CN105418762B - 与FcRn结合改变的Fc变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含相对于野生型人Fc区的至少一个修饰的变体Fc区，其中所述修饰选自由下列组成的组：434S、252Y/428L、252Y/434S和428L/434S，并且编号根据EU索引进行。

Description

与FcRn结合改变的Fc变体
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2008年12月22日；申请号：200880123009.4；发明名称：同上。
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2007年12月26日提交的USSN 61/016,793、2008年2月25日提交的USSN 61/031,353、2008年4月18日提交的USSN 61/046,353、2008年5月2日提交的USSN 61/050,172、2008年7月10日提交的USSN 61/079,779、和2008年9月22日提交的USSN 61/099,178的权益；并且是2007年10月31日提交的USSN 11/932,151的部分继续申请，USSN 11/932,151是2006年5月17日提交的USSN 11/436,266的部分继续申请，USSN11/436,266根据35U.S.C.§119(e)要求2007年7月24日提交的USSN 60/951,536的权益，并且是2005年11月14日提交的USSN 11/274,065的部分继续申请，USSN 11/274,065根据35U.S.C.§119(e)要求下列专利申请的权益：2004年11月12日提交的USSN 60/627,763；2005年1月11日提交的USSN,60/642,886；2005年2月2日提交的USSN 60/649,508；2005年3月15日提交的USSN 60/662,468；2005年4月6日提交的USSN 60/669,311；2005年5月16日提交的USSN 60/681,607；2005年6月13日提交的USSN 60/690,200；2005年7月5日提交的USSN60/696,609；2005年7月27日提交的USSN 60/703,018；以及2005年10月12日提交的USSN60/726,453，它们全部通过引用整体并入。
技术领域
本申请涉及优化的IgG免疫球蛋白变体、用于制备它们的工程化方法、以及它们的应用，尤其是用于治疗目的的应用。
背景技术
抗体是各自与特异性抗原结合的免疫蛋白。在包括人和小鼠在内的大多数哺乳动物中，抗体是由成对的多肽重链和轻链构成的。每个链由各自的免疫球蛋白(Ig)结构域构成，因此将通用术语免疫球蛋白用于这种蛋白。每条链由两个不同的区域构成，这两个不同的区域称为可变区和恒定区。轻链和重链可变区在抗体之间显示明显的序列多样性，并且负责结合靶抗原。恒定区显示较少的序列多样性，并且负责结合许多天然蛋白以引发重要的生物化学事件。在人中，有5种不同种类的抗体，包括IgA(它包括IgA1和IgA2亚类)、IgD、IgE、IgG(它包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚类)、以及IgM。这些抗体种类之间的区别特征为他们的恒定区，尽管V区也可能存在细微的不同。IgG抗体是由两条重链和两条轻链构成的四聚体蛋白。IgG重链由四个免疫球蛋白结构域从N-末端至C-末端以VH-CH1-CH2-CH3的顺序连接构成，VH-CH1-CH2-CH3分别是指重链可变结构域、重链恒定结构域1、重链恒定结构域2、和重链恒定结构域3(也称为VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3，分别是指重链可变结构域、γ1恒定结构域、γ2恒定结构域、和γ3恒定结构域)。IgG轻链由两个免疫球蛋白结构域从N-末端至C末端以VL-CL的顺序连接构成，VL-CL分别是指轻链可变结构域和轻链恒定结构域。
在IgG中，Fc上Cγ2和Cγ3结构域之间的位点介导与新生儿受体FcRn的相互作用。与FcRn的结合会从内体中将内吞的抗体再循环回血流中(Raghavan等人,1996,Annu RevCell Dev Biol 12:181-220；Ghetie等人,2000,Annu Rev Immunol 18:739-76，它们都通过引用整体并入)。这个过程结合由于全长分子的大尺寸所引起的肾过滤的排除致使有利抗体的血清半衰期介于1至3周。Fc与FcRn的结合还在抗体运输中起关键作用。Fc上的FcRn结合位点也是细菌蛋白A和G结合的位点。通常使用这些蛋白的紧密结合作为纯化抗体的方法，该方法在蛋白纯化期间采用蛋白A或蛋白G亲和色谱进行。因此，Fc上这个区域的保真性对于抗体的临床特性和它们的纯化很重要。大鼠Fc/FcRn复合体(Burmeister等人,1994,Nature,372:379-383；Martin等人,2001,Mol Cell 7:867-877，它们都通过引用整体并入)、以及Fc与蛋白A和G的复合体(Deisenhofer,1981,Biochemistry 20:2361-2370；Sauer-Eriksson等人,1995,Structure 3:265-278；Tashiro等人,1995,Curr Opin StructBiol 5:471-481，它们都通过引用整体并入)的可用结构使得能够深入了解Fc与这些蛋白的相互作用。FcRn受体还负责将IgG转移到新生儿的肠和成人肠表皮腔(Ghetie和Ward,Annu.Rev.Immunol.,2000,18:739-766；Yoshida等人,Immunity,2004,20(6):769-783，它们都通过引用整体并入)。
大鼠和人Fc结构域的研究证明了一些Fc残基对FcRn结合的重要性。大鼠和人序列在Fc区(根据EU索引的编号为残基237-443)具有约64％的序列同一性。关于大鼠/人的Fc、FcRn重链和FcRn轻链(β-2-微球蛋白)的比对参见图3、4和5。已经从大鼠Fc/FcRn复合体的现有结构建立了人Fc/FcRn复合体的模型(Martin等人,2001,Mol Cell 7:867-877，通过引用整体并入)。大鼠和人序列共有对于FcRn结合很关键的一些残基，例如H310和H435(Medesan等人,1997J.Immunol.158(5):221-7；Shields等人,2001,J.Biol.Chem.276(9):6591-6604，它们都通过引用整体并入)。然而，在许多位置，人和大鼠蛋白具有不同的氨基酸，使得人序列中的残基与大鼠序列中的残基具有不同的环境，并且可能具有不同的特征。这种变异性限制了将特征从一个同源物转移到另一同源物的能力。
在鼠Fc中，在T252、T254、和T256位点的随机突变和噬菌体展示选择产生了三突变体T252L/T254S/T256F，该三突变体的FcRn亲和力增加了3.5倍，血清半衰期增加了1.5倍(Ghetie等人,1997,Nat.Biotech.15(7):637-640，通过引用整体并入)。通过在位置253、310和435突变破坏Fc/FcRn的相互作用还导致体内半衰期降低(Medesan等人J.Immunol.1997158(5):2211-7，通过引用整体并入)。
已经在人Fcγ中对一些对于与FcRn结合很重要的残基进行了突变研究，并且已经证明它们具有增加的血清半衰期。在人Fcγ1中，Hinton等人将三个残基分别突变为另外19种常见的氨基酸。Hinton等人发现某些点会突变为FcRn结合亲和力增加的双突变体(Hinton等人2004,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216；Hinton等人Journal of Immunology2006,176:346-356，它们都通过引用整体并入)。在猴子中，两种突变具有增加的半衰期。Shields等人将残基几乎都突变为Ala，并且研究了它们与FcRn和FcγR的结合(Shields等人,2001,J.Biol.Chem.,276(9):6591-6604，通过引用整体并入)。
Dall’Acqua等人使用噬菌体展示选择了与FcRn结合的亲和力增加的Fc突变(Dall’Acqua等人2002,J.Immunol.169:5171-5180，通过引用整体并入)。所选择的DNA序列主要为双突变体和三突变体。该参考文献表达了他们所选择的序列中的一些所编码的蛋白，并且发现某些能比野生型Fc更紧密地结合FcRn。
抗体和Fc融合蛋白作为治疗剂的施用需要指定频率的注射，该指定频率与所述蛋白的清除和半衰期特征相关。较长的体内半衰期容许更少地注射或较低的剂量，这很明显是有利的。尽管过去在Fc结构域中的突变已经得到了具有增加的FcRn结合亲和力和体内半衰期的一些蛋白，但是这些突变还没有鉴定最佳的突变和增强的体内半衰期。
Fc区的一个特征是在N297处发生的N-连接的糖基化是保守的。这种碳水化合物或有时称为寡糖，在抗体中起着关键的结构和功能作用，并且是抗体必须使用哺乳动物表达系统制备的一个主要原因。等人,1999,Nat Biotechnol 17:176-180；Davies等人,2001,Biotechnol Bioeng 74:288-294；Mimura等人,2001,J Biol Chem 276:45539-45547.；Radaev等人,2001,J Biol Chem 276:16478-16483；Shields等人,2001,J BiolChem 276:6591-6604；Shields等人,2002,J Biol Chem 277:26733-26740；Simmons等人,2002,J Immunol Methods 263:133-147；Radaev等人,2001,J Biol Chem276:16469-16477；以及Krapp等人,2003,J Mol Biol 325:979-989，它们都通过引用整体并入)。
抗体已经被开发用于治疗用途。关于这种治疗的代表性公开物包括：Chamow等人,1996,Trends Biotechnol 14:52-60；Ashkenazi等人,1997,Curr Opin Immunol 9:195-200；Cragg等人,1999,Curr Opin Immunol 11:541-547；Glennie等人,2000,ImmunolToday 21:403-410；McLaughlin等人,1998,J Clin Oncol 16:2825-2833；以及Cobleigh等人,1999,J Clin Oncol17:2639-2648，它们都通过引用整体并入。对于目前的抗癌治疗，死亡率方面的任何小的改进就表明了成功。本文所公开的某些IgG变体增强了抗体限制靶癌细胞的进一步生长或至少部分破坏靶癌细胞的能力。
抗体的抗肿瘤效力是通过增强它们介导细胞毒效应子功能例如ADCC、ADCP、和CDC的能力而达成的。实例包括：Clynes等人,1998,Proc Natl Acad Sci U S A 95:652-656；Clynes等人,2000,Nat Med 6:443-446以及Cartron等人,2002,Blood 99:754-758，它们都通过引用整体并入。
人IgG1是用于治疗目的的最常用的抗体，并且在此方面已经进行了大量的工程化研究。然而，IgG种类的不同同种型包括IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4具有独特的物理、生物和临床特性。在本领域内需要设计改良的IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4变体。还需要设计与天然IgG多肽相比改良了与FcRn的结合和/或增加了体内半衰期的这类变体。此外，需要将具有改良的药代动力学特性的变体与包括通过改变的FcγR结合而改善效力的修饰的变体组合。本申请满足了这些和其他的需求。
发明内容
本发明涉及亲本多肽的Fc变体，该变体包括在多肽的Fc区的至少一个修饰。在各实施方式中，所述变体多肽表现出与亲本多肽相比改变的与FcRn的结合。在某些变化形式中，修饰可以选自由下列组成的组：428L、434M和434S，其中编号是根据Kabat等人的EU索引进行的。
在另一个实施方式中，Fc变体包括选自由下列组成的组的至少两个修饰：252Y/428L、428L/434H、428L/434F、428L/434Y、428L/434A、428L/434M、和428L/434S。
在另一个实施方式中，Fc变体包括选自由下列组成的组的至少一个修饰：M428L/N434S、V308F/M428L/N434S。
在另一个实施方式中，Fc变体包括选自由下列组成的组的至少一个修饰：259I/434S、308F/434S、308F/428L/434S、259I/308F/434S、307Q/308F/434S、250I/308F/434S和308F/319L/434S。
在另一个实施方式中，Fc变体包括选自由下列组成的组的至少一个修饰：
在另一个实施方式中，本发明包括治疗需要所述治疗的患者的方法，该方法包括施用有效量的本文所述的Fc变体。
在另一实施方式中，本发明包括通过根据本文所述的修饰对Fc进行修饰来增加抗体或免疫粘附素的半衰期的方法。
在另一变体中，本发明包括与调控效应子功能的另一Fc变体的FcRn结合增强的Fc变体。
附图说明
图1.人IgG恒定区重链的序列比对。灰色表示与IgG1的不同，方框内的残基表示人群中常见的同种异型变异。
图2.(SEQ ID NO:1-6)本发明中所用的恒定区的氨基酸序列。
图3.(SEQ ID NO:7-12)示例性变体恒定区的氨基酸序列。
图4.(SEQ ID NO:13-22)本发明中所用的VH和VL可变区的氨基酸序列。
图5.(SEQ ID NO:23-29)示例性变体抗体的氨基酸序列。
图6.野生型与选择的变体IgG1抗VEGF抗体的相对VEGF结合。该图显示在抗体分析物与固定的VEGF抗原结合的结合期结束时的Biacore响应单位(RU)。使用抗Her2IgG1抗体作为阴性对照。
图7.在低(6.0)和高(7.4)pH下野生型和变体IgG抗体与固定的人FcRn的Biacore传感图(sensorgram)。
图8.如通过Biacore所测定的在pH6.0下野生型和选择的变体IgG1抗体与人FcRn的FcRn结合亲和力。该图显示对数标度的假亲和力常数(Ka*)的图。
图9.如通过Biacore所测定的变体IgG1抗VEGF抗体与人FcRn的相对结合。该表显示了各变体相对于人野生型(天然的)IgG1的Ka*倍数。n表示各变体被测试的次数，均值和SD表示在n次结合实验中各个变体各自的平均值和标准偏差。在每个单独的结合实验中计算了所有变体相对于野生型IgG1的FcRn倍数。NB表示没有检测到结合。ND表示没有测定对于该具体变体的结合。NF表示结合数据可能不拟合。
图10.如通过Biacore所测定的变体IgG2和IgG1/2抗VEGF抗体与人FcRn的相对结合。该表如图9中所描述的一样。
图11.加性的和协同的取代组合的分析。图11a显示实验测定的各变体与人FcRn的结合倍数相对于如通过单变体的乘积确定的所预测的FcRn结合倍数的图。标记了变体数据点，直线代表完美的加性作用。图11b显示各组合变体的实验和预测倍数之间的不同。图11c显示各变体组合的协同作用。％协同作用计算为100×[(实验倍数/预测倍数)-1)]。
图12.如通过Biacore所测定的变体抗TNF、抗CD25、抗EGFR和抗IgE抗体与人FcRn的相对结合。该表如图9中所描述的一样。
图13.在mFcRn-/-hFcRn+小鼠中野生型和变体抗体的体内药代动力学。该图绘制了在单次静脉内给药后抗体的血清浓度相对于时间的图。图13a显示来自用IgG1抗体进行的4次研究中的一次(研究3)的数据，图13b显示来自用IgG2抗体进行的研究(研究5)的数据。
图14.来自在mFcRn-/-hFcRn+小鼠中用变体和野生型抗体进行的所有体内药代动力学(PK)研究的拟合PK参数。n表示每组的小鼠数，提供了PK参数的均值和标准偏差(SD)数据。半衰期表示表征抗体从血清中消除的β期。Cmax是观察到的最大血清浓度，AUC是浓度时间曲线下的面积，并且清除率是抗体从血清中的清除率。半衰期倍数计算为在各研究中变体抗体的半衰期与野生型IgG1或IgG2亲本的半衰期的比。
图15.在mFcRn-/-hFcRn+小鼠中IgG1(图15a)和IgG2(图15b)变体抗体的半衰期与相对于野生型IgG1的FcRn结合倍数之间的相关性。y轴上的数据来自图14，x轴上的数据来自图9和10。标记出了选择的变体，圈出了来自重复实验的变体数据。图15c显示IgG1和IgG2两者的相关性数据，其中黑线和灰线分别表示IgG1和IgG2数据的拟合。
图16.(SEQ ID NO:30-35)本发明中所用的变体和亲本抗TNF Fc免疫粘附素的氨基酸序列。
图17.如Biacore所测定的抗TNF免疫粘附素与TNF抗原的结合。
图18.如通过Biacore所测定的变体Fc免疫粘附素与人FcRn的相对结合。该表显示了各变体相对于人野生型(天然的)IgG1的Ka*倍数。n表示各变体被测试的次数，均值和SD表示在n次结合实验中每个变体各自的平均值和标准偏差。在每个单独的结合实验中计算了所有变体相对于各自的IgG1亲本的FcRn倍数。
图19.在mFcRn-/-hFcRn+小鼠中亲本和变体Fc免疫粘附素的体内药代动力学。该图绘制了在单次静脉内给药后Fc融合体的血清浓度相对于时间的图。
图20.来自mFcRn-/-hFcRn+小鼠中体内PK研究的Fc融合体的拟合PK参数。参数如在图14中所描述的一样。半衰期的％增加计算为100乘以变体融合体与野生型IgG1或IgG2亲本的半衰期的比。
图21.如通过Biacore所测定的变体IgG1抗VEGF抗体与短尾猴和人FcRn的相对结合。图21a显示表格形式的数据。图的说明如图9中一样，与人FcRn结合的数据取自图9。图21b显示了数据图。
图22.在短尾猴中野生型和变体抗体的体内药代动力学。该图绘制了在单次静脉内给药后抗体的血清浓度相对于时间的图。
图23.来自在短尾猴中用变体和野生型抗体进行的体内PK研究的拟合PK参数。参数如图14中所描述的一样。
具体实施方式
本发明公开了新的Fc结构域变体的制备，所述Fc结构域变体包括在抗体、Fc融合体、和免疫粘合素中存在的那些，所述Fc结构域变体与FcRn受体的结合增强。如本文所提到的，与FcRn的结合产生了较长的体内血清滞留。
为了增加体内的Fc蛋白滞留，结合亲和力的增加必须在约pH 6的条件下，而在约pH 7.4的条件下则保持较低的亲和力。尽管仍处于检测阶段，但是相信Fc区具有较长的体内半衰期，因为在pH 6时在与内体中FcRn的结合隔离了Fc(Ghetie和Ward，1997ImmunolToday.18(12):592-598，通过引用整体并入)。然后内体隔室将Fc再循环到细胞表面。一旦隔室向胞外空间开放，较高的pH约7.4便诱导Fc释放回血液中。在小鼠中，Dall’Acqua等人显示在pH 6和pH 7.4的条件下FcRn结合增加的Fc突变体实际上与野生型Fc相比具有降低的血清浓度和相同的半衰期(Dall’Acqua等人2002,J.Immunol.169:5171-5180，通过引用整体并入)。认为在pH 7.4时Fc与FcRn的亲和力增加阻止了Fc释放回血液。因此，增加Fc体内半衰期的Fc突变理想地应在较低pH下增加FcRn结合，而在较高pH下则仍然容许Fc释放。氨基酸组氨酸在6.0至7.4的pH范围内会改变其电荷状态。因此，在Fc/FcRn复合体的重要位置发现His残基并不出乎意料(图6)。
本发明的另一方面是增加与野生型相比的FcRn结合，尤其是在较低的pH约pH6.0下，以促进Fc/FcRn在内体中的结合。由于对FcγR的差异结合，尤其是与FcγRIIIb结合增加并且与FcγRIIb结合降低，已显示导致效力增加，还公开了与FcRn结合改变并且与另一类Fc受体FcγR(有时写为Fc伽马R)的结合改变的Fc变体。
定义
为了可以更完整地理解本申请，下面列出了一些定义。这些定义的意思涵盖语法上的等同物。
本文所用的“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用”意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上所结合的抗体，并且随后引起靶细胞的裂解。
本文所用的“ADCP”或抗体依赖性细胞介导的吞噬作用意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上所结合的抗体，并且随后引起靶细胞的吞噬作用。
本文所谓的“修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失，或者与蛋白化学连接部分的改变。例如，修饰可以是连接到蛋白上的碳水化合物或PEG结构的改变。本文所谓的“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失。
本文所谓的“氨基酸取代”或“取代”意指将在亲本多肽序列的特定位置的氨基酸替换为另一氨基酸。例如，取代E272Y是指变体多肽，在这种情况下为Fc变体，其中位置272处的谷氨酸被替换为酪氨酸。
本文所谓的“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列的特定位置的氨基酸序列的添加。例如，-233E或^233E是指在位置233后和位置234前的谷氨酸插入。此外，-233ADE或^233ADE是指位置233之后和位置234之前的AlaAspGlu插入。
本文所谓的“氨基酸缺失”或“缺失”意指在亲本多肽序列的特定位置的氨基酸序列的去除。例如，E233-或E233#是指在位置233处的谷氨酸缺失。此外，EDA233-或EDA233#是指在位置233处开始的GluAspAla序列的缺失。
本文所用的“变体蛋白”或“蛋白变体”、或“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本蛋白不同的蛋白。蛋白变体可以指蛋白本身、包含蛋白的组合物、或编码它的氨基酸序列。优选地，蛋白变体与亲本蛋白相比具有至少一个氨基酸修饰，例如与亲本相比约1至约70个氨基酸修饰，优选约1至约5个氨基酸修饰。本文的蛋白变体序列优选具有与亲本蛋白序列至少约80％的同源性，并且最优选至少约90％的同源性，更优选至少约95％的同源性。变体蛋白可以指变体蛋白本身、包含蛋白变体的组合物、或编码它的DNA序列。因此，本文所用的“抗体变体”或“变体抗体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本抗体不同的抗体，本文所用的“IgG变体”或“变体IgG”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本IgG不同的抗体，并且本文所用的“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。本文所用的“Fc变体”或“变体Fc”意指包含Fc结构域中的修饰的蛋白。本发明的Fc变体根据构成它们的氨基酸修饰来定义。因此。例如N434S或434S是相对于亲本Fc多肽在位置434处具有取代丝氨酸的Fc变体，其中编号是根据EU索引进行的。同样地，M428L/N434S定义了具有取代M428L和N434S的Fc变体。相对于亲本Fc多肽。野生型氨基酸的身份可能是非特异性的，在这种情况下，上述变体称为428L/434S。注意其中取代的顺序是任意提供的，也就是说，例如，428L/434S是与M428L/N434S相同的Fc变体，等等。对于本发明所讨论的所有位置，编号根据EU索引进行。EU索引或如Kabat中的EU索引或EU编号方案是指EU抗体的编号(Edelman等人,1969,Proc Natl Acad SciUSA 63:78-85，其通过引用整体并入本文)。修饰可以是添加、缺失、或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。变体可以包含非天然氨基酸。实例包括US 6,586,207；WO 98/48032；WO 03/073238；US2004-0214988A1；WO 05/35727A2；WO 05/74524A2；J.W.Chin等人,(2002),Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz,(2002),ChemBioChem 11:1135-1137；J.W.Chin,等人,(2002),PICAS United States of America 99:11020-11024；以及L.Wang和P.G.Schultz,(2002),Chem.1-10，它们都通过引用整体并入。
如本文所用“蛋白”在本文意指至少两个共价连接的氨基酸，它包括蛋白、多肽、寡肽和肽。肽基基团可以包含天然存在的氨基酸和肽键、或合成的肽模拟物结构，即“类似物”，如类肽(参见Simon等人,PNAS USA89(20):9367(1992)，其通过引用整体并入)。氨基酸可以是天然存在的或非天然存在的，如本领域的那些技术人员所了解的一样。例如高苯丙氨酸、瓜氨酸、和正亮氨酸是本发明目的所考虑的氨基酸，并且D-和L-(R或S)构型的氨基酸都可以使用。本发明的变体可以包含使用非天然氨基酸的修饰，这些非天然氨基酸使用例如Schultz和同事所开发的技术来整合，所述技术包括但不下于下列文献中所描述的方法：Cropp&Shultz,2004,Trends Genet.20(12):625-30；Anderson等人,2004,Proc Natl AcadSci USA101(2):7566-71；Zhang等人,2003,303(5656):371-3；和Chin等人,2003,Science301(5635):964-7，它们全部通过引用整体并入。此外，多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生、糖基化、PEG化、环状排列、环化、与其他分子的连接子、与蛋白或蛋白结构域的融合体、以及肽标签或标记的添加。
本文所用的“残基”意指蛋白的位置及其相关的氨基酸身份。例如，天冬酰胺297(还称为Asn297或N297)是人抗体IgG1中位置297处的残基。
本文所用的“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白结构域的多肽。Fab可以指分离状态的这个区域，或在全长抗体、抗体片段或Fab融合蛋白背景下的这个区域。如本文所用的“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”意指包含单个抗体的VL和VH结构域的多肽。
本文所用的“IgG亚类修饰”意指将一种IgG同种型的一个氨基酸转变为不同的、比对的IgG同种型的对应氨基酸的氨基酸修饰。例如，由于在EU位置296处IgG1包含酪氨酸，IgG2具有苯丙氨酸，因此IgG2中的F296Y取代被认为是IgG亚类修饰。
本文所用的“非天然存在的修饰”意指非同种型的氨基酸修饰。例如，由于没有一种IgG在位置434包含丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4中的取代434S被认为是非天然存在的修饰。
本文所用的“氨基酸”和“氨基酸身份”意指可以在特定的、指定的位置存在的20种天然存在的氨基酸或任何非天然类似物中的一种。
本文所用的“效应子功能”意指由于抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用而引起的生物化学事件。效应子功能包括但不限于ADCC、ADCP、和CDC。
本文所用的“IgG Fc配体”意指来自任何生物体的与IgG抗体的Fc区结合形成Fc/Fc配体复合体的分子，优选多肽。Fc配体包括但不限于FcγR、FcγR、FcγR、FcRn、C1q、C3、结合甘露聚糖的凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌(staphylococcal)蛋白A、葡萄球菌蛋白G、和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，它们是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人,2002,Immunological Reviews 190:123-136，其通过引用整体并入)。Fc配体可以包括结合Fc的未发现的分子。具体的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。本文所用的“Fc配 体”意指来自任何生物体的与抗体的Fc区结合形成Fc/Fc配体复合体的分子，优选多肽。
本文所用的“Fcγ受体”、“FcγR”或“Fc伽马R”意指结合IgG抗体Fc区并且由FcγR基因编码的蛋白家族的任何成员。在人中，这个家族包括但不限于FcγRI(CD64)，其包括同种型FcγRIa、FcγRIb、和FcγRIc；FcγRII(CD32)，其包括同种型FcγRIIa(包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)、和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，其包括同种型FcγRIIIa(包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包括同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人,2002,Immunol Lett 82:57-65，通过引用整体并入)；以及任何未发现的人FcγR或FcγR同种型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、和FcγRIII-2(CD16-2)、以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同种型或同种异型。
本文所用的“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区并且至少部分由FcRn基因编码的蛋白。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。如本领域所已知的，功能FcRn蛋白包含两条多肽，它们通常称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白，重链由FcRn基因编码。除非本文中另外指明，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合体。具体的感兴趣的FcRn序列显示在附图中，特别是人的。
本文所用的“亲本多肽”意指随后被修饰产生变体的未被修饰的多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽、或天然存在的多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物、或编码它的氨基酸序列。因此，本文所用的“亲本免疫球蛋白”意指被修饰产生变体的未被修饰的免疫球蛋白多肽，本文所用的“亲本抗体”意指被修饰产生变体抗体的未被修饰的抗体。应了解“亲本抗体”包括如下文中所列出的已知的商业上的重组制备的抗体。
本文所用的“位置”意指蛋白序列中的定位。位置可以顺序编号，或者根据已建立的形式例如用于抗体编号的EU索引编号。
本文所用的“靶抗原”意指被给定抗体的可变区特异性结合的分子。靶抗原可以是蛋白、碳水化合物、脂、或其他化合物。
本文所用的“靶细胞”意指表达靶抗原的细胞。
本文所用的“可变区”意指包含一个或多个Ig结构域的免疫球蛋白区域，所述一个或多个Ig结构域基本上由分别构成κ、λ、和重链免疫球蛋白基因座的Vκ、Vλ、和/或VH基因的任一种编码。
本文所谓的“野生型或WT”意指天然存在的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基因变异。WT蛋白具有未被有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本发明涉及表现出相对于野生型抗体与FcRn的结合增加的抗体。例如，在某些情况下，增加的结合导致抗体的细胞再循环并且由此增加了半衰期。此外，表现出与FcRn结合增加并且与其他Fc受体例如FcγR的结合有所改变的抗体可用于本发明。
抗体
本申请涉及包含调节与FcRn的结合的氨基酸修饰的抗体。特别感兴趣的是最低限度地包含Fc区或其功能变体的抗体，所述Fc区在较低的pH下表现出增加的结合亲和力，而在较高的pH下不表现出实质的结合改变。
传统的抗体结构单位通常包含四聚体。各四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(通常具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。人轻链被分为κ和λ轻链。重链被分为μ、δ、γ、α、或ε，它们分别将抗体同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA、和IgE。IgG具有几个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、和IgG4。IgM具有包括但不限于IgM1和IgM2的亚类。因此，本文所用的“同种型”意指通过免疫球蛋白恒定区的化学和抗原特征所定义的任何免疫球蛋白亚类。已知的人免疫球蛋白同种型为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM1、IgM2、IgD、和IgE。
各链的氨基末端部分包括约100至110或更多个氨基酸的可变区，该可变区主要负责抗原识别。在可变区中，重链和轻链的每个V结构域集合了三个环以形成抗原结合位点。每个环称为互补决定区(后面称为“CDR”)，其中氨基酸序列的变异是最显著的。
各链的羧基末端部分定义了恒定区，该恒定区主要负责效应子功能。Kabat等人收集了重链和轻链可变区的大量主要序列。根据序列的保守程度，他们将个体的主要序列分为CDR和框架，并制作了它们的列表(参见SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST(具有免疫学重要性的序列),第5版,NIH publication,No.91-3242,E.A.Kabat等人,其通过引用整体并入)。
在免疫球蛋白的IgG亚类中，重链中具有几个免疫球蛋白结构域。本文所谓的“免 疫球蛋白(Ig)结构域”意指具有独特的三级结构的免疫球蛋白区域。本发明中所感兴趣的是重链结构域，包括重链恒定(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的背景下，每个IgG同种型具有三个CH区。因此，在IgG背景下的“CH”结构域如下：“CH1”是指根据Kabat中的EU索引的位置118-220，“CH2”是指根据Kabat中的EU索引的位置237-340，并且“CH3”是指根据Kabat中的EU索引的位置341-447。
另一类重链Ig结构域是铰链区。本文所谓的“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“免疫球蛋白铰链区”意指包含抗体的第一和第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置220处结束，并且IgG CH2结构域在EU位置237处的残基开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中定义为包括位置221(IgG1中的D221)至236(IgG1中的G236)，其中编号根据Kabat中的EU索引进行。在某些实施方式中，例如在Fc区的背景下，包含较低的铰链，其中“较低的铰链”通常是指位置226或230。
本发明所特别感兴趣的是Fc区。如本文所用的“Fc”和“Fc区”意指包含抗体的恒定区，而不包含第一恒定区免疫球蛋白结构域和在一些情况下的部分铰链的多肽。因此，Fc是指IgA、IgD、和IgG的后两个恒定区免疫球蛋白结构域；IgE和IgM的后三个恒定区免疫球蛋白结构域；以及这些结构域N末端的柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可以包括J链。对于IgG，如图1中所示，Fc包含免疫球蛋白结构域C伽马2和C伽马3(Cg2和Cg3)以及C伽马1(Cg1)和C伽马2(Cg2)之间的较低的铰链区。尽管Fc区的界线可以变化，但是人IgG重链Fc区通常被定义为包括残基C226或P230至其羧基末端，其中编号是根据Kabat中的EU索引进行。如下文所述，Fc可以指分离状态的这个区域，或在Fc多肽背景下的这个区域。如本文所用的“Fc多肽”意指构成全部或部分的Fc区的多肽。Fc多肽包括抗体、Fc融合体、分离的Fc、和Fc片段。
在一些实施方式中，抗体为全长的。本文所谓的“全长抗体”意指构成天然生物学形式的抗体的结构，包括可变区和恒定区，包括一个或多个本文所列出的修饰。
可选择地，抗体可以为多种结构，包括但不限于：抗体片段、单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体(minibody)、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、抗体融合体(有时称为“抗体轭合物”)以及它们每种各自的片段。
抗体片段
在一个实施方式中，抗体是抗体片段。特别感兴趣的是包含Fc区、Fc融合体、和重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)的抗体，还包括重链恒定区融合体。
具体的抗体片段包括但不限于：(i)包含VL、VH、CL和CH1结构域的Fab片段；(ii)包含VH和CH1结构域的Fd片段；(iii)包含单个抗体的VL和VH结构域的Fv片段；(iv)包含单个可变区的dAb片段(Ward等人,1989,Nature 341:544-546，其通过引用整体并入本文)；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段，包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽连接子连接，该肽连接子容许两个结构域结合形成抗原结合位点(Bird等人,1988,Science 242:423-426；Huston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-5883，它们通过引用整体并入)；(viii)双特异性单链Fv(WO 03/11161，通过引用并入本文)；以及(ix)“双链抗体”或“三链抗体”，通过基因融合构建的多价或多特异性片段(Tomlinson等人,2000,Methods Enzymol.326:461-479；WO94/13804；Holliger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6444-6448，它们都通过引用整体并入)。抗体片段可以被修饰。例如，可以通过掺入连接VH和VL结构域的二硫桥来稳定分子(Reiter等人,1996,Nature Biotech.14:1239-1245，通过引用整体并入)。
嵌合抗体和人源化抗体
在一些实施方式中，骨架组分可以为来自不同物种的混合物。同样地，如果蛋白为抗体，则此抗体可以为嵌合抗体和/或人源化抗体。一般来说，“嵌合抗体”和“人源化抗体”都是指组合了来自不止一个物种的区域的抗体。例如，“嵌合抗体”在传统上包含来自小鼠(或在某些情况下为大鼠)的可变区和来自人的恒定区。“人源化抗体”一般是指具有交换为人抗体中所存在的序列的可变结构域框架区的非人抗体。一般而言，在人源化抗体中，除CDR外，整个抗体是由人来源的多核苷酸编码，或者与由人来源的多核苷酸编码的抗体在CDR之外具有同一性。一些或所有的CDR是由非人生物体来源的核酸编码的，将它们移植到人抗体可变区的β片层框架区以产生抗体，该抗体的特异性由植入的CDR决定。这类抗体的制备描述于：例如，WO 92/11018；Jones,1986,Nature 321:522-525；Verhoeyen等人,1988,Science 239:1534-1536，它们的全文通过引用并入。通常需要将所选的受体框架残基“回复突变”为相应的供体残基以重新获得在最初的移植构建体中丢失的亲和力(US 5530101；US 5585089；US 5693761；US 5693762；US 6180370；US 5859205；US 5821337；US 6054297；US 6407213，它们都通过引用整体并入)。人源化抗体最佳地还含有至少一部分免疫球蛋白恒定区，通常是人免疫球蛋白的恒定区，因此通常包含人Fc区。人源化抗体还可以使用具有遗传工程化的免疫系统的小鼠制备。Roque等人,2004,Biotechnol.Prog.20:639-654，其通过引用整体并入。用于人源化和改造非人抗体的多种技术和方法是本领域内所熟知的(参见Tsurushita和Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies(单克隆抗体的人源化),Molecular Biology of B Cells,533-545,Elsevier Science(USA)；和本文所引用的参考文献，它们都通过引用整体并入)。人源化方法包括但不限于下列文献所述的方法：Jones等人,1986,Nature 321:522-525；Riechmann等人,1988；Nature 332:323-329；Verhoeyen等人,1988,Science,239:1534-1536；Queen等人,1989,Proc Natl Acad Sci,USA 86:10029-33；He等人,1998,J.Immunol.160:1029-1035；Carter等人,1992,Proc NatlAcad Sci USA89:4285-9；Presta等人,1997,Cancer Res.57(20):4593-9；Gorman等人,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4181-4185；O’Connor等人,1998,Protein Eng11:321-8，它们都通过引用整体并入。人源化或降低非人抗体可变区免疫原性的其他方法可以包括表面重建方法，例如Roguska等人,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:969-973中所述的方法，所述文献通过引用整体并入。在一个实施方式中，如本领域内所已知的，亲本抗体具有成熟的亲和力。如USSN 11/004,590中所述，可以采用基于结构的方法进行人源化和亲和力成熟。可以采用基于选择的方法使抗体可变区人源化和/或亲和力成熟，所述方法包括但不限于下列文献中所述的方法：Wu等人,1999,J.Mol.Biol.294:151-162；Baca等人,1997,J.Biol.Chem.272(16):10678-10684；Rosok等人,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611-22618；Rader等人,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910-8915；Krauss等人,2003,Protein Engineering 16(10):753-759，它们都通过引用整体并入。其他人源化方法可包括仅将CDR的部分移植，包括但不限于下列文献中所述的方法：USSN 09/810,510；Tan等人,2002,J.Immunol.169:1119-1125；De Pascalis等人,2002,J.Immunol.169:3076-3084，它们都通过引用整体并入。
双特异性抗体
在一个实施方式中，本发明的抗体为多特异性抗体，尤其是双特异性抗体，有时还称为“双链抗体”。它们是结合两个(或更多个)不同抗原的抗体。双链抗体可以通过本领域内已知的多种方法制备(Holliger和Winter,1993,Current Opinion Biotechnol.4:446-449，其通过引用整体并入)，例如，以化学方法制备或从杂交瘤制备。
微型抗体
在一个实施方式中，抗体是微型抗体。微型抗体是包含连接至CH3结构域的scFv的最小化抗体样蛋白。Hu等人,1996,Cancer Res.56:3055-3061，通过引用整体并入。在一些情况下，scFv可以连接到Fc区，并且可以包含一些或整个的铰链区。
抗体融合体
在一个实施方式中，本发明的抗体是抗体融合蛋白(有时在本文中称为“抗体轭合物”)。一种类型的抗体融合体包括Fc融合体，它连接了Fc区与轭合配偶体。如本文所用的“Fc融合体”意指其中一个或多个多肽可操作地连接至Fc区的蛋白。本文中的Fc融合体意指与已有技术中所用的术语“免疫粘附素”、“Ig融合体”、“Ig嵌合体”、和“受体球蛋白”(有时用破折号)(Chamow等人,1996,Trends Biotechnol 14:52-60；Ashkenazi等人,1997,CurrOpin Immunol 9:195-200，它们通过引用整体并入)是同义的。Fc融合体组合了免疫球蛋白Fc区与融合配偶体，该融合配偶体通常可以为任何蛋白或小分子。事实上，任何蛋白或小分子都可以连接至Fc以产生Fc融合体。蛋白融合配偶体可以包括但不限于：任何抗体的可变区、受体的靶结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子、或一些其他的蛋白或蛋白结构域。小分子融合配偶体可以包括将Fc融合体导向治疗靶的任何治疗剂。这种靶可以为疾病所涉及的任何分子，优选为胞外受体。因此，可以将IgG变体连接至一个或多个融合配偶体。在一个替代性实施方式中，IgG变体与另一种治疗化合物轭合或可操作地连接。治疗化合物可以为细胞毒素剂、化疗剂、毒素、放射性同位素、细胞因子或其他治疗活性剂。IgG可以连接至多种非蛋白性聚合物中的一种，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
除了Fc融合体之外，抗体融合体包括重链恒定区与一个或多个融合配偶体(还包括任何抗体的可变区)的融合体，而其他抗体融合体则基本上或全部为具有融合配偶体的全长抗体。在一个实施方式中，融合配偶体的作用是介导靶结合，因此其在功能上类似于抗体可变区(事实上，可以是抗体可变区)。事实上，任何蛋白或小分子都可以连接至Fc以制备Fc融合体(或抗体融合体)。蛋白融合配偶体可以包括但不限于：受体的靶结合区、粘附分子、配体、酶、细胞因子、趋化因子、或一些其他的蛋白或蛋白结构域。小分子融合配偶体可以包括将Fc融合体导向治疗靶的任何治疗剂。这种靶可以为疾病所涉及的任何分子，优选为胞外受体。
轭合配偶体可以是蛋白性的或非蛋白性的；后者一般使用抗体上和轭合配偶体上的官能团制备。例如，连接子是本领域中已知的；例如同型或异型双功能连接子是熟知的(参见，1994Pierce Chemical Company catalog,technical section on cross-linkers(Pierce化学公司1994年的目录，交联剂的技术部分),第155-200页，通过引用并入本文)。
合适的轭合物包括但不限于：如下文所述的标记，药物和细胞毒素剂，包括但不限于细胞毒性药物(例如，化疗剂)或毒素或此类毒素的活性片段。适合的毒素和它们的相应片段包括白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、泻果素、巴豆毒素、酚霉素、依诺霉素等。细胞毒素剂还包括放射性化学物质，它们通过将放射性同位素轭合至抗体或将放射性核素结合至已经共价连接至抗体的螯合剂来制备。其他的实施方式使用刺孢霉素、auristatins、格尔德霉素、美登素、和倍癌霉素(duocarmycin)和类似物；对于后者，参见U.S.2003/0050331A1，其通过引用整体并入。
抗体的共价修饰
抗体的共价修饰包括在本发明的范围内，并且一般但并非总是在翻译后进行。例如，通过使抗体的特定氨基酸残基与能够与所选择的侧链或N末端或C末端残基反应的有机衍生剂反应将几种类型的抗体共价修饰引入分子中。
半胱氨酰残基最通常的是与诸如氯乙酸或氯乙酰胺的α-卤代乙酸酯(和对应的胺)反应以得到羧甲基或羧氨基甲基衍生物。半胱氨酰残基还可以通过与下列物质的反应来衍生：溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚、或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑等。
组氨酰残基通过在pH5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应来衍生，因为这个试剂对组氨酰侧链是相对特异的。也可使用对溴苯甲酰甲基溴化物；该反应优选在pH6.0下在0.1M二甲胂酸钠中进行。
赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸或其他羧酸酐反应。使用这些试剂的衍生具有逆转赖氨酰残基的电荷的作用。用于衍生含α氨基的残基的合适试剂包括亚氨酸酯，如甲基吡啶亚胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氢化物；三硝基苯磺酸；O-甲基异脲；2,4-戊二酮；和转氨酶所催化的与乙醛酸的反应。
精氨酰残基通过与一种或几种常规试剂反应来修饰，尤其是苯乙二醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮、和水合茚三酮。精氨酸残基的衍生需要反应在碱性条件下进行，这是因为胍官能团的pKa较高。此外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基反应。
可以进行酪氨酰残基的特定修饰，尤其感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应而将光谱标记引入酪氨酰残基中。最常见的是，使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷来分别形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。使用125I或131I将酪氨酰残基碘化以制备用于放射性免疫测定的标记蛋白，上文所述的氯胺T法是合适的。
羧基侧基(天冬氨酰或谷氨酰)选择性地通过与碳二亚胺(R'—N＝C＝N--R')反应来修饰，其中R和R’任选地为不同的烃基，如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4,4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰残基通过与铵离子反应而转化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。
用双官能剂进行的衍生可用于将抗体交联至水不溶性支持体基质或表面以供多种方法使用，包括下面所述的方法。常用的交联剂包括：例如，1,1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷；戊二醛；N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如与4-叠氮水杨酸的酯；同型双官能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯如3,3'-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)、和双官能的马来酰亚胺，如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷。诸如甲基-3-[(对叠氮苯基)二硫基]丙亚胺酯的衍生剂会产生光活化的中间体，该中间体能够在存在光的条件下形成交联。可选择地，可以采用反应性的水不溶性基质如溴化氰活化的碳水化合物和美国专利第3,969,287、3,691,016、4,195,128、4,247,642、4,229,537、和4,330,440号中所述的反应性基质来进行蛋白固定，所述专利都通过引用整体并入。
谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基经常分别脱酰胺化为对应的谷氨酰和天冬胺酰残基。可选择地，这些残基在弱酸条件下进行脱酰胺化。这些残基的任一形式都属于本发明的范围。其他修饰包括：脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰或苏氨酰残基的羟基的磷酸化；赖氨酸、精氨酸、和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structure andMolecular Properties(蛋白质：结构和分子特性),W.H.Freeman&Co.,San Francisco,第79-86页[1983]，通过引用整体并入)；N-末端胺的乙酰化；和任何C-末端羧基的酰胺化。
糖基化
另一种类型的共价修饰是糖基化。在另一个实施方式中，本文所公开的IgG变体可以被修饰以包含一种或多种工程化糖形。如本文所用的“工程化糖形”意指共价连接至IgG的碳水化合物组合物，其中所述碳水化合物组成在化学上与亲本IgG的碳水化合物组成不同。工程化糖形可用于多种目的，包括但不限于增强或降低效应子功能。工程化糖形可以通过许多本领域内已知的方法制备(等人,1999,Nat Biotechnol 17:176-180；Davies等人,2001,Biotechnol Bioeng 74:288-294；Shields等人,2002,J Biol Chem277:26733-26740；Shinkawa等人,2003,J Biol Chem 278:3466-3473；US 6,602,684；USSN10/277,370；USSN 10/113,929；PCT WO 00/61739A1；PCT WO 01/29246A1；PCT WO 02/31140A1；PCT WO 02/30954A1,它们都通过引用整体并入；(技术[Biowa,Inc.,Princeton,NJ]；糖基化工程技术[Glycart Biotechnology AG,Zürich,Switzerland])。这些技术中的一些基于调控岩藻糖基化水平和/或对切共价连接至Fc区的寡糖，例如，通过在工程化的或其他形式的各种生物体或细胞系(例如Lec-13CHO细胞或大鼠杂交瘤YB2/0细胞)中表达IgG；通过调节参与糖基化通路的酶(例如FUT8[α1,6-岩藻糖转移酶]和/或β1-4-N-乙酰葡糖氨基转移酶III[GnTIII])；或通过在IgG表达之后修饰碳水化合物进行。工程化糖形通常是指不同的碳水化合物或寡糖；因此IgG变体例如抗体或Fc融合体可以包含工程化糖形。可选择地，工程化糖形可以指包含不同碳水化合物或寡糖的IgG变体。如本领域内所已知的，糖基化模式可取决于蛋白序列(例如，存在或不存在特定的糖基化氨基酸残基，在下文中讨论)或产生蛋白的宿主细胞或生物体。具体的表达系统在下文中讨论。
多肽的糖基化通常为N-连接的或O-连接的。N-连接的是指碳水化合物部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。其中X为除脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，是碳水化合物部分与天冬酰氨侧链酶促连接的识别序列。因此，多肽中这些三肽序列的任一种的存在产生可能的糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、或木糖中的一种与羟基氨基酸的连接，所述羟基氨基酸最常见的是丝氨酸或苏氨酸，尽管也可以使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。
抗体中糖基化位点的添加是通过改变氨基酸序列使其含有上述三肽序列的一种或多种来方便地完成(用于N-连接的糖基化位点)。改变还可以通过将一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基添加到初始序列或用一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基取代初始序列来进行(用于O-连接的糖基化位点)。为了方便，抗体氨基酸序列优选通过在DNA水平的改变来改变，尤其是通过在预选的碱基突变编码靶多肽的DNA使得产生将翻译成所需的氨基酸的密码子。
增加抗体上碳水化合物部分数目的其他方法为将糖苷化学偶联或酶促偶联至蛋白。这些方法的有利之处在于它们不需要在宿主细胞中产生具有用于N-连接的和O-连接的糖基化的糖基化能力的蛋白。依据所用的偶联方式，糖可以连接至(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，如半胱氨酸的游离巯基；(d)游离羟基，如丝氨酸、苏氨酸、或羟脯氨酸的游离羟基；(e)芳族残基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述在WO 87/05330以及Aplin和Wriston,1981,CRCCrit.Rev.Biochem.,第259-306页，它们都通过引用整体并入。
可以通过化学法或酶法完成初始抗体上所存在的碳水化合物部分的移除。化学去糖基化需要将蛋白暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。这种处理导致了除了连接糖(N-乙酰基葡糖胺或N-乙酰基半乳糖胺)之外大部分或所有的糖被裂解，而多肽则保持完整。化学去糖基化描述在Hakimuddin等人,1987,Arch.Biochem.Biophys.259:52和Edge等人,1981,Anal.Biochem.118:131中，它们通过引用整体并入。多肽上碳水化合物部分的酶促裂解可以通过使用多种内切和外切糖苷酶来达成，如Thotakura等人,1987,Meth.Enzymol.138:350中所述，其全文通过引用并入。可以通过使用化合物衣霉素来防止在可能的糖基化位点的糖基化，如Duskin等人,1982,J.Biol.Chem.257:3105中所述，其全文通过引用并入。衣霉素阻断蛋白-N-糖苷键形成。
另一种类型的抗体共价修饰包括将抗体连接至多种非蛋白性的聚合物上，包括但不限于，多种多元醇，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，这通过下列文献中所述的方法进行：例如，2005-2006PEG Catalog from Nektar Therapeutics(2005-2006年来自Nektar治疗剂的PEG目录)(可得自Nektar网站)美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337，它们都通过引用全文并入。此外，如本领域中已知的，氨基酸取代可以在抗体中的多个位置进行，以促进诸如PEG的聚合物的添加。参见，例如美国公开第2005/0114037A1号，其通过引用整体并入。
标记的抗体
在一些实施方式中，本发明抗体的共价修饰包括添加一个或多个标记。在一些情况下，考虑的是抗体融合体。术语“标记基团”意指任何检测标记。在一些实施方式中，标记基团经由各种长度的间隔子臂偶联至抗体上以降低可能的位阻。标记蛋白的各种方法是本领域内已知的，可以使用它们进行本发明。
一般来讲，标记依据检测它们的测定分为多种类型：a)同位素标记，它可以是放射性同位素或重同位素；b)磁性标记(例如磁性粒子)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶；碱性磷酸酶)；e)生物素化基团；和f)被二级报道物所识别的预先确定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些实施方式中，标记基团经由各种长度的间隔子臂偶联至抗体上以降低可能的位阻。标记蛋白的各种方法是本领域内已知的，可以使用它们进行本发明。
具体的标记包括光学染料，包括但不限于：生色团、磷光体和荧光团，其中后一种具体用于许多情况中。荧光团可以为“小分子”荧光或蛋白性荧光。
所谓“荧光标记”意指可以经由其固有的荧光特性检测的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于：荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、藻红、香豆素、甲基-香豆素、芘、孔雀石绿(Malacite green)、均二苯乙烯、荧光黄、Cascade BlueJ、德克萨斯红、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL、LC红640、Cy 5、Cy 5.5、LC红705、俄勒冈绿(Oregon Green)、Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor680)、Cascade Blue、Cascade Yellow和R-藻红蛋白(PE)(Molecular Probes,Eugene,OR)、FITC、罗丹明、和德克萨斯红(Pierce,Rockford,IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham LifeScience,Pittsburgh,PA)。包括荧光团的合适的光学染料描述在Richard P.Haugland的Melecular Probes Handbook(分子探针手册)中，该手册通过引用整体并入。
合适的蛋白性荧光标记还包括但不限于：绿色荧光蛋白，包括Renilla、Ptilosarcus、或Aequorea种类的GFP(Chalfie等人,1994,Science263:802-805)；EGFP(Clontech Laboratories,Inc.,Genbank登录号U55762)；蓝色荧光蛋白(BFP,QuantumBiotechnologies,Inc.1801de Maisonneuve Blvd.West,8th Floor,Montreal,Quebec,Canada H3H 1J9；Stauber,1998,Biotechniques 24:462-471；Heim等人,1996,Curr.Biol.6:178-182)；加强型黄色荧光蛋白(EYFP,Clontech Laboratories,Inc.)；荧光素酶(Ichiki等人,1993,J.Immunol.150:5408-5417)；β半乳糖苷酶(Nolan等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2603-2607)和Renilla(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美国专利第5292658、5418155、5683888、5741668、5777079、5804387、5874304、5876995、5925558号)。本段中上面所引用的所有参考文献特意通过引用并入本文。
IgG变体
在一个实施方式中，本发明提供变体IgG蛋白。最低限度下，IgG变体包含含有重链CH2-CH3区的抗体片段。此外，合适的IgG变体包含Fc结构域(例如，包括较低的铰链区)，而且包含重链恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)的IgG变体也可用于本发明，它们都可以与融合配偶体融合。
IgG变体包括相对于亲本IgG多肽的一种或多种氨基酸修饰，在一些情况下为相对于野生型IgG的一种或多种氨基酸修饰。IgG变体可以具有一种或多种优化的性质。IgG变体由于至少一个氨基酸修饰而与其亲本IgG的氨基酸序列不同。因此，IgG变体与其亲本相比具有至少一个氨基酸修饰。可选择地，IgG变体与亲本相比可以具有多于一个氨基酸修饰，例如与亲本相比具有约1至50个氨基酸修饰，优选约1至10个氨基酸修饰，最优选约1至约5个氨基酸修饰。
因此，IgG变体的序列和亲本Fc多肽的序列是基本上同源的。例如，本文中的变体IgG变体序列具有与亲本IgG变体序列约80％的同源性，优选至少约90％的同源性，并且最优选至少约95％的同源性。修饰可以使用分子生物学以遗传方法进行，或者可以酶促或化学方法进行。
抗体的靶抗原
事实上，任何抗原都可以被IgG变体靶向，包括但不限于属于下列靶抗原中的蛋白、亚基、结构域、基序、和/或表位，所述靶抗原包括可溶性因子如细胞因子和膜结合因子，所述膜结合因子包括跨膜受体：17-IA、4-1BB、4Dc、6-酮-PGF1a、8-异-PGF2a、8-氧-dG、A1腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活蛋白、激活蛋白A、激活蛋白AB、激活蛋白B、激活蛋白C、激活蛋白RIA、激活蛋白RIA ALK-2、激活蛋白RIB ALK-4、激活蛋白RIIA、激活蛋白RIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α-1-抗胰蛋白酶、α-V/β-1拮抗物、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗Id、ASPARTIC、心房利钠因子、av/b3整联蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2BMP-2a、BMP-3成骨蛋白、BMP-4BMP-2b、BMP-5、BMP-6Vgr-1、BMP-7(OP-1)、BMP-8(BMP-8a、OP-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、BRK-2、RPK-1、BMPR-II(BRK-3)、BMPs、b-NGF、BOK、铃蟾肽、骨源性神经营养因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、补体因子3(C3)、C3a、C4、C5、C5a、C10、CA125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPPI、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33(p67蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80(B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)毒素、产气荚膜芽孢杆菌(Clostridium perfringen)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰变加速因子、des(1-3)-IGF-I(脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-1、DNA酶、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR(ErbB-1)、EMA、EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸细胞活化趋化因子1、EpCAM、EphrinB2/EphB4、EPO、ERCC、内皮细胞选凝素、ET-1、因子IIa、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcR1、FEN-1、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、促卵泡激素、分形素(Fractalkine)、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3(Vgr-2)、GDF-5(BMP-14、CDMP-1)、GDF-6(BMP-13、CDMP-2)、GDF-7(BMP-12、CDMP-3)、GDF-8(肌肉生长抑制素(Myostatin))、GDF-9、GDF-15(MIC-1)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-α1、GFR-α2、GFR-α3、GITR、胰高血糖素、Glut 4、糖蛋白IIb/IIIa(GP IIb/IIIa)、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap or NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB包膜糖蛋白、HCMV)gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF)、Hep Bgp120、类肝素酶、Her2、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)、单纯孢疹病毒(HSV)gB糖蛋白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)、HIV gp120、HIVIIIB gp 120V3loop、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受体、IgE、IGF、IGF结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF)-α、INF-β、INF-γ、抑制素、iNOS、胰岛素A-链、胰岛素B-链、胰岛素样生长因子1、整联蛋白α2、整联蛋白α3、整联蛋白α4、整联蛋白α4/β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白α5(αV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白α5/β3、整联蛋白α6、整联蛋白β1、整联蛋白β2、干扰素γ、IP-10、I-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层粘连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏性TGF-1、潜伏性TGF-1bp1、LBP、LDGF、LECT2、Lefty、路易斯(Lewis)-Y抗原、路易斯-Y相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn、L-选择蛋白、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面活性物质、黄体生成素、淋巴毒素β受体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、METALLOPROTEASES、MGDF受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1-α、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Muc1)、MUC18、苗勒(Mullerian)抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-钙粘蛋白、NCA90、NCAM、NCAM、中性溶酶、神经营养蛋白-3、-4或-6、Neurturin、神经元生长因子(NGF)、NGFR、NGF-β、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、甲状旁腺激素、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-钙粘蛋白、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、PlGF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、松弛素A-链、松弛素B-链、肾素、呼吸道合胞病毒(RSV)F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72(肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T-细胞受体(例如，T-细胞受体α/β)、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP-样碱性磷酸酶、TfR、TGF、TGF-α、TGF-β、TGF-β泛特异性(Pan Specific)、TGF-βRI(ALK-5)、TGF-βRII、TGF-βRIIb、TGF-βRIII、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、凝血酶、胸腺Ck-1、促甲状腺激素、Tie、TIMP、TIQ、组织因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-αβ、TNF-β2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A(TRAIL R1Apo-2、DR4)、TNFRSF10B(TRAIL R2DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C(TRAIL R3DcR1、LIT、TRID)、TNFRSF10D(TRAIL R4DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF11B(OPG OCIF、TR1)、TNFRSF12(TWEAK RFN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16(NGFR p75NTR)、TNFRSF17(BCMA)、TNFRSF18(GITR AITR)、TNFRSF19(TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L(RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55-60)、TNFRSF1B(TNF RIICD120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNF RIII、TNFC R)、TNFRSF4(OX40ACT35、TXGP1R)、TNFRSF5(CD40p50)、TNFRSF6(Fas Apo-1、APT1、CD95)、TNFRSF6B(DcR3M68、TR6)、TNFRSF7(CD27)、TNFRSF8(CD30)、TNFRSF9(4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1)、TNFRSF25(DR3Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10(TRAIL Apo-2配体、TL2)、TNFSF11(TRANCE/RANK配体ODF、OPG配体)、TNFSF12(TWEAK Apo-3配体、DR3配体)、TNFSF13(APRIL TALL2)、TNFSF13B(BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20)、TNFSF14(LIGHT HVEM配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18(GITR配体AITR配体、TL6)、TNFSF1A(TNF-a连接素(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSF1B(TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3(LTb TNFC、p33)、TNFSF4(OX40配体gp34、TXGP1)、TNFSF5(CD40配体CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP)、TNFSF6(Fas配体Apo-1配体、APT1配体)、TNFSF7(CD27配体CD70)、TNFSF8(CD30配体CD153)、TNFSF9(4-1BB配体CD137配体)、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、转移受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原CA 125、表达路易斯Y相关碳水化合物的肿瘤相关抗原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-钙粘蛋白、VE-钙粘蛋白-2、VEFGR-1(flt-1)、VEGF、VEGFR、VEGFR-3(flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德(von Willebrand)因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、以及激素和生长因子的受体。
本领域内的技术人员应了解上述所列的靶不只是指具体的蛋白和生物分子，而是指生物化学通路或包含它们的通路。例如，提到CTLA-4作为靶抗原意指构成T细胞共刺激通路的配体和受体也是靶，所述配体和受体包括CTLA-4、B7-1、B7-2、CD28、以及任何其他未发现的配体或受体。因此，如本文所用的靶不仅是指具体的生物分子，而是指与所述靶相互作用的一组蛋白和所述靶所属于的生物化学通路的成员。本领域的技术人员还应了解上述靶抗原、结合它们的配体或受体、或它们的相应生物化学通路的其他成员中的任何一种可以可操作地连接至本发明的Fc变体以产生Fc融合体。因此，例如，靶向EGFR的Fc融合体可以通过将Fc变体可操作地连接至EGF、TGF-b、或发现的或未发现的结合EGFR的任何其他配体来构建。因此，本发明的Fc变体可以可操作地连接至EGFR以产生结合EGF、TGF-b、或发现的或未发现的结合EGFR的任何其他配体的Fc融合体。因此，事实上，任何多肽，无论是配体、受体还是一些其他的蛋白或蛋白结构域，包括但不限于上述靶和构成它们的相应生物化学通路的蛋白，都可以可操作地连接至本发明的Fc变体以得到Fc融合体。
合适抗原的选择取决于所需的应用。对于抗癌治疗，期望具有表达限制在癌细胞内的靶。已证明特别适于抗体治疗的一些靶是具有信号传导功能的那些。其他治疗抗体通过抑制受体与其轭合配体之间的结合阻断受体的信号传导来发挥其作用。治疗抗体的另一个作用机制是引起受体下调。其他抗体不通过它们的靶抗原的信号传导起作用。在一些情况下，使用针对传染病的抗体。
在一个实施方式中，将本发明的Fc变体整合到抗细胞因子的抗体中。可选择地，将Fc变体与细胞因子融合或轭合。如本文所用的“细胞因子”意指用于由一个细胞群释放的作为细胞间调节物作用于另一细胞的蛋白的通用术语。例如，Penichet等人,2001,J ImmunolMethods 248:91-101中所述，其特意通过引用并入，细胞因子可以与抗体融合以提供许多期望的特性。这些细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子、和传统的多肽激素。细胞因子中包括：生长激素，如人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、和黄体生成素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β；苗勒抑制物质；小鼠促性腺素相关肽；抑制素；激活蛋白；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSFs)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)、和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15，一种如TNFα或TGF-β的肿瘤坏死因子；C5a；以及其他多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用的术语细胞因子包括来自天然来源或重组细胞培养物的蛋白和天然序列细胞因子的生物活性等同物。
细胞因子和可溶性靶如TNF超家族成员是用于本发明变体的优选靶。例如，抗VEGF、抗CTLA-4、和抗TNF抗体或它们的片段是用于增加FcRn结合的Fc变体的特别好的抗体。针对这些靶的治疗剂常涉及到自身免疫性疾病的治疗，并且需要在长的时间期间内进行多次注射。因此，由本发明的变体所实现的较长的血清半衰期和较低频率的治疗是特别优选的。
已经被批准用于临床试验或正在开发的许多抗体和Fc融合体可获益于本发明的Fc变体。这些抗体和Fc融合体在本文中称为“临床产品和候选物”。因此，在优选的实施方式中，本发明的Fc多肽可用于一系列的临床产品和候选物中。例如，靶向CD20的许多抗体可受益于本发明的Fc多肽。例如，本发明的Fc多肽可用于基本上与下列物质类似的抗体：利妥昔单抗(IDEC/Genentech/Roche)(参见，例如，US 5,736,137)，它是经批准用于治疗非霍奇金(Non-Hodgkin)淋巴瘤的抗CD20嵌合抗体；HuMax-CD20，它是目前由Genmab开发的抗CD20，是US 5,500,362中描述的抗CD20抗体，AME-133(Applied MolecularEvolution)，hA20(Immunomedics,Inc.)，HumaLYM(Intracel)和PRO70769(PCT/US2003/040426，标题为“Immunoglobulin Variants and Uses Thereof(免疫球蛋白变体及其用途)”)。靶向许多表皮生长因子受体家族成员包括EGFR(ErbB-1)、Her2/neu(ErbB-2)、Her3(ErbB-3)、Her4(ErbB-4)的许多抗体可以受益于本发明的Fc多肽。例如，本发明的Fc多肽可用于基本上与下列物质类似的抗体：曲妥单抗(Genentech)(参见，例如US 5,677,171)，被批准用于治疗乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗体；目前由Genentech公司开发的培妥珠单抗(rhuMab-2C4,OmnitargTM)；US 4,753,894中描述的抗Her2抗体；西妥昔单抗(Imclone)(US 4,943,533；PCT WO 96/40210)，一种在临床试验中用于多种癌症的抗EGFR嵌合抗体；目前由Abgenix-Immunex-Amgen开发的ABX-EGF(US 6,235,883)；目前由Genmab开发的HuMax-EGFr(USSN 10/172,317)；425、EMD55900、EMD62000、和EMD72000(Merck KGaA)(US 5,558,864；Murthy等人1987,Arch Biochem Biophys.252(2):549-60；Rodeck等人,1987,J Cell Biochem.35(4):315-20；Kettleborough等人,1991,ProteinEng.4(7):773-83)；ICR62(Institute of Cancer Research(美国癌症研究所))(PCT WO95/20045；Modjtahedi等人,1993,J.Cell Biophys.1993,22(1-3):129-46；Modjtahedi等人,1993,Br J Cancer.1993,67(2):247-53；Modjtahedi等人,1996,Br J Cancer,73(2):228-35；Modjtahedi等人,2003,Int J Cancer,105(2):273-80)；TheraCIM hR3(YMBiosciences,Canada and Centro de Immunologia Molecular,古巴(US 5,891,996；US6,506,883；Mateo等人,1997,Immunotechnology,3(1):71-81)；mAb-806(Ludwig Instituefor Cancer Research,Memorial Sloan-Kettering(Ludwig癌症研究所，纪念斯隆－凯特琳癌症中心))(Jungbluth等人2003,Proc Natl Acad Sci U S A.100(2):639-44)；KSB-102(KS Biomedix)；MR1-1(IVAX,National Cancer Institute(美国国家癌症研究所))(PCT WO 0162931A2)；和SC100(Scancell)(PCT WO 01/88138)。在另一优选实施方式中，本发明的Fc多肽可用于阿仑珠单抗(Millenium)，目前被批准用于治疗B细胞慢性淋巴细胞性白血病的人源化单克隆抗体。本发明的Fc多肽可用于基本上与其他临床产品和候选物类似的多种抗体或Fc融合体中，这些其他临床产品和候选物包括但不限于：莫罗单抗CD3(Orthoclone)，Ortho Biotech/Johnson&Johnson开发的抗CD3抗体；替伊莫单抗IDEC/Schering AG所开发的抗CD20抗体；吉妥珠单抗奥唑米星(gemtuzumab ozogamicin)Celltech/Wyeth所开发的抗CD33(p67蛋白)抗体；阿法赛特(alefacept)Biogen所开发的抗LFA-3Fc融合体)；阿昔单抗由Centocor/Lilly开发；巴利昔单抗由Novartis开发；帕利珠单抗由MedImmune开发；英夫利昔单抗由Centocor所开发的抗TNFα抗体；阿达木单抗由Abbott所开发的抗TNFα抗体；HumicadeTM，由Celltech所开发的抗TNFα抗体；依那西普由Immunex/Amgen所开发的抗TNFαFc融合体；ABX-CBL，由Abgenix所开发的抗CD147抗体；ABX-IL8，由Abgenix所开发的抗IL8抗体；ABX-MA1，由Abgenix所开发的抗MUC18抗体；Pemtumomab(R1549,90Y-muHMFG1)，由Antisoma所开发的抗MUC1；Therex(R1550)，由Antisoma所开发的抗MUC1抗体；AngioMab(AS1405)，由Antisoma开发；HuBC-1，由Antisoma开发；Thioplatin(AS1407)，由Antisoma开发；(那他珠单抗)，由Biogen所开发的抗α-4-β-1(VLA-4)和α-4-β-7抗体；VLA-1单克隆抗体(mAb)，由Biogen所开发的抗VLA-1整联蛋白抗体；LTBR mAb，由Biogen所开发的抗淋巴毒素β受体(LTBR)抗体；CAT-152，由剑桥抗体技术公司(Cambridge AntibodyTechnology)所开发的抗TGF-β2抗体；J695，由剑桥抗体技术公司和Abbott所开发的抗IL-12抗体；CAT-192，由剑桥抗体技术公司和Genzyme所开发的抗TGFβ1抗体；CAT-213，由剑桥抗体技术公司所开发的抗嗜酸细胞活化趋化因子1抗体；LymphoStat-BTM，由剑桥抗体技术公司和Human Genome Sciences Inc.所开发的抗Blys抗体；TRAIL-R1mAb，由剑桥抗体技术公司和Human Genome Sciences,Inc.开发的抗TRAIL-R1抗体；AvastinTM(贝伐珠单抗，rhuMAb-VEGF)，由Genentech所开发的抗VEGF抗体；由Genentech所开发的抗HER受体家族抗体；抗组织因子(ATF)，由Genentech所开发的抗组织因子抗体；XolairTM(奥马珠单抗)，由Genentech所开发的抗IgE抗体；RaptivaTM(依法珠单抗)，由Genentech和Xoma所开发的抗CD11a抗体；MLN-02抗体(原LDP-02)，由Genentech和Millenium Pharmaceuticals开发；HuMax CD4，由Genmab所开发的抗CD4抗体；HuMax-IL15，由Genmab和Amgen开发的抗IL15抗体；HuMax-Inflam，由Genmab和Medarex开发；HuMax-癌症，由Genmab和Medarex和OxfordGcoSciences开发的抗类肝素酶I抗体；HuMax-淋巴瘤，由Genmab和Amgen开发；HuMax-TAC，由Genmab开发；IDEC-131，由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD40L抗体；IDEC-151(克立昔单抗)，由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD4抗体；IDEC-114，由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD80抗体；IDEC-152，由IDEC Pharmaceuticals开发的抗CD23；由IDECPharmaceuticals开发的抗巨噬细胞迁移因子(MIF)抗体；BEC2，由Imclone所开发的抗独特型抗体；IMC-1C11，由Imclone所开发的抗KDR抗体；DC101，由Imclone所开发的抗flk-1抗体；由Imclone所开发的抗VE钙粘蛋白抗体；CEA-CideTM(拉贝珠单抗)，由Immunomedics所开发的抗癌胚抗原(CEA)抗体；LymphoCideTM(依帕珠单抗)，由Immunomedics所开发的抗CD22抗体；AFP-Cide，由Immunomedics开发；MyelomaCide，由Immunomedics开发；LkoCide，由Immunomedics开发；ProstaCide，由Immunomedics开发；MDX-010，由Medarex所开发的抗CTLA4抗体；MDX-060，由Medarex所开发的抗CD30抗体；由Medarex所开发的MDX-070；由Medarex所开发的MDX-018；OsidemTM(IDM-1)，由Medarex和Immuno-Designed Molecules所开发的抗Her2抗体；HuMaxTM-CD4，由Medarex和Genmab所开发的抗CD4抗体；HuMax-IL15，由Medarex和Genmab所开发的抗IL15抗体；CNTO 148，由Medarex和Centocor/J&J所开发的抗TNFα抗体；CNTO 1275，由Centocor/J&J所开发的抗细胞因子抗体；MOR101和MOR102，由MorphoSys所开发的抗细胞间粘附分子-1(ICAM-1)(CD54)抗体；MOR201，由MorphoSys所开发的抗成纤维细胞生长因子受体3(FGFR-3)抗体；(维西珠单抗)，由ProteinDesign Labs所开发的抗CD3抗体；HuZAFTM，由Protein Design Labs所开发的抗γ干扰素抗体；由Protein Design Labs所开发的抗α5β1整联蛋白；由Protein Design Labs所开发的抗IL-12；ING-1，由Xoma所开发的抗Ep-CAM抗体；和MLN01，由Xoma所开发的抗β2整联蛋白抗体，本段中上文所引用的所有参考文献都特意通过引用并入。
可以将本发明的Fc多肽整合到上述临床候选物和产品中，或者整合到基本上与它们类似的抗体和Fc融合体中。可以将本发明的Fc多肽整合到人源化、亲和力成熟、工程化、或以一些其他方式修饰的形式中的上述临床候选物和产品中。
在一个实施方式中，本发明的Fc多肽用于治疗自身免疫适应症、炎性适应症、或移植适应症。与这些疾病相关的靶抗原和临床产品和候选物包括但不限于：抗α4β7整联蛋白抗体，如LDP-02；抗β2整联蛋白抗体，如LDP-01；抗补体(C5)抗体，如5G1.1；抗CD2抗体，如BTI-322、MEDI-507；抗CD3抗体，如OKT3；SMART抗CD3、抗CD4抗体，如IDEC-151、MDX-CD4、OKT4A；抗CD11a抗体；抗CD14抗体，如IC14；抗CD18抗体；抗CD23抗体，如IDEC 152；抗CD25抗体，如赛尼哌；抗CD40L抗体，如5c8、Antova、IDEC-131；抗CD64抗体，如MDX-33；抗CD80抗体，如IDEC-114；抗CD147抗体，如ABX-CBL；抗内皮细胞选凝素抗体，如CDP850；抗gpIIb/IIIa抗体，如ReoPro/阿昔单抗；抗ICAM-3抗体，如ICM3；抗ICE抗体，如VX-740；抗FcR1抗体，如MDX-33；抗IgE抗体，如rhuMab-E25；抗IL-4抗体，如SB-240683；抗IL-5抗体，如SB-240563、SCH55700；抗IL-8抗体，如ABX-IL8；抗干扰素γ抗体；抗TNF(TNF、TNFa、TNFa、TNF-α)抗体，如CDP571、CDP870、D2E7、英夫利昔单抗、MAK-195F；和抗VLA-4抗体，如Antegren。
本发明的Fc变体，如与FcRn的结合增加的那些，可用于TNF抑制剂分子中以提供增强的特性。可用的TNF抑制剂分子包括抑制哺乳动物中TNF-α作用的任何分子。合适的实例包括Fc融合体(依那西普)和抗体(阿达木单抗)和(英夫利昔单抗)。使用本发明的Fc变体工程化以增加FcFn结合的单克隆抗体(如Remicade和Humira)可以通过增加的半衰期变得更有效力。
在一些实施方式中，使用抗传染病的抗体。抗真核细胞的抗体包括靶向酵母细胞的抗体，所述酵母细胞包括但不限于：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)和巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、恶性疟原虫(plasmodiumfalciparum)、和耶罗威亚解脂酵母(Yarrowia lipolytica)。
也可以使用抗其他真菌细胞的抗体，包括与下列菌株相关的靶抗原：念珠菌属菌株，包括光滑念珠菌(Candida glabrata)、白色念珠菌(Candida albicans)、克鲁斯念珠菌(C.krusei)、葡萄牙念珠菌(C.lusitaniae)和麦芽糖念珠菌(C.maltosa)；以及曲霉属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、球孢子菌属(Coccidioides)、芽生菌属(Blastomyces)、和青霉菌属(Penicillium)等。
直接针对与原生动物相关的靶抗原的抗体包括但不限于与下列原生动物有关的抗体：锥虫属(Trypanosoma)；利什曼原虫属(Leishmania)，包括杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)；疟原虫属(Plasmodium spp.)；卡氏肺囊虫(Pneumocystiscarinii)、小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、兰伯贾第虫(Giardia lamblia)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、和卡耶塔环孢子虫(Cyclosporacayetanensis)。
也可使用抗原核抗原的抗体，包括抗合适的细菌的抗体，合适的细菌如致病的和不致病的原核生物，包括但不限于：芽孢杆菌属(Bacillus)，包括炭疽杆菌(Bacillusanthracis)；弧菌属(Vibrio)，例如霍乱弧菌(V.cholerae)；埃希氏菌属(Escherichia)，例如肠毒性的大肠杆菌(E.coli)；志贺氏菌属(Shigella)，例如，痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如，伤寒沙门氏菌(S.typhi)；分支杆菌属(Mycobacterium)，例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分支杆菌(M.leprae)；梭状芽孢杆菌属(Clostridium)，例如肉毒杆菌(C.botulinum)、破伤风杆菌(C.tetani)、艰难梭菌(C.difficile)、产气荚膜杆菌(C.perfringens)；棒杆菌属(Cornyebacterium)，例如白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)；链球菌属(Streptococcus)，酿脓链球菌(S.pyogenes)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)；葡萄球菌属(Staphylococcus)，例如金黄色葡萄球菌(S.aureus)；嗜血杆菌属(Haemophilus)，例如，流感嗜血杆菌(H.influenzae)；奈瑟氏菌属(Neisseria)，例如，脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(N.gonorrhoeae)；耶尔森氏菌属(Yersinia)，例如，Y.lamblia、鼠疫耶尔森氏菌(Y.pestis)；假单胞菌属(Pseudomonas)，例如绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)、恶臭假单胞菌(P.putida)；衣原体属(Chlamydia)，例如，沙眼衣原体(C.trachomatis)；博德特氏菌属(Bordetella)，例如百日咳博德特氏菌(B.pertussis)；密螺旋体属(Treponema)，例如，梅毒密螺旋体(T.palladium)；炭疽芽孢杆菌(B.anthracis)、鼠疫耶尔森氏菌、布鲁氏菌属(Brucella spp.)、土拉热弗朗西丝氏菌(F.tularensis)、鼻疽假单胞菌(B.mallei)、类鼻疽假单胞菌(B.pseudomallei)、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、肉毒杆菌、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、SEB V.霍乱毒素B、大肠杆菌O157:H7、李斯特菌属(Listeria spp.)、白色毛孢子菌(Trichosporon beigelii),红酵母属(Rhodotorula species)、异常汉森酵母(Hansenula anomala)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiellasp.)、李斯特菌属(Listeria sp.)、支原菌属(Mycoplasma sp.)等。
在一些方面，抗体是针对病毒感染的，这些病毒包括但不限于：包括正粘液病毒(例如，流感病毒)、副粘液病毒(例如，呼吸道合胞体病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒)、腺病毒、鼻病毒、冠状病毒、呼肠孤病毒、披膜病毒(例如，风疹病毒)、细小病毒、痘病毒(例如，类天花病毒、痘苗病毒)、肠道病毒(例如，脊髓灰质炎病毒、柯萨奇肠道病毒)、肝炎病毒(包括甲型、乙型和丙型)、疱疹病毒(例如，单纯孢疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒)、轮状病毒、诺瓦克(Norwalk)病毒、汉坦病毒、沙粒病毒、杆状病毒(例如，狂犬病毒)、逆转录病毒(包括HIV、HTLV-I和HTLV-II)、乳多泡病毒(例如，乳头瘤病毒)、多瘤病毒、和细小核糖核酸病毒等。
优化的IgG变体特性
本申请还提供经过优化而具有多种治疗相关特性的IgG变体。被工程化或预测显示一种或多种优化的特性的IgG变体在本文中称为“优化的IgG变体”。可以被优化的最优选特性包括但不限于增强或降低FcRn亲和力并增加或降低体内半衰期。合适的实施方式包括显出如下特性的抗体：在较低的pH下，如在与内体相关的pH如pH 6.0下与FcRn结合亲和力增加，而在较高的pH如7.4下保持较低的亲和力，从而容许进入内体的摄取增加，但释放速率则正常。类似地，这些具有被调控的FcRn结合的抗体可以任选地具有其他期望的特性，例如，被调控的FcγR结合，如在U.S.S.N.11/174,287、11/124,640、10/822,231、10/672,280、10/379,392、和2005年10月21日提交的申请号为11/256,060且题目为“具有优化的效应子功能的IgG免疫球蛋白变体”的专利申请中所述的。也就是说，优化的特性还包括但不限于对FcγR的亲和力增强或减弱。在一任选的实施方式中，IgG变体被优化为具有除了FcRn结合特性之外，还具有增强的对人活化FcγR，优选FcγRIIIa的亲和力。在又一任选的替代性实施方式中，IgG变体被优化为具有降低的对人抑制性受体FcγRIIb的亲和力。也就是说，具体的实施方式涵盖了显示增加的与FcRn的结合和增加的与FcγRIIIa的结合的抗体的用途。其他实施方式利用了显示增加的与FcRn的结合和增加的与FcγRIIIa的结合的抗体的用途。预计这些实施方式在人中提供具有增强的治疗特性例如增强的效应子功能和较高的抗癌效力的IgG多肽。在替代性实施方式中，IgG变体被优化为具有增加的或降低的对FcRn的亲和力和增加的或降低的对人FcγR的亲和力，人FcγR包括但不限于FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、和FcγRIIIb，包括它们的等位基因变异。预计这些实施方式在人中提供具有增强的治疗特性例如增强的血清半衰期和降低的效应子功能的IgG多肽。在其他实施方式中，IgG变体提供增强的对FcRn的亲和力和增强的对一种或多种FcγR的亲和力，而降低的对一种或多种其他FcγR的亲和力。例如，IgG变体可以具有增强的与FcRn和FcγRIIIa的结合，而降低的与FcγRIIIb的结合。可选择地，IgG变体可以具有降低的与FcRn和与FcγR结合。在另一实施方式中，IgG变体可以具有降低的对FcRn的亲和力和增强的对FcγRIIb的亲和力，而降低的对与一种或多种活化FcγR的亲和力。在另一实施方式中，IgG变体可以具有增加的血清半衰期和降低的效应子功能。
优选的实施方式包括与人FcRn和FcγR结合的优化，然而，在替代性实施方式中，IgG变体具有增强的或降低的对来自非人生物体的FcRn和FcγR的亲和力，非人生物体包括但不限于啮齿动物和非人的灵长类。被优化用于结合非人FcRn的IgG变体可用于实验中。例如，可以使用用于多种疾病的小鼠模型，该小鼠模型能够测试给定药物候选物的特性，如效力、毒性和药代动力学特性。如本领域中所已知的，可以将癌细胞移植或注入小鼠以模拟人的癌症，此过程称为异种移植。包括被优化用于FcRn的IgG变体的IgG变体的测试可以提供关于蛋白的清除特征、其清除机制等的有价值信息。还可以优化IgG变体以具有增强糖基化形式的官能度和/或溶解特性。Fc配体包括但不限于：FcRn、FcγR、C1q、和蛋白A和G，它可以来自任何来源，包括但不限于：人、小鼠、大鼠、兔、或猴，优选为人。在替代性优选实施方式中，将IgG变体优化为比亲本IgG变体的糖基化形式更稳定和/或更可溶。
IgG变体可以包括调控与非FcRn和FcγR的Fc配体之间的相互作用的修饰，所述非FcRn和FcγR的Fc配体包括但不限于补体蛋白和Fc受体同源物(FcRH)。FcRH包括但不限于FcRH1、FcRH2、FcRH3、FcRH4、FcRH5、和FcRH6(Davis等人,2002,Immunol.Reviews 190:123-136，其通过引用整体并入)。
优选地，IgG变体的Fc配体特异性将决定它的治疗效用。用于治疗目的的给定IgG变体的效用取决于靶抗原的表位或形式以及所治疗的疾病或适应症。对于大多数的靶和适应症，增强的FcRn结合可能是优选的，因为增强的FcRn结合可以导致血清半衰期的增加。较长的血清半衰期容许治疗剂较低频率的给药或较少给药。这在治疗剂是为了响应需要重复施用的适应症而提供时是尤其优选的。对于某些靶和适应症，降低的FcRn亲和力可能是优选的。这在期望变体Fc具有增强的清除率或降低的血清半衰期时，例如在用作成像剂或辐射治疗剂的Fc多肽中时是尤其优选的。
可以使用包括这样的IgG变体的IgG变体：提供增强的对FcRn的亲和力和增强的对活化FcγR的亲和力和/或降低的对抑制性FcγR的亲和力。对于某些靶和适应症，还有利的是使用对不同的活化FcγR提供不同的选择性的IgG变体，例如，在一些情况下可能期望增强与FcγRIIa和FcγRIIIa而非FcγRI的结合，而在其他情况下，仅增强与FcγRIIa的结合可能是优选的。对于某些靶和适应症，可能优选的是利用改变FcRn结合并增强FcγR介导的效应子功能和补体介导的效应子功能二者的IgG变体，而对于其他情况下，可能有利的是利用增强FcRn结合或血清半衰期以及FcγR介导的或补体介导的效应子功能的IgG变体。对于某些靶或癌症适应症，可能有利的是降低或消除一个或多个效应子功能，例如通过敲除与C1q、一种或多种FcγR、FcRn、或一种或多种其他Fc配体的结合进行。对于其他靶和适应症，可能优选的是利用提供与抑制性FcγRIIb结合增强，而与活化FcγR结合为野生型水平、被降低或消除的IgG变体。这在例如当IgG变体的目标是抑制炎性或自身免疫性疾病或以某种方式调控免疫系统的时候是特别可用的。由于自身免疫性疾病通常持续很久并且治疗要重复给药，用具有增加的半衰期而不是增加的FcRn的Fc变体进行它们的治疗是尤其优选的。
可以进行修饰来改善IgG稳定性、溶解性、功能、或临床用途。在优选的实施方式中，IgG变体可以包括在人中降低的免疫原性的修饰。在最优选的实施方式中，使用USSN11/004,590中所述的方法降低IgG变体的免疫原性，USSN 11/004,590通过引用整体并入。在替代性实施方式中，IgG变体是人源化的(Clark,2000,Immunol Today 21:397-402，通过引用整体并入)。
IgG变体可以包括降低免疫原性的修饰。降低免疫原性的修饰可以包括降低源自亲本序列的加工肽与MHC蛋白的结合的修饰。例如，可以工程化氨基酸修饰以便没有或有最少数目的免疫表位预计与任何主要MHC等位基因高亲和力结合。本领域内已知在蛋白序列中鉴定MHC结合表位的若干方法，它们可以用于对在IgG变体中的表位评分。参见，例如WO98/52976；WO 02/079232；WO 00/3317；USSN 09/903,378；USSN 10/039,170；USSN 60/222,697；USSN 10/754,296；PCT WO 01/21823；和PCT WO 02/00165；Mallios,1999,Bioinformatics 15:432-439；Mallios,2001,Bioinformatics 17:942-948；Sturniolo等人,1999,Nature Biotech.17:555-561；WO 98/59244；WO 02/069232；WO 02/77187；Marshall等人,1995,J.Immunol.154:5927-5933；以及Hammer等人,1994,J.Exp.Med.180:2353-2358，它们都通过引用整体并入。可以使用基于序列的信息来确定给定肽-MHC相互作用的结合评分(参见，例如Mallios,1999,Bioinformatics 15:432-439；Mallios,2001,Bioinformatics 17:第942-948页；Sturniolo等人,1999,Nature Biotech.17:555-561，它们都通过引用整体并入)。
工程化IgG变体
本发明的变体可以通过多种方法设计。本文所述的变体可以是插入、缺失、取代、其他修饰、或这些的组合和其他改变。本发明的一个特别新颖的实施方式是改善或降低Fc多肽与Fc配体的结合的插入和缺失的设计。如本文所公开的，可以进行插入或缺失以增加或降低Fc多肽对FcRn的亲和力。可以通过合理的方法或通过包括使用随机组分例如随机或半随机的文库产生或筛选的方法来设计插入和缺失。在替代性实施方式中，公开了增加或降低Fc多肽对FcRn的亲和力的取代。
骨架修饰：插入和缺失
变体Fc多肽可以通过用变体氨基酸取代Fc多肽位置的亲本氨基酸产生。通过将Fc多肽中的一个或多个氨基酸取代为变体氨基酸，改变了那些位置上的侧链。最可用的取代通过改变Fc侧链而更改Fc特性。取代的侧链可以直接或间接与和Fc功能或特性相关的Fc结合配偶体相互作用。该至少一个取代改变了亲本Fc多肽的一个或多个侧链的共价结构。
可选择地，可以产生改变亲本Fc多肽的骨架的共价结构的变体Fc多肽。蛋白中的骨架原子是肽氮、α碳、羰基或肽碳和羰基氧。改变骨架的共价结构提供改变Fc多肽的特性的另外的方法。Fc骨架的共价结构可以通过添加原子到骨架中来改变，例如，通过插入一个或多个氨基酸；或从骨架中减去原子来改变，例如通过缺失一个或多个氨基酸。骨架的共价结构还可以通过将骨架的各原子改变为其他原子来改变(Deechongkit等人,J Am ChemSoc.2004.126(51):16762-71，通过引用整体并入)。如本领域内所已知的和本文所示例的，Fc多肽中氨基酸的插入或缺失可以通过插入或缺失编码Fc多肽的DNA中的相应核苷酸来进行。可选择地，如本领域中所已知，氨基酸的插入或缺失可以在Fc多肽合成期间进行。
改变Fc多肽与一个或多个结合配偶体(例如，FcγR、FcRn、C1q)的相互作用的氨基酸插入或缺失的设计可以通过考虑Fc多肽及其结合配偶体的复合体的结构来进行。在次优选的实施方式中，该设计可以通过考虑Fc多肽的结构和关于参与与结合配偶体的结合的Fc区的信息来进行。这种信息可以通过诱变实验、噬菌体展示实验、同源性比较、计算机建模或其他方法获得。
影响Fc结合相互作用但是不影响Fc多肽的整体结构、稳定性、表达或Fc用途的插入或缺失的氨基酸序列的优选位置为参与Fc/Fc结合配偶体相互作用的环。为了改变FcRn与Fc多肽的结合，位置244-257、279-284、307-317、383-390、和428-435是插入或缺失的优选环位置(根据Kabat等人的EU索引编号，Burmeister等人,1994,Nature,372:379-383；Martin等人,2001,Mol Cell 7:867-877，它们都通过引用整体并入)。为了改变Fcγ受体与Fc多肽的结合，位置229-239、266-273、294-299、和324-331是插入或缺失的优选环位置(根据Kabat等人的EU索引编号，PDB编号1E4K.pdb，Sondermann等人Nature.2000406:267，它们都通过引用整体并入)。环是不参与α螺旋或β片层结构的多肽区域。环位置是不在α螺旋或β片层结构中的位置(van Holde,Johnson和Ho.Principles of Physical Biochemistry(物理生化原理).Prentice Hall,New Jersey 1998，第1章，第2-67页，通过引用整体并入)。环位置是优选的是因为骨架原子与α螺旋和β片层的骨架原子相比通常是更柔韧的并且不太可能参与氢键。因此，由于一个或多个氨基酸的插入或缺失而引起的环的加长或缩短不太可能引起Fc多肽的大的破坏性改变，包括稳定性、表达或其他问题。
可以使用插入和缺失来改变多肽的长度。例如，在环区域，改变环长度会导致环的柔性和构象熵改变。环中的插入通常增加环的构象熵，环的构象熵用Boltzman常数乘以可能的构象数的自然对数来定义(van Holde,Johnson和Ho.Principles of PhysicalBiochemistry(物理生化原理).Prentice Hall,New Jersey 1998,第78页，通过引用整体并入)。通过将至少一个氨基酸插入到多肽中，多肽可用的构象总数增加了。这些额外的构象可能有益于形成有利的Fc/Fc结合配偶体相互作用，因为Fc多肽可以使用额外构象之一来结合Fc结合蛋白。在这种情况下，插入可能导致较强的Fc/Fc结合配偶体相互作用。如果额外的构象没有用于结合界面，则插入可能导致较弱的Fc/Fc结合配偶体相互作用，因为额外的构象会与结合活性构象相竞争。类似地，多肽片段的缺失也可能导致较强或较弱的Fc/Fc结合配偶体相互作用。如果降低可能的骨架构象数的片段的缺失移除了结合活性构象，则该缺失可能导致较弱的Fc/Fc结合配偶体相互作用。如果缺失不移除结合活性构象，则该缺失可能导致较强的Fc/Fc结合配偶体相互作用，因为该缺失可能移除与结合活性构象竞争的构象。
可以使用插入和缺失来改变Fc多肽中氨基酸的位置和取向。因为插入和缺失引起骨架的共价结构改变，它们必然会引起骨架原子的位置改变。图7比较了在三个不同的骨架中标记为L1至L4的相同环片段的骨架位置。参考骨架结构含有4个环片段，而缺失骨架缺乏片段L1，插入片段在片段L1之前即片段L1的N-末端包含额外的片段。插入和缺失会引起插入或缺失位点附近的骨架结构的最大改变。通过缺失环的N-末端附近的片段，例如，片段L1，环缩短了，并且剩余的片段的位置向更接近环N-末端的位置移动。这具有将L2片段向之前的L1片段位置和向环N-末端移动的效果。这种L2片段向L1片段的位置移动可能增强Fc/Fc结合配偶体复合体的结合，并且在当现有信息表明位于L2的一个或多个氨基酸在位于L1时能够促进Fc结合配偶体的相互作用时这是优选的。例如，如果L2含有丙氨酸和酪氨酸，并且之前将两个L1氨基酸取代为丙氨酸和酪氨酸导致Fc变体的结合增加，则L1缺失可能产生对Fc结合配偶体的亲和力增加的Fc变体。
类似地，在环的N末端侧将多肽片段插入Fc多肽中会引起环片段的位置移向环的C-末端侧。在图7中，在片段L1之前即片段L1的N-末端插入一个或多个氨基酸改变了骨架构象，包括使L1片段移至环的C-末端。这种类型的插入在已知位于片段L1的氨基酸位于L2位置时能够促进相互作用的时候是优选的，因为该插入可能导致较强的Fc/Fc结合配偶体相互作用。如果期望较弱的Fc/Fc结合配偶体相互作用，则可以使用插入来将不利的氨基酸移至新的位置。插入的、缺失的和参考片段(图7中的L1至L4)可以是Fc多肽中的一个或多于一个的氨基酸。
可选择地，可以在环的C-末端以类似于环的N-末端的插入或缺失的方式使用插入或缺失。环C-末端的插入可能导致插入的N-末端位置向环N-末端移动。环C-末端的缺失可能导致缺失的N-末端位置向环C-末端移动。在环的N-末端还是C-末端使用插入或缺失的选择基于位于环中的氨基酸、对增加或降低Fc/Fc结合配偶体亲和力的期望、和所需的位置移动。
插入或缺失可用于Fc多肽的任何区域，包括环、α螺旋和β片层区。优选的插入和缺失位置包括环区域，它是非α螺旋或β片层区的那些区域。环是优选的是因为它们一般能比α螺旋或β片层更好地接受骨架中的改变。导致较强的蛋白/蛋白相互作用的插入或缺失的尤其优选的位置在环的N-末端或C-末端边缘。如果环的侧链参与了Fc/Fc结合配偶体相互作用，则在边缘的插入或缺失会导致结合相互作用中强的有害改变的可能性较低。环的正中心的缺失更可能移除Fc/Fc结合配偶体界面的重要残基，环的正中心的插入更可能产生Fc/Fc结合配偶体界面的不利相互作用。缺失或插入的残基数目可以通过所需的骨架改变的大小来决定，其中15个或更少的残基的插入或缺失是优选的，10个或更少的残基的插入或缺失是更优选的，并且5个或更少的残基的插入或缺失是最优选的。
一旦设计出Fc缺失变体的位置和大小，便完全确定了整个多肽序列，可以通过本领域内已知的方法构建多肽。
然而Fc插入变体则具有设计要插入的至少一个氨基酸的序列的额外步骤。包括Ser、Thr、Asn、Gln、Ala、Gly、His的极性残基的插入优选在预期在Fc多肽中暴露的位置。包括Ser、Thr、和Ala的较小氨基酸是尤其优选的，因为小尺寸位阻干扰Fc/Fc结合配偶体相互作用的可能性较小。Ser和Thr还具有与Fc结合配偶体上的原子形成氢键的能力。
插入还具有增加的灵活性，插入的多肽可以设计成有利于与Fc结合配偶体的相互作用，如在需要较强的Fc/Fc结合配偶体结合时所期望的。骨架插入的长度可以通过对具有简单通用的插入序列的变体骨架建模来确定。例如，可以构建不同长度的聚丝氨酸、聚甘氨酸或聚丙氨酸插入，并进行建模。建模可以通过多种方法进行，包括基于包含插入的同源物的已知三维结构的同源物建模，可以通过包括如下的计算机建模进行：MODELLER(M.A.Marti-Renom等人.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.29,291-325,2000)和ROSETTA(Kuhlman等人(2003).Science 302,1364-8)，它们都通过引用整体并入。通常，最初制备多种骨架构象，最终的骨架结构则在确定侧链特征之后确定。侧链可以通过算法设计(US 6,188,965；6,269,312；6,403,312；6,801,861；6,804,611；6,792,356；6,950,754和USSN 09/782,004；09/927,790；10/101,499；10/666,307；10/666311；10/218,102，它们都通过引用整体并入)。
可以进行插入和缺失来以类似于所述用于改变FcRn结合特性的方法的方式改变Fc多肽与FcγR的结合。Fc结构域在图1中所指示的位置结合FcγR。Fc/FcγR复合体的结构包括PDB编号1T89和1IIS(Radaev S等人J.Biol.Chem.第276卷,第16469-16477页，通过引用整体并入)展示了两种结构之间的相互作用残基和环。诸如在US11/124620和US6737056(它们都通过引用整体并入)中所发现的那些诱变结果全都可用于确定适当的骨架定位移动。
可以通过本文所述的方法将插入和缺失设计在Fc多肽之外的任何多肽中。例如，TNF超家族成员APRIL的插入或缺失可以借助于其三维结构(PDB编号1XU1.pdb,Hymowitz,等人(2005)J.Biol.Chem.280:7218，通过引用整体并入)来设计。可以设计插入或缺失来增加APRIL与其受体TACI的结合。优选作为插入或缺失位点的环残基为残基Ser118-Val124、Asp164-Phe167、Pro192-Ala198、Pro221-Lys226。这些环与APRIL/TACI复合体中的TACI相互作用并且介导结合。
整合多肽的变体
IgG变体可以基于人IgG序列，因此人IgG序列用作其他序列与之比较的“基本”序列，其他序列包括但不限于来自其他生物体的序列，如啮齿动物和灵长类序列。IgG变体还可以包含来自其他免疫球蛋白种类的序列，如IgA、IgE、IgD、IgM等。本发明包括：尽管IgG变体是在一个亲本IgG的背景下工程化的，但是可以将变体工程化到或“转移”到另一个第二亲本IgG的背景中。这通过确定第一和第二IgG之间的“等同”或“对应”残基和取代来进行，通常是基于IgG序列之间的序列或结构同源性进行。为了确定同源性，将本文所列的第一IgG的氨基酸序列直接与第二IgG的序列进行比较。使用容许必须的插入和缺失以保持比对(即，避免通过任意缺失和插入消除保守残基)的本领域内已知的一种或多种同源比对程序(例如使用物种之间的保守残基)比对序列后，定义等同于第一IgG变体的一级序列的具体氨基酸的残基。保守残基的比对优选应保留100％的这种残基。然而，大于75％或小至50％的保守残基比对也足以定义等同残基。等同残基还可以通过测定第一和第二IgG的结构同源性来定义，结构同源性在结构已经被确定的IgG的三级结构水平进行。在这种情况下，等同残基被定义为在比对后亲本或前体的具体氨基酸残基的两个或多个主链原子的原子坐标(N上的N，CA上的CA、C上的C和O上的O)在0.13nm之内且优选为0.1nm的残基。在最佳的模型被定向和定位以使蛋白的非氢蛋白原子的原子坐标最大程度的重叠之后，便完成了比对。无论如何确定等同或对应残基，也无论制备IgG的亲本IgG的身份如何，所传达的意思是由此发现的IgG变体可以被工程化到与IgG变体具有明显的序列或结构同源性的任何第二亲本IgG中。因此，例如，如果通过使用上述方法或测定等同残基的其他方法制备了其中亲本抗体为人IgG1的变体抗体，则可以将变体抗体工程化到结合不同抗原的另一IgG1亲本抗体、人IgG2亲本抗体、人IgA亲本抗体、小鼠IgG2a或IgG2b亲本抗体等中。同样，如上文所述，亲本IgG变体背景不会影响IgG变体转移至其他亲本IgG的能力。
提供了工程化、制备、和筛选IgG变体的方法。所述方法不旨在限制于任何具体的应用或操作理论。相反，所提供的方法旨在一般性地示例出可以用实验方法工程化、制备和筛选一种或多种IgG变体以获得具有优化的效应子功能的IgG变体。USSN 10/754,296和USSN 10/672,280中描述了用于设计、制备和测试抗体和蛋白变体的多种方法，USSN 10/754,296和USSN 10/672,280都通过引用整体并入。
可以使用多种蛋白工程化方法来设计具有优化的效应子功能的IgG变体。在一个实施方式中，可以使用基于结构的工程化方法，其中使用可用的结构信息来指导取代、插入或缺失。在优选的实施方式中，可以使用计算筛选方法，其中根据它们在计算机计算中的能量适合性(energetic fitness)来设计取代。参见，例如USSN 10/754,296和USSN 10/672,280、以及本文所引用的参考文献，它们都通过引用整体并入。
可以使用序列比对来指导在指定位置的取代。本领域的技术人员应了解序列信息的使用可以控制可能不利于蛋白结构的取代的引入。序列来源可能广泛地变化，并且包括一个或多个已知的数据库，所述数据库包括但不限于：Kabat数据库(美国西北大学)；Johnson&Wu,2001,Nucleic Acids Res.29:205-206；Johnson&Wu,2000,Nucleic AcidsRes.28:214-218)；IMGT数据库(IMGT,the international ImMunoGeneTics informationLefranc等人,1999,Nucleic Acids Res.27:209-212；Ruiz等人,2000NucleicAcids Res.28:219-221；Lefranc等人,2001,Nucleic Acids Res.29:207-209；Lefranc等人,2003,Nucleic Acids Res.31:307-310)；和VBASE，它们都通过引用整体并入。可以从种系序列或来自包括但不限于哺乳动物的任何生物体的天然存在的抗体序列的序列比对获得、汇编、和/或产生抗体序列信息。本领域的技术人员应了解使用人或基本上是人的序列还可以在施用给人时具有较低免疫原性的优点。更一般性的核酸或蛋白数据库即不是特别针对抗体的其他数据库包括但不限于SwissProt、GenBank Entrez、和EMBL核苷酸序列数据库。比对的序列可以包括VH、VL、CH、和/或CL序列。本领域内已知大量的基于序列的比对程序和方法，并且它们都可以用于进行序列比对。
可选择地，可以使用随机或半随机诱变法在所需位置进行氨基酸修饰。在这些情况下，位置是随机选择的，或者使用简单化的规则进行氨基酸改变。例如，可以将所有残基都突变为丙氨酸，这称为丙氨酸扫描。这类方法可以与采用选择法来筛选较高水平的序列多样性的更复杂的工程化方法结合。如本领域所已知的，多种选择技术可以用于此类方法，包括：例如，展示技术，如噬菌体展示、核糖体展示、细胞表面展示等，如下文所描述的。
制备和筛选IgG变体的方法是本领域内所熟知的。抗体分子生物学、表达、纯化和筛选的一般方法描述于：Antibody Engineering(抗体工程化),Duebel&Kontermann编辑,Springer-Verlag,Heidelberg,2001；和Hayhurst&Georgiou,2001,Curr Opin Chem Biol5:683-689；Maynard&Georgiou,2000,Annu Rev Biomed Eng 2:339-76中。还参见USSN 10/754,296；USSN10/672,280；和USSN 10/822,231；以及11/124,620中所描述的方法，它们都通过引用整体并入。本发明的优选变体包括图8中出现的那些。本发明的替代性优选变体包括图9中出现的那些。本发明的另外的替代性优选变体包括图10中出现的那些。如实施例中所示例的，这些变体显示与Fc受体FcRn的结合增加。
制备IgG变体
IgG变体可以通过本领域内已知的任何方法制备。在一个实施方式中，可以使用IgG变体序列来制备编码成员序列的核酸，如果需要可以然后将该核酸克隆到宿主细胞中，表达并测定。这些实践使用熟知的方法进行，并且可以使用的多种方法描述在：MolecularCloning-A Laboratory Manual(分子克隆-实验室手册),第3版(Maniatis,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York,2001)；和Current Protocols in MolecularBiology(现代分子生物学实验技术)(John Wiley&Sons)中，它们都通过引用整体并入。可以将编码IgG变体的核酸整合到表达载体中以表达蛋白。表达载体通常包括与控制或调节序列、选择标志物、任何融合配偶体和/或另外的元件可操作地连接即置于功能关系的蛋白。可以通过在合适的条件下培养用核酸，优选含有编码IgG变体的核酸的表达载体转化的宿主细胞以诱导或引起蛋白表达来制备IgG变体。可以使用多种合适的宿主细胞，包括但不限于哺乳动物细胞、细菌、昆虫细胞和酵母。例如，可以使用的多种细胞系描述在自美国标准培养物保藏中心(American Type Culture Collection)获得的ATCC细胞系目录中，其通过引用整体并入。将外源核酸引入宿主细胞的方法是本领域内所熟知的，并且可以随所用的宿主细胞而变化。
在优选的实施方式中，在IgG变体表达后，将其纯化或分离。抗体可以用本领域的那些技术人员所已知的多种方法来分离或纯化。标准的纯化方法包括：色谱技术、电泳、免疫、沉淀、透析、过滤、浓缩、和色谱聚焦技术。如本领域内所熟知的，多种天然蛋白结合抗体，例如细菌蛋白A、G和L，并且这些蛋白可用于纯化。通常，能够通过特定融合配偶体来进行纯化。例如，如果使用GST融合体，则可以使用谷胱甘肽树脂来纯化蛋白；如果使用His标签，则使用Ni+2亲和色谱，或如果使用flag标签，则使用固定的抗flag抗体。对于合适的纯化技术的一般指南，参见：Antibody Purification:Principles and Practice(抗体纯化：原理与实践),第3版,Scopes,Springer-Verlag,NY,1994，其通过引用整体并入。
筛选IgG变体
Fc变体可以使用多种方法来筛选，包括但不限于：使用体外测定、体内和基于细胞的测定以及选择技术的那些方法。可以将自动和高通量筛选技术用于筛选方法。筛选可以采用融合配偶体或标记，例如，免疫标记、同位素标记、或小分子标记，如荧光或发色染料。
在优选的实施方式中，在体外测定中筛选Fc变体的功能和/或生物物理特性。在优选的实施方式中，筛选蛋白的官能度，例如其催化反应的能力或其与其靶的结合亲和力。
如本领域中所已知的，筛选方法的亚类为选择文库的有利成员的那些方法。该方法在本文中称为“选择方法”，并且这些方法可用于在本发明中筛选Fc变体。当使用选择方法筛选蛋白文库时，仅繁殖、分离、和/或观察那些有利的文库成员，即符合一些选择标准的成员。可用于本发明中筛选蛋白文库的许多选择方法是本领域内所已知的。可用于本发明中的其他选择方法包括不依赖于展示如体内方法的方法。称为“定向进化”法的一组选择方法是包括在选择期间配对或延伸有利序列，有时会掺入新的突变的那些方法。
在优选的实施方式中，使用一种或多种基于细胞的测定或体内测定来筛选Fc变体。对于这类测定，通常外源地添加纯化的或非纯化的蛋白以便使细胞暴露于属于文库的单个变体或变体库。这些测定通常但不总是基于Fc多肽的功能；即，Fc多肽结合其靶并介导诸如效应子功能、配体/受体结合抑制、凋亡等的一些生物化学事件的能力。这些测定通常包括监控细胞对IgG的反应，例如细胞存活、细胞死亡、细胞形态改变、或转录激活，如天然基因或报道基因的细胞表达。例如，这些测定可以测量Fc变体引起ADCC、ADCP、或CDC的能力。对于一些测定，可能需要添加另外的细胞或组分即除靶细胞之外的细胞或组分，例如血清补充物、或效应子细胞，如外周血单核细胞(PBMC)、NK细胞、巨噬细胞等。这些额外的细胞可以来自任何生物体，优选人、小鼠、大鼠、兔、和猴。抗体可能引起表达靶的某些细胞系凋亡，或它们可能介导被添加到测定中的免疫细胞对靶细胞的攻击。监控细胞死亡或存活率的方法是本领域内已知的，包括染料、免疫化学、细胞化学、和放射性试剂的使用。转录激活还可以作为在基于细胞的测定中测定功能的方法。可选择地，基于细胞的筛选使用被用编码变体的核酸转化或转染的细胞来进行。也就是说，Fc变体不是外源地添加到细胞中的。
IgG变体的生物特性可以在细胞、组织和整个生物体实验中表征。如本领域所已知的，药物通常在动物中测试以测量药物治疗疾病或疾病模型的效力或测量药物的药代动力学、毒性和其他特性，所述动物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪和猴。这些动物可以被称为疾病模型。治疗剂通常在小鼠中测试，所述小鼠包括但不限于裸小鼠、SCID小鼠、异种移植小鼠和转基因小鼠(包括敲入和敲除)。此实验可以提供测定蛋白用作治疗剂的可能的有意义的数据。可以使用任何生物体，优选哺乳动物进行测试。例如，由于猴与人的遗传相似性，它们可能是合适的治疗模型，因此可以用于测试IgG的效力、毒性、药代动力学或其他特性。在人中的测试最终需要被批准作为药物，因此当然包括了这些实验。因此，可以在人中测试IgG以测定它们的治疗效力、毒性、免疫原性、药代动力学、和/或其他临床特性。
使用IgG变体的方法
IgG变体可用于大量产品中。在一个实施方式中，IgG变体为治疗试剂、诊断试剂、或研究试剂，优选为治疗试剂。IgG变体可用于单克隆或多克隆的抗体组合物中。在优选的实施方式中，IgG变体用于杀伤具有靶抗原的靶细胞，例如癌细胞。在替代性实施方式中，IgG变体用于阻断、拮抗或激动靶抗原，例如拮抗细胞因子或细胞因子受体。在替代性的优选实施方式中，IgG变体用于阻断、拮抗或激动靶抗原并杀伤具有靶抗原的靶细胞。
IgG变体可用于多种治疗目的。在优选的实施方式中，将包含IgG变体的抗体施用给患者以治疗抗体相关病症。为了该目的的“患者”包括人和其他动物，优选哺乳动物并且最优选为人。本文所谓的“抗体相关病症”或“抗体反应性病症”或“病况”或“疾病”意指可以通过施用包含IgG变体的药物组合物而改善的病症。抗体相关病症包括但不限于：自身免疫性疾病、免疫疾病、传染病、炎性疾病、神经疾病、以及肿瘤和瘤形成性疾病，包括癌症。本文所谓的“癌症(cancer)”和“癌症(cancerous)”是指或描述哺乳动物中特征通常为未调节的细胞生长的生理病况。癌症的实例包括但不限于：癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤(包括脂肉瘤)、神经内分泌肿瘤、间皮瘤、施万细胞瘤、脑膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病和恶性淋巴瘤。
在一个实施方式中，IgG变体是施用给患者的唯一治疗活性剂。可选择地，IgG变体与一个或多个其他治疗剂组合施用，所述其他治疗剂包括但不限于细胞毒素剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管发生剂、保心剂、或其他治疗剂。IgG变体可以与一种或多种其他治疗方案同时施用。例如，IgG变体可以与化疗、放疗、或化疗和放疗两者一起施用给患者。在一个实施方式中，IgG变体可以与可能是或不是IgG变体的一种或多种抗体结合施用。根据另一实施方式，使用IgG变体和一个或多个其他抗癌治疗来治疗离体的癌细胞。包括了这种离体治疗可用于骨髓移植，并且尤其是自体骨髓移植。当然包括了可以与另外的治疗技术如手术组合使用IgG变体。
可以使用多种其他治疗剂来与IgG变体一起施用。在一个实施方式中，IgG与抗血管发生剂一起施用。本文所用的“抗血管发生剂”意指在某种程度上阻断、或干扰血管发育的化合物。抗血管发生剂因子可以为：例如与参与促进血管发生的生长因子或生长因子受体结合的小分子或蛋白，例如抗体、Fc融合体、或细胞因子。本文优选的抗血管发生因子为与血管内皮生长因子(VEGF)结合的抗体。在替代性实施方式中，IgG与诱导或增强获得性免疫反应的治疗剂例如靶向CTLA-4的抗体一起施用。在替代性实施方式中，IgG与酪氨酸激酶抑制剂一起施用。本文所用的“酪氨酸激酶抑制剂”意指在某种程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在替代性实施方式中，IgG变体与细胞因子一起施用。
包括了其中配制了IgG变体和一种或多种治疗活性剂的药物组合物。通过混合具有所需纯度的IgG与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)第16版,Osol,A.编辑,1980，通过引用整体并入)以冻干制剂或水溶液的形式制备用于储存的IgG变体制剂。用于体内施用的制剂优选为无菌的。这通过用无菌滤膜过滤或其他方法容易实现。本文所公开的IgG变体和其他治疗活性剂还可以配制成免疫脂质体和/或装入微胶囊中。
治疗活性IgG变体在制剂中的浓度可以按重量计从约0.1％至100％变化。在优选的实施方式中，IgG的浓度在0.003至1.0摩尔的范围内。为了治疗患者，可以施用治疗有效剂量的IgG变体。本文所谓的“治疗有效剂量”意指产生其所施用的效果的剂量。准确的剂量取决于治疗目的，并且可由本领域的技术人员使用已知的技术来确定。剂量可以在0.01mg/kg至100mg/kg体重或更大的范围内，例如0.01、0.1、1.0、10、或50mg/kg体重，优选为1至10mg/kg。如本领域内所已知的，可能需要调整蛋白降解、全身性递送或是局部递送、新蛋白酶合成的速率、以及年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病况严重程度，并且这可以由本领域的那些技术人员使用常规实验确定。
包含IgG变体的药物组合物优选为无菌水溶液形式的施用可以以多种方法进行，包括但不限于：口服、皮下、静脉内、肠胃外、鼻内、耳内、眼内、直肠、阴道、经皮、局部(例如，凝胶、药膏、洗剂、乳剂等)、腹膜内、肌内、肺内(例如从Aradigm商购获得的吸入技术、或从Nektar Therapeutics商购获得的肺部递送系统等)。本文所述的治疗剂可以与其他治疗剂同时施用，即，本文所述的治疗剂可以与其他治疗或治疗剂共同施用，其他治疗或治疗剂包括：例如，小分子、其他生物制剂、放射治疗、手术等。
实施例
下面提供实施例来示例本发明。这些实施例不旨在将本发明限制于任何具体的应用或操作理论。对于本发明所讨论的所有位置，编号根据Kabat的EU索引(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest(具有免疫学重要性的蛋白序列),第5版,United States Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,其通过引用整体并入)进行。抗体领域内的那些技术人员应了解该规定包括在特定免疫球蛋白序列区的非顺序编号，这使得免疫球蛋白家族的保守位置具有标准化的参考。因此，如通过EU索引所定义的任何给定免疫球蛋白的位置不需要对应于其顺序序列。
实施例1：Fc变体的DNA构建、表达和纯化。
工程化IgG抗体的Fc区的氨基酸修饰以改善它们对新生儿Fc受体FcRn的亲和力。在大量不同的人IgG恒定链(图2)的背景下筛选变体，所述不同的人IgG恒定链包括IgG1、IgG2和含有CH1和IgG1的上部铰链和IgG2的Fc区的杂合IgG序列。本领域的那些技术人员应了解由于IgG1和IgG2Fc区与FcγR和补体的不同相互作用，这些不同的亲本Fc区将具有不同的FcγR介导的和补体介导的效应子功能特性。在这些亲本IgG恒定链背景中的Fc变体的示例性序列显示在图3中。
在靶向血管内皮因子(VEGF)的抗体的背景下工程化Fc变体。重链和轻链可变区(VH和VL)是人源化形式的抗体A4.6.1的重链和轻链可变区，抗体A4.6.1还称为贝伐珠单抗它已被批准用于治疗多种癌症。这种抗体的VH和VL区的氨基酸序列显示在图4中。
在哺乳动物表达载体pTT5中构建编码抗VEGF抗体的重链和轻链的基因。从IMAGE克隆获得人IgG1和IgG2恒定链基因，并且将其亚克隆到pTT5载体中。使用PCR诱变构建IgG1/2基因。编码抗VEGF抗体的VH和VL基因是商业上合成的(Blue HeronBiotechnologies,Bothell WA)，将其亚克隆到编码合适的CL、IgG1、IgG2和IgG1/2恒定链的载体中。使用定点诱变法(Stratagene,La Jolla CA)利用定点诱变构建氨基酸修饰。对所有DNA进行测序以确定序列的保真性。
使用脂质体(llipofectamine)(Invitrogen,Carlsbad CA)将含有重链基因(VH-Cγ1-Cγ2-Cγ3)的质粒与含有轻链基因(VL-Cκ)的质粒共同转染到293E细胞中，并在FreeStyle 293培养基(Invitrogen,Carlsbad CA)中生长。生长5天后，使用MabSelect树脂(GE Healthcare)的通过蛋白A亲和力从培养物上清液中纯化抗体。通过二辛可宁酸(bicinchoninic acid，BCA)测定(Pierce)来测定抗体浓度。
实施例2.保持与抗原结合的Fc变体抗体
所表达的变体抗体的保真性通过证明它们保持着对抗原的特异性来确定。使用采用Biacore 3000仪器进行的表面等离子体共振(SPR,Biacore)监测VEGF结合。使用标准方法通过用N-羟基琥珀酰亚胺/N-乙基-N’-(-3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺(NHS/EDC)偶联将重组VEGF(VEGF-165,PeproTech,Rocky Hill,NJ)粘附到CM5芯片表面。将野生型和变体抗体作为分析物注射，并且获得了以共振单位(RU)测量的响应。解离期太低而测量不到真正的平衡常数，因此在结合期结束时通过测量RU来测定相对结合，相对结合应与蛋白浓度(其在实验中保持恒定)和结合速率常数成比例。数据(图6)显示与不结合VEGF的阴性对照抗Her2抗体相反，变体抗VEGF抗体保持与抗原结合。
实施例3.与人FcRn结合的测量
在pH6.0下测量变体抗体与人FcRn的结合，在pH6.0下其在内体中自然结合。构建编码FcRn的β2微球蛋白和His标记的α链基因的载体，将其共同转染到293T细胞中，并用镍色谱纯化。通过使用标准NHS/EDC化学法将人FcRn偶联至CM5芯片表面在Biacore 3000仪器上测量pH 6.0下抗体对人FcRn(hFcRn)的亲和力。野生型和变体抗体以25-100nM的浓度用于流动相并且以共振单位测量响应。获得了在pH 6.0下的结合和解离期，然后注射pH 7.4的缓冲液以测量在较高pH下抗体从受体的释放。抗体和缓冲液的循环仅提供了基线响应，将该基线响应从各样品的传感图中减去。
图7显示在两个相关pH下，天然IgG1和选择的Fc变体抗体与人FcRn结合的Biacore传感图。该数据显示在pH 6.0下野生型和变体抗体容易与FcRn芯片结合并且在该pH下解离缓慢，因为它们在内体中，然而在pH7.4下，则迅速释放，因为它们被从内体再循环回膜上并且暴露于较高的血清pH下。
FcRn结合/解离曲线不与简单的Langmuir模型拟合，这可能是由于抗体和受体的多价性或芯片的异质性所致。通过用固定在0RU时的折射率(RI)改变与构象改变模型拟合来测定假Ka值(称为Ka*)。选择的变体抗体的这些值绘制在图8中。根据等式倍数＝(野生型Ka*/变体Ka*)计算各变体与其亲本IgG相比的相对亲和力。IgG1Fc区中的所有Fc变体的相对结合数据显示在图9中，具有IgG2Fc区(恒定链IgG1和IgG1/2)的抗体中变体的结合数据显示在图10中。对于一些变体，多次(n)重复结合实验，对于它们来说通过在各具体的结合实验中与野生型IgG亲本相比来计算倍数。如图9和10中所示，这些数据的平均提供了均值和标准偏差。
图9和10显示在pH 6.0下大量工程化变体以比野生型IgG1高的亲和力与人FcRn结合。改善很大程度上取决于给定位置的取代身份。例如，使用2倍作为改善结合的标准，则在IgG2中位置434的很多突变增加了亲和力(A、S、Y、F和W)；一些是中性的(在野生型IgG2的2倍之内)(G、H、M和T)；很多取代降低了亲和力(小于0.5倍)(D、E、K、P、R和V)。IgG1背景下较高的结合不一定意味着IgG2中的较高结合(例如，434T在IgG1中改善了结合但是在IgG2中不改善)。此外，单变体所提供的改善在组合后并不总是加性的。图11a通过绘制选择的双取代变体的实验性FcRn结合倍数相对于构成它们的各单独变体的FcRn结合倍数乘积的图来图示性显示这一点。直线代表完美的加性作用，即从单取代的乘积所预计或预测的值。许多双变体落在这条线上或接近该线(259I/319I、259I/428L、319I/428L和308F/428L)。几种变体是低于加性的(319I/308F、252Y/428L和428L/434M)。对于这些变体，尤其是在后两种(252Y/428L和428L/434M)的情况下，单取代的亲和力改善似乎在组合时是彼此不相容的。出人意料的是，变体259I/308F和428L/434S的FcRn亲和力改善比从它们各自的单取代的亲和力所预计的要高。这些特定的单取代在组合时具有意料之外的协同改善。实验性亲和力与从单变体的亲和力预测的亲和力之间的差异绘制在图11b中，其中变体根据它们的复合单变体分组(259I、308F和319I在左侧，与482L的组合在右侧)。协同作用可以通过如下量化：计算实验值与预测值相比的倍数，然后将其标准化为1并转化为百分比(％协同作用＝100×[(实验倍数/预测倍数)-1)]。该分析绘制在图11b中，其中变体根据它们的复合单变体分组。该图再次突出了一些变体的协同作用，尤其是259I/308F和428L/434S。图11b和11c还强调了组合来自筛选的一些最佳单取代的非预测性。例如，尽管428L与434S和259I的组合提供了协同结合改善，但252Y或434M在与428L组合时则具有负面影响。428L与434S的组合和428L与434M的组合之间的显著差异进一步突出了在给定位置的取代的具体氨基酸身份的重要性。
实施例4.测试在其他抗体背景中的变体
在靶向其他抗原的抗体背景中构建选择的变体，所述其他抗原包括：TNF(TNFα)、CD25(TAC)、EGFR和IgE。图4提供用于本发明的靶向这些抗原的抗体的VH和VL区氨基酸序列。野生型和Fc变体抗TNF抗体含有全长的人抗体阿达木单抗的可变区，阿达木单抗目前已被批准用于治疗类风湿性关节炎(RA)、幼年特发性关节炎(JIA)、银屑病关节炎(PsA)、强直性脊柱炎(AS)和克罗恩(Crohn)病(CD)。野生型和Fc变体抗CD25抗体为人源化形式的抗TAC抗体(Junghans等人,1990,Cancer Research 50:1495-1502)，其被称为H1.8/L1抗TAC。野生型和Fc变体抗EGFR抗体为人源化形式的鼠抗体C225，它称为H4.42/L3.32C225。最后，野生型和Fc变体抗IgE抗体含有人源化抗体奥马珠单抗的可变区奥马珠单抗被批准用于治疗过敏性哮喘。
如上文所述构建、表达并纯化野生型和变体抗体。通过如上文所述的Biacore测试在pH 6.0下抗体与人FcRn的结合。变体抗TNF、抗CD25、抗EGFR和抗IgE抗体与人FcRn的相对结合数据提供在图12中。如可以看到的，变体在靶向多种抗原的抗体的背景下改善了FcRn亲和力。
实施例5.在敲入人FcRn的小鼠中的药代动力学实验
为了测试选择的变体改善体内半衰期的能力，在鼠FcRn敲出纯合性且为人FcRn敲入杂合性(mFcRn-/-,hFcRn+)(Petkova等人,2006,Int Immunol 18(12):1759-69，通过引用整体并入)的B6小鼠中进行了药代动力学实验，所述小鼠在本文中称为hFcRn或hFcRn+小鼠。对通过体重(20-30g范围)随意选择的4-7只雌性小鼠的组给予抗VEGF抗体(2mg/kg)的单次静脉内尾静脉注射。在各时间点，从框下丛(orbital plexus)抽取血液(约50μl)，加工成血清，并在-80℃下储存直到分析。研究持续时间为28天或49天。在这些研究期间动物未受损伤。
使用两种ELISA测定来测定抗体浓度。在前两个研究(称为研究1和研究2)中，将山羊抗人Fc抗体(Jackson Immuno research)粘附至板上，用PBST(具有0.05％吐温的磷酸盐缓冲盐水)洗涤孔，并用在PBST中的3％BSA封闭。添加血清或校准标准，然后用PBST洗涤、添加铕标记的抗人IgG(Perkin Elmer)，再次用PBST洗涤。收集时间分辨荧光信号。对于研究3-5，使用类似的ELISA检测血清浓度，但是使用重组VEGF(VEGF-165,PeproTech,RockyHill,NJ)作为捕获试剂并且用生物素化的抗人κ抗体和铕标记的链酶亲和素进行检测。使用WinNonLin(Pharsight Inc,Mountain View CA)利用非房室模型测定各个小鼠的PK参数。将标称时间和剂量用于点的统一加权。所用的时间点(λZ范围)为从第4天至研究结束，然而所有时间点都用于较快清除的变体，P257N和P257L。
在mFcRn-/-hFcRn+小鼠中进行了5种抗体PK研究。图13分别显示野生型和变体IgG1(研究3)和IgG2(研究5)的血清浓度数据。在mFcRn-/-hFcRn+小鼠中进行的所有体内PK研究的拟合PK参数提供在图14中。PK数据包括表示表征抗体从血清中消除的β期的半衰期、表示观察到的最大血清浓度的Cmax、表示浓度时间曲线下的面积的AUC、表示抗体从血清中的清除的清除率。还提供了各变体相对于IgG1或IgG2亲本抗体的计算的半衰期改善或降低倍数[半衰期倍数＝半衰期(变体)/半衰期(野生型)]。
该数据显示在pH 6.0下具有增强的FcRn亲和力的大量工程化Fc变体抗体延长了体内半衰期。图15a显示体内半衰期相对于IgG1抗体的FcRn结合倍数的图，其中标记了选择的变体。来自重复试验(在图中圈出)的结果表明来自体内模型的数据是可再现的。最佳的单变体包括308F和434S；最佳的双变体包括259I/308F、308F/428L、308F/434S和428L/434S；并且最佳的三变体为259I/308F/428L。在FcRn亲和力和体内半衰期之间具有大致相关性，但不是完全可预测的。显著地，FcRn结合分别改善了3.4倍和3.5倍的变体257L和257N的体内半衰期分别降低0.6和0.3。该图还再次突出了在给定位置的取代的氨基酸身份的重要性—尽管308F/434S提供明显的半衰期改善，但是308F/434M则刚刚优于IgG1。
图15b显示体内半衰期相对于IgG2变体抗体的FcRn结合倍数的图，其中标记出了变体。当将IgG2体内数据与IgG1体内数据相比时(图15c)，观察到了出乎意料的结果。相比于IgG1Fc区，变体在IgG2Fc区的背景下提供显著较高的体内半衰期改善。在所有5个研究中来自所有抗体的单变体和双变体的最长半衰期为12.2和16.5，它们分别由434S IgG2和428L/434S IgG2提供。尽管IgG2中的变体与IgG1中的变体的倍数改善相当或甚至比IgG1中的变体的倍数改善更低(434S IgG1倍数＝3.8、434S IgG2倍数＝4.9、428L/434S IgG1倍数＝17.3、428L/434S IgG2倍数＝14.8)这一事实，但IgG2变体相对于IgG1显著改善了半衰期。因此，意料之外的是，IgG2抗体可以最好地应用于Fc变体以改善在哺乳动物中的体内半衰期。
实施例6.变体免疫粘附素
还评定了本发明的Fc变体改善免疫粘附素(还称为Fc融合体)的半衰期的能力。将选择的Fc变体工程化到抗TNF免疫粘附素依那西普中。依那西普是人TNF受体2(TNF RII)和人IgG1的Fc区的融合体，并且在临床上被批准用于治疗类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病关节炎和银屑病。还构建该Fc融合体的IgG2Fc区形式，并将选择的Fc变体也构建在此背景下。本发明中表征的抗TNF免疫粘附素的氨基酸序列提供在图16中。使用递归式PCR构建基因，并将其亚克隆到pTT5载体中，使用诱变法构建Fc变体。如上所述在293E细胞中表达免疫粘附素并纯化。
通过Biacore测试与重组TNF的结合来确定纯化的免疫粘附素的结合特异性。将免疫粘附素捕获在使用标准的伯胺偶联产生的固定的蛋白A/G(Pierce)CM5传感芯片(Biacore)上。将免疫粘附素固定在蛋白A/G表面，并且将系列稀释的重组TNF注射到抗体结合表面，接下来是解离期。在每次循环后，用缓冲液使表面再生。通过在注射受体之前将时间和响应调零来处理数据并且用参考通道将其减去以计算由于注射所引起的改变。将动力学数据与1:1结合模型(Langmuir)拟合。从这些拟合中所获得的平衡结合常数(Ka)提供在图17中。该结果显示变体免疫粘附素保持着与商业的enbrel相当的TNF亲和力。
使用如上文所述的Biacore测试在pH 6.0下变体免疫粘附素与人FcRn的结合。结果(图18)表明，与抗体背景中类似，变体与它们的IgG1和IgG2亲本免疫粘附素蛋白相比改善了与FcRn的结合。
如上文所述在mFcRn-/-hFcRn+小鼠中测试变体免疫粘附素的半衰期。以2mg/kg的变体和亲本IgG1免疫粘附素注射每组12只的小鼠。使用类似于上文所述的ELISA检测血清浓度，不同的是使用山羊抗人TNF RII抗体作为捕获试剂；用生物素化的抗人κ抗体和铕标记的链酶亲和素进行检测。图19显示野生型IgG1Fc和变体Fc免疫粘附素的血清浓度数据。来自PK研究的如上文所述的拟合PK参数在图20中提供。还提供各变体计算的半衰期％增加，它计算为100乘以变体Fc融合体的半衰期与野生型IgG1Fc亲本的半衰期的比。结果表明变体在免疫粘附素的背景下延长了体内半衰期。
实施例7.在非人的灵长类中的药代动力学实验
已经充分确定生物制剂在非人灵长类中的pK特性能够预测它们在人中的特性。在短尾猴(食蟹猴(macaca fascicularis))中进行了PK研究以评定变体抗VEGF抗体在非人的灵长类中改善血清半衰期的能力。
在短尾猴中的PK研究制备中，测量了在pH 6.0下变体抗体与短尾猴(cyno)FcRn(cFcRn)的结合。如上文对于人FcRN所述构建、表达并纯化cFcRn。变体抗VEGF抗体与cFcRn的结合使用如上文所述的Biacore来测量。数据提供在图21中。结果表明变体改善了对cynoFcRn的亲和力，这与它们对于人FcRn的作用类似。在较高pH(7.4)下的解离也极为迅速(数据未显示)，这与关于结合人FcRn所观察到的情况类似。由于人和cyno受体的高度序列同源性(FcRnα链96％，β-2-微球蛋白91％)，结果并不出乎意料。
在非人灵长类中体内研究了变体的PK。将重2.3-5.1kg的雄性短尾猴(食蟹猴(macaca fascicularis)，也称为食蟹猴(crab-eating Macaque))按重量随意选择，并分为5组，每组3只猴子。用4mg/kg抗体给予猴子单次1小时的外周静脉输注。从输注完成后5分钟至90天的分离静脉中抽取血液样品(1ml)，将其加工为血清，并储存在-70℃下。在这些研究期间动物未受损伤。
如上文所述使用VEGF捕获方法测定抗体浓度。如小鼠PK研究中所做的一样通过将浓度相对于时间的函数与非房室模型拟合来测定PK参数。然而，使用第10天至第90天的时间点进行PK参数测定。PK结果绘制在图22中，并且拟合的参数提供在图23中。结果显示变体将抗体的体内半衰期增加了多达3.2倍。在最佳的情况下(428L/434S变体)半衰期从9.7天延长到了31.1天。短尾猴中所获得的PK结果与mFcRn-/-hFcRn+小鼠中所获得的那些结果一致，这验证了hFcRn小鼠模型作为评估变体体内PK特性的系统，并且支持来自那些研究的结论。
尽管为了示例的目的而在上文中描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的那些技术人员应了解可以在不背离所附的权利要求所述的发明的情况下进行大量的细节改变。本文所引用的所有参考文献都以其整体并入。
本发明包括如下实施方案：
1.一种包含相对于野生型人Fc区的至少一个修饰的变体Fc区，其中所述修饰选自由下列组成的组：252Y/428L、252Y/434S和428L/434S，其中编号根据EU索引进行。
2.根据实施方案1所述的变体，其中所述修饰为428L/434S。
3.根据实施方案1所述的变体，其中所述修饰为252Y/428L。
4.根据实施方案1所述的变体，其中所述修饰为252Y/434S。
5.根据实施方案1所述的变体，其中所述变体包括抗体或免疫粘附素，并且其中所述Fc区选自由下列组成的组：IgG1、lgG2、lgG3和lgG4。
6.根据实施方案5所述的变体，其中所述变体包含IgG1Fc区。
7.根据实施方案5所述的变体，其中所述变体包含IgG2Fc区。
8.根据实施方案5所述的变体，其中所述变体与具有所述野生型Fc区的所述抗体或免疫粘附素相比在哺乳动物中具有较长的血清半衰期。
9.根据实施方案8所述的变体，其中所述哺乳动物为表达人FcRn的小鼠或非人的灵长类。
10.根据实施方案8所述的变体，其中所述哺乳动物为人。
11.根据实施方案5所述的变体，其中所述抗体或免疫粘附素对选自由下列组成的组的抗原具有特异性：血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、CD25、表皮生长因子受体(EGFR)和IgE。
12.一种包含IgG2Fc区的变体的变体抗体或变体免疫粘附素，其中所述变体抗体或免疫球蛋白包含相对于野生型IgG2Fc区的1至5个修饰，其中至少一个所述修饰在位置434处，其中编号根据EU索引进行，并且其中所述变体抗体或变体免疫粘附素与具有所述野生型IgG2Fc区的所述抗体或免疫粘附素相比在哺乳动物中具有较长的血清半衰期。
13.根据实施方案12所述的变体，其中所述变体包含在434S处的至少一个修饰和在选自由252和428组成的组的位置处的一个修饰。
14.根据实施方案12所述的变体，其中所述哺乳动物为表达人FcRn的小鼠或非人的灵长类。
15.根据实施方案12所述的变体，其中所述哺乳动物为人。
16.一种包含相对于野生型人Fc区的至少两个修饰的变体Fc区，其中至少一个修饰为428L，并且至少一个修饰在位置252或434处，其中编号根据EU索引进行。
17.根据实施方案16所述的变体，其中所述Fc区包括抗体或免疫粘附素，并且其中所述抗体或免疫粘附素包含IgG1或IgG2Fc区，并且其中所述变体与具有所述野生型人Fc区的所述抗体或免疫粘附素相比在哺乳动物中具有较长的血清半衰期，其中所述哺乳动物为表达人FcRn的小鼠、非人的灵长类、或人。
序列表
<110> 赞科股份有限公司
拉扎·格雷格里
张伯伦·亚伦·基斯
达希亚特·巴西尔·I
德斯加莱斯·约翰·R
卡尔基·谢尔·巴阿杜
<120> 与FcRn结合改变的Fc变体
<130> 5026-WO03
<140> PCT/US2008/088053
<141> 2008-12-22
<150> 61/016,793
<151> 2007-12-26
<150> 61/ 031,353
<151> 2008-02-25
<150> 61/046,353
<151> 2008-04-18
<150> 61/050,172
<151> 2008-05-02
<150> 61/079,779
<151> 2008-07-10
<150> 61/099,178
<151> 2008-09-22
<160> 35
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 2
<211> 330
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 3
<211> 326
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
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Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
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Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 4
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<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 5
<211> 327
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 6
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1/2恒定重链（CH1-铰链-CH2-CH3）
<400> 6
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 7
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 259I/308F
<400> 7
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Phe Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 8
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 434S/428L
<400> 8
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 9
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 434S
<400> 9
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 10
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 434S/428L
<400> 10
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 11
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1/2 434S
<400> 11
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 12
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1/2 434S/428L
<400> 12
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 13
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGF VH
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50 55 60
Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗VEGF VL
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TNF VH
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TNF VL
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD25
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Arg Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Ser Thr Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Gly Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD25 VL
<400> 18
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Thr Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Arg Ser Thr Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗EGFR VH
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Ser Thr Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗EGFR VL
<400> 20
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗IgE VH
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Ser Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Val Ala Ser Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 22
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗IgE VL
<400> 22
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 23
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TNF轻链
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 24
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TNF重链IgG1 259I/308F
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Phe Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 25
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TNF重链IgG1 434S/428L
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu
420 425 430
His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 26
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TNF重链IgG2 434S
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys
210 215 220
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 27
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TNF重链IgG2 434S/428L
<400> 27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys
210 215 220
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu
420 425 430
His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 28
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TNF重链IgG1/2 434S
<400> 28
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 29
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗TNF重链IgG1/2 434S/428L
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His
420 425 430
Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 30
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有IgG1 Fc的抗TNF Fc融合体
<400> 30
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
260 265 270
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
275 280 285
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
290 295 300
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
305 310 315 320
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
325 330 335
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
340 345 350
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
355 360 365
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
370 375 380
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
385 390 395 400
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
405 410 415
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
420 425 430
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
435 440 445
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
450 455 460
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
465 470 475 480
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 31
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有IgG2 Fc的抗TNF Fc融合体
<400> 31
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
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115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
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Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
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Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
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260 265 270
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 32
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有IgG1 259I/308F Fc的抗TNF Fc融合体
<400> 32
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
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50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
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115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
260 265 270
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
275 280 285
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Ile Thr Cys Val
290 295 300
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
305 310 315 320
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
325 330 335
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Phe Leu His
340 345 350
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
355 360 365
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
370 375 380
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
385 390 395 400
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
405 410 415
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
420 425 430
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
435 440 445
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
450 455 460
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
465 470 475 480
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 33
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有IgG1 428L/434S Fc的抗TNF Fc融合体
<400> 33
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
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35 40 45
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100 105 110
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145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
260 265 270
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
275 280 285
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
290 295 300
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
305 310 315 320
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
325 330 335
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
340 345 350
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
355 360 365
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
370 375 380
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
385 390 395 400
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
405 410 415
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
420 425 430
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
435 440 445
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
450 455 460
Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln
465 470 475 480
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 34
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有IgG2 434S Fc的抗TNF Fc融合体
<400> 34
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
260 265 270
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
355 360 365
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485
<210> 35
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有IgG2 428L/434S Fc的抗TNF Fc融合体
<400> 35
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly
245 250 255
Asp Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
260 265 270
Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
275 280 285
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
290 295 300
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
305 310 315 320
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
325 330 335
Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln
340 345 350
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
355 360 365
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro
370 375 380
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
385 390 395 400
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
405 410 415
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
420 425 430
Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
435 440 445
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
450 455 460
Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ser His Tyr Thr Gln Lys
465 470 475 480
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485

Claims (10)

1.抗体在制备药物中的用途，其中所述抗体包含相对于野生型人Fc区具有两个修饰的变体Fc区，其中所述修饰是428L和434S，其中所述抗体相比没有所述修饰的抗体在哺乳动物中具有较长的半衰期，并且其中编号根据Kabat等的EU索引进行。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述Fc区选自：IgG1、lgG2、lgG3和lgG4。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述抗体包含IgG1 Fc区。
4.根据权利要求2所述的用途，其中所述抗体包含IgG2 Fc区。
5.根据权利要求1所述的用途，其用于治疗人中的病症。
6.根据权利要求2所述的用途，其中所述抗体对选自下列的抗原具有特异性：血管内皮生长因子(VEGF)、肿瘤坏死因子α (TNF-α)、CD25、表皮生长因子受体(EGFR)和IgE。
7.根据前述权利要求任一项所述的用途，其中所述药物用于治疗选自下列的病症：免疫疾病、传染病、炎性疾病、神经疾病、以及瘤形成性疾病。
8.根据权利要求7所述的用途，其中病症是自身免疫性疾病。
9.根据权利要求7所述的用途，其中病症是肿瘤性疾病。
10.根据权利要求7所述的用途，其中病症是癌症。
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