KR20040082421A - 빠른 항원 결합 속도를 갖는 항체 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 빠른 항원 결합 속도를 갖는 항체 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 항체 변이체는 그의 하나 이상의 초가변 영역내에 있거나 또는 이 영역과 인접한 하나 이상의 아미노산 변형(들)을 가지며, 이러한 변형은 항체 변이체와 이 변이체가 결합하는 항원 사이의 전하 상보성을 증가시킨다.

Description

빠른 항원 결합 속도를 갖는 항체 변이체 {Antibody Variants with Faster Antigen Association Rates}

본 발명은 빠른 항원 결합 속도를 갖는 항체 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 항체 변이체는 그의 1개 이상의 초가변 영역내에 있거나 또는 이 영역과 인접한 1개 이상의 변형을 가지며, 이러한 변형(들)은 항체 변이체와 그가 결합하는 항원 사이의 전하 상보성을 증가시킨다.

<관련 선행기술의 기재>

항체는 특정 항원에 대해 결합 특이성을 나타내는 단백질이다. 천연 항체는 일반적으로는 2개의 동일한 경 (L) 쇄 및 2개의 동일한 중 (H) 쇄로 이루어진 약 150,000 달톤 크기의 이종사량체 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 공유 디술피드 결합에 의해 연결되지만, 디술피드 결합의 수는 상이한 이뮤노글로불린 이소타입의 중쇄들 사이에서 변한다. 또한, 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 이격된 쇄내 디술피드 결합을 갖는다. 각 중쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (V_H)을 가지며, 그 뒤쪽에 다수의 불변 도메인이 존재한다. 각 경쇄는 하나의 말단에 가변 도메인 (V_L)을 갖고, 그의 다른 말단에 불변 도메인을 가지며, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되어 있고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되어 있다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이의 계면 (interface)을 형성하는 것으로 여겨진다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 여러 부위들이 항체들 사이의 서열에서 폭넓게 차이가 있으며, 각 특정 항체의 그의 특정 항원에 대한 결합 특이성을 초래한다는 사실을 의미한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인을 통해 균일하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인의 둘 다에서 상보성 결정 영역 (CDR)이라 불리는 3개의 단편들에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부위는 프레임워크 영역 (FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 이는 3개의 CDR에 의해 연결된 β-시트 형태를 주로 채택하는데, 상기 CDR은 β-시트 구조를 연결하며, 어떤 경우에는 β-시트 구조의 일부를 형성하는 루프 (loop)를 형성한다. 각 쇄의 CDR은 FR 영역의 근처 가까이에서 함께 유지되며, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (문헌 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 참조).

불변 도메인은 항체가 항원에 결합하는데 직접 관여하지 않지만, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다. 항체 또는 이뮤노글로불린은 그의 중쇄 불변 영역의 아미노산 서열에 따라 다른 군으로 지정될 수 있다. 이뮤노글로불린의 5가지 주요 군은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이며, 이들 중 여럿은 하위 군 (이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린의 다른 군에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 다양한 인간 이뮤노글로불린 군들 중에서, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgM만이 보체를 활성화하는 것으로 알려져 있다.

인간 질병의 치료를 위한 항체의 사용은 급속하게 증가하고 있다. 치료와 관련된 이러한 항체의 하나를 구성하여 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 표적화하였다 (Chen et al. Journal of Molecular Biology 293(4): 865-81 (1999); Kim et al. Nature 362(6423): 841-4 (1993); Muller et al. Structure 5(10): 1325-38 (1997); WO 96/30046; WO 98/45331; 및 WO 00/29584). VEGF는 막횡단 수용체, Flt-1 및 KDR에 대한 그의 자극을 통해 혈관 증식을 특이적으로 개시한다 (Ferrara, N. Current Topics in Microbiology & Immunology 237: 1-30 (1999)). VEGF의 길항제는 암을 포함하는 질병을 억제하는 것으로 입증되었으며, 여기서 비조절성 혈관신생 (angiogenesis)은 질병 증상에 기여한다 (Kim et al. Nature 362(6423): 841-4 (1993)).

생체내에서, 항체의 친화성 성숙은 주로 체세포 과돌연변이유발에 의해 형성되며 더 높은 친화성을 갖는 항체 변이체의 항원 선택에 의해 유도된다. 또한, "레퍼토리 전환 (repertoire shift)"이 흔히 일어나는데, 이 경우 2차 또는 3차 반응의 우세한 생식세포 유전자는 1차 또는 2차 반응의 우세한 생식세포 유전자와 차이가 있는 것으로 나타난다.

다양한 연구 그룹들이 시험관내에서 항체 유전자에 돌연변이를 도입하고 친화성 선택을 이용하여 향상된 친화성을 갖는 돌연변이체를 단리함으로써 면역계의친화성 성숙 과정을 모방하고자 시도하여 왔다. 이러한 돌연변이 항체는 섬유상 박테리오파아지의 표면에 나타낼 수 있으며, 항체는 항원에 대한 그의 친화성에 의해 또는 항원으로부터의 해리 반응속도 (오프(off)-속도)에 의해 선택될 수 있다 (Hawkins et al. J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)). CDR 워킹(walking) 돌연변이유발은 인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)의 인간 엔벨로프 당단백질 gp120 (Barbas III et al. PNAS (USA) 91: 3809-3813 (1994); and Yang et al. J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995)) 및 항-c-erbB-2 단쇄 Fv 단편 (Schier et al. J. Mol. Biol. 263:551567 (1996))과 결합하는 인간 항체를 친화성 성숙시키는 데 사용되어 왔다. 항체 쇄 셔플링(shuffling) 및 CDR 돌연변이유발을 이용하여 HIV의 제3 초가변 루프에 대해 지시되는 고친화성 인간 항체를 친화성 성숙시켰다 (Thompson et al. J. Mol. Biol. 256:77-88 (1996)). 밸린트(Balint) 및 래릭(Larrick)의 문헌 (Gene 137:109-118 (1993))은 이들이 컴퓨터-보조에 의한 올리고데옥시리보뉴클레오티드-지시된 스캐닝 돌연변이유발을 포함하는 "적은(parsimonious) 돌연변이유발"을 만들어내는 기술을 기재하고 있으며, 이 기술에 의해 가변 영역 유전자의 3개의 CDR 모두는 향상된 변이체에 대해 동시에 철저하게 조사된다. 우(Wu) 등은 초기 제한된 돌연변이유발 전략을 이용하여 αvβ3-특이적 인간화 항체를 친화성 성숙시켰는데, 6개의 CDR 모두의 위치를 돌연변이시킨 다음에, 최고 친화성의 돌연변이체를 포함하는 조합 라이브러리를 발현 및 스크리닝하였다 (Wu et al. PNAS (USA) 95: 6037-6-42 (1998)). 파아지 항체는 문헌 (Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992); and Rader and Barbas III Current Opinion in Biotech.8:503-508 (1997))에서 검토되었다.

단백질-리간드 쌍의 친화성은 해리 상수 (Kd)에 의해 기술되며, 용액 중에서 결합된 분자에 대한 비결합된 분자의 평형 분포로서 정의된다 (방정식 1). 이러한 관계는 결합 속도 상수 (온-속도 상수, k₁)에 대한 해리 속도 상수 (오프-속도 상수, k_-1)의 비율에 의해 정의될 수도 있다.

<방정식 1>

돌연변이체들 사이에서 다수의 단백질-단백질 상호작용의 친화성 차이 (Voss, E. W. Journal of Molecular Recognition 6(2): 51-8 (1993))는 일차적으로 그들의 해리 속도에서의 차이에 의해 정의된다. 이러한 관찰 결과는 단백질-단백질 계면에서의 직접적인 접촉에 관여하는 친화성을 증가시키는 돌연변이와 일치하며, 해리 속도 상수는 바람직한 좁은 범위의 상호작용의 파괴에 따라 달라진다. 이와는 달리, 결합 속도 상수 (k₁)는 두 분자 사이의 충돌 빈도 (Z), 및 각 충돌이 결합체를 형성시키는 효율에 따라 달라진다. 달리 말하면, 후자는 두 분자 및 충분한 열 활성화 에너지를 갖는 분자 집단의 배향 요건을 설명하는 입체 인자 (p)에 따라 좌우된다 (Fersht, A. R. (1985). Enzyme Structure and Mechanism, W. H. Freeman and Company, New York, NY)(방정식 2).

<방정식 2>

상기 식에서, Ea는 결합체의 형성을 위한 활성화 에너지이고, R은 보편적인 기체 상수이며, T는 온도 (켈빈(Kelvin) 온도)이다.

이론적으로, 충돌 속도 또는 충돌 효율을 증가시키는 돌연변이를 통해 결합 속도를 증가시킬 수 있다. 이는, 결합 계면을 포함하는 좁은 범위의 접촉을 파괴하지 않으면서 결합 계면의 주변에서 바람직한 정전기 조종력을 발생시키는 잔기를 돌연변이시킴으로써 달성할 수 있는 것으로 예상되었다 (Berg & von Hippel (1996) Nat. Struct. Biol. 3:427-31; Radic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:23265-77; Selzer et al. (2000) Nat. Struct. Biol. 7:537-41). 이러한 현상에 대한 조사는 다양한 점도 및 염도의 용액에서 결합 속도의 예상을 위한 완전 비-선형 포이슨-볼츠만 (Poisson-Boltzman) 방정식의 해를 구하는 브라우니언 (Brownian) 동역학 시뮬레이션 및 복잡한 컴퓨터 분석에 집중되었다 (Slagle et al. (1994) J. Biomolec. Struct. Dynam. 12:439-56; Kozack et al. (1995) Biophys. J. 68-807-14; Fogolari et al. (2000) Eur J Biochem. 267:4861-9; Gabdoulline & Wade (2001) J Mol. Biol. 306:1139-55). 그러나, 결합 속도는 바네이스-바스타(barnase-barstar) 결합체 (Schreiber & Fersht (1996) Nat. Struct. Biol. 3:427-31; Vijayakumar et al. (1998) J. Mol. Biol. 278:1015-24), TEM-락타마제-BLIP 저해제 결합체 (Selzer et al. (2000) Nat. Struct. Biol. 7:537-41), 아세틸콜린에스테라제-파시쿨린 결합체 (Radic et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:23265-77), 및 히루딘-트롬빈 결합체 (Jackman et al. (1992) J. Biol. Chem. 267:15375-83; Betz et al. (1991) Biochem. J. 275:801-3)에 대한 균일 유전 상수 80을 갖는 상호작용의 정전기 에너지를 계산함으로써 예상할 수 있다는 것이 최근에 이르러 밝혀졌다.

<발명의 개요>

본 발명은,

a) 모 (parent) 항체의 가변 도메인내에 존재하는, 1) 용액 중 노출된 잔기이고, 2) 초가변 영역내에 있거나 또는 이 영역과 인접하며, 3) 모 항체가 결합하는 항원의 약 20 Å내에 존재하는 표적 아미노산 잔기를 동정하는 단계; 및

b) 상기 단계 a)의 표적 잔기를 다른 대체 아미노산 잔기로 치환하여 항체와 항원 사이의 전하 상보성을 증가시키는 단계

를 포함하는, 상기 모 항체의 항체 변이체를 제조하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 본 발명의 방법은 항원과의 결합 속도가 모 항체보다 더 빠른 항체 변이체를 생성시킨다. 또한, 본 발명은 상기 단락의 방법에 따라 제조된 항체 변이체를 제공한다.

또한, 본 발명은 초가변 영역내에 있거나 또는 이 영역과 인접한 아미노산 변형을 포함하며, 이 변형이 항체 변이체와 이 변이체와 결합하는 항원 사이의 전하 상보성을 증가시키는 것인, 항체 변이체를 제공한다.

다양한 형태의 항체 변이체가 본원에서 고려된다. 예를 들어, 항체 변이체는 전장 항체 (예를 들어, 인간 이뮤노글로불린 불변 영역을 가짐) 또는 항체 단편 (예를 들어, Fab 또는 F(ab')₂)일 수 있다. 또한, 항체 변이체는 검출가능한 표지로 표지하고(하거나), 고상에 고정시키고(시키거나), 이종 화합물 (예, 세포독성제)과 접합시킬 수 있다.

항체 변이체에 대한 진단 및 치료 용도가 고려된다. 한가지 진단 용도에서, 본 발명은 항원을 함유하는 것으로 의심되는 샘플을 항체 변이체에 노출시키는 단계 및 항체 변이체와 샘플의 결합을 결정하는 단계를 포함하는, 대상 항원의 존재를 결정하는 방법을 제공한다. 이러한 용도를 위해, 본 발명은 항체 변이체, 및 항체 변이체를 사용하여 항원을 검출하기 위한 지침을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 항체 변이체를 코딩하는 단리된 핵산; 임의로는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 의해 인식되는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 핵산을 포함하는 벡터; 상기 핵산으로 형질전환된 숙주 세포; 및 이 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키고, 임의로는 숙주 세포 배양물로부터 (예를 들어, 숙주 세포 배양 배지로부터) 항체 변이체를 회수하는 것을 포함하는, 항체 변이체의 제조 방법을 추가로 제공한다. 회수된 항체 변이체를 이종 분자, 예를 들어 세포독성제 또는 표지에 접합시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 항체 변이체 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 치료 용도를 위한 이러한 조성물은 멸균된 것이며, 동결건조시킬 수 있다.

본 발명은 유효량의 항체 변이체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 치료 방법을 추가로 제공한다.

또한, 본 발명은

(1) 항체 및 항원을 용액 중에서 합하는 단계; 및

(2) 항체-항원 결합체의 형성을 시간에 따라 측정하는 단계

를 포함하는, 항체의 항원 결합 속도를 측정하는 방법을 제공한다.

도 1A-B는 모 항체 Y0101 Fab에 대한 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열의 정렬 (각각, 서열 1 및 2); 변형된 경쇄 "S26T-Q27K-D28K-S30K" 서열 (서열 3); 변형된 경쇄 "S26T-Q27K-D28K-S30T" 서열 (서열 4); 및 변형된 중쇄 "T28D-S100aR" 서열 (서열 5)을 나타낸다. 도 1A-B에서, 번호부여는 Kabat 번호부여 시스템에 따른 것이라기 보다는 순차적인 것이다. 따라서, 중쇄 돌연변이체의 경우, S100aR 돌연변이 (Kabat 번호부여 시스템)는 돌연변이 S105R이다 (순차적 번호부여 시스템).

도 2는 형광 스펙트럼을 나타낸다. 방출 스펙트럼: 약 10 nM Fab Y0101 (흑색 점선), 약 120 nM VEGF (회색 실선), 및 10 nM Fab와 120 nM VEGF의 혼합물 (흑색 실선). Fab와 VEGF의 개별 스펙트럼의 합은 회색 점선으로 나타내었다.

도 3은 비처리 반응속도 데이타를 나타낸다. 결합체의 형성 속도 (△형광)는 시간에 따른 VEGF 농도 변화의 함수로서 측정할 수 있으며 (회색에서 흑색으로 갈수록 농도가 증가함), 단일 지수로서 핏팅 (fitting)하여 관찰 속도 (k_obs)를 결정할 수 있다.

도 4는 k₁의 계산에 관한 것이다. 사용된 VEGF의 농도에 대해 결합체 형성의 관찰 속도 (k_obs)를 플롯팅하여 슈도 (pseudo)-1차 분석함으로써 그래프의 기울기로 제공된 k₁을 결정한다. 여기 나타낸 데이타는 중쇄 돌연변이체 T28E에 관한 것이다.

도 5는 Fab Y0101 변이체에 대한 k_obs와 k_calc의 비교를 나타낸다.

도 6A 및 6B는 항-VEGF 변이체 "34-TKKT+H97Y+VNERK" (각각, 서열 4 및 8); "34-TKKT+H97Y" (각각, 서열 4 및 9); 및 "34-TKKT+VNERK" (각각, 서열 4 및 10)의 경쇄 및 중쇄 서열의 정렬을 제공한다. 모 항체 Y0101의 서열을 비교를 위해 제공한다. 굵은 글씨 및 밑줄로 나타낸 잔기는 치환을 나타낸다.

도 7은 이온 농도에 대한 결합 속도의 의존성을 예시한다. Y0101 (속이 채워진 원) 및 빠른 결합 변이체, "34-TKKT" ((V_H-(T28D,S100aR)+V_L-(S26T, Q27K, D28K, S30T))(속이 빈 사각형)에 대한 결합 속도를 염 농도의 함수로서 측정하였다. 기울기 (-U/RT)는 각각 -1.4 및 6.5이며, Y0101에 대한 +0.86 kcal mol^-1및 가장 빠른 결합 변이체에 대한 -4.0 kcal mol^-1의 U에 상응한다.

도 8은 인간화 항-TF 항체 D3H44의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에 대한 아미노산 서열을 제공한다. 잠재적인 On-RAMPS로서 동정된 잔기는 굵은 글씨 및 밑줄로 나타내었다.

도 9는 인간화 항-HER2 항체 4D5의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에 대한 아미노산 서열을 제공한다. 잠재적인 On-RAMPS로서 동정된 잔기는 굵은 글씨 및 밑줄로 나타내었다.

바람직한 실시양태의 상세한 설명

I. 정의

용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다면 항체 단편을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은 서열에서 초가변성이고(이거나) 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 의미한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 ("CDR L1"), 50-56 ("CDR L2") 및 89-97 ("CDR L3"), 및 중쇄 가변 도메인에서 31-35 ("CDR H1"), 50-65 ("CDR H2") 및 95-102 ("CDR H3"); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및(또는) "초가변 루프"로부터의 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인에서 잔기 26-32 ("루프 L1"), 50-52 ("루프 L2") 및 91-96 ("루프 L3"), 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32 ("루프 H1"), 53-55 ("루프 H2") 및 96-101 ("루프 H3"); Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다. 두 경우에서, 문헌 (Kabat et al., supra.)에 따라 가변 도메인 잔기에 번호를 부여하였다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에서 정의된 바와 같이 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

"Kabat로 번호부여된 가변 도메인 잔기"라는 표현은 항체의 편집으로부터의 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인에 대해 사용된 번호부여 시스템을 의미한다 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). 이러한 번호부여 시스템을 사용해서, 실제적인 선형 아미노산 서열은 가변 도메인의 FR 또는 CDR의 단축 또는 상기 FR 또는 CDR로의 삽입에 상응하는, 더 적은 또는 추가의 아미노산을 함유할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 도메인은 CDR H2의 잔기 52 이후의 단일 아미노산 삽입물 (Kabat에 따른 잔기 52a) 및 중쇄 FR 잔기 82 이후의 삽입된 잔기 (예, Kabat에 따른 잔기 82a, 82b 및 82c 등)를 포함할 수 있다. 잔기의 Kabat 번호부여는 주어진 항체에 대하여 항체의 서열과 "표준" Kabat 번호부여된 서열의 상동성 영역에서의 정렬에 의해 결정될 수 있다.

"항체 단편"은 전장 항체의 일부, 일반적으로는 그의 항원 결합 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂, 및 Fv 단편, 디아바디, 선형 항체, 단쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 들 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 의미하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적인 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이어서 단일 항원성 부위에 대해 지시된다. 또한, 전형적으로는 다른 결정인자 (에피토프)에 대해 지시되는 다른 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 달리, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 얻어지는 것으로서 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 의미로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler et al., Nature, 256:495 (1975))에 처음으로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조할 수 있다. 또한, "모노클로날 항체"는, 예를 들어 문헌 (Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)) 및 (Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.

본원에서 모노클로날 항체는 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린)를 특이적으로 포함하는데, 여기서 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부는 특정 종으로부터 유도되거나 특정 항체 군 또는 하위군에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그와 상동성이지만, 쇄(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유도되거나 다른 항체 군 또는 하위군에 속하는 항체뿐 아니라, 목적하는 생물학적 활성을 나타낸다면 이러한 항체의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 그와 상동성이다 (미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

비-인간 (예를 들어, 쥐과동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역 유래의 잔기가 목적하는 항체 특이성, 친화성 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류 등의 비-인간 종 (공여 항체)의 초가변 영역 유래의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 또한, 인간화 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형을 행하여 항체 성능을 더 증진시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 초가변 루프에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것들이다. 또한, 인간화 항체는 경우에 따라 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)), (Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)) 및 (Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992))을 참조한다.

"단쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는, 항체의 V_H및 V_L도메인을 포함한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위한 목적하는 구조를 형성할 수 있도록 해주는, V_H도메인과 V_L도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 개관을 위해서는, 문헌 (Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994))을 참조한다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 의미하는데, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 쇄에서 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H) (V_H-V_L)을 포함한다. 너무 짧아서 동일한 쇄상의 2개의 도메인을 짝지을 수 없는 링커를 사용함으로써, 이들 도메인이 다른 쇄의 상보적 도메인과 짝을 짓도록 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성한다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌 (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993))에 더욱 상세하게 기재되어 있다.

본원을 통해 사용된 "선형 항체"라는 표현은 문헌 (Zapata et al. Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995))에 기재된 항체를 의미한다. 요컨대, 이러한 항체는 한쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 일렬로 된 한쌍의 Fd 단편 (V_H-C_H1-V_H-C_H1)을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적이거나 단일특이적일 수 있다.

"모 항체"는 본원에 개시된 바와 같은 항체 변이체에 비해 1개 이상의 아미노산 서열 변형이 결여된 아미노산 서열을 포함하는 항체이다. 따라서, 모 항체는 본원에 개시된 바와 같은 항체 변이체의 상응하는 초가변 영역의 아미노산 서열과 아미노산 서열에서 차이가 있는 1개 이상의 초가변 영역을 갖는 것이 일반적이다. 모 폴리펩티드는 천연 서열 (즉, 자연 발생적인) 항체 (자연 발생적인 대립유전자변이체 포함), 또는 자연 발생적인 서열의 기존의 아미노산 서열 변형 (예, 삽입, 결실 및(또는) 기타 변형)을 갖는 항체를 포함할 수 있다. 모 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것이 바람직하다.

본원에 사용된 바와 같이, "항체 변이체"는 모 항체의 아미노산 서열과 다른 아미노산 서열을 갖는 항체를 의미한다. 바람직하게는, 항체 변이체는 자연에 존재하지 않는 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 이러한 변이체는 반드시 모 항체와 100％ 미만의 서열 동일성 또는 유사성을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 항체 변이체는 모 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성 또는 유사성이 약 75％ 내지 100％ 미만, 바람직하게는 약 80％ 내지 100％ 미만, 보다 바람직하게는 약 85％ 내지 100％ 미만, 보다 더 바람직하게는 약 90％ 내지 100％ 미만, 가장 바람직하게는 약 95％ 내지 100％ 미만인 아미노산 서열을 가질 것이다. 이러한 서열에 대한 동일성 또는 유사성은 본원에서, 서열을 정렬하고 필요에 따라 최대 비율을 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입한 다음, 모 항체 잔기와 동일한 (즉, 동일 잔기) 후보 서열내 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 가변 도메인의 N-말단, C-말단, 또는 내부 연장, 결실, 또는 가변 도메인 외부의 항체 서열내 삽입의 어느 것도 서열 동일성 또는 유사성에 영향을 주는 것으로 해석되지 않는다. 일반적으로 항체 변이체는 그의 1개 이상의 초가변 영역내에 있거나 또는 이 영역과 인접한 1개 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변이체이다.

"아미노산 변형"은 소정의 아미노산 서열의 아미노산 서열에서의 변형을 의미한다. 전형적인 변형으로는 삽입, 치환 및 결실을 들 수 있다.

"아미노산 치환"은 소정의 아미노산 서열내에 존재하는 아미노산 잔기를 다른 상이한 아미노산 잔기로 대체하는 것을 의미한다.

"대체" 아미노산 잔기는 아미노산 서열에서 다른 아미노산 잔기를 대체하거나 치환하는 아미노산 잔기를 의미한다. 대체 잔기는 자연 발생적인 아미노산 잔기 또는 비-자연 발생적인 아미노산 잔기일 수 있다.

"아미노산 삽입"은 1개 이상의 아미노산 잔기를 소정의 아미노산 서열로 도입하는 것을 의미한다.

아미노산 삽입은 "펩티드 삽입"을 포함할 수 있는데, 이 경우에는 펩티드 결합(들)에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드가 소정의 아미노산 서열로 도입된다. 아미노산 삽입이 펩티드의 삽입을 포함하는 경우, 삽입된 펩티드는 그가 자연에 존재하지 않는 아미노산 서열을 갖도록 랜덤 돌연변이유발에 의해 생성될 수 있다.

"초가변 영역에 인접한" 아미노산 변형은 초가변 영역의 N-말단 및(또는) C-말단에서 1개 이상의 아미노산 잔기의 도입 또는 치환을 의미하며, 삽입된 또는 대체 아미노산 잔기(들)의 적어도 하나는 해당 초가변 영역의 N-말단 또는 C-말단 아미노산 잔기와 펩티드 결합을 형성한다.

"자연 발생적인 아미노산 잔기"는 일반적으로 알라닌 (Ala); 아르기닌 (Arg); 아스파라긴 (Asn); 아스파르트산 (Asp); 시스테인 (Cys); 글루타민 (Gln); 글루탐산 (Glu); 글리신 (Gly); 히스티딘 (His); 이소류신 (Ile): 류신 (Leu); 리신 (Lys); 메티오닌 (Met); 페닐알라닌 (Phe); 프롤린 (Pro); 세린 (Ser); 트레오닌 (Thr); 트립토판 (Trp); 티로신 (Tyr); 및 발린 (Val)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 코드에 의해 코딩된 아미노산 잔기이다.

본원에서 "비-자연 발생적인 아미노산 잔기"는 상기 기재된 자연 발생적인 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기이며, 이는 폴리펩티드 쇄에서 인접한 아미노산 잔기(들)과 공유적으로 결합할 수 있다. 비-자연 발생적인 아미노산 잔기의 예로는 노르류신, 오르니틴, 노르발린, 호모세린 및 다른 아미노산 잔기 유사체, 예를 들어 문헌 (Ellman et al. Meth. Enzym. 202:301-336 (1991))에 기재된 것들을 들 수 있다. 이러한 비-자연 발생적인 아미노산 잔기를 생성시키기 위해, 문헌 (Noren et al. Science 244:182 (1989) and Ellman et al., supra)의 방법을 이용할 수 있다. 요컨대, 이러한 방법은 비-자연 발생적인 아미노산 잔기를 갖는 서프레서 (suppressor) tRNA를 화학적으로 활성화한 다음, 상기 RNA를 시험관내 전사 및 번역하는 것을 포함한다.

"노출된" 아미노산 잔기는 그의 표면의 적어도 일부가 용액 중의 폴리펩티드 (예, 항체 또는 폴리펩티드 항원)에 존재하는 경우에 용매에 어느 정도 노출된 잔기이다. 바람직하게는, 노출된 아미노산 잔기는 그의 측쇄 표면 영역의 약 1/3 이상이 용매에 노출된 잔기이다. 잔기가 노출되었는지 그렇지 않은지를 결정하는데 이용할 수 있는 방법으로는 폴리펩티드의 분자 모델 또는 구조의 분석을 비롯한 여러 방법들이 있다.

"하전된" 아미노산 잔기는 전체 순 (net) 양전하 또는 전체 순 음전하를 보유하는 잔기이다. 양으로 하전된 아미노산 잔기로는 아르기닌, 리신 및 히스티딘을 들 수 있다. 음으로 하전된 아미노산 잔기로는 아스파르트산 및 글루탐산을 들 수 있다.

본원에서 "표적 항원"이라는 용어는 본원에 정의된 모 항체 및 항체 변이체 둘 다가 결합하는 소정의 항원을 의미한다. 표적 항원은 폴리펩티드, 탄수화물, 핵산, 지질, 합텐 또는 기타 자연 발생 화합물 또는 합성 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 표적 항원은 폴리펩티드이다. 항체 변이체는 일반적으로 모 항체보다 더 높은 결합 친화성으로 표적 항원과 결합하지만, 모 항체는 일반적으로 표적 항원에 대해 단지 약 1×10^-5M, 바람직하게는 단지 약 1×10^-6M의 결합 친화성 (K_d) 값을 갖는다.

본원에서 "결합 속도"는 항체가 용액 중의 항원과 결합체를 형성하는 온-속도 상수 (k₁)를 의미한다.

본원에서, "해리 속도"는 오프-속도 상수 (k_-1), 또는 항체와 항원 사이에서의 좁은 범위의 상호작용의 파괴를 의미한다.

본원에서 "전하 상보성"은 항체의 아미노산 잔기(들)과 항원의 아미노산 잔기(들) 사이의 정전기적 상호작용을 의미한다. 본원에서 전하란 항체가 항원과 결합하는 경우에 항체의 아미노산 잔기(들) 근처에서의 항원의 국소적 전하를 의미한다. 전하 상보성을 증가시키기 위해, 예를 들어, 항체내의 음으로 하전된 항원, 즉 음으로 하전된 여러 아미노산 잔기(들)(예, D 또는 E)에 대한 양으로 하전된 항체를, 중성 잔기(들)(예, N 또는 T) 또는 양으로 하전된 잔기 (R 또는 K)로 대체하여 음전하를 중화 또는 역전시킴으로써 음으로 하전된 항원을 더 잘 보완한다.

"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로부터 동정 및 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과의 항체로, (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균일한 정도로 정제될 것이다. 단리된 항체는 그 항체의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포내의 원위치의 항체를 포함한다. 그러나, 단리된 항체는 통상적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.

"치료"는 치료적 조치 및 예방적 또는 억제적 조치를 모두 의미한다. 치료를 필요로 하는 대상은 질환이 예방되어야 하는 대상 뿐만 아니라 이미 질환을 앓고 있는 대상도 포함한다.

"질환"은 항체 변이체를 사용한 치료에 의해 호전되는 모든 증상이다. 이것은 포유동물이 해당 질환에 걸리게 하는 병적 증상을 비롯하여 만성 및 급성 질환 또는 질병을 포함한다.

치료를 위한 "포유동물"은 인간, 가축, 및 농장 동물, 비인간 영장류, 및 동물원 동물, 경기용 동물, 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 말, 고양이, 소 등을 포함하는 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 의미한다.

"단리된" 핵산 분자는 항체 핵산의 천연 공급원에서 그와 통상적으로 결합하는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 동정 및 분리된 핵산 분자이다. 단리된 핵산 분자는 자연에 존재하는 그의 형태 또는 환경과는 다르다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 단리된 핵산 분자는 통상적으로 항체를 발현시키는 세포내에 포함된 핵산 분자를 포함하며, 예를 들어 핵산 분자는 천연 세포의 염색체 위치와 다른 염색체 위치에 존재한다.

"조절 서열"이라는 표현은 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열로는, 예를 들면 프로모터, 임의로는 오퍼레이터 서열, 및 리보좀 결합 부위를 들 수 있다. 진핵생물 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 (presequence) 또는 분비 리더의 DNA는 해당 폴리펩티드가 그의 분비에 관여하는 전단백질 (preprotein)로서 발현되는 경우에 상기 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며; 리보좀 결합 부위는 코딩 서열의 번역을 촉진하도록 배치되는 경우에 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 통상적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치하면서 리딩 상 (reading phase)인 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.

본원에 사용된 바와 같이 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 상호 교환적으로 사용되고, 이러한 명칭 모두에는 그의 자손이 포함된다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"라는 용어는 전달 횟수에 상관없이 그들로부터 유도된 1차 대상 세포 및 배양물을 포함한다. 의도적 돌연변이 또는 우연한 돌연변이로 인해, 모든 자손은 DNA 내용에 있어서 정확하게 동일하지 않을 수 있음을 이해해야 한다. 최초 형질전환된 세포에 대해 스크리닝된 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 지닌 돌연변이체 자손이 포함된다. 다른 명칭을 사용하고자 하는 경우, 이는 해당 구문으로부터 분명할 것이다.

II. 본 발명의 수행 방식

본원에서 본 발명은 적어도 부분적으로는 항체 변이체의 제조 방법에 관한 것이다. 모 항체 또는 출발 항체는 이러한 항체를 생성시키는데 이용할 수 있는 당업계의 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 항체를 생성시키는 전형적인 방법은 하기 섹션들에 보다 상세히 기술되어 있다. 또한, 본 발명에서는 본원의 항체 변이체를 생성시키는 대상 항체에 대한 이용가능한 정보 (예, 아미노산 서열 데이타)를 이용할 수 있기 때문에 모 항체의 실제적인 물리적 제조를 필요로 하지 않는다.

모 항체는 대상 표적 항원에 대해 지시된다. 바람직하게는, 표적 항원은 생물학적으로 중요한 폴리펩티드이며, 항체를 질병 또는 질환으로 고통받는 포유동물에게 투여함으로써 이 포유동물에게 치료 이익을 제공할 수 있다. 그러나, 비-폴리펩티드 항원 (예, 종양-관련 당지질 항원; 미국 특허 제5,091,178호 참조)에 대해 지시되는 항체가 또한 고려된다.

항원이 폴리펩티드인 경우, 항원은 막횡단 분자 (예, 수용체) 또는 리간드, 예를 들어 성장 인자일 수 있다. 예시적인 항원으로는 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예를 들어, 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트(von Willebrands) 인자; 항-응고 인자, 예를 들어, 단백질 C; 심방성 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성자, 예를 들어, 유로키나제 또는 인간 요 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성자(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES (활성화시 정상적으로 T-세포 발현 및 분비되어 조절됨); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민; 뮐러리안-억제 물질; 릴렉신 A-쇄; 릴렉신 B-쇄; 프로릴렉신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예를 들어, 베타-락타마제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA), 예를 들어 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 단백질 A 또는D; 류마티스양 인자; 신경영양 인자, 예를 들어, 골-유래의 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어, aFGF 및 bFGF; 상피 성장 인자 (EGF); 변형 성장 인자 (TGF), 예를 들어, TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인테루킨 (IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-10; 수퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 쇠퇴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어, AIDS 엔벨로프의 일부 등; 운반 단백질; 호밍 (homing) 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예를 들어 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 나열된 폴리펩티드의 임의의 단편과 같은 분자가 포함된다.

본 발명에 포함되는 항체에 대한 바람직한 분자 표적으로는 CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 및 CD34; ErbB 수용체 군의 구성원, 예를 들어 EGF 수용체, HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 세포 부착 분자, 예를 들어 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αv/β3 인테그린 (그의 알파 또는 베타 서브유닛 (예, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체) 포함); 성장 인자, 예를 들어 VEGF 및 TF; IgE; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C 등을 들 수 있다.

항체를 생성시키는데 사용되는 항원은 그의 천연 공급원으로부터 단리하거나, 재조합 방법으로 생상하거나, 또는 기타 합성 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 또는, 천연 또는 재조합 항원을 포함하는 세포를 항체의 제조를 위한 면역원으로 사용할 수 있다.

모 항체는 표적 항원에 대해 기존의 강한 결합 친화성을 가질 수 있다. 예를 들어, 모 항체는 대상 항원과 단지 약 1×10^-7M, 바람직하게는 단지 약 1×10^-8M, 가장 바람직하게는 단지 약 1×10^-9M의 결합 친화성 (K_d) 값으로 결합할 수 있다.

모 항체는 바람직하게는 키메라 (예, 인간화) 항체 또는 인간 항체이다. 또한, 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체는 임의로는 "친화성 성숙된" 항체이다. 항체를 친화성 성숙시키는 기술은 본원에서 "관련 선행기술의 기재"라는 제목의 섹션에서 언급된다. 한 실시양태에서, 모 항체는 항체 단편이거나, 또는 전체 항체의 항체 단편 (예, Fab 단편)을 제조하여 재조합 방법으로 생산된 변이체를 쉽게 스크리닝한다. 바람직하게는, 모 항체 및 항체 변이체가 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)와 결합한다. 예시적인 모 항체는 항-VEGF 항체, 예를 들어 Y0101 (본원의 도 1A-B); Y0317 (WO98/45331, 참고로 본원에 명시적으로 포함됨); 인간화 항-VEGF F(ab)-12 (WO98/45331, 참고로 본원에 명시적으로 포함됨); Y0192 (WO98/45331, 참고로 본원에 명시적으로 포함됨); Y0238-3 (WO98/45331, 참고로 본원에 명시적으로포함됨); Y0239-19 (WO00/29584, 참고로 본원에 명시적으로 포함됨); Y0313-2 (WO00/29584, 참고로 본원에 명시적으로 포함됨) 또는 VNERK 돌연변이체 (WO00/29584, 참고로 본원에 명시적으로 포함됨)의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 포함한다.

본원에서 항체 변이체는 바람직하게는 모 항체에 비해 더 빠른 항원 결합 속도를 나타낸다. 결합 속도는 결합체의 형성이 시간의 함수로서 관찰될 수 있는 임의의 방법에 의해 결정될 수 있다. 가장 폭넓게 사용되는 방법은 BIAcore(등록상표) 분석법이며, 이 방법에서는 항체가 바이오센서 표면상에 고정된 항원에 결합하는 것을 측정한다 (문헌 (Rich & Myszka, Curr. Opin. Biotechnol. 11:54-61 (2000))에서 검토됨). 또는, 결합 속도는 본원의 실시예에서와 같이 (고상 표면에서 보다는) 용액 중에서 항원과 항체를 혼합하고 결합체 형성 속도를 항원 농도의 함수로서 측정함으로써 측정한다. 이 경우, 내재성 또는 인공 형광단 (fluorophore)에 의해 형광을 측정하는 방법을 비롯해서 다양한 검출 방법이 가능하다 (문헌 (Linthicum et al., Comb. Chem. High Throughput Screen 4:439-449 (2001))에서 검토됨). 바람직하게는, 결합 속도는 본원의 실시예의 방법에 따라 측정한다. 가장 바람직하게는, 항체 변이체의 결합 속도는 모 항체의 결합 속도보다 약 5 배 또는 약 10 배 (예, 최대 약 1,000 배 또는 최대 약 10,000 배) 더 빠르다.

또한, 항체 변이체는 모 항체보다 표적 항원에 대해 더 강한 결합 친화성을 갖는 것이 일반적이다. 항체 "결합 친화성"은, 예를 들어 평형 방법 (예, 효소-연결 면역흡착 분석법 (ELISA) 또는 방사성면역분석법 (RIA)), 또는 반응속도법 (예, BIACORE(등록상표) 분석법)에 의해 결정할 수 있다. 항체 변이체는 표적 항원에 대해, 바람직하게는 항원에 대한 모 항체의 결합 친화성보다 약 2 배 이상 더 강한 결합 친화성, 보다 바람직하게는 약 5 배 이상 더 강한 결합 친화성, 보다 더 바람직하게는 약 10 배 또는 100 배 이상 더 강한 결합 친화성 (예, 최대 약 1,000 배 또는 최대 약 10,000 배 더 강한 결합 친화성)을 갖는다. 바람직하거나 필요한 결합 친화성의 증가는 모 항체의 초기 결합 친화성에 따라 좌우될 수 있다.

또한, 항체는, 예를 들어 치료제로서 그의 "효능" 또는 제약 활성 및 잠재적 효능을 평가하기 위해서 다른 "생물학적 활성 분석법"으로 처리할 수 있다. 이러한 분석법은 당업계에 공지되어 있으며, 항체에 대한 표적 항원 및 의도된 용도에 좌우된다. 그러한 예로는 각질세포 단층 부착 분석법 및 CD11a에 대한 혼합 림프구 반응 (MLR) 분석법 (WO 98/23761 참조); 종양 세포 성장 억제 분석법 (예를 들어, WO 89/06692에 기재됨); 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC) 및 보체-매개 세포독성 (CDC) 분석법 (미국 특허 제5,500,362호); 아고니스트 활성 또는 조혈 분석법 (WO 95/27062 참조); 삼중수소화 티미딘 혼입 분석법; 및 VEGF와 같은 분자에 반응하는 세포의 대사 활성을 측정하는 알라마 블루 (alamar blue) 분석법을 들 수 있다. 항체 변이체는 바람직하게는 선택된 생물학적 활성 분석법에서 이 분석법의 모 항체의 생물학적 활성보다 적어도 약 2 배 더 큰 효능 (예, 약 2 배에서 약 1,000 배까지 또는 심지어 약 10,000 배까지 향상된 효능), 바람직하게는 적어도 약 20 배 더 큰 효능, 보다 바람직하게는 적어도 약 50 배 더 큰 효능, 때로는 적어도 약 100 배 또는 200 배 더 큰 효능을 갖는다.

본 발명은 향상된 기능 (예, 향상된 결합 속도 및(또는) 친화성)에 대해 스크리닝될 수 있는 항체 변이체를 제조하는 체계적인 방법을 제공한다. 바람직하게는, 항체와 항원 사이의 전하 상보성을 증가시키는 항체내 후보 아미노산 변형(들)을 결정하는, 항체-항원에 관한 이용가능한 정보를 평가할 것이다. 분자 모델은 이 결합체의 X-선 결정 구조 또는 핵 자기 공명 (NMR) 구조로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Amit et al. Science 233:747-753 (1986); and Muller et al. Structure 6(9): 1153-1167 (1998))을 참조한다. 또는, 예를 들어 결정 구조가 이용가능하지 않은 경우에는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 항체/항원 결합체의 분자 모델을 생성시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 (Levy et al. Biochemistry 28:7168-7175 (1989); Bruccoleri et al. Nature 335: 564-568 (1998); and Chothia et al. Science 233: 755-758 (1986))을 참조한다).

한 실시양태에서, 변형은 모 항체의 1개 이상의 초가변 영역내에 있거나 또는 이 영역과 인접한 1개 이상의 하전된 아미노산 잔기의 삽입을 포함한다. 이 실시양태에서, 삽입된 잔기(들)은 일반적으로 항체-항원 결합체를 분석함으로써 결정되는 바와 같이 항원과 결합하지 않는다. 일반적으로, 전하 상보성을 증가시키는 약 1개 내지 약 20개, 또는 약 40개 이하의 아미노산 잔기를 삽입할 수 있다.

가장 바람직한 실시양태에서, 변형은 1개 이상의 초가변 영역내에 있거나 또는 이 영역과 인접한 1개 이상의 표적 잔기의 치환을 포함한다. 본 발명의 이러한 실시양태에 따라, 표적 잔기는 다음과 같이 선택할 수 있다:

1) 바람직하게는, 잔기는 용액에 노출되며, 예를 들어 그의 측쇄 표면 영역의 1/3 이상이 용매에 노출된다. 어떤 한가지 이론에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 이는 아마도 묻혀있는 잔기의 돌연변이를 통해 항체의 불안정화를 회피하기 위한 것으로 생각된다.

2) 바람직하게는, 정전기 인력이 거리의 함수로서 줄어들 수 있기 때문에 잔기는 결합된 상태로 항원의 적어도 약 20 Å (바람직하게는 약 16 Å) 이내에 존재한다.

3) 바람직하게는, 직접 접촉하는 잔기의 돌연변이가 가능하게는 결합된 결합체를 불안정화할 수 있기 때문에 잔기는 결합된 상태로 항원과 직접 접촉하지 않는다.

4) 초가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)내에 존재하는 잔기가 그렇지 않은 잔기에 비해 바람직한데, 그 이유는 이러한 영역이 환자에서 면역원성 반응을 덜 유도할 수 있다는 표시가 있기 때문이다.

5) 일반적으로, 항체와 항원 사이의 전하 상보성을 증가시킬 수 있는 잔기들만이 변형에 있어서 고려된다.

따라서, 실시예에 추가로 예시된 본 발명의 바람직한 실시양태에 따라, 모 항체가 결합하는 경우에 항원의 약 20 Å 이내에 존재하는 1개 이상의 노출된 초가변 영역 아미노산 잔기(들)을 동정하며, 1개 이상의 이러한 노출된 잔기(들)을 중성 또는 반대로 하전된 대체 아미노산 잔기로 치환한다.

본 발명은 본원의 기준에 따른 단일 아미노산 치환을 고려하지만, 바람직하게는 2개 이상의 치환, 예를 들어 가변 도메인 당 약 2개부터 약 10개 또는 약 20개의 치환까지 (즉, 두 가변 도메인에 대해 각각 최대 약 20개 또는 약 40개의 아미노산 치환) 포함한다. 본원에서 항체와 항원 사이의 전하 상보성을 증가시키는 변형은 항체의 초가변 영역내의 다른 아미노산 서열 변형 또는 항체의 다른 영역내의 아미노산 서열 변형과 합할 수 있다.

한 실시양태에서, 본원에서 본 발명에 따른 변형(들)을 갖는 초가변 영역은 CDR L1, CDR L2, 루프 H1 및 CDR H3으로 이루어진 군, 가장 바람직하게는 CDR L1로부터 선택된다. 또한, 2개 이상의 초가변 영역, 예를 들어 CDR L1, CDR L2, 루프 H1 및 CDR H3의 2개 이상에서의 변형을 조합할 수 있다. 예를 들어, 항체 변이체는 CDR L1에서 1개 이상의 변형을 갖는 경쇄 가변 도메인, 및 루프 H1 및(또는) CDR H3에서 1개 이상의 변형을 갖는 중쇄 가변 도메인을 포함할 수 있다.

본 발명의 한 측면에 따라, 항체 변이체 또는 항체 가변 도메인은 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 26L, 27L, 28L, 30L, 31L, 32L, 49L, 50L, 52L, 53L, 54L, 56L, 93L 또는 94L 중 1개 이상에서 및(또는) 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 25H, 28H, 30H, 54H, 56H, 61H, 62H, 64H, 97H, 98H, 99H 및(또는) 100aH 중 1개 이상에서 본 발명에 따른 하나 이상의 치환을 갖는다. 또한, 이러한 위치에서의 치환을 조합할 수 있다. 예를 들어, 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 26L, 27L, 28L 또는 30L의 2개, 3개 또는 4개에서의 치환을 조합할 수 있다. 변형된 중쇄 가변 도메인 (예를 들어, 위치 28H 및(또는) 100aH에서의 치환을 가짐)을 변형된 경쇄 가변 도메인 (예를 들어, 위치 26L, 27L, 28L 및(또는) 30L에서의 치환을 가짐)과 조합할 수 있다. 본원에서 잔기 번호부여는 문헌 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))에 따른다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 따라 얻을 수 있는 항체 변이체 또는 변형된 항체 가변 도메인을 제공한다. 바람직하게는, 항체 변이체 또는 변형된 항체 가변 도메인은 항체 변이체와 그가 결합하는 항원 사이의 전하 상보성을 증가시키는, 항체 변이체의 초가변 영역(들)내 또는 이 영역에 인접한 아미노산 치환(들)을 포함한다. 이러한 변형된 가변 도메인의 예로는 SATKKIKNYLN (서열 6) 또는 SATKKITNYLN (서열 7)로부터 선택되는 CDR L1 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인, 예를 들어 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인; 및 T28D 및 S100aR의 치환을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 예를 들어 서열 5, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10의 아미노산 서열을 들 수 있다. 임의로는, 이러한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 서열을 항체 변이체, 예를 들어 서열 4의 경쇄 가변 도메인 서열 및 서열 5, 8, 9 또는 10으로부터 선택된 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항체 변이체에서 조합한다. 바람직하게는, 항체 변이체는 그의 경쇄 가변 도메인내에서 서열 7의 CDR L1 서열 및 그의 중쇄 가변 도메인내에서 (T28D, S100aR) 치환을 포함하며, 이러한 치환의 조합을 본원의 실시예에서 "34-TKKT" 변이체로 언급한다. 이러한 치환 (V_H-(T28,S100aR)+V_L-(S26T,Q27K,D28K,S30T))은 Y0101, Y0317, 인간화항-VEGF F(ab)-12, Y0192, Y0238-3, Y0239-19, Y0313-2, 및 VNERK 돌연변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항-VEGF 항체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 모 항체에서 형성시킬 수 있다. 예를 들어, "34-TKKT+VNERK+H97Y" 변이체는 "34-TKKT", "H97Y" 및 VNERK 변이체 (각각, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에 대한 서열 4 및 8)의 변형을 조합하여 생성시킨다.

아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조한다. 이러한 방법으로는 모 항체의 미리 제조된 변이체 또는 비-변이체 형태의 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발을 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 변이체를 제조하는 바람직한 방법은 부위-지시된 돌연변이유발이다 (예를 들어, 문헌 (Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)) 참조). 또한, 핵산 서열은 목적하는 아미노산 서열이 개념적으로 떠오른다면 합성 방법으로 제조할 수도 있다. 펩티드 합성, 펩티드 라이게이션 또는 기타 방법에 의해 항체 변이체를 제조할 수도 있다.

항체 변이체의 제조 후, 이 분자의 활성을 모 항체와 비교하여 결정할 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 이러한 결정은 항체의 결합 속도 및(또는) 결합 친화성 및(또는) 기타 생물학적 활성을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 항체 변이체의 페널을 제조하여 항원에 대한 결합 속도 및(또는) 결합 친화성 및(또는) 하나 이상의 분석에서의 효능에 대하여 스크리닝한다. 초기 스크리닝으로부터 선택된 항체 변이체의 하나 이상을 하나 이상의 추가의 기능 분석법으로 임의로 처리하여 항체 변이체(들)이 하나 이상의 분석에서 향상된 활성을 갖는지를 확인한다.

모 항체의 초가변 영역(들)에서의 상기 변형(들)을 이외에, 1개 이상의 초가변 영역의 아미노산 서열에서 다른 변형을 형성시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 아미노산 변형은 다른 초가변 영역 잔기의 결실, 삽입 또는 치환과 조합할 수 있다. 또한, FR 잔기의 1개 이상의 변형 (예, 치환)을 모 항체내에 도입할 수 있는데, 이로서 항원에 대한 항체 변이체의 결합 친화성이 향상된다. 변형될 프레임워크 영역 잔기의 예로는 항원과 직접 비-공유 결합하는 것 (Amit et al. Science 233:747-753 (1986)); CDR의 형태와 상호작용하거나/영향을 주는 것 (Chothia et al. J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); 및(또는) V_L- V_H계면 (EP 239 400B1)에 관여하는 것을 들 수 있다. 이러한 아미노산 서열 변형은 모 항체에 존재하거나, 본원에서 아미노산 삽입(들)과 동시에 행해지거나, 또는 본원에서 본 발명에 따른 아미노산 변형(들)을 갖는 변이체가 생성된 후에 행해질 수 있다. 모 항체 또는 항체 변이체의 불변 도메인 서열(들)에서의 변형, 예를 들어 항체 이펙터 기능(들)을 향상시키거나 감소시키는 것들이 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, 명시적으로 본원에 참고로 포함되는 문헌 (미국 특허 제6,194,551B1호; WO 99/51642; Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000); WO00/42072 (Presta); 및 Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)) 참조).

항체 변이체는 흔히 항체의 의도된 용도에 따라 다른 변형법으로 처리할 수있다. 이러한 변형은 아미노산 서열의 추가 변형, 이종 폴리펩티드(들)과의 융합 및(또는) 공유결합 변형을 포함할 수 있다. 아미노산 서열 변형에 대해, 예시적인 변형은 상기에 상술되어 있다. 예를 들어, 항체 변이체의 적절한 형태를 유지하는 데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기를 일반적으로 세린으로 치환하여 분자의 산화적 안정성을 향상시키고, 비정상적 가교 결합을 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)을 항체에 부가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다 (특히, 항체가 항체 단편, 예를 들어 Fv 단편인 경우). 또 다른 유형의 아미노산 변이체는 변형된 글리코실화 패턴을 갖는다. 이는 항체에 존재하는 1개 이상의 탄수화물 잔기를 결실시키고(시키거나) 항체에 존재하지 않는 1개 이상의 글리코실화 부위를 부가하여 달성할 수 있다. 항체의 글리코실화는 통상적으로 N-연결된 것이거나 O-연결된 것이다. N-연결된 것이란 탄수화물 잔기의 아스파라긴 잔기 측쇄로의 부착을 의미한다. 트리펩티드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기의 아스파라긴 측쇄로의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드내 이러한 트리펩티드 서열 각각의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위를 생성시킨다. O-연결된 글리코실화란 당인 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나가 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌으로 부착됨을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신을 사용할 수도 있다. 글리코실화 부위의 항체로의 부가는, 아미노산 서열이 상기 기재된 트리펩티드 서열의 1개 이상을 함유하도록 상기 아미노산 서열을 변형시킴으로써 편리하게 달성한다 (N-연결된 글리코실화부위의 경우). 이러한 변형은 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 원래 항체의 서열로 부가하거나 상기 잔기에 의해 치환하여 행할 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

따라서, 모 항체일 수 있는 항체를 제조하는 기술은 하기와 같이 본원에 상술된 기술에 따른 변형을 필요로 한다:

A. 항체 제조

(i) 항원 제조

임의로 다른 분자에 접합된 가용성 항원 또는 그의 단편을 항체 생성을 위한 면역원으로 사용할 수 있다. 막횡단 분자, 예를 들어 수용체의 경우, 이들의 단편 (예, 수용체의 세포외 도메인)을 면역원으로 사용할 수 있다. 또는, 막횡단 분자를 발현시키는 세포를 면역원으로 사용할 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예, 암세포주)으로부터 유도되거나 또는 막횡단 분자를 발현시키는 재조합 기술에 의해 형질전환된 세포일 수 있다. 항체의 제조에 유용한 다른 항원 및 그의 형태는 당업자에게 자명할 것이다.

(ii) 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 관련 항원과 보조제를 피하 (sc) 또는 복강내 (ip)로 여러회 주사함으로써 동물에서 생성시키는 것이 바람직하다. 면역화될 종에서 면역원성을 나타내는 단백질에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있으며, 예를 들면 이관능성 물질 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬기임)을 사용하여 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH), 혈청 알부민, 소의 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 관련 항원을 접합시키는 것이 유용할 수 있다.

예를 들어, 상기 단백질 또는 접합체 100 ㎍ 또는 5 ㎍ (각각 토끼 또는 마우스의 경우)을 3배 용적의 프로인트 (Freund's) 완전 보조제와 합한 다음 이 용액을 여러 부위에 피내 주사함으로써, 동물을 상기 항원, 면역원성 접합체 또는 유도체에 대해 면역화시킨다. 1개월 후, 프로인트 완전 보조제 중의 펩티드 또는 접합체의 최초 양의 1/5 내지 1/10을 여러 부위에 피하 주사함으로써 상기 동물을 추가로 자극한다. 7일 내지 14일 후에, 상기 동물을 채혈하여 혈청의 항체 역가를 분석한다. 역가가 그래프의 평탄역에 도달할 때까지 동물을 추가로 자극한다. 바람직하게는, 동일한 항원을 사용하되 단백질에 접합시키고(시키거나) 다른 가교결합 시약을 통해 접합시켜 동물을 추가로 자극할 수 있다. 접합체는 또한 재조합 세포 배양물에서 단백질 융합체로서 만들 수도 있다. 또한, 백반과 같은 응집제를 적합하게 사용하여 면역 반응을 증진시킨다.

(iii) 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조하거나, 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조할 수 있다.

하이브리도마 방법에서는, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물 (예를 들어, 햄스터 또는 마카크 (macaque) 원숭이)을 상기 기재된 바와 같이 면역화시켜, 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생성시키거나 생성시킬 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 림프구를 시험관내 면역화시킬 수도 있다. 이후에, 적합한 융합화제, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 림프구를 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

이와 같이 제조된 하이브리도마 세포를 융합되지 않은 모 골수종 세포의 성장이나 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 바람직하게 함유하는 적합한 배양 배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들어 모 골수종 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우에는, 상기 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로, HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합되고, 선별된 항체 생성 세포에 의한 항체의 안정한 고수준 생성을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 세포이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 쥐 골수종 세포주, 예를 들어 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것 (미국 캘리포니아주 샌디에고에 소재하는 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능함) 및 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 매릴랜드주 로크빌에 소재하는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 입수가능함)이다. 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 또한 문헌 (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))에 기재되어 있다.

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지를 상기 항원에 대해 지시되는 모노클로날 항체의 생성에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법으로 측정하거나, 또는 시험관내 결합 분석법, 예를 들어 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소 연결 면역흡착 분석법 (ELISA)으로 측정한다.

원하는 특이성, 친화성 및(또는) 활성의 항체를 생성하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 클론을 제한 희석 방법으로 서브클로닝하고, 표준 방법으로 성장시킬 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적에 적합한 배양 배지의 예로는 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지 등이 있다. 또한, 하이브리도마 세포를 동물에서 복수 종양으로서 생체내 성장시킬 수 있다.

상기 서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 종래의 이뮤노글로불린 정제 방법, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피 등을 통해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리시키는 것이 적합하다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 이용하여 쉽게 단리 및 서열결정한다. 상기 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터내로 위치시킨 다음, 숙주 세포, 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니스 (Chinese) 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생성시키지 않는 골수종 세포를 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성할 수 있다. 항체의 재조합 생산에 대하여는 하기에 보다 상세히 기재되어 있다.

추가의 실시양태에서, 문헌 (McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990))에 기재된 기술을 이용하여 생성시킨 항체 파아지 라이브러리로부터 항체 또는 항체 단편을 단리시킬 수 있다. 문헌 (Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991))에는 파아지 라이브러리를 사용하여 쥐 항체와 인간 항체를 각각 단리하는 방법이 기재되어 있다. 이후에 간행된 문헌에는 연쇄 셔플링 (shuffling)에 의한 고 친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생성 (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992))뿐만 아니라, 매우 큰 파아지 라이브러리를 제작하기 위한 전략으로서의 생체내 재조합과 조합 감염법이 기재되어 있다 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체를 단리하기 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 가능한 대안이다.

DNA는, 예를 들어 상동성 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 대체하거나 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전부 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다.

통상적으로, 항체의 불변 도메인을 이러한 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드들로 치환하거나 또는 항체의 하나의 항원-결합 부위의 가변 도메인을 상기 폴리펩티드들로 치환하여, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 부위 및 다른 항원에 대한 특이성을 갖는 또 다른 항원-결합 부위를 포함하는 2가 키메라 항체를 생성시킨다.

(iv) 인간화 항체 및 인간 항체

인간화 항체에는 비-인간 공급원으로부터 유래된 1개 이상의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트 (import)" 잔기로 언급되며, 전형적으로는 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻는다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 원형 인간 가변 도메인보다 실질적으로 더 적은 서열이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체의 유사한 부위에서 유래된 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.

인간화 항체 제조에 사용될 경쇄 및 중쇄 둘 다의 인간 가변 도메인을 선택하는 것은 항원성을 감소시키는 데 매우 중요하다. 소위 "베스트-피트 (best-fit)" 방법에 따라, 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리를 대상으로 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 스크리닝한다. 이어서, 설치류의 서열과 가장 유사한 인간 서열을 인간화 항체에 대한 인간 FR로서 수용한다 (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)). 다른 방법은 인간 항체 서열의 특정 하위군을 기초로 하는 "컨센서스" 프레임워크를 사용한다. 이와 동일한 컨센서스 프레임워크는 여러 상이한 인간화 항체에 대하여 사용할 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993)).

또한, 항원에 대한 높은 친화성 및 다른 유리한 생물학적 성질을 보유하도록 항체를 인간화하는 것도 중요하다. 이 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화 생성물의 분석 방법으로 인간화 항체를 제조한다. 3차원 이뮤노글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하며 당업자에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 설명하고 보여주는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이 디스플레이의 조사는 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 항원과 결합하는 후보 이뮤노글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 원하는 항체 특성이 얻어지도록, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화성이 증가되도록 수용 서열과 임포트 서열로부터 선택 및 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 주는 데 있어서 직접적 및 가장 실질적으로 관여한다.

또는, 면역화하는 경우 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 형질전이 (transgenic) 동물 (예, 마우스)을 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 동종접합 결실이 내인성 항체 생산을 완전히 억제하는 것으로 기술되었다. 이러한 생식세포 돌연변이 마우스에서 인간 생식세포 이뮤노글로불린 유전자 어레이의 전달은 항원 접종시 인간 항체를 생산할 것이다. 예를 들어, 문헌 (Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); and Duchosal et al. Nature 355:258 (1992))을 참조한다. 또한, 인간 항체는 파아지-디스플레이 라이브러리로부터 유도될 수도 있다 (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)).

(v) 항체 단편

항체 단편을 생성하기 위한 다양한 기술이 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 원형 항체의 단백질분해 절단을 통해 유도된 것이었다 (예를 들어, 문헌(Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); Brennan et al., Science, 229:81 (1985)) 참조). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 상기에서 논의한 항체 파아지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수할 수 있고, 화학적으로 커플링시켜 F(ab')₂단편을 형성할 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 다른 방법에 따르면, F(ab')₂단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 기타 기술은 당업자에게는 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185 참조).

(vi) 다중특이적 항체

다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는다. 이러한 분자는 통상적으로 단지 2개의 항원과 결합할 것이지만 (즉, 이중특이적 항체, BsAb), 추가의 특이성을 갖는 항체, 예를 들어 삼중특이적 항체는 본원에 사용되는 경우 이러한 표현에 포함된다. BsAb의 예로는 종양 세포 항원에 대해 지시되는 하나의 아암 (arm) 및 세포독성 개시 분자에 대해 지시되는 다른 아암을 갖는 것, 예를 들어 항-FcγRI/항-CD15, 항-p185^HER2/FcγRIII (CD16), 항-CD3/항-악성 B-세포 (1D10), 항-CD3/항-p185^HER2, 항-CD3/항-p97, 항-CD3/항-신장세포 암종, 항-CD3/항-OVCAR-3, 항-CD3/L-D1 (항-결장 암종), 항-CD3/항-멜라닌세포 자극 호르몬유사체, 항-EGF 수용체/항-CD3, 항-CD3/항-CAMA1, 항-CD3/항-CD19, 항-CD3/MoV18, 항-신경세포 부착 분자 (NCAM)/항-CD3, 항-폴레이트 결합 단백질 (FBP)/항-CD3, 항-팬(pan) 암종 관련 항원 (AMOC-31)/항-CD3; 종양 항원에 특이적으로 결합하는 하나의 아암 및 독소에 결합하는 하나의 아암을 갖는 BsAb, 예를 들어 항-사포린/항-Id-1, 항-CD22/항-사포린, 항-CD7/항-사포린, 항-CD38/항-사포린, 항-CEA/항-리신 A 쇄, 항-CEA/항-빈카 알칼로이드; 효소에 의해 활성화된 전구약물을 전환시키는 BsAb, 예를 들어 항-CD30/항-알칼리 포스파타제 (미토마이신 포스페이트 전구약물의 미토마이신 알콜로의 전환을 촉매함); 피브린용해제로 사용될 수 있는 BsAb, 예를 들어 항-피브린/항-조직 플라스미노겐 활성자 (tPA), 항-피브린/항-유로키나제-유형 플라스미노겐 활성자 (uPA); 면역 결합체를 세포 표면 수용체로 표적화하는 BsAb, 예를 들어 항-저밀도 지단백질 (LDL)/항-Fc 수용체 (예, FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII); 감염성 질병의 치료에 사용되는 BsAb, 예를 들어 항-CD3/항-단순포진 바이러스 (HSV), 항-T-세포 수용체:CD3 결합체/항-인플루엔자, 항-FcγR/항-HIV; 시험관내 또는 생체내의 종양 검출을 위한 BsAb, 예를 들어 항-CEA/항-EOTUBE, 항-CEA/항-DPTA, 항-p185^HER2/항-합텐; 백신 보조제로서의 BsAb; 및 진단 도구로서의 BsAb, 예를 들어 항-토끼 IgG/항-페리틴, 항-양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)/항-호르몬, 항-소마토스타틴/항-물질 P, 항-HRP/항-FITC를 들 수 있다. 삼중특이적 항체의 예로는 항-CD3/항-CD4/항-CD37, 항-CD3/항-CD5/항-CD37 및 항-CD3/항-CD8/항-CD37을 들 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편(예, F(ab')₂이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.

이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장 이중특이적 항체의 전통적인 제법은 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초하며, 여기에서 2개의 쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 배열로 인해, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 통상적으로, 친화성 크로마토그래피 단계로 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생성물의 수율이 낮다. 유사한 방법이 WO 93/08829 및 문헌 (Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991))에 개시되어 있다.

다른 방법에 따라, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체의 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 융합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이다. 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합물의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합물, 및 원하는 경우 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 유기체로 공동형질감염시킨다. 이렇게 하면, 제작에 사용된 동등하지 않은 비율의 3가지 폴리펩티드 쇄가 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 3가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동등한 비율의 2가지 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현이 높은 수율을 제공하는 경우 또는 비율이 특별히 중요하지 않은 경우, 2가지 또는 3가지 모든 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터내에 삽입할 수 있다.

이 방법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한 아암에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄와 다른 아암에서 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 단지 1/2에서의 이뮤노글로불린 경쇄의 존재가 손쉬운 분리 방식을 제공하므로, 이러한 비대칭 구조가 원하지 않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 방법은 WO 94/04690에 기술되어 있다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은, 예를 들면 문헌 (Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121: 210 (1986))을 참조한다.

WO 96/27011에 기재된 다른 방법에 따라, 한 쌍의 항체 분자들 사이의 계면을, 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이량체의 비율을 최대화하도록 조작할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 1개 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예를 들면, 티로신 또는 트립토판)으로 대체한다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄 (예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 계면 상에, 큰 측쇄(들)과 동일하거나 그와 유사한 크기의 보충적 "공간 (cavity)"이 생성된다. 이렇게 하여, 이종이량체의 수율을 동종이량체와 같은 다른 원하지 않는 최종 생성물의 수율보다 증가시키는 기전을 제공한다.

이중특이적 항체는 가교결합된 또는 "이종접합체" 항체를 포함한다. 예를 들면, 이종접합체내의 항체 중 하나는 아비딘과 커플링되고, 다른 하나는 비오틴과 커플링될 수 있다. 그러한 항체는, 예를 들면 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 제안되고 (미국 특허 제4,676,980호), HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373, 및 유럽특허 제EP03089호) 제안되었다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 당업계에 공지되어 있고, 많은 가교결합 기법과 함께 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 제조하는 기법은 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 연결을 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 (Brennan et al., Science, 229: 81 (1985))에서는 F(ab')₂단편을 제조하기 위해 원형 항체를 단백질분해 방법으로 절단시키는 절차를 기술하였다. 이들 단편은 디티올 착화제인 소듐 아르세니트의 존재하에 환원되어 근처의 디티올을 안정화시키고, 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 이어서, 생성된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성한다. 생산된 이중특이적 항체는효소의 선택적 고정을 위한 작용제로서 사용할 수 있다.

최근의 진전으로, 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수가 용이해졌으며, 이를 화학적으로 커플링하여 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. 문헌 (Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992))에서는 완전한 인간화 이중특이적 항체 F(ab')₂분자의 생산을 기술하였다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비되었으며, 시험관내에서 지시된 화학적 커플링으로 처리하여이중특이적 항체를 형성하였다. 이렇게 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상의 인간 T 세포에 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 인간 유방 종양 표적에 대해 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 개시하였다.

또한, 재조합 세포 배양물로부터 직접적으로 이중특이적 항체 단편을 제조하고 단리하는 다양한 기법이 기술되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 류신 지퍼 (zipper)를 사용하여 생산되었다 (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5); 1547-1553 (1992)). Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드를 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부위에 연결시켰다. 항체 동종이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성한 다음, 재산화시켜 항체 이종이량체를 형성하였다. 이 방법은 항체 동종이량체의 생산에 이용될 수도 있다. 문헌 (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993))에 기술되어 있는 "디아바디" 기법에서는 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위한 대안적인 기전을 제공하였다. 단편은, 너무 짧아서 동일 쇄상의 2개의 도메인을 짝지을 수 없는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 V_H및 V_L도메인은 다른 단편의 상보적인 V_L및 V_H도메인과 짝을 이루게 됨으로써 2개의 항원 결합 부위를 형성하게 된다. 단쇄 Fv (sFv)를 사용하여 이중특이적 항체 단편을 제조하는 다른 방법이 또한 보고되었다 (문헌 (Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)) 참조).

2 초과의 결합가를 갖는 항체가 고려된다. 예를 들면, 삼중특이적 항체를 제조할 수 있다 (Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991)).

(vii) 예시적인 항체

본 발명의 범위내의 바람직한 항체로는 항-HER2 항체, 예를 들어 rhuMAb 4D5 (HERCEPTIN(등록상표)) (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285-4289 (1992), 미국 특허 제5,725,856호); 항-CD20 항체, 예를 들어 키메라 항-CD20 "C2B8" (미국 특허 제5,736,137호 (RITUXAN(등록상표))), 2H7 항체의 키메라 또는 인간화 변이체 (미국 특허 제5,721,108호, B1) 또는 토시투모맵 (Tositumomab)(BEXXAR(등록상표)); 항-IL-8 (St John et al., Chest, 103:932 (1993), 및 국제 공개 제WO 95/23865호); 항-VEGF 항체, 예를 들어 인간화 및(또는) 친화성 성숙된 항-VEGF 항체, 예를 들어 인간화 항-VEGF 항체 huA4.6.1 AVASTIN(등록상표) (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), 국제 공개 제WO 96/30046호, 및 동 제WO 98/45331호, 1998년 10월 15일 공개됨); 항-조직 인자 (TF) 항체 (유럽 특허 제0420937B1호, 1994년 11월 9일 허여됨), 예를 들어 인간화및(또는) 친화성 성숙된 항-VEGF 항체, 예를 들어 D3H44 (WO 01/70984); 항-PSCA 항체 (WO 01/40309); 항-CD40 항체, 예를 들어 S2C6 및 그의 인간화 변이체 (WO 00/75348); 항-CD11a (미국 특허 제5,622,700호, WO 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), 및 Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); 항-CD18 (미국 특허 제5,622,700호, 1997년 4월 22일 허여됨, 또는 WO 97/26912, 1997년 7월 31일 공개됨); 항-IgE (미국 특허 제5,714,338호, 1998년 2월 3일 허여됨, 또는 미국 특허 제5,091,313호, 1992년 2월 25일 허여됨, WO 93/04173, 1993년 3월 4일 공개됨, 국제 출원 제PCT/US98/13410호, 1998년 6월 30일 출원됨, 미국 특허 제5,714,338호, Presta et al., J. Immunol. 151:2623-2632 (1993), 및 국제 공개 제WO 95/19181호); 항-Apo-2 수용체 항체 (WO 98/51793, 1998년 11월 19일 공개됨); 항-TNF-α 항체, 예를 들어 cA2 (REMICADE(등록상표)), CDP571 및 MAK-195 (미국 특허 제5,672,347호, 1997년 9월 30일 허여됨, Lorenz et al. J. Immunol. 156(4):1646-1653 (1996), 및 Dhainaut et al. Crit. Care Med. 23(9):1461-1469 (1995) 참조); 항-인간 α₄β₇인테그린 (WO 98/06248, 1998년 2월 19일 공개됨); 항-EGFR (키메라 또는 인간화 225 항체 (WO 96/40210, 1996년 12월 19일 공개됨)); 항-CD3 항체, 예를 들어 OKT3 (미국 특허 제4,515,893호, 1985년 5월 7일 허여됨); 항-CD25 또는 항-tac 항체, 예를 들어 CHI-621 (SIMULECT(등록상표)) 및 (ZENAPAX(등록상표))(미국 특허 제5,693,762호, 1997년 12월 2일 허여됨); 항-CD4 항체, 예를 들어 cM-7412 항체 (Choy et al. Arthritis Rheum 39(1):52-56(1996)); 항-CD52 항체, 예를 들어 CAMPATH-1H (Riechmann et al. Nature 332:323-337 (1988); 항-Fc 수용체 항체, 예를 들어 FcγRI에 대해 지시되는 M22 항체 (Graziano et al. J. Immunol. 155(10):4996-5002 (1995)); 항-암종배아성 항원 (CEA) 항체, 예를 들어 hMN-14 (Sharkey et al. Cancer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)); 유방 상피 세포에 대해 지시되는 항체, 예를 들어 huBrE-3, hu-Mc3 및 CHL6 (Ceriani et al. Cancer Res. 55(23): 5852s-5856s (1995); 및 Richman et al. Cancer Res. 55(23 Supp): 5916s-5920s (1995)); 결장 암종 세포와 결합하는 항체, 예를 들어 C242 (Litton et al. Eur J. Immunol. 26(1):1-9 (1996)); 항-CD38 항체, 예를 들어 AT 13/5 (Ellis et al. J. Immunol. 155(2):925-937 (1995)); 항-CD33 항체, 예를 들어 Hu M195 (Jurcic et al. Cancer Res 55(23 Suppl):5908s-5910s (1995)) 및 CMA-676 또는 CDP771; 항-CD22 항체, 예를 들어 LL2 또는 림포사이드 (LymphoCide)(Juweid et al. Cancer Res 55(23 Suppl):5899s-5907s (1995)); 항-EpCAM 항체, 예를 들어 17-1A (PANOREX(등록상표); 항-GpIIb/IIIa 항체, 예를 들어 애브식시맵 (abciximab) 또는 c7E3 Fab (REOPRO(등록상표)); 항-RSV 항체, 예를 들어 MEDI-493 (SYNAGIS(등록상표)); 항-CMV 항체, 예를 들어 PROTOVIR(등록상표); 항-HIV 항체, 예를 들어 PRO542; 항-간염 항체, 예를 들어 항-Hep B 항체 OSTAVIR(등록상표); 항-CA 125 항체 OvaRex; 항-이디오타입 GD3 에피토프 항체 BEC2; 항-αvβ3 항체 VITAXIN(등록상표); 항-인간 신세포 암종 항체, 예를 들어 ch-G250; ING-1; 항-인간 17-1A 항체 (3622W94); 항-인간 결장직장 종양 항체 (A33); GD3 강글리오시드 (ganglioside)에 대해 지시되는 항-인간 흑색종 항체 R24; 항-인간 편평세포 암종 (SF-25); 및 항-인간 백혈구 항원 (HLA) 항체, 예를 들어 스마트 (Smart) ID10 또는 항-HLA DR 항체 온콜림 (Oncolym)(Lym-1)을 들 수 있다.

(viii) 면역접합체

본 발명은 또한 화학요법제, 독소 (예를 들면, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 단편), 또는 방사성 동위원소 (예를 들면, 방사성접합물)에 접합된 본원에 기술한 항체를 포함하는 면역접합체에 관한 것이다.

그러한 면역접합물의 생산에 유용한 화학요법제는 상기 기술하였다. 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 유래), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알루라이츠 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 파이톨라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 (momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노미신 및 트리코테센을 들 수 있다. 방사성접합체 항체를 생산하기 위해 다양한 방사성핵종이 이용가능하다. 그 예로는²¹¹Bi,¹³¹I,¹³¹In,⁹⁰Y 및¹⁸⁶Re를 포함한다.

항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2관능성 단백질 커플링제, 예를 들어 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 2관능성 유도체 (예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조한다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 (Vitetta et al., Science 238:1098(1987))에 기재된 바에 따라 제조될 수 있다. 탄소-14 표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 킬레이팅제의 예이다 (예를 들어 WO 94/11026 참조).

B. 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법

또한, 본 발명은 본원에 기재된 항체 변이체를 코딩하는 단리된 핵산, 이러한 핵산을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 항체 변이체의 제조를 위한 재조합 기술을 제공한다.

항체 변이체의 재조합 생산의 경우, 이를 코딩하는 핵산을 단리하여 추가의 클로닝 (DNA 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터내에 삽입할 수 있다. 항체 변이체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법을 이용하여 (예를 들어, 항체 변이체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리 및 서열화한다. 많은 벡터를 이용할 수 있다. 벡터 성분은 일반적으로 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열의 하나 이상을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 벡터 성분은 참고로 본원에 명시적으로 포함되는 WO 00/29584에 기재되어 있다.

본원에 있어서 벡터에서 DNA를 클로닝 또는 발현시키는 데 적합한 숙주 세포는 상기 기재된 원핵 세포, 효모 또는 고등 진핵 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵 생물로는 진정세균 (eubacteria), 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 생물, 예를 들어 장내세균총 (Enterobacteriaceae), 예를 들어 이셰리키아 (Escherichia)(예, 이. 콜라이), 엔터로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans), 및 시겔라 (Shigella), 및 바실러스 (Bacillus)(예, 비. 서브틸리스 (B. subtilis)) 및 비. 리체니포르미스 (B. licheniformis)(예, 1989년 4월 12일 간행된 DD 266,710에 개시된 비. 리체니포르미스 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas)(예, 피. 애루기노사 (P. aeruginosa)), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 들 수 있다. 한가지 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주들, 예를 들어 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)도 적합하다. 이러한 예는 예시적인 것일 뿐이지, 한정하기위한 것은 아니다.

원핵생물 이외에도, 진핵 미생물, 예를 들어 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상의 제빵용 효모가 하등 진핵 숙주 미생물 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 기타 속, 종 및 균주가 통상적으로 이용가능하며 본원에서 유용한데, 그러한 예로는 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어 케이. 락티스 (K. lactis), 케이 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티 (K. waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906), 케이. 테모톨레란스 (K. thermotolerans), 및 케이. 막시아누스 (K. marxianus) 등; 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070); 칸디다 (Candida); 트리코데마 리시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa); 슈바니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 슈바니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium), 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 에이. 니둘란스 (A. nidulans) 및 에이. 니게르 (A. niger) 등이 있다.

글리코실화된 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물체로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 세포 및 곤충 세포를 들 수 있다. 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충), 애데스 애집티 (Aedes aegypti) (모기), 애데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (초파리), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)와 같은 숙주로부터의 다수의 바쿨로바이러스 종 및 변이체 및 상응하는 허용성 곤충 숙주 세포가 확인되었다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 종이 공개적으로 이용가능한데, 예를 들어 오토그라파 캘리포니카 (Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) NPV의 Bm-5 종이 있으며, 본원에서 이러한 바이러스는 본 발명에 따라, 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위한 바이러스로서 이용할 수 있다. 면화, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아 (petunia), 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물을 숙주로서 사용할 수도 있다.

그러나, 가장 관심의 대상이 되는 것은 척추동물 세포이며, 배양 (조직 배양)에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 과정이 되어 왔다. 유용한 포유동물 숙주 세포의 예로는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 라인 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 라인 (현탁 배양에서의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니스 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 (African) 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개과동물 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간종양 라인 (Hep G2)을 들 수 있다.

숙주 세포를 상기 기재된 항체 생산을 위한 발현 또는 클로닝 벡터로 형질전환하고; 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나, 또는 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키는데 적절하도록 변형된 통상의 영양 배지에서 배양한다.

본 발명의 항체 변이체를 제조하는 데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 시판 배지, 예를 들어 Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), 및 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)((DMEM), Sigma)가 숙주 세포를 배양하는 데 적합하다. 또한, 문헌 (Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980), 미국 특허 제4,767,704호; 동 제4,657,866호; 동 제4,927,762호; 동 제4,560,655호; 또는 동 제5,122,469호; WO 90/03430; WO 87/00195; 또는 미국 특허 제30,985호)에 기재된 임의의 배지를 숙주 세포를 위한 배양 배지로서 사용할 수 있다. 이들 배지 중 임의의 것에 필요에 따라 호르몬 및(또는) 다른 성장 인자 (예, 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 성장 인자), 염 (예, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액 (예, HEPES), 뉴클레오티드 (예, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예, 겐타마이신 (GENTAMYCIN, 등록상표) 약물), 미량 원소 (일반적으로, 최종 농도가 마이크로몰 범위에서 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 등가의 에너지 공급원을 보충할 수 있다. 또한, 임의의 다른 필수 보충물이 당업자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도 및 pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 기존에 사용되던 것들이며, 당업자에게 자명할 것이다.

재조합 기술을 이용하는 경우, 항체 변이체는 세포내 생산되거나, 원형질막주변 공간에서 생산되거나, 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체 변이체가 세포내 생산되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립자 찌꺼기를, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거한다. 항체 변이체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액은 일반적으로는 시판 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 장치를 사용해서 먼저 농축시킨다. 프로테아제 저해제, 예를 들어 PMSF를 상기 단계들 중 어느 단계에 포함시켜 단백질분해를 억제할 수 있으며, 항생제를 포함시켜 우발적인 오염물질의 성장을 방지할 수 있다.

세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 및 친화성 크로마토그래피를 이용해서 정제할 수 있으며, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체 변이체에 존재하는 임의의 이뮤노글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 따라 달라진다. 단백질 A를 사용해서 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를기초로 하는 항체를 정제할 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 γ3에 대하여 추천된다 (Guss et al., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 흔히 대부분은 아가로스이지만, 다른 매트릭스를 이용할 수도 있다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 조절된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스에 의해 달성할 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 처리 시간을 가능케 한다. 항체 변이체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드 (Bakerbond) ABX(등록상표) 수지 (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)가 정제에 있어서 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들어 이온-교환 컬럼상 분리, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상 크로마토그래피, 헤파린 세파로스 (SEPHAROSE, 등록상표)상 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예, 폴리아스파르트산 컬럼) 상 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE, 및 암모늄 술페이트 침전을 회수될 항체 변이체에 따라 이용할 수도 있다.

C. 제약 제제

항체 변이체의 치료 제제는 저장을 위해 목적하는 순도를 갖는 항체 변이체를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합함으로써 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용된 투여량과 농도에서 수용자에게 무독성이고, 인산염, 시트르산염및 기타 유기산 등의 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (잔기 약 10개 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이팅제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨 등의 당; 나트륨 등의 염 형성 카운터-이온; 금속 착물 (예, Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN (등록상표), PLURONICS (등록상표) 또는 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 비이온성 계면활성제를 포함한다.

본원의 제제는 또한, 치료될 특정 증상에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 대해 불리한 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 면역억제제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합되어 존재한다.

활성 성분은, 예를 들면 코아세르베이션 (coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 각각, 콜로이드성약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에 포획시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))에 기재되어 있다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 멸균은 무균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성한다.

지속 방출형 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출형 제제의 적합한 예에는 항체 변이체를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면 LUPRON DEPOT (등록상표) (락트산-글리콜산 공중합체와 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상에 걸쳐 분자를 방출시킬 수 있지만, 어떤 하이드로겔은 단백질을 더 짧은 기간 동안 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 체내에 오랫 동안 남아있는 경우, 이 항체는 37 ℃에서 수분에 노출된 결과로서 변성되거나 응집될 수 있어서 생물학적 활성이 소실되고 면역원성이 변할 수 있게 된다. 관여하는 메카니즘에 따라 안정화를 위해 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지는 경우, 안정화는 술프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제를 사용하고, 특정 중합체 매트릭스 조성물을 개발하여 달성할 수 있다.

D. 항체 변이체에 대한 비-치료적 용도

본 발명의 항체 변이체는 친화성 정제 작용제로 사용할 수 있다. 이 과정에서, 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 이용해서 고상, 예를 들어 세파덱스 (Sephadex) 수지 또는 여과지 상에 고정시킨다. 고정된 항체 변이체를 정제될 항원을 함유하는 샘플과 접촉시킨 다음, 지지체를 고정된 항제 변이체에 결합되는 정제될 항원을 제외한 샘플내의 실질적으로 모든 물질을 제거하는 적합한 용매로 세척한다. 마지막으로, 지지체를, 항체 변이체로부터 항원을 방출시키는 다른 적합한 용매, 예를 들어 글리신 완충액 (pH 5.0)으로 세척한다.

변이체 항체는 진단 분석에서, 예를 들어 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 대상 항원의 발현을 검출하는데 유용할 수도 있다.

진단 용도의 경우, 항체 변이체는 통상적으로 검출가능한 잔기로 표지될 것이다. 일반적으로 하기 카테고리들로 그룹화될 수 있는 다수의 표지를 이용할 수 있다:

(a) 방사성동위원소, 예를 들어³⁵S,¹⁴C,¹²⁵I,³H 및¹³¹I. 항체 변이체는, 예를 들어 문헌 (Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen etal., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991))에 기재된 기술을 이용해서 상기 방사성동위원소로 표지할 수 있으며, 방사활성은 섬광계수법을 이용해서 측정할 수 있다.

(b) 형광 표지, 예를 들어 희토류 킬레이트 (유러퓸 킬레이트) 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red)를 이용할 수 있다. 형광 표지는, 예를 들어 문헌 (Current Protocols in Immunology, supra)에 기재된 기술을 이용하여 항체 변이체에 접합시킬 수 있다. 형광은 형광측정기 (fluorimeter)를 사용해서 정량할 수 있다.

(c) 다양한 효소-기질 표지를 이용할 수 있으며, 미국 특허 제4,275,149호는 이들 중 몇몇에 대한 검토를 제공한다. 효소는 일반적으로 다양한 기술을 이용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변화를 촉매한다. 예를 들어, 효소는 기질의 색 변화를 촉매할 수 있으며, 이는 분광광도계를 사용해서 측정할 수 있다. 또는, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변화시킬 수 있다. 형광 변화를 정량하는 기술은 상기 기술되어 있다. 화학발광 기질은 화학 반응에 의해 전자적으로 여기되고, 이후에 (예를 들어, 화학발광측정기를 사용해서) 측정될 수 있거나 또는 형광 수용체에 에너지를 공급하는 광을 방출할 수 있다. 효소 표지의 예로는 루시퍼라제 (예, 반딧불이 루시퍼라제 및 박테리아 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제 및 마이크로퍼옥시다제 등을 들 수 있다. 효소를 항체에 접합시키는 기술은 문헌 (O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981))에 기재되어 있다.

효소-기질 조합의 예로는, 예를 들어 다음과 같은 것들을 들 수 있다:

(i) 기질로서 히드로겐 퍼옥시다제를 갖는 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO) (여기서 히드로겐 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴);

(ii) 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트를 갖는 알칼리 포스파타제 (AP); 및

(iii) 발색 기질을 갖는 베타-D-갈락토시다제 (베타-D-Gal) (예, p-니트로페닐-베타-D-갈락토시다제) 또는 형광발생 기질을 갖는 베타-D-갈락토시다제 (4-메틸움벨리페릴-베타-D-갈락토시다제).

당업자라면 다수의 다른 효소-기질 조합을 이용할 수 있다. 이에 대한 일반적인 검토를 위해서는, 미국 특허 제4,275,149호 및 동 제4,318,980호를 참조한다.

때로는, 표지를 항체 변이체에 간접적으로 접합시킨다. 당업자라면 이를 달성하기 위한 다양한 기술을 알 것이다. 예를 들어, 항체 변이체를 비오틴과 접합시킬 수 있으며, 3가지 넓은 카테고리의 상기 언급한 표지들을 아비딘과 접합시키거나, 그 반대로 할 수 있다. 비오틴은 아비딘과 선택적으로 결합하며, 따라서 표지를 이러한 간접적인 방식으로 항체 변이체와 접합시킬 수 있다. 또는, 표지와 항체 변이체의 간접적인 접합을 달성하기 위해, 항체 변이체를 소형 합텐 (예, 디곡신)과 접합시키고, 상기 언급한 상이한 유형의 표지들의 하나를 항-합텐 항체 변이체 (예, 항-디곡신 항체)와 접합시킨다. 따라서, 표지와 항체 변이체의 간접적인 접합을 달성할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에서, 항체 변이체는 표지할 필요가 없으며, 그의 존재는 항체 변이체와 결합하는 표지된 항체를 사용해서 검출할 수 있다.

본 발명의 항체는 경쟁적 결합 분석, 직접 및 간접 샌드위치 분석, 및 면역침전 분석 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc. 1987))과 같은 임의의 공지된 분석 방법에서 이용할 수 있다.

경쟁적 결합 분석은 표지된 표준물이 제한된 양의 항체 변이체와 결합하는데 있어서 시험 샘플 분석물과 경쟁하는 능력에 의존한다. 이 시험 샘플 중 항원의 양은 항체에 결합하는 표준물의 양에 반비례한다. 결합하는 표준물의 양의 결정을 용이하게 하기 위해, 일반적으로 경쟁 이전이나 이후에 항체를 불용성화하여 항체에 결합하는 표준물 및 분석물이 결합되지 않은 채로 남아있는 표준물 및 분석물로부터 편리하게 분리될 수 있도록 한다.

샌드위치 분석법은 2가지 항체의 사용을 포함하며, 이중 하나는 검출될 단백질의 다른 면역원성 부위 또는 에피토프에 결합할 수 있다. 샌드위치 분석법에서,시험 샘플 분석물은 고상 지지체에 고정된 제1 항체에 의해 결합되고, 이후에 제2 항체가 분석물에 결합하며, 이에 따라 3-부분으로 된 불용성 결합체를 형성시킨다. 예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호를 참조한다. 제2 항체 자체는 검출가능한 잔기로 표지할 수 있거나 (간접 샌드위치 분석법) 또는 검출가능한 잔기로 표지된 항-이뮤노글로불린 항체를 사용해서 측정할 수 있다 (간접 샌드위치 분석법). 예를 들어, 샌드위치 분석법의 한가지 유형은 ELISA 분석법이며, 이 경우에 검출가능한 잔기는 효소이다.

면역조직화학의 경우, 종양 샘플은 신선한 것이거나 동결시킬 수 있거나, 또는 파라핀에 매입하고, 예를 들어 포르말린과 같은 보존제로 고정할 수 있다.

항체를 생체내 진단 분석에서 사용할 수도 있다. 일반적으로, 항체 변이체를 방사성핵종 (예,¹¹¹In,⁹⁹Tc,¹⁴C,¹³¹I,¹²⁵I,³H,³²P 또는³⁵S)으로 표지하여, 이뮤노신티오그래피 (immunoscintiography)로 종양을 국소화할 수 있다.

E. 진단 키트

편의상의 문제로서, 본 발명의 항체 변이체는 키트, 즉 진단 분석을 수행하기 위한 지침과 함께 소정량의 시약들의 포장된 조합물로 제공될 수 있다. 항체 변이체를 효소로 표지하는 경우, 키트는 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조인자 (예, 검출가능한 발색단 (chromophore) 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 것이다. 또한, 다른 첨가제, 예를 들어 안정화제 및 완충제 (예, 차단 완충제 또는 용해 완충제) 등이 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적 양을 폭넓게변화시켜 분석의 민감도를 실질적으로 최적화하는 시약의 용액 중 농도를 제공할 수 있다. 특히, 용해시 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하게 될 부형제를 포함하는 시약을 건조 분말로서, 일반적으로는 동결건조하여 제공할 수 있다.

F. 항체 변이체에 대한 생체내 용도

치료 용도의 경우, 본 발명의 항체 변이체는 포유동물, 바람직하게는 인간에게, 상기 논의된 것과 같은 제약상 허용되는 투여 형태, 예를 들어 인간에게 볼루스 (bolus)로서 정맥내로 또는 일정 기간 동안의 연속 주입, 근육내 경로, 복강내 경로, 뇌척수내 경로, 피하 경로, 동맥내 경로, 활막내 경로, 경막내 경로, 구강 경로, 국소 경로 또는 흡입 경로에 의해 투여할 수 있는 형태로 투여한다. 또한, 항체를 종양내, 종양 주변, 병소내 또는 병소 주변 경로로 투여하여 국소적 뿐만 아니라 전신적인 치료 효과를 발휘하는 것이 적합하다. 복강내 경로는, 예를 들어 난소 종양의 치료에서 특히 유용할 것으로 예상된다. 또한, 항체 변이체는 펄스 (pulse) 주입에 의해, 특히 감소하는 양의 항체 변이체를 투여하는 것이 적합하다. 바람직하게는, 투여는 부분적으로는 투여가 일시 투여인지 만성 투여인지에 따라 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 제공된다.

질병을 예방 또는 치료하는 경우, 항체 변이체의 적정 투여량은 치료될 질병의 유형, 질병의 중증도 및 경과, 항체 변이체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체 변이체에 대한 반응, 및 주치의의 고려에 따라 달라질 것이다. 항체 변이체는 환자에게 한번에 투여하거나 또는 일련의 치료 동안 투여하는 것이 적합하다.

본원의 예는 항-VEGF 항체에 관한 것이다. 항-VEGF 항체는 다양한 신생물성 및 비-신생물성 질병 및 질환의 치료에 유용하다. 치료에 순응성인 신생물 및 관련 증상으로는 유방 암종, 폐 암종, 위 암종, 식도 암종, 결장직장 암종, 간 암종, 난소 암종, 난포막종, 남성배세포종, 자궁경부 암종, 자궁내막 암종, 자궁내막 비후증, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막암종, 두부암 및 경부암, 비강인두 암종, 후두 암종, 간모세포종, 카포시 (Kaposi's) 육종, 흑색종, 피부 암종, 혈관종, 해면 혈관종, 혈관모세포종, 췌장 암종, 망막모세포종, 성상세포종, 교모세포종, 슈반종 (Schwannoma), 희소돌기아교세포종, 수모세포종, 신경모세포종, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종, 요로 암종, 갑상선 암종, 윌름 (Wilm's) 종양, 신세포 암종, 전립선 암종, 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 부종 (예, 뇌 종양과 관련된 부종), 및 메이그 (Meigs') 증후군을 들 수 있다.

치료에 순응성인 비-신생물성 증상으로는 류마티스성 관절염, 건선, 아테롬성경화증, 당뇨병 및 기타 증식성 망막병증, 예를 들어 미숙아 망막병증, 수정체후부섬유증식증, 신생혈관 녹내장, 연령-관련된 황반변성, 갑상선 과형성증 (그레이브 (Grave's) 병 포함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 신증후군 (nephrotic syndrome), 자간전증, 복수 (ascite), 심낭삼출 (예, 심장막염과 관련된 것), 및 흉막 유출을 들 수 있다.

연령-관련된 황반변성 (AMD)은 연장자 집단에서 중증 시각 상실의 주요 원인이다. AMD의 삼출 형태는 맥락막 혈관신생 및 망막색소 상피세포 분리를 특징으로 한다. 맥락막 혈관신생은 예후의 급격한 악화와 관련되기 때문에, 본 발명의 VEGF항체는 AMD의 중증도를 감소시키는데 특히 유용할 것으로 예상된다.

질병의 유형 및 중증도에 따라 다르지만, 항체 변이체 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예, 0.1 내지 20 mg/kg)은, 예를 들어 1회 이상 별도 투여하든지 연속 주입하든지 간에 환자에 대한 투여에 있어서 초기 후보 투여량이 된다. 전형적인 일일 투여량은 상기 언급한 인자들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그보다 많은 양의 범위일 수 있다. 증상에 따라 수일 이상 동안 반복 투여하는 경우, 치료는 질병 증상이 바람직한 정도로 억제될 때까지 지속한다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터링한다. 항체 변이체의 향상된 결합 속도로 인해, (모 항체에 비해) 적은 투여량의 항체 변이체를 투여할 수 있을 것으로 생각된다.

항체 변이체 조성물은 양질의 의료적 시행과 일치하는 방식으로 제제화, 복용 및 투여될 것이다. 이러한 상황에서 고려되는 인자로는 치료될 구체적 질환, 치료될 특정 포유동물, 각 환자의 임상 증상, 질환의 원인, 작용제 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의료 종사자에게 공지된 다른 인자를 들 수 있다. 투여될 항체 변이체의 "치료 유효량"은 이러한 고려사항에 의해 결정될 것이며, 질병 또는 질환을 예방하거나, 경감시키거나 또는 치료하는데 필요한 최소량이다. 항체 변이체는 해당 질환을 예방 또는 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 작용제가 필요한 것은 아니지만, 임의로는 상기 작용제와 함께 제제화한다. 이러한 기타 작용제의 유효량은 제제 중 존재하는 항체 변이체의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자들에 따라 달라진다. 이들은 일반적으로는 상기 사용된것과 동일한 투여량 및 투여 경로로 사용되거나 또는 상기 사용된 투여량의 약 1 내지 99％로 투여된다.

G. 제품

본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 상기 기재된 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 이러한 제품은 용기 및 표지를 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들면 병, 바이알, 주사기 및 시험관 등이 포함된다. 이러한 용기는 유리나 플라스틱과 같은 각종 재료로부터 제조될 수 있다. 상기 용기는 해당 증상을 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균된 입구를 가질 수 있다 (예를 들어, 이러한 용기는 피하 주사 바늘로 꿰뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액제 백 또는 바이알일 수 있음). 이러한 조성물 중의 활성제가 본 발명의 항체 변이체이다. 상기 용기상에 존재하거나 또는 이 용기와 결합된 표지는 해당 조성물이 선택된 증상의 치료에 사용된다는 것을 나타낸다. 제품은 제약학적으로 허용되는 완충제, 예를 들면 인산염 완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제품은 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침을 갖는 포장 삽입물을 비롯하여 상업적인 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.

H. 항원 결합 속도 분석

또한, 본 출원은 항체 (예, 본원에 기술된 것과 같은 항체 변이체)의 항원 결합 속도를 측정하는데 사용될 수 있는 분석 방법을 기술한다. 특히, 이 방법은 항체-항원 결합체의 형성이 시간에 따라 정량될 수 있도록 느린 결합 속도를 갖는항체 (예, 항원에 대한 결합 상수가 약 10⁵M^-1초^-1보다 더 느리거나 약 10⁶M^-1초^-1보다 더 느린 항체)에 대해 적합하다. 느린 항원 결합 상수를 갖는 항체의 한 예는 본원에 언급된 다양한 항-VEGF 항체에 의해 예시되는, VEGF와 결합하는 항-VEGF 항체이다.

본원에서 분석 방법은 (1) 항체 및 항원을 용액 중에서 합하는 단계, 및 이후에 (2) 항체-항원 결합체의 형성을 시간에 따라 측정하는 단계를 포함한다. 따라서, 결합체 형성은 항체와 항원이 결합한 다음에 측정된다. 시간에 따른 결합체 형성은 결합체의 형광 측정 또는 흡광도 측정과 같은 다양한 방법을 이용하거나 또는 NMR을 이용하여 결정할 수 있다. 그러나, 바람직한 실시양태에 따라, 이 방법의 제2 단계는 항체-항원 결합체의 형광 방출 강도를 시간에 따라 측정하는 것을 포함한다. 이는 항체 또는 항원이 항원-항체 결합 계면에서 트립토판 잔기를 포함하는 경우에 달성할 수 있으며, 그 결과, 트립토판 잔기의 형광 방출 강도 (이 강도는 트립토판 잔기가 결합 계면에 묻혀있는 경우에 변화함)를 측정할 수 있다. 형광 방출 강도는 약 280 내지 310 nm (예, 295 nm)의 여기 파장을 사용하고, 약 330 내지 360 nm (예, 약 340nm)의 파장에서 방출을 검출하여 결정할 수 있다.

하기 실시예는 단지 본 발명의 실시를 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명을 한정하기 위해 제시된 것은 아니다. 본원에 인용된 모든 특허문헌 및 과학 논문의 개시내용은 그 전체가 명시적으로 본원에 참고로 포함된다.

실시예 1

본 실시예는 정전기 조종 (steering)의 원리를 적용하여, 과도한 계산 없이도, 표적 부위의 목록을 실험적으로 다루기 쉬운 수로 감소시키는 일련의 기준을 통해 잠재적인 온-속도 증폭 부위를 동정함으로써 항체와 그의 항원과의 결합의 온-속도를 증가시킬 수 있음을 입증한다. 구체적인 예는 항-VEGF Y0101 항체 Fab 단편 (도 1A-B)의 변형에 대한 것이다. 형광-기초의 분석에 의해 특성화된 동정된 표적 부위에서 행해진 돌연변이를 갖는 Fab Y0101은 대략 거의 크게 향상된 결합 속도를 나타냈다. 또한, Fab-VEGF 결합체에 대해 관찰된 결합 속도는 데비-허켈 (Debye-Huckel) 에너지 상호작용의 계산에 의해 예상된 결합 속도와 상관관계가 없었다. 빠른 온-속도를 갖는 Fab Y0101의 변이체는 그의 더 큰 친화성으로 인해 VEGF의 보다 강력한 길항제일 뿐만 아니라, 더 빠른 결합으로 인해 보다 효과가 있는 것으로 예상된다. 후자에 대한 이러한 중요성이 이해되지 않은 이유는, Fab Y0101-VEGF 결합체의 결합 및 해리 속도가 통상적인 단백질-단백질 상호작용보다 대략 더 느리기 때문이다 (Chen et al. Journal of Molecular Biology 293(4): 865-81 (1999); Gabdoulline et al. Journal of Molecular Biology 306(5): 1139-55 (2001)). ON-RAMPS의 동정에 대해 본원에 기술된 기준은 항원과의 향상된 결합 및 전체 결합 친화성을 위해 항체 단편의 재설계를 안내하는 지표로서 충분하다.

재료 및 방법

온-속도 증폭 부위 (On-RAMPS)의 동정

항체 단편 (Fab)내에 약 445개의 잔기가 존재하는 경우, 리간드와의 결합 속도를 향상시키는 한 단계는 전하 상보성을 증가시키도록 돌연변이되었을 때 두 단백질 사이의 정전기 상호작용 에너지를 상당히 변화시키는 잔기를 동정하는 것을 포함한다. 하기 기준을 적용하여 이러한 "온-속도 증폭 부위" (On-RAMPS)를 동정하였다.

1) 묻혀있는 잔기의 돌연변이가 Fab를 불안정화할 수 있기 때문에, 잔기는 그의 측쇄 표면의 1/3 이상이 용매에 노출되어 있다.

2) 정전기 유인력이 거리의 함수로서 줄어들 수 있기 때문에, 잔기는 결합 상태로 VEGF의 적어도 16 Å내에 존재하였다.

3) 직접 접촉하는 잔기의 돌연변이가 결합된 결합체를 불안정화할 수 있기 때문에, 잔기는 결합 상태로 VEGF와 직접 접촉하지 않았다.

4) 상보성 결정 영역 (CDR)내에 존재한 잔기가 그렇지 않은 잔기보다 바람직한데, 그 이유는 상기 영역내 잔기가 환자에서 면역원성 반응을 덜 유도할 수 있음을 나타내기 때문이다.

5) Fab와 항원 사이의 전하 상보성을 증가시킬 수 있었던 잔기들만이 고려되었다. 예를 들어, Y0101의 V_L-D28을 돌연변이시켜 그의 전하를 중화시키거나 (D28N) 또는 역전시킴으로써 (D28K) 음으로 하전된 항원을 더 잘 보완할 수 있었지만, 잔기 V_H-K64는 그의 양전하를 증가시키도록 돌연변이시킬 수 없었다.

돌연변이유발, 단백질 발현 및 정제

VEGF의 짧은 이소폼 (8-109)을 선행 문헌 (Christinger et al. Proteins26(3): 353-7 (1996))에 기술된 바와 같이 제조하였다. Fab의 돌연변이 변이체를 구성 및 정제하는 방법은 선행 문헌 (Muller et al. Structure 6(9): 1153-67 (1998))에 기술되어 있다. 요컨대, 점 돌연변이는 쿤켈 (Kunkel)에 의해 개발된 방법 (Kunkel, T. A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(2): 488-92 (1985))에 의한 올리고뉴클레오티드 지시된 돌연변이유발에 의해 형성되었다. Fab는 비-서프레서 이. 콜라이 (E. coli) 세포주 34B8에서의 유도시 발현되며 (Baca et al. Journal of Biological Chemistry 272(16): 10678-84 (1997)), 수획된 세포의 삼투압 충격 이후에 단백질 G 수지 (Amersham)를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 통상적인 수율은 1 리터 성장 당 Fab 2 nmol이다.

결합 속도 분석

이하 기술된 실험에서, 25 mM Tris (pH 7.2) 중 약 10 nM Fab를 함유하는, 37 ℃에서 유지된 교반된 큐벳에 VEGF를 첨가했을 때, 8000-시리즈 SLM-아민코 (Aminco) 분광광도계 (THERMOSPECTRONIC (등록상표))를 사용하여 형광 방출 강도 (λ_여기= 295 nm; λ_방출= 340 nm, 16 nm 주파수폭 (bandpass))을 측정하였다.

해리 속도 분석

해리 속도는 선행 문헌 (Muller et al. Structure 6(9): 1153-67 (1998))에 기술된 바와 같이 비아코어 (BIACORE)-2000 (등록상표) 기구 (BIAcore, Inc.)상에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정하였다. VEGF를 약 10의 공명-반응 유닛에서B1 칩에 아민 커플링에 의해 고정시켰다. Fab 결합은 1 μM, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM 및 31.3 nM에서 측정하였다. 해리는 1 대 1 결합 모델을 추정하여 계산하였다. 모든 실험은 0.05％ 트윈 (Tween)-20, 0.01％ NaN3을 함유하는 pH 7.2의 인산염 완충 염수 용액 중에서 37 ℃의 온도 및 분당 20 ㎕의 유속에서 수행하였다.

결과

결합 속도 분석법의 개발

표면 플라스몬 공명 기술은 친화성 측정에 적합한 것으로 입증되었지만, 특정의 결합 상호작용의 변이체들 사이의 미묘한 차이는 흐름-동력학 (Fivash et al. Current Opinion in Biotechnology 9(1): 97-101 (1998)) 및 비-특이적 아민 커플링 (Kortt et al. Analytical Biochemistry 253(1): 103-11 (1997))의 복잡성으로부터 적절하게 폴딩된 활성 단백질의 농도를 정확하게 결정하는 능력이 단순히 없음에 이르기까지의 여러가지 이유로 인해 무시될 수 있다.

본원에 제시된 연구는 항-VEGF Fab의 변이체들 중에서 결합 속도의 차이와 관련이 있기 때문에, 온-속도에서의 미묘한 차이를 검출하는데 충분히 민감하고, 용액 중의 상호작용을 나타내며, 다양한 Fab 변이체의 농도와 독립적인 분석법을 개발하였다.

트립토판 잔기의 형광 특성은 그의 국소적 환경에 민감하다 (Lakowicz, J. R. (1999). Principles of fluorescence spectroscopy. 2nd edit, Kluwer Academic Press, New York, N. Y.). 이 연구에 사용된 VEGF와 항-VEGF Fab의 공동구조에 의해 밝혀진 바와 같이 (Muller et al. Structure 6(9): 1153-67 (1998)), 결합 상태로 VEGF와의 직접적인 접촉을 형성하는 Fab내의 3개의 트립토판이 존재하며, 그의 형광 특성은 비결합 상태에서 결합 상태로 전환시 변하는 것으로 예상될 수 있다. VEGF에는 트립토판이 없지만 Fab와 결합 계면을 형성하는 2개의 티로신 및 1개의 페닐알라닌이 존재하며 (Muller et al. Structure 6(9): 1153-67 (1998)), 이는 여기되는 경우 형광 스펙트럼에 기여할 수 있다. 이러한 잠재적인 에러의 원인을 회피하기 위해, 티로신 및 페닐알라닌의 여기 스펙트럼과 최소한으로 중복되는 295 nm의 여기 파장으로 형광 분석을 수행한다 (Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. 2nd edit, Kluwer Academic Press, New York, N. Y. (1999)).

Fab-VEGF 결합체의 형광 강도는 성분들 각각의 형광 강도의 합보다 훨씬 크다 (도 2). 형광 강도의 증가 속도는 단일 지수 곡선으로 핏팅할 수 있다 (도 3). 관찰된 속도를 VEGF 농도의 함수로서 플롯팅하여 슈도-1차 분석 (기울기는 반응에서 k₁이며, y-절편은 k_-1임)(도 4)을 행한다 (Johnson, K. A. Transient-state kinetic analysis of enzyme reaction pathways. In The Enzymes, Vol. 20: pp. 1-61. Academic Press, Inc. (1992)).

On-RAMPS의 동정

상기 약술된 기준을 적용하여, 돌연변이유발에 대해 잠재적인 부위의 수를 잔기 445개에서 22개로 줄였다 (표 1). 용매에 대한 노출인 제1 기준은 상기 수를173개로 감소시켰다. VEGF의 16 Å내인 제2 기준은 상기 수를 47개로 감소시켰다. VEGF와 직접 접촉하지 않는 것인 제3 기준은 상기 수를 31개로 감소시켰다. 잔기가 CDR내에 존재하는 것인 제4 기준은 상기 수를 23개로 감소시켰다. 마지막으로, 하나의 추가의 잔기 (V_H-K64)를 최종 기준에 의해 제거하였는데, 그와 음으로 하전된 VEGF와의 상보성이 증가될 수 없었기 때문이다. 이들 잔기 각각의 양으로 하전된 잔기로의 돌연변이에 대한 예상 온-속도를 문헌 (Schreiber et al. (2000) Nat. Struct. Biol. 7:537-41)의 방법에 따라 계산하였다.

Kabat 시스템 (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition., National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))에따라 잔기에 번호를 부여하였다. ％SASA는 1.4 Å의 프로브 반경을 이용하여 계산하였다.

결합 속도 관찰

VEGF의 순 형태 전하가 -10이기 때문에 (N-말단, 리신 및 아르기닌에 +1을 배정하고, C-말단, 아스파르테이트 및 글루타메이트에 -1을 배정하여 계산함), 돌연변이를 형성시켜 결합 계면의 주변에서 Fab에 대해 순 양전하 (야생형 = +2)를 증가시켰다. 이들 잔기의 돌연변이는 Y0101에 비해 2배와 같이 결합 속도를 크게 증가시켰다 (표 2). 한편, 용매에 노출되어 있으나 VEGF의 16 Å내에 있지 않은 잔기의 돌연변이 (표 2, 부적절함)는 적은 변화를 나타내며, 따라서 ON-RAMPS 기준의 이용을 예시한다. 항-VEGF Fab의 결합 속도는 여러 잔기들 (표 3)을 돌연변이시켜 추가로 증가시켰으며, 가장 빠른 결합 변이체인 "34-TKKT" (V_H-(T28D, S100aR) + V_L-(S26T, Q27K, D28K, S30T))는 Y0101의 결합 속도보다 6배 더 빠른 결합 속도를 나타냈다. 반대로, 전하 반발을 일으킨 돌연변이는 결합 속도를 감소시켰다 (표 3: 돌연변이체 V_L-S26E, Q27E, D28E, S30E 및 돌연변이체 V_L-T51E, S52E, S53E, L54E).

Kabat 시스템 (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition., National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))에 따라 잔기에 번호를 부여하였다. k₁은 형광 기초의 분석에 의해 결정하였다 (3회 실험의 ± 표준 편차, 야생형 단독). k_-1은 표면 플라스몬 공명에 의해 결정하였다 (12회 실험의 ± 표준 편차). k₁및 k_-1(0 M NaCl) 실험은 37 ℃에서 25 mM Tris (pH 7.2)에서 수행하였다. k_-1(0.15 M NaCl) 실험은 25 ℃에서 25 mM Tris, 150mM NaCl에서 수행하였다. K_d는 0 M NaCl 데이타로부터 계산하였다.^*, ON-RAMPS 기준을 충족시키지 않는 잔기; LE, Fab의 적은 발현은 분석을 제한함; BG, 대조군 유동 세포와의 배경 결합은 SPR 데이타의 분석을 제한함.

Kabat 시스템 (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition., National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))에 따라 잔기에 번호를 부여하였다. k₁은 형광 기초의 분석에 의해 결정하였다 (3회 실험의 ± 표준 편차). k_-1은 표면 플라스몬 공명에 의해 결정하였다 (12회 실험의 ± 표준 편차). k₁및 k_-1(0 M NaCl) 실험은 37 ℃에서 25 mM Tris (pH 7.2)에서 수행하였다. k_-1(0.15 M NaCl) 실험은 25 ℃에서 25 mM Tris, 150 mM NaCl에서 수행하였다. K_d는 0 M NaCl 데이타로부터 계산하였다. 34-TKKT, 돌연변이체 V_H-(T28, S100aR) + V_L-(S26T,Q27K,D28K,S30T). LE, Fab의 적은 발현은 분석을 제한함; BG, 대조군 유동 세포에 대한 배경 결합은 SPR 데이타의 분석을 제한함.

관찰 및 계산된 결합 속도의 비교

정전기 상호작용의 데비-허켈 에너지는 결합 속도에 대한 강력하고 정확한 지시자인 것으로 제안되었다 (Selzer, T. & Schreiber, G. Journal of Molecular Biology 287(2): 409-19 (1999)). 셀저 (Selzer) 및 슈라이버 (Schreiber)에 의해 사용된 프로그램은 이들의 인터넷 주소 (http://www.weizmann.ac.il/home/bcges/PARE.html)에서 공개적으로 이용할 수 있다. 상기 프로그램을 이용하고 이들의 지침을 따라, 이 연구에서 구성된 여러 변이체의 결합 속도를 실험적으로 결정된 값들과 비교하여 계산하였다. k_calc에 대한 k_obs의 그래프는 0.46의 R 값으로 적은 상관관계를 나타낸다 (도 5).

결합 속도의 염 의존성

변이체들 사이의 결합 속도의 차이가 결합 계면의 일반적인 구조적 재배열보다는 Fab와 VEGF 사이의 정전기 상호작용으로 인한 것임을 설명하기 위해, 본 발명자들은 여러 염 농도에서 야생형 Fab Y0101 및 34-TKKT의 결합 속도를 측정하였다 (도 7). 150 mM NaCl에서 가장 빠른 결합 변이체와 Y0101 사이의 결합 속도 차이는 2배 미만이다.

중요하게도, 결합체의 구조로부터 계산된 바와 같은 Fab와 VEGF 사이의 상호작용의 정전기 에너지 (Y0101 = 0.28 kcal mol^-1, 34-TKKT = -1.07 kcal mol^-1)는 도7의 기울기로부터 결정된 값 (Y0101 = 0.86 kcal mol^-1, 34-TKKT = -4.0 kcal mol^-1)과 함께 (크기에서의 차이에도 불구하고) 정확한 표시이다.

빠른 온-속도 변이체와 다른 친화성 성숙된 변이체의 조합

상기 기술된 빠른 온-속도 변이체를 동정된 다른 변이체와 조합하여 훨씬 더 큰 결합 친화성을 달성할 수 있다. 예를 들어, 가장 빠른 결합 변이체인 "34-TKKT"는 Fab-12, VNERK 또는 Y0317과 같은 공지된 항-VEGF 변이체와 조합할 수 있다. 추가의 서열 변형을 수행하여 분자의 결합 친화성뿐 아니라, 다른 물리적 또는 화학적 특성을 추가로 최적화할 수 있다. 도 6A 및 6B는 이러한 3가지 "조합" 변이체의 배열을 제공하는데, "34-TKKT"의 치환은 VNERK 삽입, 또는 H97Y 치환, 또는 VNERK 삽입 및 H97Y 치환의 둘 다와 함께 수행하였다. 생성된 변이체는 VEGF에 대한 더 큰 결합 친화성을 가지며, 따라서 VEGF에 대한 치료 길항제로서 사용하는 경우 더 우수한 효능을 보유할 것으로 예상된다.

실시예 2

항-VEGF 항체의 경우에서 On-RAMPS를 동정하고 상기 기술된 빠른 온-속도 변이체를 발생시키는 원리는 항-TF 및 항-HER2 항체 변이체를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 항체 변이체에 유사하게 적용될 수도 있다.

초기 단계로서, 모 항-TF 항체 D3H44 (도 8; 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에 대해 각각 서열 11 및 12) 및 모 항-HER2 항체 4D5 (도 9; 경쇄 및 중쇄 가변 도메인에 대해 각각 서열 13 및 14)는 실시예 1에 기재된 것과 유사한 기준 및 계산을 이용하여 잠재적인 ON-RAMPS를 동정하기 위해 사용하였다. 표 4 및 표 5는 제1 잔기 세트를 각각 항-TF D3H44 및 항-HER2 4D5의 잠재적인 ON-RAMPS로서 나열하고 있을뿐 아니라, 이들 잔기의 각각에 대한 단일 돌연변이를 야생형에 대한 계산된 온-속도와 함께 나열하고 있다. 계산된 온-속도는 문헌 (Schreiber et al. (2000) Nat. Struct. Biol. 7:537-41)의 방법에 따라 계산하였다. 부가적인 ON-RAMPS에 대한 추가의 정제, 돌연변이 및 동정은 유사한 방법 및 계산을 이용하여 수행한다.

Kabat 시스템 (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition., National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))에 따라 잔기에 번호를 부여하였다.

Kabat 시스템 (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition., National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991))에 따라 잔기에 번호를 부여하였다.

ON-RAMPS의 동정 및 이에 따른 단일 또는 다중 돌연변이의 설계 이후에, 생성된 변이체의 결합, 해리 속도 및 전체적인 결합 친화성을 실시예 1에 기술된 방법에 따라 관찰 및 계산할 수 있다.

그러나, 항-TF 변이체의 경우에는 특히, TF와 항-TF의 결합이 너무 빨라서 교반된 큐벳에서는 관찰할 수 없기 때문에, 형광 방출 강도 (λ_여기= 280 nm, 2 nm 주파수폭; λ_방출> 320 nm)는 중단-흐름 분광광도계 (Aviv)를 사용해서 측정하였다. 25 ℃에서 10 mM HEPES (pH 7.0) 중 항-TF의 100 nM 용액 50 ㎕를 0 nM, 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM 또는 900 nM TF를 함유하는 용액 50 ㎕와 함께 빠르게 혼합하고, 형광의 변화를 2초 동안 관찰하였다. 형광 강도의 변화 속도를 단일 지수 곡선에 핏팅하였다. 관찰된 속도를 TF 농도의 함수로서 플롯팅하여 결합 속도를 결정하였다. 이 라인의 기울기가 결합 속도 (단위는 M^-1초^-1임)이다.

<110> GENENTECH, INC ET AL. <120> ANTIBODY VARIANTS WITH FASTER ANTIGEN ASSOCIATION RATES <130> P1951R1PCT <140> PCT/US03/04184 <141> 2003-02-11 <150> US 60/355,895 <151> 2002-02-11 <150> US 60/409,685 <151> 2002-09-10 <160> 14 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Y0101-VL <400> 1 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 140 145 150 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210 Arg Gly Glu Cys <210> 2 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Y0101-VH <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 125 130 135 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 140 145 150 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 155 160 165 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 170 175 180 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 185 190 195 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 200 205 210 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 215 220 225 Cys Asp Lys Thr His Leu 230 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TKKK-VL <400> 3 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Lys Lys Ile Lys 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 140 145 150 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210 Arg Gly Glu Cys <210> 4 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TKKT-VL <400> 4 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Lys Lys Ile Thr 20 25 30 Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 Tyr Ser Thr Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 140 145 150 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210 Arg Gly Glu Cys <210> 5 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> T28D/S100aR-VH <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Arg 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 125 130 135 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 140 145 150 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 155 160 165 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 170 175 180 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 185 190 195 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 200 205 210 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 215 220 225 Cys Asp Lys Thr His Leu 230 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TKKK as CDR L1 <400> 6 Ser Ala Thr Lys Lys Ile Lys Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TKKT as CDR L1 <400> 7 Ser Ala Thr Lys Lys Ile Thr Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 8 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H97Y?VH <400> 8 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Val Asn 95 100 105 Glu Arg Lys Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 110 115 120 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 125 130 135 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 140 145 150 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 155 160 165 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 170 175 180 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 185 190 195 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 200 205 210 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 215 220 225 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu 230 <210> 9 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> H97Y-VH <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro Tyr Tyr Tyr Gly Arg 95 100 105 Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 110 115 120 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 125 130 135 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 140 145 150 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 155 160 165 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 170 175 180 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 185 190 195 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 200 205 210 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 215 220 225 Cys Asp Lys Thr His Leu 230 <210> 10 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> VNERK-VH <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Thr 20 25 30 Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr 50 55 60 Ala Ala Asp Phe Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Val Asn 95 100 105 Glu Arg Lys Ser His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 110 115 120 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 125 130 135 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 140 145 150 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 155 160 165 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 170 175 180 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 185 190 195 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 200 205 210 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu 215 220 225 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Leu 230 <210> 11 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> D3H44-VL <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Asp Ile Lys 20 25 30 Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Val Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Ser Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln 80 85 90 His Gly Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 140 145 150 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210 Arg Gly Glu Cys <210> 12 <211> 225 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> D3H44-VH <400> 12 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30 Glu Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Leu Ile Asp Pro Glu Gln Gly Asn Thr Ile Tyr 50 55 60 Asp Pro Lys Phe Gln Asp Arg Ala Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Thr Ala Ala Tyr Phe Asp 95 100 105 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 110 115 120 Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 125 130 135 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 140 145 150 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 155 160 165 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr 170 175 180 Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr 185 190 195 Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 200 205 210 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 215 220 225 <210> 13 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 4D5-VL <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn 20 25 30 Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 80 85 90 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 95 100 105 Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 110 115 120 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 125 130 135 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val 140 145 150 Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu 155 160 165 Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr 170 175 180 Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 185 190 195 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 200 205 210 Arg Gly Glu Cys <210> 14 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> 4D5-VH <400> 14 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30 Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr 95 100 105 Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115 120 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 125 130 135 Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys 140 145 150 Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 155 160 165 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 170 175 180 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 185 190 195 Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 200 205 210 Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 215 220 225 Thr His Thr

Claims (61)

1. a) 항원에 대해 특이적인 모 항체의 가변 도메인내에 존재하는, 1) 용액 중의 노출된 잔기이고, 2) 초가변 영역내에 있거나 또는 이 영역과 인접하며, 3) 모 항체가 결합하는 항원의 약 20 Å내에 존재하는 표적 아미노산 잔기를 동정하는 단계; 및

   b) 상기 단계 a)의 표적 잔기를 다른 대체 아미노산 잔기로 치환하여 항체와 항원 사이의 전하 상보성을 증가시키는 단계

   를 포함하는, 상기 모 항체의 항체 변이체를 제조하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 표적 잔기가 그와 결합한 항원과 직접 접촉하지 않는 것인 방법.
3. 제1항에 있어서, 표적 잔기의 측쇄 표면 영역의 약 1/3 이상이 용매에 노출된 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 표적 잔기가 그와 결합한 항원의 적어도 약 16 Å내에 존재하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 모 항체가 인간화 항체, 인간 항체 또는 키메라 항체인 방법.
6. 제1항에 있어서, 모 항체가 항체 단편인 방법.
7. 제6항에 있어서, 항체 단편이 Fab 단편인 방법.
8. 제1항에 있어서, 항체 변이체가 모 항체보다 항원에 대해 더 강한 결합 친화성을 갖는 것인 방법.
9. 제8항에 있어서, 항체 변이체의 결합 친화성이 모 항체의 결합 친화성보다 약 2배 이상 더 강한 것인 방법.
10. 제1항에 있어서, 항체 변이체가 모 항체보다 더 빠른 항원 결합 속도를 갖는 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 항체 변이체의 결합 속도가 모 항체의 결합 속도보다 약 5배 이상 더 빠른 것인 방법.
12. 제10항에 있어서, 항체 변이체의 결합 속도가 모 항체의 결합 속도보다 약 10배 이상 더 빠른 것인 방법.
13. 제1항에 있어서, 항체 변이체가 그의 초가변 영역에서 모 항체에 비해 약 1개 내지 약 20개의 치환을 갖는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 각각의 치환이 항체와 항원 사이의 전하 상보성을 증가시키는 것인 방법.
15. 제1항에 있어서, 항원이 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)인 방법.
16. 제15항에 있어서, 모 항체가 Y0101, Y0317, F(ab)-12, Y0192, Y0238-3, Y0239-19, Y0313-2 및 VNERK로 이루어진 군으로부터 선택된 인간화 항-VEGF 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
17. 제1항에 있어서, 치환이 CDR L1, CDR L2, 루프 (loop) H1 및 CDR H3으로 이루어진 군으로부터 선택된 초가변 영역에서의 치환인 방법.
18. 제16항에 있어서, 치환이 Kabat에 따른 잔기 번호부여 시스템 이용시 모 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 26L, 27L, 28L, 30L, 31L, 32L, 50L, 52L, 53L, 54L, 56L, 93L 또는 94L 중 1개 이상에서의 치환인 방법.
19. 제18항에 있어서, 치환이 Kabat에 따른 잔기 번호부여 시스템 이용시 모 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 26L, 27L, 28L 또는 30L 중 2개 이상에서의 치환인 방법.
20. 제19항에 있어서, 치환이 Kabat에 따른 잔기 번호부여 시스템 이용시 모 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 26L, 27L, 28L 또는 30L 중 3개 또는 4개에서의 치환인 방법.
21. 제16항에 있어서, 치환이 Kabat에 따른 잔기 번호부여 시스템 이용시 모 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 25H, 28H, 30H, 54H, 56H, 61H, 62H, 99H 또는 100aH 중 1개 이상에서의 치환인 방법.
22. 제1항에 있어서, 항원이 조직 인자 (TF)인 방법.
23. 제22항에 있어서, 모 항체가 인간화 항-TF 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
24. 제23항에 있어서, 인간화 항-TF 항체가 D3H44인 방법.
25. 제23항에 있어서, 치환이 Kabat에 따른 잔기 번호부여 시스템 이용시 모 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 30L, 49L, 50L 또는 53L 중 1개 이상에서의 치환인 방법.
26. 제25항에 있어서, 모 항체의 경쇄 가변 도메인이 서열 11의 서열인 방법.
27. 제23항에 있어서, 치환이 Kabat에 따른 잔기 번호부여 시스템 이용시 모 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 30H, 54H, 56H, 62H, 64H 또는 97H 중 1개 이상에서의 치환인 방법.
28. 제27항에 있어서, 모 항체의 중쇄 가변 도메인이 서열 12의 서열인 방법.
29. 제1항에 있어서, 항원이 HER2인 방법.
30. 제29항에 있어서, 모 항체가 인간화 항-HER2 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
31. 제30항에 있어서, 인간화 항-HER2 항체가 rhuMAb 4D5인 방법.
32. 제30항에 있어서, 치환이 Kabat에 따른 잔기 번호부여 시스템 이용시 모 항체의 경쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 27L, 28L, 52L 또는 56L 중 1개 이상에서의 치환인 방법.
33. 제32항에 있어서, 모 항체의 경쇄 가변 도메인이 서열 13의 서열인 방법.
34. 제30항에 있어서, 치환이 Kabat에 따른 잔기 번호부여 시스템 이용시 모 항체의 중쇄 가변 도메인의 아미노산 위치 중 적어도 98H에서의 치환인 방법.
35. 제34항에 있어서, 모 항체의 중쇄 가변 도메인이 서열 14의 서열인 방법.
36. 제1항에 있어서, 항체 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포에서 항체 변이체를 제조하는 것을 포함하는 방법.
37. 제36항에 있어서, 숙주 세포에 의해 제조되는 항체 변이체를 이종 분자와 접합시키는 것을 포함하는 방법.
38. 제36항의 방법에 따라 제조된 항체 변이체.
39. 모 항체의 초가변 영역내에 있거나 또는 이 영역과 인접한 아미노산 변형을 포함하며, 이 변형이 항체 변이체와 이 변이체와 결합하는 항원 사이의 전하 상보성을 증가시키는 것인, 모 항체의 항체 변이체.
40. 제39항에 있어서, 변형이 모 항체의 초가변 영역내의 아미노산 치환인 항체 변이체.
41. 제39항에 있어서, 변형이 모 항체의 초가변 영역내에 있거나 또는 이 영역과 인접한 아미노산 삽입이며, 삽입된 아미노산이 항원과 결합하지 않는 것인 항체 변이체.
42. 제39항에 있어서, 항원이 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)인 항체 변이체.
43. 제42항에 있어서, SATKKIKNYLN (서열 6) 또는 SATKKITNYLN (서열 7)로부터 선택된 CDR L1 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 변이체.
44. 제43항에 있어서, 서열 3 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 변이체.
45. 제42항에 있어서, 서열 5, 서열 8, 서열 9 또는 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함하는 항체 변이체.
46. 제39항에 있어서, 항원이 조직 인자 (TF)인 항체 변이체.
47. 제46항에 있어서, 모 항체가 D3H44인 항체 변이체.
48. 제39항에 있어서, 항원이 HER2인 항체 변이체.
49. 제48항에 있어서, 모 항체가 모 항체 4D5인 항체 변이체.
50. 제39항의 항체 변이체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
51. 제39항의 항체 변이체를 코딩하는 단리된 핵산.
52. 제51항의 핵산을 포함하는 벡터.
53. 제51항의 핵산으로 형질전환된 숙주 세포.
54. 제53항의 숙주 세포를 배양하여 핵산을 발현시키는 것을 포함하는, 항체 변이체의 제조 방법.
55. 제54항에 있어서, 항체 변이체를 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
56. 제55항에 있어서, 항체 변이체를 숙주 세포 배양 배지로부터 회수하는 방법.
57. (1) 항체 및 항원을 용액 중에서 합하는 단계; 및

    (2) 항체-항원 결합체의 형성을 시간에 따라 측정하는 단계

    를 포함하는, 항체의 항원 결합 속도를 측정하는 방법.
58. 제57항에 있어서, 상기 단계 (2)가 항체-항원 결합체의 형광 방출 강도를 측정하는 것을 포함하는 방법.
59. 제57항에 있어서, 항체 또는 항원이 항원-항체 결합 계면 (interface)에서 트립토판 잔기를 포함하며, 상기 단계 (2)에서 트립토판 잔기가 묻혀있는 경우에 변화하는 트립토판 잔기의 형광 방출 강도를 측정하는 것인 방법.
60. 제57항에 있어서, 항원이 혈관 내피 성장 인자인 방법.
61. 제57항에 있어서, 항체가 10⁵M^-1초^-1보다 더 느린 항원 결합 상수를 갖는 것인 방법.