CN112469477A - 与成纤维细胞活化蛋白结合的异源二聚体抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合的新型抗原结合结构域和异源二聚体抗体。

Description

与成纤维细胞活化蛋白结合的异源二聚体抗体
优先权要求
本申请要求于2018年4月4日提交的美国临时申请第62/652,835号的权益，所述美国临时申请通过引用整体，特别是参考其中的附图、图例和权利要求明确并入本文。
背景技术
基于抗体的治疗剂已经成功地用于治疗各种疾病，包含癌症。正在探索的日益普遍的途径是共接合两种不同抗原的单一免疫球蛋白分子的工程化。接合两种不同抗原的此类替代性抗体形式通常称为双特异性抗体。因为抗体可变区(Fv)的相当大的多样性使得可以产生识别几乎任何分子的Fv，所以产生双特异性抗体的典型方法是将新的可变区引入到抗体中。
双特异性抗体的特别有用的方法是使接合CD3的第一结合结构域和接合与癌细胞相关或在癌细胞上上调的抗原的第二结合结构域工程化，使得双特异性抗体重定向CD3+T细胞以破坏癌细胞。然而，肿瘤细胞可以脱落这些抗原作为癌症免疫编辑的一部分(Hochst和Diehl,2012)，从而有助于所述肿瘤细胞的免疫逃逸并降低靶向癌症相关抗原的此类治疗的功效。因此，另一种方法是在已知支持肿瘤细胞存活的肿瘤环境中靶向其它细胞。
成纤维细胞代表肿瘤环境中的大多数基质细胞。已经报道了这些癌症相关成纤维细胞(CAF)例如通过提供用于血管生成的生长因子并且通过促进免疫抑制环境来促进肿瘤存活和增殖(Orimo和Weinberg,《细胞周期(Cell Cycle)》5(15):1597-1601(2006)；Xing等人,《生物科学前沿(Front Biosci.)》15:166-170(2011))，并且已经与不良预后相关(Underwood等人,《病理学杂志(J.Path)》235:466-477(2015))。
成纤维细胞活化蛋白(FAP)是一种参与胞外基质重塑的丝氨酸蛋白酶(Kelly等人,2012)。如本文所示，发现FAP与正常组织相比在CAF中通常升高，因此使FAP成为用于癌症疗法的合适靶标。
本文提供了新型FAP结合结构域和包含此类结合结构域的抗体(例如，FAP x CD3双特异性抗体)。此类FAP结合结构域和相关的抗体可用于例如治疗FAP相关癌症。
发明内容
本文提供了新型FAP结合结构域以及包含此类FAP结合结构域的抗体(例如，异源二聚体双特异性抗体)。包含此类FAP结合结构域的本发明抗体有利地引发一系列不同的免疫应答，这取决于所使用的特定FAP结合结构域。例如，本发明抗体在对具有不同FAP表达的细胞的选择性、对于FAP表达性细胞的效力、引发细胞因子释放的能力以及对可溶性FAP的敏感性方面表现出差异。此类FAP结合结构域和相关的抗体可用于例如治疗FAP相关癌症。
在第一方面，本文提供了包含成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合结构域的组合物。在一个实施例中，FAP结合结构域包含以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的可变重互补决定区1-3(vhCDR1-3)和可变轻互补决定区(vlCDR1-3)：[αFAP]_H0.26_L0；[αFAP]_H0.26_L0.11；[αFAP]_H0.26_L0.19、1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1。在一些实施例中，所述vhCDR1-3和所述vlCDR1-3选自图14和45中提供的vhCDR1-3序列和vlCDR1-3序列。
在示例性实施例中，所述成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合结构域包含以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0；[αFAP]_H0.26_L0.11；[αFAP]_H0.26_L0.19、1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1A1B5H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5H1_L1(图14)。在某些实施例中，所述成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合结构域选自以下FAP结合结构域：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1(图14和45)。
在另一方面，本文提供了包含成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合结构域的抗体。在一些实施例中，FAP结合结构域包含以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的可变重互补决定区1-3(vhCDR1-3)和可变轻互补决定区(vlCDR1-3)：[αFAP]_H0.26_L0；[αFAP]_H0.26_L0.11；[αFAP]_H0.26_L0.19、1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1。在某些实施例中，所述抗体包含选自图14和45中提供的vhCDR1-3和vlCDR1-3的vhCDR1-3和vlCDR1-3。
在一些实施例中，所述抗体包含以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0；[αFAP]_H0.26_L0.11；[αFAP]_H0.26_L0.19、1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1(图14和45)。在示例性实施例中，所述抗体包含选自以下成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合结构域的FAP结合结构域：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1(图14和45)。
在示例性实施例中，所述抗体是包含以下的抗体：a)第一单体，所述第一单体包含第一抗原结合结构域和第一恒定结构域；以及b)第二单体，所述第二单体包含第二抗原结合结构域和第二恒定结构域，其中所述第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域中的任一个抗原结合结构域是FAP结合结构域。
在某些实施例中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域与不同的抗原结合。在一些实施例中，所述第一抗原结合结构域是FAP结合结构域，并且所述第二抗原结合结构域是CD3结合结构域。在示例性实施例中，所述CD3结合结构域包含以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。在一些实施例中，vhCDR1-3和vlCDR1-3选自图12中的vhCDR1-3和vlCDR1-3。在一些实施例中，所述CD3结合结构域包括以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。
在本发明抗体的一些实施例中，所述CD3结合结构域是抗CD3 scFv。在某些实施例中，所述scFv包含带电scFv连接子。
在某些实施例中，所述第一恒定结构域和所述第二恒定结构域各自包括CH2-CH3。在一些实施例中，所述第一恒定结构域和所述第二恒定结构域各自包括CH1-铰链-CH2-CH3。
在某些实施例中，所述第一恒定结构域和所述第二恒定结构域各自是变体恒定结构域。在示例性实施例中，所述第一单体和所述第二单体包括选自由图3中所描绘的异源二聚化变体组成的组的一组异源二聚化变体。在一些实施例中，所述一组异源二聚化变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；S364K:L368D/K370S；S364K:L368E/K370S；D401K:T411E/K360E/Q362E；和T366W:T366S/L368A/Y407V。
在一些实施例中，所述第一单体和所述第二单体各自进一步包括烧蚀变体。在示例性实施例中，所述烧蚀变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
在一个实施例中，所述第一单体或所述第二单体中的至少一个单体进一步包含pI变体。在一些实施例中，所述pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
在另一方面，本文提供了具有“1+1Fab-scFv-Fc”形式的抗FAP x抗CD3抗体。在一些实施例中，所述抗体包含第一单体、第二单体和轻链。在某些实施例中，所述第一单体包含：i)抗CD3 scFv，所述抗CD3 scFv包含第一可变轻结构域、scFv连接子和第一可变重结构域；以及ii)第一Fc结构域，其中所述scFv使用结构域连接子与所述第一Fc结构域的N端共价连接。在一些实施例中，所述第二单体包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是第二可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域。在一些实施例中，所述轻链包含第二可变轻结构域，其中所述第二可变重结构域和所述第二可变轻结构域形成FAP结合结构域。在示例性实施例中，所述scFv连接子是带电scFv连接子。
在示例性实施例中，所述抗FAP x抗CD3“1+1Fab-scFv-Fc”抗体包含具有以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3的FAP结合结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1。在一些实施例中，所述vhCDR1-3和所述vlCDR1-3选自图14和45中提供的vhCDR1-3序列和vlCDR1-3序列。
在抗FAP x抗CD3“1+1Fab-scFv-Fc”抗体的示例性实施例中，所述第二重可变结构域包含重可变结构域，并且所述第二轻可变结构域包含以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1。
在一些实施例中，所述抗FAP x抗CD3“1+1Fab-scFv-Fc”抗体的抗CD3 scFv包含以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。在某些实施例中，vhCDR1-3和vlCDR1-3选自图12中的vhCDR1-3和vlCDR1-3。
在一些实施例中，所述抗FAP x抗CD3“1+1Fab-scFv-Fc”抗体的抗CD3 scFv包含以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。
在抗FAP x抗CD3“1+1Fab-scFv-Fc”抗体的某些实施例中，第一可变轻结构域使用结构域连接子与第一Fc结构域的N端共价连接。在一些实施例中，所述第一可变重结构域使用结构域连接子与所述第一Fc结构域的N端共价连接。
在抗FAP x抗CD3“1+1Fab-scFv-Fc”抗体的某些实施例中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域是变体Fc结构域。
在一个实施例中，所述第一单体和所述第二单体包含选自由图3中所描绘的异源二聚化变体组成的组的一组异源二聚化变体。在某些实施例中，所述一组异源二聚化变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；S364K:L368D/K370S；S364K:L368E/K370S；D401K:T411E/K360E/Q362E；和T366W:T366S/L368A/Y407V，其中所述编号是根据EU编号进行的。在示例性实施例中，所述异源二聚化变体组是S364K/E357Q:L368D/K370S。
在一个实施例中，所述第一单体和所述第二单体进一步包含烧蚀变体。在一些实施例中，所述烧蚀变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
在抗FAP x抗CD3“1+1Fab-scFv-Fc”抗体的某些实施例中，所述第一单体或所述第二单体之一包含pI变体。在一些实施例中，所述pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中所述编号是根据EU编号进行的。
在抗FAP x抗CD3“1+1Fab-scFv-Fc”抗体的一些实施例中，所述第一单体包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且所述第二单体包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中所述编号是根据EU编号进行的。在特定实施例中，所述scFv连接子是具有氨基酸序列(GKPGS)4的带电scFv连接子。在示例性实施例中，所述第一单体和所述第二单体各自进一步包括氨基酸变体428/434S。
在抗FAP x抗CD3“1+1Fab-scFv-Fc”抗体的示例性实施例中，所述抗体包含：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包含scFv-连接子-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFV并且CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL-CL。在此类实施例中，所述第一变体Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q；所述第二变体Fc结构域包含氨基酸变体L368D/K370S；所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；所述第二单体的铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，VH和VL形成包含分别选自以下的FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域的FAP结合结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1；所述抗CD3 scFv包含选自以下的CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47和H1.31_L1.47，并且其中编号是根据EU编号进行的。在一个实施例中，抗CD3 scFv包含H1.32_L1.47的可变重结构域和可变轻结构域。
在另一方面，本文提供了具有“2+1Fab2-scFv-Fc”形式的抗FAP x抗CD3异源二聚体抗体。在一些实施例中，所述抗体包含第一单体、第二单体和共同轻链。在一些实施例中，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重结构域，scFv是抗CD3 scFV，连接子1和连接子2分别是第一结构域连接子和第二结构域连接子，并且CH2-CH3是第一Fc结构域。在一些实施例中，所述第二单体包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重结构域并且CH2-CH3是第二Fc结构域。在某些实施例中，所述共同轻链包含可变轻结构域。在这种抗FAP x抗CD3异源二聚体抗体中，所述第一可变重结构域和所述可变轻结构域形成第一FAP结合结构域，并且所述第二可变重结构域和所述可变轻结构域形成第二FAP结合结构域。
在抗FAP x抗CD3“2+1Fab2-scFv-Fc”抗体的某些实施例中，所述第一FAP结合结构域和第二FAP结合结构域各自与FAP结合并且包含以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1。在一些实施例中，所述vhCDR1-3和所述vlCDR1-3选自图14和45中提供的vhCDR1-3和vlCDR1-3。在一个实施例中，所述第一可变重结构域和所述第二可变重结构域各自包含FAP结合结构域的可变重结构域，并且所述可变轻结构域包含所述FAP结合结构域的对应可变轻结构域，其中所述FAP结合结构域是以下FAP结合结构域中的任一个FAP结合结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1。
在所述抗FAP x抗CD3“2+1Fab2-scFv-Fc”抗体的某些实施例中，所述scFv包含以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。在一些实施例中，所述CD3结合结构域是H1.32_L1.47。在某些实施例中，vhCDR1-3和vlCDR1-3选自图12中的vhCDR1-3和vlCDR1-3。在一个实施例中，所述scFv包括以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。在一些实施例中，所述CD3结合结构域是H1.32_L1.47。
在抗FAP x抗CD3“2+1Fab2-scFv-Fc”抗体的某些实施例中，所述scFv包含scFv可变重结构域、scFv可变轻结构域以及连接所述scFv可变重结构域和所述scFv可变轻结构域的scFv连接子。在一些实施例中，所述scFv可变重结构域使用所述第一结构域连接子与所述第一单体的所述CH1的C端连接，并且所述scFv可变轻结构域使用所述第二结构域连接子与所述第一Fc结构域的N端共价连接。在一个实施例中，所述scFv可变轻结构域使用所述第一结构域连接子与所述第一单体的所述CH1的C端连接，并且所述scFv可变重结构域使用所述第二结构域连接子与所述第一Fc结构域的N端共价连接。在一些实施例中，所述scFv连接子是带电scFv连接子。
在抗FAP x抗CD3“2+1Fab2-scFv-Fc”抗体的某些实施例中，所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域是变体Fc结构域。在一些实施例中，所述第一单体和所述第二单体包含选自由图3中所描绘的异源二聚化变体组成的组的一组异源二聚化变体。在一个实施例中，所述一组异源二聚化变体选自以下的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；S364K:L368D/K370S；S364K:L368E/K370S；D401K:T411E/K360E/Q362E；和T366W:T366S/L368A/Y407V，其中所述编号是根据EU编号进行的。在示例性实施例中，所述异源二聚化变体组是S364K/E357Q:L368D/K370S。
在抗FAP x抗CD3“2+1Fab2-scFv-Fc”抗体的某些实施例中，所述第一单体和所述第二单体进一步包含烧蚀变体。在一些实施例中，所述烧蚀变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中所述编号是根据EU编号进行的。
在抗FAP x抗CD3“2+1Fab2-scFv-Fc”抗体的某些实施例中，所述第一单体或所述第二单体之一进一步包含pI变体。在示例性实施例中，所述pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在抗FAP x抗CD3“2+1Fab2-scFv-Fc”抗体的某些实施例中，所述第一单体包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且所述第二单体包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中所述编号是根据EU编号进行的。在特定实施例中，所述scFv连接子是具有氨基酸序列(GKPGS)4的带电scFv连接子。在示例性实施例中，所述第一单体和所述第二单体各自进一步包括氨基酸变体428/434S。
在抗FAP x抗CD3“2+1Fab2-scFv-Fc”抗体的示例性实施例中，所述抗体包含：a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包含VH-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFV，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包含VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；以及c)共同轻链，所述共同轻链包含VL-CL。在此类实施例中，所述第一变体Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q；所述第二变体Fc结构域包含氨基酸变体L368D/K370S；所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K；所述第二单体的铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，VH和VL形成包含分别选自以下的FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域的FAP结合结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1；所述抗CD3 scFv包含选自以下的CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47和H1.31_L1.47，并且其中编号是根据EU编号进行的。在特定实施例中，所述scFv包含是具有氨基酸序列(GKPGS)4的带电scFv连接子的scFv连接子。在示例性实施例中，所述第一单体和所述第二单体各自进一步包括氨基酸变体428/434S。在一个实施例中，抗CD3 scFv包含H1.32_L1.47的可变重结构域和可变轻结构域。
在抗FAP x抗CD3“2+1Fab2-scFv-Fc”抗体的示例性实施例中，所述抗体选自以下抗体：XENP25393、XENP29140、XENP28115、XENP29141、XENP28116、XENP29142、XENP25193、XENP25194、XENP25195、XENP25967、XENC1145、XENC1123、XENC1079和XENC1101。
在另一方面，本文提供了选自本文所述的以下异源二聚体抗体的异源二聚体抗体：XENP024704、XENP024707、XENP024708、XENP024710、XENP024712、XENP024713、XENP024715、XENP024802、XENP025384、XENP025965、XENP025185、XENP025186、XENP025187、XENP025188、XENP025189、XENP025191、XENP025192、XENP025193、XENP025194、XENP025195、XENP025196、XENP025966、XENP025967。
在另一方面，本文提供了一种核酸组合物，其包含对本文所述的抗体和结合结构域进行编码的核酸、包含所述核酸的表达载体、用所述表达载体转化的宿主细胞。本文还提供了通过在其中抗体得以表达的条件下培养本文所述的任何宿主细胞以及回收所述抗体来制备此类抗体的方法。
在另一方面，本文提供了一种通过向有需要的患者施用本文所述的任何本发明抗体来治疗癌症的方法。
附图说明
图1A到1K描绘了用于本文公开的抗CD3 x抗FAP双特异性抗体的若干种形式。第一种是“1+1Fab-scFv-Fc”形式(也称为“开瓶器(bottle opener)”或“三重F”形式)，其中第一抗原结合结构域是Fab结构域并且第二抗抗原结合结构域是scFv结构域(图1A)。另外，“mAb-Fv”、“mAb-scFv”、“2+1Fab2-scFv-Fc”(也称为“中心scFv”或“中心scFv”形式)、“中心Fv”、“单臂中心scFv”、“单scFv-mAb”、“scFv-mAb”、“双scFv”、“三叉”和非异源二聚体双特异性形式都有显示。图1中描绘的scFv结构域可以是N端到C端可变重-(任选的连接子)-可变轻，或可变轻-(任选的连接子)-可变重。另外，对于所述单臂scFv-mAb，scFv可以与重链单体的N端连接或与轻链的N端连接。在某些实施例中，图1中的“抗抗原1”是指FAP结合结构域。在某些实施例中，图1中的“抗抗原1”是指CD3结合结构域。在某些实施例中，图1中的“抗抗原2”是指FAP结合结构域。在某些实施例中，图1中的“抗抗原2”是指CD3结合结构域。在一些实施例中，图1中的“抗抗原1”是指FAP结合结构域并且图1中的“抗抗原2”是指CD3结合结构域。在一些实施例中，图1中的“抗抗原1”是CD3结合结构域并且图1中的“抗抗原2”是指FAP结合结构域。所公开的任何FAP结合结构域和CD3结合结构域可以包含在图1的双特异性形式中。
图2描绘了A)人，B)小鼠以及C)食蟹猴FAP的序列(预测的)。此类FAP用于开发具有交叉反应性的FAP抗原结合结构域，以便于临床开发。
图3A-3F描绘了有用对异源二聚化变体组(包含偏斜和pI变体)。在图3F中，存在并无对应“单体2”变体的变体。此类变体是可以单独用在双特异性抗体的任一单体上或例如包含在“1+1Fab-scFv-Fc”形式抗体的Fab侧上的pI变体，并且适当的带电scFv连接子可以用在将scFv用作第二抗原结合结构域的第二单体上。适合的带电连接子示出在图7A和B中。
图4描绘了电子等排变体抗体恒定区及其相应取代的列表。pI_(-)指示较低的pI变体，而pI_(+)指示较高的pI变体。这些变体可以任选地并且独立地与本文概述的其它变体，包含异源二聚化变体组合。
图5描绘了烧蚀FcγR结合的有用烧蚀变体(也称为“敲除”或“KO”变体)。在一些实施例中，此类烧蚀变体包含在本文描述的本发明抗体的两个单体的Fc结构域中。在其它实施例中，所述烧蚀变体仅包含在仅一个变体Fc结构域上。
图6示出了本文公开的异源二聚体抗体的两个特别有用的实施例，包含在本文公开的各种“1+1Fab-scFv-Fc”形式和“2+1Fab2-scFv-Fc”形式抗体的“scFv单体”和“Fab单体”中包含的各种氨基酸取代。例如，如本文实例2中所述，具有“2+1Fab2-scFv-Fc”形式的FAP x CD3双特异性抗体在表达低水平的FAP的细胞环境中在诱导重定向T细胞细胞毒性方面是有效的。
图7描绘了用于增大或减小利用一个或多个scFv作为组分的本发明异源二聚体抗体的pI的如本文所述的多个带电scFv连接子。本文中特别适用的(+H)阳性连接子，尤其与本文所示的抗CD3 vl和vh序列一起使用。根据Whitlow等人,《蛋白质工程(ProteinEngineering)》6(8):989-995(1993)，具有单个电荷的单个现有技术scFv连接子被称为“Whitlow”。应注意，这种连接子用于减少scFv的聚合和增强scFv的蛋白水解稳定性。此类带电scFv连接子可以用于本文公开的任何本发明抗体形式，所述本发明抗体形式包含一种或多种scFv(例如，“1+1Fab-scFv-Fc”形式和“2+1Fab2-scFv-Fc”形式)。
图8描绘了可以与本文所述的异源二聚体抗体一起使用的各种异源二聚体偏斜变体氨基酸取代。
图9A-9D描绘了基于人IgG1的若干有用的“1+1Fab-scFv-Fc”双特异性抗体形式重链主链的序列，没有Fv序列(例如，Fab侧的scFv和VH)。也就是说，在“Fab-Fc侧”的开始处的“/”斜线指示本文概述的VH的C端连接在所述点处。类似地，在“scFv-Fc侧”的开始处的“/”斜线指示本文概述的scFv的C端(例如，从N端到C端，VH-scFv连接子-VL或VL-scFv连接子-VH)连接在所述点处。
如本文公开的，“1+1Fab-scFv-Fc”双特异性抗体形式包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3；b)第二单体，所述第二单体包含scFv-连接子-CH2-CH3；以及c)轻链。在图9中，每个主链序列的“Fab-Fc侧”是指第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3，并且“scFv-Fc侧”序列是指第二单体的连接子-CH2-CH3。
主链1基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有S364K/E357Q偏斜变体的单体上的C220S、在具有L368D/K370S偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及在第一单体和第二单体两者上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。主链2基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K:L368D/K370S偏斜变体、在具有S364K偏斜变体的单体上的C220S、在具有L368D/K370S偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及在两个单体上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。主链3基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K:L368E/K370S偏斜变体、在具有S364K偏斜变体的单体上的C220S、在具有L368E/K370S偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及在第一单体和第二单体两者上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。主链4基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含D401K:K360E/Q362E/T411E偏斜变体、在具有D401K偏斜变体的单体上的C220S、具有K360E/Q362E/T411E偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及在第一单体和第二单体两者上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。主链5基于人IgG1(356D/358L同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有S364K/E357Q偏斜变体的单体上的C220S、在具有L368D/K370S偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及在两个链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。主链6基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有S364K/E357Q偏斜变体的链上的C220S、在具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和在两个链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体，以及在两个链上的N297A变体。骨架7与骨架6相同，除了N297A取代被N297S取代代替之外。主链8基于人IgG4，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有L368D/K370S偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及两个单体上的如本领域已知的那样烧蚀Fab臂交换的S228P(EU编号，Kabat中的S241P)变体。主链9基于人IgG2，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有L368D/K370S偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体。主链10基于人IgG2，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有L368D/K370S偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及在第一单体和第二单体两者上的S267K变体。主链11与主链1相同，除了其包含在两个单体上的M428L/N434S扩展突变之外。主链12基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有S364K/E357Q偏斜变体的单体上的C220S和P217R/P229R/N276K pI变体，以及在两个单体上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。
在某些实施例中，异源二聚体抗体包含具有“主链1”序列的第一单体和具有对应的“主链2”序列的第二单体，其中所述“主链1”和“主链2”序列与图9A-D中所列举的“主链1”和“主链2”序列中的任一个序列的同一性为90％、95％、98％和99％(如本文所定义的)。在一些实施例中，异源二聚体抗体的“主链1”和“主链2”序列与图9A-D中所列举的“主链1”和“主链2”序列中的任一个序列相比包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个另外的氨基酸取代，所述另外的氨基酸取代如本领域的技术人员将理解的与亲本人IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于特定主链序列)相比已经含有多个氨基酸修饰。也就是说，在一些实施例中，异源二聚体抗体包含主链序列，所述主链序列除了包含在图9A-D的主链内的偏斜变体、pI变体和烧蚀变体之外还包含另外的氨基酸修饰(例如，氨基酸取代)。
如本领域的技术人员将理解和下文所概述的，这些主链序列可以与本文概述的任何VH和VL对一起使用，包含例如本文所述的任何FAP结合结构域和CD3结合结构域(例如，抗CD3 scFv)的VH和VL对。在某些实施例中，抗体包含a)与“Fab-Fc侧”(第一单体)连接的FAP结合结构域VH(例如，本文所述的任何FAP结合结构域)；b)抗CD3 scFv(例如，本文所述的抗CD3scFv中的任何抗CD3 scFv)与“scFv-Fc侧”(第二单体)连接；以及c)FAP结合结构域的对应的VL。
图10A-10C描绘了基于人IgG1的若干有用的“2+1Fab2-scFv-Fc”(也称为“中心scFv”)双特异性抗体形式单体主链的序列，没有Fv和连接子的序列。因此，例如，在“Fab-Fc侧”上，VH结构域/指示VH结构域的C端连接在所述位置处，所述位置是重链的CH1结构域的开始。类似地，“Fab-scFv-Fc侧”的开始处的“VH-CH1-结构域连接子1-scFv-结构域连接子2/”指示这些序列与所列举序列连接，所述序列是变体CH2-CH3 Fc结构域。如本文所讨论的，scFv结构域可以处于如本文所讨论的朝向上，-VH-scFv连接子-VL-或–VL-scFv连接子-VH-(从N端到C端)。另外，在本发明2+1Fab2-scFv-Fc的一些实施例中，“结构域连接子2”是图7中的“有用的结构域连接子”之一。注意，序列标识符仅针对所列举序列。
如本文所述，中心scFv双特异性抗体形式包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3(“Fab-Fc侧”)；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-(任选的连接子1)-scFv-(任选的连接子2)-CH2-CH3(“Fab-scFv-Fc侧”)；以及c)共同轻链。在图10A-C中，每个主链的“Fab-Fc侧”是指第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3，并且“Fab-scFv-Fc侧”是指第二单体的CH2-CH3氨基。
主链1基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有L368D/K370S偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及在两个单体上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。主链2基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K:L368D/K370S偏斜变体、在具有L368D/K370S偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及两个单体上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。主链3基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K:L368E/K370S偏斜变体、在具有L368E/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及在两个链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。主链4基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含D401K:K360E/Q362E/T411E偏斜变体、在具有K360E/Q362E/T411E偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及在两个链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。主链5基于人IgG1(356D/358L同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有L368D/K370S偏斜变体的链上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体，以及在两个单体上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。主链6基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有L368D/K370S偏斜变体的单体上的N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体和在两个链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体，以及在两个单体上的N297A变体。主链7与主链6相同，除了突变是N297S之外。主链8与主链1相同，除了其包含M428L/N434S扩展突变之外。主链9基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包含S364K/E357Q:L368D/K370S偏斜变体、在具有S364K/E357Q偏斜变体的链上的P217R/P229R/N276K pI变体，以及在两个单体上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K烧蚀变体。在某些实施例中，2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体包含与图10A-C中的所列举序列90％、95％、98％和99％相同(如本文所定义的)的一个或多个主链序列，和/或与主链序列相比含有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个另外的氨基酸取代。如本领域的技术人员将理解的，与亲本人IgG1(或IgG2或IgG4，这取决于主链)相比，图10A-C中的主链序列已经含有多个氨基酸修饰。也就是说，在一些实施例中，除了此图的主链内所含的偏斜变体、pI变体和烧蚀变体之外，所列举主链可以含有另外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。
如本领域的技术人员将理解和下文所概述的，这些主链序列可以与本文概述的任何VH和VL对一起使用，包含例如本文所述的任何FAP结合结构域和CD3结合结构域(例如，抗CD3 scFv)的VH和VL对。在某些实施例中，抗FAP Fab与“Fab-Fc侧”连接，并且抗FAP Fab和抗CD3 scFv(例如，本文所述的抗CD3 scFv中的任何抗CD3 scFv)与“scFv-Fc侧”连接。
图11描绘了同源轻链(即，恒定轻链)的“非Fv”主链，所述同源轻链可用于本文所述的本发明1+1Fab-scFv-Fc和2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体。
图12A-12F描绘了适合用于本发明的双特异性抗体中的示例性抗CD3scFv的序列。CDR加下划线，scFv连接子加双下划线(在序列中，scFv连接子是带正电的scFv(GKPGS)4连接子(SEQ ID NO:XXX)，但是如本领域的技术人员将理解的，这个连接子可以被其它连接子代替，包含不带电连接子或带负电的连接子，其中一些描绘在图7中)，并且斜线指示可变结构域的一个或多个边界。另外，命名约定展示了scFv从N端到C端的朝向。如图7中所示，scFv可以被朝向为VH-scFv连接子-VL(从N端到C端)或VL-scFv连接子-VH(从N端到C端)。如本文所指出的并且如本文中含有CDR的每个序列的真实情况那样，对CDR位置的精确鉴定可以根据如表2所示使用的编号而略有不同，并且因此本文中所包含的不仅有加下划线的CDR，还有使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包含的CDR。此外，如对于附图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或Fab形式使用。
图13描绘了具有来自现有技术抗FAP抗体的可变区的原型抗FAP抗体的序列，如西罗珠单抗(sibrotuzumab)(参见例如，2002年9月24日授予的美国专利第US 6,455,677号)以及具有烧蚀变体(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K,“IgG1_PVA_/S267K”)的29B11和3F2(参见例如，2012年2月16日发布的WO 2012/020006)。CDR加下划线。如本文所指出的并且如本文中含有CDR的每个序列的真实情况那样，对CDR位置的精确鉴定可以根据如表2所示使用的编号而略有不同，并且因此本文中所包含的不仅有加下划线的CDR，还有使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包含的CDR。
图14A-14N描绘了本文所述的示例性本发明FAP抗原结合结构域的氨基酸序列。所描绘的序列包含每个抗原结合结构域的可变重(vh)结构域和可变轻(vl)结构域序列。对于每个抗FAP vh序列，vhCDRs1-3加下划线。对于每个抗FAP VL序列，vlCDRs1-3加下划线。如本文所指出的并且如本文中含有CDR的每个序列的真实情况那样，对CDR位置的精确鉴定可以根据如表2所示使用的编号而略有不同，并且因此本文中所包含的不仅有加下划线的CDR，还有使用其它编号系统的vh和vl结构域内所包含的CDR。此外，如对于附图中的所有序列，这些vh和vl序列可以scFv形式或Fab形式使用。在一些实施例中，图13中描绘的FAP结合结构域特别用于本文公开的双特异性抗CD3 x抗FAP抗体，包含具有“1+1Fab-scFv-Fc”和“2+1Fab2-scFv-Fc”形式的此类双特异性抗体。
图15A-15D描绘了具有噬菌体源性可变区的具有烧蚀变体(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K,“IgG1_PVA_/S267k”)的示例性抗FAP抗体的氨基酸序列。CDR加下划线。如本文所指出的并且如本文中含有CDR的每个序列的真实情况那样，对CDR位置的精确鉴定可以根据如表2所示使用的编号而略有不同，并且因此本文中所包含的不仅有加下划线的CDR，还有使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包含的CDR。
图16A-16B描绘了本文所述的若干示例性抗FAP x抗CD3双特异性抗体。图16A描绘了具有第一Fab臂结合FAP和第二scFv臂结合CD3的“1+1Fab-scFv-Fc”或“开瓶器”形式。图16B描绘了具有第一Fab臂结合FAP和第二Fab-scFv臂的2+1Fab2-scFv-Fc”或“中心scFv”形式，其中所述Fab与FAP结合并且所述scFv与CD3结合。
图17A-17E描绘了开瓶器形式的原型抗FAP x抗CD3双特异性抗体的氨基酸序列(Fab-scFv-Fc)。首先使用Fab可变区命名抗体，并且其次使用scFv可变区命名抗体，用虚线分开。CDR加下划线，并且斜线指示可变区的一个或多个边界。scFv结构域具有VH-scFv连接子-VL的朝向(N端到C端)，但是这可以颠倒。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。
图18A-18D描绘了2+1Fab2-scFv-Fc形式(“中心scFv”)的原型抗FAP x抗CD3双特异性抗体的氨基酸序列。首先使用Fab可变区命名抗体，并且其次使用Fab-scFv可变区命名抗体，用虚线分开。CDR加下划线，并且斜线指示可变区的一个或多个边界。scFv结构域具有VH-scFv连接子-VL的朝向(N端到C端)，但是在特定实施例中这可以颠倒(即，VL-scFv连接子-VH)。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。
图19描绘了1+1Fab-scFv-Fc(“开瓶器”)形式的对照抗RSV x抗CD3双特异性抗体的氨基酸序列。首先用Fab可变区命名抗体，并且其次用scFv可变区命名抗体，用虚线分开。CDR加下划线，并且斜线指示可变区的一个或多个边界。scFv结构域具有VH-scFv连接子-VL的朝向(N端到C端)，但是这可以颠倒。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。
图20A-20G描绘了具有1+1Fab-scFv-Fc(“开瓶器”)形式的噬菌体源性可变区的示例性抗FAP x抗CD3双特异性抗体的氨基酸序列。首先使用Fab可变区命名抗体，并且其次使用scFv可变区命名抗体，用虚线分开。CDR加下划线，并且斜线指示可变区的一个或多个边界。scFv结构域具有VH-scFv连接子-VL的朝向(N端到C端)，但是这可以颠倒。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。
图21A-21J描绘了具有2+1Fab2-scFv-Fc形式(“中心scFv”)的噬菌体源性可变区的抗FAP x抗CD3双特异性抗体的氨基酸序列。首先使用Fab可变区命名抗体，并且其次使用Fab-scFv可变区命名抗体，用虚线分开。CDR加下划线，并且斜线指示可变区的一个或多个边界。scFv结构域具有VH-scFv连接子-VL的朝向(N端到C端)，但是这可以颠倒。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。
图22描绘了人DPP4的序列。
图23描绘了如从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas)(TCGA)汇编的，FAP在肿瘤相对于与各种癌症相关的匹配的正常组织上的RNA转录水平(RNAseq V2 RSEM)。
图24描绘了Detroit551、BJ人成纤维细胞、IMR90、HFL-1、HCI-H196、U937、HCC1143、WI-38、SK-MEL-3、NCI-H661、HL60、HT29和A549细胞系上的FAP抗原数量。
图25描绘了抗FAP mAb(实线)和抗小鼠IgG同种型对照物(虚线)与WI-38、IMR-90、Detroit551、HFL-1、HFL-1、BJ人成纤维细胞、SW872和NCI-H196细胞系的如通过APC MFI指示的结合。
图26描绘了说明性抗FAP mAb XENP23534(圆形)、XENP24460(正方形)和XENP24861(三角形)与间充质干细胞(MSC)、造血干细胞(HSC)、CD31+FAP+细胞、WI-38细胞和Detroit-551细胞的结合，如由MFI所指示的。
图27描绘了如通过Octet测定的，原型抗FAP x抗CD3 bsAb对于人和食蟹猴FAP的KD。由于亲合力因子，中心scFv形式bsAb的KD值应当被认为是KD(表观)值。
图28A-28D描绘了原型抗FAP(来自西罗珠单抗的可变区)x抗CD3bsAb与A)WI-38细胞，B)SW872细胞，C)HFL-1细胞和D)Detroit-551细胞的结合。圆形指示具有CD3-高的bsAb，正方形指示具有CD3-高-中等的bsAb，并且三角形指示具有CD3-中等的bsAb。
图29描绘了通过原型抗FAP(来自西罗珠单抗的可变区)x抗CD3 bsAb的细胞结合的EC50(nM)。
图30A-30D描绘了通过各种形式的另外的原型抗FAP(来自西罗珠单抗的可变区)x抗CD3 bsAb在A)WI-38，B)SW872，C)HFL-1，和D)Detroit-551细胞上的RTCC。圆形指示具有CD3-高的bsAb，正方形指示具有CD3-高-中等的bsAb，并且三角形指示具有CD3-中等的bsAb。
图31A-31D描绘了通过各种形式的原型抗FAP x抗CD3 bsAb在A)Detroit-551，B)BJ人成纤维细胞，C)IMR-90和D)HFL-1细胞上的RTCC。圆形指示具有CD3-高的开瓶器bsAb。正方形指示CD3-高-中等的开瓶器bsAb。菱形指示CD3-高的中心scFv bsAb。三角形指示二价mAb。
图32A-32B描绘了通过各种形式的原型抗FAP x抗CD3 bsAb在A)WI-38或B)SW872细胞上的RTCC。圆形指示具有CD3-高的开瓶器bsAb。正方形指示具有CD3-高-中等的1+1Fab-scFv-Fc bsAb。菱形指示具有CD3-高的2+1Fab2-scFv-Fc bsAb。三角形指示二价mAb。
图33描绘了噬菌体源性抗FAP抗体和XENP23534(作为对照)对于人、食蟹猴和鼠FAP的KD。
图34描绘了显示缺乏噬菌体源性抗FAP抗体与DPP4的结合的传感图。
图35描绘了噬菌体源性抗FAP抗体的表位分箱(epitope binning)，如由归一化BLI应答Octet所指示的。低于0.41的归一化BLI应答指示两种抗体不与同一表位结合。
图36描绘了在与示例性噬菌体源性抗FAP抗体温育之后通过西罗珠单抗(XENP23434)与WI-38细胞结合。
图37A-37D描绘了呈1+1Fab-scFv-Fc bsAb形式或二价mAb(效应子功能经烧蚀)形式的噬菌体源性抗FAP结构域在A)Detroit-551、B)SW872和C)WI-38细胞上的RTCC。
图38A-38C描绘了通过各种形式的具有源自噬菌体克隆1F4B5、1F10B5、1F12B5的抗FAP臂的抗FAP x抗CD3 bsAb在A)BJ人成纤维细胞，B)HFL-1和C)WI-38细胞上的RTCC。圆形指示具有CD3-高的2+1Fab2-scFv-Fc形式，正方形指示具有CD3-高-中等的2+1Fab2-scFv-Fc形式，菱形指示具有CD3-高的开瓶器形式，并且六边形指示具有CD3-高-中等的1+1Fab-scFv-Fc形式。
图39A-39B描绘了通过各种形式的具有源自噬菌体克隆1A7B5和1E5A5的抗FAP臂的抗FAP x抗CD3 bsAb在A)BJ人成纤维细胞和B)WI-38细胞上的RTCC。圆形指示具有CD3-高的2+1Fab2-scFv-Fc形式，正方形指示具有CD3-高-中等的2+1Fab2-scFv-Fc形式，并且菱形指示具有CD3-高的1+1Fab-scFv-Fc形式。
图40A-40B描绘了通过各种形式的具有源自噬菌体克隆1E5A5、1F10B5和1F11B5以及1E5A5的抗FAP臂的抗FAP x抗CD3 bsAb在A)BJ人成纤维细胞和B)WI-38细胞上的RTCC，其中轻链可变区具有人种系VLk 1-39序列。圆形指示具有CD3-高的1+1Fab-scFv-Fc形式bsAb，正方形指示具有CD3-高的中心scFv bsAb，菱形指示具有CD3-高-中等的2+1Fab2-scFv-Fc形式bsAb。
图41A-41B描绘了在以低剂量施用示例性抗FAP x抗CD3 bsAb和对照XENP23535给予之前和之后的食蟹猴外周血中的A)CD4+和B)CD8+淋巴细胞计数。
图42A-42B描绘了在以高剂量施用示例性抗FAP x抗CD3 bsAb和对照XENP23536给予之前和之后的食蟹猴外周血中的A)CD4+和B)CD8+淋巴细胞计数。
图43A和43B描绘了本文所述的示例性双特异性抗FAP x抗CD3抗体的可能组合的矩阵。“A”意指可以将在矩阵顶部的参考CD3结合结构域序列的CDR与在矩阵左手侧列出的FAP结合结构域序列的CDR组合。例如，关于“抗FAP 1A4A5 H1_L1”和“抗CD3 H1.30_L1.47”，“A”指示包含以下的双特异性抗体：a)CD3结合结构域，其具有来自H1.30_L1.47 CD3结合结构域可变重链(H1.30)序列的vhCDR和来自CD3 H1.30_L1.47可变轻链(L1.47)序列的vlCDR，以及b)FAP结合结构域，其具有来自1A4A5 FAP结合结构域H1序列的vhCDR和来自1A4A5 FAP结合结构域L1序列的vlCDR。“B”意指来自CD3结合结构域构建体的CDR可以与来自FAP结合结构域构建体的可变重和轻结构域组合。例如，关于“抗FAP 1A4A5”和“抗CD3H1.30_L1.47”，“B”指示包含以下的双特异性抗体：a)CD3结合结构域，其具有来自CD3H1.30_L1.47结合结构域可变重链(H1.30)序列的vhCDR和来自CD3 H1.30_L1.47结合结构域可变轻链(L1.47)序列的vlCDR，以及b)FAP结合结构域，其具有以下：具有FAP 1A4A5 H1序列的可变重结构域和具有FAP 1A4A5 L1序列的可变轻结构域。“C”指示包含以下的双特异性抗体：a)CD3结合结构域，其具有来自所指示CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域，以及b)FAP结合结构域，其具有所指示FAP结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3。“D”指示包含以下的双特异性抗体：FAP结合结构域，其具有所指示FAP结合结构域的可变重链和可变轻链；以及CD3结合结构域，其具有所指示抗CD3序列的可变重链和可变轻链。“E”指示包含scFv的双特异性抗体，其中CD3的scFv与所指示FAP结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3一起使用。“F”指示包含scFv的双特异性抗体，其中CD3的scFv与所指示FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域一起使用。
所有这些组合可以1+1Fab-scFv-Fc形式(例如，使用图9中所示的任何1+1Fab-scFv-Fc主链形式)和中心scFv形式(例如，使用图10中所示的任何中心scFv主链)进行。这些组合还可以用于替代性形式，如图1的mAb-Fv、mAb-scFv、中心Fv或双scFv形式，包含图11中所示的形式主链。例如，“A”(CD3结合结构域CDR和FAP结合结构域CDR)可以添加到1+1Fab-scFv-Fc序列(例如，图9的或包含不同异源二聚化变体的序列)、添加到中心scFv(例如，图10的序列)或添加到图11的mAb-scFv主链中。然而，通常，包含CD3的二价结合的形式是不利的。因此，在一些利用三价形式，如中心scFv的实施例中，抗CD3 x抗FAP双特异性抗体将包含两个FAP结合结构域和一个CD3结合结构域。在包含scFv的此类三价抗体形式的一些实施例中，所述scFv是CD3结合结构域(参见例如图16B)。
图43C和43D描绘了本文所述的示例性双特异性抗FAP x抗CD3 1+1Fab-scFv-Fc形式组合的可能组合的矩阵。在这些矩阵中，在X轴上列出抗CD3 scFv，并且在Y轴上列出抗FAP Fab。“A”意指可以将在矩阵顶部的参考CD3结合结构域序列的CDR与在矩阵左手侧列出的FAP结合结构域序列的CDR组合。例如，关于“抗FAP 1A4A5 H1_L1”和“抗CD3 H1.30_L1.47”，“A”指示包含以下的双特异性1+1Fab-scFv-Fc形式抗体：a)抗CD3 scFV，其具有来自H1.30_L1.47 CD3结合结构域可变重链(H1.30)序列的vhCDR和来自H1.30_L1.47 CD3结合结构域可变轻链(L1.47)序列的vlCDR，以及b)抗FAP Fab，其具有来自1A4A5 FAP结合结构域可变重链(H1)序列的vhCDR和来自1A4A5 FAP结合结构域可变轻链(L1)序列的vlCDR。“B”意指来自所指示CD3结合结构域构建体的CDR可以与来自所指示FAP结合结构域构建体的可变重和轻结构域组合。例如，关于“抗FAP 1A4A5 H1_L1”和“抗CD3 H1.30_L1.47”，“B”指示包含以下的双特异性1+1Fab-scFv-Fc抗体：a)抗CD3 scFv，其具有来自H1.30_L1.47CD3结合结构域可变重链(H1.30)序列的vhCDR和来自H1.30_L1.47 CD3结合结构域可变轻链(L1.47)序列的vlCDR，以及b)抗FAP Fab，其具有1A4A5 FAP结合结构域可变重结构域(H1)序列和1A4A5 FAP结合结构域可变轻结构域(L1)序列。“C”指示包含以下的双特异性1+1Fab-scFv-Fc抗体：a)抗CD3 scFv，其具有来自抗CD3序列的可变重结构域和可变轻结构域，以及b)抗FAP Fab，其具有抗FAP序列的CDR。“D”指示包含以下的双特异性1+1Fab-scFv-Fc抗体：抗FAP Fab，其具有所指示FAP结合结构域的可变重链和可变轻链；以及抗CD3scFv，其具有所指示CD3结合结构域的可变重链和可变轻链。“E”指示包含scFv的双特异性1+1Fab-scFv-Fc抗体，其中CD3结合结构域的scFv与FAP结合结构域的CDR一起使用。“F”指示包含scFv的双特异性抗体，其中CD3结合结构域的scFv与FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域一起使用。
图43E和43F描绘了本文所述的示例性双特异性抗FAP x抗CD3 2+1Fab2-scFv-Fc形式(也称为“中心scFv形式”)组合的可能组合的矩阵。在这些矩阵中，在X轴上列出抗CD3scFv，并且在Y轴上列出两种抗FAP Fab。“A”意指可以将在矩阵顶部的参考CD3结合结构域序列的CDR与在矩阵左手侧列出的FAP结合结构域序列的CDR组合。例如，关于“抗FAP1A4A5H1_L1”和“抗CD3 H1.30_L1.47”，“A”指示包含以下的双特异性中心scFv形式抗体：a)抗CD3 scFV，其具有来自H1.30_L1.47 CD3结合结构域可变重链(H1.30)序列的vhCDR和来自CD3 H1.30_L1.47结合结构域可变轻链(L1.47)序列的vlCDR，以及b)抗FAP Fab结构域，其具有来自FAP结合结构域1A4A5重链(H1)序列的vhCDR和来自FAP结合结构域1A4A5轻链(L1)序列的vlCDR。“B”意指来自所指示CD3结合结构域构建体的CDR可以与来自所指示FAP结合结构域构建体的可变重和轻结构域组合。例如，关于“抗FAP 1A4A5 H1_L1”和“抗CD3H1.30_L1.47”，“B”指示包含以下的双特异性中心scFv抗体：a)抗CD3 scFv，其具有来自H1.30_L1.47 CD3结合结构域可变重链(H1.30)序列的vhCDR和来自H1.30_L1.47 CD3结合结构域可变轻链(L1.47)序列的vlCDR，以及b)抗FAP Fab结构域，其具有1A4A5 FAP结合结构域可变重结构域(H1)序列和1A4A5 FAP结合结构域可变轻结构域(L1)序列。“C”指示包含以下的中心scFv抗体：a)抗CD3 scFv，其具有来自所指示CD3结合结构域序列的可变重结构域和可变轻结构域，以及b)FAP Fab结构域，其具有所指示FAP结合结构域序列的CDR。“D”指示包含以下的中心scFv抗体：抗FAP Fab结构域，其具有所指示FAP结合结构域序列的可变重链和可变轻链；以及抗CD3 scFv，其具有所指示CD3结合结构域序列的可变重链和可变轻链。“E”指示包含scFv的中心scFv抗体，其中所指示CD3结合结构域的scFV与FAP抗原结合结构域的CDR一起使用。“F”指示包含scFv的中心scFv抗体，其中所指示CD3结合结构域的scFv与所指示FAP抗原结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域一起使用。
图44A和44B描绘了A)XENP23535，1+1Fab-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3 bsAb，以及B)XENP25967，2+1Fab2-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3 bsAb对FAPhigh细胞(BJ人成纤维细胞)和FAPlow细胞(WI-38)的RTCC活性，并且显示与具有更广泛地反应性的XENP23535相比，XENP25967对于具有高肿瘤抗原密度的细胞是高度选择性的。
图45A-45W描绘了XENP23533、基于高亲和力FAP结合结构域的Fab片段以及来自高亲和力FAP结合结构域的亲和力去成熟文库的说明性抗FAP Fab片段的序列。CDR加下划线，并且斜线(/)指示可变结构域的一个或多个边界。如本文所指出的并且如本文中含有CDR的每个序列的真实情况那样，对CDR位置的精确鉴定可以根据如表2所示使用的编号而略有不同，并且因此本文中所包含的不仅有加下划线的CDR，还有使用其它编号系统的VH和VL结构域内所包含的CDR。此外，如对于附图中的所有序列，这些VH和VL序列可以Fab形式或scFv形式使用。重要的是要注意，这些序列是在已经被去除的重链的C端处使用多组氨酸(His6或HHHHHH)标签产生的。
图46描绘了用于筛选抗FAP Fab变体的亲和力的XENP22476、HIS-Avi-Fc-huFAP抗原的序列。
图47描绘了来自FAP的亲和力去成熟文库的抗FAP Fab变体的解离常数(KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。
图48描绘了来自FAP的亲和力去成熟文库的抗FAP Fab变体的解离常数(KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。
图49A-49B描绘了来自FAP的亲和力去成熟文库的抗FAP Fab变体的解离常数(KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。
图50描绘了来自FAP的亲和力去成熟文库的抗FAP Fab变体的解离常数(KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)。
图51A-51H描绘了2+1Fab2-scFv-Fc形式的说明性抗FAP x抗CD3双特异性抗体的氨基酸序列，所述双特异性抗体包括亲和力去成熟的抗FAP结合结构域。首先使用Fab可变区命名抗体，并且其次使用Fab-scFv可变区命名抗体，用虚线分开。CDR加下划线，并且斜线指示可变区的一个或多个边界。scFv结构域具有VH-scFv连接子-VL的朝向(N端到C端)，但是这可以颠倒。另外，本文概述的每个序列均可以包含或不包含一个或优选地两个Fc结构域中的M428L/N434S变体，这产生了较长的血清半衰期。
图52A和B描绘了通过2+1Fab2-scFv-Fc形式的具有亲和力去成熟的FAP结合结构域或具有噬菌体源性FAP结合结构域的抗FAP x抗CD3 bsAb在A)BJ人成纤维细胞和B)SV40转化的WI-38(VA13)上的RTCC的诱导。
图53描绘了在BJ人成纤维细胞与具有亲和力去成熟的FAP结合结构域的2+1Fab2-scFv-Fc形式的人PBMC(10:1效应子与靶细胞比率)和抗FAP x抗CD3 bsAb温育24小时之后表达A)CD69、B)CD25和C)CD107a的CD4+T细胞的百分比。数据显示，具有较低亲和力FAP结合臂的bsAb(例如，XENP28393、XENP28115和XENP28116)在使T细胞活化方面的效力低于具有较高亲和力FAP结合臂的bsAb(例如，XENP28114)。
图54描绘了在BJ人成纤维细胞与具有亲和力去成熟的FAP结合结构域的2+1Fab2-scFv-Fc形式的人PBMC(10:1效应子与靶细胞比率)和抗FAP x抗CD3 bsAb温育24小时之后A)CD69、B)CD25和C)CD107a在CD4+T细胞(如由MFI所指示的)上的上调。
图55描绘了在BJ人成纤维细胞与具有亲和力去成熟的FAP结合结构域的2+1Fab2-scFv-Fc形式的人PBMC(10:1效应子与靶细胞比率)和抗FAP x抗CD3 bsAb温育24小时之后表达A)CD69、B)CD25和C)CD107a的CD8+T细胞的百分比。数据显示，具有较低亲和力FAP结合臂的bsAb(例如，XENP28393、XENP28115和XENP28116)在使T细胞活化方面的效力低于具有较高亲和力FAP结合臂的bsAb(例如，XENP28114)。
图56描绘了在BJ人成纤维细胞与具有亲和力去成熟的FAP结合结构域的2+1Fab2-scFv-Fc形式的人PBMC(10:1效应子与靶细胞比率)和抗FAP x抗CD3 bsAb温育24小时之后A)CD69、B)CD25和C)CD107a在CD8+T细胞(如由MFI所指示的)上的上调。
图57A-57C描绘了通过PBMC与BJ人成纤维细胞和具有亲和力去成熟的FAP结合结构域的2+1Fab2-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3 bsAb一起温育24小时(10:1效应子与靶细胞比率)所释放的A)IFNγ，B)TNFα和C)IL-6的浓度。
图58描绘了XENP24370(一种内部产生的可溶性人FAP)的序列。
图59A和59B描绘了在与抗FAP x抗CD3 1+1Fab-scFv-Fc bsAb(XENP23535)或抗FAP x抗CD3 2+1Fab2-scFv-Fc bsAb(XENP25193、XENP25195、XENP25967和XENP25194)温育之后，A)人血浆(来自2个供体)和B)食蟹猴血浆中的可溶性FAP的浓度。
图60描绘了在与具有亲和力去成熟的FAP结合结构域(另外，具有或不具有可溶性FAP)的2+1Fab2-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3 bsAb温育的BJ人成纤维细胞人PBMC上的RTCC的诱导。数据显示，bsAb(如具有高亲和力FAP结合臂的XENP28114)证明在可溶性FAP存在的情况下效力的最大降低，而具有亲和力去成熟的FAP结合臂的bsAb(如XENP28115和XENP28116)的效力较少受可溶性FAP的存在的影响。
图61描绘了在与具有噬菌体源性FAP结合结构域(另外，具有或不具有可溶性FAP)的2+1Fab2-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3 bsAb温育的BJ人成纤维细胞人PBMC上的RTCC的诱导。
图62A-62E描绘了包含M428L/N434S变体的说明性抗FAP x抗CD3双特异性抗体的氨基酸序列，这产生了较长的血清半衰期。首先使用Fab可变区命名抗体，并且其次使用Fab-scFv可变区命名抗体，用虚线分开。CDR加下划线，并且斜线指示可变区的一个或多个边界。scFv结构域具有VH-scFv连接子-VL的朝向(N端到C端)，但是这可以颠倒。除了这些序列之外，本文概述的序列中的每个序列可以在一个或优选地两个Fc结构域中包含或不包含M428L/N434S变体。
图63A-63M描绘了基于人IgG1的若干有用的2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体形式重链主链，包含针对6种不同的抗CD3 ABD的scFv(在两个朝向上)，以及包含和不包含
Figure BDA0002762852890000301
FcRn变体428L/434S(有时也称为“LS”变体)但不包含针对其它抗原的ABD的序列。也就是说，每组的链是-CH1-铰链-CH2-CH3序列(“Fab-Fc侧”)，VH1序列(例如，VH1的C端在斜线“/”处连接)可以添加到其中以形成全重链VH1-CH1-铰链-CH2-CH3。每组的链2(在本文中也称为“单体2”)是-抗CD3 scFv-结构域连接子-CH2-CH3，将VH1-CH1-任选的结构域连接子-(例如，结构域连接子的C端在斜线“/”处连接)添加到其中以形成全链(VH1-CH1-结构域连接子-scFv-结构域连接子-CH2-CH3)。在此实施例中，scFv可以处于任一朝向上，从而使得全链是VH1-CH1-结构域连接子-VH2-scFv连接子-VL2-结构域连接子-CH2-CH3或VH1-CH1-结构域连接子-VL2-scFv连接子-VH2-结构域连接子-CH2-CH3(注意，图63的序列包含两个选项)。链3(在本文中也称为“轻链”)是LC结构域，VL1可以添加到其中以形成VL1-CL。CDR加下划线，连接子加双下划线，并且结构域边界用斜线标注。应注意，所有链2序列包含作为scFv的C端与CH2结构域的N端之间的结构域连接子的序列GGGGSGGGGSKTHTCPPCP(SEQ ID NO:XX)，其是“柔性半铰链”结构域连接子；然而，此连接子可以在任何图63链2序列中用图7的任何“有用的结构域连接子”代替，其中一些实施例用“全铰链C220S变体”(EPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:XX))代替“柔性半铰链”。这些序列中的每个序列包含优选的偏斜变体、pI变体和烧蚀变体。
图64A-64Q描绘了2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体形式的示例性本发明FAP x CD3双特异性抗体。此类抗体包含a)两个Fab，所述两个Fab各自包含FAP结合结构域[αFAP]_H0.26_L0的VH和VL；和b)scFv，所述scFv包含以下CD3结合结构域之一的VH和VL：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47。
图65A-65Q描绘了2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体形式的示例性本发明FAP x CD3双特异性抗体。此类抗体包含a)两个Fab，所述两个Fab各自包含FAP结合结构域[αFAP]_H0.26_L0.11的VH和VL；和b)scFv，所述scFv包含以下CD3结合结构域之一的VH和VL：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47。
图66A-66P描绘了2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体形式的示例性本发明FAP x CD3双特异性抗体。此类抗体包含a)两个Fab，所述两个Fab各自包含FAP结合结构域[αFAP]_H0.26_L0.19的VH和VL；和b)scFv，所述scFv包含以下CD3结合结构域之一的VH和VL：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47。
图67A-67P描绘了2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体形式的示例性本发明FAP x CD3双特异性抗体。此类抗体包含a)两个Fab，所述两个Fab各自包含FAP结合结构域1A7B5 H1_L1的VH和VL；和b)scFv，所述scFv包含以下CD3结合结构域之一的VH和VL：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47。
图68A-68P描绘了2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体形式的示例性本发明FAP x CD3双特异性抗体。此类抗体包含a)两个Fab，所述两个Fab各自包含FAP结合结构域1E5A5 H1_L1的VH和VL；和b)scFv，所述scFv包含以下CD3结合结构域之一的VH和VL：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47。
图69A-69P描绘了2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体形式的示例性本发明FAP x CD3双特异性抗体。此类抗体包含a)两个Fab，所述Fab各自包含FAP结合结构域1E5A5(共同轻链)H1_L1的VH和VL；以及b)scFv，所述scFv包含以下CD3结合结构域之一的VH和VL：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47。
图70A-70P描绘了2+1Fab2-scFv-Fc双特异性抗体形式的示例性本发明FAP x CD3双特异性抗体。此类抗体包含a)两个Fab，所述两个Fab各自包含FAP结合结构域1FAB5 H1_L1的VH和VL；和b)scFv，所述scFv包含以下CD3结合结构域之一的VH和VL：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47、H1.31_L1.47。
具体实施方式
I.概述
成纤维细胞代表肿瘤环境中的大多数基质细胞。已经报道了这些癌症相关成纤维细胞(CAF)例如通过提供用于血管生成的生长因子和通过促进免疫抑制环境来促进肿瘤存活和增殖(Orimo等人,2006；Xing等人,2011)，并且已经与不良预后相关(Underwood等人,2015)。因此，已经尝试通过靶向CAF来破坏肿瘤，但是迄今为止，此类治疗在临床试验中是无效的(Barnett和Vilar,2018)。
成纤维细胞活化蛋白(FAP)是一种参与胞外基质重塑的丝氨酸蛋白酶(Kelly等人,2012)。已经发现FAP在CAF中高度表达(Scanlan等人,1994)。由于FAP在癌症相关成纤维细胞中升高，因此据信抗FAP抗体对于治疗癌症是有用的。具体地，本文提供了新型抗CD3、抗FAP双特异性抗体。此类抗体用于将CD3+效应T细胞引导到FAP+位点，从而允许CD3+效应T细胞攻击并裂解FAP+细胞和肿瘤。
本文提供了包含FAP结合结构域的组合物，所述组合物包含具有此类FAP结合结构域的抗体(例如，FAP x CD3双特异性抗体)。包含此类FAP结合结构域的本发明抗体有利地引发一系列不同的免疫应答，这取决于所使用的特定FAP结合结构域。例如，本发明抗体在对具有不同FAP表达的细胞的选择性、对于FAP表达性细胞的效力、引发细胞因子释放的能力以及对可溶性FAP的敏感性方面表现出差异。此类FAP结合结构域和相关的抗体可用于例如治疗FAP相关癌症。
因此，在一方面，本文提供了与两种不同抗原结合的异源二聚体抗体，例如抗体是“双特异性的”，因为所述抗体与两种不同的靶抗原结合，通常是如下所述的FAP和CD3。这些异源二聚体抗体可以与这些靶抗原(例如，存在单个抗原结合结构域，如可变重和可变轻结构域对)或二价地(存在各自独立地与抗原结合的两个抗原结合结构域)单价地结合。本文提供的异源二聚体抗体基于使用不同的单体，所述不同的单体含有使异源二聚体相比于同源二聚体“偏斜”形成的氨基酸取代，如以下更完整地概述的，所述不同的单体与允许异源二聚体远离同源二聚体的简单纯化的“pI变体”结合，如以下类似地概述的。所提供的异源二聚体双特异性抗体通常依赖于使用可以在生产细胞中自组装以产生异源二聚体蛋白的工程化或变体Fc结构域，以及产生和纯化此类异源二聚体蛋白的方法。
II.命名法
本文提供的抗体以若干种不同的形式列出。在一些实例中，特定抗体中的每个单体被给予唯一的“XENP”编号，但是如本领域中将理解的，较长的序列可能含有较短的XENP编号。例如，1+1Fab-scFv-Fc形式抗体的“scFv-Fc”单体可以具有第一XENP编号，而scFv结构域本身将具有不同的XENP编号。一些分子具有三个多肽，因此在具有组分的情况下，XENP编号用作名称。因此，呈2+1Fab2-scFv-Fc形式的分子XENP25193包括三个序列(参见图21E)：XENP025193“重链”单体；2)XENP025193“Fab-scFv-Fc重链”单体；和3)XENP025193“轻链”或等效物，但是本领域的技术人员将能够通过序列比对容易地鉴定这些序列。这些XENP编号在序列表以及标识符中，并且用在附图中。另外，包括三个组分的一个分子产生多个序列标识符。例如，Fab单体的列表具有全长序列、可变重序列和可变重序列的三个CDR；轻链具有全长序列、可变轻序列和可变轻序列的三个CDR；并且Fab-scFv-Fc单体具有全长序列、可变重序列、3个重CDR序列、scFv序列(包含scFv可变重序列、scFv可变轻序列和scFv连接子)。应注意，本文中具有scFv结构域的所有分子使用单个带电scFv连接子(+H)，但也可以使用其它的。另外，特定可变结构域的命名法使用“Hx.xx_Ly.yy”类型的形式，其中编号是特定可变链序列的唯一标识符。因此，抗FAP结合结构域1A4A5的Fab侧的可变结构域(例如，图14A)是“H1_L1”，这指示可变重结构域H1与轻结构域L1组合。在这些序列用作scFv的情况下，名称“H1_L1”指示可变重结构域，H1与轻结构域L1组合并且从N端到C端处于VH-连接子-VL朝向。具有重可变结构域和轻可变结构域的相同序列但是所述序列处于倒序(VL-连接子-VH定向，从N端到C端)的这种分子将被命名为“L1_H1.1”。类似地，不同构建体可以“混合并匹配”重链和轻链，如根据序列表和附图将显而易见的。
III.定义
为了可以更加彻底地理解本申请，下文阐述了若干个定义。此类定义意在涵盖语法等效物。
“成纤维细胞活化蛋白”或“FAP”(例如，基因库登录号NP_004451.2(人同种型1)和NP_001278736.1(人同种型2))；以及NP_032012(小鼠))在本文中意指属于丝氨酸蛋白酶家族的同源二聚体整合膜明胶酶。FAP序列描绘在例如图2中。FAP在与上皮癌、愈合伤口的肉芽组织以及骨和软组织肉瘤的恶性细胞相关的基质成纤维细胞中高度表达。FAP涉及发育、组织修复和上皮癌发生期间成纤维细胞生长或上皮-间充质相互作用的控制。FAP的蛋白水解活性支持肿瘤生长和增殖。
本文中的“CD3”或“分化簇3”意指有助于细胞毒性T细胞(例如，CD8+天然T细胞)和T辅助细胞(例如，CD4+天然T细胞)两者的活化并且由四个不同链构成的T细胞共受体：一个CD3γ链(例如，基因库登录号NM_000073和MP_000064(人))、一个CD3δ链(例如，基因库登录号NM_000732、NM_001040651、NP_00732和NP_001035741(人))以及两个CD3ε链(例如，基因库登录号NM_000733和NP_00724(人))。CD3链是含有单个胞外免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3分子与T细胞受体(TCR)和ζ链缔合以形成T细胞受体(TCR)络合物，所述络合物在T淋巴细胞中产生活化信号中起作用。
本文中的“烧蚀”意指活性的降低或去除。因此例如，“烧蚀FcγR结合”意指Fc区氨基酸变体与不含特异性变体的Fc区相比具有少于50％的起始结合，优选大于70％到80％到90％到95％到98％的活性损失，并且通常，活性低于Biacore、SPR或BLI测定中的可检测结合的水平。特别用于FcγR结合的烧蚀的是图5所示的那些变体，所述变体通常添加到两个单体中。
如本文所使用的，“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞裂解的细胞介导反应。ADCC与结合FcγRIIIa相关；与FcγRIIIa结合增加引起ADCC活性增加。
如本文所使用的，“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬意指其中表达FcγR的非特异性吞噬细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞吞噬的细胞介导反应。
本文中的“抗原结合结构域”或“ABD”意指一组六个互补决定区(CDR)在作为多肽序列的一部分存在时与如本文所讨论的靶抗原特异性地结合。因此，“检查点抗原结合结构域”与如本文概述的靶检查点抗原结合。如本领域所已知的，这些CDR通常作为第一组可变重CDR(vhCDR或VHCDR)和第二组可变轻CDR(vlCDR或VLCDR)存在，各自包括三个CDR：重链的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3以及轻链的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3。CDR分别存在于可变重结构域和可变轻结构域中并且一起形成Fv区。(CDR编号方案参见表2和上文相关讨论)。因此，在一些情况下，抗原结合结构域的六个CDR源自可变重结构域和可变轻结构域。在“Fab”形式中，一组6个CDR源自两个不同的多肽序列、可变重结构域(vh或VH；含有vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)和可变轻结构域(vl或VL；含有vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)，vh结构域的C端与重链的CH1结构域的N端连接并且vl结构域的C端与恒定轻结构域的N端连接(并且因此形成轻链)。在scFv形式中，vh结构域和vl结构域通常通过使用如本文概述的连接子(“scFv连接子”)二价连接到单个多肽序列中，这可以是(从N端开始)vh-连接子-vl或vl-连接子-vh，通常优选的是前者(包含各侧上的任选结构域连接子，这取决于所使用的形式(例如，根据图1))。通常，scFv结构域的C端与第二单体中的铰链的N端连接。
本文中的“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失或对与蛋白质化学连接的部分的更改。例如，修饰可以是与蛋白质连接的经更改的碳水化合物或PEG结构。本文中的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另外指出，否则氨基酸修饰总是用于由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
本文中的“氨基酸取代”或“取代”意指用不同的氨基酸来代替亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸。具体地，在一些实施例中，取代是用于并非天然发生在特定位置处或并非天然发生在生物体内或任何生物体中的氨基酸。例如，取代E272Y是指变体多肽，在这一情况下是指Fc变体，其中位置272处的谷氨酸用酪氨酸代替。为清楚起见，已经被工程化以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如，将CGG(编码精氨酸)换成CGA(仍然编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管产生对相同蛋白质进行编码的新基因，但是如果蛋白质在其开始的特定位置处具有相同氨基酸，则所述蛋白质不是氨基酸取代。
如本文所使用的，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E指代在位置233之后且在位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE指代在位置233之后且在位置234之前插入AlaAspGlu。
如本文所使用的，“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸序列。例如，E233-或E233#、E233()或E233del指代位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#指代开始于位置233的序列GluAspAla缺失。
如本文所使用的，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，但并没有多得使得变体蛋白质使用如下所述比对程序将不与亲本蛋白质比对。通常，使用下文所述的比对程序如BLAST，变体蛋白质(如本文概述的变体Fc结构域等)与亲本蛋白质通常至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
如下所述，在一些实施例中，亲本多肽，例如Fc亲本多肽是人野生型序列，如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重恒定结构域或Fc区，但是具有变体的人序列还可以用作“亲本多肽”，例如可以包含美国公开2006/0134105的IgG1/2杂交体。本文中的蛋白质变体序列将与亲本蛋白质序列优选地拥有至少约80％同一性，并且最优选地至少约90％同一性，更优选地至少约95％到98％到99％同一性。因此，如本文所使用的，“抗体变体”或“变体抗体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本抗体不同的抗体，如本文所使用的，“IgG变体”或“变体IgG”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本IgG(再次，在许多情况下，来自人IgG序列)不同的抗体，并且如本文所使用的，“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。如本文所使用的，“Fc变体”或“变体Fc”意指包括如与人IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域相比，在Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。
本发明的Fc变体根据构成其的氨基酸修饰进行定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽具有位置434处的丝氨酸取代的Fc变体，其中编号是根据EU索引。同样地，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。WT氨基酸的同一性可能未指明，在此情况下，上述变体被称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，N434S/M428L是与M428L/N434S相同的Fc变体等。对于本发明所讨论的涉及抗体的所有位置，除非另外指出，否则氨基酸位置编号是根据EU索引。EU索引或如Kabat或EU编号方案中的EU索引是指EU抗体的编号。Kabat等人收集了重链和轻链的可变区的多个一级序列。基于序列的保守度，其将各个一级序列分类成CDR和框架并且做出其列表(参见《免疫学关注的序列(SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST)》第5版,NIH出版号91-3242,E.A.Kabat等人，所述文献通过引用整体并入)。还参见Edelman等人,1969,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》63:78-85，所述文献特此通过引用并入。修饰可以是添加、缺失或取代。
如本文所使用的，“变体”还指特定的氨基酸修饰(例如，“异源二聚化变体”、“pI变体”、“烧蚀变体”等)。
如本文所使用的，“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包含蛋白质、多肽、寡肽和肽。另外，构成本发明的抗体的多肽可以包含一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、循环变换、环化、其它分子的连接子、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。
如本文所使用的，“残基”意指蛋白质中的位置以及其相关的氨基酸同一性。例如，天冬酰胺297(还被称为Asn297或N297)是人抗体IgG1中位置297处的残基。
如本文所使用的，“Fab”或“Fab区”意指包括通常在两个不同的多肽链上的VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽(例如，VH-CH1在一个链上并且VL-CL在另一个链上)。Fab可以指分离情况下的这个区或本发明的双特异性抗体的上下文中的这个区。在Fab的上下文中，除了CH1和CL结构域之外，Fab还包括Fv区。
如本文所使用的，“Fv”或“Fv片段”意指包括ABD的VL和VH结构域的多肽。Fv区可以格式化为Fab(如上文所讨论的，通常是还包含如上文概述的恒定区的两种不同的多肽)和scFv两者，其中vl和vh结构域组合(通常是与如本文所讨论的连接子组合)以形成scFv。
本文中的“单链Fv”或“scFv”意指通常使用如本文所讨论的scFv连接子来与可变轻结构域共价连接以形成scFv或scFv结构域的可变重结构域。scFv结构域可以从N端到C端处于任一朝向(vh-连接子-vl或vl-连接子-vh)。在序列表和附图所描绘的序列中，vh和vl结构域的顺序以名称指示，例如，H.X_L.Y意指N端到C端为vh-连接子-vl，并且L.Y_H.X为vl-连接子-vh。
如本文所使用的，“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”意指将一个IgG同种型的一个氨基酸转换为不同的比对的IgG同种型中的对应氨基酸的氨基酸修饰。例如，因为IgG1包括酪氨酸并且IgG2包括EU位置296处的苯基丙氨酸，因此IgG2的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。
如本文所使用的，“非天然发生修饰”意指不是同种型的氨基酸修饰。例如，因为人IgG均不包括位置434处的丝氨酸，因此IgG1、IgG2、IgG3或IgG4(或其杂交体)的取代434S被认为是非天然发生修饰。
如本文所使用的，“氨基酸”和“氨基酸同一性”意指由DNA和RNA编码的20个天然发生的氨基酸之一。
如本文所使用的，“效应子功能”意指造成抗体Fc区与FC受体或配体相互作用的生物化学事件。效应子功能包含但不限于ADCC、ADCP和CDC。
如本文所使用的，“IgG Fc配体”意指来自与IgG抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体络合物的任何生物体的分子，优选地是多肽。Fc配体包含但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒性FcγR。Fc配体还包含Fc受体同源物(FcRH)，所述Fc受体同源物是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人,2002,《免疫学评论(Immunological Reviews)》190:123-136，所述文献通过引用整体并入)。Fc配体可以包含与Fc结合的未发现的分子。特定的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。如本文所使用的，“Fc配体”意指来自与抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体络合物的任何生物体的分子，优选地是多肽。
如本文所使用的，“Fcγ受体”或“FcγR”或“FcgammaR”意指与IgG抗体Fc区结合并由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人类中，这个家族包含但不限于FcγRI(CD64)，包含同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，包含同种型FcγRIIa(包含同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，包含同种型FcγRIIIa(包含同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包含同种异型FcγRIIb-NA1和FcγRIIb-NA2)(Jefferis等人,2002,《免疫学快报(Immunol Lett)》82:57-65，所述文献通过引用整体并入)，以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包含但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包含但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)和FcγRIII-2(CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
如本文所使用的，“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指与IgG抗体Fc区结合并且至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包含但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域已知的，功能FcRn蛋白包括两种肽，通常被称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，并且重链由FcRn基因编码。除非本文另外指出，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的络合物。各种FcRn变体用于增加与FcRn受体的结合并且在一些情况下用于增加血清半衰期。“FcRn变体”是有助于增加与FcRn受体的结合的氨基酸修饰，并且下文中示出了适合的FcRn变体。
如本文所使用的，“亲本多肽”意指随后被修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽或天然存在的多肽的变体或工程化版本。因此，如本文所使用的，“亲本免疫球蛋白”意指被修饰以产生变体的未经修饰免疫球蛋白多肽，并且如本文所使用的，“亲本抗体”意指被修饰以产生变体抗体的未经修饰抗体。应注意，“亲本抗体”包含如下文概述的已知商业的重组产生抗体。在这个上下文中，“亲本Fc结构域”将是相对于所列举变体；因此，将“变体人IgG1 Fc结构域”与人IgG1的亲本Fc结构域相比较，将“变体人IgG4Fc结构域”与亲本Fc结构域人IgG4相比较等。
如本文所使用的，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指包括抗体的恒定区，在一些情况下不包含所有第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1)或其一部分，并且在一些情况下，任选地包含铰链的全部或一部分的多肽。对于IgG，Fc结构域包括免疫球蛋白结构域CH2和CH3(Cγ2和Cγ3)，以及任选地CH1(Cγ1)与CH2(Cγ2)之间的铰链区的全部或一部分。因此，在一些情况下，Fc结构域从N端到C端包含CH2-CH3和铰链-CH2-CH3。在一些实施例中，Fc结构域是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域，其中IgG1铰链-CH2-CH3和IgG4铰链-CH2-CH3特别用于许多实施例中。另外，在人IgG1 Fc结构域的情况下，铰链时常包含C220S氨基酸取代。此外，在人IgG4Fc结构域的情况下，铰链时常包含S228P氨基酸取代。尽管Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常被定义成在其羧基端包含残基E216、C226或A231，其中根据如Kabat中的EU索引进行编号。在一些实施例中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如改变与一种或多种FcγR或与FcRn的结合。
如本领域的技术人员将理解的，在不同的编号系统之间，重恒定区结构域的精确编号和放置可以有所不同。根据EU和Kabat的重恒定区编号的有用比较如下，参见Edelman等人,1969,《美国国家科学院院刊》63:78-85，以及Kabat等人,1991,《免疫学关注的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第5版,美国公共卫生署(United States Public Health Service),国立卫生研究院(National Institute ofHealth),贝塞斯达(Bethesda)，所述文献通过引用整体并入)。
表1
<u>EU编号</u> <u>Kabat编号</u>
CH1 118-215 114-223
铰链 216-230 226-243
CH2 231-340 244-360
CH3 341-447 361-478
如本文所使用的，“Fc变体”或“变体Fc”意指包括Fc结构域中的氨基酸修饰的蛋白质。修饰可以是添加、缺失或取代。Fc变体根据构成其的氨基酸修饰进行定义。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽具有位置434处的丝氨酸取代的Fc变体，其中编号是根据EU索引。同样地，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。WT氨基酸的同一性可能未指明，在此情况下，上述变体被称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，428L/434S是与434S/428L相同的Fc变体等。对于本文所讨论的涉及抗体或其衍生物和片段(例如，Fc结构域)的所有位置，除非另外指出，否则氨基酸位置编号是根据EU索引。“EU索引”或如Kabat或“EU编号”方案中的“EU索引”是指EU抗体的编号(Edelman等人,1969,《美国国家科学院院刊》63:78-85，所述文献特此通过引用整体并入)。修饰可以是添加、缺失或取代。
通常，变体Fc结构域与对应的亲本人IgG Fc结构域具有至少约80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一性(使用下文所讨论的同一性算法，其中一个实施例利用如本领域已知的BLAST算法，使用默认参数)。可替代地，与亲本Fc结构域相比，变体Fc结构域可以具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸修饰。可替代地，与亲本Fc结构域相比，变体Fc结构域可以具有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸修饰。另外，如本文所讨论的，本文中的变体Fc结构域仍然保持与另一个Fc结构域形成二聚体的能力，如使用本文所述已知技术如非变性凝胶电泳所测量的。
本文中的“重链恒定区”意指抗体(或其片段)的CH1-铰链-CH2-CH3部分，不包含可变重结构域；在人IgG1的EU编号中，这是氨基酸118到447。本文中的“重链恒定区片段”意指从N端和C端中的任一者或两者含有较少氨基酸但仍保持能够与另一个重链恒定区形成二聚体的重链恒定区。
如本文所使用的，“位置”意指蛋白质的序列中的位置。位置可以顺序地或根据已建立的形式进行编号，例如用于抗体结构域的编号的EU索引(例如，CH1、CH2、CH3或铰链结构域)。
如本文所使用的，“靶抗原”意指通过包括给定抗体的可变区的抗原结合结构域来特异性地结合的分子。如下文所讨论的，在此情况下，靶抗原是检查点抑制剂蛋白。
在本文中，在本发明的异源二聚体抗体的单体的上下文中，“链型(strandedness)”意指，类似于DNA的“相匹配”的两个链，异源二聚化变体结合到每个单体中以便保持“相匹配”以形成异源二聚体的能力。例如，如果一些pI变体被工程化成单体A(例如，使pI更高)，则也可以利用的“电荷对”的空间变体不干扰pI变体，例如使pI更高的电荷变体被放在同一个“链”或“单体”上以保持两种功能。类似地，对于如以下更全面地概述的以成对的组出现的“偏斜”变体，技术人员将认为pI决定所述对中的一组将会进入哪个链或单体，从而使得还使用偏斜变体的pI使pI分离最大化。
如本文所使用的，“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。
在本文中，在产生根据本发明的双特异性抗体的上下文中，“宿主细胞”意指含有对双特异性抗体的组分进行编码的外源性核酸并且能够在适合条件下表达双特异性抗体的细胞。下文中讨论了适合的宿主细胞。
如本文所使用的，“可变区”或“可变结构域”意指包括基本上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白基因基因座的任何Vκ、Vλ和/或VH基因编码的一个或多个Ig结构域并且含有赋予抗原特异性的CDR的免疫球蛋白的区域。因此，“可变重结构域”与“可变轻结构域”配对以形成抗原结合结构域(“ABD”)。另外，每个可变结构域包括从氨基末端到羧基末端按以下顺序布置的三个高变区(“互补决定区”、“CDR”)(可变重结构域的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3和可变轻结构域的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)和四个框架(FR)区：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
“野生型或WT”在本文中意指在自然界发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包含等位变异。WT蛋白质具有尚未被有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本文提供了与人抗体结构域具有序列同一性的多个抗体结构域(例如，Fc结构域)。两个类似序列之间的序列同一性(例如，抗体可变结构域)可以通过如以下的算法等算法测量：如Smith,T.F.和Waterman,M.S.(1981)“生物序列的比较(Comparison OfBiosequences)”,《应用数学进展(Adv.Appl.Math.)》2:482[局部同源算法]；Needleman,S.B.和Wunsch,CD.(1970)“可适用于搜索两种蛋白质的氨基酸序列中的类似性的一般方法(A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino AcidSequence Of Two Proteins)”,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》48:443[同源比对算法]，Pearson,W.R.和Lipman,D.J.(1988)“用于生物序列比较的改进的工具(Improved ToolsFor Biological Sequence Comparison)”,《美国国家科学院院刊》85:2444[相似度搜索法]；或Altschul,S.F.等人,(1990)“基础局部比对搜索工具(Basic Local AlignmentSearch Tool)”,《分子生物学杂志》215:403-10，“BLAST”算法，参见https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。在使用任何上述算法时，使用默认参数(针对窗口长度、空位罚分等)。在一个实施例中，使用默认参数用BLAST算法来完成序列同一性。
本发明的抗体通常是分离的或重组的。在用于描述本文所公开的各种多肽时，“分离的”意指已经从表达多肽的细胞或细胞培养物中鉴定并且分离和/或回收的多肽。通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体。“重组”意指在外源性宿主细胞中使用重组核酸技术产生抗体，并且也可以分离抗体。
“特异性结合”或“特异性地结合”或“特异于”特定抗原或表位意指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可以例如通过测定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，特异性结合可以通过与类似于靶标的对照分子竞争来测定。
特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过针对抗原或表位的KD为以下的抗体来表现：至少约10-4M、至少约10-5M、至少约10-6M、至少约10-7M、至少约10-8M、至少约10-9M、可替代地至少约10-10M、至少约10-11M、至少约10-12M或更大，其中KD是指特定的抗体-抗原相互作用的解离速率。典型地，与抗原特异性地结合的抗体的KD是对照分子相对于抗原或表位的KD的20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
而且，特定抗原或表位的特异性结合可以例如通过针对抗原或表位的KA或Ka为以下的抗体来表现：针对相对于对照物的表位大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。结合亲和力通常使用Biacore、SPR或BLI测定来测量。
IV.FAP抗原结合结构域
在一方面，本文提供了FAP抗原结合结构域(ABD)和包含此类FAP抗原结合结构域(ABD)的组合物。本文提供的FAP结合结构域表现出对FAP的广泛程度的亲和力(参见例如，图45-49)。包含此类FAP结合结构域的本发明抗体(例如，FAP x CD3双特异性抗体)有利地引发一系列不同的免疫应答，这取决于此类抗体中包含的特定FAP结合结构域和结合结构域的数量。例如，本发明抗体在对具有不同FAP表达的细胞的选择性、对于FAP表达性细胞的效力、引发细胞因子释放的能力以及对可溶性FAP的敏感性方面表现出差异(参见例如，实例6-8)。此类FAP结合结构域和相关的抗体可用于例如治疗FAP相关癌症。
如本领域的技术人员将理解的，适合的FAP结合结构域可以包括如在序列表和附图中所描绘的或如其被加下划线的一组6个CDR，或在如本文所述并且如表2中所示的使用不同编号方案的情况下，使用在图14和45以及序列表中所描绘的那些序列的可变重(VH)链结构域和可变轻结构域(VL)序列内的其它比对鉴定的CDR。适合的FAP ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个VH和VL序列。
在一个实施例中，FAP抗原结合结构域包含图13-15、45、51或62或序列表中所述的任何FAP结合结构域的6个CDR(即，vhCDR1-3和vlCDR1-3)。
除了在附图和序列表中所公开的形成ABD到FAP的亲本CDR组之外，本文提供了具有包含本文公开的FAP ABD CDR的至少一个修饰的CDR的变体FAP ABDS(例如，图13-15、45、51或62或序列表)。在一个实施例中，与如在图13-15、45、51或62或序列表中所描绘的FAPABD的6个CDR相比，FAP ABD包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个氨基酸修饰的一组6个CDR。在某些实施例中，FAP ABD能够结合FAP抗原，如通过Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量法，例如Octet测定)测定中的至少一种测定所测量的，其中后者特别用于许多实施例中。
在一个实施例中，FAP ABD包含与如在图13-15、45、51或62或序列表中所描绘的FAP ABD的6个CDR至少90％、95％、97％、98％或99％相同的6个CDR。在某些实施例中，FAPABD能够与FAP结合，如通过Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量法，例如，Octet测定)测定中的至少一种测定所测量的，其中后者特别用于许多实施例中。
在一个实施例中，FAP抗原结合结构域包含FAP ABD的6个CDR(即，vhCDR1-3和vlCDR1-3)，其中所述FAP ABD是以下FAP ABD之一：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAPH0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAPH0.26_L0.11)；XENP27969(aFAP H0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
在一个实施例中，FAP抗原结合结构域是包含6个CDR(即，vhCDR1-3和vlCDR1-3)的变体FAP抗原结合结构域，其中与以下FAP ABD之一的6个CDR相比，所述6个CDR包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个修饰：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAPH0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAPH0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
在一个实施例中，FAP抗原结合结构域是包含6个CDR(即，vhCDR1-3和vlCDR1-3)的变体FAP抗原结合结构域，其中与以下FAP ABD之一的6个CDR相比，所述6个CDR至少90％、95％、97％、98％或99％相同：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAPH0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAPH0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
在另一个示例性实施例中，FAP ABD包含图13-15、45、51或62或序列表中公开的FAP ABD中的任一个的可变重(VH)结构域和可变轻(VL)结构域。
除了本文公开的亲本FAP可变重和可变轻结构域之外，本文提供了包含可变重结构域和/或可变轻结构域的FAP ABD，所述可变重结构域和/或可变轻结构域是本文公开的FAP ABD VH和VL结构域的变体。在一个实施例中，变体VH结构域和/或VL结构域与图13-15、45、51或62或序列表中所描绘的FAP ABD的VH和/或VL结构域相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化。在某些实施例中，FAP ABD能够与FAP结合，如Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量法，例如，Octet测定)测定中的至少一种测定所测量的，其中后者特别用于许多实施例中。
在一个实施例中，变体VH和/或VL结构域与如图13-15、45、51或62或序列表中所描绘的FAP ABD的VH和/或VL至少90％、95％、97％、98％或99％相同。在某些实施例中，FAPABD能够与FAP结合，如通过Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量法，例如，Octet测定)测定中的至少一种测定所测量的，其中后者特别用于许多实施例中。
在一些实施例中，FAP ABD包含以下FAP ABD之一的VH和VL：1A4A5 H1_L1；1C3A5H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAPH0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAP H0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
在一些实施例中，FAP ABD包含VH和VL，其中与本文公开的以下FAP ABD之一的VH和/或VL相比，所述VH和/或VL包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸修饰：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAPH0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
在某些实施例中，FAP ABD包含VH和VL，其中与本文公开的以下FAP ABD之一的VH和VL相比，所述VH和所述VL至少90％、95％、97％、98％或99％相同：1A4A5 H1_L1；1C3A5H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAPH0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAP H0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
V.抗FAP抗体
在一方面，本文提供了与FAP结合的抗体(例如，抗FAP抗体)。在某些实施例中，所述抗体与人FAP结合(图2)。本发明抗FAP抗体包含单特异性FAP抗体，以及多特异性(例如，双特异性)抗FAP抗体。在某些实施例中，抗FAP抗体具有根据图1中所描绘的抗体形式中的任一种抗体形式的形式。
在一些实施例中，本发明组合物包含FAP结合结构域。在一些实施例中，组合物包含具有FAP结合结构域的抗体。本文提供的抗体包含一个、两个、三个、四个和五个或更多个FAP结合结构域。在某些实施例中，FAP结合结构域包含选自图13-15、45、51和62中所描绘的那些的FAP结合结构域的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列中的任一个序列。在一些实施例中，FAP结合结构域包含选自图13-15、45、51和62中所描绘的那些的FAP结合结构域的加下划线的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列。在一些实施例中，FAP结合结构域包含选自图13-15、45、51和62中所描绘的那些的FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域。图13-15、45、51和62中所描绘的FAP结合结构域包含1A4A5H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAPH0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAPH0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAP H0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)。
在一些实施例中，所述抗体是与FAP和CD3结合的双特异性抗体。此类抗体包含CD3结合结构域和至少一个FAP结合结构域。任何适合的FAP结合结构域可以包含在抗FAP X抗CD3双特异性抗体中。在一些实施例中，抗FAP X抗CD3双特异性抗体包含一个、两个、三个、四个或更多个FAP结合结构域，包含但不限于图13-15、45、51和62中描述的FAP结合结构域。在某些实施例中，抗FAP X抗CD3抗体包含FAP结合结构域，所述FAP结合结构域包含选自由图13-15、45、51和62中所描绘的FAP结合结构域组成的组的FAP结合结构域的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列。在一些实施例中，抗FAP X抗CD3抗体包含FAP结合结构域，所述FAP结合结构域包含选自图13-15、45、51和62中所描绘的FAP结合结构域的FAP结合结构域的加下划线的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列。在一些实施例中，抗FAP X抗CD3抗体包含FAP结合结构域，所述FAP结合结构域包含选自图13-15、45、51和62中所描绘的FAP结合结构域的FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域。
本文提供的抗FAP x抗CD3抗体可以包含任何适合的CD3结合结构域。在某些实施例中，抗FAP X抗CD3抗体包含CD3结合结构域，所述CD3结合结构域包含选自由图14和15中所描绘的CD3结合结构域组成的组的CD3结合结构域的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列。在一些实施例中，抗FAP X抗CD3抗体包含CD3结合结构域，所述CD3结合结构域包含选自由图14和15中所描绘的CD3结合结构域组成的组的CD3结合结构域的加下划线的vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3序列。在一些实施例中，FAP XCD3抗体包含CD3结合结构域，所述CD3结合结构域包含选自由图12中所描绘的CD3结合结构域组成的组的CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域。在一些实施例中，CD3结合结构域选自抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47；抗CD3 H1.89_L1.48；抗CD3 H1.90_L1.47；抗CD3 H1.33_L1.47；和抗CD3 H1.31_L1.47。
如本文所使用的，通常使用术语“抗体”。用于本发明的抗体可以采取如本文所述的多种形式，包含本文所述的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。
传统抗体结构单位通常包括四聚体。每种四聚体通常由相同的两对多肽链构成，每对具有一个“轻”链(通常，分子量为约25kDa)和一个“重”链(通常，分子量为约50-70kDa)。人轻链被分类为κ和λ轻链。本发明涉及IgG类，所述IgG类具有若干个亚类，包含但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。应注意，IgG1具有在356(D或E)和358(L或M)处具有多态性的不同的同种异型。本文所描绘的序列使用356D/358M同种异型，然而其它同种异型也包含在本文中。也就是说，包含本文所包含的IgG1 Fc结构域的任何序列可以具有代替356D/358M同种异型的356E/358L。
在本文中许多抗体具有被丝氨酸代替的在根据EU编码(铰链区)的位置220处的至少一个半胱氨酸。通常，这种修饰在本文所描绘的大多数序列的“scFv单体”侧上，但是其也可以是在“Fab单体”侧上或在两者上以减少二硫化物形成。在本文中，被代替的这些半胱氨酸(C220S)中的一个或两个特异性地包含在序列中。
因此，如本文所使用的，“同种型”意指免疫球蛋白的由其恒定区的化学和抗原特性定义的任何亚类。应理解，治疗性抗体还可以包括同种型和/或亚类的杂交体。例如，如通过引用并入的美国公开2009/0163699所示，本发明包含使用人IgG1/G2杂交体。
高变区通常涵盖从轻链可变区中的约氨基酸残基24-34(LCDR1；“L”表示轻链)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)的氨基酸残基和在重链可变区中的约31-35B(HCDR1；“H”表示重链)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)周围的氨基酸残基；Kabat等人,《免疫学关注的蛋白质的序列》,第5版,公共卫生署,国立卫生研究院,贝塞斯达,马里兰州(1991)和/或形成高变环的那些残基(例如，在轻链可变区中的残基26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)以及在重链可变区中的26-32(HCDR1)、53-55(HCDR2)和96-101(HCDR3)；Chothia和Lesk(1987)《分子生物学杂志》196:901-917。下文中描述了本发明的特异性CDR。
如本领域的技术人员将理解的，在不同的编号系统中，CDR的精确编号和放置可以有所不同。然而，应理解，可变重和/或可变轻序列的公开内容包含相关(固有)CDR的公开内容。因此，每个可变重区的公开内容是vhCDR的公开内容(例如，vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)，并且每个可变轻区的公开内容是vlCDR的公开内容(例如，vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)。CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人,《发展与比较免疫学(Dev.Comp.Immunol.)》27(1):55-77(2003)：
表2
Figure BDA0002762852890000601
Figure BDA0002762852890000611
贯穿本说明书，在提及可变结构域中的残基(大致上，轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时通常使用Kabat编号系统，并且EU编号系统用于Fc区(例如，Kabat等人,同上(1991))。
重链的另一种类型的Ig结构域是铰链区。在本文中，“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“铰链结构域”意指包括抗体的第一恒定结构域与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置215处结束，并且IgG CH2结构域开始于残基EU位置231。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中被定义为包含位置216(IgG1中的E216)到230(IgG1中的p230)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些情况下，使用“铰链片段”，所述铰链片段在铰链结构域的N端和C端中的任一者或两者处含有较少氨基酸。如本文所述，pI变体也可以处于铰链区中。
轻链通常包括两个结构域：可变轻结构域(含有轻链CDR并且与可变重结构域一起形成Fv区)，以及恒定轻链区(通常称为CL或Cκ)。
下文概述的用于另外的取代的另一个所关注区是Fc区。
本文提供的抗原结合结构域和抗体包含大量不同的CDR组。在这种情况下，“完整的CDR组”包括三个可变轻和三个可变重CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些分别可以是较大的可变轻结构域或可变重结构域的一部分。另外，如本文中更全面地概述的，在使用重链和轻链时(例如，在使用Fab时)，可变重结构域和可变轻结构域可以在单独的多肽链上，或在scFv序列的情况下在单个多肽链上。
CDR有助于抗原结合或更具体地抗体的表位结合位点的形成。“表位”是指与被称为互补位的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的决定簇。表位是如氨基酸或糖侧链等分子的基团(grouping)并且通常具有特定的结构特性以及特定的电荷特性。单个抗原可以具有多于一个表位。
表位可以包括直接涉及结合的氨基酸残基(还被称为表位的免疫显性组分)以及不直接涉及结合的其它氨基酸残基，如被特异性地抗原结合肽有效地阻断的氨基酸残基；换而言之，氨基酸残基在特异性地抗原结合肽的覆盖区范围(footprint)内。
表位可以是构象的或线性的。构象表位是由来自线性多肽链的不同区段的空间并列的氨基酸产生。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象表位与非构象表位的区别可以在于，在变性溶剂的存在下，与前者而非后者的结合丧失。
在独特的空间构象中，表位典型地包含至少3个并且更通常至少5个或8-10个氨基酸。识别同一表位的抗体可以用简单的免疫测定来验证，所述免疫测定示出了一个抗体阻断另一个抗体与靶抗原结合的能力，例如“分箱(binning)”。如下文概述的，本发明不仅包含本文所枚举的抗原结合结构域和抗体，还包含竞争与所枚举的抗原结合结构域结合的表位结合的抗原结合结构域和抗体。
因此，本文提供的抗原结合结构域和抗体包含不同的抗体结构域。如本文所述以及本领域已知的，本发明的异源二聚体抗体包括重链和轻链内的不同结构域，所述结构域也可以重叠。这些结构域包含但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、可变重结构域、可变轻结构域、轻恒定结构域、Fab结构域和scFv结构域。
因此，“Fc结构域”包含-CH2-CH3结构域以及任选地铰链结构域(-铰链-CH2-CH3)。在本文的实施例中，在scFv与Fc结构域连接时，scFv构建体的C端通过连接子(例如，铰链、部分铰链或图7中包含的任何“有用的结构域连接子”)与Fc结构域连接。重链包括可变重结构域和恒定结构域，所述恒定结构域包含包括CH2-CH3的CH1-任选的铰链-Fc结构域。轻链包括可变轻链和轻恒定结构域。scFv包括可变重链、scFv连接子和可变轻结构域。在本文概述的scFv的一些实施例中，scFv可变重链的C端与scFv连接子的N端连接，所述连接子的C端与scFv可变轻链的N端(N-VH-连接子-VL-C)连接。在本文提供的scFv的其它实施例中，scFv可变轻链的C端与scFv连接子的N端连接，所述连接子的C端与scFv可变重链的N端(N-VL-连接子-VH-C)连接。
本文提供的本发明抗体的一些实施例包括至少一个scFv结构域，所述至少一个scFv结构域虽然不是天然发生的但是通常包含通过scFv连接子连接在一起的可变重结构域和可变轻结构域。如本文概述的，虽然scFv结构域通常从N端到C端朝向成VH-scFv连接子-VL，但是对于任何scFv结构域(或使用来自Fab的vh和vl序列构建的那些)，这可以颠倒成VL-scFv连接子-VH，其中在一端或两端处的任选连接子取决于形式(通常参见图1)。
如本文所示，存在可以用于共价连接所列举结构域(例如，scFv、Fab、Fc结构域等)的多个适合的连接子(用于用作结构域连接子或scFv连接子)，包含通过重组技术产生的传统肽键。图7中描绘了使本发明抗体的结构域彼此连接的示例性连接子。在一些实施例中，连接子肽可以主要包含以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。连接子肽的长度应当足以以此方式连接两个分子，以便其相对于彼此呈现正确的构象，以便其保留期望活性。在一个实施例中，连接子的长度为约1个到50个氨基酸，优选地长度为约1个到30个氨基酸。在一个实施例中，可以使用长度为1个到20个氨基酸的连接子，在一些实施例中使用约5个到约10个氨基酸。有用的连接子包含甘氨酸-丝氨酸聚合物(包含例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为一(并且通常为3到4)的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其它柔性连接子。可替代地，各种非蛋白质聚合物可以用作连接子，包含但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
其它连接子序列可以包含CL/CH1结构域的任何长度的任何序列，但不包含CL/CH1结构域的所有残基；例如，CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。连接子可以源自免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。连接子可以源自任何同种型的免疫球蛋白重链，包含例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。连接子序列还可以源自其它蛋白质，如Ig样蛋白(例如，TCR、FcR、KIR)、铰链区来源的序列以及来自其它蛋白质的其它天然序列。
在一些实施例中，连接子是“结构域连接子”，用于将如本文概述的任何两个结构域连接在一起。例如，在图1F中，可以存在将Fab的CH1结构域的C端与scFv的N端连接的结构域连接子，其中另一个任选的结构域连接子将scFv的C端与CH2结构域连接(但是在许多实施例中，铰链用作此结构域连接子)。虽然可以使用任何适合的连接子，许多实施例利用甘氨酸-丝氨酸聚合物作为结构域连接子，包含例如(GS)n、(GSGGS)n、(GGGGS)n和(GGGS)n，其中n是至少为一(并且通常3到4到5)的整数，以及允许两个结构域的重组连接并且具有足够长度和柔性以使得每个结构域保留其生物功能的任何肽序列。在一些情况下并且在注意如下文所概述的“链型”的情况下，可以使用如scFv连接子的一些实施例中所使用的带电结构域连接子。
在一些实施例中，连接子是用于共价连接如本文所讨论的VH和VL结构域的scFv连接子。在许多情况下，scFv连接子是带电scFv连接子，多个所述带电scFv连接子示出在图7中。因此，本文提供了带电scFv连接子以用于促进第一单体与第二单体之间的pI分离。也就是说，通过并入带正电或负电(或在使用不同单体上的scFv的支架的情况下两者皆有)的带电scFv连接子，这允许包括带电连接子的单体更改pI而不对Fc结构域做出进一步改变。这些带电连接子可以被取代到含有标准连接子的任何scFv中。再次，如本领域的技术人员将理解的，根据期望的pI变化，带电scFv连接子用在正确的“链”或单体上。例如，如本文所讨论的，为了形成1+1Fab-scFv-Fc形式的异源二聚体抗体，计算每个期望抗原结合结构域的Fv区的原始pI，并且一个被选择成形成scFv，并且根据pI，选择正或负连接子。
带电结构域连接子还可以用于增加本发明的单体的pI分离，并且因此图7中所包含的那些在本文中可以用于利用连接子的任何实施例中。
具体地，图1所描绘的形式是抗体，通常被称为“异源二聚体抗体”，意指蛋白质具有自组装成异源二聚体Fc结构域中的至少两个相关Fc序列以及至少两个Fv区，无论是作为Fab还是作为scFv。
A.嵌合和人源化抗体
在某些实施例中，本文提供的本发明抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类抗体可以包括人类抗体或由其组成，所述人类抗体包括作为特定种系序列的“产物”或“源自”特定种系序列的重链或轻链可变区。作为人类种系免疫球蛋白序列“的产物”或“源自”人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体可以如此鉴定：通过将人类抗体的氨基酸序列与人类种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并且选择与人类抗体的序列在序列方面最接近(即，最大同一性％)的人类种系免疫球蛋白序列(使用本文概述的方法)。作为特定人类种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”特定人类种系免疫球蛋白序列的人类抗体与种系序列相比，可能由于例如天然发生的体细胞突变或故意引入的定点突变而含有氨基酸差异。然而，人源化抗体通常与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上具有至少90％相同，并且在与其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠种系序列)进行比较时，含有将抗体鉴定为源自人类序列的氨基酸残基。在某些情况下，人源化抗体可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上至少95％、96％、97％、98％或99％，或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。通常，源自特定人类种系序列的人源化抗体将显示出与由人类种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于10-20个氨基酸差异(在引入本文中的任何偏斜变体、pI变体和烧蚀变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体的数量通常较低)。在某些情况下，人源化抗体可以显示出与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于5个或甚至不多于4个、3个、2个或1个氨基酸差异(再次，在引入本文中的任何偏斜变体、pI变体和烧蚀变体之前；即，在引入本发明的变体之前，变体数量
在一个实施例中，亲本抗体已经亲和力成熟，如本领域已知的。可以利用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟，例如如USSN 11/004,590中所述。基于选择的方法可以用于人类化和/或亲和力成熟抗体可变区，包含但不限于以下文献中所述的方法：Wu等人,1999,《分子生物学杂志》294:151-162；Baca等人,1997,《生物化学杂志》272(16):10678-10684；Rosok等人,1996,《生物化学杂志》271(37):22611-22618；Rader等人,1998,《美国国家科学院院刊》95:8910-8915；Krauss等人,2003,《蛋白质工程》16(10):753-759，所有所述文献均通过引用整体并入。其它人源化方法可以涉及仅移植部分CDR，包括但不限于以下文献中所述的方法：USSN 09/810,510；Tan等人,2002,《免疫学杂志》169:1119-1125；DePascalis等人,2002,《免疫学杂志》169:3076-3084，所有所述文献都以引用的方式整体并入本文中。
B.异源二聚体抗体
本文提供了包含两个变体Fc结构域序列的异源二聚体抗体。此类变体Fc结构域包含氨基酸修饰以促进异源二聚体抗体的自组装和/或纯化。
在一些实施例中，异源二聚体抗体是包含FAP结合结构域的双特异性(即，与两种不同抗原结合)抗体。在一些实施例中，异源二聚体双特异性抗体是抗FAP x抗CD3双特异性抗体。
抗体技术中正存在的一个问题是期望“双特异性”抗体同时与两种不同抗原结合，通常由此允许不同抗原接近且从而产生新功能和新疗法。通常，这些抗体是通过将每条重链和轻链的基因纳入宿主细胞中来产生。这通常导致期望的异源二聚体(A-B)以及两个同源二聚体(A-A和B-B(不包含轻链异源二聚体问题))形成。然而，形成双特异性抗体的主要障碍是难以使期望异源二聚体抗体的形成偏向于同源二聚体的形成和/或难以从同源二聚体抗体中纯化异源二聚体抗体。
存在多种机制可以用于产生本发明异源二聚体抗体。另外，如本领域的技术人员将理解的，这些不同的机制可以组合以确保高异源二聚化。促进异源二聚体的产生和纯化的氨基酸修饰通常统称为“异源二聚化变体。”如下文所讨论的，异源二聚化变体可以包含“偏斜”变体(例如，下文所述“隆凸与孔”和“电荷对”变体)以及“pI变体”，这允许从同源二聚体纯化异源二聚体。如在美国专利第US 9,605,084号中一般性描述的(特此通过引用整体并入并且具体地如下对于异源二聚化变体的讨论)，用于异源二聚化的有用机制包含如在美国专利第US 9,605,084号中所述的“隆凸与孔”(“KIH”)、如在美国专利第US 9,605,084号中所述的“静电转向”或“电荷对”、如在美国专利第US 9,605,084号中所述的pI变体以及如在美国专利第US 9,605,084号和下文概述的一般性的另外的Fc变体。
可用于形成和纯化本发明异源二聚体抗体(例如，双特异性抗体)的异源二聚化变体在下文进一步详细讨论。
1.偏斜变体
在一些实施例中，异源二聚体抗FAP抗体包含偏斜变体，所述偏斜变体是在第一Fc结构域(A)和/或第二Fc结构域(B)中的一个或多个氨基酸修饰，所述一个或多个氨基酸修饰有利于形成Fc异源二聚体(包含第一Fc结构域和第二Fc结构域的Fc二聚体)；(A-B)超过Fc同源二聚体(包含第一Fc结构域中的两个或第二Fc结构域中的两个的Fc二聚体；A-A或B-B)。适合的偏斜变体包含在美国公开申请第2016/0355608的图29以及图3和6中，所述美国公开申请特此通过引用整体并且具体地针对其偏斜变体的公开内容并入。
一种特定类型的偏斜变体在本领域中通常被称为“隆凸与孔”，是指产生空间影响以有利于异源二聚体形成并且不利于同源二聚体形成的氨基酸工程化，如在USSN 61/596,846；Ridgway等人,《蛋白质工程化》9(7):617(1996)；Atwell等人,《分子生物学杂志》1997270:26；美国专利第8,216,805号中所述，所有所述文献通过引用整体并且具体地针对“隆凸与孔”突变的公开内容并入。这在本文中有时被称为“空间变体”。附图鉴定了依赖于“隆凸与孔”的多个“单体A-单体B”对。另外，如在Merchant等人,《自然生物科技(NatureBiotech.)》16:677(1998)中所述，这些“隆凸与孔”突变可以与二硫键组合以进一步有利于形成Fc异源二聚体。
用于生成异源二聚体的另一种方法有时被称为“静电转向”，如特此通过引用整体并入的Gunasekaran等人,《生物化学杂志》285(25):19637(2010)所述。这在本文中有时被称作“电荷对”。在此实施例中，静电用于使形成偏向异源二聚化。如本领域的技术人员将理解的，这些电荷对还可能影响pI并因此对影响纯化，并且因此在一些情况下还可以被视为pI变体。然而，由于这些电荷对被生成以迫使进行异源二聚化并且不用作纯化工具，因此其被分类为“偏斜变体”。这些电荷包含但不限于与D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E(例如，这些是“单体对应组”)和与C220R/E224R/P228R/K409R配对的C220E/P228E/368E。
在一些实施例中，所述偏斜变体有利地并且同时地有利于基于“隆凸和孔”机制和“静电转向”机制两者的异源二聚化。在一些实施例中，异源二聚体抗FAP抗体包含一组或多组此类异源二聚化偏斜变体。这些变体以成“对”“组”方式出现。也就是说，将一组对结合到第一单体中且将另一组对结合到第二单体中。应注意，这些组不一定表现为“隆凸入孔”变体，其中在一个单体上的残基与另一个单体上的残基之间存在一一对应。也就是说，这些对组反而可以形成两个单体之间的界面，所述界面鼓励异源二聚体形成并且不鼓励同源二聚体形成，从而允许在生物学条件下自发形成的异源二聚体的百分比超过90％，而非预期的50％(25％同源二聚体A/A:50％异源二聚体A/B:25％同源二聚体B/B)。图4中描绘了示例性异源二聚化“偏斜”变体。
在示例性实施例中，异源二聚体抗FAP抗体包含S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q；或T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥接二硫化物，T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)“偏斜”变体氨基酸取代组。在示例性实施例中，异源二聚体抗FAP抗体包含“S364K/E357Q:L368D/K370S”氨基酸取代组。就命名法而言，所述对“S364K/E357Q:L368D/K370S”意指单体之一包含包括氨基酸取代S364K和E357Q的Fc结构域，并且另一单体包含包括氨基酸取代L368D和K370S的Fc结构域；如上，这些“链型”对取决于起始pI。
在一些实施例中，本文提供的偏斜变体可以任选地并且独立地与任何其它修饰——包含但不限于其它偏斜变体(参见例如，美国公开申请第2012/0149876号的图37中，所述美国公开申请通过引用并入本文，特别是出于其对偏斜变体的公开的原因而并入)、pI变体、同种型变体、FcRn变体、烧蚀变体等——一起结合到异源二聚体抗FAP抗体的第一Fc结构域和第二Fc结构域中的一者或两者中。进一步地，个体修饰也可以独立地并且任选地包含或不包含在本发明异源二聚体抗FAP抗体中。
在一些实施例中，本文概述的偏斜变体可以任选且独立地与任何pI变体(或其它变体，如Fc变体、FcRn变体等)一起结合到一个或两个重链单体中，并且可以独立地且任选地包含或不包含在本发明异源二聚体抗体中。
2.异源二聚体的pI(等电点)
在一些实施例中，异源二聚体抗FAP抗体包含有利地允许从同源二聚体蛋白质分离异源二聚体抗FAP抗体的纯化变体。
存在若干种基本机制可以导致易于纯化异源二聚化抗体。例如，对抗体重链单体A和B中的一者或两者的修饰，使得每个单体具有不同的pI，允许从单体A-A和B-B蛋白等电纯化异源二聚体A-B抗体。可替代地，一些支架形式，如“1+1Fab-scFv-Fc”和“2+1Fab2-scFv-Fc”形式，也允许基于大小进行分离。如本文所述，还可能使用偏斜变体，相对于同源二聚体“偏斜”异源二聚体的形成。因此，异源二聚化偏斜变体和pI变体的组合特别用于本文提供的异源二聚体抗体中。
另外，如下文更全面地概述的，根据异源二聚体抗体的形式，可以使用包含在单体的恒定区和/或Fc结构域内的pI变体和/或结构域连接子。在一些实施例中，异源二聚体抗体包含对于还可以产生pI变化的替代性功能的另外的修饰，如Fc、FcRn和KO变体。
在一些实施例中，本文提供的本发明异源二聚体抗体包含至少一个单体，所述至少一个单体具有改变单体的pI的一个或多个修饰(即，“pI变体”)。通常，如本领域的技术人员将理解的，pI变体存在两种通用类别：提高蛋白质pI(碱性变化)的变体和降低蛋白质pI(酸性变化)的变体。如本文所述，可以实现这些变体的所有组合：一个单体可以是野生型，或pI与野生型无显著差异的变体；并且另一个单体可以更具碱性或更具酸性。可替代地，改变每种单体，一种具有更强碱性且一种具有更强酸性。
根据异源二聚体抗体的形式，pI变体可以包含在单体的恒定和/或Fc结构域内，或者可以使用带电连接子，结构域连接子或scFv连接子。也就是说，利用如“1+1Fab-scFv-Fc”等一个或多个scFv的抗体形式可以包含出于纯化目的给出另外的pI助推的带电scFv连接子(带正电或负电)。如本领域的技术人员将理解的，一些1+1Fab-scFv-Fc形式可与仅带电scFv连接子一起使用而无另外的pI调整，但是本发明还提供了在单体中的一个或两个上的pI变体和/或带电结构域连接子。另外，用于替代性功能的另外的氨基酸工程化也可以赋予pI变化，如Fc、FcRn和KO变体。
在将pI用作分离机制以允许纯化异源二聚体蛋白的本发明异源二聚体抗体中，将氨基酸变体引入到单体多肽中的一个或两个单体多肽中。也就是说，所述单体之一(为了简单起见，在本文中被称为“单体A”)的pI可以被工程化为远离单体B，或单体A和单体B两者均可以随着单体A的pI增加和单体B的pI降低而改变。如下文更全面地概述的，任一个或两个单体的pI变化可以通过以下来完成：去除或添加带电残基(例如，用带正电或带负电的氨基酸残基来代替中性氨基酸，例如甘氨酸到谷氨酸)、将带电残基从带正电或带负电改变为相反电荷(例如，天冬氨酸到赖氨酸)或将带电残基改变为中性残基(例如，电荷损失；赖氨酸到丝氨酸)。图3和4中示出了多种这些变体。
因此，在一些实施例中，本发明异源二聚体抗体包含在恒定区中的氨基酸修饰，所述氨基酸修饰通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)结合到单体中的一个或两个中来更改二聚体蛋白的单体中的至少一个(如果不是两个)的等电点(pI)以形成“pI抗体”。如本文所示，如果两个单体的pI相差小到0.1个pH单位(0.2、0.3、0.4和0.5或更大pH单位都能适用于本发明中)，那么可以实现异源二聚体与两种同源二聚体的分离。
如本领域的技术人员将理解的，每个或两个单体上要包含的用于得到良好分离的pI变体的数量将部分地取决于组分的起始pI，例如在1+1Fab-scFv-Fc形式中，所关注scFv和Fab的起始pI。即，为了确定对哪个单体进行工程化或处于哪个“方向”(例如，更具阳性或更具阴性)，计算这两种靶抗原的Fv序列并据此作出决定。如本领域已知的，不同的Fv将具有用于本发明中的不同起始pI。通常，如本文概述的，pI经工程化而使得每种单体的总pI差异达到至少约0.1log，如本文概述的优选0.2到0.5。
在pI变体用于实现异源二聚化的情况下，通过使用一个或多个重链的一个或多个恒定区，提供了用于设计和纯化双特异性蛋白质(包含抗体)的更模块化方法。因此，在一些实施例中，异源二聚化变体(包含偏斜和pI异源二聚化变体)并不包含在可变区中，使得每个单独的抗体必须工程化。另外，在一些实施例中，通过导入来自不同IgG同种型的pI变体以便在不引入显著免疫原性的情况下改变pI来显著降低pI变体导致免疫原性的可能性。因此，待解决的另一个问题是阐明具有高人类序列含量的低pI恒定结构域，例如最小化或避免任何特定位置的非人类残基。可替代地或除了同种型取代之外，通过利用电子等排取代(例如，Asn到Asp；以及Gln到Glu)显著降低由pI变体产生的免疫原性的可能性。
这种pI工程化可以得到的额外益处也是血清半衰期延长和FcRn结合增加。也就是说，如在美国公开申请第US 2012/0028304号(通过引用整体并入)中所述，降低抗体恒定结构域(包含在抗体和Fc融合中找到的那些)的pI可能导致血清保留在体内更长时间。具有增加的血清半衰期的这些pI变体也促进了pI变化以进行纯化。
另外，应注意，pI变体给予了双特异性抗体的分析和质量控制过程另外益处，因为在同源二聚体存在时消除、最小化和区分的能力是显著的。类似地，可靠地测试异源二聚体抗体产生的再现性的能力是重要的。
通常，特定用途的实施例依赖于包含偏斜变体的变体组，相比于同源二聚体化形成，所述偏斜变体与pI变体结合促成异源二聚化形成，所述pI变体增加两个单体之间的pI差异以促进将异源二聚体从同源二聚体中纯化出来。
pI变体的示例性组合示出于美国公开申请第2016/0355608号中的图4和5以及图30中，所有所述文献通过引用整体并入本文，特别是针对pI变体的公开内容并入。图3和4中示出了pI变体的优选组合。如本文所概述且如图中所示，这些变化是相对于IgG1展示，而且所有同型以及同型杂合体均可以按此方式改变。在重链恒定结构域是来自IgG2-4的情况下，还可以使用R133E和R133Q。
在一个实施例中，例如在图1A、E、F、G、H和I形式中，pI变体的优选组合具有包括208D/295E/384D/418E/421D变体(在相对于人IgG1时是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)的一个单体(负Fab侧)和包括带正电的scFv连接子的第二单体(正scFv侧)，包含(GKPGS)4(SEQ ID NO:XX)。然而，如本领域的技术人员将理解的，第一单体包含CH1结构域，其包含位置208。因此，在不包含CH1结构域的构建体(例如，针对不在所述结构域之一上利用CH1结构域的抗体，例如以双scFv形式或“单臂”形式，如图1B、C或D所描绘的形式)中，优选的负pI变体Fc组包含295E/384D/418E/421D变体(在相对于人IgG1时是Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
因此，在一些实施例中，一个单体具有来自图4的一组取代并且另一个单体具有带电连接子(呈带电scFv连接子的形式，因为所述单体包括如形式所指示的scFv或带电结构域连接子，所述带电结构域连接子可以选自图7中所描绘的那些)。
在一些实施例中，在Fc结构域的铰链中进行修饰，包含基于EU编号的位置216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229和230。因此，pI突变和特别是取代可以在位置216-230中的一个或多个位置中进行，其中可使用1个、2个、3个、4个或5个突变。同样，单独或与其它结构域中的其它pI变体一起考虑所有可能的组合。
可用于降低铰链结构域的pI的特定取代包括但不限于位置221处的缺失、位置222处的非天然缬氨酸或苏氨酸、位置223处的缺失、位置224处的非天然谷氨酸、位置225处的缺失、位置235处的缺失和位置236处的缺失或非天然丙氨酸。在一些情况下，仅在铰链结构域中进行pI取代，并且在其它情况下，这些取代以任何组合添加到其它结构域中的其它pI变体。
在一些实施例中，可以在CH2区中进行突变，包含基于EU编号的位置233、234、235、236、274、296、300、309、320、322、326、327、334和339。应该注意，可以进行233-236的改变以增加IgG2主链中的效应功能(以及327A)。再次，可以对这14个位置进行所有可能的组合；例如，IL-7-Fc融合蛋白可以包含具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个CH2 pI取代的变体Fc结构域。
可用于降低CH2结构域的pI的特定取代包含但不限于位置274处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置296处的非天然苯基丙氨酸、位置300处的非天然苯基丙氨酸、位置309处的非天然缬氨酸、位置320处的非天然谷氨酸、位置322处的非天然谷氨酸、位置326处的非天然谷氨酸、位置327处的非天然甘氨酸、位置334处的非天然谷氨酸、位置339处的非天然苏氨酸以及CH2内和与其它结构域的所有可能的组合。
在此实施例中，修饰可以独立地并且任选地选自CH3区的位置355、359、362、384、389、392、397、418、419、444和447(EU编号)。可用于降低CH3结构域的pI的特定取代包含但不限于位置355处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置384处的非天然丝氨酸、位置392处的非天然天冬酰胺或谷氨酸、位置397处的非天然甲硫氨酸、位置419处的非天然谷氨酸、位置359处的非天然谷氨酸、位置362处的非天然谷氨酸、位置389处的非天然谷氨酸、位置418处的非天然谷氨酸、位置444处的非天然谷氨酸和位置447处的缺失或非天然天冬氨酸。
3.同种型变体
另外，本发明异源二聚体抗体的许多实施例依赖于特定位置处的pI氨基酸从一个IgG同种型到另一个的“引进(importation)”，由此降低或消除将不想要的免疫原性引入到变体中的可能性。在美国公开2014/0370013的图21中示出了多种这些变体，所述美国公开特此通过引用并入。也就是说，出于多种原因，IgG1是治疗性抗体的常用同种型，包含高效应子功能。然而，IgG1的重恒定区具有比IgG2的pI更高的pI(8.10相对于7.31)。通过将特定位置处的IgG2引入到IgG1主链中，所得单体的pI降低(或增高)并且另外表现出更长的血清半衰期。例如，IgG1具有位置137处的甘氨酸(pI为5.97)，并且IgG2具有谷氨酸(pI为3.22)；输入谷氨酸将影响所得蛋白质的pI。如下文所描述的，通常需要多个氨基酸取代来显著影响变体抗体的pI。然而，应注意，如下文所讨论的，即便是IgG2分子发生变化也允许血清半衰期增加。
在其它实施例中，作出了非同种型氨基酸改变，以便降低所得蛋白质的总电荷状态(例如，通过将较高pI氨基酸改为较低pI氨基酸)或为了稳定而允许调节结构等，如下文中更进一步描述的。
另外，通过pI工程化重恒定结构域和轻恒定结构域，可以看到异源二聚体的每个单体的显著变化。如本文所讨论的，使两个单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱法或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。
4.计算pI
本文提供的抗体的每个单体的pI可以取决于变体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，所述总单体包含变体重链恒定结构域和融合配偶体。因此，在一些实施例中，使用美国公开2014/0370013中的图19的图表，基于变体重链恒定结构域计算pI变化。如本文所讨论的，要工程化哪个单体通常由Fv和支架区的固有pI来决定。可替代地，可以比较每个单体的pI。
5.还赋予了更好的FcRn体内结合的pI变体
在pI变体减小单体的pI的情况下，其可以具有提高体内血清固位的额外益处。
虽然仍在审查中，但是据信，Fc区在体内具有较长的半衰期，因为在核内体中以pH6与FcRn的结合螯合了Fc(Ghetie和Ward,1997《今日免疫学(Immunol Today.)》18(12):592-598，所述文献通过引用整体并入)。核内体隔室然后使Fc再循环到细胞表面。一旦隔室向胞外空间打开，则较高pH(～7.4)会诱导将Fc释放回到血液中。在小鼠中，Dall'Acqua等人示出了，在pH为6和pH为7.4时具有增加的FcRn结合的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度和与野生型Fc相同的半衰期(Dall'Acqua等人,2002,《免疫学杂志(J.Immunol.)》169:5171-5180，所述文献通过引用整体并入)。据认为，在pH为7.4时FcRn的Fc的增加的亲和力阻止将Fc释放回到血液中。因此，将增加Fc的体内半衰期的Fc突变将理想地增加较低pH时的FcRn结合，同时仍允许在较高pH时释放Fc。氨基酸组氨酸改变了其在6.0到7.4的pH范围下的电荷状态。因此，在Fc/FcRn复合物中的重要位置处发现His残基不足为奇。
最近，已经提出，带具有较低等电点的可变区的抗体还可以具有较长的血清半衰期(Igawa等人,2010《蛋白质工程设计与选择(PEDS)》23(5):385-392，所述文献通过引用整体并入)。然而，对其机制仍知之甚少。而且，可变区因抗体而有所不同。具有降低的pI和延长的半衰期的恒定区变体将会提供更具模块化的方法来提高抗体的药代动力学性质，如本文所描述的。
C.用于另外功能的另外Fc变体
除了上文所讨论的异源二聚化变体之外，存在出于各种原因可以作出的许多有用的Fc氨基酸修饰，包含但不限于更改与一个或多个FcγR受体的结合、更改与FcRn受体的结合等，如以下所讨论的。
因此，本文提供的抗体(异源二聚体以及同源二聚体)可以包含具有或不具有本文概述的异源二聚化变体(例如，pI变体和空间变体)的此类氨基酸修饰。每组变体可以独立地且任选地包含在内或不包含在任何特定异源二聚体蛋白中。
1.FcγR变体
因此，存在可以作出以更改与FcγR受体中的一个或多个的结合的多个有用Fc取代。在某些实施例中，本发明抗体包含更改与一种或多种FcγR受体的结合的修饰(即，“FcγR变体”)。导致增加的结合以及减少的结合的取代可以是有用的。例如，已知增加与FcγRIIIa的结合通常导致ADCC增加(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；其中表达FcγR的非特异性毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞裂解的细胞介导的反应)。类似地，在一些情况下，与FcγRIIb的结合减弱(抑制性受体)也可能是有利的。可用于本发明抗体的氨基酸取代包含在美国专利第8,188,321号(具体地图41)和第8,084,582号以及美国公开申请第20060235208号和第20070148170号中所列举的氨基酸取代，所有所述美国专利通过引用整体明确并入本文，特别是针对影响Fcγ受体结合的在其中公开的变体明确并入本文。可使用的特定变体包含但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。此类修饰可以包含在本发明抗体的一个或两个Fc结构域中。
在一些实施例中，本发明抗体包含增加血清半衰期的一个或多个Fc修饰。如特此通过引用整体并入的USSN 12/341,769中具体公开的可用于增加与FcRn受体的结合并且增加血清半衰期的Fc取代包含但不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I或V/434S、436V/428L和259I/308F/428L。此类修饰可以包含在本发明抗体的一个或两个Fc结构域中。
2.烧蚀变体
在一些实施例中，抗FAP抗体包含减少或去除Fc结构域与Fcγ受体中的一个或多个或所有(例如，FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合以避免另外的作用机制的一个或多个修饰。此类修饰被称为“FcγR烧蚀变体”或“Fc敲除(FcKO或KO)”变体。在这些实施例中，对于一些治疗应用，期望减少或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合，以避免其它作用机制。也就是说，例如，在许多实施例中，特别是在使用与CD3单价地结合的双特异性抗体中，通常期望的是烧蚀FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性。在一些实施例中，本文所述的本发明抗体的Fc结构域中的至少一个Fc结构域包括一种或多种Fcγ受体烧蚀变体。在一些实施例中，本文所述的本发明抗体的Fc结构域两者均包括一种或多种Fcγ受体烧蚀变体。图5中描绘了这些烧蚀变体，并且各自可以独立且任选地包含在内或不包含在内，优选方面利用了选自由以下组成的组的烧蚀变体：G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。应注意本文中提及的烧蚀变体烧蚀FcγR结合，但是通常不烧蚀FcRn结合。
如本领域所已知的，人IgG1的Fc结构域具有与Fcγ受体的最高结合，并且因此，在异源二聚体抗体的主链中的恒定结构域(或Fc结构域)为IgG1时，可以使用烧蚀变体。例如，可替代地或除了IgG1背景下的烧蚀变体之外，糖基化位置297处的突变(通常突变成A或S)可以显著烧蚀与FcγRIIIa的结合。人IgG2和IgG4具有与Fcγ受体天然减少的结合，并且因此那些主链可以在有或没有烧蚀变体的情况下使用。
D.异源二聚体变体和Fc变体的组合
如本领域的技术人员将理解的，所有所列出异源二聚化变体(包含偏斜变体和/或pI变体)可以任何方式任选地且独立地组合，只要其保持器“链型”或“单体分隔”即可。另外，所有这些变体可以组合成任何异源二聚化形式。
在pI变体的情况下，虽然附图中示出了特别有用的实施例，但是可以遵循更改两个单体之间的pI差异以促进纯化的基本规则，生成其它组合。
另外，如本文总体上概述的，异源二聚化变体、偏斜变体和pI变体中的任何一个都与Fc烧蚀变体、Fc变体、FcRn变体独立地且任选地组合。
包含在异源二聚体1+1Fab-scFv-Fc和2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体的一些实施例中的变体的示例性组合包含在图6中。在一些实施例中，异源二聚体抗体包含如图6中所描绘的变体的组合。在某些实施例中，所述抗体是异源二聚体1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体。
E.有用的抗体形式
如本领域的技术人员将理解的并且如下文更全面地讨论的，本发明的异源二聚体融合蛋白可以采取各种配置，如图1中总体上描绘的。一些附图描绘了“单端”配置，其中分子的一个“臂”上有一种类型的特异性并且另一个“臂”上有不同的特异性。其它附图描绘了“双端”配置，其中分子的“顶部”有至少一种类型的特异性并且分子的“底部”有一种或多种不同的特异性。因此，本发明涉及共同接合不同的第一抗原和第二抗原的新型免疫球蛋白组成物。
如本领域的技术人员将理解的，本发明的异源二聚体形式可以具有不同的化合价并且可以是双特异性的。也就是说，本发明的异源二聚体抗体可以是二价的和双特异性的，其中一个靶肿瘤抗原(例如，CD3)由一个结合结构域结合并且另一个靶肿瘤抗原(例如，FAP)由第二结合结构域结合。异源二聚体抗体还可以是三价的和双特异性的，其中第一抗原由两个结合结构域结合并且第二抗原由第二结合结构域结合。如本文概述的，当CD3是靶抗原之一时，优选的是CD3仅单价地结合，以减少潜在的副作用。
本发明利用CD3抗原结合结构域与FAP结合结构域的组合。如本领域的技术人员将理解的，可以使用如在任何图(具体地参见图12)中所描绘的抗CD3 CDR、抗CD3可变轻和可变重结构域、Fab和scFv的任何集合。类似地，可以使用任何抗FAP抗原结合结构域，无论是否可以使用如在任何图(例如，图13-15)中所描绘的CDR、可变轻和可变重结构域、Fab和scFv，任选地并且独立地以任何组合组合。
1.2+1Fab2-scFv-Fc形式(中心scFv形式)
一种可用于本发明双特异性FAP抗体(例如，FAP x CD3双特异性抗体)的异源二聚体支架是图1F中所示的2+1Fab2-scFv-Fc形式(也称为“中心scFv形式”)。在此实施例中，所述形式依赖于插入的scFv结构域的使用，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分各自与FAP结合，并且“额外的”scFv结构域与CD3结合。scFv结构域被插入Fc结构域与单体之一的CH1-Fv区之间，从而提供第三抗原结合结构域。例如，如本文实例2中所述，具有2+1Fab2-scFv-Fc形式的FAP x CD3双特异性抗体在表达低水平的FAP的细胞环境中在诱导重定向T细胞细胞毒性方面是有效的。此外，如实例中所示，具有2+1Fab2-scFv-Fc形式的FAP x CD3双特异性抗体允许免疫应答的“微调”，因为此类抗体表现出各种各样的不同性质，这取决于所使用的FAP和/或CD3结合结构域。例如，此类抗体在对具有不同FAP表达的细胞的选择性、对FAP表达性细胞的效力、引发细胞因子释放的能力以及对可溶性FAP的敏感性方面表现出差异。这些FAP抗体可用于例如治疗FAP相关癌症。
在此实施例中，一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重结构域、CH1结构域(以及任选的铰链)和Fc结构域，其中scFv包括scFv可变轻结构域、scFv连接子和scFv可变重结构域。使用任选的结构域连接子(VH1-CH1-[任选的连接子]-VH2-scFv连接子-VH2-[任选的连接子]-CH2-CH3或scFv的相反朝向、VH1-CH1-[任选的连接子]-VL2-scFv连接子-VH2-[任选的连接子]-CH2-CH3)来将scFv共价地连接在重恒定结构域的CH1结构域的C端与第一Fc结构域的N端之间。在一些实施例中，任选的连接子是铰链或其片段。另一个单体是标准Fab侧。(即，VH1-CH1-铰链-CH2-CH3)。此实施例进一步利用了包括可变轻结构域和恒定轻结构域的共同轻链，所述共同轻链与重链缔合以形成与FAP结合的两个相同的Fab。就本文的许多实施例来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、烧蚀变体、另外的Fc变体等。
在一个实施例中，2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体包含具有图12或序列表中所描绘的CD3结合结构域序列的VH和VL的scFv。在一个实施例中，2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体包含具有如图13-15和序列表中所示的FAP结合结构域的VH和VL的两个Fab。与2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体一起使用的特别有用的FAP和CD3序列组合包含[αFAP]_H0.26_L0 x H1.32_L1.47、[αFAP]_H0.26_L0.11 x H1.32_L1.47、[αFAP]_H0.26_L0.19 x H1.32_L1.47、1A7B5 H1_L1x H1.32_L1.47、1E5A5 H1_L1 x H1.32_L1.47、1E5A5(共同轻链)H1_L1 x H1.32_L1.47和1F4B5 H1_L1 x H1.32_L1.47以及图43E和F所公开的那些。
另外，2+1Fab2-scFv-Fc抗体的Fc结构域是包含偏斜变体(例如，如图3和8中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体包含S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)、任选地烧蚀变体(包含图5中所示的那些)、任选地带电scFv连接子(包含图7中所示的那些)和在所述变体Fc结构域中的一个或两个上的pI变体(包含图4中所示的那些)的变体Fc结构域。
在一些实施例中，2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体包含偏斜变体、pI变体和烧蚀变体。因此，一些实施例包含2+1Fab2-scFv-Fc形式，所述形式包括：a)第一单体(Fab-scFv-Fc侧)，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重结构域，所述可变重结构域与轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体(Fab-Fc侧)，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重结构域，所述可变重结构域与轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv；以及c)轻链，所述轻链包括可变轻结构域和恒定轻结构域。
在一些实施例中，2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体包含偏斜变体、pI变体、烧蚀变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含2+1Fab2-scFv-Fc形式，所述形式包括：a)第一单体(Fab-scFv-Fc侧)，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和可变重结构域，所述可变重结构域与轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv和与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体(Fab-Fc侧)，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和可变重结构域，所述可变重结构域与轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv；以及c)轻链，所述轻链包括可变轻结构域和恒定轻结构域。
特别用于这些实施例的CD3结合结构域序列包含但不限于抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47和抗CD3H1.31_L1.47，以及图12和13中所描绘的那些。在这些实施例中特别有用的FAP结合结构域序列包含[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1，以及在图13-15中所描绘的那些。
在一个实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含具有抗CD3 H1.30_L1.47(参见例如，图12)的VH和VL的抗CD3 scFv以及两个Fab，每个Fab具有FAP结合结构域的VH和VL，其中所述FAP结合结构域是[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1或1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在另一个实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含具有抗CD3 H1.32_L1.47(参见例如，图12)的VH和VL的抗CD3 scFv以及两个Fab，每个Fab具有FAP结合结构域的VH和VL，其中所述FAP结合结构域是[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1或1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在一个实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含具有抗CD3 H1.89_L1.47(参见例如，图12)的VH和VL的抗CD3 scFv以及两个Fab，每个Fab具有FAP结合结构域的VH和VL，其中所述FAP结合结构域是[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1或1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在另一个实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含具有抗CD3 H1.90_L1.47(参见例如，图12)的VH和VL的抗CD3 scFv以及两个Fab，每个Fab具有FAP结合结构域的VH和VL，其中所述FAP结合结构域是[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1或1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在又另一个实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含具有抗CD3 H1.33_L1.47(参见例如，图12)的VH和VL的抗CD3 scFv以及两个Fab，每个Fab具有FAP结合结构域的VH和VL，其中所述FAP结合结构域是[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1或1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在一个实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含具有抗CD3 H1.31_L1.47(参见例如，图12)的VH和VL的抗CD3 scFv以及两个Fab，每个Fab具有FAP结合结构域的VH和VL，其中所述FAP结合结构域是[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1或1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在示例性实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在示例性实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中CH2-CH3是包含异源二聚化变体S364K/E357Q的第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是包含异源二聚化变体L368D/K370S的第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1分别是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。在一些实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一个实施例中，第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在示例性实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
在某些实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在某些实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.30_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在某些实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.32_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在某些实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.89_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在某些实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.90_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在某些实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.33_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在某些实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.31_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。
在一个实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3scFv并且CH2-CH3是包含异源二聚化变体S364K/E357Q的第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是包含异源二聚化变体L368D/K370S的第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1分别是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)。在一些实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一个实施例中，第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在示例性实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
在某些实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.30_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是包含异源二聚化变体S364K/E357Q的第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是包含异源二聚化变体L368D/K370S的第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5H1_L1(参见例如，图14)。在一些实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一个实施例中，第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在示例性实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
在一个实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.32_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是包含异源二聚化变体S364K/E357Q的第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是包含异源二聚化变体L368D/K370S的第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5H1_L1(参见例如，图14)。在一些实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一个实施例中，第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在示例性实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
在一些实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.89_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是包含异源二聚化变体S364K/E357Q的第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是包含异源二聚化变体L368D/K370S的第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5H1_L1(参见例如，图14)。在一些实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一个实施例中，第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在示例性实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
在某些实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.90_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是包含异源二聚化变体S364K/E357Q的第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是包含异源二聚化变体L368D/K370S的第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5H1_L1(参见例如，图14)。在一些实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一个实施例中，第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在示例性实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
在一个实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.33_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是包含异源二聚化变体S364K/E357Q的第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是包含异源二聚化变体L368D/K370S的第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5H1_L1(参见例如，图14)。在一些实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一个实施例中，第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在示例性实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
在一些实施例中，FAP 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是具有抗CD3 H1.31_L1.47的VH和VL的抗CD3 scFv，并且CH2-CH3是包含异源二聚化变体S364K/E357Q的第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是包含异源二聚化变体L368D/K370S的第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5H1_L1(参见例如，图14)。在一些实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。在一个实施例中，第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。在示例性实施例中，第一变体Fc结构域和第二变体Fc结构域进一步包含FcKO变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二单体的铰链-CH2-CH3进一步包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
在一些实施例中，2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体利用图10和63中的利用2+1Fab2-scFv-Fc主链序列中的任一个的2+1Fab2-scFv-Fc主链序列(任选地包含M428L/N434S)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.30_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.30_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.30_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在一些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.32_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.32_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.32_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.89_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.89_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.89_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在一个实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.90_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.90_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.90_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.33_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.33_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.33_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在一些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.31_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.31_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.31_L1.47–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.30_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.30_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.30_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在示例性实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.32_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.32_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.32_L1.47–有扩展”(SEQ IDNO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.89_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.89_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.89_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.90_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.90_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.90_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.33_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.33_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.33_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–H1.31_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–H1.31_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–H1.31_L1.47–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.30–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.30–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.30–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.32–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.32–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.32–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.89–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.89–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.89–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.90–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.90–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.90–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.33–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.33–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.33–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.31–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.31–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.31–无扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.30–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.30–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.30–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.32–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.32–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.32–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.89–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.89–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.89–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.90–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.90–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.90–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.33–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.33–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.33–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
在某些实施例中，FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含：a)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，其中scFv是抗CD3 scFv并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域；b)第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二变体Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包含VL1和CL，其中VH1和VL1是以下FAP结合结构域之一的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)，其中第一单体的scFv-连接子2-CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.31–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链2”的序列，第二单体的CH2-CH3具有“2+1–L1.47_H1.31–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链1”的序列，并且CL具有“2+1–L1.47_H1.31–有扩展”(SEQ ID NO:XXX)的“链3”的第二个(参见图63)。
图21、51、62和64-70中描绘了示例性本发明FAP x CD3 2+1Fab2-scFv-Fc形式抗体。示例性FAP x CD3本发明2+1Fab2-scFv-Fc抗体包含XENP25393、XENP29140、XENP28115、XENP29141、XENP28116、XENP29142、XENP25193、XENP25194、XENP25195、XENP25967、XENC1145、XENC1123、XENC1079和XENC1101。
2.1+1Fab-scFv-Fc形式(“开瓶器”)
可用于本文中的本发明FAP x CD3双特异性抗体的一种异源二聚体抗体形式是如图1A中所示的“1+1Fab-scFv-Fc”或“开瓶器”形式。在此实施例中，抗体的一个重链单体含有单链Fv(“scFv”，如下文所定义的)，并且另一个重链单体是包含可变重链和可变轻链的“常规”Fab形式。此结构在本文中有时被称为“开瓶器”形式，这是由于与开瓶器具有大致视觉相似度。通过使用恒定区(例如，Fc结构域、CH1结构域和/或铰链区)中的如下文更全面地描述的促进异源二聚体抗体形成的氨基酸变体(例如，上文所讨论的异源二聚化变体)，这两个重链单体被放在一起。
本发明的“1+1Fab-scFv-Fc”形式具有若干个明显优势。如本领域所已知的，依赖于两个scFv构建体的抗体类似物常常具有稳定性和聚合问题，在本发明中可以通过添加“常规”的重链和轻链配对来缓解所述稳定性和聚合问题。另外，如与依赖于两个重链和两个轻链的形式相反，不存在重链和轻链错误配对(例如，重链1与轻链2配对等)的问题。
本文概述的许多实施例通常依赖于包括第一单体的1+1Fab-scFv-Fc形式抗体，所述第一单体包括scFv，所述scFv包括使用scFv连接子(在许多但并非所有情况下，带电)进行共价连接的可变重结构域和可变轻结构域，其中scFv通常通过结构域连接子与第一Fc结构域的N端共价连接。结构域连接子可以是带电或不带电的并且是外源或内源的(例如，天然铰链结构域的全部或部分)。1+1Fab-scFv-Fc形式的第二单体是重链，并且组成物进一步包括轻链。
通常，在许多优选的实施例中，scFv是与CD3结合的结构域，并且Fab形成FAP结合结构域。在图16A中描绘了1+1Fab-scFv-Fc形式的示例性抗FAP x抗CD3双特异性抗体。
另外，1+1Fab-scFv-Fc形式的Fc结构域通常包括异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和8中所示的一组氨基酸取代)。特别有用的异源二聚化偏斜变体包含S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L；K370S:S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，任选地烧蚀变体(包含图5中所示的那些)，任选地带电scFv连接子(包含图7中所示的那些)，并且重链包括pI变体(包含图4中所示的那些)。在示例性实施例中，1+1Fab-scFv-Fc形式抗体包含
在某些实施例中，1+1Fab-scFv-Fc支架形式包含第一单体，所述第一单体包含scFv-铰链-CH2-CH3单体；第二单体，所述第二单体包含第一可变重结构域-CH1-铰链-CH2-CH3单体；以及第三单体，所述第三单体包含第一可变轻结构域。在一些实施例中，第一单体的CH2-CH3是第一变体Fc结构域，并且第二单体的CH2-CH3是第二变体Fc结构域。在一些实施例中，scFv包含形成CD3结合部分的scFv可变重结构域和scFv可变轻结构域。在某些实施例中，scFv可变重结构域和scFv可变轻结构域使用scFv连接子(带电，在许多但不是所有情况下)进行共价连接。在一些实施例中，第一可变重结构域和第一可变轻结构域形成FAP结合结构域。
在一些实施例中，1+1Fab-scFv-Fc形式包含偏斜变体、pI变体和烧蚀变体。因此，一些实施例包含1+1Fab-scFv-Fc形式，所述形式包括：a)第一单体(“scFv单体”)，所述第一单体包括带电scFv连接子(图7的+H序列在一些实施例中是优选的)、偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与如本文概述的与CD3结合的scFv；b)第二单体(“Fab单体”)，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及可变重结构域；以及c)轻链，所述轻链包含可变轻结构域。可变重结构域和可变轻结构域构成FAP结合部分。
与CD3结合的scFv的示例性可变重和轻结构域包含在图12中。与FAP结合的Fv的示例性可变重和轻结构域包含在图13-15中。在示例性实施例中，1+1Fab-scFv-Fc FAP x CD3双特异性抗体的FAP结合结构域包含以下FAP结合结构域之一的VH和VL：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1(参见例如，图14)(参见图14)。在一个实施例中，1+1Fab-scFv-Fc FAPx CD3双特异性抗体的CD3结合结构域包含以下CD3结合结构域之一的VH和VL：H1.30_L1.47(即，“CD3高”)、抗CD3 H1.32_L1.47(即，“CD3高-中等”)、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47和抗CD3 H1.31_L1.47。用于1-+1Fab-scFv-Fc FAP xCD3双特异性抗体的特别有用的FAP和CD3组合公开于图43C和D中并且包含1E5A5 H1_L1 xCD3 H1.30_L1.47；FAP 1A7B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1E5A5 H1_L1 x CD3H1.30_L1.47；FAP 1F4B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F12B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F10B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F12B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP 1F4B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP 1F10B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP1A7B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；[αFAP]_H0.26_L0 x CD3 H1.30_L1.47；[αFAP]_H0.26_L0 x CD3 H1.32_L1.47；[αFAP]_H0.26_L0.11 x CD3 H1.30_L1.47；[αFAP]_H0.26_L0.11x CD3 H1.32_L1.47；[αFAP]_H0.26_L0.19 x CD3 H1.30_L1.47；和[αFAP]_H0.26_L0.19 xCD3 H1.32_L1.47。
在一些实施例中，1+1Fab-scFv-Fc形式包含偏斜变体、pI变体、烧蚀变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含1+1Fab-scFv-Fc形式，所述形式包括：a)第一单体(“scFv单体”)，所述第一单体包括带电scFv连接子(图7的+H序列在一些实施例中是优选的)、偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与如本文概述的CD3结合的scFv；b)第二单体(“Fab单体”)，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及可变重结构域；以及c)轻链，所述轻链包含可变轻结构域。可变重结构域和可变轻结构域构成FAP结合结构域。
图9示出了缺少可以用于本发明的Fv序列的一些示例性1+1Fab-scFv-Fc“主链”序列。在一些实施例中，本文所描绘的任何vh和vl序列(包含附图和序列表中所描绘的所有vh和vl序列，包含针对FAP的序列)可以使用附图和序列表中所示的任何抗CD3 scFv序列添加到图9的1+1Fab-scFv-Fc主链形式作为“Fab侧”。
对于来自图9的1+1Fab-scFv-Fc主链1(任选地包含428L/434S变体)，特别用于这些实施例的CD3结合结构域序列包含但不限于CD3结合结构域抗CD3 H1.30_L1.47(即，“CD3高”)、抗CD3 H1.32_L1.47(即，“CD3高-中等”)、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47和抗CD3 H1.31_L1.47，以及在图12中所描绘的那些，其作为图9中所示的主链的scFv侧连接。
对于来自图9的1+1Fab-scFv-Fc主链1(任选地包含428L/434S变体)，在这些实施例中特别有用的FAP结合结构域序列包含但不限于1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1，以及图13-15所描绘的那些，其作为图9中所示的主链的Fab侧连接。
图43C和D中公开了用于与来自图9的1+1Fab-scFv-Fc主链1(任选地包含428L/434S变体)一起使用的特别有用的FAP和CD3序列组合。
在一些示例性实施例中，1+1Fab-scFv-Fc抗体包含来自图9的1+1 Fab-scFv-Fc“主链”1，FAP和CD3组合选自由以下组成的组：FAP 1E5A5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP1A7B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1E5A5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F4B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F12B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F10B5 H1_L1 xCD3 H1.30_L1.47；FAP 1F12B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP 1F4B5 H1_L1 x CD3H1.32_L1.47；FAP 1F10B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP 1A7B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；[αFAP]_H0.26_L0 x CD3 H1.30_L1.47；[αFAP]_H0.26_L0 x CD3 H1.32_L1.47；[αFAP]_H0.26_L0.11 x CD3 H1.30_L1.47；[αFAP]_H0.26_L0.11 x CD3 H1.32_L1.47；[αFAP]_H0.26_L0.19 x CD3 H1.30_L1.47；和[αFAP]_H0.26_L0.19 x CD3 H1.32_L1.47。图43C和D中公开了用于与1+1Fab-scFv-Fc形式一起使用的其它特别有用的FAP和CD3序列组合。
3.mAb-Fv形式
特别用于本发明的一种异源二聚体支架是图1G所示的mAb-Fv形式。在此实施例中，所述形式依赖于使用“额外”可变重结构域与一个单体的C端连接以及“额外”可变轻结构域与另一个单体的C端连接，从而形成第三抗原结合结构域(即，“额外”Fv结构域)，其中这两个单体的Fab部分与FAP结合并且“额外”第三抗原结合结构域与CD3结合。
在此实施例中，第一单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重结构域和包括第一Fc结构域的第一恒定重结构域，其中第二可变重结构域使用结构域连接子(vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的连接子]-vh2)来与所述第一Fc结构域的C端共价连接。第二单体包括第一可变重结构域、包括第二Fc结构域的第二恒定重结构域以及使用结构域连接子(vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的连接子]-vl2)与所述第二Fc结构域的C端共价连接的第二可变重结构域。此实施例进一步利用包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域的共同轻链。共同轻链与重链缔合以形成两个相同的Fab，包含与FAP结合的两个相同的Fv。两个C端连接的可变结构域(vh2和vl2)构成与CD3结合的“额外”第三Fv(因为具有二价CD3结合是较不优选的)。就本文的许多实施例来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、烧蚀变体、另外的Fc变体等。
本发明提供了mAb-Fv形式，其中CD3结合结构域序列如图14和15以及序列表中所示。本发明提供了mAb-Fv形式，其中FAP结合结构域序列如图11-13以及序列表中所示。用于与mAb-Fv形式一起使用的特别有用的FAP和CD3序列组合包含但不限于：FAP 1E5A5 H1_L1x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1A7B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1E5A5 H1_L1 x CD3H1.30_L1.47；FAP 1F4B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F12B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F10B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F12B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP 1F4B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP 1F10B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP1A7B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47。图43A和B中公开了用于与1+1Fab-scFv-Fc形式一起使用的其它特别有用的FAP和CD3序列组合。
另外，mAb-Fv形式的Fc结构域通常包括偏斜变体(例如，如图3和8所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)、任选地烧蚀变体(包含图5所示的那些)、任选地带电scFv连接子(包含图7所示的那些)，并且重链包括pI变体(包含图4所示的那些)。
在一些实施例中，mAb-Fv形式包含偏斜变体、pI变体和烧蚀变体。因此，一些实施例包含mAb-Fv形式，所述形式包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和第一可变重结构域以及第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与FAP结合的Fv；b)第二单体，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和第一可变重结构域以及第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv，所述第二可变轻链与第二可变重结构域一起形成与CD3结合的Fv(ABD)；以及c)轻链，所述轻链包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。
在一些实施例中，mAb-Fv形式包含偏斜变体、pI变体、烧蚀变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含mAb-Fv形式，所述形式包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和第一可变重结构域以及第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与FAP结合的Fv；b)第二单体，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和第一可变重结构域以及第二可变轻链，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv，所述第二可变轻链与第一单体的第二可变重结构域一起形成与CD3结合的Fv(ABD)；以及c)轻链，所述轻链包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。
对于类似于来自图10的mAb-Fv主链1的mAb-Fv序列(任选地包含M428L/434S变体)，可特别用于这些实施例的CD3结合结构域序列包含但不限于抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47和抗CD3H1.31_L1.47，以及在图12中所描绘的那些。
对于类似于来自图10的mAb-Fv主链1的mAb-Fv序列(任选地包含M428L/434S变体)，在这些实施例中特别有用的FAP结合结构域序列包含但不限于1A4A5 H1_L1；1C3A5H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1。
用于与类似于来自图11的mAb-Fv主链1的mAb-Fv序列(任选地包含428L/434S变体)一起使用的特别有用的FAP和CD3序列组合包含但不限于FAP 1E5A5 H1_L1 x CD3H1.30_L1.47；FAP 1A7B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1E5A5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F4B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F12B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F10B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F12B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP1F4B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP 1F10B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP 1A7B5H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47。图43A和B中公开了用于与1+1Fab-scFv-Fc形式一起使用的其它特别有用的FAP和CD3序列组合。
4.mAb-scFv形式
可特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1H所示的mAb-scFv形式。在此实施例中，所述形式依赖于使用scFv与单体之一的C端连接，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分各自与FAP结合并且“额外”scFv结构域与CD3结合。
在此实施例中，第一单体包括第一重链(包括可变重结构域和恒定结构域)，其中C端共价连接的scFv包括在任一朝向上(vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的连接子]-vh2-scFv连接子-vl2或vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的连接子]-vl2-scFv连接子-vh2)的scFv可变轻结构域、scFv连接子和scFv可变重结构域。第二单体包括第二重链(vh1-CH1-铰链-CH2-CH3)。此实施例进一步利用了包括可变轻结构域和恒定轻结构域的共同轻链，所述共同轻链与重链缔合以形成与FAP结合的两个相同的Fab。就本文的许多实施例来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、烧蚀变体、另外的Fc变体等。
本发明提供了mAb-scFv形式，其中CD3结合结构域序列如图12以及序列表中所示。本发明提供了mAb-scFv形式，其中FAP结合结构域序列如图13-15以及序列表中所示。图43A和B中公开了用于与mAb-scFv形式一起使用的特别有用的FAP和CD3序列组合。
此外，mAb-scFv形式的Fc结构域通常包括偏斜变体(例如，如图3和8中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，任选地烧蚀变体(包含如图5中所示的那些)，任选地带电scFv连接子(包含如图7中所示的那些)，并且重链包括pI变体(包含如图4中所示的那些)。
在一些实施例中，mAb-scFv形式包含偏斜变体、pI变体和烧蚀变体。因此，一些实施例包含1+1Fab-scFv-Fc形式，所述形式包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和第一可变重结构域，所述第一可变重结构域与所述第一可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv以及与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和第一可变重结构域，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv；以及c)轻链，所述轻链包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。
在一些实施例中，mAb-scFv形式包含偏斜变体、pI变体、烧蚀变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含mAb-scFv形式，所述形式包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和第一可变重结构域，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv以及与CD3结合的scFv结构域；b)第二单体，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和第一可变重结构域，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv；以及c)轻链，所述轻链包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。
在来自图11的mAb-scFv主链1(任选地包含M428L/N434S)(任选地包含428L/434S变体)中，可特别用于这些实施例的CD3结合结构域序列包含但不限于抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47和抗CD3 H1.31_L1.47，以及在图12中所描绘的那些。
在来自图10的mAb-scFv主链1(任选地包含M428L/N434S)(任选地包含428L/434S变体)中，在这些实施例中特别有用的FAP结合结构域序列包含但不限于但不限于FAP1E5A5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1A7B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1E5A5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F4B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F12B5 H1_L1 x CD3H1.30_L1.47；FAP 1F10B5 H1_L1 x CD3 H1.30_L1.47；FAP 1F12B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP 1F4B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP 1F10B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47；FAP 1A7B5 H1_L1 x CD3 H1.32_L1.47。图43A和B中公开了用于与1+1Fab-scFv-Fc形式一起使用的其它特别有用的FAP和CD3序列组合。
5.中心Fv形式
可特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1I所示的中心Fv形式。在此实施例中，所述形式依赖于使用插入的Fv结构域(即，中心Fv结构域)，从而形成“额外”第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分与FAP结合并且“额外”中心Fv结构域与CD3结合。“额外”中心Fv结构域被插入在Fc结构域与单体的CH1-Fv区之间，从而提供第三抗原结合结构域(即，“额外”中心Fv结构域)，其中每个单体含有“额外”中心Fv结构域的组分(即，一个单体包括可变重结构域，并且另一个包括“额外”中心Fv结构域的可变轻结构域)。
在这个实施例中，一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重结构域、CH1结构域以及Fc结构域和额外可变轻结构域。另外的可变轻结构域使用结构域连接子(vh1-CH1-[任选的连接子]-vl2-铰链-CH2-CH3)共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C端与第一Fc结构域的N端之间。另一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重结构域、CH1结构域和Fc结构域以及另外的可变重结构域(vh1-CH1-[任选的连接子]-vh2-铰链-CH2-CH3)。另外的可变重结构域使用结构域连接子共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C端与第一Fc结构域的N端之间。
此实施例利用了包括可变轻结构域和恒定轻结构域的共同轻链，所述共同轻链与重链缔合以形成各自与FAP结合的两个相同的Fab。另外的可变重结构域和另外的可变轻结构域(vh2和vl2)形成与CD3结合的“额外”中心Fv。就本文的许多实施例来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、烧蚀变体、另外的Fc变体等。
本发明提供了中心Fv形式，其中CD3结合结构域序列如图12以及序列表中所示。本发明提供了中心Fv形式，其中FAP结合结构域序列如图13-15以及序列表中所示。图43A和B公开了用于与中心Fv形式一起使用的特别有用的FAP和CD3序列组合。
此外，单臂中心Fv形式的Fc结构域通常包含偏斜变体(例如，如图3和8中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，任选地烧蚀变体(包含如图5中所示的那些)，任选地带电scFv连接子(包含如图7中所示的那些)，并且重链包括pI变体(包含如图4中所示的那些)。
在一些实施例中，中心Fv形式包含偏斜变体、pI变体和烧蚀变体。因此，一些实施例包含中心Fv形式，所述形式包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、第一可变重结构域以及第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与FAP结合的Fv，所述第二可变重结构域与第二单体的第二可变轻结构域构成与CD3结合的“额外”中心Fv；b)第二单体，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、第一可变重结构域以及第二可变轻结构域，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与FAP结合的Fv，所述第二可变轻结构域与第一单体的第二可变重结构域构成与CD3结合的“额外”中心Fv；以及c)轻链，所述轻链包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。
在一些实施例中，中心Fv形式包含偏斜变体、pI变体、烧蚀变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含中心Fv形式，所述形式包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S、第一可变重结构域以及第二可变重结构域，所述第一可变重结构域与轻链的第一可变轻结构域构成与FAP结合的Fv，所述第二可变重结构域与第二单体的第二可变轻结构域构成与CD3结合的“额外”中心Fv；b)第二单体，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S、第一可变重结构域以及第二可变轻结构域，所述第一可变重结构域与第一可变轻结构域构成与FAP结合的Fv，所述第二可变轻结构域与第一单体的第二可变重结构域构成与CD3结合的“额外”中心Fv；以及c)轻链，所述轻链包括第一可变轻结构域和恒定轻结构域。
对于中心Fv形式，特别用于这些实施例的CD3结合结构域序列包含但不限于抗CD3H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3H1.33_L1.47和抗CD3 H1.31_L1.47，以及图14和15中所描绘的那些。
对于中心Fv形式，特别用于这些实施例的FAP结合结构域序列包含但不限于：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1，以及如图13-15中所描绘的那些。
6.单臂中心scFv形式
特别用于本发明的一种异源二聚体支架是图1C中所示的单臂中心scFv形式。在此实施例中，一种单体仅包括Fc结构域，而另一种单体包含Fab结构域(第一抗原结合结构域)、scFv结构域(第二抗原结合结构域)和Fc结构域，其中scFv结构域被插入在Fc结构域与Fc结构域之间。在此形式下，Fab部分与一个受体靶标结合，并且scFv与另一个受体靶标结合。在此形式下，Fab部分与FAP结合并且scFv与CD3结合，或反之亦然。
在此实施例中，一个单体包括第一重链，所述第一重链包括第一可变重结构域、CH1结构域和Fc结构域，其中scFv包括scFv可变轻结构域、scFv连接子和scFv可变重结构域。scFv使用结构域连接子在任一朝向上共价连接在重恒定结构域的CH1结构域的C端与第一Fc结构域的N端之间(VH1-CH1-[任选的结构域连接子]-VH2-scFv连接子-VL2-[任选的结构域连接子]-CH2-CH3或VH1-CH1-[任选的结构域连接子]-VL2-scFv连接子-VH2-[任选的结构域连接子]-CH2-CH3)。第二单体包括Fc结构域(CH2-CH3)。此实施例进一步利用了包括可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链，所述轻链与重链缔合以形成Fab。
就本文的许多实施例来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、烧蚀变体、另外的Fc变体等。
本发明提供了单臂中心scFv形式，其中CD3结合结构域序列如图12以及序列表中所示。本发明提供了单臂中心scFv形式，其中FAP结合结构域序列如图13-15以及序列表中所示。图43A和B公开了用于与中心Fv形式一起使用的特别有用的FAP和CD3序列组合。
另外，单臂中心scFv形式的Fc结构域通常包含偏斜变体(例如，如图3和8中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，任选地烧蚀变体(包含如图5中所示的那些)，任选地带电scFv连接子(包含如图7中所示的那些)，并且重链包括pI变体(包含如图4中所示的那些)。
在一些实施例中，单臂中心scFv形式包含偏斜变体、pI变体和烧蚀变体。因此，单臂中心scFv形式的一些实施例包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、可变重结构域以及scFv结构域，所述可变重结构域与轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv，所述scFv结构域与CD3结合；b)第二单体，所述第二单体包含具有偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包括可变轻结构域和恒定轻结构域。
在一些实施例中，单臂中心scFv形式包含偏斜变体、pI变体、烧蚀变体和FcRn变体。因此，单臂中心scFv形式的一些实施例包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S、可变重结构域以及scFv结构域，所述可变重结构域与轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv，所述scFv结构域与CD3结合；b)第二单体，所述第二单体包含具有偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及FcRn变体M428L/N434S的Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包括可变轻结构域和恒定轻结构域。
对于单臂中心scFv形式，可特别使用的CD3结合结构域序列包含但不限于抗CD3H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3H1.33_L1.47和抗CD3 H1.31_L1.47，以及在图12中描绘的那些。
对于中心scFv形式，具有特别用途的FAP结合结构域序列包含但不限于：1A4A5H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1，以及如图13-15中所描绘的那些。
7.单臂scFv-mAb形式
可特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1D所示的单臂scFv-mAb形式。在此实施例中，一个单体仅包括Fc结构域，而另一个单体通常通过使用以下连接子来使用连接在重链的N端处的scFv结构域：vh1-scFv连接子-vl1-[任选的结构域连接子]-VH2-CH1-铰链-CH2-CH3或(在相反朝向上)vl1-scFv连接子-vh1-[任选的结构域连接子]-VH2-CH1-铰链-CH2-CH3。在此形式下，Fab部分与FAP结合并且scFv与CD3结合，或反之亦然。
此实施例进一步利用包括可变轻结构域和恒定轻结构域的轻链。轻链与重链缔合以形成Fab。就本文的许多实施例来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、烧蚀变体、另外的Fc变体等。
本发明提供了单臂scFv-mAb形式，其中CD3结合结构域序列如图12以及序列表中所示。本发明提供了单臂scFv-mAb形式，其中FAP结合结构域序列如图13-15以及序列表中所示。图43A和B公开了用于与单臂scFv-mAb形式一起使用的特别有用的FAP和CD3序列组合。
另外，单臂scFv-mAb形式的Fc结构域通常包含偏斜变体(例如，如图3和8中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，任选地烧蚀变体(包含如图5中所示的那些)，任选地带电scFv连接子(包含如图7中所示的那些)，并且重链包括pI变体(包含如图4中所示的那些)。
在一些实施例中，单臂scFv-mAb形式包含偏斜变体、pI变体和烧蚀变体。因此，单臂scFv-mAb形式的一些实施例包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重结构域以及scFv结构域，所述可变重结构域与轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv，所述scFv结构域与CD3结合；b)第二单体，所述第二单体包含具有偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K的Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包括可变轻结构域和恒定轻结构域。
在一些实施例中，单臂scFv-mAb形式包含偏斜变体、pI变体、烧蚀变体和FcRn变体。因此，一些实施例单臂scFv-mAb形式包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和可变重结构域以及scFv结构域，所述可变重结构域与轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv，所述scFv结构域与CD3结合；b)第二单体，所述第二单体包含具有偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及FcRn变体M428L/N434S的Fc结构域；以及c)轻链，所述轻链包括可变轻结构域和恒定轻结构域。
对于单臂scFv-mAb形式，可特别使用的CD3结合结构域序列包含但不限于抗CD3H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3H1.33_L1.47和抗CD3 H1.31_L1.47，以及在图12中描绘的那些。
对于单臂scFv-mAb形式，具有特别用途的FAP结合结构域序列包含但不限于：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1，以及如图13-15中所描绘的那些。
8.scFv-mAb形式
特别用于本发明的一种异源二聚体支架是如图1E所示的scFV-mAb形式。在此实施例中，所述形式依赖于使用scFv与单体之一的N端连接，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分与FAP结合并且“额外”scFv结构域与CD3结合。
在此实施例中，第一单体包括第一重链(包括可变重结构域和恒定结构域)，其中N端共价连接的scFv包括在任一朝向上的scFv可变轻结构域、scFv连接子和scFv可变重结构域((vh1-scFv连接子-vl1-[任选的结构域连接子]-vh2-CH1-铰链-CH2-CH3)或(scFv在相反朝向上)((vl1-scFv连接子-vh1-[任选的结构域连接子]-vh2-CH1-铰链-CH2-CH3))。第二单体包括重链vh2-CH1-铰链-CH2-CH3。
此实施例进一步利用包括可变轻结构域和恒定轻结构域的共同轻链。共同轻链与重链缔合以形成与FAP结合的两个相同的Fab。就本文的许多实施例来说，这些构建体包含如所期望并且本文所述的偏斜变体、pI变体、烧蚀变体、另外的Fc变体等。
本发明提供了scFv-mAb形式，其中CD3结合结构域序列如图12以及序列表中所示。本发明提供了scFv-mAb形式，其中FAP结合结构域序列如图13-15以及序列表中所示。图43A和B公开了用于与scFv-mAb形式一起使用的特别有用的FAP和CD3序列组合。
另外，scFv-mAb形式的Fc结构域通常包含偏斜变体(例如，如图3和8中所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；L368D/K370S:S364K；L368E/K370S:S364K；T411T/E360E/Q362E:D401K；L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、T366S/L368A/Y407V:T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，任选地烧蚀变体(包含如图5中所示的那些)，任选地带电scFv连接子(包含如图7中所示的那些)，并且重链包括pI变体(包含如图4中所示的那些)。
在一些实施例中，scFv-mAb形式包含偏斜变体、pI变体和烧蚀变体。因此，一些实施例包含scFv-mAb形式，所述形式包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、可变重结构域以及scFv结构域，所述可变重结构域与共同轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv，所述scFv结构域与CD3结合；b)第二单体，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K和可变重结构域，所述可变重结构域与共同轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv；以及c)共同轻链，所述共同轻链包括可变轻结构域和恒定轻结构域。
在一些实施例中，scFv-mAb形式包含偏斜变体、pI变体、烧蚀变体和FcRn变体。因此，一些实施例包含scFv-mAb形式，所述形式包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S、可变重结构域以及scFv结构域，所述可变重结构域与共同轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv，所述scFv结构域与CD3结合；b)第二单体，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S和可变重结构域，所述可变重结构域与共同轻链的可变轻结构域构成与如本文概述的FAP结合的Fv；以及c)共同轻链，所述共同轻链包括可变轻结构域和恒定轻结构域。
在一些实施例中，scFv-mAb抗体包含来自图10的mAb-scFv形式主链1序列(任选地包含M428L/N434S)。
可特别使用的CD3结合结构域序列包含但不限于抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47和抗CD3H1.31_L1.47，以及在图12中描绘的那些。
具有特别用途的FAP结合结构域序列包含但不限于：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1，以及如图13-15中所描绘的那些。
9.双scFv形式
本发明还提供了如本领域已知并且图1B中所示的双scFv形式。在此实施例中，FAPx CD3异源二聚体双特异性抗体由两个scFv-Fc单体(这两个单体呈(vh-scFv连接子-vl-[任选的结构域连接子]-CH2-CH3)形式或(vl-scFv连接子-vh-[任选的结构域连接子]-CH2-CH3)形式，或一个单体在一个朝向上，而另一个单体在另一个朝向上)构成。
本发明提供了双scFv形式，其中CD3结合结构域序列如图12以及序列表中所示。本发明提供了双scFv形式，其中FAP结合结构域序列如图13-15以及序列表中所示。图43A和B中公开了用于与双scFv形式一起使用的特别有用的FAP和CD3序列组合。
在一些实施例中，双scFv形式包含偏斜变体、pI变体和烧蚀变体。因此，一些实施例包含双scFv形式，所述形式包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与CD3或FAP结合的第一scFv；以及b)第二单体，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及与CD3或FAP结合的第二scFv。
在一些实施例中，双scFv形式包含偏斜变体、pI变体、烧蚀变体和FcRn变体。在一些实施例中，双scFv形式包含偏斜变体、pI变体和烧蚀变体。因此，一些实施例包含双scFv形式，所述形式包括：a)第一单体，所述第一单体包括偏斜变体S364K/E357Q、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与CD3或FAP结合的第一scFv；以及b)第二单体，所述第二单体包括偏斜变体L368D/K370S、pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、烧蚀变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、FcRn变体M428L/N434S以及与CD3或FAP结合的第二scFv。
对于双scFv形式，可特别使用的CD3结合结构域序列包含但不限于抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47和抗CD3 H1.31_L1.47，以及在图12中描绘的那些。
对于双scFv形式，具有特别用途的FAP结合结构域序列包含但不限于：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1，以及如图13-15中所描绘的那些。
10.非异源二聚体双特异性抗体
如本领域的技术人员将理解的，本文概述的FAP和CD3 Fv序列还可以用于单特异性抗体(例如，“传统单克隆抗体”)或非异源二聚体双特异性形式两者(图1J)。
可特别使用的CD3结合结构域序列包含但不限于抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47和抗CD3H1.31_L1.47，以及在图12中描绘的那些。
具有特别用途的FAP结合结构域序列包含但不限于：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1，以及如图13-15中所描绘的那些。
图43A和B中公开了用于与非异源二聚体抗体形式一起使用的特别有用的FAP和CD3序列组合。
适合的非异源二聚体双特异性形式是本领域已知的，并且包含如Spiess等人,《分子免疫学(Molecular Immunology)》(67):95-106(2015)和Kontermann,mAbs 4:2,182-197(2012)中总体上描绘的许多不同形式，所述两个文献均通过引用明确并入，特别是针对附图、图例以及对其中形式的引用而明确并入。
11.三叉形式(Trident format)
在一些实施例中，本发明的双特异性抗体呈如在WO2015/184203中总体上描述的“三叉”形式，所述文献特此通过引用整体明确并入，特别是针对“异源二聚体促进结构域”或“HPD”的附图、图例、定义和的序列(包含“K螺旋”和“E螺旋”序列)而明确并入。三叉依赖于使用两种不同的HPD，所述两种不同的HPD缔合以形成异源二聚体结构作为结构的组分，参见图1K。在此实施例中，三叉形式包含“传统的”重链和轻链(例如，VH1-CH1-铰链-CH2-CH3和VL1-CL)、包括第一“双抗体型结合结构域”或
Figure BDA0002762852890001231
VH2-(连接子)-VL3-HPD1的第三链以及包括第二
Figure BDA0002762852890001232
VH3-(连接子)-(连接子)-VL2-HPD2的第四链。VH1和VL1形成第一ABD，VH2和VL2形成第二ABD，并且VH3和VL3形成第三ABD。在一些情况下，如图1K中所示，第二和第三ABD与同一抗原结合，在这种情况下通常是FAP，例如二价地，其中第一ABD单价地结合CD3。
可特别使用的CD3结合结构域序列包含但不限于抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47和抗CD3H1.31_L1.47，以及在图12中描绘的那些。
具有特别用途的FAP结合结构域序列包含但不限于：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1，以及如图13-15中所描绘的那些。
12.单特异性、单克隆抗体
如本领域的技术人员将理解的，本文概述的新型Fv序列还可以用于单特异性抗体(例如，“传统单克隆抗体”)或非异源二聚体双特异性形式两者。因此，本发明提供了单克隆(单特异性)抗体，所述单克隆抗体包括6个CDR和/或来自附图的vh和vl序列，通常具有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，其中IgG1、IgG2和IgG4(包含包括S228P氨基酸取代的IgG4恒定区)特别用于一些实施例。也就是说，本文中的具有“H_L”名称的任何序列可以连接到人IgG1抗体的恒定区。
在一些实施例中，单特异性抗体是FAP单特异性抗体。在某些实施例中，单特异性抗FAP抗体包含选自以下的任何抗FAP抗体的6个CDR：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1，以及如图13-15中所描绘的那些。
在一些实施例中，单特异性FAP抗体包含选自以下的任何抗FAP抗体的可变重结构域和可变轻结构域：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；和1F10B5 H1_L1，以及如图13-15中所描绘的那些。
F.针对靶抗原的抗原结合结构域
本发明双特异性抗体具有以二价双特异性形式或三价双特异性形式与两个不同的抗原(“靶标对”)结合的两个不同的抗原结合结构域(ABD)，如图1中总体上所示的。应注意，针对每一对，这些双特异性抗体通常被命名为“抗FAP X抗CD3”或通常简化地或为方便起见(并且因此可互换地)被命名为“FAP X CD3”等。应注意，除非本文另外说明，以名称列出的抗原的顺序不赋予结构；也就是说，FAP X CD3 1+1Fab-scFv-Fc抗体可以具有与FAP或CD3结合的scFv，但是在一些情况下，所述顺序指定了如所指示结构。
如本文中更全面地概述的，ABD的这些组合可以呈如下文概述的各种形式，通常是一个ABD呈Fab形式并且另一个呈scFv形式的组合。如本文所讨论的并且在图1中所示的，一些形式使用单个Fab和单个scFv(例如，图1A、C和D，1+1Fab-scFv-Fc)，并且一些形式使用两个Fab和单个scFv(例如，图1E、F和H，2+1Fab2-scFv-Fc)。
另外，通常，ABD之一包括如本文概述的在从vh-scFv连接子-vl或vl-scFv连接子-vh的N端到C端的朝向上的scFv。根据形式，其它ABD中的一个或两个通常是包括一个蛋白质链上的vh结构域(通常作为重链的组分)和另一个蛋白质链上的vl(通常作为轻链的组分)的Fab。
如本领域的技术人员将理解的，任何一组6个CDR或vh和vl结构域可以呈scFv形式或Fab形式，所述形式然后被添加到重恒定结构域和轻恒定结构域，其中重恒定结构域包括变体(包含在CH1结构域以及Fc结构域内)。序列表中含有的scFv序列利用特定带电连接子，而如本文概述的，可以使用不带电或其它带电连接子，包含图7中所描述的那些。
另外，如上文所讨论的，序列表中使用的用于鉴定CDR的编号是Kabat，然而，可以使用不同的编号，所述不同的编号将改变如表2所示的CDR的氨基酸序列。
对于本文所列出的所有可变重和轻结构域，可以制备另外的变体。如本文概述的，在一些实施例中，一组6个CDR可以具有0个、1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(其中氨基酸取代特别有用)以及可变重和轻结构域的框架区的变化，只要框架(除CDR之外)保持与选自图1中的美国专利第7,657,380号中列出的那些序列的人种系序列至少约80％、85％或90％同一性，所述美国专利的附图和图例通过引用整体并入本文。因此，例如，如本文所描述的相同CDR可以与来自人种系序列的不同框架序列组合，只要框架区保持与选自图1中的美国专利第7,657,380号中列出的那些序列的人种系序列至少80％、85％或90％同一性。可替代地，CDR可以具有氨基酸修饰(例如，一组CDR中的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸修饰(也就是说，只要一组6个CDR的变化的总数量小于6个氨基酸修饰，CDR就可以被修饰，其中CDR的任何组合被改变；例如，vlCDR1中可以存在一个改变，vhCDR2中可以存在两个改变，vhCDR3中不存在改变等))，并且具有框架区改变，只要框架区与选自图1中的美国专利第7,657,380号中列出的那些序列的人种系序列保持至少80％、85％或90％同一性。
1.FAP抗原结合结构域
如上所讨论的，本文提供的抗FAP抗体包含一个或多个FAP抗原结合结构域。本文提供的FAP结合结构域表现出对FAP的广泛程度的亲和力(参见例如，图45-49)。进而，包含此类FAP结合结构域的本发明抗体有利地引发一系列不同的免疫应答，这取决于所使用的特定FAP结合结构域。例如，本发明抗体在对具有不同FAP表达的细胞的选择性、对于FAP表达性细胞的效力、引发细胞因子释放的能力以及对可溶性FAP的敏感性方面表现出差异(参见例如，实例6-8)。此类FAP结合结构域和相关的抗体可用于例如治疗FAP相关癌症。
如本领域的技术人员将理解的，适合的FAP结合结构域可以包括如在序列表和附图中所描绘的或如其被加下划线的一组6个CDR，或在如本文所述并且如表2中所示的使用不同编号方案的情况下，使用在图14和45中所描绘的那些序列的可变重(vh)链结构域和可变轻结构域(vl)序列内的其它比对鉴定的CDR。适合的FAP ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个vh和vl序列。
在一个实施例中，FAP抗原结合结构域包含任何FAP结合结构域的6个CDR(即，vhCDR1-3和vlCDR1-3)。
除了在附图和序列表中所公开的形成ABD到FAP的亲本CDR组之外，本文提供了具有作为本文公开的FAP ABD CDR的变体的CDR的FAP ABDS(例如，图14和45)。在一个实施例中，FAP ABD包含来自亲本FAP ABD CDR的具有1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化的一组6个CDR(参见例如，图14和45)。在某些实施例中，FAP ABD能够结合FAP抗原，如通过Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量法，例如Octet测定)测定中的至少一种测定所测量的，其中后者特别用于许多实施例中。
在一个实施例中，FAP抗原结合结构域包含FAP ABD的6个CDR(即，vhCDR1-3和vlCDR1-3)，其中所述FAP ABD是以下FAP ABD之一：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAPH0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAPH0.26_L0.11)；XENP27969(aFAP H0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
在另一个示例性实施例中，FAP ABD包含本文公开的FAP ABD中的任一个的可变重(VH)结构域和可变轻(VL)结构域(参见例如，图14和45)。
除了本文公开的亲本FAP可变重和可变轻结构域之外，本文提供了包含可变重结构域和/或可变轻结构域的FAP ABD，所述可变重结构域和/或可变轻结构域是本文公开的FAP ABD VH和VL结构域的变体。在一个实施例中，变体VH结构域和/或VL结构域与图14或45中所描绘的FAP ABD的亲本VH和VL结构域相比具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化。在某些实施例中，FAP ABD能够与FAP结合，如Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量法，例如，Octet测定)测定中的至少一种测定所测量的，其中后者特别用于许多实施例中。
在另一个实施例中，变体VH和/或VL结构域与如图14或45中所描绘的FAP ABD的VH和/或VL至少90％、95％、97％、98％或99％相同。在某些实施例中，FAP ABD能够与FAP结合，如通过Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量法，例如，Octet测定)测定中的至少一种测定所测量的，其中后者特别用于许多实施例中。
在一些实施例中，抗FAP抗体的FAP ABD包含FAP ABD的VH和VL，其中所述FAP ABD是以下FAP ABD之一：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAPH0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAPH0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
2.CD3抗原结合结构域
在一些实施例中,ABD之一与CD3结合。图12和13以及序列表中描绘了适合的多组6个CDR和/或vh和vl结构域以及scFv序列。具有特别用途的CD3结合结构域序列包含但不限于抗CD3 H1.30_L1.47、抗CD3 H1.32_L1.47、抗CD3 H1.89_L1.47、抗CD3 H1.90_L1.47、抗CD3 H1.33_L1.47和抗CD3 H1.31_L1.47，以及在图12中描绘的那些。
如本领域的技术人员将理解的，适合的CD3结合结构域可以包括如在序列表和附图中所描绘的或如其被加下划线的一组6个CDR，或在如本文所述并且如表2中所示的使用不同编号方案的情况下，使用在图12中所描绘的那些序列的vh和vl序列内的其它比对鉴定的CDR。适合的ABD还可以包含如这些序列和附图中所描绘的用作scFv或Fab的整个vh和vl序列。在本文中含有Fv到CD3的许多实施例中，与CD3结合的是scFv单体。
除了附图和序列表中公开的形成ABD到CD3的亲本CDR组之外，本发明提供了变体CDR组。在一个实施例中，一组6个CDR可以具有来自亲本CDR的1个、2个、3个、4个或5个氨基酸变化，只要CD3 ABD仍然能够与靶抗原结合，如通过Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量法，例如Octet测定)测定中的至少一种测定所测量的，其中后者特别用于许多实施例中。
除了本文公开的形成ABD到CD3的亲本可变重结构域和可变轻结构域之外，本发明提供了变体vh和vl结构域。在一个实施例中，变体vh和vl结构域各自可以具有来自亲本vh和vl结构域的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸变化，只要ABD仍然能够与靶抗原结合，如Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量法，例如Octet测定)测定中的至少一种测定所测量的，其中后者特别用于许多实施例中。在另一个实施例中，变体vh和vl与相应的亲本vh或vl具有至少90％、95％、97％、98％或99％相同，只要ABD仍然能够与靶抗原结合，如通过Biacore、表面等离子体共振(SPR)和/或BLI(生物层干涉测量法，例如Octet测定)测定中的至少一种测定所测量的，其中后者特别用于许多实施例中。
在一些实施例中，双特异性抗体包含H1.30_L1.47 CD3抗原结合结构域作为包含在图9的任何1+1Fab-scFv-Fc形式主链内的scFv。在一些实施例中，双特异性抗体包含H1.32_L1.47 CD3抗原结合结构域作为包含在图9的任何1+1Fab-scFv-Fc形式主链内的scFv。
在一些实施例中，双特异性抗体包含H1.30_L1.47 CD3抗原结合结构域作为包含在图10的2+1Fab2-scFv-Fc主链内的scFv(还参见图63)。在一些实施例中，双特异性抗体包含H1.32_L1.47 CD3抗原结合结构域作为包含在图10的中心scFv形式主链形式主链内的scFv(还参见图63)。
VI.有用的实施例
在一个实施例中，用于本发明的偏斜变体和pI变体的特定组合是T366S/L368A/Y407V:T366W(任选地包含桥接二硫化物、T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)，其中一个单体包括Q295E/N384D/Q418E/N481D，并且另一个单体包括带正电的scFv连接子(当所述形式包含scFv结构域时)。如本领域将理解的，“隆凸入孔”变体不改变pI，并且因此可以用在任一单体上。
VII.核酸
在另一方面，本文提供了对FAP结合结构域和抗FAP抗体(FAP x CD3双特异性抗体和FAP单特异性抗体)进行编码的核酸组合物。
如本领域的技术人员将理解的，核酸组合物将依赖于异源二聚体蛋白的形式和支架。因此，例如，当所述形式需要三个氨基酸序列时，例如对于1+1Fab-scFv-Fc或2+1Fab2-scFv-Fc形式，三个核酸序列可以结合到一个或多个表达载体中以进行表达。类似地，一些形式(例如，双scFv形式，如图1公开的形式)仅需要两种核酸；再次，所述两种核酸被放入到一个或多个表达载体中。
如本领域已知的，对本文公开的FAP结合结构域和FAP抗体的组分进行编码的核酸可以结合到如本领域已知并且取决于用于产生本发明的异源二聚体抗体的宿主细胞的表达载体中。通常，核酸可操作地连接到任何数量的调节元件(启动子、复制起点、可选择标志物、核糖体结合位点、诱导剂等)。表达载体可以是染色体外的或整合载体。
本发明的核酸和/或表达载体然后转化成如本领域众所周知的任何数量的不同类型的宿主细胞，包含哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和/或真菌细胞，其中哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)可用于许多实施例中。
在一些实施例中，如果取决于形式适用的话，对每个单体进行编码的核酸和对轻链进行编码的任选核酸通常在不同或相同的启动子对照条件下各自包含在单个表达载体内。在特别用于本发明的实施例中，这两个或这三个核酸中的每个核酸包含在不同表达载体上。如本文所示并且如特此通过引用并入的US 62/025,931所示的，不同的载体比率可以用于驱使异源二聚体形成。也就是说，令人惊讶地，虽然蛋白质包括1:1:2比率的第一单体:第二单体:轻链(在本文中具有包括异源二聚体抗体的三个多肽的许多实施例的情况下)，但是这些并非得到最佳结果的比率。
通过培养包括如本领域众所周知的一个或多个表达载体的宿主细胞来制备本发明的异源二聚体抗体。一旦产生，就执行传统抗体纯化步骤，包含离子交换色谱法步骤。如本文所讨论的，使两个单体的pI相差至少0.5可以允许通过离子交换色谱法或等电聚焦或对等电点敏感的其它方法进行分离。也就是说，包含改变每个单体的等电点(pI)的pI取代使得每个单体具有不同的pI并且异源二聚体也具有不同的pI，从而促进“1+1Fab-scFv-Fc”异源二聚体的等电纯化(例如，阴离子交换柱、阳离子交换柱)。这些取代还有助于测定和监测任何污染的双scFv-Fc和纯化后mAb同源二聚体(例如，IEF凝胶、cIEF和分析型IEX柱)。
VIII.异源二聚体FAP x CD3抗体的生物和生物化学功能
通常，向患有癌症的患者施用本文所述的双特异性FAP x CD3抗体，并且以本文所述的多种方式对功效进行评估。因此，虽然可以进行标准功效测定，如癌症负载、肿瘤大小、转移的存在或程度的评估等，但是也可以基于免疫状态评估来评定免疫肿瘤学治疗。这可以以多种方式进行，包含体外和体内测定两者。治疗
一旦制备，本发明的组合物可用于许多应用。发现FAP与正常组织相比在癌症相关成纤维细胞(CAF)中通常升高。CAF涉及肿瘤存活和增殖，例如通过提供用于血管生成的生长因子和通过促进免疫抑制环境，并且已经与不良预后相关。因此，FAP是用于癌症疗法的适合的靶标。因此，本发明的异源二聚体组合物可用于治疗涉及FAP阳性CAF的癌症。
A.用于体内施用的抗体组合物
通过将具有期望程度的纯度的抗体与任选的药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂(如《雷明顿药物科学(Remington’s Pharmaceutical Sciences)》,第16版,Osol,A.编辑[1980])进行混合来制备根据本发明使用的抗体的调配物，以供以冻干调配物或水溶液的形式进行储存。可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包含缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，锌-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
B.施用方式
本发明的抗体和化疗剂根据已知的方法，如静脉内施用(作为推注(bolus)或通过在一段时间内连续输注)向受试者施用。
C.治疗方式
在本发明的方法中，疗法用于提供关于疾病或病状的阳性治疗应答。“阳性治疗应答”旨在改善疾病或病状，和/或改善与疾病或病状相关的症状。例如，阳性治疗应答是指疾病的以下改善中的一种或多种改善：(1)减少赘生性细胞的数量；(2)增加赘生性细胞死亡；(3)抑制赘生性细胞存活；(5)抑制(即，在某种程度上减慢，优选地停止)肿瘤生长；(6)增加患者存活率；以及(7)与疾病或病状相关的一个或多个症状的一些缓解。
可以通过对所述疾病或病状具有特异性的归一化应答标准来确定任何给定疾病或病状的阳性治疗应答。可以使用如磁共振成像(MRI)扫描、x放射影像成像、计算机断层摄影术(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和包含骨髓穿刺(BMA)在内的肿瘤活检取样等筛选技术以及对循环中的肿瘤细胞进行计数来评估针对肿瘤形态(即，总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)变化的肿瘤应答。
除了这些阳性治疗应答之外，经受疗法的受试者可能经历与疾病相关的症状的改善的有益效果。
根据本发明的治疗包含所使用的“治疗有效量”的药物。“治疗有效量”是指以剂量计并且持续所需的时间段以实现期望的治疗结果的有效量。
治疗有效量可以根据如个体的疾病状态、年龄、性别和重量等因素以及药物在个体中引发期望的应答的能力而变化。治疗有效量也是抗体或抗体部分的治疗有益效果超过其任何毒性或有害效果的量。
肿瘤疗法的“治疗有效量”还可以通过其稳定疾病的进展的能力测量。可以在预示人类肿瘤中的功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。
可替代地，通过熟练的从业者已知的体外测定，组合物的这种性质可以通过检验化合物抑制肿瘤生长或诱导凋亡的能力来评估。治疗有效量的治疗化合物可以减小肿瘤大小或以其它方式改善受试者的症状。本领域的普通技术人员将能够基于如受试者的大小、受试者症状的严重程度和特定组合物或所选的施用途径此类因素确定这种量。
调整剂量方案以提供最佳的所期望应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用单次推注，可以随时间推移施用若干次分剂量，或可以按治疗状况的紧急情况所指示的成比例地减少或增加剂量。为了易于施用和剂量的均匀性，肠胃外组合物可以按剂量单位调配。如本文所使用的剂量单位形式是指适于作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位含有与所需药物载剂相关的、经过计算以产生所期望治疗效果的预定量的活性化合物。
针对本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：(a)活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，和(b)个体敏感性对复合用于治疗的此类活性化合物造成的本领域固有限制。
用于本发明的双特异性抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病状并且可以由本领域的技术人员确定。
用于本发明的治疗有效量的双特异性抗体的示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg。
所有引用的参考文献均通过引用整体明确并入本文。
尽管出于说明的目的已经在上文描述了本发明的特定实施例，但是本领域的技术人员将理解的是，在不脱离如所附权利要求所描述的本发明的情况下可以做出许多细节变化。
实例
以下提供实例以说明本发明。这些实例并不意味着将本发明限制于任何特定的应用或操作理论。对于本发明中所论述的所有恒定区位置，根据如Kabat中的EU索引(Kabat等人,1991,《免疫学相关蛋白质序列》第5版,美国公共卫生署,国立卫生研究院,贝塞斯达，其以引用的方式整体并入本文中)。抗体领域中的技术人员将了解这个规约由以下组成：免疫球蛋白序列的特定区域的非顺序编号、对免疫球蛋白家族中的保守位置实现归一化的称呼。因此，由EU索引定义的任何给定免疫球蛋白的位置不一定对应于其顺序序列。
在美国公开2015/0307629、2014/0288275和WO2014/145806中概述了通用和具体的科学技术，所有所述公开通过引用明确并入，特别是针对其中概述的技术而明确并入。
实例1：FAP作为靶向肿瘤基质成纤维细胞的适合抗原
背景技术
基于抗体的治疗剂已经成功地用于治疗各种疾病，包含癌症。正在探索的日益普遍的途径是共接合两种不同抗原的单一免疫球蛋白分子的工程化。接合两种不同抗原的此类替代性抗体形式通常称为双特异性抗体。因为抗体可变区(Fv)的相当大的多样性使得可以产生识别几乎任何分子的Fv，所以产生双特异性抗体的典型方法是将新的可变区引入到抗体中。
双特异性抗体的特别有用的方法是使接合CD3的第一结合结构域和接合与癌细胞相关或在癌细胞上上调的抗原的第二结合结构域工程化，使得双特异性抗体重定向CD3+T细胞以破坏癌细胞。然而，肿瘤细胞可以脱落这些抗原作为癌症免疫编辑的一部分(Hochst和Diehl,2012)，从而有助于所述肿瘤细胞的免疫逃逸并降低靶向癌症相关抗原的此类治疗的功效。因此，另一种方法是在已知支持肿瘤细胞存活的肿瘤环境中靶向其它细胞。
成纤维细胞代表肿瘤环境中的大多数基质细胞。已经报道了这些癌症相关成纤维细胞(CAF)例如通过提供用于血管生成的生长因子和通过促进免疫抑制环境来促进肿瘤存活和增殖(Orimo等人,2006；Xing等人,2011)，并且已经与不良预后相关(Underwood等人,2015)。因此，已经尝试通过靶向CAF来破坏肿瘤，但是迄今为止，此类治疗在临床试验中是无效的(Barnett和Vilar,2018)。
成纤维细胞活化蛋白(FAP)是一种参与胞外基质重塑的丝氨酸蛋白酶(Kelly等人,2012)。已经发现FAP在CAF中高度表达(Scanlan等人,1994)。已经开发了许多FAP靶向疗法来靶向CAF，如抗FAP mAb西罗珠单抗和FAP-CAR-T。虽然显示成功地靶向CAF而没有副作用，但西罗珠单抗不满足早期II期试验中至少一次完全或部分缓解的临床试验继续的最低要求(Scott等人,2003；Hofheinz等人,2003)。另一方面，以基于抗小鼠FAP抗体73.3的FAP-CAR-T细胞(人和小鼠两者)的过继转移为特征的临床前数据显示成功地限制了用人间皮瘤细胞移植的小鼠以及用鼠胰腺癌细胞移植的小鼠中的肿瘤生长。然而，在小鼠肿瘤模型中使用基于FAP5 mAb的抗鼠FAP-CAR-T细胞的单独研究导致骨髓毒性和恶病质(Tran等人,2013)。因此，对于具有增强的安全性特征的靶向CAF的有效疗法存在需要和潜力。
1A：与匹配的正常组织相比，FAP在肿瘤组织中上调
在寻求鉴定用于靶向破坏肿瘤基质的适合抗原时，使用来自癌症基因组图谱项目(TCGA)的RNA测序数据来研究CAF相关抗原在肿瘤组织相对于匹配的正常组织上的转录水平。从FireBrowse(http://firebrowse.org/)下载V2RSEM数据，并且使用R用定制例程进行分析。在图22中描绘了与各种癌症相关的肿瘤组织和匹配的正常组织上的FAP转录水平。数据显示，除了若干种癌症(例如，宫颈鳞状细胞癌、胰腺癌、胸腺瘤和子宫体子宫内膜癌)之外，与匹配的正常组织相比，FAP转录水平在肿瘤组织中通常升高。并且在胰腺癌的情况下，与大多数其它正常组织相比，FAP转录水平在癌组织中大大升高。这表明靶向肿瘤相关基质成纤维细胞上的FAP应该导致最小的在靶/脱肿瘤毒性。
1B：各种细胞系中的FAP表达水平
接下来，研究了许多细胞系上的FAP表达水平。在第一实验中，将来自Detroit-551(正常皮肤成纤维细胞)、BJ人成纤维细胞(正常皮肤成纤维细胞)、IMR-90(正常肺成纤维细胞)、HFL-1(正常肺成纤维细胞-胎儿)、NCI-H196(小细胞肺癌，源自转移位点：胸腔积液)、U937(组织细胞性淋巴瘤)、HCC1143(原发性导管癌，TNMA IIA期，3级)、WI-38(正常肺成纤维细胞-胎儿)、SK-MEL-3(恶性黑色素瘤，源自转移位点：淋巴结)、NCI-H661(大细胞肺癌，源自转移位点：淋巴结)、HL60(急性早幼粒细胞性白血病)、HT29(结肠直肠腺癌)以及A549(肺癌)细胞系的500K细胞与多种浓度(4、2、1以及0.5μg/ml)的小鼠抗人FAP(R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州(Minneapolis,Minn.))在冰上温育1小时。将细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并且然后在冰上用Dako
Figure BDA0002762852890001381
检测抗体(安捷伦公司(Agilent)，圣克拉拉，加利福尼亚州)染色45分钟，并且根据制造商的说明书。染色后，将细胞用PBS洗涤两次，并且再悬浮于200μl FACS缓冲液(含1％PFA的PBS)中，并且在FACSCanto细胞计数器(BD生物科学公司(BD Biosciences)，圣何塞，加利福尼亚州)上通过流式细胞术进行分析。图24中描绘了各种细胞系上的FAP抗原编号。
在另一个实验中，将来自WI-38、IMR-90、Detroit551、HFL-1、BJ人成纤维细胞、SW872和NCI-H196细胞系的200K细胞用多种浓度的抗体(小鼠抗FAP-APC(R&D系统公司(R&DSystems)，明尼阿波利斯，明尼苏达州)或抗小鼠IgG-APC(R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州)作为同种型对照物)在冰上染色一小时。染色后，将样品用PBS洗涤一次，并且重悬于200μl FACS缓冲液中并通过流式细胞术进行分析。图25中描绘了指示通过抗FAP抗体或同种型对照抗体结合的APC MFI。
1C：WI-38作为骨髓干细胞替代物
Tran等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》210(6)::1125-1135(2013)报道了在用包括来自FAP5 mAb的scFv的抗FAP-CAR-T细胞处理之后在小鼠中的恶病质和骨髓毒性。具体地，发现鼠骨髓干细胞表达FAP并且被靶向以被FAP5-CAR-T破坏。因此，重要的是确保新型FAP靶向疗法不破坏骨髓干细胞，如间充质基质细胞(MSC)和造血干细胞(HSC)。研究了MSC和HSC上的FAP表达水平。用抗CD4-PercP/Cy5.5(OKT5)、抗CD8-PercP/Cy5.5(RPA-T8)、抗CD14-PercP/Cy5.5(M5E2)、抗CD16-PercP/Cy5.5(3G8)、抗CD56-PercP/Cy5.5(MY31)、抗CD20-PercP/Cy5.5(2H7)、抗CD105-PE(SN6)、抗CD73-APC(AD2)、抗CD90-BV421(5E10)、抗CD34-BUV395(563)、抗CD133-PE-Vio615(AC133)、抗CD31-BV605(WM59)、抗CD45-AF700(D058-1283)、抗CD117-BV711(104D2)、抗CD11b-BV786(1CRF44)以及抗FAP-Alexa488(XENP23534、XENP24460或XENP24861，其是内部纯化和标记的)标记来自5个单独供体的100μl的骨髓抽吸物。在与染色抗体一起温育之后，将ACK裂解缓冲液添加到混合物中以裂解红细胞。最后，将细胞固定在FACS缓冲液中，并在BD Fortessa X-20(BD生物科学公司，圣何塞，加利福尼亚州)上通过流式细胞术进行分析。MSC被定义为谱系阴性(CD4-CD8-CD14-CD16-CD56-CD20-)和CD34-CD105+CD90+CD73+，并且HSC被定义为谱系阴性和CD34+CD105-。还鉴定了谱系阴性CD31+群体，其亚群体是FAP阳性的。最后，根据来自抗FAP抗体的结合的MFI评估MSC、HSC和谱系阴性CD31+FAP+细胞(以及WI-38、HFL-1和Detroit-551细胞)上的FAP表达，其数据描绘于图26中。虽然数据证实MSC和HSC(以及谱系阴性CD31+细胞的亚群体)具有升高的FAP水平，但是数据还显示FAP水平小于WI-38的FAP水平，这表明WI-38可以是有待通过新型FAP靶向疗法避免的细胞类型的适合的替代物。
实例2：抗FAP x抗CD3双特异性抗体
研究了使用抗FAP x抗CD3双特异性抗体(bsAb)来重定向CD3+效应T细胞以破坏肿瘤基质成纤维细胞的潜力。为此，使用来自现有技术抗FAP抗体(如西罗珠单抗(参见例如，2002年9月24日授予的美国专利第US 6,455,677号)、29B11和3F2(参见例如，2012年2月16日公开的WO 2012/020006))的可变区产生抗FAP x抗CD3 bsAb，其序列描绘于图13中。在bsAb中使用的抗CD3 scFv的序列包含在图12中。
2A：抗FAP x抗CD3双特异性抗体的产生
在图16中描绘了说明性抗FAP x抗CD3 bsAb的示意图。图16A描绘了“1+1Fab-scFv-Fc”形式，所述形式包括重组地融合到异源二聚体Fc的一侧的单链Fv(“scFv”)、重组地融合到异源二聚体Fc的另一侧的重链可变区(VH)以及分开转染的轻链(LC)，这样使得Fab结构域与可变重结构域一起形成。图16B描绘了“2+1Fab2-scFv-Fc”形式，所述形式包括重组地融合到融合到异源二聚体Fc的一侧的scFv的VH结构域、重组地融合到异源二聚体Fc的另一侧的VH结构域以及分开转染的LC，这样使得Fab结构域与VH结构域一起形成。
通过基因合成产生对抗FAP可变重链可变和可变轻结构域进行编码的DNA，并且将其亚克隆到含有适当的融合配偶体(例如，恒定区或抗CD3scFv-Fc)的pTT5表达载体中。通过基因合成产生对抗CD3 scFv-Fc重链进行编码的DNA。将DNA转染到HEK293E细胞中以进行表达。图17和18中描绘了序列还产生了抗RSV x抗CD3双特异性抗体作为对照，其序列描绘于图19中。
2B：FAP与原型抗FAP x抗CD3 bsAb的结合
使用Octet针对与人和食蟹猴FAP的结合筛选如上所述产生的说明性抗FAP x抗CD3 bsAb。Octet的实验步骤通常包含以下：固定(将配体捕获到生物传感器上)；缔合(将配体涂覆的生物传感器浸入到含有连续稀释液的分析物的孔中)；以及解离(将生物传感器返回到含有缓冲液的孔中)，以确定测试物品的亲和力。仅含有缓冲液的参考孔也包含在用于在数据处理期间进行背景校正的方法中。具体地，HIS1K生物传感器用于捕获His标签的人FAP(对于人FAP序列参见图2A)或His标签的食蟹猴FAP(对于预测的食蟹猴FAP序列参见图2C)并且浸入到多种浓度的每种双特异性抗体中以确定KD，如图27中所描绘的。
2C：具有源自西罗珠单抗的抗FAP结合结构域的抗FAP x抗CD3 bsAb的表征
2C(a)：具有不同FAP表达水平的细胞上的结合
为了研究原型抗FAP(来自西罗珠单抗的可变区)x抗CD3 bsAb与FAP表达性细胞系的结合，将来自WI-38(低FAP表达)、SW872(低FAP表达)、HFL-1(高-中等FAP表达)以及Detroit-551(高FAP表达)细胞系的200K细胞与多种浓度的所指示测试物品在冰上温育一小时。对照包含不用任何测试物品温育和用抗RSV x抗CD3-高bsAb(XENP13245)温育。在用测试物品温育之后，将样品用第二检测抗体染色并且通过流式细胞术进行分析。图28中描绘了指示bsAb结合的PE MFI，并且图29描绘了细胞系上细胞结合的EC50。数据显示，1+1Fab-scFv-Fc形式比2+1Fab2-scFv-Fc形式更多地与细胞结合，这表明源自西罗珠单抗的结合结构域的高亲和力FAP结合活性特征消除了2+1Fab2-scFv-Fc形式预期的亲合力效应。相反，1+1Fab-scFv-Fc形式的单价性允许更多的bsAb结合，从而导致较高的PE MFI。还在具有高FAP水平的细胞上观察到亲合力效应的消除，例如Detroit-551。
2C(b)：对具有不同FAP表达水平的细胞的重定向的T细胞细胞毒性
接下来，研究了原型抗FAP(来自西罗珠单抗的可变区)x抗CD3 bsAb对具有不同FAP表达水平的细胞系的重定向的T细胞细胞毒性(RTCC)。将WI-38、SW872、HFL-1以及Detroit-551与人PBMC和所指示测试物品在37℃下以10:1的效应子:靶标比率温育24小时。使用CytoTox-ONETM同质膜完整性测定(普洛麦格(Promega)，麦迪逊，威斯康星州)来测定RTCC以根据制造商的说明书测量乳酸脱氢酶水平，并且在Wallac Victor2酶标仪(珀金埃尔默(PerkinElmer)，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)上获取数据。
图30中所描绘的数据指示bsAb的RTCC效力取决于抗CD3 scFv的亲和力。值得注意地，在作为表达较低水平的FAP的细胞的WI-38和SW872上，由于通过2+1Fab2-scFv-Fc形式传递的额外亲合力，2+1Fab2-scFv-Fc形式在诱导RTCC中总体上比1+1Fab-scFv-Fc形式更有效。在具有较高FAP水平的细胞，如HFL-1和Detroit-551上，亲合力效应减弱。
2D：具有不同抗FAP结合结构域的另外的原型抗FAP x抗CD3 bsAb的RTCC
为了研究使用替代性抗FAP结合结构域的作用，将具有源自西罗珠单抗、29B11或3F2的抗FAP可变区的原型抗FAP x抗CD3 bsAb针对RTCC在各种细胞系上进行体外比较，如上文实例2C(b)中总体上所述的。
在第一实验中，将表达高水平的FAP(Detroit-551、BJ人成纤维细胞、IMR-90和HFL-1)的细胞与人PBMC和所指示测试物品在37℃下以10:1的效应子:靶标比率温育24小时。图31中所描绘的数据显示每种FAP表达性细胞系被各种形式的抗FAP bsAb杀死。与实例2C(b)中所述的结果一致，对于每个抗FAP结合结构域，2+1Fab2-scFv-Fc形式比1+1Fab-scFv-Fc形式更有效。值得注意地，基于29B11的bsAb比基于3F2的bsAb更有效，这表明RTCC效力还可以取决于抗FAP结合结构域的亲和力。
在另一个实验中，将表达低水平的FAP(WI-38和SW872)的细胞与人PBMC和所指示测试物品在37℃下以10:1的效应子:靶标比率温育24小时。如上所述测定RTCC，并且图32中描绘了数据。
实例3：另外的FAP抗原结合结构域的产生
除了报道由用其FAP5-CAR-T细胞治疗引起的骨髓毒性之外，Tran等人(2013)注意到靶向FAP的若干其它临床前研究没有报道显著的毒性。假设毒性的缺乏可能是由于效力和/或靶向FAP表位的差异。进一步地，如实例2D所述，抗FAP结合结构域的亲和力可能影响双特异性抗体的RTCC效力。因此，产生了另外的FAP抗原结合结构域(ABD)以鉴定具有一定亲和力并且结合不同于FAP5的表位的ABD。
3A：噬菌体展示文库
内部产生具有组氨酸标签的重组人、食蟹猴和鼠FAP(序列参见图2)以用于噬菌体淘选。通过吉布森组装(Gibson assembly)在pTT5载体中构建对抗原进行编码的质粒。在HEK293E细胞的瞬时转染之后，通过NiNTA色谱法纯化分泌性抗原。
建立内部从头噬菌体文库，在噬菌体外壳蛋白pIII上展示Fab和scFv变体，并且在5轮中针对人、食蟹猴和鼠FAP进行淘选。在第一轮之前和每一轮之后，将噬菌体添加到对数期XL1-Blue细胞(安捷伦公司，威明顿市，特拉华州)中并且在37℃、250rpm下温育过夜。Fab和scFv克隆是针对其VH和VL同一性的序列，通过吉布森组装从这些序列中构建质粒并且将其亚克隆到含有IgG1恒定区的编码序列的pTT5表达载体中。将DNA在HEK293E中转染以进行表达，并且通过蛋白A色谱法纯化抗体。图15中描绘了被格式化为二价mAb的示例性噬菌体源性克隆的氨基酸序列。
3B：噬菌体源性抗FAP抗体的亲和力筛选
在通过Octet纯化之前，如在实例2B中总体上所述的，针对亲和力筛选噬菌体源性抗FAP抗体。具体地，使用抗人IgG-Fc(AHC)生物传感器来捕获来自HEK293E培养物的1:5稀释液的上清液并且浸入到100nM的人、食蟹猴或鼠FAP中。图33中描绘了所选噬菌体源性抗FAP抗体的结果。数据显示，所述克隆展示出一系列FAP结合活性，并且所述克隆中的若干克隆对于鼠FAP是交叉反应性的。
3C：噬菌体源性抗FAP抗体不与DPP4非特异性地结合
DPP4(图22中所描绘的序列)是具有68％同一性的FAP同源物。为了进一步避免脱靶毒性，使用Octet来研究噬菌体源性抗FAP结合结构域是否与DPP4交叉反应。HIS1K生物传感器用于捕获His标签的DPP4(义翘神州生物技术有限公司(Sino Biological)，北京，中国))并且浸入到100nM的噬菌体源性抗FAP mAb中。图34中描绘了描绘每个测试物品与DPP4的结合的传感图的叠加。数据显示，噬菌体源性抗FAP抗体均不与DPP4结合。
3D：噬菌体源性抗FAP结合结构域不与FAP5和西罗珠单抗结合同一表位
接下来，使用Octet来鉴定不与FAP5结合结合同一表位的克隆。首先使用HIS1K生物传感器来捕获带组氨酸标签的人FAP，将其浸入到第一抗体(列于图35中的表的左侧)中，并且然后浸入到第二抗体(列于图35中的表的顶部)中。BLI应答针对将生物传感器浸入到HBS-EP缓冲液中，然后浸入到第二抗FAP抗体中的BLI应答进行归一化。如果第二抗体提供小于0.41的归一化BLI应答，则认为这两种抗体位于同一表位仓中，即识别非常类似或大部分重叠的表位。图35中概括了每个噬菌体对的归一化BLI应答。所述分箱显示，噬菌体源性抗FAP结合结构域均不与FAP5或西罗珠单抗同一/类似的表位结合。
3E：噬菌体源性抗FAP克隆不与西罗珠单抗在WI-38细胞上竞争结合
为了研究噬菌体源性抗FAP克隆是否与西罗珠单抗在FAP表达性细胞上竞争结合，将200K WI-38细胞与多种浓度的所指示测试物品在冰上温育30分钟。温育后，添加AlexaF488-标记的XENP23534(西罗珠单抗)并且温育持续额外的30分钟。接下来，将样品用冰冷的PBS洗涤一次，并且重悬于150μl冰冷的FACS缓冲液中并通过流式细胞术进行分析。图36中描绘AlexaF488MFI(指示在与所指示测试物品温育之后通过XENP23534结合)的数据显示，没有噬菌体源性抗FAP克隆与西罗珠单抗竞争结合。
实例4：表征另外的抗FAP(噬菌体源性)x抗CD3双特异性抗体
用噬菌体源性FAP结合结构域产生另外的抗FAP x抗CD3 bsAb，如实例2A中总体上所述的。还使用基于克隆1E5A5的另外的抗FAP结合结构域，但其中轻链被人种系VLk 1-39和J链序列代替。图20和21中描绘了说明性双特异性抗体的序列。
4A：具有噬菌体源性抗FAP结合结构域的1+1Fab-scFv-Fc双特异性Ab对FAP表达性 细胞系的重定向的T细胞细胞毒性
如实例2C(b)中总体上所述的，通过被格式化为二价mAb(具有经烧蚀的效应子功能)或1+1Fab-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3 bsAb的噬菌体源性抗FAP结合结构域进行RTCC的研究。将Detroit-551、SW872或WI-38细胞与人PBMC和所指示测试物品在37℃下以10:1的效应子:靶标比率温育24小时。图37中所描绘的数据显示，具有噬菌体源性抗FAP结合结构域的许多bsAb诱导对FAP表达性细胞的杀伤，而具有经烧蚀的效应子功能的二价mAb不诱导对FAP表达性细胞的杀伤。另外，数据显示，RTCC通常在具有高FAP表达水平(即，Detroit-551)的细胞上比在具有较低FAP表达水平(即，SW872和WI-38)的细胞上被更有效地诱导。
4B：各种形式的抗FAP(噬菌体源性)x抗CD3对FAP表达性细胞系的重定向的T细胞 细胞毒性
接下来在许多实验中，所选噬菌体源性抗FAP结合结构域被格式化为呈1+1Fab-scFv-Fc形式和2+1Fab2-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3 bsAb的一部分，其中抗CD3 scFv具有高或高中等亲和力，并且对FAP表达性细胞上的RTCC进行研究，如实例2C(b)中总体上所述的。图38-40中描绘了数据。数据显示，若干抗FAP x抗CD3 bsAb，包含XENP25193、XENP25195、XENP25967和XENP25194，在具有高FAP表达的细胞系上诱导有效的RTCC(例如，BJ人成纤维细胞和HFL-1)，并且在具有低FAP表达的细胞系上诱导最小或基本上降低的RTCC活性(例如，如实例1C中所述的WI-38被选择作为细胞类型的替代物以避免)。
实例5：食蟹猴中的初步研究
在食蟹猴中进行初步研究，以研究示例性抗FAP x抗CD3 bsAb的体内特征，如T细胞再分布。向10组猴子(n＝3)以低剂量或高剂量施用单次静脉内(i.v.)剂量的示例性噬菌体源性bsAb，以及XENP23535和XENP23536作为西罗珠单抗来源的对照。
通过本发明的bsAb，将来自外周血的T细胞再分布评估为T细胞重定向到FAP表达性细胞的指示剂。首先用抗CD3-BUV395(SP-34-2)、抗CD4-APC(OKT4)、抗CD8-PerCP-Cy5.5(RPA-T8)、抗CD16-BV421(3G8)、抗CD66-APC-Cy7(TET2)以及抗CD45-AF700(D058-1283)抗体对外周血进行染色，以针对各种细胞群体进行门控。图41和42中描绘了CD4和CD8表达性细胞的计数。数据显示，在用噬菌体源性bsAb给药之后，来自外周血的CD4+和CD8+淋巴细胞快速再分布，这指示靶标依赖性T细胞重定向。
实例6：对FAP结合结构域的亲和力进行微调以进一步增强选择性
为了扼要重述以上发现，可以对2+1Fab2-scFv-Fc形式的bsAb进行微调(例如，通过降低CD3结合亲和力和/或肿瘤抗原结合亲和力)以对具有高肿瘤抗原密度的细胞比对具有低肿瘤抗原密度的细胞具有高度选择性，而具有高CD3和肿瘤抗原结合亲和力的1+1Fab-scFv-Fc形式的未经微调的bsAb是更广泛反应性的。在图44中表示如在实例2D(图31和32)和实例4(图38-40)中所呈现的XENP23535和XENP25967的说明性数据以突出此发现。具有高亲和力CD3结合和高亲和力FAP结合两者的XENP23535在具有高密度和低密度FAP表达两者的细胞上诱导有效的RTCC活性。另一方面，对于XENP25967，虽然CD3结合和FAP结合亲和力两者均降低，但是由2+1形式提供的亲合力使得分子仍然能够在具有高密度FAP表达的细胞上诱导RTCC活性，同时避免具有低密度FAP表达的细胞。与此相一致，如实例2C(b)-2D中所呈现的数据共同指示，高亲和力肿瘤抗原结合可以在较低浓度下消除亲合力效应并降低选择性。因此，在2+1Fab2-scFv-Fc bsAb形式的上下文中，试图对高亲和力FAP结合结构域的亲和力进行微调。
6A：亲和力去成熟文库
首先产生高亲和力FAP结合结构域的亲和力去成熟文库作为His标签的Fab片段，其说明性序列描绘于图45中。使用如上文总体上所述的Octet来研究所述变体的亲和力。具体地，AHC生物传感器用于捕获HIS-Avi-Fc-huFAP(其序列描绘于图46中)并且浸入到多种浓度的抗FAP Fab变体中的每个变体中。通过用1:1Langmuir结合模型对结合数据进行全局拟合来进行动力学分析。图47-50中描绘了所得解离常数(KD)、缔合速率(ka)和解离速率(kd)(分别针对4个单独实验中的每个实验)。数据显示，获得了具有宽范围亲和力的抗FAP结合结构域。
6B：通过具有亲和力去成熟的FAP结合结构域的2+1Fab2-scFv-Fc形式的抗FAP x 抗CD3 bsAb的RTCC
为了研究使用亲和力去成熟的抗FAP结合结构域的作用，如上文总体上所述的，工程化并产生包括如实例6A中所述的结合结构域的2+1Fab2-scFv-Fc形式的说明性抗FAP x抗CD3 bsAb，其序列描绘于图51中，并且如上文在实例2C(b)中总体上所述的，在各种细胞系上针对RTCC进行体外比较。
将BJ人成纤维细胞(高FAP表达)和WI38(低FAP表达)与人PBMC和所指示测试物品在37℃下以10:1的效应子:靶标比率温育过夜。使用CytoTox-ONETM同质膜完整性测定(普洛麦格，麦迪逊，威斯康星州)测定RTCC以根据制造商的说明书测量乳酸脱氢酶水平，并且在Wallac Victor2酶标仪(珀金埃尔默，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)上获取数据。
图52中所描绘的数据显示，包括具有较高亲和力臂(例如，XENP28114)的FAP结合臂的2+1Fab2-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3 bsAb在FAPlow细胞系上比包括基本上亲和力去成熟的FAP结合臂的bsAb(例如，XENP28115)更有效，而包括基本上亲和力去成熟的FAP结合臂的bsAb在FAPlow细胞系上诱导与在FAPhigh细胞系中相比可忽略的RTCC。这指示对2+1Fab2-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3 bsAb中的FAP结合的亲和力进行微调提供了对具有各种FAP表达密度的细胞的选择性。
6C：通过具有亲和力去成熟的FAP结合结构域的2+1Fab2-scFv-Fc形式的抗FAP x 抗CD3 bsAb的T细胞活化和细胞因子释放
进一步研究了上述抗FAP x抗CD3 bsAb对T细胞的活化和细胞因子释放。CD69是早期活化标志物，并且CD25是晚期活化标志物，所述早期活化标志物和晚期活化标志物两者均在T细胞活化后通过TCR信号传导上调。CD107a是T细胞脱粒和细胞毒性活性的功能标志物。细胞因子释放综合征是指细胞因子(如IFNγ、TNFα和IL-6)从PBMC中过量释放，并且可能在患者中引起威胁生命的反应。
将BJ人成纤维细胞与人PBMC、各种浓度的所指示测试物品以及抗CD107a-BV321以10:1的效应子:靶标比率在37℃下温育24小时。温育之后，收集上清液用于通过V-PLEX促炎小组I人类试剂盒(V-PLEX Proinflammatory Panel 1Human Kit)(根据制造商方案；MesoScale Discovery，罗克维尔市，马里兰州)的细胞因子分析。然后将细胞洗涤，并且用抗CD4-APC-Cy7、抗CD8-PerCP-Cy5.5、抗CD69-APC以及抗CD25-PE-Cy7染色抗体进行染色，并且通过流式细胞术进行分析。对效应细胞进行门控以鉴定CD4+和CD8+T细胞。然后针对CD69、CD25和CD107a表达对T细胞进行门控。图53-56中描绘了描绘CD4+和CD8+T细胞上的标志物的上调的数据，并且图57中描绘了描绘通过PBMC释放IFNγ、TNFα和IL-6的数据。数据显示，具有较低亲和力FAP结合臂的bsAb(例如，XENP28393、XENP28115和XENP28116)在使T细胞活化方面的效力低于具有较高亲和力FAP结合臂的bsAb(例如，XENP28114)。然而，并且值得注意地，与具有较高亲和力FAP结合臂的bsAb相比，具有较低亲和力FAP结合臂的bsAb诱导减少的细胞因子释放。
实例7：抗FAP x抗CD3在可溶性FAP存在下的活性
FAP不仅在细胞表面上表达，而且其还以可溶性形式脱落到循环中。因此，循环中的可溶性FAP可以充当抗原沉默(antigen-sink)并且影响抗FAP x抗CD3双特异性的活性。因此，研究了抗FAP x抗CD3 bsAb在可溶性FAP存在下的活性(内部产生为XENP24370；其序列描绘于图58中)。
7A：呈1+1Fab-scFv-Fc形式的bsAb对可溶性FAP更敏感
将来自2个单独供体的人血浆或食蟹猴血浆与各种浓度的所指示测试物品在室温下温育1.5小时。温育之后，使用人FAP DuoSet ELISA(R&D系统公司，明尼阿波利斯，明尼苏达州)评定样品中的FAP浓度，将其数据描绘于图59中。数据显示在人和食蟹猴血浆两者中，FAP浓度随着XENP23535(呈1+1Fab-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3)剂量依赖性地降低，而FAP浓度受2+1Fab2-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3 bsAb的影响较小。这指示在临床环境中，呈1+1Fab-scFv-Fc形式的抗FAP x抗CD3 bsAb可能更多地经受抗原沉默并且影响bsAb的药代动力学和/或药效学。
7B：呈1+1Fab-scFv-Fc形式的bsAb对可溶性FAP更敏感
将BJ人成纤维细胞(高FAP表达)细胞与人PBMC和所指示测试物品在37℃下以10:1的效应子:靶标比率在具有或不具有100ng/ml可溶性FAP的情况下温育24小时。使用CytoTox-ONETM同质膜完整性测定(普洛麦格，麦迪逊，威斯康星州)测定RTCC以根据制造商的说明书测量乳酸脱氢酶水平，并且在Wallac Victor2酶标仪(珀金埃尔默，沃尔瑟姆，马塞诸塞州)上获取数据。
图60和61中所描绘的数据显示，可溶性FAP降低了若干种测试物品的效力。具体地，具有高亲和力FAP结合臂的bsAb(如XENP28114)证明了在可溶性FAP存在下效力降低最大。值得注意地，具有较低亲和力FAP结合臂的bsAb(如XENP25194、XENP25195、XENP25967、XENP28115和XENP28116)的效力受可溶性FAP的存在影响较小。
实例8：有扩展的抗FAP x抗CD3 bsAb的产生
还产生了具有包括扩展(M428L/N434S)突变的Fc区的抗FAP x抗CD3 bsAb，因为增强的血清半衰期在临床环境中可能是有益的。图62中描绘了用于说明此类bsAb的序列，并且如实例2A中总体上所述的产生了抗体。

Claims (99)

1.一种组合物，其包括成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合结构域，所述FAP结合结构域包括以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的可变重互补决定区1-3(vhCDR1-3)和可变轻互补决定区(vlCDR1-3)：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAPH0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAPH0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述vhCDR1-3和所述vlCDR1-3选自图14和45中提供的FAP结合结构域的vhCDR1-3序列和vlCDR1-3序列。
3.一种组合物，其包括成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合结构域，所述FAP结合结构域包括以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：1A4A5H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAPH0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918 (aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAPH0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAP H0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
4.一种组合物，其包括选自以下成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合结构域的FAP结合结构域：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAPH0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
5.一种核酸组合物，其包括：
a)第一核酸，所述第一核酸对可变重结构域进行编码，所述可变重结构域包括FAP结合结构域的可变重互补决定区1-3(vhCDR1-3)；以及
b)第二核酸，所述第二核酸对可变轻结构域进行编码，所述可变轻结构域包括所述FAP结合结构域的可变轻互补决定区1-3(vlCDR1-3)，其中所述FAP结合结构域是以下FAP结合结构域之一：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAPH0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
6.根据权利要求5所述的核酸组合物，其中所述vhCDR1-3和所述vlCDR1-3选自图14中提供的vhCDR1-3序列和vlCDR1-3序列。
7.一种核酸组合物，其包括：
a)第一核酸，所述第一核酸对可变重结构域进行编码，所述可变重结构域包括FAP结合结构域的可变重结构域；以及
b)第二核酸，所述第二核酸对可变轻结构域进行编码，所述可变轻结构域包括所述FAP结合结构域的可变轻结构域，
其中所述FAP结合结构域是以下FAP结合结构域中的任一个FAP结合结构域：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAPH0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAP H0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
8.一种表达载体组合物，其包括：
a)第一表达载体，所述第一表达载体包括根据权利要求5到7中任一项的第一核酸；以及
b)第二表达载体，所述第二表达载体包括根据权利要求5到7中任一项的第二核酸。
9.一种宿主细胞，其包括根据权利要求8所述的表达载体组合物。
10.一种制备根据权利要求1中任一项的成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合结构域的方法，所述方法包括在所述FAP结合结构域得以表达的条件下培养根据权利要求9所述的宿主细胞；以及回收所述FAP结合结构域。
11.一种抗FAP抗体，其包括成纤维细胞活化蛋白(FAP)结合结构域，所述FAP结合结构域包括以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的可变重互补决定区1-3(vhCDR1-3)和可变轻互补决定区(vlCDR1-3)：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAPH0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAPH0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
12.根据权利要求11所述的抗FAP抗体，其中所述vhCDR1-3和所述vlCDR1-3选自图14和45中的以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3。
13.一种抗成纤维细胞活化蛋白(FAP)抗体，其包括FAP结合结构域，所述FAP结合结构域包括以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAPH0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
14.一种抗成纤维细胞活化蛋白(FAP)抗体，其包括选自以下FAP结合结构域中的任一个FAP结合结构域的FAP结合结构域：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAPH0.26_L0.11)；XENP27969(aFAP H0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
15.根据权利要求11到14中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括：
a)第一单体，所述第一单体包括第一抗原结合结构域和第一恒定结构域；以及
b)第二单体，所述第二单体包括第二抗原结合结构域和第二恒定结构域，
其中所述第一抗原结合结构域或所述第二抗原结合结构域中的任一个抗原结合结构域是所述FAP结合结构域。
16.根据权利要求15所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域与不同的抗原结合。
17.根据权利要求16所述的抗体，其中所述第一抗原结合结构域是所述FAP结合结构域，并且所述第二抗原结合结构域是CD3结合结构域。
18.根据权利要求17所述的抗体，其中所述CD3结合结构域包括以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。
19.根据权利要求18所述的抗体，其中所述CD3结合结构域的所述vhCDR1-3和所述vlCDR1-3选自图12中的vhCDR1-3和vlCDR1-3。
20.根据权利要求17所述的抗体，其中所述CD3结合结构域包括以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。
21.根据权利要求17到20中任一项所述的抗体，其中所述CD3结合结构域是抗CD3scFv。
22.根据权利要求15到21中任一项所述的抗体，其中所述第一恒定结构域和所述第二恒定结构域各自包括CH2-CH3。
23.根据权利要求16到21中任一项所述的抗体，其中所述第一恒定结构域和所述第二恒定结构域各自包括CH1-铰链-CH2-CH3。
24.根据权利要求16到23中任一项所述的抗体，其中所述第一恒定结构域和所述第二恒定结构域各自是变体恒定结构域。
25.根据权利要求16到24中任一项所述的抗体，其中所述第一单体和所述第二单体包括选自由图3中所描绘的异源二聚化变体组成的组的一组异源二聚化变体。
26.根据权利要求25所述的抗体，其中所述一组异源二聚化变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；S364K:L368D/K370S；S364K:L368E/K370S；D401K:T411E/K360E/Q362E；和T366W:T366S/L368A/Y407V。
27.根据权利要求25或26所述的抗体，其中所述第一单体和所述第二单体各自进一步包括烧蚀变体。
28.根据权利要求27所述的抗体，其中所述烧蚀变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K。
29.根据权利要求25到28中任一项所述的抗体，其中所述第一单体或所述第二单体中的至少一个单体进一步包括pI变体。
30.根据权利要求29所述的抗体，其中所述pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D。
31.根据权利要求21所述的抗体，其中所述scFv包括带电scFv连接子。
32.一种核酸组合物，其包括对根据权利要求1到31中任一项所述的抗FAP抗体进行编码的核酸。
33.一种核酸组合物，其包括对根据权利要求15到32中任一项的第一单体和第二单体进行编码的核酸。
34.一种表达载体，其包括根据权利要求32或33的核酸。
35.一种用根据权利要求34所述的表达载体转化的宿主细胞。
36.一种制备根据权利要求11到31中任一项所述的抗FAP抗体的方法，所述方法包括在所述抗FAP抗体得以表达的条件下培养根据权利要求35所述的宿主细胞；以及回收所述抗FAP抗体。
37.一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据权利要求11到31中任一项所述的抗体。
38.一种异源二聚体抗体，其包括：
a)第一单体，所述第一单体包括：
i)抗CD3 scFv，所述抗CD3 scFv包括第一可变轻结构域、scFv连接子和第一可变重结构域；以及
ii)第一Fc结构域，其中所述scFv使用结构域连接子与所述第一Fc结构域的N端共价连接；
b)第二单体，所述第二单体包括VH2-CH1-铰链-CH2-CH3单体，其中VH是第二可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；以及
c)轻链，所述轻链包括第二可变轻结构域，
其中所述第二可变重结构域和所述第二可变轻结构域形成FAP结合结构域。
39.根据权利要求38所述的异源二聚体抗体，其中所述FAP结合结构域包括以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAPH0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAPH0.26_L0.11)；XENP27969(aFAP H0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
40.根据权利要求39所述的异源二聚体抗体，其中所述FAP结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3选自图14和45中提供的FAP结合结构域的vhCDR1-3序列和vlCDR1-3序列。
41.根据权利要求38所述的异源二聚体抗体，其中所述第二重可变结构域包括重可变结构域，并且所述第二轻可变结构域包括以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的可变轻结构域：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAPH0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
42.根据权利要求38到41中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述抗CD3 scFv包括以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。
43.根据权利要求42所述的异源二聚体抗体，其中所述抗CD3 scFv的vhCDR1-3和vlCDR1-3选自图12中的vhCDR1-3和vlCDR1-3。
44.根据权利要求43所述的异源二聚体抗体，其中所述抗CD3 scFv包括以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。
45.根据权利要求38到44中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述第一可变轻结构域使用结构域连接子与所述第一Fc结构域的N端共价连接。
46.根据权利要求38到44中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述第一可变重结构域使用结构域连接子与所述第一Fc结构域的N端共价连接。
47.根据权利要求38到46中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv连接子是带电scFv连接子。
48.根据权利要求38到47中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域是变体Fc结构域。
49.根据权利要求38到48中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述第一单体和所述第二单体包括选自由图3中所描绘的异源二聚化变体组成的组的一组异源二聚化变体。
50.根据权利要求49所述的异源二聚体抗体，其中所述一组异源二聚化变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；S364K:L368D/K370S；S364K:L368E/K370S；D401K:T411E/K360E/Q362E；和T366W:T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。
51.根据权利要求49或50所述的异源二聚体抗体，其中所述第一单体和所述第二单体进一步包括烧蚀变体。
52.根据权利要求51所述的异源二聚体抗体，其中所述烧蚀变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。
53.根据权利要求38到52中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述第一单体或所述第二单体之一包括pI变体。
54.根据权利要求53所述的异源二聚体抗体，其中所述pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。
55.根据权利要求38到47中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述第一单体包括氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，
其中所述第二单体包括氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且
其中编号是根据EU编号进行的。
56.根据权利要求55所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv连接子是具有氨基酸序列(GKPGS)4的带电scFv连接子。
57.根据权利要求55所述的异源二聚体抗体，其中所述第一单体和所述第二单体各自进一步包括氨基酸变体428/434S。
58.一种异源二聚体抗体，其包括：
a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括scFv-连接子-CH2-CH3，
其中scFv是抗CD3 scFV，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；
b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包括VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；以及
c)轻链，所述轻链包括VL-CL；
其中所述第一变体Fc结构域包括氨基酸变体S364K/E357Q，
其中所述第二变体Fc结构域包括氨基酸变体L368D/K370S，
其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包括氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，
其中所述第二单体的所述铰链-CH2-CH3包括氨基酸变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，
其中所述VH和所述VL形成FAP结合结构域，所述FAP结合结构域分别包括选自以下的FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5H1_L1、1E5A5 H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1，
其中所述抗CD3 scFv包括选自以下的CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47和H1.31_L1.47，并且
其中编号是根据EU编号进行的。
59.根据权利要求58所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv包括具有氨基酸序列(GKPGS)4的带电scFv连接子。
60.根据权利要求58所述的异源二聚体抗体，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自进一步包括氨基酸变体428/434S，其中编号是根据EU编号进行的。
61.一种核酸组合物，其包括对根据权利要求38到60中任一项所述的抗体的所述第一单体和所述第二单体以及所述轻链进行编码的核酸。
62.一种表达载体，其包括根据权利要求61的核酸。
63.一种用根据权利要求62所述的表达载体转化的宿主细胞。
64.一种治疗FAP相关癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据权利要求38到60中任一项所述的抗体。
65.一种异源二聚体抗体，其包括：
a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，
其中VH1是第一可变重结构域，scFv是抗CD3 scFV，连接子1和连接子2分别是第一结构域连接子和第二结构域连接子，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；
b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包括VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重结构域，并且CH2-CH3是第二Fc结构域；以及
c)共同轻链，所述共同轻链包括可变轻结构域；
其中所述第一可变重结构域和所述可变轻结构域形成第一FAP结合结构域，并且所述第二可变重结构域和所述可变轻结构域形成第二FAP结合结构域。
66.根据权利要求65所述的异源二聚体抗体，其中所述第一FAP结合结构域和所述第二FAP结合结构域各自包括以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAP H0.26_L0.11)；XENP27969(aFAPH0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
67.根据权利要求66所述的异源二聚体抗体，其中所述第一FAP结合结构域和所述第二FAP结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3选自图14和45中提供的vhCDR1-3和vlCDR1-3。
68.根据权利要求65所述的异源二聚体抗体，其中所述第一可变重结构域和所述第二可变重结构域各自包括FAP结合结构域的可变重结构域，并且第一可变轻结构域和第二可变轻结构域各自包括所述FAP结合结构域的可变轻结构域，其中所述FAP结合结构域是以下FAP结合结构域中的任何FAP结合结构域：1A4A5 H1_L1；1C3A5 H1_L1；1E5A5 H1_L1；1E5A5(共同轻链)H1_L1；1A1B5 H1_L1；1A7B5 H1_L1；1F4B5 H1_L1；1F11B5 H1_L1；1F12B5 H1_L1；1D5B5 H1_L1；1F10B5 H1_L1；XENP23533(aFAP H0_L0)；XENP24774(aFAP H0.1_L0)；XENP24775(aFAP H0.2_L0)；XENP24776(aFAP H0.3_L0)；XENP24777(aFAP H0.4_L0)；XENP24778(aFAP H0.5_L0)；XENP24779(aFAP H0.6_L0)；XENP24780(aFAP H0.7_L0)；XENP24781(aFAP H0.8_L0)；XENP24782(aFAP H0.9_L0)；XENP24783(aFAP H0.10_L0)；XENP24784(aFAP H0.11_L0)；XENP24785(aFAP H0.12_L0)；XENP247836(aFAP H0.13_L0)；XENP24787(aFAP H0.14_L0)；XENP24788(aFAP H0.15_L0)；XENP24789(aFAP H0.16_L0)；XENP24790(aFAP H0.17_L0)；XENP24791(aFAP H0.18_L0)；XENP24792(aFAP H0.19_L0)；XENP24793(aFAP H0.20_L0)；XENP24794(aFAP H0.21_L0)；XENP24795(aFAP H0.22_L0)；XENP24796(aFAP H0.23_L0)；XENP24801(aFAP H0.24_L0)；XENP25264(aFAP H0.25_L0)；XENP25265(aFAP H0.26_L0)；XENP27885(aFAP H0_L0.1)；XENP27886(aFAP H0_L0.2)；XENP27887(aFAP H0_L0.3)；XENP27888(aFAP H0_L0.4)；XENP27889(aFAP H0_L0.5)；XENP27890(aFAP H0_L0.6)；XENP27891(aFAP H0_L0.7)；XENP27892(aFAP H0_L0.8)；XENP27893(aFAP H0_L0.9)；XENP27894(aFAP H0_L0.10)；XENP27895(aFAP H0_L0.11)；XENP27896(aFAP H0_L012)；XENP27897(aFAP H0_L0.13)；XENP27898(aFAP H0_L0.14)；XENP27899(aFAP H0_L0.15)；XENP27900(aFAP H0_L0.16)；XENP27901(aFAP H0_L0.17)；XENP27902(aFAP H0_L0.18)；XENP27903(aFAP H0_L0.19)；XENP27904(aFAP H0_L0.20)；XENP27905(aFAP H0_L0.21)；XENP27906(aFAP H0_L0.22)；XENP27907(aFAP H0_L0.23)；XENP27908(aFAP H0_L0.24)；XENP27909(aFAP H0_L0.25)；XENP27910(aFAP H0_L0.26)；XENP27911(aFAP H0_L0.27)；XENP27912(aFAP H0_L0.28)；XENP27913(aFAP H0_L0.29)；XENP27914(aFAP H0_L0.30)；XENP27915(aFAP H0_L0.31)；XENP27916(aFAP H0_L0.32)；XENP27917(aFAP H0_L0.33)；XENP27918(aFAP H0_L0.34)；XENP27919(aFAP H0_L035)；XENP27920(aFAP H0_L0.36)；XENP27921(aFAP H0_L0.37)；XENP27922(aFAP H0_L0.38)；XENP27923(aFAP H0_L0.39)；XENP27924(aFAP H0_L0.40)；XENP27251(aFAP H0_L0.41)；XENP27926(aFAP H0_L0.42)；XENP27927(aFAP H0_L0.43)；XENP27928(aFAP H0_L0.45)；XENP27929(aFAP H0_L1(CLC))；XENP27964(aFAP H0.13_L0.11)；XENP27965(aFAP H0.13_L0.14)；XENP27966(aFAP H0.13_L0.19)；XENP27967(aFAP H0.13_L0.41)；XENP27968(aFAPH0.26_L0.11)；XENP27969(aFAP H0.26_L0.14)；XENP27970(aFAP H0.26_L0.19)；以及XENP27971(aFAP H0.26_L0.41)(图14和45)。
69.根据权利要求65所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv包括以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。
70.根据权利要求69所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv的vhCDR1-3和vlCDR1-3选自图12中的vhCDR1-3和vlCDR1-3。
71.根据权利要求70所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv包括以下CD3结合结构域中的任何CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：H1.30_L1.47；H1.32_L1.47；H1.89_L1.48；H1.90_L1.47；H1.33_L1.47；和H1.31_L1.47。
72.根据权利要求65到71中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv包括scFv可变重结构域、scFv可变轻结构域以及连接所述scFv可变重结构域和所述scFv可变轻结构域的scFv连接子。
73.根据权利要求72中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv可变重结构域使用所述第一结构域连接子与所述第一单体的所述CH1的C端连接，并且所述scFv可变轻结构域使用所述第二结构域连接子与所述第一Fc结构域的N端共价连接。
74.根据权利要求65到72中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv可变轻结构域使用所述第一结构域连接子与所述第一单体的所述CH1的C端连接，并且所述scFv可变重结构域使用所述第二结构域连接子与所述第一Fc结构域的N端共价连接。
75.根据权利要求65到74中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv连接子是带电scFv连接子。
76.根据权利要求65到75中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述第一Fc结构域和所述第二Fc结构域是变体Fc结构域。
77.根据权利要求65到76中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述第一单体和所述第二单体包括选自由图3中所描绘的异源二聚化变体组成的组的一组异源二聚化变体。
78.根据权利要求77所述的异源二聚体抗体，其中所述一组异源二聚化变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q:L368D/K370S；S364K:L368D/K370S；S364K:L368E/K370S；D401K:T411E/K360E/Q362E；和T366W:T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号进行的。
79.根据权利要求77或78中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述第一单体和所述第二单体进一步包括烧蚀变体。
80.根据权利要求79所述的异源二聚体抗体，其中所述烧蚀变体是E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号进行的。
81.根据权利要求67到80中任一项所述的异源二聚体抗体，其中所述第一单体或所述第二单体之一进一步包括pI变体。
82.根据权利要求81所述的异源二聚体抗体，其中所述pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号进行的。
83.根据权利要求76所述的异源二聚体抗体，其中所述第一变体Fc结构域包括氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，
其中所述第二变体Fc结构域包括氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且其中编号是根据EU编号进行的。
84.根据权利要求83所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv连接子是具有氨基酸序列(GKPGS)4的带电scFv连接子。
85.根据权利要求84所述的异源二聚体抗体，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自进一步包括氨基酸变体428/434S，其中编号是根据EU编号进行的。
86.根据权利要求65所述的异源二聚体抗体，其选自以下异源二聚体抗体：XENP25393、XENP29140、XENP28115、XENP29141、XENP28116、XENP29142、XENP25193、XENP25194、XENP25195、XENP25967、XENC1145、XENC1123、XENC1079和XENC1101。
87.一种异源二聚体抗体，其包括：
a)第一单体，所述第一单体从N端到C端包括VH1-CH1-连接子1-scFv-连接子2-CH2-CH3，
其中scFv是抗CD3 scFV，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；
b)第二单体，所述第二单体从N端到C端包括VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；以及
c)共同轻链，所述共同轻链包括VL-CL；
其中所述第一变体Fc结构域包括氨基酸变体S364K/E357Q，
其中所述第二变体Fc结构域包括氨基酸变体L368D/K370S，
其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自包括氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，
其中所述第二单体的所述铰链-CH2-CH3包括氨基酸变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，
其中所述VH和所述VL包括选自以下的FAP结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：[αFAP]_H0.26_L0、[αFAP]_H0.26_L0.11、[αFAP]_H0.26_L0.19、1A7B5 H1_L1、1E5A5H1_L1、1E5A5(共同轻链)H1_L1和1F4B5 H1_L1，
其中所述抗CD3 scFv包括选自以下的CD3结合结构域的可变重结构域和可变轻结构域：H1.30_L1.47、H1.32_L1.47、H1.89_L1.47、H1.90_L1.47、H1.33_L1.47和H1.31_L1.47，并且
其中编号是根据EU编号进行的。
88.根据权利要求87所述的异源二聚体抗体，其中所述scFv包括具有氨基酸序列(GKPGS)4的带电scFv连接子。
89.根据权利要求87所述的异源二聚体抗体，其中所述第一变体Fc结构域和所述第二变体Fc结构域各自进一步包括氨基酸变体428/434S。
90.一种核酸组合物，其包括对根据权利要求65到89中任一项所述的抗体的所述第一单体和所述第二单体以及所述共同轻链进行编码的核酸。
91.一种表达载体，其包括根据权利要求90的核酸。
92.一种用根据权利要求91所述的表达载体转化的宿主细胞。
93.一种治疗FAP相关癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据权利要求65到89中任一项所述的抗体。
94.一种异源二聚体抗体，其选自以下异源二聚体抗体：XENP024704、XENP024707、XENP024708、XENP024710、XENP024712、XENP024713、XENP024715、XENP024802、XENP025384和XENP025965。
95.一种异源二聚体抗体，其选自以下：XENP025185；XENP025186；XENP025187；XENP025188；XENP025189；XENP025191；XENP025192；XENP025193；XENP025194；XENP025195；XENP025196；XENP025966；XENP025967；XENP25388；XENP25389；XENP25390；XENP25391；XENP25392；XENP25393；XENP28114；XENP28115；XENP28116；XENP28117；XENP28118；XENP29140；XENP29141；XENP29142；XENC1001；XENC1002；XENC1003；和XENC1004。
96.一种核酸组合物，其包括对根据权利要求94或95中任一项所述的异源二聚体抗体进行编码的核酸。
97.一种表达载体，其包括根据权利要求96的核酸。
98.一种用根据权利要求79所述的表达载体转化的宿主细胞。
99.一种治疗FAP相关癌症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用根据权利要求94或95中任一项所述的异源二聚体抗体。
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