪唑并喹啉(imidazoqinolines)和loxorbine所组成的组中。
优选的，Toll样受体(TLR)激动剂存在的浓度可以有效用于诱导树突状细胞局部产生白介素-12(IL-12).
在一些实施方案中，所述装置包括一种免疫原性因子/感染-模拟组合物，例如，toll样受体配位体、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列或者其衍生物、肿瘤抗原、生长因子、热-休克蛋白质、细胞死亡的产物或者细胞因子。
本发明还提供了一种装置，所述装置包括多孔的聚合结构组合物、一种疾病相关抗原和一种Toll样受体(TLR)激动剂，其中所述Toll样受体(TLR)激动剂优选结合TLR3。在一些情况下，所述聚合结构组合物包括聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)。所述TLR3激动剂存在的数量能够优选刺激CD8+树突状细胞或者CD141+树突状细胞。
优选的，所述Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR3激动剂。在一些情况下，所述TLR3激动剂包括聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I:C))或者聚(氮丙啶)(PEI)-聚(I:C)。例如，所述Toll样受体(TLR)核酸包括核酸。在其它情况下，所述Toll样受体(TLR)激动剂进一步包括TLR9激动剂。例如。所述TLR9激动剂包括一种胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)或者一种聚(氮丙啶)(PEI)胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。选择性地，所述装置包括Toll样受体(TLR)激动剂的结合，所述结合包括TLR3激动剂和TLR9激动剂。例如，所述TLR3激动剂包括聚(I:C)和并且所述TLR9激动剂包括胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。
做为选择，所述装置包括Toll样受体(TLR)激动剂的结合，所述结合包括TLR3激动剂和TLR4激动剂。例如，所述TLR3激动剂包括聚(I:C)并且所述TLR4激动剂包括单磷酸脂A(MPLA)。
选择性地，所述装置进一步地包括一种募集组合物。示范性的募集组合物包括粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L和CCL20。例如，所述募集组合物包括封装的粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在一些情况下，所述疾病相关的抗原包括一种肿瘤抗原。例如，所述肿瘤抗原包括一种肿瘤溶解产物，纯化的蛋白质肿瘤抗原，或者合成的肿瘤抗原。
选择性地，所述Toll样受体(TLR)激动剂进一步地包括病原体相关的分子类型(PAMPs)。例如，所述病原体相关的分子类型(PAMP)包括一种单磷酸脂A(MPLA)。
还提供了一种装置，所述装置包括一种聚合结构组合物、一种肿瘤抗原和Toll样受体(TLR)激动剂的结合，其中所述Toll样受体(TLR)激动剂选自由Toll样受体(TLR)1、Toll样受体(TLR)2、Toll样受体(TLR)3、Toll样受体(TLR)4、Toll样受体(TLR)5、Toll样受体(TLR)6、Toll样受体(TLR)7、Toll样受体(TLR)8、Toll样受体(TLR)9、Toll样受体(TLR)10、Toll样受体(TLR)11、Toll样受体(TLR)12和Toll样受体(TLR)13所组成的组中。
通过将主体与一种装置相接触或者将所述装置植入主体中来实施一种引起抗肿瘤免疫反应的方法，其中，所述装置包括一种聚合结构组合物、一种肿瘤抗原和一种Toll样受体(TLR)激动剂，其中所述Toll样受体(TLR)激动剂优选的结合TLR3。例如，所述Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR3激动剂。做为选择，所述Toll样受体(TLR)激动剂包括TLR3激动剂和TLR9激动剂。
优选的，所述抗肿瘤免疫反应包括CD8+树突状细胞或者CD141+树突状细胞的活化作用。在一些情况下，所述抗肿瘤免疫反应包括浆样树突状细胞或者CD141+树突状细胞的活化作用。做为选择，所述抗肿瘤免疫反应包括肿瘤负荷的减少。
优选的，Toll样受体(TLR)激动剂存在的浓度可以有效用于诱导树突状细胞局部产生白介素-12(IL-12)。
选择性地，所述装置进一步包括粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施例中，所述粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是封装的。另一种任选的募集组合物是一种细胞因子。例如，所述装置包括1微克、3微克、5微克、10微克、25微克或者50微克的粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
所述装置还包括一种肿瘤抗原，例如，以肿瘤溶解产物的形式(培养细胞或者病人衍生的初级细胞)或者纯化的肿瘤抗原(例如，化学合成的/合成蛋白、重组(例如，生物化学-纯化的)蛋白质/抗原(例如，从肿瘤细胞中纯化的)。在一些情况下，所述重组蛋白质/抗原由原核细胞制备。在其它情况下，所述重组蛋白质/抗原由真核生物(例如，哺乳动物)细胞制备。
本发明还包括一种方法，该方法通过将装置与主体相接触，例如向主体中植入所述装置来引起抗肿瘤免疫反应，所述装置包括一种多孔的聚合结构组合物、一种肿瘤抗原和一种Toll样受体(TLR)激动剂。例如，所述Toll样受体(TLR)激动剂选自由Toll样受体(TLR)1、Toll样受体(TLR)2、Toll样受体(TLR)3、Toll样受体(TLR)4、Toll样受体(TLR)5、Toll样受体(TLR)6、Toll样受体(TLR)7、Toll样受体(TLR)8、Toll样受体(TLR)9、Toll样受体(TLR)10、Toll样受体(TLR)11、Toll样受体(TLR)12和Toll样受体(TLR)13所组成的组中。如上所述，所述装置与之前的疫苗更有优势。最重要的优势在于它能够刺激至关重要的树突状细胞(DC)子集，所述子集能够调节有效的抗肿瘤活性。所述方法包括，向主体施用一种装置，所述装置包括一种TLR3激动剂和/或TLR9激动剂，这种施用引发抗肿瘤免疫反应，所述抗肿瘤免疫反应以被使用疫苗的主体内浆样树突状细胞(DC)和/或CD141+树突状细胞(DC)的活化作用为特点。所述疫苗可以有效用于预防和治疗。
所述装置被施用，例如，局部施用或者植入，并存在一定的时间，例如，内部居住一段时间，而原位不断的募集、驯化并分散或者派遣细胞进入体内淋巴结或者疾病位点或者感染位点。对现有装置的改善包括对进入所述装置的细胞进行长时间不间断的活化作用，并且伴随长时间不间断的释放免疫活化的(例如抗原灌注的)细胞。所述装置包括一种脚手架组合物，一种募集组合物和一种调配组合物。所述调配组合物调节延长的并且连续流出的始发细胞，所述调配组合物是一种感染-模拟组合物，例如一种细菌衍生的免疫调节剂。在优选的实施方案中，所述细菌衍生的免疫调节剂是一种核酸，例如，一种胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。
本发明可以用于治疗各种各样的疾病并用于研发针对各种各样抗原的疫苗。在一种优选的实施方案中，本发明用于开发一种癌症疫苗。本发明的另一个优选的实施方案包括一种感染-模拟微环境，用于活化宿主免疫系统并随后用于诱导免疫反应。利用具有外源粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的合成胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)提供一种用于精确控制树突状细胞迁移并调节抗原特异性免疫反应的方法。使用这些合成的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列和/或聚(I:C)(例如，浓缩的低聚核苷酸，例如(PEI-CpG-ODN或者PEI-聚(I:C)))的方法与早期的免疫治疗剂相比显示了重要的改善作用。(参见，例如，US 2012-0100182，例如，第14页[0106]-第15页[0110]段和第24页[0176]段，通过引证在此并入本文。
这些装置完成三个主要功能，例如，向装置中吸引细胞、呈递免疫原性因子、并诱导细胞迁移出所述装置，例如，到达引流淋巴结，活化的细胞在此可以激发他们抗肿瘤作用。使用脚手架和/或生物活性组合物进行所有这些主要功能。在示例性的装置中，不同的脚手架或者生物组合物的结合可以实现至少一个主要作用。例如，在一些装置中，所述脚手架组合物进行完成这三个主要功能中的每个。在选择性的实施例中，所述脚手架组合物完成一个主要功能，例如，向装置中吸引细胞(优选的，树突状细胞)，而所述生物组合物完成两个主要功能，例如，呈递免疫原性因子和诱导细胞(优选的，树突状细胞)迁移出所述装置，而一些装置，例如，是相反的组合。示例性的脚手架和/或生物组合物的次要功能包括，但是不局限于，使装置靶向具体的细胞或者组织类型，将装置粘附/释放到一种或者一种以上细胞或者组织的表面上，以及，调节装置的稳定性/降解作用。
本发明包括一种装置，所述装置包括一种脚手架组合物和生物活性组合物，所述生物活性组合物被整合到脚手架组合物中或者共轭在脚手架组合物上，其中，所述脚手架组合物吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子从而活化所述树突状细胞，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述脚手架组合物。做为选择，所述生物活性组合物被整合入脚手架组合物，或者被涂布在所述脚手架组合物上，吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子，从而活化所述树突状细胞，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述脚手架组合物。在其他优选的实施方案中，所述脚手架组合物或者生物活性组合物分别向装置中吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述装置。
树突状细胞(DC)包括传统的树突状细胞(DC)和树突状细胞(DC)的特定子集。所述Toll样受体(TLR)激动剂，例如，TLR3激动剂，优先地吸引并且刺激人体中的CD141+树突状细胞(DC)(在小鼠中是CD8+树突状细胞(DC))。所述TLR9激动剂，例如，CpG，优选地吸引并且刺激浆样树突状细胞(DC)。
在优选的实施方案中，所述募集组合物是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，例如，封装的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。所述装置暂时控制局部粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)浓度，从而控制免疫细胞的募集、滞留和随后向远离装置位置的淋巴结或者组织位点(例如感染位点或者肿瘤位点)的分散/调配。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的浓度确定其是否起到募集成分或者调配成分的作用。因此，通过向主体中引入包括脚手架组合物和封装的募集组合物的装置来实施原位编程树突状细胞的方法。在引入装置后1-7天的时间内，一股募集组合物脉冲从装置中释放出来，在装置中残留剩余量的募集组合物。在这股脉冲释放之后，剩余量的募集组合物在数周内缓慢释放。募集组合物的局部浓度和释放的暂时方式调节树突状细胞向装置中的募集、保留和随后的释放。例如，这股募集组合物脉冲包括装置中至少50％、60％、75％、90％或者95％的募集组合物。示例性的暂时释放曲线包括一种脉冲，所述脉冲的特点在于在向主体中引入装置后的1-5天内释放所述装置中至少60％的募集组合物。在所述脉冲之后，在延长的时间(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12天或者2、3、4、5或更多周)内剩余量缓慢的释放。其他募集组合物包括Flt3L和/或CCL20。所述募集化合物可以分别使用或者结合使用。
通过提供一种脚手架组合物、向所述脚手架组合物中整合或者在所述脚手架组合物上涂布一种第一生物活性组合物(所述第一生物活性组合物包括能够吸引或者驱逐树突状细胞的多肽)、并且将所述脚手架组合物与一种第二生物活性组合物(其中，所述第二生物活性组合物共价或者非共价连接脚手架组合物，并且其中第二生物活性组合物包括一种免疫原性的因子)相接触来实施制备脚手架的方法。在本方法作为选择的实施方案中，重复所述连接和接触步骤从而产生多个层，其中，第二生物活性组合物包括能够活化树突状细胞的化合物的结合。
所述方法包括连续的原位树突状细胞编程，包括向主体施用一种装置装置，所述装置包括一种脚手架组合物和生物活性组合物，所述生物活性组合物被整合到脚手架组合物中或者共轭在脚手架组合物上，其中，所述脚手架组合物吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子从而活化所述树突状细胞，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述脚手架组合物。所述装置募集并刺激异源树突状细胞群落。各个子集被具体化并明显用于产生免疫反应。例如，所述装置调节胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)呈递和树突状细胞子集的富集、浆样树突状细胞(pDC)的富集、或者CD141+树突状细胞(DC)的富集，这对抗肿瘤免疫性的产生是非常重要的。
所述方法包括增加疫苗效力，包括向主体施用一种装置，所述装置包括一种脚手架组合物和生物活性组合物，所述生物活性组合物被整合到脚手架组合物中或者共轭在脚手架组合物上，其中，所述脚手架组合物吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子从而活化所述树突状细胞，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述脚手架组合物，从而增加疫苗接种过程的效力。
所述方法包括向主体接种抗癌疫苗，包括对主体施用一种装置，所述装置包括一种脚手架组合物和生物活性组合物，所述生物活性组合物被整合到脚手架组合物中或者共轭在脚手架组合物上，其中，所述脚手架组合物吸引树突状细胞，向树突状细胞中引入免疫原性因子从而活化所述树突状细胞，并且诱导所述树突状细胞迁移出所述脚手架组合物，从而赋与主体抗肿瘤免疫能力。例如，IL-12的产生和肿瘤负荷的减少。对于局部肿瘤或者实体肿瘤的情况，所述装置被施用或者被移植在肿瘤位点或者接近肿瘤的位点，或者在肿瘤被检测或者外科手术除去的位点。例如，所述装置被植入距离肿瘤位点或者肿瘤切除位点1毫米、3毫米、5毫米、10毫米、15毫米、20毫米、25毫米、40毫米的位点，例如，所述聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗装置被施用在距离肿瘤16-21毫米的地方。
免疫原性因子包括Toll样受体(TLR)配体。例如，所使用的免疫原性因子是被修饰Toll样受体(TLR)-9配体序列，聚(氮丙啶)(PEI)胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)。优选的，所述Toll样受体(TLR)配体是TLR3激动剂，例如聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I：C))或者聚(氮丙啶)(PEI)-聚(I：C)。
脚手架组合物包括一种非生物可降解的材料。示范性的非生物可降解的材料包括，但是不局限于，金属，塑料聚合物，或者丝聚合物。而且，脚手架组合物由一种生物相容的材料组成。这种生物相容的材料是无毒的或者非免疫原性的。
生物活性组合物与脚手架组合物共价连接或者非共价连接。生物活性组合物包括一种成分，共价的或者非共价的与脚手架组合物表面键合，用于吸引树突状细胞。做为选择，或者另外，生物活性组合物包括一种成分，共价的或者非共价的与脚手架组合物表面键合，用于向树突状细胞中引入一种免疫原性因子。做为选择，或者进一步另外，生物活性组合物包括一种成分，共价的或者非共价的与脚手架组合物表面键合，用于诱导树突状细胞从脚手架组合物中迁移出来。
生物活性组合物中能够操控树突状细胞的成分是分泌氨基酸或者膜结合性氨基酸、肽、多肽、蛋白质、核苷酸、双核苷酸、低聚核苷酸、多聚核苷酸、聚合物、小分子或者化合物。在一种优选的实施方案中，该成分是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，由于该成分能够向脚手架组合物中吸引树突状细胞。在另一个优选的实施方案中，该成分是一种聚(氮丙啶)(PEI)胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列，这是由于该成分能够向树突状细胞中引入胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列从而活化所述细胞。在一些实施方案中，该成分是编码CCR7的多聚核苷酸或者多肽，一种趋化因子受体，所述趋化因子受体能够调解树突状细胞向淋巴结迁移并远离所述脚手架组合物。所述CCR7成分与聚(氮丙啶)(PEI)胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列同时或者先后被引入树突状细胞，从而提高树突状细胞从所述脚手架组合物中迁移出来。
本发明的脚手架组合物包括外表面。做为选择，或者另外，本发明的脚手架组合物包括内表面。脚手架组合物的外表面或者内表面是固体或者多孔的。孔径小于大约10纳米，直径在大约100纳米到20微米范围内，或者大于大约20微米。在优选的实施方案中，小孔尺寸能够允许细胞(例如树突状细胞(DC))从装置中迁入以及随后迁出。例如，所述孔是纳米孔、微米孔或者大孔。例如，所述纳米孔的直径小于大约10纳米；微米孔的直径在大约100微米到20微米范围内；并且，大孔直径大于大约20微米(优选的，大于大约100微米或更大，优选的大于大约400微米，例如，大于600微米或大于800微米)。在一个实施例中，所述脚手架是大孔的，具有开放的、相互连通的孔，直径大约为100-500微米，例如，直径为100-200微米、200-400微米或者400-500微米。所述孔的尺寸和相互连接的结构的尺寸能够允许细胞进入，通过相互连通的孔穿过装置内部、然后通过孔离开装置去往装置外的身体部分，例如，肿瘤位点，并在此产生针对肿瘤细胞的免疫反应。在转移性肿瘤细胞或者血液肿瘤，例如白血病的情况下，活化的树突状细胞(DC)从装置中迁移出来并在不连续的位点或者全身引起针对实体肿瘤的免疫反应。
本发明的脚手架组合物包括一个或者一个以上隔间。
本发明的装置被口服、系统性、皮下或者经皮施用或者植入，作为动脉支架，或者手术使用。
本发明的装置和方法为一些与原位细胞连续编程方法有关的问题提供了解决方案。原位细胞编程系统能够刺激细胞的免疫反应并诱导他们向外迁移到感染的或者患病的身体组织，该系统能够提高恢复的成功程度，例如，特异性的消除有病的组织。一种装置能够控制细胞功能和行为，例如，运动。这种装置包括一种脚手架组合物和一个或者一个以上生物活性组合物。所述生物活性组合物被整合到脚手架组合物中或者被涂布在脚手架组合物上。所述脚手架组合物和/或生物活性组合物暂时控制并且空间上(定向)控制树突状细胞吸引、编程和迁移。
所述装置经由体内的材料来调节宿主细胞的活性募集、修饰和释放，从而改善与脚手架接触的细胞功能。例如，所述装置向所述脚手架材料中吸引或者募集已经存在于身体内的细胞，并且对已经存在的细胞进行编程后者重新编程，获得需要的历程(例如，免疫活化作用)。
该装置包括一种脚手架组合物，所述脚手架组合物能够结合生物活性组合物或者被生物活性组合物所包覆；该装置调节树突状细胞的吸引、活化和迁移。根据所设计的装置的应用，所述装置通过定性脚手架本身的物理或者化学性质调节树突状细胞的吸引、活化和/或迁移。例如、所述脚手架组合物具有差别化的可渗透性，只在特定脚手架面积内允许细胞迁移。通过，例如选择或者设计具有更大或者更小孔径、密度、聚合物交联度、硬度、韧性、延伸度或者粘弹性的材料来调节所述脚手架组合物的渗透性。所述脚手架组合物包括物理通道或者路径，这些通道或者路径允许细胞更容易的从装置或者装置内的隔间流出流向目标区域。所述脚手架组合物选择性地由不同的隔间或者隔层组成，每一个都具有不同的渗透性从而可以精确地并且可预见的控制细胞穿过所述装置所需要的时间。还可以通过所述脚手架组合物的降解作用、去水合作用或者再水合作用、氧化、化学或者pH变化或者不间断的自组装调节迁移。
使用生物活性组合物调节吸引、活化和/或迁移。所述装置通过其结构控制并指挥细胞的活化和迁移。可以使用化学亲和性来引导细胞向出口特定区域流动。例如，使用细胞因子诱导或者放慢细胞迁移。通过改变生物活性物质的密度和混合物，所述装置能够控制迁移时间。通过控制这些生物活性物质的最初掺杂水平或者浓度梯度，通过将所述生物活性物质包埋在具有已知渗出率的脚手架材料中、通过随着脚手架材料降解释放、通过从浓度区域扩散、通过前体化学物质扩散进入某一区域的相互作用，或者通过现有细胞产生/分泌组合物，来控制这些生物活性物质的密度和混合物。所述脚手架的物理或者化学结构还能够调节生物活性试剂通过所述装置的扩散。
所述生物活性组合物包括一个或者一个以上能够调节细胞功能和/或行为的化合物。所述生物活性组合物与脚手架组合物共价连接或者非共价连接。
作为对免疫调节因子的相应，引发参与细胞迁移过程的信号传导事件。因此，所述装置选择性的包括一种第二生物活性组合物，所述生物活性组合物包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)或者聚(I：C)序列、一种癌症抗原和/或免疫调节剂。
有时候，第二生物活性组合物与脚手架组合物共价连接，保持组合物在所述脚手架组合物上相对固定。在其它情况下，第二生物活性组合物与所述脚手架非共价连接。非共价键通常比共价键弱一至三个数量级，从而允许因子从脚手架中扩散出来进入周围的组织。非共价键包括静电、氢键、范德华键、π芳族和疏水性键。
所述脚手架组合物是生物相容的。所述组合物是生物可降解的/可吸收的，或者不会再体内分解。相对长久(抗降解)的脚手架组合物包括金属和一些聚合物(例如，丝)。优选的，所述脚手架组合物以根据物理参数而预先确定的速率降解，所述物理参数选择由温度、pH、水合作用状态、多孔性和交联密度、类型和化学作用或者主链键合对降解作用的敏感性所组成的组中，或者，所述脚手架组合物以根据化学聚合物比例预先确定的速率降解。例如，一种由单丙交酯构成的高分子量聚合物在几年的时间内降解，例如，1-2年，而由50∶50丙交酯和乙交酯混合物组成的低分子量聚合物在几周的时间内降解，例如，1、2、3、4、6、10周。一种钙交联的凝胶剂由高分子量、高古罗糖醛藻朊酸盐组成，这种凝胶剂在几个月(1、2、4、6、8、10、12月)的时间到几年的时间(1、2、5年)内体内降解，而由低分子量藻朊酸盐和/或部分氧化的藻朊酸盐组成的凝胶剂能在几周内降解。
示范性的脚手架组合物包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)聚合物、藻朊酸盐和藻朊酸盐衍生物、明胶、胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、富含粘连蛋白的凝胶剂、琼脂糖、天然多糖和合成多糖、聚氨基酸、多肽、聚酯、聚酐、聚膦嗪、聚(乙烯醇)、聚(烯基氧化物)、聚(烯丙胺)(PAM)、聚(丙烯酸酯)、修饰的聚苯乙烯、复合多元醇、聚乙氧基/聚丙氧基共聚物(polyoxamers)、聚(糖醛酸)、聚(乙烯基吡硌烷酮)以及上述任意的共聚物或者接枝共聚物。优选的脚手架组合物包括RGD-修饰的藻朊酸盐。在另一个实施例中，所述脚手架组合物包括交联的聚合物，例如交联的藻酸盐，明胶，或其衍生物，比如异丁烯酸。
另一个优选的脚手架组合物是大孔的聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)。例如，所述聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、危险信号和一种目标抗原，例如，一种癌症抗原，并且如他们所编程的，驻扎于此募集树突状细胞(DC)。所述募集成分，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，被封装入聚(丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架。包括封装的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质能够提供树突状细胞募集组合物的脉冲，然后提供逐渐减缓的释放速率。在向被治疗的主体特定位点上施用后，所述脉冲包括初始量生物活性组合物的至少40％、50％、60％、75％、80％或更多，剩余的百分比在随后的几天或者几周内逐步释放。例如，在开始的五天内释放大约60％的生物活性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)负荷，然后在随后的10天内缓慢的持续释放生物活性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。这种释放曲线调节了所述因子通过周围组织扩散的速率，从而有效的募集固有的树突状细胞(DC)。
脚手架组合物的多孔性能够影响细胞通过所述装置的迁移。小孔是纳米孔、微米孔或者大孔。例如，所述纳米孔的直径小于大约10纳米；微米孔的直径在大约100微米到20微米范围内；并且，大孔直径大于大约20微米(优选的，大于大约100微米或更大，优选的大于大约400微米)。在另一个实施例中，所述孔径在小于10纳米到大约1000微米。在一些情况下，平均孔径范围在大约250微米到大约500微米范围内。在一些情况下，多孔结构是随意的或者是定位的。在一个实施例中，所述脚手架是大孔的，并且具有直径为400-500微米的定位孔。
通过提供一种脚手架组合物以及与所述脚手架组合物共价连接或者非共价连接的第一生物活性组合物来实施制备脚手架的方法。US 2012/0100182、PCT/US2010/057630和PCT/US2012/35505描述了示例性的装置以及制造所述装置的方法，每个所述专利通过引证在此并入本文。所述第一生物活性组合物优选的包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。所述脚手架组合物还与一种第二生物活性组合物相接触，优选的，所述第二生物活性组合物是一种或者一种以上胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列。第二生物活性组合物与脚手架组合物相连，产生涂料的脚手架，也就是说，包括一种或者一种以上生物活性物质的脚手架组合物。所述接触步骤可以选择性的重复从而产生多重涂料的脚手架，例如，每一次接触步骤都与不同量的第二生物活性组合物相接触，从而在脚手架装置上产生第二生物活性组合物的梯度。除了改变组合物的量之外，随后的接触步骤包括不同的生物活性组合物，例如，第三、第四、第五、第六组合物或者所述组合物的混合物，这些组合物与之前步骤中使用的组合物或者混合物相比，具有不同的因子结构或者化学式。所述方法选择性的包括将各个局部、层或者隔间彼此粘附在一起，和/或向其中或者装置的一个或者一个以上边界上插入半渗透性膜、可渗透性膜或者不渗透性膜，从而进一步控制/调节细胞或者生物活性组合物的运动。
本发明装置的治疗应用包括免疫细胞的说明。例如，所述方法包括以下步骤：提供一种装置，所述装置包括在其中或者其上整合有生物活性组合物的脚手架组合物，和一种与所述脚手架相结合的哺乳动物细胞；将哺乳动物组织与所述装置相接触，例如，通过将装置植入哺乳动物组织或者附着在哺乳动物组织上。在施用所述装置或者植入装置时，各个组分(募集组合物(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L或者CCL20)、危险信号(例如，胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))和抗原(例如，纯化的肿瘤抗原或者肿瘤细胞溶解产物))示范性的相对量如下所示：GM-CSF：0.5微克-500微克；胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)：50微克-3000微克；和，肿瘤抗原/溶解产物：100微克-10000微克。
一种调节细胞(例如，宿主细胞)活性的方法，通过向哺乳动物施用一种包括脚手架组合物和整合在其中或者其上的募集组合物的装置，然后将所述细胞与一种调配信号相接触来实施。细胞离开装置后遇到抗原(及其他因子)，并且因此被活化并找出体内的肿瘤细胞，针对此肿瘤细胞确定免疫反应。在出口处的细胞活性与之前进入装置时的细胞活性不同。细胞被募集如装置后在装置中存在一段时间，例如，几分钟、0.2小时、0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时；2天、4天、6天；几周(1-4)、几月(2、4、6、8、10、12)或者几年，在此期间，细胞被暴露于结构成分和生物活性组合物，这会导致细胞活性或者活性水平的变化。在装置中与抗原或者其他化合物的相遇导致细胞被改变(再培养或者再编程)之后流出，并且所述细胞从所述装置中迁移出来进入周围组织或者更遥远的目标位置，从而找到并调节针对患病细胞(例如，肿瘤细胞)的免疫性。
所述调配信号是一种组合物，例如，蛋白质、肽、或者核酸或者细胞的活化状态。例如，在吸收抗原之后，树突状细胞(DC)被活化并迁移到淋巴结、脾、及其他解剖学位置，在这里，树突状细胞(DC)与T细胞相遇进一步的传播抗原特异性免疫应答，例如，抗癌症反应。例如，迁移入装置的细胞在一进入装置后就遇到调配信号。在一些情况下，所述调配信号是一种核酸分子，例如，一种质粒，这种质粒包括编码诱导细胞从所述装置中迁移出来进入周围组织的蛋白质的序列。当细胞在装置中遇到所述质粒时发生调配信号，在细胞中DNA被内源化(即，细胞被转染)，并且所述细胞产生被此DNA编码的基因产物。在一些情况下，传递调配信号的分子是装置的一种成分，并且相对于细胞与募集组合物的接触，所述分子以延迟的方式从装置中释放出来(例如，暂时延迟或者空间延迟)。做为选择，所述调配信号是募集组合物的减少或者缺失。例如，募集组合物诱导细胞迁移入装置，并且所述装置中募集组合物浓度的减少或者耗尽、消散或者扩散会使细胞从装置中流出。如此，个体免疫细胞，例如T细胞、B细胞或者树突状细胞(DC)被募集入装置，装填并活化从而产生针对抗原特异性目标的免疫反应。选择性地，抗原相当于目标，希望针对此目标产生免疫反应，将此抗原整合在脚手架结构之中或者之上。细胞因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))也可以作为装置的组成，所述装置能够放大免疫活化作用和/或诱导细胞向淋巴结的迁移。其他细胞特异的募集组合物描述如下。
所述装置在体内募集细胞，修饰这些细胞然后促进其向体内另一个位点的迁移。在本申请中该方法结合树突状细胞和癌症疫苗的发展进行例证，但是还可以有效用于其他疫苗，例如，针对微生物病原体的疫苗以及通用的细胞治疗剂。使用这里描述装置进行的细胞培养促进组织或者器官一靠近所述材料即再生，或者在更远的位点再生。做为选择，培养所述细胞从而促进组织的破坏(局部或者在更远的位点)。该方法可以有效用于疾病预防，例如，用于促进组织结构和功能基于细胞的维持，从而停止或者放缓疾病进程或者与年龄有关的组织变化。装置中的细胞驯化，“编程”和“再编程”允许体内细胞功能或者活性的改变，从而变成多功能性干细胞并发挥治疗作用。
由于传统的体外树突状细胞基疫苗接种策略无法调和并维持癌症病人体内由异源树突状细胞网络调节的免疫反应，因此这种方法的临床效果是有限的。由于与之前的疫苗方式相比，pDC的优先募集和扩散能够显著的改善针对癌症抗原的免疫反应并且减少肿瘤进程，这里描述的装置和方法具有明显优势。
这里描述了一种基于材料的(例如，聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG))疫苗，所述疫苗已经被最优化，例如，相对于其他疫苗制剂，控制粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和辅料的存在，从而提高T效应子活性和下调Treg细胞和其他可以由一些辅料引起的免疫抑制性机制。基于材料的疫苗与之前的疫苗系统相比表现了显著的优势，所述优势在于，它构建了一种肿瘤和疫苗的微环境，此微环境优先通过增加效应因子T细胞产生和扩张穿过Treg细胞来响应免疫-抑制性蛋白质，例如，抗CTLA-4。
多聚核苷酸、多肽或者其他试剂，可以被纯化和/或分离。具体地说，如这里所使用的，“分离的”或者“纯化的″核苷酸分子、多聚核苷酸、多肽或者蛋白质是指在通过重组技术产生时基本上不含有其他细胞物质或者培养基的物质，或者是指通过化学合成的化学前体物或者其他化学试剂。纯化后的化合物按重量计算(干重)占所关心化合物的至少60％。优选的，所述制剂按重量计算占所关心化合物的至少75％，更优选的占至少90％，并且最优选的，占至少99％。例如，纯化后的化合物按重量计算占理想化合物的至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，98％，99％，或者100％(重量/重量)。可以通过任何适当的标准方法来测量纯度，例如，通过柱形色谱法、薄层色层分析法、或者高效液相色谱(HPLC)分析。纯化后的或者分离的多聚核苷酸(核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA))不含有哪些在其天然存在形式中存在的侧链基因或者序列。纯化后或者分离的多肽不含有那些在其天然存在的形式中存在的氨基酸或者侧链序列。纯化的也用于定义一种灭菌程度，这种灭菌程度可以安全的对人类主体给药，例如，不具有传染性或者毒剂。
同样，“基本上纯的”是指从其天然伴随的成分中分离出来的核苷酸或者多肽。通常，当核苷酸和多肽按重量计算不含有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或者甚至至少99％的蛋白质和其天然伴随存在的有机分子时，这种核苷酸和多肽是基本上纯的。
“分离的核酸”指的是一种核酸，这种核酸不含有其天然存在的基因组中的侧链基因，所述天然存在的基因组存在于所述核酸所衍生的有机体中。该术语包括，例如，(a)一种DNA，这种DNA属于天然存在的基因组DNA分子的一部分，但是这部分DNA不是天然存在有机体基因组分子的侧链核苷酸序列；(b)一种核苷酸，这种核苷酸与一种载体整合或者以某种方式整合入原核生物或者真核生物基因组DNA中，从而使所得到的分子不与任意天然存在的载体或者基因组DNA相一致，(c)一种分离的分子，例如互补DNA、基因组片段、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段、或者限制性片断；和(d)一种重组核苷酸序列，这种重组核苷酸序列是杂合基因的一部分，即，一种基因编码的融合蛋白。根据本发明的分离的核苷酸分子进一步包括合成产生的分子，以及任意具有改变的化学主链和/或具有修饰的主链的核苷酸。例如，所述分离核酸是一种纯化的cDNA或者RNA多聚核苷酸。分离核酸分子还包括信使核糖核酸(mRNA)分子。
某一具体多聚核苷酸序列“保守性修饰的变体”指的是与基本上一致的序列编码相同或者基本上相同的氨基酸序列的多聚核苷酸，或者，是指其上多聚核苷酸不编码氨基酸序列。由于遗传密码的退化，大量功能上一致的核酸编码任意给定的多肽。例如，所述密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG全部编码氨基酸精氨酸。因此，在每一个用密码子特指精氨酸的位置，所述密码子可以改变为任意上面描述的相应的密码子而不改变其编码的多肽。这种核酸变化是“静止取代”或者“静止变体”，这也是“保守性修饰变体”中的一种。这里所描述的每个编码多肽的多聚核苷酸序列也代表了每个可能的静止变体，除非另有说明。因此，静止取代时每个编码氨基酸的核酸序列所暗含的特征。本领域普通技术人员可以使用标准技术识别出核酸中的每个密码子(除了AUG，通常，这是甲硫氨酸仅有的密码子)可以被修饰产生功能上相同的分子。
同样，“保守性氨基酸取代作用”，在氨基酸序列中的一个或者一些氨基酸中被不同的氨基酸取代，具有非常相似的性质，也被认为是与特定的氨基酸序列高度相似的，或者与编码氨基酸的具体的核酸序列高度相似的。任意特定序列中的这种保守性取代变体是本发明的特征之一。单独的取代作用、删除作用或者加入可能导致被编码的序列中的单个氨基酸或者一个小百分比的氨基酸(通常小于5％，更通常小于1％)的改变、增加或者删除，这种单独的取代作用、删除作用或者加入是“保守性修饰的变体”，其中，这些变化导致一种氨基酸被化学上类似的氨基酸取代。保存性取代表提供了本领域内已知的功能性相似的氨基酸。(参见，例如，Creighton(1984)Proteins,W.H.Freeman and Company,通过引证在此全部并入本文。
术语制剂或者制剂组分的“有效量”和“治疗有效量”指的是所述制剂或其组分为了提供理想的效果，单独提供或者结合提供时所需的足够数量。例如，“有效量”值得是化合物的量，单独使用或者结合时，减少或者预防哺乳动物体内癌症所需要的量。最终，由主治医师或者兽医决定适当的剂量和给药方案。
如这里所使用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指的是对患有不利病况、异常或者疾病并具有临床症状的个体给药一种试剂或者制剂，从而起到减少症状严重性和/或出现率，消除所述症状和/或其起因，和/或促进改善或者补救损伤的作用。
术语“预防”和“防止”指的是通过向对某种不利病况、异常或者疾病敏感但是无临床症状的个体给药一种试剂或者组合物，从而防止症状出现和/或其诱因。
过渡术语“包括(comprising)”与“包含(including)”、“含有(containing)”或者“具有...的特征”是同义词，都属于包括性的或者开放式定义，不排除其他未列出的成分或者方法步骤。相反，术语“由。。。组成”不包括任何在权利要求中没有特别指出的成分、步骤或者组分。术语“基本上由。。。组成”将权利要求的范围限制在指定的材料或者步骤，“以及那些本质上不影响要求保护的发明的本质和新颖特性的材料或者步骤”。
从下面关于本发明优选的实施方案的表述中，以及从权利要求书中，本发明的其他特点和优势将变得显而易见。除非另有定义，这里使用的所有科技用语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。虽然与这里描述的方法和材料相似的任何方法和材料都可以被用于实施或者检测本发明，但是下面描述的是适当的方法和材料。这里应用的所有公开的外国专利和专利申请在此通过引证全部并入本文。Genbank和NCBI指明的登记号码也通过引证在此全部并入本文。这里引用的其他出版的参考文献、文件、原稿和科学文献通过引证在此全部并入本文。如果出现矛盾，以本发明说明书包括定义为准。此外，这里所述的材料、方法和实施例只起到说明作用，并不作为限制。
附图说明
图1A是在使用或者不使用抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体治疗几天后，患有黑素瘤小鼠体内肿瘤尺寸的图表。数值表示平均偏差和标准偏差(n＝10)。
图1B是Kaplar Meier生存曲线，表示了在使用或者不使用抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体治疗的患有黑素瘤小鼠的存活时间。
图2A是在使用或者不使用疫苗和/或抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体治疗几天后，患有黑素瘤小鼠体内肿瘤面积的图表。数值表示平均偏差和标准偏差(n＝10)。除非另作说明，与所有其他实验条件相比*P<0.05。
图2B是Kaplar Meier生存曲线，表示了在使用或者不使用疫苗和/或抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体治疗后患有黑素瘤小鼠的存活时间。数值表示平均偏差和标准偏差(n＝10)。
图3A是存在于B16肿瘤中的CD3+CD8+肿瘤渗透T细胞数目的条形图，所述B16肿瘤提取自使用或者不使用疫苗和/或抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体治疗后的患有黑素瘤的老鼠。数值表示平均偏差和标准偏差(n＝5)。除非另作说明，与所有其他实验条件相比*P<0.05**P<0.01。
图3B是存在于B16肿瘤中的CD3+CD8+效应性T细胞与CD3+FoxP3+T调节细胞比值的条形图，所述B16肿瘤提取自使用或者不使用疫苗和/或抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体治疗后的患有黑素瘤的老鼠。数值表示平均偏差和标准偏差(n＝5)。除非另作说明，与所有其他实验条件相比*P<0.05**P<0.01。
图4A是CD3+T细胞过滤物的流式细胞计直方图，所述CD3+T细胞过滤物是从用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗单独治疗(VAX)或者与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体联合治疗(VAX+CTLA-4)14天的小鼠中分离出来的。
图4B显示了从小鼠中分离的CD3+CD8+效应因子T细胞总额的条形图，所述所述小鼠被植入空白基质(Con)、单独的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗(VAX)、或者疫苗与抗PD1的结合物(VAX+PD1)、或者疫苗与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)的结合物(VAX+CTLA)14天。数值表示平均偏差和标准偏差(n＝5)。除非另作说明，与所有其他实验条件相比*P<0.05**P<0.01。
图5A是一种流失细胞分布图，显示了四个处理组中对CD8和CD107a呈阳性的脚手架中分离的细胞群落的百分比。
图5B是一种条形图，显示了活化的CD8+细胞数、对CD107a和IFNγ呈阳性的脚手架-过滤的T细胞的细胞数增加的倍数。数值表示平均偏差和标准偏差(n＝5)。除非另作说明，与所有其他实验条件相比*P<0.05**P<0.01。
图6A是荧光激活细胞分类术分布图板，显示了从聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗移植物中分离的T细胞滤出物的比例，所述PLG疫苗移植物在只有疫苗治疗的小鼠中(VAX)、用疫苗加抗-细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体治疗的小鼠中(VAX+CTLA4)和用疫苗加抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体(VAX+PD1)治疗的小鼠中表达CD4、CD8和/或FoxP3。
图6B是一种条形图，显示了小鼠疫苗接种位点处CD3+CD8+效应因子T细胞与CD4+FoxP3+T细胞的比例，所述小鼠只用疫苗治疗(VAX)、或者用疫苗与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体(VAX+CTLA)、或者用疫苗与抗PD1(VAX+PD1)抗体治疗14天。数值表示平均偏差和标准偏差(n＝5)。除非另作说明，与所有其他实验条件相比*P<0.05**P<0.01。
图7A是一组流式细胞仪直方图，显示了小鼠疫苗引导淋巴结中CD8+效应性T细胞的数目，所述小鼠只用疫苗治疗(VAX)或者用疫苗与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体治疗(VAX+CTLA)、或者用疫苗与抗PD1(VAX+PD1)抗体治疗。
图7B是一组流式细胞仪直方图，显示了小鼠疫苗引导淋巴结中FoxP3+Treg细胞的数目，所述小鼠只用疫苗治疗(VAX)或者用疫苗与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体治疗(VAX+CTLA)、或者用疫苗与抗PD1(VAX+PD1)抗体治疗。
图8A是一组条形图，显示了小鼠疫苗引导淋巴结中T细胞的百分比，所述T细胞是CD8+或者FoxP3+，所述小鼠只用疫苗治疗(VAX)或者用疫苗与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体结合治疗(VAX+CTLA)、或者用疫苗与抗PD1(VAX+PD1)抗体结合治疗。数值表示平均偏差和标准偏差(n＝5)。除非另作说明，与所有其他实验条件相比*P<0.05**P<0.01。
图8B是一组条形图，显示了小鼠疫苗引导淋巴结中CD8+T细胞与FoxP3+T细胞的比例，所述小鼠只用疫苗治疗(VAX)或者用疫苗与抗T细胞毒性T-淋巴T细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体结合治疗(VAX+CTLA)、或者用疫苗与抗PD1(VAX+PD1)抗体结合治疗。数值表示平均偏差和标准偏差(n＝5)。除非另作说明，与所有其他实验条件相比*P<0.05**P<0.01。
图9A-图9D是一系列条形图，说明了多检验点阻断剂与聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)癌症疫苗的结合。图9A是条形图，显示了小鼠体内B16黑素瘤的尺寸，所述小鼠接种105肿瘤细胞，并只用疫苗治疗(V)、或者用疫苗和抗PD-1(+P)、抗-CTLA4(+C)分别结合治疗，或者与PD-1和细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)共同结合治疗(+P+C)35天。图9A是条形图，显示了CD8(+)T细胞的数目，图9C是条形图，显示了从小鼠B16肿瘤中分离出来的FoxP3(+)Tregs细胞数目，所述小鼠用105肿瘤细胞接种，并只用疫苗治疗(V)、或者用疫苗和抗PD-1(+P)、抗-CTLA4(+C)分别结合治疗，或者与PD-1和细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)共同结合治疗(+P+C)35天。图9D是条形图，显示了小鼠B16肿瘤中CD8(+)T细胞和FoxP3(+)Tregs细胞比例，所述小鼠用105肿瘤细胞接种，并只用疫苗治疗(V)、或者用疫苗和抗PD-1(+P)、抗-CTLA4(+C)分别结合治疗，或者与PD-1和细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)共同结合治疗(+P+C)35天。B(n＝8)、C和D(n＝5)中的数值表示平均值和标准差。如图所示，与所有其他实验条件相比*P<0.05**P<0.01。
图10A-图10E是一系列直方图和点绘图，显示了聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与阻断剂抗体结合施用能够增加肿瘤内效应性T细胞活性。图10A是直方图，显示了从未被处理的小鼠(参照)和只用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗治疗的小鼠(Vax)或者用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与抗PD-1(+PD-1)和抗CTLA-4(+CTLA4)抗体结合治疗的小鼠的B16肿瘤中分离除了CD3(+)CD8(+)T细胞的总数。图10B是直方图，显示了从未被处理的小鼠(参照)和只用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗治疗的小鼠(Vax)或者用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与抗PD-1(+PD-1)和抗CTLA-4(+CTLA4)抗体结合治疗的小鼠的B16肿瘤中分离的CD3(+)FoxP3(+)T调节细胞的总数。图10C是直方图，显示了从未被处理的小鼠(参照)和只用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗治疗的小鼠(Vax)或者用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与抗PD-1(+PD-1)和抗CTLA-4(+CTLA-4)抗体结合治疗的小鼠的B16肿瘤中分离的CD3(+)CD8(+)T细胞与CD3(+)FoxP3(+)T调节细胞的比例。图10D是一系列荧光激活细胞分类图，显示了从未被处理的小鼠(参照)和只用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗治疗的小鼠(Vax)或者用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与抗PD-1(+PD-1)和抗CTLA-4(+CTLA4)抗体结合治疗的小鼠的肿瘤中肿瘤过滤白血球。在第18天制备来自肿瘤的单细胞悬浮液并对活化的、细胞毒性T细胞标记物、CD8(+)和CD107a染色。荧光激活细胞分类术中的数目显示对两种标记物都呈阳性的细胞群体百分比。图10E是直方图，显示了在空白基质(参照)中、单独PLG疫苗或者疫苗与抗-PD-1和抗-CTLA-4结合物中，对IFNγ或者CD107a呈阳性的CD8(+)、肿瘤过滤T细胞数目。除非另作说明，与只使用疫苗相比(V vs V+P；V vsV+C)，*P<0.05**P<0.01。
图11是直方图，显示了从未被处理的小鼠(参照)和只用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗治疗的小鼠(Vax)或者用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与抗PD-1(+PD-1)和抗CTLA-4(+CTLA-4)抗体结合治疗的小鼠的B16肿瘤中分离的CD3(+)CD8(+)T细胞与CD3(+)FoxP3(+)T调节细胞的比例。数值表示平均偏差和标准偏差(n＝5)。V+C与其他实验条件相比，计算所得**P<0.01。
图12是点绘图，显示了用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗接种之后，停止抗体治疗对肿瘤生长的作用。比较患有确诊的黑素瘤(用5x105B16-F10细胞接种)并用单独的疫苗治疗(V)或者使用疫苗与抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)结合静脉注射治疗(V+P)或者疫苗与抗CTLA-4抗体结合静脉治疗(V+C)后的小鼠体内的肿瘤面积。每个数据点代表一个动物(n＝8)并且点绘图中的线代表平均肿瘤面积。
具体实施方式
在本发明之前，癌症疫苗通常依赖实验室中繁重并昂贵的细胞操作，以及随后的细胞移植，使较弱的淋巴结复位并产生有限的作用。根据癌症治疗，由于癌症可以指派免疫检验点途径从而避开内源性的免疫反应，所以许多现存的治疗剂都是无效的。虽然已经有试剂被识别并用于预防或者最小化癌细胞避开免疫系统的能力，但是这些试剂在免疫原性较差的肿瘤中效力不足。本发明使用能够模拟细菌感染关键方面的适于癌症接种的材料直接控制免疫细胞运输及在体内的活化，从而解决这些问题。本发明进一步将这些癌症疫苗与免疫-抑制性蛋白质(例如，免疫检验点蛋白质)的抑制剂相结合，从而使内源性免疫反应足够有力的消除肿瘤或者最小化肿瘤进程。同样，癌症疫苗有效的与免疫-抑制性蛋白质抑制剂发挥协调作用，使在治疗癌症时需要的抑制剂剂量与使用抑制剂作为单一制剂时所需要的剂量相比有所下降。
这里所描述的结果说明聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)癌症疫苗在黑素瘤模型中产生显著数量的抗原特异性T细胞。总之，为了检验疫苗和抗体(例如，抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)和/或抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体)的结合治疗作用，使用一种侵略性的治疗性的B16黑素瘤型号。在患有B16黑素瘤的小鼠中，单独使用抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体和抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体对肿瘤尺寸和这些动物的存活率没有影响(图1A-B)。聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗平常地抑制肿瘤进展但是不影响患有B16黑素瘤小鼠的长期存活率。意外的，将CTLA-4抗体和PD-1抗体分别与聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗一起施用能够促进小鼠的长期存活率分别到75％和40％，否则，如果用这些制剂单独治疗时，这些小鼠会死亡。这些治疗在肿瘤位点和疫苗内协同促进重要的T细胞活性(图3A-6B)。相对于抑制性调节的T细胞活性，该反应显著的倾向于细胞毒性T细胞活性，并且当抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体与疫苗接种相结合时，这些反应可以维持更长的时间(图6B)。
免疫检验点途径和癌症
在健康的主体中，免疫检验点途径(亦称免疫-抑制性途径)对维持自体耐受性和预防自身免疫很重要。然而，在癌细胞中的免疫检验点途径通常是失调的，导致肿瘤有能力避开身体的内源性抗肿瘤免疫反应。癌症通过许多方式指派免疫检验点途径，例如，上调通常起到免疫抑制作用的免疫检验点蛋白质的表达。例如，抑制性配体和调节T细胞效应因子活性的受体通常在癌细胞中过表达。
抑制示范性的抑制性受体是细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)，也叫做CD152，他可以降低T细胞活化作用水平。另一个示范性的抑制性受体是程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)，也叫做CD279，这可以限制效应性T细胞活性。例如，癌细胞上调程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)配位体(例如程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1))，从而阻断抗肿瘤免疫反应。
在癌症免疫疗法中，免疫检验点阻断剂已经开始作为一种有前途的方式来对抗使癌细胞避开抗肿瘤免疫反应的机制。例如，针对免疫-抑制性蛋白质的抗体，例如，免疫检验点蛋白质(在这里也被认为是阻断剂抗体)正在作为一种潜在的抗癌症治疗剂被研究。参见，例如，Pardoll.Nat.Reviews Cancer.(2012)12:252-264.
免疫-抑制性蛋白质及其抑制剂
免疫检验点蛋白质包括B7/CD28受体大族。CTLA-4属于受体的免疫球蛋白总科，受体的免疫球蛋白总科还包程序性细胞死亡蛋白质(PD-1)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA)、T细胞免疫球蛋白和包含粘蛋白结构域的蛋白质3(TIM-3)，和T细胞活化作用的V-结构域免疫球蛋白抑制子(VISTA)。其他免疫调节检验点蛋白质包括肿瘤坏死因子族的蛋白质(例如，OX40(也叫做CD134)和4-1BB)配位体。
实验室老鼠VISTA的氨基酸序列显示如下：由Genbank Accession No.AEO22039.1提供(SEQ ID NO:1)
编码实验室老鼠VISTA的mRNA序列显示如下(SEQ ID NO：2)，由Genbank登记号JN602184.1提供，起始密码子和终止密码子用黑体表示。
人OX40配位体的氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：3)，有Genbank登记号NP_003318.1提供，其中信号肽显示为带有下划线的自体，成熟肽显示为斜体字。
编码人OX40配位体的mRNA序列显示如下(SEQ ID NO：4)，由Genbank登记号NM_003327.3提供，起始密码子和终止密码子用黑体表示。
人4-1BB的氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：5)，有Genbank登记号NP_001552.2提供，其中信号肽显示为带有下划线的自体，成熟肽显示为斜体字。
人4-1BB的mRNA序列显示如下(SEQ ID NO：6)，由Genbank登记号NM_001561.5提供，起始密码子和终止密码子用黑体表示。
细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)是只在T细胞上表达的受体，并且它能通过干扰T细胞共-刺激性受体CD28活性来减少T细胞活化水平。细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)是癌症免疫疗法(例如，通过与细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)结合或者阻断细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)的抗体)的目标。易普利姆玛(Ipilimumab)(由Bristol-Myers Squibb公司制造)是完全人源化的抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体，已经被美国食品与药物管理局(FDA)批准用于治疗黑素瘤(尤其是，不可切除的或者转移性的黑素瘤)并且正在进行用于其他癌症的临床试验。替西木单抗(Tremelimumab)(由辉瑞公司；CAS号745013-59-6)是完全人源化的IgG2单克隆抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体，正在进行用于治疗黑素瘤的临床试验。
人细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：7)，由Genbank登记号P16410.3提供
SEQ ID NO：7的氨基酸残基36-223相当于细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)的成熟序列。人细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)的mRNA序列显示如下(SEQ ID NO：8)，由Genbank登记号AF414120.1提供。
atg起始密码子和终止密码子是加粗并带下划线的。
细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)的阻断剂能够启动之前存在的内源性抗肿瘤免疫反应从而破坏肿瘤。因此，当在主体中存在内源性的抗肿瘤免疫反应时，细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)的抑制作用提高了对免疫反应的抵抗力并允许身体免疫细胞破坏癌细胞。然而，在免疫原性较差的肿瘤中，所述内源性免疫反应或者是不存在的，或者太弱而不能杀死癌细胞，并且单独的细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抑制作用具有最小的效力。
程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)的作用是在对感染的免疫反应期间限制外周组织中的T细胞活性并最小化自身免疫作用。程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)在活化的淋巴细胞上表达，所述活化的淋巴细胞包括活化的效应性T细胞、B细胞和天然致死(NK)细胞。适合程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)的配位体包括程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1，也叫做B7-H1和CD274)、和程序性细胞死亡蛋白质2配位体(PDL2，也叫做B7-DC和CD273)。程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)当与它的配位体结合起来时，抑制淋巴细胞功能。在患有癌症的主体中，程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)常常在大百分数的肿瘤过滤淋巴细胞上表达。同样，程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)在癌症，例如黑素瘤、卵巢癌、肾癌和肺癌中过表达。PDL2在淋巴瘤细胞中过表达，所述淋巴瘤例如B细胞淋巴瘤(例如，主要纵隔的B细胞淋巴瘤、卵泡细胞B细胞淋巴瘤和霍金氏病)。因此，程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)和它的配位体在肿瘤微环境中发挥主要免疫抑制作用，并因此适合于作为癌症免疫疗法的目标。
编码人程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)的mRNA序列显示如下(SEQ ID NO：9)，由Genbank登记号NM_005018.2提供。
atg起始密码子和终止密码子是加粗并带下划线的。
人程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)的氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：10)，由Genbank登记号NP_005009.2提供。
SEQ ID NO：10的残基1-20相当于信号肽序列，并且SEQ ID NO：10的残基21-288相当于成熟肽序列。
人程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)的氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：11)，由Genbank登记号Q9NZQ7.1提供，通过引证在此全部并入本文。
编码人程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)的mRNA序列显示如下(SEQ ID NO：12)，由Genbank登记号AY291313.1提供，通过引证在此全部并入本文，起始密码子和终止密码子用黑体表示。
人PDL2的氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：13)，由Genbank登记号Q9BQ51.2提供，通过引证在此全部并入本文。
编码人PDL2的mRNA序列显示如下(SEQ ID NO：14)，由Genbank登记号AF344424.1提供，通过引证在此全部并入本文，起始密码子和终止密码子用黑体表示。
MDX-1106(也叫做BMS-936558；由Bristol Myers Squibb公司制造)是一种PD1人单克隆抗体，正在进行用于黑素瘤、肾癌和肺癌的临床试验。参见，例如，临床试验标识符号NCT00730639。MK-3475(由默克公司制造)是一种针对程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)的单克隆IgG4抗体，正在经历用于预先治疗患有非小细胞肺癌(NSCLC)的临床试验。CT-011(也叫做pidilizumab，由Cure Tech公司制造)是一种针对程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)是人源化的单克隆抗体，并且正在进行用于转移性结肠直肠癌症、转移性的黑素瘤和淋巴瘤的临床试验。AMP-224(由葛兰素史克和Amplimmune公司研发)是一种包含程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)配位体的Fc融合蛋白质。AMP-224阻断程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)和程序性细胞死亡蛋白质2配位体(PDL2)或者程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)之间的相互作用。AMP-224正在经历用于癌症的临床试验。参见，例如，临床试验标识符号NCT01352884。MDX1105(由Bristol-Myers Squibb公司制造)是一种完全人单克隆IgG4抗程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)抗体并且正在进行针对癌症(例如，复发的/难治的肾细胞癌，NSCLC，结肠直肠腺癌，恶性黑色素瘤，促进性/转移性上皮细胞的卵巢癌，胃癌，胰腺癌，和乳腺癌)的临床试验。参见，例如，临床试验标识符号NCT00729664。
除免疫检验点受体之外，B7族免疫抑制的配位体也是免疫-抑制性蛋白质，是适合于癌症免疫疗法的候选目标。例如，B7-H3(也叫做CD276)和B7-H4(也叫做B7-S1、B7x或者VCTN1)已经被包括在免疫抑制中。另外，B7-H3和B7-H4在癌细胞上过表达并在肿瘤过滤细胞上过表达。MGA271(Macrogenics公司制备)是一种人源化的IgG1/κ单克隆抗体，抗B7-H3，并且目前正在进行用于难治的表达B7-H3的赘生物(例如，前列腺癌症和黑素瘤)的临床试验。参见，例如，临床试验标识符号NCT01391143。
人B7-H3的氨基酸序列由Genbank登记号Q5ZPR3.1通过，通过引证在此全部并入本文。编码人B7-H3的mRNA序列由Genbank登记号AJ583695.1提供，通过引证在此全部并入本文。
人B7-H4的氨基酸序列由Genbank登记号Q7Z7D3.1提供，通过引证在此全部并入本文。编码人B7-H4的mRNA序列由Genbank登记号DQ103757.1提供，通过引证在此全部并入本文。
许多其他的蛋白质已经被证明与免疫细胞活性的抑制有关，并且因此也可以作为癌症免疫疗法的潜在目标。这些蛋白质包括淋巴细胞活化基因3(LAG3或者CD223)、2B4(CD244)、B和T淋巴细胞衰减子(BTLA、CD272)、T膜蛋白质3(TIM3，HAVcr2)、腺苷酸A2a受体(A2aR)和致死抑制性受体。致死抑制性受体包括致死细胞免疫球蛋白-样受体(KIRs)和C-型瘦蛋白受体，这两个都能调节NK细胞的致死活性。IMP321(Immutep公司制备)是一种可溶的淋巴细胞活化基因3(LAG3)-免疫球蛋白融合蛋白质，能够靶向淋巴细胞活化基因3(LAG3)，并且目前在进行研究，用于预测肾细胞腺癌和促进的胰腺腺癌。(参见，例如，Brignone et al.Clin.Cancer Res.(2009)15:6225-6231和Wang-Gillam etal.Invest.New Drugs(2013)31:707-13.
人BTLA的氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：15)，由Genbank登记号NP_861445.3提供，其中信号肽显示为带有下划线的自体，成熟肽显示为斜体字。
编码人BTLA的mRNA序列显示如下(SEQ ID NO：16)，由Genbank登记号NM_181780.3提供，通过引证领进此全部并入本文，起始密码子和终止密码子用黑体表示。
人TIM3的氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：17)，由Genbank登记号Q8TDQ0.3提供，通过引证在此全部并入本文。
编码人TIM3的mRNA序列显示如下(SEQ ID NO：18)，由Genbank登记号AF450242.1提供，通过引证在此全部并入本文。
抑制剂和疫苗的结合
因此，当在主体中存在内源性的抗肿瘤免疫反应时，如上所述免疫-抑制(例如，免疫检验点)蛋白质的抑制作用提高了癌细胞对免疫反应的抵抗力并允许身体免疫细胞破坏癌症。然而，在免疫原性较差的肿瘤中，所述内源性免疫反应或者是不存在的，或者太弱而不能杀死癌细胞，并且单独的免疫-抑制性蛋白质抑制作用具有最小的效力。
为了解决这一问题，本发明提供了一种方法，这种方法利用癌症疫苗装置和免疫-抑制性蛋白质抑制剂的组合。如在工作实施例中描述的细节，与单独给药抑制剂相比，这一结合令人意外的导致肿瘤尺寸的大幅下降并使存活时间变得更长。这里描述了一种基于材料的(例如，聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG))疫苗，所述疫苗已经被最优化，例如，相对于其他疫苗制剂，控制粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和辅料的存在，从而提高T效应子活性和下调Treg细胞和其他可以由一些辅料引起的免疫抑制性机制。基于材料的疫苗与之前的疫苗系统相比表现了显著的优势，所述优势在于，它构建了一种肿瘤和疫苗的微环境，此微环境优先通过增加效应因子T细胞产生和扩张穿过Treg细胞来响应免疫-抑制性蛋白质，例如，抗CTLA-4。
本发明的特征在于一种癌症疫苗装置，其包括一种或者一种以上(例如，1、2、3、4、5、6或者更多)免疫-抑制性蛋白质的抑制剂。例如，所述抑制剂整合在癌症疫苗装置中或者在癌症疫苗装置上，例如，整合入或者整合在装置内的脚手架组合物上。给药包含所述抑制剂(们)的癌症疫苗装置能够实现抑制剂的定点传递，例如，与疫苗相同的位点传递。
在制造所述装置时，抑制剂可以被封装入所述疫苗装置中。做为选择，在制造完成之后，所述抑制剂被加入所述疫苗装置。例如，所述抑制剂被封装在用于制造所述疫苗的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体中，与CpG和蔗糖结合，在泡沫化前被加入到聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)中，或者在制备完成后加入到疫苗装置中，例如通过吸附到装置表面、或者通过将抑制剂放置在一种持续释放制剂中，所述持续释放制剂随后与所述疫苗装置结合。
例如，所述癌症疫苗装置包括细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体和/或程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体。
本发明还提供了一种致死癌细胞、放缓癌症进程、减少肿瘤尺寸、延迟癌症病人存活时间、和/或通过将癌症疫苗与免疫-抑制性蛋白质抑制剂共同给药治疗癌症的方法。
例如，所述疫苗和抑制剂分别配制，那就是说所述抑制剂不包括在所述疫苗装置内。在一些实施方案中，所述疫苗和一种或者一种以上(例如，1，2，3，4，5，6，或者更多)抑制剂(们)同时给药。在其它情况下，所述疫苗和所述抑制剂(们)顺序给药。例如，所述抑制剂(们)在给药疫苗之前至少6小时(例如，6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1.5周、2周、3周、4周或更长时间)给药。在其它情况下，所述疫苗在给药抑制剂(们)之前至少6小时(例如，6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1.5周、2周、3周、4周或更长时间)给药。在其他实施方案中，所述疫苗和抑制剂是一起配制的，那就是说，所述抑制剂包括在所述疫苗装置内或者包覆在疫苗装置上。
例如，抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体和/或抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体与所述疫苗装置结合共同给药(例如，同时给药或者顺序给药)。
抑制剂(们)和疫苗的结合能提供某些优势。例如，该结合协同诱导能够过滤肿瘤的效应性T细胞活性。同样，该结合增加局部效应性T细胞活性(例如，非常接近于移植的疫苗装置的T细胞和/或疫苗引流淋巴结中的T细胞)。同样，抑制剂(们)和疫苗在相同的装置中的结合与非装置性疫苗与所述抑制剂(们)的结合相比具有优势。尤其是，在所述疫苗装置中包括抑制剂，允许靶向局部或者特异性免疫细胞(例如，特异性募集到装置中的那些细胞)。与抑制剂的系统性给药不同，抑制剂的局部给药有时会导致更小的毒性并且发挥效力需要的剂量也降低。
在一些情况下，所述抑制剂在疫苗装置之前被给药。例如，在给药抑制剂(例如，抗体)之后，例如，一周之内，免疫细胞渗透进入肿瘤位点。这种渗透可能导致肿瘤尺寸暂时增加。在给药(例如植入)疫苗装置后，肿瘤尺寸发生退化。例如，在给药疫苗装置至少1周(例如，1周，2周，3周，4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，12周，13周，14周，15周，16周，17周，18周，19周，20周，30周，40周，50周，60周或更长的时间内)发生肿瘤退化。在一些情况下，与给药抑制剂和/或疫苗装置之间的肿瘤尺寸相比，所述抑制剂和疫苗装置的组合使肿瘤尺寸减少(例如，至少减少10％，例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或者更多)。在一些实施例中，抑制剂和疫苗的结合使肿瘤完全消失。
通过本领域标准方法确定肿瘤尺寸。例如，肿瘤尺寸是肿瘤重量或者肿瘤面积。肿瘤尺寸(面积为平方毫米)是，例如，肿瘤的两个最长直径的产物。可以使用标准方法测量肿瘤直径(例如，用测径规)。在其他实施例中，肿瘤的肿瘤也是他尺寸的度量。
癌症疫苗装置
在癌症疫苗中，适合于癌症疫苗接种的Toll样受体(TLR)激动剂的呈递导致免疫细胞活化作用的改善。所述疫苗和方法包括整合并呈递迁入在结构聚合装置中的Toll样受体(TLR)激动剂。CD8(+)树突状细胞(DCs)和浆样树突状细胞(DC)(以及传统的树突状细胞(DC))在癌症疫苗接种中发挥至关重要的作用，使用包括Toll样受体(TLR)激动剂的结构聚合装置优先募集并活化这些细胞。所述装置被制成一种小的生物工程多孔盘，其中装满肿瘤特异抗原和Toll样受体(TLR)激动剂。这种盘被植入人体，例如，插入皮肤下，在此活化免疫系统，毁坏癌细胞。该方法改编已经存在于身体内的细胞。
在一些实施例中，所述装置包括一种募集组分。因此，所述装置选择性地包括一种募集分子，比如一种细胞因子。在一些情况下，聚合物被设计成首先释放一种细胞因子，用于募集和收容宿主树突状细胞(DC)，随后呈递癌症抗原和危险信号，以活化存留的树突状细胞(DC)并显著提高其瞄准淋巴结。在这些材料中发生特异性的保护性的抗肿瘤免疫性。例如，在动物中实现90％的存活率，否则在25天内死于癌症。这些材料可以有效用于癌症及其他疫苗中，用于编程并控制体内各种细胞类型的运输。
聚合物系统被设计成不仅能够用作药物传递装置，还可以作为一种物理的抗原呈递结构，此结构可以募集树突状细胞(DC)，并且，使用材料(聚[丙交酯-共-乙交酯])(PLG)和生物活性分子(例如，粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))活化树突状细胞(DC)，在被活化时，该树突状细胞(DC)所居住于此抗原呈递结构中。这些生物活性分子具有突出的安全曲线。所述材料系统可以用作一种有效的癌症疫苗，消除现有细胞治疗剂所具有的时间、费用和调整负担，并减少或者消除多次、全身注射的需要和高的总药装载量。这里所描述的装置使用感染模拟材料原位编程树突状细胞(DC)。
本发明包括大孔聚合物基质，这些大孔聚合物基质能够通过精确控制粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)助剂的呈递调节树突状细胞的体内运输和活化(Ali et al.,2009Nat Mater,2:151–8；Ali et al.,2009Sci Transl Med,1:8–19).当作为疫苗使用时，这些基质会导致CTL-调节的黑素瘤肿瘤的根除(Ali et al.,2009Sci Transl Med,1:8–19).
大孔聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质可以在体内，以预先确定的空间与时间方式呈递粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、危险信号和癌症抗原，并且按照其所编程的，存留于此募集树突状细胞(DC)。如美国2013-0202707使用高压二氧化碳泡沫法将粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)封装入聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架中。粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)从基质中的释放曲线允许所述因子通过周围组织扩散，从而有效的募集固有的树突状细胞(DC)。
利用原位靶向树突状细胞的系统，使用Toll样受体(TLR)激动剂治疗性的控制免疫系统。如US2013-0202707(通过引证在此全部并入本文)中的详细描述，设计大孔聚合脚手架从而在体内传递三种不同种类的Toll样受体(TLR)激动剂：胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)、单磷酸脂A(MPLA)和聚肌苷：聚胞苷P(I:C)与粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L或者CCL20的结合，以扩大树突状细胞(DC)的募集和活化。树突状细胞(DC)的各个亚群被募集并用于原位疫苗接种。无论Toll样受体(TLR)激动剂的类型或者剂量如何，这些系统提供免疫预防和消除肿瘤的能力需要CD8(+)树突状细胞(DC)，并且与浆样树突状细胞(DC)(pDCs)和IL-12产生高度相关。
炎症性调节因子
树突状细胞(DC)增殖、迁移和成熟过程对于炎症性调节因子十分敏感，并且粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)已经被认为是一种有效的免疫反应刺激因子，具体的说，抗癌症抗原免疫反应细胞因子。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)还能够募集和编程抗原呈递免疫细胞。另外，在细菌DNA中发现的胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)低聚核苷酸(CpG-ODN)序列是一种有效的免疫调节剂，所述免疫调节剂刺激树突状细胞(DC)活化，导致特异性T细胞反应。通过呈递外源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)创建感染模拟微环境，这为精确控制树突状细胞迁移的数目和时间并调节抗原特异性免疫反应提供了一条途径。
脊椎动物免疫系统使用各种的机制进行病原体识别，这使其更易于产生抗原特异性反应并清除感染。通过抗原递呈细胞(APCs)，尤其是树突状细胞(DC)来控制免疫性，这可以捕获抗原并被刺激因子活化，所述刺激因子是侵入的病原体独特的“危险信号”，例如细菌DNA中胞嘧啶-鸟嘌呤CpG二核苷酸序列(Banchereau J，and Steinman RM.Nature.392，245-252.(1998)；Klinman DM.Nat.Rev.Immunol.4，249-58(2004)；该专利通过引证在此并入本文)。
然而，来源于自体组织的癌细胞不含有信号树突状细胞(DC)成熟过程所需要的危险信号，并且反而能够促进允许细胞逃避免疫性的免疫抑制微环境。感染的关键元素是炎症性细胞因子和危险信号。聚合材料系统能够理想的以所需要的时间空间方式呈递这些因子，从而提供了一种原位感染模拟微环境，可以有效的用作疫苗。这些感染模拟物提供了连续编程的宿主树突状细胞(DC)，为有效的树突状细胞活化和原位分配做准备。这些感染模拟装置可以有效用于多种疫苗应用，包括黑素瘤癌症疫苗。
在许多感染中，炎症性细胞因子和危险信号刺激特异性树突状细胞(DC)反应，所述特异性树突状细胞(DC)反应能调节免疫识别和病原体清除率(图1)。例如，随着细菌感染和毒素释放，皮肤细胞(例如，成纤维细胞、角质化细胞和黑素细胞)受到损伤，导致炎症性细胞因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))的释放(Hamilton J.Trends inImmunol.23，403-408.(2002)；Hamilton J.，and Anderson G.Growth Factors.22(4)，225-231.(2004)；该专利通过引证在此并入本文)，该释放能够募集郎格涵树突状细胞(DC)(皮肤)和树突状细胞(DC)前体(单核细胞；血液)(Hamilton J.Trends in Immunol.23，403-408.(2002)；Hamilton J.，and Anderson G.Growth Factors.22(4)，225-231.(2004)；Bowne W.B.，et al.Cytokines Cell Mol Ther.5(4)，217-25.(1999).；Dranoff，G.Nat.Rev.Cancer 4，11-22(2004)；该专利通过引证在此并入本文)。当树突状细胞到达感染位点后开始分化，然后响应于发炎，增加吞噬细胞能力。(Mellman I.，and SteinmanR.M.Cell.106，255-258.(2001)，该专利通过引证在此并入本文)，并且，吸收了细菌或者其产物的树突状细胞(DC)开始处理抗原，并且通过细菌DNA中的CpG二核苷酸序列刺激的内TLR9信号传导进行树突状细胞(DC)的成熟过程(Krieg A.M.，Hartmann G.，and WeinerG.J.CpG DNA：A potent signal for growth，activation，and maturation of humandendritic cells.Proc Natl Acad Sci U S A.16，9305-9310(1999)，该专利通过引证在此并入本文)。然后成熟的树突状细胞(DC)回到淋巴结，并在此激发抗原特异性T细胞反应，清除感染。
胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)是有效的“危险信号”，能够上调CCR7、CD80/86共刺激分子的树突状细胞(DC)表达和MHC-抗原复合物。重要地是，TLR9信号诱导树突状细胞(DC)，通过产生细胞因子(例如1类IFN)和在MHCI分子上交叉呈递抗原来促进Th1-样、细胞毒性-T细胞反应。这些信号和肿瘤抗原一起呈递，提供了一种免疫信号，这种免疫信号是促进有效抵抗癌细胞的免疫反应所必须的。
根据低聚核苷酸(ODN)不同的结构和序列，不同种类的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CPG-ODN)促进不同的免疫反应。本发明利用的低聚核苷酸(ODN)是胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)1826，这已经在多种小鼠疫苗接种模型(包括黑素瘤)中被成功的检验了。胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)1826在单独使用时或者用作肽疫苗和全细胞疫苗的助剂时显示有益的效果。而且，已经显示ODN 1826能够直接促进树突状细胞(DC)成熟过程和细胞因子产生。这些具体的CpG ODN序列还能间接活化Th1细胞和NK细胞，并且，因此增加适应性细胞免疫反应。
已经研发出能够促进CpG内化入树突状细胞(DC)，增加传递及其对TLR9定位能力的载体系统。富含胺的聚阳离子、聚(氮丙啶)(PEI)已经广泛的用于浓缩质粒DNA，通过与DNA磷酸基的结合，导致小正电荷浓缩物，促进细胞膜结合和DNA被细胞吸收(Godbey W.T.，Wu K.K.，and Mikos，A.G.J.of Biomed Mater Res，1999，45，268-275；Godbey W.T.，WuK.K.，and Mikos，A.G.Proc Natl Acad Sci U S A.96(9)，5177-81.(1999)；该专利通过引证在此并入本文)。因此，聚(氮丙啶)(PEI)已经被用作一种非病毒载体，提高基因转染并制造装载有聚(氮丙啶)(PEI)-DNA的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质，促进宿主细胞中的原位长效基因表达(Huang YC，Riddle F，Rice KG，and Mooney DJ.Hum Gene Ther.5，609-17.(2005)，该专利通过引证在此并入本文)。因此，在本发明中胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)与聚(氮丙啶)(PEI)分子一起浓缩。这些聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物的尺寸和电荷取决于胺类-磷酸盐电荷比，并对其进行表征。评价聚(氮丙啶)(PEI)冷凝作用增加的树突状细胞(DC)内化胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的能力，然后在树突状细胞(DC)中对聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)去冷凝，体外分析树突状细胞活化的促进作用(US2013-0202707，该专利通过引证在此全部并入本文，例如，第86页1-7行和图3)。
为了适当的模拟感染和原位编程细胞，设计一种聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)系统，这种系统不但可以作为一种药物传递装置释放炎症性细胞因子(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))，还可以作为一种可以募集树突状细胞并使其在被危险信号(例如，CpG-ODN)活化时居住于此的物理结构。通过暂时控制粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的原位传递来实现控制多孔的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质中树突状细胞(DC)募集和存留的能力，这回导致一批被编程的树突状细胞(DC)在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)浓度原位下降时被分散。例如该系统向淋巴结分散至少5％(例如，大约6％)的编程的树突状细胞(DC)，并且，当作为癌症疫苗时，该系统在至少20％(例如，大约23％)的小鼠中诱导保护性的抗-肿瘤免疫性。使用过载的二次信号(胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))能够改善细胞编程和分散效率，所述二次信号能够连续的从粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)抑制中释放树突状细胞(DC)，并在高水平粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)存在的情况下原位促进树突状细胞(DC)的成熟和分散。具体地说，制备聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质来局部呈递具有外源粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的合成的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)，允许粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)募集的树突状细胞(DC)被胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)原位刺激。
树突状细胞
树突状细胞(DC)是哺乳动物免疫系统内的免疫细胞，来源于造血性骨髓祖细胞。更具体的说，树突状细胞(DC)可以被分类成淋巴(或者浆样)树突状细胞(pDC)和脊髓的树突状细胞(mDC)分支，分别来自淋巴(或者浆样)或者脊髓前体细胞。无论祖细胞的类型是什么，从祖细胞中可以产生一种不成熟的树突状细胞。不成熟的树突状细胞的特点在于高的内吞活性和低的T细胞活化能力。因此，不成熟的树突状细胞可以作为其直接周围环境病原体的组成性样品。示范性的病原体包括，但是不局限于，一种病毒或者一种细菌。样品含有模式识别受体(PRRs)，例如toll-样受体(TLRs)。一旦病原体被模式识别受体，例如toll样受体所识别，树突状细胞被活化并成熟。
成熟的树突状细胞不但吞噬病原体并使其破坏，还可以降解其蛋白质并使用MHC(主要组织相容性复合体)分子(I类、II类和III类)在其细胞表面呈递这些蛋白片段(也叫做抗原)。成熟的树突状细胞还能够上调细胞表面受体，所述细胞表面受体可以作为T细胞活化的共受体。示范性的共受体包括，但是不局限于，CD80、CD86和CD40。同时，成熟的树突状细胞上调趋化因子受体，例如CCR7，所述趋化因子受体允许细胞随着血液流或者淋巴系统分别移向脾或者淋巴结。
树突状细胞存在于与外界环境接触的外部组织中，例如皮肤(居住在皮肤中的树突状细胞还叫做郎格罕氏细胞)。或者，树突状细胞存在于与外界环境接触的内部组织中，例如鼻、肺、胃和肠。最后，不成熟的树突状细胞居住在血流中。一旦被活化，来自所有这些组织中的树突状细胞被迁移到淋巴组织中，在这里他们呈递抗原并影响T细胞和B细胞，引发免疫反应。对本发明十分重要的一个信号传导系统包括在树突状细胞表面上表达的趋化因子受体CCR7和淋巴结结构分泌的用于吸引成熟的树突状细胞向高浓度的免疫细胞迁移的趋化因子受体配体CCL19。通过与成熟树突状细胞接触而活化的示范性的免疫细胞包括，但是不局限于，辅助性T细胞、杀伤性T细胞和B细胞。虽然在免疫系统中有多种细胞类型能够呈递抗原，例如，巨噬细胞和B淋巴细胞，但是在这些抗原呈递细胞中，树突状细胞是最有效的活化剂。
树突状细胞因其特征性的细胞形状而得名，其细胞形状包括从细胞体中延伸出来的多个树状突。这些细胞形状的功能优势在于能够相对于细胞体积显著的增加细胞表面积和细胞与周围组织接触的面积。有时，不成熟的树突状细胞缺乏特征性的树状突形成，被命名为帘细胞。帘细胞具有大面积的细胞质网膜而不是树状突。
浆样树突状细胞(pDCs)是先天免疫细胞，该细胞在血液中循环，并被发现在外周淋巴器官中。他们构成了小于0.4％的外周血液单核细胞(PBMC)。在人体中，这些细胞表达表面标志物CD123、BDCA-2(CD303)和BDCA-4(CD304)，但是不表达高浓度的CD11c或者CD14，这使其与传统的树突状细胞或者单核细胞区分开来。小鼠浆样树突状细胞(pDC)表达CD11c、B220、BST-2(mPDCA)和Siglec-H，并且对于CD11b成阴性。作为先天免疫系统的组成部分，这些细胞表达细胞内Toll样受体7和9，Toll样受体7和9分别检验ssRNA和CpG DNA部分。随着刺激作用和随后的活化作用，这些细胞产生大量I类干扰素(主要是IFN-α(alpha)和IFN-β(beta))，这些I类干扰素是重要的多效性抗病毒化合物，调节各种各样的作用。所述CD8-子集使用II类途径将抗原呈递到CD4+辅助性T细胞。CD8+子集使用I类途径呈递抗原。肽/1类MHC分子被CD8+T细胞呈递，CD8+T细胞随后编程细胞毒淋巴细胞(CTL)。小鼠中的CD8细胞表面蛋白相当于人体中的CD141细胞表面蛋白。CD8/CD141-阳性细胞表达TLR3，并且优选的被TLR3激动剂活化。
Toll-样受体(TLRs)
Toll-样受体(TLRs)是一种单横跨膜区域、非催化性受体，识别结构保守分子，所述结构保守分子被叫做病原体相关的分子类型(PAMP)。微生物中存在病原体相关的分子类型(PAMP)并且与宿主分子相区别。Toll-样受体(TLRs)存在于所有的脊椎动物中。在人体和小鼠中已经识别了十三种Toll-样受体(TLRs)(顺序编码为TLRl-13)。人包括Toll-样受体(TLRs)1-10。
Toll-样受体(TLRs)和白介素-1(IL-1)受体包括一种受体总科，其中的成员具有相同的TIR结构域(Toll-IL-1受体)。不由三种不同功能的三种变体中存在TIR结构域。亚群1的TIR结构域存在于白介素受体中，所述白介素由巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞产生。亚群2的TIR结构域存在于传统的Toll-样受体(TLRs)中，直接或者间接与来源于微生物的分子相结合。亚群3的TIR结构域存在于胞浆调节因子中，能够调节蛋白质之间信号传导的蛋白质包括亚群1和2的TIR结构域。
Toll样受体(TLR)配体包括一些分子，这些分子能够与威胁宿主存活率的迹象(例如病原体或者细胞应力)持续结合并具有高度的特异性。Toll样受体(TLR)配体对病原体具有特异性，但是对宿主没有。示范性的病原体分子包括，但是不局限于，脂多糖(LPS)、脂蛋白、脂阿拉伯甘露聚糖、鞭毛蛋白、双链RNA和DNA的未甲基化的CpG岛。
在本发明的一个优选的实施方案中，使用在树突状细胞内隔间中发现的细菌DNA或者合成低聚核苷酸(ODNs)中的包括特异性未甲基化的CpG的序列活化Toll-样受体9(TLR9)。CpG位点的甲基化状态是细菌DNA和哺乳动物DNA之间以及正常组织和癌组织之间的主要区别。未甲基化的低聚核苷酸(ODNs)包括一种或者一种以上CpG部分，这种未甲基化的低聚核苷酸(ODNs)模拟细菌DNA的作用。做为选择或者另外，包括一种或者一种以上CpG部分的未甲基化的低聚核苷酸(ODNs)在致癌基因呈递过程中在恶性肿瘤细胞内产生。
Toll样受体(TLR)-9受体的一种或者一种以上序列能够识别一种或者一种以上本发明的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列。下面的序列表述了本发明所包括的Toll样受体(TLR)-9受体。
人Toll样受体(TLR)-9(同种型A)被下列的mRNA序列编码(NCBI登记号NM_017442和SEQ ID NO：19；所有mRNA序列的起始密码子以黑体和大写字母表示)：
人Toll样受体(TLR)-9，同种型A，(由下列氨基酸顺序(NCBI登记号NP_059138和SEQ ID NO：20)编码：
人TLR3被下列mRNA序列编码(GenBank登记号：NM_003265.2(GI：19718735)，通过引证在此全部并入本文；SEQ ID NO：21)：
人TLR3被下列氨基酸序列编码(GenBank登记号：ABC86910.1(GI：86161330)，通过引证在此全部并入本文；SEQ ID NO：22)：
GenBank登记号NM_003263.3(GI：41350336)中提供了人TLR1的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_003254.2(GI：41350337)中提供了人TLR1的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_003264.3(GI：68160956)中提供了人TLR2的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_003254.2(GI：19718734)中提供了人TLR2的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_138554.4(GI：373432600)中提供了人TLR4的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_612564.1(GI：19924149)中提供了人TLR4的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_003268.5(GI：281427130)中提供了人TLR5的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_003259.2(GI：16751843)中提供了人TLR5的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_006068.4(GI：318067953)提供了人TLR6的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_006059.2(GI：20143971)中提供了人TLR6的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_016562.3(GI：67944638)提供了人TLR7的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_057646.1(GI：7706093)中提供了人TLR7的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_138636.4(GI：257196253))提供了人TLR8的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_619542.1(GI：20302168)中提供了人TLR8的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_030956.3(GI：306140488)提供了人TLR10的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_112218.2(GI：62865618)中提供了人TLR10的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_205819.3(GI：408684412)提供了小鼠TLR11的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_991388.2(GI：408684413)中提供了小鼠TLR11的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_205823.2(GI：148539900)提供了小鼠TLR12的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_991392.1(GI：45430001)中提供了小鼠TLR12的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
GenBank登记号NM_205820.1(GI：45429998)提供了小鼠TLR13的核酸序列，通过引证在此全部并入本文。GenBank登记号NP_991389.1(GI：45429999)中提供了小鼠TLR13的氨基酸顺序，通过引证在此全部并入本文。
下面的表2中提供了Toll样受体(TLR)激动剂(包括合成的和天然配体)及其相应受体的代表性列表。
*TLR1和TLR2识别的配体
**TLR2和TLR6识别的配体
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粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种蛋白质，由巨噬细胞、T细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞所分泌。具体地说，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种细胞因子，可以起到白细胞生长因子的功能。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激干细胞产生粒性白细胞和单核细胞。单核细胞从血流中出来，移入组织，并随后成熟进入巨噬细胞。
这里描述的脚手架装置包括并且释放粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽，用于将宿主树突状细胞(DC)吸引到所述装置中。预计的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是从体内分离的，或者是体内或者体外合成的。内生的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是从健康的人类组织中分离出来的。在将模板DNA转染或者转化进入宿主有机体或者细胞(例如，哺乳动物或者培养的人细胞系)中之后，体内合成性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽。做为选择，合成性粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是使用聚合酶链式反应(PCR)或者其他本领域内已知的方法Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，and Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：一种实验室手册).Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，NY，Vol.1，2，3(1989)，通过引证在此并入本文)体外合成的。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽被修饰以增加体内蛋白质的稳定性。做为选择，对粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽进行设计使其具有更多或者更少的免疫原性。内原性的成熟人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是糖基化的，据报道，在氨基酸残基23(白氨酸)、27(天门冬酰胺)和39(谷氨酸)处糖基化(参见美国专利第5,073,627号)。相对于糖基化状态，在一个或者一个以上的氨基酸残基上修饰本发明的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽。
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是重组的。做为选择，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽是哺乳动物粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽的人源化衍生物。可以衍生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)多肽的示范性的哺乳动物种类包括，但是不局限于，小鼠、大鼠、仓鼠、荷兰猪、白鼬、猫、狗、猴子或者灵长类动物。在一种优选的实施方案中，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种重组人蛋白质(PeproTech公司，编目号300-03)。做为选择，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是一种重组鼠科(小鼠)蛋白质(PeproTech公司，编目号#_315-03)。最后，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是重组体小鼠蛋白质人源化的衍生物。
人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(PeproTech公司，编目#_300-03)(由下列多肽序列编码(SEQ ID NO：24))：
MAPARSPSPS TQPWEHVNAI QEARRLLNLS RDTAAEMNET VEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGS LTKLKGPLTM MASHYKQHCP PTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE(SEQ ID NO：24)
鼠重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(PeproTech公司，编目#_315-03)(由下列多肽序列编码(SEQ ID NO：25)：
MAPTRSPITV TRPWKHVEAI KEALNLLDDM PVTLNEEVEV VSNEFSFKKLTCVQTRLKIFEQGLRGNFTK LKGALNMTAS YYQTYCPPTPETDCETQVTT YADFIDSLKT FLTDIPFECKKPVQK(SEQ ID NO：25)
人内原性的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(由下列mRNA序列(NCBI登记号NM_000758和SEQ ID NO：26)编码)：
人内原性的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(由下列氨基酸序列(NCBI登记号NP_000749.2和SEQ ID NO：27)编码)：
MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEP
TCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCW
EPVQE(SEQ ID NO：27)
粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号是传统树突状细胞(DC)的有效趋化因子，并且能显著的增加MHC(II)和CD86(+)的表面表达，这可以用于激发T细胞免疫性。相反，Flt3L疫苗导致更多的浆样树突状细胞(pDCs)，与增加的T细胞激发的细胞因子(能够放大T细胞反应)水平有关。因此，如US2013-0202707所述，通过引证在此全部并入本文，被修饰来呈递炎症性细胞因子的三维聚合基质被用于有效的动员和活化不同的体内树突状细胞(DC)亚群，用于免疫治疗。
示范性的人Flt3的氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：28)，由Genbank登记号P49771.1(GI：1706818)提供，通过引证在此全部并入本文。
胞嘧啶-鸟嘌呤(CpG)低聚核苷酸(CpG-ODN)序列
CpG位点是脱氧核糖核酸(DNA)区域，在此区域中，基质线性序列沿着其长度方向胞嘧啶核苷紧挨着鸟苷酸(“p”表示他们之间存在的磷酸键，并将他们与胞嘧啶-鸟嘌呤互补碱基对相区别)。CpG位点在DNA甲基化过程中发挥关键作用，这是细胞用来静止基因表达的一些内源性机制中的一个。启动子元素内CpG位点的甲基化能够使基因静止。在癌症的情况下，已知肿瘤抑制基因通常是静止的，而致癌基因或者癌症诱导基因被表达。重要地，已经证实肿瘤抑制基因(预防癌症形成的基因)启动子区域中的CpG位点是被甲基化的，而在某些癌症中致癌基因启动子区域中的CpG位点是低甲基化的或者未甲基化的。Toll样受体(TLR)-9受体结合DNA中未甲基化的CpG位点。
本发明包括CpG二核苷酸和低聚核苷酸。预计的CpG低聚核苷酸是从体内分离的，或者是体内或者体外合成的。示范性的内源性CpG低聚核苷酸来源包括，但是不局限于，微生物、细菌、真菌、原生虫、病毒、霉菌或者寄生虫。或者，内源性的CpG低聚核苷酸是从哺乳动物良性或者恶性赘生性肿瘤中分离出来的。合成的CpG低聚核苷酸是在将模板DNA转染或者转化入宿主有机体内之后，在体内合成的。做为选择，合成性CpG低聚核苷酸是使用聚合酶链式反应(PCR)或者其他本领域内已知的方法(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，andManiatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：一种实验室手册).Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)，NY，Vol.1，2，3(1989)，通过引证在此并入本文)体外合成的。
呈递CpG低聚核苷酸用于树突状细胞的胞内吸收。在一个实施方案中，使用无保护的CpG低聚核苷酸。术语“无保护的”用于描述一种分离的内源性或者合成的多聚核苷酸(或者低聚核苷酸)，其上不含有额外的取代基。在另一个实施方案中，CpG低聚核苷酸与一种或者一种以上化合物相结合，增加细胞吸收的效率。做为选择或者另外，CpG低聚核苷酸与一种或者一种以上的化合物结合，增加脚手架和/或树突状细胞内低聚核苷酸的稳定性。
在细胞吸收之前，浓缩CpG低聚核苷酸。在一个优选的实施方案中，使用聚(氮丙啶)(PEI)浓缩CpG低聚核苷酸，所述聚(氮丙啶)(PEI)是一种阳离子聚合物，能够增加树突状细胞细胞吸收的效率。
本发明的CpG低聚核苷酸可以被分成多个种类。例如，本发明组合物、方法和装置中包括的示范性的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)是刺激性的、中性的或者抑制性的。这里使用的术语“刺激性的”用于描述一类能够活化TLR9的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列。这里使用的术语“中性的”用于描述一类不能活化TLR9的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列。这里使用的术语“抑制性的”用于描述一类能够抑制TLR9的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列。术语“活化的TLR9”描述了一种方法，使用此方法TLR9能够引起细胞内的信号传导。
刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)可以进一步被分成三种类型，A、B和C，这些类型在免疫刺激活性方面有所不同。A类刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的特点在于包括磷酸二酯中心性CpG的回文部分和一种硫代磷酸3’聚G线。在TLR9活化之后，这些胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)诱导浆样树突状细胞(pDC)中产生高产量的IFN-α。A类胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)微弱地刺激TLR9-依赖性的NF-κB信号传导。
B型刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)包括一种全硫代磷酸主链，具有一种或者一种以上CpG二核苷酸。在TLR9活化后，这些胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)有力的刺激B细胞。与A类胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)不同，B类胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)微弱地刺激IFN-α分泌。
C类刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)包括A和B类的特征。C类胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)包括一种全硫代磷酸主链和一种包括CpG的回文结构部分。与A类胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)相似，C类胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)诱导pDC产生大量的IFN-α。与B类胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)相以，C类胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)诱导强烈的B细胞刺激。
示范性的刺激性CpG ODNs包括，但是不局限于，ODN 1585、ODN 1668、ODN 1826、ODN 2006、ODN 2006-G5、ODN 2216、ODN 2336、ODN 2395、ODN M362(都来自InvivoGen)。本发明还包括前述CpG低聚核苷酸(ODNs)任何人源化的版本。在一个优选的实施方案
中，本发明的组合物、方法和装置包括ODN 1826(其序列从5’到3’是tccatgacgttcctgacgtt，其中CpG元素用黑体表示，SEQ ID NO:29)。
不刺激TLR9的中性或者参照胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)被包括在本发明中。这些低聚核苷酸(ODNs)包括与其刺激性对应物相同的序列，但是不含有CpG二核苷酸，而是含有GpC二核苷酸。
本发明所包括的示范性的中性或者参照胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)包括，但是不局限于，ODN 1585参照物、ODN 1668参照物、ODN 1826参照物、ODN 2006参照物、ODN 2016参照物、ODN 2336参照物、ODN 2395参照物、ODN M362参照物(都来自InvivoGen)。本发明还包括前述CpG低聚核苷酸(ODNs)任何人源化的版本。
本发明包括抑制性的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)，这种胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)能够抑制TLR9。有效抑制性序列的示例是发现在哺乳动物端粒中的(TTAGGG)4(SEQ ID NO：30)(低聚核苷酸TTAGGG，InvivoGen公司)和CpGODN 2088(InvivoGen公司)，ODN 2088是一种来源于鼠科的刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)，有3个碱基取代。内囊中抑制性低聚核苷酸(ODNs)与TLR9共定位的断裂不会影响细胞结合和吸收。本发明包括的抑制性的CpG低聚核苷酸(ODNs)被用于调整、驯化、逆转或者抵抗刺激性胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)的作用。做为选择或者，另外，本发明的组合物、方法或装置包括抑制性CpG低聚核苷酸(ODNs)，所述抑制性的CpG低聚核苷酸(ODNs)可以用于治疗自体免疫疾病或者在植入后预防免疫反应。
癌症抗原
本发明的组合物、方法和装置包括癌症抗原，用于向施用此装置的主体接种和/或提供预防性免疫力。癌症抗原可以单独使用，或者与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列、或者免疫调节剂结合使用。而且，癌症抗原可以与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列、或者免疫调节剂同时或者先后使用。
本发明的组合物、方法和装置中包括的示范性的癌症抗原包括，但是不局限于，从活体检查中提取的肿瘤溶解产物(例如，来自黑素瘤的活体解剖，或者从患有B16-F10黑素瘤肿瘤细胞的小鼠中分离B16-F10肿瘤)、照射的肿瘤细胞(例如，照射的黑素瘤细胞)、肺癌抗原、乳腺癌抗原(例如，Her2，例如，纯化的Her2或者其片段)、神经胶质瘤抗原、前列腺(例如，前列腺癌症)抗原(例如，前列腺酸性磷酸酶)、抗原的MAGE系列(例如MAGE-1)、MART-1/梅拉A、酪氨酸酶、神经节苷脂、gp100、GD-2、O-乙酰化GD-3、GM-2、MUC-1、Sos1、蛋白激酶C-结合蛋白、反转录酶蛋白质、AKAP蛋白质、VRK1、KIAA1735、T7-1、T11-3、T11-9、现代人端粒酶发酵产物(hTRT)、细胞角蛋白-19(CYFRA21-1)、鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)、(蛋白质T4-A)、鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)、卵巢癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)、粘蛋白1(肿瘤相关的粘蛋白)、癌-相关的粘蛋白)、(多形态上皮细胞粘蛋白)、(PEM)、(PEMT)、(EPISIALIN)、(肿瘤相关的上皮细胞膜抗原)、(EMA)、(H23AG)、(花生反应性的尿粘蛋白)、(PUM)、(乳腺癌相关的抗原DF3)、CTCL肿瘤抗原se1-1、CTCL肿瘤抗原se14-3、CTCL肿瘤抗原se20-4、CTCL肿瘤抗原se20-9、CTCL肿瘤抗原se33-1、CTCL肿瘤抗原se37-2、CTCL肿瘤抗原se57-1、CTCL肿瘤抗原se89-1、前列腺特异性膜抗原、5T4癌坯滋养层糖蛋白、Orf73皮肤多发性出血性肉瘤相关的疱疹病毒、MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原)(DAM10)、MAGE-B2抗原(DAM6)、MAGE-2抗原、MAGE-4a抗原、MAGE-4b抗原、结肠癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12变体A、癌症相关的表面抗原、腺癌抗原ART1、伴生肿瘤相关的脑-睾丸-癌症抗原(旁瘤抗原MA2；伴生肿瘤神经元抗原)、神经肿瘤腹部抗原2(NOVA2)、肝细胞癌抗原基因520、肿瘤相关的抗原CO-029、肿瘤相关的抗原MAGE-X2、滑膜肉瘤、X断点2、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原、血清学检测的结肠癌抗原1、血清学检测的乳癌抗原NY-BR-15、血清学检测的乳癌抗原NY-BR-16、嗜铬粒蛋白A；甲状旁腺分泌的蛋白质1、DUPAN-2、CA19-9、CA72-4、CA195、癌胚抗原(CEA)。
人前列腺酸性磷酸酶的氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：31)，由Genbank登记号AAA60022.1提供，其中信号肽显示为带有下划线的自体，成熟肽显示为斜体字。
编码人前列腺酸性磷酸酶的mRNA序列显示如下(SEQ ID NO：32)，由Genbank登记号M24902.1提供，起始密码子和终止密码子用黑体表示。
人Her2的氨基酸序列显示如下(SEQ ID NO：33)，由Genbank登记号P04626.1提供。
编码人Her2的mRNA序列显示如下(SEQ ID NO：34)，由Genbank登记号NM_004448.3提供，起始密码子和终止密码子用黑体表示。
在一些实施方案中，肿瘤抗原根据其表达曲线可以被分成4个大组。参见van derBruggen P,Stroobant V,Vigneron N,Van den Eynde B.Peptide database:T cell-defined tumor antigens.Cancer Immun 2013.URL:www.cancerimmunity.org/peptide/,通过引证在此全部并入本文。示范性的肿瘤抗原和他们的分类如下面的概括：
1)独有抗原：肿瘤细胞独有的抗原(表1)。这些抗原来自于基因中的突变，所述基因编码所述蛋白质抗原。通常，所述突变影响基因的编码序列。在一些实施例中，所述突变对于个别主体或者少量主体是独有的。这些独有抗原通常不是不听主体的肿瘤共享的。
2)共享抗原：肿瘤特异抗原(表2)。共享抗原与独有抗原不同，在多个独立的肿瘤中表达。肿瘤特异抗原在多个肿瘤中表达但是不在正常细胞中表达。例如，这些抗原被“癌症-种系”基因编码。
3)共享抗原：分化抗原(表3)。分化抗原在肿瘤中表达，也在肿瘤来源的正常组织中表达。例如，这些抗原在发育阶段，在细胞的特点系谱中表达。由于这些抗原不是肿瘤特异性的，靶向这些抗原来进行癌症治疗可能导致针对相应正常组织的自身免疫性，这取决于正常组织是否是可省略的，以及所述组织表达抗原是否可以在癌症治疗过程中手术除去。
4)共享抗原：过表达的抗原(表4)。这些抗原在各种正常组织中表达并且在肿瘤细胞中过表达。
例如，肿瘤肽表，例如，根据其可以被识别肿瘤细胞表达母蛋白质的T淋巴细胞识别而被认为是肿瘤抗原。下面每个表都包括蛋白质或基因名称、蛋白质/基因的GeneCard信息、来自所述蛋白质的肽序列(例如，对于抗原特异性的最小序列，例如可以被T细胞识别的最小序列)、以及所述肽在全长蛋白质序列中的位置。在一些实施例中，在下表中显示的肽是一种呈递人类白细胞抗原(HLA)的分子，例如，所述肽呈递在主要组织相容性复合体(MHC)分子上。在表1中，带下划线的氨基酸是与在非-肿瘤细胞中发现的蛋白质的序列所不同的氨基酸，也就是说，肿瘤细胞包含蛋白质的突变形式，突变位置在表1中用下划线表示。
表1
表2
表3
表4
免疫调节剂
本发明的组合物、方法和装置包括免疫调节剂，所述免疫调节剂包括但不限于，Toll样受体(TLR)配体、生长因子和临终细胞产物，例如热休克蛋白，用于刺激树突状细胞活化。免疫调节剂可以单独使用，或者与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列、或者癌症抗原结合使用。免疫调节剂可以与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列、或者癌症抗原同时或者先后使用。
本发明的组合物、方法和装置包括所有已知的在细胞表面发现的或者在细胞隔间内发现的Toll样受体(TLR)配体。示范性的Toll样受体(TLR)配体包括，但是不局限于，三酰基脂蛋白(TLR1)；脂蛋白，革兰氏阳性肽聚糖、脂磷壁酸、真菌和病毒糖蛋白(TLR2)；双链RNA、聚I：C(Toll样受体(TLR)3)；脂多糖、病毒糖蛋白(Toll样受体(TLR)4)；鞭毛蛋白(TLR5)；二酰基脂蛋白(TLR6)；小合成性化合物、单链RNA(TLR7和Toll样受体(TLR)8)；未甲基化的CpG DNA(TLR9)；前纤维蛋白(TLR11)。还包括作为TRL配体的宿主分子样粘连蛋白和热休克蛋白(HSPs)。本发明还包括宿主Toll样受体(TLR)配体。Toll-样受体(TLRs)在先天免疫性中的作用以及用于活化和抑制Toll-样受体(TLRs)的信号传导分子的作用在本领域内是已知的(作为回顾，参见Holger K.Frank B.，Hessel E.，and CoffmanRL.Therapeutic targeting of innate immunity with Toll-like receptor agonistsand antagonists(使用Toll样受体激动剂和拮抗剂进行的天然免疫性的治疗性靶点).Nature Medicine 13，552-559(2007)，该专利通过引证在此并入本文).
本发明的组合物、方法和装置包括所有已知的生长因子。示范性的生长因子包括，但是不局限于，转化生长因子β(TGF-β)、粒性白细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、神经生长因子(NGF)、神经素营养因子、血小板衍生生长因子(PDGF)、促红细胞生成素(EPO)、促血小板生成素(TPO)、肌骨素(GDF-8)、生长分化作用因子-9(GDF9)、酸性的成纤维细胞生长因子(aFGF或者FGF-1)、碱性的成纤维细胞生长因子(bFGF或者FGF-2)、表皮生长因子(EGF)、肝细胞生长因子(HGF)。本发明包括刺激树突状细胞活化的细胞因子以及生长因子。示范性的细胞因子包括，但是不局限于，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-8，IL-10，IL-121L-15，1L-17，1L-18，TNF-α，IFN-γ，和IFN-α.
细胞死亡和临终细胞产物的指示剂刺激树突状细胞活化。因而，本发明的组合物、方法和装置包括所有的临终细胞产物。示范性的细胞死亡产物包括，但是不局限于，细胞的任何细胞内特征，例如细胞器、气囊、细胞骨架成分、蛋白质、DNA和RNA。尤其重要的是热休克蛋白，当细胞在受力的情况下表达热休克蛋白并在细胞死亡时释放。示范性的热休克蛋白包括，但是不局限于，Hsp10，Hsp20，Hsp27，Hsp33，Hsp40，Hsp60，Hsp70，Hsp71，Hsp72，Grp78，Hsx70，Hsp84，Hsp90，Grp94，Hsp100，Hsp104，Hsp110.
微环境和疫苗效力
这里描述的装置/脚手架代表一种模拟感染的微环境。各个装置组成能够吸引/接受、培养/刺激和长出周围身体组织的工厂，所述组织被树突状细胞活化，能够刺激/增加对具体抗原的免疫反应。具体地说，所述脚手架装置被植入或者用病原性分子包覆，达到模拟的传染性微环境中，从而进一步活化树突状细胞反应。
当用作癌症疫苗时，使用材料系统适当的模拟感染方面可以通过连续补充、活化和使树突状细胞(DC)复位到LN来显著的影响肿瘤进程。第一个PLG疫苗只使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，导致一系列过程，在此过程中，宿主树突状细胞(DC)被粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)募集、停留在肿瘤抗原呈递位点，然后被封闭直到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)水平下降，并且细胞可以被活化和分散(参见US 2008/0044900 A1；通过引证在此并入本文)。局部粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)浓度的暂时变化能够随着被募集的树突状细胞(DC)的数目被控制，并且使其活化和分散同步。虽然最好的基于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的疫苗能够赋与几乎四分之一的待检测动物保护性免疫作用，但是大约26％的募集的树突状细胞(DC)被活化(大约240,000个树突状细胞(DC))和大约6％的树突状细胞(DC)被分散到LN。高水平的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)募集大量的树突状细胞(DC)，并且限制树突状细胞(DC)活化，在脚手架内留下潜在的治疗性树突状细胞(DC)。这些结果刺激了改善性系统的发展，所述改善性系统能够通过局部呈递CpG-ODNs作为过载的“危险信号”来模拟细菌感染，并且抵抗树突状细胞(DC)活化和分散的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)抑制作用。这里描述的装置通过调节树突状细胞增加的、连续性的流出来显示重要的促进作用。
使用聚(氮丙啶)(PEI)浓缩胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)分子，这不仅可以促进ODN被树突状细胞(DC)吸收和定位其Toll样受体(TLR)-9受体，还可以将该分子静电固定进入PLG基质中，与肿瘤抗原同时呈递。体外结果显示，在抑制性浓度的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(500纳克/毫升)存在的情况下，聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物可以被树突状细胞(DC)去冷凝，并刺激能够促进树突状细胞(DC)活化和向着淋巴结衍生的趋化因子(CCL19)分散的Toll样受体(TLR)信号传导(US2013-0202707,本专利通过引证在此全部并入本文)。
如在US2013-0202707中详细描述的，本发明的疫苗装置有效的允许细胞行为和原位编程的精密控制。
脚手架组合物和结构
脚手架的组分可以被制成各种几何形状(例如，圆盘形、小珠、球粒)、存在于不同的环境下，不同的平面层(例如薄层)中。例如，所述圆盘的直径大约为0.1-200毫米，例如，直径是5、10、20、40、50毫米，所述圆盘被皮下植入。所述圆盘的厚度是0.1到10毫米，例如，是1、2、5毫米。这种圆盘可以容易的被压缩或者冷冻干燥，然后对病人施用。一种用于皮下给药的示例性的圆盘具有以下尺寸：直径为8厘米，厚度为1厘米。多组分的脚手架优选的是同心层结构，每一层的特点在于具有不同的物质质量(％聚合物、％聚合物交联物)、脚手架的化学成分、孔径、多孔性和多孔结构、不同的硬度、韧性、延伸度、粘弹性以及不同的生物活性物质组合物(例如，生长因子、复位/迁移因子、分化作用因子)。每个微环境中都对细胞群体具有特异性作用，例如，促进或者抑制抑制具体的细胞功能、增殖作用、分化作用、分泌的因子或者酶的加工或者迁移。在这种脚手架中的细胞被培养并诱导向着脚手架外迁移，从而直接影响靶点组织，例如，受损害的组织位点。例如，在片状结构中使用基质血管细胞和平滑肌细胞，这些细胞被用于恢复血管样结构，例如血管或者身体腔层。例如，这种结构被用于修复腹壁损伤或者缺损，例如腹裂。同样，向片状的脚手架上接种皮肤干细胞和/或角质化细胞，在绑带或者伤口包裹物上使用这种片状的脚手架用于使皮肤组织再生。所述装置被放置或者移植在靶点组织上或者紧挨着靶点组织，位于身体中的受保护位置，紧挨着血管，或者在外用伤口包覆物的存在下体外使用。使用各种各样已知的方法和工具将这些装置引入体中或者身体上，例如，勺子、镊子或者抓子、皮下注射针头、内窥镜的机械手、内血管导管或传血管导管、立体定位针、蛇管装置、器官表面爬行机器人(美国专利申请20050154376；Otaet al.,2006,Innovations 1:227-231)、最小侵入性外科装置、外科移植工具和透皮贴片。这些装置可以被组装，例如通过先后注射或者插入基质材料来组装。选择性的，脚手架装置可以被再充入细胞或者生物活性组合物，例如，通过连续注射或者喷雾物质(例如生长因子或者分化作用因子)再充入。
脚手架或者脚手架装置是一种实质的结构，相关的细胞附在其上或者其中，并且，所述脚手架组合物是用于制备此结构的材料。例如，脚手架组合物包括生物可降解材料或者永久材料，例如下面所列的。所述脚手架的机械特性随之应用或者需要再生的组织类型变化。他是可以生物降解的(例如，胶原蛋白、藻酸盐、多糖、聚乙二醇(PEG)、聚(乙交酯)(PGA)、聚(L-丙交酯)(PLA)、或者聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、或者永久的(例如，丝绸)。在可生物降解的结构中，所述组合物可以被物理降解或者化学降解，例如，通过水合作用、加热或者离子交换，或者通过细胞作用，例如通过邻近的或者原有的细胞进行的酶、肽或者其他化合物的加工。粘稠度可以是软的/柔韧的(例如凝胶)到玻璃状的、橡胶状的、易碎的、坚韧的、有弹性的、非弹性的。所述结构包括小孔，所述小孔可以是纳米孔、微孔或者大孔，并且选择性的，所述孔的类型可以是均质的、异质的、排列的、重复的或者随机的。
藻酸盐是一种基于聚合物的多用多糖，可以根据具体的应用配制来控制分子量、降解速度和脚手架形成的方法。可以使用偶联反应将生物活性抗原决定簇(例如细胞粘着序列RGD)与聚合物骨架共价相连。藻酸盐聚合物被放入各种类型的脚手架中。可注射的水凝胶由低分子量的藻酸盐溶液在加入交联剂(例如，钙离子)的情况下制成，而通过冷冻干燥高分子量的藻酸盐制成大孔脚手架。脚手架配方中的差异能够控制脚手架降解的动力学。呈递成形素的脚手架配方可以以空间和时间的控制方法控制成形素或者其他生物活性物质从藻酸盐脚手架中释放的速率。这种控制的释放不但消除了全身性副作用，不需要多次注射，而且可以用于创建一种微环境，这种微环境能够活化位于在植入位点的宿主细胞和接种在脚手架上的移植的细胞。
所述脚手架包括一种生物相容性聚合基质，选择性地，这种生物相容性聚合基质是完全生物可降解的或者部分生物可降解的。水凝胶是一种适当的聚合基质材料。可以用于形成水凝胶的材料的实施例包括聚乳酸、聚乙醇酸聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)、藻酸盐和藻酸盐衍生物、明胶、胶原蛋白、琼脂糖、天然多糖和合成多糖、聚氨基酸(例如多肽，尤其是聚赖氨酸)、聚酯(例如聚羟基丁酯和聚ε己内酯)、聚酐；聚膦嗪、聚(乙烯醇)、聚(氧化烯)(尤其是聚(环氧乙烷))、聚(烯丙胺)(PAM)、聚(丙烯酸酯)、修饰的聚苯乙烯(例如聚(4-氨基甲基苯乙烯))、复合多元醇、聚乙氧基/聚丙氧基共聚物、聚(糖醛酸)、聚(乙烯基吡硌烷酮)和上述物质的共聚物，包括接枝共聚物。
所述脚手架由合成的聚合物和天然存在的聚合物制成，所述聚合物，例如，但不局限于，胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、琼脂糖和富集粘连蛋白的凝胶剂。一个优选的用于水凝胶的材料是藻朊酸盐或者修饰藻朊酸盐材料。藻酸盐分子由(1-4)-连接的β-D-甘露糖醛酸(M单元)和αL-古罗糖醛酸(G单元)单体组成，聚合物链上这两个单体的比例和分布顺序是可以变化的。藻朊酸盐多糖是一种聚合电解质系统，这种系统对于二价阳离子(例如，Ca+2、Mg+2、Ba+2)具有很强的亲和力，当暴露在这些分子中时，会形成稳定的水凝胶。参见Martinsen A.,et al.,Biotech.&Bioeng.,33(1989)79-89.)例如，钙交联的藻酸盐水凝胶可以有效用于牙科，伤口包覆软骨细胞移植物并作为其他细胞类型的基质。
示范性的装置利用分子量相对低的藻酸盐或者其他多糖，优选的，其尺寸在溶解后处于能从人的肾脏中清除的阈值中，例如，所述藻酸盐或者多糖的分子量减少到1000到80,000道尔顿。优选的，所述分子量是1000到60,000道尔顿，尤其优选的是1000到50,000道尔顿。使用具有高古罗糖醛酸含量的藻酸盐材料，而不是高甘露糖醛酸含量的藻酸盐材料也是有效的，这是由于古罗糖醛酸能通过二价阳离子提供更多的凝胶聚合物离子交联位点。美国专利第6,642,363号通过引证在此全部并入本文，该专利公开了用于制造和使用包括多糖(例如藻酸盐或者修饰藻酸盐)的聚合物的方法，所述多糖尤其有效的用于细胞移植和组织工程应用。
除了藻酸盐之外有效的多糖包括琼脂糖和微生物多糖，如下表中所列出的。
aN-天然的,A＝阴离子和C＝阳离子.
本发明的脚手架是多孔的或者是无孔的。例如，所述脚手架是纳米孔的，所述纳米孔的直径小于大约10纳米；所述脚手架是微孔的，所述微孔的直径在大约100微米到20微米范围内；或者所述脚手架是大孔的，所述大孔的直径大于大约20微米(优选的，大于大约100微米或更优选的大于大约400微米)。在一个实施例中，所述脚手架是大孔的，并且具有直径为400-500微米的定位孔。实施例中描述了如何制备具有需要孔径和孔排列的聚合基质。其他制备多孔水凝胶产物的方法在本领域内是已知的(美国专利号6,511,650，通过引证在此全部并入本文)。
生物活性组合物
所述装置包括一种或者一种以上的生物活性组合物。所述生物活性组合物是天然存在的、合成的或者重组的化合物，例如，多肽、核酸、小分子或者其他试剂。例如，所述组合物包括粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)和肿瘤抗原或者其他抗原。例如，这里所描述的组合物包括免疫抑制性蛋白质的抑制剂(例如，细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抑制剂、程序性
细胞死亡蛋白质1(PD1)抑制剂、程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)抑制剂、B7-H3抑制剂、B7-H4抑制剂、LAG3抑制剂、2B4抑制剂、BTLA抑制剂、TIM3抑制剂、A2aR抑制剂或者致死抑制性受体抑制剂)。例如，这里所描述的组合物包括抗体或其片段，或者一种能够结合免疫抑制蛋白质(例如，细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抑制剂、程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抑制剂、程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)抑制剂、B7-H3抑制剂、B7-H4抑制剂、LAG3抑制剂、2B4抑制剂、BTLA抑制剂、TIM3抑制剂、A2aR抑制剂或者致死抑制性受体抑制剂)的蛋白质。在优选的实施方案中，所述组合物包括能够结合细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)，程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)，或者程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)的抗体或其片段。
在这里描述的组合物是纯化的。纯化后的化合物按重量计算(干重)占所关心化合物的至少60％。优选的，所述制剂按重量计算占所关心化合物的至少75％，更优选的占至少90％，并且最优选的，占至少99％。可以通过任何适当的标准方法来测量纯度，例如，通过柱形色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、或者高效液相色谱(HPLC)分析。
使用本领域普通技术人员已知的方法将多肽和聚合基质耦合在一起。将肽和聚合物耦合在一起的方法描述在Hirano and Mooney,Advanced Materials,p.17-25(2004).其他有效的化学键合作用包括Hermanson,Bioconjugate Techniques,p.152-185(1996)中描述的，尤其是通过使用二亚胺碳偶合剂、DCC和DIC(Woodward试剂K)。多肽包括适用于这种二亚胺碳键的末端胺基。优选的，通过使用1-乙-3-(3-二甲基氨基丙基)二亚胺碳(EDC)催化形成氨键，EDC是一种水溶性酶，通常被用于肽合成。
生物活性组合物释放动力学的控制
使用多种不同的技术，例如，包覆、在脚手架上的附着/连接性质、脚手架的多孔性和生物活性组合物的颗粒尺寸来控制生物活性组合物(例如，粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))的释放曲线。
例如，通过一种方式包覆粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以此将粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)整合入脚手架中。收件将粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)包覆如聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体中，然后用气体发泡法处理装载GM-CSF的微球体，产生大孔聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架。将粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)整合入微球体会造成粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)更深的包覆在聚合物中，使装置在1-5天内维持粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的初始脉冲。其他的整合方法可选择性的用于根据需要改变或者适度调整粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)脉冲的持续时间，因此改变DC募集的动力学。例如，泡沫状的PLG颗粒与冷冻干燥的粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)混合在一起使粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)更多的结合到聚合物脚手架的表面，并且蛋白质扩散的更快。
作为选择的制备脚手架的方法可以修改释放动力学，所述方法包括修饰脚手架孔径的物理结构，从而获得不同的降解时间和释放动力学(改变作为体积百分比的孔径或者总孔隙率)，例如，Riddle et al.,Role of poly(lactide-co-glycolide)particle sizeon gas-foamed scaffolds.(聚(丙交酯-共-乙交酯)颗粒尺寸在发泡形成的脚手架中的作用)，J Biomater Sci Polym Ed.2004；15(12):1561-70中的描述。另一种改变释放动力学的方法是修饰这种组合物，即，修饰制备脚手架的原材料，从而改变释放性质。例如，使用不同的聚合物，例如，藻酸盐、PLA、PGA或者使用PLGA。同样，使用具有不同乙二醇和乳酸比例的聚合物也会产生不同的释放曲线。例如，使用已知的双重乳化(水/油/水)技术，具有不同组合物(丙交酯对乙交酯比例)和分子量的PLG被用于制备微球体(5-50微米)，随后利用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微粒和聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体，通过气体发泡/颗粒挤出技术制备脚手架。(Ennett et al.,Temporally regulated delivery of VEGF invitro and in vivo(体内和体外VEGF短时间调节的传递).J Biomed Mater ResA.2006Oct；79(1).另一个技术包括将蛋白质整合入不同的隔间(例如，在发泡前，用聚合物包覆蛋白质PLG微球体或者将聚合物和微球体简单混合或者冷冻干燥)。制造这里所描述的脚手架的方法包括使用气体泡沫体，例如，在Harris et al.J.Biomed.MaterialsRes.Part A.42.3(1998)396-402和Sheridan et al.J.Control.Rel.64(2000)91-102中所详细描述的，这两篇文献通过引证在此全部并入文本。在其他实施方案中，线(例如，包含多个线的模板)被用作制孔剂，即用于在脚手架中建造小孔，例如，建造排列的小孔。
对装置进行充满和/或再充满
将一种生物活性组合物(例如，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))整合到装置的不同层/隔间中，从而传递多个粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)脉冲。每个脉冲用树突状细胞(DC)流充满(或者再充满)装置。使用各种方法制造脚手架，产生粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(或者其他生物活性试剂)的多个脉冲。例如，通过将蛋白质整合入不同的隔间(例如，用聚合物包覆蛋白质PLG微球体或者在发泡前与聚合物简单混合并冷冻干燥)制备这种装置，从而产生2个或者更多个不同的蛋白质释放曲线(即，脉冲)(例如，Richardson et al.，Polymeric system for dual growth factor delivery(双重生长因子传递的聚合基质).Nat Biotechnol.2001Nov；19(11)中所述)。
做为选择，所述蛋白质被包覆在快速降解的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体(例如低分子量，50∶50)和缓慢降解的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体(高分子量，85∶15)中。然后，这些微球体混合在一起，随后用于制备脚手架。因此，所述蛋白质被包覆在快速降解聚合物和缓慢降解聚合物中，产生至少两种不同的释放动力学和传递脉冲。使用这种方法制备3种、4种、5种或者更多不同种类的微球体，这种比例计是不同的，从而产生3种、4种、5种或者更多生物活性组合物(例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))的释放脉冲。
另一种制备能够传递超过一个脉冲的装置的方法是制造分层的脚手架。通过在不同配方的脚手架上压缩制模另一个不同配方的脚手架来制备分层的脚手架。例如，在模具中压缩原材料(蔗糖+PLGl+蛋白质)然后稍微改变制剂配方(蔗糖+PLG2+蛋白质)同样在模具中压缩。然后将这两层一起压缩，发泡，产生双层脚手架，对蛋白质具有不同的空间控制，例如Chen e t al.，Pharm Res.Spatio-temporal VEGF and PDGF delivery patt ernsblood vessel formation and maturation.2007Feb；24(2)：258-64)中所述.
装置构建物
从多种不同刚性组合物、半刚性组合物、柔软的组合物、凝胶组合物、自组装组合物、液态晶体组合物或者流体组合物(例如肽聚合物、多糖、合成聚合物、水凝胶材料、陶瓷(例如，磷酸钙或者羟基磷灰石)、蛋白质、糖蛋白、蛋白聚糖金属和金属合金)中构建脚手架结构。使用本领域内已知的方法将所述组合物组装进入细胞脚手架结构中，所述方法例如，注模法、预定结构的冻干法、印刷、自组装、相逆变、溶剂烧注、融化加工、气体发泡、纤维定型/加工、微粒浸出或者这种方法的结合。然后将组装的装置移植入或者向被治疗的个体给药。
所述装置以多种方式在体内组装。所述脚手架由凝胶材料制成，在其未成凝胶时就被引入体内，在体内原位成胶。将装置组分传递到发生装配的位点的示范性方法包括通过针头或者其他挤出工具注射、喷雾、涂布，或者在组织位点沉降，例如使用插管插入传递应用装置。在一个实施例中，在引入身体之前或者在引入时，所述未成胶的或者未形成的脚手架材料与生物活性物质和细胞相混合。所得到体内/原位组装的脚手架包括这些物质和细胞的混合物。
脚手架的原位组装作为聚合物自发作用或者协同性的或者化学催化聚合的结果而发生。由多种内源性的因素或者情况、或者操作器向组装位点提供的外源性因素或者情况在组装位点或者组装位点附近引发协同性催化或者化学催化，所述内源性的因素或者情况例如，体温、体内离子或者pH值，外源性因素或者情况例如，光子、加热、电场、声场、或者其他在引入后直接使用在未成胶材料商的其他辐射。通过辐射束或者通过加热或者光导体(例如线、纤维光缆)或者使用超声波传感器使能量应用到脚手架材料上。作为选择，使用一种剪切稀化的材料，例如ampliphile，这种材料在剪切力作用(例如通过针缝)后的重新相互交联已经被减轻。
适用于体内、体外组装脚手架装置的水凝胶是本领域内已知的，例如Lee et al.，2001，Chem.Rev.7：1869-1879中的描述.肽amphiphile自组装装配方法记载在，例如Hartgerink et al.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99：5133-5138中。在剪切稀释后可逆成胶的方法例举在Lee et al.，2003，Adv.Mat.15：1828-1832中.
通过向目标位点使用连续的相同或者不同的涂料凝胶或者其他脚手架材料，在体内组装成具有多个隔间的装置。例如，用针向预先注射的材料中心依次注射贴近的内层，形成同心圆行的装置。通过将材料注射入预先注射层的不同位置形成非同轴隔间。多头注射装置平行且同时挤出隔间。各个层由相似的或者不同的脚手架组合物制成，用不同的生物活性物质和不同的细胞型涂布。做为选择，根据其疏水/亲水性或者各个隔间内二级相互作用，隔间完成自组装。
隔间化的装置
在一些情况下，一种包括隔间的装置是有效的，各个隔间具有不同的化学和/或物理性能。设计并建造隔间化的装置并使各个隔间使用不同的组合物或者具有不同的组合物浓度。
作为选择，分别制备各个隔间，然后彼此粘附在一起(例如，象“三明治”似的在中间有一个内隔间，在一个侧面或者所有侧面别其他隔间包围)。后一种制造方法是使用各个层之间固有的粘连性、使用各个层之间扩散的相互渗透的聚合物链、通过聚合作用或者第一层和第二层之间的交联作用、使用粘合剂(例如，纤维蛋白胶)、或者一个隔间与另一个隔间的物理捕获完成的。根据适当的前体(例如，对温度敏感的低聚肽、对离子强度敏感的低聚肽、块状聚合物、交联剂和聚合体链，或者这些物质的结合)存在的情况下，这些隔间在体内或者体外自组装并适当的对接，并且这些前体包括能够控制细胞组装的细胞粘着分子。
做为选择，使用印刷技术形成所述隔间化的装置。用生物活性物质涂布脚手架前体的连续的邻接层，将这种连续的邻接层放置在底物上，然后交联，例如通过自组装化学作用交联。当使用化学催化的、光催化的或者热催化的聚合反应控制交联时，各个层的厚度和类型被一种面具控制，当各个催化之后未交联的前体材料被冲走时，产生一种复合的三维模型。(WT Brinkman et al.,Photo-cross-linking of type 1collagen gels in thepresence of smooth muscle cells:mechanical properties,cell viability,andfunction.Biomacromolecules,2003Jul-Aug；4(4):890-895.；W.Ryu et al.,Theconstruction of three-dimensional micro-fluidic scaffolds of biodegradablepolymers by solvent vapor based bonding of micro-molded layers.Biomaterials,2007Feb；28(6):1174-1184；Wright,Paul K.(2001).21st Century manufacturing.NewJersey:Prentice-Hall Inc.)复合物，多隔间层还可以使用喷墨装置制备，所述喷墨装置将不同涂布的脚手架前体“涂”在底物的不同区域。Julie Phillippi(Carnegie Mellon大学)在2006年12月10日的美国细胞生物学年会上发表的内容；Print me a heart and aset of arteries,Aldhouse P.,New Scientist 13April 2006Issue 2547p 19.(为我打印一个心脏和一组动脉，New Scientist(科学工作者)Aldhouse P.,2006年4月13日发行的第19页)；Replacement organs,hot off the press,C.Choi,New Scientist,25Jan 2003,v2379.将这些层放入复合的三维隔间中。还可以使用下面方法制备该装置：喷光致聚合物，选择性激光烧结，分层物体制造，熔融沉积造型，单喷嘴的喷墨印刷，三维印刷，或分层物体制造。
因子扩散和聚合物降解作用、系统中装载的因子剂量和聚合物的组成控制生物活性物质从脚手架装置中释放的释放曲线。相似的，在这些变量中，作用范围(组织分布)和作用持续时间，或者释放因子的空间与时间梯度是可调的。在所关心的组织中，这些因子的扩散和降解作用可以被这些因子的化学修饰任选的调节(例如聚乙二醇化的生长因子)。在这两种情况下，释放的时间范围决定了细胞被这种装置有效传递所需的时间。
使用已知的方法将生物活性物质添加到脚手架组合物上，所述方法包括表面吸收、物理固定，例如，使用相变将物质俘获在脚手架材料中。例如，在生长因子处于水相或者液相中时将其与脚手架组合物相混合，然后改变环境条件(例如，pH、温度、离子浓度)，使液体凝胶化或者固化，从而捕获生物活性物质。或者，使用共价偶联，例如，通过烷基化试剂或者酰化试剂进行共价偶联来使生物活性物质在脚手架上以预定的形态稳定的，长时间的呈递。用于使这些物质共价偶联的示范性的试剂被提供在下表中。
将聚合物与肽/蛋白共价耦合的方法
[a]EDC:1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐；DCC:二环己基碳二亚胺
适合于本发明应用的生物活性物质包括，但是不局限于：干扰素、白介素、趋化因子、细胞因子、集落刺激因子、趋化因子、粒性白细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。可以有效的使用上面提到的任何蛋白质的拼接变体或其小分子激动剂或者拮抗剂来活化树突状细胞，这也被包括在本发明中。
适合于用在本发明所述疫苗装置中、上或者与本发明所述疫苗装置结合的示范性的生物活性物质包括免疫-抑制性蛋白质抑制剂。示范性的免疫-抑制性蛋白质包括免疫检验点蛋白质(例如，细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)、程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)、和程序性细胞死亡蛋白质2配位体(PDL2))。其他示范性的免疫抑制性蛋白质包括B7-H3、B7-H4、LAG3、2B4、BTLA、TIM3、A2aR和/或致死抑制性受体。示范性的抑制剂包括小分子、蛋白质、肽、抗体或者其片段和核酸。例如，所述抑制剂是核酸、蛋白质、抗体或其片段，所述核酸、蛋白质、抗体或其片段能够结合细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)、程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)抑制剂、PDL2、B7-H3、B7-H4、LAG3、2B4、BTLA、TIM3、A2aR和/或致死抑制性受体。例如，所述抑制剂是能够结合一种mRNA的核酸，所述mRNA能够编码细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)、程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)抑制剂、PDL2、B7-H3、B7-H4、LAG3、2B4、BTLA、TIM3、A2aR和/或致死抑制性受体。在一些实施方案中，结合所述抑制剂的mRNA的核酸下调节抑制剂在mRNA和/或蛋白水平中的表达。
小分子是低分子量化合物，分子量小于1000道尔顿、小于800道尔顿或者小于500道尔顿。这里所描述的抗体及其片段包括，但是不局限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合的dAb(结构域抗体)、单链抗体、Fab、Fab’和F(ab’)2片段、Fv、单链抗体(scFv)。抗体片段具有其各自抗体的免疫活性。在一些实施方案中，抗体片段包含1500或者更少、1250的更少、1000或者更少、900或者更少、800或者更少、700或者更少、600或者更少、500或者更少、400或者更少、300或者更少、200或者更少的氨基酸。例如，蛋白质或者肽抑制剂包含1500或者更少、1250的更少、1000或者更少、900或者更少、800或者更少、700或者更少、600或者更少、500或者更少、400或者更少、300或者更少、200或者更少、100或者更少、80或者更少、70或者更少、60或者更少、50或者更少、40或者更少、30或者更少、25或者更少、20或者更少、10或者更少的氨基酸。例如，本发明的核酸抑制剂包含400或者更少、300的更少、200或者更少、150或者更少、100或者更少、90或者更少、80或者更少、70或者更少、60或者更少、50或者更少、40或者更少、35或者更少、30或者更少、28或者更少、26或者更少、24或者更少、22或者更少、20或者更少、18或者更少、16或者更少、14或者更少、12或者更少、10或者更少的氨基酸。
有时候，本发明的化合物(例如，小分子)或者大分子(例如，核酸、多肽、或者蛋白质)被纯化和/或被分离。如这里所使用的，“分离的”或者“纯化的"小分子、多聚核苷酸、多肽、或者蛋白质(例如，抗体或者其片段)是指在通过重组技术产生时基本上不含有其他细胞物质或者培养基的物质，或者是指通过化学合成的化学前体物或者其他化学试剂。纯化后的化合物按重量计算(干重)占所关心化合物的至少60％。优选的，所述制剂按重量计算占所关心化合物的至少75％，更优选的占至少90％，并且最优选的，占至少99％。例如，纯化后的化合物按重量计算占理想化合物的至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，98％，99％，或者100％(重量/重量)。可以通过任何适当的标准方法来测量纯度，例如，通过柱形色谱法、薄层色层分析法、或者高效液相色谱(HPLC)分析。纯化后的或者分离的多聚核苷酸(核糖核酸(RNA)或者脱氧核糖核酸(DNA))不含有哪些在其天然存在形式中存在的侧链基因或者序列。纯化的也用于定义一种灭菌程度，这种灭菌程度可以安全的对人类主体给药，例如，不具有传染性或者毒剂。
“基本上纯的”是指从其天然伴随的成分中分离出来的核苷酸或者多肽。通常，当核苷酸和多肽按重量计算不含有至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或者甚至至少99％的蛋白质和其天然伴随存在的有机分子时，这种核苷酸和多肽是基本上纯的。
例如，核酸抑制剂是短干扰性RNA、短发夹式RNA、反义RNA、适体、肽核酸(PNAs)、微RNA(miRNAs)或者闭合核酸(LNAs)。在一些实施方案中，所述核酸包括修饰的低聚核苷酸(例如、2’-氧-甲基RNA)。
如上所述，示例性的细胞因子包括，但是不局限于IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12 1L-15,1L-17,1L-18,粒性白细胞-巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素-γ(γ-IFN),IFN-α、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-b,FLT-3配体和CD40配体。
本发明的脚手架选择性的包括至少一个非病毒性基因治疗载体，从而在植入位点附近的植入细胞或者宿主细胞会吸收并表达基因，在需要的时间短产生需要的因子的局部有效性。这种非病毒性载体包括，但是不局限于，阳离子性脂类、聚合物、目标蛋白质和磷酸钙。
脚手架的制备
在气体发泡过程中使用85:15，120kD的D,L-丙交酯和乙交酯共聚物(PLG)(Alkermes公司，剑桥，麻省)形成具有开放的，相互连通的小孔的脚手架(Cohen S.,Yoshioka T.,Lucarelli,M.,Hwang L.H.,and Langer R.Pharm.Res.8,713-720(1991)；通过引证在此并入本文)。使用标准双乳液方法制备封装粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体(Harris,L.D.,Kim,B.S.,and Mooney,D.J.J.Biomed.Mater.Res.42,396-402(1998)；通过引证在此并入本文)。然后将16毫克的PLG微球体和150毫克的制孔剂、NaCl或者蔗糖相混合(过筛，使其颗粒大小在250微米和425微米之间)，然后压膜。所得的圆盘在高压的二氧化碳环境中被平衡，然后快速降压，使颗粒展开，并融合成相互连接的结构。通过在水中浸泡使NaCl从脚手架中浸出，产生90％多孔的脚手架。为了将肿瘤溶解产物整合入PLG脚手架中，将已经在C57BL/6J小鼠背部皮下生长过的B16-F10肿瘤活组织切片(杰克逊实验室，Bar Harbor，缅因州)消化在胶原酶中(250U/毫升)(Worthington公司，Lakewood，新泽西)，并在用40微米过滤器过滤后，将细胞悬浮使细胞浓度为107个细胞/毫升。在液氮中快速冷冻肿瘤细胞悬浮液4个循环，解冻(37℃)并在400转/分的离心机中离心10分钟。收集包含肿瘤溶解产物的上清液(1毫升)然后与PLG微球体一起冷冻干燥，使用所得混合物制备基于PLG脚手架的癌症疫苗。为了将CpG-ODNs整合入PLG脚手架，聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩溶液与60微升50％(重量/体积)蔗糖溶液一起涡流，冷冻干燥，然后与干燥的蔗糖混合，使终浓度为150毫克。然后将包括聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物的蔗糖与空白粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或装载肿瘤溶解产物的PLG微球体一起混合，制备PLG癌症疫苗。
本发明的脚手架组合物包括粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L、和/或CCL20和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列。可以预计各个成分的浓度在一个很大的范围内。在一种优选的实施方案中，所述脚手架组合物包括PLG。对于粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L、和/或CCL20，每40毫克聚合脚手架组合物，0-100微克的粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L、和/或CCL20多肽被整合或者被涂布在所述脚手架组合物上。做为选择，被整合在所述脚手架组合物上的粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L、和/或CCL20的剂量包括0-50微克、0-25微克、0-10微克、0-5微克和0-3微克。在一种优选的实施方案中，0-3微克的GM-CSF、Flt3L、和/或CCL20被整合入脚手架组合物中。对于胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列或者PEI-CpG-ODN浓缩物，每40毫克聚合脚手架组合物，0-1000微聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)被整合或者被涂布在所述脚手架组合物上。做为选择，被整合在所述脚手架组合物上的PEI-CpG-ODN的剂量包括0-500微克、0-250微克、0-100微克、0-50微克、0-10微克和0-5微克。在一种优选的实施方案中，0-50微克的聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)被整合到脚手架组合物中。
疫苗装置
生物相容性脚手架被用作癌症疫苗的传递工具。癌症疫苗刺激抵抗癌症细胞的内源性免疫反应。目前生产的疫苗显著活化人体免疫系统(即，抗体依赖性免疫反应)。其他目前正在研发的疫苗主要集中在活化细胞调节的免疫系统方面，包括细胞毒淋巴细胞，这种细胞能够致死肿瘤细胞。通常，癌症疫苗能够增加癌症抗原在抗原呈递细胞(例如，巨噬细胞和树突状细胞)上的呈递，和/或在其他免疫细胞上的呈递，例如T细胞、B细胞和NK细胞。虽然癌症疫苗可以以任意形式存在，但是他们的目的都是将癌症抗原和/或癌症相关的抗原传递到抗原递呈细胞(APC)，从而加速这些抗原在抗原递呈细胞上的内源性过程并最终在MHC 1类分子的细胞表面上呈递这些细胞。癌症疫苗的一种形式是全细胞疫苗，这种疫苗是通过从主体中移出的癌细胞、体外处理，然后作为全细胞重新引入主体而制备的。这些疗法选择性的包括细胞因子，暴露这些细胞因子来活化细胞，从基因上操控细胞过表达细胞因子，或者用肿瘤特异抗原或者抗原混合物激发，并在培养基中扩散。树突状细胞疫苗能够直接活化抗原递呈细胞，使用脚手架组合物调节抗原递呈细胞的增殖、活化和向淋巴结的迁移，从而增加其引发免疫反应的能力。被治疗的癌症种类包括中枢神经系统(CNS)癌症、中枢神经系统(CNS)生殖细胞肿瘤、肺癌、白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、恶性的神经胶质瘤、成神经管细胞瘤和黑素瘤。
为了引起抗原特异性免疫反应，向哺乳动物体内植入一种脚手架装置。定制所述装置来活化免疫细胞并用一种特异性抗原引发细胞，从而增加免疫预防能力并破坏不需要的组织和目标微生物，例如细菌或者病毒病原体。所述装置通过包含和/或释放信号物质，例如粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)来吸引适当的免疫细胞，比如巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞，和树突状细胞。使用本领域惯常用于将其他生物活性化合物整合入脚手架组合物中的技术，将这些信号物质整合在脚手架组合物中，整合方式使其释放可以在时间上和空间上被控制。
一旦免疫细胞进入装置，该装置编程免疫细胞来攻击或者产生其他方面的免疫系统，用于攻击不需要的组织(例如，癌症、脂肪沉淀、或者感染病毒的细胞或者相反的，患病细胞)或者微生物。免疫细胞活化作用伴随着居住的免疫细胞与目标特异性组合物的制备，所述目标特异性组合物例如，在不需要的组织或有机体表面发现的配体，例如癌细胞表面标记物、病毒蛋白质、低聚核苷酸、肽序列或者其他特异性抗原。例如，有效的癌细胞-特异性抗原及其他组织或者有机体-特异性蛋白质列在下表中。
所述装置选择性的包括多重配体或者抗原，用于产生多价疫苗。所述组合物被嵌入或者涂布在脚手架组合物的一个或者一个以上隔间中，从而使免疫细胞迁移穿过装置，在横穿该装置过程中，所述装置与组合物相接触。当脚手架组合物降解时，抗原或者其他免疫刺激性分子暴露于或者将要暴露于细胞中。该装置可能还包括疫苗助剂，所述疫苗助剂能够编程免疫细胞使其识别配体并增加抗原呈递。示范性的疫苗助剂包括趋化因子/细胞因子、富含CpG的低聚核苷酸或者与靶细胞特异性抗原或者配体同时暴露的抗体。
该装置吸引免疫细胞向着脚手架迁移，在脚手架中，细胞以抗原特异性方式被驯化和活化。然后诱导被编程的免疫细胞以多种方式向着淋巴结流出。在一个或者一个以上脉冲中释放所述募集组合物和调配信号/组合物(例如，诱导向着淋巴结迁移的物质)，用整合和/或释放脚手架材料的方法编程，或者通过连续脚手架隔间(包括诱引剂的脚手架隔间)的降解作用控制。当脉冲小时时，细胞迁移开来。设计包括排异物质的隔间来降解并释放所述排异物质，所述释放可以是在一个或者更多个脉冲中释放，或者随着时间稳定释放。排异物质的相对浓度使免疫细胞从装置中迁移出来。做为选择，已经被放入或者已经迁移进入装置中的细胞被编程，从而释放排异物质，或者改变其自身行为。例如，通过将细胞暴露于附着在脚手架上的质粒DNA来进行定位基因治疗。有效的排异物质包括趋化因子和细胞因子。做为选择，所述装置可以通过降解或者释放免疫细胞使免疫细胞流出。
下面列出了在疫苗装置中有效的目标疾病状态，刺激性分子和抗原。
促进免疫反应的生物活性因子
a.白介素:IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-8,IL-10,IL-12 1L-15,1L-17,1L-18等等。
b.TNF-α
c.IFN-γ
d.IFN-α
e.GM-CSF
f.G-CSF
g.Ftl-3配体
h.MIP-3β(CCL19)
i.CCL21
j.M-CSF
k.MIF
l.CD40L
m.CD3
n.ICAM
o.抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)蛋白质或者其片段(例如，易普利姆玛(Ipilimumab)或者替西木单抗(Tremelimumab))
p.TGF-β
q.富含CPG的DNA或者低聚核苷酸
r.与细菌有关的糖部分：例如脂聚糖(LPS)
s.Fas配体
t.示踪剂
u.淋巴细胞趋化因子
v.Mannan(M-FP)
w.热休克蛋白(例如apg-2,Hsp70和Hsp 90)
x.抗-PD1蛋白质或者抗体(例如，MDX-1106,MK3475,CT-011或者AMP-224)
y.抗-PDL1或者抗-PDL2蛋白质或者抗体(例如，MDX-1105)
z.抗-LAG3蛋白质或者抗体或其片段
aa.抗-B7-H3蛋白质或者抗体或其片段
bb.抗-B7-H4蛋白质或者抗体或其片段
cc.抗-TIM3蛋白质或者抗体或其片段
dd.抗-BTLA蛋白质或者抗体或其片段
ee.抗-A2aR蛋白质或者抗体或其片段
ff.抗-致死抑制性受体(KIR)(例如，致死细胞免疫球蛋白-样受体或者C-类凝集素受体)蛋白质或者抗体或其片段
gg.抗-TIM4蛋白质或者抗体或其片段
hh.抗-TIM2蛋白质或者抗体或其片段
ii.抗-OX40蛋白质或者抗体或其片段
jj.抗-4-1BB蛋白质或者抗体或其片段
kk.抗-磷脂酰丝氨酸蛋白质或者抗体或其片段(例如，针对磷脂酰丝氨酸的单克隆抗体)
疾病和抗原-疫苗接种目标
a.癌症：抗原及其来源
i.从活组织检查中提取的肿瘤溶解产物(例如，来自黑素瘤活检)
ii.照射的肿瘤细胞(例如，照射的黑素瘤细胞)
iii.黑素瘤
1.MAGE系列抗原(例如，MAGE-1)
2.MART-1/melanA
3.酪氨酸酶
4.神经节苷酯
5.gp100
6.GD-2
7.O-乙酰化GD-3
8.GM-2
9.B16-F10肿瘤溶解产物，例如，来自用B16-F10黑素瘤肿瘤细胞(ATCC,Manassas,NJ)攻击的小鼠的溶解产物
10.酪氨酸酶-相关蛋白质(TRP)-2
11.肺癌细胞溶解产物或者肺癌细胞抗原
12.神经胶质瘤癌细胞溶解产物或者神经胶质瘤癌细胞抗原
13.前列腺癌细胞溶解产物或者前列腺癌细胞抗原
iv.乳腺癌
1.MUC-1
2.Sos1
3.蛋白激酶C-结合蛋白
4.逆转录酶蛋白
5.AKAP蛋白
6.VRK1
7.KIAA1735
8.T7-1,T11-3,T11-9
9.Her2(也叫做CD340)
v.其他通用和特异性癌症抗原
1.现代人端粒酶酵素(hTRT)
2.角蛋白-19(CYFRA21-1)
3.鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)，(蛋白质T4-A)
4.鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)
5.卵巢癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)
6.粘蛋白1(肿瘤相关粘蛋白),(癌相关粘蛋白),(多肽性上皮粘蛋白),(PEM),(PEMT),(上皮唾蛋白),(肿瘤-相关的上皮细胞膜抗原),(EMA),(H23AG),(花生-反应性尿粘蛋白),(PUM),(乳腺癌相关抗原DF3)
7.CTCL肿瘤抗原se1-1
8.CTCL肿瘤抗原se14-3
9.CTCL肿瘤抗原se20-4
10.CTCL肿瘤抗原se20-9
11.CTCL肿瘤抗原se33-1
12.CTCL肿瘤抗原se37-2
13.CTCL肿瘤抗原se57-1
14.CTCL肿瘤抗原se89-1
15.前列腺-特异性膜抗原
16.5T4癌胚滋养层糖蛋白
17.Orf73卡波济肉瘤相关疱疹病毒
18.MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)
19.MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原)(DAM10)
20.MAGE-B2抗原(DAM6)
21.MAGE-2抗原
22.MAGE-4a抗原
23.MAGE-4b抗原
24.结肠癌抗原NY-CO-45
25.肺癌抗原NY-LU-12变体A
26.癌相关表面抗原
27.腺癌抗原ART1
28.伴癌相关的脑-睾丸-癌抗原(旁瘤抗原MA2；肿瘤伴随神经元抗原)
29.神经肿瘤抗原2(NOVA2)
30.原发性干细胞癌抗原基因520
31.肿瘤相关抗原CO-029
32.肿瘤相关抗原MAGE-X2
33.滑膜肉瘤，X断点2
34.T细胞识别的鳞状细胞癌抗原
35.血清学方法测出的结肠癌抗原1
36.血清学方法测出的乳腺癌抗原NY-BR-15
37.血清学方法测出的乳腺癌抗原NY-BR-16
38.嗜铬粒蛋白A；甲状旁腺分泌蛋白1
39.DUPAN-2
40.CA 19-9
41.CA 72-4
42.CA 195
43.癌胚抗原(CEA)
b.AIDS(HIV相关抗原)
i.Gp120
ii.SIV229
iii.SIVE660
iv.SHIV89.6P
v.E92
vi.HC1
vii.OKM5
viii.FVIIIRAg
ix.HLA-DR(Ia)抗原
x.OKM1
xi.LFA-3
c.常见的感染性基本及相关抗原
i.肺结核
1.结核杆菌抗原5
2.结核杆菌抗原85
3.ESAT-6
4.CFP-10
5.Rv3871
6.GLU-S
ii.疟疾
1.CRA
2.RAP-2
3.MSP-2
4.AMA-1
iii.可能突变的流行性感冒和脑膜炎菌株
d.神经保护–防止神经疾病(例如，阿尔兹海默氏病、帕金森病、朊蛋白病)
1.自CNS抗原种类
2.人α-突触核蛋白(帕金森病)
3.β-淀粉样斑块(阿尔兹海默氏病)
e.自体免疫性疾病(多发性硬化,类风湿性关节炎，等等)
i.疾病连接的MHC抗原
ii.不同种类的自体抗原
iii.胰岛素
iv.胰岛素肽B9-23
v.谷氨酸
vi.脱羧酶65(GAD 65)
vii.HSP 60
疾病连接的T细胞受体(TCR)
现有的疫苗对于已经产生的癌症通常没有任何效果，这是由于先进的疾病需要更有力并且更持续的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的活化作用来致死肿瘤细胞并消除疾病。树突状细胞(DC)的子集专门进行抗原交叉呈递并产生细胞因子，这种子集调节CTL和T调节性(Treg)细胞，降低效应子T细胞反应。树突状细胞网(尤其是浆样树突状细胞(pDC)和CD8+树突状细胞)的协同调节作用能够提高老鼠的宿主免疫力。将功能性的生物材料与炎症性细胞因子、免疫危险信号和肿瘤溶解产物的多种形式的结合相整合，用于控制宿主树突状细胞群落原位活化和定位。
这里使用了可植入性合成聚合物基质(装载抗原的多孔生物材料装置)，所述基质可以在时间、空间上控制细胞因子、肿瘤抗原和危险信号的体内呈递。GM-CSF从这些聚丙交酯-共-乙交酯(PLG)(一种食品药品管理局(FDA)-认证的生物材料)基质中释放到周围组织，从而募集树突状细胞前体和树突状细胞。富含CpG的低聚核苷酸被固定在基质上作为危险信号，并且抗原(肿瘤溶解产物)被释放到居住在基质上的树突状细胞中，编程树突状细胞的发展的成熟。这些基质定量调节树突状细胞的活化和原位运输，并诱导针对小鼠B16-F10黑素瘤细胞接种的预防性免疫作用(P.Schnorrer,G.M.Behrens,N.S.Wilson,J.L.Pooley,C.M.Smith,D.El-Sukkari,G.Davey,F.Kupresanin,M.Li,E.Maraskovsky,G.T.Belz,F.R.Carbone,K.Shortman,W.R.Heath,J.A.Villadangos,The dominant roleof CD8+dendritic cells in cross-presentation is not dictated by antigencapture.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103,10729–10734(2006))。如这里所述，在一定时间内重复施用本系统从而控制多种树突状细胞和T细胞子集的募集和活化，这是一种针对已有肿瘤的有效的治疗性疫苗。
基质制备
这里所描述的是用于基质制备的示范性方案(参见，例如，US2013-0202707，通过引证在此全部并入本文)。在气体发泡过程中使用85:15，120kD的D,L-丙交酯和乙交酯共聚物(PLG)(Alkermes公司)形成多孔的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质(L.D.Harris,B.S.Kim,D.J.Mooney,Open pore biodegradable matrices formed with gasfoaming.J.Biomed.Mater.Res.42,396–402(1998)).简单地说，使用标准双乳液技术制备聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体包覆的GM-CSF(S.Cohen,T.Yoshioka,M.Lucarelli,L.H.Hwang,R.Langer,Controlled delivery systems for proteins based on poly(lactic/glycolic acid)microspheres.Pharm.Res.8,713–720(1991)).然后将PLG微球和150毫克的制孔剂、蔗糖相混合(过筛，使其颗粒大小在250微米和425微米之间)，然后压膜。所得的圆盘在高压的二氧化碳环境中被平衡，然后快速降压，使颗粒展开，并融合成相互连接的结构。通过在水中浸泡使蔗糖从脚手架中浸出，产生90％多孔的脚手架。为了将肿瘤溶解产物整合入PLG脚手架中，将已经在C57BL/6J小鼠背部皮下生长过的B16-F10肿瘤活组织切片(杰克逊实验室)消化在胶原酶中(250U/毫升)(Worthington公司)，并在用40微米过滤器过滤后，将细胞悬浮使细胞浓度为107个细胞/毫升。在液氮中快速冷冻肿瘤细胞悬浮液四个循环，解冻(37℃)并在400转/分的离心机中离心10分钟。收集包含肿瘤溶液产物的上清液(1毫升)，与聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)微球体一起培养，并冷冻干燥，在高压二氧化碳中使所得混合物发泡产生整合有肿瘤溶解产物的大孔聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质。
为了将CpG-ODN整合入聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架中，使用PEI(分子量大约为60,000；Sigma Aldrich公司)分子，通过将ODN 1826溶液滴入PEI溶液中同时搅拌混合物来浓缩胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)1826，5-tccatgacgttcctgacgtt-3′(Invivogen公司，圣地亚哥，加利福尼亚；SEQ ID NO:29)(L.D.Harris,B.S.Kim,D.J.Mooney,Open pore biodegradable matrices formed with gasfoaming.J.Biomed.Mater.Res.42,396–402(1998)；S.Cohen,T.Yoshioka,M.Lucarelli,L.H.Hwang,R.Langer,Controlled delivery systems for proteins based on poly(lactic/glycolic acid)microspheres.Pharm.Res.8,713–720(1991)；Y.C.Huang,M.Connell,Y.Park,D.J.Mooney,K.G.Rice,Fabrication and in vitro testing ofpolymeric delivery system for condensed DNA.J.Biomed.Mater.Res.A 67,1384–1392(2003)).在冷凝过程中，聚(氮丙啶)(PEI)和胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)(NH3+:PO4–)之间的比值维持在7。然后，聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩溶液与60微升50％(重量/体积)蔗糖溶液一起涡流，冷冻干燥，然后与干燥的蔗糖混合，使终浓度为150毫克。然后将包括聚(氮丙啶)(PEI)-胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)浓缩物的蔗糖与空白粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和/或装载肿瘤溶解产物的PLG微球体一起混合，制备PLG癌症疫苗。
为了完成控制的粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和Toll样受体(TLR)激动剂呈递，大孔的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质快速释放粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(Ali et al.,2009Nat Mater,2:151–8)；例如，大约60％的所述蛋白质在10天内释放(US2013-0202707，通过引证在此全部并入本文)，从而诱导树突状细胞(DC)或者其前体的募集。装载粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)脚手架还可以被修饰用于呈递Toll样受体(TLR)-活化的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)、单磷酸脂A(MPLA)和P(I:C)分子，作为危险信号。呈递Toll样受体(TLR)激动剂以提供长期的局部信号，活化树突状细胞(DC)。重要的是，选择相对高分子量和组成的PLG用于制备脚手架，导致缓慢的脚手架降解作用，允许对疫苗接种位点的长期分析和其对树突状细胞活化的T细胞免疫性的调节。
本发明的疫苗系统可以对缺乏免疫原性的B16-F10黑素瘤产生预防免疫性(O.A.Ali,N.Huebsch,L.Cao,G.Dranoff,D.J.Mooney,Infection-mimicking materialsto program dendritic cells in situ.Nat.Mater.8,151–158(2009)和US2013-0202707，通过引证在此全部并入本文)。如US2013-0202707(通过引证在此全部并入本文)中所述，所述疫苗系统通过pDC和CD8+DCs诱导的天然T细胞分化作用促进和延长细胞毒素T-淋巴细胞(CTL)反应，并相应的产生I型IFNs和IL-12，并抑制负反馈机制。
如在US2013-0202707中所述，通过引证在此全部并入本文，包含各种Toll样受体(TLR)激动剂的疫苗制剂产生重要的和系统性的抗黑素瘤CTL，与特异性树突状细胞(DC)亚群的活化和减少的肿瘤负荷相关。活化的树突状细胞(DC)包括Toll样受体(TLR)激动剂，通常增加其表面MHCII和共刺激分子CD86的表达，说明具有增加的呈递抗原和活化的T细胞群能力。尤其是，适当的Toll样受体(TLR)信号增加疫苗位点处CD8(+)和pDC亚群的产生，并刺激IFN和潜在的T细胞生长因子，IL-12的产生。
在一些实施方案中，三种不同的病原体相关的分子类型(PAMP)被整合在结构聚合装置中或者结构聚合装置上，例如，聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)圆盘结构/脚手架，在疫苗中作为辅料(3种类型；短的低聚核苷酸(胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN))；合成的RNA-(聚(I:C)；P(I:C))，合成类脂物((单磷酸脂A(MPLA))。这种疫苗制剂募集并活化树突状细胞原位。
在侵略性黑素瘤癌症模型中疫苗依赖型残余物与疫苗特异性活化2种树突状细胞亚群(CD8(+)树突状细胞(DC)和浆样树突状细胞(pDC))的能力密切相关，无论所述疫苗系统中使用的辅料是什么。这种相关性已经利用4种不同的疫苗辅料在聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗中证实。这些疫苗通过活化特异性T细胞反应在黑素瘤治疗模型中有效的诱导肿瘤排异，所述特异性T细胞反应以及在疫苗位点和肿瘤处检测到。这些发现表明聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗系统在与不同类型的激动剂整合时的多样性，所述激动剂刺激不同的先天性和适应性免疫反应途径。
树突状细胞在免疫反应中的作用
树突状细胞(DC)通过激发并传播特异性细胞毒素T-淋巴细胞(CTL)反应来安排针对感染和肿瘤的免疫反应。在外周组织中不成熟的树突状细胞(DC)残基检测侵入性病原体独有的外源物质(即，抗原)，并通过刺激在病原体诱导的炎症性反应期间产生的例如病原体相关的分子类型(PAMP)或者临终细胞(即“危险信号”)，来活化所述不成熟的树突状细胞(DC)。成熟的树突状细胞(DC)使主要组织相容性复合体(MHC)受体上加工和抗原呈递过程变成熟，并表达共刺激分子CD80和CD86，这两种都是效应因子T细胞刺激作用所需要的。另一个“危险信号”促进的树突状细胞(DC)成熟的重要结果是所述树突状细胞(DC)能够到达淋巴结，从而调动并活化天然的T细胞，使所述体细胞能够识别树突状细胞(DC)呈递的抗原。
特定树突状细胞(DC)引发和控制免疫反应的能力来源于其组织内定位能力及其专门的移动能力。树突状细胞(DC)来自骨髓中的多功能干细胞，进入血液流并定位于基本上所有的器官中。根据一系列表面标记物的相对表达，在外周血液中可以识别出不同亚群的树突状细胞或者树突状细胞前体，包括浆样树突状细胞(pDCs)和传统的树突状细胞(cDCs)。pDC是主要的1类干扰素(IFN)生产者，并且专门活化适应性免疫反应，所述适应性免疫反应是针对通过细胞因子信号传导引发的病毒攻击的。CD11c(+)cDC，例如表皮树突状细胞(DC)，尤其适用于抗原呈递和共刺激T细胞。
随着微生物的入侵和感染，树突状细胞快速迁移进入淋巴结和原始感染位点，其数量源源超过其他APC，例如巨噬细胞。在稳定状态下，使用细胞因子Fms-有关的酪氨酸激酶3配体，配体(FL)控制最多树突状细胞(DC)亚群的产生，包括(pDCs)。损伤或者感染细胞释放的其他细胞因子，比如粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和CCL20，在发炎位点主动募集并定位cDC。在炎症性模型中，无论是体内还是体外，这些炎症性细胞因子以及显示出能够增加树突状细胞的迁移和增殖作用，并且可以调节树突状细胞(DC)的活化状态。在感染期间活化的树突状细胞(DC)的数量或者在肿瘤内活化的树突状细胞(DC)的数量与随后免疫反应的强度和疾病预后有关。
为了产生足够数量的树突状细胞(DC)进行免疫治疗，通常使用树突状细胞(DC)前体和炎症性细胞因子的基于实验室的培养物，所述炎症性细胞因子例如粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和FL(Flt3)。体外修饰用于呈递肿瘤抗原的树突状细胞(DC)能够随着移植，在小鼠模型中激发抗癌作用。体外基于树突状细胞(DC)的疫苗的临床试验证明能够在癌症病人亚群中诱导肿瘤退化，但是几乎没有改善存活率。涉及树突状细胞体外操作的方案被产生的树突状细胞的数量和种类、不好的移植功效和LN定位以及注射入体内环境之后树突状细胞(DC)活化作用的损失所限制。
为了解决这些显示，本装置的感染模拟材料使炎症性细胞因子与一种危险信号一起呈递，从而体内募集并活化树突状细胞(DC)。同样，包括富集胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)序列的纳米颗粒被固定在脚手架上，胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)被表示为细菌DNA，并且是有效的危险信号，可以刺激基质中居住的树突状细胞(DC)的活化。
CD141+树突状细胞(DC)和浆样树突状细胞(DC)是成功进行癌症疫苗接种(预防性的和治疗性的)的关键。浆样树突状细胞(DC)好象浆细胞，但是具有某些类俗语脊髓树突状细胞的特征，可以产生大量的干扰素-α，并且特征为TLR7和TLR9。所述Toll样受体(TLR)激动剂，CpG，结合TLR9。小鼠体内的CD8+树突状细胞(DC)等于CD141+树突状细胞。CD141+树突状细胞(DC)在人淋巴结、骨髓、扁桃体和血液中存在。其特征在于高表达Toll样受体3(TLR3)，产生IL-12p70和IFN-β，并与更广泛研究的CD1c+树突状细胞(DC)亚群相比，具有更高的诱导T辅助1细胞反应能力。
与聚I:C–活化的CD1c+树突状细胞(DC)相比，聚肌苷-聚胞啶酸(聚I:C)-活化的CD141+树突状细胞(DC)具有更高的将抗原交叉呈递到CD8+细胞毒性T细胞上的能力。因此，CD141+树突状细胞(DC)亚群代表了一种重要的功能性不同的人树突状细胞(DC)亚类，其特征与小鼠CD8α+树突状细胞(DC)亚群类似。CD141+树突状细胞(DC)在诱导细胞毒性T细胞反应时发挥重要作用，并且其活化作用对于抗癌、抗病毒及其他病原体疫苗接种是非常重要的。
疫苗装置中的p(I:C)刺激人体中的CD141+树突状细胞(DC)(在小鼠体内时CD8+树突状细胞(DC))，并且CpG刺激浆样树突状细胞(DC)。带有一种或者全部两种所述Toll样受体(TLR)激动剂的装置会产生有效的树突状细胞(DC)活化作用并产生显著的预防性和治疗性抗肿瘤免疫反应。不同Toll样受体(TLR)激动剂的结合，例如，p(I:C)和CpG的结合，在装置中会导致活化的协同效应，所述活化是针对肿瘤的树突状细胞(DC)免疫反应活化。
聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)和P(I:C)整合在一起，能够发挥协同作用，产生重要的肿瘤抑制作用，减少肿瘤负荷，产生改善的抗肿瘤免疫反应。
细胞因子的控制释放和体内树突状细胞(DC)募集
涉及大孔的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质用于提供粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、FL和CCL20长时间的持续释放，并收容树突状细胞(DC)用于活化。这些PLG脚手架是80-90％多孔的，其平均孔径在125-200微米之间，用于促进树突状细胞的渗入。这三种细胞因子的体外释放动力学是相似的，在头五天，基质快速释放蛋白质脉冲，随后在几乎几周的时间内持续释放(US 2013-0202707，通过引证在此全部并入本文)。
树突状细胞(DC)的体内活化
修饰PLG脚手架来呈递纳米颗粒，所述纳米颗粒包括Toll样受体(TLR)活化的胞嘧啶-鸟嘌呤低聚核苷酸(CpG-ODN)作为一种感染模拟危险信号，与炎症性细胞因子一起传递。与缺乏细胞因子信号传导的参照情况相比，这显著的增加了树突状细胞的原位活化。
树突状细胞(DC)和树突状细胞(DC)前体受控制的移动和活化对于体外开发基于树突状细胞的疫苗是非常重要的，并且对于设计能够体内活化免疫系统的材料通常也是非常重要的。如这里所述，模拟微生物感染关键方面的聚合物能够有效的募集树突状细胞(DC)用于癌症疫苗接种。工程设计PLG脚手架从而释放GM-CSF、FL和CCL20，这能使居住的树突状细胞的数量显著增加，并且，与危险信号一起共呈递能够导致树突状细胞的成熟。即使所有的疫苗配方都能够在B16-F10黑素瘤治疗模型中诱导肿瘤保护作用，与CCL20相比，粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和FL疫苗能够产生更多的抗原特异性CTL，较高水平的Th1激发的细胞因子和更高的存活率。
pDC及其依赖性细胞溶解(cDC)对应物被靶向从而开发其调节抗肿瘤T细胞反应的能力。与纳米颗粒靶向系统相反，这里描述的聚合物系统不但能够作为一种抗原传递装置募集并活化树突状细胞(DC)，还可以作为一种物理结构，在此结构中，树突状细胞短时间居住于此同时被活化。
这里描述的系统显示重要的抗肿瘤活性。除了所述聚合物(例如，这里描述的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG))之外，基质可选的由其他更多的炎症性聚合物制备，从而促进免疫反应和树突状细胞的迁移。随后T细胞激发的另一个重要方面是LN复位。通过将不同的助剂整合到材料中活化迁移功能来最优化与抗原接触后树突状细胞的离去或者分散。做为选择，改变其他基质性质(包括降解动力学和多孔性)来促进对树突状细胞运输的进一步控制。
在生物材料系统中使用FL、CCL20和GM-CSF模拟感染诱导树突状细胞(DC)的原位募集。如US2013-0202707中所述，例如，在第111页第17行-第113页第17行(通过引证在此全部并入本文)，模拟感染的多孔装置可以有效作为治疗性癌症疫苗。
抗体
如这里所使用的，术语“抗体”指的是免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，包含抗原结合位点的分子，所述抗原结合位点是指特异性结合抗原的位点(与抗原发生免疫反应的位点)。通过“特异性结合”或者“与。。发生免疫反应”指的是抗体与一种或者一种以上理想抗原的抗原决定簇发生反应，并且不与其他抗原发生显著的反应。这里所描述的抗体包括，但是不局限于，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、dAb(结构域抗体)、单链抗体、Fab、Fab'和F(ab')2片段、单链抗体(scFv)和Fab表达文库。
单链FV(“scFv”)多肽分子是一种以共价键联系的VH::VL杂二聚物，其可以从一种基因融合物中被挤出，所述基因融合物包括重链可变区(VH)-和轻链可变区(VL)-编码基因，通过编码肽的连接体相连。(参见Huston et al.(1988)Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883).目前已经公开了许多方法分辨自然聚集物转化的化学结构，但是将轻和重多肽链从抗体V区域化学上分离成单链抗体(scFv)分子会折叠成已知三维结构，这种结构基本上类似于抗原结合簇的结构。(参见，例如，美国专利第5,091,513号，第5,132,405号和第4,946,778号。
术语“抗原结合簇”或者“结合部分”指的是免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重(“H”)和轻(“L”)链的N-末端可变(“V”)区域的氨基酸残基组成。重链和轻链可变区内部的三个高度离散型拉伸区也被称作“高可变区”，插入更保守的侧链延展区，被称为“骨架区域”或者“FRs”。因此，术语“FR”指的是免疫球蛋白高可变区域之间和附近天然存在的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高可变区域和重链的三个高可变区域在三维空间中相互放置，形成一种抗原-边界面。所述抗原-变截面与结合抗原的三维表面是互补的，并且每个重链和轻链的三个高度可变区中的每个都被认为是“互补决定区”或者“CDR”。
如这里所使用的，术语“抗原决定簇”包括任何能够与免疫球蛋白、单链抗体(scFv)或者T细胞受体特异性结合的蛋白质决定簇。抗原决定簇由分子的化学活性表面基团，例如氨基酸或者糖侧链组成，并且具有特异性的三维结构特征和特异性电特征。例如，所述抗体可以由抗多肽的N末端或者C末端肽、蛋白质的线性肽序列或者非线性的肽序列以及包括第一抗原和第二抗原的抗原决定簇而产生。
如这里所使用的，术语“免疫结合”和“免疫结合性质”指的是发生在免疫球蛋白分子和该免疫球蛋白所特异的抗原之间的非-共价相互作用类型。免疫结合相互作用的浓度或者亲合性可以表示为相互作用的电离常数(Kd)，其中较小的Kd代表较大的结合亲合性。使用本领域内已知的方法可以定量被选择的多肽的免疫结合性质。这种方法中的一个包括测量抗原结合簇/抗原复合物形成和解离的速率，其中，所述速率依赖于复合物构成的浓度、相互作用的亲合性和同样影响双向速率的几何参数。因此，可以通过计算浓度和实际结合和解离速度确定“结合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)。(Nature361:186-87(1993)).Koff/Kon比例能够删除所有与亲合性不相关的参数，并等于电离常数Kd。Davieset al.(1990)Annual Rev Biochem 59:439-473).本发明的抗体据说特异性的结合这里所描述的抗原或者抗原决定簇(例如，CTLA、程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)、程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)或者其他免疫抑制性蛋白质和/或肿瘤抗原)，当平衡结合常数(Kd)￡1μM，优选￡100nM，更优选的￡10nM，更优选的￡1nM，并且最优选的￡100pM到大约1pM，如通过例如本领域普通技术人员所熟知的放射性配体结合试验或者类似的试验来测定的。
给药途径
本发明的药物组合物(例如这里所描述的抑制剂)被配制为适合于其预定的给药途径。给药途径的实施例包括肠胃外给药，例如，静脉给药、腹膜内给药、皮内给药、皮下给药、口服(例如，吸入)给药、透皮给药(即，局部给药)、经粘膜给药和直肠给药。用于肠胃外给药、皮内给药或者皮下给药的溶液或者悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释液，例如注射用水、盐溶液、不易挥发的油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其他合成溶液；抗菌剂，例如苯甲醇或者对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂例如抗坏血酸或者亚硫酸氢钠；螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)；缓冲液例如醋酸盐、柠檬酸盐或者磷酸盐，和用于调整张力的试剂，例如氯化钠或者葡萄糖。pH值可以用酸或者碱调整，例如用盐水或者氢氧化钠。将肠胃外制剂装入安瓿瓶、可随意使用的注射器或者由玻璃或者塑料制成的多次剂量小瓶中。
适合于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(在水可溶时)或者分散体系和无菌粉末，用于随时制备无菌可注射溶液或者分散体系。用于静脉内给药，适当的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(巴斯夫公司，Parsippany，新泽西)或者磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有的情况下，所述组合物将应无菌的，并且必须能够有效的流动从而容易可注射性。其在制备和储存条件下必须是稳定的，并且必须防止微生物(例如，细菌和真菌)的污染作用。所述载体可以是一种溶剂或者分散介质，包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油，丙二醇和液态的聚乙二醇，等等)和其适当的混合物。通过使用包覆材料(例如，卵磷脂)，对于分散体系来讲通过维持要求的粒度以及通过使用表面活性剂可以维持合适的流动性。通过包含多种抗菌剂和抗真菌剂的方式完成对微生物的预防作用，所述抗菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸、氯代丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等等。在许多情况下，所述组合物中优选包括等渗剂，例如糖、多元醇，例如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠或其结合。可注射组合物的延迟吸收可以通过向组合物中加入能够延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现。
通过将需要量的所述治疗性活性化合物整合入适当的溶剂(根据需要含有上面所列举的一种组分或者组分的结合)，随后过滤灭菌可以制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物整合入一种无菌媒介物中可以制备分散体系，所述无菌媒介物包括基本分散介质和来自上面列举的需要的其他组成。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末来讲，优选那制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这会产生活性成分(即，治疗性化合物那粉末)，并选择性的获得其他来自无菌过滤溶液的需要的组分。
口服组合物通常包括一种惰性稀释剂或者一种可食用的载体。他们可以被装入胶囊中或者被压缩成片。为了实现口服治疗性给药，所述活性化合物可以与赋形剂混合，并用于形成片剂、锭剂或者胶囊剂。口服组合物还可以使用液体载体制备，用作嗽口水，其中在液体载体中的化合物口服使用并漱口、吐出或者吞咽。制药上合适的结合试剂和/或辅料材料可以被包括作为组合物的一部分。所述片剂、药丸、胶囊剂、锭剂等等可以包含以下任何一个成分，或者类似性质的化合物：一种粘合剂，例如微晶纤维素、黄芪胶或者明胶；一种赋形剂，例如淀粉或者乳糖；一种崩解剂，例如海藻酸、Primogel或者玉米淀粉；一种润滑剂，例如硬脂酸镁或者Sterotes；一种助流剂，例如，胶体二氧化硅；一种甜味剂，例如蔗糖或者糖精；或者一种调味剂，例如，胡椒薄荷、水杨酸甲酯或者橙香料。
对于吸入式给药，所述组合物以气溶胶喷雾的形式从按压容器中传递或者从包含适当的推进剂，例如，气体(例如二氧化碳)的调和器或者喷雾器中传递。
系统性给药还可以通过经粘膜或者透皮给药方式给药。对于经粘膜或者透皮方式给药，适合于穿过屏障进行渗透的渗透剂被用于所述制剂中。这种渗透剂通常是本领域内已知的，并且包括，例如，用于经粘膜给药、清洁剂、胆盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜给药可以通过鼻喷入法或者栓剂完成。对于透皮给药，所述活性化合物被配制成软膏剂，油膏剂、凝胶剂或者乳膏剂，如本领域内已知的。
本发明化合物还可以被制备成栓剂(例如，用传统的栓剂基质，例如，可可脂及其他甘油酯)或者保留在肠中用于直肠传递。
在一个实施方案中，所述活性化合物可以用能够防止化合物快速从体内排出的载体来制备，例如，持续/控制释放制剂，包括移植物和微囊密封的传递系统。可以使用生物降解性、生物相容性聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯共聚物、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这种制剂的方法对本领域普通技术人员来讲是显而易见的。
例如，所述活性成分可以被包裹在制备的微胶囊中，例如，通过凝聚技术或者通过界面聚合作用，分别例如，羟甲基纤维素或者明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，在胶体药物传递系统中(例如，脂质体、白蛋白微球体、胶束溶液、纳米-颗粒和纳米微胶囊)或者在大乳化剂中。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂适当的实施例包括含有该抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质以定型固体形式存在，例如，薄膜或者微胶囊。持续释放基质的实施例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-异丁烯酸)、或者聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸的共聚物、不可降解的亚乙基-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物，例如LUPRON DEPOT TM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮脯利特醋酸盐组成的可注射的微球体)和聚-D-(-)-3-羟丁酸。聚合物，例如亚乙基-醋酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能够在超过100天的时间内释放分子，而某些水凝胶只能在较短的时间内释放蛋白质。
这些材料还可以从Alza公司和诺华制药公司商业购得。磷脂悬浮液(包括靶向受感染细胞的脂质体和病毒抗原的单克隆抗体)也可以被用作药学上可接受的载体。这些可以使用本领域普通技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利第4,522,811号中的描述，通过引证在此全部并入本文。
配制口服或者肠胃外给药组合物对于单位剂量形式是十分有利的，可以便于给药并具有剂量上的均一性。如这里所使用的单位剂量形式指的是适合于作为单一剂量对接受治疗的主体给药的物理上独立的单元；每个单元包括预先确定量的活性化合物，经计算，这些活性化合物能够产生理想的治疗作用，并且所述活性化合物与所述的药物载体和选择性的另一种试剂结合。本发明对患者进行治疗的单位剂量形式的说明书可以通过活性化合物的特有特性和需要实现的具体治疗作用、以及活性化合物合成技术固有的限制来确定或者决定。
药物组合物可以与说明书一起被包括在容器、包装或者调配器中用于给药。
剂量
本发明的方法包括以0.01-10毫克/千克(例如，0.1-5毫克/千克)体重的剂量给药这里所描述的免疫-抑制性蛋白质的一种或者一种以上抑制剂。例如，所述抑制剂以0.01毫克/千克、0.02毫克/千克、0.05毫克/千克、0.1毫克/千克、0.3毫克/千克、0.5毫克/千克、1毫克/千克、3毫克/千克、5毫克/千克、10毫克/千克、15毫克/千克、20毫克/千克、25毫克/千克、30毫克/千克、35毫克/千克、40毫克/千克、45毫克/千克、50毫克/千克的剂量被给药。在一些实施方案中，所述抑制剂每天给药、每隔一天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、或者每隔6天给药。在其他实施方案中，所述抑制剂每1-10周给药(例如，每1、2、3、4、5、6、7、8、9或者10周)。例如，在总共7天到3年的时间里给药抑制剂(例如，7天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、24周、36周、1年、1.5年、2年、2.5年或者3年)。例如，所述抑制剂长时间被给药(例如，至少3年)。在一些实施方案中，抑制剂的提供量是0.01-50毫克(例如，0.05-30毫克)每剂量。例如，所述抑制剂每次以0.01毫克、0.02毫克、0.05毫克、0.1毫克、0.2毫克、0.4毫克、0.8毫克、2毫克、5毫克、10毫克、15毫克、20毫克、25毫克、30毫克、40毫克，或者50毫克)的剂量被给药(例如，每次注射)。有时候，所述抑制剂是每两周被给药。例如，所述抑制剂每隔一周被给药，总共给药1-20次(例如，1、2、4、6、8、10、15或者20次)。
在一些实施例中，抑制剂(例如，这里所描述的抗体)被整合到疫苗装置中或者整合到疫苗装置上。在此情况下，0-100毫克(例如，5-100毫克、10-100毫克、20-100毫克、30-100毫克、40-100毫克、50-100毫克、60-100毫克、70-100毫克、80-100毫克、90-100毫克、1-95毫克、1-90毫克、5-95毫克、5-90毫克、5-80毫克、5-70毫克、5-60毫克、5-50毫克、5-40毫克、5-30毫克，或者5-20毫克)抑制剂(例如，这里所描述的抗体)存在于所述装置中。例如，所述抑制剂(例如，这里所描述的抗体)以至少5％(例如、至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、八成、85％、90％、95％、98％、99％，或者更多)的重量/重量浓度存在于所述装置中。
例如，对主体以0.5-5毫克/千克(例如，3毫克/千克)体重的剂量给药(例如，系统性给药)一种抑制剂(例如，抗-细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体或者抗-程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体)，例如，对体重大约为87公斤的主体给药43毫克-435毫克每剂量(例如，平均260毫克每剂量)。在一些实施例中，所述抑制剂(例如，抗-细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体或者抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体)被给药(例如，系统性给药)4剂量，例如，0.5-5毫克/千克每剂量(例如，3毫克/千克每剂量)，在4次剂量之后总剂量达到大约1000毫克。在其他实施例中，所述抑制剂(例如，抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体或者抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体)以超过一个剂量(例如，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，或者更多剂量)被给药。在一些实施方案中，剂量之前的时间间隔至少是1天(例如，1天，2天，3天，4天，5天，6天，7天或以上，1周，2周，3周，4周，5周，6周，7周，8周，9周，10周，11周，或者12周以上，3月，4月，5月，6月，7月，8月，9月，10月，11月，或者12月以上，1年，2年，3年，4年，5年，6年，7年，8年，9年，10年，11年，12年，13年，14年，15年，16年，17年，18年，19年，或者20年以上)。
在一些实施方案中，以0.5-5毫克/千克(例如，3毫克/千克)体重的剂量对需要的主体给药易普利姆玛(Ipilimumab)。例如，易普利姆玛(Ipilimumab)每天给药、每隔一天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、或者每隔6天给药。例如，易普利姆玛(Ipilimumab)每1-6周被给药1次(例如，每3周给药1次)。例如，对主体给药易普利姆玛(Ipilimumab)总共12周或更长的时间。易普利姆玛(Ipilimumab)通过例如注射或者输液的途径被给药。对需要的主体给药易普利姆玛(Ipilimumab)，总共给药4剂量。例如，易普利姆玛(Ipilimumab)以3毫克/千克体重的剂量静脉内给药90分钟，每三周给药1次共给药4剂量。在一些实施方案中，易普利姆玛(Ipilimumab)与这里所描述的疫苗装置联合给药(例如，同时或者顺序给药)。
有时候，以1-20毫克/千克(例如，15毫克/千克)体重的剂量对需要的主体给药替西木单抗(Tremelimumab)。例如，替西木单抗(Tremelimumab)每天给药1次、每隔一天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、或者每隔6天或者每周给药一次。例如，替西木单抗(Tremelimumab)每10-100天(例如，90天)给药1次。
在有些情况下，以0.01-10毫克/千克(例如，0.1-10毫克/千克)体重(例如，0.01-1毫克/千克、0.5-8毫克/千克、1-10毫克/千克或者2-8毫克/千克)的剂量对需要的主体给药MDX-1106。例如，MDX-1106以10毫克/千克的剂量给药。MDX-1106被，例如，静脉内给药。有时候，MDX-1106每天给药1次、每隔一天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、或者每隔6天或者每周给药一次。在其它情况下，MDX-1106每2周、每3周或者每4周给药。例如，MDX-1106被给药的总时间至少是6个月(例如，6个月、1年、2年、3年以上)。
本发明还包括对需要的主体给药0.5毫克/千克、1毫克/千克、2毫克/千克、5毫克/千克或者10毫克/千克体重的MK3475。MK3475每天给药1次、每隔一天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、或者每隔6天或者每周给药一次。在另一个实施方案中，MK3475每隔一周、每个两周或者每个三周被给药一次。
有时候，以0.05-6毫克/千克(例如，0.2-6.0毫克/千克)体重的剂量对需要的主体给药CT-011。
在一些实施方案中，以0.01-10毫克/千克(例如，0.1-10毫克/千克)体重(例如，0.01毫克/千克、0.05毫克/千克、0.1毫克/千克、0.3毫克/千克、1毫克/千克、3毫克/千克或者10毫克/千克)的剂量对需要的主体给药MDX-1105。例如，MDX-1105每天给药1次、每隔一天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、或者每隔6天或者每周给药一次。在其它情况下中，MDX-1105每隔一周、每个两周或者每个三周被给药一次。在一种优选的实施方案中，MDX-1105每隔14天被给药一次，总共给药42天。
本发明还准备了以每次(例如，每次注射)0.01-30毫克(例如，0.050-30毫克，或者0.01、0.05、0.25、1.25、6.25或者30毫克)的剂量对需要的主体给药IMP321。例如，IMP321每两周给药1次(例如，总共至少6周，或者至少12周)。在其它情况下，IMP321每天给药1次、每隔一天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、或者每隔6天或者每周给药一次。有时候，IMP321以5毫克/千克的剂量给药。IMP321通过，例如皮下注射的途径被给药。
在一些实施方案中，这里所描述的抑制剂(们)与这里所描述的疫苗装置联合给药(例如，同时或者顺序)。例如，所述抑制剂被系统性传递而疫苗被局部传递。在一些实施方案中，所述抑制剂被包括在疫苗装置中或者疫苗装置上。例如，所述抑制剂和疫苗都被局部传递。
在其他实施例中，所述抑制剂在给药所述疫苗装置之前至少6小时(例如，至少6小时，至少12小时，至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天，至少1星期，至少2周，至少3周，至少4周，至少1个月，至少2个月，至少3个月，至少4个月，至少6个月，至少8个月，至少1年，至少2年，至少3年，至少4年，至少6年，至少8年，或者更久)被给药。在其他实施方案中，所述疫苗装置在给药所述抑制剂(们)之前至少6小时(例如，至少6小时，至少12小时，至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天，至少1星期，至少2周，至少3周，至少4周，至少1个月，至少2个月，至少3个月，至少4个月，至少6个月，至少8个月，至少1年，至少2年，至少3年，至少4年，至少6年，至少8年，或者更久)被给药。
例如，在给药(例如，移植)所述疫苗装置之前系统性给药抑制剂(例如，这里所描述的抗体)。有时候，所述抑制剂(例如，抗体)使肿瘤块消退(即退化)。例如，肿瘤块消退发生在给药疫苗装置之前、期间和/或之后。
如这里所使用的，术语“大约”是加或者减1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，12％，或者15％。
本发明将在下面实施例中进行进一步的描述，而下面实施例并不限定权利要求书中所描述的本发明的范围。
实施例
实施例1：用抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)和抗程序性细胞死亡蛋 白质1(PD1)抗体治疗患有肿瘤的小鼠
使用小鼠黑素瘤模型来确定阻断抗体(抗-细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)或者抗-程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体)在肿瘤生长和存活方面的作用。为了建立黑素瘤肿瘤，对小鼠灌输5x105的B16-F10黑素瘤细胞并允许其生长9天。
对患有建立的黑素瘤肿瘤的小鼠腹膜内注射抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)或者抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体。每三天进行一次抗体治疗并在第三天开始挑战肿瘤。
比较未被治疗的小鼠和抗体治疗的小鼠之间的肿瘤发育和存活。与未被治疗的小鼠相比，用抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体或抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体治疗的小鼠具有较小肿瘤尺寸(图1A)和比较久的存活时间(图1B)。
抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体(9D9，编目#_BE0086)和抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体(RMP1-14，编目#_BE0146**)购自Bioxcell公司。
实施例2：治疗剂聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与阻断抗体共同诱导的肿瘤保 护和T细胞活性
使用黑素瘤小鼠模型确定聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗和抗-程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗-细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体的联合治疗作用。为了建立黑素瘤肿瘤，对小鼠灌输5x105的B16-F10黑素瘤细胞并允许其生长9天。
患有黑素瘤肿瘤的老鼠或者是未被治疗的、或者是用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗单独治疗的、或者是用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗和抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体联合治疗的。在肿瘤攻击(用B16-F10细胞，如上所述)后第三天开始进行抗体治疗并在肿瘤攻击24小时后每3天进行一次静脉内注射。聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗接种在肿瘤攻击之后第9天进行。确定每个治疗组的肿瘤尺寸(面积单位为平方毫米)和存活率。肿瘤面积是肿瘤两个最长直径的产物。可以使用标准方法测量肿瘤直径(例如，用测径规)。与未被治疗的小鼠相比，单独用疫苗治疗的小鼠存活的较久并且具有更小的肿瘤面积(图2A-B)。令人意外的是，与单独用疫苗治疗的小鼠相比，用疫苗与抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体联合治疗的小鼠存活的更久并且具有更小的肿瘤面积(图2A-B)。
实施例3：工程设计的疫苗与阻断抗体的结合增加肿瘤内效应因子T细胞活性
在每个治疗组(即，未被治疗组、只用疫苗治疗的组、疫苗+抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体治疗的组，或者疫苗+抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体治疗的组)中确定来自小鼠中分离的B16(一种黑素瘤细胞)肿瘤中CD3+CD8+肿瘤过滤T细胞的总数。CD3也叫做T细胞共受体，是T细胞标记物，其在所有成熟T细胞表面上表达并且是T细胞活化作用所必须的。CD8是细胞毒性T细胞(CTLs)标记物。过滤肿瘤的CD3+CD8+T细胞数目的增加表明增加的针对肿瘤的免疫反应。
同样，确定每个治疗组中，来自小鼠B16肿瘤中的CD3+CD8+T细胞与CD3+FoxP3+T调节(Treg)细胞的比例。FoxP3是Treg细胞标记物，能够调节(例如，抑制)免疫反应。因此，该比例提供了细胞毒素T-淋巴细胞(CTL)对Treg反应强度的测量法。所得比例越高说明针对肿瘤的免疫反应越强。
在肿瘤攻击(用5x105个B16-F10细胞)后第三天开始进行抗体静脉给药治疗并在肿瘤攻击后第9天进行疫苗接种。在第20天提取B16肿瘤，确定具有肿瘤过滤功能的T细胞种类。与未被治疗的小鼠相比，在疫苗治疗的小鼠体内能够过滤肿瘤的CD3+CD8+T细胞的数目显著增加(图3A)。同样，与未被治疗的小鼠相比，在疫苗治疗的小鼠体内CD3+CD8+T细胞与CD3+FoxP3+Treg细胞的比例目显著增加(图3B)。令人吃惊地是，与只用疫苗治疗的小鼠相比，在用疫苗+抗体联合治疗的小鼠体内能够过滤肿瘤的CD3+CD8+T细胞的数目明显更多(图3A)。同样，与只用疫苗治疗的小鼠相比，在用疫苗+抗体联合治疗的小鼠体内CD3+CD8+T细胞与CD3+FoxP3+Treg cells的比例显著增加(图3B)。
综上所述，这些结果说明聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体联合给药能够协同的降低肿瘤尺寸、延长存活时间并在从肿瘤中分离出的T细胞群中，相对于Treg细胞活性协同增加效应性T细胞活性。
另外，在对小鼠移植后14天，使用流式细胞仪比较各个治疗组(即，空白基质、只使用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗、或者疫苗与抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体结合)之间脚手架过滤的白血球，具体的说，CTL百分比。在疫苗接种后在第0、3、6、9和12天进行抗体治疗。在第14天制备来自脚手架的单细胞悬浮液并对活化的、细胞毒性T细胞标记物、CD8和CD107a染色。对两种标记物都是阳性的脚手架中，结合治疗的细胞的百分比大于只用疫苗治疗的小鼠中的百分比(图5A)。
同样，在对小鼠移植后14天后，比较空白基质、只使用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗、或者疫苗与抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体结合治疗组之间，对IFNγ和CD107a均成阳性的CD8+、脚手架-过滤T细胞的成倍增加(相对于空白参照)。在疫苗接种后在第0、3、6、9和12天进行抗体治疗。在肿瘤攻击7天后植入疫苗。CD107a是一种适合于CTL和IFNγ的标记物，是一种针对肿瘤、病毒和细菌感染的免疫反应所涉及的细胞因子。与只用疫苗治疗的小鼠相比，用疫苗+抗体联合治疗的小鼠体内脚手架中，对IFNγ和CD107a均成阳性的活化的CD8+T细胞的成倍增加更为明显(图5B)。
因此，所述疫苗与所述阻断抗体协同工作增加局部效应性T细胞活性，即增加移植的疫苗位点或者疫苗内效应性T细胞活性。疫苗+阻断抗体的联合也能协同的增加活化CD8+T细胞(例如、CTL)对肿瘤的过滤能力，并增加肿瘤位点处的T细胞活性。
实施例4：工程设计聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与阻断抗体的结合增加局部 效应性T细胞活性
确定聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与阻断抗体的结合对局部(即，在疫苗脚手架移植位点)效应性T细胞活性的作用。用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗单独治疗小鼠或者用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体共同治疗小鼠14天。一小群小鼠被抗体和疫苗治疗但是并不受到肿瘤攻击，从而分析疫苗位点处的作用。用500,000个B16肿瘤细胞攻击另一小组小鼠。在肿瘤攻击7天后给药疫苗。在疫苗接种后在第0、3、6、9和12天进行抗体治疗。
检测肿瘤位点的作用，具体的说，细胞毒性T细胞的数目、干扰素γ表达、CD107a表达和Treg细胞数目。使用流式细胞计确定从两个治疗组中分离的、渗透进入植入的疫苗脚手架的CD3+T细胞的数目。与只用疫苗治疗的小鼠相比，联合治疗(疫苗+抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体)的小鼠在脚手架中具有更多的T细胞滤出物(图4A)。
在小鼠体内植入不含疫苗的空白基质、只使用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗、或者疫苗与抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)或者抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体的结合物14天之后，确定小鼠体内CD3+CD8+效应性T细胞的总数。在疫苗接种后在第0、3、6、9和12天进行抗体治疗。出乎意料的，与单独使用疫苗相比，上述结合治疗导致渗透进入脚手架的CD3+CD8+效应性T细胞数目显著增加(图4B)。
实施例5：工程设计的聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与CTLA-4结合维持局部T细 胞活性
在将疫苗植入小鼠体内14天后确定渗入聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗的T细胞数量。从只用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗治疗的小鼠(Vax)体内和用疫苗与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体(Vax+CTLA4)或者与抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体(Vax+PD1)联合治疗的小鼠体内分离聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)植入物,使用流式细胞计确定从所述植入物中分离的T细胞滤出物表型(即，CD4+CD8+对CD4+FoxP3+)。与单独使用VAX的小鼠相比，在VAX+CTLA4和VAX+PD1小鼠中，表达CD8的CD4+T细胞的比例更高。在VAX+CTLA小鼠中大部分CD4+T细胞具有低FoxP3表达水平(图6A)。从只用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗治疗的小鼠(Vax)体内和用疫苗与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体(Vax+CTLA4)或者与抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体(Vax+PD1)联合治疗30天的小鼠体内分离聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)植入物,确定从所述植入物中分离的细胞中CD4+CD8+效应因子T细胞对CD4+FoxP3+T细胞的比例。在VAX+CTLA4小鼠体内的CD3+CD8+效应因子T细胞与CD4+FoxP3+T细胞的比例明显高于VAX小鼠或者VAX+PD1小鼠(图6B)。因此，聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体的结合维持局部T细胞活性，并且相对于抑制Treg活性，所述结合使T细胞反应向细胞毒性T细胞活性方向倾斜。这些活性和反应维持延长的时间，例如，至少30天。
实施例6：在疫苗引流淋巴结中效应因子T细胞活性大于调节性T细胞活性
用疫苗单独治疗小鼠或者用疫苗与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体或者抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体共同治疗小鼠。在疫苗接种后在第0、3、6、9和12天进行抗体治疗。然后在第14天提取疫苗引流淋巴结并测量T细胞渗入程度。使用流式细胞仪定量测定CD8+T细胞和FoxP3+Treg细胞在所述疫苗引流淋巴结中的百分比。还确定CD3+CD8+T细胞与CD3+FoxP3+Treg细胞的比例。
根据流式细胞计的测量结果，在用疫苗+抗体联合治疗的小鼠的淋巴结中的CD8+效应性T细胞百分比大于单独使用疫苗治疗的小鼠体内的百分比(图7A和图8A)。同样，在也疫苗+抗体联合治疗的小鼠的淋巴结中的FoxP3+Treg细胞百分比小于单独使也疫苗治疗的小鼠体内的百分比(图7A和图8A)。与单独使用疫苗治疗的小鼠或者使用疫苗+抗-程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体联合治疗的小鼠相比，使用疫苗+抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体联合治疗的小鼠体内淋巴结中CD3+CD8+T细胞与CD3+FoxP3+Treg细胞的比例明显更大。
因此，疫苗与阻断抗体协同作用，尤其是与抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抗体协同作用增加效应性T细胞的比例并减少疫苗引流淋巴结中的Treg细胞比例。
实施例7：抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体和抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的 抗原4(CTLA4)抗体与聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗结合使用增加黑素瘤模型中的T细胞 活化作用和肿瘤抑制
这里所描述的的数据与结构性疫苗和检验点抗体有关。与任意单独抗体疫苗接种相比，检验点阻断抑制剂(α-PD-1和α-细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4))与聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗联合使用对肿瘤生长有非常重要的作用(图9A)。抗体治疗被静脉给药，如疫苗实验所述，直到第35天进行肿瘤切除，进行T细胞渗入分析。疫苗接种在肿瘤攻击之后第9天引发。在肿瘤攻击第35天之后，用聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗与或者α-PD-1或者α-CTLA4抗体结合治疗的小鼠对肿瘤进展的抑制能力与只接种疫苗的相比大大约2.2-2.6倍(图9A)。在第35天，抗体和疫苗的结合使B16肿瘤生长降低5倍(图9A)。肿瘤生长的抑制作用与渗入肿瘤中的T细胞数量有关。所有三种治疗方法(α-PD-1、α-CTLA4和PLG疫苗)的结合相对于其他治疗方法，能够增加肿瘤内C8(+)T细胞的数量、FoxP3(+)Tregs和CD8T细胞/Treg比例(图9B-图9D)。这些数据说明将疫苗和阻断剂相结合进行治疗产生的肿瘤抑制作用可能是由于增加的T细胞活化和阻断免疫抑制相反的细胞毒性产生的，根据别处的报道，所述免疫抑制作用是由Tregs调节的。
实施例8：抗程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抗体和抗细胞毒性T-淋巴细胞-相关的 抗原4(CTLA4)抗体与聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗相结合增加细胞毒性T细胞反应
如下面描写的细节，相对于抑制性的Tregs，将阻断抗体与聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗相结合可以显著的使肿瘤过滤白血球(TIL)反应向活化的细胞毒性T细胞倾斜(图10A-图10E和图11)。这与发现的肿瘤退化现象相一致，肿瘤内更高的CD8/Treg比例代表有效的疫苗接种(Curran et al.,2010PNAS U.S.A.,107,4275–4280).对于图10A-10E，抗体治疗被静脉给药，如疫苗实验所述，直到第18天进行肿瘤切除，进行T细胞渗入分析。疫苗接种在肿瘤攻击之后第9天引发。所有细胞染色在从肿瘤中提取的总细胞悬浮液中进行。同样，对于图11，抗体治疗被静脉给药，如疫苗实验所述(每3天)，直到第30天进行肿瘤切除，进行T细胞渗入分析。疫苗接种在肿瘤攻击之后第9天引发。
在肿瘤入侵9天后进行聚-丙交酯-共-乙交酯(PLG)疫苗接种，该疫苗诱导显著水平的CD3(+)CD8(+)T细胞渗入20天大的B16肿瘤，使每平方毫米肿瘤具有大约3,500个细胞毒性T细胞(图10A)。在疫苗接种后加入抗PD-1治疗不会对肿瘤过滤CD(+)CD8(+)T细胞的总数有显著作用，而加入抗-CTLA-4治疗会产生细胞毒性T细胞水平为每平方毫米肿瘤超过17,000个CD(+)CD8(+)T细胞(图11)。相反，这些治疗组对肿瘤固有的CD4(+)FoxP3(+)Tregs的数目无影响(图10B)。在第18天，用PD-1抗体给药的情况下，肿瘤内CD8(+)效应因子与Tregs的比例几乎是只接种疫苗的2倍(图10C)。令人吃惊的是，在第18天，与单独接种疫苗相比，抗-CTLA-4与疫苗的结合会导致Teff/Treg比例增加9倍(25.3比2.8；图10C)。在肿瘤入侵后30天进行相同的分析，只有与抗-CTLA-4结合的免疫能够产生显著的CD8/Treg比例(大约6-倍增加；图11)，与长期存活率数据一致。另外，如通过CD107a和干扰素γ(IFN-γ)共表达所确定的，用PD-1或者CTLA-4抗体治疗作为疫苗接种的补充会导致肿瘤内细胞毒性T细胞活化作用增加3-倍和8-倍(图10D和图10E)。检验点阻断剂的加入不但增加了活化的CD8(+)TIL的密度，还增加了活化的总CD8(+)T细胞的百分比(图10D和图11E)，这说明这些治疗能够促进肿瘤内局部T细胞毒性。
所有的肿瘤在接种疫苗前都要用抗体阻断剂进行预处理，这是由于该序列可能反应临床设置，在临床设置中，根据护理标准，这些抗体首先用于治疗肿瘤。然而，如果抗体给药在疫苗接种之后被停止，则对肿瘤的抑制作用就消失了(图12)，说明阻断剂治疗显著的增加疫苗接种诱导后的T细胞反应。在图12中，在第0、3、6、和9天进行四种抗体治疗。在肿瘤入侵后第9天对小鼠接种疫苗并在肿瘤入侵第26天后测量肿瘤尺寸，记录在案。
其他实施方案
尽管本发明已经结合具体实施方式进行了描述，但之前的描述只起到解释作用并不能限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书定义。其他的方面、优势和修饰也被包括在所附权利要求书记载的范围内。
这里所涉及的所有专利和科技文献构成了本领域普通技术人员能够获得的知识。这里引用的所有美国专利和公开的或者未公开的美国专利申请通过引证在此并入本文。这里引用的所有公开的外国专利和专利申请在此通过引证全部并入本文。GENBANK和NCBI指明的登记号码也通过引证在此并入本文。这里引用的其他出版的参考文献、文件、原稿和科学文献通过引证在此并入本文。
尽管本发明已经参照其优选的实施方案进行了具体的显示和表述，但是本领域普通技术人员应该理解，在不脱离本发明范围的情况下，在形式和细节上可以存在各种各样的变化，本发明的范围由所附的权利要求书概括。

Claims (78)

1.一种装置，包括：
a)免疫-抑制性蛋白质的抑制剂；
b)脚手架组合物；
c)募集细胞的组合物；和
d)生物活性组合物，其中所述生物活性组合物被整合入所述脚手架组合物或者包覆在所述脚手架组合物上，并且其中，所述生物活性组合物使装置中的细胞或者募集到装置中的细胞发生修饰作用。
2.根据权利要求1所述的装置，其中，所述免疫-抑制性蛋白质选自由以下所组成的组中：细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)、程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)、程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)、淋巴细胞活化基因3(LAG3)、B7-H3、B7-H4和T细胞膜蛋白质3(TIM3)。
3.根据权利要求2所述的装置，其中免疫-抑制性蛋白质是细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)。
4.根据权利要求2所述的装置，其中，所述免疫-抑制性蛋白质是PD1。
5.根据权利要求1所述的装置，其中，包括细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抑制剂和程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)抑制剂。
6.根据权利要求1所述的装置，其中，所述抑制剂包括蛋白质、肽、或者核酸。
7.根据权利要求2所述的装置，其中，所述抑制剂包括一种抗体或其片段。
8.根据权利要求7所述的装置，其中，所述抗体或者其片段结合细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)。
9.根据权利要求8所述的装置，其中，所述抗体或其片段包括易普利姆玛(Ipilimumab)、替西木单抗(Tremelimumab)或其片段。
10.根据权利要求2所述的装置，其中，所述抑制剂结合程序性细胞死亡蛋白质1(PD1)，并且所述抑制剂是一种蛋白质。
11.根据权利要求10所述的装置，其中，所述抑制剂是MDX-1106、MK3475、CT-011、AMP-224或其片段。
12.根据权利要求10所述的装置，其中，所述抑制剂是PDL2-免疫球蛋白(Ig)融合的蛋白质。
13.根据权利要求2所述的装置，其中，所述抑制剂是一种蛋白质，并且所述抑制剂结合程序性细胞死亡蛋白质1配位体(PDL1)。
14.根据权利要求13所述的装置，其中，所述抑制剂是MDX-1105。
15.根据权利要求2所述的装置，其中，所述抑制剂是蛋白质，并且所述抑制剂结合淋巴细胞活化基因3(LAG3)。
16.根据权利要求15所述的装置，其中，所述抑制剂是LAG3-Ig融合蛋白质。
17.根据权利要求16所述的装置，其中，所述LAG3-Ig融合蛋白质是IMP321。
18.根据权利要求2所述的装置，其中，所述抑制剂是一种蛋白质，并且其中，所述抑制剂结合B7-H3。
19.根据权利要求18所述的装置，其中，所述抑制剂是MGA271。
20.根据权利要求1所述的装置，其中，所述细胞募集组合物募集免疫细胞。
21.根据权利要求20所述的装置，其中，所述免疫细胞包括一种抗原呈递细胞。
22.根据权利要求21所述的装置，其中，所述抗原呈递细胞包括树突状细胞。
23.根据权利要求20所述的装置，其中，所述免疫细胞包括巨噬细胞、T细胞、B细胞、天然致死(NK)细胞或者树突状细胞。
24.根据权利要求1所述的装置，其中，所述脚手架包括开放的相互贯通的大孔。
25.根据权利要求1所述的装置，进一步包括一种调配信号，所述调配信号能够诱导或者促进细胞迁移。
26.根据权利要求24所述的装置，其中，所述调配信号包括一种蛋白质、肽或者核酸。
27.根据权利要求25所述的装置，其中，所述调配信号包括：
i)一种或者一种以上能够诱导细胞迁移并具有梯度或者能够形成梯度的因子
ii)一种编码能够诱导细胞从所述装置中迁移出来的蛋白质的核酸；或者
iii)募集细胞的组合物的耗尽或者扩散。
28.根据权利要求1所述的装置，其中，所述募集细胞的组合物包括一种细胞因子、趋化因子，或者生长因子。
29.根据权利要求1所述的装置，其中，所述募集细胞的组合物包括粒性白细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、Flt3L，或者CCL20。
30.根据权利要求1所述的装置，其中，所述生物活性组合物包括一种目标抗原组合物。
31.根据权利要求1所述的装置，其中，所述募集细胞的组合物将免疫细胞募集到所述装置，在装置中，所述免疫细胞遭遇目标抗原，并且在这里，所述免疫细胞存留，直到调配信号诱导所述免疫细胞流出到装置外的淋巴结组织。
32.根据权利要求31所述的装置，其中，流出的免疫细胞免疫活化作用水平大于进入所述装置之前的水平。
33.根据权利要求31所述的装置，其中，所述免疫细胞是抗原-激发的，与进入装置之前的激发水平相比。
34.根据权利要求30所述的装置，其中，所述目标抗原组合物包括癌症抗原或者癌症衍生的抗原。
35.根据权利要求1所述的装置，其中，所述癌症细胞来源于黑素瘤、中枢神经系统(CNS)癌症、中枢神经系统(CNS)生殖细胞肿瘤、肺癌、白血病、多发性骨髓瘤、肾癌、恶性的神经胶质瘤、髓母细胞瘤(Medulloblatoma)、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、纤维肉瘤、胰腺癌、胃癌、头和颈部癌症，或者结肠直肠癌。
36.根据权利要求34所述的装置，其中，癌症衍生的抗原选自由以下所组成的组中：MAGE系列抗原(例如MAGE-1)、MART-1/梅拉纳、酪氨酸酶、神经节苷脂、gp100、GD-2、O-乙酰化GD-3、GM-2、MUC-1、Sos1、蛋白激酶C-结合蛋白、反转录酶蛋白质、AKAP蛋白质、VRK1、KIAA1735、T7-1、T11-3、T11-9、现代人端粒酶发酵产物(hTRT)、细胞角蛋白-19(CYFRA21-1)、鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)、(蛋白质T4-A)、鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)、卵巢癌抗原CA125(1A1-3B)(KIAA0049)、粘蛋白1(肿瘤相关的粘蛋白)、癌-相关的粘蛋白)、(多形态上皮细胞粘蛋白)、(PEM)、(PEMT)、(EPISIALIN)、(肿瘤相关的上皮细胞膜抗原)、(EMA)、(H23AG)、(花生反应性的尿粘蛋白)、(PUM)、(乳腺癌相关的抗原DF3)、CTCL肿瘤抗原se1-1、CTCL肿瘤抗原se14-3、CTCL肿瘤抗原se20-4、CTCL肿瘤抗原se20-9、CTCL肿瘤抗原se33-1、CTCL肿瘤抗原se37-2、CTCL肿瘤抗原se57-1、CTCL肿瘤抗原se89-1、前列腺特异性膜抗原、5T4癌坯滋养层糖蛋白、Orf73皮肤多发性出血性肉瘤相关的疱疹病毒、MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1抗原(MAGE-XP抗原)(DAM10)、MAGE-B2抗原(DAM6)、MAGE-2抗原、MAGE-4a抗原、MAGE-4b抗原、结肠癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12变体A、癌症相关的表面抗原、腺癌抗原ART1、伴生肿瘤相关的脑-睾丸-癌症抗原(旁瘤抗原MA2；伴生肿瘤神经元抗原)、神经肿瘤腹部抗原2(NOVA2)、肝细胞癌抗原基因520、肿瘤相关的抗原CO-029、肿瘤相关的抗原MAGE-X2、滑膜肉瘤、X断点2、T细胞识别的鳞状细胞癌抗原、血清学检测的结肠癌抗原1、血清学检测的乳癌抗原NY-BR-15、血清学检测的乳癌抗原NY-BR-16、嗜铬粒蛋白A；甲状旁腺分泌的蛋白质1、DUPAN-2、CA19-9、CA72-4、CA195、癌胚抗原(CEA)。
37.根据权利要求1所述的装置，其中，所述生物活性组合物包括肿瘤溶解产物。
38.根据权利要求1所述的装置，其中，所述生物活性组合物包括照射的肿瘤细胞。
39.根据权利要求1所述的装置，其中，所述生物活性组合物包括一种癌细胞表面抗原
40.根据权利要求1所述的装置，其中，所述生物活性组合物包括一种病毒或者细菌抗原。
41.根据权利要求1所述的装置，其中，所述装置进一步包括辅料。
42.根据权利要求41所述的装置，其中，所述辅料包括富集CpG的低聚核苷酸。
43.根据权利要求42所述的装置，其中，所述辅料包括浓缩的CpG低聚核苷酸。
44.根据权利要求42所述的装置，其中，所述辅料包括聚(氮丙啶)(PEI)-CpG
45.根据权利要求1所述的装置，其中，所述脚手架进一步包括RGD-修饰的藻酸盐。
46.根据权利要求1所述的装置，其中，所述装置进一步包括一种Toll样受体(TLR)激动剂。
47.根据权利要求46所述的装置，其中，所述Toll样受体(TLR)激动剂优选结合TLR3。
48.根据权利要求46所述的装置，其中，所述Toll样受体(TLR)激动剂包括一种TLR3激动剂。
49.根据权利要求48所述的装置，其中，所述TLR3激动剂包括聚肌苷-聚胞苷酸(聚(I:C))或者聚(氮丙啶)(PEI)-聚(I:C)。
50.根据权利要求1所述的装置，其中，所述脚手架包括一种水凝胶或者多孔聚合物，所述脚手架包括一种聚合物或者聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)，藻酸盐，明胶，胶原蛋白，琼脂糖，聚(赖氨酸)，聚羟基丁酯，聚ε己内酯，聚膦嗪，聚(乙烯醇)，聚(氧化烯)，聚(环氧乙烷)，聚(烯丙胺)，聚(丙烯酸酯)，聚(4-氨基甲基苯乙烯)，普卢兰尼克多元醇，泊洛沙姆(polyoxamer)，聚(糖醛酸)，聚(酸酐)或者聚(乙烯基吡硌烷酮)的共聚物。
51.根据权利要求1所述的装置，其中，所述多孔聚合物是通过气体-泡沫产生的。
52.根据权利要求1所述的装置，其中，所述装置以小珠、丸状、片状或者圆盘状的形式存在。
53.一种杀死所需要的主体中癌细胞的方法，包括给药权利要求1所述的装置。
54.一种杀死所需要的主体中癌细胞的方法，包括施用：
a)免疫-抑制性蛋白质的抑制剂；和
b)装置，包括
i)脚手架组合物，
ii)募集细胞的组合物，和
iii)一种生物活性组合物，其中，所述生物活性组合物被整合入所述脚手架组合物中或者包覆在脚手架组合物上，并且，其中，所述生物活性组合物造成装置中的细胞或者募集到装置中的细胞的修饰作用。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，所述脚手架包括开放的相互连接的大孔，并且，其中，通过开放的、相互联系的大孔并且通过调配信号可以促进被修饰的细胞向身体内另一个位点的迁移。
56.根据权利要求55所述的方法，其中，身体内的另一个位点是组织目标附近或者较远的地方。
57.根据权利要求54所述的方法，其中，所述抑制剂存在于所述装置中或者在装置上
58.根据权利要求55所述的方法，其中，所述抑制剂包覆于所述脚手架组合物中或者在脚手架组合物上。
59.根据权利要求54所述的方法，其中，所述抑制剂不存在于装置中或者装置上。
60.根据权利要求59所述的方法，其中，所述抑制剂不包覆所述脚手架组合物或者不在所述脚手架组合物上。
61.根据权利要求54所述的方法，其中，所述抑制剂和所述装置被共同配制。
62.根据权利要求54所述的方法，其中，所述抑制剂和所述装置被分别配制。
63.根据权利要求62所述的方法，其中，所述抑制剂和所述装置被同时施用给主体。
64.根据权利要求62所述的方法，其中，所述抑制剂和所述装置被顺序施用给主体。
65.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述装置被皮下植入主体中。
66.根据权利要求54所述的方法，其中，所述抑制剂被静脉给药、腹腔内给药、皮下给药、口服给药、皮内给药、吸入给药、肌肉内给药或者直肠给药。
67.根据权利要求54所述的方法，其中，所述抑制剂被注射给药、输液或者吸入。
68.根据权利要求54所述的方法，其中，所述抑制剂以0.01-10毫克/千克体重的剂量被施用。
69.根据权利要求54所述的方法，其中，所述抑制剂以0.01-30毫克/千克每剂量的量被施用。.
70.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述主体包括癌细胞，其中，所述癌细胞具有较差的免疫原性。
71.根据权利要求70所述的方法，其中，所述癌细胞抵抗细胞毒素T-淋巴细胞(CTL)调解的溶解。
72.根据权利要求70所述的方法，其中，所述癌细胞抵抗天然致死(NK)细胞调节的致死作用。
73.根据权利要求53或54所述的方法，其中，所述主体不包括自身抗体。
74.根据权利要求54所述的方法，其中，所述免疫-抑制性蛋白质抑制剂包括细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抑制剂和程序性细胞死亡蛋白质1(PD-1)抑制剂。
75.根据权利要求74所述的方法，其中，所述细胞毒性T-淋巴细胞-相关的抗原4(CTLA4)抑制剂包括抗CTLA-4抗体，并且程序性细胞死亡蛋白质1(PD-1)抑制剂包括抗PD-1抗体。
76.根据权利要求54所述的方法，其中，所述脚手架包括一种水凝胶或者多孔聚合物，所述脚手架包括一种聚合物或者聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)的共聚物。
77.根据权利要求54所述的方法，其中，细胞毒性T细胞相对于免疫抑制性Treg细胞被提高。
78.根据权利要求54所述的方法，其中，所述免疫-抑制性蛋白质的抑制剂在给药所述装置之前和之后被给药。
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