BRPI0914091B1

BRPI0914091B1 - Igg variante, composição farmacêutica, kit e usos de um igg variante

Info

Publication number: BRPI0914091B1
Application number: BRPI0914091-3A
Authority: BR
Inventors: Lisa A. Damico; Henry B. Lowman; Napoleone Ferrara; Yik Andy Yeung; Yu-Ju G. Meng
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2008-10-14
Filing date: 2009-10-13
Publication date: 2022-05-10
Also published as: EP2352521B1; WO2010045193A1; IL264138A; AU2009303526A1; RU2536937C2; JP5913980B2; KR20110070914A; PE20110707A1; IL212048A0; EP2352521A1; PE20150682A1; KR102100066B1; KR20180027609A; JP6122072B2; CN102245208B; HK1163550A1; TW201023884A; TW201542228A; PH12016500081B1; CL2015000148A1

Abstract

lgG VARIANTE, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT, IgG, VARIANTE E USOS DE UM lgG VARIANTE. A presente invenção está relacionada a imunoglobulinas variantes com uma ou mais modificações de aminoácido na região de Fc que possui meia-vida in vivo aumentada, e métodos para usar as mesmas.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido é um pedido não provisional depositado sob 37 CFR 1,53 (b) (1), reivindicando prioridade sob 35 USC 119 (e) ao número de pedido provisório 61/105, 086 depositado em 14 de outubro de 2008, número de pedido provisório 61/152, 131 depositado em 12 de fevereiro 2009, número de pedido provisório 61/171, 768 depositado em 22 abril de 2009, e número de pedido provisório 61/220, 514 depositado em 25 de junho de 2009, o conteúdo do qual é incorporado aqui por referência.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção relaciona-se geralmente no campo da biologia molecular. Mais especificamente, a presente invenção refere-se às variantes de imunoglobulina IgG com a alteração de propriedades biológicas e métodos de uso dos mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Ao longo dos anos o uso de imunoglobulinas como agentes terapêuticos tem aumentado dramaticamente. As moléculas de imunoglobulina (Ig), que constituem uma parte importante do sistema imunológico são de grande interesse, porque (1) reagem com uma diversificada família de ligantes (2), possuem diferentes funções efetoras e (3) são de grande importância biológica. Hoje os usos de medicamentos à base de anticorpos incluem o tratamento de câncer, doenças autoimunes, bem como várias doenças sistêmicas e doenças infecciosas. Além disso, as imunoglobulinas são úteis como ferramentas de diagnóstico in vivo, por exemplo, em procedimentos de

[004] diagnóstico por imagem. IgG é a classe de imunoglobulina mais frequente em humanos e outros mamíferos e é utilizada em vários tipos de imunoterapias e procedimentos diagnósticos.

[005] A IgG1 humana é o anticorpo mais comumente utilizado para fins terapêuticos. Atualmente muitos anticorpos em ensaios clínicos são dirigidos contra antígenos associados ao tumor. Em particular, os anticorpos neutralizantes anti-VEGF mostraram suprimir o crescimento de uma variedade de linhas de células tumorais humanas em camundongos sem pêlo (Kim et al. Nature 362:841-844 (1993); Warren et al. J. Clin. Invest. 95:1789 a 1797 (1995); Borgstrom et al. Cancer Res. 56:4032 a 4039 (1996); e Melnyk et al. Cancer Res. 56:921 a 924 (1996)) e também inibir a angiogênese intra-ocular em modelos de isquemia retiniana (al Adamis al. Arch. Ophthalmol. 114:66 a 71 (1996)). De fato, um anticorpo humanizado anti-VEGF, o bevacizumabe (Avastin ®, Genentech, South San Francisco, CA) é o primeiro tratamento aprovado pela FDA projetado para inibir a angiogênese.

[006] Apesar de seu potencial, um dos problemas com a imunoterapia de imunoglobulina tem sido a persistência de imunoglobulinas na circulação. A taxa de depuração da imunoglobulina afeta diretamente a quantidade e a frequência da dosagem da imunoglobulina. O aumento da dosagem e a frequência da dose podem causar efeitos adversos no paciente e também aumenta os custos médicos.

[007] O mecanismo de catabolismo de IgG na circulação foi esclarecido através de estudos relacionados com a transferência de imunidade passiva da mãe para o feto / recém-nascido através da placenta ou do saco vitelino ou através do colostro (transferência materno-fetal de anticorpos IgG através transcitose) em roedores (Brambell, Lancet, ii :1087-1093, de 1966; Rodewald, J. Biol Cell, 71:666-670, 1976; Morris et al, In: Antigen Absorption by the Gut, pp. 3 a 22, 1978, University Park Press, Baltimore; Jones et al., J. Clin. Invest., 51:2916-2927, 1972). O receptor Fc neonatal (FcRn) desempenha um papel importante na transcitose e homeostase de IgG em mamíferos. FcRn é estruturalmente homólogo às moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e consiste de uma cadeia α de transmembrana e β2-microglobulina (β2m). Estudos anteriores em camundongos mostraram que a meia-vida sérica de IgG em FcRn ou camundongos deficientes de β2m foi bastante reduzido (Roopenian et al., J Immunol 170(7), 3528 a 3533, 2003; Israel et al., Immunology 89(4), 573 a 578, 199, demonstrando o papel protetor da FcRn na regulação do nível de IgG circulante. Vários experimentos com mutagênese sítio-específicos na região Fc das IgGs de camundongos levaram à identificação de certos resíduos críticos de aminoácidos envolvidos na interação entre IgG e FcRn (Kim et al., Eur. J. Immunol., 24:2429 a 2434, 1994; Medesan et al., Eur. J. Immunol., 26:2533, 1996; Medesan et al., J. Immunol., 158:2211 a 2217, 1997). Além disso, várias publicações descrevem métodos para obtenção de moléculas fisiologicamente ativas cujas meias-vidas são modificadas, quer através da introdução ou modificação de uma região ligante FcRn dos IgGs (WO 97/43316; U.S. Pat. n°. 5,869,046; U.S. Pat. n°. 5,747,035; WO 96/32478; WO2006053301; U.S. Pat. n° 7,083,784; U.S. Pat. No. 7,371,826).

[008] Em nível molecular, o FcRn liga a porção Fc de IgG na região de domínio CH2-CH3. A interação Fc-FcRn é altamente dependente do pH; IgGs ligam FcRn com alta afinidade em um pH 6, mas como o pH é aumentado para 7,4, a afinidade de ligação cai consideravelmente. Essa interação dependente do pH é responsável por proteger o IgG da degradação. Especificamente, o IgG pinocitado é capturado por FcRn no endossomo ácido, reciclado de volta para a superfície da célula e, em seguida, liberado de volta para a circulação em um soro fisiológico de pH de 7,4 (Ober et al. Proc Natl Acad Sci EUA 101(30), 11076 a 11081, 2004; Ober et al. J Immunol 172(4), 2021 a 2029, 2004; Prabhat et al. Proc Natl Acad Sci EUA 104(14), 5889 a 5894, 2007). IgG que não está vinculado pelo FcRn é voltado para o lisossoma e degradado. Como FcRn é importante na regulação da homeostase de IgG, a modulação da interação entre Fc e FcRn através da engenharia de proteínas é um método para melhorar a farmacocinética de anticorpos terapêuticos (Shields et al. J Biol Chem 276(9), 6591 a 6604, 2001; Dall'Acqua et al. Nat Biotechnol 15(7), 637 a 640, 1997; Dall'Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171 a 5180, 2002; Hinton et al. J Biol Chem 279(8), 6213 a 6216, 2004; Hinton et al. J Immunol 176(1), 346 a 356, 2006; Datta-Mannan et al. Drug Metab Dispos 35(1), 86 a 94, 2007; Datta-Mannan et al. J Biol Chem 282(3), 1709 a 1717, 2007). Uma série de estudos em camundongos, macacos resos e cinomolgos têm demonstrado que o aumento da afinidade de ligação de pH-6 de IgGs pode prolongar a meia-vida (Dall'Acqua et al. Nat Biotechnol 15(7), 637 a 640, 1997; Dall'Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171 a 5180, 2002; Hinton et al. J Biol Chem 279(8), 6213 a 6216, 2004; Hinton et al. J Immunol 176(1), 346 a 356, 2006). Além disso, outros estudos também demonstraram que a afinidade de ligação FcRn em pH 7,4 é um determinante adicional de farmacocinética de IgG. Especificamente, algumas variantes com o aumento da afinidade de ligação de pH 7,4 ao camundongo FcRn apresentaram aumento (ou seja, diminuição da meia-vida) em camundongos (Dall'Acqua et al. J Immunol 169 (9), 5171 a 5180, 2002). No entanto, a relação detalhada entre afinidade e meia-vida de FcRn não foi esclarecida, já que todos os estudos anteriores envolveram um número pequeno de variantes, dentro de uma gama limitada de afinidades de FcRn. A extensão de meia-vida máxima alcançável através de engenharia da interação Fc:FcRn não é clara.

[009] Apesar do fato de que a adesão ao (cumprimento) tratamento medicamentoso seja importante, estima-se que metade das pessoas para as quais os medicamentos são prescritos não os toma na forma recomendada. Por exemplo, uma pesquisa recente mostrou que mais de um terço das mulheres que tomam drogas de câncer de mama desenvolvidas nos últimos 10 anos não concluiram seu curso de cinco anos recomendados. Algumas das causas para a baixa adesão incluem esquecimento, dificuldade física no cumprimento (por exemplo, viajar ou se afastar do local de tratamento), inconveniência, efeitos adversos, esquema complicado e custo dos medicamentos. A má adesão ao tratamento medicamentoso pode levar a atingir menos os benefícios de saúde totais que os medicamentos podem fornecer aos pacientes. Por exemplo, não completando o curso recomendado no tratamento do câncer pode levar a uma recorrência da doença e uma redução da chance de sobrevivência.

[010] As estratégias para melhorar o cumprimento de drogas incluem torna-lo mais conveniente para os pacientes que terminam o curso de tratamento recomendado. Uma das maneiras que isto pode ser realizado em pacientes sob tratamento com a imunoterapia é aumentar a duração do tempo que as imunoglobulinas ficam em circulação. A taxa de depuração da imunoglobulina afeta diretamente a quantidade e a frequência da dosagem da imunoglobulina. Portanto, o desenvolvimento de uma imunoglobulina, que confere maior meia-vida "in vivo" pode diminuir a quantidade e / ou frequência da dosagem, minimizando assim os inconvenientes, bem como quaisquer custos médicos adicionais.

[011] Assim, seria altamente vantajoso modificar as imunoglobulinas que conferem maior meia-vida in vivo para fins terapêuticos. A presente invenção aborda estas e outras necessidades, como será evidente após a revisão da seguinte divulgação.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[012] A invenção fornece novas variantes de IgG e suas respectivas utilizações. Uma série de variantes IgG é fornecida na invenção. Por exemplo, a presente invenção revela novas variantes de IgG compreendendo uma região de Fc de IgG humana compreendendo duas ou mais substituições de aminoácidos em relação a uma região de Fc de IgG humana do tipo selvagem em dois ou mais resíduos de aminoácidos 251, 252, 307, 308, 378 , 428, 430, 434 e 436, numerados de acordo com o índice EU como em Kabat, em que o IgG variante tem uma meia-vida aumentada comparada à meia-vida de um IgG tendo uma região de Fc de IgG humano do tipo selvagem, e em que pelo menos duas das substituições de aminoácidos são nos resíduos de aminoácidos 251, 252, 307, 308, 378, 428, 430, 434 ou 436, e uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 251 é uma substituição com ácido aspártico ou ácido glutâmico, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 252 é uma substituição com a tirosina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 307 é uma substituição com a glutamina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 308 é uma substituição com prolina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 378 é uma substituição com valina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 428 é uma substituição com leucina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 430 é uma substituição com alanina ou lisina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 434 é uma substituição com alanina, serina ou tirosina, e uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 436 é uma substituição com isoleucina.

[013] Em certas modalidades, a região Fc da IgG humana compreende a substituição de um aminoácido no aminoácido 251, onde a substituição do aminoácido no aminoácido 251 é a substituição com ácido aspártico ou ácido glutâmico. Em certas modalidades, a região Fc da IgG humana compreende a substituição de um aminoácido no aminoácido 307, onde a substituição do aminoácido no aminoácido 307 é a substituição com glutamina. Em certas modalidades, a região Fc da IgG humana compreende a substituição de um aminoácido no aminoácido 308, onde a substituição do aminoácido no aminoácido 308 é a substituição com prolina. Em certas modalidades, a região Fc da IgG humana compreende a substituição de um aminoácido no aminoácido 378, onde a substituição do aminoácido no aminoácido 378 é a substituição com valina. Em certas modalidades, a região Fc da IgG humana compreende a substituição de um aminoácido no aminoácido 436, onde a substituição do aminoácido no aminoácido 436 é a substituição com isoleucina. Em certas modalidades, as IgGs variantes têm uma maior afinidade de ligação para FcRn do que a IgG com a região Fc com IgG humana de tipo selvagem.

[014] Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 307 com glutamina e a substituição do aminoácido no aminoácido 434 com alanina. Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 307 com glutamina e a substituição de aminoácido em aminoácido 434 com serina. Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 308 com prolina e a substituição do aminoácido no aminoácido 434 com alanina. Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 252 com tirosina e a substituição do aminoácido no aminoácido 434 com alanina. Em uma modalidade, região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 378 com valina e a substituição do aminoácido no aminoácido 434 com alanina. Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 428 com leucina e a substituição do aminoácido no aminoácido 434 com alanina. Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 434 com alanina e a substituição do aminoácido no aminoácido 436 com isoleucina. Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 308 com prolina e a substituição de aminoácido em aminoácido 434 com tirosina. Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 307 com glutamina e a substituição do aminoácido no aminoácido 436 com isoleucina.

[015] A presente invenção revela novas variantes de IgG compreendendo uma região de Fc de IgG humano compreendendo três ou mais substituições de aminoácidos em relação a uma região de Fc de IgG humano do tipo selvagem em três ou mais resíduos de aminoácidos 251, 252, 307, 308, 378 , 428, 430, 434 e 436, numerados de acordo com o índice EU como em Kabat, em que o IgG variante tem uma meia-vida aumentada comparada à meia-vida de um IgG tendo a região de Fc de IgG humano do tipo selvagem, e em que pelo menos três das substituições de aminoácidos são nos resíduos de aminoácidos 251, 252, 307, 308, 378, 380, 428, 430, 434 ou 436, e uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 251 é uma substituição com ácido aspártico ou ácido glutâmico, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 252 é uma substituição com tirosina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 307 é uma substituição com glutamina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 308 é uma substituição com prolina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 378 é uma substituição com valina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 380 é uma substituição com alanina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 428 é uma substituição com a leucina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 430 é uma substituição com alanina ou lisina, uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 434 é uma substituição com alanina, serina, tirosina ou histidina, e uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 436 é uma substituição com isoleucina.

[016] Em certas modalidades, a região Fc da IgG humana compreende a substituição de um aminoácido no aminoácido 251, onde a substituição do aminoácido no aminoácido 251 é a substituição com ácido aspártico ou ácido glutâmico. Em certas modalidades, a região Fc da IgG humana compreende a substituição de um aminoácido no aminoácido 307, onde a substituição do aminoácido no aminoácido 307 é a substituição com glutamina. Em certas modalidades, a região Fc da IgG humana compreende a substituição de um aminoácido no aminoácido 308, onde a substituição do aminoácido no aminoácido 308 é a substituição com prolina. Em certas modalidades, a região Fc da IgG humana compreende a substituição de um aminoácido no aminoácido 378, onde a substituição do aminoácido no aminoácido 378 é a substituição com valina. Em certas modalidades, a região Fc da IgG humana compreende a substituição de um aminoácido no aminoácido 436, onde a substituição do aminoácido no aminoácido 436 é a substituição com isoleucina. Em certas modalidades, as IgGs variantes têm uma maior afinidade de ligação ao FcRn em comparação com IgG com tendo a região Fc de IgG humana de tipo selvagem.

[017] Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 307 com glutamina, a substituição do aminoácido no aminoácido 380 com alanina e a substituição de aminoácido em aminoácido 434 com serina. Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 307 com glutamina, a substituição do aminoácido no aminoácido 380 com alanina e a substituição do aminoácido no aminoácido 434 com alanina. Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido aminado no aminoácido 252 com tirosina, a substituição do aminoácido no aminoácido 308 com prolina e a substituição de aminoácido em aminoácido 434 com tirosina. Em uma modalidade, a região Fc da IgG humana compreende a substituição do aminoácido no aminoácido 251 com ácido aspártico, a substituição do aminoácido no aminoácido 307 com glutamina e a substituição do aminoácido no aminoácido 434 com histidina.

[018] Em certas modalidades, a presente invenção fornece as IgGs variantes ou fragmentos das mesmas que compreendem ainda a substituição de um aminoácido na posição 297 para alanina. Em certas modalidades, a IgG variante da presente invenção tem uma afinidade maior de ligação para FcRn do que a IgG tendo a região Fc de IgG humana de tipo selvagem. Em certas modalidades, a IgG variante tem uma afinidade maior de ligação para FcRn em pH 6,0 que em pH 7,4. Em certas modalidades, a IgG variante é uma IgG humana ou humanizada. Em certas modalidades, a IgG variante é IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em certas modalidades, a região Fc de IgG da IgG variante é uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em certas modalidades, a região Fc de IgG da IgG variante é uma região Fc de IgG1.

[019] Em certas modalidades, a variante de IgG é um anticorpo anti-VEGF. Em certas modalidades, a IgG variante é uma variante do bevacizumabe. Em certas modalidades, a IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem é o bevacizumabe. Em certas modalidades, a região Fc de IgG humana de tipo selvagem é a região Fc do bevacizumabe. Em certas modalidades, a IgG variante compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 1) e o domínio variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 2). Em certas modalidades, a IgG variante compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 3) e domínio variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 4). Em certas modalidades, a IgG variante compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 7) e domínio variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 8).

[020] A presente invenção divulga novas composições farmacêuticas compreendendo qualquer das IgGs variantes aqui descritas e um veículo farmaceuticamente aceitável. Um kit compreendendo qualquer uma das IgGs variantes descritas aqui, em um recipiente, e instruções de uso também são fornecidos.

[021] Em certas modalidades, a meia-vida da IgG variante é aumentada em pelo menos 50%, 100%, 150%, 200%, 300% ou mais em comparação com uma IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem. Em certas modalidades, a meia-vida da IgG variante é aumentada em pelo menos duas vezes em comparação com uma IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem. Em certas modalidades, a meia-vida da IgG variante é aumentada em pelo menos três vezes em comparação com uma IgG com ao região Fc de IgG humana de tipo selvagem. Em certas modalidades, a meia-vida da IgG variante é aumentada em pelo menos quatro vezes em comparação com uma IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem. Em certas modalidades, a IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem é o bevacizumabe. Em certas modalidades, a meia-vida da IgG variante é a semivida média de bevacizumabe. Em certas modalidades, a meia-vida média de bevacizumabe é de cerca de 10 a 12 dias, medida em macacos cinomolgos, ou cerca de três semanas quando medida em seres humanos.

[022] Em certas modalidades, as variantes de IgGs compreendendo uma região Fc de IgG humana são fornecidas, em que a região Fc da IgG humana compreende substituições de aminoácidos em relação a uma região Fc de IgG humana de tipo selvagem em resíduos de aminoácidos 307 e 434, numerados de acordo com o índice da EU como em Kabat, onde a IgG variante tem uma meia-vida aumentada em comparação com a meia-vida de IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem, e em que a substituição do aminoácido no resíduo de aminoácidos 307 é uma substituição com a glutamina, e a substituição do aminoácido no resíduo de aminoácidos 434 é uma substituição com alanina. Em uma modalidade, a IgG variante é a IgG1 variante compreendendo o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 1) e o domínio variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 2), e compreendendo uma região de Fc de IgG1 humano compreendendo substituições de aminoácidos em relação a uma região de Fc de IgG1 humano do tipo selvagem nos resíduos de aminoácidos 307 e 434, numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat, em que o IgG1 variante tem uma meia-vida aumentada comparada à meia-vida de um IgG1 tendo a região de Fc de IgG1 humano de tipo selvagem, e em que a substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 307 é uma substituição com a glutamina, e a substituição do aminoácido no resíduo de aminoácidos 434 é uma substituição com alanina.

[023] Em outra modalidade, as IgGs variantes que compreendem uma região Fc de IgG humana são fornecidas, onde a região Fc de IgG humana compreende substituições de aminoácidos em relação a região Fc de IgG humana de tipo selvagem de resíduos de aminoácidos 307 e 434, numerados de acordo com o índice da EU como em Kabat, onde a IgG variante tem uma meia- vida aumentada em comparação com a meia-vida de IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem, e em que a substituição do aminoácido no resíduo de aminoácidos 307 é uma substituição com a glutamina, e a substituição do aminoácido no resíduo de aminoácidos 434 é a substituição com serina.

[024] Em outra modalidade, as IgGs variantes que compreendem uma região Fc de IgG humana são fornecidas, onde a região Fc de IgG humana de aminoácidos em relação a uma região Fc de IgG humana de tipo selvagem de resíduos de aminoácidos 308 e 434, numeradas de acordo com o índice da EU como em Kabat, onde a IgG1 variante tem uma meia-vida aumentada em comparação com a meia-vida de IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem, e em que a substituição do aminoácido no resíduo de aminoácidos 308 é uma substituição de prolina e a substituição do aminoácido no resíduo de aminoácidos 434 é uma substituição com alanina.

[025] Em outra modalidade, as IgGs variantes que compreendem uma região Fc de IgG humana são fornecidas, onde a região Fc de IgG humana compreende substituições de aminoácidos em relação a uma região Fc de IgG humana de tipo selvagem de resíduos de aminoácidos 307, 380 e 434, numeradas de acordo com o índice da EU como em Kabat, onde a IgG variante tem uma meia-vida aumentada em comparação com a meia-vida de IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem, e em que a substituição do aminoácido no resíduo de aminoácidos 307 é uma substituição com glutamina, a substituição do aminoácido no resíduo de aminoácidos 380 é uma substituição com alanina, e a substituição de aminoácido em resíduo de aminoácidos 434 é a substituição com serina.

[026] Em certas modalidades, a IgG variante compreende uma região Fc da IgG humana acima descrita tendo uma afinidade maior de ligação para FcRn do que a IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem. Em certas modalidades, a IgG variante tem uma afinidade maior de ligação para FcRn em pH 6,0 que em pH 7,4. Em certas modalidades, a IgG variante é uma IgG humana ou humanizada. Em certas modalidades, a IgG variante é IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em certas modalidades, a região Fc de IgG da IgG variante é uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em certas modalidades, a região Fc de IgG da IgG variante é a região Fc de IgG1. Em certas modalidades, a variante de IgG é um anticorpo anti-VEGF. Em certas modalidades, a IgG variante é uma variante do bevacizumabe. Em certas modalidades, a IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem é o bevacizumabe. Em certas modalidades, a região Fc de IgG humana de tipo selvagem é a região Fc do bevacizumabe. Em certas modalidades, a IgG variante compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 1) e o domínio variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 2). Em certas modalidades, uma composição farmacêutica compreendendo uma das IgGs variantes compreendendo uma região Fc da IgG humana e um veículo farmaceuticamente aceitável são fornecidos aqui. Um kit composto por qualquer uma das IgGs variante compreende uma região Fc da IgG humana, em um recipiente, e instruções de uso também são fornecidas.

[027] Em certas modalidades, variantes de IgGs compreendendo a região Fc de IgG humana são fornecidas, o IgGs variante compõem o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 1) e o domínio variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 2) e em que uma região Fc de IgG humana compreende uma substituição de aminoácido em relação a uma região Fc de IgG humana de tipo selvagem no resíduo de aminoácidos 434, numerados de acordo com o índice da EU como em Kabat, onde a IgG variante tem uma meia-vida aumentada em comparação com a meia-vida de uma IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem, e a IgG variante tem uma maior afinidade de ligação para FcRn em comparação com a afinidade de ligação para FcRn da IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem, e em que a substituição do aminoácido no resíduo de aminoácidos 434 é uma substituição com histidina. Em certas modalidades, a IgG variante é a IgG1 variante.

[028] Em certas modalidades, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é aumentada em pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 100% em comparação com a meia-vida da IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem. Em uma modalidade, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é aumentada em pelo menos 50% em relação ao meia- vida da IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem. Em outra modalidade, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é aumentada em pelo menos 75% em relação ao meia-vida da IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem. Em ainda outra modalidade, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é aumentada em pelo menos 100% em comparação com a meia-vida da IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem.

[029] Em certas modalidades, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é pelo menos cerca de 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 dias. Em uma modalidade, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é pelo menos cerca de 15 dias. Em outra modalidade, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é pelo menos cerca de 20 dias. Em outra modalidade, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é pelo menos cerca de 25 dias. Em outra modalidade, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é pelo menos cerca de 30 dias. Em outra modalidade, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é pelo menos cerca de 35 dias. Em outra modalidade, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é pelo menos cerca de 40 dias. Em certas modalidades, a IgG variante é a IgG1 variante.

[030] Em certas modalidades, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é a meia-vida como medida em seres humanos. Em certas modalidades, a meia-vida de uma IgG variante da presente invenção é a meia- vida como medida em macacos cinomolgos. Em certas modalidades, a IgG do tipo selvagem ou tendo a região Fc de IgG humana de tipo selvagem é o bevacizumabe. Em certas modalidades, a meia-vida de bevacizumabe é de cerca de 10 a 12 dias quando medida em macacos cinomolgos, ou cerca de 20 dias quando medida em humanos.

[031] Uma série de métodos de uso das variantes de IgG é fornecida na invenção. Métodos para tratar tumor em um indivíduo são fornecidos. Por exemplo, os métodos compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de qualquer IgGs variantes descritas acima e aqui. Em certas modalidades, a variante de IgG é um anticorpo anti-VEGF. Em certas modalidades, a IgG variante é uma variante do bevacizumabe. Em certas modalidades, os métodos ainda compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um agente quimioterapêutico.

[032] Métodos para inibir atividade de VEGF em um indivíduo são fornecidos na invenção. Por exemplo, os métodos compreendem administrar a dito indivíduo uma quantidade eficaz de qualquer IgGs variantes descritas acima e aqui. Em certas modalidades, a atividade de VEGF é a angiogênese.

[033] Métodos para modular permeabilidade vascular em um indivíduo são fornecidos na invenção. Por exemplo, os métodos compreendem administrar a dito indivíduo uma quantidade eficaz de qualquer IgGs variantes descritas acima e aqui.

[034] Os métodos de tratamento de um distúrbio não neoplásico em um indivíduo são fornecidos na invenção. Por exemplo, os métodos compreendem administrar a dito indivíduo uma quantidade eficiente de quaisquer IgGs variantes descritas acima e aqui. Em certas modalidades, a doença não neoplásica é uma doença autoimune. Em certas modalidades, a doença não neoplásica é a doença de Alzheimer. Em certas modalidades, o indivíduo é diagnosticado com a degeneração macular relacionada à idade.

[035] Os métodos de tratamento de um tumor expressando HER em um indivíduo são fornecidos na invenção. Por exemplo, os métodos compreendem administrar a dito indivíduo uma quantidade eficiente de quaisquer IgGs variantes descritas acima e aqui. Em certas modalidades, a IgG variante compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID NO: 7) e domínio variável de cadeia leve (SEQ ID NO: 8).

[036] Métodos para inibir ou prevenir crescimento de células de câncer em um indivíduo são fornecidos na invenção. Por exemplo, os métodos compreendem administrar a dito indivíduo uma quantidade eficaz de qualquer IgGs variantes descritas acima e aqui.

[037] Os métodos de administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de uma variante de IgG são fornecidos na invenção. Estes métodos de administração podem ser usados em combinação com outros métodos (por exemplo, os métodos de tratamentos) aqui descritos. Em certas modalidades, os métodos compreendem a administração ao dito indivíduo com uma quantidade eficiente de qualquer IgGs variantes descritas acima e aqui, e em que a IgG variante é administrada ao indivíduo a cada 4 semanas ou com intervalos maiores. Em certas modalidades, a IgG variante é administrada a cada 5 semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante é administrada a cada 6 semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante é administrada a cada 7 semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante é administrada a cada 8 semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante é administrada a cada nove semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante é administrada a cada 10 semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante é administrada a cada 11 semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante é administrada a cada 12 semanas ou mais. Em certas modalidades, os métodos compreendem a administração ao dito indivíduo com uma quantidade eficiente de quaisquer IgGs variantes, em que a IgG variante é administrada com menos frequência que a frequência de dose recomendada ou prescrita de IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem. Em certas modalidades, a IgG com a região Fc de IgG humana de tipo selvagem é o bevacizumabe. Em certas modalidades, a IgG variante, por exemplo, uma variante do bevacizumabe, é administrada com menos frequência que a frequência de dose prescrita de bevacizumabe.

[038] Em certas modalidades, a IgG variante é inicialmente administrada a cada duas semanas e, posteriormente, administrada a cada 4 semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante é inicialmente administrada a cada três semanas e, posteriormente, administrada a cada 6 semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante é inicialmente administrada a cada quatro semanas e, posteriormente, administrada a cada 8 semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante é inicialmente administrada a cada cinco semanas e, posteriormente, administrada a cada 10 semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante é inicialmente administrada a cada seis semanas e, posteriormente, administrada a cada 12 semanas ou mais. Em certas modalidades, a IgG variante, por exemplo, uma variante do bevacizumabe, inicialmente é administrada com a frequência de dose prescrita de bevacizumabe e, posteriormente, administrada com menos frequência do que a dose prescrita de bevacizumabe.

[039] Em determinadas modalidades dos métodos descritos no presente documento, o IgG variante é um anticorpo anti-VEGF. Em uma modalidade, o anticorpo anti-VEGF compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID N°:1) e o domínio variável de cadeia leve (SEQ ID N°:2). Em outra modalidade, o anticorpo anti-VEGF é um variante de bevacizumab.

[040] Em determinadas modalidades, os IgG variantes da invenção são administrados a um indivíduo de maneira intravenosa. Em determinadas modalidades, os IgG variantes da invenção são administrados a um indivíduo de maneira subcutânea.

[041] Em determinadas modalidades dos métodos descritos no presente documento, o indivíduo é um humano. Em determinadas modalidades, o indivíduo é diagnosticado com câncer. Em determinadas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de pulmão não pequena célula, carcinoma celular renal, câncer do ovário, glioblastoma, câncer de mama e câncer colorretal.

[042] Também são fornecidos no presente documento métodos de tratamento de um câncer benigno, pré-canceroso ou não-metastático em um indivíduo, que compreende a administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um IgG variante. Em determinadas modalidades, a administração do IgG variante evita que o câncer benigno, pré-canceroso ou não-metastático se torne um câncer invasivo ou metastático. Por exemplo, o câncer benigno, pré- canceroso ou não-metastático pode ser um câncer de estágio 0, estágio 1 ou estágio 1I e, em determinadas modalidades, a administração do IgG variante evita que o câncer benigno, pré-canceroso ou não-metastático progrida para o(s) próximo(s) estágio(s), por exemplo, um câncer de estágio 1, de estágio 1I, de estágio 1II ou de estágio 1V. Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado por um período e em uma quantidade suficiente para tratar o tumor benigno, pré-canceroso ou não-metastático no indivíduo ou para evitar que o tumor benigno, pré-canceroso ou não-metastático se torne um câncer invasivo ou metastático. Em determinadas modalidades, administrar o IgG variante reduz o tamanho do tumor, carga tumoral ou o número do tumor do tumor benigno, pré- canceroso ou não-metastático. O IgG variante também pode ser administrado em uma quantidade e por um período para diminuir a densidade vascular no tumor benigno, pré-canceroso ou não-metastático.

[043] Conforme descrito no presente documento, os métodos da invenção podem ser usados para tratar, por exemplo, um câncer de estágio 0 (por exemplo, um carcinoma in situ), de estágio 1 ou de estágio 1I. Os métodos de terapia neoadjuvante ou adjuvante podem ser usados para tratar qualquer tipo de câncer, por exemplo, benigno ou maligno. Em determinadas modalidades da invenção, o câncer é um tumor sólido, incluindo, mas não se limitando a, câncer de colo, câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, câncer de pulmão (por exemplo, câncer de pulmão não pequena célula), melanoma, câncer do ovário, câncer pancreático, câncer gastrointestinal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de fígado e cânceres de tecido macio (por exemplo, linfomas de célula B como NHL e mieloma múltiplo e leucemias como leucemia linfocítica crônica). Em outra modalidade, o tumor benigno, pré-canceroso ou não- metastático é um pólipo, adenoma, fibroma, lipoma, gastrinoma, insulinoma, condroma, osteoma, hemangioma, linfangioma, meningioma, leiomioma, rabdomioma, papiloma de célula escamosa, neuromas acústicos, neurofibroma, cistanoma de duto biliar, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, mixomas, tracomas, granulomas, hamartoma, papiloma de célula transicional, adenoma pleiomórfico da glândula salivar, tumor desmóide, cistopapiloma dermóide, cistadenoma, hiperplasia nodular focal ou uma hiperplasia regenerativa nodular. Em outra modalidade, o método é desejavelmente usado para tratar um adenoma. Os exemplos não limitadores de adenomas incluem adenoma de célula de fígado, adenoma renal, adenoma metanéfrico, adenoma bronquial, adenoma alveolar, adenoma adrenal, adenoma pituitário, adenoma de paratireóide, adenoma pancreático, adenoma de glândula salivar, adenoma hepatocelular, adenoma gastrointestinal, adenoma tubular e adenoma de duto biliar.

[044] A invenção também apresenta métodos que compreendem a administração a um indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante para evitar a ocorrência ou recorrência de um câncer benigno, pré-canceroso ou não- metastático no indivíduo. Em determinadas modalidades da invenção, o indivíduo está em risco para câncer, pólipos, ou uma síndrome de câncer. Em um exemplo, o indivíduo tem um histórico familiar de câncer, pólipos ou uma síndrome de câncer herdada. Em determinados aspectos da invenção, o indivíduo está em risco de desenvolver um tumor benigno, pré-canceroso ou não-metastático. Em determinadas modalidades, o método evita a ocorrência ou recorrência do dito câncer benigno, pré-canceroso ou não-metastático em um indivíduo que nunca teve um tumor, um indivíduo que nunca teve um câncer clinicamente detectável ou um indivíduo que apenas teve um tumor benigno.

[045] Em outro aspecto, são fornecidos métodos para evitar ou reduzir a probabilidade de recorrência de um câncer em um indivíduo que incluem a administração a um indivíduo um IgG variante por um período e em uma quantidade suficiente para evitar ou reduzir a probabilidade de recorrência de câncer no indivíduo. A invenção inclui um método para evitar a recorrência de um câncer em um indivíduo que tem um tumor que inclui as etapas de remover o tumor (por exemplo, com o uso de cirurgia definitiva) e, posteriormente, administrar a um indivíduo um IgG variante. A invenção inclui métodos para evitar o recrescimento de um tumor em um indivíduo que inclui as etapas de remover o tumor (por exemplo, com o uso de cirurgia definitiva) e, posteriormente, administrar a um indivíduo um IgG variante. Em um aspecto relacionado, a invenção inclui um método para evitar recorrência de câncer em um indivíduo ou reduzir a probabilidade de recorrência de câncer em um indivíduo que inclui, opcionalmente, administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante antes da cirurgia, realizar cirurgia definitiva e administrar uma quantidade eficaz de um IgG variante seguinte à cirurgia sendo que a administração do IgG variante após a cirurgia evita a recorrência do câncer ou reduz a probabilidade de recorrência de câncer. Em outro aspecto relacionado, a invenção inclui um método para evitar recorrência de câncer em um indivíduo ou reduzir a probabilidade de recorrência de câncer em um indivíduo que inclui administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante na ausência de qualquer agente terapêutico anti-câncer adicional, sendo que a administração evita a recorrência de câncer em um indivíduo ou reduz a probabilidade de recorrência de câncer em um indivíduo.

[046] Para cada um dos aspectos acima, o tumor pode ser qualquer tipo de tumor incluindo, mas não se limitando aos tumores sólidos e, particularmente, aos tumores e adenomas, descritos no presente documento. O indivíduo pode ter um tumor dormente ou micrometástase, que pode, ou não, ser clinicamente detectável. Em uma modalidade deste aspecto, o IgG variante é administrado por um período e em uma quantidade suficiente para reduzir neovascularização de um tumor dormente ou micrometástase. Em outra modalidade, o IgG variante é administrado por um período e em uma quantidade suficiente para evitar a ocorrência de um tumor clinicamente detectável, ou metástase do mesmo, ou para aumentar a duração de sobrevivência do indivíduo.

[047] Em uma modalidade, o IgG variante é uma monoterapia. Em outra modalidade, o indivíduo foi previamente tratado para o tumor, por exemplo, com o uso de uma terapia anti-câncer. Em um exemplo, a terapia anti-câncer é cirurgia. Em outra modalidade, o indivíduo pode ser tratado, ainda, com uma terapia anti-câncer adicional antes, durante (por exemplo, simultaneamente), ou depois da administração do IgG variante. Os exemplos de terapias anti-câncer incluem, sem limitação, cirurgia, terapia de radiação (radioterapia), bioterapia, imunoterapia, quimioterapia ou uma combinação destas terapias.

[048] Em modalidades onde o indivíduo se submeteu a cirurgia definitiva, o IgG variante é geralmente administrado após um período de tempo no qual o indivíduo se recuperou da cirurgia. Este período de tempo pode incluir o período necessário para cura de ferimento ou cura da incisão cirúrgica, o período de tempo necessário para reduzir o risco de deiscência de ferimento ou o período de tempo necessário para o indivíduo retornar a um nível de saúde essencialmente similar ou melhor que o nível de saúde antes da cirurgia. O período entre a conclusão da cirurgia definitiva e a primeira administração do IgG variante também pode incluir o período necessário para uma interrupção da droga, no qual o indivíduo necessita ou solicita um período de tempo entre regimes terapêuticos. Geralmente, o período de tempo entre a conclusão da cirurgia definitiva e o começo da terapia de IgG variante pode incluir menos de uma semana, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas (28 dias), 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos ou mais. Em uma modalidade, o período de tempo entre a cirurgia definitiva e a administração do IgG variante é maior que 2 semanas e menor que 1 ano. Em uma modalidade, o período de tempo entre a cirurgia definitiva e a administração do IgG variante é maior que 4 semanas (28 dias).

[049] Em determinadas modalidades, cada um dentre os aspectos acima pode incluir, ainda, o monitoramento do indivíduo para recorrência do câncer.

[050] A invenção também fornece métodos de terapia neoadjuvante antes da remoção cirúrgica de câncer operável em um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, que compreendem a administração ao paciente uma quantidade eficaz de um IgG variante onde o paciente foi diagnosticado com um tumor ou câncer. O IgG variante pode ser administrado sozinho ou em combinação com ao menos um agente quimioterápico.

[051] A invenção também inclui um método de tratamento de um indivíduo com câncer operável que inclui administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante antes da cirurgia e, posteriormente, realizar cirurgia através da qual o câncer é ressecado. Em uma modalidade, o método inclui, ainda, a etapa de administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante após cirurgia para evitar recorrência do câncer.

[052] Em outro aspecto, a invenção está relacionada a um método de terapia neoadjuvante que compreende a administração a um indivíduo com câncer operável uma quantidade eficaz de um IgG variante e ao menos um agente quimioterápico antes da cirurgia definitiva.

[053] Em outro aspecto, a invenção inclui um método de redução de tamanho do tumor em um indivíduo que tem um tumor irressecável que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante sendo que a administração reduz o tamanho do tumor permitindo assim a resseção do tumor. Em uma modalidade, o método inclui, ainda, administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante após resseção completa do tumor.

[054] Em outro aspecto, a invenção está relacionada a um método de tratamento de câncer em um indivíduo que compreende as seguintes etapas: a) um primeiro estágio que compreende uma pluralidade de ciclos de tratamento sendo que cada ciclo compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante e ao menos um agente quimioterápico em um intervalo predeterminado; b) a cirurgia definitiva através da qual o câncer é removido; e c) a segundo estágio que compreende uma pluralidade de ciclos de manutenção sendo que cada ciclo compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante sem qualquer agente quimioterápico em um intervalo predeterminado. Em uma modalidade, o primeiro estágio compreende uma primeira pluralidade de ciclos de tratamento sendo que um IgG variante e um primeiro regime de quimioterapia são administrados seguidos por uma segunda pluralidade de ciclos de tratamento sendo que um IgG variante e um segundo regime de quimioterapia são administrados.

[055] A invenção fornece métodos que compreendem a administração a um indivíduo com câncer metastático ou não-metastático, seguinte à cirurgia definitiva, uma quantidade eficaz de um IgG variante. Em determinadas modalidades, o método inclui, ainda, o uso de ao menos um agente quimioterápico.

[056] Em um aspecto, o método compreende as seguintes etapas: a) um primeiro estágio que compreende uma pluralidade de ciclos de tratamento sendo que cada ciclo compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante e ao menos um agente quimioterápico em um intervalo predeterminado; e b) um segundo estágio que compreende uma pluralidade de ciclos de manutenção sendo que cada ciclo compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante sem qualquer agente quimioterápico em um intervalo predeterminado. Em uma modalidade, o primeiro estágio compreende uma primeira pluralidade de ciclos de tratamento sendo que um IgG variante e um primeiro regime de quimioterapia são administrados, seguindo por uma segunda pluralidade de ciclos de tratamento sendo que um IgG variante e um segundo regime de quimioterapia são administrados.

[057] Em determinadas modalidades, o IgG variante é um anticorpo anti-VEGF que aglutina ao VEGF ou reduz a expressão de VEGF ou a atividade biológica. O anticorpo anti-VEGF, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, pode ser um anticorpo monoclonal, um anticorpo quimérico, um anticorpo completamente humano ou um anticorpo humanizado. Em determinadas modalidades, os anticorpos exemplificadores úteis nos métodos da invenção incluem bevacizumab (AVASTIN®), G6-31, B20-4.1, B20-4.1.1 e fragmentos dos mesmos.

[058] Em determinadas modalidades, o IgG variante é anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado HERCEPTIN®. Em determinadas modalidades, o IgG variante é chimeric anticorpo quimérico anti-CD20 Rituxan®, anticorpo anti-IgE XOLAIR®, anticorpo anti-CD20, anticorpo anti-CD11a Raptiva®, anticorpo anti-Her2 Omnitarg®, um anticorpo anti-oxLDL, anticorpo anti-CD4 MTRX1011A, um anticorpo anti-HCV, um anticorpo anti- IL-17A/F, um anticorpo anti-A-beta, um anticorpo anti-DR6, anticorpo anti-humano citomegalovírus (HCMV), anticorpo da família do receptor anti-HER, um anticorpo de fator anti-tecido, anticorpo MLN-02, anticorpo anti-CD 18 F(ab')2 humanizado ou um anticorpo anti-IgE IgG1 humanizado rhuMab-E25. Em determinadas modalidades, o IgG variante is a anticorpo biespecífico sendo que os antígenos alvo são IL-4 e IL-13. Em determinadas modalidades, o IgG variante é um anticorpo que alveja um epítopo de staph aureus.

[059] Embora o indivíduo possa ser tratado de inúmeras maneira diferentes antes, durante ou após a administração do IgG variante, em determinadas modalidades, o indivíduo é tratado sem cirurgia ou quimioterapia. Em outras modalidades, o tratamento com o IgG variante é uma monoterapia ou uma monoterapia para a duração do período de tratamento do IgG variante, conforme avaliado pelo médico ou descrito no presente documento.

[060] Em outras modalidades, o tratamento com o IgG variante está em combinação com uma terapia anti-câncer adicional, incluindo, mas não se limitando a, cirurgia, terapia de radiação, quimioterapia, terapia de diferenciação, bioterapia, imunoterapia, um inibidor de angiogênese e um composto anti-proliferativo. O tratamento com o IgG variante também pode incluir qualquer combinação dos tipos acima de regimes terapêuticos. Em determinadas modalidades, agentes citotóxicos, anti-angiogênicos e anti- proliferativos podem ser usados em combinação com o IgG variante. Em uma modalidade, a terapia anti-câncer é quimioterapia. Em determinadas modalidades, o agente quimioterápico e o IgG variante são administrados concomitantemente.

[061] Em determinadas modalidades, os métodos da invenção apresentam vantagens no tratamento e prevenção de tumores de estágio primário, evitando assim a progressão aos estágios mais avançados resultando em uma redução na morbidade e mortalidade associadas ao câncer avançado. O método da invenção também apresenta vantagens na prevenção da recorrência de um tumor ou do recrescimento de um tumor, por exemplo, a tumor dormente que persiste após remoção do tumor primário, ou na redução ou prevenção da ocorrência ou proliferação de micrometástase.

[062] Para os métodos da invenção, o câncer pode ser um tumor sólido, por exemplo, como, câncer de mama, câncer colorretal, câncer retal, câncer de pulmão, câncer de célula renal, um glioma (por exemplo, astrocitoma anaplásico, oligoastrocitoma anaplásico, oligodendroglioma anaplásico, glioblastoma multiforme), câncer de rins, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer pancreático, sarcoma de tecido macio, carcinoma carcinóide, câncer de cabeça e pescoço, melanoma e câncer do ovário.

[063] Os métodos da invenção também podem incluir monitoramento do indivíduo para recorrência do câncer ou tumor.

[064] Outros recursos e vantagens da invenção se tornarão evidentes a partir da seguinte Descrição Detalhada, dos desenhos e das reivindicações.

[065] Qualquer modalidade descrita no presente documento ou qualquer combinação disto se aplica a qualquer e todos IgG variantes e métodos da invenção descritos no presente documento.

[066] Figura 1: Painéis A-B: Ligação de variantes de anti-VEGF de tipo selvagem (WT) e de anti-VEGF em relação ao FcRn humano em pH 6,0. Foram realizadas duas operações experimentais separadas com níveis diferentes de FcRn acoplado nos chips. Para cada operação, uma unidade de resposta de estado estacionário é plotada como uma função de concentrações variantes para estimar as constantes de dissociação.

[067] Tabela A: As constantes de dissociação dos variantes de anti-VEGF de tipo selvagem (WT) e anti-VEGF contra FcRn humano em pH 6,0. KD foi estimado a partir de duas operações diferentes mostradas na Figura 1.

[068] Figura 3: Ligação de variantes de anti-VEGF de tipo selvagem (WT) e anti-VEGF em relação ao FcRn humano em pH 7,4. A unidade de resposta de estado estacionário é plotada como uma função de concentrações variantes de anti-VEG.

[069] Figura 4: Painéis A-D: Ligação de variantes de anti-VEGF de tipo selvagem e anti-VEGF em relação ao (A) FcRn humano em pH 6,0, (B) FcRn humano em pH 7,4, (C) FcRn de cino em pH 6,0 e (D) FcRn de cino em pH 7,4.

[070] Tabela B: Parâmetros cinéticos e constantes de dissociação monovalente (KD) de vários variantes de anti-VEGF contra FcRn humano em pH 6,0 e 25oC. Os resultados são representativos de três experimentos independentes.

[071] Tabela C: Parâmetros cinéticos e constantes de dissociação monovalente (KD) de vários variantes de anti-VEGF contra FcRn de cino em pH 6,0 e 25oC. Os resultados são representativos de três experimentos independentes.

[072] Figura 7: Painéis A-B: A taxa de dissociação (koff) de (A) FcRn humano e (B) FcRn de cino contra diferentes variantes de anti-VEGF em diferentes pHs.

[073] Tabela D: Sumário da melhora da afinidade do FcRn humano dos variantes de anti-VEGF sobre anti-VEGF de tipo selvagem. Os dados são sumarizados a partir das Figuras 4 e 5.

[074] Figura 9: Painéis A-B: A ligação de VEGF de (1) variantes de anti-VEGF de tipo selvagem e de anti-VEGF (2) N434H, (3) T307Q/N434A, (4) T307Q/N434S, (5) T307Q/E380A/N434S e (6) V308P/N434A. (A) A ligação de VEGF dos anticorpos determinada através da injeção de variantes anti-VEGF de tipo selvagem e de anti-VEGF sobre um chip de sensor revestido de VEGF- A109 a 37oC com o uso de BIAcore® 3000. (B) Sensorgramas para as injeções de 50 nM e 100 nM. Cada referência de sensorgrama foi deslocada por 4RU para melhor visualização.

[075] Figura 10: A inibição de proliferação de HUVEC in-vitro de AVASTIN®, variantes de anti-VEGF de tipo selvagem (bevacizumab) e variantes de anti-VEGF. As células endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVEC) foram cultivadas na presença de VEGF e várias concentrações de anticorpos anti-VEGF. A viabilidade após 4 dias de cultivo foi estimada.

[076] Figura 11: Perfis farmacocinéticos do anti-VEGF de tipo selvagem e cinco variantes de anti-VEGF em macacos cinomolgos seguinte a um única dose de IV de 5 mg/kg. As concentrações de soro dos anticorpos foram medidas através de ELISA. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão (n= 12 animais/grupo exceto pelo grupo V308P/N434A que tem 11 animais).

[077] Tabela E: Parâmetros farmacocinéticos para o variante de anti-VEGF de tipo selvagem e cinco variantes de anti-VEGF seguinte a uma única dose de IV de 5 mg/kg em relação aos macacos cinomolgos.

[078] Figura 13: O gráfico mostra a relação entre meia-vida terminal em macacos cinomolgos e a afinidade de FcRn de pH 6,0 para o anti- VEGF de tipo selvagem e cinco variantes de anti-VEGF. As barras de erro representam desvios padrão de 11 ou 12 animais por grupo.

[079] Figura 14: Painéis A-B: Perfis farmacocinéticos do anti- VEGF de tipo selvagem e do variante anti-VEGF T307Q/N434A em camundongos transgênicos de VEGF humanizado seguinte a única dose de IV de 0,3 ou 5 mg/kg. As concentrações do soro dos anticorpos foram medidas ou com o uso de (A) ELISA de captura de VEGF ou (B) ELISA de captura de Fc humano. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão.

[080] Tabela F: Parâmetros farmacocinéticos para o anti-VEGF de tipo selvagem e o variante de anti-VEGF T307Q/N434A seguinte a uma única dose intravenosa de 0,3 ou 5 mg/kg para camundongos transgênicos de VEGF humanizado.

[081] Figura 16: Painéis A-B: Perfis farmacocinéticos de variante de anti-VEGF T307Q/N434A em camundongos transgênicos de VEGF humanizado seguinte a uma multidose de 0,3 ou 5 mg/kg. O anticorpo foi administrado no dia 0, 3, 6, e 9. As concentrações de soro dos anticorpos foram medidas ou com o uso de (A) ELISA de captura de VEGF ou (B) ELISA de captura de Fc humano. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão.

[082] Tabela G: Parâmetros farmacocinéticos para o T307Q/N434A seguinte a quatro doses intravenosas de 0,3 ou 5 mg/kg no dia 0, 3, 6, e para camundongos transgênicos de VEGF humanizado.

[083] Figura 18: Painéis A-C: Eficácia de variante de anti-VEGF de tipo selvagem e T307Q/N434A (QA) no tratamento de xenoenxertos de HM-7 implantados de modo subcutâneo em RAG2 KO; camundongos duplamente homozigotos KI VEGF hum-X. 5mg/kg e 0,5mg/kg de variante tipo selvagem e T307Q/N434A e 5mg/kg de controle anti-ragweed foram administrados de modo intraperitoneal duas vezes por semana. (A) As curvas de crescimento. Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (B) As curvas de crescimento de tumores de HM-7 para grupos de tratamento de 0,5 e 0,05mg/kg. (C) As concentrações de anti-VEGF de anticorpo de soro no final do tratamento (dia 18 para anti-ragweed e dia 21 para os grupos de tratamento de anti-VEGF). As concentrações foram medidas com o uso de ELISA de captura de VEGF. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão.

[084] Figura 19: Painéis A-E: Um estudo de eficácia de repetição de variante de anti-VEGF de tipo selvagem e T307Q/N434A (QA) no tratamento de xenoenxertos de HM-7 implantados de modo subcutâneo em RAG2 KO; camundongos duplamente homozigotos KI VEGF hum-X. 5, 0,5 e 0,05mg/kg de variante de tipo selvagem e T307Q/N434A e 5mg/kg de controle anti-ragweed foram administrados de modo intraperitoneal duas vezes por semana. (A) As curvas de crescimento de tumores de HM-7. Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (B) As curvas de crescimento de tumores de HM-7 para grupos de tratamento de 0,5 e 0,05mg/kg. Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (C) Os pesos terminais de tumores de HM-7 determinados no final do tratamento (dia 16 para anti-ragweed, dia 19 para grupo de 0,05mg/kg e dia 22 dos grupos remanescentes). Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (D) As concentrações de anti-VEGF de anticorpo de soro no final do tratamento. As concentrações foram medidas com o uso de ELISA de captura de Fc humano. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão. (E) A razão de concentração de anticorpo em tumores para aquele no sangue. As concentrações de anticorpo de tumor foram determinadas ao medir a quantidade total de lisados de tumor e a quantidade de anticorpo anti- VEGF nos lisados de tumor. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão.

[085] Figura 20: Painéis A-D: O terceiro estudo de eficácia de variante de anti-VEGF de tipo selvagem e T307Q/N434A (QA) no tratamento de xenoenxertos de HM-7 implantados de modo subcutâneo em RAG2 KO; camundongos duplamente homozigotos KI VEGF hum-X. 5, 0,5 e 0,05mg/kg de de tipo selvagem e T307Q/N434A e 5mg/kg de controle anti-ragweed foram administrados de modo intraperitoneal duas vezes por semana. (A) Volume médio de tumor para cada grupo no final do tratamento (dia 22). Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (B) Os pesos terminais de tumores de HM-7. Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (C) As concentrações de anti-VEGF de anticorpo de soro no final do tratamento. As concentrações foram medidas com o uso de ELISA de captura de Fc anti- humano. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão. (D) A razão de concentração de anticorpo em tumores para aquele no sangue. As concentrações de anticorpo de tumor foram determinadas ao medir a quantidade total de lisados de tumor e a quantidade de anticorpo anti-VEGF nos lisados de tumor. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão.

[086] Figura 21: Painéis A-D: A eficácia de variante de anti-VEGF de tipo selvagem e T307Q/N434A (QA) no tratamento de xenoenxertos de HT- 55 implantados de modo subcutâneo em RAG2 KO; camundongos duplamente homozigotos KI VEGF hum-X. 5, 0,5 e 0,05mg/kg de tipo selvagem e T307Q/N434A e 5mg/kg de controle anti-ragweed foram administrados de modo intraperitoneal duas vezes por semana. (A) As curvas de crescimento de tumores de HT-55. Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (B) Os pesos terminais de tumores de HT-55 determinados no final do tratamento (dia 35). Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (C) As concentrações de anti-VEGF de anticorpo de soro no final do tratamento. As concentrações foram medidas com o uso de ELISA de captura de Fc humano. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão. (D) A razão de concentração de anticorpo em tumores para aquele no sangue. As concentrações de anticorpo de tumor foram determinadas ao medir a quantidade total de lisados de tumor e a quantidade de anticorpo anti-VEGF nos lisados de tumor. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão.

[087] Figura 22: Painéis A-E: A eficácia de variante de anti-VEGF de tipo selvagem e T307Q/N434A (QA) no tratamento de xenoenxertos de Colo- 205 implantados de modo subcutâneo em RAG2 KO; camundongos duplamente homozigotos KI VEGF hum-X. 5, 0,5 e 0,05mg/kg de tipo selvagem e T307Q/N434A e 5mg/kg de controle anti-ragweed foram administrados de modo intraperitoneal duas vezes por semana. (A) As curvas de crescimento tumores de Colo-205. Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (B) As curvas de crescimento tumores de Colo-205 em grupos de tratamento de 0,5 e 0,05mg/kg. (C) Os pesos terminais de tumores de Colo-205 determinados no final do tratamento (dia 38). Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (D) As concentrações de anti-VEGF de anticorpo de soro no final do tratamento. As concentrações foram medidas com o uso de ELISA de captura de Fc humano. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão. (E) A razão de concentração de anticorpo em tumores para aquele no sangue. As concentrações de anticorpo de tumor foram determinadas ao medir a quantidade total de lisados de tumor e a quantidade de anticorpo anti-VEGF nos lisados de tumor. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão.

[088] Figura 23: Painéis A-D: Um estudo de eficácia de repetição de variante de anti-VEGF de tipo selvagem e T307Q/N434A (QA) no tratamento de xenoenxertos de Colo-205. 5, 0,5 e 0,05mg/kg de tipo selvagem e T307Q/N434A e 5mg/kg de controle anti-ragweed foram administrados de modo intraperitoneal duas vezes por semana. (A) As curvas de crescimento tumores de Colo-205. Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (B) As curvas de crescimento tumores de Colo-205 em grupos de tratamento de 0,5 e 0,05mg/kg . (C) Os pesos terminais de tumores de Colo-205 determinados no final do tratamento (dia 32). Os dados são representados como o meio ± padrão de erro. (D) As concentrações de anti-VEGF de anticorpo de soro no final do tratamento. As concentrações foram medidas com o uso de ELISA de captura de Fc humano. Os dados são representados como o meio ± desvio padrão.

[089] Tabela H: As constantes de dissociação monovalente (KD) de variante de Fc de IgG1 anti-HER2 (traztuzumab) para FcRn humano em pH 6,0 e 25oC com o uso de BIAcore. Os resultados são representativos de dois experimentos independentes.

[090] Figura 25: Os níveis de expressão de FcRn em linhagens de célula de tumor humano diferentes. Cinco milhões de células de cada linhagem de célula foram usadas para o experimento. As células Raji (linfoma de célula B humano) foram usadas como um controle negativo, enquanto proteína de FcRn humano solúvel, que está faltando as regiões citoplasméticas e transmembrana de 7kDa, foram manchados como um controle positivo. As diluições de proteína de FcRn solúvel foram usadas como padrão para quantificar o nível de expressão de FcRn. Os resultados mostrados são representativos de ao menos três experimentos independentes.

[091] Figura 26: A ligação dependente de pH de variantes de Fc de IgG1 de anti-HER2 (traztuzumab) em FcRn humano. Os variantes foram construídos com mutações em L251, L314, e E430. A ligação foi medida em pH que se situa na faixa de 6 a 7,2 com o uso de BIAcore a 25oC. As razões de afinidade dos variantes em relação ao IgG1 anti-HER2 de tipo selvagem foram determinadas e plotadas como uma função de pH.

[092] Figura 27: Painéis A-C: Ligação de IgG1 anti-HER2 (traztuzumab) de tipo selvagem, variante T307Q/N434A, variante L251D/T307Q/N434H e variante L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I contra FcRn humano em (A) pH 6,0, (B) pH 7,1, e (C) pH 7,4. A ligação foi medida com o uso de BIAcore a 25oC. Não houve ligação detectável de variante L251D/T307Q/N434H ao FcRn humano em pH 7,4 na Figura 27C.

[093] Figura 28: A taxa de dissociação (koff) de FcRn humano contra vários variantes de anti-VEGF e anti-HER2 em diferentes pHs. Os variantes de anti-VEGF são T307Q/N434A, T307Q/N434S. T307Q/E380A/N434S e V308P/N434A. O variante de anti-HER2 é L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I. Os valores koff values em diferentes pHs foram ajustados contra o pH para cada variante para render a inclinação da linha de melhor ajuste (equação: log(koff) = inclinação x pH +y-intercepto).

DESCRIÇÃO DETALHADAS DA INVENÇÃO

[094] A presente invenção refere-se a novos variantes de domínios Fc, incluindo aqueles encontrados em anticorpos, fusões de Fc e imunoadesinas, que têm uma meia-vida in vivo aumentada. Estes variantes compreendem uma região de Fc de IgG humana, ou fragmento disto que aglutina a um FcRn, que contém uma ou mais modificações de aminoácido em relação a uma região de Fc de IgG humana de tipo selvagem cujas modificações aumentam a afinidade da região de Fc de IgG, ou fragmento disto, para o FcRn.

[095] As técnicas e procedimentos descritos ou referenciados no presente documento são, de modo geral, compreendidas e empregadas comumente com o uso de metodologia convencional pelo versado na na técnica, como, por exemplo, as metodologias amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames e G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, AND ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell e Tissue Culture (J. P. Mather e P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell e Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, e D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley e Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller e M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway e P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow e D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); e Cancer: Principles e Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

[096] A menos que definido de outra forma, os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado conforme comumente compreendido pelo elemento versado na técnica a qual esta invenção pertence. Singleton et al., Dictionary of Microbiology e Molecular Biology 2a ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), e March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms e Structure 4a ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992), fornece a um versado na técnica um guia geral dos muitos termos utilizados no presente relatório descritivo. Todas as referências citadas no presente documento, incluindo publicações e pedidos de patente, estão incorporadas a título de referência em sua totalidade.

DEFINIÇÕES

[097] Para propósitos de interpretação deste relatório descritivo, as seguintes definições irão aplicar e, sempre que apropriado, os termos usados no singular também irão incluir o plural e vice versa. Compreende-se que a terminologia usada no presente documento serve ao propósito de descrever as modalidades particulares apenas e não se destina a ser um fator limitador. No caso de qualquer definição apresentada abaixo entrar em conflito com qualquer documento incorporado ao presente documento a título de referência, a definição apresentada deverá prevalecer.

[098] Ao longo do presente relatório descritivo e das reivindicações, a numeração dos resíduos em uma cadeia pesada de imunoglobulina é aquela do índice EU como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), expressamente incorporado a título de referência. O “índice EU conforme em Kabat” se refere à numeração de resíduo do anticorpo EU de IgG1 humano.

[099] O termo "meia-vida in vivo" ou “a meia-vida do anticorpo in vivo” para uso no presente documento se refere a uma meia-vida biológica de um tipo particular de molécula de IgG ou seus fragmentos que contêm sítios de ligação de FcRn na circulação de um dado animal e é representado pelo tempo exigido para a concentração de circulação de uma molécula para diminuir em 50%. Em determinadas modalidades, quando a concentração de um dado IgG é plotada como uma função de tempo, a curva é usualmente bifásica com uma fase α rápida que representa um equilíbrio das moléculas de IgG injetadas entre o espaço intra- e extra-vascular e uma fase β mais longa que representa a eliminação das moléculas de IgG do espaço intravascular. Em determinadas modalidades, o termo "meia-vida in vivo" corresponde à meia-vida da moléculas de IgG na fase β. Em determinadas modalidades, a concentração em relação à curva de tempo de um dado IgG é trifásica, com distribuição correspondente em uma fase α e uma fase β, e a eliminação terminal representada por uma fase Y. Portanto, em determinadas modalidades, meia-vida in vivo corresponde à meia- vida da fase de eliminação terminal, ou a fase y. Em determinadas modalidades, a concentração em relação à curva de tempo de um dado IgG é monofásica, com uma única fase de eliminação. Portanto, em determinadas modalidades, meia- vida in vivo corresponde à meia-vida da única fase de eliminação.

[100] Por “polipeptídeo parental” ou “polipeptídeo de tipo selvagem” para uso no presente documento entende-se um polipeptídeo não modificado, um polipeptídeo de ocorrência natural ou uma versão modificada por engenharia de um polipeptídeo de ocorrência natural que é desprovido de uma ou mais modificações de aminoácido de região de Fc apresentadas no presente documento e que difere em função efetora comparada ao variante de IgG conforme apresentado no presente documento. O polipeptídeo parental pode compreender uma região de Fc de sequência nativa ou uma região de Fc com modificações de sequência de aminoácido pré-existentes (como adições, deleções e/ou substituições). O polipeptídeo parental também pode compreender aminoácidos não-naturais conforme descrito abaixo. O polipeptídeo parental pode ser referir ao próprio polipeptídeo, composições que compreendem o polipeptídeo parental ou à sequência de aminoácido que codifica isto. O polipeptídeo parental inclui, sem limitação, imunoglobulina parental, imunoglobulina de tipo selvagem, anticorpo parental e anticorpo de tipo selvagem.

[101] Consequentemente, por “imunoglobulina parental,” “IgG parental,” “imunoglobulina de tipo selvagem” ou “IgG de tipo selvagem” para uso no presente documento entende-se uma imunoglobulina não modificada, uma imunoglobulina de ocorrência natural ou uma versão modificada por engenharia de uma imunoglobulina de ocorrência natural que é desprovida de uma ou mais modificações de aminoácido de região de Fc apresentadas no presente documento e que difere em função efetora comparada ao IgG variante conforme apresentado no presente documento. A imunoglobulina parental pode compreender uma região de Fc de sequência nativa ou uma região de Fc com modificações de sequência de aminoácido pré-existentes (como adições, deleções e/ou substituições). A imunoglobulina parental também pode compreender aminoácidos não-naturais conforme descrito abaixo. A imunoglobulina parental pode se referir à própria imunoglobulina, composições que compreendem a imunoglobulina parental ou à sequência de aminoácido que codifica isto.

[102] Por “anticorpo parental” ou “anticorpo de tipo selvagem” para uso no presente documento entende-se um anticorpo não modificado, um anticorpo de ocorrência natural ou uma versão modificada por engenharia de um anticorpo de ocorrência natural que é desprovida de uma ou mais modificações de aminoácido de região de Fc apresentadas no presente documento e que difere em função efetora comparado ao IgG variante conforme apresentado no presente documento. O anticorpo parental pode compreender uma região de Fc de sequência nativa ou uma região de Fc com modificações de sequência de aminoácido pré-existente (como adições, deleções e/ou substituições). O anticorpo parental também pode compreender aminoácidos não-naturais conforme descrito abaixo. O anticorpo parental pode se referir ao próprio anticorpo, composições que compreendem o anticorpo parental ou à sequência de aminoácido que codifica isto.

[103] Em determinadas modalidades, “IgG parental,” “anticorpo parental,” “IgG de tipo selvagem” ou “anticorpo de tipo selvagem” inclui, mas não se limita a, anticorpos produzidos de maneira recombinante comercialmente conhecidos conforme descrito no presente documento. Em determinadas modalidades, o IgG de tipo selvagem é um IgG que tem uma região de Fc de tipo selvagem de IgG humana. Em determinadas modalidades, a região de Fc de tipo selvagem de IgG humana se refere à região de Fc que é desprovida de uma ou mais modificações de aminoácido de região de Fc apresentado no presente documento. Em determinadas modalidades, a região de Fc de tipo selvagem de IgG humana se refere à região de Fc com uma ou mais modificações de aminoácido de região de Fc não apresentado no presente documento. Em determinadas modalidades, o IgG de tipo selvagem é bevacizumab. Em determinada modalidade, o anticorpo de tipo selvagem é um fragmento de anticorpo que não contém uma região de Fc. Em determinadas modalidades, o IgG variante de tal anticorpo de tipo selvagem é uma proteína de fusão de Fc que compreende fragmentos de domínio Fab do anticorpo de tipo selvagem, ou o domínio ou domínios de uma proteína de não-anticorpo e um fragmento de domínio de Fc que compreende uma ou mais modificações de região de Fc apresentadas no presente documento. Em determinadas modalidades, a região de Fc de tipo selvagem de IgG humana se refere a uma região de Fc de IgG com mutação de Fc L251D ou L251D/434H, mas não tem outras modificações de aminoácido de região de Fc apresentadas no presente documento.

[104] Por “variante”, “proteína variante” ou “variante de proteína” para uso no presente documento entende-se uma proteína que difere daquela de uma proteína parental em virtude de ao menos uma modificação de aminoácido. O variante de proteína pode ser referir a própria proteína, uma composição que compreende a proteína ou à aminosequência que codifica isto. Em determinadas modalidades, o variante de proteína tem ao menos uma modificação de aminoácido comparado ao polipeptídeo parental, por exemplo de cerca de uma a cerca de dez modificações de aminoácido. Em determinadas modalidades, o variante de proteína tem ao menos duas modificações de aminoácido na região de Fc de IgG. Em determinadas modalidades, o variante de proteína tem ao menos três modificações de aminoácido na região de Fc de IgG. A sequência de variante de proteína no presente documento possuirá, de preferência, ao menos cerca de 80% de homologia com uma sequência de proteína parental e mais preferencialmente ao menos cerca de 90% de homologia, mais preferencialmente ao menos cerca de 95% de homologia. Os variantes de proteína também podem compreender aminoácidos não-naturais, conforme definido abaixo. O termo “variante de proteína” inclui variante de imunoglobulina e variante de anticorpo conforme descrito no presente documento.

[105] O termo “variante de imunoglobulina”, “imunoglobulina variante”, “IgG variante” ou "variante de lgG" para uso no presente documento entende-se uma sequência de imunoglobulina que difere daquela de uma sequência de imunoglobulina de tipo selvagem ou parental em virtude de ao menos uma modificação de aminoácido. Em determinadas modalidades, IgG variante tem ao menos duas modificações de aminoácido na região de Fc em relação ao IgG de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, IgG variante tem ao menos três modificações de aminoácido na região de Fc em relação ao IgG de tipo selvagem. Em determinadas modalidades, IgG variante é um anticorpo variante. Em determinadas modalidades, o IgG variante é um anticorpo anti-VEGF. Em uma modalidade, o IgG variante é um variante de bevacizumab que compreende uma ou mais modificação de aminoácido na região de Fc do anticorpo.

[106] Por "variante de anticorpo" ou "anticorpo variante" para uso no presente documento entende-se um anticorpo que difere de um anticorpo parental em virtude de ao menos uma modificação de aminoácido. Em determinadas modalidades, o anticorpo variante tem uma ou mais modificações de aminoácido na região de Fc em relação ao anticorpo de tipo selvagem.

[107] Por “posição” para uso no presente documento entende-se um local na sequência de uma proteína. As posições podem ser sequencialmente numeradas, ou de acordo com um formato estabelecido, por exemplo, o índice EU conforme em Kabat.

[108] O termo “polipeptídeo que contém região de Fc” ou “polipeptídeo de Fc” se refere a um polipeptídeo que compreende toda ou parte de uma região de Fc. Por exemplo, os polipeptídeos de Fc incluem anticorpos, fusões de Fc, Fcs isolados e fragmentos de Fc.

[109] O termo “anticorpo que contém região de Fc” se refere a um anticorpo que compreende uma região de Fc. A lisina de C terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região de Fc pode ser removida, por exemplo, durante purificação do anticorpo ou através de modificação por engenharia recombinante do ácido nucléico que codifica o anticorpo. Consequentemente, uma composição que compreende um anticorpo que tem uma região de Fc pode compreender um anticorpo com K447, com todo K447 removido ou uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447.

[110] Uma “modificação de aminoácido” refere-se a uma mudança na sequência de aminoácido de uma sequência de aminoácido predeterminada. As modificações exemplificares incluem uma substituição de aminoácido, inserção e/ou deleção. Em determinadas modalidades, a modificação de aminoácido é uma substituição.

[111] Uma “modificação de aminoácido em” uma posição especificada, por exemplo, da região de Fc, refere-se à substituição ou deleção do resíduo especificado, ou à inserção de ao menos um resíduo de aminoácido adjacente ao resíduo especificado. Por inserção “adjacente” a um resíduo especificado entende-se inserção em um ou dois resíduos do mesmo. A inserção pode ser N terminal ou C terminal no resíduo especificado.

[112] Uma “substituição de aminoácido” refere-se à substituição de ao menos um resíduo de aminoácido existente em uma sequência de aminoácido predeterminada com outro resíduo de aminoácido de “substituição”. O resíduo ou resíduos de substituição pode ser “resíduo de aminoácidos de ocorrência natural” (isto é, codificado pelo código genético) e selecionado do grupo que consiste em: alanina (Ala); arginina (Arg); asparagina (Asn); ácido aspártico (Asp); cisteína (Cys); glutamina (Gln); ácido glutâmico (Glu); glicina (Gly); histidina (His); isoleucina (Ile): leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofan (Trp); tirosina (Tyr); e valina (Val). Em determinadas modalidades, o resíduo de substituição não é cisteína. A substituição com um ou mais resíduo de aminoácidos de ocorrência não-natural também está abrangida pela definição de uma substituição de aminoácido no presente documento.

[113] Um “resíduo de aminoácidos de ocorrência não-natural” refere-se a um resíduo, excetos aqueles resíduos de aminoácido de ocorrência natural listados acima, que é capaz de aglutinar adjacente ao(s) resíduo(s) de aminoácidos em uma cadeia de polipeptídeo. Os exemplos de resíduo de aminoácidos de ocorrência não-natural incluem norleucina, ornitina, norvalina, homoserina e outros análogos de resíduo de aminoácido como aqueles descritos em Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301 a 336 (1991); Patente U.S. n° 6.586.207; WO 98/48032; WO 03/073238; pedido de publicação U.S N° 2004-0214988A1; WO 05135727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026 a 9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135 a 1137; e J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99:11020 a 11024, todos incorporados ao presente documento a título de referência em sua totalidade.

[114] Um “aminoácido inserção” refere-se à incorporação de ao menos em aminoácido a uma sequência de aminoácido predeterminada. Enquanto a inserção consistirá, usualmente, na inserção de um ou dois resíduos de aminoácido, o presente relatório contempla larger “inserções de peptídeo” maiores, por exemplo, inserção de cerca de três a cerca de cinco ou até cerca de dez resíduos de aminoácido. O(s) resíduo(s) inserido(s) pode ser de ocorrência natural ou de ocorrência não natural conforme apresentado acima.

[115] Uma “deleção de aminoácido” refere-se à remoção de ao menos um resíduo de aminoácido de uma sequência de aminoácido predeterminada.

[116] Em determinadas modalidades, o termo “aumento”, “meia- vida aumentada” ou “meia-vida in vivo aumentada” se refere a um aumento geral de ao menos cerca de 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 150%, 200%, 300% ou maior, na meia-vida in vivo de um IgG variante da invenção detectado através de métodos da técnica padrão conhecidos como aqueles descritos no presente documento, quando comparado a um IgG de tipo selvagem ou um IgG que tem a região de Fc de tipo selvagem de IgG humana. Em determinadas modalidades, o termo aumento se refere à meia-vida in vivo aumentada do IgG variante, sendo que o aumento é de ao menos cerca de 1,25X, 1,5X, 1,75X, 2X, 3X, 4X, 5X ou 10X ou maior quando comparado a um IgG de tipo selvagem ou um IgG que tem a região de Fc de tipo selvagem de IgG humana. Em determinadas modalidades, o IgG de tipo selvagem ou o IgG que tem a região de Fc de tipo selvagem de IgG humana é bevacizumab. Em determinadas modalidades, a meia-vida média de bevacizumab é de cerca de 10 a 12 dias conforme medido em macacos cinomolgos, ou de cerca de 20 dias conforme medido em seres humanos.

[117] “Região da dobradiça” é geralmente definida como estiramento de Glu216 a Pro230 de IgG1 humano (Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)). As regiões de dobradiça de outros isótopos de IgG podem estar alinhadas à sequência de IgG1 ao colocar o primeiro e o último resíduos que formam ligações S--S de cadeia inter-pesada nas mesmas posições.

[118] A “região de dobradiça inferior” de uma região de Fc é normalmente definida como o estiramento de resíduos imediatamente de C terminal até a região de dobradiça, isto é, resíduos 233 a 239 da região de Fc. Antes da presente invenção, a ligação de FCYR foi geralemte atribuída ao resíduo de aminoácidos na região de dobradiça inferior de uma região de Fc de IgG.

[119] “C1q” é um polipeptídeo que inclui um sítio de ligação para a região de Fc de uma imunoglobulina. C1q junto com duas proteases de serina, C1r e C1s, forma o complexo C1, o primeiro componente da trajetória de citotoxidade dependente de complemento (CDC). C1q humano pode ser comercialmente adquirido junto a, por exemplo, Quidel, San Diego, Califórnia, EUA.

[120] O termo “domínio de ligação” refere-se à região de um polipeptídeo que aglutina a outra molécula. No caso de um FcR, o domínio de ligação pode compreender uma porção de uma cadeia de polipeptídeo disto (por exemplo, a cadeia α disto) que é responsável pela ligação de uma região de Fc. Um domínio de ligação útil é um domínio extracelular de uma cadeia α de FcR.

[121] O termo "anticorpo" usado no presente documento no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos desde que os mesmos exibam a atividade biológica desejada.

[122] Um anticorpo “isolado” é um que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam na pesquisa, diagnóstico ou uso terapêutico do anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceo ou não proteináceo. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado (1) para valores superiores a 95% em peso de anticorpo conforme determinado por, por exemplo, o método Lowry e, em algumas modalidades, para valores maiores de 99% em peso; (2) até um grau suficiente para obter ao menos 15 resíduos de sequência de aminoácido N terminal ou interna através do uso de, por exemplo, a sequenciador de copo giratório, ou (3) até homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições de redução ou de não-redução com o uso de, por exemplo, manchamento de prata ou azul de Coomassie. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ nas células recombinantes já que ao menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Ordinariamente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por ao menos uma etapa de purificação.

[123] Os "anticorpos nativos" são usualmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150,000 daltons, compostos de duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada através de uma ligação bissulfeto covalente, enquanto o número de ligações bissulfeto varia dentre as cadeias pesadas de diferentes isótopos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e cada cadeia leve também têm pontes bissulfeto de intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem, em uma extremidade, um domínio variável (VH) seguido por um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve está alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve está alinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que os resíduos de aminoácido particulares formam uma interface entre a cadeia leve e o domínio variável de cadeias pesadas.

[124] O termo "domínio constante" refere-se à porção de uma molécula de imunoglobulina que tem uma sequência de aminoácido mais conservada em relação à outra porção da imunoglobulina, o domínio variável, que contém o sítio de ligação de antígeno. O domínio constante contém os domínios CH1, CH2 e CH3 da cadeia pesada e o domínio CHL da cadeia leve.

[125] A “região variável” ou “domínio variável” de um anticorpo se refere aos domínios amino-terminais da cadeia leve ou pesada do anticorpo. O domínio variável da cadeia pesada pode ser referido como “VH”. O domínio variável da cadeia leve pode ser referido como “VL”. Estes domínios são geralmente as partes mais variáveis de um anticorpo e contêm os sítios de ligação de antígeno.

[126] O termo “variável” refere-se ao fato de que certas porções dos domínios variáveis diferem extensivamente na sequência dentre os anticorpos e são usado na ligação e especificidade de cada anticorpo particular para seu antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é eventualmente distribuída ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Está concentrada em três segmentos denominados regiões hipervariáveis (HVRs) tanto nos domínios variáveis de cadeia leve quanto na cadeia pesada. As porções mais conservadas de domínios variáveis são denominadas as regiões de estrutura (FR). Os domínios variáveis de cadeias leves e pesadas nativas compreendem, cada um, quatro regiões de FR, que adotam amplamente uma configuração folha beta, conectadas através de três HVRs, que forma laços que conectam e, em alguns casos, formam parte da estrutura folha beta. Os HVRs em cada cadeia são mantidos juntamente em proximidade pelas regiões de FR e, com os HVRs de outras cadeias, contribuem para a formação da sítio de ligação de antígeno de anticorpos (vide Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, como participação do anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpo.

[127] As “cadeias leves” de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie vertebrada podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, denominados kappa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos de seus domínios constantes.

[128] O termo “isótopo” ou “subclasse” de IgG para uso no presente documento está relacionado a qualquer das subclasses de imunoglobulinas definidas pelas características químicas e de antígeno de suas regiões constantes.

[129] Dependendo da sequência de aminoácidos dos domínios constantes de suas cadeias pesadas, os anticorpos (imunoglobulinas) podem ser atribuídos a diferentes classes. Há cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e diversas dentre as mesmas podem ser, ainda, divididas em subclasses (isótopos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados α, δ, ε, y, e μ, respectivamente. As configurações tridimensionais e estruturas de subunidade de diferentes classes de imunoglobulinas são conhecidas e descritas geralmente em, por exemplo, Abbas et al. Cellular e Mol. Immunology, 4a ed. (W.B. Saunders, Co., 2000). Um anticorpo pode ser parte de uma molécula de fusão maior, formado através de associação covalente ou não-covalente do anticorpo a uma ou mais proteínas ou peptídeos.

[130] O termo “modificação de subclasse de IgG” para uso no presente documento está relacionado a uma modificação de aminoácido que converte um aminoácido de um isótopo de lgG no aminoácido correspondente em um isótopo de lgG alinhado diferente. Por exemplo, devido ao fato de que lgG1 compreende uma tirosina e lgG2, uma fenilalanina na posição EU 296, uma substituição de F296Y em IgG2 é considerada uma modificação de subclasse de IgG.

[131] Por “modificação de ocorrência não natural” para uso no presente documento entende-se uma modificação de aminoácido que não é isotópica. Por exemplo, devido ao fato de que nenhum dos IgGs compreende um ácido glutâmico na posição 332, a substituição na posição 332 com ácido glutâmico (332E) em IgG1, lgG2, IgG3, ou lgG4 é considerada uma modificação de ocorrência não natural.

[132] Os termos “anticorpo de comprimento inteiro”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são usados no presente documento de forma intercambiável para se referirem a um anticorpo em sua forma substancialmente intacta. Os termos se referem particularmente a um anticorpo com cadeias pesadas que contém uma região de Fc.

[133] Um “anticorpo nu” para os propósitos do presente documento é um anticorpo que não é conjugado a uma porção citotóxica ou radioidentificador.

[134] Os "fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, de preferência, que compreendem a região de ligação de antígeno disto. Em determinadas modalidades, os fragmentos de anticorpos compreendem uma região de Fc ou uma porção de região de Fc que compreende uma ou mais modificações de região de Fc apresentadas no presente documento. Os exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única; um anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo.

[135] A digestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação ao antígeno idênticos, denominados fragmentos “Fab”, cada um com um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento “Fc” residual, cujo nome reflete sua capacidade de cristalizar prontamente. O tratamento de pepsina rende um fragmento de F(ab’)2 qye tem dois sítios de combinação de antígeno e ainda é capaz de antígeno de reticulação.

[136] “Fv” é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de ligação de antígeno completo. Em uma modalidade, uma espécie de Fv de duas cadeias consiste em um dímero de domínio variável de uma cadeia pesada e uma cadeia leve em uma associação não-covalente apertada. Em uma espécie Fv (scFv) de cadeia única, o domínio variável de uma cadeia pesada e uma cadeia leve pode estar conectado de maneira covalente através de um ligante de peptídeo flexível de tal modo que as cadeias pesada e leve possam se associar em uma estrutura “dimérica” análoga a aquela em uma espécie Fv de duas cadeias. Está nesta configuração que os três HVRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, os seis HVRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou meio de um Fv que compreende apenas três HVRs específicos para um antígeno) tem a capacidade de reconhecer e aglutinar um antígeno, embora tenha afinidade inferior a todo sítio de ligação.

[137] O fragmento Fab contém os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve e também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab’ diferem dos fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos no terminal carbóxi da cadeia pesada CH1 domínio incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça de anticorpo. Fab’-SH é a designação para Fab’ na qual o(s) resíduo(s) de cisteína do domínios constantes toleram um grupo livre de tiol. Os fragmentos de anticorpo F(ab’)2 foram produzidos originalmente como pares de fragmentos Fab’ que têm cisteínas de dobradiças entre os mesmos. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo também são conhecidos.

[138] Os fragmentos de anticorpo “de Fv de cadeia única” ou “scFv” compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, sendo que estes domínios estão presentes em uma única cadeia de polipeptídeo. Geralmente, o polipeptídeo scFv compreende adicionalmente um ligante de polipeptídeo entre os domínios VH e VL que possibilita que o scFv forme a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão de scFv, vide, por exemplo, Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), páginas 269 a 315.

[139] O termo “diacorpos” refere-se aos fragmentos de anticorpo com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH-VL). Com o uso de um ligante que é muito curto para permitir emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a emparelhar com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Os diacorpos podem ser bivalentes ou biespecifícos. Os diacorpos são descritos de maneira mais completa em, por exemplo, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Os triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

[140] O termo "anticorpo monoclonal" para uso no presente documento refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto para mutações possíveis, por exemplo, mutações de ocorrência natural, que podem estar presentes em menores quantidades. Assim, o “monoclonal” modificador indica a natureza do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos discretos. Em determinadas modalidades, tal anticorpo monoclonal inclui tipicamente um anticorpo que compreende uma sequência de polipeptídeo que aglutina um alvo, sendo que a sequência de polipeptídeo de ligação ao alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma única sequência de polipeptídeo de ligação ao alvo de uma pluralidade de sequências de polipeptídeo. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um clone único de uma pluralidade de clones, como uma piscina de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinante. Deve-se compreender que a sequência de ligação ao alvo selecionada pode ser adicionalmente alterada, por exemplo, para aprimorar afinidade para o alvo, para humanizar a sequência de ligação ao alvo, para aprimorar a sua produção em cultura de célula, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo que compreende a sequência de ligação ao alvo alterada também é um anticorpo monoclonal desta invenção. Em contraste às preparações de anticorpo policlonal, que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionada contra um único determinante em um antígeno. Em adição as suas especificidades, as preparações de anticorpo monoclonal são vantajosas já que as mesmas não são contaminadas por outras imunoglobulinas.

[141] O modificador “monoclonal” indica a natureza do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como uma exigência de produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser feitos a partir de uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler e Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies e T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (vide, por exemplo, Patente U.S. n° 4.816.567), tecnologias de exibição de fago (vide, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004), e tecnologias para produção de anticorpos humano ou similar a humano em animais que têm partes ou todo o gene ou local de imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglobulina humana (vide, por exemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); Patente U.S. N° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; e 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

[142] Os anticorpos monoclonais no presente especificamente incluem anticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga as sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou que pertencem a uma classe ou subclasse de anticorpo particular, enquanto o remanescente da cadeia(s) é idêntico ou homólogo as sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou que pertencem a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, enquanto eles exibam a atividade biológica desejada (vide, por exemplo, A Patente N° U.S. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticorpos quiméricos incluem anticorpos PRIMATIZED® em que a região de ligação por antígeno do anticorpo é derivada de um anticorpo produzido por, por exemplo, macacos símios imunizados com o antígeno de interesse.

[143] Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Em uma modalidade, um anticorpo humanizado é uma imunoglobulina humana (anticorpo receptor) em que resíduos de um HVR do receptor são substituídos por resíduos de um HVR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que tenha a especificidade, afinidade e/ou capacidade desejada. Em algumas instâncias, resíduos de FR da imunoglobulina humana são substituídos correspondendo-se resíduos não humanos. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações podem ser feitas para adicionalmente refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todo o ao menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana, e todos ou substancialmente todos os FRs são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá ao menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide, por exemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Vide ademais, por exemplo, Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428433 (1994); e Patentes Nos U.S. 6.982.321 e 7.087.409.

[144] Um “anticorpo humano” é aquele que processa uma sequência de aminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou que foi feito com uso de qualquer técnica para fazer anticorpos humanos conforme revelado no presente. Esta definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação por antígeno não humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos com uso de várias técnicas conhecidas na área, que incluem bibliotecas exibidas por página. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Também disponíveis para preparação de anticorpos monoclonais humanos estão métodos descritos em Cole et al., Monoclonal Anticorpos e Câncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Vide também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados administrando-se o antígeno a um animal transgênico que tenha sido modificado para produzir tais anticorpos em resposta a um desafio antigênico, mas cujos loci endógenos foram desativados, por exemplo, ratos transgênicos imunizados (vide, por exemplo, Patentes Nos U.S. 6.075.181 e 6.150.584 que se referem à tecnologia XENOMOUSETM). Vide ademais, por exemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) que se referem a anticorpos humanos gerados por meio de uma tecnologia de hibridoma de célula B humana.

[145] Um “anticorpo dependente por espécie” é aquele que tem uma afinidade de ligação mais forte para um antígeno de uma primeira espécie de mamífero que este tem para um homólogo daquele antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente por espécie "se aglutina especificamente" a um antígeno humano (isto é, tem um valor de afinidade de ligação (Kd) de não mais que cerca de 1 x 10-7 M, preferencialmente não mais que cerca de 1 x 10-8 M e o mais preferenciam não mais que cerca de 1 x 10-9 M), mas tem uma afinidade de ligação para um homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero não humano que é de ao menos cerca de 50 vezes, ou ao menos cerca de 500 vezes, ou ao menos cerca de 1000 vezes, mais fraco que sua afinidade de ligação para o antígeno humano. O anticorpo dependente por espécie pode ser qualquer dos vários tipos de anticorpos conforme definido anteriormente, mas preferencialmente é um anticorpo humano ou humanizado.

[146] O termo “região hipervariável,” “HVR,” ou “HV,” quando usado no presente se refere às regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência e/ou laços de forma definida estruturalmente. Geralmente, anticorpos compreendem seis HVRs; três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Em anticorpos nativos, H3 e L3 exibem as mais diversificadas das seis HVRs, e H3 em particular acredita-se que desempenhe um papel único em conferir especificidade precisa aos anticorpos. Vide, por exemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson e Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003). De fato, naturalmente que ocorrem anticorpos de camelídeos, que consistem de uma cadeia pesada, que só são funcionais e estáveis na ausência de cadeia leve. Vide, por exemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

[147] Uma variedade de delineações de HVR está em uso e é abrangida no presente. As Regiões Determinantes de Complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade de sequência e são as mais comumente usadas (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia se refere no lugar da localização dos laços estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). As HVRs AbM representam um compromisso entre as HVRs de Kabat e os laços estruturais de Chothia, e são usados pelo software de modelagem de anticorpo da Oxford Molecular's. As HVRs de “contato” são baseadas em uma análise das estruturas de cristal complexas disponíveis . Os resíduos de cada uma dessas HVRs são percebidos a seguir.

[148] As HVRs podem compreender “HVRs estendidas” conforme segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 50-56 (L2) e 89-97 ou 89-96 (L3) na VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102, ou 95-102 (H3) na VH. Os resíduos de domínio variável são numerados de acordo com Kabat et al., supra, para cada uma dessas definições.

[149] Resíduos de "Moldura" ou "FR" são aqueles resíduos de domínio variável outros que não os resíduos de HVR conforme definidos no presente.

[150] O termo “numeração de resíduo de domínio variável conforme em Kabat” ou “numeração de posição de aminoácido conforme em Kabat,” e variações destes, se referem ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al., supra. Com uso deste sistema de numeração, a sequência de aminoácido linear atual pode conter poucos ou adicionais aminoácidos que correspondem a um encurtamento ou inserção em uma FR ou HVR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo de FR de cadeia pesada 82. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada por um dado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Kabat “padrão”.

[151] O sistema de numeração de Kabat é geralmente usado quando se refere a um resíduo no domínio variável (aproximadamente resíduos de 1 a 107 da cadeia leve e resíduos 1 a 113 da cadeia pesada) (por exemplo, Kabat et al., Sequências of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). O “sistema de numeração EU” ou “índice EU” é geralmente usado quando se refere a um resíduo em uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, o índice EU relatado em Kabat et al., supra). O “índice EU conforme em Kabat” se refere à numeração de resíduo do anticorpo IgG1 EU humano. A não ser que de outra forma determinado no presente, se refere ao número de resíduos no domínio variável de numeração de resíduo de meio de anticorpos pelo sistema de numeração de Kabat. A não ser que de outra forma determinado no presente, se refere ao número de resíduo no domínio constante de numeração de resíduo de meio de anticorpos pelo sistema de numeração EU (vide por exemplo, Publicação PCT N° WO2006073941).

[152] Um anticorpo de “afinidade maturada” é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais HVRs deste que resultam em um aperfeiçoamento na afinidade do anticorpo for antígeno, comparado a um anticorpo de origem que não possui aquela(s) alteração(ões). Em uma modalidade, um anticorpo de afinidade maturada tem afinidades nanomolares ou até picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos de afinidade maturada podem ser produzidos com uso de certos procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descreve maturação de afinidade por reorganização de domínio de VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de HVR e/ou moldura é descrita por, por exemplo, Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

[153] Um anticorpo de “bloqueio” ou um anticorpo “antagonista” é aquele que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno ao qual se aglutina. Certos anticorpos de boqueio ou anticorpos antagonistas substancialmente ou completamente inibem a atividade biológica do antígeno.

[154] Um “anticorpo agonista,” conforme usado no presente, é um anticorpo que parcialmente ou totalmente imita ao menos uma das atividades funcionais de um polipeptídeo de interesse.

[155] Anticorpos de “crescimento inibitório” são aqueles que impedem ou reduzem a proliferação de uma célula que expressa um antígeno ao qual o anticorpo se aglutina.

[156] As “funções efetoras” do anticorpo se referem aquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de sequência nativa ou uma região Fc variante de sequência de aminoácido) de um anticorpo, e variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras do anticorpo incluem: ligação de C1q e citotoxicidade dependente complemento (CDC); ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; regulação baixa de receptores de superfície de célula (por exemplo B célula receptor); e ativação de célula B.

[157] O termo “região Fc” no presente é usado para definir uma região de terminal C de uma cadeia pesada de imunoglobulina, que inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina heavy possam variar, a região de cadeia pesada de IgG humana Fc é normalmente definida para alongar a partir de um resíduo de aminoácido em posição Cys226, ou a partir de Pro230, para o término de carboxil deste. A lisina de terminal C (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a produção ou purificação do anticorpo, ou projetando-se de forma recombinante o ácido nucleico que codifica uma cadeia pesada do anticorpo. Da mesma forma, uma composição de anticorpos intactos pode compreender populações de anticorpo todos os resíduos K447 removidos, populações de anticorpo com nenhum resíduo K447 removido, e populações de anticorpo que têm uma mistura de anticorpos com e sem o resíduo K447. Em certas modalidades, a região Fc de uma imunoglobulina compreende dois domínios constantes, CH2 e CH3.

[158] O “domínio CH2” de uma região Fc de IgG humana (também referida como “domínio CY2”) normalmente se estende a partir de cerca do aminoácido 231 para cerca do aminoácido 340. O domínio CH2 é o único que não é pareado proximamente com outro domínio. Ao invés disso, duas cadeias de carboidrato ramificadas ligadas por N são interpostas entre dois domínios CH2 de uma molécula de IgG nativa intacta. Foi especulado que o carboidrato pode fornecer um substituto para o pareamento de domínio-domínio e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22:161-206 (1985).

[159] O “domínio CH3” compreende o alongamento de do terminal C de resíduos para um domínio CH2 na região Fc (isto é de cerca do resíduo de aminoácido 341 para cerca do resíduo de aminoácido 447 de uma IgG).

[160] Uma “região Fc funcional” possui uma “função efetora” de uma região Fc de sequência nativa. “Funções efetoras” exemplificativas incluem ligação de receptor Fc; ligação C1q; CDC; ADCC; fagocitose; regulação baixa de receptores de superfície de célula (por exemplo receptor de célula B; BCR), etc. Tais funções efetoras geralmente necessitam da região Fc para serem combinadas com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo) e podem ser avaliadas com uso de vários ensaios.

[161] Uma “região Fc de sequência nativa” compreende uma sequência aminoácido idêntica à sequência de aminoácido de uma região Fc revelada in nature. As regiões Fcs humanas de sequência nativa incluem uma região Fc de IgG1 humana de sequência nativa (alótipos A e não A); uma região Fc de IgG2 humana de sequência nativa; uma região Fc de IgG3 humana de sequência nativa; e uma região Fc de IgG4 humana de sequência nativa assim como naturalmente ocorrem variantes destas (vide por exemplo, SEQ ID N°:11 a SEQ ID N°:17).

[162] Uma “região Fc variante” compreende uma sequência de aminoácido que difere daquela de uma região Fc de sequência nativa em virtude de ao menos uma modificação de aminoácido. Em certas modalidades, a região Fc variante compreende uma sequência de aminoácido que se difere daquela de uma região Fc de sequência nativa por uma ou mais substituição de aminoácido. Em certas modalidades, a região Fc variante tem ao menos uma substituição de aminoácido comparadas com a região Fc de uma IgG do tipo selvagem ou um anticorpo do tipo selvagem. Em certas modalidades, a região Fc variante tem duas ou mais substituições de aminoácido na região Fc do anticorpo do tipo selvagem. Em certas modalidades, a região Fc variante tem três ou mais substituições de aminoácido da região Fc do anticorpo do tipo selvagem. Em certas modalidades, a região Fc variante tem ao menos uma, duas ou três ou mais substituições de aminoácido da região Fc descritas no presente. Em certas modalidades, a região Fc variante no presente possuirá ao menos cerca de 80% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo de origem. Em certas modalidades, a região Fc variante no presente possuirá ao menos cerca de 90% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo de origem. Em certas modalidades, a região Fc variante no presente possuirá ao menos cerca de 95% de homologia com uma região Fc de sequência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo de origem.

[163] "Receptor Fc” ou “FcR” descreve um receptor que se aglutina à região Fc de um anticorpo. Em algumas modalidades, um FcR é um FcR humano nativo. Em algumas modalidades, um FcR é aquele que aglutina um anticorpo de IgG (um receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, que incluem variantes alélicas e alternativamente formas entrançadas daqueles receptores. Os receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm sequências de aminoácido similares que diferem primariamente nos domínios citoplasmáticos destas. O receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação baseado em tirosina de imunoreceptor (ITAM) em seu domínio citoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição baseado em tirosina de imunoreceptor (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (vide, por exemplo, Daêron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Os FcRs são revisados, por exemplo, em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs, que incluem aqueles a serem identificados no futuro, são abrangidos pelo termo "FcR" no presente.

[164] O termo "receptor Fc" ou “FcR” também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) e regulação de homeostase de imunoglobulinas. Métodos de medição de ligação ao FcRn são conhecidos (vide, por exemplo, Ghetie e Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).

[165] A meia-vida in vivo ou soro de polipeptídios de ligação de alta afinidade de FcRn humano pode ser ensaiado, por exemplo, em camundongos transgênicos, em humanos, ou em primatas não humano aos quais os polipeptídios com uma região Fc variante são administrados. Vide também, por exemplo, Petkova et al. International Immunology 18(12):1759-1769 (2006).

[166] “Células efetoras humanas” são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras. Em certas modalidades, as células expressam ao menos o FcyRIII e realizam função(ões) efetora(s) de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células assassinas naturais (NK), monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, de sangue.

[167] “Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” ou “ADCC” se refere a uma forma de citotoxicidade em que Ig oculta aglutinada no receptor Fc s (FcRs) presente em certas células citotóxicas (por exemplo células NK, neutrófilos, e macrófagos) permitem que essas células efetoras citotóxicas se aglutinem especificamente a uma célula alvo de marcação por antígeno e subsequentemente mate a célula alvo com citotoxinas. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam FcyRIII somente, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas é sumarizada na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio de ADCC in vitro, tal como aquele descrito na Patente N° US 5.500.362 ou 5.821.337 ou a Patente N° U.S. 6.737.056 (Presta), pode ser realizado. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células PBMC e NK. Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em uma modelo animal tal como aquele revelado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

[168] A “citotoxicidade dependente de complemento” ou “CDC” se refere à lise de uma célula alvo na presença de complemento. A ativação do trajeto de complemento clássico é inibida pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) para anticorpos (da subclasse apropriada), que estão aglutinados a seu antígeno cognato. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC, por exemplo, conforme descrito em Gazzano- Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado. Variantes de polipeptídeo com sequências de aminoácido da região Fc alterados (polipeptídios com uma região Fc variante) e capacidade de ligação C1q aumentada ou diminuída são descritas, por exemplo, na Patente N° US 6.194.551 B1 e WO 1999/51642. Vide também, por exemplo, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

[169] Uma variante de polipeptídeo com afinidade de ligação FcR “alterada” ou atividade de ADCC é aquela que tem tanto atividade de ligação FcR e/ou atividade de ADCC melhorada ou diminuída comparada a um polipeptídeo de origem ou a um polipeptídeo que compreende uma região Fc de sequência nativa. A variante de polipeptídeo que “exibe ligação aumentada” para um FcR se aglutina a ao menos um FcR com melhor afinidade que o polipeptídeo de origem. A variante de polipeptídeo que “exibe ligação diminuída” a um FcR, se aglutina a ao menos um FcR com afinidade mais baixa que a um polipeptídeo de origem. Tais variantes que exibem ligação diminuída a um FcR pode possuir pouca ou nenhuma ligação apreciável a um FcR, por exemplo, 0 a 20% de ligação a um FcR comparado a uma região Fc de IgG de sequência nativa.

[170] A variante de polipeptídeo que “media citotoxicidade (ADCC) mediada por célula dependente de anticorpo na presença de células efetoras humanas mais efetivamente” que um anticorpo de origem é aquela em que in vitro ou in vivo é substancialmente mais efetiva em ADCC de mediação, quando as quantidades de variante de polipeptídeo e de anticorpo de origem usadas no ensaio são essencialmente as mesmas. Geralmente, tais variantes serão identificadas com uso de ensaio de ADCC in vitro conforme revelado no presente, mas outros ensaios ou métodos para determinar a atividade de ADCC, por exemplo, em um modelo animal etc., são contemplados.

[171] “Afinidade de ligação” geralmente se refere à resistência da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que de outra forma indicado, conforme usado no presente, “afinidade de ligação” se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligações (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para sua parceira Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd), uma recíproca da constante de associação (Ka). A afinidade pode ser medida por métodos comuns na técnica, incluindo aqueles descritos no presente. Anticorpos de baixa afinidade geralmente se aglutinam a antígeno lentamente e/ou tendem a se desassociarem prontamente, enquanto anticorpos de alta afinidade geralmente se aglutinam a antígeno mais rápido e/ou tendem a permanecer aglutinados por mais tempo. Uma variedade de métodos de medição de afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer uma das quais pode ser usada para o propósito da presente invenção. Modalidades ilustrativas e exemplificativas específicas para medir a afinidade de ligação são descritas a seguir.

[172] Em certas modalidades, a “KD,” “Kd,” “Kd” ou “valor de Kd” de acordo com esta invenção é medida com uso de ensaios de ressonância de plásmon de superfície com uso de um BIACORE®-2000 ou um BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C com pedaços de antígeno CM5 imobilizados em ~10 unidades de resposta (RU). Brevemente, pedaços de biosensor de dextrano carboximetilados (CM5, BIACORE, Inc.) são ativados com N-etil-N’- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimide hidrocloreto (EDC) e N- hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, para 5 μg/ml (~0,2 μM) após injeção a uma taxa de fluxo de 5 μl/minuto para alcançar aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Seguindo-se a injeção de antígeno, 1 M de etanolamina é injetada a grupos não reagidos em bloco. Para medições de cinética, diluições em série de polipeptídeo, por exemplo, anticorpo de comprimento completo, é injetado em PBS com 0,05% de surfactante TWEEN-20TM (PBST) a 25 °C a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas com uso de um simples modelo de ligação de Langmuir uma a um (Software de Avaliação BIACORE ® versão 3.2) encaixando simultaneamente os sensogramas de associação de dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como a razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Se a taxa on excede 106 M-1 s-1 pelo teste de ressonância de plásmon se superfície anterior, então a taxa on pode ser determinada com uso de uma técnica de supressão fluorescente que mede o aumento ou diminuição em intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de passa faixa) a 25 °C de um anticorpo anti-antígeno de 20 nM em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações em aumento antígeno conforme medido em um espectrômetro, tal como um espectrofotômetro equipado com parada do fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro 8000-series SLM-AMINCOTM (ThermoSpectronic) com uma cuveta agitada.

[173] Uma “taxa on,” “taxa de associação,” ou “kon” de acordo com esta invenção pode também ser determinada conforme descrito anteriormente com uso de um sistema BIACORE ®-2000 ou BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).

[174] O termo “substancialmente similar” ou “substancialmente o mesmo,” conforme usado no presente, denota um grau suficientemente alto de similaridade entre dois valores numéricos de forma que um versado na técnica poderia considerar a diferença entre os dois valores sendo de pouca ou nenhuma significância biológica e/ou estatística dentro do contexto da característica biológica medida por ditos valores (por exemplo, valores de Kd). Em certas modalidades, a diferença entre ditos dois valores é, por exemplo, menos que cerca de 50%, menos que cerca de 40%, menos que cerca de 30%, menos que cerca de 20% e/ou menos que cerca de 10% como uma função do valor de referência/comparador.

[175] A frase “substancialmente reduzido” ou “substancialmente diferente,” conforme usada no presente, denota um grau suficientemente alto de diferença entre dois valores numéricos de forma que alguém versado na técnica poderia considerar a diferença entre os dois valores numéricos sendo de significância estatística dentro do contexto da característica biológica medida por ditos valores (por exemplo, valores de Kd). Em certas modalidades, a diferença entre ditos dois valores é, por exemplo, maior que cerca de 10%, maior que cerca de 20%, maior que cerca de 30%, maior que cerca de 40% e/ou maior que cerca de 50% com o uma função do valor para a molécula de referência/comparadora.

[176] Uma “moldura humana aceitadora” para os propósitos do presente é uma moldura que compreende a sequência de aminoácido de uma moldura VL ou VH derivado de uma moldura de imunoglobulina humana ou uma moldura consenso humano. Uma moldura humana aceitadora “derivada de” uma moldura de imunoglobulina humana ou uma moldura consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácido deste, ou pode conter mudanças de sequência de aminoácido pré-existentes. Em algumas modalidades, o número de mudanças de aminoácido pré-existentes é de 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos, ou 2 ou menos. Onde as mudanças de aminoácido pré- existentes estão presentes em uma VH, preferencialmente aquelas mudanças ocorrem em somente três, duas ou uma das posições 71H, 73H e 78H; por exemplo, os resíduos de aminoácido naquelas posições podem ser 71A, 73T e/ou 78A. Em uma modalidade, a moldura humana aceitadora de VL é idêntica em sequência a sequência de moldura humana aceitadora de VL ou a sequência de moldura consenso humano consensus.

[177] A “moldura consenso humana” é uma moldura que representa os mais comumente ocorrentes resíduos de aminoácido em uma seleção de sequências de VL de imunoglobulina humana ou moldura de VH. Geralmente, a seleção de sequências de VL de imunoglobulina humana ou moldura de VH é a partir de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo conforme em Kabat et al., supra. Em uma modalidade, para o VL, o subgrupo é o subgrupo kappa I conforme em Kabat et al., supra. Em uma modalidade, para o VH, o subgrupo é o subgrupo III conforme em Kabat et al., supra.

[178] Uma “moldura consenso do subgrupo III de VH” compreende a sequência consenso obtida a partir das sequências de aminoácido em um subgrupo III pesado variável de Kabat et al.

[179] Uma “moldura consenso do subgrupo I de VL” compreende a sequência consenso obtida a partir das sequências de aminoácido em um subgrupo I kappa leve variável de Kabat et al.

[180] “Purificado” significa que uma molécula está presente em uma amostra a uma concentração de ao menos 95% por peso, ou ao menos 98% por peso da amostra em que está contida.

[181] Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que está separada de ao menos uma outra molécula de ácido nucleico com a qual estaria normalmente associada, por exemplo, em seu ambiente natural. Uma molécula de ácido nucleico isolada adicionalmente inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que ordinariamente expressam a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente de forma extra cromossômica ou em uma localização cromossômica que é diferente de sua localização cromossômica natural.

[182] O termo "vetor," conforme usado no presente, pretende se referir a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a um DNA de cadeia dupla circular no qual segmentos de DNA adicional podem ser aglutinados. Outro tipo de vetor é um vetor de fago. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicional podem ser aglutinados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles estão introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que tem uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissômicos). Outros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissômicos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira, e assim são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles estão operativamente ligados. Tais vetores são referidos no presente como "vetores de expressão recombinante," ou simplesmente "vetores de expressão." Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante são normalmente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados alternadamente já que o plasmídeo é a forma mais comumente usado de vetor.

[183] "Polinucleotídeo" ou "ácido nucleico," conforme usado no presente, se refere a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser deoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero por polimerase de DNA ou RNA ou por uma reação de síntese. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tal como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, a modificação à estrutura do nucleotídeo pode ser realizada antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes de não nucleotídeo. Um polinucleotídeo pode compreender modificação(ões) feitas após a síntese, tal como conjugação a um marcador. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, “coberturas,” substituição de um ou mais dos nucleotídeos naturalmente ocorrentes com um análogo, modificações internucleotídeos tais como, por exemplo, aqueles com ligações descarregadas (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbanatos, etc.) e com ligações carregadas (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aqueles que contêm partes pendentes, tais como, por exemplo, proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, poli-L-lisina, etc.), aqueles com intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), aqueles que contêm quelatores (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), aqueles que contêm alquilatantes, aqueles com ligações modificadas (por exemplo, ácido nucleicos alfa anoméricos, etc.), assim como formas não modificadas de polinucleotídeos(s). Ademais, qualquer dos grupos de hidroxila ordinariamente presentes nos açúcares podem ser substituídos, por exemplo, por grupos de fosfonato, grupos de fosfonato, protegidos por grupos de proteção padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados a suportes sólidos ou semi-sólidos. O OH de terminal 5’ e 3’ pode ser fosforilado ou substituído com aminas ou partes de grupo terminal orgânico de 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas podem também ser derivadas a grupos de proteção padrão. Polinucleotídeos podem também conter forma análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são geralmente conhecidas na técnica, que incluem, por exemplo, 2’-O-metil-, 2’-O-alil-, 2’-fluoro- ou 2’-azido-ribose, açúcar carbocíclico análogo, açúcares a-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, açúcares de xiloses ou lixoses, piranose, açúcares de furanose, sedoeptuloses, acíclicos análogos e nucleotídeos básicos análogos tais como metil ribose. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligação alternativos. Esses grupos de ligação alternativos incluem, mas não estão limitados a, modalidades em que o fosfato é substituído por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O)NR2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OU’, CO, ou CH2 (“formacetal”), em que cada R ou R’ é independentemente H ou alquil substituído ou não substituído (1-20 C) opcionalmente contendo uma ligação de éter (-O-), aril, alquenil, cicloalquil, cicloalquenil ou aralil. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição precedente se aplica a todos os polinucleotídeos referidos no presente, incluindo RNA e DNA.

[184] “Oligonucleotídeo,” conforme usado no presente, geralmente se refere polinucleotídeos curtos, geralmente de cadeia única, geralmente sintéticos, que têm geralmente, mas não necessariamente, menos que cerca de 200 nucleotídeos em comprimento. Os termos “oligonucleotídeo” e “polinucleotídeo” não são mutualmente exclusivos. A descrição anterior para polinucleotídeos é igualmente e completamente aplicável a oligonucleotídeos.

[185] A expressão "sequências de controle" se refere a sequências DNA necessariamente para a expressão de uma sequência de codificação ligada operável em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle que são adequadas para procariontes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma sequência operadora, e um sítio de ligação de ribossomo. Células eucarióticas são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação, e intensificadores.

[186] Ácido nucleico é "ligado de forma operável" quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, DNA para um pré-sequenciamento ou secretor principal é ligado de forma operável ao DNA por um polipeptídeo se este é expresso como uma pré- proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou intensificador é ligado de forma operável a uma sequência de codificação se afeta a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação de ribossomo é ligado de forma operável a uma sequência de codificação se esse é posicionado de forma a facilitar a translação. Geralmente, "ligado de forma operável" significa que as sequências DNA que estão sendo ligadas são contínuas, e, no caso de um secretor principal, contínuo e em fase de leitura. No entanto, intensificadores não precisam ser contínuos. A ligação é acompanhada por ligação em sítios de restrição conveniente. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ou ligadores de oligonucleotídeo sintético são usados em concordância com a prática convencional.

[187] Conforme usadas no presente, as expressões "célula," "linhagem de célula" e "cultura de célula" são usadas alternadamente e todas tais designações incluem progênie. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula sujeita primária e culturas derivadas desta sem considerar o número de transferências. É também entendido que todo progênie pode não ser precisamente idêntico em teor de DNA, devido às mutações deliberadas ou inadvertidas. Uma progênie mutante que tenha a mesma função ou atividade biológica conforme procurado na célula originalmente transformada está incluída. Onde designações distintas são pretendidas, estará claro a partir do contexto.

[188] Conforme usado no presente, “conjunto de códon” se refere a um conjunto de diferentes sequências triplas de nucleotídeo usado para codificar aminoácidos variantes desejados. Um conjunto de oligonucleotídeos pode ser sintetizado, por exemplo, por síntese de fase sólida, que inclui sequências que representam todas as possíveis combinações de trios de nucleotídeo fornecidos pelo conjunto de códon e que codificarão o grupo desejado de aminoácidos. Uma forma padrão de designação de códon é aquela do código IUB, que é conhecido na técnica e descrito no presente. Um conjunto de códon tipicamente é representado por 3 letras maiúsculas em itálico, por exemplo, NNK, NNS, XYZ, DVK e similares. Um “conjunto de códon não aleatório”, conforme usado no presente, assim se refere a um conjunto de códon que codifica aminoácidos seletos que preenchem parcialmente, preferencialmente completamente, o critério para seleção de aminoácido conforme descrito no presente. A síntese de oligonucleotídeos com "degeneracidade" do nucleotídeo selecionado em certas posições é bem conhecida na técnica, por exemplo, a abordagem de TRIM (Knappek et al. (1999) J. Mol. Biol. 296:57-86); Garrard & Henner (1993) Gene 128:103). Tais conjuntos de oligonucleotídeos que têm certos conjuntos de códon podem ser sintetizados com uso de sintetizadores de ácidos nucleicos comerciais (disponíveis, por exemplo, pela Applied Biosystems, Foster City, CA), ou podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, da Life Technologies, Rockville, MD). Então, um conjunto de oligonucleotídeos sintetizado que tem um conjunto de códon particular incluirá tipicamente uma pluralidade de oligonucleotídeos com diferentes sequências, as diferenças estabelecidas pelo conjunto de códon dentro da sequência total. Os oligonucleotídeos, conforme usado de acordo com a invenção, têm sequências que permitem a hibridização a um modelo de ácido nucleico de domínio variável e também pode, mas não necessariamente, incluir sítios de enzima de restrição úteis para, por exemplo, propósitos de clonagem.

[189] A expressão “anticorpos lineares" se refere aos anticorpos descritos em Zapata et al. (1995 Protein Eng, 8(10):1057-1062). Brevemente, esses anticorpos compreendem um par de segmentos Fd consecutivos (VH- CH1-VH-CH1) que, juntamente com polipeptídios de cadeia leve complementária, formam um par de regiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou monoespecíficos.

[190] Conforme usado no presente, “biblioteca” se refere a uma pluralidade de sequências de fragmento de anticorpo ou anticorpo (por exemplo, IgGs variantes da invenção), ou os ácidos nucleicos que codificam essas sequências, sendo as sequências diferentes na combinação de aminoácidos variantes que são introduzidos nessas sequências de acordo com os métodos da invenção.

[191] "Exibição de fago" é uma técnica pela qual polipeptídios são exibidos como proteínas de fusão para ao menos a porção de proteína de revestimento na superfície de fago, por exemplo, fago filamentoso, partículas. Uma utilidade de exibição de fago está no fato de que grandes bibliotecas de variantes de proteína randomizadas podem ser rapidamente e eficientemente ordenadas por aquelas sequências que se aglutinam a um antígeno alvo com alta afinidade. A exibição de bibliotecas de peptídeo e proteína em fago tem sido usada para varrer milhões de polipeptídios por uns com propriedades de ligação específicas. Métodos de exibição de fago polivalente têm sido usados para exibir pequenos peptídeos aleatórios e pequenas proteínas através de fusões tanto do gene III como do gene VIII de fago filamentoso. Wells e Lowman (1992) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:355-362, e referências citadas destes. Em uma exibição de fago monovalente, uma biblioteca de proteína ou peptídeo é fundida a um gene III ou uma porção deste, e expressada em baixos níveis na presença de proteína de gene III do tipo selvagem de forma que partículas exibam uma cópia ou nenhuma das proteínas de fusão. Os efeitos de avidez são reduzidos em relação ao fago polivalente de forma a ordenar está na base de afinidade ligante intrínseca, e vetores fagomídeos são usados, os quais simplificam a manipulação de DNA. Lowman e Wells (1991) Methods: A companion to Methods in Enzymology 3:205-0216.

[192] Um "fagomídeo" é um vetor plasmídeo que tem uma origem bacteriana de replicação, por exemplo, Co1E1, e uma cópia de uma região intergênica de um bacteriófago. O fagomídeo pode ser usado em qualquer bacteriófago conhecido, incluindo bacteriófago filamentoso e bacteriófago lambdoide. O plasmídeo também geralmente conterá um marcador selecionável para resistência a antibiótico. Segmentos de DNA clonados nesses vetores podem ser propagados como plasmídeos. Quando células contendo esses vetores são fornecidas com todos os genes necessários para a produção de partículas de fago, o modo de replicação do plasmídeo muda para replicação de círculo rolante para gerar cópias de um filamento do DNA de plasmídeo e partículas de fago compactadas. O fagomídeo pode formar partículas de fago infecciosas ou não infecciosas. Este termo inclui fagomídeos que contêm um gene de proteína de cobertura de fago ou fragmento deste ligado a um gene de polipeptídeo heterólogo como uma fusão de gene de forma que o polipeptídeo heterólogo é exibido na superfície da partícula de fago.

[193] O termo “vetor de fago" significa uma forma replicativa de cadeia dupla a de um bacteriófago que contém um gene heterólogo e capacidade de replicação. O vetor de fago tem uma origem de fago de replicação que permite a replicação do fago e formação de partícula de fago. O fago é preferencialmente um bacteriófago filamentoso, tal como um fago M13, f1, fd, Pf3 ou um derivado destes, ou um fago lambdoide, tal como lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, etc., ou um derivado destes.

[194] Conforme usado no presente, "posição acessível a solvente" se refere a uma posição de um resíduo de aminoácido nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um fragmento de ligação de anticorpo ou antígeno de fonte que é determinado, baseado em estrutura, montagem de estruturas e/ou estrutura moldada do fragmento de ligação de anticorpo ou antígeno, conforme potencialmente disponível para acesso e/ou contato do solvente com uma molécula, tal como um antígeno específico por anticorpo. Essas posições são tipicamente encontradas nos CDRs e no exterior da proteína. As posições acessíveis a solvente de um fragmento de ligação de anticorpo ou antígeno, conforme definidas no presente, podem ser determinadas com uso de qualquer um de uma variedade de algoritmos conhecidos na técnica. Em uma modalidade, as posições acessíveis a solvente são determinadas com uso de coordenadas de um modelo tridimensional de um anticorpo, preferencialmente com uso de um programa de computador tal como o InsightII program (Accelrys, San Diego, CA). As posições acessíveis a solvente podem também ser determinadas com uso de algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (1971) J. Mol. Biol. 55, 379 e Connolly (1983) J. Appl. Cryst. 16, 548). A determinação de posições acessíveis a solvente pode ser realizada com uso de um software adequado para modelagem de proteína e informação estrutural tridimensional de um anticorpo. O software que pode ser utilizado para esses fins inclui o software SYBYL Biopolymer Module (Tripos Associates). Geralmente, onde um algoritmo (programa) necessita de um parâmetro de tamanho de entrada de usuário, o “tamanho” de uma sonda que é usada no cálculo é definido em cerca de 1,4 Angstroms ou menos em raio. Em adição, a determinação das regiões acessíveis a solvente e métodos de área que usam software para computadores pessoais foi descrita por Pacios (1994) Comput. Chem. 18(4): 377-386.

[195] A “identidade de sequência de aminoácido em percentual (%)" com relação a uma sequência de polipeptídeo é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácido em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácido na sequência de polipeptídeo referida, após alinhas as sequências e introduzir intervalos, se necessário, para alcançar a identidade de sequência de percentual máximo, e não considerar quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinar a identidade de sequência de aminoácido percentual pode ser alcançado de várias formas que conhecidas pelo versado na técnica , por exemplo, com uso de software de computador disponível para publicidade tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Aqueles versados na técnica podem determinar parâmetros apropriados para alinhar as sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo sobre todo o comprimento das sequências que são comparadas. Para os fins do presente, no entanto, valores de identidade de sequência de aminoácido % são gerados com uso do programa de computador para comparação de sequência ALIGN-2. O programa de computador para comparação de sequência ALIGN-2 foi criado pela Genentech, Inc., e o código fonte foi preenchido com documentação de usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob o N° de Registro Copyright U.S. TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível a partir da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferencialmente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

[196] Em situações em que o ALIGN-2 é empregado para comparações de sequência de aminoácido, a identidade de sequência de aminoácido % de uma dada sequência de aminoácido A a, com ou contra uma dada sequência de aminoácido B (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de aminoácido A que tem ou compreende uma certa identidade de sequência de aminoácido % a, com, ou contra uma dada sequência de aminoácido B) é calculada como segue: 100 vezes a fração X/Y onde X é o número de resíduos de aminoácido ordenado como correspondentes idênticos pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN- 2 em que o alinhamento do programa é de A e B, e onde Y é o número total de resíduos de aminoácido em B. Deve-se perceber que onde o comprimento de sequência de aminoácido A não é igual ao comprimento de sequência de aminoácido B, a identidade de sequência de aminoácido % de A para B não será igual à identidade de sequência de aminoácido % de B para A. A não ser que de outra forma determinado, todos os valores de identidade de sequência de aminoácido % usados no presente são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior com uso do programa de computador ALIGN-2.

[197] O termo "VEGF" ou “VEGF-A” conforme usado no presente se refere ao fator de crescimento de célula endotelial vascular humana do aminoácido 165 e se relaciona aos fatores de crescimento de célula endotelial vascular humana do aminoácido 121, 189 e 206, conforme descrito por Leung et al. (1989) Science 246:1306, e Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5:1806, juntamente com alélico que ocorre naturalmente e formas processadas destes. O termo “VEGF” também se refere aos VEGFs a partir de espécies não humanas tais como camundongo, rato ou primata. Algumas vezes o VEGF de uma espécie específica é indicado por termos tais como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino, e etc. O termo "VEGF" é também usado para se referir a formas truncadas do polipeptídeo que compreende os aminoácidos 8 a 109 ou 1 a 109 do fator de crescimento de célula endotelial vascular humana do aminoácido 165. Em referência a quaisquer tais formas de VEGF pode ser identificado na presente aplicação, por exemplo, por “VEGF (8-109),” “VEGF (1109),” “VEGF-A109” ou “VEGF165.” As posições de aminoácido para um VEGF nativo "truncado" são numeradas conforme indicado na sequência VEGF nativa. Por exemplo, a posição de aminoácido 17 (metionina) em VEGF nativo truncado é também a posição 17 (metionina) em VEGF nativo. O VEGF nativo truncado tem afinidade de ligação para os receptores KDR e Flt-1 comparáveis ao VEGF nativo.

[198] Um “VEGF antagonista” se refere a uma molécula capaz de neutralizar, bloquear, inibir, anular, reduzir ou interferir nas atividades de VEGF que incluem, mas não se limitam a, sua ligação a um ou mais receptores de VEGF. Os VEGF antagonistas incluem, sem limitação, fragmentos de anticorpos anti-VEGF e ligação por antígeno destes, moléculas receptoras e derivadas que se aglutinam especificamente a VEGF assim separar sua ligação a um ou mais receptores, anticorpos receptores de anti-VEGF, antagonistas receptores de VEGF tais como inibidores de molécula da VEGFR tirosina quinases e imunoadesinas que se aglutinam a VEGF tal como coletor de VEGF. O termo “VEGF antagonista,” conforme usado no presente, especificamente inclui moléculas, incluindo anticorpos, fragmentos de anticorpo, outros polipeptídios de ligação, pequenas moléculas de peptídeos, e não peptídeos, que se aglutinam a VEGF e são capazes de neutralizar, bloquear, inibir, anular, reduzir ou interferir nas atividades de VEGF. Assim, o termo “atividade de VEGF” especificamente inclui atividades biológicas mediadas por de VEGF.

[199] Os termos “atividade biológica” e “biologicamente ativo” com relação ao polipeptídeo de VEGF ou “atividade de VEGF” se referem às propriedades física/químicas e funções biológicas associadas com o VEGF de comprimento total e/ou truncado. Em certas modalidades, a atividade de VEGF está induzindo e/ou estimulando e/ou promovendo a angiogênese. Em certas modalidades, a atividade de VEGF está induzindo e/ou estimulando e/ou promovendo a neovascularização. Em certas modalidades, a atividade de VEGF está induzindo e/ou modulando a permeabilidade vascular. Em certas modalidades, a atividade de VEGF está induzindo e/ou estimulando e/ou promovendo a migração de células endoteliais e/ou a proliferação de células endoteliais.

[200] Os anticorpos de neutralização de anti-VEGF suprimem o crescimento de uma variedade de linhagens de célula de tumor humano em ratos sem pêlo (Kim et al., Nature 362:841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995); Borgstrom et al., Câncer Res. 56:4032-4039 (1996); Melnyk et al., Câncer Res. 56:921-924 (1996)) e também inibem a angiogênese intraocular em modelos de desordens retinais isquêmicas. Adamis et al., Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996).

[201] O termo “anticorpo anti-VEGF” ou “um anticorpo que se aglutina a VEGF” se refere a um anticorpo que é capaz de se aglutinar a VEGF com afinidade e especificidade suficientes para que o anticorpo seja útil como um agente diagnóstico e/ou terapêutico em apontar VEGF. Por exemplo, o anticorpo anti-VEGF da invenção pode ser usado como um agente terapêutico em apontar e interferir em doenças e condições em que a atividade de VEGF esteja envolvida. Vide, por exemplo, as Patentes U.S. 6.582.959, 6.703.020; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202, WO2005/044853; EP 0666868B1; os Pedidos de Patente US 20030206899, 20030190317, 20030203409, 20050112126, 20050186208 e 20050112126; Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004); e WO2005012359. O anticorpo selecionado terá normalmente uma afinidade de ligação suficientemente forte para VEGF. Por exemplo, o anticorpo pode aglutinar hVEGF com um valor de Kd entre 100 nM-1 pM. As afinidades de anticorpo podem ser determinadas por um ensaio baseado em ressonância de plásmon de superfície (tal como o ensaio BIAcore conforme descrito no Pedido de Patente PCT N° WO2005/012359);ensaio de imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA); e ensaios de concorrência (por exemplo RIA’s), por exemplo. O anticorpo pode ser sujeitado a outros ensaios de atividade biológica, por exemplo, com o objetivo de avaliar sua efetividade como um terapêutico. Tais ensaios não conhecidos na técnica e dependem do antígeno alvo e uso pretendido para o anticorpo. Exemplos incluem o ensaio de inibição HUVEC; ensaios de inibição de crescimento de célula de tumor (conforme descrito em WO 89/06692, por exemplo); ensaios de citotoxicidade celular de dependente de anticorpo (ADCC) e de citotoxicidade mediada por complemento (CDC) (Patente US 5.500.362); e ensaios de atividade agonística ou hematopoiese (vide WO 95/27062). Um anticorpo anti-VEGF normalmente não se ligará a outro VEGF homólogo tal como VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D ou VEGF-E, nem a outros fatores de crescimento tais como PlGF, PDGF ou bFGF. Em uma modalidade, o anticorpo anti-VEGFs inclui um anticorpo monoclonal que se aglutina ao mesmo epitopo que o anticorpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 produzido por hibridoma ATCC HB 10709; um anticorpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante (vide Presta et al. (1997) Câncer Res. 57:4593-4599), que inclui, mas não se limita a, o anticorpo conhecido como “bevacizumab (BV),” também conhecido como “rhuMAb VEGF” ou “AVASTIN®.” AVASTIN® está atualmente disponível comercialmente. O bevacizumab compreende regiões de moldura de IgG1 humana mutante e regiões de determinação complementária de ligação por antígeno a partir do anticorpo murino A.4.6.1 que bloqueia a ligação de VEGF humano a seus receptores. Aproximadamente 93% da sequência de aminoácido de bevacizumab, incluindo a maioria das regiões de moldura, é derivada de IgG1 humana, e cerca de 7% da sequência é derivada de A4.6.1. O bevacizumab tem uma massa molecular de cerca de 149,000 daltons e é glicosilada. O bevacizumab e outros anticorpos anti-VEGF humanizados são adicionalmente descritos na Patente N° U.S. 6.884.879, emitida em 26 de fevereiro de 2005. Anticorpos anti-VEGF adicionais incluem os anticorpos de série G6 ou B20 (por exemplo, G6-23, G6-31, B20-4.1), conforme descrito na Publicação de Pedido PCT N° WO2005/012359. Para anticorpos preferenciais adicionais vide as Patentes Nos U.S. 7.060.269, 6.582.959, 6.703.020; 6.054.297; WO98/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; as Publicações de Pedido de Patente Nos U.S. 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409, e 20050112126; e Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004).

[202] O termo “polipeptídeo de série B20” conforme usado no presente se refere a um polipeptídeo, que inclui um anticorpo que se aglutina ao VEGF. Os polipeptídios de série B20 incluem, mas não são limitados a, anticorpos derivados de uma sequência do anticorpo B20 ou um anticorpo derivado de B20 descrito na Publicação N° US 20060280747, Publicação N° US 20070141065 e/ou Publicação N° US 20070020267, o conteúdo desses pedidos de patente são expressamente incorporado ao presente a título de referência. Em uma modalidade, o polipeptídeo de série B20 é B20-4.1 conforme descrito na Publicação N° US 20060280747, Publicação N° US 20070141065 e/ou Publicação N° US 20070020267. Em outra modalidade, o polipeptídeo de série B20 é B20-4.1.1 descrito na Publicação N° US WO 2009/073160, a revelação completa deste é expressamente incorporada ao presente a título de referência.

[203] O termo “polipeptídeo de série G6” conforme usado no presente se refere a um polipeptídeo, incluindo um anticorpo que se aglutina a VEGF. Os polipeptídios de série G6 incluem, mas não são limitados a, anticorpos derivados de uma sequência do anticorpo G6 ou um anticorpo derivado de G6 descrito na Publicação N° US 20060280747, Publicação N° US 20070141065 e/ou Publicação N° US 20070020267. Os polipeptídios de série G6, conforme descritos na Publicação N° US 20060280747, Publicação N° US 20070141065 e/ou Publicação N° US 20070020267 incluem, mas não são limitados a, G6-8, G6-23 e G6-31.

[204] Um “agente ou fator angiogênico” é um fator de crescimento que estimula o desenvolvimento de vasos sanguíneos, por exemplo, promove angiogênese, crescimento de células endoteliais, estabilidade de vasos sanguíneos, e/ou vasculogênese, etc. Por exemplo, fatores angiogênicos incluem, mas não são limitados a, por exemplo, VEGF e membros da família VEGF (VEGF-B, VEGF-C e VEGF-D), PlGF, família PDGF, família de fator de crescimento de fibroblastos (FGFs), ligantes TIE (Angiopoietins), efrinas, ligante tipo delta 4 (DLL4), Del-1, fatores de crescimento de fibroblasto: acidico (aFGF) e básico (bFGF), folistatina, fator de estimulação de colônia de granulócito (G- CSF), fator de crescimento de hepatócito (HGF) /fator de dispersão (SF), Interleukin-8 (IL-8), leptina, midkine, neuropilinas, fator de crescimento de placenta, fator de crescimento de células epiteliais derivadas de plaquetas (PD- ECGF), especialmente PDGF-BB ou PDGFR-beta, pleiotrophin (PTN), progranulina, proliferina, fator alfa de crescimento de transformação (TGF-alfa), fator beta de crescimento de transformação (TGF-beta), fator alfa de necrose de tumor (TNF-alpha), etc. Também poderia incluir fatores que aceleram a cicatrização de feridas, tais como hormônios de crescimento, fator I de crescimento do tipo insulina (IGF-I), VIGF, fator de crescimento epidérmico (EGF), CTGF e membros de sua família, e TGF-alfa e TGF-beta. Vide, por exemplo, Klagsbrun e D’Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit e Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (por exemplo, a Tabela 1 que lista fatores angiogênicos conhecidos); e, Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206.

[205] Um "agente anti-angiogênese" ou “inibidor de angiogênese” se refere a uma substância de pequeno peso molecular, um polinucleotídeo (que inclui, por exemplo, um RNA inibitório (RNAi ou siRNA)), um polipeptídeo , uma proteína isolada, uma proteína recombinante, um anticorpo, ou conjugados ou proteínas de fusão destes, que inibe a angiogênese, vasculogênese ou permeabilidade vascular indesejáveis, tanto diretamente como indiretamente. Deve-se entender que o agente anti-angiogênese inclui aqueles agentes que aglutinam e bloqueiam a atividade angiogênica do fator angiogênico ou seu receptor. Por exemplo, um agente anti-angiogênese é um anticorpo ou outro antagonista a um agente angiogênico conforme descrito anteriormente, por exemplo, anticorpos para VEGF-A ou para o receptor VEGF-A (por exemplo, receptor KDR ou receptor Flt-1), inibidores anti-PDGFR tais como GLEEVEC® (Imatinib Mesylate), pequenas moléculas que boqueiam a sinalização de receptor VEGF (por exemplo, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®/SU11248 (malato de sunitinib), AMG706, ou aqueles descritos, por exemplo, no pedido de patente internacional WO 2004/113304). Agentes anti-angiogênese também incluem inibidores de angiogênese nativos, por exemplo, angiostatina, endostatina, etc. Vide, por exemplo, Klagsbrun e D’Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit e Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (por exemplo, a Tabela 3 que lista terapia anti-angiogênica em melanoma maligno); Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (por exemplo, a Tabela 2 que lista fatores anti- angiogênicos conhecidos); e, Sato (2003) Int. J. Clin. dOncol. 8:200-206 (por exemplo, a Tabela 1 que lista agentes anti-angiogênicos usados em estudos clínicos).

[206] Uma "desordem" é qualquer condição ou doença que poderia se beneficiar a partir de tratamento com uma composição ou método da invenção. Isto inclui desordens ou doenças crônicas e agudas que incluem aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero à desordem em questão. Exemplos não limitantes de desordens que podem ser tratadas com uso dos anticorpos e fragmentos de anticorpo da invenção incluem várias doenças e desordens fornecidas de no presente mediante “Definições”.

[207] Os termos “desordem proliferativa de células” e “desordem proliferativa” se referem a desordens que estão associadas com algum grau de proliferação de células anormal. Em uma modalidade, a desordem proliferativa de células é câncer.

[208] "Tumor," conforme no presente, se refere a todo crescimento e proliferação de célula neoplástica, seja maligno ou benigno, e todas as células e tecidos pré-câncerosos e câncerosos. Os termos “câncer”, “cânceroso”, “desordem proliferativa de células”, “desordem proliferativa” e “tumor” não são mutualmente exclusivos conforme referidos no presente.

[209] O tumor pode ser um tumor sólido ou a não sólido ou um tumor de tecido mole. Exemplos de tumores de tecido mole incluem leucemia (por exemplo, leucemia mielogenosa crônica, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa aguda adulta, leucemia mielogenosa aguda, leucemia mielogenosa aguda de célula B madura, leucemia linfocítica crônica, leucemia polinfocítica ou leucemia de células cabeludas), ou linfoma (por exemplo, linfoma não Hodgkin, linfoma de célula T cutânea ou doença de Hodgkin). Um tumor sólido inclui qualquer câncer de tecidos corporais outros que o sangue, medula óssea ou o sistema linfático. Tumores sólidos podem ser adicionalmente separados em aqueles de origem de célula epitelial e aqueles de origem de célula não epitelial. Exemplos de tumores sólidos incluem tumores de colón, seio, próstata, pulmão, rim, fígado, pâncreas, ovário, cabeça e pescoço, cavidade oral, estômago, duodeno, intestino delgado, intestino grosso, trato gastrointestinal, ânus, vesícula biliar, lábios, nasofaringe, pele, útero, órgão genital masculino, órgãos urinários, bexiga e pele. Tumores sólidos de origem não epitelial incluem sarcomas, tumores cerebrais e tumores ósseos.

[210] Os termos "câncer" e "canceroso" se referem ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não são limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia ou linfoides malignos. Exemplos mais particulares de tais cânceres incluem, mas não são limitados a, carcinoma das células escamosas (por exemplo, carcinoma das células escamosas epiteliais), câncer de pulmão que inclui câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago que inclui câncer gastrointestinal e câncer de estroma gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer de ovário, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer do trato urinário, hepatoma, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de reto, câncer colorretal, carcinoma endometrial ou uterino, carcinoma da glândula salivar, câncer de rim ou renal, câncer próstata, câncer de vulva, câncer tireoide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma peniano, melanoma, melanoma de expansão superficial, melanoma lentigo maligno, melanomas acrais letiginosos, melanomas nodulares, mieloma múltiplo e linfoma de célula B (que inclui linfoma não Hodgkin de grau/folicular baixo (NHL); NHL linfocítico pequeno (SL); NHL de grau/folicular intermediário; NHL difuso de grau intermediário; NHL imunoblástico de grau alto; NHL linfoblástico de grau alto; NHL de pequenas células não clivada de grau alto; NHL de doença volumosa; linfoma de célula de manto; linfoma relacionado à AIDS; e Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crônica (CLL); leucemia linfocítica aguda (ALL); leucemia de células cabeludas; leucemia mieloblástica crônica; e desordem linfoproliferativa pós-transplante (PTLD), assim como proliferação vascular anormal associada com facomatoses, edema (tal como aquele associado com tumores cerebrais), síndrome de Meigs, câncer de cérebro, assim como de cabeça pescoço, e associada à metástase. Em certas modalidades, cânceres que são tratáveis com tratamento pelas IgGs variantes da invenção incluem câncer de mama, câncer colorretal, câncer de reto, câncer de pulmão de células não pequenas, glioblastoma, linfoma não Hodgkin (NHL), câncer de célula renal, câncer próstata, câncer de fígado, câncer pancreático, sarcoma de tecido mole, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, câncer de cabeça e pescoço, mieloma de ovário, mesotelioma e milenoma múltiplo. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste de câncer de pulmão de pequenas células, gliblastoma, neuroblastomas, melanoma, carcinoma de mama, câncer gástrico, câncer colorretal (CRC), e carcinoma hepatocelular. Ainda, em algumas modalidades, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste de câncer de pulmão de células não pequenas, câncer colorretal, glioblastoma e carcinoma de mama, que inclui formas metastáticas destes cânceres.

[211] O termo câncer engloba uma coleção de desordens proliferativas, que incluem, mas não são limitadas a, crescimentos pré- cancerosos, tumores benignos, tumores malignos e tumores dormentes. Tumores benignos permanecem localizados no sítio de origem e não têm capacidade de infiltrar, invadir ou fazer metástase em sítios distantes. Tumores malignos invadirão e danificação outros tecidos a seu redor. Eles podem também ganhar a habilidade de escapar de onde se iniciaram e se espalharem a outras partes do corpo (metástase), normalmente através da corrente sanguínea ou através do sistema linfático onde os nodos linfáticos estão localizados. Tumores dormentes são tumores inertes em que células de tumor estão presentes, mas a progressão do tumor não é clinicamente aparente. Tumores primários são classificados pelo tipo de tecido do qual eles surgem; tumores metastáticos são classificados pelo tipo de tecido do qual as células cancerígenas derivam. Com o tempo, as células de um tumor maligno se tornam mais anormais e parecem menos com as células normais. Esta mudança na aparência das células cancerígenas é chamada de grau de tumor e as células cancerígenas são descritas como sendo bem diferenciadas, moderadamente diferenciadas, pouco diferenciadas ou indiferenciadas. As células bem diferenciadas são quase normais em aparência e remontam às células normais das quais se originaram. As células indiferenciadas são células que se tornaram tão anormais que não é mais possível determinar a origem das células.

[212] Os cânceres epiteliais geralmente evoluem de um tumor benigno para um estágio pré-invasivo (por exemplo, carcinoma in situ), para um câncer maligno, que penetrou a membrana basal e invadiu o estroma subepitelial.

[213] Por “displasia” entende-se qualquer crescimento ou desenvolvimento anormal de tecido, órgão ou células. Em certas modalidades, a displasia é de alto grau ou pré-cancerosa.

[214] Por “metástase” entende-se o espalhamento de câncer de seu sítio primário para outros locais no corpo. Células cancerígenas podem escapar de um tumor primário, penetrar em vasos de sangue ou linfáticos, circular através da corrente sanguínea e crescer em focos distantes (metástase) em tecidos normais em outros locais no corpo. A metástase pode ser local ou distante. A metástase é um processo sequencial, que consiste em células de tumor que escapam do tumor primário, viajam através da corrente sanguínea e param em um sítio distante. No novo sítio, as células estabelecem um suprimento de sangue e podem crescer para formar uma massa de potencial letal. Amos os trajetos moleculares estimulatório e inibitório dentro da célula de tumor regulam seu comportamento e interações entre a célula de tumor e as células hospedeiras no sítio distante são também significantes.

[215] Por “micrometástase” entende-se que um pequeno número de células se espalhou de um tumor primário para outras partes do corpo. A micrometástase pode ou não ser detectada em um teste de varredura ou diagnóstico.

[216] Por “não metastático” entende-se que um câncer é benigno ou permanece no sítio primário e não penetrou no sistema de vaso sanguíneo ou linfático ou em tecidos outros que o sítio primário. Geralmente, um câncer não metastático é qualquer câncer que está em um Estágio 0, I ou II, e ocasionalmente um câncer em Estágio III.

[217] Em referência a um tumor ou câncer como um “Estágio 0,” “Estágio I,” “Estágio II,” “Estágio III” ou “Estágio IV” indica classificação do tumor ou câncer com uso dos métodos de Estadiamento de Numeral Romano ou Agrupamento de Estágio Total conhecidos na técnica. Embora o estágio atual do câncer dependa do tipo de câncer, em geral, um câncer de Estágio 0 é uma lesão in situ, um câncer de Estágio I é um pequeno tumor localizado, um câncer de Estágio II e III é um tumor local avançado que exibe envolvimento dos nodos linfáticos locais e um câncer de Estágio IV representa câncer metastático. Os estágios específicos para cada tipo de tumor são conhecidos pelos clínicos versados.

[218] Por “tumor primário” ou “câncer primário” entende-se o câncer original e não uma lesão metastática localizada em outro tecido, órgão ou localização no corpo do sujeito.

[219] Por “tumor benigno” ou “câncer benigno” entende-se um tumor que permanece localizado no sítio de origem e não tem a capacidade de infiltrar, invadir ou fazer metástase para um sítio distante.

[220] “Recorrência de câncer” no presente se refere a um retorno de câncer seguindo-se ao tratamento, e inclui o retorno de câncer no órgão primário, assim como recorrência distante, onde o câncer retorna fora do órgão primário.

[221] Por “dormência de tumor” entende-se um estado inerte prolongado em que as células de tumor estão presentes, mas a progressão do tumor não é clinicamente aparente. Um tumor dormente pode ou não ser detectado em um teste de varredura ou diagnóstico.

[222] Por “carga tumoral” entende-se o número de células cancerígenas, o tamanho de um tumor ou a quantidade de câncer no corpo. A carga tumoral é também referida como carregamento de tumor.

[223] Por “número de tumor” entende-se o número de tumores.

[224] Condições não-neoplásicas que passíveis ao tratamento com anticorpos e fragmentos de anticorpos da invenção incluem, mas não são limitados a, por exemplo, hipertrofia indesejada ou anormal, hipertrofia prostática benigna, artrite, artrite reumatóide (RA), artrite psoriática, doenças neurodegenerativas (por exemplo, doença de Alzheimer, demência relacionada à AIDS, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, retinite pigmentosa, atrofia muscular espinhal e degeneração cerebelar), doença autoimune, psoríase, placas psoriáticas, sarcoidose, aterosclerose, placas ateroscleróticas, tireoidite de Hashimoto, distúrbios angiogênicos, doença ocular como síndrome de histoplasmose ocular presumida, vascularização da retina, retinopatias diabética e proliferativa incluindo retinopatia de prematuridade, nefropatia diabética, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneração muscular relacionada à idade, edema macular diabético, neovascularização córnea, neovascularização de enxerto córneo, rejeição de enxerto córneo, neovascularização retinal/coroidal, neovascularização do ângulo (rubeose), doença neovascular ocular, doença vascular, condições que envolvem a proliferação anormal de células epiteliais vasculares, restenose vascular, Síndrome de Guillain-Barre, pólipos, como um pólipo de cólon, polipose adenomatosa familiar, pólipos nasais ou pólipos gastrointestinais, úlceras gastrointestinais, estenose pilórica hipertrófica infantil, síndrome obstrutiva urinária, doença de Menetrier, adenomas secretor ou síndrome de perda de proteína, fibroadenoma, doença respiratória, colecistite, neurofibromatose, malformações arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias tireóides (incluindo a doença de Grave), transplante córneo e de outros tecidos, doenças inflamatórias, inflamação crônica, inflamação pulmonar, lesão pulmonar aguda /ARDS, sepse, doença pulmonar oclusiva crônica, hipertensão pulmonar primária, efusões pulmonares malignas, ateroma, edema seguindo queimaduras, trauma, radiação, derrame, hipóxia ou isquemia, edema de infarto miocardial, lesão isquêmica, danos seguindo um evento isquêmico cerebral, edema cerebral (por exemplo, associado com derrame agudo/lesão de cabeça fechada/ trauma), trombo causado por agregação de plaqueta, doenças fibróticas ou de edemia, como cirrose hepática, fibrose pulmonar, sarcoidose, troidite, síndrome de hiperviscosidade sistêmica, inflamação sinovial, formação de pano em RA, miosite ossificante, formação óssea hipertrópica, patologias associadas aos ossos, como osteoartrite, raquitismo e osteoporose, ascite refratória, inflamação óssea ou da junta, Síndrome Mielodisplásica, anemia aplásica, rim ou fígado;doença de hipersensibilidade mediada por células T, doença de Paget, doença de rim policístico, 3° espaçamento de doenças fluidas (pancreatite, síndrome compartimental, queimaduras, doença intestinal), inflamação crônica como IBD (doença de Crohn e colite ulcerativa), distúrbios renais, rejeição renal, doença de enxerto versus hospedeiro ou rejeição de transplante, doença intestinal inflamatória, nefropatias crônicas e agudas (incluindo glomerulonefirite proliferativa e doença renal induzida por diabete), síndrome nefrótica, crescimento de massa de tecido anormal ou não desejada (não-cancerosa), obesidade, crescimento de massa de tecido adiposo, juntas hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, inibição de crescimento de cabelo, síndrome de Osler Weber-Rendu, fibroplasias retrolentais de granuloma piogênico, escleroderma, tracoma, adesões vasculares, sinovite, reação de hipersensibilidade da pele, distúrbio da pele incluindo psoríase e dermatite, eczema, fotoenvelhecimento (por exemplo, causado por radiação UV da pele humana), formação de cicatriz hipertrófica, condições reprodutivas como endometriose, síndrome da hiperestimulação ovariana, doença ovariana policística, pré-eclampsia, sangramento uterino disfuncional, ou menometrorragia, fibróides uterinas, parto prematuro, ascite, efusão pericardial (como aquela associada à pericardite), efusão pleural, choque endotóxico e infecção fúngica, certas infecções microbianas, incluindo patógenos microbianos selecionados a partir de adenovírus, hantavírus, Borrelia burgdorferi, Yersinia spp., Bordetella pertussis e distúrbios psiquiátricos (por exemplo, esquizofrenia, depressão bipolar, autismo e distúrbio de déficit de atenção).

[225] Uma "doença respiratória" envolve o sistema respiratório e inclui bronquite crônica, asma, incluindo asma aguda e asma alérgica, fibrose cística, bronquiectasia, rinite alérgica ou outras rinites e sinusites, deficiência alfa 1-antitripsina, tosse, enfisema pulmonar, fibrose pulmonar ou via áreas hiperativas, doença pulmonar obstrutiva crônica e distúrbio pulmonar obstrutivo crônico.

[226] Uma "doença autoimune", aqui, é uma doença ou distúrbio não maligno que surge a partir de e é direcionado contra os próprios tecidos de um indivíduo. Exemplos de doenças ou distúrbios autoimunes incluem, mas não se limitam a, respostas inflamatórias como doenças de pele inflamatórias, incluindo psoríase e dermatite (por exemplo, dermatite atópica e dermatite de contato); escleroderma sistêmico e esclerose; reações associadas à doença intestinal inflamatória (como doença de Crohn e colitite ulcerativa); síndrome da dificuldade respiratória (incluindo síndrome da dificuldade respiratória adulta, ARDS); dermatite; meningite; encefalite; uveite; colite; glomerulonefrite; condições alérgicas como eczema e asma e outras condições envolvendo a infiltração de células T e reações inflamatórias crônicas; aterosclerose; deficiência de adesão de leucócito; artrite reumatóide; lúpus eritematoso sistêmico (SLE); diabetes mellitus (por exemplo, diabetes mellitus do tipo I ou diabetes mellitis dependente de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud; tiroidite auto-imune; encefalomielite alérgica; síndrome de Sjorgen; sintomas precoces de diabetes e reações imunes associadas à hipersensibilidade aguda e atrasada mediada por citoquinas e linfócitos T tipicamente encontrados em tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; anemia perniciosa (doença de Addison); doenças envolvendo diapedese de leucócito; distúrbio inflamatório do sistema nervoso central (SNC); síndrome de trauma de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, mas não limitando a, crioglobinemia ou anemia positiva de Coombs); miastenia grave; doenças mediadas por complexo de antígeno-anticorpo; síndrome do anticorpo anti-membrana basal glomerular; síndrome antifosfolipídica; neurite alérgica; doença de Graves; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; penfigóide bolhoso; pemfigo; poliendocrinopatias autoimunes; doença de Reiter; síndrome da pessoa rígida; doença de Behcet; artrite de célula gigante; nefrite complexa imune; neuropatia de IgA; polineuropatia de IgM; púrpura trombocitopênica imune (ITP) ou trombocitopenia autoimune, etc.

[227] O termo "doença ou distúrbio vascular" aqui se refere às várias doenças ou distúrbios que tem impacto sobre o sistema vascular, incluindo o sistema cardiovascular. Exemplos de tais doenças incluem arteriosclerose, re- obstrução vascular, aterosclerose, estenose vascular pós-cirúrgica, restenose, oclusão vascular ou doença obstrutiva carótida, doença da artéria coronária, angina, doença de vaso pequeno, hipercolesterolemia, hipertensão, e condições que envolvem a proliferação anormal ou função de células epiteliais vasculares.

[228] Conforme usado aqui, “tratamento” (e variações como “tratar” ou “tratando”) refere-se à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou célula sendo tratado, e pode realizar ou para a profilaxe ou durante o curso da patologia clínica. Efeitos de tratamento desejáveis incluem a prevenção da ocorrência ou recorrência de doença, alívio de sintomas, diminuição de qualquer conseqüência patológica direta ou indireta da doença, prevenção de metástase, diminuição da taca de progressão da doença, amelioração ou paliação do estado da doença, e a remissão ou prognostico melhorado. Em algumas modalidades, as variantes IgGs da invenção são usadas para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou distúrbio ou para retardar a progressão de uma doença ou distúrbio.

[229] Um “indivíduo,” “sujeito,” ou “paciente” é um vertebrado. Em certas modalidades, o vertebrado é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não são limitados a, animais de fazenda (como vacas), animais de esporte, bichos de estimação (como gatos, cachorros, e cavalos), primatas, camundongos e ratos. Em certas modalidades, um mamífero é um humano.

[230] O termo “formulação farmacêutica” ou “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em tal forma de modo a permitir que a atividade biológica do ingrediente ativo seja eficaz, e que não contém nenhum componente adicional que seja inaceitavelmente tóxico para um indivíduo ao qual a formulação seria administrada. Tais formulações podem ser estéreis. Consultar, também a seção intitulada Dosagens, Formulações, e Duração.

[231] Uma formulação “estéril” é asséptica ou isenta de todos os microorganismos vivos e seus esporos.

[232] O termo “quantidade eficaz” ou “quantidade terapeuticamente eficaz” refere-se a uma quantidade de uma droga eficaz para tratar uma doença ou distúrbio em um indivíduo. Em certas modalidades, uma quantidade eficaz refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessário, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma substância/molécula da invenção pode variar de acordo com fatores como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e a habilidade da substância/molécula de elicitar uma reação desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz abrange uma quantidade na qual quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais da substância/molécula tem menor importância que os efeitos terapeuticamente benéficos. No caso de câncer, a quantidade eficaz da droga pode reduzir o número de células cancerosas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, retardar até certo ponto e tipicamente parar) a infiltração de célula cancerosa em órgãos periféricos; inibir (isto é, retardar até certo ponto e tipicamente parar) a metástase de tumor; inibir, até certo ponto, o crescimento de tumor, permitir o tratamento do tumor, e/ou aliviar até certo ponto um ou mais sintomas associados ao distúrbio. Ate o ponto em que a droga pode evitar o crescimento e/ou matar células cancerosas existentes, ela pode ser citostática e/ou citotóxica.

[233] Uma "quantidade profilaticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz a dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, já que uma dose profilática é usada em indivíduos anteriormente a ou em um estágio precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz seria menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.

[234] No caso de tumores pré-cancerosos, benignos ou em estágio inicial ou em estágio avançado, a quantidade terapeuticamente eficaz do inibidor angiogênico pode reduzir o número de células cancerosas, reduzir o tamanho primário do tumor, inibir (isto é, retardar até certo ponto e, preferivelmente, parar) a infiltração de célula cancerosa em órgãos periféricos; inibir (isto é, retardar até certo ponto e, preferivelmente, parar) a metástase do tumor; inibir ou atrasar, até certo ponto, o crescimento do tumor ou a progressão do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio. Até o ponto em que a droga pode evitar o crescimento e/ou matar células cancerosas existentes, ela pode citostática e/ou citotóxica.

[235] O termo “eficácia” é usado aqui no sentido mais amplo e se refere à habilidade da imunoglobulina, do anticorpo ou da proteína de fusão Fc de produzir um efeito desejado. Em certas modalidades, a eficácia se refere ao efeito máximo observado de uma imunoglobulina, anticorpo ou proteína de fusão Fc em níveis de saturação. Em certas modalidades, a eficácia se refere à EC50 de uma imunoglobulina, anticorpo ou proteína de fusão Fc. Em certas modalidades, a eficácia se refere à potência de uma imunoglobulina, anticorpo ou proteína de fusão Fc. Em certas modalidades, a eficácia se refere à habilidade de uma imunoglobulina, anticorpo ou proteína de fusão Fc de produzir efeitos benéficos no curso ou duração de uma doença, incluindo benefício clínico, conforme definido aqui.

[236] O termo “EC50” refere-se à concentração de uma imunoglobulina, anticorpo ou proteína de fusão Fc que induz uma reação entre a linha de base e o máximo. Em certas modalidades, a EC50 representa a concentração de uma imunoglobulina, anticorpo ou proteína de fusão Fc em que 50% de seu efeito máximo é observado. Em certas modalidades, a EC50 representa a concentração de plasma ou soro exigida para se obter 50% do efeito máximo in vivo.

[237] A eficácia no tratamento do câncer pode ser demonstrada ao se detectar a habilidade de um anticorpo, de uma proteína de fusão, de uma molécula conjugada, ou de uma composição da invenção para inibir ou reduzir o crescimento ou a metástase e as células cancerosas ou para melhorar ou aliviar um ou mais sintomas associados ao câncer. O tratamento é considerado terapêutico se houver, por exemplo, uma redução no crescimento ou metástase de células cancerosas, melhora de um ou mais sintomas associados ao câncer, ou uma diminuição na mortalidade e/ou morbidade seguindo a administração de um anticorpo, uma proteína de fusão, uma molécula conjugada, ou uma composição da invenção. Anticorpos, proteínas de fusão ou composições da invenção podem ser testados por sua habilidade de reduzir a formação de tumor em ensaios in vitro, ex vivo, e in vivo. Para terapia de câncer, a eficácia in vivo pode, por exemplo, ser, também, medida ao se avaliar a duração de sobrevivência, o tempo para a progressão da doença (TTP), as taxas de reação (RR), a duração da reação, e/ou a qualidade de vida. Consultar, também a seção intitulada Eficácia do Tratamento.

[238] A eficácia no tratamento de distúrbios inflamatórios pode ser demonstrada ao detectar a habilidade de um anticorpo, uma proteína de fusão, uma molécula conjugada, ou uma composição da invenção para reduzir ou inibir a inflamação em um animal ou para melhorar ou aliviar um ou mais sintomas associados a um distúrbio inflamatório. O tratamento é considerado terapêutico se houver, por exemplo, uma redução em uma inflamação ou melhora de um ou mais sintomas seguindo a administração de um anticorpo, uma proteína de fusão, uma molécula conjugada, ou uma composição da invenção.

[239] A eficácia no tratamento ou prevenção de infecção viral pode ser demonstrada ao detectar a habilidade de um anticorpo, uma proteína de fusão, uma molécula conjugada, ou uma composição da invenção para inibir a replicação do vírus, para inibir a transmissão ou evitar que o vírus se estabeleça sem seu hospedeiro, ou para evitar, melhorar ou aliviar um ou mais sintomas associados à infecção viral. O tratamento é considerado terapêutico se houver, por exemplo, uma redução na carga viral, uma melhora de um ou mais sintomas ou uma diminuição na mortalidade e/ou morbidade seguindo a administração de um anticorpo, uma proteína de fusão, uma molécula conjugada, ou uma composição da invenção. Anticorpos, proteínas de fusão, moléculas conjugadas ou composições da invenção também podem ser testados por suas habilidades de inibição de replicação viral ou redução de carga viral em ensaios in vitro e in vivo.

[240] A eficácia no tratamento ou na prevenção de infecção bacteriana pode ser demonstrada ao se detectar a habilidade de um anticorpo, uma proteína de fusão ou uma composição da invenção de inibir a replicação bacteriana, ou de prevenir, melhorar ou aliviar um ou mais sintomas associados à infecção bacteriana. O tratamento é considerado terapêutico se houver, por exemplo, uma redução nos números bacterianos, uma melhora de um ou mais sintomas ou uma diminuição na mortalidade e/ou morbidade seguindo a administração de um anticorpo, uma proteína de fusão ou uma composição da invenção.

[241] O beneficio clínico pode ser medido ao se avaliar vários objetivos, por exemplo, a inibição, até certo ponto, da progressão da doença, incluindo o retardamento e a total parada; a redução no número de episódios e/ou sintomas da doença; a redução no tamanho da lesão; inibição (isto é, a redução, o retardamento ou a completa parada) da infiltração da célula doente em órgãos periféricos adjacentes e/ou tecidos; a inibição (isto é, a redução, o retardamento ou a completa parada) do espalhamento da doença; a diminuição de reação auto-imune, que pode, mas não tem que, resultar na regressão ou ablação da lesão da doença; alívio, até certo ponto, de um ou mais sintomas associados ao distúrbio; aumento, no alcance de apresentação isenta de doença seguindo o tratamento, por exemplo, uma sobrevivência livre de progressão; sobrevivência aumentada, no geral; maior taxa de reação e/ou mortalidade reduzida, em um dado ponto do tempo seguindo o tratamento.

[242] "Reduzir ou inibir" é diminuir ou reduzir uma atividade, função, e/ou quantidade, se comparado a uma referencia. Em certas modalidades, “reduzir ou inibir” é tido como a habilidade de causar uma diminuição geral de 20% ou mais. Em outra modalidade, “reduzir ou inibir” significa a habilidade de causar uma diminuição geral de 50% ou mais. Em ainda outra modalidade, “reduzir ou inibir” significa a habilidade de causar uma diminuição geral de 75%, 85%, 90%, 95%, ou maior. A redução ou inibição podem se referir aos sintomas do distúrbio sendo tratado, à presença ou tamanho da metástase, ao tamanho do tumor primário, ou ao tamanho do número de vasos sanguíneos em distúrbios angiogênicos.

[243] Um câncer “operável” é o câncer que está confinado ao órgão primário e é adequado para cirurgia.

[244] A “sobrevivência” refere-se ao paciente que permanece vivo e inclui a sobrevivência livre de doença (DFS), sobrevivência livre de progressão (PFS) e sobrevivência geral (OS). A sobrevivência pode ser estimada pelo método Kaplan-Meier, e quaisquer diferenças na sobrevivência são computadas com o uso do teste log-rank estratificado.

[245] “Sobrevivência livre de doença (DFS)” refere-se ao paciente que permanece vivo, sem a volta do câncer, por um período de tempo definido, como cerca de 1 ano, cerca de 2 anos, cerca de 3 anos, cerca de 4 anos, cerca de 5 anos, cerca de 10 anos, etc., a partir do início do tratamento ou do diagnóstico inicial. Em um aspecto da invenção, DFS é analisado de acordo com o princípio de intenção de tratamento, isto é, pacientes são avaliados ao longo de sua terapia designada. Os eventos usados na análise de DFS podem incluir a recorrência local, regional e distante do câncer, ocorrência de câncer secundário e morte de qualquer causa em pacientes sem um evento anterior (por exemplo, recorrência de câncer de mama ou segundo câncer primário).

[246] “Sobrevivência geral” refere-se ao paciente que permanece vivo por um determinado período de tempo, como cerca de 1 ano, cerca de 2 anos, cerca de 3 anos, cerca de 4 anos, cerca de 5 anos, cerca de 10 anos, etc., a partir do início do tratamento ou a partir do diagnóstico inicial.

[247] “Sobrevivência estendida” significa aumentar a DFS e/ou OS em um paciente tratado em relação a um paciente não tratado, ou em relação a um protocolo de tratamento de controle, como um tratamento apenas com o agente quimioterápico. A sobrevivência é monitorada por pelo menos seis meses, ou em pelo menos cerca de 1 ano, ou pelo menos cerca de 2 anos, ou pelo menos cerca de 3 anos, ou pelo menos cerca de 4 anos, ou em pelo menos cerca de 5 anos, ou em pelo menos cerca de 10 anos, etc., seguindo o início do tratamento ou seguindo o diagnostico inicial.

[248] O termo “simultaneamente” é usado, aqui, para se referir à administração de dois ou mais agentes terapêuticos, onde pelo menos parte da administração sobrepõe em tempo. Em conformidade, a administração simultânea inclui um regime de dosagem quando a administração de um ou mais agente(s) continua após descontinuas a administração de um ou mais outro(s) agente(s).

[249] “Monoterapia” significa um regime terapêutico que inclui apenas um único agente terapêutico para o tratamento de câncer ou tumor durante o curso do período de tratamento. Em certas modalidades, a monoterapia com o uso de uma variante IgG significa que a variante IgG é administrada na ausência de uma terapia anti-câncer adicional durante aquele período de tratamento.

[250] “Terapia de manutenção” significa um regime terapêutico que é dado para reduzir a probabilidade de recorrência ou progressão de doença. A manutenção de terapia pode ser fornecida por qualquer período de tempo, incluindo períodos de tempo estendidos até a expectativa de vida do indivíduo. A terapia de manutenção pode ser fornecida após uma terapia inicial ou em conjunto com terapias iniciais ou adicionais. As dosagens usadas para a terapia de manutenção podem variar e podem incluir dosagens diminuídas se comparadas às dosagens usadas para outros tipos de terapia.

[251] “Terapia neoadjuvante” ou “terapia pré-operatória” no presente documento referem-se à terapia dada anteriormente à cirurgia. O objetivo de terapia neoadjuvante é fornecer tratamento sistêmico imediato, potencialmente erradicando micrometastases que, de outro modo, proliferariam se a sequência padrão de cirurgia seguida por terapia sistêmica fosse seguido. A terapia neoadjuvante também pode ajudar a reduzir o tamanho do tumor permitindo a resseção completa de tumores inicialmente irresseçáveis ou preservando as porções do órgão e suas funções. Além disso, a terapia neoadjuvante permite uma avaliação in vivo da eficácia da droga, que pode guiar a escolha e tratamentos subseqüentes.

[252] “Terapia adjuvante” no presente documento, se refere à terapia dada após a cirurgia, onde nenhuma evidência de doença residual pode ser detectada, de modo a reduzir o risco de recorrência de doença. O objetivo de terapia adjuvante é evitar a recorrência do câncer, e, portanto, reduzir a chance de morte ligada ao câncer.

[253] Aqui, a quimioterapia de “padrão de cuidado” se refere aos agentes quimioterápicos usados para tratar um câncer particular.

[254] “Cirurgia definitiva” é usado como é usado na comunidade médica. A cirurgia definitiva inclui, por exemplo, procedimentos, cirúrgicos ou não, que resultam na remoção ou resseção do tumor, incluindo aqueles que resultam na remoção ou resseção de todo o tumor em geral. A cirurgia definitiva inclui, por exemplo, a resseção completa ou curativa ou resseção geral completa do tumor. A cirurgia definitiva inclui procedimentos que ocorrem em um ou mais estágios, e incluem, por exemplo, procedimentos cirúrgicos de múltiplos estágios, onde um ou mais procedimentos cirúrgicos ou não são realizados anteriormente à resseção do tumor. A cirurgia definitiva inclui procedimentos para remover ou operar o tumor que inclui órgãos envolvidos, partes de órgãos e tecidos, assim como órgãos circundantes, como nódulos linfáticos, partes de órgãos, ou tecidos.

[255] A administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui a administração simultânea (concomitante) e consecutiva em qualquer ordem.

[256] A administração "crônica" se refere à administração de agente(s) em um modo contínuo, em oposição a um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período de tempo estendido. Administração “intermitente” é o tratamento que não é consecutivamente feito sem interrupção, mas, em vez disso, é cíclico em sua natureza.

[257] "Veículos", conforme usado aqui, incluem veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ou estabilizantes que são não tóxicos à célula ou ser mamífero exposto aos mesmos a dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente, o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de pH aquosa. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos que cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina sérica, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; alcoóis de açúcar como manitol ou sorbitol; contraíons formadores de sal como sódio; e/ou tensoativos não iônicos como TWEEN™, polietileno glicol (PEG), e PLURONICS™.

[258] Um "lipossoma" é uma pequena vesícula composta de vários tipos de lipídios, fosfolipídios e/ou tensoativos que são uteis para a aplicação de uma droga (como uma IgG variante) a um mamífero. Os componentes do lipossomo são comumente dispostos em uma formação de camada dupla, similar à disposição de lipídio de membranas biológicas.

[259] O termo “composição anti-neoplásica” refere-se a uma composição útil no tratamento de câncer que compreende pelo menos um agente terapêutico ativo, por exemplo, “agente anti-câncer.” Exemplos de agentes terapêuticos (agentes anti-câncer) incluem, mas são limitados a, por exemplo, agentes quimioterápicos, agentes inibidores de crescimento, agentes citotóxicos, agentes usados na terapia de radiação, agentes anti-angiogênese, agentes apoptóticos, agentes anti-tubulina, e outros agentes para tratar câncer, como anticorpos anti-HER-2, anticorpos anti-CD20, um antagonista de receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR) (por exemplo, um inibidor de tirosina quinase), inibidor de HER1/EGFR (por exemplo, erlotinibe (TARCEVA®), inibidores de fator de crescimento derivado de plaquetas (por exemplo, GLEEVEC® (Imatinibe Mesilato)), um inibidor de COX-2 (por exemplo, celecoxibe), interferonas, citoquinas, antagonistas (por exemplo, anticorpos neutralizadores) que aglutinam a um ou mais do(s) seguinte(s) receptor(es) alvo ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA ou VEGF, TRAIL/Apo2, e outros agentes químicos orgânicos e bioativos, etc. Combinações dos mesmos também estão incluídas na invenção.

[260] O termo "agente citotóxico”, conforme é usado aqui, refere-se a uma substância que inibe ou previne uma função celular e/ou leva à morte ou destruição celular. O termo é intencionado a incluir isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos (por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcalóides de vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucil, daunorubicina ou outros agentes intercalados, anzimas e fragmentos das mesmas, como enzimas nucleolíticas, antibióticos, e toxinas, como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos, e os vários agentes anti- câncer ou anti-tumor apresentados abaixo. Outros agentes citotóxicos são descritos abaixo. Um agente tumoricida causa a destruição de células de tumor. Em certas modalidades, a variante IgG pode ser conjugada com um agente citotóxico.

[261] Uma “toxina” é qualquer substancia capaz de ter um efeito prejudicial no crescimento ou proliferação de uma célula.

[262] Um "agente quimioterápico" eu um composto químico útil no tratamento de câncer. Os exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes de alquilação, como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN®); alquilsulfonatos como busulfano, improsulfano e piposulfano; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenofosforamida, trietilenetiofosforamida e trimetilomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecano, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, scopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo sua adozelesina, carzelesina e bizelesina análogos sintéticos); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposídeo; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficinas 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio como clorambucil, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, ácido de cloridretro de mecloretamina, melfalano, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrosouréias como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos como os antibióticos de enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama1I e caliqueamicina ômegaI1 (consultar, por exemplo, Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183 a 186 (1994)); CDP323, um inibidor de alfa-4-integrina oral; dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; assim como neocarzinostatina cromoforo e cromóforos antibióticos de enedina de cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluindo ADRIAMICINA®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino- doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, injeção de lipossoma doxorrubicina HCl (DOXIL®), doxorrubicina lipossomal TLC D-99 (MYOCET®), doxorrubicina lipossomal peglilatada (CAELYX®), e deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitas como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®), tegafur (UFTORAL®), capecitabina (XELODA®), uma epotilona, e 5-fluorouracil (5-FU); combretastatina; análogos de ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais como aminoglutotimida, mitotano, trilostano; regenerador de ácido fólico, como ácido frolínico, aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracila; amsacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; um epotilona; etoglucídio; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinano; lonidainina; maitansinóides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenameta; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2’-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo (“Ara-C”); tiotepa; taxóide, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®), formulação de nanopartícula projetada com albumina de paclitaxel (ABRAXANETM), e docetaxel (TAXOTERE®); cloranbucila; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platina como cisplatina, oxaliplatina (por exemplo, ELOXATIN®), e carboplatina; vincas, que evitam que a polimerização de tubulina forme microtúbulos, incluindo vinblastina (VELBAN®), vincristina (ONCOVIN®), vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®), e vinorelbina (NAVELBINE®); etoposídeo (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides como ácido retinóico, incluindo bexaroteno (TARGRETIN®); bisfosfonatos como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE-58095, ácido zoledrônico /zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®), ou risedronato (ACTONEL®); troxacitabina (a análogo de citosina nucleosídeo de 1,3-dioxolano); oligonucleotídeos anti- sentido, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em trajetos de sinalização implicados em proliferação celular anormal, como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras, e receptor de fator de crescimento epidérmico (EGF-R) (por exemplo, erlotinibe (TARCEVA®)); e VEGF-A que reduzem a proliferação celular; vacinas como a vacina THERATOPE®, e vacinas de terapia de gene, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; inibidor de topoisomerase 1 (por exemplo, LURTOTECAN®); rmRH (por exemplo, ABARELIX®); BAY439006 (sorafenibe; Bayer); SU-11248 (sunitinibe, SUTENT®, Pfizer); perifosina, inibidor de COX-2 (por exemplo celecoxibe ou etoricoxibe), inibidor de proteosoma (por exemplo PS341); bortezomibe (VELCADE®); CCI-779; tipifarnibe (R11577); orafenibe, ABT510; inibidor de Bcl- 2, como oblimersen de sódio (GENASENSE®); pixantrona; inibidores de EGFR; inibidores de tirosina quinase; inibidores de serina-treonina quinase como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®); inibidores de farnesiltransferase, como lonafarnibe (SCH 6636, SARASARTM); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um daqueles acima; bem como combinações de dois ou mais daqueles mencionados acima, como CHOP, uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina, e prednisolona; e FOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATINTM) combinada a 5-FU e leucovorina, e saias farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um daqueles acima; como as combinações de dois ou mais dos acima.

[263] Os agentes quimioterápicos, conforme definido aqui, incluem “agentes anti-hormonais” ou “terapêuticos endócrinos” que agem para regular, reduzir, bloquear, ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimento do câncer. Eles podem ser hormônios em si, incluindo, mas não limitando a: anti-estrogênios e moduladores de receptor de estrogênio seletivo (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifeno NOLVADEX®), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, e FARESTON^ toremifeno; inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais, como, por exemplo, 4(5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestania, fadrozole, vorozole RIVISOR®, letrozole FEMARA®, e anastrozole ARIMIDEX®; e anti-andrógenos, como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e goserelina; assim como troxacitabina (um análogo de citosina de nucleotídeo 1,3-dioxolano); oligonucleotídeos de anti-sentido, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes em trajetos de sinalização implicados na proliferação de célula anormal, como, por exemplo, PKC-alfa, Raf e H-Ras; ribozimas como um inibidor de expressão de VEGF (por exemplo, ribozima ANGIOZYME®) e um inibidor de expressão HER2; as vacinas como vacinas de terapia genética, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inibidor de topoisomerase 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; Vinorelbina e Esperamicinas (consultar U.S. Pat. N° 4,675,187), e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos, ou derivados de quaisquer dos acima, assim como combinações de dois ou mais dos mencionados acima.

[264] Um "agente inibidor de crescimento" quando usado aqui refere-se a um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula (como uma célula que expressa VEGF) ou in vitro ou in vivo. Portanto, o agente inibidor de crescimento pode ser um que reduza significativamente o percentual de células (como uma célula que expressa VEGF) na fase S. Exemplos de agentes inibidores de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão de ciclo de célula (em um lugar diferente de fase S), como agentes que induzem o sequestro de G1 e sequestro de fase M. OS bloqueadores de fase M clássicos incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos, e inibidores de topoisomerase II como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposídeo, e bleomicina. Aqueles agentes que seqüestram G1 também são derrubados no sequestro de fase S, por exemplo, agentes de alquilação de DNA, como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5- fluorouracil, e ara-C. informações adicionais podem ser encontradas em Mendelsohn e Israel, eds., The Molecular Basis of Cancer, Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, e antineoplastic drugs" por Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), por exemplo, p. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são drogas anti-câncer, ambas derivadas do teixo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a montagem de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam microtúbulos ao evitar a despolimerização, que resulta na inibição de mitose nas células.

[265] “Terapia de radiação” quer dizer o uso de raios gama ou raios beta direcionados para induzir danos o suficiente a uma célula de modo a limitar sua habilidade de funcionar normalmente ou de destruir a célula como um todo. Será apreciado que existirão muitas maneiras conhecidas na técnica de determinar a dosagem e a duração do tratamento. Tratamentos típicos são dados como uma administração única e as dosagens típicas variam de 10 a 200 unidades (Grays) por dia.

[266] A "patologia" de uma doença inclui todos os fenômenos que compreendem o bem estar do paciente. Para câncer, isso inclui, sem limitação, crescimento celular anormal e incontrolável, metástase, interferência com o funcionamento normal de células vizinhas, liberação de citoquinas ou outros produtos secretórios em níveis anormais, supressão ou agravação de reação inflamatória ou imunológica, etc.

[267] Uma “molécula pequena” é definida aqui para ter um peso molecular abaixo de 500 Daltons.

[268] O termo “infusão intravenosa” refere-se à introdução de uma droga na veia de um paciente animal ou humano por um período de tempo maior que aproximadamente 5 minutos, de preferência entre aproximadamente 30 a 90 minutos, embora, de acordo com a invenção, a infusão intravenosa seja alternativamente administrada por 10 horas ou menos.

[269] O termo “bolus intravenoso” ou “injeção rápida” refere-se à administração de droga na veia de um animal ou humano de modo que o corpo receba a droga em aproximadamente 15 minutos ou menos, de preferência 5 minutos ou menos.

[270] O termo “administração subcutânea” refere-se à introdução de uma droga sob a pele de um paciente animal ou humano, de preferência em um bolso entre a pele e o tecido subjacente, através da aplicação relativamente lenta, sustentada a partir de um receptáculo de droga. O bolso pode ser criado por beliscar ou levantar a pele e afastá-la do tecido subjacente.

[271] O termo “infusão subcutânea” refere-se à introdução de uma droga abaixo da pele de um paciente animal ou humano, de preferência no interior de um bolso entre a pele e o tecido subjacente através da aplicação relativamente lenta, sustentada a partir de um receptáculo de droga por um período de tempo, incluindo, mas não se limitando a, 30 minutos ou menos, ou 90 minutos ou menos. Opcionalmente, a infusão pode ser feita a partir do implante subcutâneo de uma bomba de aplicação de droga implantado sob a pele do paciente animal ou humano, em que a bomba aplica uma quantidade pré-determinada de droga por um período de tempo pré-determinado, como 30 minutos, 90 minutos, ou um período de tempo que atravessa o todo o regime de tratamento.

[272] O termo “bolus subcutâneo” refere-se à administração de droga sob a pele de um paciente animal ou humano, onde a aplicação de droga de bolus é, de preferência, menor que aproximadamente 15 minutos, com mais preferência, menor que 5 minutos, e, com maior preferência ainda, menor que 60 segundos. A administração é, de preferência, em um bolso entre a pele e o tecido subjacente, onde o bolso é criado, por exemplo, ao beliscar ou a levantar a pele e depois afastá-la , do tecido subjacente.

[273] A palavra “marcador”, quando usada aqui, refere-se a um composto detectável ou a uma composição que é conjugada diretamente ou indiretamente ao polipeptídeo. O marcador pode ser, em si, detectável (por exemplo, marcadores de radioisótopo ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que é detectável. ANTICORPOS

[274] Os anticorpos são proteínas que apresentam especificidade de ligação a um antígeno específico. Anticorpos nativos são, normalmente, glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto o numero de ligações de dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de isótipos diferentes de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também pode ser pontes de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domínio variável (VH) seguido de um número de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante em sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que resíduos de aminoácido particulares formam uma interface entre os domínios variáveis de cadeia pesada e leve.

[275] Dependendo da seqüência de aminoácido da região constante das cadeias pesadas, os anticorpos ou imunoglobulinas podem ser designados a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e diversas delas podem ser, ainda, divididas em subclasses (isótipos), por exemplo IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4; IgA1 e IgA2. Uma variedade de alótipos humanos IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 foi descrita (revista por M.-P. LeFranc e G. LeFranc in: "The Human IgG Subclasses," F. Shakib (ed.), pp. 43 a 78, Pergamon Press, Oxford (1990)). Os diferentes isótipos da classe IgG, incluindo lgG1, lgG2s, lgG3, e lgG4, têm propriedades físicas, biológicas e clinicas únicas. O IgG1 humano é o anticorpo mais comumente usado para fins terapêuticos, e a maioria dos estudos de engenharia foi construída nesse contexto.

[276] O presente pedido é direcionado às imunoglobulinas variantes IgG que incluem modificações de aminoácido que alteram as propriedades biológicas do IgG. As imunoglobulinas variantes do presente pedido incluem anticorpos que compreendem uma região Fc modificada que exibe meias-vidas mais longas in vivo se comparadas aos anticorpos de tipo selvagem.

[277] Em certas modalidades, a meia-vida de um IgG variante da presente invenção é aumentada em pelo menos 50% se comparado à meia-vida do IgG que tem a região IgG Fc humana de tipo selvagem. Em certas modalidades, a meia-vida de um IgG variante da presente invenção é aumentada em pelo menos 75%, se comparada à meia-vida do IgG que tem a região IgG Fc humana de tipo selvagem. Em certas modalidades, a meia-vida de um IgG variante da presente invenção é aumentada em pelo menos 100% se comparada à meia-vida do IgG variante da região de IgG Fc humano de tipo selvagem.

[278] Em certas modalidades, a meia-vida de um IgG variante da presente invenção é de pelo menos cerca de 15 dias. Em certas modalidades, a meia-vida de um IgG variante da presente invenção é de pelo menos cerca de 20 dias. Em certas modalidades, a meia-vida de um IgG variante da presente invenção é de pelo menos cerca de 25 dias. Em certas modalidades, a meia-vida de um IgG variante da presente invenção é de pelo menos cerca de 30 dias. Em certas modalidades, a meia-vida de um IgG variante da presente invenção é de pelo menos cerca de 35 dias. Em certas modalidades, a meia-vida de um IgG variante da presente invenção é de pelo menos cerca de 40 dias. Em certas modalidades, o IgG variante é IgG1 variante.

[279] Em certas modalidades, a meia-vida do IgG variante da presente invenção é a meia-vida conforme medida em humanos. Em certas modalidades, a meia-vida do IgG variante da presente invenção é a meia-vida conforme medida em macacos cinomolgo.

FRAGMENTOS DE ANTICORPO

[280] A presente invenção abrange fragmentos de anticorpo. São de interesse particular anticorpos que compreendem regiões Fc, fusões Fc e a região constante da cadeia pesada. Em certas modalidades, os fragmentos de anticorpo são os fragmentos de imunoglobulinas variantes (IgGs) que compreendem regiões Fc. Os fragmentos de anticorpo podem ser gerados por meios tradicionais, como uma digestão enzimática, ou por técnicas tecombinantes.

[281] As varias técnicas foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentos foram derivados através de digestão proteolíticas de anticorpos intactos (consultar, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical e Biophysical Methods 24:107 a 117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem, agora, ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Os fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv podem, todos, ser expressos em e secretados a partir de E. coli, permitindo, assim, a produção facilitada de grandes quantidades desses fragmentos. Os fragmentos de anticorpo podem ser isolados das bibliotecas de fago de anticorpo. Em certas modalidades, fragmentos de Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente acoplados para formar fragmentos de F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163 a 167 (1992)). De acordo com uma outra abordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de células hospedeiras recombinantes. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo ficarão aparentes ao profissional versado na técnica. O fragmento de anticorpo pode, também, ser um "anticorpo linear", por exemplo, conforme descrito em U.S. Pat. N° 5.641.870, por exemplo. Tais anticorpos lineares podem ser monoespecíficos ou biespecíficos. ANTICORPOS HUMANIZADOS

[282] A invenção abrange anticorpos humanizados. Em certas modalidades, os anticorpos humanizados são IgGs variantes humanizados com uma ou mais modificações de aminoácidos na região Fc em relação ao IgG de tipo selvagem. Os vários métodos para humanizar anticorpos não humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos noj mesmo a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácido não humanos são frequentemente chamados de resíduos "importados”, que são tipicamente tirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e colegas (Jones et al. (1986) Nature 321:522 a 525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323 a 327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534 a 1536), ao substituir as seqüências de região hipervariável pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Em conformidade, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente U.S. N° 4.816.567) em que substancialmente menos que um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são, tipicamente, anticorpos nos quais alguns resíduos de região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedor.

[283] A escolha por domínios variáveis humanos, ambos o leve e o pesado, a serem usados na fabricação dos anticorpos humanizados pode ser importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método do "melhor ajuste", a sequência do domínio variável de um anticorpo de roedor é triada com base em toda a biblioteca de sequências de domínio humano variável conhecidas. A sequência humana que é mais próxima à do roedor é, então, aceita como moldura humana para o anticorpo humanizado. Consultar, por exemplo, Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Outro método usa uma moldura particular derivada da sequência de consenso de todo os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma moldura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes. Consultar, por exemplo, Carter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol., 151:2623.

[284] É, ainda, em geral, desejável que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para alcançar esse objetivo, de acordo com um método, os anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceituais com o uso de modelos tri-dimensionais das sequências parentais e humanizadas. Os modelos de imunoglobulina tri-dimensionais são comumente disponíveis e são familiares àqueles versados na técnica. Os programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tri-dimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas estão disponíveis. A inspeção dessas exibições permite a análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influencia a habilidade da imunoglobulina candidata de aglutinar seu antígeno. Dessa forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir do recipiente e impostar sequências de modo que a característica de anticorpo desejada, como afinidade aumentada do(s) antígeno(s) alvo, seja alcançada. Em geral, os resíduos da região hipervariável são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência sobre a ligação de antígeno. ANTICORPOS HUMANOS

[285] Em certas modalidades, os anticorpos humanos da presente invenção são IgGs variantes humanos com uma ou mais modificações de aminoácido na região Fc em relação ao IgG de tipo selvagem. Os anticorpos humanos podem ser construídos ao se combinar a(s) sequência(s) de domínio variável de clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição de fago derivadas de humano com sequência(s) de domínio constante(s) humana(s) conhecida(s), conforme descrito acima. Alternativamente, os anticorpos monoclonais humanos podem ser feitos pelo método do hibridoma. As linhagens de célula de mieloma humano e o heteromileoma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Anticorpo Production Techniques e Applications, pp. 51 a 63 (Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).

[286] Hoje é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigota do gene de região de união de cadeia pesada de anticorpo (JH) em camundongos mutantes de linhagem germinativa e quimérica resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência do arranjo de gene de imunoglobulina de linha germinativa humana em tais camundongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante o desafio antígeno. Consultar, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol., 7: 33 (1993).

[287] A mistura de gene também pode ser usada para derivar anticorpos humanos a partir de anticorpos não humanos, por exemplo, de roedores, onde o anticorpo humano tem afinidades e especificidades similares ao anticorpo não humano de início. De acordo com esse método, que também é chamado de "imprinting genômico de epítopo", a região variável ou de cadeia pesada ou de cadeia leve de um fragmento de anticorpo não humano obtido por técnicas de exibição de fago, conforme descrito aqui, é substituída por um repertório de genes de domínio V humanos, criando uma população de scFv de cadeia não humana/cadeia humana ou Fab quiméricos. A seleção com resultados antígenos no isolamento de um scFv ou Fab quimérico de cadeia não humana/cadeia humana em que a cadeia humana restaura o sítio de ligação de antígeno destruído mediante a remoção da cadeia não humana correspondente no clone de exibição de fago primário, isto é, o epítopo governa (imprime) a escolha do parceiro de cadeia humana. Quando o processo é repetido para que se substitua a cadeia não humana remanescente, um anticorpo humano é obtido (consultar PCT WO 93/06213 publicada em 1 de abril de 1993). Diferentemente da humanização tradicional de anticorpos não humanos por enxerto de CDR, essa técnica fornece humanos completamente humanos que não tem resíduos de FR ou CDR de origem não humana.

ANTICORPOS BIESPECÍFICOS

[288] Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos são anticorpos biespecíficos com uma ou mais modificações de aminoácido na região Fc em relação ao anticorpo de tipo selvagem. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos são anticorpos humanos ou humanizados. Em certas modalidades, uma das especificidades de ligação é para VEGF e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos podem aglutinar a dois epítopos diferentes de VEGF. Os anticorpos biespecíficos podem, também, ser usados para localizar os agentes citotóxicos para células que expressam VEGF. Esses anticorpos possuem um braço de ligação de VEGF e um braço que aglutina a um agente citotóxico, como, por exemplo, saporina, anti-interferona-α, alcalóide da vinca, cadeia de ricina A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo. Em certos anticorpos, as especificidades de ligação são para IL-4 e IL-13. Os anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpo que compreendem a região Fc.

[289] Métodos para fazer anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos e baseada na co-expressão de dois pares de cadeia leva-cadeia pesada de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Devido à classificação aleatória de cadeias leves e pesadas de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de 10 moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é normalmente feita por etapas de cromatografia de afinidade, é, na verdade, inconveniente, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são apresentados em WO 93/08829 publicada em 13 de maio de 1993, e em Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655 (1991).

[290] De acordo com uma abordagem diferente, os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpo-antígeno) são fundidas às sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão, por exemplo, é com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina que compreende pelo menos parte da dobradiça, regiões CH2, e CH3. Em certas modalidades, a primeira região constante de cadeia pesada (CH1), que contém o sítio necessário par a ligação de cadeia leve, está presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que encodificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são co-transfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso propicia grande flexibilidade no ajuste de proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeo em modalidades quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeo usadas na construção fornecem os rendimentos ótimos. É, entretanto, possível inserir as sequencias de codificação para dois ou todos as três cadeias de polipeptídeo em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeo em razoes iguais resultam em rendimentos altos ou quando as razões não têm nenhuma significância particular.

[291] Em uma modalidade dessa abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina híbrida (fornecendo uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Encontrou-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, já que a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica propicia uma maneira fácil de separação. Essa abordagem é apresentada em WO 94/04690. Para mais detalhes da geração de anticorpos biespecíficos, consultar, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

[292] De acordo com outra abordagem, a interface entre um par de moléculas de anticorpo pode ser projetada para maximizar o percentual de heterodímeros que são recuperados da cultura de célula recombinante. A interface compreende pelo menos uma parte do domínio CH3 de um domínio constante de anticorpo. Nesse método, uma ou mais pequenas cadeias laterais de aminoácido da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). “Cavidades” compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas na interface da segunda molécula de anticorpo ao substituir cadeias laterais grandes de aminoácido por cadeias menores (por exemplo alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo para aumentar o rendimento de um heterodímero sobre o de outros produtos finais indesejados como homodímeros.

[293] Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina, o outro à biotina. Tais anticorpos foram, por exemplo, propostos para direcionar células do sistema imunológico a células indesejadas (Patente US N° 4.676.980), e para o tratamento de infecção com HIV (WO 91/00360, WO 92/00373, e EP 03089). Os anticorpos heteroconjugados podem ser feitos com o uso de qualquer método de reticulação conveniente. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica, e são apresentados na Patente US N° 4.676.980, junto com inúmeras técnicas de reticulação.

[294] A tecnologia de "diacorpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para fazer fragmentos de anticorpo biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (VL) por um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Em conformidade, os domínios VH e VL de um fragmento são forçados a parear com os domínios complementares VL e VH de outro fragmento, formando, assim, dois sítios de ligação de antígeno. Outra estratégia para fazer fragmentos de anticorpo biespecífico pelo uso de dímeros Fv (sFv) de cadeia única também foi relatada. Consultar Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

[295] Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). ANTICORPOS MULTIVALENTES

[296] Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rápido que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno ao qual os anticorpos aglutinam. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (que são diferentes daqueles da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser prontamente produzidos pela expressão recombinante de ácido nucléico encodificando as cadeias de polipeptídeo do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação de antígeno. Em certas modalidades, o domínio de dimerização compreende (ou consiste em) uma região Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo compreenderá uma região Fc e três ou mais amino-terminais de sítios de ligação de antígeno à região Fc. Em certas modalidades, um anticorpo multivalente compreende (ou consiste em) três a cerca de oito sítios de ligação de antígeno. Em tal modalidade, um anticorpo multivalente compreende (ou consistem em) quatro sítios de ligação de antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia de polipeptídeo (por exemplo, duas cadeias de polipeptídeo), em que a(s) cadeia(s) de polipeptídeo compreende dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a(s) cadeia(s) de polipeptídeo podem compreender VD1-(X1)n - VD2-(X2)n -Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia de polipeptídeo de uma região Fc, X1 e X2 representam um aminoácido ou um polipeptídeo, e n é 0 ou 1. Por exemplo, a(s) cadeia(s) de polipeptídeo podem compreender: cadeia de VH-CH1-ligante flexível-VH-CH1-região Fc; ou cadeia VH-CH1-VH-CH1-Região Fc. O anticorpo multivalente da presente invenção pode compreender pelo menos dois (por exemplo, quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalente da presente invenção pode, por exemplo, compreender de cerca de dois a cerca de oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos de domínio variável de vadeia leve contemplados aqui podem compreender um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, compreender, ainda, um domínio CL. ANTICORPOS DE DOMÍNIO ÚNICO

[297] Em algumas modalidades, um anticorpo da invenção é um anticorpo de domínio único que compreende uma região Fc. Em certas modalidade, o anticorpo de domínio único tem uma ou mais modificações de aminoácido na região Fc em relação ao IgG de tipo selvagem. Um anticorpo de domínio único é uma cadeia de polipeptídeo única que compreende todo ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio de variável de cadeia leve de um anticorpo.

MODIFICAÇÕES DE ANTICORPO

[298] Em certas modalidades, a(s) modificação(ões) na sequência de aminoácido das imunoglobulinas descritas aqui são contempladas. Em certas modalidades, as modificações compreendem uma ou mais modificações de aminoácido aos IgGs variantes da presente invenção. Em certas modalidades, pode ser desejável alterar ainda mais a afinidade de ligação, meia-vida in vivo e/ou outras propriedades biológicas dos IgGs variantes da presente invenção. Em certas modalidades, as modificações de aminoácido compreendem uma ou mais modificações na região Fc não descrita aqui. As sequências de aminoácido modificadas dos IgGs variantes podem ser preparadas pela introdução de mudanças apropriadas na seqüência de nucleotídeo que encodifica o anticorpo, ou por síntese de peptídeo. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções em e/ou substituições de, resíduos em sequencias de aminoácido nas sequencias de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, dado que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácido podem ser introduzidas na sequência de aminoácido do anticorpo do indivíduo no momento em que a sequência é feita.

[299] Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são locais preferíveis para mutagênese é chamado "mutagênese de varredura de alanina" conforme descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244:1081 a 1085. Aqui , um resíduo ou um grupo de resíduos alvo são identificados (por exemplo, resíduos carregados, como arg, asp, his, lis, e glu) e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com antígeno. Aquelas localizações de aminoácido que demonstram a sensibilidade funcional às substituições são, então, refinadas ao se introduzir mais ou outras modificações em, ou para, os sítios de substituição. Portanto, enquanto o sítio para a introdução de modificação de sequência de aminoácido é pré-determinado, a natureza da mutação em si não precisa ser pré-determinada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, varredura ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as imunoglobulinas expressas são triadas para a atividade desejada.

[300] As inserções de sequência de aminoácido incluem fusões de terminal amino e/ou carboxil variando no comprimento de um resíduo aos polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como as inserções de intrasequência de resíduos de ácido de aminoácidos múltiplos ou único. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo de metionila de N-terminal. Outras modificações insercionais da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida do soro do anticorpo.

[301] Em certas modalidades, o IgG variante da presente invenção é alterado para aumentar ou diminuir a extensão à qual o anticorpo é glicosilado. A glicosilação de polipeptídeos é tipicamente ou ligado em N ou ligado em O. Ligado em N se refere à ligação de uma porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são as sequencias de reconhecimento para a fixação enzimática da porção de carboidrato para a cadeia lateral de asparagina. Portanto, a presença ou dessas sequências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação ligada em O se refere à ligação de um dos açúcares N- acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um ácido hidróxiamino, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usados.

[302] A adição ou deleção de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada ao se alterar a sequência de aminoácido de modo que uma ou mais das sequências de tripeptídeo descritas acima (para sítios de glicosilação ligados em N) seja criada ou removida. A alteração também pode ser feita pela adição, deleção, ou substituição de um ou mais resíduos de treonina à sequência do anticorpo original (para sítios de glicosilação ligados em O).

[303] O carboidrato fixado à Região Fc dos IgGs variantes pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células mamíferas tipicamente compreendem um oligossacarídeo ramificado, biantenário que é, em geral, fixado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Consultar, por exemplo, Wright et al. (1997) TIBTECH 15:26-32. O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose, e ácido siálico, assim como uma fucose ligada a um GlcNAc no “tronco” da estrutura de oligossacarídeo biantenária. Em algumas modalidades, as modificações do oligossacarídeo em um IgG variante da invenção podem ser feitas para criar IgGs variantes com certas propriedades adicionalmente melhoradas. Em certas modalidades, um IgG variante compreende, ainda, uma substituição de amino na posição 297 a alanina.

[304] Por exemplo, as modificações a anticorpo são fornecidas tendo uma estrutura de carboidrato que não tem fucose fixada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Tais modificações podem ter função ADCC melhorada. Ver, por exemplo, Publicação de Patente US Nos US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relacionadas a modificações a anticorpo “defucosiladas” ou “deficiente em fucose” incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239 a 1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos defucosilatados incluem células Lec13 CHO deficientes em fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533 a 545 (1986); Pedido de Patente US N° US 2003/0157108 A1, Presta, L; e WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens de célula de knockout, como o gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, célula CHO knockout (consultar, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680 a 688 (2006); e WO2003/085107).

[305] As modificações de Anticorpo são, ainda, dotadas de oligossacarídeos bissecionados, por exemplo, no quais um oligossacarídeo biantenário fixado à região Fc do anticorpo é bissectado por GlcNAc. Tais variantes de anticorpo podem ter fucosilação reduzida e/ou função ADCC melhorada. Exemplos de tais modificações de anticorpo são descritos, por exemplo, em WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); Patente US N° 6.602.684 (Umana et al.); e US 2005/0123546 (Umana et al.). As modificações de anticorpo com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo fixado à região Fc também são fornecidas. Tais modificações de anticorpo podem ter função CDC melhoradas. Tais modificações de anticorpo são descritas, por exemplo, em WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); e WO 1999/22764 (Raju, S.).

[306] Em certas modalidades, a invenção contempla modificações de anticorpo que possuem algumas, mas não todas funções efetoras, que a torna uma candidata desejável para muitas aplicações nas quais a meia-vida do anticorpo in vivo é importante, ainda que certas funções efetoras (como complemento e ADCC) sejam desnecessárias ou deletérias. Em certas modalidades, as atividades Fc do anticorpo são medidas para garantir que apenas as propriedades desejadas sejam mantidas. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção de atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação de receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para garantir que o anticorpo não tenha a ligação FcyR (portanto, não tenha, provavelmente, atividade ADCC), mas retenha a habilidade de ligação de FcRn. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam Fc(apenas RIII, enquanto monócitos expressam Fc(RI, Fc(RII e Fc(RIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457 a 92 (1991). Exemplos não limitadores de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente U.S. N° 5.500.362 (consultar, por exemplo, Hellstrom, I., et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059 a 7063 (1986)) e Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499 a 1502 (1985); 5,821,337 (consultar Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351 a 1361 (1987)). alternativamente, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (consultar, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativo ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; e ensaio de citotoxicidade não radioativo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI). Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) e células matadora natural (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal conforme apresentado em Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652 a 656 (1998). Os ensaios de ligação de C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de aglutinar C1q e, portanto, falta atividade CDC. Para avaliar a ativação de complemento, um ensaio CDC pode ser realizado (consultar, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045 a 1052 (2003); e Cragg, M.S. e M.J. Glennie, Blood 103:2738 a 2743 (2004)). A ligação de FcRn e as determinações de espaçamento/meia-vida in vivo também podem ser realizadas como uso de métodos conhecidos na técnica (consultar, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759 a 1769 (2006)).

[307] Outras modificações de anticorpo que têm um ou mais substituições de aminoácido são fornecidas. Os sítios de interesse para a mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas as alterações FR também são contempladas. As substituições conservadoras são mostradas na Tabela sob o nome de "substituições preferidas." Mais mudanças substâncias, denominadas "substituições exemplificadoras" são fornecidas na Tabela 1, ou conforme é adicionalmente descrito abaixo em referência às classes de aminoácido. As substituições de aminoácido podem ser introduzidas a um anticorpo de interesse e os produtos podem ser varridos, por exemplo, par a uma atividade desejada, como uma ligação de antígeno melhorada, imunogenicidade diminuída, ADCC ou CDC melhorados, etc. TABELA 1

[308] As modificações nas propriedades biológicas de um anticorpo podem ser realizadas ao selecionas as substituições que afetam (a) a estrutura da cadeia principal do polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) a carga ou hidrofovicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) a maior parte da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as similaridades nas propriedades de suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, in Biochemistry, segunda edição, pp. 73 a 75, Worth Publishers, Nova York (1975)): (1) não-polar: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) polar não carregado: Gli (G), Ser (S), Thr (T), Cis (C), Tir (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) ácido: Asp (D), Glu (E); (4) básico: Lys (K), Arg (R), His(H).

[309] Alternativamente, resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos baseado em propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cis, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação de cadeia: Gli, Pro; (6) aromático: Trp, Tir, Phe.

[310] Substituições não conservadoras acarretarão na troca de um membro de uma dessas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos sítios de substituição conservadora ou nos sítios remanescentes (não-conservados).

[311] Um tipo de modificação substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parente (por exemplo, um anticorpo humano ou humanizado). Em certas modalidades, o anticorpo parente é o IgG variante de contraparte de tipo selvagem (por exemplo, um IgG variante da invenção sem nenhuma alteração adicional em sua sequência de aminoácido). Em geral, os anticorpos resultantes selecionados para desenvolvimento adicional terão propriedades biológicas modificadas (por exemplo, melhoradas) em relação ao anticorpo parente a partir do qual eles são gerados. Uma modificação substitucional exemplificadora é um anticorpo maduro de afinidade, que pode ser convenientemente ser gerado com o uso de técnicas de maturação de afinidade baseado em exibição de fago. Brevemente, diversos sítios de região hipervariável (por exemplo 6-7 sítios) são modificados para gerar todas as substituições de aminoácido possíveis em cada sítio. Os anticorpos gerados dessa forma são exibidos a partir de partículas de fago filamentoso como fusões a pelo menos parte de uma proteína de revestimento de fago (por exemplo, o produto de gene III de M13) embalada no interior de cada partícula. Os anticorpos exibidos em fago são, então, triados para sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação). Para identificar os sítios de região hipervariável candidatos para modificação, a varredura de mutagênese (por exemplo, varredura de alanina) pode ser realizada para identificar resíduos de região hipervariável que contribuem significativamente à ligação de antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo de antígeno-anticorpo para identificar os pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para a substituição, de acordo com técnicas conhecidas na técnica, incluindo aquelas elaboradas aqui. Uma vez que os tais anticorpos modificados são gerados, o painel de anticorpos está sujeito à triagem com o uso de técnicas conhecidas na técnica, incluindo aquelas descritas aqui, e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

[312] As moléculas de ácido nucléico que encodificam a sequência de aminoácido do anticorpo modificado (por exemplo, IgG variante modificado) são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, mas não se limitam a, o isolamento a partir de uma fonte natural (no caso de modificações de sequência de aminoácido de ocorrência natural) ou a preparação por metagênese mediada por oligonucleotídeo (ou direcionada a sírio), mutagênese de PCR, e mutagênese de cassete de um anticorpo modificado anteriormente preparado ou uma versão não modificada do anticorpo.

[313] De acordo com essa descrição e com os ensinamentos da técnica, contempla-se que, em certas modalidades, uma modificação de anticorpo da invenção possa compreender uma ou mais alterações se comparado ao IgG variante de contraparte de tipo selvagem (por exemplo, um IgG variante da invenção sem nenhuma alteração adicional sem sua sequência de aminoácido). Essas modificações de anticorpo que compreendem alterações adicionais reteriam, apesar de tudo, substancialmente as mesmas características exigidas para utilidade terapêutica se comparado ao IgG variante de contraparte de tipo selvagem. Em certas modalidades, o IgG variante de contra parte de tipo selvagem é uma variante de bevacizumab.

[314] Em outro aspecto, a invenção fornece modificações de anticorpo que compreendem modificações na interface de polipeptídeos Fc que compreendem a região Fc, em que as modificações facilitam e/ou promovem a heterodimerização. Essas modificações compreendem a introdução de uma protuberância em um primeiro polipeptídeo Fc e uma cavidade em um segundo polipeptídeo Fc, em que a protuberância é posicionável na cavidade de modo a promover a complexação do primeiro e do segundo polipeptídeos Fc. Os métodos de geração de anticorpos com essas modificações são conhecidos na técnica, por exemplo, conforme descrito na Patente U.S. N° 5.731.168.

[315] Em ainda outro aspecto, pode ser que seja desejável criar anticorpos projetados a partir de cisteína, por exemplo, “tioMAbs,” nos quais um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em certas modalidades, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Ao substituir aqueles resíduos com cisteína, os grupos de tiol reativos são, por meio disso, posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outras porções, como porções de droga ou porções de ligante de droga, conforme descrito adicionalmente aqui. Em certas modalidades, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos pode ser substituído por cisteína: V205 (numeração Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da cadeia pesada da região Fc.

DERIVADOS DE ANTICORPO

[316] Em certas modalidades, o IgGs variante da presente invenção pode ser adicionalmente modificado para conter porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e prontamente disponíveis. Em certas modalidades, o IgG variante pode ser conjugado com um agente citotóxico.em certas modalidades, o IgG variante ao qual o agente citotóxico é ligado é internalizado pela célula, resultando na eficácia terapêutica aumentada do conjugado ao exterminar a célula cancerosa à qual se liga. Em um modalidade, o agente citotóxico direciona ou interfere com ácido nucléico na célula cancerosa.

[317] Em certas modalidades, as porções adequadas para a derivatização do anticorpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não limitadores de polímeros solúveis em água incluem, mas não se limitam a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool de polivinila, polivinil pirrolidona, poli-1, 3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de anidrido maléico/etileno, poliaminoácidos (ou homopolímeros ou copolímeros aleatórios), e dextrano ou poli(n-vinila pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, co-polímeros de óxido de propropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool de polivinila, e misturas dos mesmos. Propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação decido à sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros fixados ao anticorpo pode variar, e se mais que um polímero estiver fixado, eles podem ser a mesma molécula ou moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para a derivatização pode ser determinado com base em considerações, incluindo, mas não se limitando a, as propriedades particulares ou funções do anticorpo a serem melhoradas, se o anticorpo derivado será usado em uma terapia sob condições definidas, etc.

[318] Em outra modalidade, os conjugados de um anticorpo e porção não proteinácea que pode ser seletivamente aquecida por exposição à radiação são fornecidos. Em uma modalidade, a porção não proteinácea é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600 a 11605 (2005)). A radiação pode ser de qualquer comprimento de onda e inclui, mas não se limita a, comprimentos de onda que não prejudicam células ordinárias, mas que aquecem a porção não proteinácea a uma temperatura na qual as células próximas à porção não proteinácea do anticorpo são exterminadas.

FABRICAÇÃO DE IGGS VARIANTES

[319] Os IgGs variantes podem ser feitos por qualquer método conhecido na técnica. Em certas modalidades, as sequências de IgG variantes são usadas para criar ácidos nucléicos que encodificam as sequências de membro, e que podem, então, ser clonadas em células hospedeiras, expressas e avaliadas, se desejado. Essas práticas são realizadas com ouso de procedimentos bem conhecidos, e uma variedade de métodos em que podem encontrar uso são descritas em Molecular Cloning--A Laboratory Manual, 3a Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nova York, 2001), e Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons), ambos aqui incorporados a título de referência em suas totalidades. Os ácidos nucléicos que encodificam os IgGs variantes podem ser incorporados em um vetor de expressão para expressar a proteína. Os vetores de expressão incluem, tipicamente, uma proteína operavelmente ligada, isso é, colocada em relação funcional, com sequências de controle ou regulatórias, marcadores selecionáveis, quaisquer parceiros de fusão, e/ou elementos adicionais. Os IgGs variantes podem ser produzidos pelo cultivo de uma célula hospedeira transformada com ácido nucléico, de preferência um vetor de expressão, contendo o ácido nucléico que encodifica os IgGs variantes, sob as condições apropriadas para induzir ou causar a expressão da proteína. Uma ampla variedade de células hospedeiras apropriadas pode ser usada, incluindo, mas não limitando células mamíferas, bactérias, células de insetos, e levedura. Por exemplo, uma variedade de linhagens celulares que possam encontrar uso conforme descrito no catálogo de linhagem celular ATCC, disponível junto à American Type Culture Collection, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade. Os métodos de introdução de um ácido nucléico exógeno em células hospedeiras são bem conhecidos na técnica, e irão variar com a célula hospedeira usada.

[320] Em certas modalidades, IgGs variantes são purificados ou isolados após a expressão. Os anticorpos podem ser isolados ou purificados em uma variedade de maneiras conhecidas àqueles versados na técnica. Métodos de purificação padrão incluem técnicas cromatrográficas, eletroforéticas, imunológicas, de precipitação, de diálise, de filtração, de concentração, e técnicas de cromatofocalização. Assim como é bem conhecido na técnica, uma variedade de anticorpos de ligação a proteínas naturais, por exemplo, proteínas bacterianas A, G, e L, e essas proteínas podem encontrar uso na purificação. Frequentemente, a purificação pode ser permitida por um parceiro de fusão particular. Por exemplo, as proteínas podem ser purificadas com o uso de resina de glutationa se uma fusão GST for empregada, cromatografia por afinidade com Ni+2 se um His-tag for empregado ou anticorpo anti-flag imobilizado se um flagtag for usado. Para um guia geral em técnicas de purificação adequadas, consutlar Anticorpo Purification: Principles e Practice, 3a Ed., Scopes, SpringerVerlag, NY, 1994, aqui incorporado a titulo de referencia em sua totalidade. TRIANDO IGGS VARIANTES

[321] Os IgGs variantes da presente invenção podem ser triados com o uso de uma variedade de métodos, incluindo, mas não limitando a aqueles que usam ensaios in vitro, in vivo e ensaios baseados em célula e tecnologias de seleção. Tecnologias de triagem de automação e de alto rendimento podem ser utilizadas nesses procedimentos de triagem. A triagem pode empregar o uso de um parceiro de fusão ou identificador, por exemplo, um identificador imune, identificador isotópico, ou pequeno identificador de molécula como um corante fluorescente ou calorimétrico.

[322] Em certa modalidade, as propriedades funcionais e/ou biofísicas dos IgGs variantes são triados em um ensaio in vitro. Em certas modalidades, a proteína é triada para funcionalidade, por exemplo, sua habilidade de catalisar uma reação ou sua afinidade de ligação a seu alvo.

[323] Um subconjunto de métodos de triagem são aqueles que selecionam buscando por membros favoráveis de uma biblioteca. Os métodos são chamados aqui de "métodos de seleção," e esses métodos são úteis na presente invenção para a triagem de IgGs variantes. Quando as bibliotecas de proteínas são triadas com o uso do método de seleção, apenas aqueles membros de uma biblioteca que são favoráveis, ou seja, que preenchem algum dos critérios de seleção, são propagados, isolados, e/ou observados. Uma variedade de métodos de seleção são conhecidos na técnica que podem ser úteis na presente invenção para triar bibliotecas de proteínas. Outros métodos da seleção podem ser úteis na presente invenção que não dependem de exibição, como métodos in vivo. Um subconjunto de métodos de seleção chamados de métodos de "evolução direcionada" são aqueles que incluem a combinação ou cruzamento de sequências favoráveis durante a seleção, algumas vezes com a incorporação de novas mutações.

[324] Em certas modalidades, os IgGs variantes são triados com o uso de um ou mais ensaios baseados em célula ou in vivo. Para tais ensaios, as proteínas purificadas ou não purificadas são, tipicamente, adicionadas exogenicamente de modo que as células sejam expostas a variantes individuais ou agrupamentos de variantes pertencentes à biblioteca. Esses ensaios são, tipicamente, mas não sempre, com base na função do IgG variante; isto é, a habilidade do IgG variante de se aglutinar a seu alvo e mediar algum evento bioquímico, por exemplo, função efetora, inibição de ligação de ligando/receptor, apoptose, e similares. tais ensaios frequentemente envolvem a monitoração da reação de células ao IgG, por exemplo, proliferação celular, migração celular, angiogênese, sobrevivência celular, morte celular, mudança na morfologia celular, ou ativação transcricional como expressão celular de um natural ou um gene repórter. Por exemplo, tais ensaios podem medir a habilidade de IgG variantes de elicitar ADCC, ADCP, ou CDC. Para alguns ensaios, células adicionais ou componentes, isto é, além das células alvo, podem precisar ser adicionados, por exemplo, complemento de soro, ou células efetoras como monócitos sanguíneos periféricos (PBMCs), células NK, macrófagos, e similares. Tais células adicionais podem ser de qualquer organismo, de preferência humanas, de camundongo, rato, coelho, e macaco. Em certas modalidades, anticorpos podem inibir a angiogênese e métodos par monitorar tal atividade são bem conhecidos na técnica. Em ainda outra modalidade, os anticorpos podem causar apoptose de certas linhagens celulares que expressam o alvo, ou eles podem mediar o ataque em células alvo por células imunes que foram adicionadas ao ensaio. Os métodos para o monitoramento de morte celular ou viabilidade são conhecidos na técnica, e incluem o uso de corantes, reagentes imunoqímicos, citoquímicos, e radioativos. A ativação transcricional também pode servir como um método para avaliar a função em ensaios baseados em célula. alternativamente, as tiragens baseadas em célula são realizadas como uso de células que foram transformadas ou transfectadas com ácidos nucléicos encodificando as variantes. Isto é, os IgGs variantes não são adicionados exogenicamente às células.

[325] As propriedades biológicas dos IgGs variantes podem ser caracterizadas em experimentos com célula, tecido e organismos inteiros. As drogas são frequentemente testadas em animais, incluindo, mas não se limitando a camundongos, ratos, coelhos, cachorros, gatos, porcos e macacos para medir a eficácia de uma droga no tratamento contra uma doença ou modelo de doença, ou para medir as propriedades farmacocinéticas, de toxicidade e outras da droga. Os animais podem ser chamados de modelos de doença. Terapias são frequentemente testados em camundongos, incluindo, mas na se limitando a camundongos sem pelo, camundongos SCID, camundongos xenográficos, e camundongos transgênicos (incluindo knockins e knockouts). Tal experimento pode fornecer dados significativos para a determinação do potencial da proteína a ser usada como terapêutica. Qualquer organismo, de preferência mamíferos, pode ser usado para o teste. Por exemplo, por causa de sua similaridade genética aos seres humanos, os macacos podem ser modelos terapêuticos adequados, e, portanto, podem ser usados para testar a eficiência, a toxicidade, a farmacocinética ou outras propriedades dos IgGs variantes. Os testes em humanos são, ultimamente, exigidos para a aprovação como drogas, e, portanto, é claro que esses experimentos são contemplados. Então, os IgGs variantes podem ser testados e m humanos para determinar sua eficácia, toxicidade, imunogenicidade, farmacocinética farmacêuticas e/ou outras propriedades clinicas.

USOS TERAPÊUTICOS DOS IGGS VARIANTES

[326] Os IgGs variantes podem ser úteis em uma ampla gama de produtos. Em certas modalidades, o IgG variante é um reagente terapêutico, diagnóstico ou de pesquisa. O IgG variante pode ser útil em uma composição de anticorpo que é monoclonal ou policlonal. Em certas modalidades, os IgGs variantes são usados para bloquear, antagonizar o antígeno alvo, como VEGF. Em certas modalidades, os IgGs variantes são usados para bloquear ou neutralizar a atividade de VEGF. Em uma modalidade, a atividade de VEGF é angiogênese.

[327] Os IgGs variantes podem ser usado para vários fins terapêuticos, incluindo, mas não se limitando a, tratar um paciente com doenças neoplásicas e/ou não-neoplasicas, conforme definido aqui sob “Definições.” Em certas modalidades, a doença neoplásica é câncer. Em certas modalidades, os pacientes são primeiramente tratados com IgG de tipo selvagem e, mais tarde, tratados com IgG variante. Em uma modalidade, os pacientes são primeiramente tratados com bevacizumab e, então, mais tarde, são tratados com o IgG variante, por exemplo, uma variante de bevacizumab. Em certas modalidades, os pacientes são tratados com bevacizumab por cerca de 6 meses e, então, tratados com o IgG variante, por exemplo, uma variante de bevacizumab.

[328] Inúmeros anticorpos e fusões Fc que são aprovados para uso, em ensaios clínicos, ou em desenvolvimento, são chamados, aqui, de “produtos clínicos e candidatos.” Em certas modalidades, as variantes IgGs da presente invenção podem encontrar uso em uma variedade de produtos clínicos e candidatos. Exemplos de anticorpos que podem ser modificados incluem, mas não se limitam a, um anticorpo que pode se aglutinar a um antígeno alvo, como VEGF, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), CD20, IgE, CD11, lipoproteína de baixa densidade (LDL), interleuquina 4 (IL-4), interleuquina 13 (IL-13), um epítopo de hepatite C, A-beta, IL-17A, IL-17F, DR6, DR5, um epítopo de citomegalovírus humano, um epítopo de estafilococos dourados, fator de tecido, alfa4beta7 integrina, alfa5beta1 integrina, CTLA4, CD3, um epítopo de RSV, NFalfa, CD147, IL8, MUC18, MUC1, alfa4beta1 (VLA- 4) integrina, receptor de limfotoxina alfa, recpetor limfotoxina beta (LTBR), TGF- β2, IL-12, TGFβ1, Eotaxina1, BAFF, TRAIL-R1, IL15, Heparanase I; CD40, CD154, CD80, CD23, fator de migração macrofago (MIF), KDR, flk-1, caderina VE, antígeno carcinoembriônico (CEA), CD22, CTLA4, CD30, molécula-1 de adesão intercelular, receptor 3 de fator de crescimento anti-fibroblasto (FGFR- 3), interferona gama, IL-12, anticorpo Ep-CAM e beta2 integrina.

[329] Exemplos de produtos clínicos e candidatos que possam ser modificados incluem, mas não se limitam a, anticorpo anti-VEGF AVASTIN® (bevacizumab, Genentech) (consultar, por exemplo, Patente U.S. N° 7.169.901, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade); anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado HERCEPTIN® (trastuzumab, Genentech) (consultar, por exemplo, Patente U.S. N° 6.489.447, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade); anticorpo anti-CD20 quimérico RITUXAN® (rituximab, IDEC/Genentech/Roche); anticorpo anti-IgE XOLAIR® (omalizumab, Genentech); outros anticorpos anti-CD20; anticorpo anti-CD11a RAPTIVA® (efalizumab, Genentech/Xoma); anticorpo anti-Her2 OMNITARG® (pertuzumab, Genentech); um anticorpo anti-oxLDL (consultar, por exemplo, Publicação U.S. N° 20040202653 e WO 2004030607, ambas incorporados a título de referência em sua totalidade); anticorpo anti-CD4 MTRX1011A (consultar, por exemplo, WO 02/102853, incorporada aqui a título de referência em sua totalidade); anticorpos biespecíficos em que antígenos alvo são IL-4 e IL-13; um anticorpo anti-HCV; um anticorpo anti- IL-17A/F; um anticorpo anti-A-beta; um anticorpo anti-DR6; um anticorpo de citomegalovírus anti-humano (HCMV); anticorpos da família de receptor anti-HER; um anticorpo de fator anti-tecido; anticorpo MLN- 02, um anticorpo monoclonal IgG1 humanizado a um integrnio α4β7 (anteriormente LDP-02, Genentech/Millennium Pharmaceuticals); anticorpo antiCD 18 F(ab')2 humanizado; e um anticorpo rhuMab-E25 anti-IgE IgG1 humanizado (Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems).

[330] Os produtos clínicos adicionais e os candidatos que podem ser modificados incluem, mas não se limitam a, um anticorpo anti-CD20 quimérico aprovado para tratar linfoma de não-Hodgkin; um anticorpo HuMax- CD20 anti-CD20 (Genmab); anticorpo AME-133 anti-CD20 (consultar, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.500.362, aqui incorporada em sua totalidade a título de referência, Applied Molecular Evolution); hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel), e PRO70769 (PCT/US2003/040426, incorporado a título de referência em sua totalidade). Inúmeros anticorpos que são direcionados a membros alvo da família de receptores de fator de crescimento epidérmico, incluindo EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), também podem ser benéficos a partir das modificações à região Fc descrita na presente invenção. Por exemplo, os IgG variantes podem ser úteis em um anticorpo que é substancialmente similar a ERBITUX® (cetuximab, Imclone) (Patente U.S. N° 4.943.533; WO 96/40210, ambas aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade); um anticorpo anti-EGFR quimérico em testes clínicos para uma variedade de cânceres; ABX-EGF (Patente U.S. N° 6.235.883, incorporada a título de referência em sua totalidade, Abgenix/Immunex/Amgen); HuMax-EGFr (U.S. Ser. N° 10/172,317, incorporada a título de referência em sua totalidade, Genmab); 425, EMD55900, EMD62000, e EMD72000 (Merck KGaA) (Patente U.S. N° 5.558.864; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2):549 a 60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7):773 a 83, todas aqui incorporadas a título de referência em sua totalidade); ICR62 (Institute of Cancer Research) (WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3):129 a 46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247 a 53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73(2):228 a 35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273 a 80, todas aqui incorporadas em sua totalidade a título de referência); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Canada e Centro de Immunologia Molecular, Cuba (Patente U.S. N° 5.891.996; 6.506.883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1):71 a 81), todas aqui incorporadas em sua totalidade a título de referência); mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100(2):639 a 44); KSB-102 (KS Biomedix, incorporado a título de referência em sua totalidade); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (WO 0162931A2, incorporado a título de referência em sua totalidade); e SC100 (Scancell) (WO 01/88138 incorporado a título de referência em sua totalidade). Em certas modalidades, os IgG variantes da presente invenção podem ser úteis em CAMPATH® (alemtuzumab, Genzyme Corporation), um anticorpo monoclonal humanizado atualmente aprovado para tratamento de leucemia linfocítica crônica de célula B. Os IgG variantes da presente invenção podem ser úteis em uma variedade de anticorpos ou fusões de Fc que são susbtancialmente similares a outros produtos clínicos e candidatos, incluindo, mas não se limitando a VEGF-Trap (Regeneron); muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®), um anticorpo anti-CD3 (Ortho Biotech/Johnson & Johnson); anticorpo anti-CD20 ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetano, IDEC/Schering AG); anticorpo anti-CD33 MYLOTARG®, um anticorpo (proteína p67) gemtuzumab ozogamicina (Celltech/Wyeth); um anticorpo de fusão de Fc anti-LFA-3 AMEVIVE® (alefacept, Biogen); REOPRO® (abciximab, Centocor/Lilly); SIMULECT® (basiliximab, Novartis); SYNAGIS® (palivizumab, MedImmune); anticorpo anti-TNFalpha REMICADE® (infliximab, Centocor); anticorpo anti-TNFalpha HUMIRA®, (adalimumab, Abbott); anticorpo IgG4 anti-TNF humanizado HUMICADE® (Celltech); fusão de Fc anti-TNFalpha ENBREL® (etanercept, Immunex/Amgen); anticorpo ABX-CBL anti-CD147 (Abgenix); anticorpo ABX-IL8 anti-IL8 (Abgenix); anticorpo ABX-MA1 anti- MUC18 (Abgenix); um anticorpo pemtumomab anti-MUC1 (R1549, 90Y- muHMFG1) (Antisoma); anticorpo therex anti-MUC1 (R1550) (Antisoma); AngioMab (AS1405) (Antisoma); HuBC-1 (Antisoma); Thioplatin (AS1407) (Antisoma); TYSABRI® (formalmente ANTEGREN®, natalizumab), um anticorpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) e alfa-4-beta-7 (Biogen); anticorpo VLA-1 mAb anti- VLA-1 integrina (Biogen); anticorpo LTBR mAb de beta receptor anti-limfotoxina (LTBR) (Biogen); anticorpo CAT-152 anti-TGF-β2 (Cambridge Antibody Technology); J695, um anticorpo anti-IL (Cambridge AntibodyTechnology/Abbott); CAT-192, um anticorpo anti-TGFβ1 (Cambridge Antibody Technology/Genzyme); CAT-213, um anticorpo anti-Eotaxin1 (Cambridge Antibody Technology); LYMPHOSTAT-B®, um anticorpo anti-Blys (Cambridge Antibody Technology/ Human Genome Sciences Inc.; TRAIL- R1mAb, um anticorpo anti-TRAIL-R1 (Cambridge Antibody Technology/Human Genome Sciences, Inc.); HUMAX-CD4, um anticorpo anti-CD4 (Genmab); HuMax-IL15, um anticorpo anti-IL15 (Genmab/Amgen); HuMax-Inflam (Genmab/ Medarex); HuMax-Cancer, um anticorpo anti-Heparanase I (Genmab/Medarex/Oxford GlycoSciences); HuMax-Limfoma (Genmab/Amgen); HuMax-TAC (Genmab); IDEC-131, um anticorpo anti-CD40L (IDEC Pharmaceuticals); IDEC-151 (clenoliximab), um anticorpo anti-CD4 (IDEC Pharmaceuticals); IDEC-114, um anticorpo anti-CD80 (IDEC Pharmaceuticals); IDEC-152, um anticorpo anti-CD23 (IDEC Pharmaceuticals); anticorpos de fator de migração anti-macrófago (MIF) (IDEC Pharmaceuticals); BEC2, um anticorpo anti-idiotípico (Imclone); IMC-1C11, um anticorpo anti-KDR (Imclone); DC101, um anticorpo anti-flk-1 (Imclone); anticorpos anti-VE caderina (Imclone); CEA- CIDE® (labetuzumab), um anticorpo de antígeno anti-carcinoembriônica (CEA) (Immunomedics); LYMPHOCIDE® (Epratuzumab), um anticorpo anti-CD22 (Immunomedics); AFP-Cide (Immunomedics); MielomaCide (Immunomedics); LkoCide (Immunomedics); ProstaCide (Immunomedics); MDX-010, um anticorpo anti-CTLA4 (Medarex); MDX-060, um anticorpo anti-CD30 (Medarex); MDX-070 (Medarex); MDX-018 (Medarex); OSIDEM® (IDM-1), um anticorpo anti-Her2 (Medarex /Immuno-Designed Molecules); CNTO 148, um anticorpo anti-TNFα (Medarex/Centocor/J&J); CNTO 1275, um anticorpo anti-citoquina (Centocor/J&J); MOR101 e MOR102, anticorpos de molécula-1 de adesão anti- intercelular (ICAM-1, também conhecido como CD54) (MorphoSys); MOR201, um anticorpo de receptor 3 de fator de crescimento anti-fibroblasto (FGFR-3) (MorphoSys); NUVION® (visilizumab), um anticorpo anti-CD3 (Protein Design Labs); HuZAF®, um anticorpo de interferona anti-gama (Protein Design Labs); anticorpos a α5β1 integrina (Protein Design Labs); anti-IL-12 (Protein Design Labs); ING-1, um anticorpo anti-Ep-CAM (Xoma); e MLN01, um anticorpo anti- beta2 integrina (Xoma), todas as referências citadas acima neste parágrafo são expressamente incorporadas aqui a título de referência.

[331] Os IgGs variantes com modificações na região Fc de IgG da presente invenção podem ser incorporados nos candidatos clínicos supramencionados e nos produtos, ou em anticorpos e fusões de Fc que são substancialmente similares aos mesmos. Os IgGs variantes da presente invenção também pode ser incorporado em versões dos candidatos clínicos supramencionados e produtos que são humanizados, amadurecidos em afinidade, projetados ou modificados de alguma outra maneira.

[332] Em certas modalidades, os IgGs variantes da presente invenção podem ser úteis no tratamento de cânceres benignos, pré-cancerosos, ou não-metastásicos; para o tratamento de tumores inativos ou micrometástases; para a prevenção de recorrência de tumor ou re-crescimento; ou para o tratamento ou prevenção de câncer em um indivíduo com risco de desenvolver um câncer. Por exemplo, os IgGs variantes que compreendem modificações Fc conforme descrito aqui podem ser usados para a terapia adjuvante para o tratamento de um indivíduo com câncer não metastático, seguindo a cirurgia definitiva ou para a terapia neoadjuvante para o tratamento de um sujeito com um câncer operável onde a terapia é fornecida anteriormente à remoção cirúrgica de câncer operável no indivíduo. Enquanto as aplicações terapêuticas são separadas abaixo de prevenção, terapia neoadjuvante, e terapia adjuvante, será apreciado pelo indivíduo versado na técnica que essas categorias não sejam necessariamente mutuamente exclusivas.

CLASSIFICAÇÃO DE TUMORES

[333] Sistemas de estadiamento do câncer descrevem o quanto o câncer já se espalhou anatomicamente e tentam colocar pacientes com prognósticos e tratamentos similares no mesmo grupo de estadiamento. Diversos testes podem ser realizados para ajudar a classificar o câncer incluindo biópsia e certos testes de imageamento, como um raio-x do peitoral, mamografia, tomografia óssea, tomografia computadorizada, e imageamento de ressonância magnética. Testes de sangue e uma avaliação clínica também são usados para avaliar a saúde em geral de um paciente e detectar se o câncer se espalhou para certos órgãos.

[334] Para classificar o câncer, o American Joint Committee on Cancer primeiramente coloca o câncer, particularmente os tumores sólidos, em uma categoria de letra com o uso do sistema de classificação TNM. Os cânceres são designados à letra T (tamanho de tumor), N (nódulos palpáveis), e/ou M (metástase). T1, T2, T3, e T4 descrevem o tamanho cada vez maior da lesão primária; N0, N1, N2, N3 indicam o envolvimento progressivamente avançado do nódulo; e M0 e M1 refletem a ausência ou presença de metástases distantes.

[335] No segundo método de estadiamento, também conhecido como o Agrupamento de Estágio Geral ou Estadiamento em Números Romanos, os cânceres são divididos em estágios 0 a IV, incorporando o tamanho de lesões primárias, bem como a presença de espalhamento nodal e de metástases distantes. Nesse sistema, os casos são agrupados em quatro estágios estipulados pelos algarismos romanos I a IV ou são classificados como “recorrentes.” Para alguns cânceres, o estágio 0 é chamado de “in situ” ou “Tis,” tal como carcinoma ductal in situ ou carcinoma lobular lobular in situ para cânceres de mama. Adenomas de alto grau também podem ser classificados como estágio 0. Em geral, os cânceres de estágio I são pequenos cânceres localizados que são normalmente curáveis, enquanto que os de estágio IV normalmente representam um câncer inoperável ou metastático. Os cânceres de estágio II e III são, em geral, localmente avançados e/ou exibem envolvimento de linfonodos locais. Geralmente, os altos números do estágio indicam uma doença mais extensiva, incluindo um tamanho maior do tumor e/ou espalhamento do câncer até os linfonodos próximos e/ou órgãos adjacentes ao tumor primário. Esses estágios são definidos precisamente, mas a definição é diferente para cada tipo de câncer e é conhecida por aquele elemento versado.

[336] Muitos registros de câncer, como o Programa de Vigilância, Epidemiologia e Resultados Finais (SEER) do NCI, usam o estadiamento de resumo. Esse sistema é usado para todos os tipos de câncer. Este agrupa casos de câncer em cinco categorias principais:

[337] In situ é o câncer inicial que está presente apenas na camada das células nas quais ele começa.

[338] Localizado é o câncer que está limitado ao órgão no qual ele começa, sem evidência de espalhamento.

[339] Regional é o câncer que se espalhou além do sítio original beyond (primário) até os linfonodos próximos ou órgãos e tecidos.

[340] Distante é o câncer que se espalhou do sítio primário até os órgãos distantes ou linfonodos distantes.

[341] Desconhecido é usado para descrever casos para os quais não existem informações suficientes para indicar um estágio.

[342] Em adição, é comum que o câncer retorne meses ou anos após o tumor primário ter sido removido. O câncer que retorna após todos os tumores visíveis terem sido erradicados é chamado de doença recorrente. A doença que retorna na área do tumor primário é localmente recorrente, e a doença que retorna como metástase é chamada de recorrência distante. Um tumor dormente é um tumor que existe em um estado quiescente no qual as células tumorais estão presentes, mas a progressão tumoral não é clinicamente aparente. As micrometástases são pequenas metástases ou iníumeras células que se espalharam a partir do tumor primário para outras partes do corpo. A micrometástase pode ou não ser detectada em um teste de triagem ou diagnóstico. Os métodos da invenção são uteis para a prevenção da ocorrência de tumores dormentes ou micrometástases ou a recorrência do tumor, por exemplo, em um conjunto em que um tumor dormente ou micrometástases estão presentes, mas pode ou não ser clinicamente detectado.

[343] Os métodos da invenção também são uteis para o tratamento de cânceres precoces incluindo, mas não se limitando a tumores benignos, pré- cancerosos ou não metastáticos. Isso inclui qualquer tumor de estágio 0, I ou II; qualquer tumor de estágio II não metastático; qualquer condição que proceda ou se desenvolva, tipicamente, em um câncer, incluindo, mas não se limitando a, displasia; e qualquer tumor que permaneça localizado no sítio de origem e não tenha infiltrado, invadido ou metastizado para sítios distantes. Os exemplos de tumores benignos, pré-cancerosos ou não metastáticos incluem um pólipo, adenoma, fibroma, lipoma, gastrinoma, insulinoma, condroma, osteoma, hemangioma, linfangioma, meningioma, leiomioma, rabdomioma, papiloma de célula escamosa, neuromas acústicos, neurofibroma, cistoadenoma do ducto biliar, leiomiomas, mesoteliomas, teratomas, mixomas, tracomas, granulomas, hamartoma, papiloma de célula transicional, adenoma pleiomórfico da glândula salivar, tumor desmóide, cistopapiloma dermóide, cistoadenoma, hiperplasia nodular focal e hiperplasia nodular regenerativa.

[344] Devido ao fato de a angiogênese estar envolvida tanto no crescimento do tumor primário quanto na metástase, o tratamento anti-angiogênico fornecido pela invenção é capaz de inibir o crescimento neoplástico do tumor no sítio primário, bem como evita a metástase de tumores nos sítios secundários, dessa forma, permitindo o ataque dos tumores por outros tratamentos terapêuticos.

[345] As informações adicionais sobre terapias adjuvantes e neoadjuvantes e o tratamento de tumores no estágio precoce são apresentadas no Pedido de Patente N° U.S.12/002.605 e Pedido de Patente PCT PCT/US2007/088000, em que os conteúdos desses pedidos de patente são expressamente incorporados no presente documento por referência. PREVENÇÃO

[346] Em determinadas modalidades, IgGs variantes podem ser usados para o tratamento de cânceres benignos, pré-cancerosos ou em estágio precoce ou para o tratamento ou prevenção da recorrência do tumor. Em determinadas modalidades, o IgG variante é um anticorpo anti-VEGF. Em uma modalidade, o IgG variante é um variante de bevacizumab. Em uma modalidade, o IgG variante compreende as regiões determinadas por complementaridade de bevacizumab. Em outra modalidade, o IgG variante compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID N°:1) e domínio variável de cadeia leve (SEQ ID N°:2). Ainda em outra modalidade, o IgG variante compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID N°:7) e o domínio variável de cadeia leve (SEQ ID N°:8).

[347] Os métodos podem ser usados para tratar o câncer em si ou para evitar a progressão do câncer até um estágio metastático ou invasivo ou até um alto grau ou estágio. Por exemplo, os métodos da invenção podem ser usados para tratar um indivíduo com câncer ou pólipos em estágio 0 com a finalidade de evitar as progressão até um tumor em estágio I ou tumor em maior estágio. De modo similar, em um paciente que tem câncer no estágio II, os métodos podem ser usados para evitar a progressão do câncer para um câncer em um estágio III ou estágio Stage IV.

[348] IgGs variantes também podem ser usados para evitar a recorrência de um tumor. Por exemplo, se um tumor é identificado e tratado (por exemplo, com quimioterapia ou removido cirurgicamente), um IgG variante pode ser usado para evitar a recorrência local do tumor colorretal ou uma metástase do tumor colorretal. Para a prevenção da recorrência do tumor, os IgGs variantes podem ser usados, por exemplo, para tratar um tumor dormente ou micrometástases ou para evitar o crescimento ou recrescimento de um tumor dormente ou micrometástases, que pode ou não ser clinicamente detectável.

[349] Em determinadas modalidades, IgGs variantes podem ser usados para a prevenção de um câncer em um indivíduo que nunca tenha tido câncer ou que tem risco de desenvolver um câncer. Existe uma variedade de fatores de risco conhecidos por serem associados a câncer e muitos deles são descritos no presente documento. Em adição, considera-se que um indivíduo conhecido por ter uma síndrome de câncer herdada tem um risco de desenvolver um câncer. TERAPIA NEOADJUVANTE

[350] A invenção fornece métodos de terapia neoadjuvante anteriores à remoção cirúrgica de câncer operável em um indivíduo, por exemplo, um paciente humano, que compreendem administrar ao paciente (por exemplo, quando o paciente é diagnosticado com um tumor e/ou câncer) uma quantidade eficaz de um IgG variante. Em determinadas modalidades, o IgG variante é um anticorpo anti-VEGF. Em uma modalidade, o IgG variante is a variant of bevacizumab. Em uma modalidade, o IgG variante compreende as regiões determinadas por complementaridade de bevacizumab. Em outra modalidade, o IgG variante compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID N°:1) e o domínio variável de cadeia leve (SEQ ID N°:2). Ainda em outra modalidade, o IgG variante compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID N°:7) e o domínio variável de cadeia leve (SEQ ID N°:8).

[351] Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado em combinação com pelo menos um agente quimioterapêutico. A etapa adicional de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante após a cirurgia a fim de evitar a recorrência do câncer também pode ser empregada com as terapias neoadjuvantes descritas no presente documento. Para os métodos que incluem a etapa adicional de administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante após a cirurgia, qualquer dentre os métodos adjuvantes descritos no presente documento pode ser usado.

[352] Por exemplo, um método inclui o tratamento de câncer em um individuo que compreende as seguintes etapas: a) um primeiro estágio compreendendo uma pluralidade de ciclos de tratamento em que cada cicle compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um IgG variante e, opcionalmente, pelo menos um agente quimioterapêutico em um intervalo pré-determinado; b) uma cirurgia definitiva na qual o câncer é removido; e, opcionalmente, c) um segundo estágio compreendendo uma pluralidade de ciclos de manutenção em que cada ciclo compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma IgG variante com ou sem qualquer agente quimioterapêutico em um intervalo pré-determinado.

[353] Em uma modalidade de uma administração programada, a neoterapia adjuvante compreende uma primeira etapa em que um IgG variante e um ou mais agentes quimioterapêuticos são administrados aos pacientes em uma pluralidade de ciclos neoadjuvantes, seguidos por uma cirurgia para remover definitivamente o tumor. Em determinadas modalidades, a neoterapia adjuvante dura por menos de um ano, em uma modalidade, menos que deis meses antes da cirurgia. TERAPIA ADJUVANTE

[354] A invenção fornece métodos de terapia adjuvante que compreendem administrar um IgG variante a um indivíduo com câncer não metastático, subsequente à cirurgia definitiva. Em determinadas modalidades, o IgG variante é um anticorpo anti-VEGF. Em uma modalidade, o IgG variante é uma variante de bevacizumab. Em uma modalidade, o IgG variante compreende as regiões deterinadas por complementaridade de bevacizumab. Em outra modalidade, o IgG variante compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID N°:1) e o domínio variável de cadeia leve (SEQ ID N°:2). Ainda em outra modalidade, o IgG variante compreende o domínio variável de cadeia pesada (SEQ ID N°:7) e o domínio variável de cadeia leve (SEQ ID N°:8).

[355] Por exemplo, um método pode incluir as seguintes etapas: a) um primeiro estágio que compreende uma pluralidade de ciclos de tratamento, em que cada ciclo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante e, opcionalmente, pelo menos um agente quimioterapêutico em um intervalo pré-determinado; e b) um segundo estágio que compreende uma pluralidade de ciclos de manutenção, em que cada ciclo compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um IgG variante sem qualquer agente quimioterapêutico em um intervalo pré-determinado; em que o primeiro e segundo estágios combinados duram por pelo menos um ano após o tratamento pós-operatório inicial. Em uma modalidade, o primeiro estágio compreende uma primeira pluralidade de ciclos de tratamento em que um IgG variante e um primeiro regime de quimioterapia são administrados, seguidos por uma segunda pluralidade de ciclos de tratamento em que um IgG variante e um segundo regime de quimioterapia são administrados.

[356] O IgG variante é, em geral, administrado após um período de tempo no qual o indivíduo tenha se recuperado da cirurgia. Esse período de tempo pode incluir o período necessário para a cicatrização de ferida ou cocatrização da incisão cirúrgica, o período de tempo necessário para reduzir o risco de deiscência da ferida ou o período de tempo necessário para que o indivíduo retorne a um nível de saúde essencialmente similar ou melhor do que o nível de saúde antes da cirurgia. O período entre a conclusão da cirurgia definitiva e a primeira administração do IgG variante também pode incluir o período necessário para uma pausa da droga, em que o indivíduo exige ou requer um período de tempo entre os regimes terapêuticos. Em geral, o período de tempo entre a conclusão da cirurgia definitiva e o início da terapia com IgG variante pode incluir menos do que uma semana, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas (28 dias), 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, ou mais. Em uma modalidade, o período de tempo entre a cirurgia definitiva e a administração do IgG variante é maior do que 4 semanas (28 dias) e menos do que 1 ano.

[357] Em uma programação de administração, a terapia adjuvante compreende um primeiro estágio em que um IgG variante e um ou mais agentes quimioterapêuticos são administrados aos pacientes em uma pluralidade de ciclos de tratamento; e um segundo estágio em que um IgG variante é usado como um agente único em uma pluralidade de ciclos de manutenção. Em determinadas modalidades, o IgG variante é variante de bevacizumab e um ciclo de tratamento pode ter oito semanas, o que significa que os paciente recebem uma dose de quimioterapia e uma dose de bevacizumab variante a cada oito semanas. Em determinadas modalidades, o ciclo de tratamento também ter doze semanas, o que significa que pacientes recebem uma dose de quimioterapia e uma dose de bevacizumab variante, a cada doze semanas. Em determinadas modalidades, a terapia adjuvante dura por pelo menos um ano a partir do início do tratamento, e o progresso do indivíduo será seguido após aquele período. O progresso da terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

DOSAGENS, FORMULAÇÕES E DURAÇÃO

[358] A composição de IgG variante será formulada, dosada e administrada em um modo consistente com as boas práticas médicas. Os fatores para consideração nesse contexto incluem, mas não se limitam a, distúrbio particular a ser tratado, mamífero particular a ser tratado, condição clínica do paciente individual, causa do distúrbio, sítio de aplicação do agente, método de administração, programação da administração e outros fatores conhecidos dos profissionais médicos. Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um IgG variante, por exemplo, um anticorpo, da invenção (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, o tipo de anticorpo, a severidade e curso da doença, enquanto que o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia prévia, histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e a discrição do médico responsável. O IgG variante é administrado adequadamente ao paciente de uma vez ou através de uma série de tratamentos.

[359] As formulações farmacêuticas no presente documento também podem conter mais do que um composto ativo, conforme necessário, para a indicação particular a ser tratada, de preferência, aqueles com atividades complementares que não afetem desfavoravelmente um ao outro. Essas moléculas estão presentes adequadamente em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade prevista.

[360] A "quantidade terapeuticamente eficaz" do IgG variante, por exemplo, um anticorpo, a ser administrada será administrada por considerações discutidas no presente documento, e é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar ou tratar uma doença ou distúrbio. Em determinadas modalidades, a “quantidade terapeuticamente eficaz” do IgG variante a ser administrada é a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar ou tratar ou estabilizar, um câncer benigno, pré-canceroso ou câncer em estágio precoce; ou para tratar ou prevenir a ocorrência ou recorrência de um tumor, um tumor dormente ou micrometástases, por exemplo, no conjunto neoadjuvante ou adjuvante. O IgG variante precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes usados, atualmente, para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de IgG variante presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento e outros fatores discutidos acima. Esses são, em geral, usados nas mesmas dosagens e com rotas de administração conforme usadas anteriormente no presente documento ou de cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas até agora. Em geral, o alívio ou tratamento de uma doença ou distúrbio envolve a diminuição de um ou mais sintomas ou problemas médicos associados à doença ou distúrbio. Em caso de câncer, a quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode realizar um ou uma combinação dos seguintes: reduzir a quantidade de células de câncer; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, diminuir até certo ponto e/ou parar) a infiltração de célula de câncer em órgãos periféricos; inibir a metástase do tumor; inibir, até certo ponto, o crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dentre os sintomas associados ao câncer. Na medida em que a droga pode evitar o crescimento e/ou exterminar as células cancerosas existentes, essa pode ser citostática e/ou citotóxica. Em algumas modalidades, uma composição dessa invenção pode ser usada para evitar o início ou recorrência da doença ou distúrbio em um indivíduo ou mamífero.

[361] Em determinadas modalidades, a duração da terapia continuará durante o tempo indicado pelo médico ou até um efeito terapêutico desejado (por exemplo, aqueles descritos no presente documento) ser alcançado. Em determinadas modalidades, a terapia com IgG variante é continuada por 2 meses, 4 meses, 6 meses, 8 meses, 10 meses, 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 10 anos ou por um período de anos até a vida inteira do indivíduo.

[362] Em geral, a mitigação ou tratamento de um câncer benigno, pré-canceroso ou câncer em estágio precoce ou a terapia adjuvante ou neoadjuvante de um câncer (benigno ou maligno) envolve a diminuição de um ou mais sintomas ou problemas médicos associados ao câncer. A quantidade terapeuticamente eficaz da droga pode realizar um ou uma combinação dentre os seguintes para reduzir (por exemplo, por 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais) a quantidade de células cancerosas no tumor; para reduzir o tamanho do tumor; para reduzir a carga tumoral; para inibir (isto é, para diminuir até certo ponto e/ou parar) a infiltração da célula de câncer em órgãos periféricos; para reduzir a densidade do vaso no tumor; para inibir a metástase do tumor; para reduzir ou inibir o crescimento do tumor ou a proliferação da célula de tumor; para reduzir ou evitar o crescimento de um tumor dormente; para reduzir ou evitar o crescimento ou proliferação de micrometástases; para reduzir ou evitar o recrescimento de um tumor após tratamento ou remoção (por exemplo, em terapia adjuvante); para aumentar ou extender a DFS ou OS de um indivíduo suscetível a ou diagnosticado com um tumor benigno, pré-canceroso ou não metastático ou um tumor maligno; para reduzir o tamanho de um tumor para permitir a cirurgia (por exemplo, em neoterapia adjuvante); e/ou para aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao câncer. Em algumas modalidades adicionais, o IgG variante pode ser usado para evitar a ocorrência ou recorrência de câncer no indivíduo.

[363] Para a prevenção ou tratamento de uma doença, a dosagem apropriada de um IgG variante da invenção (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, o tipo de anticorpo, a severidade e curso da doença, enquanto que o IgG variante é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e reposta ao IgG variante, e a discrição do me'dico responsável. Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado adequadamente ao paciente de uma vez ou através de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 20 mg/kg (por exemplo, 0,1mg/kg a 15mg/kg) de IgG variante pode ser uma dosagem candidata inicial para administrar ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode se situar na faixa de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para as administrações repetidas ao longo de inúmeros dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento poderia, em geral, ser mantido até que uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorresse. Em uma modalidade, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que o câncer seja tratado, conforme medido pelos métodos descritos no presente documento ou conhecidos na técnica. Uma dosagem exemplificadora do IgG variante poderia se situar na faixa de 0,05 mg/kg a cerca de 20 mg/kg. Dessa forma, uma ou mais doses de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg ou 15 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas de maneira intermitente, por exemplo, a cada três, a cada oito ou a cada doze semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba de duas a cerca de vinte, ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Em determinadas modalidades, uma dose de maior carga inicial, seguida por uma ou mais doses inferiores pode ser administrada. Em determinadas modalidades, o regime de dosagem compreende administrar uma dose de carga inicial de 4 mg/kg, seguida por uma dose de manutenção semanal de 2 mg/kg do anticorpo. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

[364] Em determinadas modalidades, o IgG variante é um anticorpo anti-VEGF. Em determinadas modalidades, o IgG variante é um variante de bevacizumab.

[365] Em determinadas modalidades, a frequência de administração do IgG variante é reduzida comparada à frequência de administração do IgG do tipo selvagem devido à meia-vida aumentada do IgG variante. Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado de maneira menos frequente do que a frequência da dosagem prescrita ou recomendada do IgG do tipo selvagem.

[366] Em determinadas modalidades, em que o IgG variante é um variante de bevacizumab, o IgG variante pode ser determinado a cada 4 semanas ou em intervalos mais longos. Em outra modalidade, o IgG variante pode ser administrado a cada 6 semanas ou mais. Em outra modalidade, o IgG variante pode ser administrado a cada 8 semanas ou mais. Em outra modalidade, o IgG variante pode ser administrado a cada 10 semanas ou mais. Em outra modalidade, o IgG variante pode ser administrado a cada 12 semanas ou mais.

[367] Em determinadas modalidades, o IgG variante pode ser administrado inicialmente a cada 2 semanas e, subsequentemente, a cada 4 semanas ou em intervalos mais longos. Em outra modalidade, o IgG variante pode ser administrado inicialmente a cada 2 a 3 semanas e, subsequentemente a cada 6 semanas ou mais. Em outra modalidade, o IgG variante pode ser administrado inicialmente a cada 2 a 4 semanas e, subsequentemente, a cada 8 semanas ou mais. Em outra modalidade, o IgG variante pode ser administrado inicialmente a cada 2 a 5 semanas e, subsequentemente, a cada 10 semanas ou mais. Em outra modalidade, o IgG variante pode ser administrado inicialmente a cada 2 a 6 semanas e, subsequentemente, a cada 12 semanas ou mais. Em determinadas modalidades, o IgG variante, por exemplo, uma variante de bevacizumab, é administrado inicialmente com a frequência de dosagem prescrita de bevacizumab e, posteriormente, administrado menos frequqntemente do que a frequência de dosagem prescrita de bevacizumab. Em determinadas modalidades, bevacizumab é administrado inicialmente na frequência de dosagem prescrita e uma variante de bevacizumab é, posteriormente, administrada menos frequentemente do que a frequência de dosagem prescrita de bevacizumab.

[368] Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado a cada 14 dias ou em intervalos mais longos. Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado a cada 21 dias ou mais. Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado a cada 28 dias ou mais. Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado a cada 60 dias ou mais. Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado a cada mês ou em intervalos mais longos. Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado a cada dois meses ou mais. Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado a cada três meses ou mais.

[369] Em determinadas modalidades, o paciente é tratado com uma combinação do IgG variante e um ou mais outros agentes terapêuticos. A administração combinada inclui co-administração ou administração concorrente, usando formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única e administração consecutiva em qualquer ordem, em que exista opcionalmente um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos exerçam simultaneamente suas atividades biológicas. As quantidades eficazes de agentes terapêuticos administrados em combinação com um IgG variante ficarão a critério do médico ou veterinário. A administração da dosagem e ajuste é feito para alcançar a gestão máxima das condições a serem tratadas. Esta dose dependerá, adicionalmente, de tais fatores como o tipo de agente terapêutico a ser usado e o paciente especifico sendo tratado. Em determinadas modalidades, dosagens adequadas para o IgG variante são atualmente usadas para seus IgG do tipo selvagem e podem ser diminuídas devido ao aumento de meia-vida e/ou a ação combinada (sinergia) do IgG variante e o agente terapêutico adicional usado. Em determinadas modalidades, a combinação dos inibidores potencializa a eficácia de um inibidor único. O termo "potencializa" se refere a um aprimoramento na eficácia de um agente terapêutico em sua dose comum ou aprovada.

[370] Em determinadas modalidades, os regimes de dosagem discutidos no presente documento são usados em combinação com um regime quimioterpêutico. Em determinadas modalidades, o regime de quimioterapia envolve a administração intermitente de alta dose tradicional. Em determinadas modalidades, os agentes quimioterapêuticos são administrados com o uso de doses menores e mais frequentes sem interrupções programadas (“quimioterapia metronômica”).

[371] Em determinadas modalidades, o paciente é tratado com uma combinação do IgG variante e um ou mais agentes quimioterapêutico. Em determinadas modalidades, o agente quimioterapêutico pode ser administrado antes de, ou seguindo, a administração do IgG variante. Em uma modalidade, a sincronização entre pelo menos uma administração do agente quimioterapêutico e pelo menos uma administração do IgG variante é de aproximadamente 1 mês ou menos. Em uma modalidade, a sincronização entre pelo menos uma administração do agente quimioterapêutico e pelo menos uma administração do IgG variante é de aproximadamente 2 semanas ou menos. Alternativamente, o agente quimioterapêutico e o IgG variante são administrados concomitantemente ao paciente, em uma única formulação ou em formulações separadas. O tratamento com a combinação do agente quimioterapêutico e o IgG variante pode resultar em um benefício terapêutico sinérgico ou mais do que aditivo ao paciente.

[372] O agente quimioterapêutico, se administrado, é usualmente administrado em dosagens conhecidas do mesmo ou, opcionalmente, diminuído devido à ação combinada das drogas ou efeitos colaterais negativos atribuíveis à administração do agente quimioterapêutico antimetabólito. As programações de preparação e dosagem para tais agentes quimioterapêuticos podem ser usadas de acordo com as instruções do fabricante ou conforme determinado de fomra empírica pelo elemento versado.

[373] Vários agentes quimioterapêuticos que podem ser combinados são revelados no presente documento, por exemplo, sob Definições. Os exemplos de agentes quimioterapêuticos a serem combinados com o IgG variante incluem, mas não são limitados a, por exemplo, um taxóide (incluindo docetaxel e paclitaxel), vinca (tal como vinorelbina ou vinblastina), composto de platina (como carboplatina ou cisplatina), inibidor de aromatase (como letrozol, anastrazol ou exemestano), anti-estrogênio (por exemplo, fulvestranto ou tamoxifeno), etopósido, tiotepa, ciclofosfamida, metotrexato, doxorrubicina lipossomal, doxorrubicina lipossomal peguilhada, capecitabina, gemcitabina, inibidor COX-2 (por exemplo, celecoxibe), ou inibidor proteossoma (por exemplo, PS342). “Coquetéis” de diferentes agentes quimioterapêuticos podem ser administrados.

[374] O progresso da terapia da invenção é facilmente monitorado por ensaios e técnicas convencionais.

[375] Em determinadas modalidades, o tratamento ou prevenção da ocorrência ou recorrência de um tumor, um tumor dormente ou micrometástases envolve a prevenção de tumor ou formação de metátases, em geral, após tratamento inicial ou remoção de um tumor (por exemplo, usando uma terapia anti-câncer como cirurgia, quimioterapia ou terapia de radiação). A cirurgia pode deixar células de tumor residuais ou nódulos micrometastáticos dormentes, que têm o potencial de reativar o “programa angiogênico” e facilitam o crescimento tumoral mais exponencial. Apesar de a presença de um tumor dormente ou micrometástases não ser necessariamente detectável com o uso de emdições clínicas ou triagens, uma quantidade terapeuticamente eficaz é aquela que é suficiente para evitar ou reduzir a detecção do tumor dormente, micrometástases, metástases ou recorrência do tumor com o uso de técnicas conhecidas do clínico. Em um exemplo, um indivíduo que é tratado em relação a um tumor através de remoção cirúrgica do tumor é, então, tratado com um IgG variante e monitorado ao longo do tempo para a detecção de um tumor dormente, micrometástases ou recorrência do tumor. O IgG variante, por exemplo, um anticorpo anti-VEGF, pode ser administrado em combinação com outra terapia anti-câncer (por exemplo, antes, com ou após o IgG variante) e uma ou ambas as terapias podem ser continuadas como uma terapia de manutenção.

[376] As medições adicionais da eficácia terapêutica no tratamento de cânceres são descritas na Publicação do Pedido de Patente N° U.S.20050186208.

[377] O IgG variante da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por quaisquer meios adequados, incluindo administração parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intracérebro-espinhal, intrapulmonar e intranasal, e, caso seja desejado para um tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Em determinadas modalidades, o IgG variante, por exemplo, um anticorpo, é administrado adequadamente por infusão de pulso, particularmente, com doses declinantes do IgG variante. A dosagem pode ser através de qualquer rota adequada, por exemplo, por injeções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte, se a administração é breve ou crônica. Em determinadas modalidades, o IgG variante é administrado a um indivíduo de modo intravenoso, por exemplo, como um bolus ou por infusão contínua sobre um período de tempo.

[378] A localização do alvo de ligação de um IgG variante, por exemplo, um anticorpo, da invenção pode ser levado em consideração na preparação e administração do IgG variante. Quando o alvo de ligação de um IgG variante está localizado no cérebro, determinadas modalidades da invenção preveem que o IgG variante atravesse a barreira sangue-cérebro. Inúmeras abordagens conhecidas na técnica existem para transportar moléculas através da barreira sangue-cérebro, incluindo, masn não se limitando a, métodos físicos, métodos baseados em lipídios, métodos baseados em células-tronco e métodos baseados em canal e receptor.

[379] Os métodos físicos de transporte de um IgG variante, por exemplo, um anticorpo, através da barreira sangue-cérebro incluem, mas não se limitam a, envolver totalmente a barreira sangue-cérebro ou através da criação de aberturas na barreira sangue-cérebro. Os métodos de envolvimento incluem, mas não se limitam a, injeção direta no cérebro (ver, por exemplo, Papanastassiou et al., Gene Therapy 9: 398 a 406 (2002)), infusão intersticial/aplicação melhorada por convecção (ver, por exemplo, Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076 a 2080 (1994)), e implantação de um dispositivo de aplicação no cérebro (ver, por exemplo, Gill et al., Nature Med. 9: 589 a 595 (2003); e Gliadel Wafers™, Guildford Pharmaceutical). Os métodos de criação de aberturas na barreira incluem, mas não se limitam a, ultrassom (ver, por exemplo, Publicação de Patente N° U.S.2002/0038086), pressão osmótica (por exemplo, por administração de manitol hipertônico (Neuwelt, E. A., Implication of the Sangue-cérebro Barrier and its Manipulation, Volumes 1 & 2, Plenum Press, N.Y. (1989)), permeabilização por, por exemplo, bradicinina ou permeabilizador A-7 (ver, por exemplo, Patentes Nos U.S.5.112.596, 5.268.164, 5.506.206 e 5.686.416), e transfecção de neurônios que escancham a barreira sangue-cérebro com vetores que contêm genes que codificam o IgG variante (ver, por exemplo, Publicação de Patente N° U.S.2003/0083299).

[380] Os métodos baseados em lipídeos de transporte de um IgG variante, por exemplo, um anticorpo, através da barreira sangue-cérebro incluem, mas não se limitam a, encapsulação do IgG variante em lipossomos que são acoplados aos fragmentos que aglutinam anticorpo que se liga aos receptores no endotélio vascular da barreira sangue-cérebro (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente N° U.S. 20020025313), e revestimento do IgG variante em partículas de lipoproteína de baixa densidade (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente N° U.S. 20040204354) ou apolipoproteína E (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente N° U.S. 20040131692).

[381] Os métodos baseados em célula-tronco de transporte de um IgG variante, por exemplo, um anticorpo, através da barreira sangue-cérebro confere células progenitoras neurais geneticamente projetadas (NPCs) para expressar o anticorpo de interesse e, então, implantando as células-tronco no cérebro do indivíduo a ser tratado. Ver, Behrstock et al. (2005) Gene Ther. 15 de dezembro de 2005 publicação on-line avançada (relatando que NPCs geneticamente projetadas expressam os sintomas reduzidos do fator neurotrófico GDNF da doença de Parkinson quando implantadas nos cérebros de modelos de roedores e primatas).

[382] Os métodos baseados em canal e receptor de transporte de um IgG variante, por exemplo, um anticorpo, através da barreira sangue-cérebro incluem, mas não se limitam a, usar bloqueadores glucocorticóides para aumentar a permeabilidade da barreira sangue-cérebro (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente Nos U.S.2002/0065259, 2003/0162695 e 2005/0124533); ativar canais de potássio (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente N° U.S. 2005/0089473), inibir transportadores de droga ABC (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente N° U.S. 2003/0073713); revestir anticorpos com transferrina e modular a atividade do um ou mais receptores de tranferrina (ver, por exemplo, Publicação de Pedido de Patente N° U.S. 2003/0129186), e cationizar os anticorpos (ver, por exemplo, Patente N° U.S. 5.004.697).

[383] As formulações farmacêuticas que compreendem um IgG variante, por exemplo, um anticorpo, da invenção são preparadas para o armazenamento, através da mistura do IgG variante que tem o grau desejado de pureza com veículos fisiologicamente aceitáveis opcionais, excipientes ou estabilizadores (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a edição (2000)), sob a forma de soluções aquosas, liofilizadas ou outras formulações secas. Veículos, excipientes ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos a recipientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões como fosfato, citrato, histidina e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; preservativos (como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto benzalcônio, cloreto benzetônio; fenol, butil ou álcool benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m- cresol); baixo peso molecular (menor do que cerca de 10 resíduos) polipeptídeos; proteínas, como soro albumina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glucose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

[384] Os ingredientes ativos também podem ser capturados em microcápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsula de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de aplicação de droga coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nano-partículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são reveladas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a edição (2000).

[385] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é imediatamente realizado pela filtração através das membranas de filtração estéreis.

[386] As preparações de liberação prolongada podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo a imunoglobulina da invenção, cujas matrizes estão sob a forma de artigos conformados, por exemplo, filmes ou microcápsula. Os exemplos de matrizes de liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2- hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (Patente N° U.S.3.773.919), copolímeros de ácido glutâmico L e y etil-L-glutamato, acetato de etileno vinil não degradável, copolímeros de ácido glicólico- ácido lático degradáveis como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido de poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Apesar de os polímeros como acetato de etileno-vinil e ácido lático-ácido glicólico permitirem a liberação de moléculas por mais de 100 dias, determinados hidrogéis liberam proteínas por curtos períodos de tempo. Quando as imunoglobulinas encapsuladas permenecem no corpo por um longo período, elas podem desnaturar ou se agregar como resultado da exposição à mistura a 37°C, resultando em uma perda de atividade biológica e alterações possíveis na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser planejadas para a estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação for revelado por ser uma formação de ligação S-S intermolecular através de troca tio-dissulfeto, a estabilização poderá ser alcançada através da modificação de resíduos sulfidrila, liofilização a partir de soluções ácidas, controle do teor da mistura, uso de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz de polímero específicas. EFICÁCIA DO TRATAMENTO

[387] A eficácia de IgGs variantes pode ser medida de vários modos, incluindo, mas não se limitando aos métodos descritos no presente documento sob “Definições.” Por exemplo, a eficácia no tratamento de tumor pode ser medida pela detecção da capacidade de um IgG variante para inibir ou reduzir o crescimento ou metástase de tumor. Em determinadas modalidades, um IgG variante tem eficácia superior comparada a um IgG do tipo selvagem se o IgG variante for capaz de reduzir a taxa de crescimento de tumor comparada ao crescimento de tumor alcançado com o tratamento que usa IgG do tipo selvagem. Em determinadas modalidades, um IgG variante tem eficácia superior comparado ao IgG do tipo selvagem se o IgG variante puder alcançar a inibição máxima de crescimento do tumor em uma dose de IgG inferior à dose que é necessária para que o IgG do tipo selvagem alcance a inibição máxima de crescimento de tumor. Em determinadas modalidades, um IgG variante tem eficácia superior comparado ao IgG do tipo selvagem se o IgG variante tiver a capacidade para inibir ou reduzir o crescimento ou metástase de células cancerosas em uma dose inferior de IgG dose do que a dose necessária para o IgG do tipo selvagem. Em determinadas modalidades, os IgGs variantes da presente invenção têm eficácia igual ou superior comparados com os IgGs do tipo selvagem. Em determinadas modalidades, IgGs variantes da presente invenção não têm eficácia inferior comparados às IgGs do tipo selvagem.

[388] A eficácia do tratamento da invenção também pode ser medida por várias finalidades comumente usadas na avaliação de distúrbios neoplásticos ou não-neoplásticos. Por exemplo, os tratamentos de câncer podem ser avaliados por, por exemplo, mas não se limitando a, regressão do tumor, tamanho do tumor ou redução do tamanho, tempo até a progressão, duração de sobrevivência, sobrevivência livre de progressão, taxa de resposta geral, duração da resposta, qualidade de vida, expressão e/ou atividade da proteína. Devido ao fato de determinados agentes descritos no presente documento, tais como os agentes anti-angiogênicos, alvejarem a vasculatura do tumor e, não necessariamente, as próprias células neoplásticas, esses representam uma classe única de drogas anticâncer e, dessa forma, podem exigir medidas e definições únicas de respostas clínicas às drogas. Por exemplo, a redução do tumor em mais do que 50% em uma análise bi-dimensional é o corte padrão para a declaração de uma resposta. Entretanto, os inibidores da invenção podem causar a inibição de espalhamento metastático sem a redução do tumor primário ou podem, simplesmente, exercer um efeito tumorestático. Em conformidade, as abordagens para determinar a eficácia da terapia podem ser empregadas, incluindo, por exemplo, medição de plasma ou marcadores urinários de angiogênese e medição de resposta através de imageamento radiológico.

TERAPIAS DE COMBINAÇÃO

[389] Os tratamentos terapêuticos descritos no presente documento podem ser administrados com outros tratamentos terapêuticos concomitantemente, isto é, os tratamentos terapêuticos descritos no presente documento podem ser co-administrados com outras terapias ou tratamentos terapêuticos, incluindo, por exemplo, moléculas pequenas, outros tratamentos biológicos, terapia de radiação, cirurgia, etc.

[390] Em determinadas modalidades, um IgG variante é o único agente terapeuticamente ativo administrado a um paciente. Em determinadas modalidades, um IgG variante é administrado em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos, incluindo, mas não se limitando a, agentes anti- angiogênicos, agentes quimioterapêuticos, citoquinas, agentes inibitórios de crescimento, agentes anti-hormonais, inibidores de cinase, agentes citotóxicos, cardioprotetores ou outros agentes terapêuticos. Os IgGs variantes podem ser administrados concomitantemente com um ou mais outros regimes terapêuticos. Em determinadas modalidades, um IgG variante pode ser administrado em conjunto com um ou mais anticorpos, que podem ou não ser um IgG variante. Em determinadas modalidades, os IgGs variantes podem ser empregados em combinação com ainda outras técnicas terapêuticas como cirurgia.

[391] Em determinadas modalidades, agentes adicionais, por exemplo, agentes anti-câncer ou tratamentos terapêuticos ou agentes anti- angiogênese, também podem ser administrados em combinação com IgG variante para tratar várias condições neoplásticas ou não neoplásticas. Em uma modalidade, a condição neoplástica ou não neoplástica é caracterizada por distúrbio patológico associado à angiogênese indesejada ou anormal. Os IgGs variantes da invenção podem ser administrados em série ou em combinação com outro agente que é eficaz para aqueles propósitos, em uma mesma composição ou como composições separadas usando as rotas de administração iguais ou diferentes.

[392] A terapia anti-angiogênica em relação ao câncer é uma estratégia de tratamento de câncer voltada para a inibição do desenvolvimento de vasos sanguíneos do tumor necessários para o fornecimento de nutrientes que sustentam o crescimento do tumor. Em determinadas modalidades, devido ao fato de a angiogênese estar envolvida tanto no crescimento do tumor primário e metástase, o tratamento anti-angiogênico fornecido pela invenção é capaz de inibir o crescimento neoplástico do tumor no sítio primário, bem como evitar a metástase de tumores nos sítios secundários, dessa forma, permitindo o ataque dos tumores por outros tratamentos terapêuticos. Em uma modalidade da invenção, agente anti-câncer ou terapêutico é um agente anti-angiogênico. Em outra modalidade, o agente anti-câncer é um agente quimioterapêutico.

[393] Muitos agentes anti-angiogênicos têm sido identificados e são conhecidos nas técnicas, incluindo aqueles listados no presente documento, por exemplo, listados sob Definições e por, por exemplo, Carmeliet e Jain, Nature 407:249 a 257 (2000); Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391 a 400 (2004); e Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200 a 206 (2003). Ver também, Publicação de Patente N° U.S.20030055006. Em determinadas modalidades, dois ou mais inibidores de angiogênese podem, opcionalmente, ser co- administrados ao paciente em adição ao IgG variante da invenção.

[394] Em determinadas modalidades, outros agentes terapêuticos que podem ser combinados com o IgG variante são um antagonista VEGF ou antagonistas do receptor VEGF. Em determinadas modalidades, outros agentes terapêuticos úteis para a combinação de terapia de tumor com o IgG variante incluem o antagonista de outros fatores que estão envolvidos no crescimento de tumor, como EGFR, ErbB2 (também conhecido como Her2) ErbB3, ErbB4 ou TNF. Em determinadas modalidades, o IgG variante pode ser usado em combinação com inibidores do receptor tirosina quinase de molécula pequena (RTKIs) que alvejam um ou mais receptores tirosina quinase como receptores VEGF, receptores FGF, receptores EGF e receptores PDGF. Muitos RTKIs de molécula pequena terapêuticos são conhecidos na técnica, incluindo, mas não se limitando a, vatalanibe (PTK787), erlotinibe (TARCEVA®), OSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®), ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinibe (SUTENT®), semaxanibe (SU5416), AMG706, AG013736, Imatinibe (GLEEVEC®), MLN-518, CEP-701, PKC- 412, Lapatinibe (GSK572016), VELCADE®, AZD2171, sorafenibe (NEXAVAR®), XL880 e CHIR-265.

[395] A invenção também retrata o uso de uma combinação de dois ou mais IgGs variantes da invenção ou a combinação de pelo menos um IgG variante com uma ou mais terapias anti-câncer adicionais. Os exemplos de terapias anti-câncer incluem, sem limitação, cirurgia, terapia de radiação (radioterapia), bioterapy, imunoterapia, quimioterapia ou uma combinação dessas terapias. Em uma modalidade, a terapia anti-câncer para o câncer de próstata, câncer de ovário e câncer de mama pode ser terapia hormonal. Em adição, agentes citotóxicos, agentes anti-angiogênicos e anti-proliferativos podem ser usados em combinação com o IgG variante. Em determinadas modalidades, um IgG variante é administrado ao paciente junto com quimioterapia, terapia de radiação ou com quimioterapia e terapia de radiação.

[396] Em determinadas modalidades, o IgG variante é usado como terapia adjuvante para o tratamento de um câncer não metastático seguida por cirurgoa definitiva. Nesse exemplo, o IgG variante pode ser fornecido com ou sem pelo menos um agente quimioterapêutico adicional.

[397] Em determinadas modalidades, o IgG variante é usado como neoterapia adjuvante para o tratamento de um câncer operável antes da cirurgia. Nesse exemplo, o IgG variante pode ser fornecido antes da cirurgia com ou sem pelo menos um agente quimioterapêutico adicional.

[398] Em determinadas modalidades, o IgG variante e o um ou mais outros agentes terapêuticos podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente em uma quantidade e por um tempo suficiente para reduzir ou eliminar a ocorrência ou recorrência de um tumor, um tumor dormente ou micrometástases. O IgG variante e o um ou mais outros agentes terapêuticos podem ser administrados como terapia de manutenção para evitar ou reduzir a probabilidade de recorrência do tumor.

[399] Em determinadas modalidades, a invenção retrata o uso de um IgG variante com um ou mais agentes quimioterapêuticos (por exemplo, um coquetel). Exemplos não limitadores de agentes quimioterapêuticos são descritos no presente documento sob Denfinições. As programações de preparação e dosagem para tais agentes quimioterapêuticospodem ser usadas de acordo com as instruções do fabricante ou conforme determinado empiricamente pelo elemento versado, ver, também, seção intitulada Dosagens, Formulações e Duração. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[400] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de fabricação contendo materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico dos distúrbios descritos acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um identificador ou intruções para uso no ou associado ao recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente guarda uma composição que é sozinha ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasco que tenha uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). O identificador ou instrução para uso indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. Em determinadas modalidades, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um IgG variante da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional ou, de outra forma, um agente terapêutico. O artigo de fabricação pode compreender adicionalmente uma instrução para uso indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição particular. Alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode compreender adicionalmente um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), salina tamponada de fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Esse pode incluir adicionalmente outros materiais desejáveis a parit de um ponto de vista de usuário e comercial, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[401] Em determinadas modalidades, o IgG variante pode ser embalado sozinho ou em combinação com outros compostos terapêuticos como um kit. Em uma modalidade, o composto terapêutico é um agente anti-câncer. O kit pode incluir componentes opcionais que auxiliam na administração da dose unitária aos pacientes, como frascos para reconstituir formas em pó, seringas para injeção, sistemas de aplicação IV customizados, inaladores, etc. Adicionalmente, o kit de dose unitária pode conter instruções para a preparação e administração das composições. O kit pode ser fabricado como uma dose unitária única para um paciente, usos múltiplos para um paciente particular (em uma dose constante ou em que os compostos individuais podem variar na potência como pregressos da terapia); ou o kit pode conter doses múltiplas adequadas para administração a múltiplos pacientes (“embalamento a granel”). Os componentes do kit podem ser montados em caixas de papelão, embalagens de plástico, garrafas, tubos e similares.

EXEMPLOS

[402] A seguir estão exemplos de métodos e composições da invenção. É compreendido que várias outras modalidades podem ser praticadas, concedendo a descrição geral fornecida abaixo.

EXEMPLO 1: PRODUÇÃO DE VARIANTES ANTI-VEGF (BEVACIZUMAB)

[403] As regiões Fv de IgG1 anti-VEGF (Bevacizumab) do tipo selvagem pesadas e leves foram clonadas separadamente em dois plasmídeos de ransfecção transientes baseados em Prk contendo domínios constantes de IgG1 humano. A mutagênese direcionada ao sítio com base em Kunkel foi, então, usada para gerar todos os IgG1 variantes anti-VEGF nos quais os resíduos nos domínios CH2 e CH3 foram mutados. As variantes anti-VEGF geradas nesse estudo são resumidas na Tabela 2 abaixo. Cada variante contém mutações únicas, duplas e triplas nos domínios CH2 e CH3. As variantes são numeradas de acordo com o índice EU como em Kabat. TABELA 2

[404] Os plasmídeos contendo a cadeia pesada e cadeia leve do tipo selvagem das variantes foram co-transfectados na linhagem celular de rim embriônico humano transformado por adenovirus 293 pela FUGENE® (Roche, Basel, Suíça) de acordo com o protocolo do fabricante. Após 24 horas de incubação com os complexos de transfecção, as células transfectadas foram, então, cultivadas tanto com PSO4 de meio livre de soro suplementado com 10mg/l de insulina quanto com elementos de traço por 5 dias ou meio a 1,3X GEM N com 5 mM de Glutamina. Os sobrenadantes foram coletados e condicionados com 1M TRIS de pH 8,0 e cloreto de sódio a 5M (NaCl) para rneder uma concentração final de 30 mM de TRIS e 50 mM de NaCl. Os sobrenadantes condicionados foram, então, purificados com o uso de cromatografia de Proteína A. O IgG1 aglutinado foi eluído a partir da coluna de Proteína A com tampão de glicina a 0,1M e pH 3,0. A seguir, o IgG1 purificado foi concentrado e injetado sobre uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho Superdex-200 para remover quaisquer agregados. As frações de IgG1 monoméricas foram agrupadas e, posteriormente, usadas para os estudos de ligação. As concentrações de IgG1 variantes anti-VEGF e anti-VEGF do tipo selvagem foram calculadas com o uso de leitura de absorbância a 280 nM e uma absorbância de 1,5 foi estimada por ser 1mg/ml de IgG1. EXEMPLO 2: PRODUÇÃO DE FCRN DE MACACO CINOMOLGO E HUMANO

[405] O FcRn humano é um heterodímero de uma subunidade de cadeia alfa e de β2-microglobulina. Essas duas subunidades foram clonadas separadamente em dois plasmídeos de transfecção transientes baseados em pRK. Os plasmídeos contendo tanto cadeia alfa quanto uma β2-microglobulina foram co-transfectados em 293 células usando FUGENE® (Roche, Basel, Suíça) de acordo com o protocolo do fabricante. Após 24 horas de incubação com os complexos de transfecção, as células transfectadas foram, então, mudadas para meio PSO4 livre de soro suplementado com 10 mg/l de insulina e elementos de traço por 5 dias. Os sobrenadantes coletados foram filtrados e condicionados com ácido hidroclorídrico a 1M e NaCl a 5M para render um pH final de 6,0 e uma concentração de NaCl a 50 mM. Os sobrenadantes condicionados foram purificados com o uso de cromatografia em sefarose de IgG. O FcRn aglutinado foi eluído a partir da coluna usando um tampão de pH 8,0 contendo 30 mM TRIS e 150 mM NaCl. O FcRn eluído foi purificado adicionalmente usando uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho Superdex-75 para remover quaisquer agregrados. A concetração de FcRn foi calculada com o uso de leitura de absorbância a 280 nM, e uma absorbância de 1,9 correspondeu por ser 1mg/ml de FcRn. O FcRn de macaco cinomolgo é produzido e purificado similarmente ao FcRn humano, exceto pelo fato de que os plasmídeos que contêm a cadeia alfa de cino e β2-microglobulina de cino foram usados para a transfecção. EXEMPLO 3: ESTUDOS DE LIGAÇÃO DE FCRN: INJEÇÃO DE VARIANTES DE IGGI SOBRE FCRN

[406] A ligação de variantes anti-VEGF com FcRn humano foi estudada por ressonância de plásmon de superfície usando um instrumento BIAcore 3000 (GE healthcare, Piscataway, NJ, EUA). O FcRn humano foi acoplado ao chip de sensor usando um kit de acoplamento amina. Especificamente, o chip de sensor CM5 foi ativado com EDC/NHS por 7min a 5μl/min. 100μg/ml de FcRn humano foram injetados por 30 s a 2 min em uma taxa de fluido de 10μl/min sobre o chip ativado para render uma unidade de resposta de ligação máxima (RU) de 50 a 200. Após a conjugação, o chip acoplado de FcRn foi bloqueado por uma injeção de 35μl de hidrocloreto de etanolamina a 1M em 5μl/min.

[407] As variantes de anti-VEGF de tipo selvagem (WT) e de anti- VEGF que se aglutinam ao FcRn humano em pH 6,0 ou pH 7,4 foram determinadas. O tampão de execução para o experimento de ligação é PBS de pH 6,0 ou pH 7,4 contendo 0,01% de P20 e 0,02% de azida de sódio. As variantes de anti-VEGF (Bevacizumab) WT e de anti-VEGF foram trocadas de tampão para um tampão de execução de pH 6,0 ou pH 7,4. Todos os experimentos foram realizados a 25oC. Para a execução de pH 6,0 run, as variantes, com concentrações na faixa de 15 μM a 0,7 nM, fluíram sobre um chip revestido de FcRn em 30μl/min por várias vezes para atingir o estado estacionário e, então, permitiu-se que se dissociassem do chip por 5min. Para a execução de pH 7,4, as variantes, com concentrações na faixa de 30 μM a 30 nM, foram injetadas sobre o chip revestido de FcRn em 20 μl/min por várias vezes para tingir o estado estacionário e, então, liberadas por 2min. As variantes também fluíram em uma mancha não conjugada sobre o chip de sensor para permitir a subtração da ligação não específica de fundo a partir da ligação com o chip acoplado ao FcRn. O chip foi regenerado com pulso de 30 s de 0,1M TRIS de pH 8,3 entre as injeções. O RU de estado estacionário para cada injeção foi gravado no fim de cada fase de injeção e as constantes de dissociação aparentes (KD aparente) foram estimadas posteriormente à medida que as concentrações de IgG atingiram 50% de RU máximo.

[408] Os resultados na Figura 1A e 1B, resultantes de duas execuções diferentes, mostram que todas as variantes aperfeiçoaram a afinidade de FcRn com tipo selvagem em pH 6. As estimativas das constantes de dissociação aparentes (KD) são mostradas na Tabela A. Visto que a densidade do acoplamento de FcRn diferiu para as duas execuções, o nível de avidez foi diferente, resultando em valores de KD aparentes ligeiramente diferentes para a mesma variante. Entretanto, a classificação de afinidade dessas variantes permaneceu igual para diferentes execuções. TABELA A

[409] A Figura 3 mostra que todas as variantes anti-VEGF testadas exibiram ligação ao FcRn humano de pH altamente neutro comparadas às do tipo selvagem. A classificação de afinidade das variantes baseada na ligação de pH 7,4 correspondeu à classificação de afinidade determinada com o uso de ligação de pH 6. TABELA 3

[410] A ligação de FcRn humano e de cino das variantes anti-VEGF do tipo selvagem (WT) e anti-VEGF mostrada na Tabela Table 3 foi avaliada adicionalmente com o uso desse formato de ensaio. O FcRn humano e de cino foi revestido em chips de sensor. As variantes anti-VEGF do tipo selvagem e anti-VEGF foram injetadas sobre chips revestidos de FcRn a 25oC em tampão de pH 6,0 ou de pH 7,4. As unidades de resposta de estado estacionário foram gravadas e plotadas como uma função de concentrações de injeção. Todas as variantes anti-VEGF mostraram ligação aperfeiçoada em relação ao FcRn humano e de cino sobre anti-VEGF do tipo selvagem tanto em pH 6,0 quanto em pH 7,4 (ver, Fig. 4A a-4D). A classificação de afinidade para as variantes anti- VEGF determinadas nesse ensaio foi igual à classificação determinada com o uso de KD monovalente.

[411] A ligação de FcRn humano das variantes anti-HER2 do tipo selvagem (WT) e anti-HER2 mostradas na Figura 26 também foi avaliada com o uso desse formato de ensaio. As variantes estudadas na Figura 26 são L251A, L314A, L314D, L314K, E430A, E430K, L251D/N434H e L314D/N434H. O FcRn humano foi revestido sobre chips de sensor. As variantes anti-HER2 do tipo selvagem e anti-HER2 foram injetadas sobre os chips revestidos com FcRn a 25oC em tampões com pH na faixa de 6,0 a 7,2. As unidades de resposta de estado estacionário foram gravadas e plotadas como uma função de concentrações de injeção para cada pH. As afinidades de tipo selvagem e cada variante foram, então, estimadas para cada pH de injeção e a razão de afinidade entre a variante e do tipo selvagem foi plotada como uma função de pH na Figura 26. As razões de afinidade para variantes E430A, E430K e L251D/N434H diminuem com o aumento de pH; enquanto que as razões de afinidade para todas dentre as outras variantes aumentam com o aumento de pH.

[412] As ligações de IgG1 anti-HER2 (traztuzumab) do tipo selvagem, T307Q/N434A variante, L251D/T307Q/N434H variante L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I variante com FcRn humano em pH 6,0 (Fig. 27A), pH 7,1 (Fig. 27B) e pH 7,4 (Fig. 27C) também foram avaliadas com o uso do formato de ensaio similar. As variantes anti-HER2 do tipo selvagem e anti- HER2 foram injetadas sobre os chips revestidos com FcRn a 25oC em tampão de pH 6,0, pH 7,1 ou pH 7,4. As unidades de resposta de estado estacionário foram gravadas e plotadas como uma função de concentrações de injeção para cada avariante. Os resultados mostram que em pH 6,0 (Fig. 27A), L251D/T307Q/N434H variant tem afinidade de FcRn similar à do tipo selvagem e L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I variante tem afinidade de FcRn similar à T307Q/N434A variante. Em pH 7,1 (Fig. 27B), L251D/T307Q/N434H variante tem afinidade de FcRn muito menor do que a do tipo selvagem; e L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I variante tem afinidade de FcRn similar à do tipo selvagem e afinidade de FcRn muito menor do que T307Q/N434A variante. Em pH 7,4 (Fig. 27C), L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I variante tem afinidade de FcRn muito menor do que a do tipo selvagem e a T307Q/N434A variante.

EXEMPLO 4: ESTUDOS DE LIGAÇÃO DE FCRN: INJEÇÃO DE FCRN HUMANO OU DE CINO SOBRE VARIANTES DE IGGI

[413] No formato de ligação usando um instrumento BIAcore 3000 (GE healthcare, Piscataway, NJ, EUA), variantes anti-VEGF do tipo selvagem (Bevacizumab) e anti-VEGF foram conjugadas com células de fluxo diferentes do chip de sensor usando um kit de acoplamento amina. Especificamente, o chip de sensor CM5 foi ativado com EDC/NHS por 7 min a 5μl/min. 10 s 50μg/ml de anticorpos foram injetados por 30 s a 2 min em uma taxa de fluido de 10μl/min sobre o chip ativado para render uma unidade de resposta de ligação máxima (RU) de 50 a 200. Após a conjugação, o chip acoplado ao FcRn foi bloqueado por uma injeção de 35μl de hidrocloreto de etanolamina a 1M em 5μl/min.

[414] O tampão de execução para os experimentos de ligação foi PBS de pH 6,0/ P20 a 0,01% / azida de sódio (NaN3) a 0,02%. As diluições de FcRn humano ou de cino solúveis de 20 μM a 0,15 nM foram injetadas em uma taxa de fluido de 30μl/min por 10 min sobre o chip de sensor revestido com anticorpo a 25oC. As RUs de estado estacionário foram gravadas no fim da injeção. O chip foi regenerado com um pulso de 30 s de 0,1 M TRIS pH 8,5/0,15 M NaCl. O FcRn também foi injetado sobre uma superfície não conjugada para subtração de fundo. Os parâmetros cinéticos e as constantes de ligação de equilíbrio monovalente (KD) foram calculados usando o software de avaliação BIA (GE healthcare, Piscataway, NJ, EUA).

[415] Os resultados na Tabela B e Tabela C mostram que todas dentre as variantes anti-VEGF aperfeiçoaram a afinidade de FcRn em relação à do tipo selvagem para o FcRn humano e de cino em pH 6,0. Os aperfeiçoamentos de afinidade se deram devido aos aumentos nas constantes de taxa de associação e reduções nas constantes de taxa de dissociação. Em geral, os aperfeiçoamentos de afinidade de FcRn das variantes anti-VEGF em relação àquelas do tipo selvagem com o uso de ensaios de ligação diferentes são resumidos na Tabela D. A Tabela D mostra que a variante V308P/N434A teve a afinidade de FcRn mais alta entre as variantes listadas na Tabela 3, seguida por T307Q/E380A/N434S, T307Q/N434S e T307Q/N434A. A variante N434H teve a menor quantidade de aperfeiçoamento de afinidade de FcRn em relação à do tipo selvagem.

EXEMPLO 5: TAXAS DE DISSOCIAÇÃO DAS VARIANTES ANTI-VEGF E ANTI-HER2 EM PHS DIFERENTES

[416] Para medir as taxas de dissociação em vários pH’s, 200 nM a 2 mM de FcRn humano ou de cino foram primeiramente injetados sobre uma célula de fluxo conjugada a um anticorpo em 30μl/min em PBS pH 6,0/0,01% P20/0,02% NaN3 por 5 min para tingir o estado estacionário. Depois, o tampão PBS em pHs na faixa de 6 a 7,4 foram injetados em 30μl/min sobre a célula de fluxo por 8min para permitir que o complexo se dissociasse. O FcRn também foi injetado sobre uma superfície não conjugada para a subtração de fundo. As constantes de taxa de dissociação foram determinadas pelo ajuste da fase de dissociação do sensorgrama usando o software de avaliação BIA (GE healthcare, Piscataway, NJ, EUA). Os resultados na Figura 7 mostram que as koffs das variantes em relação ao FcRn humano (Fig. 7A) e FcRn de cino (Fig. 7B) aumentam com o aumento de pH, e a taxa de koff que aumenta para cada variante foi similar.

[417] A taxa de dissociação b (koff) de variante anti-HER2 L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I em relação ao FcRn humano em pHs diferentes foi similarmente medida. A koff de variante anti-HER2 L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I em relação ao FcRn humano foi plotada como uma função de pH na Figura 28. A koff de variantes anti-VEGF T307Q/N434A, T307Q/N434S, T307Q/E380A/N434S e V308P/N434A em relação ao FcRn humano da Figura 7 também foi plotada na Figura 28 para comparação. Os valores de koff em pHs diferentes foram ajustados em relação ao pH para cada variante para render a inclinação da linha de melhor ajuste (equação: log(koff) =inclinação x pH +y-intercepto). As inclinações das variantes anti-VEGF se situam na faixa de 0,75 a 0,84; enquanto que a inclinação da variante anti-HER2 L251D/T307Q/M428L/N434H/Y436I é cerca de 1,2. EXEMPLO 6: LIGAÇÃO COM VEGF HUMANO

[418] A forma recombinante de VEGF-A109 foi conjugada sobre um chip CM5 usando um kit de acoplamento amina. Especificamente, o chip de sensor CM5 foi ativado com EDC/NHS por 7 min a 5μl/min. 1 a 2μg/ml de VEGF-A109 foram injetados por 30 s em uma taxa de fluido de 10μl/min sobre o chip ativado para render uma unidade de resposta de ligação máxima (RU) de 100 a 400. Após a conjugação, o chip acoplado ao FcRn foi bloqueado por uma injeção de 35μl de 1M hidrocloreto de etanolamina em 5μl/min. As diluições de duas dobras dos anticorpos de 100 nM a 6 nM foram injetadas sobre o chip conjugado ao VEGF por 4 min em PBS/0,05% Tween/0,02% NaN3 a 37oC. Permitiu-se que os complexos se dissociassem por 18 min. O chip foi regenerado com um pulso de 30 s de 20 mM de ácido hidroclorídrico. Os anticorpos também foram injetados sobre uma superfície não conjugada para a subtração de fundo. Os resultados na Figura 9 mostram que as mutações de Fc não alteram a ligação de VEGF e que todas dentre as variantes têm a mesma resposta de ligação que às do tipo selvagem. EXEMPLO 7: INIBIÇÃO IN-VITRO DE PROLIFERAÇÃO CELULAR

[419] Várias concentrações de variantes anti-VEGF do tipo selvagem (Bevacizumab) e anti-VEGF foram pré-incubadas com VEGF humano recombinante à temperatura ambiente por 1 hora. As concentrações de variantes anti-VEGF do tipo selvagem (Bevacizumab) e anti-VEGF se situam na faixa de 33 nM a 0,05 nM. A concentração de VEGF humano recombinante foi 0,26 nM. Os complexos foram, então, apresentados às celulas endoteliais vasculares umbilicais humanas (HUVEC) em cultura a 37oC e CO2a 5%. As viabilidades de HUVEC após 4 dias de cultura foram avaliadas pela incubação das células com 20% de corante ALAMAR BLEU® (Trek Diagnostic Systems, Cleveland, OH, EUA) por 6 horas a 37oC e CO2 a 5%. A fluorescência de ALAMAR BLEU® foi, então, detectada com um leitor de microplaca Molecular Devices (Sunnyvale, CA, EUA). Conforme mostrado na Figura 10, todas dentre as variantes têm o mesmo nível de inibição de proliferação que as do tipo selvagem e AVASTIN®, confirmando novamente que as mutações de Fc não afetam a capacidade das variantes de neutralizar o VEGF. EXEMPLO 8: ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS EM MACACOS CINOMOLGOS

[420] Trinta e seis macacos cinomolgos intocados machos e trinta e seis macacos cinomolgos intocados fêmeas, pesando de 2 a 5 kg e com 2 a 7 anos de idade em exame físico pré-estudo foram avaliados para seis grupos de tratamento, cada um consistindo em seis machos e seis fêmeas. Os animais foram designados para grupos de tratamento usando um procedimento de bloqueio computadorizado destinado a atingir equilíbrio de peso corporal em relação aos grupos de tratamento. Somente os animais que aparentaram estar saudáveis e que estavam isentos de nomalias óbvias foram usados no estudo. Todos os animais receberam uma única dose de bolus intravenosa via veia safena seguida por uma purgação salina de 0,9% no dia 1. O nível de dose para todos os grupos foi 5 mg/kg. As amostras sanguíneas (aproximadamente 1,0 ml) da veia femoral foram coletadas pré-dose e pós-dose em 0,5, 2, 4, 8 horas, nos dias 1, 2, 4, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56 e 70. As curvas de tempo- concentração de soro para todos os grupos foram construídas usando a concentração de soro média de n=11 para 12 animais por group. As amostras de soro coletadas nesse experimento foram analisadas usando um protocolo ELISA descrito no Exemplo 9. EXEMPLO 9: DETECÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO EM SORO DE MACACO CINOMOLGO POR ELISA

[421] As placas de ELISA Maxisorp (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, EUA) foram revestidas com 0,5 μg/ml de VEGF humano recombinante em tampão carbonato a 50 mM, pH 9,6, a 4°C de um dia para o outro. As placas foram bloqueadas com PBS, 0,5% BSA, 10ppm Proclin, pH 7,2 por 1 hora à temperatura ambiente e, então, lavadas com tampão de água (PBS/0,05% Tween 20/pH 7,2). Padrões diluídos em série duas vezes (IgG1 anti-VEGF do tipo selvagem (Bevacizumab)) bem como amostras de soro de cino diluídas em série três vezes (começando em 1:10) em tampão de PBS contendo albumina de soro bovino a 0,5%, Tween 20 a 0,05%, 5 mM de EDTA pH 8,0, CHAPS a 0,25%, globulina de gama bovino a 0,2%, 10ppm de Proclin e 0,35M de NaCl foram adicionados às placas bloqueadas e incubados por 2 horas à temperatura ambiente com agitação. As placas foram lavadas 6 vezes e a droga aglutinada foi detectada IgG anti-human (Fc específico)-HRP de carneiro (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA) e diluída 1:10K em tampão de ensaio (PBS, pH 7,4, 0,5% BSA, 0,05% Tween 20, 10ppm de Proclin) por 1 hora à temperatura ambiente com agitação. As placas foram, então, lavadas 6 vezes novamente, seguidas pela adição de substrato de tetrametil benzidina (Moss, Pasadena, MD, EUA) para o desenvolvimento de cor. A reação foi interrompida após 20 minutos pela adição de 1M de ácido fosfórico (H3PO4). As placas foram lidas sobre um leitor de microplacas da Molecular Devices em um comprimento de onda de 450 a 620 nm. Os perfis de soro das variantes do tipo selvagem e de cinco variantes anti-VEGF em macacos cinomolgos seguidos por uma única dose IV de 5 mg/kg são mostrados na Figura 11. Todas as cinco variantes exibiram folga reduzida e meia-vida prolongada comparadas às do tipo selvagem. EXEMPLO 10: ANÁLISE DE DADOS FARMACOCINÉTICOS

[422] Os parâmetros PK foram estimados usando WinNonLin-Enterprise, versão 5.1.1 (Pharsight Corporation; Mountain View, CA, EUA). Um modelo com dois compartimentos com entrada de bolus IV, eliminação de primeira ordem e constantes de taxa micro (Model 7) foi usado para descrever os dados observados. As concentrações foram pesadas com o uso de reponderação iterativa (prevista para energia n=-1) e o algoritmo de minimização Gauss-Newton com modificação de Levenberg e Hartley. Os seguintes parâmetros PK foram relatados com o uso de WinNonLin Modelo 7: AUC~ = exposição da droga total definida como área sob a curva de concentração-tempo extrapolada até infinito; 11/2, α = meia-vida da fase alfa (meia-vida alfa); 11/2, p = mei vida da fase beta (meia-vida beta); Cmax = concentração máxima observada; CL = folga; V1 = volume do compartimento central; Vss = volume de distribuição em estado estacionário.

[423] Para todos os grupos de dose, a seleção de modelo foi baseada na bondade de ajuste por inspeção visual do perfil concentração-tempo de soro previsto versus perfil concentração-tempo de soro observado para cada animal, exame das somas residuais pesadas de quadrados e exame do erro padrão e coeficiente de variação para cada parâmetro. Os parâmetros PK foram apresentados como o desvio padrão (SD) ± médio de cada grupo.

[424] A Tabela E mostra os parâmetros farmacocinéticos dispostos em tabela para a variante anti-VEGF do tipo selvagem e cinco variantes, N434H, T307Q/N434A, T307Q/N434S, T307Q/E380A/N434S e V308P/N434A, seguidas por uma única dose IV de 5 mg/kg para macacos cinomolgos. As meias-vidas β (terminal) de variantes são cerca de 1,6 a 2,2 vezes mais longas do que a meia- vida da variante do tipo selvagem, com a variante T307Q/N434A tendo a meia- vida mais longa de 24,9 dias. Para fim de conhecimento, a meia-vida da variante T307Q/434A, cerca de 25 dias, representa a meia-vida mais longa de um IgG humana em macaco cinomolgo já relatada. TABELA E

a n= 12 animaisb n=11 animais Cm ax= concentração máxima observada Os dados são mostrados com + ou - um desvio padrão exposição total do medicam ento como definido com o área sob curva de tempo de concentração extrapolado para a infinidade t %, α= meia-vida da fase alfa t %, β= meia-vida da fase beta

[425] A relação entre a meia-vida e a afinidade de FcRn é mostrada na Figura 13. O aumento modesto em pH 6,0 na afinidade de FcRn resulta em meia-vida terminal prolongada, conforme evidenciado por variantes N434H e T307Q/N434A. Entretanto, o aumento adicional em afinidade de FcRn de pH 6,0 (T307Q/N434S, T307Q/E380A/N434A e V308P/N434A) não aperfeiçoou adicionalmente a meia-vida, visto que a taxa de dissociação mais lenta e a afinidade aumentada em pH neutro podem compensar o benefício produzido do aumento da afinidade de pH ácido. Ao invés disso, existe uma tendência em direção à meia-vida reduzida em afinidades de FcRn mais altas em pH 6,0. EXEMPLO 11: ESTUDOS FARMACOCINÉTICOS EM CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS

[426] A cepa de camundongos usada no estudo é Mu.VEGFhuX.KI.R1.B6.129. Camundongos MuVEGFhuMUTX (+/+) knock-in, RAG2 (-/-) knock-out contêm dois alelos de formas humanizadas de VEGF, que podem ser neutralizadas pelo anticorpo anti-VEGF (Bevacizumab) do tipo selvagem. Os camundongos RAG2 (-/-) são imunodeficientes e não geram células B e T funcionais. Os tumores humanos podem crescer nesses camundongos, que expressam formas humanizadas de VEGF na ausência de uma resposta imunológica observável em direção á células tumorais. Dessa forma, VEGF derivado do tumor humano e células estromais de camundongo serão neutralizadas pelo anticorpo anti- VEGF (Bevacizumab) do tipo selvagem, o qual não neutraliza VEGF murina. O PK da variante anti-VEGF do tipo selvagem e anti-VEGF T307Q/N434A foi avaliado nesses camundongos transgênicos não portadores de tumor.

[427] Dois estudos de PK diferentes foram realizados. O primeiro estudo é um estudo de PK de única dose. Existem 4 grupos com 8 a 9 animais por grupo, cada um, recebendo uma única dose intravenosa de 0,3 ou 5 mg/kg da variante do tipo selvagem e variante T307Q/N434A em PBS. O volue de dose a ser administrado variou de 5 a 15ml/kg, dependendo da concentração da solução de dosagem e do peso de cada animal. A dosagem IV foi feita via a veia caudal. As amostras de 3 camundongos foram sangradas em cada instante de tempo e cerca de 125ul de amostras sanguíneas para análise de PK foram colhidas em 15 minutos, 8 horas, 24 horas, nos dias 2, 4, 7, 10, 14, 21 pós-dose. As amostras sanguíneas foram coletadas sob anestesia via seio periorbital. Em momentos de segundos, os camundongos foram sangrados por punção cardíaca sob anestesia isoflurano.

[428] O segundo estudo é um estudo PK de múltiplas doses. Existem 9 animais por grupo. Cada animal recebeu 0,3 ou 5 mg/kg de T307Q/N434A variante em PBS nos dias 0, 3, 6 e 9. Os métodos de injeção e coleta de amostras foram similares aos do estudo de PK de única dose. Entretanto, as amostras sanguíneas foram coletadas em 15 min após a primeira dose, dia 3 (pré-dose), dia 6 (pré-dose), dia 9 (pré-dose), 15min após a dose do dia 9, dia 11, dia 14, dia 21, dia 28 e dia 35.

[429] As amostras de soro coletadas dos estudos de PK foram analisadas usando ELISA descrita no Examples 13. As Figuras 14A e 14B mostram os perfis farmacocinéticos da variante do tipo selvagem e T307Q/N434A variante determinados com o uso de captura de VEGF (Fig. 14A) ou captura de Fc humano (Fig. 14B) por ELISA, respectivamente. T307Q/N434A variante que teve perfis de PK similares é variante do tipo selvagem seguida por uma única dose IV de 0,3 ou 5 mg/kg. A Tabela F confirma que as meias-vidas da variante do tipo selvagem e T307Q/N434A variante em camundongos transgênicos são comparáveis. Entretanto, as respostas de PK não lineares foram observadas, visto que os anticorpos dosados em 0.3mg/kg têm meias-vidas mais curtas do que aquele dosados em 5mg/kg, possivelmente, devido ao espaçamento dependente de antígeno. A Figura 16 mostra os perfis farmacocinéticos de T307Q/N434A variante em camundongos transgênicos de VEGF humanizado seguidos de múltiplas doses de 0,3 ou 5 mg/kg e os parâmetros de PK são resumidos na Tabela G. Os resultados mostram que as concentrações de soro medidas experimentalmente corresponderam bem com as concentrações previstas por uma simulação usando os parâmetros de PK de única dose. TABELA F

EXEMPLO 12: ESTUDOS DE EFICÁCIA IN VIVO

[430] As células HT-55 humana, Colo-205 (carcinoma colorretal) e Calu-6 (carcinoma de pulmão) foram obtidas da Coleção de Cultura Tipo Americana (Manassas, VA, EUA). A linhagem celular HM-7 de carcinoma colorretal humano é derivada de LS 174T. Calu-6 e HM-7 foram cultivadas em Ham’s F12, DMEM 1:1 de glicose baixa. Colo-205 e HT-55 foram cultivadas em meio RPMI 1640. Ambos os meios foram suplementados com 10% v/v de FBS, 1% v/v de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), 2 mM de L- glutamina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) e 1 μg/ml de FUNGIZONE™ (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As células foram cultivadas a 37 °C em 5% de CO2 até serem confluídas, colhidas e ressuspensas em Matrigel estéril em 50 x 106 de células por ml. Os xenoenxertos foram estabelecidos em camundongos duplamente homozigotos KI VEGF hum-X de 6 a 8 semanas de idade RAG2 KO (Genentech, South San Francisco, CA, EUA) por injeção subcutânea no flanco dorsal de 5 x106 células por camundongo e permitiu-se que crescessem. O tratamento com anticorpo i.p. na dose de 5, 0,5 e 0,05 mg/kg duas vezes semanalmente foi iniciado 24 h após a inoculação da célula tumoral. Os tumores transplantados foram medidos duas vezes semanalmente ao longo do eixo geométrico mais longo e do eixo geométrico perpendicular conforme descrito. Para cada dia em que os tumores foram medidos, o volume do tumor para cada camundongo foi calculado e os volumes médios do tumor do grupo de anticorpo de controle (anti-Ragweed) e de cada grupo anti-VEGF foram comparados por teste t de estudante, em um nível de P < 0,05. Os camundongos foram mortos quando o volume do tumor atingiu 2.000 mm3.

[431] Os resultados do primeiro nestudo de xenoenxertos HM-7 são mostrados na Figura 18. As Figuras 18A e 18B mostram que a variante T307Q/N434A foi capaz de atingir a inibição máxima do crescimento tumoral em grupos de tratamento de 0,5 mg/kg bem como grupos de tratamento de 5 mg/kg. Apesar de o tipo selvagem não ter inibido o crescimento tumoral em ambas as doses, esse não atingiu a inibição máxima do crescimento tumoral de 0,5 mg/kg. Esses resultados sugerem que a variante T307Q/N434A é mais eficaz do que a do tipo selvagem em 0,5 mg/kg no tratamento de xenoenxertos HM-7, apesar dos níveis similares de concentração de IgG de soro (Fig. 18C). Um estudo de eficácia repetido de xenoenxertos HM-7 mostrados na Figura 19 confirma que a variante T307Q/N434A é mais eficaz do que a do tipo selvagem em grupos de tratamento de 0,5 e grupos de tratamento 0,05 mg/kg. De fato, a variante T307Q/N434A mostrou uma inibição maior de crescimento tumoral em todos os grupos de tratamento comparada com a variante do tipo selvagem (Fig. 19A e 19B). A eficácia aumentada pode ser devido à maior concentração de anticorpo normalizada no sangue em tumores para grupos tratados de variante T307Q/N434A comparada com a variante do tipo selvagem (Fig. 19E). O terceiro estudo de eficácia de xenoenxertos HM-7 mostrados na Figura 20 valida adicionalmente a eficácia superior de T307Q/N434A em relação à variante do tipo selvagem em grupos de tratamento de 0,5 e 0,05 mg/kg.

[432] Para o estudo de xenoenxertos HT-55, a variante T307Q/N434A mostrou uma inibição maior do crescimento tumoral comparada com a variante do tipo selvagem em grupos de tratamento de 0,05 mg/kg (Fig. 21) sugerindo que T307Q/N434A é mais eficaz do que a variante do tipo selvagem em grupos de tratamento de 0,05 mg/kg. Para o estudo de Colo-205, a Figura 22B mostra uma diferença significante nas curvas de crescimento entre a variante do tipo selvagem 0,5 mg/kg e a variante T307Q/N434A 0,5 mg/kg. As Figuras 22A e 22B também mostram um aumento na inibição do crescimento do tumor por T307Q/N434A em grupos de tratamento de 0,5 e 0,05 mg/kg, sugerindo uma eficácia ligeiramente superior para T307Q/N434A em grupos 0,5 e 0,05 mg/kg. Um estudo de Colo-205 repetido mostrado na Figura 23 indica que T307Q/N434A é ligeiramente mais eficaz do que a variante do tipo selvagem no tratamento de xenoenxertos Colo-205. Finalmente, as eficácias da variante T307Q/N434A e variante do tipo selvagem em estudo de xenoenxertos Calu-6 foram similares.

[433] Podem existir inúmeras razões possíveis para eficácia aumentada das variantes de Fc. Por exemplo, a potência aumentada de uma variante poderia ser devido à retenção aumentada e/ou reciclagem do anticorpo variante mediado pelo FcRn humano expresso em determinados tumores (por exemplo, HM-7). Isso pode levar a um efeito de ação em massa aumentado de bloqueio de VEGF localmente produzido ou pode fornecer um mecanismo para melhorar a degradação de VEGF no tumor. Entretanto, revelou-se que a concentração aumentada da variante detectada nos tumores HM-7 em relação aos tumores HT-55 e Calu-6 não está diretamente correlacionada com o nível de expressão de FcRn celular, visto que as células HM-7 expressam quantidades inferiore de FcRn do que as células HT-55 ou Calu-6 (Figura 25). Outros fatores no microambiente do tumor como pH do tumor, taxa de crescimento e outros constituintes do tumor também podem executar funções colaborativas com o FcRn na determinação da distribuição de IgGs. Por exemplo, o microambiente do tumor é na maior parte ácido, com pH na faixa de 6,0 a 7,6 (média =7,1), enquanto que aquele de tecidos normais se situa na faixa de 7,3 a 7,8 (média =7,55), ver, Song, C.W. et al., "Influence of Tumor pH on Therapeutic Response" em Cancer Drug Resistance, 21 a 42 (2007). Adicionalmente, tipos diferentes de tumores podem ter uma ampla faixa de pH devido ao suprimento vascular heterogêneo e perfusão sanguínea, ver, Song, C.W. et al., Cancer Drug Resistance, 21 a 42 (2007), supra; Gillies, R.J. et al., J Magn Reson Imaging 16, 430 a 450 (2002). Inúmeros estudos in-vitro indicam que a quantidade de Fc/IgG associado à célula aumenta quando as células são incubadas em pH ácido, ver, Praetor, A. et al., Journal of cell science 112 (Pt 14), 2291 a 2299 (1999); McCarthy, K.M., Yoong, Y. & Simister, N.E. Bidirectional transcytosis of IgG by the rat neonatal Fc receptor expressed in a rat kidney cell line: a system to study protein transport across epithelia. Journal of cell science 113 ( Pt 7), 1277 a 1285 (2000); Tesar, D.B. et al., Traffic 7, 1127 a 1142 (2006). Dessa forma, é concebível que as diferenças de pH entre as linhagens de tumor testadas podem afetar o nível de acúmulo de anticorpo dentro de cada tumor. Adicionalmente, o microambiente ácido do tumor também ativa a expressão de VEGF (ver, Song, C.W. et al., Cancer Drug Resistance, 21 a 42 (2007), supra), que poderia mediar a retenção desses anticorpos anti-VEGF especificamente. Além disso, os tumores HM- 7 em camundongos foram previamente mostrados por terem estroma escasso (ver, Liang, W. C. et al., J Biol Chem 281, 951 a 961 (2006)), enquanto tumores Calu-6 induziram uma forte resposta estromal e foram relativamente ricos em estroma (ver, Tejada, M. L. et al., Clin Cancer Res 12, 2676 a 2688 (2006)). A presença de células estromais de camundongo, que expressam FcRn murina, pode disfarçar a reciclagem aperfeiçoada de uma variante de IgG por células tumorais humanas. Isso pode levar ao menor efeito concentrativo em xenoenxertos humanos que têm um maior componente de stroma murina, por exemplo, Calu-6. EXEMPLO 13: DETECÇÃO DE CONCENTRAÇÕES DE ANTICORPO EM SOROS E TUMORES DE CAMUNDONGOS TRANSGÊNICOS POR ELISA

[434] Dois formatos de ensaio de ELISA diferentes com dois reagente s de captura de anticorpo diferentes (VEGF ou Fc de IgG1 anti-humano) revestidos em placas foram usados para detectar concentrações de anticorpo em camundongos transgênicos. As placas de ELISA da Maxisorp (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, EUA) foram revestidas com 0,5 μg/ml de VEGF humano recombinante ou 0,25μg/ml (Fab’2) de Fc de IgG1 anti-humano de coelho (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA) em 50 mM de tampão de carbonato, pH 9,6, a 4°C de um dia para o outro. As placas foram bloqueadas com PBS, 0,5% de BSA, 10ppm de Proclin, pH 7,2 por 1 hora à temperatura ambiente e, então, lavadas com tampão de lavagem (PBS/0,05% de Tween 20/pH 7,2). Padrões diluídos em série duas vezes (Bevacizumab para formato de VEGF ou IgG1 humano para formato de Fc) reduzidos a 12,5 ng/ml bem como amostras de soro de cino diluídas em série três vezes (iniciando em 1:10) em tampão de PBS contendo 0,5% de albumina de soro bovino, 0,05% de Tween 20, 5 mM de EDTA pH 8,0, 0,25% de CHAPS, 0,2% de gama globulina bovina, 10 ppm de Proclin e 0,35 M de NaCl foram adicionados às placas bloqueadas e incubados por 2 horas à temperatura ambiente com agitação. As placas foram lavadas 6 vezes e a droga aglutinada foi detectada com conjugado (Jackson) de IgG anti-humano (Fc específico)-HRP de cabra (Fab’2) diluída de 1:20K para 1:60K em tampão de ensaio (PBS, pH 7,4, 0,5% de BSA, 0,05% de Tween 20, 10 ppm de Proclin) por 1 hora à temperatura ambiente com agitação. As placas foram, então, lavadas novamente por 6 vezes, seguidas pela adição de substrato de tetrametil benzidina (Moss, Pasadena, MD, EUA) para desenvolvimento de cor. A reação foi interrompida após 20 minutos pela adição de 1M de ácido fosfórico (H3PO4). As placas foram lidas sobre um leitor de micro placas Molecular Devices em um comprimento de onda de 450 a 620 nm. EXEMPLO 14: VARIANTES DE FC DE IGGI COM VÁRIOS APERFEIÇOAMENTOS DE AFINIDADE EM RELAÇÃO À VARIANTE DO TIPO SELVAGEM E SEUS COMPORTAMENTOS FARMACOCINÉTICOS IN-VIVO

[435] As combinações adicionais de muatações de Fc, mostradas na Tabela H, foram incorporadas em anti-HER2 humano (tratuzumab) para construir variantes de IgG. As variantes de IgG1 foram expressas usando descritos no Exemplo 1. As constantes de dissociação da variante de IgG1 anti- HER2 do tipo selvagem e variante de IgG1 anti-HER2 são medidas conforme descrito no Exemplo 4 e os resultados são mostrados na Tabela H. Os resultados mostram que através da combinação de mutações diferentes, pode-se construir uma variante de gG tal como M252Y/V308P/N434Y que seja capaz de aglutinar o FcRn humano com afinidade nanomolar de dígito único, representando um aperfeiçoamento de 450 vezes em relação ao IgG do tipo selvagem1.

[436] Entretanto, as variantes de alta afinidade não necessariamente aperfeiçoaram os comportamentos farmacocinéticos in vivo. Por exemplo, duas mutações de Fc, N434A e N434W, foram incorporadas em um anticorpo humano diferente para construir duas variantes IgG1. As duas variantes de IgG1, variante N434A e variante N434W, resultaram em aproximadamente uma afinidade de Fc Rn superior de 3 vezes e 40 vezes em pH 6,0 comparada ao anticorpo do tipo selvagem, respectivamente, conforme mostrado na Tabela H. Seus compostamentos farmacocinéticos foram avaliados em macacos cinomolgos, conforme descrito no Exemplo 8 e 9, e comparados àqueles do tipo selvagem (aproximadamente 6 a 9 dias). A meia-vida de N434W (cerca de 9,7 +/- 2,4 dias) foi menos aperfeiçoada do que aquela da variante modestamente aperfeiçoada por afinidade, N434A (cerca de 14,5 +/-2,2 dias). Esses resultados sugerem que muito aumento na afinidade de FcRn pode ter um efeito detrimental na meia-vida de uma variante de Fc e é dificil prever a priori se uma variante de Fc com afinidade de FcRn aperfeiçoada aperfeiçoará a meia- vida ou não. TABELA H

EXEMPLO 15: IMUNOPRECIPITAÇÃO DE FCRN USANDO UMA VARIANTE DE IGGI DE ALTA AFINIDADE

[437] Linhagens de cinco milhões de células /cada dentre HM-7, HT-55, Calu-6 ou Raji (linfoma de célula B) foram lisadas pela incubação em tampão de fosfato de sódio de 25 mM e pH 6,0 contendo 1% de Nonidet P-40, 0,5% de deoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, 2 mM de EDTA, 150 mM de NaCl e inibidor de protease de 1X (Pierce, Rockland, IL) por 1 hora a 4 oC. As células lisadas foram centrifugadas a 12,000 g por 30 min a 4 oC e, então, 50 nM de variante M252Y/V308P/N434Y de Fc de trastuzumab (Yeung et al., submetido) foram adicionadas ao sobrenadante para capturar o FcRn. Após um dia para o outro a incubação a 4 oC, resina de Proteína-L (Pierce) foi adicionada e permitiu- se aglutinar on complexo por 4 hora a 4 oC. A resina foi, então, lavada cinco vezes com on tampão de lise e as porteinas aglutinadas foram eluídas com um tampão de carregamento 2X (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As proteínas foram separadas em um gel BIS-TRIS de 4 a 12% (Invitrogen) e manchadas sobre numa membrana de nitrocelulose (Invitrogen). A membrana foi bloqueada com 3% de leite sem gordura em PBS e sondada com 1ng/ml de anticorpo FcRn anti-humano de coelho (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, EUA) à temperatura ambiente por 1 hora, depois, com conjugado de IgG-peroxidase de anti-coelho de cabra em diluição de 1:104 (Pierce) por 1 hora à temperatura ambiente. A membrana foi lavada com PBS/0,05% de Tween entre as etapas de incunbação do anticorpo e bloqueio. A proteína FcRn foi visualizada pelo kit de detecção de ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA). Ver, Figura 25.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

[438] Dois experimentos de ligação separados com variantes anti- VEGF diferentes foram realizados em cada pH, pH 6,0 e pH 7,4. A unidade de resposta de ligação de estado estacionário (RU) como uma função de concentração para pH 6,0 e pH 7,4 foi plotada na Figura 1A e Figura 1B, respectivamente. As constantes de dissociação (KD) em pH 6,0 foram estimadas da Figura 1 e resumidas na Tabela A. As constantes de dissociação da mesma variante calculadas a partir de duas execuções diferentes foram ligeiramente diferentes. Por exemplo, a variante N434A teve uma KD de 550 nM na primeira execução, mas sua KD da segunda execução foi 250 nM. A diferença foi devido ao efeito de avidez no formato de ensaio que envolveu fluir um anticorpo bivalente sobre um chip acoplado ao FcRn. O nível de contribuição de avidez para a constante de dissociação dependeu do nível de FcRn acoplado aos chips, com alto nível de acoplamento de FcRn, resultando em maior avidez. Isto pode explicar a alta afinidade observada na segunda operação, que teve RU cerca de duas vezes maior que a primeira operação. Embora tenha havido efeito de avidez na configuração de ensaio, este forma mais parecido com o processo de ligação natural dentro das células, onde se permite que os anticorpos bivalentes pinocitosados aglutinem ao FcRn aglutinado à membrana. Enquantro o KD absoluto pode diferenciar de operação para operação, a classificação de afinidade destes variantes foi consistente mesmo com nível diferente de FcRn acoplado. Tanto a Figura 1 quanto a Tabela A mostraram que V308P/N434A teve consistentemente a afinidade mais elevada dentre os variantes testados e todos os variantes testados aprimoraram ligação ao FcRn em pH 6,0.

[439] As afinidades dos variantes de anti-VEGF ao FcRn em pH 7,4 são muito inferiores que suas afinidades em pH 6,0. Já que a afinidade de ligação em pH 7,4 foi muito baixa, as constantes de dissociação dos variantrs em pH 7,4 não foram determinadas. No entanto, a Figura 3 mostrou que a classificação de afinidade destes variantes em pH 7,4 foi a mesma como em pH 6,0, indicando que a ligação dos variantes ao FcRn em pH 6,0 e pH 7,4 foi acoplada. Conforme a ligação em pH 6,0 de variantes é aprimorada, o mesmo ocorre com a ligação em pH 7,4. Há um delicado equilíbrio entre como a ligação em pH 6,0 e 7,4 ao FcRn afeta a meia-vida do variante. Sugere-se que a ligação aprimorada em pH 6,0 tenha uma função benéfica na meia-vida in vivo do variante, como os variantes de maior afinidade por aglutinar FcRn de forma mais satisfatória e, por conseguinte, ser mais reciclados por FcRn. Por outro lado, propõe-se que a ligação substancialmente alta em pH 7,4 seja desfavorável para a meia-vida de variante, como os anticorpos aglutinados a FcRn não podem ser prontamente liberados para circulação se os mesmos estão aglutinados severamente.

[440] A afinidade aumentada em alto pH pode negar os efeitos favoráveis de afinidade aumentada em baixo pH. Por exemplo, Dall’Acqua et al., J Immunol 169(9), 5171-5180, 2002, mostrou que variantes de IgG1 humano como M252Y/S254T/T256E e G385D/Q386P/N389S não tiveram meia-vida aprimorada em camundongos, aparentemente devido a sua afinidade de ligação de alto pH ao FcRn murino. Portanto, foi claro que as melhoras na ligação de alto pH podem ser toleradas em variantes de IgG1 ao aprimorar ainda suas meia- vidas farmacocinéticas.

[441] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exmplo para propósitos de entendimento, as descrições e exemplos não devem ser interpretadas como limitadores do escopo da invenção. As descriçõs de toda a patent e literaturas científicas citadas no presente documento são expressamente incorporadas a título de referência em sua totalidade.

Claims

1. IgG VARIANTE, caracterizado pelo fato de que compreende uma região de Fc de IgG1 humana compreendendo duas ou mais substituições de aminoácidos em relação a uma região de Fc de IgG1 humana do tipo selvagem, e em que a região Fc compreende um dos conjuntos de mutações selecionado em: - uma substituição de aminoácidos no aminoácido 307 com glutamina e uma substituição no 434 com alanina; ou - uma substituição de aminoácidos no aminoácido 307 com glutamina e uma substituição no 434 com serina; ou - uma substituição de aminoácidos no aminoácido 307 com glutamina e uma substituição no 378 com valina; ou - uma substituição de aminoácidos no aminoácido 307 com glutamina e uma substituição no 436 com isoleucina; ou - uma substituição de aminoácidos no aminoácido 308 com prolina e uma substituição no 434 com alanina; ou - uma substituição de aminoácidos no aminoácido 434 com alanina e uma substituição no 436 com isoleucina; ou - uma substituição de aminoácidos no aminoácido 307 com glutamina, uma substituição de aminoácidos no aminoácido 378 com valina e uma substituição de aminoácidos no 436 com isoleucina; em que os resíduos são numerados de acordo com o índice EU como em Kabat.

2. IgG VARIANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a substituição de aminoácido no aminoácido 308 com prolina e a substituição de aminoácido no aminoácido 434 com alanina.

3. IgG VARIANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem uma afinidade de ligação mais elevada para FcRn do que o IgG tendo a região de Fc de IgG humana do tipo selvagem.

4. IgG VARIANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem uma afinidade de ligação mais elevada para FcRn em pH 6,0 do que em pH 7,4.

5. IgG VARIANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tem uma eficácia igual ou maior que o IgG tendo a região de Fc de IgG humana do tipo selvagem.

6. IgG VARIANTE, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que tem uma eficácia maior que o IgG tendo a região de Fc de IgG humana do tipo selvagem.

7. IgG VARIANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um IgG humanizado ou humano.

8. IgG VARIANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o IgG variante é um anticorpo anti-VEGF.

9. IgG VARIANTE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende o domínio variável de cadeia pesada compreendendo a SEQ ID N°: 1 e o domínio variável de cadeia leve compreendendo a SEQ ID N°: 2.

10. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelo fato de que compreende o IgG variante, conforme definido na reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. KIT, caracterizado pelo fato de que compreende o IgG variante, conforme definido na reivindicação 1, em um recipiente, e instruções para uso.

12. USO DE UM IgG VARIANTE, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratamento de tumor em um indivíduo.

13. USO DE UM IgG VARIANTE, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para inibir atividade de VEGF em um indivíduo.

14. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a atividade de VEGF é angiogênese.

15. USO DE UM IgG VARIANTE, conforme na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para modular permeabilidade vascular em um indivíduo.

16. USO DE UM IgG VARIANTE, conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para inibir ou prevenir crescimento de células cancerosas em um indivíduo.