KR20190025057A - 이뮤노글로불린 변이체 및 그의 용도 - Google Patents

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헨리 비. 로우만
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Abstract

Fc 영역에서 1개 이상의 아미노산 변형을 갖고 생체내 반감기가 증가된 변이체 이뮤노글로불린 및 이것의 사용 방법이 제공된다.

Description

이뮤노글로불린 변이체 및 그의 용도 {IMMUNOGLOBULIN VARIANTS AND USES THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2008년 10월 14일자로 출원된 가출원 번호 61/105,086, 2009년 2월 12일자로 출원된 가출원 번호 61/152,131, 2009년 4월 22일자로 출원된 가출원 번호 61/171,768, 및 2009년 6월 25일자로 출원된 가출원 번호 61/220,514 (이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함됨)를 35 USC 119(e)하에 우선권 주장하면서 37 CFR 1.53(b)(1)하에 출원된 정식 출원이다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 변경된 생물학적 특성을 갖는 IgG 이뮤노글로불린 변이체 및 이것을 사용한 방법에 관한 것이다.
수년에 걸쳐 치료제로서의 이뮤노글로불린의 사용은 크게 증가했다. 면역계의 중요 부분을 이루는 이뮤노글로불린 (Ig) 분자는 (1) 이것들이 다양한 부류의 리간드와 반응하고, (2) 이것들이 여러가지 이펙터 기능을 보유하며, (3) 이것들이 생물학적으로 매우 중요하기 때문에 높은 관심을 받고 있다. 오늘날, 항체 기재의 약물의 용도는 암, 자가면역 질환 및 또한 다양한 전신 및 감염성 질환의 치료를 포함한다. 또한, 이뮤노글로불린은 예를 들어 진단 영상화 절차에서의 생체내 진단 도구로서 유용하다.
IgG는 인간 및 다른 포유동물에서 가장 일반적인 이뮤노글로불린 클래스이고, 다양한 유형의 면역요법 및 진단 절차에 사용된다. 인간 IgG1은 치료 목적을 위해서 가장 흔히 사용되는 항체이다. 현재, 임상 시험 중인 많은 항체들이 종양 관련 항원에 대한 것이다. 특히, 항-VEGF 중화 항체는 누드 마우스에서 다양한 인간 종양 세포주의 성장을 저해 ([Kim et al., Nature 362:841-844 (1993)], [Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995)], [Borgstroem et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)] 및 [Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-924 (1996)])하고 또한 허혈성 망막 장애 모델에서 안내 혈관신생(angiogenesis)을 억제 ([Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)])하는 것으로 나타났다. 실제로, 인간화 항-VEGF 항체인 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)®, 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재의 제넨테크(Genentech))은 혈관신생 억제를 위해 디자인된, 최초로 미국 FDA의 승인을 받은 요법제이다.
이뮤노글로불린 면역요법의 잠재력에도 불구하고, 이것과 관련된 문제점 중 하나는 이뮤노글로불린이 순환계 내에 지속된다는 것이었다. 이뮤노글로불린 청소율은 이뮤노글로불린의 양 및 투여 빈도에 직접 영향을 미친다. 투여량 및 투여 빈도의 증가는 환자에게 유해한 효과를 야기할 수도 있고, 또한 의료 비용을 증가시킬 수도 있다.
순환계 내 IgG 이화작용의 메카니즘은 설치류에서 태반 또는 난황낭을 통해 또는 초유를 통해 (트랜스시토시스(transcytosis)를 통한 IgG의 모체태아 전달) 모체로부터 태아/신생아로 수동 면역성이 전달되는 것에 관한 연구를 통해 해명되었다 ([Brambell, Lancet, ii:1087-1093, 1966], [Rodewald, J. Cell Biol., 71:666-670, 1976], [Morris et al., In: Antigen Absorption by the Gut,pp. 3-22, 1978, University Park Press, Baltimore], [Jones et al., J. Clin. Invest., 51:2916-2927, 1972]). 신생아 Fc 수용체 (FcRn)는 포유동물에서 트랜스시토시스 및 IgG의 항상성에서 중요한 역할을 수행한다. FcRn은 주조직적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 분자와 구조적으로 상동성이고, 막횡단 α 쇄 및 β2-마이크로글로불린 (β2m)으로 이루어진다. 넉아웃(knockout) 마우스에서 수행된 기존 연구에서는 FcRn- 또는 β2m-결핍 마우스에서 IgG의 혈청 반감기가 크게 감소되는 것으로 나타났고 ([Roopenian et al., J Immunol 170(7), 3528-3533, 2003], [Israel et al., Immunology 89(4), 573-578, 1996]), 이것은 순환하는 IgG의 수준 조절에 있어서 FcRn의 보호 역할을 입증한다. 마우스 IgG의 Fc 영역에서의 다양한 부위 특이적 돌연변이유발 실험으로, IgG와 FcRn 사이의 상호작용에 관여하는 특정 중요 아미노산 잔기가 확인되었다 ([Kim et al., Eur.J. Immunol., 24:2429-2434, 1994], [Medesan et al., Eur.J. Immunol., 26:2533, 1996], [Medesan et al., J. Immunol., 158:2211-2217, 1997]). 추가로, 여러 간행물이 IgG의 FcRn-결합 영역을 도입하거나 변형시켜서 반감기가 변형된 생리적 활성 분자를 수득하는 방법을 기재한다 (WO 97/43316, 미국 특허 번호 5,869,046, 미국 특허 번호 5,747,035, WO 96/32478, WO 2006053301, 미국 특허 번호 7,083,784, 미국 특허 번호 7,371,826).
분자 수준에서, FcRn은 CH2-CH3 도메인 영역에서 IgG의 Fc 부분에 결합한다. Fc-FcRn 상호작용은 pH에 고도로 의존적이고, IgG는 pH 6에서 FcRn에 높은 친화도로 결합하지만 pH가 7.4로 높아지면 결합 친화도가 상당히 떨어진다. 이러한 pH 의존적 상호작용은 IgG가 분해되지 않도록 보호하는 것을 담당한다. 구체적으로, 세포 흡수된 IgG는 산성 엔도솜에서 FcRn에 의해 포획되고, 세포 표면으로 다시 재순환된 후에 생리적 혈청 pH 7.4에서 순환계로 다시 방출된다 ([Ober et al., Proc Natl Acad Sci U S A 101(30), 11076-11081, 2004], [Ober et al., J Immunol 172(4), 2021-2029, 2004], [Prabhat et al., Proc Natl Acad Sci U S A 104(14), 5889-5894, 2007]). FcRn과 결합되지 않은 IgG는 리소좀으로 표적화되어 분해된다. FcRn은 IgG 항상성 조절에 중요하기 때문에, 단백질 조작을 통해 Fc와 FcRn 사이의 상호작용을 조정하는 것은 치료용 항체의 약력학을 개선시키는 한가지 방법이다 ([Shields et al., J Biol Chem 276(9), 6591-6604, 2001], [Dall'Acqua et al., Nat Biotechnol 15(7), 637-640, 1997], [Dall'Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002], [Hinton et al., J Biol Chem 279(8), 6213-6216, 2004], [Hinton et al., J Immunol 176(1), 346-356, 2006], [Datta-Mannan et al., Drug Metab Dispos 35(1), 86-94, 2007], [Datta-Mannan et al., J Biol Chem 282(3), 1709-1717, 2007). 마우스, 붉은털 및 시노몰구스 원숭이에서 수행된 수많은 연구는, IgG의 pH-6 결합 친화도 증가가 반감기를 연장시킬 수 있음을 입증하였다 ([Dall'Acqua et al., Nat Biotechnol 15(7), 637-640, 1997], [Dall'Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002], [Hinton et al., J Biol Chem 279(8), 6213-6216, 2004], [Hinton et al., J Immunol 176(1), 346-356, 2006]). 추가로, 다른 연구는 또한 pH 7.4에서의 FcRn 결합 친화도가 IgG 약력학의 추가의 결정자임을 입증하였다. 구체적으로, 마우스 FcRn에 대한 pH-7.4 결합 친화도가 증가된 특정 변이체는 마우스에서 증가된 청소율 (즉, 반감기가 감소됨)을 나타냈다 ([Dall'Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002]). 그럼에도 불구하고, 모든 기존의 연구가 제한된 범위의 FcRn 친화도 내에서 적은 수의 변이체를 사용하였기 때문에 FcRn 친화도와 반감기 사이의 상세한 관계는 해명되지 못했다. Fc:FcRn 상호작용을 조작하여 달성될 수 있는 최대 반감기 연장은 불명확하다.
약물 처치를 따르는 것 (약물 처치에 대한 순응)이 중요하다는 사실에도 불구하고, 의약이 처방된 사람들 중 절반은 이것을 권장된 방식으로 복용하지 않는 것으로 추정된다. 예를 들어, 최근의 연구는 지난 10년 동안 개발된 유방암 약물을 복용하는 여성 중 무려 1/3이 이것들의 권장되는 5년 과정을 완료하지 않았음을 보여주었다. 불량한 순응성에 대한 원인 중 일부는 건망, 순응에 대한 신체적 어려움 (예를 들어, 여행을 가거나 처치 장소로부터 멀리 떨어진 곳으로 이동함), 불편함, 유해 부작용, 복잡한 투약법 및 약물의 비용을 포함한다. 약물 처치를 제대로 따르지 않는 것은 그 의약이 환자에게 제공할 수 있는 완전한 건강상의 이점을 제대로 달성할 수 없게 할 수 있다. 예를 들어, 권장되는 암 치료 과정을 완료하지 않게 되면, 상기 질환이 재발되고 생존 기회가 감소될 수 있다.
약물 순응성을 개선시키는 전략은 환자가 권장되는 처치 과정을 완료하는 것을 보다 편리하게 하는 것을 포함한다. 면역요법 처치를 받고 있는 환자의 경우에 이것을 달성할 수 있는 방법 중 하나는, 이뮤노글로불린이 순환계 내 존재하는 기간을 증가시키는 것이다. 이뮤노글로불린 청소율은 이뮤노글로불린의 양 및 투여 빈도에 직접 영향을 미친다. 따라서, 생체내 반감기를 증가시킨 이뮤노글로불린의 개발은 양 및/또는 투여 빈도를 감소시킬 수 있어서 불편함 및 또한 임의의 추가의 의료 비용을 최소로 할 수 있다.
따라서, 치료 목적을 위해서는 생체내 반감기가 증가된 변형된 이뮤노글로불린을 확보하는 것이 매우 유리할 것이다. 본 발명은 하기하는 개시내용을 검토할 때 명백할 바와 같이, 이러한 필요성 및 기타 필요성에 관한 것이다.
도 1 패널 A-B: pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 항-VEGF 야생형 (WT) 및 항-VEGF 변이체의 결합. 칩에 커플링된 상이한 수준의 FcRn을 사용하여 2회의 별개의 실험 운행을 수행하였다. 각 운행마다, 항정 상태 반응 단위를 변이체 농도의 함수로서 플롯팅하여 해리 상수를 추정하였다.
도 2: pH 6.0에서 인간 FcRn에 대한 항-VEGF 야생형 (WT) 및 항-VEGF 변이체의 해리 상수. KD는 도 1에 나타낸 2회의 상이한 운행으로부터 추정되었다.
도 3: pH 7.4에서 인간 FcRn에 대한 항-VEGF 야생형 (WT) 및 항-VEGF 변이체의 결합. 항정 상태 반응 단위를 항-VEGF 변이체 농도의 함수로서 플롯팅하였다.
도 4 패널 A-D: (A) pH 6.0에서 인간 FcRn, (B) pH 7.4에서 인간 FcRn, (C) pH 6.0에서 시노 FcRn, 및 (D) pH 7.4에서 시노 FcRn에 대한 항-VEGF 야생형 및 항-VEGF 변이체의 결합.
도 5: pH 6.0 및 25℃에서 인간 FcRn에 대한 다양한 항-VEGF 변이체의 역학 파라미터 및 1가 해리 상수 (KD). 결과는 3회의 독립적 실험의 대표값이다.
도 6: pH 6.0 및 25℃에서 시노 FcRn에 대한 다양한 항-VEGF 변이체의 역학 파라미터 및 1가 해리 상수 (KD). 결과는 3회의 독립적 실험의 대표값이다.
도 7 패널 A-B: 상이한 pH에서 상이한 항-VEGF 변이체에 대한 (A) 인간 FcRn 및 (B) 시노 FcRn의 해리 속도 (koff).
도 8: 항-VEGF 야생형과 비교한 항-VEGF 변이체의 인간 FcRn 친화도 개선에 대한 요약. 데이타는 도 4 및 도 5에 대한 요약이다.
도 9 패널 A-B: (1) 항-VEGF 야생형 및 항-VEGF 변이체, (2) N434H, (3) T307Q/N434A, (4) T307Q/N434S, (5) T307Q/E380A/N434S 및 (6) V308P/N434A의 VEGF 결합. (A) 37℃에서 BIAcore® 3000을 사용하여 VEGF-A109 코팅된 센서 칩에 항-VEGF 야생형 및 항-VEGF 변이체를 주입하여 측정한, 항체의 VEGF 결합. (B) 50 nM 및 100 nM 주입에 대한 센서그램. 각 센서그램 기준선은 더 잘 보이게 하기 위해 4 RU만큼 오프셋하였다.
도 10: 아바스틴®, 항-VEGF 야생형 (베바시주맙) 및 항-VEGF 변이체의 시험관내 HUVEC 증식 억제. 인간 제대 혈관 내피 세포 (HUVEC)를 VEGF 및 다양한 농도의 항-VEGF 항체의 존재하에 배양하였다. 배양 4일 후의 생존율을 평가하였다.
도 11: 시노몰구스 원숭이에서 항-VEGF 야생형 및 5종의 항-VEGF 변이체의 5 mg/kg의 단일 IV 투여 후 약력학 프로파일. 항체의 혈청 농도는 ELISA로 측정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다 (n = 12마리 동물/군 - 11마리 동물을 사용한 V308P/N434A 군은 제외).
도 12: 시노몰구스 원숭이에서 항-VEGF 야생형 및 5종의 항-VEGF 변이체의 5 mg/kg의 단일 IV 투여 후 약력학 파라미터.
도 13: 항-VEGF 야생형 및 5종의 항-VEGF 변이체에 대한 시노몰구스 원숭이에서의 말단 반감기 및 pH 6.0 FcRn 친화도 사이의 관계를 보여주는 그래프. 오차 막대는 군 1개 당 11마리 또는 12마리 동물의 표준 편차를 나타낸다.
도 14 패널 A-B: 인간화 VEGF 트랜스제닉 마우스에서 항-VEGF 야생형 및 항-VEGF 변이체 T307Q/N434A의 0.3 또는 5 mg/kg의 단일 IV 투여 후 약력학 프로파일. 항체의 혈청 농도는 (A) VEGF 포획 ELISA 또는 (B) 인간 Fc 포획 ELISA를 이용하여 측정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다.
도 15: 인간화 VEGF 트랜스제닉 마우스에서 항-VEGF 야생형 및 항-VEGF 변이체 T307Q/N434A의 0.3 또는 5 mg/kg의 단일 정맥내 투여 후 약력학 파라미터.
도 16 패널 A-B: 인간화 VEGF 트랜스제닉 마우스에서 항-VEGF 변이체 T307Q/N434A의 0.3 또는 5 mg/kg의 다중 투여 후 약력학 프로파일. 항체는 제0일, 제3일, 제6일 및 제9일에 투여하였다. 항체의 혈청 농도는 (A) VEGF 포획 ELISA 또는 (B) 인간 Fc 포획 ELISA를 이용하여 측정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다.
도 17: 인간화 VEGF 트랜스제닉 마우스에게 T307Q/N434A를 제0일, 제3일, 제6일 및 제9일에 0.3 또는 5 mg/kg씩 4회 정맥내 투여한 후의 약력학 파라미터.
도 18 패널 A 내지 C: RAG2 KO; hum-XVEGF KI 이중-동형접합 마우스에게 s.c. 이식된 HM-7 이종이식편의 치료에 있어서 항-VEGF 야생형 및 T307Q/N434A (QA) 변이체의 효능. 5 mg/kg 및 0.5 mg/kg의 야생형 및 T307Q/N434A 변이체 및 5 mg/kg의 항-두드러기쑥 대조군을 매주 2회씩 복강내 투여하였다. (A) HM-7 종양의 성장 곡선. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (B) 0.5 및 0.05 mg/kg 처치군에서의 HM-7 종양의 성장 곡선. (C) 처치 종료시 (항-두드러기쑥의 경우에는 제18일, 항-VEGF 처치군의 경우에는 제21일)의 혈청 항-VEGF 항체 농도. 농도는 VEGF 포획 ELISA로 측정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다.
도 19 패널 A-E: RAG2 KO; hum-XVEGF KI 이중-동형접합 마우스에 s.c. 이식된 HM-7 이종이식편의 치료에 있어서 항-VEGF 야생형 및 T307Q/N434A (QA) 변이체의 반복된 효능 연구. 5, 0.5 및 0.05 mg/kg의 야생형 및 T307Q/N434A 변이체 및 5 mg/kg의 항-두드러기쑥 대조군을 1주 당 2회씩 복강내 투여하였다. (A) HM-7 종양의 성장 곡선. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (B) 0.5 및 0.05 mg/kg 처치군에서의 HM-7 종양의 성장 곡선. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (C) 처치 종료시 (항-두드러기쑥의 경우에는 제16일, 0.05 mg/kg 군의 경우에는 제19일, 나머지 군의 경우에는 제22일)에 측정한 HM-7 종양의 최종 중량. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (D) 처치 종료시의 혈청 항-VEGF 항체 농도. 농도는 인간 Fc 포획 ELISA로 측정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다. (E) 혈액 중 항체 농도에 대한 종양 중 항체 농도의 비율. 종양 항체 농도는 종양 용해물의 총량 및 종양 용해물 중 항-VEGF 항체의 양을 측정하여 결정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다.
도 20 패널 A-D: RAG2 KO; hum-XVEGF KI 이중-동형접합 마우스에 s.c. 이식된 HM-7 이종이식편의 치료에 있어서 항-VEGF 야생형 및 T307Q/N434A (QA) 변이체의 세번째 효능 연구. 5, 0.5 및 0.05 mg/kg의 야생형 및 T307Q/N434A 및 5 mg/kg의 항-두드러기쑥 대조군을 1주 당 2회씩 복강내 투여하였다. (A) 처치 종료시 (제22일) 각 군에 대한 평균 종양 부피. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (B) HM-7 종양의 최종 중량. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (C) 처치 종료시의 혈청 항-VEGF 항체 농도. 농도는 항-인간 Fc 포획 ELISA로 측정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다. (D) 혈액 중 항체 농도에 대한 종양 중 항체 농도의 비율. 종양 항체 농도는 종양 용해물의 총량 및 종양 용해물 중 항-VEGF 항체의 양을 측정하여 결정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다.
도 21 패널 A-D: RAG2 KO; hum-XVEGF KI 이중-동형접합 마우스에 s.c. 이식된 HT-55 이종이식편의 치료에 있어서 항-VEGF 야생형 및 T307Q/N434A (QA) 변이체의 효능. 5, 0.5 및 0.05 mg/kg의 야생형 및 T307Q/N434A 및 5 mg/kg의 항-두드러기쑥 대조군을 1주 당 2회씩 복강내 투여하였다. (A) HT-55 종양의 성장 곡선. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (B) 처치 종료시 (제35일)에 측정한 HT-55 종양의 최종 중량. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (C) 처치 종료시의 혈청 항-VEGF 항체 농도. 농도는 인간 Fc 포획 ELISA로 측정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다. (D) 혈액 중 항체 농도에 대한 종양 중 항체 농도의 비율. 종양 항체 농도는 종양 용해물의 총량 및 종양 용해물 중 항-VEGF 항체의 양을 측정하여 결정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다.
도 22 패널 A-E: RAG2 KO; hum-XVEGF KI 이중-동형접합 마우스에 s.c. 이식된 Colo-205 이종이식편의 치료에 있어서 항-VEGF 야생형 및 T307Q/N434A (QA) 변이체의 효능. 5, 0.5 및 0.05 mg/kg의 야생형 및 T307Q/N434A 및 5 mg/kg의 항-두드러기쑥 대조군을 1주 당 2회씩 복강내 투여하였다. (A) Colo-205 종양의 성장 곡선. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (B) 0.5 및 0.05 mg/kg 처치군에서의 Colo-205 종양의 성장 곡선. (C) 처치 종료시 (제38일)에 측정한 Colo-205 종양의 최종 중량. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (D) 처치 종료시의 혈청 항-VEGF 항체 농도. 농도는 인간 Fc 포획 ELISA로 측정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다. (E) 혈액 중 항체 농도에 대한 종양 중 항체 농도의 비율. 종양 항체 농도는 종양 용해물의 총량 및 종양 용해물 중 항-VEGF 항체의 양을 측정하여 결정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다.
도 23 패널 A-D: Colo-205 이종이식편의 치료에 있어서 항-VEGF 야생형 및 T307Q/N434A (QA) 변이체의 반복 효능 연구. 5, 0.5 및 0.05 mg/kg의 야생형 및 T307Q/N434A 및 5 mg/kg의 항-두드러기쑥 대조군을 1주 당 2회씩 복강내 투여하였다. (A) Colo-205 종양의 성장 곡선. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (B) 0.5 및 0.05 mg/kg 처치군에서의 Colo-205 종양의 성장 곡선. (C) 처치 종료시 (제32일)에 측정한 Colo-205 종양의 최종 중량. 데이타는 평균±표준 오차로 나타냈다. (D) 처치 종료시의 혈청 항-VEGF 항체 농도. 농도는 인간 Fc 포획 ELISA로 측정하였다. 데이타는 평균±표준 편차로 나타냈다.
도 24: BIAcore를 사용한, pH 6.0 및 25℃에서 인간 FcRn에 대한 항-HER2 (트라스투주맙) IgG1 Fc 변이체의 1가 해리 상수 (KD). 결과는 2회의 독립적 실험의 대표값이다.
도 25: 다양한 인간 종양 세포주에서의 FcRn의 발현 수준. 각 세포주마다 5백만개의 세포를 본 실험에 사용하였다. Raji 세포 (인간 B-세포 림프종)를 음성 대조군으로 사용하였고, 7 kDa 막횡단 및 세포질 영역이 결실된 가용성 인간 FcRn 단백질을 양성 대조군으로서 블럿팅하였다. 가용성 FcRn 단백질의 희석물을 FcRn 발현 수준 정량화를 위한 표준물로서 사용하였다. 결과는 적어도 3회의 독립적 실험의 대표값이다.
도 26: 인간 FcRn에 대한 항-HER2 (트라스투주맙) IgG1 Fc 변이체의 pH-의존적 결합. L251, L314 및 E430에서 돌연변이를 갖는 변이체를 구축하였다. 결합은 BIAcore를 사용하여 25℃에서 6 내지 7.2 범위의 pH에서 측정하였다. 항-HER2 IgG1 야생형에 대한 상기 변이체의 친화도 비율을 결정하고, pH의 함수로서 플롯팅하였다.
도 27 패널 A 내지 C: 인간 FcRn에 대한 항-HER2 (트라스투주맙) IgG1 야생형, 변이체 T307Q/N434A, 변이체 L251D/T307Q/N434H 및 변이체 L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I의 (A) pH 6.0, (B) pH 7.1 및 (C) pH 7.4에서의 결합. 결합은 BIAcore를 사용하여 25℃에서 측정하였다. 도 27C에서, 변이체 L251D/T307Q/N434H는 pH 7.4에서 인간 FcRn에 대해 검출가능한 결합이 없었다.
도 28: 다양한 pH에서 다양한 항-VEGF 및 항-HER2 변이체에 대한 인간 FcRn의 해리 속도 (koff). 항-VEGF 변이체는 T307Q/N434A, T307Q/N434S, T307Q/E380A/N434S 및 V308P/N434A이다. 항-HER2 변이체는 L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I이다. 다양한 pH에서의 koff 값을 각 변이체마다 pH에 대해 핏팅하여 최적의 핏팅선의 기울기 (식: log(koff) = 기울기 × pH + y-절편)를 구하였다.
발명의 요약
본 발명은 신규 IgG 변이체 및 그의 용도를 제공한다. 수많은 IgG 변이체가 본 발명에서 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 아미노산 잔기 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 및 436 (카바트(Kabat)에서와 같이 EU 지수에 따라 번호매김함) 중 2개 이상에서 야생형 인간 IgG Fc 영역에 대한 2개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG Fc 영역을 포함하고, 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 2개 이상의 아미노산 치환은 아미노산 잔기 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 또는 436에 존재하고, 아미노산 잔기 251에서의 아미노산 치환은 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 치환이고, 아미노산 잔기 252에서의 아미노산 치환은 티로신으로의 치환이고, 아미노산 잔기 307에서의 아미노산 치환은 글루타민으로의 치환이고, 아미노산 잔기 308에서의 아미노산 치환은 프롤린으로의 치환이고, 아미노산 잔기 378에서의 아미노산 치환은 발린으로의 치환이고, 아미노산 잔기 428에서의 아미노산 치환은 류신으로의 치환이고, 아미노산 잔기 430에서의 아미노산 치환은 알라닌 또는 리신으로의 치환이고, 아미노산 잔기 434에서의 아미노산 치환은 알라닌, 세린 또는 티로신으로의 치환이며, 아미노산 잔기 436에서의 아미노산 치환은 이소류신으로의 치환인 신규 IgG 변이체를 개시한다.
특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 251에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 251에서의 아미노산 치환은 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 307에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 307에서의 아미노산 치환은 글루타민으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 308에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 308에서의 아미노산 치환은 프롤린으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 378에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 378에서의 아미노산 치환은 발린으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 436에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 436에서의 아미노산 치환은 이소류신으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG보다 FcRn에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다.
한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 307에서 글루타민으로의 아미노산 치환 및 아미노산 434에서 알라닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 307에서 글루타민으로의 아미노산 치환 및 아미노산 434에서 세린으로의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 308에서 프롤린으로의 아미노산 치환 및 아미노산 434에서 알라닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 252에서 티로신으로의 아미노산 치환 및 아미노산 434에서 알라닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 378에서 발린으로의 아미노산 치환 및 아미노산 434에서 알라닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 428에서 류신으로의 아미노산 치환 및 아미노산 434에서 알라닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 434에서 알라닌으로의 아미노산 치환 및 아미노산 436에서 이소류신으로의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 308에서 프롤린으로의 아미노산 치환 및 아미노산 434에서 티로신으로의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 307에서 글루타민으로의 아미노산 치환 및 아미노산 436에서 이소류신으로의 아미노산 치환을 포함한다.
본 발명은 또한 아미노산 잔기 251, 252, 307, 308, 378, 380, 428, 430, 434 및 436 (카바트에서와 같이 EU 지수에 따라 번호매김함) 중 3개 이상에서 야생형 인간 IgG Fc 영역에 대한 3개 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG Fc 영역을 포함하고, 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 3개 이상의 아미노산 치환은 아미노산 잔기 251, 252, 307, 308, 378, 380, 428, 430, 434 또는 436에 존재하고, 아미노산 잔기 251에서의 아미노산 치환은 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 치환이고, 아미노산 잔기 252에서의 아미노산 치환은 티로신으로의 치환이고, 아미노산 잔기 307에서의 아미노산 치환은 글루타민으로의 치환이고, 아미노산 잔기 308에서의 아미노산 치환은 프롤린으로의 치환이고, 아미노산 잔기 378에서의 아미노산 치환은 발린으로의 치환이고, 아미노산 잔기 380에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이고, 아미노산 잔기 428에서의 아미노산 치환은 류신으로의 치환이고, 아미노산 잔기 430에서의 아미노산 치환은 알라닌 또는 리신으로의 치환이고, 아미노산 잔기 434에서의 아미노산 치환은 알라닌, 세린, 티로신 또는 히스티딘으로의 치환이며, 아미노산 잔기 436에서의 아미노산 치환은 이소류신으로의 치환인 신규 IgG 변이체를 개시한다.
특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 251에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 251에서의 아미노산 치환은 아스파르트산 또는 글루탐산으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 307에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 307에서의 아미노산 치환은 글루타민으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 308에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 308에서의 아미노산 치환은 프롤린으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 378에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 378에서의 아미노산 치환은 발린으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 436에서의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 아미노산 436에서의 아미노산 치환은 이소류신으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG에 비해 FcRn에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다.
한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 307에서 글루타민으로의 아미노산 치환, 아미노산 380에서 알라닌으로의 아미노산 치환 및 아미노산 434에서 세린으로의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 307에서 글루타민으로의 아미노산 치환, 아미노산 380에서 알라닌으로의 아미노산 치환 및 아미노산 434에서 알라닌으로의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 252에서 티로신으로의 아미노산 치환, 아미노산 308에서 프롤린으로의 아미노산 치환 및 아미노산 434에서 티로신으로의 아미노산 치환을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 251에서 아스파르트산으로의 아미노산 치환, 아미노산 307에서 글루타민으로의 아미노산 치환 및 아미노산 434에서 히스티딘으로의 아미노산 치환을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 위치 297에서 알라닌으로의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 변이체 IgG 또는 그의 단편을 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG보다 FcRn에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 FcRn에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 인간 또는 인간화 IgG이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 IgG Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 IgG Fc 영역은 IgG1 Fc 영역이다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 항-VEGF 항체이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 베바시주맙의 변이체이다. 특정 실시양태에서, 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG는 베바시주맙이다. 특정 실시양태에서, 야생형 인간 IgG Fc 영역은 베바시주맙의 Fc 영역이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 1) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 2)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 3) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 4)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 7) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 8)을 포함한다.
추가로, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 변이체 IgG 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 개시한다. 용기 내의 본원에 기재된 임의의 변이체 IgG 및 사용 지침서를 포함하는 키트 또한 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 반감기는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG에 비해 적어도 50％, 100％, 150％, 200％, 300％ 이상 증가된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 반감기는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG에 비해 적어도 2배 증가된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 반감기는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG에 비해 적어도 3배 증가된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 반감기는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG에 비해 적어도 4배 증가된다. 특정 실시양태에서, 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG는 베바시주맙이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 반감기는 베바시주맙의 평균 반감기이다. 특정 실시양태에서, 베바시주맙의 평균 반감기는 시노몰구스 원숭이에서 측정시에는 약 10일 내지 12일, 또는 인간에서 측정시에는 약 3주이다.
특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 변이체 IgG가 제공되며, 여기서 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 잔기 307 및 434 (카바트에서와 같이 EU 지수에 따라 번호매김함)에서 야생형 인간 IgG Fc 영역에 대한 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 상기 변이체 IgG는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 아미노산 잔기 307에서의 아미노산 치환은 글루타민으로의 치환이고, 아미노산 잔기 434에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다. 한 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 1) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 2)을 포함하고 아미노산 잔기 307 및 434 (카바트에서와 같이 EU 지수에 따라 번호매김함)에서 야생형 인간 IgG1 Fc 영역에 대한 아미노산 치환을 포함하는 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 변이체 IgG1이고, 여기서 상기 변이체 IgG1은 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 갖는 IgG1의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 아미노산 잔기 307에서의 아미노산 치환은 글루타민으로의 치환이고, 아미노산 잔기 434에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다.
또 다른 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 변이체 IgG가 제공되며, 여기서 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 잔기 307 및 434 (카바트에서와 같이 EU 지수에 따라 번호매김함)에서 야생형 인간 IgG Fc 영역에 대한 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 상기 변이체 IgG는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 아미노산 잔기 307에서의 아미노산 치환은 글루타민으로의 치환이고, 아미노산 잔기 434에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다.
또 다른 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 변이체 IgG가 제공되며, 여기서 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 잔기 308 및 434 (카바트에서와 같이 EU 지수에 따라 번호매김함)에서 야생형 인간 IgG Fc 영역에 대한 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 상기 변이체 IgG1은 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 아미노산 잔기 308에서의 아미노산 치환은 프롤린으로의 치환이고, 아미노산 잔기 434에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이다.
또 다른 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 변이체 IgG가 제공되며, 여기서 인간 IgG Fc 영역은 아미노산 잔기 307, 380 및 434 (카바트에서와 같이 EU 지수에 따라 번호매김함)에서 야생형 인간 IgG Fc 영역에 대한 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 상기 변이체 IgG는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 아미노산 잔기 307에서의 아미노산 치환은 글루타민으로의 치환이고, 아미노산 잔기 380에서의 아미노산 치환은 알라닌으로의 치환이고, 아미노산 잔기 434에서의 아미노산 치환은 세린으로의 치환이다.
특정 실시양태에서, 상기 기재된 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 변이체 IgG는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG보다 FcRn에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 FcRn에 대해 더 높은 결합 친화도를 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 인간 또는 인간화 IgG이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 IgG Fc 영역은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 IgG Fc 영역은 IgG1 Fc 영역이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 항-VEGF 항체이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 베바시주맙의 변이체이다. 특정 실시양태에서, 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG는 베바시주맙이다. 특정 실시양태에서, 야생형 인간 IgG Fc 영역은 베바시주맙의 Fc 영역이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 1) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 2)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 임의의 변이체 IgG 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 본원에서 제공된다. 용기 내의 인간 IgG Fc 영역을 포함하는 임의의 변이체 IgG 및 사용 지침서를 포함하는 키트 또한 본원에서 제공된다.
특정 실시양태에서, 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 변이체 IgG가 제공되고, 여기서 상기 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 1) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 2)을 포함하고, 인간 IgG1 Fc 영역은 아미노산 잔기 434 (카바트에서와 같이 EU 지수에 따라 번호매김함)에서 야생형 인간 IgG1 Fc 영역에 대한 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 상기 변이체 IgG는 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 변이체 IgG는 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 갖는 IgG의 FcRn에 대한 결합 친화도에 비해 FcRn에 대해 더 높은 결합 친화도를 가지며, 아미노산 잔기 434에서의 아미노산 치환은 히스티딘으로의 치환이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 변이체 IgG1이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 적어도 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 100％ 증가된다. 한 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 적어도 50％ 증가된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 적어도 75％ 증가된다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 적어도 100％ 증가된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 15일, 20일, 25일, 30일, 35일 또는 40일이다. 한 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 15일이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 20일이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 25일이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 30일이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 35일이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 40일이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 변이체 IgG1이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 인간에서 측정된 반감기이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 시노몰구스 원숭이에서 측정된 반감기이다. 특정 실시양태에서, 야생형 IgG 또는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG는 베바시주맙이다. 특정 실시양태에서, 베바시주맙의 반감기는 시노몰구스 원숭이에서 측정시에는 약 10일 내지 12일, 또는 인간에서 측정시에는 약 20일이다.
IgG 변이체를 사용하는 수많은 방법이 본 발명에서 제공된다. 대상체에서 종양을 치료하는 방법이 제공된다. 예를 들어, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 상기 및 본원에 기재된 임의의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 항-VEGF 항체이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 베바시주맙의 변이체이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 유효량의 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
대상체에서 VEGF 활성을 억제하는 방법이 본 발명에서 제공된다. 예를 들어, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 상기 및 본원에 기재된 임의의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, VEGF 활성은 혈관신생이다.
대상체에서 혈관 투과성을 조절하는 방법이 본 발명에서 제공된다. 예를 들어, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 상기 및 본원에 기재된 임의의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함한다..
대상체에서 비-신생물 장애를 치료하는 방법이 본 발명에서 제공된다. 예를 들어, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 상기 및 본원에 기재된 임의의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 비-신생물 장애는 자가면역 질환이다. 특정 실시양태에서, 비-신생물 장애는 알츠하이머병이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 노화-관련 황반 변성으로 진단된다.
대상체에서 HER 발현 종양을 치료하는 방법이 본 발명에서 제공된다. 예를 들어, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 상기 및 본원에 기재된 임의의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 7) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 8)을 포함한다.
대상체에서 암 세포의 성장을 억제 또는 예방하는 방법이 본 발명에서 제공된다. 예를 들어, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 상기 및 본원에 기재된 임의의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함한다.
대상체에게 유효량의 변이체 IgG를 투여하는 방법이 본 발명에서 제공된다. 이러한 투여 방법은 본원에 기재된 다른 방법 (예를 들어, 치료 방법)과 조합하여 이용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 상기 및 본원에 기재된 임의의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 변이체 IgG는 대상체에게 4주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 5주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 6주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 7주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 8주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 9주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 10주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 11주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 12주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 유효량의 임의의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 변이체 IgG는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 권장되거나 처방된 투여 빈도보다 덜 빈번하게 투여된다. 특정 실시양태에서, 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG는 베바시주맙이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG, 예를 들어 베바시주맙의 변이체는 베바시주맙의 처방된 투여 빈도보다 덜 빈번하게 투여된다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 처음에는 2주마다 투여되고, 이후에는 4주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 처음에는 3주마다 투여되고, 이후에는 6주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 처음에는 4주마다 투여되고, 이후에는 8주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 처음에는 5주마다 투여되고, 이후에는 10주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 처음에는 6주마다 투여되고, 이후에는 12주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG, 예를 들어 베바시주맙의 변이체는 처음에는 베바시주맙의 처방된 투여 빈도로 투여되고, 이후에는 베바시주맙의 처방된 투여 빈도보다 덜 빈번하게 투여된다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 항-VEGF 항체이다. 한 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 중쇄 가변 도메인 (서열 1) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 2)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙의 변이체이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 대상체에게 정맥내 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 대상체에게 피하 투여된다.
본원에 기재된 방법의 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암으로 진단된다. 특정 실시양태에서, 암은 비-소세포 폐암, 신세포 암종, 난소암, 교아세포종, 유방암 및 결장직장암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 본원에서는 대상체에게 유효량의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 양성, 전암성 또는 비-전이성 암을 치료하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 투여는 양성, 전암성 또는 비-전이성 암이 침습성 또는 전이성 암이 되는 것을 예방한다. 예를 들어, 양성, 전암성 또는 비-전이성 암은 0기, I기 또는 II기 암일 수 있고, 특정 실시양태에서는 변이체 IgG의 투여가 양성, 전암성 또는 비-전이성 암이 다음 단계(들), 예를 들어 I기, II기, III기 또는 IV기 암으로 진행되는 것을 예방한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 대상체에서 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양을 치료하거나 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양이 침습성 또는 전이성 암이 되는 것을 예방하기에 충분한 시간 동안 충분한 양으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 투여는 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양의 종양 크기, 종양 존재량 또는 종양 수를 감소시킨다. 변이체 IgG는 또한 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양에서 혈관 밀도를 감소시키기 위한 양으로 그러한 시간 동안 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 예를 들어 0기 (예를 들어, 계내 암종), I기 또는 II기 암을 치료하는데 이용될 수 있다. 네오아주반트 및 아주반트 요법의 방법은 임의의 유형의 암, 예를 들어 양성 또는 악성 암을 치료하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 암은 충실성 종양, 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 결장암, 유방암, 전립선암, 신장암, 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암), 흑색종, 난소암, 췌장암, 위장암, 두경부암, 간암 및 연조직 암 (예를 들어, B 세포 림프종, 예컨대 NHL 및 다발성 골수종 및 백혈병, 예컨대 만성 림프구성 백혈병)이다. 또 다른 실시양태에서, 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양은 폴립, 선종, 섬유종, 지방종, 가스트린종, 인슐린종, 연골종, 골종, 혈관종, 림프관종, 수막종, 평활근종, 횡문근종, 편평 세포 유두종, 청신경종, 신경섬유종, 담관 낭선종, 평활근종, 중피종, 기형종, 점액종, 트라코마, 육아종, 과오종, 이행 세포 유두종, 침샘의 다형성 선종, 인대양 종양, 유피 낭선유두종, 낭선종, 초점성 결절성 과증식 또는 결절성 재생성 과증식이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 방법은 바람직하게는 선종을 치료하는데 이용된다. 선종의 비-제한적 예는 간 세포 선종, 신장 선종, 후신 선종, 기관지 선종, 포상 선종, 부신 선종, 뇌하수체 선종, 부갑상선 선종, 췌장 선종, 침샘 선종, 간세포 선종, 위장 선종, 관상 선종 및 담관 선종을 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에게 유효량의 변이체 IgG를 투여하여 상기 대상체에서 양성, 전암성 또는 비-전이성 암이 발생 또는 재발하는 것을 예방하는 것을 포함하는 방법을 특징으로 한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 대상체는 암, 폴립 또는 암 증후군의 위험이 있다. 한 예에서, 대상체는 암, 폴립 또는 유전적 암 증후군의 가족력을 갖는다. 본 발명의 특정 측면에서, 대상체는 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양이 발생할 위험이 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 종양에 걸린 적이 없는 대상체, 임상적으로 검출가능한 암에 걸린 적이 없는 대상체, 또는 단지 양성 종양만을 갖는 대상체에서 상기 양성, 전암성 또는 비-전이성 암이 발생 또는 재발하는 것을 예방한다.
또 다른 측면에서, 대상체에게 변이체 IgG를 대상체에서의 암 재발을 예방하거나 암 재발 가능성을 감소시키기에 충분한 시간 동안 충분한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암이 재발하는 것을 예방하거나 암이 재발할 가능성을 감소시키는 방법이 제공된다. 본 발명은 종양을 제거 (예를 들어, 결정적 수술을 이용함)하는 단계, 및 이후 대상체에게 변이체 IgG를 투여하는 단계를 포함하는, 종양을 갖는 대상체에서 암의 재발을 예방하는 방법을 포함한다. 본 발명은 종양을 제거 (예를 들어, 결정적 수술을 이용함)하는 단계, 및 이후 대상체에게 변이체 IgG를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 종양의 재성장을 예방하는 방법을 포함한다. 관련 측면에서, 본 발명은 대상체에게 수술 전에 유효량의 변이체 IgG를 투여하고, 결정적 수술을 수행하고, 수술 후에 유효량의 변이체 IgG를 투여하는 것을 임의로 포함하며, 여기서 수술 후 변이체 IgG의 투여는 암의 재발을 예방하거나 암 재발 가능성을 감소시키는 것인, 대상체에서 암의 재발을 예방하거나 대상체에서 암 재발 가능성을 감소시키는 방법을 포함한다. 또 다른 관련 측면에서, 본 발명은 대상체에게 유효량의 변이체 IgG를 임의의 추가의 항암 치료제 없이 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 투여가 대상체에서 암의 재발을 예방하거나 대상체에서 암 재발 가능성을 감소시키는 것인, 대상체에서 암의 재발을 예방하거나 대상체에서 암 재발 가능성을 감소시키는 방법을 포함한다.
상기 측면 각각에서, 종양은 충실성 종양, 및 특히 본원에 기재된 종양 및 선종을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 종양일 수 있다. 대상체는 임상적으로 검출가능할 수도 있고 임상적으로 검출가능하지 않을 수도 있는 잠복기 종양 또는 미세전이물을 가질 수 있다. 이러한 측면의 한 실시양태에서, 변이체 IgG는 잠복기 종양 또는 미세전이물의 신생혈관증식(neovascularization)을 감소시키기에 충분한 시간 동안 충분한 양으로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 임상적으로 검출가능한 종양 또는 그의 전이물의 발생을 예방하거나 대상체의 생존 기간을 증가시키기에 충분한 시간 동안 충분한 양으로 투여된다.
한 실시양태에서, 변이체 IgG는 단일요법이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 이전에 예를 들어 항암 요법을 이용한 종양 치료를 받은 적이 있다. 한 예에서, 항암 요법은 수술이다. 또 다른 실시양태에서, 대상체는 변이체 IgG의 투여 전, 투여 동안 (예를 들어, 동시에) 또는 투여 후에 추가의 항암 요법으로 추가로 처치될 수 있다. 항암 요법의 예는 수술, 방사선 요법 (방사선요법), 생물요법, 면역요법, 화학요법, 또는 이들 요법의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
대상체에게 결정적 수술을 실시한 실시양태에서, 변이체 IgG는 일반적으로 대상체가 수술로부터 회복되는 기간 후에 투여된다. 이러한 기간은 창상 치유 또는 수술 절개부의 치유에 필요한 기간, 창상이 벌어지는 위험을 감소시키는데 필요한 시간, 또는 대상체가 수술 전의 건강 수준과 본질적으로 유사하거나 그보다 더 양호한 건강 수준으로 회복되는데 필요한 기간을 포함할 수 있다. 또한, 결정적 수술의 완료와 변이체 IgG의 1차 투여 사이의 기간은 대상체가 치료 처치 사이의 기간을 필요로 하거나 요청하는 약물 중단기에 필요한 기간을 포함할 수 있다. 일반적으로, 결정적 수술의 완료와 변이체 IgG 요법의 개시 사이의 기간은 1주 미만, 1주, 2주, 3주, 4주 (28일), 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년 또는 그보다 더 오랜 기간을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 결정적 수술과 변이체 IgG의 투여 사이의 기간은 2주 초과 1년 미만이다. 한 실시양태에서, 결정적 수술과 변이체 IgG의 투여 사이의 기간은 4주 (28일) 초과이다.
특정 실시양태에서, 상기 측면 각각은 암의 재발에 대해 대상체를 모니터링하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 대상체, 예를 들어 인간 환자에게 유효량의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 환자는 종양 또는 암으로 진단된, 상기 대상체, 예를 들어 인간 환자에서 수술가능한 암의 수술적 제거 전에 네오아주반트 요법을 실시하는 방법을 제공한다. 변이체 IgG는 단독으로 투여될 수도 있고, 또는 1종 이상의 화학요법제와 조합하여 투여될 수도 있다.
본 발명은 또한 수술가능한 암을 갖는 대상체에게 수술 전에 유효량의 변이체 IgG를 투여한 후에 수술을 수행하여 암을 절제하는 것을 포함하는, 수술가능한 암을 갖는 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 수술 후에 유효량의 변이체 IgG를 투여하여 암의 재발을 예방하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 수술가능한 암을 갖는 대상체에게 결정적 수술 전에 유효량의 변이체 IgG 및 1종 이상의 화학요법제를 투여하는 것을 포함하는, 네오아주반트 요법을 실시하는 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 절제불가능한 종양을 갖는 대상체에게 유효량의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 투여가 종양 크기를 감소시켜서 종양이 완전히 절제되도록 하는 것인, 절제불가능한 종양을 갖는 대상체에서 종양 크기를 감소시키는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 종양의 완전한 절제 후에 유효량의 변이체 IgG를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 a) 복수개의 처치 주기를 포함하고, 여기서 각 주기는 대상체에게 유효량의 변이체 IgG 및 1종 이상의 화학요법제를 소정의 간격을 두고 투여하는 것을 포함하는 것인 제1 단계, b) 결정적 수술을 수행하여 암을 제거하는 단계, 및 c) 복수개의 유지 주기를 포함하고, 여기서 각 주기는 대상체에게 유효량의 변이체 IgG를 임의의 화학요법제 없이 소정의 간격을 두고 투여하는 것을 포함하는 것인 제2 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 제1 단계는 변이체 IgG 및 제1 화학요법제를 투여하는 제1 복수개의 처치 주기 및 이후 변이체 IgG 및 제2 화학요법제를 투여하는 제2 복수개의 처치 주기를 포함한다.
본 발명은 전이성 또는 비-전이성 암을 갖는 대상체에게 결정적 수술 후에 유효량의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 1종 이상의 화학요법제의 사용을 추가로 포함한다.
한 측면에서, 상기 방법은 a) 복수개의 처치 주기를 포함하고, 여기서 각 주기는 대상체에게 유효량의 변이체 IgG 및 1종 이상의 화학요법제를 소정의 간격을 두고 투여하는 것을 포함하는 것인 제1 단계, 및 b) 복수개의 유지 주기를 포함하고, 여기서 각 주기는 대상체에게 유효량의 변이체 IgG를 임의의 화학요법제 없이 소정의 간격을 두고 투여하는 것을 포함하는 것인 제2 단계를 포함한다. 한 실시양태에서, 제1 단계는 변이체 IgG 및 제1 화학요법제를 투여하는 제1 복수개의 처치 주기 및 이후 변이체 IgG 및 이후 제2 화학요법제를 투여하는 제2 복수개의 처치 주기를 포함한다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 VEGF에 결합하거나 VEGF 발현 또는 생물학적 활성을 감소시키는 항-VEGF 항체이다. 항-VEGF 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 모노클로날 항체, 키메라 항체, 완전 인간 항체 또는 인간화 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법에 유용한 예시적인 항체는 베바시주맙 (아바스틴®), G6-31, B20-4.1, B20-4.1.1, 및 이것들의 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 인간화 항-HER2 모노클로날 항체 헤르셉틴(HERCEPTIN)®이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 키메라 항-CD20 항체 리툭산(Rituxan)®, 항-IgE 항체 크솔라르(XOLAIR)®, 항-CD20 항체, 항-CD11a 항체 랍티바(Raptiva)®, 항-Her2 항체 옴니타르그(Omnitarg)®, 항-oxLDL 항체, 항-CD4 항체 MTRX1011A, 항-HCV 항체, 항-IL-17A/F 항체, 항-A-베타 항체, 항-DR6 항체, 항-인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 항체, 항-HER 수용체 부류 항체, 항-조직 인자 항체, MLN-02 항체, 인간화 항-CD18 F(ab')2 항체 또는 인간화 항-IgE IgG1 항체 rhuMab-E25이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 표적 항원이 IL-4 및 IL-13인 이중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 스타필로코쿠스 아우레우스(staph aureus)의 에피토프를 표적으로 하는 항체이다.
대상체를 변이체 IgG의 투여 전, 투여 동안, 또는 투여 후에 수많은 상이한 방법으로 처치할 수 있지만, 특정 실시양태에서는 대상체를 수술 또는 화학요법 없이 처치한다. 다른 실시양태에서, 임상의에 의해 평가되거나 본원에 기재된 바와 같이 변이체 IgG 처치는 단일요법이거나 변이체 IgG 처치 기간 동안 단일 요법이다.
다른 실시양태에서, 변이체 IgG 처치는 수술, 방사선 요법, 화학요법, 분화 요법, 생물요법, 면역 요법, 혈관신생 억제제 및 항-증식성 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가의 항암 요법과 조합된다. 변이체 IgG 처치는 또한 상기 유형의 치료 방식의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포독성제, 항-혈관신생제 및 항-증식제가 변이체 IgG와 조합되어 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 항암 요법은 화학요법이다. 특정 실시양태에서, 화학요법제 및 변이체 IgG는 동시에 투여된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법은 초기 단계 종양을 치료 및 예방하여 보다 진행된 단계로의 진행을 예방함으로써 진행성 암과 관련된 이환율 및 사망률을 감소시키는데 유리하다. 본 발명의 방법은 또한 예를 들어 원발성 종양의 제거 후에 지속되는 잠복기 종양과 같은 종양의 재발 또는 종양의 재성장을 예방하거나, 또는 미세전이물의 발생 또는 증식을 감소시키거나 예방하는데 유리하다.
본 발명의 방법의 경우, 암은 충실성 종양, 예를 들어 유방암, 결장직장암, 직장암, 폐암, 신장 세포 암, 신경교종 (예를 들어, 미분화 성상세포종, 미분화 희돌기성상세포종, 미분화 희돌기교종, 다형성 교아세포종), 신장암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 흑색종 및 난소암일 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 암 또는 종양의 재발에 대해 대상체를 모니터링하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기하는 상세한 설명, 도면 및 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
본원에 기재된 임의의 실시양태 또는 이것들의 임의의 조합은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 및 모든 변이체 IgG 및 방법에 적용된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 생체내 반감기가 증가된, 항체, Fc 융합체 및 면역어드헤신에 존재하는 것들을 포함하는 Fc 도메인의 신규 변이체에 관한 것이다. 이들 변이체는 FcRn에 결합하고 야생형 인간 IgG Fc 영역에 비해 FcRn에 대한 IgG Fc 영역 또는 그의 단편의 친화도를 증가시키는 1개 이상의 아미노산 변형을 함유하는 인간 IgG Fc 영역 또는 그의 단편을 포함한다.
본원에 기재되거나 언급된 기술 및 절차는 일반적으로 당업자에게 널리 이해되고 통상적인 방법으로 보편적으로 이용되는 것들이며, 예를 들어 하기 문헌에 기재된 널리 사용되는 방법이다:
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달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 용어 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 ([Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley ＆ Sons (New York, N.Y. 1994)] 및 [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley ＆ Sons (New York, N.Y. 1992)])은 당업자에게 본 출원에서 사용된 많은 용어에 관한 일반적인 지침을 제공한다. 특허 출원 및 공개공보를 포함하여 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참고로 포함된다.
정의
본 명세서를 이해하기 위해 하기 정의가 적용될 것이고, 적절할 경우에는 언제라도 단수로 사용된 용어들이 복수도 포함할 것이고, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시양태를 기재하고자 하는 목적으로만 사용되는 것이며, 이는 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 하기 기재된 임의의 정의가 본원에서 참고문헌으로 포함된 임의의 문헌과 모순되는 경우에는 하기 정의가 우선한다.
본 명세서와 특허청구범위 전반에 걸쳐, 이뮤노글로불린 중쇄 내의 잔기에 관한 번호매김은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)] (본원에 명백하게 참고로 포함됨)에서와 같은 EU 지수의 번호매김이다. "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호매김을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "생체내 반감기" 또는 "항체의 생체내 반감기"는 주어진 동물의 순환계 내에서 FcRn 결합 부위를 함유하는 특정 유형의 IgG 분자 또는 그의 단편의 생물학적 반감기를 지칭하고, 분자의 순환 농도가 50％ 감소되는데 필요한 시간으로 표시된다. 특정 실시양태에서, 주어진 IgG의 농도를 시간의 함수로 플롯팅하면, 곡선은 일반적으로 혈관내 및 혈관외 공간 사이에서 주입된 IgG 분자의 평형을 나타내는 신속한 α-기 및 혈관내 공간으로부터 IgG 분자의 제거를 나타내는 보다 긴 β-기를 갖는 2상이다. 특정 실시양태에서, 용어 "생체내 반감기"는 β-기에서의 IgG 분자의 반감기에 상응한다. 특정 실시양태에서, 주어진 IgG의 농도 vs. 시간 곡선은 α-기 및 β-기로의 상응하는 분포 및 γ-기로 표시되는 최종 제거를 갖는 3상이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 생체내 반감기는 최종 제거 기 또는 γ-기의 반감기에 상응한다. 특정 실시양태에서, 주어진 IgG의 농도 vs. 시간 곡선은 단일 제거 기를 갖는 1상이다. 따라서, 특정 실시양태에서, 생체내 반감기는 단일 제거 기의 반감기에 상응한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "모 폴리펩티드" 또는 "야생형 폴리펩티드"는 본원에 개시된 1개 이상의 Fc 영역 아미노산 변형이 없고 본원에 개시된 바와 같은 변이체 IgG와 비교하여 이펙터 기능이 상이한 미변형 폴리펩티드, 천연 발생 폴리펩티드, 또는 조작된 변형된 버전의 천연 발생 폴리펩티드를 의미한다. 모 폴리펩티드는 천연 서열 Fc 영역 또는 기존의 아미노산 서열 변형 (예를 들어, 부가, 결실 및/또는 치환)을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 모 폴리펩티드는 또한 하기 기재된 바와 같은 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 모 폴리펩티드는 폴리펩티드 자체, 모 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 또는 이것을 코딩하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 모 폴리펩티드는 모 이뮤노글로불린, 야생형 이뮤노글로불린, 모 항체 및 야생형 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "모 이뮤노글로불린", "모 IgG", "야생형 이뮤노글로불린" 또는 "야생형 IgG"는 미변형 이뮤노글로불린, 천연 발생 이뮤노글로불린, 또는 본원에 개시된 1개 이상의 Fc 영역 아미노산 변형이 없고 본원에 개시된 바와 같은 변이체 IgG와 비교하여 이펙터 기능이 상이한 조작된 변형된 버전의 천연 발생 이뮤노글로불린을 의미한다. 모 이뮤노글로불린은 천연 서열 Fc 영역 또는 기존의 아미노산 서열 변형 (예를 들어, 부가, 결실 및/또는 치환)을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 모 이뮤노글로불린은 또한 하기 기재된 바와 같은 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 모 이뮤노글로불린은 이뮤노글로불린 자체, 모 이뮤노글로불린을 포함하는 조성물, 또는 이것을 코딩하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "모 항체" 또는 "야생형 항체"는 미변형 항체, 천연 발생 항체, 또는 본원에 개시된 1개 이상의 Fc 영역 아미노산 변형이 없고 본원에 개시된 바와 같은 변이체 IgG와 비교하여 이펙터 기능이 상이한 조작된 변형된 버전의 천연 발생 항체를 의미한다. 모 항체는 천연 서열 Fc 영역 또는 기존의 아미노산 서열 변형 (예를 들어, 부가, 결실 및/또는 치환)을 갖는 Fc 영역을 포함할 수 있다. 모 항체는 또한 하기 기재된 바와 같은 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 모 항체는 항체 자체, 모 항체를 포함하는 조성물, 또는 이것을 코딩하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다.
특정 실시양태에서, "모 IgG", "모 항체", "야생형 IgG" 또는 "야생형 항체"는 본원에 기재된 바와 같은 재조합 방식으로 생성된, 공지된 시판 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 야생형 IgG는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG이다. 특정 실시양태에서, 야생형 인간 IgG Fc 영역은 본원에 개시된 1개 이상의 Fc 영역 아미노산 변형이 없는 Fc 영역을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 야생형 인간 IgG Fc 영역은 본원에 개시되지 않은 1개 이상의 Fc 영역 아미노산 변형을 갖는 Fc 영역을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 야생형 IgG는 베바시주맙이다. 특정 실시양태에서, 야생형 항체는 Fc 영역을 함유하지 않는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 이러한 야생형 항체의 변이체 IgG는 야생형 항체의 Fab 도메인 단편 또는 비-항체 단백질의 도메인(들), 및 본원에 개시된 1개 이상의 Fc 영역 변형을 포함하는 Fc 도메인 단편을 포함하는 Fc 융합 단백질이다. 특정 실시양태에서, 야생형 인간 IgG Fc 영역은 Fc 돌연변이 L251D 또는 L251D/434H를 갖지만 본원에 개시된 다른 Fc 영역 아미노산 변형은 갖지 않는 IgG Fc 영역을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "변이체", "변이체 단백질" 또는 "단백질 변이체"는 1개 이상의 아미노산 변형에 의해 모 단백질과 상이한 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 단백질 자체, 상기 단백질을 포함하는 조성물, 또는 이것을 코딩하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질 변이체는 모 폴리펩티드와 비교하여 1개 이상의 아미노산 변형, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 변형을 갖는다. 특정 실시양태에서, 단백질 변이체는 IgG Fc 영역에서 2개 이상의 아미노산 변형을 갖는다. 특정 실시양태에서, 단백질 변이체는 IgG Fc 영역에서 3개 이상의 아미노산 변형을 갖는다. 본원에서의 단백질 변이체 서열은 바람직하게는 모 단백질 서열과 적어도 약 80％의 상동성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90％의 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95％의 상동성을 가질 것이다. 단백질 변이체는 또한 하기 정의된 바와 같은 비-천연 아미노산을 포함할 수 있다. 용어 "단백질 변이체"는 본원에 기재된 바와 같은 이뮤노글로불린 변이체 및 항체 변이체를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이뮤노글로불린 변이체", "변이체 이뮤노글로불린", "변이체 IgG" 또는 "IgG 변이체"는 1개 이상의 아미노산 변형에 의해 모 또는 야생형 이뮤노글로불린 서열과 상이한 이뮤노글로불린 서열을 의미한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 야생형 IgG와 비교하여 Fc 영역에서 2개 이상의 아미노산 변형을 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 야생형 IgG와 비교하여 Fc 영역에서 3개 이상의 아미노산 변형을 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 변이체 항체이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 항-VEGF 항체이다. 한 실시양태에서, 변이체 IgG는 항체의 Fc 영역에서 1개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 베바시주맙의 변이체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 변이체" 또는 "변이체 항체"는 1개 이상의 아미노산 변형에 의해 모 항체와 상이한 항체를 의미한다. 특정 실시양태에서, 변이체 항체는 야생형 항체와 비교하여 Fc 영역에서 1개 이상의 아미노산 변형을 갖는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "위치"는 단백질의 서열 내 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로 번호매김될 수도 있고, 또는 확립된 포맷, 예를 들어 카바트에서와 같은 EU 지수에 따라 번호매김될 수도 있다.
용어 "Fc 영역-함유 폴리펩티드" 또는 "Fc 폴리펩티드"는 Fc 영역의 모두 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어, Fc 폴리펩티드는 항체, Fc 융합체, 단리된 Fc 및 Fc 단편을 포함한다.
용어 "Fc 영역-포함 항체"는 Fc 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 번호매김 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 정제 동안, 또는 항체를 코딩하는 핵산의 재조합 조작에 의해 제거될 수 있다. 따라서, Fc 영역을 갖는 항체를 포함하는 조성물은 K447을 갖는 항체, 모든 K447이 제거된 항체, 또는 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 포함할 수 있다.
"아미노산 변형"은 소정의 아미노산 서열의 아미노산 서열에서의 변화를 지칭한다. 예시적인 변형은 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아미노산 변형은 치환이다.
명시된 위치, 예를 들어 Fc 영역의 명시된 위치에서의 "아미노산 변형"은 명시된 잔기의 치환 또는 결실, 또는 명시된 잔기에 인접한 1개 이상의 아미노산 잔기의 삽입을 지칭한다. 명시된 잔기에 "인접한" 삽입은, 그의 1개 또는 2개 잔기 내의 삽입을 의미한다. 삽입은 명시된 잔기에 대해 N-말단 또는 C-말단일 수 있다.
"아미노산 치환"은 소정의 아미노산 서열 내에 존재하는 1개 이상의 아미노산 잔기를 또 다른 상이한 "대체" 아미노산 잔기로 대체시키는 것을 지칭한다. 대체 잔기(들)은 "천연 발생 아미노산 잔기" (즉, 유전자 코드에 의해 코딩됨)일 수 있고, 알라닌 (Ala), 아르기닌 (Arg), 아스파라진 (Asn), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루타민 (Gln), 글루탐산 (Glu), 글리신 (Gly), 히스티딘 (His), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 리신 (Lys), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr) 및 발린 (Val)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, 대체 잔기는 시스테인이 아니다. 1개 이상의 비-천연 발생 아미노산 잔기에 의한 치환 또한 본원에서의 아미노산 치환의 정의에 포함된다.
"비-천연 발생 아미노산 잔기"는 폴리펩티드 쇄 내의 인접한 아미노산 잔기(들)에 공유 결합할 수 있는, 상기 열거된 천연 발생 아미노산 잔기들 이외의 잔기를 지칭한다. 비-천연 발생 아미노산 잔기의 예는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 기타 아미노산 잔기 유사체, 예컨대 문헌 [Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)], 미국 특허 번호 6,586,207, WO 98/48032, WO 03/073238, 미국 공개 번호 2004-0214988A1, WO 05135727A2, WO 05/74524A2, [J. W. Chin et al. (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027], [J. W. Chin, ＆ P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137] 및 [J. W. Chin, et al. (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024] (모두가 전체적으로 참고로 포함됨)에 기재된 것들을 포함한다.
"아미노산 삽입"은 1개 이상의 아미노산을 소정의 아미노산 서열 내로 혼입시키는 것을 지칭한다. 삽입이 통상적으로 1개 또는 2개의 아미노산 잔기를 삽입하는 것으로 이루어지긴 하지만, 본 출원은 보다 큰 "펩티드 삽입", 예를 들어 약 3개 내지 약 5개 또는 심지어는 최대 약 10개의 아미노산 잔기의 삽입을 고려한다. 삽입되는 잔기(들)은 상기 개시된 바와 같은 천연 발생 또는 비-천연 발생 잔기일 수 있다.
"아미노산 결실"은 소정의 아미노산 서열로부터 1개 이상의 아미노산 잔기를 제거하는 것을 지칭한다.
특정 실시양태에서, 용어 "증가", "증가된 반감기" 또는 "증가된 생체내 반감기"는 당업계의 표준 공지 방법, 예컨대 본원에 기재된 방법으로 검출할 때 야생형 IgG 또는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG와 비교하여 본 발명의 변이체 IgG의 생체내 반감기에서의 적어도 약 25％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 100％, 150％, 200％, 300％ 이상의 전체적인 증가를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 용어 증가는 변이체 IgG의 증가된 생체내 반감기를 지칭하고, 여기서 상기 증가는 야생형 IgG 또는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG와 비교하여 적어도 약 1.25배, 1.5배, 1.75배, 2배, 3배, 4배, 5배 또는 10배 이상이다. 특정 실시양태에서, 야생형 IgG 또는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG는 베바시주맙이다. 특정 실시양태에서, 베바시주맙의 평균 반감기는 시노몰구스 원숭이에서 측정시에는 약 10일 내지 12일, 또는 인간에서 측정시에는 약 20일이다.
"힌지 영역"은 일반적으로 인간 IgG1의 Glu216 내지 Pro230의 스트레치로 정의된다 ([Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)]). 다른 IgG 이소형의 힌지 영역은 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 첫번째 및 마지막 시스테인 잔기를 IgG1 서열과 동일한 위치에 배치하여 정렬될 수 있다.
Fc 영역의 "하부 힌지 영역"은 통상적으로 힌지 영역에 바로 C-말단인 잔기의 스트레치, 즉 Fc 영역의 잔기 233 내지 239로서 정의된다. 본 발명 이전에는, FcγR 결합은 일반적으로 IgG Fc 영역의 하부 힌지 영역에서 아미노산 잔기에 의한 것이었다.
"C1q"는 이뮤노글로불린의 Fc 영역에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드이다. C1q는 2종의 세린 프로테아제, C1r 및 C1s와 함께 보체 의존적 세포독성 (CDC) 경로의 제1 성분인 복합체 C1을 형성한다. 인간 C1q는 예를 들어 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 퀴델(Quidel)로부터 구입할 수 있다.
용어 "결합 도메인"은 또 다른 분자에 결합하는 폴리펩티드의 영역을 지칭한다. FcR의 경우, 결합 도메인은 Fc 영역과의 결합을 담당하는 그의 폴리펩티드 쇄 (예를 들어, 그의 α 쇄)의 일부를 포함할 수 있다. 한 유용한 결합 도메인은 FcR α 쇄의 세포외 도메인이다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로 모노클로날 항체 (예를 들어, 전장 모노클로날 항체), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 항체 단편을 포함한다.
"단리된" 항체는 천연 환경 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 이것의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 연구, 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬 및 기타 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어 로우리(Lowry) 방법으로 측정시에 항체의 95 중량％를 초과하는 정도, 일부 실시양태에서는 99 중량％를 초과하는 정도로, (2) 예를 들어 스피닝 컵 시쿼네이터(spinning cupsequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로, 또는 (3) 예를 들어 쿠마시 블루(Coomassie blue) 또는 은 염색을 이용하여 환원 또는 비-환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균일한 것으로 나타날 정도로 정제된다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함하는데, 이는 항체 천연 환경의 1종 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 1회 이상의 정제 단계를 통해 제조될 것이다.
"천연 항체"는 일반적으로 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결부의 수는 다양한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 그 뒤에는 많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에서의 가변 도메인 (VL) 및 다른쪽 말단에서의 불변 도메인을 가지며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다.
용어 "불변 도메인"은 항원 결합 부위를 함유하는 이뮤노글로불린의 다른 부분인 가변 도메인에 비해 보다 보존된 아미노산 서열을 갖는 이뮤노글로불린 분자의 일부를 지칭한다. 불변 도메인은 중쇄의 CH1, CH2 및 CH3 도메인 및 경쇄의 CHL 도메인을 함유한다.
항체의 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단 도메인을 지칭한다. 중쇄의 가변 도메인은 "VH"로서 지칭될 수 있다. 경쇄의 가변 도메인은 "VL"로서 지칭될 수 있다. 이들 도메인은 일반적으로 항체의 가장 가변적인 부분이고, 항원 결합 부위를 함유한다.
용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분들이 항체들 사이에서 광범위한 서열 상이성을 나타낸다는 사실을 지칭하고, 각 특정 항체의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에서 사용된다. 그러나, 가변성이 항체 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이것은 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 둘다에서 초가변 영역 (HVR)이라 불리는 3개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 주로 베타-시트 형태를 취하며 3개의 HVR에 의해 연결되어 있는 4개의 FR을 포함하는데, 이것은 베타 시트 구조를 연결하고, 일부 경우에는 상기 베타 시트 구조의 일부를 형성하는 루프를 형성한다. 각 쇄에서의 HVR들은 FR 영역에 의해 근접하게 위치되어 있고, 다른 쇄로부터의 HVR과 함께 항체의 항원 결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)] 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는데는 직접 관여하지 않지만, 항체-의존적 세포성 세포독성에서의 항체 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
임의의 척추동물 종의 항체 (이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 (κ) 및 람다 (λ)라고 불리는 2개의 분명하게 상이한 유형 중 하나로 배정될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 IgG "이소형" 또는 "하위클래스"는 그의 불변 영역의 화학적 및 항원성 특징으로 정의되는 임의의 하위클래스의 이뮤노글로불린을 의미한다.
중쇄 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체 (이뮤노글로불린)는 다양한 클래스로 배정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 이뮤노글로불린 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 하위클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 구조는 공지되어 있고, 일반적으로 예를 들어 문헌 [Abbas et al., Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)]에 기재되어 있다. 항체는 항체 및 1종 이상의 다른 단백질 또는 펩티드의 공유 또는 비-공유 결합에 의해 형성되는, 더 큰 융합 분자의 일부일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "IgG 하위클래스 변형"은 한 IgG 이소형의 1개의 아미노산을 상이한 정렬된 IgG 이소형에서의 상응하는 아미노산으로 전환시키는 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, EU 위치 296에서 IgG1은 티로신을 포함하고 IgG2는 페닐알라닌을 포함하기 때문에, IgG2에서의 F296Y 치환은 IgG 하위클래스 변형이라 고려된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "비-천연 발생 변형"은 이소형이 아닌 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, IgG 어느 것도 위치 332에서 글루탐산을 포함하지 않기 때문에, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4의 위치 332에서 글루탐산 (332E)으로의 치환은 비-천연 발생 변형이라 고려된다.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "온전한 항체"는 본원에서 구별없이 사용되며, 실질적으로 무손상 형태인 항체를 지칭한다. 상기 용어는 특히 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
본원의 목적상, "네이키드(naked) 항체"는 세포독성 부분 또는 방사선표지와 접합되지 않은 항체이다.
"항체 단편"은 바람직하게는 항원 결합 영역을 포함하는 무손상 항체의 일부를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 본원에 개시된 1개 이상의 Fc 영역 변형을 포함하는 Fc 영역 또는 Fc 영역의 일부를 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체를 파파인으로 소화시키면 "Fab" 단편이라 불리는 2개의 동일한 항원-결합 단편 (각각 단일 항원 결합 부위를 가짐) 및 나머지 "Fc" 단편 (이러한 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영함)이 생성된다. 펩신 처리하면, 2개의 항원 결합 부위를 갖고 항원과 여전히 가교 결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 한 실시양태에서, 2-쇄 Fv 종은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 비-공유 결합으로 단단하게 연결되어 있는 이량체로 이루어진다. 단일 쇄 Fv (scFv) 종에서, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인은 경쇄 및 중쇄가 2-쇄 Fv종에서와 유사한 "이량체" 구조로 결합할 수 있도록 가요성 펩티드 링커에 의해 공유 연결될 수 있다. 이러한 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 HVR은 상호작용하여 VH-VL 이량체 표면의 항원 결합 부위를 규정한다. 전체적으로, 6개의 HVR이 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 HVR만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.
Fab 단편은 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 함유하고, 또한 경쇄의 불변 도메인과 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 1개 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 수개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서, Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)에 유리 티올 기를 보유하는 Fab'에 대한 명칭이다. F(ab')2 항체 단편은 원래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인을 갖는, Fab' 단편들의 쌍으로서 생성되었다. 항체 단편의 기타 화학적 커플링 또한 공지되어 있다.
"단일 쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄 내에 존재하는, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, scFv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는, VH 도메인과 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. scFv를 검토하기 위해서는, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315]을 참조한다.
용어 "디아바디"는 동일 폴리펩티드 쇄 (VH-VL)로 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편을 지칭한다. 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써, 상기 도메인은 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원 결합 부위를 생성하게 된다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097, WO 1993/01161, [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)] 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]에 더욱 상세하게 기재되어 있다. 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody) 역시 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉, 이 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 돌연변이, 예를 들어 천연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 별개의 항체의 혼합물이 아니라는 것으로 나타낸다. 특정 실시양태에서, 이러한 모노클로날 항체는 전형적으로 표적에 결합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하고, 표적-결합 폴리펩티드 서열은 복수개의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 과정에 의해 수득되었다. 예를 들어, 선별 과정은 복수개의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론 또는 재조합 DNA 클론의 풀로부터 독특한 클론을 선별하는 것일 수 있다. 선별된 표적 결합 서열은 예를 들어 표적에 대한 친화도 개선, 표적 결합 서열의 인간화, 세포 배양물 중 이것의 생성 개선, 생체내 이것의 면역원성 감소, 다중특이적 항체의 생성 등을 위해 추가로 변경될 수 있고, 변경된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 모노클로날 항체임을 이해해야 한다. 상이한 결정자 (에피토프)에 대한 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정자에 대한 것이다. 모노클로날 항체 제제는 이것의 특이성에 추가하여 전형적으로 다른 이뮤노글로불린으로 오염되지 않았다는 점에서 유리하다.
수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 다양한 기술, 예를 들어 하이브리도마 방법 (예를 들어, 하기 문헌 참조:
Figure pat00002
재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조), 파지-디스플레이 기술 (예를 들어, 하기 문헌 참조:
Figure pat00003
및 인간 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌 또는 유전자의 일부 또는 전부를 갖는 동물에서 인간 또는 인간-유사 항체를 생성하는 기술 (예를 들어, 하기 문헌 참조:
Figure pat00004
로 제조될 수 있다.
구체적으로, 본원에서의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄 (들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체, 및 또한 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 및 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)] 참조). 키메라 항체는 항체의 항원-결합 영역이 예를 들어 짧은꼬리(macaque) 원숭이를 관심 항원으로 면역화하여 생성된 항체로부터 유래되는 프라이메이티지드(PRIMATIZED)® 항체를 포함한다.
비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 수용자의 HVR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 HVR의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 FR 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 증진되도록 이루어질 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대하여는 예를 들어 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr.Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 문헌 [Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma ＆ Immunol. 1:105-115 (1998)], [Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)], [Hurle and Gross, Curr.Op. Biotech. 5:428-433 (1994)] 및 미국 특허 번호 6,982,321 및 7,087,409를 참조한다.
"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외한다. 인간 항체는 파지-디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계 공지의 다양한 기술을 이용하여 생성될 수 있다 ([Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)], [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]). 또한, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)], [Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]에 기재된 방법도 인간 모노클로날 항체의 제조에 이용가능하다. 또한, 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr.Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)]을 참조한다. 인간 항체는 항원 시험접종에 반응하여 이러한 항체를 생성하도록 변형되었으나 내인성 유전자좌는 무력화시킨 트랜스제닉 동물, 예를 들어 면역화된 제노마우스(xenomice)에게 항원을 투여하여 제조될 수 있다 (예를 들어, 제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술에 관한 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 참조). 또한, 예를 들어 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체에 관한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]도 참조한다.
"종-의존적 항체"는 제1 포유동물 종으로부터의 항원에 대한 결합 친화도가 제2 포유동물 종으로부터의 상기 항원의 상동체에 대한 결합 친화도보다 더 강력한 항체이다. 통상적으로, 종-의존성 항체는 인간 항원에 "특이적으로 결합" (즉, 결합 친화도 (Kd) 값이 약 1×10-7 M 이하, 바람직하게는 약 1×10-8 M 이하, 가장 바람직하게는 약 1×10-9 M 이하)하지만, 제2의 비-인간 포유동물 종으로부터의 상기 항원의 상동체에 대한 결합 친화도는 인간 항원에 대한 결합 친화도보다 적어도 약 50배 또는 적어도 약 500배 또는 적어도 약 1,000배 더 약하다. 종-의존적 항체는 상기 정의된 바와 같은 임의의 다양한 유형의 항체일 수 있으나, 바람직하게는 인간화 또는 인간 항체이다.
용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"가 본원에서 사용되는 경우, 이것은 서열에서 초가변이고/이거나 구조적으로 규정된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR - VH 내에 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR 중에서 가장 높은 다양성을 나타내고, 특히 H3은 항체에 정밀한 특이성을 부여하는데 특유의 역할을 수행한다고 여겨진다. 예를 들어, 문헌 [Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000)], [Johnson and Wu,in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., HumanPress, Totowa, NJ, 2003)]을 참조한다. 실제로, 중쇄만으로 이루어진 천연 발생 카멜리드(camelid) 항체는 경쇄의 부재하에 기능적이고 안정적이다. 예를 들어, 문헌 [Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993)], [Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)]을 참조한다.
많은 HVR 설명이 사용되고 있고 본원에 포함된다. 카바트 상보성 결정 영역 (CDR)은 서열 가변성을 기초로 하며, 가장 흔히 사용된다 ([Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)]). 대신, 코티아(Chothia)는 구조적 루프의 위치를 표시한다 ([Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]). AbM HVR은 카바트 HVR과 코티아 구조 루프 사이의 절충안을 나타내고, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에 의해 사용된다. "접촉" HVR은 이용가능한 복합 결정 구조의 분석을 기초로 한다. 이들 HVR 각각으로부터의 잔기가 다음에 제시된다:
Figure pat00005
HVR은 다음과 같이 "연장된 HVR"을 포함할 수 있다: VL에서 24-36 또는 24-34 (L1), 46-56 또는 50-56 (L2) 및 89-97 또는 89-96 (L3), 및 VH에서 26-35 (H1), 50-65 또는 49-65 (H2) 및 93-102, 94-102, 또는 95-102 (H3). 가변 도메인 잔기는 각각의 상기 정의에 대해 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 번호매김된다.
"프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같은 HVR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.
용어 "카바트에서와 같은 가변 도메인 잔기 번호매김" 또는 "카바트에서와 같은 아미노산 위치 번호매김" 및 이들의 변형 형태는 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서 항체 캄필레이션(compilation)의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 사용된 번호매김 시스템을 지칭한다. 이러한 번호매김 시스템을 이용하여, 실제 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 HVR의 단축 또는 이것으로의 삽입에 상응하는 보다 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 H2의 잔기 52 후에 단일 아미노산 삽입 (카바트에 따른 잔기 52a), 및 중쇄 FR 잔기 82 후에 삽입된 잔기 (예를 들어, 카바트에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 카바트 번호매김은 항체 서열의 상동성 영역에서 "표준" 카바트 번호매김 서열과 정렬함으로써 주어진 항체에 대하여 결정할 수 있다.
카바트 번호매김 시스템은 일반적으로 가변 도메인 내의 잔기 (대략 경쇄의 잔기 1-107 및 중쇄의 잔기 1-113)를 지칭할 때 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)]). "EU 번호매김 시스템" 또는 "EU 지수"는 일반적으로 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역 내의 잔기를 지칭할 때 사용된다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 보고된 EU 지수). "카바트에서와 같은 EU 지수"는 인간 IgG1 EU 항체의 잔기 번호매김을 지칭한다. 본원에서 달리 언급되지 않는다면, 항체 가변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 카바트 번호매김 시스템에 의한 잔기 번호매김을 의미한다. 본원에서 달리 언급되지 않는다면, 항체 불변 도메인 내의 잔기 번호에 대한 언급은 EU 번호매김 시스템에 의한 잔기 번호매김을 의미한다 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2006073941 참조).
"친화도 성숙" 항체는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체에 비해 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는, 1개 이상의 HVR에 1개 이상의 변경을 갖는 항체이다. 한 실시양태에서, 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대한 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 갖는다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 특정 절차에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]에는 VH- 및 VL-도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙이 기재되어 있다. HVR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 예를 들어 하기 문헌에 기재되어 있다:
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"차단" 항체 또는 "길항제" 항체는 이것이 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 항체이다. 특정 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 실질적으로 또는 완전히 억제한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "효능제 항체"는 관심 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능적 활성을 부분적으로 또는 완전히 모방하는 항체이다.
"성장 억제" 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 저해하거나 감소시키는 항체이다.
항체 "이펙터 기능"은 항체의 Fc 영역 (천연 서열 Fc 영역 또는 아미노산 서열 변이체 Fc 영역)에 기인하는 생물학적 활성을 지칭하고, 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC), 식작용, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서의 용어 "Fc 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역, 예를 들어 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역을 정의하기 위하여 사용된다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226 또는 Pro230의 아미노산 잔기로부터 이것의 카르복실 말단까지의 스트레치인 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 번호매김 시스템에 따른 잔기 447)은 예를 들어 항체의 생성 또는 정제 동안 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 조작으로 제거될 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 제거되지 않는 항체 집단, 및 K447 잔기가 존재하는 항체와 존재하지 않는 항체들의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 2개의 불변 도메인 CH2 및 CH3을 포함한다.
인간 IgG Fc 영역의 "CH2 도메인" ("Cγ2" 도메인이라 지칭되기도 함)은 통상적으로 대략 아미노산 231에서 대략 아미노산 340까지에 이른다. CH2 도메인은 또 다른 도메인과 근접하게 쌍을 이루지 않는다는 점에서 독특하다. 오히려, 2개의 N-연결된 분지형 탄수화물 쇄가 무손상 천연 IgG 분자의 2개의 CH2 도메인 사이에 배치된다. 탄수화물이 도메인-도메인 쌍형성에 대한 치환물을 제공할 수 있고 CH2 도메인의 안정화를 도울 수 있다고 추정되었다 ([Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)]).
"CH3 도메인"은 Fc 영역 내의 CH2 도메인에 대해 C-말단인 잔기들의 스트레치 (즉, IgG의 대략 아미노산 잔기 341에서 대략 아미노산 잔기 447까지)를 포함한다.
"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 "이펙터 기능"을 보유한다. 예시적인 "이펙터 기능"은 Fc 수용체 결합, C1q 결합, CDC, ADCC, 식작용, 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체, BCR)의 하향조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것이 요구되고, 다양한 검정을 이용하여 평가할 수 있다.
"천연 서열 Fc 영역"은 자연계에서 발견된 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 천연 서열 인간 Fc 영역은 천연 서열 인간 IgG1 Fc 영역 (비-A 및 A 동종이형), 천연 서열 인간 IgG2 Fc 영역, 천연 서열 인간 IgG3 Fc 영역 및 천연 서열 인간 IgG4 Fc 영역 및 또한 이것들의 천연 발생 변이체를 포함한다 (예를 들어, 서열 11 내지 서열 17 참조).
"변이체 Fc 영역"은 1개 이상의 아미노산 변형에 의해 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 1개 이상의 아미노산 치환(들)에 의해 천연 서열 Fc 영역과는 상이한 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 야생형 IgG 또는 야생형 항체의 Fc 영역과 비교하여 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 야생형 항체의 Fc 영역에서 2개 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 야생형 항체의 Fc 영역에서 3개 이상의 아미노산 치환을 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 본원에 기재된 Fc 영역 아미노산 치환을 적어도 1개, 2개 또는 3개 또는 그보다 많은 수로 갖는다. 특정 실시양태에서, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80％의 상동성을 가질 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 90％의 상동성을 가질 것이다. 특정 실시양태에서, 본원에서의 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 95％의 상동성을 가질 것이다.
"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체 (감마 수용체)에 결합하는 것이며, FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위클래스의 수용체, 예를 들어 이들 수용체의 대립유전자 변이체 및 다르게 스플라이싱된 형태를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하고, 이것들은 주로 그의 세포질 도메인에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 활성화 모티프 (ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기재의 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다 (예를 들어, 문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참조). FcR은 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)], [Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)] 및 [de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에서 검토된다. 추후로 확인될 것을 포함하는 기타 FcR이 본원의 용어 "FcR"에 포함된다.
용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 또한 모체 IgG의 태아로의 전달 ([Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)]) 및 이뮤노글로불린의 항상성 조절을 담당하는 신생아 수용체 FcRn을 포함한다. FcRn에 대한 결합을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)], [Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)], [Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)], WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참조).
인간 FcRn 고친화도 결합 폴리펩티드의 생체내 또는 혈청 반감기는 예를 들어 변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드를 투여한 트랜스제닉 마우스, 인간 또는 비-인간 영장류에서 검정할 수 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Petkova et al., International Immunology 18(12):1759-1769 (2006)]을 참조한다.
"인간 이펙터 세포"는 1종 이상의 FcR을 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 특정 실시양태에서, 상기 세포는 적어도 FcγRIII를 발현하고 ADCC 이펙터 기능(들)을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈 단핵 세포 (PBMC), 천연 킬러 (NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다. 이펙터 세포는 천연 공급원, 예를 들어 혈액으로부터 단리될 수 있다.
"항체 의존적 세포 매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, NK 세포, 호중구 및 대식세포)상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)와 결합된 분비형 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있게 하고, 이후에 표적 세포를 세포독소로 사멸시킬 수 있게 하는 세포독성의 형태를 지칭한다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해서, 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337 또는 미국 특허 번호 6,737,056 (Presta)에 기재된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 PBMC 및 NK 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS (USA) 95:652-656 (1998)]에 개시된 바와 같은 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다.
"보체-의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재하의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적인 보체 경로의 활성화는 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)이 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 하위클래스의 항체)에 결합함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]에 기재되어 있는 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다. 변경된 Fc 영역 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 변이체 (변이체 Fc 영역을 갖는 폴리펩티드) 및 증가되거나 저하된 C1q 결합 능력을 갖는 폴리펩티드 변이체는 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551 B1 및 WO 1999/51642에 기재되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Idusogie et al., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]도 참조한다.
"변경된" FcR 결합 친화도 또는 ADCC 활성을 갖는 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교해서 증진되거나 감소된 FcR 결합 활성 및/또는 ADCC 활성을 갖는 것이다. FcR에 대한 "증가된 결합을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드보다 더 우수한 친화도로 1종 이상의 FcR과 결합한다. FcR에 대한 "감소된 결합을 나타내는" 폴리펩티드 변이체는 모 폴리펩티드보다 더 낮은 친화도로 1종 이상의 FcR과 결합한다. FcR에 대해 감소된 결합을 나타내는 이러한 변이체는 FcR에 대한 주목할만한 결합이 거의 없거나 전혀 없을 수 있고, 예를 들어 천연-서열 IgG Fc 영역에 비해 FcR에 대한 결합이 0 내지 20％이다.
모 항체보다 "인간 이펙터 세포의 존재하에 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)을 보다 효과적으로 매개하는" 폴리펩티드 변이체는 검정에 사용된 폴리펩티드 변이체 및 모 항체의 양이 본질적으로 동일한 경우에 시험관내 또는 생체내 ADCC를 매개함에 있어서 실질적으로 보다 효과적인 것이다. 일반적으로, 이러한 변이체는 본원에 개시된 바와 같은 시험관내 ADCC 검정으로 확인될 것이지만, 예를 들어 동물 모델 등에서 ADCC 활성을 결정하는 다른 검정 또는 방법도 고려된다.
"결합 친화도"는 일반적으로 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비-공유 상호작용의 총 합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는다면, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 내재적 결합 친화도를 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 결합 상수 (Ka)와 상호적인 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 포함하는 당업계 공지의 통상의 방법으로 측정할 수 있다. 저친화도 항체는 일반적으로 항원과 서서히 결합하고/하거나 쉽게 해리되는 경향이 있는 반면, 고친화도 항체는 일반적으로 항원과 보다 신속하게 결합하고/하거나 보다 오랫 동안 결합된 상태를 유지하는 경향이 있다. 결합 친화도를 측정하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있고, 본 발명의 목적상, 이것들 중 임의의 방법이 사용될 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적이고 예시적인 실시양태를 아래에 기재한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 "KD", "Kd", "Kd" 또는 "Kd 값"은 25℃에서 약 10 반응 단위 (RU)의 고정된 항원 CM5 칩으로 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 미국 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용한 표면 플라즈몬 공명 검정으로 측정한다. 간략하게 설명하면, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코아, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 ㎍/mL (약 0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 ㎕/분의 유속으로 주입한다. 항원 주입 후, 미반응 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민을 주입한다. 역학 측정을 위해, 폴리펩티드, 예를 들어 전장 항체의 계열 희석물을 대략 25 ㎕/분의 유속으로 25℃에서 0.05％ 트윈-20(TWEEN-20)™ 계면활성제를 함유하는 PBS (PBST) 중에서 주입한다. 결합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)는 결합 및 해리 센서그램을 동시 핏팅함으로써 단순 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (BIACORE® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비율로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 결합속도(on-rate)가 106 M-1s- 1를 초과하는 경우, 결합속도는 분광계, 예를 들어 정지 유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭(quenching) 기술을 이용하여 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 "결합속도", "결합의 속도", "결합 속도" 또는 "kon"은 또한 BIACORE®-2000 또는 BIACORE®-3000 시스템 (비아코어, 인크., 미국 뉴욕주 피스카타웨이)을 사용하여 상기한 바와 같이 결정할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 유사한" 또는 "실질적으로 동일한"은 당업자가 2개의 수치값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 생물학적 및/또는 통계적 유의성이 거의 또는 전혀 없는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 유사성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 값의 함수로서 예를 들어 약 50％ 미만, 약 40％ 미만, 약 30％ 미만, 약 20％ 미만 및/또는 약 10％ 미만이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "실질적으로 감소된" 또는 "실질적으로 상이한"은 당업자가 2개의 수치값 (예를 들어, Kd 값)에 의해 측정된 생물학적 특징과 관련하여 이들 2개 값 사이의 차이를 통계적 유의성이 있는 것으로 간주할 정도의, 상기 값 사이의 충분히 높은 정도의 차이를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 상기 2개 값 사이의 차이는 참조/비교 분자에 대한 값의 함수로서 예를 들어 약 10％ 초과, 약 20％ 초과, 약 30％ 초과, 약 40％ 초과 및/또는 약 50％ 초과이다.
본원의 목적상, "수용자 인간 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 VL 또는 VH 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수도 있고, 또는 기존의 아미노산 서열 변화를 함유할 수도 있다. 일부 실시양태에서, 기존의 아미노산 변화의 수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 또는 2 이하이다. 기존의 아미노산 변화가 VH에 존재하는 경우, 바람직하게는 이들 변화가 위치 71H, 73H 및 78H 중의 단지 3개, 2개 또는 1개에서만 일어나는 경우, 예를 들어 이들 위치에서의 아미노산 잔기는 71A, 73T 및/또는 78A일 수 있다. 한 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열 면에서 동일하다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선별시 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선별은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.
"VH 하위군 III 컨센서스 프레임워크"는 카바트 등의 가변 중쇄 하위군 III 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다.
"VL 하위군 I 컨센서스 프레임워크"는 카바트 등의 가변 경쇄 카파 하위군 I 내의 아미노산 서열로부터 수득된 컨센서스 서열을 포함한다.
"정제된"은 분자가 이것을 함유하는 샘플의 적어도 95 중량％, 또는 적어도 98 중량％의 농도로 샘플 내에 존재함을 의미한다.
"단리된" 핵산 분자는 예를 들어 그의 천연 환경에서 그와 통상적으로 회합되는 1종 이상의 다른 핵산 분자로부터 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 그 핵산 분자를 통상적으로 발현하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 추가로 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외 존재하거나 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 그에 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 한 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 추가의 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입시에 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터는 벡터가 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터", 또는 단순히 "재조합 벡터"라 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에 구별없이 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 중합체를 지칭하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 중합체의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비-뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 합성 후에 생성된 변형(들), 예를 들어 표지와의 접합을 포함할 수 있다. 다른 유형의 변형은 예를 들어 "캡(cap)", 1개 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 대전되지 않은 연결부 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 대전된 연결부 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)를 갖는 변형, 팬던트 잔기, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 변형, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등)를 갖는 변형, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사능 금속, 붕소, 산화 금속 등)를 함유하는 변형, 알킬레이터를 함유하는 변형, 변형된 연결부 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)를 갖는 변형, 및 또한 미변형 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 추가로, 당 내에 통상적으로 존재하는 임의의 히드록실기가 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기로 대체되거나, 표준 보호기로 보호되거나, 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결부가 제조되도록 활성화되거나, 또는 고체 또는 반-고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 또는 아민 또는 1개 내지 20개 탄소 원자의 유기 캡핑기 잔기로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 표준 보호기로 유도체화될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 당업계에 일반적으로 공지된 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴-, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 유사체 및 염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결부가 대안적인 연결부로 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈") (여기서, 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H이거나, 또는 에테르 (-O-) 연결부를 임의로 함유하는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 (1개 내지 20개의 C)이거나, 또는 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬임)로 대체된 실시양태를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결부가 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 일반적으로 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로 길이가 약 200개 미만의 뉴클레오티드 (반드시 이러한 것은 아님)인 짧은, 일반적으로 단일 가닥인 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 상호 배타적 의미를 갖는 것이 아니다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.
표현 "제어 서열"은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 지칭한다. 원핵생물에 적합한 제어 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로는 오퍼레이터 서열 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 전서열(presequence) 또는 분비 리더의 DNA는 폴리펩티드에 대한 DNA가 상기 폴리펩티드의 분비에 관여하는 전단백질(preprotein)로서 발현되는 경우에 상기 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미칠 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이며, 리보솜 결합 부위는 코딩 서열의 번역을 용이하게 하도록 배치될 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서의 라이게이션을 통해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 구별없이 사용되고, 모든 이러한 명칭은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 단어는 1차 대상 세포 및 전달 횟수와는 상관없이 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 모든 자손은 의도적이거나 의도하지 않은 돌연변이로 인해 DNA 내용물이 정확히 일치하지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 포함된다. 별개의 명칭이 의도되는 경우, 이는 문맥으로부터 명백할 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "코돈 세트"는 원하는 변이체 아미노산을 코딩하는데 사용되는 여러가지 뉴클레오티드 트리플렛 서열 세트를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드 세트는, 예를 들어 고체 상 합성에 의해 합성될 수 있고, 코돈 세트에 의해 제공되는 뉴클레오티드 트리플렛들의 모든 가능한 조합을 나타내며 원하는 군의 아미노산을 코딩할 서열을 포함한다. 코돈 명칭의 표준 형태는, 당업계에 공지되어 있으며 본원에 기재된 IUB 코드의 것이다. 코돈 세트는 전형적으로 3가지 대문자를 이탤릭체로, 예를 들어 NNK, NNS, XYZ, DVK 등으로 표시한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비-무작위 코돈 세트"는 이에 따라 본원에 기재된 바와 같은 아미노산 선택 기준을 부분적으로, 바람직하게는 완전하게 충족시키는 선택된 아미노산을 코딩하는 코돈 세트를 지칭한다. 특정 위치에서 선택된 뉴클레오티드 "동의성"을 갖는 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 TRIM 접근법 (문헌 [Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86], [Garrard ＆ Henner (1993) Gene 128:103])이 있다. 특정 코돈 세트를 갖는 이러한 올리고뉴클레오티드 세트는 시판 핵산 합성기 (예를 들어, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재의 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터 구입가능함)를 이용하여 합성할 수도 있고, 또는 구입 (예를 들어, 미국 메릴랜드주 로크빌 소재의 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)로부터 구입함)할 수도 있다. 따라서, 특정 코돈 세트를 갖는 합성된 올리고뉴클레오티드 세트는 전형적으로 상이한 서열을 갖는 복수개의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 그 차이는 전체 서열 내 코돈 세트에 의해 확립된다. 본 발명에 따라 사용된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 가변 도메인 핵산 주형과 혼성화될 수 있는 서열을 갖고, 또한 예를 들어 클로닝 목적에 유용한 제한 효소 부위를 포함할 수도 있지만 반드시 그러한 것은 아니다.
표현 "선형 항체"는 문헌 [Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062)]에 기재된 항체를 지칭한다. 간략하게 설명하면, 이들 항체는 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 한 쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 한 쌍의 병렬식 Fd 절편 (VH-CH1-VH-CH1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "라이브러리"는 복수개의 항체 또는 항체 단편 서열 (예를 들어, 본 발명의 변이체 IgG), 또는 이들 서열을 코딩하는 핵산을 지칭하며, 이 서열은 본 발명의 방법에 따라 이들 서열 내로 도입되는 변이체 아미노산의 조합에 있어서 상이하다.
"파지 디스플레이"는 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 필라멘트형 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 대형 라이브러리를 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열에 대해 신속하고 효율적으로 분류할 수 있다는 점에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 갖는 폴리펩티드를 찾기 위해서 수백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 이용되어 왔다. 다가 파지 디스플레이 방법은 필라멘트형 파지의 유전자 III 또는 유전자 VIII과의 융합을 통해 소형 무작위 펩티드 및 소형 단백질을 디스플레이하는데 이용되어 왔다 ([Wells and Lowman (1992) Curr.Opin. Struct. Biol. 3:355-362] 및 상기 문헌에서 인용된 참조문헌). 1가 파지 디스플레이에서는, 단백질 또는 펩티드 라이브러리를 유전자 III 또는 그의 일부와 융합시키고, 야생형 유전자 III 단백질의 존재하에 저수준으로 발현시켜 파지 입자가 상기 융합 단백질의 1개 카피를 디스플레이하거나 전혀 디스플레이하지 않도록 한다. 화합력 효과는 다가 파지에 비해 감소되기 때문에 분류는 내재적 리간드 친화도를 기준으로 하고 DNA 조작을 단순화시키는 파지미드 벡터를 사용한다 ([Lowman and Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216]).
"파지미드"는 박테리아 복제 기점, 예를 들어 ColE1, 및 박테리오파지의 유전자간 영역의 카피를 갖는 플라스미드 벡터이다. 파지미드는 필라멘트형 박테리오파지 및 람다형 박테리오파지를 비롯한 임의의 공지된 박테리오파지에서 사용될 수 있다. 이러한 플라스미드는 또한 일반적으로 항생제 내성에 대한 선별가능한 마커를 함유할 것이다. 이들 벡터 내로 클로닝된 DNA 절편은 플라스미드로서 증식될 수 있다. 이들 벡터를 보유하는 세포에 파지 입자의 생성에 필요한 모든 유전자가 제공되는 경우, 플라스미드의 복제 방식이 롤링 서클(rolling circle) 복제로 변화되어 플라스미드 DNA 및 패키지 파지 입자의 1개 가닥 카피를 생성시킨다. 파지미드는 감염성 또는 비-감염성 파지 입자를 형성할 수 있다. 상기 용어는 유전자 융합체로서 이종 폴리펩티드 유전자에 연결된 파지 외피 단백질 유전자 또는 그의 단편을 함유하여 상기 이종 폴리펩티드가 파지 입자의 표면상에 디스플레이 되도록 하는 파지미드를 포함한다.
용어 "파지 벡터"는 이종 유전자를 함유하고 복제할 수 있는 이중 가닥 복제 형태의 박테리오파지를 의미한다. 파지 벡터는 파지 복제와 파지 입자 형성을 허용하는 파지 복제 기점을 갖는다. 파지는 바람직하게는 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13, f1, fd, Pf3 파지 또는 그의 유도체, 또는 람다형 파지, 예를 들어 람다, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434 등 또는 그의 유도체이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "용매 접근가능한 위치"는 용매 접근 및/또는 분자, 예컨대 항체-특이적 항원과의 접촉에 잠재적으로 이용가능한 바와 같이 구조에 기초하여 항체 또는 항원 결합 단편의 구조 및/또는 모델화 구조의 앙상블을 결정하는 원시 항체 또는 항원 결합 단편의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 내의 아미노산 잔기 위치를 지칭한다. 이들 위치는 전형적으로 CDR 내 및 단백질 외부에서 발견된다. 본원에 정의된 바와 같이, 항체 또는 항원 결합 단편의 용매 접근가능한 위치는 당업계에 공지된 임의의 수많은 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, 용매 접근가능한 위치는 항체의 3차원 모델로부터의 좌표를 사용하여, 바람직하게는 InsightII 프로그램 (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 액셀리스(Accelrys))과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 결정된다. 용매 접근가능한 위치는 또한 당업계에 공지된 알고리즘을 이용하여 결정될 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Lee and Richards (1971) J. Mol. Biol. 55, 379] 및 [Connolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548]). 용매 접근가능한 위치의 결정은 항체로부터 수득된 단백질 모델링 및 3차원 구조 정보에 적합한 소프트웨어를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 목적에 이용될 수 있는 소프트웨어는 SYBYL 바이오폴리머(Biopolymer) 모듈 소프트웨어 (트리포스 어소시에이트스(Tripos Associates))를 포함한다. 일반적으로, 알고리즘 (프로그램)이 사용자 입력 크기 파라미터를 필요로 하는 경우에 계산에 사용된 프로브의 "크기"는 반경 약 1.4 옹스트롬 이하로 설정된다. 또한, 개인용 컴퓨터용 소프트웨어를 사용하여 용매 접근가능한 영역 및 구역 공법을 결정하는 것은 문헌 [Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4): 377-386]에 기재되어 있다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성(％)"은 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성(％) 달성을 위해 갭(gap)을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율(％)로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성(％)을 결정하기 위한 정렬은 당업계 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈린(Megalign) (디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교될 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 서열 정렬에 적절한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성(％) 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 원시 코드는 미국 저작권청(Copyright Office) (미국 20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되었고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재의 제넨테크, 인크.를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 원시 코드로부터 컴파일될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작업 시스템, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 사용되도록 컴파일되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성(％) (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, 주어진 아미노산 서열 B와, 또는 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성(％)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 × X/Y의 비율
여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 스코어링된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에는 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성(％)이 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성(％)과 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 아미노산 서열 동일성(％) 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 바로 앞 단락에서 기재한 바와 같이 구한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VEGF" 또는 "VEGF-A"는 문헌 [Leung et al. (1989) Science 246:1306] 및 [Houck et al. (1991) Mol. Endocrin., 5:1806]에 기재된 바와 같은 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련 121-, 189- 및 206-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 그의 천연 발생 대립유전자 및 프로세싱된 형태를 지칭한다. 용어 "VEGF"는 또한 비-인간 종, 예컨대 마우스, 래트 또는 영장류로부터의 VEGF를 지칭한다. 때때로, 특정 종으로부터의 VEGF는 인간 VEGF에 대한 hVEGF, 뮤린 VEGF에 대한 mVEGF 등과 같은 용어로 표시된다. 용어 "VEGF"는 또한 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 아미노산 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 말단절단 형태를 지칭하는데 사용된다. VEGF의 임의의 이러한 형태들에 대한 언급은 본원에서 예를 들어 "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)", "VEGF-A109" 또는 "VEGF165"에 의해 확인될 수 있다. "말단절단형" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에 표시된 바와 같이 번호매김된다. 예를 들어, 말단절단형 천연 VEGF에서의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한 천연 VEGF에서의 위치 17 (메티오닌)이다. 말단절단형 천연 VEGF는 KDR 및 Flt-1 수용체에 대해 천연 VEGF와 유사한 결합 친화도를 갖는다.
"VEGF 길항제"는 1종 이상의 VEGF 수용체에 대한 결합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 VEGF 활성을 중화하거나 차단하거나 억제하거나 없애거나 감소시키거나 방해할 수 있는 분자를 지칭한다. VEGF 길항제는 항-VEGF 항체 및 그의 항원-결합 단편, VEGF에 특이적으로 결합함으로써 1종 이상의 수용체에 대한 그의 결합을 봉쇄시키는 수용체 분자 및 유도체, 항-VEGF 수용체 항체, VEGF 수용체 길항제, 예컨대 VEGFR 티로신 키나제의 소분자 억제제, 및 VEGF에 결합하는 면역어드헤신, 예컨대 VEGF Trap을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VEGF 길항제"는 구체적으로 항체, 항체 단편, 기타 결합 폴리펩티드, 펩티드 및 비-펩티드 소분자를 비롯한, VEGF에 결합하여 VEGF 활성을 중화하거나 차단하거나 억제하거나 없애거나 감소시키거나 방해할 수 있는 분자를 포함한다. 따라서, 용어 "VEGF 활성"은 구체적으로 VEGF의 VEGF 매개 생물학적 활성을 포함한다.
VEGF 폴리펩티드과 관련한 용어 "생물학적 활성" 및 "생물학적으로 활성인" 또는 "VEGF 활성"은 전장 및/또는 말단절단형 VEGF와 관련이 있는 물리/화학적 특성 및 생물학적 기능을 지칭한다. 특정 실시양태에서, VEGF 활성은 혈관신생을 유도 및/또는 자극 및/또는 촉진시킨다. 특정 실시양태에서, VEGF 활성은 신생혈관증식을 유도 및/또는 자극 및/또는 촉진시킨다. 특정 실시양태에서, VEGF 활성은 혈관 투과성을 유도 및/또는 조정한다. 특정 실시양태에서, VEGF 활성은 내피 세포 이동 및/또는 내피 세포 증식을 유도 및/또는 자극 및/또는 촉진시킨다.
항-VEGF 중화 항체는 누드 마우스에서 다양한 인간 종양 세포주의 성장을 저해하고 ([Kim et al., Nature 362:841-844 (1993)], [Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995)], [Borgstroem et al., Cancer Res. 56:4032-4039 (1996)], [Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-924 (1996)]), 또한 허혈성 망막 장애 모델에서 안내 혈관생성을 억제한다 ([Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996)]).
용어 "항-VEGF 항체" 또는 "VEGF에 결합하는 항체"는 충분한 친화도 및 특이성으로 VEGF와 결합할 수 있는 항체를 지칭하며, 이러한 항체는 VEGF를 표적화하는데 있어서의 진단제 및/또는 치료제로서 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 상태를 표적화하고 방해하는데 있어서의 치료제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,582,959, 6,703,020, WO 98/45332, WO 96/30046, WO 94/10202, WO 2005/044853, EP 0666868B1, 미국 특허 출원 20030206899, 20030190317, 20030203409, 20050112126, 20050186208 및 20050112126, [Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)] 및 WO 2005012359를 참조한다. 선별된 항체는 통상적으로 VEGF에 대해 충분히 강력한 결합 친화도를 가질 것이다. 예를 들어, 항체는 100 nM 내지 1 pM 사이의 Kd 값으로 hVEGF에 결합할 수 있다. 항체 친화도는, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기재의 검정 (예를 들어, PCT 출원 공개 번호 WO 2005/012359에 기재된 바와 같은 BIAcore 검정), 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 및 경쟁 검정 (예를 들어, RIA)으로 결정할 수 있다. 상기 항체를 대상으로 다른 생물학적 활성 검정을 수행하여, 예를 들어 치료제로서의 그의 효과를 평가할 수 있다. 이러한 검정은 당업계에 공지되어 있고, 표적 항원 및 항체의 의도된 용도에 따라 달라진다. 이것의 예는 HUVEC 억제 검정, 종양 세포 성장 억제 검정 (예를 들어, WO 89/06692에 기재된 바와 같음), 항체-의존적 세포의 세포독성 (ADCC) 및 보체-매개 세포독성 (CDC) 검정 (미국 특허 5,500,362) 및 효능 활성 또는 조혈 검정 (WO 95/27062 참조)을 포함한다. 항-VEGF 항체는 통상적으로 다른 VEGF 상동체, 예컨대 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 또는 VEGF-E 또는 기타 성장 인자, 예컨대 PlGF, PDGF 또는 bFGF 어느 것에도 결합하지 않을 것이다. 한 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생성된 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체, 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체 (문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599] 참조), 예를 들어 (이에 제한되지 않음) "베바시주맙 (BV)" (또한 "rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴®"이라고도 공지됨)이라고 공지된 항체를 포함한다. 아바스틴®은 현재 시판되고 있다. 베바시주맙은 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크 영역, 및 인간 VEGF가 그의 수용체에 결합하는 것을 차단하는 뮤린 항체 A.4.6.1로부터의 항원-결합 상보성 결정 영역을 포함한다. 베바시주맙의 아미노산 서열의 대략 93％ (대부분의 프레임워크 영역을 포함함)는 인간 IgG1로부터 유래되고, 상기 서열의 약 7％는 A4.6.1로부터 유래된다. 베바시주맙은 분자량 약 149,000 달톤이고 글리코실화된다. 베바시주맙 및 기타 인간화 항-VEGF 항체는 2005년 2월 26일자로 허여된 미국 특허 번호 6,884,879에 추가로 기재되어 있다. 추가의 항-VEGF 항체는 PCT 출원 공개 번호 WO 2005/012359에 기재된 바와 같은 G6 또는 B20 시리즈 항체 (예를 들어, G6-23, G6-31, B20-4.1)를 포함한다. 추가의 바람직한 항체에 대해서는 하기 문헌을 참조한다:
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본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "B20 시리즈 폴리펩티드"는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. B20 시리즈 폴리펩티드는 미국 공개 번호 20060280747, 미국 공개 번호 20070141065 및/또는 미국 공개 번호 20070020267 (이들 특허 출원서의 내용은 명백하게 본원에 참고로 포함됨)에 기재된 B20 항체 또는 B20-유래의 항체의 서열로부터 유래된 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, B20 시리즈 폴리펩티드는 미국 공개 번호 20060280747, 미국 공개 번호 20070141065 및/또는 미국 공개 번호 20070020267에 기재된 바와 같은 B20-4.1이다. 또 다른 실시양태에서, B20 시리즈 폴리펩티드는 PCT 공개 번호 WO 2009/073160에 기재된 B20-4.1.1이고, 상기 문헌의 전체 개시내용은 명백하게 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "G6 시리즈 폴리펩티드"는 VEGF에 결합하는 항체를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. G6 시리즈 폴리펩티드는 미국 공개 번호 20060280747, 미국 공개 번호 20070141065 및/또는 미국 공개 번호 20070020267에 기재된 G6 항체 또는 G6-유래의 항체의 서열로부터 유래된 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 미국 공개 번호 20060280747, 미국 공개 번호 20070141065 및/또는 미국 공개 번호 20070020267에 기재된 바와 같이, G6 시리즈 폴리펩티드는 G6-8, G6-23 및 G6-31을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"혈관신생 인자 또는 작용제"는 혈관의 발달을 자극하는, 예를 들어 혈관신생, 내피 세포 성장, 혈관의 안정성 및/또는 혈관형성(vasculogenesis) 등을 촉진하는 성장 인자이다. 예를 들어, 혈관신생 인자는 예를 들어 VEGF 및 VEGF 부류 구성원 (VEGF-B, VEGF-C 및 VEGF-D), PlGF, PDGF 부류, 섬유아세포 성장 인자 부류 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴(Angiopoietin)), 에프린, 델타-유사 리간드 4 (DLL4), Del-1, 섬유아세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 및 염기성 (bFGF), 폴리스타틴, 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 간세포 성장 인자 (HGF)/분산 인자 (SF), 인터루킨-8 (IL-8), 렙틴, 미드킨, 뉴로필린, 태반 성장 인자, 혈소판-유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판 유래 성장 인자, 특히 PDGF-BB 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀 (PTN), 프로그래눌린, 프롤리페린, 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이것은 또한 창상 치유를 가속화하는 인자, 예컨대 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), CTGF 및 이것의 부류의 구성원, 및 TGF-알파 및 TGF-베타도 포함한다. 예를 들어, 하기 문헌을 참조한다:
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"항-혈관신생제" 또는 "혈관신생 억제제"는 혈관신생, 혈관형성, 또는 바람직하지 않은 혈관 투과성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 적은 분자량의 물질, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 억제성 RNA (RNAi 또는 siRNA)), 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 이것들의 접합체 또는 융합 단백질을 지칭한다. 항-혈관신생제는 혈관신생 인자 또는 그의 수용체에 결합하고 그의 혈관신생 활성을 차단하는 작용제를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 항-혈관신생제는 상기 정의된 바와 같은 혈관신생제에 대한 항체 또는 기타 길항제, 예를 들어 VEGF-A 또는 VEGF-A 수용체 (예를 들어, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체, 항-PDGFR 억제제, 예컨대 글리벡(GLEEVEC)® (이마티닙 메실레이트), VEGF 수용체 신호전달을 차단하는 소분자 (예를 들어, PTK787/ZK2284, SU6668, 수텐트(SUTENT)®/SU11248 (수니티닙 말레이트), AMG706, 또는 예를 들어 국제 특허 출원 WO 2004/113304에 기재된 것들)이다. 항-혈관신생제는 또한 천연 혈관신생 억제제, 예를 들어 안지오스타틴, 엔도스타틴 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39], [Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179] (예를 들어, 악성 흑색종에서의 항-혈관신생 요법을 기재한 표 3), [Ferrara ＆ Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364], [Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556] (예를 들어, 공지의 항-혈관신생 인자를 기재한 표 2) 및 [Sato (2003) Int. J. Clin. dOncol. 8:200-206] (예를 들어, 임상 실험에 사용되는 항-혈관신생제를 기재한 표 1)을 참조한다.
"장애"는 본 발명의 조성물 또는 방법을 이용한 치료가 유익할 임의의 상태 또는 질환이다. 이것은 포유동물이 해당 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리적 상태를 포함하는, 만성 및 급성 장애 또는 질환을 포함한다. 본 발명의 항체 및 항체 단편을 이용하여 치료될 수 있는 장애의 비-제한적 예는 본원의 "정의"에서 제공되는 다양한 질환 및 장애를 포함한다.
용어 "세포 증식 장애" 및 "증식 장애"는 어느 정도의 비정상적인 세포 증식과 관련이 있는 장애를 지칭한다. 한 실시양태에서, 세포 증식 장애는 암이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "종양"은 모든 신생물 세포 성장 및 증식 (악성이든 양성이든) 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 본원에서 지칭되는 바와 같이, 용어 "암", "암성", "세포 증식 장애", "증식 장애" 및 "종양"은 상호 배타적인 것이 아니다.
종양은 충실성 종양 또는 비-충실성 또는 연조직 종양일 수 있다. 연조직 종양의 예는 백혈병 (예를 들어, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성인 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 성숙 B-세포 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 전림프구성 백혈병 또는 모발 세포 백혈병), 또는 림프종 (예를 들어, 비-호지킨 림프종, 피부 T-세포 림프종 또는 호지킨병)을 포함한다. 충실성 종양은 혈액, 골수 또는 림프계 이외의 신체 조직의 임의의 암을 포함한다. 충실성 종양은 상피 세포 기원의 것 및 비-상피 세포 기원의 것으로 추가로 분리될 수 있다. 충실성 종양의 예는 결장, 유방, 전립선, 폐, 신장, 간, 췌장, 난소, 두경부, 구강, 위, 십이지장, 소장, 대장, 위장관, 항문, 담낭, 음순, 비인두, 피부, 자궁, 남성 생식 기관, 비뇨 기관, 방광 및 피부의 종양을 포함한다. 비-상피성 기원의 충실성 종양은 육종, 뇌 종양 및 골 종양을 포함한다.
용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않는 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는 포유동물에서의 생리적 상태를 지칭하거나 기재한다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병 또는 림프양 악성종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특별한 예는 편평 세포 암 (예를 들어, 상피성 편평 세포 암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 상피암, 복막암, 간세포암, 위암(gastric 또는 stomach cancer), 예를 들어 위장암 및 위장 간질 암, 췌장암, 교아세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 간종양, 유방암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 침샘 암종, 신장암(kidney 또는 renal cancer), 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종, 흑색종, 표재성 확산 흑색종, 악성 검은사마귀 흑색종, 말단성 흑점양 흑색종, 결절성 흑색종, 다발성 골수종 및 B-세포 림프종 (예를 들어, 저 악성도/소포 비-호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중간 악성도/소포 NHL; 중간 악성도 미만성 NHL; 고 악성도 면역모구성 NHL; 고 악성도 림프모구성 NHL; 고 악성도 소 비-절단 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 림프모구성 백혈병; 및 이식 후 림프구증식 장애 (PTLD), 및 또한 모반증과 관련이 있는 비정상적인 혈관 증식, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 관련이 있는 부종), 메이그스 증후군, 뇌, 및 또한 두경부암, 및 관련 전이를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG로 치료할 수 있는 암은 유방암, 결장직장암, 직장암, 비-소세포 폐암, 교아세포종, 비-호지킨 림프종 (NHL), 신장 세포 암, 전립선암, 간암, 췌장암, 연조직 육종, 카포시 육종, 카르시노이드 암종, 두경부암, 난소암, 중피종, 및 다발성 골수종을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 소세포 폐암, 교아세포종, 신경아세포종, 흑색종, 유방 암종, 위암, 결장직장암 (CRC) 및 간세포 암종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 그러나, 일부 실시양태에서, 암은 비-소세포 폐암, 결장직장암, 교아세포종 및 유방 암종, 예를 들어 이들 암의 전이성 형태로 이루어진 군으로부터 선택된다.
암이라는 용어는 전암성 성장, 양성 종양, 악성 종양 및 잠복기 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는 증식 장애를 통칭하여 포함한다. 양성 종양은 발원 부위에 국한되어 유지되고 원위 부위로 침윤, 침습, 또는 전이하는 능력을 갖지 않는다. 악성 종양은 그 주변의 다른 조직에 침습하여 손상시킬 것이다. 이것들은 또한 일반적으로는 혈류를 통해 또는 림프절이 위치한 림프계를 통해 이것들이 시작된 곳으로부터 분리되어 신체의 다른 부위로 확산하는 (전이하는) 능력을 수득할 수 있다. 잠복기 종양은 종양 세포가 존재하긴 하지만 종양 진행이 임상적으로 명백하지 않은 휴지기 종양이다. 원발성 종양은 이것들이 발생한 조직의 유형에 따라 분류되고, 전이성 종양은 암 세포가 유래된 조직의 유형에 따라 분류된다. 시간이 지남에 따라, 악성 종양 세포는 더욱 비정상적으로 되고 정상 세포와 달라진다. 암 세포의 외형에 있어서의 이러한 변화를 종양 등급이라 칭하며, 암 세포는 고분화성, 중간 분화성, 저분화성 또는 미분화성으로 기재된다. 고분화성 세포는 상당히 정상적인 외형을 나타내며 이것들이 유래된 정상 세포와 유사하다. 미분화성 세포는 세포의 기원을 알 수 없을 정도로 매우 비정상적이 된 세포이다.
상피 암은 일반적으로 양성 종양에서 침습전 단계 (예를 들어, 계내 암종)로, 기저막을 침투하고 상피하 간질을 침습하는 악성 암으로 발전한다.
"이형성"은 조직, 장기 또는 세포의 임의의 비정상적인 성장 또는 발생을 의미한다. 특정 실시양태에서, 이형성은 고 악성도 또는 전암성이다.
"전이"는 암이 그의 원발성 부위로부터 신체 내 다른 부위로 확산되는 것을 의미한다. 암 세포는 원발성 종양으로부터 분리되어, 림프관 및 혈관 내로 침투하고, 혈류를 통하여 순환하여 신체 내 그 밖의 정상 조직에서 원위 중심에서 성장 (전이)할 수 있다. 전이는 국소 또는 원위일 수 있다. 전이는 원발성 종양으로부터 분리된 종양 세포에 우발적으로 발생하고 혈류를 통해 이동하여 원위 부위에서 중단하는 순차적 과정이다. 이러한 새로운 부위에서 상기 세포는 혈류 공급을 확립시키고 성장하여 생명을 위협하는 덩어리를 형성할 수 있다. 종양 세포 내에서의 자극성 분자 경로와 억제성 분자 경로 모두가 이러한 거동을 조절하고, 원위 부위 내의 종양 세포와 숙주 세포 사이의 상호 작용이 또한 유의하다.
"미세전이"는 적은 수의 세포가 원발성 종양으로부터 기타 신체 부위로 확산되는 것을 의미한다. 미세전이는 스크리닝 또는 진단 시험에서 검출될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
"비-전이성"은, 양성인 암, 또는 여전히 원발성 부위 내에 있으면서 림프계 또는 혈관계로 침투되지 않았거나 원발성 부위 이외의 조직 내로 침투되지 않은 암을 의미한다. 일반적으로, 비-전이성 암은 0기, I 또는 II의 암 및 때때로 III기 암인 임의의 암이다.
종양 또는 암을 "0기", "I기", "II기", "III기" 또는 "IV기"로서 언급하는 것은 당업계에 공지된 전반적인 병기분류 또는 로마 숫자 병기분류 방법을 이용한 종양 또는 암의 분류를 나타낸다. 암의 실제 병기는 암의 유형에 따라 달라지지만, 일반적으로 0기 암은 계내 병변이고 I기 암은 작은 국소 종양이고 II기 및 III의 암은 국소 림프절이 관여함을 나타내는 국소 진행성 종양이며 IV기 암은 전이성 암을 나타낸다. 각 유형의 종양에 대한 구체적인 병기는 숙련된 임상의에게 공지되어 있다.
"원발성 종양" 또는 "원발성 암"은 본래의 암을 의미하고, 대상체 신체 내 또 다른 조직, 장기 또는 위치에 위치하는 전이성 병변이 아니다.
"양성 종양" 또는 "양성 암"은 본래의 부위에 국소화된 채로 있고 원위 부위로 침윤, 침습 또는 전이될 수 있는 능력이 갖지 않는 종양을 의미한다.
본원에서의 "암 재발"은 치료 후 암이 다시 생기는 것을 지칭하고, 원발성 장기에서 암이 다시 생기는 것 및 또한 암이 원발성 장기를 벗어나 다시 생기는 원위 재발을 포함한다.
"종양 잠복기"는 종양 세포가 존재하긴 하지만 종양 진행이 임상적으로 나타나지 않는 연장된 휴지기 상태를 의미한다. 잠복기 종양은 스크리닝 또는 진단 시험에서 검출될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.
"종양 존재량"은 신체 내 암 세포 수, 종양 크기 또는 암의 양을 의미한다. 종양 존재량은 또한 종양 부하량이라 지칭되기도 한다.
"종양 수"는 종양의 수를 의미한다.
본 발명의 항체 및 항체 단편으로 치료할 수 있는 비-신생물 상태는 예를 들어 원치않는 또는 이상 비대증, 양성 전립선 비대증, 관절염, 류마티스 관절염 (RA), 건선성 관절염, 신경변성 질환 (예를 들어, 알츠하이머병, AIDS-관련 치매, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증, 색소성 망막염, 척수 근위축증 및 소뇌 변성), 자가면역 질환, 건선, 건선성 플라크, 사르코이드증, 아테롬성동맥경화증, 아테롬성 경화판, 하시모토 갑상선염, 혈관신생 장애, 안구 질환, 예컨대 추정상의 안구 히스토플라스마증 증후군, 망막 혈관증식, 당뇨성 및 기타 증식성 망막증, 예를 들어 미숙아 망막증, 당뇨성 신증, 후수정체 섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 노화-관련 황반 변성, 당뇨성 황반 부종, 각막 신생혈관증식, 각막 이식편 신생혈관증식, 각막 이식 거부, 망막/맥락막 신생혈관증식, 각의 신생혈관증식 (피부홍조), 안구 신생혈관 질환, 혈관 질환, 혈관 상피 세포의 비정상적인 증식을 수반하는 상태, 혈관 재협착증, 길랑-바레 증후군, 폴립, 예컨대 결장 폴립, 가족성 선종 폴립증, 비측 폴립 또는 위장 폴립, 위장 궤양, 영아 비대성 유문 협착증, 비뇨기 폐쇄성 증후군, 메네트리에병, 분비성 선종 또는 단백질 손실 증후군, 섬유선종, 호흡기 질환, 담낭염, 신경섬유종증, 동정맥 기형 (AVM), 수막종, 혈관종, 혈관섬유종, 갑상선 비대증 (예를 들어, 그레이브스병), 각막 및 기타 조직 이식, 염증성 질환, 만성 염증, 폐 염증, 급성 폐 손상/ARDS, 패혈증, 만성 폐색성 폐 질환, 원발성 폐 고혈압, 악성 폐 삼출, 죽종, 화상, 외상, 방사선, 졸중, 저산소증 또는 허혈 후의 부종, 심근 경색으로 인한 부종, 허혈성 손상, 대뇌 허혈 사건 후의 손상, 대뇌 부종 (예를 들어, 급성 졸중/폐쇄성 두부 손상/외상 관련), 혈소판 응집으로 인한 혈전, 섬유증 또는 부종 질환, 예컨대 간 경변, 폐 섬유증, 사르코이드증, 갑상선염, 전신 과다점성 증후군, 활액 염증, RA에서의 판누스 형성, 골화 근육염, 비대성 골 형성, 골 관련 병리, 예컨대 골관절염, 구루병 및 골다공증, 불응성 복수, 골 또는 관절 염증, 골수이형성 증후군, 재생불량성 빈혈, 신장 또는 간; T-세포 매개 과민증 질환, 파제트병, 다낭성 신장 질환, 체액의 제3공간 질환 (췌장염, 구획 증후군, 화상, 장 질환), 만성 염증, 예컨대 IBD (크론병 및 궤양성 대장염), 신장 장애, 신장 동종이식 거부, 이식편 대 숙주 질환 또는 이식 거부, 염증성 장 질환, 급성 및 만성 신증 (예를 들어, 증식성 사구체신염 및 당뇨병-유도된 신장 질환), 신증 증후군, 원치않는 또는 이상 조직 덩어리 성장 (비-암), 비만, 지방 조직 덩어리 성장, 혈우병 관절, 비후성 반흔, 모발 성장의 억제, 오슬러-웨버-랑뒤 증후군, 화농성 육아종, 후수정체 섬유증식증, 경피증, 트라코마, 혈관 부착, 활막염, 피부의 과민 반응, 피부 장애, 예를 들어 건선 및 피부염, 습진, 광노화 (예를 들어, 인간 피부의 UV 조사에 의해 야기됨), 비후성 반흔 형성, 생식 관련 상태, 예컨대 자궁내막증, 난소 과자극 증후군, 다낭성 난소 질환, 자간전증, 기능장애 자궁 출혈, 또는 불규칙과다월경, 자궁 섬유증, 조산, 복수, 심낭 삼출 (예를 들어, 심막염 관련), 흉막 삼출, 내독소 쇼크 및 진균 감염, 특정 미생물 감염, 예를 들어 아데노바이러스, 한타바이러스, 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 예르시니아 종(Yersinia spp .) 및 보르데텔라 백일해(Bordetella pertussis)로부터 선택된 미생물 병원체 감염, 및 정신의학적 장애 (예를 들어, 정신분열증, 양극성 우울증, 자폐증 및 주의력 결핍 장애)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"호흡기 질환"은 호흡계를 포함하고, 만성 기관지염, 천식, 예를 들어 급성 천식 및 알레르기성 천식, 낭성 섬유증, 기관지확장증, 알레르기성 또는 기타 비염 또는 부비동염, α1-항-트립신 결핍, 기침, 폐 기종, 폐 섬유증 또는 반응성항진 기도, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 만성 폐쇄성 폐 장애를 포함한다.
본원에서의 "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직으로부터 발생되고 이에 대해 지시되는 비-악성 질환 또는 장애이다. 자가면역 질환 또는 장애의 예는 염증성 반응, 예컨대 염증성 피부 질환, 예를 들어 건선 및 피부염 (예를 들어, 아토피성 피부염 및 접촉성 피부염); 전신 경피증 및 경화증; 염증성 장 질환 (예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염)과 관련이 있는 반응; 호흡 곤란 증후군 (예를 들어, 성인 호흡 곤란 증후군; ARDS); 피부염; 수막염; 뇌염; 포도막염; 결장염; 사구체신염; 알레르기성 상태, 예컨대 습진 및 천식, 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증성 반응을 수반하는 기타 상태; 아테롬성동맥경화증; 백혈구 접착 결핍; 류마티스 관절염; 전신 홍반성 루푸스 (SLE); 진성 당뇨병 (예를 들어, 제I형 진성 당뇨병 또는 인슐린 의존적 진성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노 증후군; 자가면역 갑상선염; 알레르기성 뇌척수염; 쇼그렌 증후군; 유년 발병형 당뇨병; 및 결핵, 사르코이드증, 다발성근염, 육아종증 및 혈관염에서 전형적으로 발견되는, 시토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 관련이 있는 면역 반응; 악성 빈혈 (애디슨병); 백혈구 누출을 수반하는 질환; 중추 신경계 (CNS) 염증성 장애; 다발성 장기 손상 증후군; 용혈성 빈혈 (예를 들어 (이에 제한되지 않음), 한랭글로불린혈증 또는 크움즈 양성 빈혈); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항-인지질 증후군; 알레르기성 신경염; 그레이브스병; 램버트-이튼 근무력증 증후군; 수포성 유천포창; 천포창; 자가면역 다내분비질환; 라이터병; 강직 인간 증후군; 베체트병; 거대 세포 동맥염; 면역 복합체 신염; IgA 신증; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판감소성 자반병 (ITP) 또는 자가면역 혈소판감소증 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서의 용어 "혈관 질환 또는 장애"는 심혈관계를 비롯한 혈관계에 영향을 주는 다양한 질환 또는 장애를 지칭한다. 이러한 질환의 예는 동맥경화증, 혈관 재폐쇄, 아테롬성동맥경화증, 수술후 혈관 협착증, 재협착증, 혈관 폐색 또는 경동맥 폐쇄성 질환, 관상 동맥 질환, 협심증, 소혈관 질환, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 및 혈관 상피 세포의 비정상적인 증식 또는 기능을 수반하는 상태를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치료" (및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 변형 형태)는 치료할 개체 또는 세포의 천연 과정을 변경시키려는 시도의 임상적 개입을 지칭하고, 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리적 결과의 축소, 전이의 예방, 질환 질행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 질환 또는 장애의 발생을 지연시키거나 질환 또는 장애의 진행을 저속화하는데 사용된다.
"개체", "대상체" 또는 "환자"는 척추동물이다. 특정 실시양태에서, 척추동물은 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소), 경주용 동물, 애완동물 (예를 들어, 고양이, 개 및 말), 영장류, 마우스 및 래트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
용어 "제약 제제" 또는 "제약 조성물"은 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태이고 제제가 투여되는 대상체에게 허용되지 않은 독성을 보이는 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다. 이러한 제제는 멸균성일 수 있다. 또한, 투여량, 제제화 및 기간이라는 제목의 섹션을 참조한다.
"멸균" 제제는 무균 상태이거나 또는 모든 살아있는 미생물 및 이것들의 포자가 존재하지 않는다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량"은 대상체에서 질환 또는 장애의 치료에 효과적인 약물의 양을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 유효량은 원하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 투여량에서 그러한 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 본 발명의 물질/분자의 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 원하는 반응을 유발하는 물질/분자의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 물질/분자의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 치료상 유익한 효과가 능가하는 양을 포함한다. 암의 경우, 유효량의 약물은 암 세포의 수 감소, 종양 크기의 감소, 말초 장기로의 암 세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 저속화되고 전형적으로는 멈추는 것), 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 저속화되고 전형적으로는 멈추는 것), 종양 성장의 어느 정도의 억제, 종양 치료의 허용, 및/또는 장애와 관련이 있는 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감을 유도할 수 있다. 약물이 기존 암 세포의 성장을 예방하고/하거나 기존 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도라면, 이것은 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다.
"예방 유효량"은, 필요한 투여량 및 기간 동안 원하는 예방 결과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방 용량은 질환의 보다 초기 단계 이전 또는 보다 초기 단계의 대상체에서 사용되기 때문에 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이지만 반드시 그러한 것은 아니다.
전암성, 양성, 조기 또는 말기 종양의 경우, 치료 유효량의 혈관신생 억제제는 암 세포의 수 감소, 원발성 종양의 크기 감소, 말초 장기로의 암 세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 저속화되고 바람직하게는 멈추는 것), 종양 전이의 억제 (즉, 어느 정도 저속화되고 바람직하게는 멈추는 것), 종양 성장 또는 종양 진행의 어느 정도의 억제 또는 지연, 및/또는 장애와 관련이 있는 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감을 유도할 수 있다. 약물이 기존 암 세포의 성장을 예방하고/하거나 기존 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도라면, 이것은 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다.
용어 "효능"은 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 효과를 야기하는 이뮤노글로불린, 항체 또는 Fc 융합 단백질의 능력을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 효능은 포화 수준에서 이뮤노글로불린, 항체 또는 Fc 융합 단백질의 최대 관찰 효과를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 효능은 이뮤노글로불린, 항체 또는 Fc 융합 단백질의 EC50을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 효능은 이뮤노글로불린, 항체 또는 Fc 융합 단백질의 효력을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 효능은 이뮤노글로불린, 항체 또는 Fc 융합 단백질이 질환의 경과 또는 기간에 유익한 효과, 예를 들어 본원에서 정의된 바와 같은 임상적 이점을 생성하는 능력을 지칭한다.
용어 "EC50"은 이뮤노글로불린, 항체 또는 Fc 융합 단백질이 기준선과 최대치 사이의 절반인 반응을 유도하는 농도를 지칭한다. 특정 실시양태에서, EC50은 최대 효과의 50％가 관찰되는 이뮤노글로불린, 항체 또는 Fc 융합 단백질의 농도를 나타낸다. 특정 실시양태에서, EC50은 생체내 최대 효과의 50％ 달성에 필요한 혈장 또는 혈청 농도를 나타낸다.
암 치료에서의 효능은 본 발명의 항체, 융합 단백질, 접합된 분자 또는 조성물이 암성 세포의 성장 또는 전이를 억제하거나 감소시키거나, 또는 암과 관련이 있는 하나 이상의 증상을 호전시키거나 경감시키는 능력을 검출하여 입증될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항체, 융합 단백질, 접합된 분자 또는 조성물의 투여 후 암성 세포의 성장 또는 전이의 감소, 암과 관련이 있는 하나 이상의 증상의 호전, 또는 사망률 및/또는 이환율에서의 감소가 있는 경우, 처치는 치료적인 것으로 간주된다. 본 발명의 항체, 융합 단백질 또는 조성물은 시험관내, 생체외 및 생체내 검정에서 종양 형성을 감소시키는 능력에 대해 시험될 수 있다. 암 요법의 경우, 생체내 효능은 예를 들어 또한 생존 기간, 질환 진행까지의 시간 (TTP), 반응률 (RR), 반응 기간 및/또는 삶의 질을 평가하여 측정될 수 있다. 또한, 치료의 효능이라는 제목의 섹션을 참조한다.
염증성 장애 치료에서의 효능은 본 발명의 항체, 융합 단백질, 접합된 분자 또는 조성물이 동물에서 염증을 감소시키거나 억제하거나, 또는 염증성 장애와 관련이 있는 하나 이상의 증상을 호전시키거나 경감시키는 능력을 검출하여 입증될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항체, 융합 단백질, 접합된 분자 또는 조성물의 투여 후 염증의 감소 또는 하나 이상의 증상의 호전이 있는 경우, 처치는 치료적인 것으로 간주된다.
바이러스 감염의 치료 또는 예방에서의 효능은 본 발명의 항체, 융합 단백질, 접합된 분자 또는 조성물이 바이러스의 복제를 억제하거나, 바이러스의 전달을 억제하거나, 또는 바이러스가 숙주 내에서 스스로를 확립시키는 것을 저해하거나, 또는 바이러스 감염과 관련이 있는 하나 이상의 증상을 예방하거나 호전시키거나 경감시키는 능력을 검출하여 입증될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항체, 융합 단백질, 접합된 분자 또는 조성물의 투여 후 바이러스 존재량의 감소, 하나 이상의 증상의 호전 또는 사망률 및/또는 이환율에서의 감소가 있는 경우, 처치는 치료적인 것으로 간주된다. 본 발명의 항체, 융합 단백질, 접합된 분자 또는 조성물은 시험관내 및 생체내 검정에서 바이러스 복제를 억제하거나 바이러스 존재량을 감소시키는 능력에 대해 시험될 수 있다.
박테리아 감염의 치료 또는 예방에서의 효능은 본 발명의 항체, 융합 단백질 또는 조성물이 박테리아 복제를 억제하거나, 또는 박테리아 감염과 관련이 있는 하나 이상의 증상을 예방하거나 호전시키거나 경감시키는 능력을 검출하여 입증될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항체, 융합 단백질 또는 조성물의 투여 후 박테리아 수의 감소, 하나 이상의 증상의 호전 또는 사망률 및/또는 이환율에서의 감소가 있는 경우, 처치는 치료적인 것으로 간주된다.
임상적 이점은 다양한 종점, 예를 들어 질환 진행의 어느 정도의 억제, 예를 들어 저속화 및 완전한 정지, 질환 에피소드 및/또는 증상의 수 감소, 병변 크기의 감소, 인접한 말초 장기 및/또는 조직으로의 질환 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 정지), 질환 확산의 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 정지), 질환 병변을 퇴행시키거나 제거할 수는 있지만 반드시 그래야 하는 것은 아닌 자가면역 반응의 감소, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감, 처치 후 무병 상태, 예를 들어 무진행 생존을 보이는 기간의 증가, 전체 생존의 증가, 반응율의 증가, 및/또는 처치 후 주어진 시점에서의 사망률 감소를 평가하여 결정할 수 있다.
"감소 또는 억제"는 기준물과 비교하여 활성, 기능 및/또는 양을 감소시키거나 줄이는 것이다. 특정 실시양태에서, "감소 또는 억제"는 20％ 이상의 전반적 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, "감소 또는 억제"는 50％ 이상의 전반적 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 또 다른 실시양태에서, "감소 또는 억제"는 75％, 85％, 90％, 95％ 이상의 전반적 감소를 야기하는 능력을 의미한다. 감소 또는 억제는 치료할 장애의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 원발성 종양의 크기, 또는 혈관신생 장애에서 혈관의 크기 또는 수를 지칭할 수 있다.
"수술가능한" 암은 원발성 장기로 한정되고 수술하기에 적합한 암이다.
"생존"은 환자가 여전히 살아있는 상태를 지칭하며, 무병 생존 (DFS), 무진행 생존 (PFS) 및 전체 생존 (OS)을 포함한다. 생존은 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법으로 추정될 수 있고, 생존에서의 임의의 차이는 층상 로그-랭크 시험을 이용하여 전산화한다.
"무병 생존 (DFS)"은 환자가 처치 개시 또는 초기 진단으로부터 규정된 기간 동안, 예컨대 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 10년 등 동안 암의 재발 없이 살아있는 상태를 지칭한다. 본 발명의 한 측면에서, DFS는 치료 의향(intent-to-treat) 원칙에 따라서 분석되며, 즉, 환자를 그의 정해진 요법을 기초로 평가한다. DFS의 분석에 사용되는 사건은 암의 국소, 국부 및 원위 재발, 2차 암의 발생, 및 선행 사건 (예를 들어, 유방암 재발 또는 제2 원발성 암) 없이 임의의 원인으로 인한 환자의 사망을 포함할 수 있다.
"전체 생존"은 환자가 처치 개시 또는 초기 진단으로부터 규정된 기간 동안, 예컨대 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 10년 등 동안 살아있는 상태를 지칭한다.
"생존 연장"은, 미처치 환자, 또는 대조군 치료 프로토콜, 예컨대 화학요법제만을 사용한 치료법과 비교하여 처치된 환자에서 DFS 및/또는 OS가 증가된 것을 의미한다. 생존은 처치 개시 후 또는 초기 진단 후 적어도 약 6개월, 또는 적어도 약 1년, 또는 적어도 약 2년, 또는 적어도 약 3년, 또는 적어도 약 4년, 또는 적어도 약 5년, 또는 적어도 약 10년 등 동안 모니터링된다.
본원에서, 용어 "공동으로"는 투여의 적어도 일부가 시간상 중첩되는, 2종 이상의 치료제의 투여를 지칭하는데 사용된다. 따라서, 공동 투여는 1종 이상의 다른 작용제(들)를 불연속적으로 투여한 후에 연속하여 1종 이상의 작용제(들)을 투여하는 경우의 투약법을 포함한다.
"단일요법"은 처치 기간 동안 암 또는 종양을 치료하기 위해 단지 단일 치료제만을 포함하는 치료 처치를 의미한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG를 사용한 단일요법은 변이체 IgG가 처치 기간 동안 추가의 항암 요법 없이 투여되는 것을 의미한다.
"유지 요법"은 질환의 재발 또는 진행 가능성을 감소시키기 위해 제공되는 치료 처치를 의미한다. 유지 요법은 최대로는 대상체의 수명까지 연장된 기간을 포함하는 임의의 기간의 시간 동안 제공될 수 있다. 유지 요법은 초기 요법 후에 제공될 수도 있고, 또는 초기 또는 추가의 요법과 연계해서 제공될 수도 있다. 유지 요법에 사용되는 투여량은 다양할 수 있고, 다른 유형의 요법에 사용된 투여량과 비교할 때 감소된 투여량을 포함할 수 있다.
본원에서의 "네오아주반트 요법" 또는 "수술전 요법"은 수술 전에 제공되는 요법을 지칭한다. 네오아주반트 요법의 목표는 표준 수술 순서 이후 전신 요법이 수행되는 경우에 증식할 수도 있는 미세전이를 잠재적으로 근절시키는 긴급 전신 치료를 제공하기 위한 것이다. 네오아주반트 요법은 또한 종양 크기의 감소를 도와서 초기에 절제불가능한 종양을 완전하게 절제하게 하거나 해당 장기 또는 그의 기능의 일부를 보존시킬 수 있다. 추가로, 네오아주반트 요법은 약물 효능의 생체내 평가를 허용하여, 후속 치료의 선택에 지침이 될 수 있다.
본원에서의 "아주반트 요법"은 잔류 질환의 증거가 전혀 검출될 수 없어서 질환 재발의 위험을 감소시키는, 수술 후에 제공되는 요법을 지칭한다. 아주반트 요법의 목표는 암의 재발을 예방하여 암-관련 사망 기회를 감소시키는 것이다.
본원에서, "표준 치료" 화학요법은 특정 암 치료를 위해 통상적으로 사용되는 화학요법제를 지칭한다.
"결정적 수술"은 의학계 내에서 사용되는 용어이다. 결정적 수술은 예를 들어 종양을 제거 또는 절제하는 수술적 또는 다른 방식의 절차, 예를 들어 전체적으로 가시적인 모든 종양을 제거 또는 절제하는 절차를 포함한다. 결정적 수술은 예를 들어 종양의 완전한 또는 치유력 있는 절제 또는 완전한 육안 절제를 포함한다. 결정적 수술은 1개 이상의 단계로 수행되는 절차를 포함하고, 예를 들어 종양 절제 전에 하나 이상의 수술 또는 기타 절차가 수행되는 다단계 수술적 절차를 포함한다. 결정적 수술은 관련 장기, 장기의 일부 및 조직, 및 또한 주변 장기, 예컨대 림프절, 장기의 일부 또는 조직을 포함하는 종양을 제거하거나 절제하는 절차를 포함한다.
1종 이상의 추가의 치료제와의 "조합" 투여는 동시 (공동) 투여 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다.
"만성" 투여는 급성 방식과는 반대로 연장된 기간 동안 초기 치료 효과 (활성)를 유지하기 위해 연속 방식으로 작용제(들)을 투여하는 것을 지칭한다. "간헐적" 투여는 중단없이 연속적으로 행해지지는 않지만 특성상 주기적인 치료법이다.
본원에서 사용된 바와 같이, "담체"는 사용되는 투여량 및 농도에서 그에 노출되는 세포 또는 포유동물에게 비독성인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 생리적으로 허용되는 담체는 수성 pH 완충 용액이다. 생리적으로 허용되는 담체의 예는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산; 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라진, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당 알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 플루로닉스(PLURONICS)™를 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어, 변이체 IgG)을 포유동물에게 전달하는데 유용한 각종 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 이루어진 작은 소포이다. 통상적으로, 리포좀의 성분들은 생체막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다.
용어 "항-신생물 조성물"은 1종 이상의 활성 치료제, 예를 들어 "항암제"를 포함하는, 암 치료에 유용한 조성물을 지칭한다. 치료제 (항암제)의 예는 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항-혈관신생제, 세포자멸제, 항-튜불린제, 및 암을 치료하기 위한 기타 작용제, 예컨대 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제 (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바(TARCEVA)®), 혈소판 유래 성장 인자 억제제 (예를 들어, 글리벡® (이마티닙 메실레이트)), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕십), 인터페론, 시토카인, ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들) 표적 중 1종 이상과 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 기타 생물활성 및 유기 화학제 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이것들의 조합물 역시 본 발명에 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 저해하고/하거나 세포 사멸 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 상기 용어는 방사능 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212, 및 Lu의방사능 동위원소), 화학요법제 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 삽입성 작용제, 효소 및 그의 단편, 예컨대 뉴클레오티드분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소, 예를 들어 그의 단편 및/또는 변이체, 및 하기 개시한 다양한 항-종양제 또는 항암제를 포함한다. 다른 세포독성제는 하기 기재되어 있다. 종양치사제는 종양 세포의 파괴를 야기한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 세포독성제와 접합될 수 있다.
"독소"는 세포의 성장 또는 증식에 유해한 효과를 가질 수 있는 임의의 물질이다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로스포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)®); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메트우레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예를 들어 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀(MARINOL)®); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (예를 들어, 합성 유사체 토포테칸 (하이캄틴(HYCAMTIN)®), CPT-11 (이리노테칸, 캄프토사르(CAMPTOSAR)®), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (예를 들어, 그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (예를 들어, 합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 에네디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마1I 및 칼리케아미신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)] 참조); CDP323, 경구 알파-4 인테그린 억제제; 다이네미신, 예를 들어 다이네미신 A; 에스페라미신; 및 또한 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색단백질 에네디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (예를 들어, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)®, 모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포좀 주입물 (독실(DOXIL)®), 리포좀 독소루비신 TLC D-99 (미오세트(MYOCET)®), PEG화 리포좀 독소루비신 (캘릭스(CAELYX)®) 및 데옥시독소루비신), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포르피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예컨대 메토트렉세이트, 겜시타빈 (겜자르(GEMZAR)®), 테가푸르 (우프토랄(UFTORAL)®), 카페시타빈 (크셀로다(XELODA)®), 에포틸론, 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 콤브레타스타틴; 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK® 다당류 복합체 (제이에이치에스 내추럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 미국 오레곤주 유진); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2'-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신 (엘디신(ELDISINE)®, 필데신(FILDESIN)®); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)®), 파클리탁셀의 알부민-조작 나노입자 제제 (아브락산(ABRAXANE)™), 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)®); 클로란부실; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 작용제, 예컨대 시스플라틴, 옥살리플라틴 (예를 들어, 엘록사틴(ELOXATIN)®), 및 카르보플라틴; 튜불린 중합으로 미세소관이 형성되는 것을 저해하는 빈카, 예를 들어 빈블라스틴 (벨반(VELBAN)®), 빈크리스틴 (온코빈(ONCOVIN)®), 빈데신 (엘디신®, 필데신®), 및 비노렐빈 (나벨빈(NAVELBINE)®); 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 류코보린; 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산, 예를 들어 벡사로텐 (타르그레틴(TARGRETIN)®); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스(BONEFOS)® 또는 오스탁(OSTAC)®), 에티드로네이트 (디드로칼(DIDROCAL)®), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타(ZOMETA)®), 알렌드로네이트 (포사막스(FOSAMAX)®), 파미드로네이트 (아레디아(AREDIA)®), 틸루드로네이트 (스켈리드(SKELID)®), 또는 리세드로네이트 (악토넬(ACTONEL)®); 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로 중의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R) (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바®)); 및 세포 증식을 감소시키는 VEGF-A; 백신, 예컨대 테라토프(THERATOPE)® 백신 및 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드(VAXID)® 백신; 토포이소머라제 1 억제제 (예를 들어, 루르토테칸(LURTOTECAN)®); rmRH (예를 들어, 아바렐릭스(ABARELIX)®); BAY439006 (소라페닙; 바이엘(Bayer)); SU-11248 (수니티닙, 수텐트®, 화이자(Pfizer)); 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕십 또는 에토리콕십), 프로테오솜 억제제 (예를 들어, PS341); 보르테조밉 (벨케이드(VELCADE)®); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 올리메르센 나트륨 (게나센스(GENASENSE)®); 픽산트론; EGFR 억제제; 티로신 키나제 억제제; 세린-트레오닌 키나제 억제제, 예컨대 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨(RAPAMUNE)®); 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 로나파르닙 (SCH 6636, 사라사르(SARASAR)™); 및 이것들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체, 및 또한 이것들 중 2종 이상의 조합물, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴™)을 사용한 치료법에 대한 약자인 FOLFOX, 및 이것들 중 임의의 것의 산 또는 유도체, 및 또한 이것들 중 2종 이상의 조합물을 포함한다.
본원에서 정의된 바와 같은 화학요법제는 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하는 "항-호르몬제" 또는 "내분비 치료제"를 포함한다. 이것들은 그 자체가 호르몬일 수 있고, 예를 들어 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (예를 들어, 놀바덱스(NOLVADEX)® 타목시펜), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 파레스톤(FARESTON)·토레미펜; 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가스(MEGASE)® 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)® 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)® 보로졸, 페마라(FEMARA)® 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)® 아나스트로졸; 및 항-안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 또한 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식에 연루된 신호전달 경로 중의 유전자의 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf 및 H-Ras; 리보자임, 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME)® 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신, 예컨대 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)® 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)® 백신, 및 박시드(VAXID)® 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 (미국 특허 번호 4,675,187 참조), 및 이것들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 및 또한 이것들 중 2종 이상의 조합물.
본원에 사용되는 경우의 "성장 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포 (예를 들어, VEGF를 발현하는 세포)의 성장을 억제하는 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 따라서, 성장 억제제는 S기에서 세포 (예를 들어, VEGF를 발현하는 세포)의 백분율(％)을 유의하게 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 (S기 이외의 다른 단계에) 차단하는 작용제, 예컨대 G1 정지 및 M기 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 통상적인 M기 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. G1을 정지시키는 작용제, 예를 들어 DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로레타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 ara-C는 S기 정지로까지 이어질 수도 있다. 추가의 정보는 문헌 [Mendelsohn and Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Chapter 1 (영문 제목: "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs") (Murakami et al.) (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995)], 예를 들어 페이지 13에서 찾을 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀)은 둘다 주목에서 유래된 항암 약물이다. 유럽형 주목에서 유래된 도세탁셀 (탁소테레®, 론-프랑 로러(Rhone-Poulenc Rorer))은 파클리탁셀 (탁솔®, 브리스톨-마이어스 스퀴브(Bristol-Myers Squibb))의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터의 미세소관 조립을 촉진하고, 탈중합을 방지함으로써 미세소관을 안정화시켜서 세포에서의 유사분열 억제를 야기한다.
"방사선 요법"은, 정상적으로 기능할 수 있거나 함께 세포를 파괴시킬 수 있는 능력이 제한되도록 세포에 대한 충분한 손상을 유도시키기 위해 지정된 감마선 또는 베타선을 사용하는 것을 의미한다. 당업계에는 투여량 및 처치 기간을 결정하는 수많은 방법이 공지되어 있음을 이해할 것이다. 전형적인 처치는 1회 투여로 제공되며, 전형적인 투여량은 1일 당 10 내지 200 단위 (그레이(Gray))의 범위이다.
질환의 "병리"는 환자의 안녕을 손상시키는 모든 현상을 포함한다. 암의 경우, 이것은 비정상적인 또는 제어가능하지 않은 세포 성장, 전이, 이웃 세포의 정상적인 기능수행의 방해, 비정상적인 수준의 시토카인 또는 기타 분비 생성물의 방출, 염증성 또는 면역학적 반응의 저해 또는 악화 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"소분자"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 정의된다.
용어 "정맥내 주입"은 약물을 대략 5분 초과, 바람직하게는 대략 30분 내지 90분의 기간에 걸쳐 동물 또는 인간 환자의 정맥 내로 도입하는 것을 지칭하지만, 본 발명에 따라 정맥내 주입은 대안적으로 10시간 이하 동안 투여되기도 한다.
용어 "정맥내 볼루스" 또는 "정맥내 푸시"는 신체가 약물을 대략 15분 이하, 바람직하게는 5분 이하로 수용하도록 동물 또는 인간의 정맥 내로 약물을 투여하는 것을 지칭한다.
용어 "피하 투여"는 약물 리셉터클로부터 비교적 저속의 지속적인 전달에 의해 동물 또는 인간 환자의 피부 아래쪽으로, 바람직하게는 피부와 기저 조직 사이의 포켓 내로 약물이 도입되는 것을 지칭한다. 포켓은 피부를 기저 조직으로부터 핀칭 또는 드로잉하여 생성될 수 있다.
용어 "피하 주입"은 30분 이하 또는 90분 이하를 포함하지만 이에 제한되지 않는 기간의 시간 동안 약물 리셉터클로부터 비교적 저속의 지속적인 전달에 의해 동물 또는 인간 환자의 피부 아래쪽으로, 바람직하게는 피부와 기저 조직 사이의 포켓 내로 약물이 도입되는 것을 지칭한다. 임의로, 주입은 동물 또는 인간 환자의 피부 아래쪽에 이식된 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 이루어질 수 있는데, 이러한 펌프는 소정량의 약물을 소정 기간의 시간, 예컨대 30분, 90분, 또는 처치 기간의 길이에 걸친 기간 동안 전달한다.
용어 "피하 볼루스"는 동물 또는 인간 환자의 피부 밑으로의 약물 투여를 지칭하고, 여기서 볼루스 약물 전달은 바람직하게는 대략 15분 미만, 더욱 바람직하게는 5분 미만, 가장 바람직하게는 60초 미만이다. 투여는 바람직하게는 피부와 기저 조직 사이의 포켓 내에서 이루어지고, 포켓은 예를 들어 피부를 기저 조직으로부터 핀칭 또는 드로잉하여 생성된다.
본원에 사용된 경우의 용어 "표지"는 폴리펩티드와 직접적으로 또는 간접적으로 접합되는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 지칭한다. 표지는 그 자체로 검출가능할 수도 있고 (예를 들어, 방사선동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 기질 화합물 또는 조성물의 검출가능한 화학적 변경을 촉매할 수도 있다.
항체
항체는 특정 항원에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질이다. 일반적으로, 천연 항체는 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. 각각의 경쇄는 1개의 디술피드 공유 결합에 의해 중쇄에 연결되고, 디술피드 연결부의 수는 다양한 이뮤노글로불린 이소형의 중쇄마다 상이하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정하게 이격된 쇄내 디술피드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인 (VH)을 갖고, 그 뒤에는 수많은 불변 도메인이 존재한다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에서의 가변 도메인 (VL) 및 다른쪽 말단에서의 불변 도메인을 가지며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 사이의 계면을 형성한다고 여겨진다.
중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 이뮤노글로불린은 여러 클래스로 배정될 수 있다. 5가지 주요 클래스의 이뮤노글로불린, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이중 몇 가지는 하위클래스 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; IgA1 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 다양한 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 동종이형이 기재된 바 있다 (문헌 [M.-P. LeFranc and G. LeFranc in: "The HumanIgG Subclasses,"F. Shakib (ed.), pp. 43-78, Pergamon Press, Oxford (1990)]에서 검토됨). IgG 클래스, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 상이한 이소형은 독특한 물리적, 생물학적 및 임상적 특성을 갖는다. 인간 IgG1은 치료 목적을 위해 가장 통상적으로 사용되는 항체이고, 대다수의 조작 연구가 이와 관련하여 구축되었다.
본 출원은 IgG의 생물학적 특성을 변경시키는 아미노산 변형을 포함하는 변이체 IgG 이뮤노글로불린에 관한 것이다. 본 출원의 변이체 이뮤노글로불린은 야생형 항체와 비교하여 보다 긴 생체내 반감기를 나타내는 변형된 Fc 영역을 포함하는 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 적어도 50％ 증가된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 적어도 75％ 증가된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 야생형 인간 IgG Fc 영역을 갖는 IgG의 반감기에 비해 적어도 100％ 증가된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 15일이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 20일이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 25일이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 30일이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 35일이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 적어도 약 40일이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 변이체 IgG1이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 인간에서 측정된 반감기이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 반감기는 시노몰구스 원숭이에서 측정된 반감기이다.
항체 단편
본 발명은 항체 단편을 포함한다. 특히 관심이 있는 것은 Fc 영역, Fc 융합체 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 Fc 영역을 포함하는 변이체 이뮤노글로불린 (IgG)의 단편이다. 항체 단편은 통상의 수단, 예컨대 효소 소화에 의해, 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다.
항체 단편 생성을 위한 다양한 기술이 개발되었다. 통상적으로, 이러한 단편들은 무손상 항체의 단백질분해소화를 통해 유도되었다 (예를 들어, 문헌 [Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)] 및 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생성될 수 있다. Fab, Fv 및 ScFv 항체 단편은 모두가 이. 콜라이(E. coli)에서 발현 및 분비될 수 있어서, 이들 단편의 대량 생성을 용이하게 한다. 항체 단편은 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 특정 실시양태에서, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 ([Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)]). 또 다른 접근법에 따라, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 항체 단편은 또한 예를 들어 미국 특허 번호 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.
인간화 항체
본 발명은 인간화 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 야생형 IgG와 비교하여 Fc 영역에서 1개 이상의 아미노산 변형을 갖는 인간화 변이체 IgG이다. 비-인간 항체를 인간화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터 유래된 1개 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있을 수 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "도입" 잔기라 지칭되고, 전형적으로 "도입" 가변 도메인의 것이다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열 대신 초가변 영역 서열을 사용함으로써 본질적으로 윈터(Winter) 및 동료들의 방법 ([Jones et al. (1986) Nature 321:522-525], [Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327], [Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536)])을 따라 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 무손상 인간 가변 도메인에 실질적으로 미치지 못하는 부분이 비-인간 종의 상응하는 서열로 치환된 키메라 항체 (미국 특허 번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체의 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 모두의 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 중요할 수 있다. 소위 "최적 맞춤(best-fit)" 방법에 따라, 설치류 항체의 가변 도메인 서열을 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 이후, 설치류와 가장 근접한 인간 서열을 인간화 항체를 위한 인간 프레임워크로서 수용한다. 예를 들어, 문헌 [Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296], [Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901]을 참조한다. 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위군의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 특정 프레임워크를 이용한다. 동일한 프레임워크가 여러가지 상이한 인간화 항체를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285], [Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623]을 참조한다.
추가로, 항원에 대한 높은 친화도 및 기타 유리한 생물학적 특성을 보유하도록 항체를 인간화하는 것이 일반적으로 바람직하다. 이러한 목적을 달성하기 위해서, 한 방법에 따라, 인간화 항체는 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하는 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 공정에 의해 제조된다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고, 당업자에게 공지되어 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형상적 구조를 예시하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능수행에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능하다. 이러한 방식으로, 원하는 항체 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화도 증가가 달성되도록 FR 잔기를 수용 서열 및 도입 서열로부터 선택 및 조합할 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역 잔기가 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.
인간 항체
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 야생형 IgG와 비교하여 Fc 영역에서 1개 이상의 아미노산 변형을 갖는 인간 변이체 IgG이다. 인간 항체는 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열(들)을 상기한 바와 같이 공지의 인간 불변 도메인 서열(들)과 조합함으로써 구축할 수 있다. 대안적으로, 인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체 생성을 위해 예를 들어 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)], [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)]에 기재된 바 있다.
면역화시에 내인성 이뮤노글로불린의 생성 없이 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 생성하는 것이 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배선 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (JH) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체의 생성이 완전히 억제된다고 기재된 바 있다. 인간 배선 이뮤노글로불린 유전자 어레이를 이러한 배선 돌연변이 마우스에게 전달하면, 항원 접종시에 인간 항체가 생성될 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993)], [Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993)], [Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993)]을 참조한다.
유전자 셔플링은 또한 비-인간, 예를 들어 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수도 있고, 이때 인간 항체는 출발 비-인간 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅(imprinting)"이라고도 지칭되는 이러한 방법에 따라, 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술에 의해 수득된 비-인간 항체 단편의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어 비-인간 쇄/인간 쇄 scFv 또는 Fab 키메라 집단을 생성시킨다. 항원을 기초로 선택한 결과로서, 인간 쇄가 1차 파지 디스플레이 클론에서 상응하는 비-인간 쇄의 제거시에 파괴된 항원 결합 부위를 복원하는 비-인간 쇄/인간 쇄 키메라 scFv 또는 Fab가 단리되고, 즉, 에피토프가 인간 쇄 파트너의 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 나머지 비-인간 쇄를 대체하기 위해 상기 과정을 반복하는 경우에 인간 항체가 수득된다 (1993년 4월 1일자로 공개된 PCT WO 93/06213 참조). CDR 이식에 의한 비-인간 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기술은 비-인간 기원의 FR 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.
이중특이적 항체
이중특이적 항체는 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 야생형 항체와 비교하여 Fc 영역에서 1개 이상의 아미노산 변형을 갖는 이중특이적 항체이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 VEGF에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 VEGF의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 세포독성제를 VEGF를 발현하는 세포에 국소화시키는데 사용될 수 있다. 이들 항체는 VEGF-결합 아암(arm), 및 세포독성제, 예를 들어 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사능 동위원소 합텐에 결합하는 아암을 보유한다. 특정 항체에서, 결합 특이성은 IL-4 및 IL-13에 대한 것이다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 Fc 영역을 포함하는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시 발현을 기초로 하고, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 ([Milstein and Cuello,Nature, 305: 537 (1983)]). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (콰드로마(quadroma))는 10종의 상이한 항체 분자들의 잠재적인 혼합물을 생성하며, 이 중에서 오직 1종만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 상기 정확한 분자의 정제는 다소 성가시고 생성 수율이 낮다. 유사한 절차가 1993년 5월 13일자로 공개된 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근법에 따라, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 예를 들어 힌지의 적어도 일부, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재한다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합체 및 원하는 경우에는 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 동시형질감염시킨다. 이것은 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비율이 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2종 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우, 또는 비율이 특별한 유의성을 갖지 않는 경우, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.
이러한 접근법의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 존재하는 것이 용이한 분리 방법을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체의 생성에 대한 추가의 세부사항에 대해서는 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조한다.
또 다른 접근법에 따라, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 백분율(％)을 최대화할 수 있다. 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 아미노산 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 큰 측쇄(들)에 대한 동일하거나 유사한 크기의 보상 "공동(cavity)"이 제2 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 다른 원치않는 최종 생성물, 예를 들어 동종이량체에 비해 이종이량체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 가교된 또는 "이종접합" 항체를 포함한다. 예를 들어, 이종접합체의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링되고, 다른 하나는 바이오틴에 커플링될 수 있다. 이러한 항체들은, 예를 들어 원치않는 세포에 대한 면역계 세포의 표적화 (미국 특허 번호 4,676,980), 및 HIV 감염의 치료 (WO 91/00360, WO 92/00373 및 EP 03089)를 위해서 제안되었다. 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제가 당업계에 공지되어 있고, 수많은 가교 기술과 함께 미국 특허 번호 4,676,980에 개시되어 있다.
문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공한다. 상기 단편은 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이의 쌍 형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 따라서, 1개 단편의 VH 및 VL 도메인이 또 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하게 되어 2개의 항원 결합 부위를 형성하게 된다. 단일 쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또 다른 전략도 보고된 바 있다. 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)]을 참조한다.
2가 초과의 항체가 고려된다. 예를 들어 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 ([Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)]).
다가 항체
다가 항체는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포에 의해 2가 항체보다 신속하게 내재화 (및/또는 이화)될 수 있다. 본 발명의 항체는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 (예를 들어, 4가 항체) 다가 항체 (IgM 클래스 이외의 것)일 수 있고, 이는 항체의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 핵산의 재조합 발현에 의해 쉽게 생성될 수 있다. 다가 항체는 이량체화 도메인 및 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이량체화 도메인은 Fc 영역 또는 힌지 영역을 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 시나리오에서, 항체는 Fc 영역, 및 Fc 영역의 아미노 말단에 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 다가 항체는 3개 내지 약 8개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 이러한 한 실시양태에서, 다가 항체는 4개의 항원 결합 부위를 포함한다 (또는 이것으로 이루어진다). 다가 항체는 적어도 1개의 폴리펩티드 쇄 (예를 들어, 2개의 폴리펩티드 쇄)를 포함하고, 여기서의 상기 폴리펩티드 쇄(들)는 2개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어 폴리펩티드 쇄(들)은 VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc (여기서, VD1은 제1 가변 도메인이고, VD2는 제2 가변 도메인이고, Fc는 Fc 영역의 1개의 폴리펩티드 쇄이고, X1 및 X2는 아미노산 또는 폴리펩티드를 나타내고, n은 0 또는 1임)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드 쇄(들)는 VH-CH1-가요성 링커-VH-CH1-Fc 영역 쇄 또는 VH-CH1-VH-CH1-Fc 영역 쇄를 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 적어도 2개 (예를 들어, 4개)의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 본원에서의 다가 항체는 예를 들어 약 2개 내지 약 8개의 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 본원에서 고려되는 경쇄 가변 도메인 폴리펩티드는 경쇄 가변 도메인을 포함하고, 임의로 CL 도메인을 추가로 포함한다.
단일-도메인 항체
일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 Fc 영역을 포함하는 단일-도메인 항체이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 야생형 IgG와 비교하여 Fc 영역에서 1개 이상의 아미노산 변형을 갖는다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 단일 폴리펩티드 쇄이다.
항체 변형
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 이뮤노글로불린의 아미노산 서열 변형(들)이 고려된다. 특정 실시양태에서, 변형은 본 발명의 변이체 IgG에 대한 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG의 결합 친화도, 생체내 반감기 및/또는 기타 생물학적 특성을 추가로 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아미노산 변형은 본원에 기재되지 않은 Fc 영역에서 1개 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 변이체 IgG의 변형된 아미노산 서열은 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변화를 도입하거나 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 원하는 특징을 갖는 최종 구축물이 생성되도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다. 아미노산 변경은 서열이 제조되는 시점에 대상 항체 아미노산 서열에 도입될 수 있다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발의 바람직한 위치인 항체의 특정 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 지칭된다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 대전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 대전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 미친다. 이후, 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치를 치환 부위에서 또는 치환 부위에 대하여 추가적인 또는 다른 변이체를 도입함으로써 정련시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변형을 도입하기 위한 부위는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정할 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해, 표적 코돈 또는 영역에서 ala 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 이뮤노글로불린을 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산 서열 삽입은 길이가 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드까지의 범위인 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합체 및 또한 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변형은 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 항체의 글리코실화 정도가 증가되거나 감소되도록 변경된다. 폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결은 아스파라진 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 잔기의 부착을 지칭한다. 트리펩티드 서열, 아스파라진-X-세린 및 아스파라진-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라진 측쇄로 탄수화물 잔기를 효소적 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성한다. O-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌으로의 당, N-아세일갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신이 사용될 수도 있다.
항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 1개 이상의 상기한 트리펩티드 서열이 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 또한 본래의 항체 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 통해 수행될 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).
변이체 IgG의 Fc 영역에 부착된 탄수화물은 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생성된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 대한 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지된 2분지의 올리고당을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. (1997) TIBTECH 15:26-32]을 참조한다. 상기 올리고당은 각종 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산, 및 또한 2분지형 올리고당 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG에서의 올리고당의 변형은 특정의 추가로 개선된 특성을 갖는 변이체 IgG가 생성되도록 이루어질 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 위치 297에서 알라닌으로의 아미노 치환을 추가로 포함한다.
예를 들어, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 없는 탄수화물 구조를 갖는 항체 변형체가 제공된다. 이러한 변형체에서는 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 하꼬 고교 컴퍼니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))를 참조한다. "푸코스제거(defucosylated)" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변형에 관련된 간행물의 예는 하기 문헌을 포함한다:
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푸코스가 제거된 항체를 생성할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 ([Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)], 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L) 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al.) (특히, 실시예 11)) 및 넉아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 FUT8이 넉아웃된 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)], [Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)] 및 WO 2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고당을 갖는 항체 변형, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 2분지형 올리고당이 GlcNAc에 의해 이등분된 항체 변형체가 추가로 제공된다. 이러한 항체 변형체에서는 푸코실화가 감소되고/되거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변형의 예는 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.) 및 US 2005/0123546 (Umana et al.)에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고당 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변형체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변형체에서는 CDC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변형은 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.), WO 1998/58964 (Raju, S.) 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 모든 이펙터 기능이 아니라 일부 이펙터 기능을 보유하여 생체내 항체의 반감기가 중요하긴 하지만 특정 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 많은 적용 분야에 대한 바람직한 후보가 되는 항체 변형체를 고려한다. 특정 실시양태에서, 항체의 Fc 활성을 측정하여 원하는 특성만이 유지되는 것을 확인한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합은 없지만 (따라서, ADCC 활성이 없을 수 있음), FcRn 결합 능력은 유지되는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 주요 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991)]의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하는 시험관내 검정의 비-제한적 예는 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)], 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사능 검정 방법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포계측을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사능 세포독성 검정 (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.)) 및 사이톡스(CytoTox) 96® 비-방사능 세포독성 검정 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가(Promega)) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 천연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 예를 들어 문헌 [Clynes et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 생체내 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성이 없다는 것을 확인하기 위해 C1q 결합 검정을 수행할 수도 있다. 보체 활성화를 평가하기 위해서 CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)], [Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)] 및 [Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 청소율/반감기 결정 역시 당업계에 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 기타 항체 변형체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발에서의 위한 관심 부위는 초가변 영역을 포함하지만 FR 변경도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제하에 표 1에 나타냈다. 하기 표 1에 "예시적인 치환"으로 명명되거나 아미노산 클래스를 언급하며 아래에 추가로 기재된 보다 실질적인 변화가 제공된다. 아미노산 치환을 관심 항체 내로 도입하고, 생성물을 예를 들어 원하는 활성, 예컨대 개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 개선된 ADCC 또는 CDC 등에 대해 스크리닝할 수 있다.
Figure pat00010
항체의 생물학적 특성에 있어서의 변형은, (a) 치환 영역에서 예를 들어 시트 또는 나선 형태로서의 폴리펩티드 주쇄에 영향을 미치거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성에 영향을 미치거나, 또는 (c) 측쇄의 크기에 영향을 미치는 치환을 선택함으로써 수행될 수 있다. 아미노산은 그의 측쇄 특성의 유사성에 따라 다음과 같은 군으로 나뉠 수 있다 ([A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers,New York (1975)]):
(1) 비-극성:
Figure pat00011
(2) 대전되지 않은 극성:
Figure pat00012
(3) 산성:
Figure pat00013
(4) 염기성:
Figure pat00014
대안적으로, 천연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 나뉠 수 있다:
(1) 소수성:
Figure pat00015
(2) 중성 친수성:
Figure pat00016
(3) 산성:
Figure pat00017
(4) 염기성:
Figure pat00018
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기:
Figure pat00019
(6) 방향족:
Figure pat00020
비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다. 이러한 치환된 잔기는 또한 보존적 치환 부위 내로 또는 나머지 (비-보존된) 부위 내로 도입될 수 있다.
치환적 변형의 한가지 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 특정 실시양태에서, 모 항체는 야생형 대응 변이체 IgG (예를 들어, 아미노산 서열에 임의의 추가의 변경이 없는 본 발명의 변이체 IgG)이다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된 생성된 항체는 이것들이 생성된 모 항체에 비해 변형된 (예를 들어, 개선된) 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환적 변형체는 친화도 성숙 항체이고, 이것은 파지 디스플레이-기재의 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게 설명하면, 여러 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6개 또는 7개 부위)를 각 부위에서 모든 가능한 아미노산 치환이 생성되도록 돌연변이시킨다. 이로써 생성된 항체를 필라멘트형 파지 입자로부터 각 입자 내에 패키지된 파지 외피 단백질 (예를 들어, M13의 유전자 III 생성물)의 적어도 일부에 대한 융합체로서 디스플레이시킨다. 이어서, 파지-디스플레이된 항체를 이것들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형시킬 후보 초가변 영역 부위를 확인하기 위해서, 스캐닝 돌연변이유발 (예를 들어, 알라닌 스캐닝)을 수행하여 항원 결합에 유의하게 기여하는 초가변 영역 잔기를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인하기 위해서는 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하는 것이 유익할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 본원에서 상술된 기술에 따라 치환시킬 후보이다. 일단 이러한 변형된 항체가 생성되면, 항체의 패널을 당업계에 공지된 기술, 예를 들어 본원에 기재된 기술로 스크리닝하고, 하나 이상의 관련 검정에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가 개발을 위해 선택할 수 있다.
변형된 항체 (예를 들어, 변형된 변이체 IgG)의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 이러한 방법은 천연 공급원으로부터의 단리 (천연 발생 아미노산 서열 변형체의 경우), 또는 이전에 제조된 변형된 항체 또는 변형되지 않은 버전의 항체의 올리고뉴클레오티드-매개 (또는 부위 지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원 명세서 및 당업계의 교시내용에 따라, 특정 실시양태에서, 본 발명의 항체 변형은 야생형 대응 변이체 IgG (예를 들어, 아미노산 서열에 임의의 추가의 변경이 없는 본 발명의 변이체 IgG)와 비교하여 1개 이상의 변경을 포함할 수 있음이 고려된다. 그럼에도 불구하고, 추가의 변경을 포함하는 이러한 항체 변형은 야생형 대응 변이체 IgG와 비교하여 치료 유용성에 필요한 실질적으로 동일한 특징을 보유할 것이다. 특정 실시양태에서, 야생형 대응 변이체 IgG는 베바시주맙의 변이체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Fc 영역을 포함하는 Fc 폴리펩티드의 계면 내에서의 변형을 포함하는 항체 변형체를 제공하며, 이러한 변형은 이종이량체화를 용이하게하고/하거나 촉진시킨다. 이들 변형은 제1 Fc 폴리펩티드 내로의 돌출부 도입 및 제2 Fc 폴리펩티드 내로의 공동의 도입을 포함하고, 여기서 상기 돌출부는 상기 공동 내에 위치하여 제1 및 제2 Fc 폴리펩티드의 복합체화를 촉진시킬 수 있다. 이러한 변형을 갖는 항체를 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 5,731,168에 기재되어 있다.
또 다른 측면에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에 존재한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되고, 이것을 이용하여 항체를 본원에 추가로 기재된 바와 같은 다른 부분, 예컨대 약물 부분 또는 링커-약물 부분에 접합시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 임의의 1개 이상의 하기 잔기가 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 번호매김), 중쇄의 A118 (EU 번호매김), 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 번호매김).
항체 유도체
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 당업계에 공지되고 쉽게 입수가능한 추가의 비-단백질성 부분을 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 세포독성제와 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포독성제와 결합된 변이체 IgG는 세포에 의해 내재화되어 여기에 결합되는 암 세포를 사멸시키는데 있어서의 접합체의 치료 효능이 증가된다. 한 실시양태에서, 세포독성제는 암 세포 중의 핵산을 표적으로 하거나 이를 저해한다.
특정 실시양태에서, 항체의 유도체화에 적합한 잔기는 수용성 중합체이다. 수용성 중합체의 비-제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이것들의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제조에 유리할 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착되는 중합체의 수는 다양할 수 있으며, 1개 초과의 중합체가 부착될 경우에 이것들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비-단백질성 부분의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비-단백질성 부분은 탄소 나노튜브이다 ([Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)]). 방사선은 임의의 파장을 가질 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비-단백질성 부분에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비-단백질성 부분을 가열하는 파장을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
변이체 IgG의 제조
변이체 IgG는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG 서열은 구성원 서열을 코딩하고 원한다면 이후에 숙주 세포로 클로닝되고 발현 및 검정될 수 있는 핵산을 생성하는데 사용된다. 이러한 실행은 공지된 절차를 이용하여 수행되고, 여기에 이용될 수 있는 다양한 방법이 문헌 [Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001)] 및 [Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley ＆ Sons)] (둘다 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 변이체 IgG를 코딩하는 핵산을 발현 벡터 내로 혼입시켜서 단백질을 발현시킬 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 제어 또는 조절 서열과 작동가능하게 연결된, 즉 기능적 관계로 배치된 단백질, 선별가능한 마커, 임의의 융합 파트너 및/또는 추가의 요소를 포함한다. 변이체 IgG는 변이체 IgG를 코딩하는 핵산, 바람직하게는 이것을 함유하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 상기 단백질의 발현을 유도하거나 야기하는데 적절한 조건하에 배양하여 생성될 수 있다. 포유동물 세포, 박테리아, 곤충 세포 및 효모를 포함하지만 이에 제한되지 않는 광범위하게 다양한 적절한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 예를 들어, 사용될 수 있는 다양한 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type CultureCollection)으로부터 입수할 수 있는 ATCC 세포주 카탈로그 (본원에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 외인성 핵산을 숙주 세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 사용되는 숙주 세포에 따라 달라질 것이다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 발현 후에 정제되거나 단리된다. 항체는 당업자에게 공지된 다양한 방법으로 단리되거나 정제될 수 있다. 표준 정제 방법은 크로마토그래피 기술, 전기영동, 면역학적, 침전, 투석, 여과, 농축 및 크로마토포커싱 기술을 포함한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 다양한 천연 단백질, 예를 들어 박테리아 단백질 A, G 및 L이 항체에 결합하며, 이들 단백질을 정제에 이용할 수 있다. 종종, 정제는 특정 융합 파트너에 의해 가능해질 수 있다. 예를 들어, GST 융합체가 사용되는 경우에는 단백질을 글루타티온 수지를 이용하여 정제할 수 있고, His-태그가 사용되는 경우에는 단백질을 Ni+2 친화도 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있고, 또는 flag-태그가 사용되는 경우에는 단백질을 고정된 항-flag 항체를 사용하여 정제할 수 있다. 적합한 정제 기술에서의 일반적인 지침에 대하여는, 문헌 [Antibody Purification:Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994] (본원에 그 전문이 참고로 포함됨)을 참조한다.
변이체 IgG의 스크리닝
본 발명의 변이체 IgG는 시험관내 검정, 생체내 및 세포-기재의 검정을 사용하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법 및 선별 기술을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 자동화 및 고처리량 스크리닝 기술을 스크리닝 절차에 이용할 수 있다. 스크리닝은 융합 파트너 또는 표지, 예를 들어 면역 표지, 동위원소 표지, 또는 소분자 표지, 예컨대 형광 또는 열량측정 염료를 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 기능적 및/또는 생물물리학적 특성을 시험관내 검정으로 스크리닝할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단백질을 기능성, 예를 들어 그의 반응 촉매 능력 또는 그의 표적에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝한다.
스크리닝 방법의 하위세트는 라이브러리의 유리한 구성원을 선택하는 것이다. 상기 방법은 본원에서 "선별 방법"이라 지칭되고, 이러한 방법은 본 발명에서 변이체 IgG를 스크리닝하는데 이용된다. 선별 방법을 이용하여 단백질 라이브러리를 스크리닝하는 경우, 일부 선별 기준을 충족시키는 유리한 라이브러리 구성원만을 증식, 단리 및/또는 관찰한다. 본 발명에서 단백질 라이브러리를 스크리닝하는데 이용될 수 있는 다양한 선별 방법이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 다른 선별 방법은 디스플레이에 의존적이지 않은 방법, 예컨대 생체내 방법을 포함한다. "방향적 진화(directed evolution)" 방법이라 지칭되는 하위세트의 선별 방법은 선별 동안 때때로 새로운 돌연변이가 혼입된 유리한 서열을 선택하는 것을 포함하는 방법이다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 1종 이상의 세포-기재 또는 생체내 검정으로 스크리닝된다. 이러한 검정에서, 정제되거나 정제되지 않은 단백질은 전형적으로 세포가 라이브러리에 속한 개개의 변이체 또는 변이체의 풀에 노출되도록 외부에서 첨가된다. 이러한 검정은 전형적으로 (언제나 그러한 것은 아님) 변이체 IgG의 기능, 즉 변이체 IgG가 그의 표적에 결합하고 일부 생화학적 사건, 예를 들어 이펙터 기능, 리간드/수용체 결합 억제, 세포자멸 등을 매개하는 능력을 기초로 한다. 이러한 검정은 종종 IgG에 대한 세포의 반응, 예를 들어 세포 증식, 세포 이동, 혈관신생, 세포 생존, 세포 사멸, 세포 형태의 변화, 또는 전사 활성화, 예컨대 천연 유전자 또는 리포터 유전자의 세포 발현을 모니터링하는 것을 수반한다. 예를 들어, 이러한 검정은 IgG 변이체가 ADCC, ADCP 또는 CDC를 유발하는 능력을 측정할 수 있다. 일부 검정의 경우에, 표적 세포에 추가하여 추가의 세포 또는 성분, 예를 들어 혈청 보체, 또는 이펙터 세포, 예컨대 말초혈 단핵구 (PBMC), NK 세포, 대식세포 등의 첨가가 필요할 수 있다. 이러한 추가의 세포는 임의의 유기체, 바람직하게는 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이 유래의 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 혈관신생을 억제할 수 있고, 이러한 활성을 모니터링하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 표적을 발현하는 특정 세포주의 세포자멸을 야기할 수도 있고, 또는 이것이 검정에 첨가된 면역 세포에 의한 표적 세포에 대한 공격을 매개할 수도 있다. 세포 사멸 또는 생존을 모니터링하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 염료, 면역화학, 세포화학 및 방사능 시약의 사용을 포함한다. 전사 활성화는 또한 세포-기재의 검정으로 기능을 검정하는 방법으로서 이용될 수 있다. 대안적으로, 세포-기재의 스크리닝은 변이체를 코딩하는 핵산으로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 사용하여 수행된다. 즉, 변이체 IgG가 세포에 외부에서 첨가되지 않는다.
변이체 IgG의 생물학적 특성은 세포, 조직 및 온전한 유기체 실험에서 특징규명될 수 있다. 종종, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지 및 원숭이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 동물에서 질환 또는 질환 모델에 대한 약물의 치료 효능을 측정하거나 약물의 약력학, 독성 및 기타 특성을 측정하기 위해서 약물이 시험된다. 상기 동물은 질환 모델이라 지칭될 수 있다. 종종, 치료제는 누드 마우스, SCID 마우스, 이종이식편 마우스 및 트랜스제닉 마우스 (예를 들어, 넉인(knockin) 및 넉아웃)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 마우스에서 시험된다. 이러한 실험은 치료제로 사용될 단백질의 잠재력을 결정하기 위한 의미있는 데이타를 제공할 수 있다. 임의의 유기체, 바람직하게는 포유동물이 시험에 사용될 수 있다. 예를 들어, 원숭이는 인간과의 유전학적 유사성으로 인해 적합한 치료 모델일 수 있고, 따라서 변이체 IgG의 효능, 독성, 약력학 또는 기타 특성을 시험하는데 사용될 수 있다. 약물로서 승인받기 위해서는 인간에서의 시험이 궁극적으로 필요하기 때문에 이러한 실험이 고려되는 것이 당연하다. 따라서, 변이체 IgG는 이것의 치료 효능, 독성, 면역원성, 약력학 및/또는 기타 임상적 특성을 결정하기 위해 인간에서 시험될 수 있다.
변이체 IgG의 치료 용도
변이체 IgG는 광범위한 범위의 생성물에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, IgG 변이체는 치료용, 진단용 또는 연구용 시약이다. 변이체 IgG는 모노클로날 또는 폴리클로날인 항체 조성물에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 표적 항원, 예컨대 VEGF를 차단하거나 길항 작용을 하거나 효능 작용을 하는데 사용된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 VEGF 활성을 차단하거나 중화시키는데 사용된다. 한 실시양태에서, VEGF 활성은 혈관신생이다.
변이체 IgG는 본원의 "정의"에서 정의된 바와 같은 신생물 및/또는 비-신생물 질환을 갖는 환자의 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 치료 목적을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 신생물 질환은 암이다. 특정 실시양태에서, 환자에게 우선 야생형 IgG를 처치한 후에 변이체 IgG를 처치한다. 한 실시양태에서, 환자에게 우선 베바시주맙을 처치한 후에 변이체 IgG, 예를 들어 베바시주맙의 변이체를 처치한다. 특정 실시양태에서, 환자에게 베바시주맙을 약 6개월 동안 처치한 후에 변이체 IgG, 예를 들어 베바시주맙의 변이체를 처치한다.
임상 시험 또는 개발시에 사용하도록 승인을 받은 수많은 항체 및 Fc 융합체가 본원에서 "임상적 생성물 및 후보"라 지칭된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 소정 범위의 임상적 생성물 및 후보에서 사용될 수 있다. 변형될 수 있는 항체의 예는 표적 항원, 예컨대 VEGF, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), CD20, IgE, CD11, 저밀도 지단백질 (LDL), 인터루킨 4 (IL-4), 인터루킨 13 (IL-13), C형 간염의 에피토프, A-베타, IL-17A, IL-17F, DR6, DR5, 인간 사이토메갈로바이러스의 에피토프, 스타필로코쿠스 아우레우스의 에피토프, 조직 인자, 알파4베타7 인테그린, 알파5베타1 인테그린, CTLA4, CD3, RSV의 에피토프, NF알파, CD147, IL8, MUC18, MUC1, 알파4베타1 (VLA-4) 인테그린, 림포톡신 알파 수용체, 림포톡신 베타 수용체 (LTBR), TGF-β2, IL-12, TGFβ1, 에오탁신1, BAFF, TRAIL-R1, IL15, 헤파라나제 I; CD40, CD154, CD80, CD23, 대식세포 이동 인자 (MIF), KDR, flk-1, VE 카드헤린, 암성배아 항원 (CEA), CD22, CTLA4, CD30, 세포간 접착 분자-1, 항-섬유아세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR-3), 감마 인터페론, IL-12, Ep-CAM 항체 및 베타2 인테그린에 결합할 수 있는 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
변형될 수 있는 임상적 생성물 및 후보의 예는 항-VEGF 항체 아바스틴® (베바시주맙, 제넨테크) (예를 들어, 미국 특허 번호 7,169,901 참조 (그 전문이 참고로 포함됨)); 인간화 항-HER2 모노클로날 항체 헤르셉틴® (트라스투주맙, 제넨테크) (예를 들어, 미국 특허 번호 6,489,447 참조 (그 전문이 참고로 포함됨)); 키메라 항-CD20 항체 리툭산(RITUXAN)® (리툭시맙, 아이데크(IDEC)/제넨테크/로쉐(Roche)); 항-IgE 항체 크솔라르® (오말리주맙, 제넨테크); 다른 항-CD20 항체; 항-CD11a 항체 랍티바® (에팔리주맙, 제넨테크/크소마(Xoma)); 항-Her2 항체 옴니타르그(OMNITARG)® (페르투주맙, 제넨테크); 항-oxLDL 항체 (예를 들어, 미국 공개 번호 20040202653 및 WO 2004030607 참조 (둘다 그 전문이 참고로 포함됨)); 항-CD4 항체 MTRX1011A (예를 들어, WO 02/102853 참조 (그 전문이 참고로 포함됨)); 표적 항원이 IL-4 및 IL-13인 이중특이적 항체; 항-HCV 항체; 항-IL-17A/F 항체; 항-A-베타 항체; 항-DR6 항체; 항-인간 사이토메갈로바이러스 (HCMV) 항체; 항-HER 수용체 부류 항체; 항-조직 인자 항체; MLN-02 항체, α4β7 인테그린에 대한 인간화 IgG1 모노클로날 항체 (이전에는, LDP-02, 제넨테크/밀레니엄 파마슈티칼즈(Millennium Pharmaceuticals)); 인간화 항-CD18 F(ab')2 항체; 및 인간화 항-IgE IgG1 항체 rhuMab-E25 (제넨테크/노파르티스(Norvartis)/타녹스 바이오시스템즈(Tanox Biosystems))를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이와 같이 변형될 수 있는 추가의 임상적 생성물 및 후보는 비-호지킨 림프종 치료용으로 승인을 받은 키메라 항-CD20 항체; 항-CD20 항체 HuMax-CD20(젠맵(Genmab)); 항-CD20 항체 AME-133 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,500,362 참조 (그 전문이 참고로 포함됨), 어플라이드 몰레큘라 에볼루션(Applied Molecular Evolution)); hA20 (이뮤노메딕스, 인크.(Immunomedics, Inc.)), HumaLYM(인트라셀(Intracel)), 및 PRO70769 (PCT/US2003/040426 (그 전문이 참고로 포함됨))를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 표피 성장 인자 수용체 부류의 구성원, 예를 들어 EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4)를 표적으로 하는 수많은 항체도 본 발명에 기재된 Fc 영역에 대한 변형이 유익할 수 있다. 예를 들어, IgG 변이체가 에르비툭스(ERBITUX)® (세툭시맙, 임클론(Imclone)) (미국 특허 번호 4,943,533, WO 96/40210 (둘다 그 전문이 참고로 포함됨))과 실질적으로 유사한 항체; 각종 암에 대해 임상 시험 중인 키메라 항-EGFR 항체; ABX-EGF (미국 특허 번호 6,235,883 (그 전문이 참고로 포함됨), 아브제닉스(Abgenix)/이뮤넥스(Immunex)/암젠(Amgen)); HuMax-EGFr(미국 시리즈 번호 10/172,317 (그 전문이 참고로 포함됨), 젠맵); 425, EMD55900, EMD62000 및 EMD72000 (머크(Merck) KGaA) (미국 특허 번호 5,558,864, [Murthy et al., 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60], [Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20], [Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773-83] (모두가 그 전문이 참고로 포함됨)); ICR62 (인스티튜트 오브 캔서 리써치(Institute of Cancer Research)) (WO 95/20045, [Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129-46], [Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53], [Modjtahedi et al., 1996, Br J Cancer, 73(2):228-35], [Modjtahedi et al., 2003, Int J Cancer, 105(2):273-80] (모두가 그 전문이 참고로 포함됨)); TheraCIM hR3 (캐나다 소재의 와이엠 바이오사이언시즈(YM Biosciences) 및 쿠바 소재의 센트로 드 이뮤놀로지아 몰레큘라(Centro de Immunologia Molecular) (미국 특허 번호 5,891,996, 6,506,883, [Mateo et al., 1997, Immunotechnology, 3(1):71-81]) (모두가 그 전문이 참고로 포함됨)); mAb-806 (루드빅 인스티튜트 포 캔서 리써치(Ludwig Institute for Cancer Research), 메모리얼 슬로안-케터링(Memorial Sloan-Kettering)) ([Jungbluth et al., 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2):639-44]); KSB-102 (케이에스 바이오메딕스(KS Biomedix) (그 전문이 참고로 포함됨)); MR1-1 (IVAX, 미국 국립 암 연구소(National Cancer Institute)) (WO 0162931A2 (그 전문이 참고로 포함됨)); 및 SC100 (스칸셀(Scancell)) (WO 01/88138 (그 전문이 참고로 포함됨))에서 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 IgG 변이체는 B-세포 만성 림프구성 백혈병의 치료용으로 현재 승인을 받은 인간화 모노클로날 항체인 캄패스(CAMPATH)® (알렘투주맙, 겐자임 코포레이션(Genzyme Corporation))에서 사용될 수 있다. 본 발명의 IgG 변이체는 VEGF-Trap (레제네론(Regeneron)); 무로모납-CD3 (오르토클론(Orthoclone) OKT3®), 항-CD3 항체 (오르토 바이오테크(Ortho Biotech)/존슨 앤드 존슨(Johnson ＆ Johnson)); 항-CD20 항체 제발린(ZEVALIN)® (이브리투모맙 티욱세탄, 아이데크/쉐링 아게(Schering AG)); 항-CD33 항체 밀로타르그(MYLOTARG)®, (p67 단백질) 항체 겜투주맙 오조가미신 (셀테크(Celltech)/와이어쓰(Wyeth)); 항-LFA-3 Fc 융합 항체 아메비브(AMEVIVE)® (알레파셉트, 바이오젠(Biogen)); 레오프로(REOPRO)® (아브식시맙, 센토코르(Centocor)/릴리(Lilly)); 시물렉트(SIMULECT)® (바실릭시맙, 노파르티스); 시나기스(SYNAGIS)® (팔리비주맙, 메드이뮨(MedImmune)); 항-TNF알파 항체 레미케이드(REMICADE)® (인플릭시맙, 센토코르); 항-TNF알파 항체 휴미라(HUMIRA)®, (아달리무맙, 애보트(Abbott)); 인간화 IgG4 항-TNF 항체 휴미케이드(HUMICADE)® (셀테크); 항-TNF알파 Fc 융합 엔브렐(ENBREL)® (에타네르셉트, 이뮤넥스(Immunex)/암젠); 항-CD147 항체 ABX-CBL (아브제닉스); 항-IL8 항체 ABX-IL8 (아브제닉스); 항-MUC18 항체 ABX-MA1 (아브제닉스); 항-MUC1 항체 펨투모맙 (R1549, 90Y-muHMFG1) (안티소마(Antisoma)); 항-MUC1 항체 테렉스 (R1550) (안티소마); AngioMab (AS1405) (안티소마); HuBC-1(안티소마); 티오플라틴 (AS1407) (안티소마); 티사브리(TYSABRI)® (이전에는 안테그렌(ANTEGREN)®, 나탈리주맙), 항-알파-4-베타-1 (VLA-4) 및 알파-4-베타-7 항체 (바이오젠); 항-VLA-1 인테그린 항체 VLA-1 mAb (바이오젠); 항-림포톡신 베타 수용체 (LTBR) 항체 LTBR mAb (바이오젠); 항-TGF-β2 항체 CAT-152 (캠브릿지 안티바디 테크놀로지(Cambridge Antibody Technology)); J695, 항-IL-12 항체 (캠브릿지 안티바디 테크놀로지/애보트); CAT-192, 항-TGFβ1 항체 (캠브릿지 안티바디 테크놀로지/겐자임); CAT-213, 항-에오탁신1 항체 (캠브릿지 안티바디 테크놀로지); 림포스타트-비(LYMPHOSTAT-B)®, 항-Blys 항체 (캠브릿지 안티바디 테크놀로지/휴먼 게놈 사이언시즈 인크.(Human Genome Sciences Inc.)); TRAIL-R1mAb, 항-TRAIL-R1 항체 (캠브릿지 안티바디 테크놀로지/휴먼 게놈 사이언시즈, 인크.); HUMAX-CD4, 항-CD4 항체 (젠맵); HuMax-IL15, 항-IL15 항체 (젠맵/암젠); HuMax-Inflam(젠맵/메다렉스(Medarex)); HuMax-Cancer, 항-헤파라나제 I 항체 (젠맵/메다렉스/옥스포드 글라이코사이언시즈(Oxford GlycoSciences)); HuMax-Lymphoma(젠맵/암젠); HuMax-TAC(젠맵); 아이데크-131, 항-CD40L 항체 (아이데크 파마슈티칼즈(IDEC Pharmaceuticals)); 아이데크-151 (클레놀릭시맙), 항-CD4 항체 (아이데크 파마슈티칼즈); 아이데크-114, 항-CD80 항체 (아이데크 파마슈티칼즈); 아이데크-152, 항-CD23 항체 (아이데크 파마슈티칼즈); 항-대식세포 이동 인자 (MIF) 항체 (아이데크 파마슈티칼즈); BEC2, 항-이디오형 항체 (임클론); IMC-1C11, 항-KDR 항체 (임클론); DC101, 항-flk-1 항체 (임클론); 항-VE 카드헤린 항체 (임클론); CEA-사이드(CIDE)® (라베투주맙), 항-암성배아 항원 (CEA) 항체 (이뮤노메딕스(Immunomedics)); 림포사이드(LYMPHOCIDE)® (에프라투주맙), 항-CD22 항체 (이뮤노메딕스); AFP-사이드(Cide) (이뮤노메딕스); 마이엘로마사이드(MyelomaCide) (이뮤노메딕스); 엘코사이드(LkoCide) (이뮤노메딕스); 프로스타사이드(ProstaCide) (이뮤노메딕스); MDX-010, 항-CTLA4 항체 (메다렉스); MDX-060, 항-CD30 항체 (메다렉스); MDX-070 (메다렉스); MDX-018 (메다렉스); 오시뎀(OSIDEM)® (IDM-1), 항-Her2 항체 (메다렉스/이뮤노-디자인드 몰레큘즈(Immuno-Designed Molecules)); CNTO 148, 항-TNFα 항체 (메다렉스/센토코르/제이앤드제이(J＆J)); CNTO 1275, 항-시토카인 항체 (센토코르/제이앤드제이); MOR101 및 MOR102, 항-세포간 접착 분자-1 (ICAM-1, 또한 CD54라고 공지되어 있음) 항체 (모르포시스(MorphoSys)); MOR201, 항-섬유아세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR-3) 항체 (모르포시스); 누비온(NUVION)® (비실리주맙), 항-CD3 항체 (프로테인 디자인 랩스(Protein Design Labs)); HuZAF®, 항-감마 인터페론 항체 (프로테인 디자인 랩스); α5β1 인테그린에 대한 항체 (프로테인 디자인 랩스); 항-IL-12 (프로테인 디자인 랩스); ING-1, 항-Ep-CAM 항체 (크소마); 및 MLN01, 항-베타2 인테그린 항체 (크소마) (본 단락에서 상기 언급된 모든 참고문헌은 본원에 참고로 명백하게 포함됨)를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 다른 임상적 생성물 및 후보와 실질적으로 유사한 다양한 항체 또는 Fc 융합체에서 사용될 수 있다.
본 발명의 IgG Fc 영역에서 변형을 갖는 변이체 IgG는 상기 언급된 임상적 후보 및 생성물, 또는 이것과 실질적으로 유사한 항체 및 Fc 융합체로 혼입될 수 있다. 본 발명의 변이체 IgG는 또한 인간화되거나 친화도 성숙되거나 조작되거나, 또는 일부 다른 방법으로 변형된 버전의 상기 언급된 임상적 후보 및 생성물로 혼입될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 양성, 전암성 또는 비-전이성 암의 치료; 잠복기 종양 또는 미세전이물의 치료; 종양 재발 또는 재성장의 예방; 또는 암이 발생할 위험이 있는 대상체에서 암의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 Fc 변형을 포함하는 변이체 IgG는 비-전이성 암을 갖는 대상체의 치료를 위한 아주반트 요법에서 결정적 수술 후에 사용될 수도 있고, 또는 수술가능한 암을 갖는 대상체에서 상기 암의 수술적 제거 전에 상기 대상체의 치료를 위해 행해지는 네오아주반트 요법에서 사용될 수도 있다. 아래의 기재에서 치료 용도가 예방, 네오아주반트 요법 및 아주반트 요법으로 분리되지만, 당업자는 이러한 카테고리가 반드시 상호 배타적일 필요는 없음을 이해할 것이다.
종양의 분류
암의 병기분류 시스템은 암이 해부학적으로 얼마나 멀리 확산되었는지를 기재하고, 동일한 병기 군에서 유사한 예후 및 치료를 나타내는 환자를 수용하고자 하는 것이다. 생검 및 특정 영상화 시험, 예를 들어 흉부 x-선, 유방촬영사진, 골 스캐닝, CT 스캐닝, 및 MRI 스캐닝을 비롯한, 암의 병기분류를 돕기 위한 몇가지 시험을 수행할 수 있다. 또한, 혈액 시험 및 임상 평가를 이용하여 환자의 전반적인 건강 상태를 평가하고 암이 특정 장기로 확산되었는지의 여부를 검출할 수 있다.
암의 병기분류를 위해서, 미국 암 연합 위원회(American Joint Committee on Cancer)는 우선 암, 특히 충실성 종양에 TNM 분류 시스템을 이용한 문자 카테고리를 부여한다. 암은 문자 T (종양 크기), N (감지가능한 결절) 및/또는 M (전이)로 표시된다. T1, T2, T3 및 T4는 원발성 병변의 증가 크기를 기재하고, N0, N1, N2, N3은 점진적으로 진행되는 결절의 존재를 표시하고, M0 및 M1은 원위 전이물의 부재 또는 존재를 반영한다.
전반적인 병기분류 또는 로마 숫자 병기분류라고도 공지된 제2 병기분류 방법에서는 암을 0기 내지 IV기로 나누며, 원발성 병변의 크기 및 또한 결절 확산 및 원위 전이의 존재 여부를 도입한다. 이러한 시스템에서는, 사례를 로마 숫자 I 내지 IV로 표시되는 4가지 병기로 분류하거나 "재발"로서 분류한다. 일부 암의 경우에, 0기는 "계내" 또는 "Tis"라고 지칭되는데, 예를 들어 유방암의 경우에 계내 소엽 암종 또는 계내 관상 암종이다. 고 악성도 선종은 또한 0기로 분류될 수도 있다. 일반적으로, I기 암은 통상적으로 치유가능한 작은 국소 암인 반면, IV기 암은 통상적으로 수술이 불가능한 암 또는 전이성 암을 나타낸다. II기 및 III기 암은 통상적으로 국소 진행되고/되거나 국소 림프절의 존재를 나타낸다. 일반적으로, 보다 높은 병기 숫자는 보다 광범위한 질환, 예를 들어 보다 큰 종양 크기 및/또는 원발성 종양에 인접한 근처 림프절 및/또는 장기로의 암의 확산을 표시한다. 이러한 병기는 정확하게 규정되지만, 그 정의는 각 종류의 암마다 상이하고 당업자에게 공지되어 있다.
많은 암 등기소, 예컨대 NCI의 SEER (Surveillance, Epidemiology, and End Results Program)은 요약 병기분류를 이용한다. 이 시스템은 모든 유형의 암에 사용된다. 이는 암 사례를 5가지 주요 카테고리로 분류한다:
계내 암은 암이 시작되는 세포 층에만 존재하는 초기 암이다.
국소 암은 암이 시작되는 장기로 제한되는 암으로, 확산의 증거가 없다.
국부 암은 본래의 (원발성) 부위를 벗어나서 근처 림프절 또는 장기 및 조직으로 확산된 암이다.
원위 암은 원발성 부위로부터 원위 장기 또는 원위 림프절로 확산된 암이다.
미지의 암은 병기 표시에 충분한 정보가 없는 사례를 기재하는데 사용된다.
또한, 원발성 종양이 제거된 지 수 개월 또는 수 년 후에 암이 재발되는 것은 흔한 일이다. 모든 가시적 종양이 근절된 후에 재발되는 암은 재발성 질환이라 불린다. 원발성 종양 부위에서 재발되는 질환은 국소적으로 재발성이고, 전이물로서 재발되는 질환은 원위 재발이라 지칭된다. 잠복기 종양은 종양 세포가 존재하긴 하지만 종양 진행이 임상적으로 명백하지 않은 휴지기 상태로 존재하는 종양이다. 미세전이물은 전이물이 작거나 원발성 종양으로부터 기타 신체 부위로 확산된 세포 수가 적다. 미세전이는 스크리닝 또는 진단 시험에서 검출될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 본 발명의 방법은, 예를 들어 잠복기 종양 또는 미세전이물이 존재하긴 하지만 임상적으로 검출될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 상황에서 잠복기 종양 또는 미세전이물의 발생 또는 종양의 재발을 예방하는데 유용하다.
본 발명의 방법은 또한 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는 초기 암을 치료하는 데에 유용하다. 이것은 임의의 0기, I기 또는 II기 종양; 임의의 비-전이성 II기 종양; 전형적으로 암으로 진행 또는 발달되는 임의의 상태, 예를 들어 이형성; 및 본래의 부위에 국소화된 채로 유지되고 원위 부위로 침윤, 침습 또는 전이되지 않은 임의의 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양의 예는 폴립, 선종, 섬유종, 지방종, 가스트린종, 인슐린종, 연골종, 골종, 혈관종, 림프관종, 수막종, 평활근종, 횡문근종, 편평 세포 유두종, 청신경종, 신경섬유종, 담관 낭선종, 평활근종, 중피종, 기형종, 점액종, 트라코마, 육아종, 과오종, 이행 세포 유두종, 침샘의 다형성 선종, 인대양 종양, 유피 낭종 유두종, 낭선종, 초점성 결절성 과증식 및 결절성 재생성 과증식을 포함한다.
혈관신생은 원발성 종양 성장 및 전이 둘다에 관여하기 때문에, 본 발명에 의해 제공되는 항-혈관신생 처치는 원발성 부위에서 종양의 신생물 성장을 억제할 수 있고 또한 2차 부위에서의 종양의 전이를 예방할 수 있어서, 다른 치료제에 의한 종양의 공격을 허용한다.
아주반트 및 네오아주반트 요법 및 초기 단계 종양의 치료에 관한 추가의 정보는 미국 출원 번호 12/002,605 및 PCT 출원 PCT/US2007/088000 (이들 특허 출원의 내용은 본원에 참고로 명백하게 포함됨)에 개시되어 있다.
예방
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 양성, 전암성 또는 초기 단계 암의 치료, 또는 종양 재발의 치료 또는 예방을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 항-VEGF 항체이다. 한 실시양태에서, 변이체 IgG는 베바시주맙의 변이체이다. 한 실시양태에서, 변이체 IgG는 베바시주맙의 상보성 결정 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 1) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 2)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 7) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 8)을 포함한다.
상기 방법을 이용하여 암 자체를 치료할 수도 있고, 또는 암이 전이성 또는 침습성 단계 또는 보다 높은 악성도 또는 병기로 진행되는 것을 예방할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법을 이용하여 0기 암 또는 폴립을 갖는 대상체를 치료하여 I기 또는 보다 높은 병기의 종양으로 진행되는 것을 예방할 수 있다. 유사하게, II기 암 환자에서는 상기 방법을 이용하여 상기 암이 III기 또는 IV기 암으로 진행되는 것을 예방할 수 있다.
변이체 IgG는 또한 종양의 재발을 예방하는데 사용될 수도 있다. 예를 들어, 종양을 확인하고 치료한 경우 (예를 들어, 화학요법을 이용하거나 수술적으로 제거함), 변이체 IgG를 사용하여 결장직장 종양의 재발을 국소적으로 예방하거나 결장직장 종양의 전이를 예방할 수 있다. 종양의 재발 예방을 위해, 변이체 IgG를 사용하여 예를 들어 임상적으로 검출가능할 수도 있고 임상적으로 검출가능하지 않을 수도 있는 잠복기 종양 또는 미세전이물을 치료하거나 상기 잠복기 종양 또는 미세전이물의 성장 또는 재성장을 예방할 수 있다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG를 사용하여 암에 걸린 적이 없거나 암 발병 위험이 있는 대상체에서 암을 예방할 수 있다. 암과 관련된 것으로 공지된 다양한 위험 인자가 존재하고, 이것들 중 많은 것들이 본원에 기재되어 있다. 또한, 유전적 암 증후군을 갖는다고 공지된 대상체는 암 발병의 위험이 있는 것으로 간주된다.
네오아주반트 요법
본 발명은 대상체, 예를 들어 인간 환자 (예를 들어, 상기 환자는 종양 및/또는 암으로 진단됨)에게 유효량의 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체, 예를 들어 인간 환자에서 수술가능한 암의 수술적 제거 전에 네오아주반트 요법을 실시하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 항-VEGF 항체이다. 한 실시양태에서, 변이체 IgG는 베바시주맙의 변이체이다. 한 실시양태에서, 변이체 IgG는 베바시주맙의 상보성 결정 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 1) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 2)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 7) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 8)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 1종 이상의 화학요법제와 조합하여 투여된다. 수술 후에 암의 재발 예방을 위해 대상체에게 유효량의 변이체 IgG를 투여하는 추가의 단계는 또한 본원에 기재된 네오아주반트 요법과 함께 이용될 수도 있다. 대상체에게 수술 후에 유효량의 변이체 IgG를 투여하는 추가의 단계를 포함하는 방법의 경우에, 본원에 기재된 임의의 아주반트 방법을 이용할 수 있다.
예를 들어, 한 방법은 a) 복수개의 처치 주기를 포함하고, 여기서 각 주기는 대상체에게 유효량의 변이체 IgG 및 임의로는 1종 이상의 화학요법제를 소정의 간격을 두고 투여하는 것을 포함하는 것인 제1 단계, b) 결정적 수술을 수행하여 암을 제거하는 단계, 및 임의로는 c) 복수개의 유지 주기를 포함하고, 여기서 각 주기는 대상체에게 유효량의 변이체 IgG를 임의의 화학요법제와 함께 또는 이러한 화학요법제 없이 소정의 간격을 두고 투여하는 것을 포함하는 것인 제2 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 것을 포함한다.
투여 스케줄의 한 실시양태에서, 네오아주반트 요법은 변이체 IgG 및 1종 이상의 화학요법제를 복수개의 네오아주반트 주기로 환자에게 투여한 후에 종양을 결정적으로 제거하는 수술을 수행하는 제1 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 네오아주반트 요법은 수술 전에 1년 미만 동안 지속되고, 한 실시양태에서는 수술 전에 6개월 미만 동안 지속된다.
아주반트 요법
본 발명은 비-전이성 암을 갖는 대상체에게 결정적 수술 후에 변이체 IgG를 투여하는 것을 포함하는, 아주반트 요법을 실시하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 항-VEGF 항체이다. 한 실시양태에서, 변이체 IgG는 베바시주맙의 변이체이다. 한 실시양태에서, 변이체 IgG는 베바시주맙의 상보성 결정 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 1) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 2)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 중쇄 가변 도메인 (서열 7) 및 경쇄 가변 도메인 (서열 8)을 포함한다.
예를 들어, 한 방법은 a) 복수개의 처치 주기를 포함하고, 여기서 각 주기는 대상체에게 유효량의 변이체 IgG 및 임의로는 1종 이상의 화학요법제를 소정의 간격을 두고 투여하는 것을 포함하는 것인 제1 단계, 및 b) 복수개의 유지 주기를 포함하고, 여기서 각 주기는 대상체에게 유효량의 변이체 IgG를 임의의 화학요법제 없이 소정의 간격을 두고 투여하는 것을 포함하는 것인 제2 단계를 포함할 수 있고, 여기서 조합된 제1 및 제2 단계는 수술후의 초기 처치 후 적어도 1년 동안 지속된다. 한 실시양태에서, 제1 단계는 변이체 IgG 및 제1 화학요법제를 투여하는 제1 복수개의 처치 주기, 및 이후 변이체 IgG 및 제2 화학요법제를 투여하는 제2 복수개의 처치 주기를 포함한다.
변이체 IgG는 일반적으로 대상체가 수술로부터 회복되는 기간 후에 투여된다. 이러한 기간은 창상 치유 또는 수술 절개부의 치유에 필요한 기간, 창상이 벌어지는 위험을 감소시키는데 필요한 시간, 또는 대상체가 수술 전의 건강 수준과 본질적으로 유사하거나 그보다 더 양호한 건강 수준으로 회복되는데 필요한 기간을 포함할 수 있다. 또한, 결정적 수술의 완료와 변이체 IgG의 1차 투여 사이의 기간은 대상체가 치료 처치 사이의 기간을 필요로 하거나 요청하는 약물 중단기에 필요한 기간을 포함할 수 있다. 일반적으로, 결정적 수술의 완료와 변이체 IgG 요법의 개시 사이의 기간은 1주 미만, 1주, 2주, 3주, 4주 (28일), 5주, 6주, 7주, 8주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 1년, 2년, 3년 또는 그보다 더 오랜 기간을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 결정적 수술과 변이체 IgG의 투여 사이의 기간은 4주 (28일) 초과 1년 미만이다.
한 투여 스케줄에서, 아주반트 요법은 변이체 IgG 및 1종 이상의 화학요법제를 환자에게 복수개의 처치 주기로 투여하는 제1 단계, 및 변이체 IgG를 복수개의 유지 주기에서 단일 작용제로 사용하는 제2 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 베바시주맙의 변이체이고 처치 주기는 8주일 수 있으며, 이것은 환자에게 8주마다 화학요법제의 1회 투여 및 변이체 베바시주맙의 1회 투여를 제공하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 처치 주기는 또한 12주일 수 있고, 이것은 환자에게 12주마다 화학요법제의 1회 투여 및 변이체 베바시주맙의 1회 투여를 제공하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 아주반트 요법은 처치 개시로부터 적어도 1년 동안 지속되고, 이 시점 이후에 대상체의 진행 상태를 확인할 것이다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
투여량, 제제화 및 기간
변이체 IgG 조성물은 양호한 의료 관행과 일치하는 방식으로 제제화되어 투여량에 따라 분배되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정 장애, 치료받을 특정 포유동물, 개개의 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄, 및 의료 전문인에게 공지된 기타 인자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 질환의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 변이체 IgG, 예를 들어 항체의 적절한 투여량 (단독으로 사용되거나 1종 이상의 다른 추가의 치료제와 조합되어 사용되는 경우의 투여량)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 환자의 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 변이체 IgG는 환자에게 적합하게는 1회 또는 일련의 처치에 걸쳐 투여된다.
본원에서의 제약 제제는 또한 치료할 특정 적응증에 필요한 경우에는 1종 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.
투여될 변이체 IgG, 예를 들어 항체의 "치료 유효량"은 본원에서 논의된 고려사항에 따라 달라질 것이고, 해당 질환 또는 장애를 예방하거나 호전시키거나 치료하는데 필요한 최소량이다. 특정 실시양태에서, 투여될 변이체 IgG의 "치료 유효량"은 예를 들어 네오아주반트 또는 아주반트 요법에서 양성, 전암성 또는 초기 단계 암을 예방하거나 호전시키거나 치료하거나 안정화시키는데 필요하거나 종양, 잠복기 종양 또는 미세전이물의 발생 또는 재발을 치료하거나 예방하는데 필요한 최소량이다. 변이체 IgG는 해당 장애를 예방하거나 치료하기 위해서 현재 사용되는 1종 이상의 작용제와 함께 임의로 제제화되지만 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 중에 존재하는 변이체 IgG의 양, 장애 또는 처치 유형, 및 상기 논의된 기타 인자에 따라 달라진다. 일반적으로, 이것들은 이전에 사용되던 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나, 이전에 사용되던 투여량의 약 1％ 내지 99％로 사용된다. 일반적으로, 질환 또는 장애의 경감 또는 치료는 이러한 질환 또는 장애와 관련이 있는 하나 이상의 증상 또는 의학적 문제를 줄이는 것을 포함한다. 암의 경우, 치료 유효량의 약물은 암 세포의 수 감소, 종양 크기의 감소, 말초 장기로의 암 세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 감소되고/되거나 멈추는 것), 종양 전이의 억제, 종양 성장의 어느 정도의 억제, 및/또는 암과 관련이 있는 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감 중 하나 또는 이것들의 조합을 유도할 수 있다. 약물이 기존 암 세포의 성장을 예방하고/하거나 기존 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도라면, 이것은 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물을 사용하여 특정 대상체 또는 포유동물에서 질환 또는 장애의 발생 또는 재발을 예방할 수 있다.
특정 실시양태에서, 요법의 기간은 의학적으로 나타나는 한 계속되거나 원하는 치료 효과 (예를 들어, 본원에 기재된 효과)가 달성될 때까지 지속될 것이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG 요법은 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 10개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 10년, 또는 최대로는 대상체의 수명까지의 기간 동안 지속된다.
일반적으로, 양성, 전암성 또는 초기 단계 암의 경감 또는 치료 또는 암 (양성 또는 악성)의 아주반트 또는 네오아주반트 요법은 암과 관련이 있는 하나 이상의 증상 또는 의학적 문제를 줄이는 것을 포함한다. 치료 유효량의 약물은 종양에서의 암 세포 수 감소 (예를 들어, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 100％ 이상 감소), 종양 크기의 감소, 종양 존재량의 감소, 말초 장기로의 암 세포 침윤의 억제 (즉, 어느 정도 감소되고/되거나 멈추는 것), 종양 내 혈관 밀도의 감소, 종양 전이의 억제, 종양 성장 또는 종양 세포 증식의 감소 또는 억제, 잠복기 종양의 성장 감소 또는 예방, 미세전이물의 성장 또는 증식의 감소 또는 예방, 치료 또는 제거 후 종양 재성장의 감소 또는 예방 (예를 들어, 아주반트 요법에서), 양성, 전암성 또는 비-전이성 종양 또는 악성 종양에 감수성이 있거나 이것을 진단된 대상체의 DFS 또는 OS의 증가 또는 연장, 수술 가능할 정도로의 종양 크기의 감소 (예를 들어, 네오아주반트 요법에서), 및/또는 암과 관련이 있는 하나 이상의 증상의 어느 정도의 경감 중 하나 또는 이것들의 조합을 유도할 수 있다. 일부 추가의 실시양태에서, 변이체 IgG를 사용하여 대상체에서의 암 발생 또는 재발을 예방할 수 있다.
질환의 예방 또는 치료를 위한 본 발명의 변이체 IgG의 적절한 투여량 (단독으로 사용되거나 1종 이상의 다른 추가의 치료제와 조합되어 사용되는 경우의 투여량)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 변이체 IgG가 예방 목적으로 투여되는지 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상적 병력 및 변이체 IgG에 대한 환자의 반응, 및 담당 의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 환자에게 적합하게는 1회 또는 일련의 처치에 걸쳐 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 별개의 투여에 의해서든 연속 주입에 의해서든 간에 약 1 ㎍/kg 내지 20 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 15 mg/kg)의 변이체 IgG가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 전형적인 1일 투여량 중 하나는 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그보다 높은 값의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 처치는 일반적으로 상태에 따라서 질환 증상이 원하는 수준으로 저해될 때까지 지속된다. 한 실시양태에서, 처치는 상태에 따라 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 방법으로 측정하여 암이 치료될 때까지 지속된다. 변이체 IgG의 예시적인 투여량 중 하나는 약 0.05 mg/kg 내지 약 20 mg/kg의 범위이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg 또는 15 mg/kg 중 하나 이상의 용량 (또는 이것들의 임의의 조합)을 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 3주마다, 8주마다 또는 12주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 환자에게 항체를 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 투여함). 특정 실시양태에서, 보다 높은 초기 로딩 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 투약법은 항체를 약 4 mg/kg의 초기 로딩 용량으로 투여한 후에 약 2 mg/kg씩의 매주 유지 용량으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투약법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 항-VEGF 항체이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 베바시주맙의 변이체이다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG의 투여 빈도는 변이체 IgG의 반감기 증가로 인해 야생형 IgG의 투여 빈도와 비교하여 감소된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 야생형 IgG의 권장된 또는 처방된 투여 빈도보다 덜 빈번하게 투여된다.
변이체 IgG가 베바시주맙의 변이체인 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 4주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 6주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 8주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 10주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 12주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 처음에는 2주마다 투여되고 이후에는 4주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 처음에는 2주 내지 3주마다 투여되고 이후에는 6주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 처음에는 2주 내지 4주마다 투여되고 이후에는 8주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 처음에는 2주 내지 5주마다 투여되고 이후에는 10주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 변이체 IgG는 처음에는 2주 내지 6주마다 투여되고 이후에는 12주마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG, 예를 들어 베바시주맙의 변이체는 처음에는 베바시주맙의 처방된 투여 빈도로 투여되고, 이후에는 베바시주맙의 처방된 투여 빈도보다 덜 빈번하게 투여된다. 특정 실시양태에서, 베바시주맙은 처음에는 처방된 투여 빈도로 투여되고, 이후에는 베바시주맙의 변이체가 베바시주맙의 처방된 투여 빈도보다 덜 빈번하게 투여된다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 14일마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 21일마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 28일마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 60일마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 1개월마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 2개월마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 3개월마다 또는 더 오랜 간격을 두고 투여된다.
특정 실시양태에서, 환자에게 변이체 IgG 및 1종 이상의 다른 치료제(들)의 조합물을 처치한다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용한 동시 투여 또는 공동 투여 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 이때, 임의로는 2종 모두 (또는 모든) 활성 작용제가 이것들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 기간이 존재한다. 변이체 IgG와 조합하여 투여되는 치료제의 유효량은 의사 또는 수의사의 판단에 따라 달라질 것이다. 치료할 상태의 최대 관리를 달성하도록 투여량 투여 및 조정이 이루어진다. 용량은 사용될 치료제의 유형 및 치료받을 특정 환자와 같은 인자에 따라 추가로 달라질 것이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG에 적합한 투여량은 이것의 야생형 IgG에 대해 현재 사용되는 투여량이고, 변이체 IgG의 증가된 반감기 및/또는 변이체 IgG와 사용되는 추가의 치료제의 조합 작용 (상승작용)으로 인해 저하될 수 있다. 특정 실시양태에서, 억제제들의 조합은 단일 억제제의 효능을 강화시킨다. 용어 "강화시킨다"는 일반적인 또는 승인된 용량의 치료제의 효능 개선을 지칭한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 논의된 투약법은 화학요법제와 조합되어 사용된다. 특정 실시양태에서, 화학요법제는 통상적인 고용량 간헐적 투여를 포함한다. 특정 실시양태에서, 화학요법제는 중단 스케줄 없이 보다 적은 양으로 보다 빈번하게 투여된다 ("메트로놈(metronomic) 화학요법").
특정 실시양태에서, 환자에게 변이체 IgG 및 1종 이상의 화학요법제(들)의 조합물을 처치한다. 특정 실시양태에서, 화학요법제는 변이체 IgG의 투여 전에 또는 이것의 투여 이후에 투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 적어도 1회의 화학요법제 투여와 적어도 1회의 변이체 IgG 투여 사이의 기간은 대략 1개월 이하이다. 한 실시양태에서, 적어도 1회의 화학요법제 투여와 적어도 1회의 변이체 IgG 투여 사이의 기간은 대략 2주 이하이다. 대안적으로, 화학요법제 및 변이체 IgG는 환자에게 단일 제제 또는 별개의 제제로 공동으로 투여된다. 화학요법제 및 변이체 IgG의 조합물 처치로 인해 상승작용이 일어날 수도 있고, 또는 환자에게 부가적인 정도보다 높은 치료 이점이 있을 수 있다.
화학요법제가 투여되는 경우, 이것은 일반적으로 이에 대해 공지된 투여량으로 투여되거나, 임의로는 약물의 조합 작용 또는 항-대사물질 화학요법제의 투여로 인한 음성 부작용 때문에 감소된 투여량으로 투여된다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 전문인이 경험적으로 결정하는 바에 따라 이용될 수 있다.
조합될 수 있는 다양한 화학요법제는 본원에서 예를 들어 정의 섹션에 개시되어 있다. 본 발명의 변이체 IgG와 조합될 화학요법제의 예는 예를 들어 탁소이드 (예를 들어, 도세탁셀 및 파클리탁셀), 빈카 (예를 들어, 비노렐빈 또는 빈블라스틴), 백금 화합물 (예를 들어, 카르보플라틴 또는 시스플라틴), 아로마타제 억제제 (예를 들어, 레트로졸, 아나스트라졸, 또는 엑세메스탄), 항-에스트로겐 (예를 들어, 풀베스트란트 또는 타목시펜), 에토포시드, 티오테파, 시클로포스파미드, 메토트렉세이트, 리포좀 독소루비신, PEG화 리포좀 독소루비신, 카페시타빈, 겜시타빈, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕십), 또는 프로테오솜 억제제 (예를 들어, PS342)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상이한 화학요법제들의 "칵테일"이 투여될 수 있다.
본 발명의 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
특정 실시양태에서, 종양, 잠복기 종양 또는 미세전이물의 발생 또는 재발을 치료 또는 예방하는 것은 일반적으로 종양의 초기 치료 또는 제거 (예를 들어, 항암 요법, 예컨대 수술, 화학요법 또는 방사선 요법의 이용) 후에 종양 또는 전이물 형성을 예방하는 것을 포함한다. 수술은 "혈관신생 프로그램"을 재활성화시키고 보다 기하급수적인 종양 성장을 용이하게 하는 잠재력을 갖는 잔류 종양 세포 또는 잠복기 미세전이성 결절을 남겨둘 수 있다. 잠복기 종양 또는 미세전이물의 존재가 임상적 측정이나 스크리닝에 의해 반드시 검출가능한 것은 아니지만, 치료 유효량은 임상의에게 공지된 기술을 이용하여 잠복기 종양, 미세전이물, 전이물 또는 종양 재발의 검출을 예방하거나 감소시키는데 충분한 양이다. 한 예에서, 종양을 수술로 제거하여 종양이 치료된 대상체에게 이후에 변이체 IgG를 처치하고 잠복기 종양, 미세전이물 또는 종양 재발의 검출에 대해 시간 경과에 따라 모니터링한다. 변이체 IgG, 예를 들어 항-VEGF 항체는 또 다른 항암 요법과 조합되어 (예를 들어, 변이체 IgG의 투여 이전, 이와 동시에 또는 이후에) 투여될 수 있고, 상기 요법 중 하나 또는 둘다를 유지 요법으로서 지속할 수 있다.
암 치료에 있어서 치료 효능의 추가의 측정은 미국 특허 출원 공개 번호 20050186208에 기재되어 있다.
본 발명의 변이체 IgG (및 임의의 추가의 치료제)는 임의의 적합한 수단, 예를 들어 비경구, 피하, 복강내, 뇌척수내, 폐내 및 비내, 및 국소 처치를 원하는 경우에는 병변내 투여로 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG, 예를 들어 항체는 특히 변이체 IgG의 투여량을 감소시킨 펄스 주입에 의해 적합하게 투여된다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기인지 장기인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 대상체에게 예를 들어 볼루스로서 또는 시간 경과에 따른 연속 주입에 의해 정맥내 투여된다.
본 발명의 변이체 IgG, 예를 들어 항체의 결합 표적의 위치는 변이체 IgG의 제조 및 투여시에 고려될 수 있다. 변이체 IgG의 결합 표적이 뇌에 위치한 경우, 본 발명의 특정 실시양태는 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 변이체 IgG를 제공한다. 물리적 방법, 지질-기재의 방법, 줄기 세포-기재의 방법, 및 수용체 및 채널-기재의 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 혈액-뇌 장벽을 가로질러 분자를 수송하는 당업계 공지의 접근법이 여러가지 존재한다.
변이체 IgG, 예를 들어 항체를 혈액-뇌 장벽을 가로질러 수송하는 물리적 방법은 혈액-뇌 장벽을 아예 피해가는 것, 또는 혈액-뇌 장벽에 개구부를 생성시키는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 피해가는 방법은 뇌로의 직접 주사 (예를 들어, 문헌 [Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398-406 (2002)] 참조), 세포간 주입/대류-증진 전달 (예를 들어, 문헌 [Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994)] 참조), 및 뇌 내 전달 장치의 이식 (예를 들어, 문헌 [Gill et al., Nature Med. 9: 589-595 (2003)] 및 길포드 파마슈티칼(Guildford Pharmaceutical)의 글리아델 웨이퍼즈(Gliadel Wafers)™ 참조)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 장벽 내 개구부의 생성 방법은 초음파 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2002/0038086 참조), 삼투압 (예를 들어, 고장성 만니톨의 투여에 의함 ([Neuwelt, E. A., Implication of the Blood-Brain Barrier and its Manipulation, Vols 1 ＆ 2, Plenum Press, N.Y. (1989)]), 예를 들어 브래디키닌 또는 투과화제 A-7에 의한 투과화 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,112,596, 5,268,164, 5,506,206, 및 5,686,416 참조), 및 변이체 IgG를 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터에 의한, 혈액-뇌 장벽을 가로지르는 뉴런의 형질감염 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2003/0083299 참조)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 변이체 IgG, 예를 들어 항체를 수송하는 지질-기재의 방법은 혈액-뇌 장벽의 혈관 내피상의 수용체에 결합하는 항체 결합 단편에 커플링된 리포좀에 변이체 IgG를 포획시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20020025313 참조), 및 변이체 IgG를 저-밀도 지단백질 입자 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20040204354 참조) 또는 아포지단백질 E (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 20040131692 참조)로 코팅하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 변이체 IgG, 예를 들어 항체를 수송하는 줄기 세포 기재의 방법은 신경 선조 세포 (NPC)를 관심 항체를 발현하도록 유전자 조작한 후에 줄기 세포를 치료할 개체의 뇌로 이식하는 것을 포함한다. 문헌 [Behrstock et al. (2005) Gene Ther. 15 Dec. 2005 advanced online publication](신경영양 인자 GDNF를 발현하도록 유전자 조작된 NPC가 설치류 및 영장류 모델의 뇌에 이식되는 경우에 파킨슨병의 증상이 감소됨을 보고함)을 참조한다.
혈액-뇌 장벽을 가로질러 변이체 IgG, 예를 들어 항체를 수송하는 수용체 및 채널-기재의 방법은 혈액-뇌 장벽의 투과성을 증가시키기 위한 글루코코르티코이드 차단제의 사용 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0065259, 2003/0162695, 및 2005/0124533 참조), 칼륨 채널의 활성화 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2005/0089473 참조); ABC 약물 수송자의 억제 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0073713 참조); 트랜스페린에 의한 항체 코팅 및 1종 이상의 트랜스페린 수용체의 활성 조정 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2003/0129186 참조), 및 항체의 양이온화 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,004,697 참조)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 변이체 IgG, 예를 들어 항체를 포함하는 제약 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 변이체 IgG를 임의의 생리적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 ([Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)])와 혼합하여 수용액제, 동결건조된 제제 또는 기타 건조된 제제의 형태로 저장되도록 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예를 들어, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이팅제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다.
활성 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다.
지속 방출형 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 본 발명의 이뮤노글로불린을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형 용품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일이 넘는 기간 동안 분자를 방출할 수 있게 하지만, 특정 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 포획된 이뮤노글로불린이 오랜 시간 동안 신체 내에 유지되는 경우, 이것들은 37℃에서 습기에 노출될 때 변성 또는 응집되어 생물학적 활성의 손실 및 면역원성의 가능한 변화가 야기될 수 있다. 관련 메카니즘에 따라, 안정화를 위한 합리적 전략을 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되면, 안정화는 술피드릴 잔기의 변형, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 제어, 적절한 첨가제의 사용 및 특정 중합체 매트릭스 조성물의 개발에 의해 달성될 수 있다.
치료의 효능
변이체 IgG의 효능은 "정의"에서 본원에 기재된 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 종양 치료에 있어서의 효능은 변이체 IgG가 종양의 성장 또는 전이를 억제하거나 감소시키는 능력을 검출하여 결정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG가 야생형 IgG 처치로 달성되는 종양 성장과 비교하여 종양 성장의 속도를 감소시킬 수 있는 경우, 변이체 IgG는 야생형 IgG에 비해 더 높은 효능을 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG가 종양 성장의 동일한 최대 억제 달성에 필요한 야생형 IgG의 용량보다 더 낮은 IgG 용량으로 종양 성장의 최대 억제를 달성할 수 있는 경우, 변이체 IgG는 야생형 IgG에 비해 더 높은 효능을 갖는다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG가 야생형 IgG의 경우에 필요한 용량보다 더 낮은 IgG 용량에서 암성 세포의 성장 또는 전이를 억제하거나 감소시키는 능력을 갖는 경우, 변이체 IgG는 야생형 IgG에 비해 더 높은 효능을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 야생형 IgG와 비교하여 동일하거나 더 높은 효능을 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG는 야생형 IgG에 비해 더 낮은 효능을 갖지 않는다.
본 발명의 치료 효능을 또한 신생물성 또는 비-신생물성 장애를 평가하는데 통상적으로 사용되는 다양한 종점에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 암 치료는, 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 종양 퇴행, 종양 중량 또는 크기 수축, 진행까지의 시간, 생존 기간, 무진행 생존, 전반적인 반응 속도, 반응 기간, 삶의 질, 단백질 발현 및/또는 활성에 의해 평가할 수 있다. 본원에 기재된 특정 작용제, 예컨대 항-혈관신생제는 종양 혈관계를 표적으로 하고 반드시 신생물 세포 자체를 표적화하는 것은 아니기 때문에 독특한 클래스의 항암 약물을 나타내고, 따라서 약물에 대한 임상 반응의 독특한 측정법 및 정의를 필요로 할 수 있다. 예를 들어, 예를 들어 2차원 분석에서 50％ 초과의 종양 수축이 반응을 선언하는 표준 컷-오프(cut-off)이다. 그러나, 본 발명의 억제제는 원발성 종양의 수축 없이도 전이성 확산을 억제할 수도 있고, 또는 단순히 종양증식억제 효과를 발휘할 수도 있다. 따라서, 예를 들어 혈관신생의 혈장 또는 소변 마커의 측정 및 방사선 영상화를 통한 반응의 측정을 포함하는, 요법의 효능을 결정하는 접근법을 이용할 수 있다.
조합 요법
본원에 기재된 치료제는 다른 치료제와 동시에 투여될 수 있고, 즉, 본원에 기재된 치료제는 다른 요법 또는 치료제, 예를 들어 소분자, 기타 생물학적 작용제, 방사선 요법, 수술 등과 공동 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, IgG 변이체는 환자에게 투여되는 유일한 치료 활성 작용제이다. 특정 실시양태에서, IgG 변이체는 항-혈관신생제, 화학요법제, 시토카인, 성장 억제제, 항-호르몬제, 키나제 억제제, 세포독성제, 심장보호제 또는 기타 치료제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 1종 이상의 다른 치료제와 조합되어 투여된다. IgG 변이체는 1종 이상의 다른 치료 방식과 동시에 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, IgG 변이체는 IgG 변이체일 수도 있고 IgG 변이체가 아닐 수도 있는 1종 이상의 항체와 함께 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, IgG 변이체는 다른 치료 기술, 예컨대 수술과 조합되어 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 추가의 작용제, 예를 들어 항암제 또는 치료제, 또는 항-혈관신생제가 또한 변이체 IgG와 조합되어 투여되어 다양한 신생물성 또는 비-신생물성 상태를 치료할 수도 있다. 한 실시양태에서, 신생물성 또는 비-신생물성 상태는 이상 또는 원치않는 혈관신생과 관련이 있는 병리적 장애를 특징으로 한다. 본 발명의 변이체 IgG는 해당 목적에 효과적인 또 다른 작용제와 일련으로 또는 조합되어 동일 조성물 중에서 또는 별개의 조성물로서 동일하거나 상이한 투여 경로를 이용하여 투여될 수 있다.
암과 관련이 있는 항-혈관신생 요법은 종양 성장을 지지하는 영양분 제공에 필요한 종양 혈관의 발달 억제를 목표로 하는 암 치료 전략이다. 특정 실시양태에서, 혈관신생이 원발성 종양 성장 및 전이 둘다에 관여하기 때문에, 본 발명에서 제공되는 항-혈관신생 치료는 원발성 부위에서의 종양의 신생물성 성장을 억제할 수 있을 뿐만이 아니라, 또한 2차 부위에서의 종양의 전이를 예방할 수도 있고, 따라서 다른 치료제에 의한 종양의 공격을 허용한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 항암제 또는 치료제는 항-혈관신생제이다. 또 다른 실시양태에서, 항암제는 화학요법제이다.
본원에 기재된 것들, 예를 들어 정의 섹션에 기재된 것들, 및 예를 들어 문헌 [Carmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)], [Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)] 및 [Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)]에 기재된 것들을 포함하는 많은 항-혈관신생제가 확인되었고 당업계에 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 공개 번호 20030055006을 참조한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 변이체 IgG에 추가하여 2종 이상의 혈관신생 억제제가 환자에게 임의로 공동-투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG와 조합될 수 있는 다른 치료제는 VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제이다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG와의 조합 종양 요법에 유용한 다른 치료제는 종양 성장에 관여하는 다른 인자의 길항제, 예컨대 EGFR, ErbB2 (또한 Her2라고도 공지됨), ErbB3, ErbB4 또는 TNF를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 1종 이상의 티로신 키나제 수용체, 예컨대 VEGF 수용체, FGF 수용체, EGF 수용체 및 PDGF 수용체를 표적으로 하는 소분자 수용체 티로신 키나제 억제제 (RTKI)와 조합되어 사용될 수 있다. 많은 치료 소분자 RTKI, 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 바탈라닙 (PTK787), 에를로티닙 (타르세바®), OSI-7904, ZD6474 (자크티마(ZACTIMA)®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, 수니티닙 (수텐트®), 세마크사닙 (SU5416), AMG706, AG013736, 이마티닙 (글리벡®), MLN-518, CEP-701, PKC-412, 라파티닙 (GSK572016), 벨케이드®, AZD2171, 소라페닙 (넥사바르(NEXAVAR)®), XL880 및 CHIR-265가 당업계에 공지되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 2종 이상의 변이체 IgG의 조합물 또는 1종 이상의 변이체 IgG와 1종 이상의 추가의 항암 요법의 조합의 사용을 특징으로 한다. 항암 요법의 예는 수술, 방사선 요법 (방사선요법), 생물요법, 면역요법, 화학요법 또는 이들 요법의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 전립선암, 난소암 및 유방암을 위한 항암 요법은 호르몬 요법일 수 있다. 또한, 세포독성제, 항-혈관신생제 및 항-증식제가 변이체 IgG와 조합되어 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, IgG 변이체는 환자에게 화학요법, 방사선 요법, 또는 화학요법과 방사선 요법 둘다와 함께 투여된다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 비-전이성 암을 치료하기 위한 아주반트 요법으로서 결정적 수술 후에 사용된다. 이러한 예에서, 변이체 IgG는 1종 이상의 추가의 화학요법제와 함께 또는 이러한 추가의 화학요법제 없이 제공될 수 있다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 수술가능한 암을 치료하기 위한 네오아주반트 요법으로서 수술 전에 사용된다. 이러한 예에서, 변이체 IgG는 수술 전에 1종 이상의 추가의 화학요법제와 함께 또는 이러한 추가의 화학요법제 없이 제공될 수 있다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG 및 1종 이상의 다른 치료제는 종양, 잠복기 종양 또는 미세전이물의 발생 또는 재발을 감소시키거나 없애는데 충분한 양으로 충분한 시간 동안 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 변이체 IgG 및 1종 이상의 다른 치료제는 종양 재발의 가능성을 예방하거나 감소시키기 위한 유지 요법으로서 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 변이체 IgG와 1종 이상의 화학요법제 (예를 들어, 칵테일)의 사용을 특징으로 한다. 화학요법제의 비-제한적인 예는 본원에서 정의 섹션에 기재되어 있다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 전문인이 경험적으로 결정하는 바에 따라 이용될 수 있고, 또한 투여량, 제제화 및 기간이라는 제목의 섹션을 참조한다.
제조 용품
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 언급된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제조 용품이 제공된다. 제조 용품은 용기, 및 용기상에 있거나 그와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 보유하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합하여 보유하며, 멸균 입구를 가질 수 있다 (예를 들어, 상기 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 라벨 또는 포장 삽입물은 상기 조성물이 선택된 장애를 치료하는데 사용된다는 것을 표시한다. 특정 실시양태에서, 제조 용품은 (a) 본 발명의 변이체 IgG를 포함하는 조성물이 함유된 제1 용기, 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 기타 치료제를 포함하는 조성물이 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 제조 용품은 상기 조성물이 특정 상태를 치료하는데 사용될 수 있음을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조 용품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질, 예를 들어 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 변이체 IgG는 단독으로 또는 기타 치료 화합물과 조합되어 키트로서 포장될 수 있다. 한 실시양태에서, 치료 화합물은 항암제이다. 이러한 키트는 환자에게 단위 투여량을 투여하는 데에 도움을 주는 임의의 성분, 예를 들어 분말 형태를 재구성하기 위한 바이알, 주사용 시린지, 주문제작된 IV 전달 시스템, 흡입기 등을 포함할 수 있다. 추가로, 단위 투여 키트는 조성물의 제조 및 투여를 위한 지침서를 함유할 수 있다. 키트는 1명의 환자를 위한 1회용 단위 용량으로서 제조될 수도 있고 특정 환자를 위해 여러회 사용하도록 (일정한 용량으로 투여되도록, 또는 요법이 진행됨에 따라 개개의 화합물의 효력이 달라질 수 있게 투여되도록) 제조될 수도 있으며, 또는 키트는 다수의 환자에게 투여하는데 적합한 다중 용량을 함유할 수 있다 ("벌크 포장"). 키트 성분은 카툰, 블리스터 팩, 병, 튜브 등에 조립될 수 있다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제시된 일반적인 설명을 기초로 하여 다양한 다른 실시양태를 실시할 수 있음이 이해된다.
실시예 1: 항-VEGF (베바시주맙) 변이체의 생성
야생형 항-VEGF (베바시주맙) IgG1 중쇄 및 경쇄의 Fv 영역을 인간 IgG1 불변 도메인을 함유하는 2종의 pRK-기재의 일시적인 형질감염 플라스미로 별도로 클로닝하였다. 이어서, 쿤켈(Kunkel) 기재의 부위 지정 돌연변이유발을 이용하여 CH2 및 CH3 도메인 내의 잔기가 돌연변이된 모든 항-VEGF IgG1 변이체를 생성하였다. 본 연구에서 생성된 항-VEGF 변이체를 하기 표 2에 요약하였다. 각각의 변이체는 CH2 및 CH3 도메인에서 단일, 이중 및 삼중 돌연변이를 함유한다. 변이체는 카바트에서와 같이 EU 지수에 따라 번호매김하였다.
Figure pat00021
변이체의 중쇄 및 야생형 경쇄를 함유하는 플라스미드를 퓨진(FUGENE)® (스위스 바젤 소재의 로쉐)을 제조 프로토콜에 따라 사용하여 아데노바이러스-형질전환된 인간 배아 신장 세포주 293으로 동시 형질감염시켰다. 형질감염 복합체와 함께 24시간 동안 인큐베이션한 후, 형질감염된 세포를 10 mg/L 인슐린 및 미량 원소를 함유하고 PSO4가 보충된 혈청 무함유 배지로 5일 동안 배양하거나 5 mM 글루타민을 함유하는 1.3× GEM N 배지로 배양하였다. 상등액을 수집하고 1 M TRIS (pH 8.0) 및 5 M 염화나트륨 (NaCl)으로 조건화하여 최종 농도 30 mM TRIS 및 50 mM NaCl을 달성하였다. 이어서, 조건화된 상등액을 단백질 A 크로마토그래피로 정제하였다. 결합된 IgG1을 0.1 M 글리신 완충제 (pH 3.0)를 사용하여 단백질 A 컬럼으로부터 용출시켰다. 다음으로, 정제된 IgG1을 농축시키고, 수퍼덱스(Superdex)-200 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 임의의 응집물을 제거하였다. 단량체성 IgG1 분획물을 함께 모아 이후에 결합 연구에 사용하였다. 항-VEGF 야생형 및 항-VEGF 변이체 IgG1 농도를 280 nM에서 판독한 흡광도를 이용하여 계산하였고, 흡광도 1.5는 1 mg/mL IgG1인 것으로 추정되었다.
실시예 2: 인간 및 시노몰구스 원숭이 FcRn의 생성
인간 FcRn은 알파 쇄 및 β2-마이크로글로불린 서브유닛의 이종이량체이다. 이들 2종의 서브유닛을 2종의 pRK 기재의 일시적인 형질감염 플라스미드로 별도로 클로닝하였다. 알파 쇄 및 β2-마이크로글로불린 둘다를 함유하는 플라스미드를 퓨진® (스위스 바젤 소재의 로쉐)을 제조 프로토콜에 따라 사용하여 293 세포로 동시 형질감염시켰다. 형질감염 복합체와 함께 24시간 동안 인큐베이션한 후, 형질감염된 세포를 10 mg/L 인슐린 및 미량 원소를 함유하고 PSO4가 보충된 혈청 무함유 배지로 5일 동안 배양하였다. 상등액을 수집하고 1 M 염산 및 5 M NaCl로 조건화하여 최종 pH 6.0 및 농도 50 mM NaCl을 달성하였다. 조건화된 상등액을 IgG-세파로스 크로마토그래피로 정제하였다. 결합된 FcRn을 30 mM TRIS 및 150 mM NaCl을 함유하는 pH 8.0 완충제를 사용하여 상기 컬럼으로부터 용출시켰다. 용출된 FcRn을 수퍼덱스-75 크기 배제 크로마토그래피 컬럼으로 추가로 정제하여 임의의 응집물을 제거하였다. FcRn 농도를 280 nM에서 판독한 흡광도를 이용하여 계산하였고, 흡광도 1.9는 1 mg/mL FcRn에 상응하였다. 시노 알파 쇄 및 시노 β2-마이크로글로불린을 함유하는 플라스미드를 형질감염에 사용했다는 점을 제외하고는 시노몰구스 원숭이 FcRn을 인간 FcRn과 유사하게 생성 및 정제하였다.
실시예 3: FcRn 결합 연구: FcRn에 대한 IgG 1 변이체의 주입
인간 FcRn에 대한 항-VEGF 변이체의 결합을 BIAcore 3000 기기 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬쓰케어(GE healthcare))를 사용한 표면 플라스몬 공명으로 연구하였다. 인간 FcRn을 아민 커플링 키트를 사용하여 센서 칩에 커플링시켰다. 구체적으로, CM5 센서 칩을 EDC/NHS로 7분 동안 5 ㎕/분으로 활성화시켰다. 100 ㎍/mL의 인간 FcRn을 30초 내지 2분 동안 10 ㎕/분의 유속으로 상기 활성화된 칩에 주입하여 최대 결합 반응 단위 (RU) 50 내지 200을 달성하였다. 접합 후, FcRn 커플링된 칩을 1 M 에탄올아민 히드로클로라이드 35 ㎕를 5 ㎕/분으로 주입하여 차단하였다.
pH 6.0 또는 pH 7.4에서 인간 FcRn에 대한 항-VEGF 야생형 (WT) 및 항-VEGF 변이체의 결합을 측정하였다. 본 결합 실험을 위한 운행 완충제는 0.01％ P20 및 0.02％ 아지드화나트륨을 함유하는 pH 6.0 또는 pH 7.4의 PBS였다. 항-VEGF (베바시주맙) WT 및 항-VEGF 변이체를 pH 6.0 또는 pH 7.4의 운행 완충제로 완충제-교환하였다. 모든 실험은 25℃에서 수행하였다. pH 6.0 운행의 경우, 15 μM 내지 0.7 nM 범위 농도의 변이체를 FcRn 코팅된 칩에 다양한 시간 동안 30 ㎕/분으로 유동시켜서 항정 상태를 달성한 후에 5분 동안 상기 칩으로부터 해리되도록 하였다. pH 7.4 운행의 경우, 30 μM 내지 30 nM 범위 농도의 변이체를 FcRn 코팅된 칩에 다양한 시간 동안 20 ㎕/분으로 주입하여 항정 상태를 달성한 후에 2분 동안 해리시켰다. 변이체를 또한 센서 칩상의 미접합 스팟에 유동시켜서 FcRn-커플링된 칩에 대한 결합으로부터 백그라운드 비-특이적 결합을 감하였다. 주입 사이마다 칩을 0.1 M TRIS (pH 8.3)의 30초 펄스로 재생시켰다. 각 주입마다의 항정 상태 RU를 각 주입 단계 종료시에 기록하였고, 이후에 겉보기 해리 상수 (겉보기 KD)를 최대 RU의 50％를 달성하는 IgG 농도로서 추정하였다.
2회의 상이한 운행으로부터 수득된 도 1A 및 도 1B의 결과는 모든 변이체가 pH 6에서 야생형에 비해 개선된 FcRn 친화도를 갖는다는 것을 보여준다. 겉보기 해리 상수 (KD)의 추정치를 도 2에 나타냈다. FcRn 커플링 밀도가 2회의 운행에서 상이했기 때문에, 화합력 수준이 상이하여 동일 변이체에 대하여 약간 상이한 겉보기 KD 값이 생성되었다. 그러나, 이들 변이체의 친화도 순위는 여러 운행마다 동일하였다. 도 3은 시험한 모든 항-VEGF 변이체가 야생형과 비교하여 인간 FcRn에 대한 더 높은 중성 pH 결합을 나타냄을 보여준다. pH 7.4 결합을 기초로 한 변이체의 친화도 순위는 pH 6 결합을 이용하여 결정된 친화도 순위에 상응하였다.
Figure pat00022
표 3에 나타낸 항-VEGF 야생형 (WT) 및 항-VEGF 변이체의 인간 및 시노 FcRn 결합을 이러한 검정 포맷을 이용하여 추가로 평가하였다. 인간 또는 시노 FcRn을 센서 칩에 코팅하였다. 항-VEGF 야생형 및 항-VEGF 변이체를 FcRn 코팅된 칩상에 25℃에서 pH 6.0 또는 pH 7.4 완충제 중에 주입하였다. 항정 상태 반응 단위를 기록하고, 주입 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 모든 항-VEGF 변이체는 pH 6.0 및 pH 7.4 둘다에서 항-VEGF 야생형보다 인간 및 시노 FcRn에 대한 개선된 결합을 보여주었다 (도 4A 내지 도 4D 참조). 본 검정에서 결정된 항-VEGF 변이체의 친화도 순위는 1가 KD를 이용하여 결정된 순위와 동일하였다.
또한, 도 26에 나타낸 항-HER2 야생형 (WT) 및 항-HER2 변이체의 인간 FcRn 결합도 이러한 검정 포맷을 이용하여 평가하였다. 도 26에서 연구된 변이체는
Figure pat00023
였다. 인간 FcRn을 센서 칩에 코팅하였다. 항-HER2 야생형 및 항-HER2 변이체를 상기 FcRn 코팅된 칩에 25℃에서 6.0 내지 7.2 범위의 pH를 갖는 완충제 중에서 주입하였다. 항정 상태 반응 단위를 기록하고, 각 pH마다 주입 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 이어서, 야생형 및 각 변이체의 친화도를 각각의 주입 pH마다 추정하고, 야생형에 대한 변이체의 친화도 비율을 도 26에서 pH의 함수로서 플롯팅하였다. 변이체 E430A, E430K 및 L251D/N434H에 대한 친화도 비율은 pH 증가에 따라 감소한 반면, 모든 다른 변이체에 대한 친화도 비율은 pH 증가에 따라 증가하였다.
또한, pH 6.0 (도 27A), pH 7.1 (도 27B) 및 pH 7.4 (도 27C)에서 인간 FcRn에 대한 항-HER2 (트라스투주맙) IgG1 야생형, 변이체
Figure pat00024
, 변이체
Figure pat00025
및 변이체
Figure pat00026
의 결합을 유사한 검정 포맷을 이용하여 평가하였다. 항-HER2 야생형 및 항-HER2 변이체를 FcRn 코팅된 칩에 25℃에서 pH 6.0, pH 7.1 또는 pH 7.4의 완충제 중에서 주입하였다. 항정 상태 반응 단위를 기록하고, 각 변이체마다 주입 농도의 함수로서 플롯팅하였다. 결과는 pH 6.0에서 (도 27A) 변이체
Figure pat00027
가 야생형과 유사한 FcRn 친화도를 갖고, 변이체
Figure pat00028
가 변이체
Figure pat00029
와 유사한 FcRn 친화도를 갖는다는 것을 보여준다. pH 7.1에서 (도 27B), 변이체
Figure pat00030
는 야생형보다 훨씬 더 낮은 FcRn 친화도를 가졌고, 변이체
Figure pat00031
는 야생형과 유사한 FcRn 친화도 및 변이체
Figure pat00032
보다 훨씬 낮은 FcRn 친화도를 가졌다. pH 7.4에서 (도 27C), 변이체
Figure pat00033
는 야생형 및 변이체
Figure pat00034
보다 낮은 FcRn 친화도를 가졌다.
실시예 4: FcRn 결합 연구: IgG 1 변이체에 대한 인간 또는 시노 FcRn의 주입
BIAcore 3000 기기 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬쓰케어)를 사용한 결합 포맷으로, 항-VEGF 야생형 (베바시주맙) 및 항-VEGF 변이체를 아민 커플링 키트를 사용하여 센서 칩의 여러 유동셀에 접합시켰다. 구체적으로, CM5 센서 칩을 EDC/NHS로 7분 동안 5 ㎕/분으로 활성화시켰다. 10 내지 50 ㎍/mL의 항체를 30초 내지 2분 동안 10 ㎕/분의 유속으로 상기 활성화된 칩에 주입하여 50 내지 200의 최대 결합 반응 단위 (RU)를 달성하였다. 접합 후, FcRn 커플링된 칩을 1 M 에탄올아민 히드로클로라이드 35 ㎕를 5 ㎕/분으로 주입하여 차단하였다.
본 결합 실험을 위한 운행 완충제는 PBS (pH 6.0)/0.01％ P20/0.02％ 아지드화나트륨 (NaN3)이었다. 20 μM 내지 0.15 nM의 가용성 인간 또는 시노 FcRn 희석물을 30 ㎕/분의 유속으로 10분 동안 상기 항체-코팅된 센서 칩에 25℃에서 주입하였다. 항정 상태 RU를 주입 종료시에 기록하였다. 칩을 0.1 M TRIS (pH 8.5)/0.15 M NaCl의 30초 펄스로 재생시켰다. FcRn을 또한 미접합 표면에 주입하여 백그라운드를 감하였다. 역학 파라미터 및 1가 평형 결합 상수 (KD)를 BIA이밸루에이션(BIAevaluation) 소프트웨어 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬쓰케어)를 사용하여 계산하였다.
도 5 및 도 6의 결과는 모든 항-VEGF 변이체가 pH 6.0에서 인간 및 시노 FcRn 둘다에 대하여 야생형보다 개선된 FcRn 친화도를 갖는다는 것을 보여준다. 친화도 개선은 결합 속도 상수의 증가 및 해리 속도 상수의 감소 둘다로 인한 것이었다. 전체적으로, 상이한 결합 검정을 이용한 야생형 대비 항-VEGF 변이체의 FcRn 친화도 개선을 도 8에 요약하였다. 도 8은 표 3에 기재된 변이체들 중에서
Figure pat00035
변이체가 가장 높은 FcRn 친화도를 가지며, 그 다음은
Figure pat00036
임을 보여준다.
Figure pat00037
변이체는 야생형에 비해 최소 수준의 FcRn 친화도 개선을 갖는다.
실시예 5: 여러 pH에서 항-VEGF 및 항-HER2 변이체의 해리 속도
다양한 pH에서의 해리 속도를 결정하기 위해서, 200 nM 내지 2 μM의 인간 또는 시노 FcRn을 우선 항체-접합된 유동셀에 PBS (pH 6.0)/0.01％ P20/0.02％ NaN3 중에 5분 동안 30 ㎕/분으로 주입하여 항정 상태를 달성하였다. 이어서, 6 내지 7.4의 pH 범위의 PBS 완충제를 30 ㎕/분으로 상기 유동셀상에 8분 동안 주입하여 복합체가 해리되도록 하였다. FcRn을 또한 미접합 표면에 주입하여 백그라운드를 감하였다. 해리 속도 상수를 센서그램의 해리 단계를 BIA이밸루에이션 소프트웨어 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬쓰케어)로 핏팅하여 결정하였다. 도 7의 결과는 인간 FcRn (도 7A) 및 시노 FcRn (도 7B) 둘다에 대한 변이체의 koff가 pH 증가와 함께 증가하며, 각 변이체마다 koff 증가율은 유사함을 보여준다.
다양한 pH에서 인간 FcRn에 대한 항-HER2 변이체
Figure pat00038
의 해리 속도 (koff)를 유사하게 측정하였다. 인간 FcRn에 대한 항-HER2 변이체
Figure pat00039
의 koff를 도 28에서 pH의 함수로서 플롯팅하였다. 도 7의 인간 FcRn에 대한 항-VEGF 변이체
Figure pat00040
의 koff도 비교를 위해서 도 28에서 플롯팅하였다. 다양한 pH에서의 koff 값을 각 변이체마다 pH에 대해 핏팅하여 최적 맞춤선의 기울기를 구하였다 (식: log(koff) = 기울기 × pH + y-절편). 항-VEGF 변이체의 기울기는 0.75 내지 0.84 범위였고, 항-HER2 변이체
Figure pat00041
의 기울기는 약 1.2였다.
실시예 6: 인간 VEGF에 대한 결합
재조합 형태의 VEGF-A109를 아민 커플링 키트를 사용하여 CM5 칩에 접합시켰다. 구체적으로, CM5 센서 칩을 EDC/NHS로 7분 동안 5 ㎕/분으로 활성화시켰다. 1 내지 2 ㎍/mL의 VEGF-A109를 30초 동안 10 ㎕/분의 유속으로 상기 활성화된 칩에 주입하여 100 내지 400의 최대 결합 반응 단위 (RU)를 달성하였다. 접합 후, FcRn 커플링된 칩을 1 M 에탄올아민 히드로클로라이드 35 ㎕를 5 ㎕/분으로 주입하여 차단하였다. 100 nM 내지 6 nM 항체의 2배 희석물을 VEGF-접합된 칩에 4분 동안 PBS/0.05％ 트윈/0.02％ NaN3 중에 37℃에서 주입하였다. 상기 복합체가 18분 동안 해리되도록 하였다. 칩을 20 mM 염산의 30초 펄스로 재생시켰다. 항체를 또한 미접합 표면에 주입하여 백그라운드를 감하였다. 도 9의 결과는 Fc 돌연변이가 VEGF 결합을 변경시키지 않으며, 모든 변이체는 야생형과 동일한 결합 반응을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 7: 세포 증식의 시험관내 억제
다양한 농도의 항-VEGF 야생형 (베바시주맙) 및 항-VEGF 변이체를 재조합 인간 VEGF와 실온에서 1시간 동안 사전 인큐베이션하였다. 항-VEGF 야생형 (베바시주맙) 및 항-VEGF 변이체의 농도는 33 nM 내지 0.05 nM 범위였다. 재조합 인간 VEGF의 농도는 0.26 nM이었다. 이어서, 상기 복합체를 37℃ 및 5％ CO2하에 배양 중인 인간 제대 혈관 내피 세포 (HUVEC)에 첨가하였다. 배양 4일 후 HUVEC의 생존율을, 상기 세포를 20％ 알라마르 블루(ALAMAR BLUE)® 염료 (트레크 다이아그노스틱 시스템즈(Trek Diagnostic Systems), 미국 오하이오주 클레베드)와 6시간 동안 37℃에서 5％ CO2하에 인큐베이션하여 평가하였다. 이어서, 알라마르 블루®의 형광을 몰레큘라 디바이시즈(Molecular Devices) (미국 캘리포니아주 선니베일) 마이크로플레이트 판독기로 검출하였다. 도 10에 나타난 바와 같이, 모든 변이체는 야생형 및 아바스틴®과 동일한 수준의 증식 억제를 가졌고, 이것은 Fc 돌연변이가 변이체의 VEGF 중화 능력에는 영향을 미치지 않음을 다시 확인시켜 준다.
실시예 8: 시노몰구스 원숭이에서의 약력학 연구
연구전 신체 검사시에 체중이 2 내지 5 kg이고 연령이 2세 내지 7세인 36마리의 수컷 및 36마리의 암컷 나이브(naive) 시노몰구스 원숭이를 각각이 6마리 수컷 및 6마리 암컷으로 이루어진 6개의 처치군에 배정하였다. 처치군이 체중 균형을 이루도록 디자인된 전산화 차단 절차를 이용하여 동물들을 처치군에 배정하였다. 건강해보이고 분명한 비정상이 없는 동물들만을 연구에 사용하였다. 제1일에 모든 동물에게 단일 정맥내 볼루스 투여를 복재 정맥을 통해 실시한 후에 0.9％ 염수 세정을 실시하였다. 모든 군의 용량 수준은 5 mg/kg이었다. 투여전 및 투여 후 제0.5시간, 제2시간, 제4시간, 제8시간, 제1일, 제2일, 제4일, 제7일, 제10일, 제14일, 제21일, 제28일, 제35일, 제42일, 제49일, 제56일 및 제70일에 대퇴 정맥으로부터 혈액 샘플 (대략 1.0 mL)을 수집하였다. 군 1개 당 n = 11마리 내지 12마리 동물의 평균 혈청 농도를 이용하여 모든 군에 대하여 혈청 농도-시간 곡선을 구축하였다. 본 실험에서 수집한 혈청 샘플을 실시예 9에 기재된 ELISA 프로토콜을 이용하여 분석하였다.
실시예 9: ELISA에 의한, 시노몰구스 원숭이 혈청 중 항체 농도의 검출
맥시소르프(Maxisorp) ELISA 플레이트 (미국 뉴욕주 로체스터 소재의 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 50 mM 카르보네이트 완충제 (pH 9.6) 중 0.5 ㎍/mL 재조합 인간 VEGF로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS, 0.5％ BSA, 10 ppm 프로클린(Proclin) (pH 7.2)으로 1시간 동안 실온에서 차단한 후에 세척 완충제 (PBS/0.05％ 트윈 20/pH 7.2)로 세척하였다. 0.5％ 소 혈청 알부민, 0.05％ 트윈 20, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0.25％ CHAPS, 0.2％ 소 감마 글로불린, 10 ppm 프로클린 및 0.35 M NaCl을 함유하는 PBS 완충제 중에 2배 계열 희석된 표준물 (항-VEGF IgG1 야생형 (베바시주맙)) 및 또한 3배 계열 희석된 시노 혈청 샘플 (1:10에서 출발함)을 상기 차단된 플레이트에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 플레이트를 6회 세척하고, 결합된 약물을 검정 완충제 (PBS (pH 7.4), 0.5％ BSA, 0.05％ 트윈 20, 10 ppm 프로클린) 중에 1:10K로 희석된 양 항-인간 IgG (Fc 특이적)-HRP (미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노리써치(Jackson ImmunoResearch))를 사용하여 1시간 동안 실온에서 진탕하에 검출하였다. 이어서, 플레이트를 다시 6회 세척한 후에 색상 발색을 위해 테트라메틸 벤지딘 기질 (미국 메릴랜드주 파사데나 소재의 모쓰(Moss))을 첨가하였다. 20분 후에 1 M 인산 (H3PO4)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 450 내지 620 nm 파장의 몰레큘라 디바이시즈 마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다. 시노몰구스 원숭이에서 야생형 및 5종의 항-VEGF 변이체의 5 mg/kg의 단일 IV 투여 후 혈청 프로파일을 도 11에 나타냈다. 모든 5종의 변이체는 야생형과 비교하여 감소된 청소율 및 연장된 반감기를 나타냈다.
실시예 10: 약력학 데이타 분석
PK 파라미터를 윈논린 엔터프라이즈(WinNonLin Enterprise) 버전 5.1.1 (파르사이트 코포레이션(Pharsight Corporation), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)을 사용하여 추정하였다. IV-볼루스 주입, 1차 제거, 및 마이크로-속도 상수를 갖는 2-구획 모델 (모델 7)을 사용하여, 관찰된 데이타를 기재하였다. 농도는 반복적인 재측량 (파워 n = -1로 예측됨) 및 레벤베르크(Levenberg) 및 하르틀리(Hartley) 변형을 이용한 가우스-뉴턴(Gauss-Newton) 최소화 알고리즘을 이용하여 측량하였다. 하기하는 PK 파라미터를 윈논린 모델 7을 사용하여 보고하였다: AUC∞ = 무한대로 외삽 추정된 농도-시간 곡선하 면적으로 정의되는 총 약물 노출, t1/2, α = 알파 기의 반감기 (알파 반감기), t1/2, β = 베타 기의 반감기 (베타 반감기), Cmax = 최대 관찰 농도, CL = 청소율, V1 = 중앙 구획의 부피, Vss = 항정 상태에서의 분포 부피.
모든 투여 군에서, 각 동물마다 관찰치 vs. 예측치 혈청 농도-시간 프로파일을 육안 검사하고 가중 잔차법 제곱 합을 조사하고 각 파라미터마다 표준 오차 및 변동 계수를 조사하여 핏팅의 양호성을 기준으로 하여 모델을 선택하였다. PK 파라미터는 각 군마다 평균±표준 편차 (SD)로 나타냈다.
도 12는 항-VEGF 야생형 및 5종의 변이체,
Figure pat00042
로 시노몰구스 원숭이에게 5 mg/kg의 단일 IV 투여를 실시한 후 표로 작성한 약력학 파라미터를 보여준다. 변이체의 β (말단) 반감기는 야생형의 반감기보다 약 1.6배 내지 2.2배 더 길었고,
Figure pat00043
변이체는 24.9일의 최장 반감기를 가졌다. 본 발명자들이 알기로는, 변이체
Figure pat00044
의 반감기 약 25일은 지금까지 보고된 시노몰구스 원숭이에서의 인간 IgG의 반감기 중에서 가장 길다.
반감기와 FcRn 친화도 사이의 관계를 도 13에 나타냈다.
Figure pat00045
변이체에 의해 입증되는 바와 같이, pH 6.0에서 FcRn 친화도가 중간 정도로 증가한 결과로서 말단 반감기가 연장되었다. 그러나, pH 6.0에서 FcRn 친화도가 더 증가한 것
Figure pat00046
이 반감기를 추가로 개선시키지는 않았는데, 이는 중성 pH에서의 더 느린 해리 속도 및 증가된 친화도가 산성 pH 친화도 증가로 인한 이점을 보상할 수 있기 때문이다. 사실, pH 6.0에서의 더 높은 FcRn 친화도에서는 반감기가 감소되는 경향이 있다.
실시예 11: 트랜스제닉 마우스에서의 약력학 연구
본 연구에 사용된 마우스 종은
Figure pat00047
였다. MuVEGFhuMUTX(+/+) 넉인, RAG2 (-/-) 넉아웃 마우스는 야생형 항-VEGF 항체 (베바시주맙)에 의해 중화될 수 있는 인간화 형태 VEGF의 2가지 대립유전자를 함유한다. RAG2 (-/-) 마우스는 면역결핍이고, 기능적 T 및 B 세포를 생성하지 않는다. 인간 종양은 이들 마우스에서 성장할 수 있고, 종양 세포에 대한 명시적인 면역 반응의 부재하에 인간화 형태의 VEGF를 발현한다. 따라서, 야생형 항-VEGF 항체 (베바시주맙)는 인간 종양 및 마우스 간질 세포로부터 유래된 VEGF를 중화시킬 수 있지만 뮤린 VEGF는 중화시키지 못한다. 항-VEGF 야생형 및 항-VEGF 변이체
Figure pat00048
의 PK를 이들 비-종양 함유 트랜스제닉 마우스에서 평가하였다.
2가지 상이한 PK 연구를 수행하였다. 첫번째 연구는 단일-투여 PK 연구였다. 군 1개 당 8마리 또는 9마리 동물을 갖는 4개의 군이 있고, 이들 각각에는 PBS 중 0.3 또는 5 mg/kg의 야생형 및 변이체
Figure pat00049
를 단일 정맥내 투여하였다. 투여되는 용량 부피는 투여 용액의 농도 및 각 동물의 중량에 따라 5 내지 15 mL/kg으로 다양하였다. IV 투여는 꼬리 정맥을 통해 수행되었다. 각 시점에 3마리 마우스로부터 채혈하여 샘플을 수득하였고, PK 분석을 위해 혈액 샘플 약 125 ㎕를 투여 후 제15분, 제8시간, 제24시간, 제2일, 제4일, 제7일, 제10일, 제14일, 제21일 및 제28일에 수집하였다. 혈액 샘플을 마취하에 안와주위 동을 통해 수집하였다. 희생 시점에, 마우스를 이소플루란 마취하에 심장 천자로 출혈시켰다.
두번째 연구는 다중 투여 PK 연구였다. 군 1개 당 9마리이었다. 각각의 동물에게 PBS 중 0.3 또는 5 mg/kg의 변이체
Figure pat00050
를 제0일, 제3일, 제6일 및 제9일에 투여하였다. 주입 및 샘플 수집 방법은 단일-투여 PK 연구와 유사하였다. 그러나, 혈액 샘플을 첫번째 투여 후 제15분, 제3일 (투여전), 제6일 (투여전), 제9일 (투여전), 제9일 투여후 제15분, 제11일, 제14일, 제21일, 제28일 및 제35일에 수집하였다.
PK 연구에서 수집된 혈청 샘플을 실시예 13에 기재된 ELISA로 분석하였다. 도 14A 및 도 14B는 VEGF 포획 (도 14A) 또는 인간 Fc 포획 (도 14B) ELISA 각각으로 결정된 야생형 및 변이체
Figure pat00051
의 약력학 프로파일을 보여준다. 변이체
Figure pat00052
는 0.3 또는 5 mg/kg의 단일 IV 투여 후에 야생형과 유사한 PK 프로파일을 가졌다. 도 15는 트랜스제닉 마우스에서 야생형 및
Figure pat00053
변이체의 반감기가 유사함을 확인시켜 준다. 그러나, 0.3 mg/kg으로 투여된 항체는 5 mg/kg으로 투여된 경우보다 반감기가 더 짧았기 때문에 비-선형 PK 반응이 관찰되었고, 이것은 항원 의존적 청소율로 인한 것일 수 있다. 도 16은 인간화 VEGF 트랜스제닉 마우스에서 변이체
Figure pat00054
의 0.3 또는 5 mg/kg의 다중 투여 후 약력학 프로파일을 보여주며, PK 파라미터는 도 17에 요약되어 있다. 결과는 실험적으로 측정된 혈청 농도가 단일-투여 PK 파라미터를 이용한 모의실험으로 예측된 농도와 잘 상응한다는 것을 보여준다.
실시예 12: 생체내 효능 연구
인간 HT-55, Colo-205 (결장직장 암종) 및 Calu-6 (폐 암종) 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수하였다. 인간 결장직장 암종 HM-7 세포주는 LS 174T의 유도체이다. Calu-6 및 HM-7은 햄(Ham's) F12, 저농도 글루코스 DMEM 1:1 중에서 성장시켰다. Colo-205 및 HT-55는 RPMI 1640 배지 중에서 성장시켰다. 2가지 배지 모두에 10％ v/v FBS, 1％ v/v 페니실린/스트렙토마이신 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen)), 2 mM L-글루타민 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐) 및 1 ㎍/mL 펀자이존(FUNGIZONE)™ (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)을 보충하였다. 세포를 37℃에서 5％ CO2하에 전면성장시까지 성장시켜 수확하고 멸균 마트리겔(Matrigel) 중에 1 mL 당 50×106개 세포로 재현탁시켰다. 6주령 내지 8주령 RAG2 KO; hum-XVEGF KI 이중-동형접합 마우스 (미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재의 제넨테크)에서 마우스 1마리 당 5×106개 세포를 등쪽 옆구리 s.c. 주사하여 이종이식편을 수립하고 성장하게 하였다. 5, 0.5 및 0.05 mg/kg 용량의 항체의 i.p. 처치를 종양 세포 접종 후 제24시간에 개시하여 1주 당 2회씩 수행하였다. 이식된 종양을 기재한 바와 같이 최장 축 및 수직 축을 따라 1주 당 2회씩 측정하였다. 종양을 측정하는 날마다 각 마우스의 종양 부피를 계산하고, 대조군 항체군 (항-두드러기쑥) 및 각 항-VEGF군으로부터의 평균 종양 부피를 스투던트 t 시험(Student's t test)으로 비교하였다 (P 수준 < 0.05). 종양 부피가 2,000 mm3에 이르면 마우스를 사망시켰다.
첫번째 HM-7 이종이식편 연구의 결과는 도 18에 나타냈다. 도 18A 및 도 18B는 변이체
Figure pat00055
가 0.5 mg/kg 및 또한 5 mg/kg 처치군 둘다에서 종양 성장의 최대 억제를 달성할 수 있었음을 보여준다. 야생형은 상기 2가지 용량 둘다에서 종양 성장을 억제하였지만, 0.5 mg/kg에서 종양 성장의 최대 억제를 달성하지는 못했다. 이러한 결과는 HM-7 이종이식편을 치료하는데 있어서
Figure pat00056
변이체가 0.5 mg/kg에서 혈청 IgG 농도 수준이 유사함에도 불구하고 야생형보다 더 효능이 있음을 시사한다 (도 18C). 도 19에 나타낸 HM-7 이종이식편의 효능 연구를 반복하여,
Figure pat00057
변이체가 0.5 및 0.05 mg/kg 처치군에서 야생형보다 더 효능이 있음을 확인하였다. 사실,
Figure pat00058
변이체는 야생형과 비교하여 모든 처치군에서 종양 성장을 보다 크게 억제하였다 (도 19A 및 19B). 이러한 효능 증가는 야생형에 비해
Figure pat00059
처치군에 대한 종양 중 혈액-표준화 항체 농도가 더 높기 때문일 수 있다 (도 19E). 도 20에 나타낸 HM-7 이종이식편의 세번째 효능 연구는 0.5 및 0.05 mg/kg 처치군에서 야생형보다 더 우수한
Figure pat00060
의 효능을 추가로 입증한다.
HT-55 이종이식편 연구의 경우,
Figure pat00061
변이체는 0.05 mg/kg 처치군에서 야생형에 비교하여 더 높은 종양 성장 억제를 보여주었고 (도 21), 이는
Figure pat00062
가 0.05 mg/kg 처치군에서 야생형보다 더 효능이 있음을 시사한다. Colo-205 연구의 경우, 도 22B는 0.5 mg/kg 야생형 및 0.5 mg/kg
Figure pat00063
변이체 사이의 성장 곡선에 있어서의 유의한 차이를 보여준다. 또한, 도 22A 및 22B는 0.5 및 0.05 mg/kg 처치군에서
Figure pat00064
에 의한 종양 성장의 억제 증가를 보여주며, 이는 0.5 및 0.05 mg/kg 군에서
Figure pat00065
의 효능이 약간 더 높다는 것을 시사한다. 도 23에 나타낸 반복된 Colo-205 연구는,
Figure pat00066
가 Colo-205 이종이식편을 치료하는데 있어서 야생형보다 약간 더 효능이 있음을 나타낸다. 마지막으로, Calu-6 이종이식편 연구에서 T307Q/N434A 변이체 및 야생형의 효능은 유사하였다.
Fc 변이체의 증가된 효능에 대해서는 여러가지 가능한 이유가 존재할 수 있다. 예를 들어, 변이체의 증가된 효력은 특정 종양 (예를 들어, HM-7)에서 발현되는 인간 FcRn에 의해 매개되는 변이체 항체의 체류 및/또는 재순환 증가로 인한 것일 수 있다. 이것은 국소 생성된 VEGF를 차단하는 전반적인 작용 효과를 증가시킬 수도 있고, 또는 종양 내 VEGF의 분해를 증진시키는 메카니즘을 제공할 수도 있다. 그러나, 본 발명자들은 HM-7 세포는 HT-55 또는 Calu-6 세포보다 더 적은 양의 FcRn을 발현하기 때문에 (도 25) HT-55 및 Calu-6 종양에 비해 HM-7 종양에서 검출된 변이체의 농도 증가가 세포의 FcRn 발현 수준과 직접적인 상관관계가 있지 않음을 알아냈다. 종양 미소환경에 있어서의 다른 인자, 예컨대 종양 pH, 성장 속도, 및 기타 종양 구성성분 또한 IgG의 분포 결정에 있어서 FcRn과 공동적인 역할을 수행할 수 있다. 예를 들어, 종양 미소환경은 대개가 산성이고 6.0 내지 7.6 (중앙 값 = 7.1) 범위의 pH를 갖는 반면에, 정상 조직은 7.3 내지 7.8 (중앙 값 = 7.55)의 pH 범위를 가지며, 문헌 [Song, C.W. et al., "Influence of TumorpH on Therapeutic Response" in Cancer Drug Resistance, 21-42 (2007)]을 참조한다. 추가로, 다양한 유형의 종양은 불균일한 혈관 공급 및 혈액 관류로 인해 광범위한 범위의 pH를 가질 수 있으며, 문헌 [Song, C.W. et al., Cancer Drug Resistance, 21-42 (2007), 상기 문헌], [Gillies, R.J. et al., J Magn Reson Imaging 16, 430-450 (2002)]을 참조한다. 다수의 시험관내 연구는 세포를 산성 pH에서 인큐베이션한 경우에 세포-관련 Fc/IgG의 양이 증가된다는 것을 보여주며, 문헌 [Praetor, A. et al., Journal of cell science 112 (Pt 14), 2291-2299 (1999)], [McCarthy, K.M., Yoong, Y. ＆ Simister, N.E. Bidirectional transcytosis of IgG by the rat neonatal Fc receptor expressed in a rat kidney cell line: a system to study protein transport across epithelia. Journal of cell science 113 (Pt 7), 1277-1285 (2000)], [Tesar, D.B. et al., Traffic 7, 1127-1142 (2006)]을 참조한다. 따라서, 시험한 종양 세포주 사이의 pH 차이가 각 종양 내 항체의 축적 수준에 영향을 미칠 수 있다는 것을 예상할 수 있다. 추가로, 산성 종양 미소환경은 또한 VEGF 발현을 활성화하고 (문헌 [Song, C.W. et al., Cancer Drug Resistance, 21-42 (2007), 상기 문헌] 참조), 이것은 이들 항-VEGF 항체의 체류를 특이적으로 매개할 수 있다. 추가로, 마우스에서의 HM-7 종양은 간질이 거의 없지만 (문헌 [Liang, W. C. et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006)] 참조), Calu-6 종양은 강력한 숙주 간질 반응을 유도하고 비교적 간질이 풍부 (문헌 [Tejada, M. L. et al., Clin Cancer Res 12, 2676-2688 (2006)] 참조)한 것으로 이전에 나타났다. 뮤린 FcRn을 발현하는 마우스 간질 세포의 존재는 인간 종양 세포에 의한 IgG 변이체의 개선된 재순환을 차폐시킬 수 있다. 이것은 뮤린 간질의 더 많은 성분을 갖는 인간 이종이식편, 예를 들어 Calu-6에서 더 낮은 집중 효과를 유도할 수 있다.
실시예 13: 트랜스제닉 마우스의 혈청 및 종양에서 ELISA에 의한 항체 농도의 검출
플레이트상에 코팅된 2종의 상이한 항체 포획 시약 (VEGF 또는 항-인간 IgG1 Fc)을 사용한 2종의 상이한 ELISA 검정 포맷으로 트랜스제닉 마우스에서의 항체 농도를 검출하였다. 맥시소르프 ELISA 플레이트 (미국 뉴욕주 로체스터 소재의 써모 피셔 사이언티픽)를 50 mM 카르보네이트 완충제 (pH 9.6) 중 0.5 ㎍/mL 재조합 인간 VEGF 또는 0.25 ㎍/mL (Fab'2) 토끼 항-인간 IgG1 Fc (미국 펜실바니아주 웨스트 그로브 소재의 잭슨 이뮤노리써치)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 PBS, 0.5％ BSA, 10 ppm 프로클린 (pH 7.2)으로 1시간 동안 실온에서 차단한 후에 세척 완충제 (PBS/0.05％ 트윈 20/pH 7.2)로 세척하였다. 0.5％ 소 혈청 알부민, 0.05％ 트윈 20, 5 mM EDTA (pH 8.0), 0.25％ CHAPS, 0.2％ 소 감마 글로불린, 10 ppm 프로클린 및 0.35 M NaCl을 함유하는 PBS 완충제 중에 12.5 ng/mL까지 감소시킨 2배 계열 희석된 표준물 (VEGF 포맷은 베바시주맙, 또는 Fc 포맷은 인간 IgG1) 및 또한 3배 계열 희석된 시노 혈청 샘플 (1:10에서 출발함)을 상기 차단된 플레이트에 첨가하고 2시간 동안 실온에서 진탕하에 인큐베이션하였다. 플레이트를 6회 세척하고, 결합된 약물을 검정 완충제 (PBS (pH 7.4), 0.5％ BSA, 0.05％ 트윈 20, 10 ppm 프로클린) 중에 1:20K 내지 1:60K로 희석된 염소 (Fab'2) 항-인간 IgG (Fc 특이적)-HRP 접합체 (잭슨)를 사용하여 1시간 동안 실온에서 진탕하에 검출하였다. 이어서, 플레이트를 다시 6회 세척한 후에 색상 발색을 위해 테트라메틸 벤지딘 기질 (미국 메릴랜드주 파사데나 소재의 모쓰)을 첨가하였다. 20분 후에 1 M 인산 (H3PO4)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 450 내지 620 nm 파장의 몰레큘라 디바이시즈 마이크로플레이트 판독기에서 판독하였다.
실시예 14: 야생형에 비해 다양한 친화도 개선을 갖는 IgG 1 Fc 변이체 및 이것들의 생체내 약력학 거동
도 24에 나타낸 Fc 돌연변이들의 추가의 조합물을 인간 항-HER2 (트라투주맙)에 혼입하여 IgG 변이체를 구축하였다. 상기 IgG1 변이체를 실시예 1에 기재된 방법을 이용하여 발현시켰다. 야생형 항-HER2 IgG1 및 항-HER2 IgG1 변이체의 해리 상수를 실시예 4에 기재된 바와 같이 하여 측정하고, 결과를 도 24에 나타내었다. 결과는 본 발명자들이 상이한 돌연변이들을 조합함으로써 IgG 변이체, 예컨대 한자리 숫자의 나노몰 친화도로 인간 FcRn에 결합할 수 있어서 야생형 IgG1에 비해 약 450배 개선을 나타내는
Figure pat00067
를 구축할 수 있음을 보여준다.
그러나, 고친화도 변이체가 반드시 생체내 개선된 약력학 거동을 가질 필요는 없다. 예를 들어, 2종의 Fc 돌연변이 N434A 및 N434W를 상이한 인간 항체에 혼입하여 2종의 IgG1 변이체를 구축하였다. 도 24에 나타난 바와 같이, 상기 2종의 IgG1 변이체 N434A 변이체 및 N434W 변이체는 pH 6.0에서 야생형 항체와 비교하여 FcRn 친화도가 각각 대략 3배 및 40배 더 높았다. 실시예 8 및 9에 기재된 바와 같이 이것들의 약력학 거동을 시노몰구스 원숭이에서 평가하였고, 야생형의 경우 (대략 6일 내지 9일)와 비교하였다. N434W의 반감기 (약 9.7±2.4일)는 중간 정도로 친화도 개선된 변이체, N434A의 반감기 (약 14.5±2.2일)보다 덜 개선되었다. 이러한 결과는 FcRn 친화도에 있어서의 지나치게 높은 증가는 Fc 변이체의 반감기에 유해 효과를 가질 수 있고 개선된 FcRn 친화도를 갖는 Fc 변이체가 개선된 반감기를 가질지 아닐지의 여부를 연역적으로 예측하는 것은 어려운 일임을 시사한다.
실시예 15: 고친화도 IgG 1 변이체를 사용한 FcRn 면역침전
HM-7, HT-55, Calu-6 또는 Raji (B-세포 림프종) 세포주마다 5백만개의 세포를 1％ 노니데트(Nonidet) P-40, 0.5％ 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1％ SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl 및 1× 프로테아제 억제제 (미국 일리노이주 록클랜드 소재의 피어스(Pierce))를 함유하는 25 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.0) 중에서 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하여 용해시켰다. 용해된 세포를 12,000 g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리한 후에 50 nM 트라스투주맙 Fc 변이체
Figure pat00068
([Yeung et al.] (제출함))를 상기 상등액에 첨가하여 FcRn을 포획하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 단백질-L (피어스) 수지를 첨가하고 상기 복합체에 4시간 동안 4℃에서 결합되도록 하였다. 이어서, 수지를 용해 완충제로 5회 세척하고, 결합된 단백질을 2× 로딩 완충제 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐)로 용출시켰다. 단백질을 4％ 내지 12％ BIS-TRIS 겔 (인비트로겐)에서 분리하고, 니트로셀룰로스 막 (인비트로겐)으로 블럿팅하였다. 상기 막을 PBS 중 3％ 무지방 밀크로 차단하고, 1 ng/mL 토끼 항-인간 FcRn 항체 (미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재의 산타 크루즈(Santa Cruz))로 실온에서 1시간 동안, 이후 1:104 희석률의 염소 항-토끼 IgG-퍼옥시다제 접합체 (피어스)로 1시간 동안 실온에서 프로빙하였다. 막을 차단 단계와 항체 인큐베이션 단계 사이에서 PBS/0.05％ 트윈으로 세척하였다. FcRn 단백질을 ECL 검출 키트 (미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 지이 헬쓰케어)로 가시화하였다. 도 25를 참조한다.
결과 및 논의
여러가지 항-VEGF 변이체를 사용한 2회의 별개의 결합 실험을 각각의 pH, pH 6.0 및 pH 7.4에서 수행하였다. pH 6.0 및 pH 7.4의 경우에 항정 상태 결합 반응 단위 (RU)를 농도의 함수로 하여 각각 도 1 및 도 2에 플롯팅하였다. pH 6.0에서의 해리 상수 (KD)를 도 1로부터 추정하여 도 2에 요약하였다. 2회의 상이한 운행으로부터 계산된 동일 변이체의 해리 상수는 약간 상이하였다. 예를 들어, 변이체 N434A는 제1 운행에서는 KD가 550 nM이었지만 제2 운행에서는 KD가 250 nM이었다. 이러한 차이는 2가 항체를 FcRn-커플링된 칩에 유동시키는 것을 포함하는 검정 포맷에서의 화합력 효과로 인한 것이었다. 해리 상수에 화합력이 기여하는 수준은 칩에 커플링된 FcRn의 수준에 따라 달랐고, FcRn 커플링의 수준이 높을 수록 화합력이 더 높았다. 이것은 제1 운행에서보다 약 2배 더 높은 RU를 갖는 것으로 관찰된 제2 운행에서의 더 높은 친화도를 설명해 줄 수 있다. 검정 셋업에 화합력 효과가 있었지만, 이러한 포맷은 세포에 의해 흡수된 2가 항체가 막 결합 FcRn에 결합하게 되는 세포 내 천연 결합 과정과 가장 유사하다. 절대적인 KD는 운행마다 다를 수 있지만, 이들 변이체의 친화도 순위는 커플링된 FcRn의 수준이 상이함에도 불구하고 일치하였다. 도 1 및 도 2 둘다
Figure pat00069
가 시험한 변이체들 사이에서 일관되게 가장 높은 친화도를 가지며, 시험한 모든 변이체가 pH 6.0에서 FcRn에 대한 결합이 개선되었음을 보여주었다.
pH 7.4에서 FcRn에 대한 항-VEGF 변이체의 친화도는 pH 6.0에서의 이것의 친화도에 비해 훨씬 낮다. pH 7.4에서의 결합 친화도가 매우 낮기 때문에, pH 7.4에서의 변이체의 해리 상수를 결정하지 못했다. 그러나, 도 3은 pH 7.4에서의 이들 변이체의 친화도 순위가 pH 6.0에서의 순위와 동일함을 보여주었고, 이것은 pH 6.0 및 pH 7.4에서 FcRn에 대한 변이체의 결합이 유사함을 나타낸다. 변이체의 pH 6.0 결합이 개선되었기 때문에, pH 7.4에서의 결합도 마찬가지이다. FcRn에 대한 pH 6.0 및 7.4 결합이 변이체의 반감기에 영향을 미치는 방식 사이에는 미세한 균형이 존재한다. 더 높은 친화도의 변이체가 FcRn에 더 강력하게 결합할 수 있어서 FcRn에 의해 보다 많이 재순환될 수 있기 때문에 pH 6.0에서의 결합 개선은 변이체의 생체내 반감기에서 유익한 역할을 가질 것으로 여겨진다. 한편, FcRn-결합된 항체가 너무 강력하게 결합된 경우에는 쉽게 방출되어 다시 순환될 수 없기 때문에 pH 7.4에서의 실질적으로 높은 결합은 변이체의 반감기에 불리하다고 여겨진다.
높은 pH에서의 높은 친화도는 낮은 pH에서의 증가된 친화도의 유리한 효과를 무효로 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Dall'Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002]은
Figure pat00070
와 같은 인간 IgG1 변이체가 마우스에서 반감기가 개선되지 못했음을 보여주었고, 이것은 분명 뮤린 FcRn에 대한 이것들의 높은 pH 결합 친화도 때문이다. 따라서, 높은 pH 결합에 있어서의 얼마나 많은 개선이 약력학 반감기를 여전히 개선시키면서 IgG1 변이체에서 허용될 수 있는지는 불명확했다.
전술된 발명이 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 설명 및 예로서 약간 상세하게 기재되었지만, 상기 기재 및 예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 않된다. 본원에서 언급된 모든 특허 및 학술 문헌의 개시내용은 그 전문이 명백하게 참고로 포함된다.
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  1. 이뮤노글로불린 변이체의 용도.
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