JP5616428B2 - 三価の二重特異性抗体 - Google Patents

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Description

本発明は、三価の二重特異性抗体、それらの製造方法、前述の抗体を含む医薬組成物、及びその使用に関する。

広範な種類の組換え多特異性抗体フォーマットが最近開発されてきている、例えば、IgG抗体フォーマットと一本鎖ドメインの融合による、例えば、四価二重特異性抗体が開発された(例えば、Coloma M. J. et al., Nature Biotech. 15(1997)159-163; WO 2001077342; 及びMorrison S. L. Nature Biotech. 25(2007)1233-1234を参照のこと)。

また、抗体コア構造(IgA、IgD、IgE、IgG又はIgM)がもはや保持されていないいくつかの新しいフォーマット、例えば、2つ以上の抗原に結合できる、ジ抗体、トリ抗体又はテトラ抗体、ミニ抗体、いくつかの一本鎖フォーマット(scFv、ビス‐scFv)が開発された(Holliger P. et al., Nature Biotech. 23(2005)1126-1136; Fischer N. and Leger O. Pathobiology 74(2007)3-14; Shen J. et al., J. Immunol. Methods 318(2007)65-74; Wu C. et al., Nature Biotech. 25(2007)1290-1297)。

すべてのこのようなフォーマットはリンカーを使用して抗体コア(IgA、IgD、IgE、IgG又はIgM)を更なる結合性タンパク質(例えば、scFv)に融合するか、あるいは、例えば、2つのFabフラグメント又はscFvを融合する(Fischer N. and Leger O. Pathobiology 74(2007)3-14)。天然に存在するものに対して高度の類似性を維持することによって、Fc受容体結合を通して介在される、エフェクター機能、例えば、補体依存性細胞毒性(CDC)又は抗体依存性細胞毒性(ADCC)を保持することが望まれることもあり得ることに留意すべきである。

WO2007/024715では、改変多価及び多特異性結合タンパク質として二重可変ドメイン免疫グロブリンが報告されている。生物学的に活性な抗体二量体の調製方法は、US6,897,044に報告されている。ペプチド・リンカーを介して互いに連結されている少なくとも4つの可変ドメインを持つ多価性Fv抗体構築物が、US7,129,330で報告されている。二量体及び多量体の抗原結合構築物は、US2005/0079170で報告されている。(天然の免疫グロブリンでない)結合構造によって互いに共有結合した3つ又は4つのFabフラグメントを含んでなる三又は四価の単一特異性抗原結合性タンパク質が、US6,511,663で報告されている。WO2006/020258では、原核生物及び真核生物細胞で効率的に発現され、治療薬や診断法に有用である四価の二重特異性抗体が報告されている。
2つのタイプのポリペプチド二量体を含んでなる混合物からの少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合によって連結されず二量体からの少なくとも1つの鎖間ジスルフィド結合によって連結される二量体を分離するか、又は優先的には合成する方法が、US 2005/0163782で報告されている。二重特異性の四価の受容体が、US 5,959,083で報告されている。三重機能性以上の抗原結合部位を持つ改変抗体が、WO 2001/077342で報告されている。

多特異性、且つ、多価の抗原結合性ポリペプチドが、WO1997/001580で報告されている。WO1992/004053では、通常、同じ抗原決定基に結合するIgGクラスのモノクローナル抗体から調製されたホモ接合体が合成架橋によって共有結合で連結されていることが報告されている。抗原に対して高い親和性を有するオリゴマーモノクローナル抗体が、WO1991/06305で報告され、それによれば2つ以上の免疫グロブリンモノマーが一緒になって四価又は六価のIgG分子を形成する通常IgGクラスのオリゴマーが分泌されている。ヒツジ由来抗体及び改変抗体構築物が、US6,350,860で報告されていて、それは、インターフェロンγ活性が病因である疾患を治療するのに使用される。US2005/0100543では、二重特異性抗体の多価担体である標的を設定可能な、すなわち、標的を設定可能な構築物の各分子が2以上の二重特異性抗体の担体として機能することができる、構築物が報告されている。遺伝的に改変された二重特異性四価抗体は、WO1995/009917で報告されている。安定しているWO2007/109254には、安定化scFvから成るか、又はそれを含んでなる安定化結合分子が報告されている。

本発明の第1の態様は、以下の:
a)第1の抗原に特異的に結合し、且つ、2つの抗体重鎖と2つの抗体軽鎖から成る全長抗体;
b)以下の:
ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH);又は
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常ドメイン1(CH1);
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、VHドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちの一方のC末端に融合されている、
c)以下の:
ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);又は
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)と抗体軽鎖定常ドメイン(CL);から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、VLドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちのもう片方のC末端に融合されている、
を含んでなり;そして
ここで、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)が一緒になって、第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。

本発明の更なる態様は、本発明による三価の二重特異性抗体をコードする核酸分子である。
本発明のより更なる態様は、前記三価の二重特異性抗体を含んでなる医薬組成物である。
本発明による三価の二重特異性抗体は、一方で、異なった抗原へのそれらの結合により新しい特性を示し、その一方で、それらの安定性、低凝集、並びに薬物動力学的及び生物的性質により製品及び医薬製剤に好適である。それらのIgコアのため、それらは、ADCCやCDCのような天然抗体の特性を保有し続けている。

発明の詳細な説明
本発明の1つの態様は、以下の:
a)第1の抗原に特異的に結合し、且つ、2つの抗体重鎖と2つの抗体軽鎖から成る全長抗体;
b)以下の:
ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH);又は
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常ドメイン1(CH1);
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、VHドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちの一方のC末端に融合されている、
c)以下の:
ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);又は
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)と抗体軽鎖定常ドメイン(CL);から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、VLドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちのもう片方のC末端に融合されている、
を含んでなり;そして
ここで、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)が一緒になって、第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。

任意には、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)は、連結され、そして下記の位置の間へのジスルフィド結合の導入によって鎖間ジスルフィド架橋によって安定化させる:
i)重鎖可変ドメインの第44位〜軽鎖可変ドメインの第100位
ii)重鎖可変ドメインの第105位〜軽鎖可変ドメインの第43位、又は、
iii)重鎖可変ドメインの第101位〜軽鎖可変ドメインの第100位(付番は常にKabatのEUインデックスに準じる)。

安定化のために非天然ジスルフィド架橋を導入する技術は、例えば、WO94/029350、Rajagopal, V., et al., Prot Engin.(1997)1453-59; Kobayashi, H., et al., Nuclear Medicine & Biology, Vol. 25,(1998)387-393;又はSchmidt, M., et al., Oncogene(1999)18 1711-1721に記載されている。1つの実施形態では、b)とc)のポリペプチドの可変ドメインの間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの第44位と軽鎖可変ドメインの第100位の間にある。1つの実施形態では、b)とc)のポリペプチドの可変ドメインの間の任意のジスルフィド結合は、重鎖可変ドメインの第105位と軽鎖可変ドメインの第43位の間にある(付番は常にKabatのEUインデックスに準じる)。1つの実施形態では、一本鎖Fabフラグメントの可変ドメインVHとVLの間の前記任意のジスルフィド安定化のない、三価の二重特異性抗体が好まれる。

用語「全長抗体」は、2つの「全長抗体重鎖」と2つの「全長抗体軽鎖」から成る抗体を意味する(図1を参照のこと)。「全長抗体重鎖」は、N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ部(HR)、抗体重鎖定常ドメイン2(CH2)、及び抗体重鎖定常ドメイン3(CH3)から成り、VH‐CH1‐HR‐CH2‐CH3と略記される、ポリペプチドであり、さらに任意に、IgEサブクラスの抗体の場合には、抗体重鎖定常ドメイン4(CH4)から成るポリペプチドである。好ましくは「全長抗体重鎖」は、N末端からC末端に向かって、VH、CH1、HR、CH2及びCH3から成るポリペプチドである。「全長抗体軽鎖」は、N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、及び抗体軽鎖定常ドメイン(CL)から成り、VL‐CLと略記される、ポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン(CL)は、κ(カッパ)又はλ(ラムダ)であり得る。2つの全長抗体鎖は、CLドメインとCH1ドメインの間、及び全長抗体重鎖のヒンジ部の間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して一緒につながっている。典型的な全長抗体の例は、IgG(例えば、IgG1及びIgG2)、IgM、IgA、IgD、並びにIgEのような天然抗体である。本発明による全長抗体は、単一種、例えばヒトからのものであることができるし、又はそれらは、キメラ化若しくはヒト化抗体であることもできる。本発明による全長抗体は、一対のVHとVLによってそれぞれ形成された抗原結合部位を2つ含んでなるが、それらは、ともに同じ抗原に特異的に結合する。前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のC末端は、前記重鎖又は軽鎖のC末端で最後のアミノ酸を意味する。

b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)のN末端は、VH又はVLドメインのN末端で最後のアミノ酸を意味する。

本発明による前記全長抗体のCH3ドメインは、例えばWO96/027011、Ridgway, J.B., et al, Protein Eng 9(1996)617-621;及びMerchant, A.M., et al, Nat Biotechnol 16(1998)677-681において、いくつかの例により詳細に説明されている「knob−into−holes」技術により変更され得る。この方法では、2種のCH3ドメインの相互作用表面が、それらの2種のCH3ドメインを含む両重鎖のヘテロダイマー化を高めるために変更される。(2種の重鎖の)2種のCH3ドメインの個々が「knob」であり、そして他が「hole」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロダイマーを安定化し(Merchant, A..M., et al, Nature Biotech 16(1998)677-681; Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270(1997)26-35)、そして収率を高める。

従って、本発明の1つの態様では、前記三価の二重特異性抗体は、全長抗体の1つの重鎖のCH3ドメイン及び全長抗体の他の重鎖のCH3ドメインが、抗体CH3ドメイン間に本来の界面を含んでなる界面で各々接触し;
ここで、前記界面は二価の二重特異性抗体の形成を促進するよう変更され、ここで、前記変更が:
a)二価の二重特異性抗体内のもう片方の重鎖のCH3ドメインの本来の界面と接触する、一方の重鎖のCH3ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ残基により置換され、それにより、もう片方の重鎖のCH3ドメインの界面内の腔に配置可能な、一方の重鎖CH3ドメインの界面内に隆起部を生じるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更され、そして
b)三価の二重特異性抗体内の第1CH3ドメインの本来の界面と接触する、第2CH3ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第1CH3ドメインの界面内の隆起部が配置可能な第2CH3ドメインの界面内に腔を生じるように、もう片方の重鎖のCH3ドメインが変更されることによりさらに特徴づけられる。

好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)から成る群から選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)から成る群から選択される。

本発明の1つの態様においては、両CH3ドメインはさらに、それらの両CH3ドメイン間にジスルフィド架橋が形成され得るよう、各々のCH3ドメインのその対応する位置のアミノ酸としてのシステイン(C)の導入により変更される。

好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、「knobs鎖」のCH3ドメイン内にT366W突然変異、及び「hole鎖」のCH3ドメイン内にT366S、L368A、Y407V突然変異を含んでなる。例えば、「knobs鎖」のCH3ドメイン内にY349C突然変異、及び「hole鎖」のCH3ドメイン内にE356C突然変異又はS354C突然変異を導入することによって、CH3ドメイン間の追加的な鎖間ジスルフィド架橋もまた使用できる(Merchant, A.M., et al., Nature Biotech 16(1998)677-681)。よって、別の好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインのうちの一方にY349C、T366W突然変異、そして2つのCH3ドメインのうちのもう片方にE356C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含んでなるか、又は前記三価の二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインのうちの一方にY349C、T366W突然変異、そして2つのCH3ドメインのうちのもう片方にS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含んでなる(鎖間ジスルフィド架橋を形成する、一方のCH3ドメイン内の追加的なY349C突然変異ともう片方のCH3ドメイン内の追加的なE356C又はS354C突然変異)(付番は常にKabatのEUインデックスに準じる)。しかし、EP1870459A1によって記載される他のknob−into−holes技術もまた代替的に又は追加的に使用できる。前記三価の二重特異性抗体の好ましい例は、「knobs鎖」のCH3ドメイン内のR409D;K370E突然変異、及び「hole鎖」のCH3ドメイン内のD399K;E357K突然変異である(付番は常にKabatのEUインデックスに準じる)。

別の好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、「knobs鎖」のCH3ドメイン内のT366W突然変異及び「hole鎖」のCH3ドメイン内のT366S、L368A、Y407V突然変異、そして追加的に「knobs鎖」のCH3ドメイン内のR409D;K370E突然変異及び「hole鎖」のCH3ドメイン内のD399K;E357KE突然変異を含んでなる。

別の好ましい実施形態では、前記三価の二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインのうちの一方にY349C、T366W突然変異、そして2つのCH3ドメインのうちのもう片方にS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含んでなるか、又は前記三価の二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインのうちの一方にY349C、T366W突然変異、そして2つのCH3ドメインのうちのもう片方にS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含んでなり、そして追加的に「knobs鎖」のCH3ドメイン内にR409D;K370E突然変異、及び「hole鎖」のCH3ドメイン内にD399K;E357K突然変異を含んでなる。

本発明による二重特異性抗体は、3つの抗原結合部位(A)第1の抗原に特異的に結合する2つの同一の抗原結合部位を含んでなる全長抗体、並びにB)第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を一緒になって形成する、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)を含んでなる。用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、本明細書中で使用される場合、それぞれの抗原が実際にその領域に特異的に結合する、本発明による前記二重特異性抗体の(単数若しくは複数の)領域を意味する。全長抗体内、又はb)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)による、抗原結合部位は、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)と抗体重鎖可変ドメイン(VH)から成る対によってそれぞれ形成される。

所望の抗原に特異的に結合する抗原結合部位は、a)抗原に対して公知の抗体に由来するか、あるいは、b)とりわけ抗原タンパク質又は核酸若しくはその断片のいずれかを使用したデノボ免疫法によって、又はファージ・ディスプレイによって得られた新しい抗体又は抗体フラグメントに由来することができる。

本発明の抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位の親和性に多かれ少なかれ貢献する6つの相補性決定領域(CDRs)を含んでいる。3つの重鎖可変ドメインCDRs(CDRH1、CDRH2及びCDRH3)と3つの軽鎖可変ドメインCDRs(CDRL1、CDRL2及びCDRL3)がある。CDRとフレームワーク領域(FR)の程度は、配列内での可変性によってそれらの領域が規定されたコンパイルされたアミノ酸配列のデータベースとの比較によって決定される。

抗体の特異性は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。例えば、天然抗体は単一特異性である。本発明による「二重特異性抗体」は、2つの異なった抗原結合特異性を有する抗体である。抗体が2以上の特異性を有する場合には、認識されたエピトープは単一の抗原又は2以上の抗原と結合することもできる。用語「単一特異性」抗体は、本明細書中で使用される場合、そのそれぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する1以上の結合部位を持つ抗体を意味する。用語「価」は、本明細書中で使用される場合、抗体分子内に存在している一定数の結合部位を意味する。例えば、天然抗体又は本発明による全長抗体は、2つの結合部位を持っているので、二価である。同様に、用語「三価」は、抗体分子内の3つの結合部位の存在を意味する。本発明による二重特異性抗体は「三価」である。用語「三価の二重特異性」抗体は、本明細書中で使用される場合、その2つが同じ抗原(若しくは抗原の同じエピトープ)に結合し、且つ、3番目のものが異なる抗原又は同じ抗原の異なるエピトープに結合する3つの抗原結合部位を持つ抗体を意味する。本発明の抗体は、3つの結合部位を持っているので、二重特異性である。

本発明の他の実施形態は、以下の:
a)第1の抗原に特異的に結合し、且つ、以下の:
aa)N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ部(HR)、抗体重鎖定常ドメイン2(CH2)、及び抗体重鎖定常ドメイン3(CH3)から成る2つの抗体重鎖;及び
ab)N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、及び抗体軽鎖定常ドメイン(CL)から成る2つの抗体軽鎖;
から成る全長抗体;並びに
b)以下の:
ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH);又は
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常ドメイン1(CH1)、から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、VHドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちの一方のC末端に融合されていて、ここで、前記ペプチドコネクタが5つのアミノ酸、好ましくは25〜50個のアミノ酸から成るペプチドである、

c)以下の:
ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);又は
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)と抗体軽鎖定常ドメイン(CL)、
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドはVLドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちのもう片方のC末端に融合されていて、
ここで、前記ペプチドコネクタがb)のペプチドコネクタと同一である、
を含んでなり;そして
ここで、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)が一緒になって、第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。

この実施形態の中で、好ましくは三価の二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインのうちの一方にT366W突然変異、そして2つのCH3ドメインのうちのもう片方にT366S、L368A、Y407V突然変異を含んでなり、より好ましくは三価の二重特異性抗体は、2つのCH3ドメインのうちの一方にY349C、T366W突然変異、そして2つのCH3ドメインのなかのもう片方にD356C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含んでなる(一方のCH3ドメイン内の追加的なY349C突然変異ともう片方のCH3ドメイン内の追加的なD356C突然変異は鎖間ジスルフィド架橋を形成する)。

本発明の1つの実施形態では、本発明による三価の二重特異性抗体は、以下の:
a)前記全長抗体は、ErbB‐3に特異的に結合し、配列番号1の配列を重鎖可変ドメインとして、及び配列番号2の配列を軽鎖可変ドメインとして含んでなり;
b)b)の前記ポリペプチドが重鎖可変ドメインとして配列番号3の配列を含んでなり;そして
c)c)の前記ポリペプチドが軽鎖可変ドメインとして配列番号4の配列を含んでなること、を特徴とする。
本発明の別の態様では、本発明による三価の二重特異性抗体は、以下の:
a)第1の抗原に結合し、2つの抗体重鎖、VH‐CH1‐HR‐CH2‐CH3及び2つの抗体軽鎖VL‐CLから成る全長抗体;
(ここで、好ましくは2つのCH3ドメインのうちの一方がY349C、T366W突然変異を含んでなり、そして2つのCH3ドメインのうちのもう片方がS354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含んでなる);
b)以下の:
ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH);又は
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常ドメイン1(CH1)、
から成るポリペプチド;
ここで、前記ポリペプチドはVHドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちの一方のC末端に融合されている;

c)以下の:
ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、又は
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)と抗体軽鎖定常ドメイン(CL)、から成るポリペプチド、ここで、前記ポリペプチドはVLドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちのもう片方のC末端に融合されている;
を含んでなり、そして
ここで、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)が一緒になって、第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する。

本発明の他の実施形態は、以下の:
a)ヒトErbB‐3に特異的に結合し、且つ、以下の:
aa)N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ部(HR)、抗体重鎖定常ドメイン2(CH2)、及び抗体重鎖定常ドメイン3(CH3)から成る2つの抗体重鎖;及び
ab)N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、及び抗体軽鎖定常ドメイン(CL)から成る2つの抗体軽鎖(VL‐CL);
から成る全長抗体;並びに
b)ヒトc‐Metに特異的に結合する1つの一本鎖Fvフラグメント、
を含んでなり、
ここで、b)の前記一本鎖Fvフラグメントは、a)の前記全長抗体に、前記全長抗体の重鎖又は軽鎖のC又はN末端(好ましくは重鎖のC末端)のペプチドコネクタを介して融合されていて;
ここで、前記ペプチドコネクタは、少なくとも5つのアミノ酸、好ましくは25〜50個のアミノ酸から成るペプチドである、三価の二重特異性抗体である。

好ましくは、そういった三価の二重特異性抗体は、全長抗体の2つのCH3ドメインのうちの一方にY349C、T366Wに突然変異、そして全長抗体の2つのCH3ドメインのうちのもう片方にS354C(又はE356C)、T366S、L368A、Y407V突然変異をさらに含んでなる。
本発明の他の実施形態は、以下の:
a)ヒトErbB‐3に特異的に結合し、且つ、以下の:
aa)N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン(VH)、抗体定常重鎖ドメイン1(CH1)、抗体ヒンジ部(HR)、抗体重鎖定常ドメイン2(CH2)、及び抗体重鎖定常ドメイン3(CH3)から成る2つの抗体重鎖;及び
ab)N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)、及び抗体軽鎖定常ドメイン(CL)から成る2つの抗体軽鎖;
から成る全長抗体;並びに
b)以下の:
ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH);又は
bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常ドメイン1(CH1)、から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドは、VHドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちの一方のC末端に融合されていて、ここで、前記ペプチドコネクタが5つのアミノ酸、好ましくは25〜50個のアミノ酸から成るペプチドである、

c)以下の:
ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);又は
cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)と抗体軽鎖定常ドメイン(CL)、
から成るポリペプチド、
ここで、前記ポリペプチドはVLドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちのもう片方のC末端に融合されていて、
ここで、前記ペプチドコネクタがb)のペプチドコネクタと同一である、
を含んでなり;そして
ここで、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)が一緒になって、ヒトc‐Metに特異的に結合する抗原結合部位を形成する、三価の二重特異性抗体である。

本発明の全長抗体は、1以上の免疫グロブリン・クラスの免疫グロブリン定常領域を含んでなる。免疫グロブリン・クラスには、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEアイソタイプが含まれ、そしてIgG及びIgAの場合には、それらのサブタイプが含まれる。好ましい実施形態では、本発明の全長抗体は、IgGタイプ抗体の定常ドメイン構造を持つ。

用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、本明細書において使用される場合、単一のアミノ酸組成物の抗体分子の調製物を意味する。

用語「キメラ抗体」とは、通常組換えDNA技術により調製される、可変領域、すなわち1つの源又は種からの結合領域、及び異なった源又は種に由来する定常領域の少なくとも一部を含んでなる抗体を意味する。ネズミ可変領域及びヒト定常領域を含んでなるキメラ抗体が好ましい。本発明により包含される他の好ましい形の「キメラ抗体」は、定常領域が、特にC1q結合及び/又はFc受容体(FcR)結合に関して、本発明の性質を生じるように、修飾されているか、又は元の抗体のその領域から変更されているそれらの抗体である。そのようなキメラ抗体はまた、「クラス‐スイッチ抗体」とも呼ばれる。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変領域をコードするDNAセグメント、及び免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントを含んでなる免疫グロブリン遺伝子が発現された生成物である。キメラ抗体を生成するための方法は、当業界において現在良く知られている、従来の組換えDNA及び遺伝子トランスフェクション技術を包含する。例えば、Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81(1984)6851-6855; US 5,202,238及びUS 5,204,244を参照のこと。

用語「ヒト化抗体」とは、そのフレームワーク又は「相補性決定領域」(CDR)が、親イムノグロブリンのCDRに比較して、異なった特異性の免疫グロブリンのCDRを含んでなるよう修飾されている抗体を意味する。好ましい実施形態では、ネズミCDRは、「ヒト化抗体」を調製するために、ヒト抗体のフレームワーク領域中に移植される。例えば、Riechmann, L., et al., Nature 332(1988)323-327;及びNeuberger, M.S., et al., Nature 314(1985)268-270を参照のこと。特に好ましいCDRは、キメラ抗体に関して上記に示される抗原を認識する配列を表すものに対応する。本発明により包含される他の形の「ヒト化抗体」とは、定常領域が、特にC1q結合及び/又はFc受容体(FcR)結合に関して、本発明の性質を生じるように、さらに修飾されているか、又は元の抗体のその領域から変更されている抗体である。

用語「ヒト抗体」とは、本明細書において使用される場合、ヒト生殖系免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を包含することを意図する。ヒト抗体は技術的に良く知られている(van Dijk, M.A., and van de Winkel, J. G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001)368-374)。ヒト抗体はまた、免疫化に基づいて、内因性免疫グロブリン生成の不在下でヒト抗体の全レパートリー又は選択物を生成できるトランスジェニック動物(例えば、マウス)においても生成され得る。そのような生殖系変異マウス内へのヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイのトランスファーは、抗原攻撃に基づくヒト抗体の生成をもたらすであろう(例えば、Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(1993)2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362(1993)255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7(1993)33-40を参照のこと)。ヒト抗体はまた、ファージ提示ライブラリーにおいても生成され得る(Hoogenboom, H. R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227(1992)381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222(1991)581-597)。Cole, S.P.C.ら及びBoerner, Pらの技術はまた、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用できる(Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77-96(1985);及びBoerner, P., et al., J. Immunol. 147(1991)86-95)。本発明のキメラ及びヒト化抗体についてすでに言及されたように、用語「ヒト抗体」とは、本明細書において使用される場合、また、特にC1q結合及び/又はFcR結合に関して、例えばFc部分の「クラススイッチ」、すなわち変更又は突然変異誘発(IgG1からIgG4への及び/又はIgG1/IgG4突然変異)により、本発明の性質を生じるように定常領域において修飾されているそのような抗体も含んでなる。

用語「組換えヒト抗体」とは、本明細書において使用される場合、組換え手段により調製され、発現され、作出され、又は単離されるすべてのヒト抗体、例えば宿主細胞、例えばNS0又はCHO細胞から又はヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離された抗体、又は宿主細胞中にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現された抗体を意味する。そのような組換えヒト抗体は、再配置された形で、可変及び定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、生体内における体細胞超突然変異にゆだねられている。従って、組換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系VH及びVL領域に由来し、そしてその配列に関連しているが、天然においては、ヒト抗体生殖系レパートリー内で生体内には存在することができない配列である。

「可変ドメイン」(軽鎖の可変領域(VL)、重鎖の可変領域(VH))は、本明細書において使用される場合、抗原への抗体の結合において直接関与する軽鎖及び重鎖の対の各々を示す。ヒト可変軽鎖及び重鎖のドメインは、同じ一般構造を有し、そして各々のドメインは4個のフレームワーク(FR)領域を含んで成り、それらの配列は広く保存され、3個の「超可変領域」(又は相補性決定領域、CDR)により結合される。フレームワーク領域は、β‐シートコンホメーションを採用し、そしてCDRはβ‐シート構造体を結合するループを形成することができる。各々の鎖におけるCDRは、フレームワーク領域によりそれらの立体構造を保持され、そして他の鎖からのCDRと共に抗原結合部位を形成する。抗体重鎖及び軽鎖CDR3領域は、本発明の抗体の結合特異性/親和性において特に重要な役割を演じ、従って、本発明のさらなる目的を提供する。

用語「超可変領域」又は「抗体の抗原‐結合部分」とは、本明細書において使用される場合、抗原結合を担当できる抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は「相補性決定領域」又は「CDR」からのアミノ酸残基を含んでなる。「フレームワーク」又は「FR」領域は、本明細書において定義されるように超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽鎖及び重鎖は、N末端からC末端に向かって、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含んでなる。各々の鎖上のCDRはそのようなフレームワークアミノ酸により分離される。特に、重鎖のCDR3は、ほとんど抗原結合に寄与する領域である。CDR及びFR領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991)の標準的な定義に従って決定される。

本明細書において使用される場合、用語「結合」又は「特異的に結合」とは、試験管内におけるアッセイ、好ましくは精製した野生型抗原を用いたプラズモン共鳴アッセイ(BIAcore、GE-Healthcare Uppsala, Sweden)における抗体の抗原のエピトープへの結合を指す。結合の親和性は、用語ka(抗体/抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数)、kD(解離定数)、及びKD(kD/ka)によって規定される。結合又は特異的に結合は、10-8mol/l以下、好ましくは10-9M〜10-13mol/lの結合親和性(KD)を意味する。よって、本発明による三価の二重特異性抗体は、各抗原に対して10-8mol/l、好ましくは10-9M〜10-13mol/lの結合親和性(KD)を有する特異性をもって特異的に結合する。
FcγRIIIへの抗体の結合は、BIAcoreアッセイ(GE-Healthcare Uppsala, Sweden)により調査され得る。結合の親和性は、用語ka(抗体/抗原複合体からの抗体結合に関する速度定数)、kD(解離定数)、及びKD(kD/ka)により規定される。

用語「エピトープ」とは、抗体に対して特異的に結合できるいずれかのポリペプチド決定基を包含する。ある実施形態においては、エピートープ決定基は、分子、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリン又はスルホニルなどの化学的活性表面群を包含し、そしてある実施形態においては、特定の立体構造特性及び/又は比電荷特性を有することができる。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。
ある実施形態においては、抗体は、それがタンパク質及び/又は高分子の複合混合物中でその標的抗原を選択的に認識する場合、抗原を特異的に結合すると言われる。

用語「ペプチドコネクタ」は、本発明の中で使用される場合、アミノ酸配列を有するペプチドを意味し、それは、好ましくは合成起源のものである。本発明によるこれらのペプチドコネクタは、本発明による三価の二重特異性抗体を形成するために、b)及びc)のポリペプチドを全長抗体の重鎖C末端に融合するのに使用される。好ましくは、前記ペプチドコネクタは、少なくとも5つのアミノ酸の長さを有する、好ましくは10〜100個のアミノ酸の長さを有する、より好ましくはで25〜50個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列を持つペプチドである。好ましくは、前記のb)及びc)のペプチドコネクタは、少なくとも25個のアミノ酸の長さを有する、好ましくは25〜50個のアミノ酸の長さを有するペプチドと同一であり、そしてより好ましくは、前記ペプチドコネクタは、(GxS)nあるいは(GxS)nGmであって、G=グリシン、S=セリン、並びに(x=3、n=6、7又は8、及びm=0、1、2又は3)又は(x=4、n=3、4、5、6、又は7及びm=0、1、2又は3)、好ましくはx=4及びn=5、6、又7を示す。

さらなる態様において、本発明による三価の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトIgG1サブクラスのものか、又は突然変異L234A及びL235Aを持つヒトIgG1サブクラスであることを特徴とする。
さらなる態様において、本発明による三価の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトIgG2サブクラスのものであることを特徴とする。
さらなる態様において、本発明による三価の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトIgG3サブクラスのものであることを特徴とする。
さらなる態様において、本発明による三価の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトIgG4サブクラスのものであるか、又は追加的な突然変異S228Pを持つヒトIgG4はサブクラスのものであることを特徴とする。

好ましくは、本発明による三価の二重特異性抗体は、前記全長抗体がヒトIgG1サブクラスのものであるか、又は追加的な突然変異S228Pを持つヒトIgG4サブクラスのものであることを特徴とする。

本発明による三価の二重特異性抗体が、改善された特徴、例えば、生物学的若しくは薬理学的活性、薬物動態学的特性又は毒性などを有することをここで見つけた。それらは、例えば、癌などの疾患の処置に使用できる。

さらなる態様において、本発明による三価の二重特異性抗体は、ErbB3とc‐Metに特異的に結合することを特徴とする。用語「定常領域」は、本明細書中で使用される場合、可変領域以外の抗体のドメインの集合を意味する。定常領域は、抗原の結合に直接的にかかわらないが、様々なエフェクター機能を示す。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、抗体は以下のクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMに分類され、そしてそのいくつか、例えばIgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4、IgA1及びIgA2などは、サブクラスに更に分類されることもできる。異なった抗体クラスに該当する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。全部で5つの抗体クラスで見ることができる軽鎖定常領域(CL)は、κ(カッパ)及びλ(ラムダ)と呼ばれる。

用語「ヒト起源由来の定常領域」は、本願で使用される場合、ヒト抗体のサブクラスIgG1、IgG2、IgG3、若しくはIgG4の重鎖定常領域、及び/又は定常軽鎖カッパ又はラムダ領域を規定する。そのような定常領域は、当技術分野の現状において周知であり、例えば、Kabat, E.A.によって説明されている(例えばJohnson, G., and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28(2000)214-218; Kabat, E.A., et al., Proc, Natl. Acad. Sci. USA 72(1975)2785-2788を参照のこと)。

IgG4サブクラスの抗体がFc受容体(FcyRIIIa)結合の低減を示している一方で、他のIgGサブクラスの抗体は強い結合を示している。しかしながら、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc炭水化物の欠如)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、及びHis435は、変更された場合には、同様に低減されたFc受容体結合性を示す残基である(Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276(2001)6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9(1995)115-119; Morgan, A., et al., Immunology 86(1995)319-324; EP 0 307 434)。

1つの実施形態では、本発明による抗体は、IgG1抗体と比較してFcR結合が低減されているので、全長親抗体は、FcR結合に関して、IgG4サブクラスのもの、あるいはS228、L234、L235及び/又はD265に突然変異を伴う、及び/又はPVA236突然変異を含むIgG1又はIgG2サブクラスのものである。1つの実施形態では、全長親抗体内の突然変異は、S228P、L234A、L235A、L235E、及び/又は、PVA236である。他の実施形態では、全長親抗体内の突然変異は、IgG4ではS228PそしてとIgG1ではL234AとL235Aにある。

抗体の定常領域は、ADCC(抗体依存性細胞毒性)及びCDC(補体依存性細胞毒性)に直接関与する。補体活性化(CDC)は、大部分のIgG抗体サブクラスの定常領域への補体C1q因子の結合により開始する。抗体へのC1qの結合は、いわゆる結合部位で所定のタンパク質‐タンパク質相互作用により起きる。そのような定常領域の結合部位は、当技術分野の現状において公知であり、例えばLukas, T.J., et al., J. Immunol. 127(1981)2555-2560;Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16(1979)907-917;Burton, D.R., et al., Nature 288(1980)338-344;Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37(2000)995-1004;Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164(2000)4178-4184;Hezareh, M., et al., J. Virol. 75(2001)12161-12168;Morgan, A., et al., Immunology 86(1995)319-324;及びEP 0 307 434により記載されている。そのような定常領域の結合部位は、例えばアミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及びP329(付番は常にKabatのEUインデックスに準じる)を特徴とする。

用語「抗体依存性細胞毒性(ADCC)」は、エフェクター細胞の存在下での、本発明よる抗体によるヒト標的細胞の溶解を指す。ADCCは、好ましくは、新たに単離されたPBMC、又は単球若しくはナチュラルキラー(NK)細胞又は恒久的に増殖しているNK細胞株のような精製された軟膜由来エフェクター細胞等のエフェクター細胞の存在下で、本発明よる抗体を用いて、抗原を発現細胞の調製物を処理することにより測定される。
用語「補体依存性細胞毒性(CDC)」は、大部分のIgG抗体サブクラスのFc部への補体C1q因子の結合により開始する過程と規定される。抗体へのC1qの結合は、いわゆる結合部位で所定のタンパク質‐タンパク質相互作用により起きる。そのようなFc部の結合部位は、当技術分野の現状において公知である(前記を参照のこと)。そのようなFc部の結合部位は、例えばアミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331、及びP329(付番は常にKabatのEUインデックスに準じる)を特徴とする。サブクラスIgG1、IgG2、及びIgG3の抗体は、通常はC1q及びC3の結合を含めた補体活性化を示し、一方でIgG4は補体系を活性化せず、C1q及びC3と結合しない。

モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能は、Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17(1999)176-180及びUS 6,602,684に記載されているように、それらのオリゴ糖構成要素を操作することによって増強することができる。癌免疫療法において最もよく使用される抗体であるIgG1型抗体は、保存されたN結合型グリコシル化部位を各CH2ドメイン中のAsn297において有する糖タンパク質である。Asn297に結合した2つの複合型二分岐オリゴ糖は、CH2ドメインの間に埋もれて、ポリペプチド骨格との広範囲の接触面を形成し、それらの存在は、抗体依存性細胞毒性(ADCC)のようなエフェクター機能を抗体が媒介するために不可欠である(Lifely, M.R., et al., Glycobiology 5(1995)813-822; Jefferis, R., et al., Immunol. Rev. 163(1998)59-76; Wright, A. and Morrison, S.L., Trends Biotechnol. 15(1997)26-32)。Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17(1999)176-180及びWO 99/54342は、2つに分岐したオリゴ糖の形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(「GnTIII」)がチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において過剰発現されると、抗体の生体内でのADCC活性が有意に増大することを示した。また、Asn297炭水化物の組成の改変又はその除去も、FcγR及びC1qへの結合に影響を及ぼす(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17(1999)176-180; Davies, J., et al., Biotechnol. Bioeng. 74(2001)288-294; Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276(2001)45539-45547; Radaev, S., et al., J. Biol. Chem. 276(2001)16478-16483; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276(2001)6591-6604; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 277(2002)26733-26740; Simmons, L.C., et al., J. Immunol. Methods 263(2002)133-147)。

モノクローナル抗体の細胞媒介性エフェクター機能を増強するための方法は、例えば、WO 2005/018572、WO 2006/116260、WO 2006/114700、WO 2004/065540、WO 2005/011735、WO 2005/027966、WO 1997/028267、US 2006/0134709、US 2005/0054048、US 2005/0152894、WO 2003/035835、及びWO 2000/061739に記載されている。

驚いたことに、本発明の1つの実施形態である二重特異性<ErbB3‐c‐Met>抗体は、それらの親<ErbB3>及び/又は<c‐Met>抗体と比較して、標的抗原の下方制御の低下と内在化を示す。そのため、本発明の1つの好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、(それがIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4サブクラス、好ましくはIgG1又はIgG3サブクラスのFc部を含んでなる場合)Asn297にて糖鎖を用いてグリコシル化され、それによって、前記糖鎖内のフコースの量が65%以下になる(付番はKabatに準じる)。他の実施形態では、前記糖鎖内のフコースの量が、5%〜65%、好ましくは20%〜40%である。本発明による「Asn297」は、Fc領域内の約297位に見られるアミノ酸であるアスパラギンを意味する。抗体のわずかな配列変化により、Asn297はまた、297位の数アミノ酸(通常、±3アミノ酸以下)上流又は下流、すなわち、294位から300位の間でも見られることがある。本発明によるグリコシル化抗体の1つの実施形態では、IgGサブクラスは、ヒトIgG1サブクラスのもの、突然変異L234AとL235Aを伴うヒトIgG1サブクラスのもの又はIgG3サブクラスのものである。さらなる態様では、前記糖鎖内のN‐グリコリルノイラミン酸(NGNA)の量が1%以下である、及び/又はN末端アルファ‐1,3‐ガラクトースの量が1%以下である。前記糖鎖は、好ましくは、CHO細胞において遺伝子組み換えにより発現される抗体のAsn297に取り付けられたN結合型グリカンの特徴を示す。

用語「CHO細胞において遺伝子組み換えにより発現される抗体のAsn297に取り付けられたN結合型グリカンの特徴を示す」は、本発明による全長親抗体のAsn297の糖鎖が、例えば、未改変のCHO細胞において発現された抗体、例えばWO2006/103100で報告された抗体と同じ抗体と同じ構造及びフコース残基以外の糖残基配列を持つことを意味する。
用語「NGNA」は、本明細書中で使用される場合、糖残基N‐グリコリルノイラミン酸を意味する。

ヒトIgG1又はIgG3のグリコシル化は、最大2つのGal残基で終わるコアフコシル化二本鎖複合型オリゴ糖グリコシル化としてAsn297で起こる。IgG1又はIgG3サブクラスのヒト重鎖定常領域は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)、及びBruggemann, M., et al., J. Exp. Med. 166(1987)1351-1361; Love, T.W., et al., Methods Enzymol. 178(1989)515-527によって詳細に説明されている。これらの構造は、終末のGal残基の量に依存して、G0、G1(α‐1,6‐若しくはα‐1,3‐)又はG2グリカン残基として指定される(Raju, T.S., Bioprocess Int. 1(2003)44-53)。抗体Fc部分のCHOタイプのグリコシル化は、例えば、Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14(1997)201-207によって説明されている。非糖修飾CHO宿主細胞において組換え発現される抗体は、通常少なくとも85%の量がAsn297においてフコシル化されている。全長親抗体の修飾オリゴ糖は、ハイブリッドであっても複合体であってもよい。好ましくは、分枝、還元/非フコシル化オリゴ糖がハイブリッドされる。他の実施形態において、分枝、還元又は非フコシル化オリゴ糖が複合体化される。

本発明による「フコースの量」は、MALDI−TOF質量分析法によって測定し、平均値として算出した、Asn297に結合したすべての糖残基(例えば、複合体構造物、ハイブリッド構造物、及び高マンノース構造物)の合計に対するAsn297における糖鎖内のフコースの量を意味する。フコースの相対量は、MALDI−TOFによって測定した、N-グリコシダーゼFで処理したサンプルにおいて同定された全糖構造物(例えば、それぞれ複合体構造物、ハイブリッド構造物、並びにオリゴマンノース構造物及び高マンノース構造物)に対するフコース含有構造物のパーセンテージである。

本発明に記載の抗体は、リコンビナント手段により産生される。よって、本発明の1つ態様は、本発明による抗体をコードする核酸であり、そして更なる態様は、本発明による抗体をコードする前記核酸を含んでなる細胞である。リコンビナント産生のための方法は、当技術分野の現状において広く公知であり、抗体ポリペプチドのその後の単離及び通常は医薬として許容され得る純度への精製を伴う、原核細胞及び真核細胞におけるタンパク質の発現を含む。宿主細胞における前述の抗体の発現のために、個別に改変した軽鎖及び重鎖をコードする核酸が、標準的な方法により発現ベクターに挿入される。発現は、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母、又はE.コリ(E. coli)細胞などの適切な原核又は真核宿主細胞において行われ、そして抗体は、その細胞から回収される(上清又は細胞溶解後に)。抗体のリコンビナント産生のための一般的な方法は、当技術分野の現状において周知であり、例えばMakrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17(1999)183-202;Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8(1996)271-282;Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16(2000)151-160;Werner, R.G., Drug Res. 48(1998)870-880の総説に記載されている。

本発明による三価の二重特異性抗体は、例えばプロテインA‐セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの通常の免疫グロブリン精製手順により培養液から適切に分離される。モノクローナル抗体をコードするDNA及びRNAは、通常の手順を使用して容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNA及びRNAの起源として役立つことができる。いったん単離されれば、DNAを発現ベクターに挿入し、次いでそれをHEK293細胞、CHO細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、この宿主細胞におけるリコンビナントモノクローナル抗体の合成を達成することができ、この宿主細胞は、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない。

三価の二重特異性抗体のアミノ酸配列変異体(突然変異体)は、抗体のDNA内に適切なヌクレオチドの変更を導入することによって、又はヌクレオチド合成によって調製される。しかし、そのような改変は、例えば上記のように非常に限られた範囲内でのみ行うことができる。例えば、改変は、IgGアイソタイプ及び抗原の結合などの前述の抗体の特徴を変化させるのではなく、リコンビナント産生の収率又はタンパク質の安定性を改善することがあるし、精製を容易にすることもある。

用語「宿主細胞」は、本願で使用される場合、本発明による抗体を産生するために設計され得るあらゆる種類の細胞系を意味する。1つの実施形態では、HEK293細胞及びCHO細胞が宿主細胞として使用される。本明細書において使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」及び「細胞培地」とは、互換的に使用され、そしてすべてのそのような名称は子孫も包含する。従って、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」とは、トランスファーの数に関係なく、それらに由来する初代対象細胞及び培養物を包含する。すべての子孫は、故意の又は偶然な突然変異のために、DNA含有において正確には同一でないこともまた理解されている。元の形質転換された細胞についてスクリーンされる場合、同じ機能的又は生物学的活性を有する変異体子孫が包含される。

NS0細胞における発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32(2000)109-123; Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73(2001)261-270により記載されている。一過性発現が、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30(2002)E9により記載される。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(1989)3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(1992)4285-4289;及びNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204(1997)77-87により記載されている。好ましい一過性発現システム(HEK293)は、Schlaeger, E.-J., and Christensen, K., in Cytotechnology 30(1999)71-83 及びSchlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194(1996)191-199により記載される。

原核生物のために適切である制御配列には、例えばプロモーター、任意にはオペレーター配列及びリボソームに結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを使用することが知られている。

核酸は、それが他の核酸配列と機能的な関連性をもって配置されるとき、「操作可能な形で連結され」ている。例えば、プレ配列又は分泌リーダーのDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるとき、ポリペプチドに関してDNAと操作可能な形で連結している;プロモーター又はエンハンサーは、それがその配列の転写に影響するとき、コード配列と操作可能な形で連結されている;又は、リボソーム結合部位は、それが転写を促進するように配置されているとき、コード配列に操作可能な形で連結されている。一般的に、「操作可能な形で連結された」は、連結されたDNA配列が隣接し、そして、分泌リーダーの場合は、隣接し、且つ、読み枠内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要は無い。連結は、都合の良い制限部位でライゲーションを行うことにより達成される。そのような部位が存在しなければ、確立された手段に従い、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。

抗体の精製は、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当該技術分野において周知な他の方法を含む標準的な技術により、他の細胞成分又は他の汚染物、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質を除去するために実行される。Ausubel, F., et al. (ed.), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York(1987)を参照のこと。別の方法、例えば、微生物タンパク質を用いた親和性クロマトグラフィー(例えば、プロテインA又はプロテインG親和性クロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、カチオン交換(カルボキシメチル樹脂)、陰イオン交換性(アミノエチル樹脂)及び混合モード交換)、thiophilic吸着(例えば、β‐メルカプトエタノールと他のSHリガンド類を用いて)、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー(例えば、フェニル‐セファロース、アザ‐アレノフィリック樹脂、又はm‐アミノフェニルボロン酸を用いて)、金属キレート親和性クロマトグラフィー(例えば、ニッケル(II)及びCu(II)親和性材料を用いて)、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動法(ゲル電気泳動、毛細管電気泳動など)などが、確立されており、そしてタンパク質精製のために幅広く使用されている(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102)。

本発明の1つの態様は、本発明による抗体を含んでなる医薬組成物である。本発明の別の態様は、医薬組成物の製造のための本発明による抗体の使用である。本発明の更なる態様は、本発明による抗体を含んでなる医薬組成物の製造のための方法である。別の態様では、本発明は、医薬担体と一緒に処方される本発明による抗体を含んでなる組成物、例えば医薬組成物を提供する。

本発明の1つの態様は、癌治療のための本発明による三価の二重特異性抗体である。
本発明の別の態様は、癌治療のための前記医薬組成物である。
本発明の別の態様は、癌処置用の治療薬の製造のための本発明による抗体の使用である。
本発明の別の態様は、本発明による抗体をそういった処置を必要としている患者に投与することによる、癌に罹患している患者の処置方法である。

本明細書中で使用されるとき、「医薬担体」には、生理学的に適合する任意の及び全ての溶媒、分散媒、被覆剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、前記担体は、(例えば注射又は点滴による)静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与又は上皮投与に適切である。

本発明の組成物は、当該技術分野において知られる様々な方法により投与され得る。当業者に認識されるように、投与の経路及び/又は様式は、所望される結果に依存して異なる。ある投与径路により本発明の組成物を投与するためには、その組成物を、その不活性化を防止する材料で被覆し、又はその組成物と共に同時に投与する必要がある。例えば、前記組成物は、例えばリポソーム、又は希釈剤などの適切な担体に加えられて対象に投与され得る。医薬として許容される希釈剤には、生理食塩水及び水性緩衝溶液が含まれる。医薬として許容される担体には、滅菌水性溶液又は分散剤、滅菌済みの注射可能な溶液又は分散剤を即時調製するための滅菌粉末が含まれる。そのような医薬活性物質のための媒体及び薬剤は、当該技術分野において知られている。

「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、本明細書中で使用される場合、腸内投与及び局所投与以外の投与様式を意味し、通常は注射により、これだけに限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、皮下、くも膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内注射及び点滴を含む。

用語「癌」は、本明細書中で使用される場合、例えばリンパ腫、リンパ球性白血病、肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細気管支肺胞細胞性肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部の癌、皮膚又は眼内の黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部の癌、胃癌、胃せん癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣癌、外陰部癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓又は輸尿管の癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞性癌、胆管癌、中枢神経系(CNS)の新生物、脊椎軸腫瘍、脳幹膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、脳室上衣腫、髄芽腫、髄腹腫、扁平上皮癌、脳下垂体腺腫及びユーイング肉腫、そして前記癌のうちのいずれかの難治性バーション、又は前記癌のうちの1つ若しくは複数の組合せを含めたものであり得る。

これらの組成物はさらに、保存料、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの補助剤を含むこともできる。微生物の存在の予防は、前掲の殺菌手段によって、及び様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの含有によって確保できる。組成物中に等張剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましいこともある。加えて、注射用医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの吸収を遅らせる作用物質の含有によって引き起こすこともできる。

選択した投与経路にかかわらず、(好適な水和形態で使用することもできる)本発明の化合物、及び/又は本発明の医薬組成物を、当業者に知られている従来の方法によって医薬的に許容し得る剤形に処方する。
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者、組成物、及び投与様式について、その患者にとって有毒であることなしに、所望の治療応答を達成するのに有効である有効成分量を得るように変更することもできる。選択される投与量レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、、投与経路、投与時間、用いられる特定の化合物の排泄速度、処置期間、用いられる特定の組成物と組み合わせて使用されるその他の薬物、化合物及び/又は材料、処置される患者の年齢、性別、体重、身体状態、健康全般、及び前病歴、並びに医療分野で周知の要因など、を含めたさまざまな薬物動態学的要因に依存するであろう。

組成物は、それがシリンジによって提出できる程度に無菌であり、且つ、液状でなければならない。水に加えて、好ましくは、担体は等張緩衝生理食塩溶液である。

適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合には所望の粒度の維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持できる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、マンニトールやソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムを含むことが望ましい。

本明細書において使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」及び「細胞培地」とは、互換的に使用され、そしてすべてのそのような名称は子孫も包含する。従って、単語「形質転換体」及び「形質転換細胞」とは、トランスファーの数に関係なく、それらに由来する初代対象細胞及び培養物を包含する。すべての子孫は、故意の又は偶然な突然変異のために、DNA含有において正確には同一でないこともまた理解されている。元の形質転換された細胞についてスクリーンされる場合、同じ機能的又は生物学的活性を有する変異体子孫が包含される。異なった命名法が意図される場合は、その内容から明白であろう。

用語「形質転換」とは、本明細書において使用される場合、宿主細胞中へのベクター/核酸のトランスファー工程を指す。強い細胞壁バリアを有さない細胞が宿主細胞として使用される場合、トランスフェクションが、例えばGraham, F.L., and van der Ed, A.J. Virology 52(1973)456-467により記載されるようなリン酸カルシウム沈殿方法により実施される。しかしながら、核注入又はプロトプラスト融合による細胞中へのDNAの導入のための他の方法がまた使用され得る。原核細胞、又は実質的な細胞壁構造を含む細胞が使用される場合、1つのトランスフェクション方法は、Cohen, S.N, et al, PNAS 69(1972)2110-2114により記載されるような、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理法である。

本明細書において使用される場合、「発現」とは、核酸がmRNAに転換される方法、及び/又は転写されたmRNA(転写体とも呼ばれる)がペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に連続的に翻訳される過程を指す。転写体及びコードされるポリペプチドは、集合的には、遺伝子生成物とも呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、真核細胞における発現は、mRNAのスプライシングを含む。

「ベクター」とは、挿入される核酸分子を、宿主細胞中に及び/又は宿主細胞間にトランスファーする、核酸分子、特に自己複製する核酸分子である。この用語は、DNAの細胞中への挿入(例えば、染色体組込み)のために主に機能するベクター、DNA又はRNAの複製のために主に機能するベクターの複製、及びDNA又はRNAの転写及び/又は翻訳のために機能する発現ベクターを包含する。記載されるような機能のうちの2つ以上を提供するベクターもまた包含される。

「発現ベクター」とは、適切な宿主細胞中に導入される場合、転写され、そしてポリペプチドに翻訳され得るポリヌクレオチドである。「発現システム」とは、所望する発現生成物を生成するために機能することができる発現ベクターを含んでなる適切な宿主細胞を通常指す。

アミノ酸配列の説明
配列番号1 重鎖可変ドメイン<ErbB3>HER3クローン29
配列番号2 軽鎖可変ドメイン<ErbB3>HER3クローン29
配列番号3 重鎖可変ドメイン<c‐Met>Mab 5D5
配列番号4 軽鎖可変ドメイン<c‐Met>Mab 5D5
配列番号5 重鎖<ErbB3>HER3クローン29
配列番号6 軽鎖<ErbB3>HER3クローン29
配列番号7 重鎖<c‐Met>Mab 5D5
配列番号8 軽鎖<c‐Met>Mab 5D5
配列番号9 重鎖<c‐Met>Fab 5D5
配列番号10 軽鎖<c‐Met>Fab 5D5

配列番号11 重鎖1<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_KHSS
配列番号12 重鎖2<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_KHSS
配列番号13 軽鎖<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_KHSS
配列番号14 重鎖1<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_SSKH
配列番号15 重鎖2<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_SSKH
配列番号16 軽鎖<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_SSKH
配列番号17 重鎖1<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_SSKHSS
配列番号18 重鎖2<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_SSKHSS
配列番号19 軽鎖<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_SSKHSS
配列番号20 重鎖1<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_1C

配列番号21 重鎖2<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_1C
配列番号22 軽鎖<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_1C
配列番号23 重鎖1<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_6C
配列番号24 重鎖2<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_6C
配列番号25 軽鎖<ErbB3‐c‐Met>Her3/Met_6C
配列番号26 ヒトIgG1の重鎖定常領域
配列番号27 ヒトIgG1の重鎖定常領域
配列番号28 ヒト軽鎖カッパ定常領域
配列番号29 ヒト軽鎖ラムダ定常領域

以下の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されるが、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に示される。本発明の要旨から逸脱することなしに、示された手順に改変を加えることができることが理解されている。

典型的な順序で可変ドメインと定常ドメインを含んでなる2対の重鎖と軽鎖を持ち、第1の抗原1に特異的に結合するCH4ドメインを含まない全長抗体の図式的構造。 2つのポリペプチドVHとVLがそれに融合されている(VHドメインとVLドメインは両方が一緒になって、第2の抗原2に特異的に結合する抗原結合部位を形成する)、第1の抗原1に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性抗体の略図。 2つのポリペプチドVH‐CH1とVL‐CLがそれに融合されている(VHドメインとVLドメインは両方が一緒になって、第2の抗原2に特異的に結合する抗原結合部位を形成する)、第1の抗原1に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性抗体の略図。 「knobs and holes」を備えた2つのポリペプチドVHとVLがそこに融合されている(VHドメインとVLドメインは両方が一緒になって第2の抗原2に特異的に結合する抗原結合部位を形成する)、第1の抗原1に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性抗体の略図。 「knobs and holes」を備えた2つのポリペプチドVHとVLがそれに融合されている(VHドメインとVLドメインは両方が一緒になって第2の抗原2に特異的に結合する抗原結合部位を形成する、ここで、それらのVHドメイン及びVLドメインはVH44位とVL100位の間に鎖間ジスルフィド架橋を含んでなる)、第1の抗原1に特異的に結合する全長抗体を含んでなる本発明による三価の二重特異性抗体の略図。 癌細胞の細胞表面への二重特異性抗体の結合。 二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによるHGF誘発c‐Met受容体リン酸化の阻害。 二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによるHGF誘発c‐Met受容体リン酸化の阻害。 二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによるHGF誘発c‐Met受容体リン酸化の阻害。 二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによるHRG誘発Her3受容体リン酸化の阻害。 二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによるHRG誘発Her3受容体リン酸化の阻害。 二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによるHGF誘発HUVEC増殖の阻害。 二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによる癌細胞株A431における増殖の阻害。 二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによる癌細胞株A431におけるHGF誘発細胞‐細胞転移(分散)の阻害の分析。

実験手順
材料と方法
組み換えDNA技術
Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載の標準的な方法を、DNAを操作するために使用した。分子生物学的試薬を製造業者の取扱説明書に従って使用した。

DNAとタンパク質の配列分析、及び配列データ・マネジメント
以下でヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する概説は:Kabat, E.A. et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242にある。抗体鎖のアミノ酸には、EUナンバリングに従って付番した(Edelman, G.M., et al., PNAS 63(1969)78-85; Kabat, E.A., et al.,(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242)。GCG(Genetics Computer Group、Madison, Wisconsin)のソフトウェアパッケージ バージョン10.2及びInfomaxのVector NTI Advance suiteバージョン8.0を、配列新規作成、マッピング、分析、アノテーション及び図示に使用した。

DNA配列決定
DNA配列を、SequiServe(Vaterstetten, Germany)及びGeneart AG(Regensburg, Germany)にて実施された二本鎖配列決定法によって決定した。

遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、自動化遺伝子合成によって合成オリゴヌクレオチドとPCR産物からGeneart AG(Regensburg, Germany)で調製された。1つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接した遺伝子セグメントを、pGA18(ampR)プラスミド内にクローン化した。プラスミドDNAを形質転換細菌から精製し、そしてUV分光法によって濃度決定した。サブクローニングした遺伝子フラグメントのDNA配列を、DNA配列決定法で確認した。(G4S)nペプチドコネクタによって連結されているC末端5D5 VH領域を持つCH3ドメイン内にT366W突然変異を保有する「knobs‐into‐hole」Her3(クローン29)抗体重鎖、並びに(G4S)nペプチドコネクタによって連結されているC末端5D5 VL領域を持ち、T366S、L368A及びY407V突然変異を保有する「knobs‐into‐hole」Her3(クローン29)抗体重鎖をコードする遺伝子セグメントを、5’‐BamHI及び3’‐XbaI制限部位を用いて合成した。同じように、(G4S)nペプチドコネクタで連結されているC末端5D5 VH領域を持つCH3ドメイン内にS354C及びT366Wが突然変異を保有する「knobs‐into‐hole」Her3(クローン29)抗体重鎖、並びに(G4S)nペプチドコネクタで連結されているC末端5D5 VL領域を持ち、Y349C、T366S、L368A、及びY407V突然変異を保有する「knobs‐into‐hole」Her3(クローン29)抗体重鎖をコードするDNA配列を、隣接するBamHI及びXbaI制限部位を用いて遺伝子合成によって調製した。最後に、Her3(クローン29)及び5D5抗体の無改変重鎖及び軽鎖をコードするDNA配列を、隣接するBamHI及びXbaI制限部位によって合成した。すべての構築物をリーダーペプチド(MGWSCIILFLVATATGVHS)をコードする5’末端DNA配列を用いて設計し、そして真核細胞内での分泌のためのタンパク質を目的とした。

発現プラスミドの構築
発現プラスミドをコードしているRoche発現ベクターを、すべての重VH/VL融合タンパク質及び軽鎖タンパク質の構築に使用した。ベクターは、以下の要素:
− 選択マーカーとしてのハイグロマイシン耐性遺伝子、
− エプスタイン‐バールウイルス(EBV)の複製開始点、oriP、
− E.コリ内でのこのプラスミドの複製を可能にするベクターpUC18からの複製開始点、
− E.コリ内でアンピシリン耐性を付与するβ‐ラクタマーゼ遺伝子、
− ヒト・サイトメガロウイルス(HCMV)からの前初期エンハンサ及びプロモーター
− ヒト1‐免疫グロブリン・ポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列、及び
− 固有のBamHI及びXbaI制限部位、
から構成される。

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記載したように、重鎖又は軽鎖構築物、並びにC末端VH及びVLドメインを持つ「knobs‐into‐hole」構築物を含んでなる免疫グロブリン融合遺伝子を、遺伝子合成によって調製し、そしてpGA18(ampR)プラスミド内にクローン化した。合成DNAセグメントとRoche発現ベクターを保有するpG18(ampR)プラスミドを、BamHI及びXbaI制限酵素(Roche Molecular Biochemicals)によって消化し、そしてアガロースゲル電気泳動法にかけた。次いで、精製した、重鎖又は軽鎖をコードするDNAセグメントを、単離したRoche発現ベクターBamHI/XbaI断片に連結して、最終的な発現ベクターを得た。最終的な発現ベクターをE.コリ細胞内に形質転換し、発現プラスミドDNAを単離し(Miniprep)、そして制限酵素分析とDNA配列決定にかけた。正しいクローンを、150mlのLB‐Amp培地中で培養し、再びプラスミドDNAを単離し(Maxiprep)、そして配列完全性をDNA配列決定によって確認した。

HEK293細胞における免疫グロブリン変異体の一過性発現
遺伝子組み換え免疫グロブリン変異体を、製造業者の取扱説明書(Invitrogen, USA)に従ってFreeStyle(商標)293発現系を使用したヒト胎児腎臓293‐F細胞の一過性トランスフェクションによって発現した。簡単に言えば、懸濁液FreeStyle(商標)293‐F細胞を、37℃/8%のCO2にてFreeStyle(商標)293発現培地中で培養し、そしてその細胞をトランスフェクションの日に1〜2×l06生存細胞/mlの密度で新しい培地中に播種した。DNA‐293fectin(商標)複合体を、250mlの最終的なトランスフェクション体積に対して1:1モル比で、325μlの293fectin(商標)(Invitrogen, Germany)と250μgの重鎖又は軽鎖プラスミドDNAを使用したOpti-MEM(登録商標)I培地(Invitrogen, USA)中で調製した。「knobs‐into‐hole」DNA‐293fectin複合体を、250mlの最終的なトランスフェクション体積に対して1:1:2モル比で、325μlの293fectin(商標)(Invitrogen, Germany)と、250μgの「Knobs‐into‐ホール」重鎖1及び2と、軽鎖プラスミドDNAを使用したOpti-MEM(登録商標)I培地(Invitrogen, USA)中で調製した。抗体を含有している細胞培養上清を、14000gで30分間の遠心分離及び滅菌濾紙(0.22μm)を通して濾過してトランスフェクションの7日後に採取した。上清を−20℃にて精製まで保存した。

三価の二重特異性抗体と対照抗体の精製
三価の二重特異性抗体及び対照抗体を、Protein A-Sepharose(商標)(GE Healthcare、Sweden)を使用した親和性クロマトグラフィーとSuperdex200サイズ排除クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。簡単に言えば、滅菌濾過した細胞培養上清を、PBSバッファー(10mMのNa2HPO4、1mMのKH2PO4、137mMのNaCl及び2.7mMのKCl、pH、7.4)で平衡化したHiTrap ProteinA HP(5ml)カラムにかけた。非結合タンパク質を平衡化バッファーで洗い落とした。抗体と抗体変異体を、0.1Mのクエン酸バッファー、pH2.8で溶出し、そしてタンパク質含有画分を0.1mlの1M Tris(pH8.5)で中和した。次いで、溶出したタンパク質画分を貯留し、Amiconの超遠心濾過機デバイス(MWCO:30K、Millipore)を用いて3mlの体積まで濃縮し、20mMのヒスチジン、140mMのNaCl、pH6.0で平衡化したSuperdex200 HiLoad 120ml 16/60ゲル濾過カラム(GE Healthcare、Sweden)に投入した。高分子量集合体が5%未満しかない、精製された二重特異性抗体と対照抗体を含有する画分を貯留し、そして1.0mg/mlのアリコートとして−80℃にて保存した。Fabフラグメントを、精製した5D5モノクローナル抗体のパパイン消化と、それに続くプロテインAクロマトグラフィーによる夾雑Fcドメインの除去によって作り出した。非結合Fabフラグメントを、20mMのヒスチジン、140mMのNaCl、pH6.0で平衡化したSuperdex200 HiLoad 120ml 16/60ゲル濾過カラム(GE Healthcare、Sweden)でさらに精製し、貯留し、そして1.0mg/mlのアリコートとして−80℃にて保存した。

精製タンパク質の分析
精製タンパク質サンプルのタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて算出したモル吸光係数を使用し、280nmにて吸光度(OD)を計測することによって測定した。二重特異性抗体及び対照抗体の純度と分子量を、還元剤(5mMの1,4‐ジチオスレイトール)の存在下と不存在下でのSDS‐PAGE分析、そしてクーマシーブリリアントブルーでの染色によって分析した。NuPAGE(登録商標)Pre-Castゲルシステム(Invitrogen, USA)を、製造業者の取扱説明書に従って使用した(4‐20%のトリスグリシン・ゲル)。二重特異性抗体及び対照抗体サンプルの凝集体量を、200mMのKH2PO4、250mMのKCl、pH7.0の泳動バッファー中、25℃にてSuperdex200分析用サイズ排除カラム(GE Healthcare、Sweden)を使用した高性能SECによって分析した。25μgのタンパク質を、0.5ml/分の流量にてカラム上に注入し、そして50分間かけて定組成で溶出した。安定性分析のために、1mg/mlの濃度の精製タンパク質を、4℃と40℃にて7日間インキュベートし、その後、高性能SECによって評価した。還元した二重特異性抗体軽鎖及び重鎖のアミノ酸骨格の完全性を、ペプチド‐N‐グリコシダーゼF(Roche Molecular Biochemicals)での酵素的処理によるN‐グリカンの除去後のNanoElectrospray Q-TOF質量分析によって確認した。

c‐Metリン酸化アッセイ
6ウェルプレートの1ウェルあたり5x10e5個のA549細胞を、0.5%のFCS(ウシ胎仔血清)を含むRPMI中、HGF刺激の前日に播種した。翌日に、成長培地を、0.2%のBSA(ウシ血清アルブミン)を含むRPMIで一時間、置き換えた。次いで、5μg/mLの二重特異性抗体を培地に加え、そして細胞を、HGFを加えるまで10分間インキュベートし、50ng/mlの終濃度で更に10分間インキュベートした。それらを氷上に置いてすぐに、細胞を1mMのバナジウム酸ナトリウムを含有する氷冷PBSで一度洗浄し、そしてそれらを、100μLの溶解バッファー(50mMのTris‐Cl pH7.5、150mMのNaCl、1%のNP40、0.5%のDOC、アプロチニン、0.5mMのPMSF、1mMのバナジウム酸ナトリウム)を用いて細胞培養プレート内で溶解した。細胞溶解物をエッペンドルフチューブに移し、そして溶解を氷上で30分間進めた。タンパク質濃度を、BCA方法(Pierce)を使用して測定した。30〜50μgの溶解物を、4‐12%のBis-Tris NuPageゲル(Invitrogen)により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を、5%のBSAを含有するTBS‐Tで一時間ブロッキングし、そして製造業者の取扱説明書に従って、Y1230、1234、1235(44-888、Biosource)に対するリン酸化部位特異的c‐Met抗体を用いて現像した。免疫ブロットを、非リン酸化c‐Metに結合する抗体(AF276、R&D)で再検出した。

Her3(ErbB3)リン酸化アッセイ
12ウェルプレートの1ウェルにつき2×10e5個のMCF7細胞を、完全成長培地(RPMI1640、10%FCS)中で播種した。細胞を、2日以内に90%集密まで成長させた。次いで、培地を、0.5%のFCSを含む飢餓培地で置き換えた。翌日、500ng/mlのヘレグリン(R&D)の添加の1時間前に、それぞれの抗体を表示した濃度にて補った。ヘレグリン細胞を添加すると、細胞を採集し、そして溶解するまでに更に10分間培養した。タンパク質濃度をBCA法(Pierce)を使用することで測定した。30〜50μgの溶解物を、4‐12%のBis-Tris NuPageゲル(Invitrogen)により分離し、そしてゲル上のタンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を、5%のBSAを含むTBS‐Tで1時間ブロッキングし、そしてTyr1289(4791、Cell Signaling)を特異的に認識するリン酸化部位特異的Her3/ErbB3抗体を用いて現像した。

分散アッセイ
化合物処置の前日に、A549(1ウェルあたり4000個の細胞)又はA431(1ウェルあたり8000個の細胞)を、0.5%のFCSを含むRPMI中、96ウェルのE-Plate(Roche、05232368001)内の200μLの全容量の中に播種した。接着と細胞成長を、電気抵抗を観察する15分毎のスイープによりReal Time Cell Analyzer機器で一晩観察した。翌日、細胞を、5分毎にスイープしながらPBS中のそれぞれの抗体希釈物5μLと共にプレインキュベートした。30分後に、20ng/mLの終濃度をもたらす2.5μLのHGF溶液を加え、そして実験を更に72時間続けた。急激な変化を、180分間の1分毎のスイープで観察し、続いて残りの期間、15分毎のスイープで観察した。

FACS
a)結合アッセイ
A431を剥離し、そしてカウントした。96ウェルのコニカルプレートの1ウェルあたり1.5×10e5個の細胞を播種した。細胞を、遠沈し(1500rpm、4℃、5分間)、そして2%のFCS(ウシ胎仔血清)を含むPBS中のそれぞれの二重特異性抗体の希釈系列50μL中で、氷上において30分間インキュベートした。細胞を、再度遠沈し、そして2%のFCSを含有するPBS200μLで洗浄し、続いて2%のFCS(Jackson Immunoresearch、109116098)を含有するPBSに希釈した、ヒトFcに対するフィコエリトリン結合抗体と一緒に30分間の2回目のインキュベーションをおこなった。細胞を、2%のFCSを含有するPBS200μLで2回、遠沈洗浄し、BD CellFix溶液(BD Biosciences)で再懸濁し、そして氷上で少なくとも10分間インキュベートした。細胞の平均蛍光強度(mfi)を、フローサイトメトリー(FACS Canto、BD)によって測定した。Mfiを、少なくとも2つの独立した染色の二重反復試験で決定した。フローサイトメトリースペクトルを、FlowJoソフトウェア(TreeStar)を使用して更に加工した。最大半減結合を、XLFit4.0(IDBS)及び用量応答ワンサイトモデル205を使用して決定した。

b)内在化アッセイ
細胞は、剥離し、そしてカウントした。5×10e5個の細胞を、エッペンドルフチューブ内の50μLの完全培地中に入れ、5μg/mLのそれぞれの二重特異性抗体と一緒に37℃にてインキュベートした。表示した時点で細胞を氷上に保存し、タイムコースが完了するまで保存した。その後、細胞を、FACSチューブに移し、遠沈し(1500rpm、4℃、5分間)、PBS+2%のFCSで洗浄し、そして2%のFCS(Jackson Immunoresearch、109116098)を含有したPBSちゅに希釈した、ヒトFcに対するフィコエリトリン結合二次抗体50μLと一緒に30分間インキュベートした。細胞を、再度遠沈し、PBS+2%のFCSで洗浄し、そして蛍光強度をフローサイトメトリー(FACS Canto、BD)によって測定した。

c)架橋試験
HT29細胞を剥離し、カウントし、そして製造業者の取扱説明書に従ってPKH26とPKH67(Sigma)で個別に染色した2つの集団に分けた。それぞれの染色集団について、5×10e5個の細胞を採取し、合わせ、そして完全培地中で10μg/mLのそれぞれの二重特異性抗体と一緒に30分間及び60分間インキュベートした。表示した時点で細胞を氷上に保存し、タイムコースが完了するまで保存した。細胞を、遠沈し(1500rpm、4℃、5分間)、PBS+2%のFCSで洗浄し、そして蛍光強度をフローサイトメトリー(FACS Canto、BD)によって測定した。

Cell Titer Glowアッセイ
細胞生存率と増殖をcell titer glowアッセイ(Promega)を使用することで定量化した。製造業者の取扱説明書に従ってアッセイを実施した。簡単に言えば、細胞を、96ウェルプレート内の100μLの全容量中で所望の期間、培養した。増殖アッセイのために、細胞を、インキュベータから取り出し、そして室温にて30分間、静置した。100μLのcell titer glow試薬を加え、そしてマルチウェルプレートを2分間、オービタル振盪機にかけた。発光をマイクロプレートリーダー(Tecan)により15分後に定量化した。

Wst‐1アッセイ
Wst‐1生存率と細胞増殖アッセイをエンドポイント分析として実施し、代謝的に活性な細胞の数を検出した。簡単に言えば、20μLのWst‐1試薬(Roche、1164480700)を200μLの培地に加えた。色素の完全な現像まで、96ウェルプレートを更に30分間〜1時間インキュベートした。染色強度を、450nmの波長にてマイクロプレートリーダー(Tecan)により定量化した。

三価の二重特異性<ErbB3‐c‐Met>抗体の発現及び精製の設計
表1において:表1に示したそれぞれの特徴を有する、全長ErbB‐3抗体(Her3 クローン29)とC‐Met抗体(c‐Met 5D5)からのVH及びVLドメインに基づく三価の二重特異性<ErbB3‐c‐Met>抗体を、先に記載の一般的方法に従って発現させ、そして精製した。対応するHER3クローン29とc‐Met 5D5のVH及びVLを配列表に示した。

実施例1(図5):
癌細胞の細胞表面への二重特異性抗体の結合
細胞表面のそれらの受容体それぞれに対する二重特異性抗体の結合特性を、フローサイトメトリーに基づくアッセイによりA431癌細胞上で分析した。細胞を、単一又は二重特異性一次抗体と一緒にインキュベートし、そしてこれらの抗体のそれらの同族受容体に対する結合を、一次抗体のFcに特異的に結合するフルオロフォアを結合させた二次抗体を用いて検出した。一次抗体の希釈系列の平均蛍光強度を、抗体の濃度に対してプロットして、シグモイド結合曲線を得た。c‐MetとHer3の細胞表面発現を、二価の5D5及びHer3クローン29抗体だけでのインキュベーションによって実証した。Her3/c‐Met_KHSS抗体は、A431の細胞表面に容易に結合する。これらの実験設定の下で、抗体はそのHer3部分を介して結合するだけであるので、その結果、平均蛍光強度はHer3クローン29単独の染色を超えない。

実施例2(図6):
二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによるHGF誘発c‐Met受容体リン酸化の阻害
二重特異性抗体のc‐Met部分の機能性を確認するために、c‐Metリン酸化アッセイを実施した。この実験では、A549肺癌細胞又はHT29大腸癌細胞を、二重特異性抗体又は対照抗体で前処理した後に、HGFにさらした。次いで、細胞を溶解し、そしてc‐Met受容体のリン酸化を調べた。免疫ブロットにおけるリン酸化c‐Met特異的バンドの出現によって観察されるように、両細胞株ともHGFで刺激できた。

実施例3(図6):
二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによるHRG誘発Her3受容体リン酸化の阻害
二重特異性抗体のHer3部分の機能性を確認するために、Her3リン酸化アッセイを実施した。この実験では、MCF7細胞を、二重特異性抗体又は対照抗体で前処理した後に、HRG(Heregulin)にさらした。次いで、細胞を溶解し、そしてHer3受容体のリン酸化を調べた。Her3/c‐Met_KHSSは、親Her3クローン29と同程度にHer3受容体のリン酸化を阻害したので、その抗体のHer3結合及び機能性が三価抗体フォーマットによって損なわれないことを示した。

実施例4(図8):
二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによるHGF誘発HUVEC増殖の阻害
HGFの細胞分裂効果を実証するために、HUVEC増殖アッセイを実施した。HUVECへのHGFの添加は、増殖の2倍の増加をもたらす。二重特異性抗体と同じ濃度領域内でのヒトIgG対照抗体の添加は、細胞増殖に対して全く影響がなかったが、その一方で、5D5 Fabフラグメントは、HGF誘発増殖を阻害した。Her3/c‐Met_KHSSの滴定は、抗体のわずかな阻害効果を実証している(図8)。その効果は、Her3/Met‐6C抗体に関してより明白であり、より長いコネクタが抗体の有効性を改善することを示している。これは三価抗体フォーマットにおけるc‐Met成分の機能性を実証している。

実施例5(図9):
二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによる癌細胞株A431における増殖阻害
A431を血清減量培地に播種した場合、HGF添加は、転移とは別に弱い細胞分裂効果を誘発する。これをHGF処理したA431の増殖に対するHer3/c‐Met_KHSSの効果を分析するのに利用した。実際には、二重特異性抗体は、HGF誘導性の増殖の増加を大幅に阻害できた(15%)。対照ヒトIgG1抗体は、HGFによって促進したA431細胞の増殖に影響を与えなかった。

実施例6(図10):
二重特異性Her3/c‐Met抗体フォーマットによる癌細胞株A431におけるHGF誘発性細胞‐細胞転移(分散)の阻害の分析
HGF誘導性分散は細胞の形態学的変化を伴うので、細胞の円形化、糸状仮足様前突起、紡錘形構造体、及び細胞の特定の運動性をもたらす。Real Time Cell Analyzer(Roche)は、所定の細胞培養ウェルの電気抵抗を計測するので、そのため細胞形態及び増殖における変化を間接的に観察できる。A431及びA549細胞に対するHGFの添加は、時間の関数として観察した電気抵抗の変化をもたらした。Her3/c‐Met_KHSS及びHer3/Met‐6Cは、HGF誘導性分散を阻害し、Her3/Met‐6Cがより効果的であった(20.7%及び43.7%の分散阻害)(図10)

Claims (9)

  1. 三価の二重特異性抗体であって、以下の:
    a)第1の抗原に特異的に結合し、且つ、2つの抗体重鎖と2つの抗体軽鎖から成る全長抗体;
    b)ポリペプチドであって、以下の:
    ba)抗体重鎖可変ドメイン(VH);又は
    bb)抗体重鎖可変ドメイン(VH)と抗体定常ドメイン1(CH1);
    から成り、ここで、VHドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちの一方のC末端に融合されている前記ポリペプチド、
    c)ポリペプチドであって、以下の:
    ca)抗体軽鎖可変ドメイン(VL);又は
    cb)抗体軽鎖可変ドメイン(VL)と抗体軽鎖定常ドメイン(CL);から成り、ここで、VLドメインのN末端で、ペプチドコネクタを介して前記全長抗体の2つの重鎖のうちのもう片方のC末端に融合されている前記ポリペプチド、
    を含んでなり;そして、ここで、b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)とc)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)が一緒になって、第2の抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成する前記三価の二重特異性抗体。
  2. 一方の重鎖のCH3ドメインともう片方の重鎖のCH3ドメインが、抗体CH3ドメイン間に本来の界面を含んでなる界面で各々接触することを特徴とする、請求項1に記載の三価の二重特異性抗体であって;
    ここで、前記界面は二価の二重特異性抗体の形成を促進するよう変更され、ここで、前記変更が、以下の:
    i)二価の二重特異性抗体内のもう片方の重鎖のCH3ドメインの本来の界面と接触する、一方の重鎖のCH3ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより大きな側鎖体積を有するアミノ残基により置換され、それにより、もう片方の重鎖のCH3ドメインの界面内の腔に配置可能な、一方の重鎖CH3ドメインの界面内に隆起部を生じるように、一方の重鎖のCH3ドメインが変更され、そして
    ii)三価の二重特異性抗体内の第1CH3ドメインの本来の界面と接触する、第2CH3ドメインの本来の界面内で、アミノ酸残基がより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基により置換され、それにより、第1CH3ドメインの界面内の隆起部が配置可能な、第2CH3ドメインの界面内に腔を生じるように、もう片方の重鎖のCH3ドメインが変更されることを特徴とする、前記三価の二重特異性抗体。
  3. 以下の:
    i)より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)から成る群から選択され;且つ
    ii)より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基が、アラニン(A)、セリン(S)、トレオニン(T)、バリン(V)から成る群から選択される、
    を特徴とする、請求項2に記載の三価の二重特異性抗体。
  4. 両CH3ドメインが、その両CH3ドメイン間にジスルフィド架橋を形成できるように、各々のCH3ドメインの対応する位置のアミノ酸としてのシステイン(C)の導入によりさらに変更されることを特徴とする、請求項2又は3に記載の三価の二重特異性抗体。
  5. 以下の:
    前記i)のCH3ドメインが、T366W突然変異を含んでなり;且つ
    前記ii)のCH3ドメインが、T366S、L368A、Y407V突然変異を含んでなる、
    を特徴とする、請求項2〜4のいずれか1項に記載の三価の二重特異性抗体。
  6. 以下の:
    前記i)のCH3ドメインが、Y349C、T366Wに突然変異を含んでなり;且つ
    前記ii)のCH3ドメインが、S354C、T366S、L368A、Y407V突然変異を含んでなる、
    を特徴とする、請求項4に記載の三価の二重特異性抗体。
  7. 前記b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)と前記c)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)が連結され、そして下記の位置:
    i)重鎖可変ドメインの第44位〜軽鎖可変ドメインの第100位
    ii)重鎖可変ドメインの第105位〜軽鎖可変ドメインの第43位、又は、
    iii)重鎖可変ドメインの第101位〜軽鎖可変ドメインの第100位、
    の間へのジスルフィド結合の導入によって鎖間ジスルフィド架橋によって安定化させることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の三価の二重特異性抗体。
  8. 前記b)のポリペプチドの抗体重鎖可変ドメイン(VH)と前記c)のポリペプチドの抗体軽鎖可変ドメイン(VL)が連結され、そして下記の位置:
    i)重鎖可変ドメインの第44位と軽鎖可変ドメインの第100位、
    の間へのジスルフィド結合の導入によって鎖間ジスルフィド架橋によって安定化させることを特徴とする、請求項7に記載の三価の二重特異性抗体。
  9. 前記b)とc)のペプチドコネクタが、25〜50アミノ酸の長さを有する同一のペプチドであることを特徴とする、請求項6に記載の三価の二重特異性抗体。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9975966B2 (en) 2014-09-26 2018-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing theraputic agent

Families Citing this family (117)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
TW201900878A (zh) 2009-03-19 2019-01-01 日商中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
RU2598248C2 (ru) 2009-04-02 2016-09-20 Роше Гликарт Аг Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab
KR101456326B1 (ko) 2009-04-07 2014-11-12 로슈 글리카트 아게 3가, 이중특이적 항체
RU2011144312A (ru) * 2009-04-07 2013-05-20 Роше Гликарт Аг БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИ-ErbB-3/АНТИ-С-МЕТ АНТИТЕЛА
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) * 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
WO2011028952A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SG179196A1 (en) 2009-09-16 2012-04-27 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
MX2013000667A (es) 2010-07-19 2013-02-27 Hoffmann La Roche Metodo para identificar pacientes con probabilidad incrementada de responder a una terapia anticancer.
KR20130055647A (ko) 2010-07-19 2013-05-28 에프. 호프만-라 로슈 아게 항암요법에 반응할 가능성이 증가된 환자를 확인하는 방법
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
CA2806252C (en) 2010-07-29 2019-05-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
CN103209709A (zh) 2010-08-05 2013-07-17 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗mhc抗体抗病毒性细胞因子融合蛋白
BR112013001847A2 (pt) 2010-08-24 2016-05-31 Hoffmann La Roche anticorpo biespecífico, método de preparação do anticorpo biespecífico, do anticorpo biespecífico trivalente, métodos e composição farmacêutica
KR101862832B1 (ko) * 2010-11-01 2018-05-30 심포젠 에이/에스 Pan―her 항체 조성물
CA2825064A1 (en) * 2011-02-04 2012-08-09 Genentech, Inc. Fc variants and methods for their production
ES2549638T3 (es) 2011-02-28 2015-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteínas de unión a antígeno
CN103429619B (zh) 2011-03-17 2017-07-28 雷蒙特亚特特拉维夫大学有限公司 双特异性和单特异性、不对称抗体和其制备方法
AU2012244816B2 (en) 2011-04-20 2015-12-10 Roche Glycart Ag Method and constructs for the pH dependent passage of the blood-brain-barrier
WO2012171996A1 (en) 2011-06-15 2012-12-20 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-human epo receptor antibodies and methods of use
EP2722343A4 (en) 2011-06-20 2014-12-17 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd ANTI-erbB3 ANTIBODY
US20130011394A1 (en) 2011-06-22 2013-01-10 Hoffmann-La Roche Inc. Complexes comprising mhc class i fusion polypeptides and antigen-specific antibodies and methods of use
LT2748202T (lt) * 2011-08-23 2018-09-25 Roche Glycart Ag Bispecifinės antigeną surišančios molekulės
AR087608A1 (es) * 2011-08-23 2014-04-03 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
WO2013026837A1 (en) * 2011-08-23 2013-02-28 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP2758435A1 (en) 2011-09-23 2014-07-30 Roche Glycart AG Bispecific anti-egfr/anti igf-1r antibodies
CN104040350B (zh) 2011-12-19 2016-05-18 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于检测多特异性结合物的游离结合搭档的方法
AU2012355415B2 (en) * 2011-12-20 2017-07-06 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
US9963511B2 (en) 2011-12-22 2018-05-08 Hoffmann-La Roche Inc. Expression vector organization, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
SG11201403443WA (en) 2011-12-22 2014-07-30 Hoffmann La Roche Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
KR20140107295A (ko) 2011-12-22 2014-09-04 에프. 호프만-라 로슈 아게 진핵 세포용 전장 항체 표시 시스템 및 그것의 용도
CN106443016B (zh) 2012-02-01 2019-08-13 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于检测多特异性结合物的结合搭档的方法
RU2693264C2 (ru) 2012-02-03 2019-07-01 Ф.Хоффман-Ля Рош Аг Молекулы биспецифических антител и т-клетки, трансфецированные антигеном, и их применение в медицине
JP6486686B2 (ja) 2012-02-10 2019-03-20 ジェネンテック, インコーポレイテッド 単鎖抗体及び他のヘテロ多量体
RU2624128C2 (ru) 2012-02-15 2017-06-30 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Аффинная хроматография с применением fc-рецепторов
WO2013150043A1 (en) 2012-04-05 2013-10-10 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies against human tweak and human il17 and uses thereof
MX354862B (es) 2012-06-27 2018-03-23 Hoffmann La Roche Método para la producción de entidades dirigidas altamente selectivas hechas a la medida y biespecíficas que contienen dos entidades de unión diferentes.
HUE029435T2 (en) 2012-07-04 2017-02-28 F Hoffmann-La Roche Ag Anti-theophylline antibodies and methods of use
EP3138580A1 (en) 2012-07-04 2017-03-08 F. Hoffmann-La Roche AG Covalently linked antigen-antibody conjugates
EP2870180A1 (en) 2012-07-04 2015-05-13 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-biotin antibodies and methods of use
ES2627482T3 (es) 2012-07-13 2017-07-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Procedimiento para la detección de una proteína de unión multiespecífica
KR20150052085A (ko) 2012-09-14 2015-05-13 에프. 호프만-라 로슈 아게 2개 이상의 상이한 단위를 포함하는 분자의 제조 및 선별 방법, 및 이의 용도
CN104704004A (zh) 2012-10-08 2015-06-10 罗切格利卡特公司 包含两个Fab片段的无Fc的抗体及使用方法
US9725512B2 (en) 2012-11-08 2017-08-08 Hoffmann-La Roche Inc. HER3 antibodies binding to the beta-hairpin of HER3
WO2014108854A1 (en) 2013-01-09 2014-07-17 Fusimab Ltd. Monospecific anti-hgf and anti-ang2 antibodies and bispecific anti-hgf/anti-ang2 antibodies
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
WO2014110601A1 (en) 2013-01-14 2014-07-17 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014207549B2 (en) 2013-01-15 2018-12-06 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
PE14102015A1 (es) 2013-02-26 2015-09-18 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014227638A1 (en) * 2013-03-15 2015-09-17 Merck Patent Gmbh Tetravalent bispecific antibodies
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
UA118029C2 (uk) 2013-04-29 2018-11-12 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифіковане антитіло, що зв'язується з людським fcrn, й способи його застосування
UA118674C2 (uk) 2013-04-29 2019-02-25 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Антитіло до igf-1r з елімінованою здатністю зв'язуватися з fcrn та його застосування для лікування судинних захворювань очей
WO2014188423A1 (en) 2013-05-21 2014-11-27 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Treatment of mast cell related pathologies
WO2015025054A1 (en) 2013-08-22 2015-02-26 Medizinische Universität Wien Dye-specific antibodies for prestained molecular weight markers and methods producing the same
CN105612182A (zh) * 2013-10-11 2016-05-25 豪夫迈·罗氏有限公司 多特异性结构域交换共有可变轻链抗体
CA2924268A1 (en) 2013-11-21 2015-05-28 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
JP2017502034A (ja) 2013-12-20 2017-01-19 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft ヒト化抗タウ(pS422)抗体及び使用方法
CN106459182A (zh) 2013-12-30 2017-02-22 岸迈生物科技有限公司 串联fab免疫球蛋白及其用途
JP2017505296A (ja) 2014-01-03 2017-02-16 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 共有結合で連結されたヘリカー−抗ヘリカー抗体コンジュゲートおよびその用途
KR20160105880A (ko) 2014-01-03 2016-09-07 에프. 호프만-라 로슈 아게 공유 연결된 폴리펩티드 독소-항체 콘쥬게이트
BR112016013849A2 (pt) 2014-01-03 2017-10-10 Hoffmann La Roche conjugados de anticorpos biespecíficos antihapteno/antirreceptores da barreira hematoencefálica, seus usos, e formulação farmacêutica
JP6557664B2 (ja) 2014-01-06 2019-08-07 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 一価の血液脳関門シャトルモジュール
RU2016133346A3 (ja) 2014-01-15 2018-11-08
EA201691925A1 (ru) 2014-03-28 2017-06-30 Ксенкор, Инк. Биспецифические антитела, которые связываются с cd38 и cd3
JP2017509669A (ja) 2014-04-02 2017-04-06 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 多重特異性抗体の軽鎖誤対合を検出するための方法
US10329556B2 (en) 2014-05-13 2019-06-25 Bioatla, Llc Conditionally active biological proteins
US10392438B2 (en) 2014-05-16 2019-08-27 Pfizer Inc. Bispecific antibodies
AR100978A1 (es) 2014-06-26 2016-11-16 F Hoffmann-La Roche Ag LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
TW201623329A (zh) 2014-06-30 2016-07-01 Affiris Ag 針對骨調素截斷變異體的疫苗及單株抗體暨其用途
EP3166966A1 (en) 2014-07-10 2017-05-17 Affiris AG Substances and methods for the use in prevention and/or treatment in huntington's disease
EP3177643B1 (en) 2014-08-04 2019-05-08 F.Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
EP3176183A1 (en) 2015-12-02 2017-06-07 Yeda Research and Development Co. Ltd Compositions and methods for treating cancer not resistant to a tyrosine kinase inhibitor (tki)
WO2016038610A1 (en) 2014-09-08 2016-03-17 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for treating cancer resistant to a tyrosine kinase inhibitor (tki)
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
EP3223845A2 (en) 2014-11-26 2017-10-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and tumor antigens
EP3227341A1 (en) 2014-12-02 2017-10-11 CeMM - Forschungszentrum für Molekulare Medizin GmbH Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
US20180057607A1 (en) * 2015-04-01 2018-03-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
EP3356821A1 (en) 2015-10-02 2018-08-08 H. Hoffnabb-La Roche Ag Cellular based fret assay for the determination of simultaneous binding
JP2018537951A (ja) 2015-10-02 2018-12-27 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗pd1抗体と使用方法
KR20180069065A (ko) 2015-10-29 2018-06-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-변이체 fc-부위 항체 및 사용 방법
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
CN108699136A (zh) 2015-12-07 2018-10-23 Xencor股份有限公司 结合cd3和psma的异二聚抗体
EP3433281A1 (en) 2016-03-21 2019-01-30 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific and multifunctional molecules and uses thereof
SG11201810777WA (en) 2016-06-17 2018-12-28 Genentech Inc Purification of multispecific antibodies
CA3029328A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
WO2018002358A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Improved adoptive t-cell therapy
EP3515932A1 (en) 2016-09-19 2019-07-31 H. Hoffnabb-La Roche Ag Complement factor based affinity chromatography
EP3519820A1 (en) 2016-09-30 2019-08-07 H. Hoffnabb-La Roche Ag Spr-based dual-binding assay for the functional analysis of multispecific molecules
TW201829463A (zh) 2016-11-18 2018-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗hla-g抗體及其用途
AU2017363309A1 (en) 2016-11-23 2019-07-11 Bioverativ Therapeutics Inc. Mono- and bispecific antibodies binding to coagulation factor IX and coagulation factor X
KR20190082943A (ko) 2016-12-21 2019-07-10 에프. 호프만-라 로슈 아게 항체의 시험관 내 당조작 방법
BR112019010485A2 (pt) 2016-12-21 2019-09-10 Hoffmann La Roche método para a produção de um anticorpo, anticorpo e formulação farmacêutica
CN110100007A (zh) 2016-12-21 2019-08-06 豪夫迈·罗氏有限公司 用于体外糖工程化抗体的酶的再使用
WO2018151820A1 (en) 2017-02-16 2018-08-23 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules comprising a trimeric ligand and uses thereof
CA3055132A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to steap-1
CA3053360A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-lag3 antibodies
WO2018185043A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies specifically binding to pd1 and lag3
WO2018222901A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to myeloproliferative leukemia (mpl) protein and uses thereof
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. Multispecific molecules that bind to bcma and uses thereof
WO2019105916A1 (en) 2017-11-29 2019-06-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Target interference suppressed anti-drug antibody assay
US20190248916A1 (en) 2017-12-21 2019-08-15 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies binding To HLA-A2/WT1
WO2019129677A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-vegf antibodies and methods of use
WO2019149715A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Stabilized immunoglobulin domains
WO2019149716A1 (en) 2018-01-31 2019-08-08 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific antibodies comprising an antigen-binding site binding to lag3
WO2019154890A1 (en) 2018-02-09 2019-08-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to gprc5d
WO2019178364A2 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules and uses thereof
WO2019178362A1 (en) 2018-03-14 2019-09-19 Elstar Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof

Family Cites Families (207)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4150149A (en) 1976-11-29 1979-04-17 Professional Staff Association Of The Los Angeles County Harbor General Hospital Method and means for the early detection and diagnosis of certain types of cancers
US4361544A (en) 1980-03-03 1982-11-30 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies specific to intracellular tumor-associated markers
US4444744A (en) 1980-03-03 1984-04-24 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibodies to cell surface antigens
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US6548640B1 (en) * 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・2・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
EP0462246A4 (en) 1989-11-07 1992-11-25 Bristol-Myers Squibb Company Oligomeric immunoglobulins
WO1992004053A1 (en) 1990-08-31 1992-03-19 Bristol-Myers Sqibb Company Homoconjugated immunoglobulins
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
DE4118120A1 (de) 1991-06-03 1992-12-10 Behringwerke Ag Tetravalente bispezifische rezeptoren, ihre herstellung und verwendung
US6511663B1 (en) 1991-06-11 2003-01-28 Celltech R&D Limited Tri- and tetra-valent monospecific antigen-binding proteins
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
JP3951062B2 (ja) 1991-09-19 2007-08-01 ジェネンテック・インコーポレーテッドGenentech,Inc. 少なくとも遊離のチオールとして存在するシステインを有する抗体フラグメントの大腸菌での発現、2官能性F(ab’)2抗体の産生のための使用
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
CA2129663C (en) 1992-02-06 2005-07-05 James S. Huston Biosynthetic binding protein for cancer marker
GB9221657D0 (en) * 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant bispecific antibodies
ES2309119T3 (es) 1992-10-28 2008-12-16 Genentech, Inc. Utilizacion de antagonistas del factor de crecimiento celular vegf.
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
US6476198B1 (en) 1993-07-13 2002-11-05 The Scripps Research Institute Multispecific and multivalent antigen-binding polypeptide molecules
ES2156587T3 (es) 1993-08-02 2001-07-01 Merck Patent Gmbh Moleculas iniciadoras biespecificas que reconocen antigeno linfocitico cd2 y antigenos tumorales.
WO1995009917A1 (en) 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
US5814464A (en) 1994-10-07 1998-09-29 Regeneron Pharma Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
GB9504344D0 (en) 1995-03-03 1995-04-19 Unilever Plc Antibody fragment production
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
BR9606706A (pt) 1995-10-16 1999-04-06 Unilever Nv Análogo de fragmento de anticorpo biespecífico ou bivalente uso processo para produzir o mesmo
US6750334B1 (en) 1996-02-02 2004-06-15 Repligen Corporation CTLA4-immunoglobulin fusion proteins having modified effector functions and uses therefor
EP0894135B1 (en) * 1996-04-04 2004-08-11 Unilever N.V. Multivalent and multispecific antigen-binding protein
EP0971959B1 (en) 1997-04-07 2005-12-28 Genentech, Inc. Humanized antibodies and methods for forming humanized antibodies
DE69829891T2 (de) 1997-04-07 2005-10-06 Genentech, Inc., South San Francisco Anti-VEGF Antikörper
WO1998048032A2 (en) 1997-04-21 1998-10-29 Donlar Corporation POLY-(α-L-ASPARTIC ACID), POLY-(α-L-GLUTAMIC ACID) AND COPOLYMERS OF L-ASP AND L-GLU, METHOD FOR THEIR PRODUCTION AND THEIR USE
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
US6350860B1 (en) 1997-08-18 2002-02-26 Innogenetics N.V. Interferon-gamma-binding molecules for treating septic shock, cachexia, immune diseases and skin disorders
DK1049787T3 (da) 1998-01-23 2005-04-04 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antistofderivater med flere anvendelsesmuligheder
IL138608D0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
DE69942021D1 (de) 1998-04-20 2010-04-01 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
DE69942148D1 (de) * 1998-06-22 2010-04-29 Immunomedics Inc Gebrauch von bispezifischen antikörpern in diagnose und therapie
US7138103B2 (en) * 1998-06-22 2006-11-21 Immunomedics, Inc. Use of bi-specific antibodies for pre-targeting diagnosis and therapy
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
AU1687500A (en) 1998-12-16 2000-07-03 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Antihuman vegf monoclonal antibody
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6897044B1 (en) 1999-01-28 2005-05-24 Biogen Idec, Inc. Production of tetravalent antibodies
CN1232039A (zh) 1999-04-02 1999-10-20 中国人民解放军海军总医院 一种基因工程双特异抗体及其应用
EP2270148A3 (en) 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
WO2001025454A2 (en) 1999-10-04 2001-04-12 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes in the presence of nitrogen
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
US7449443B2 (en) 2000-03-23 2008-11-11 California Institute Of Technology Method for stabilization of proteins using non-natural amino acids
JP2004500108A (ja) 2000-03-24 2004-01-08 マイクロメット アーゲー Nkg2dレセプター複合体のエピトープへの結合部位を含む多機能ポリペプチド
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
DE10021678A1 (de) 2000-05-05 2002-04-18 Stefan Duebel Antikörperkonstrukte mit variablen Regionen
AU6494601A (en) 2000-05-24 2001-12-03 Imclone Systems Inc Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
EP1294904A1 (en) 2000-06-30 2003-03-26 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Heterodimeric fusion proteins
US20030035798A1 (en) * 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
RU2295537C2 (ru) 2000-10-20 2007-03-20 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Модифицированное агонистическое антитело
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
EP1517921B1 (en) 2002-06-28 2006-06-07 Domantis Limited Dual specific ligands with increased serum half-life
WO2003033648A2 (en) 2001-09-05 2003-04-24 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Imaging the activity of extracellular proteases in cells using mutant anthrax toxin protective antigens that are cleaved by specific extracellular proteases
EP1293514B1 (en) 2001-09-14 2006-11-29 Affimed Therapeutics AG Multimeric single chain tandem Fv-antibodies
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7521053B2 (en) 2001-10-11 2009-04-21 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
EP1450857B1 (en) 2001-10-16 2010-09-15 The Government of the United States of America, represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Broadly cross-reactive neutralizing antibodies against human immunodeficiency virus selected by env-cd4-co-receptor complexes
US7053202B2 (en) 2001-10-19 2006-05-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin DNA cassette molecules, monobody constructs, methods of production, and methods of use therefor
AU2002337935B2 (en) 2001-10-25 2008-05-01 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
EP1490677A4 (en) 2002-02-27 2006-01-18 California Inst Of Techn Computational method for designing enzymes for incorporation of amino acid analogs into proteins
WO2003074569A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7332585B2 (en) 2002-04-05 2008-02-19 The Regents Of The California University Bispecific single chain Fv antibody molecules and methods of use thereof
WO2003093318A1 (en) 2002-04-29 2003-11-13 Genpat77 Pharmacogenetics Ag Novel antibody binding tcr and tirc7 and its use in therapy and diagnosis
US6658672B2 (en) 2002-05-06 2003-12-09 Elvis Hsieh Hinge of toilet bowl seat and toilet bowl cover
US7081443B2 (en) 2002-05-21 2006-07-25 Korea Advanced Institutes Of Science And Technology (Kaist) Chimeric comp-ang1 molecule
SE0201863D0 (en) 2002-06-18 2002-06-18 Cepep Ab Cell penetrating peptides
HUE025086T2 (en) * 2002-10-10 2016-02-29 Merck Patent Gmbh Pharmaceutical compositions directed to erb-b1 receptors
US7534427B2 (en) 2002-12-31 2009-05-19 Immunomedics, Inc. Immunotherapy of B cell malignancies and autoimmune diseases using unconjugated antibodies and conjugated antibodies and antibody combinations and fusion proteins
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス,インコーポレーテッド 変異型Fc領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
PL222206B1 (pl) 2003-01-22 2016-07-29 Glycart Biotechnology Ag Komórka gospodarza i sposób wytwarzania polipeptydu w komórce gospodarza
BRPI0407446A (pt) * 2003-02-13 2006-01-31 Pharmacia Corp Anticorpos para c-met para o tratamento de cânceres
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
TWI353991B (en) * 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
CN101274098A (zh) 2003-05-30 2008-10-01 健泰科生物技术公司 利用抗-vegf抗体的治疗
CA2527694C (en) 2003-05-30 2015-07-14 Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom Fab library for the preparation of anti vegf and anti rabies virus fabs
CA2530388A1 (en) 2003-06-27 2005-01-06 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
AU2004255216B2 (en) 2003-07-01 2010-08-19 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
AR046071A1 (es) 2003-07-10 2005-11-23 Hoffmann La Roche Anticuerpos contra el receptor i del factor de crecimiento de tipo insulinico y los usos de los mismos
EP1648511A1 (en) 2003-07-29 2006-04-26 Morphotek, Inc. Antibodies and methods for generating genetically altered antibodies with enhanced effector function
US20050106667A1 (en) 2003-08-01 2005-05-19 Genentech, Inc Binding polypeptides with restricted diversity sequences
WO2005044853A2 (en) 2003-11-01 2005-05-19 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
NZ545776A (en) 2003-08-22 2009-05-31 Biogen Idec Inc Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
US20050152894A1 (en) 2003-09-05 2005-07-14 Genentech, Inc. Antibodies with altered effector functions
US20050064509A1 (en) 2003-09-23 2005-03-24 The Regents Of The University Of California Use of templated self assembly to create novel multifunctional species
CN1326881C (zh) 2003-09-29 2007-07-18 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 一种三价双特异性抗体,其制备方法及用途
JP4890253B2 (ja) 2003-10-09 2012-03-07 アンブレツクス・インコーポレイテツド アジドまたはアセチレン末端水溶性ポリマー
PL2077282T3 (pl) 2003-11-05 2017-08-31 Roche Glycart Ag Cząsteczki wiążące antygen o zwiększonym powinowactwie wiązania z receptorem Fc oraz zwiększonej funkcji efektorowej
WO2005051976A2 (en) 2003-11-20 2005-06-09 Ansata Therapeutics, Inc. Protein and peptide ligation processes and one-step purification processes
DK1718677T3 (da) 2003-12-19 2012-07-09 Genentech Inc Monovalente antistoffragmenter egnede som terapeutiske midler
KR20060130181A (ko) 2004-02-02 2006-12-18 암브룩스, 인코포레이티드 변형된 인간 성장 호르몬 폴리펩티드 및 이의 용도
WO2005075514A2 (en) 2004-03-10 2005-08-18 Lonza Ltd. Method for producing antibodies
EP1786918A4 (en) 2004-07-17 2009-02-11 Imclone Systems Inc Novel tetravalent bispecific antibody
BRPI0515230A (pt) 2004-08-19 2008-07-15 Genentech Inc polipeptìdeos, anticorpos e ácidos nucléicos isolados, composições, vetor de expressão, células hospedeiras isoladas, método para a produção de um anticorpo, artigos manufaturados, métodos de tratamento e para o alìvio de disfunções, métodos de produção e de seleção de um polipeptìdeo, anticorpo de ligação cd20 humanizado, anticorpo anti-her2 isolado e usos de um anticorpo
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
AU2005335714B2 (en) 2004-11-10 2012-07-26 Macrogenics, Inc. Engineering Fc antibody regions to confer effector function
NZ556029A (en) 2004-12-21 2010-04-30 Astrazeneca Ab Antibodies directed to angiopoietin-2 and uses thereof
BRPI0607315A2 (pt) 2005-02-07 2009-09-01 Glycart Biotechnology Ag polinucleotìdeo isolado, vetor de expressão, composição, método de produzir uma molécula de ligação de antìgeno, molécula de ligação de antìgeno e o uso da mesma-, método para detectar in vivo ou in vitro a presença de egfr em uma amostra, célula hospedeira engendrada, composição farmacêutica e o uso da mesma
BRPI0519897A2 (pt) * 2005-02-23 2009-08-18 Merrimack Pharmaceuticals Inc método para modular a atividade ou atividades biológicas de moléculas alvo em uma célula alvo, agente de ligação biespecìfico, composição, uso de um agente de ligação biespecìfico, e, kit
JP2008531049A (ja) 2005-02-28 2008-08-14 セントカー・インコーポレーテツド ヘテロ二量体タンパク質結合組成物
JP5620626B2 (ja) 2005-03-31 2014-11-05 中外製薬株式会社 会合制御によるポリペプチド製造方法
TW200720289A (en) 2005-04-01 2007-06-01 Hoffmann La Roche Antibodies against CCR5 and uses thereof
US9963510B2 (en) * 2005-04-15 2018-05-08 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
AU2006236439B2 (en) 2005-04-15 2012-05-03 Macrogenics, Inc. Covalent diabodies and uses thereof
AU2006239851B2 (en) 2005-04-26 2011-06-16 Medimmune, Llc Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
CA2605697A1 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Bioren, Inc. Method of producing human igg antibodies with enhanced effector functions
EP1917232B1 (de) 2005-08-02 2011-09-14 Basf Se Verfahren zur herstellung von xylylendiamin durch kontinuierliche hydrierung von phthalodinitril
US8008453B2 (en) * 2005-08-12 2011-08-30 Amgen Inc. Modified Fc molecules
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
TWI323734B (en) 2005-08-19 2010-04-21 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1931712B1 (en) 2005-08-26 2018-12-05 Roche Glycart AG Modified antigen binding molecules with altered cell signaling activity
WO2007044887A2 (en) 2005-10-11 2007-04-19 Transtarget, Inc. Method for producing a population of homogenous tetravalent bispecific antibodies
US7666622B2 (en) * 2005-10-19 2010-02-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Monomeric self-associating fusion polypeptides and therapeutic uses thereof
TW200732350A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
FR2894959B1 (fr) 2005-12-15 2008-02-29 Galderma Res & Dev Derives biphenyliques agonistes selectifs du recepteur rar-gamma
TW200730191A (en) 2005-12-15 2007-08-16 Astrazeneca Ab Combinations
GB0601513D0 (en) 2006-01-25 2006-03-08 Univ Erasmus Medical Ct Binding molecules 3
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
EP1986684A2 (en) 2006-02-15 2008-11-05 ImClone Systems Incorporated Functional antibodies
JP5374359B2 (ja) 2006-03-17 2013-12-25 バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド 安定化されたポリペプチド化合物
EP1996236A2 (en) 2006-03-22 2008-12-03 National Institute of Immunology Novel bioconjugates as therapeutic agent and synthesis thereof
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
US20070274985A1 (en) 2006-05-26 2007-11-29 Stefan Dubel Antibody
WO2008005828A2 (en) 2006-06-30 2008-01-10 Novo Nordisk A/S PHARMACEUTICALLY ACCEPTABLE COMPOSITIONS COMPRISING ANTIBODY MOLECULES SPECIFIC TO LAMININ-5 α3 CHAIN DOMAINS G1G2 AND USE THEREOF
AR062223A1 (es) 2006-08-09 2008-10-22 Glycart Biotechnology Ag Moleculas de adhesion al antigeno que se adhieren a egfr, vectores que los codifican, y sus usos de estas
CN101205255A (zh) 2006-12-14 2008-06-25 上海中信国健药业有限公司;上海国健生物技术研究院 抗cd20四价抗体、其制备方法和应用
AU2007333735A1 (en) 2006-12-19 2008-06-26 Genentech, Inc. VEGF-specific antagonists for adjuvant and neoadjuvant therapy and the treatment of early stage tumors
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008100624A2 (en) * 2007-02-16 2008-08-21 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Antibodies against erbb3 and uses thereof
US10259860B2 (en) 2007-02-27 2019-04-16 Aprogen Inc. Fusion proteins binding to VEGF and angiopoietin
EP2626371A1 (en) * 2007-07-31 2013-08-14 MedImmune, LLC Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
WO2009023843A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Isp Investments Inc. Polyvinylamide polymers containing polymerizable functionalities
ES2628395T3 (es) 2007-08-15 2017-08-02 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Anticuerpo regulado por proteasa
DE102007038753A1 (de) 2007-08-16 2009-02-19 Giesecke & Devrient Gmbh Vorrichtung und Verfahren für die Kalibrierung eines Sensorsystems
CN101842116A (zh) 2007-08-28 2010-09-22 比奥根艾迪克Ma公司 结合igf-1r多个表位的组合物
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
JP2009181819A (ja) 2008-01-31 2009-08-13 Hitachi High-Technologies Corp 荷電粒子線装置
JP4438875B2 (ja) 2008-02-27 2010-03-24 三菱自動車工業株式会社 車両の貯蔵燃料量推定装置
NZ621443A (en) 2008-04-11 2015-09-25 Emergent Product Dev Seattle Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
CN102164960A (zh) 2008-09-26 2011-08-24 罗氏格黎卡特股份公司 双特异性抗-egfr/抗-igf-1r抗体
HUE033438T2 (en) 2008-09-26 2017-11-28 Ucb Biopharma Sprl Biological products
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
CA2739429A1 (en) 2008-10-14 2010-04-22 Lisa A. Damico Immunoglobulin variants and uses thereof
AU2009322236B2 (en) 2008-12-04 2013-11-07 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2391714B2 (en) 2009-01-30 2019-07-24 Whitehead Institute for Biomedical Research Methods for ligation and uses thereof
WO2010112194A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen-binding polypeptides and multispecific antibodies comprising them
RU2598248C2 (ru) 2009-04-02 2016-09-20 Роше Гликарт Аг Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab
KR101456326B1 (ko) 2009-04-07 2014-11-12 로슈 글리카트 아게 3가, 이중특이적 항체
BRPI1014449A2 (pt) 2009-04-07 2017-06-27 Roche Glycart Ag anticorpos biespecíficos anti-erbb-2/ anti-c-met.
DE102009016373A1 (de) 2009-04-07 2010-10-21 V. KRÜTTEN MEDIZINISCHE EINMALGERÄTE GmbH Verbindungsstück für den Sondenschlauch einer enteralen Ernährungssonde und Anordnung aus einer enteralen Ernährungssonde und einem enteralen Überleitsystem
RU2011144312A (ru) 2009-04-07 2013-05-20 Роше Гликарт Аг БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИ-ErbB-3/АНТИ-С-МЕТ АНТИТЕЛА
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
BRPI1007602A2 (pt) 2009-05-27 2016-02-16 Hoffmann La Roche "anticorpo tri ou tetraespecífico, método para preparação de um anticorpo triespecífico ou tetraespecífico, célula hospedeira, composição, composição farmacêutica e método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia"
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
WO2011003780A1 (en) 2009-07-06 2011-01-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Bi-specific digoxigenin binding antibodies
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SG179196A1 (en) 2009-09-16 2012-04-27 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
SI2483310T1 (sl) 2009-09-29 2014-12-31 Roche Glycart Ag Bispecifiäśna agonistiäśna protitelesa receptorja smrti
EA201492253A1 (ru) 2009-12-29 2015-06-30 Эмерджент Продакт Дивелопмент Сиэтл, Ллс Конструкторы, связывающиеся с ron, и способы их использования
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
WO2012025525A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Roche Glycart Ag Activatable bispecific antibodies
BR112013001847A2 (pt) 2010-08-24 2016-05-31 Hoffmann La Roche anticorpo biespecífico, método de preparação do anticorpo biespecífico, do anticorpo biespecífico trivalente, métodos e composição farmacêutica
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
KR101572338B1 (ko) 2011-02-28 2015-11-26 에프. 호프만-라 로슈 아게 1가 항원 결합 단백질
ES2549638T3 (es) 2011-02-28 2015-10-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Proteínas de unión a antígeno
US10081684B2 (en) 2011-06-28 2018-09-25 Whitehead Institute For Biomedical Research Using sortases to install click chemistry handles for protein ligation
AR087608A1 (es) 2011-08-23 2014-04-03 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
KR101723273B1 (ko) 2011-08-23 2017-04-04 로슈 글리카트 아게 2 개의 fab 단편을 포함하는 fc-부재 항체 및 이용 방법
LT2748202T (lt) 2011-08-23 2018-09-25 Roche Glycart Ag Bispecifinės antigeną surišančios molekulės
AU2012355415B2 (en) 2011-12-20 2017-07-06 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
JP2015500655A (ja) 2011-12-21 2015-01-08 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 同起源の抗体可変領域遺伝子セグメントをクローニングおよび発現させるための迅速な方法
JP6272299B2 (ja) 2012-04-20 2018-01-31 メルス ナムローゼ フェンノートシャップ Ig様分子を生産する方法、Ig様分子の混合物、組み換え宿主細胞、医薬組成物、宿主細胞を作成する方法、および培養物
CA2869529A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Raffaella CASTOLDI Multispecific antibodies
BR112014028368A2 (pt) 2012-06-27 2017-11-14 Hoffmann La Roche método de produção de conjugado de região fc de anticorpo, conjugado de região fc de anticorpo e formulação farmacêutica
CN104395340B9 (zh) 2012-06-27 2018-11-30 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含至少两个不同靶向实体的定制选择性和多特异性治疗分子的方法及其用途
EP2872170A4 (en) 2012-07-13 2016-06-22 Zymeworks Inc Bispecific asymmetric heterodimers comprising anti-cd3 constructs
KR20150052085A (ko) 2012-09-14 2015-05-13 에프. 호프만-라 로슈 아게 2개 이상의 상이한 단위를 포함하는 분자의 제조 및 선별 방법, 및 이의 용도
EP3401337A1 (en) 2012-09-25 2018-11-14 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Purification of hetero-dimeric immunoglobulins
AU2014227638A1 (en) 2013-03-15 2015-09-17 Merck Patent Gmbh Tetravalent bispecific antibodies
BR112015025306A2 (pt) 2013-04-03 2017-10-10 Roche Glycart Ag anticorpo biespecífico, anticorpos, composição farmacêutica, uso do anticorpo biespecífico, sequência de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira procariótica ou eucariótica e método de produção de um anticorpo
AU2015330087A1 (en) 2014-10-08 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of bispecific antibodies specific for FAP and DR5 and chemotherapeutic agents
JP2018502835A (ja) 2014-12-03 2018-02-01 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 多重特異性抗体

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9975966B2 (en) 2014-09-26 2018-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing theraputic agent

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