ES2457072T3 - Anticuerpos optimizados que seleccionan como diana CD19 - Google Patents

Abstract

Anticuerpo que se une a CD19, que comprende una CDR1 de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada y una CDR3 de cadena pesada representadas en SEQ ID NO: 40; y una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una CDR3 de cadena ligera representadas en SEQ ID NO: 58, en el que la numeración es según Kabat.

Description

Anticuerpos optimizados que seleccionan como diana CD19

5 Antecedentes

Células B

Las células B son linfocitos que desempeñan un amplio papel en la respuesta inmunitaria humoral. Se producen en la médula ósea de la mayoría de mamíferos y representan el 5-15% de la reserva linfoide circulante. La principal función de las células B es producir anticuerpos contra diversos antígenos y constituyen un componente esencial del sistema inmunitario adaptativo.

El cuerpo humano produce millones de tipos diferentes de células B cada día que circulan en la sangre y la linfa

15 desempeñando el papel de la vigilancia inmunitaria. Las células B, también denominadas linfocitos B, no producen anticuerpos hasta que se activan completamente. Cada célula B tiene una proteína receptora única (denominada receptor de células B (BCR)) en su superficie que se unirá a un antígeno particular. El BCR es una inmunoglobulina unida a membrana y esta molécula es la que permite la distinción de las células B de otros tipos de linfocitos, al tiempo que es el principal receptor implicado en la activación de las células B. Una vez que una célula B encuentra su antígeno relacionado y recibe una señal adicional de una célula T cooperadora, puede diferenciarse adicionalmente en diversos tipos de células B enumerados más adelante. La célula B o bien puede convertirse en uno de estos tipos celulares directamente o bien puede experimentar una etapa de diferenciación intermedia, la reacción del centro germinal, en la que la célula B hipermutará la región variable de su gen de inmunoglobulina y posiblemente experimentará cambio de clase.

25 El desarrollo de las células B se produce a través de varias fases, representando cada fase un cambio en el contenido de genoma en los loci del anticuerpo. Las fases del desarrollo de las células B incluyen células B progenitoras, células pro-B tempranas, células pro-B tardías, células pre-B grandes, células pre-B pequeñas, células B inmaduras y células B maduras.

Las células B maduras pueden dividirse en cuatro tipos principales:

Las células B-1 expresan CD5, un marcador encontrado habitualmente en las células T. Las células B-1 también expresan IgM en mayores cantidades que IgG. Secretan anticuerpos polirreactivos de baja afinidad naturales

35 encontrados en el suero y que a menudo tienen especificidades dirigidas hacia autoantígenos y polisacáridos bacterianos comunes. Las células B-1 están presentes en bajo número en los ganglios linfáticos y en el bazo y en cambio se encuentran predominantemente en las cavidades peritoneal y pleural.

Las células B-2 son las células B convencionales a las que se refieren la mayoría de los textos. Residen en la médula ósea, el bazo y los ganglios linfáticos. Viven poco tiempo y cuando se activan por antígenos pueden diferenciarse en células B de memoria que producen IgG. En el transcurso de estas respuestas de anticuerpos, la IgG puede experimentar maduración de la afinidad sustancial.

Las células B plasmáticas (también conocidas células plasmáticas) son células B grandes que se han expuesto al

45 antígeno y producen y secretan grandes cantidades de anticuerpos, que ayudan en la destrucción de microbios uniéndose y facilitando la selección como diana por fagocitos, así como la activación del sistema del complemento. Las células plasmáticas se denominan en ocasiones fábricas de anticuerpos.

Las células B de memoria se forman a partir de células B activadas que son específicas para el antígeno encontrado durante la respuesta inmunitaria primaria. Estas células viven mucho tiempo y pueden responder rápidamente tras una segunda exposición al mismo antígeno.

Cuando una célula B omite alguna etapa del proceso de maduración, morirá mediante un mecanismo denominado apoptosis. Si reconoce un autoantígeno durante el proceso de maduración, la célula B se suprimirá (lo que se

55 conoce como anergia) o experimentará apoptosis. Las células B se producen continuamente en la médula ósea, pero sólo una pequeña parte de las células B recién formadas sobreviven para participar en la reserva de células B periférica que viven mucho tiempo.

En los últimos años, han surgido datos que sugieren que los linfocitos B desempeñan un papel más amplio en las respuestas inmunitarias y no son meramente los receptores pasivos de señales que dan como resultado la diferenciación en células plasmáticas productoras de anticuerpos. Junto con sus papeles tradicionales como células presentadoras de antígenos y precursores de células plasmáticas productoras de anticuerpos, también se ha encontrado que las células B regulan las funciones de las células presentadoras de antígenos (APC) y de las células T, producen citocinas y expresan pares de receptor/ligando, lo que anteriormente se había pensado que estaba

65 limitado a otros tipos de células.

Trastornos de células B

Debido a su papel crítico en la regulación del sistema inmunitario, la desregulación de células B está asociada con una variedad de trastornos. Los trastornos de las células B, también denominados en el presente documento

5 enfermedades relacionadas con células B, se dividen en proliferación excesiva o no controlada (linfomas, leucemias) y defectos del desarrollo de células B/producción de inmunoglobulinas (inmunodeficiencias) La mayoría de los casos de linfoma (80%) tienen como origen las células B. Estos incluyen el linfoma no Hodgkin (LNH), la leucemia linfoblástica aguda (LLA) y enfermedades relacionadas con la autoinmunidad.

El LNH es un tumor maligno heterogéneo que se origina a partir de linfocitos. En los Estados Unidos (EE. UU.), se estima que la incidencia es de 65.000/año con una mortalidad de aproximadamente 20.000 (American Cancer Society, 2006; y SEER Cancer Statistics Review). La enfermedad puede producirse en todas las edades, iniciándose la aparición habitual en adultos mayores de 40 años, aumentando la incidencia con la edad. El LNH se caracteriza por una proliferación clonal de linfocitos que se acumulan en los ganglios linfáticos, la sangre, la médula ósea y el

15 bazo, aunque puede resultar implicado cualquier órgano principal.

El diagnóstico y la caracterización histológica del LNH se realizan usando una combinación de criterios morfológicos e inmunofenotípicos. El sistema de clasificación actual usado por patólogos y clínicos es la clasificación de tumores de la Organización Mundial de la Salud (OMS) que organiza al LNH en neoplasmas de células T o células B precursoras y maduras. La PDQ divide actualmente el LNH como indolente o agresivo para la entrada en ensayos clínicos. Por coherencia, el presente documento también usará una división similar. El grupo de LNH indolente comprende principalmente subtipos foliculares, linfoma linfocítico pequeño, MALT y de zona marginal; indolente engloba a aproximadamente el 50% de los pacientes con LNH de células B recién diagnosticado. El LNH agresivo incluye pacientes con diagnósticos histológicos principalmente de células B grandes difusas (el 40% de todos los

25 pacientes recién diagnosticados tienen células grandes difusas), de Burkitt y de células del manto.

La evolución clínica del LNH es altamente variable. Un determinante principal de la evolución clínica es el subtipo histológico. Se considera que la mayoría de los tipos indolentes de LNH son enfermedades incurables. Los pacientes responden inicialmente o bien a quimioterapia o bien a terapia con anticuerpos y la mayoría sufrirán recidiva. Los estudios hasta la fecha no han demostrado una mejora en la supervivencia con la intervención temprana. En pacientes asintomáticos, resulta aceptable “observar y esperar” hasta que el paciente se convierte en sintomático o el ritmo de la enfermedad parece acelerarse. A lo largo del tiempo, la enfermedad puede transformarse en una histología más agresiva. La mediana de supervivencia es de 8 a 10 años y los pacientes indolentes a menudo reciben 3 o más tratamientos durante la fase de tratamiento de su enfermedad. El tratamiento inicial del

35 paciente con LNH indolente sintomático ha sido históricamente quimioterapia de combinación. Los agentes usados más comúnmente incluyen: ciclofosfamida, vincristina y prednisona (CVP); ciclofosfamida, adriamicina, vincristina, prednisona (CHOP); o el análogo de purina, fludarabina. Aproximadamente del 70% al 80% de los pacientes responderán a su quimioterapia inicial, siendo la duración de las remisiones del orden de 2-3 años. Finalmente, la mayoría de los pacientes sufren recidiva. El descubrimiento y el uso clínico del anticuerpo anti-CD20, rituximab, ha proporcionado mejoras significativas en la tasa de respuesta y de supervivencia. El tratamiento de referencia actual para la mayoría de los pacientes es rituximab + CHOP (R-CHOP) o rituximab + CVP (R-CVP). El interferón se ha aprobado para el tratamiento inicial del LNH en combinación con agentes alquilantes, pero tiene un uso limitado en los EE. UU.

45 Se ha demostrado que la terapia con rituximab es eficaz en varios tipos de LNH y actualmente está aprobada como tratamiento de primera línea tanto para el LNH indolente (linfoma folicular) como para el agresivo (linfoma de células B grandes difusas). Sin embargo, hay limitaciones significativas del anticuerpo monoclonal (AcM) anti-CD20, incluyendo resistencia primaria (respuesta del 50% en pacientes indolentes con recidiva), resistencia adquirida (tasa de respuesta del 50% con tratamiento de nuevo), respuesta completa poco común (tasa de respuesta completa del 2% en la población con recidiva) y un patrón de recidiva continuado. Finalmente, muchas células B no expresan CD20 y por tanto muchos trastornos de células B no pueden tratarse usando terapia con anticuerpos anti-CD20. Los anticuerpos contra antígenos distintos a CD20 pueden tener efectos anti-linfoma que podrían superar la resistencia anti-CD20 o aumentar la actividad de la terapia anti-CD20.

55 Además del LNH, hay varios tipos de leucemias que resultan de la desregulación de las células B. La leucemia linfocítica crónica (también conocida como “leucemia linfoide crónica” o “LLC”), es un tipo de leucemia de adulto producida por una acumulación anómala de linfocitos B. En la LLC, los linfocitos tumorales pueden parecer normales y maduros, pero no pueden hacer frente eficazmente a la infección. La LLC es la forma más común de leucemia en adultos. Los hombres tienen el doble de probabilidades de desarrollar LLC que las mujeres. Sin embargo, el factor de riesgo clave es la edad. Más del 75% de los nuevos casos se diagnostican en pacientes con más de 50 años de edad. Se diagnostican más de 10.000 casos cada año y la mortalidad es casi de 5.000 al año (American Cancer Society, 2006; y SEER Cancer Statistics Review).

La LLC es una enfermedad incurable pero que avanza lentamente en la mayoría de los casos. Muchas personas con

65 LLC llevan vidas normales y activas durante muchos años. Debido a su lenta aparición, la LLC en fase temprana generalmente no se trata puesto que se cree que la intervención temprana de la LLC no mejora el tiempo de supervivencia o la calidad de vida. En cambio, se monitoriza el estado a lo largo del tiempo. Los tratamientos iniciales para la LLC varían dependiendo del diagnóstico exacto y de la progresión de la enfermedad. Hay muchos agentes usados para la terapia de la LLC. Aunque se demostró que el análogo de purina, fludarabina, facilita tasas de respuesta superiores al clorambucilo como terapia principal, no hay pruebas de que el uso temprano de

5 fludarabina mejore la supervivencia global. Los regímenes de quimioterapia de combinación tales como fludarabina con ciclofosfamida, FCR (fludarabina, ciclofosfamida y rituximab) y CHOP son eficaces tanto en la LLC recién diagnosticada como con recidiva. Raramente se usa el trasplante alogénico de médula ósea (células madres) como tratamiento de primera línea para la LLC debido a su riesgo.

La LLC “resistente” es una enfermedad que ya no responde favorablemente al tratamiento. En este caso, se consideran terapias más agresivas, incluyendo trasplante de médula ósea (células madre). Puede usarse el anticuerpo monoclonal alemtuzumab, dirigido contra CD52, en pacientes con enfermedad resistente, basada en médula ósea.

15 Otro tipo de leucemia es la leucemia linfoblástica aguda (LLA), también conocida como leucemia linfocítica aguda. La LLA se caracteriza por la producción en exceso y la multiplicación continua de glóbulos blancos tumorales e inmaduros (también conocidos como linfoblastos) en la médula ósea. “Aguda” se refiere al estado inmaduro, no diferenciado de los linfocitos circulantes (“blastos”) y a que la enfermedad avanza rápidamente con una expectativa de vida de semanas a meses si no se trata. La LLA es más común en la infancia con una incidencia pico de 4-5 años de edad. Los niños con 12-16 años fallecen más fácilmente de ella que otros. Actualmente, al menos el 80% de la LLA infantil se considera curable. Cada año se diagnostican menos de 4.000 casos y la mortalidad es de casi 1.500 al año (American Cancer Society, 2006; y SEER Cancer Statistics Review).

La autoinmunidad resulta de un fallo de la autotolerancia que implica mecanismos inmunitarios humorales y/o

25 mediados por células. Entre las consecuencias del fallo en la tolerancia central y/o periférica, están la supervivencia y la activación de células T y células B autorreactivas. Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES o lupus), esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren y púrpura trombocitopénica idiopática (PTI). La patogénesis de la mayoría de las enfermedades autoinmunitarias está asociada a la producción de autoanticuerpos contra autoantígenos, lo que conduce a una variedad de patologías asociadas. Los autoanticuerpos se producen por células plasmáticas diferenciadas de manera terminal que se derivan de células B vírgenes o de memoria. Además, las células B pueden tener otros efectos sobre la patología inmunitaria, como células presentadoras de antígeno (APC) que pueden interaccionar con y estimular a las células T auxiliares, estimulando adicionalmente el ciclo de la respuesta autoinmunitaria. La reducción de células B puede tener un impacto directo sobre la producción de autoanticuerpos. De hecho, se ha

35 demostrado que el tratamiento de AR y LES con terapias de reducción de células B tales como con Rituxan tienen beneficio clínico para ambas clases de enfermedad (Edwards & Cambridge, Nat. Rev. Immunol. 2006; Dass et al., Future Rheumatol. 2006; Martin & Chan, Annu. Rev. Immunol. 2006).

Desgraciadamente, no se conoce a priori qué mecanismos de acción pueden ser óptimos para un antígeno diana dado. Además, no se conoce qué anticuerpos pueden mediar un mecanismo de acción dado contra una célula diana. En algunos casos, una falta de actividad del anticuerpo, o bien mediada por Fv o bien mediada por Fc, puede deberse a la selección como diana de un epítopo en el antígeno diana que es insuficiente para mediar tal actividad. En otros casos, el epítopo seleccionado como diana puede ser apto para una actividad deseada mediada por Fv o mediada por Fc, aunque la afinidad (afinidad de la región Fv por el antígeno o afinidad de la región Fc por receptores

45 de Fc) puede ser insuficiente. Para abordar este problema, la presente invención describe modificaciones en anticuerpos anti-CD19 que proporcionan actividades optimizadas mediadas por Fv y Fc. Se contempla una amplia serie de aplicaciones de estos anticuerpos optimizados.

Sumario de la invención

La invención se refiere particularmente a un anticuerpo que se une a CD19 y que comprende una CDR1 de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada y una CDR3 de cadena pesada representadas en SEQ ID NO: 40 y una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una CDR3 de cadena ligera representadas en SEQ ID NO: 58, en el que la numeración es según Kabat.

55 En un aspecto, la presente descripción se refiere a un anticuerpo que se une a CD19, en el que dicho anticuerpo comprende al menos una modificación en la región constante en relación con un anticuerpo original y en el que el anticuerpo de la descripción se une con afinidad alterada a un receptor de Fc o altera la función efectora en comparación con el anticuerpo original.

En un aspecto, la descripción se refiere a un anticuerpo que se une a CD19, que incluye al menos una modificación en la región constante en relación con un anticuerpo anti-CD19 original, en la que el anticuerpo se une con afinidad aumentada para el receptor Fc!RIIIa en comparación con el anticuerpo original.

65 En aspectos adicionales, la modificación de aminoácido es 332E. En determinadas realizaciones preferidas la segunda modificación de aminoácido es 239D.

En otros aspectos, la modificación es una modificación de glicoforma que reduce el nivel de fucosa en relación con el anticuerpo original. Todavía en otros aspectos, la invención se refiere a una composición que incluye una pluralidad de anticuerpos glicosilados, en la que aproximadamente el 80-100% de los anticuerpos glicosilados en la

5 composición comprende una estructura de hidrato de carbono central madura que carece de fucosa.

En una realización adicional, el anticuerpo reduce la unión a Fc!RIIb en comparación con el anticuerpo anti-CD19 original.

En variaciones dadas a conocer adicionales, el anticuerpo tiene una secuencia de cadena pesada variable seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 13-16, 20-23 y 27-44, y/o una secuencia de cadena ligera variable seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 17-19, 24-26 y 45-79.

En diversos aspectos adicionales, la descripción se refiere a una secuencia de ácido nucleico que codifica para 15 cualquiera de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento.

En aspectos adicionales, se refiere a un método de tratamiento de una enfermedad relacionada con células B administrando un anticuerpo según la reivindicación 1. En determinadas variaciones, la enfermedad se selecciona de linfomas no Hodgkin (LNH), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma/leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) y linfoma de células del manto (LCM). En determinados aspectos, la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria, tal como artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES o lupus), esclerosis múltiple, síndrome de Sjorgen y púrpura trombocitopénica idiopática (PTI).

En aspectos adicionales, la invención se refiere a una composición que comprende un anticuerpo descrito en el 25 presente documento y un portador aceptable.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos ilustran adicionalmente aspectos de la invención y no pretenden restringir la invención a ninguna aplicación o teoría de funcionamiento particular.

Figura 1: Secuencia de aminoácidos de CD19 de Homo sapiens, tal como se obtiene a partir del clon de ADNc, MGC:12802, IMAGE:4054919, registro de GenBank: BC006338.

35 Figura 2. Secuencias de las regiones constantes de anticuerpos naturales, incluyendo la cadena ligera constante kappa y las cadenas pesadas constantes gamma para IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. También se proporciona la secuencia de una cadena constante de IgG híbrida y de una cadena constante de IgG híbrida que comprende las sustituciones 239D e I332E.

Figura 3. Alineación de las secuencias de aminoácidos de las inmunoglobulinas IgG humanas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, la figura 3a proporciona las secuencias de los dominios CH1 (C!1) y bisagra y la figura 3b proporciona las secuencias de los dominios CH2 (C!2) y CH3 (C!3). Las posiciones se numeran según el índice EU de la secuencia de IgG1 y las diferencias entre IgG1 y las otras inmunoglobulinas IgG2, IgG3 e IgG4 se muestran en gris. Existen polimorfismos alotípicos en varias posiciones y por tanto pueden existir ligeras diferencias entre las secuencias

45 presentadas y las secuencias en la técnica anterior. Están marcados los posibles comienzos de la región Fc, definidos en el presente documento o bien como la posición de EU 226 o bien la 230.

Figura 4. Los haplotipos comunes de la cadena gamma de la IgG1 (figura 4a) e IgG2 (figura 4b) humanas que muestran las posiciones y las sustituciones de aminoácidos relevantes.

Figura 5. Realizaciones preferidas de perfiles de unión de receptor que incluyen aumentos en, reducciones en o ausencia de efecto en la unión a diversos receptores, pudiendo ser tales cambios beneficiosos en determinados contextos.

55 Figura 6. Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera de los anticuerpos originales 4G7 y HD37 (H0 y L0). La figura 6a proporciona las secuencias de los dominios VH y VL y la figura 6b proporciona las secuencias de las CDR. Los límites de CDR se determinan según la convención de Kabat (CDR1 de VH: 31-35b, CDR2 de VH: 50-65, CDR3 de VH: 95-102, CDR1 de VL: 24-34, CDR2 de VL: 50-56 y CDR3 de VL: 89-97).

Figura 7. Las afinidades de unión relativas de S239D/I332E híbrido de 4G7 y el anticuerpo IgG1 de 4G7 a un panel de receptores de Fc.

Figura 8. ADCC de S239D/I332E híbrido de 4G7, S239D/I332E híbrido de HD37, IgG1 de 4G7, IgG1 de HD37 y un

65 anticuerpo de control negativo en la línea celular Daudi (figura 8a) y ADCC de S239D/I332E híbrido de 4G7, IgG1 de 4G7, rituximab y un anticuerpo de control negativo en las líneas celulares SUP-B15 y Raji (figura 8b).

Figura 9. Un ensayo de unión a la superficie celular de S239D/I332E híbrido de 4G7 a células Raji.

Figura 10. La figura 10a muestra ensayos de ADCC de S239D/I332E híbrido de 4G7, IgG1 de 4G7 y rituximab en un

5 panel de 14 líneas celulares que representan diversos linfomas y leucemias. La potencia (CE50) y la eficacia (% de ADCC) de ambos parámetros se normalizan con respecto a la de rituximab (anti-CD20). La figura 10b enumera líneas celulares de linfoma y leucemia sometidas a prueba.

Figura 11. Secuencias de región variable de cadena pesada con inmunogenicidad reducida para el anticuerpo 4G7 anti-CD19.

Figura 12. Secuencias de región variable de cadena ligera con inmunogenicidad reducida para el anticuerpo 4G7 anti-CD19.

15 Figura 13. Secuencias de región variable de cadena pesada con inmunogenicidad reducida para el anticuerpo HD37 anti-CD19.

Figura 14. Secuencias de región variable de cadena ligera con inmunogenicidad reducida para el anticuerpo HD37 anti-CD19.

Figura 15. Resultados de un ensayo de unión a la superficie celular de variantes de 4G7 de inmunogenicidad reducida a células Raji (figura 15a) y ADCC de S239D/I332E híbrido de HD37_H2L1 e S239D/I332E híbrido de 4G7_H1L3 en células MEC-1 (figura 15b).

25 Figura 16. Afinidad de unión celular en células RS4;11 de 4G7 madurados por afinidad en relación con el AcM H1L1.

Figura 17. Datos de unión celular a células RS4;11 de variantes de 4G7 incubadas durante 5 días a 37ºC, pH 9,0 en Tris-HCL 200 mM que muestran la mejora en la estabilidad obtenida.

Figura 18. Secuencias para variantes de cadena pesada de anticuerpos anti-CD19 que aumentan la afinidad y/o la estabilidad.

Figura 19. Secuencias para variantes de cadena ligera de anticuerpos anti-CD19 que aumentan la afinidad y/o estabilidad.

35 Figura 20. Propiedades antiproliferativas de S239D/I332E híbrido de 4G7 en células Raji.

Figura 21. Propiedades antiproliferativas de S239D/I332E híbrido de estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 en células SU-DHL-6 con y sin reticulación.

Figura 22. Fagocitosis de células Raji y RS4;11 con S239D/I332E híbrido de estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7.

Figura 23. ADCC de S239D/I332E híbrido de estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 contra múltiples líneas 45 celulares de linfoma usando linfocitos citolíticos naturales (NK) purificados.

Figura 24. S239D/I332E híbrido de estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 que se une a células 293T transfectadas con CD19 humano.

Figura 25. Reactividad cruzada de S239D/I332E híbrido de estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 a CD19 tanto de cynomolgus como de rhesus.

Figura 26. ADCC en células RS4;11 y MEC-1 usando un anticuerpo anti-CD19 de función efectora potenciada (S239D/I332E híbrido de 4G7 H1L1) con contenido en fucosa inferior proporcionado por la expresión en el sistema

55 Lec13.

Figura 27. Sustituciones individuales realizadas para estabilidad y/o afinidad potenciadas. La numeración de la región variable es según Kabat. Se incluye un conjunto ampliado de posiciones en las CDR. Los límites de CDR canónicos definidos por Kabat, tal como se enumeran en la figura 6, están resaltados en gris.

Figura 28. Variantes de región variable de anticuerpo anti-CD19 construidas para optimizar la afinidad y la estabilidad.

Figura 29. Variantes preferidas y aumento relativo en la afinidad de unión frente al AcM H1L1 original.

65 Figura 30. Ensayo de proliferación de células B, que muestra la capacidad de los anticuerpos anti-CD19 variantes para inhibir la viabilidad de células B primarias. La figura 30a muestra la dependencia de la dosis del anticuerpo antimu en la proliferación de células B. La figura 30b muestra la proliferación de células B en presencia de anticuerpo anti-mu fijo (2 mg/ml) más concentraciones variables de anticuerpos control variantes de Fc anti-CD30 y variantes de Fc y anti-CD19 TN. Anticuerpos Anti-Anti-CD19_IgG1_TN = IgG1_TN de 4G7_H3_L1, anticuerpo anti

5 CD19_híbrido_S239D/I332E = 4G7_H3_L1_híbrido_239D/332E y anticuerpo anti-CD30_S239D/I332E, usados en este caso como control negativo, = AC10_H3.69V2_L3.71_híbrido_239D/332E (tal como se da a conocer en el documento US 2007/0166309, Lazar G.A. et al.).

Descripción detallada de la invención

La descripción se refiere a anticuerpos anti-CD19 modificados y a métodos de uso de los mismos. En diversos aspectos, los anticuerpos pueden tener una región Fc modificada, secuencias de CDR específicas, secuencias de región variable y/o modificaciones de región constante. En diversas realizaciones, los anticuerpos están humanizados. La descripción se refiere además a métodos de uso de los anticuerpos en diversas indicaciones de

15 enfermedad, incluyendo las de origen en células B tales como linfoma no Hodgkin (LNH), leucemia linfoblástica aguda (LLA) y enfermedades autoinmunitarias de origen en células B.

Con el fin de que la invención pueda entenderse más completamente, a continuación se exponen varias definiciones. Se pretende que tales definiciones engloben equivalentes gramaticales.

Mediante “ADCC” o “citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos” tal como se usa en el presente documento se quiere decir la reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan Fc!R reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente producen la lisis de la célula diana. En diversos aspectos, la función efectora de ADCC potenciada puede querer decir potencia potenciada o eficacia

25 potenciada. Mediante “potencia” tal como se usa en el contexto experimental se quiere decir la concentración de anticuerpo cuando se observa un efecto terapéutico particular, CE50 (concentración necesaria para conseguir la mitad de la eficacia máxima). Mediante “eficacia” tal como se usa en el contexto experimental se quiere decir la función efectora posible máxima a niveles de saturación del anticuerpo.

Mediante “ADCP” o fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos tal como se usa en el presente documento se quiere decir la reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan Fc!R reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente producen la fagocitosis de la célula diana.

Mediante “aminoácido” e “identidad de aminoácido” tal como se usa en el presente documento se quiere decir uno

35 de los 20 aminoácidos que se producen de manera natural o cualquier análogo no natural que puede estar presente en una posición específica, definida. Por tanto “aminoácido” tal como se usa en el presente documento significa tanto aminoácidos que se producen de manera natural como sintéticos. Por ejemplo, homofenilamina, citrulina y norleucina se consideran aminoácidos para los fines de la invención. “Aminoácido” también incluye residuos de iminoácido tales como prolina e hidroxiprolina. La cadena lateral puede estar o bien en la configuración (R) o bien en la (S). En la realización preferida, los aminoácidos están en la configuración (S) o L. Si se usan cadenas laterales que no se producen de manera natural, pueden usarse sustituyentes distintos de aminoácidos, por ejemplo para prevenir o retardar la degradación in vivo.

Mediante “célula B” o “linfocito B” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un tipo de linfocito

45 desarrollado en la médula ósea que circula en la sangre y la linfa, y proporciona inmunidad humoral. Las células B reconocen moléculas de antígeno libres y se diferencian o maduran dando lugar a células plasmáticas que secretan inmunoglobulinas (anticuerpos) que inactivan a los antígenos. También pueden generarse células de memoria que producen la inmunoglobulina específica (anticuerpo) en encuentros posteriores con tal antígeno. Las células B también se conocen como “células Beta” en los islotes de Langerhans.

Mediante “antígeno de células B” o “marcador de células B” tal como se usa en el presente documento se quiere decir cualquier proteína que se expresa en células B.

Mediante “CD19” tal como se usa en el presente documento se quiere decir la proteína de SEQ ID NO: 1

55 (representada en la figura 1). CD19 también se conoce como antígeno B4 de la superficie de las células B, antígeno CD19 de células B, CD19 antígeno y Leu-12. El CD19 humano se designa GeneID:930 por Entrez Gene y HGNC:1633 por HGNC. CD19 puede codificarse por el gen designado CD19. El uso de “CD19’’ en el presente documento quiere decir que engloba a todos los alelos y formas polimórficas conocidos o todavía no descubiertos de CD19.

Mediante “CDC” o “citotoxicidad dependiente de complemento” tal como se usa en el presente documento se quiere decir la reacción en la que uno o más componentes proteicos del complemento reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente producen la lisis de la célula diana.

65 Mediante “región constante” tal como se usa en el presente documento se quiere decir el polipéptido que incluye al menos una parte de las primeras tres regiones constantes de un anticuerpo, que tienen al menos una función

efectora. Por tanto, región constante se refiere así a los últimos tres dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD e IgG, y los últimos cuatro dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM, y el extremo N-terminal bisagra flexible para estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, la región constante incluye los dominios de inmunoglobulina Cgamma1, Cgamma2 y Cgamma3 (C!1, C!2 y C!3) y la 5 región bisagra entre Cgamma1 (C!1) y Cgamma2 (C!2). Aunque los límites de la región constante pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de la IgG humana habitualmente se define comprendiendo residuos hasta su extremo carboxilo terminal, siendo la numeración según el índice EU como en Kabat. La cadena ligera constante normalmente comprende un único dominio y tal como se define en el presente documento se refiere a las posiciones 108-214 de C∀ o C#, siendo la numeración según el índice EU. Para los anticuerpos IgG de longitud completa, la 10 cadena pesada constante, tal como se define en el presente documento, se refiere a del extremo N-terminal del dominio CH1 al extremo C-terminal del dominio CH3, o a las posiciones 118-447, siendo la numeración según el índice EU. “Región constante” puede referirse a esta región aislada o a un truncamiento o fusión que incluye anticuerpos, fusiones de Fc, regiones Fc aisladas y fragmentos de Fc. En diversas realizaciones, la región constante puede ser la región del anticuerpo que está codificada por uno de los genes de la región constante de

15 inmunoglobulina de cadena ligera o pesada, es decir, la región de un anticuerpo codificado por los genes de las cadenas ligeras kappa (C∀) o lambda (C#). En diversas realizaciones, la cadena pesada constante o región constante de cadena pesada puede ser la región de un anticuerpo codificada por los genes mu, delta, gamma, alfa o épsilon para definir el isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA o IgE, respectivamente.

20 Mediante “función efectora” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un acontecimiento bioquímico que resulta de la interacción de una región Fc de anticuerpo con un receptor o ligando de Fc. Las funciones efectoras incluyen funciones efectoras medidas por Fc!R tales como ADCC y ADCP y funciones efectoras mediadas por complemento tales como CDC. Mediante “célula efectora” tal como se usa en el presente documento se quiere decir una célula del sistema inmunitario que expresa uno o más receptores de Fc y media una o más funciones

25 efectoras. Las células efectoras incluyen, pero no se limitan a, monocitos, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, plaquetas, células B, linfocitos granulares grandes, células de Langerhans, linfocitos citolíticos naturales (NK) y células T !∃ y pueden proceder de cualquier organismo incluyendo pero sin limitarse a seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos.

30 Mediante “Fab” o “región Fab” tal como se usa en el presente documento se quiere decir los polipéptidos que comprenden los dominios de inmunoglobulina VH, CH1, VH y CL. Fab puede referirse a esta región aislada o a esta región en el contexto de un anticuerpo de longitud completa o fragmento de anticuerpo.

Mediante “Fc” o “región Fc”, tal como se usa en el presente documento se quiere decir el polipéptido que comprende

35 la región constante de un anticuerpo excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante. Por tanto, Fc se refiere a los últimos dos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD e IgG y a los últimos tres dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM y al extremo N-terminal bisagra flexible para estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cgamma2 y Cgamma3 (C!2 y C!3) y la región bisagra entre Cgamma1 (C!1) y Cgamma2 (C!2).

40 Aunque los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de la IgG humana habitualmente se define como que comprende los residuos C226 o P230 para su extremo carboxilo terminal, siendo la numeración según el índice EU como en Kabat. Fc puede referirse a esta región aislada o a esta región en el contexto de un polipéptido de Fc, por ejemplo a un anticuerpo. Mediante “polipéptido de Fc” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un polipéptido que comprende toda o parte de una región Fc. Los polipéptidos de Fc

45 incluyen anticuerpos, fusiones de Fc, regiones Fc aisladas y fragmentos de Fc.

Mediante “receptor gamma de Fc” o “Fc!R” tal como se usa en el presente documento se quiere decir cualquier miembro de la familia de proteínas que se une a la región Fc del anticuerpo IgG. En diversas realizaciones, Fc!R están codificados sustancialmente por los genes de Fc!R. En seres humanos, esta familia incluye, pero no se limita 50 a,Fc!RI (CD64), incluyendo las isoformas Fc!RIa, Fc!RIb y Fc!RIc; Fc!RII (CD32), incluyendo las isoformas Fc!RIIa (incluyendo los alotipos H131 y R131), Fc!RIIb (incluyendo Fc!RIIb-1 y Fc!RIIb-2) y Fc!RIIc; y Fc!RIII (CD16), incluyendo las isoformas Fc!RIIIa (incluyendo los alotipos V158 y F158) y Fc!RIIIb (incluyendo los alotipos Fc-!RIIIb-NA1 y Fc!RIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65), así como cualquier isoforma o alotipo de Fc!R o Fc!R humano no descubierto. Los Fc!R de ratón incluyen, pero no se limitan a, Fc!RI (CD64), Fc!RII (CD32), Fc!RIII

55 (CD16) y Fc!RIII-2 (CD16-2), así como cualquier isoforma o alotipo de Fc!R o Fc!R de ratón no descubierto. Un Fc!R puede proceder de cualquier organismo, incluyendo pero sin limitarse a seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos.

Mediante “ligando de Fc” o “receptor de Fc” tal como se usa en el presente documento se quiere decir una molécula,

60 preferiblemente un polipéptido, procedente de cualquier organismo que se une a la región Fc de un anticuerpo para formar un complejo Fc-ligando. Los ligandos de Fc incluyen, pero no se limitan a, Fc!R, FcRn, Clq, C3, lectina de unión a manano, receptor de manosa, proteína A de Staphylococco, proteína G de Streptococco y Fc!R viral. Los ligandos de Fc también incluyen homólogos del receptor de Fc (FcRH), que son una familia de receptores de Fc que son homólogos a los Fc!R (Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136). Los ligandos de Fc pueden incluir moléculas no descubiertas que se unen a Fc.

Mediante “IgG” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un polipéptido que pertenece a la clase de anticuerpos que están codificados sustancialmente por un gen gamma de inmunoglobulina reconocido. En seres

5 humanos, esta clase comprende IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En ratones, esta clase comprende IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. Mediante “inmunoglobulina (Ig)” en el presente documento se quiere decir una proteína que consiste en uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Las inmunoglobulinas incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos. Las inmunoglobulinas pueden tener varias formas estructurales, incluyendo pero sin limitarse a anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo y dominios de inmunoglobulina individuales. Mediante “dominio de inmunoglobulina (Ig)” en el presente documento se quiere decir una región de una inmunoglobulina que existe como entidad estructural distinta tal como determina un experto en la técnica de la estructura de proteínas. Los dominios de Ig normalmente tienen una topología de plegamiento en sándwich % característica. Los dominios de Ig conocidos en la clase de IgG de anticuerpos son VH, C!1, C!2, C!3, VLy CL.

15 Mediante “modificación” en el presente documento se quiere decir una alteración en las propiedades físicas, químicas o de secuencia de una proteína, polipéptido, anticuerpo o inmunoglobulina. Las modificaciones preferidas de la invención son modificaciones de aminoácido y modificaciones de glicoforma.

Mediante “modificación de aminoácido” en el presente documento se quiere decir una sustitución, inserción y/o deleción de aminoácido en una secuencia polipeptídica. Mediante “sustitución de aminoácido” o “sustitución” en el presente documento se quiere decir el reemplazo de un aminoácido en una posición particular en una secuencia polipeptídica original por otro aminoácido. Por ejemplo, la sustitución I332E se refiere a un polipéptido variante, en este caso a una variante de cadena pesada constante, en la que la isoleucina en la posición 332 se reemplaza por ácido glutámico. El residuo TN puede designarse o no. Para el ejemplo anterior, 332E indica la sustitución de

25 posición 332 con un ácido glutámico. Para los fines en el presente documento, las sustituciones múltiples normalmente están separadas por una barra oblicua. Por ejemplo, 239D/332E se refiere a una variante doble que comprende las sustituciones 239D y 332E. Mediante “inserción de aminoácido” o “inserción” tal como se usa en el presente documento se quiere decir la adición de un aminoácido en una posición particular en una secuencia polipeptídica original. Por ejemplo, el inserto -236 designa una inserción de glicina en la posición 236. Mediante “deleción de aminoácido” o “deleción” tal como se usa en el presente documento se quiere decir la eliminación de un aminoácido en una posición particular en una secuencia polipeptídica original. Por ejemplo, G236-designa la deleción de glicina en la posición 236.

Mediante “modificación de glicoforma” o “glicoforma modificada” o “glicoforma modificada por ingeniería genética” tal

35 como se usa en el presente documento se quiere decir una composición de hidrato de carbono que se une covalentemente a una proteína, por ejemplo a un anticuerpo, difiriendo dicha composición de hidrato de carbono químicamente de la de una proteína original. Glicoforma modificada normalmente se refiere al hidrato de carbono u oligosacárido diferente; por tanto por ejemplo un anticuerpo puede comprender una glicoforma modificada. Alternativamente, glicoforma modificada puede referirse al anticuerpo que comprende el hidrato de carbono u oligosacárido diferente.

Mediante “polipéptido original”. “proteína original”, “polipéptido precursor” o “proteína precursora” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un polipéptido no modificado que se modifica posteriormente para generar una variante. Dicho polipéptido original puede ser un polipéptido que se produce de manera natural o una variante o

45 versión modificada por ingeniería genética de un polipéptido de que produce de manera natural. Polipéptido original puede referirse al propio polipéptido, a composiciones que comprenden el polipéptido original o la secuencia de aminoácidos que codifica para él. Por consiguiente, mediante “anticuerpo original” o “inmunoglobulina original” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un anticuerpo o inmunoglobulina que se modifica para generar una variante. Mediante “anticuerpo anti-CD19 original” o “inmunoglobulina anti-CD19 original” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un anticuerpo o inmunoglobulina que se une a CD19 y se modifica para generar una variante.

Mediante “proteína” o “polipéptido” tal como se usa en el presente documento se quiere decir al menos dos aminoácidos unidos covalentemente, que incluyen proteínas, polipéptidos, oligopéptidos y péptidos. La proteína

55 puede estar constituida por aminoácidos que se producen de manera natural y enlaces peptídicos o estructuras peptidomiméticas sintéticas, es decir “análogos”, tal como peptoides.

Mediante “posición” tal como se usa en el presente documento se quiere decir una ubicación en la secuencia de una proteína. Las posiciones pueden numerarse secuencialmente, o según un formato establecido, por ejemplo el índice EU como en Kabat. Las posiciones correspondientes se determinan tal como se explica resumidamente en el presente documento, generalmente a través de la alineación con otras secuencias originales.

Mediante “residuo” tal como se usa en el presente documento se quiere decir una posición en una proteína y su identidad de aminoácido asociada. Por ejemplo, asparagina 297 (también denominada Asn297 y N297) es un

65 residuo en la posición 297 en el anticuerpo IgG1 humano.

Mediante “antígeno diana” o “diana” o “antígeno” tal como se usa en el presente documento se quiere decir la molécula que se une específicamente mediante la región variable de un anticuerpo dado. Un antígeno diana puede ser una proteína, hidrato de carbono, lípido u otro compuesto químico. Mediante “célula diana” tal como se usa en el presente documento se quiere decir una célula que expresa un antígeno diana.

5 Mediante “región variable” se quiere decir la región variable de una cadena pesada o cadena ligera de anticuerpo. La región variable de cadena pesada (VH), tal como se define en el presente documento, se refiere a del extremo Nterminal al extremo C-terminal del dominio VH, definido por los residuos 1-113 según la convención de numeración de Kabat. La región variable de cadena ligera (VL), tal como se define en el presente documento, se refiere a del extremo N-terminal al extremo C-terminal del dominio VL, definido por los residuos 1-107 según la convención de numeración de Kabat. Los expertos en la técnica reconocerán que la convención de numeración de la región variable de Kabat emplea letras para explicar la longitud variable de las CDR. Por tanto, que una VH se defina por los residuos de Kabat 1-113 y que una VL se defina por Kabat 1-107, no significa necesariamente que el dominio VH contenga exactamente 113 residuos, ni que VL contenga exactamente 107 residuos. En cambio, los residuos 1-113

15 de VH y 1-107 de VL según Kabat quieren decir que engloban los dominios estructurales que se determinaron mediante alineaciones de secuencia de un gran conjunto de regiones variables de anticuerpo de longitud variable de longitudes variables ((Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). En determinadas realizaciones, la región variable puede comprender uno o más dominios de Ig codificados sustancialmente por cualquiera de los genes de V∀, V# y/o VH que constituyen los loci genéticos de inmunoglobulina de cadena kappa, lambda y pesada respectivamente.

Mediante “proteína variante”, “variante de proteína”, “polipéptido variante” o “variante de polipéptido” tal como se usa en el presente documento se quiere decir una secuencia polipeptídica que difiere de la de una secuencia polipeptídica original en virtud de al menos una modificación de aminoácido. Polipéptido variante puede referirse al

25 propio polipéptido, a una composición que comprende el polipéptido o a la secuencia de aminoácidos que codifica para él. Preferiblemente, el polipéptido variante tiene al menos una modificación de aminoácido en comparación con el polipéptido original, por ejemplo desde aproximadamente una hasta aproximadamente diez modificaciones de aminoácido, y preferiblemente desde aproximadamente una hasta aproximadamente cinco modificaciones de aminoácido en comparación con el original. La secuencia polipeptídica variante en el presente documento presentará preferiblemente al menos aproximadamente una homología del 80% con una secuencia polipeptídica original, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente una homología del 90%, más preferiblemente al menos aproximadamente una homología del 95%. Por consiguiente, mediante “anticuerpo variante” o “variante de anticuerpo” tal como se usa en el presente documento se quiere decir una secuencia de anticuerpo que difiere de una secuencia de anticuerpo original en virtud de al menos una modificación de aminoácido. Variante de anticuerpo

35 puede referirse al propio anticuerpo polipéptido, a composiciones que comprenden el polipéptido variante de anticuerpo o a la secuencia de aminoácidos que codifica para él. Por consiguiente, mediante “anticuerpo variante” o “variante de anticuerpo” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un anticuerpo, tal como se definió anteriormente que difiere en secuencia de la de una secuencia de anticuerpo original en virtud de al menos una modificación de aminoácido. Anticuerpo variante puede referirse a la propia proteína, a composiciones que comprenden la proteína o a la secuencia de aminoácidos que codifica para ella. Por consiguiente, mediante “variante de cadena pesada constante” o “variante de cadena ligera constante” o “variante de Fc” tal como se usa en el presente documento se quiere decir una cadena pesada constante, cadena ligera constante o polipéptido o secuencia de región Fc, respectivamente, que difiere en secuencia de la de una secuencia original en virtud de al menos una modificación de aminoácido.

45 Mediante “tipo natural o TN” en el presente documento se quiere decir un secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza, incluyendo variaciones alélicas. Una proteína, polipéptido, anticuerpo, inmunoglobulina, IgG, etc., TN, tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que no se ha modificado de manera intencionada.

Para todas las posiciones de región constante de cadena pesada de inmunoglobulina comentadas en la presente invención, la numeración es según el índice EU como en Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda). El “índice EU como en Kabat” se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo EU de IgG1 humana, tal como se

55 describe en Edelman et al., 1969, Biochemistry 63:78-85.

Anticuerpos

Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” se refiere a una proteína monomérica o multimérica que comprende una o más cadenas polipeptídicas. Un anticuerpo se une específicamente a un antígeno (por ejemplo CD19) y puede modular la actividad biológica del antígeno. Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo” puede incluir “anticuerpo de longitud completa” y “polipéptido de Fc.”

Mediante “anticuerpo de longitud completa” en el presente documento se quiere decir la estructura que constituye la

65 forma biológica natural de un anticuerpo, incluyendo las regiones variable y constante. Por ejemplo, en la mayoría de los mamíferos, incluyendo seres humanos y ratones, el anticuerpo de longitud completa de la clase IgG es un tetrámero y consiste en dos pares idénticos de dos cadenas de inmunoglobulina, teniendo cada par una cadena ligera y una pesada, comprendiendo cada cadena ligera los dominios de inmunoglobulina VL y CL y comprendiendo cada cadena pesada los dominios de inmunoglobulina VH, CH1 (C!1), CH2 (C!2) y CH3 (C!3). En algunos mamíferos, por ejemplo en camellos y llamas, los anticuerpos IgG pueden consistir en sólo dos cadena pesadas,

5 comprendiendo cada cadena pesada un dominio variable unido a la región Fc.

El término “anticuerpo” también incluye fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo específicos incluyen, pero no se limitan a, (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAc (Ward et al., 1989, Nature 341:544-546) que consiste en una única variable, (v) las regiones CDR aisladas, (vi) los fragmentos F(ab’)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos, (vii) las moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), en las que un dominio VH y un dominio VL están unidos por un ligador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno (Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883), (viii) dímeros de Fv

15 biespecíficos de cadena sencilla (documento WO 93/011161) y (ix) “diacuerpos” o “triacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión génica (Tomlinson et al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; documento WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448). En determinadas realizaciones, se producen anticuerpos mediante técnicas de ADN recombinante. Otros ejemplos de formatos y arquitecturas de anticuerpos se describen en Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):11261136, y Carter 2006, Nature Reviews Immunology 6:343-357 y referencias citadas en los mismos. En realizaciones adicionales, los anticuerpos se producen mediante escisión enzimática o química de anticuerpos que se producen en la naturaleza.

Las unidades estructurales de anticuerpo natural normalmente comprenden un tetrámero. Cada tetrámero

25 normalmente está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (que normalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una “pesada” (que normalmente tiene un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Cada una de las cadenas ligera y pesada están constituidas por dos regiones distintas, denominadas las regiones variable y constante. Para la clase IgG de inmunoglobulinas, la cadena pesada está compuesta por cuatro dominios de inmunoglobulina unidos desde el extremo N-terminal hasta el C-terminal en el orden VH-CH1-CH2-CH3, en referencia al dominio variable de cadena pesada, dominio constante cadena pesada 1, dominio constante de cadena pesada 2 y dominio constante de cadena pesada 3, respectivamente (también denominado VH-C!1-C!2-C!3, en referencia al dominio variable de cadena pesada, dominio constante gamma 1, dominio constante gamma 2 y dominio constante gamma 3, respectivamente). La cadena ligera de IgG está compuesta por dos dominios de inmunoglobulina unidos desde el

35 extremo N-terminal hasta el C-terminal en el orden VL-CL, en referencia al dominio variable de cadena ligera y al dominio constante de cadena ligera, respectivamente. Las regiones constantes muestran menos diversidad de secuencia y son responsables de unir varias proteínas naturales para provocar importantes acontecimientos bioquímicos.

La región variable de un anticuerpo contiene determinantes de unión a antígeno de la molécula, y por tanto determina la especificidad de un anticuerpo para su antígeno diana. La región variable se denomina así porque es la más distinta en secuencia de otros anticuerpos dentro de la misma clase. En la región variable, se unen tres bucles por cada uno de los dominios V de la cadena pesada y la cadena ligera para formar un sitio de unión a antígeno. Cada uno de los bucles se denomina región determinante de complementariedad (denominada a continuación en el 45 presente documento “CDR”), en la que la variación en la secuencia de aminoácidos es la más significativa. Hay 6 CDR totales, tres cada por cadena pesada y ligera, denominadas CDR1 de VH, CDR2 de VH, CDR3 de VH, CDR1 de VL, CDR2 de VL y CDR3 de VL. La región variable fuera de las CDR se denomina la región de entramado (FR). Aunque no de manera tan diversa como las CDR, sí se produce variabilidad de secuencia en la región FR entre diferentes anticuerpos. En general, esta arquitectura característica de anticuerpos proporciona una estructura principal estable (la región FR) en la que puede examinarse la diversidad de unión a antígeno sustancial (las CDR) por el sistema inmunitario para obtener especificidad para una amplia serie de antígenos. Se dispone de varias estructuras de alta resolución para una variedad de fragmentos de región variable procedentes de diferentes organismos, algunas no unidas y algunas en complejo con antígeno. Las características de secuencia y estructurales de las regiones variables de los anticuerpo se dan a conocer, por ejemplo, en Morea et al., 1997,

55 Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279, y las características conservadas de los anticuerpos se dan a conocer, por ejemplo, en Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376.

Los anticuerpos se agrupan en clases, también denominadas isotipos, tal como se determina genéticamente por la región constante. Las cadenas ligeras constantes humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa (C∀) y lambda (C#). Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon y definen el isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. La clase de IgG se usa lo más comúnmente para fines terapéuticos. En seres humanos, esta clase comprende las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En ratones, esta clase comprende las subclases IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. IgM tiene subclases, incluyendo pero sin limitarse a IgM1 e IgM2. IgA tiene varias subclases, incluyendo pero sin limitarse a IgA1 e IgA2. Por tanto, “isotipo” tal como se usa 65 en el presente documento se quiere decir cualquiera de las clases o subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes. Los isotipos de inmunoglobulinas humanas

conocidos son IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD e IgE. La figura 2 proporciona las secuencias de la cadena ligera humana kappa y las cadenas constantes gamma de cadena pesada. La figura 3 muestra una alineación de las cadenas pesadas constantes de la IgG humana.

5 También pueden ser útiles para la invención las IgG que son composiciones híbridas de isotipos de IgG humana natural. Las funciones efectoras tales como ADCC, ADCP, CDC y la semivida sérica difieren significativamente entre las diferentes clases de anticuerpos, incluyendo por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG e IgM humanas (Michaelsen et al., 1992, Molecular Immunology, 29(3): 319-326). Varios estudios han examinado las variantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 con el fin de investigar los determinantes de las diferencias de función efectora entre ellas. Véanse por ejemplo Canfield & Morrison, 1991, J. Exp. Med. 173: 1483-1491; Chappel et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(20): 9036-9040; Chappel et al., 1993, Journal of Biological Chemistry 268:25124-25131; Tao et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 1025-1028; Tao et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 661-667; Redpath et al., 1998, Human Immunology, 59, 720-727.

15 Tal como se describe en el documento US 2006/0134105, titulado “IgG Immunoglobulin Variants with Optimized Effector Function”, es posible obtener modificaciones de aminoácido por ingeniería genética en un anticuerpo que comprende regiones constantes de otras clases de inmunoglobulinas, por ejemplo las ilustradas en las alineaciones en la figura 3. Tales composiciones de IgG híbridas modificadas por ingeniería genética pueden proporcionar propiedades de función efectora mejoradas, incluyendo ADCC, fagocitosis, CDC y semivida sérica mejoradas. Por ejemplo, tal como se ilustra mediante la figura 3, puede construirse una variante de híbrido IgG1/IgG3 sustituyendo posiciones de IgG1 en la región CH2 y CH3 por los aminoácidos de IgG3 en posiciones en las que difieren los dos isotipos. Por tanto, puede construirse un anticuerpo de IgG variante híbrido que comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R y 436F, siendo la numeración según el índice EU. Una variante de este tipo puede proporcionar propiedades de

25 función efectora alternativas y/o mejoradas.

Como otro ejemplo, la función efectora relativamente insuficiente de IgG2 puede mejorarse reemplazando residuos de unión de Fc!R clave por los aminoácidos correspondientes en una IgG con mejor función efectora. Por ejemplo, diferencias de residuos clave entre IgG2 e IgG1 con respecto a la unión de Fc!R pueden incluir P233, V234, A235, -236 (en referencia a una deleción en IgG2 en relación con IgG1) y G327. Por tanto, una o más modificaciones de aminoácido en la IgG2 original, reemplazándose uno o más de estos residuos por los aminoácidos de IgG1 correspondientes, P233E, V234L, A235L, -236G (en referencia a una inserción de una glicina en la posición 236), y G327A, puede(n) proporcionar una función efectora potenciada. En la figura 2 se proporciona la secuencia de una IgG de este tipo, que comprende un híbrido de residuos de IgG1 e IgG2, denominado en el presente documento

35 “híbrido” en los ejemplos y las figuras.

Tal como se conoce bien en la técnica, existen polimorfismos de inmunoglobulinas en la población humana. El polimorfismo de Gm se determina mediante los genes de IGHG1, IGHG2 e IGHG3 que tienen alelos que codifican para determinantes antigénicos alotípicos denominados alotipos G1m, G2m y G3m para marcadores de las moléculas IgG1, IgG2 e IgG3 humanas (no se han encontrado alotipos de Gm en la cadena gamma 4). Los marcadores pueden clasificarse en “alotipos” e “isoalotipos”. Se diferencian en bases serológicas diferentes dependientes de las fuertes homologías de secuencia entre isotipos. Los alotipos son determinantes antigénicos especificados por formas alélicas de los genes de Ig. Los alotipos representan ligeras diferencias en las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada o ligera de diferentes individuos. Incluso una única diferencia de aminoácido

45 puede dar lugar a un determinante alotípico, aunque en muchos casos se han producido varias sustituciones de aminoácidos. Los alotipos son diferencias de secuencia entre alelos de una subclase por lo que los antisueros reconocen sólo las diferencias alélicas. Un isoalotipo es un alelo en un isotipo que produce un epítopo que se comparte con una región homóloga no polimórfica de uno o más de otros isotipos y debido a esto, los antisueros reaccionarán tanto con los alotipos relevantes y con los isotipos homólogos relevantes (Clark, 1997, IgG effector mechanisms, Chem Immunol. 65:88-110; Gorman & Clark, 1990, Semin Immunol 2(6):457-66).

Las formas alélicas de las inmunoglobulinas humanas se han caracterizado bien (WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. J Immunogen 1976, 3: 357-362; WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 599-601; E. van

55 Loghem, 1986, Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 40-51). Adicionalmente, se han caracterizado otros polimorfismos (Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1-9). En la actualidad, se conocen 18 alotipos de Gm: G1m (1, 2, 3, 17) o G1m (a, x, f, z), G2m (23) o G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) o G3m (b1, c3, b5, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulation. Pergamon, Oxford, págs. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Los alotipos que se heredan en combinaciones fijas se denominan haplotipos de Gm. La figura 4 muestra los haplotipos comunes de la cadena gamma de la IgG1 (figura 4a) y la IgG2 (figura 4b) humanas mostrando las posiciones y las sustituciones de aminoácidos relevantes. Las secuencias de aminoácidos de estas versiones alotípicas de IgG1 e IgG2 se proporcionan como las SEQ ID: 80-85. Los anticuerpos de la presente invención pueden codificarse sustancialmente mediante un alotipo, isoalotipo o haplotipo de cualquier gen de inmunoglobulina.

65 Las formas alélicas de las inmunoglobulinas humanas se han caracterizado bien (WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. J Immunogen 1976, 3: 357-362; WHO Review of the notation for the allotypic and related markers of human immunoglobulins. 1976, Eur. J. Immunol. 6, 599-601; E. van Loghem, 1986, Allotypic markers, Monogr Allergy 19: 40-51). Adicionalmente, se han caracterizado otros polimorfismos (Kim et al., 2001, J. Mol. Evol. 54:1-9). En la actualidad, se conocen 18 alotipos de Gm: G1m (1, 2, 3,

5 17) o G1m (a, x, f, z), G2m (23) o G2m (n), G3m (5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) o G3m (b1, c3, b5, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5) (Lefranc, et al., The human IgG subclasses: molecular analysis of structure, function and regulación. Pergamon, Oxford, págs. 43-78 (1990); Lefranc, G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). Los alotipos que se heredan en combinaciones fijas se denominan haplotipos de Gm. La figura 4 muestra los haplotipos comunes de la cadena gamma de la IgG1 (figura 4a) y la IgG2 (figura 4b) humanas que muestra las posiciones y las sustituciones de aminoácidos relevantes. Los anticuerpos de la presente invención pueden codificarse sustancialmente mediante un alotipo, isoalotipo o haplotipo de cualquier gen de inmunoglobulina.

Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden codificarse sustancialmente por genes procedentes de cualquier organismo, preferiblemente mamíferos, incluyendo pero sin limitarse a seres humanos, 15 roedores incluyendo pero sin limitarse a ratones y ratas, lagomorfos incluyendo pero sin limitarse a conejos y liebres, camélidos incluyendo pero sin limitarse a camellos, llamas y dromedarios, y primates no humanos, incluyendo pero sin limitarse a prosimios, platirrinos (monos del Nuevo Mundo), cercopitecoideos (monos del Viejo Mundo) y homínidos incluyendo los gibones y simios grandes y pequeños. En una realización más preferida, los anticuerpos de la presente invención son sustancialmente humanos. Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden codificarse sustancialmente por genes de inmunoglobulina que pertenecen a cualquiera de las clases de anticuerpos. En una realización más preferida, los anticuerpos de la presente invención comprenden secuencias que pertenecen a la clase de anticuerpos de IgG, incluyendo las subclases humanas IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden comprender secuencias que pertenecen a las clases de anticuerpos IgA (incluyendo las subclases humanas IgA1 e IgA2), IgD, IgE, IgG o IgM. Los anticuerpos dados a

25 conocer en el presente documento pueden comprender más de una cadena proteica. Es decir, la presente invención puede usarse en un anticuerpo que es un monómero o un oligómero, incluyendo un homo o hetero-oligómero.

En la realización más preferida, los anticuerpos de la invención se basan en secuencias de IgG humanas, y por tanto las secuencias de IgG humanas se usan como las secuencias de “base” con las que se comparan otras secuencias, incluyendo pero sin limitarse a secuencias procedentes de otros organismos, por ejemplo secuencias de roedores y primates, así como secuencias procedentes de otras clases de inmunoglobulinas tales como IgA, IgE, IgGD, IgGM y similares. Se da a conocer que, aunque los anticuerpos de la presente invención se modifican por ingeniería genética en el contexto de un anticuerpo original, las variantes pueden modificarse por ingeniería genética o “transferirse” al contexto de otro segundo anticuerpo original. Esto se realiza determinando los residuos 35 “equivalentes” o “correspondientes” y las sustituciones entre los anticuerpos primero y segundo, basadas normalmente en la secuencia o la homología estructural entre las secuencias de los dos anticuerpos. Con el fin de establecer la homología, la secuencia de aminoácidos de un primer anticuerpo explicada resumidamente en el presente documento se compara directamente con la secuencia de un segundo anticuerpo. Tras alinear las secuencias, usando uno o más de los programas de alineación por homología conocidos en la técnica (por ejemplo usando residuos conservados entre especies), permitiendo las inserciones y deleciones necesarias con el fin de mantener la alineación (es decir, evitando la eliminación de residuos conservados a través de la deleción e inserción arbitrarias), se definen los residuos equivalentes a aminoácidos particulares en la secuencia primaria del primer anticuerpo. La alineación de residuos conservados debe conservar preferiblemente el 100% de tales residuos. Sin embargo, también es adecuada la alineación de más del 75% o de tan solo el 50% de los residuos conservados para 45 definir residuos equivalentes. También pueden definirse residuos equivalentes determinando la homología estructural entre un anticuerpo primero y segundo que está en el nivel de la estructura terciaria para anticuerpos cuyas estructuras se han determinado. En este caso, los residuos equivalentes se definen como aquellos para los que las coordenadas atómicas de dos o más de los átomos de cadena principal de un residuo de aminoácidos particular de la molécula original o precursora (N en N, CA en CA, C en C y O en O) están dentro de 0,13 nm y preferiblemente 0,1 nm tras la alineación. La alineación se logra una vez que se ha orientado y colocado el mejor modelo para obtener el máximo solapamiento de coordenadas atómicas de átomos proteicos distintos de hidrógeno de las proteínas. Independientemente de cómo de equivalentes o correspondientes se determinen los residuos e independientemente de la identidad del anticuerpo original en la que se basen los anticuerpos, lo que se pretende transmitir es que los anticuerpos descubiertos por la presente invención pueden modificarse por ingeniería genética

55 dando lugar a cualquier segundo anticuerpo original que tenga homología de secuencia o estructural significativa con dicho anticuerpo. Por tanto, por ejemplo, si se genera un anticuerpo variante en el que el anticuerpo original es la IgG1 humana, mediante el uso de los métodos descritos anteriormente o de otros métodos para determinar residuos equivalentes, dicho anticuerpo variante puede modificarse por ingeniería genética dando lugar a un anticuerpo original IgG2 humano, a un anticuerpo original IgA humano, a un anticuerpo original IgG2a o IgG2b de ratón, y similares. De nuevo, tal como se describió anteriormente, el contexto del anticuerpo original no afecta a la capacidad para transferir los anticuerpos de la presente invención a otros anticuerpos originales. Por ejemplo, los anticuerpos variantes que se modifican por ingeniería genética dando lugar a un anticuerpo IgG1 humano que selecciona como diana un epítopo antigénico puede transferirse a un anticuerpo IgG2 humano que selecciona como diana un epítopo antigénico diferente, y así sucesivamente.

65 En la clase IgG de inmunoglobulinas, hay varios dominios de inmunoglobulina en la cadena pesada. Mediante

“dominio de inmunoglobulina (Ig)” en el presente documento se quiere decir una región de una inmunoglobulina que tiene una estructura terciaria distinta. En la presente invención son de interés los dominios de la cadena pesada constante, (incluyendo, los dominios pesados constantes (CH) y la región bisagra. En el contexto de los anticuerpos IgG, los isotipos de IgG tienen cada uno tres regiones CH: “CH1” se refiere a las posiciones 118-220, “CH2” se 5 refiere a las posiciones 237-340 y “CH3”’ se refiere a las posiciones 341-447 según el índice EU como en Kabat. Mediante “bisagra” o “región bisagra” o “región bisagra de anticuerpo” o “región bisagra de inmunoglobulina” en el presente documento se quiere decir el polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre los dominios constantes primero y segundo de un anticuerpo. Estructuralmente, el dominio CH1 de IgG CH1 termina en la posición EU 220 y el dominio CH2 de IgG CH2 comienza en la posición EU de residuo 237. Por tanto, para la IgG la región bisagra se define en el presente documento incluyendo las posiciones 221 (D221 en IgG1) a 236 (G236 en IgG1), siendo la numeración según el índice EU como en Kabat. En algunas realizaciones, por ejemplo en el contexto de una región Fc, la región bisagra inferior está incluida, refiriéndose “la bisagra inferior” en general a las posiciones 226 ó 230. La cadena pesada constante, tal como se define en el presente documento, se refiere a del extremo N-terminal del dominio CH1 al extremo C-terminal del dominio CH3, comprendiendo por tanto la posiciones

15 118-447, siendo la numeración según el índice EU. La cadena ligera constante comprende un único dominio, y tal como se define en el presente documento, se refiere a las posiciones 108-214 de C∀ o C#, siendo la numeración según el índice EU.

Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden incluir anticuerpos multiespecíficos, especialmente anticuerpos biespecíficos, denominados también en ocasiones “diacuerpos”. Son anticuerpos que se unen a dos (o más) antígenos diferentes. Los diacuerpos pueden obtenerse de una variedad de formas conocidas en la técnica, por ejemplo, pueden prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos. En una realización, el anticuerpo es un minianticuerpo. Los minianticuerpos son proteínas similares a anticuerpos minimizados que comprenden un fragmento scFv unido a un dominio CH3. En algunos casos, el fragmento scFv puede unirse a la

25 región Fc y puede incluir parte o toda la región bisagra. Para una descripción de anticuerpos multiespecíficos, véase Holliger & Hudson, 2006, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136 y referencias citadas en el mismo.

Además se da a conocer que el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Son de particular interés los anticuerpos que comprenden regiones Fc, fusiones de Fc y la región constante de la cadena pesada (CH1-bisagra-CH2-CH3). Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden comprender fragmentos de Fc. Un fragmento de Fc tal como se da a conocer en el presente documento puede comprender desde el 1 hasta el 90% de la región Fc, prefiriéndose del 10 al 90% y siendo lo más preferido del 30 al 90%. Por tanto, por ejemplo, un fragmento de Fc tal como se da a conocer en el presente documento puede comprender un dominio C!2 de IgG1, un dominio C!2 de IgG1 y la región bisagra, un dominio C!3 de IgG1, y así sucesivamente. Un fragmento de Fc tal

35 como se da a conocer en el presente documento puede comprender adicionalmente una pareja de fusión, dando lugar de manera eficaz a una fusión de fragmento Fc. Los fragmentos Fc pueden contener o no una secuencia polipeptídica extra.

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Anticuerpos quiméricos, humanizados y completamente humanos

La inmunogenicidad es el resultado de una compleja serie de respuestas a una sustancia que se percibe como foránea, y puede incluir producción de anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes, formación de complejos inmunitarios, activación del complemento, activación de mastocitos, inflamación, respuestas de hipersensibilidad y anafilaxia. Varios factores pueden contribuir a la inmunogenicidad de proteínas, incluyendo pero sin limitarse a la

45 secuencia de las proteínas, la vía y la frecuencia de administración y la población de pacientes. La inmunogenicidad puede limitar la eficacia y seguridad de una proteína terapéutica de múltiples modos. Puede reducirse directamente la eficacia por la formación de anticuerpos neutralizantes. También puede reducirse la eficacia indirectamente, ya que la unión a anticuerpos o bien neutralizantes o bien no neutralizantes conduce normalmente a un rápido aclaramiento del suero. Pueden producirse graves efectos secundarios e incluso muerte cuando se genera una reacción inmunitaria. Por tanto, en una realización preferida se usa modificación por ingeniería genética de proteínas para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos de la presente invención.

En algunas realizaciones, los componentes de la estructura principal pueden ser una mezcla de diferentes especies. Un anticuerpo de este tipo puede ser un anticuerpo quimérico y/o un anticuerpo humanizado. En general, tanto los

55 “anticuerpos quiméricos” como los “anticuerpo humanizados” se refieren a anticuerpos que combinan regiones de más de una especie. Los “anticuerpos quiméricos” comprenden tradicionalmente región(es) variable(s) procedente(s) de un ratón (o rata, en algunos casos) y la(s) región(es) constante(s) procedente(s) de un ser humano (Morrison et al., 1984, Proc Natl Acad Sci USA 81: 6851-6855).

Mediante anticuerpo “humanizado” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un anticuerpo que comprende una región de entramado (FR) humana y una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) procedentes de un anticuerpo no humano (habitualmente de ratón o rata). El anticuerpo no humano que proporciona las CDR se denomina el “donador” y la inmunoglobulina humana que proporciona la región de entramado se denomina el “aceptor”. En determinadas realizaciones, la humanización se basa principalmente en el 65 injerto de las CDR del donador en las regiones de entramado de VL y VH del aceptor (humano) (documento de Winter US 5225539). Esta estrategia se denomina “injerto de CDR”. A menudo se requiere “retromutación” de residuos de región de entramado de aceptor seleccionados en los residuos de donador correspondientes para recuperar la afinidad que se pierde en el constructo injertado inicial (documento US 5693762). El anticuerpo humanizado también comprenderá de manera óptima al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina, normalmente la de una inmunoglobulina humana, y por tanto normalmente comprenderá una 5 región Fc humana. Se conoce bien en la técnica una variedad de técnicas y métodos para humanizar y reorganizar anticuerpos no humanos (véase Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (EE. UU.) y referencias citadas en el mismo). La humanización u otros métodos de reducir la inmunogenicidad de regiones variables de anticuerpos no humanos puede incluir métodos de renovación de superficie, tal como se describe por ejemplo en Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973. En una realización, pueden emplearse métodos basados en selección para humanizar y/o madurar por afinidad las regiones variables de anticuerpos, es decir, para aumentar la afinidad de la región variable por su antígeno diana. Otros métodos de humanización pueden implicar el injerto sólo de partes de las CDR, incluyendo pero sin limitarse a métodos descritos en el documento US 2002/0034765; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:11191125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084. Pueden emplearse métodos basados en la estructura

15 para la humanización y la maduración por afinidad, por ejemplo, tal como se describe en el documento US 2002/0177170 y solicitudes relacionadas.

En determinadas variaciones, la inmunogenicidad del anticuerpo se reduce usando un método descrito en el documento US 2006/0008883, titulado “Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof”.

Las modificaciones para reducir la inmunogenicidad pueden incluir modificaciones que reducen la unión de péptidos procesados derivados de la secuencia original a proteínas del MHC. Por ejemplo, podrían obtenerse por ingeniería genética modificaciones de aminoácidos de manera que no hubiera o hubiera un número mínimo de epítopos

25 inmunitarios que se prevé que se unan, con alta afinidad, a cualquier alelo prevalente del MHC. Se conocen en la técnica varios métodos de identificación de epítopos de unión a MHC en secuencias de proteínas y pueden usarse para clasificar epítopos en un anticuerpo de la presente invención. Véanse por ejemplo los documentos US 2002/0119492, US 2004/0230380, US 2006/0148009 y referencias citadas en los mismos.

Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden ser completamente humanos, es decir, las secuencias de los anticuerpos son completa o sustancialmente humanas. “Anticuerpo completamente humano” o “anticuerpo humano completo” se refiere a un anticuerpo humano que tiene la secuencia génica de un anticuerpo derivado de un cromosoma humano con las modificaciones explicadas resumidamente en el presente documento. Se conocen en la técnica varios métodos para generar anticuerpos completamente humanos, incluyendo el uso de

35 ratones transgénicos (Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458,) o bibliotecas de anticuerpos humanos acopladas con métodos de selección (Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108).

Anticuerpos que seleccionan como diana CD19

Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden presentar selectividad por CD19 frente a dianas alternativas o selectividad por una forma específica de la diana frente a formas alternativas. Los ejemplos incluyen variantes de longitud completa frente a variantes alternativas de corte y empalme, formas de la superficie celular frente a solubles, selectividad por diversas variantes polimórficas o selectividad por formas conformacionales específicas de una diana. Un anticuerpo tal como se da a conocer en el presente documento puede unirse a 45 cualquier epítopo o región en CD19 y puede ser específico para fragmentos, formas mutantes, formas alternativas de corte y empalme o formas aberrantes de dichos antígenos. Los anticuerpos o inmunoadhesinas adecuados incluyen las inmunoadhesinas o anticuerpos anti-CD19 en MT-103, (un anticuerpo anti-CD19/CD3 biespecífico de cadena sencilla; Hoffman, P. et al. 2005. Int. J. Cancer. 115: 98-104; Schlereth, B. et al. 2006. Cancer Immunol. Immunother. 55: 503-514), un diacuerpo anti-CD19/CD16 (Schlenzka, J. et al. 2004. Anti-cancer Drugs. 15: 915-919; Kipriyanov, S.M-et al. 2002. J. Immunol. 169: 137-144), BU12-saporina (Flavell, D.J. et al. 1995. Br. J. Cancer. 72: 1373-1379) y anticuerpos anti-CD19-idarubicina (Rowland, A.J. et al. 1993. Cancer Immunol. Immunother. 55: 503514); Olson, publicación estadounidense n.º 2004/0136908A1, presentada el 4 de marzo de 2004; documento US 5.686.072; Olson, documento WO 02/080987A1, presentado el 29 de marzo de 2002; Tedder, documento WO 06/133450A1, presentado el 8 de junio de 2006; Tedder, documento WO 06/121852A2, presentado el 5 de abril de 55 2006; Tedder, documento WO 06/089133A2, presentado el 15 de febrero de 2006; Tedderm, publicación estadounidense n.º 2006/280738A1, presentada el 8 de junio de 2006; documento US 7.109.304; Hansen, publicación estadounidense n.º 2005/070693A1, presentada el 2 de agosto de 2004; Hansen, publicación estadounidense n.º 2006/257398A1, presentada el 1 de junio de 2006; Hansen, documento WO 05/012493A2, presentado el 2 de agosto de 2004; Rao-Naik, documento WO 07/002223A2, presentado el 10 de junio de 2006; Page, publicación estadounidense. 2002/182208A1, presentada el 16 de mayo de 2002; documento US 5.686.072; Page, documento EP00481790B1, presentado el 17 de octubre de 1991; Hariharan, publicación estadounidense n.º 2003/103971A1, presentada el 12 de septiembre de 2002; Goldenberg, publicación estadounidense n.º 2003/133930A1, presentada el 24 de enero de 2003; Goldenberg, publicación estadounidense n.º 2004/219156A1, presentada el 30 de diciembre de 2002; Hariharan, publicación estadounidense n.º 2007/0009519A1, presentada el 65 21 de julio de 2006; Curd, documento WO 00/067796A1, presentado el 4 de mayo de 2000; Kipriyanov, documento WO 03/088998A1, presentado el 15 de abril de 2003; documento US 7.112.324, documento US 7.129.330, Olson, publicación estadounidense n.º 2004/013690A1, presentada el 4 de marzo de 2004; Dorken, publicación estadounidense n.º 2006/0193852A1, presentada el 5 de mayo de 2006; Amphlett, publicación estadounidense n.º 2007/0009541A1, presentada el 14 de septiembre de 2006; Kersey, documento WO 96/36360A1, presentado el 15 de mayo de 1996; Kufer, documento WO 04/106381A1, presentado el 26 de mayo de 2004; Little, publicación 5 estadounidense n.º 2007/031436A1, presentada el 10 de octubre de 2006; Kufer, publicación estadounidense n.º 2007/123479A1, presentada el 26 de mayo de 2004; Baeuerle, documento WO 07/068354A1, presentado el 29 de noviembre de 2006; Le Gall, documento EP 01314741B1, presentado el 14 de noviembre de 2001; Pesando, documento WO 91/13974A1, presentado el 12 de marzo de 1991; Alien et al, Clin. 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45 Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse en una amplia variedad de productos. En una realización, el anticuerpo de la invención es un agente terapéutico, un agente de diagnóstico o un reactivo de investigación, preferiblemente un agente terapéutico. Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención puede usarse para usos agrícolas o industriales. Un anticuerpo de la presente invención puede usarse en una composición de anticuerpo que es monoclonal. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser agonistas, antagonistas, neutralizantes, inhibidores o estimuladores. En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención se usan para destruir células diana que portan el antígeno diana, por ejemplo células cancerosas. En una realización alternativa, los anticuerpos de la presente invención se usan para bloquear, antagonizar o agonizar con el antígeno diana. En una realización alternativamente preferida, los anticuerpos de la presente invención se usan para

55 bloquear, antagonizar o agonizar con el antígeno diana y para destruir las células diana que portan el antígeno diana.

Anticuerpos anti-CD19 como agentes terapéuticos para tratar trastornos de células B

Los anticuerpos son una clase de proteínas terapéuticas que pueden usarse para tratar trastornos de células B. Varias propiedades favorables de los anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse una especificidad por la diana, capacidad para mediar mecanismos efectores inmunitarios y larga semivida en suero, hacen de los anticuerpos agentes terapéuticos poderosos. La presente invención describe anticuerpos contra el antígeno CD19 de células B.

65 El antígeno CD19 de células B (CD19, también conocido como antígeno B4 de la superficie de las células B, Leu-12) es un marcador de la superficie de las células pan-B que se expresa desde los estadios iniciales del desarrollo de células pre-B a través de diferenciación terminal en células plasmáticas. CD19 promueve la proliferación y la supervivencia de células B maduras. Se asocia en un complejo con CD21 en la superficie celular. También se asocia con CD81 y Leu-13 y potencia la señalización del receptor de células B (BCR). Junto con BCR, CD19 modula los umbrales de señalización inducidos por receptor de antígeno e intrínsecos críticos para la expansión clonal de las

5 células B y la inmunidad humoral. En colaboración con CD21, se asocia al sistema inmunitario adaptativo e innato. Con la activación, la cola citoplasmática de CD19 se fosforila, lo que conduce a la unión mediante cinasas de la familia Src y al reclutamiento de la PI-3 cinasa. Es una diana inmunoterápica atractiva para cánceres de origen linfoide puesto que también se expresa en la inmensa mayoría de las células de LNH así como en algunas leucemias.

Se han evaluado varios anticuerpos o conjugados de anticuerpos que seleccionan como diana CD19 en estudios preclínicos o en ensayos clínicos para el tratamiento de cánceres. Estos anticuerpos anti-CD19 o conjugados de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, MT-103 (un anticuerpo anti-CD19/CD3 biespecífico de cadena sencilla; Hoffman et al, 2005 Int J Cancer 115:98-104; Schlereth et al, 2006 Cancer Immunol Immunother 55:503-514), un

15 diacuerpo anti-CD19/CD16 (Schlenzka et al, 2004 Anti-cancer Drugs 15:915-919; Kipriyanov et al, 2002 J Immunol 169:137-144), BU12-saporina (Flavell et al, 1995 Br J Cancer 72:1373-1379) y anticuerpo anti-CD19-idarubicina (Rowland et al, 1993 Cancer Immunol Immunother 55:503-514).

Optimización de Fc de anticuerpos anti-CD19

Hay varios mecanismos caracterizados mediante los cuales los anticuerpos median efectos celulares, incluyendo la antiproliferación a través del bloqueo de rutas de crecimiento necesarias, la señalización intracelular que conduce a apoptosis, la regulación por disminución potenciada y/o recambio de receptores, la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis

25 mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) y la estimulación de una respuesta inmunitaria adaptativa (Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410). La eficacia de los anticuerpos puede deberse a una combinación de estos mecanismos y su importancia relativa en la terapia clínica para oncología parece ser dependiente del cáncer.

Se ha demostrado la importancia de la funciones efectoras mediadas por Fc!R para la actividad de algunos anticuerpos en ratones (Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:652-656; Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443446) y a partir de correlaciones observadas entre la eficacia clínica en seres humanos y su alotipo de formas polimórficas de alta (V158) o baja (F158) afinidad de Fc!RIIIa (Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758; Weng & Levy, 2003, Journal of Clinical Oncology, 21:3940-3947). Juntos, estos datos sugieren que un anticuerpo que está

35 optimizado para unirse a determinados Fc!R puede mediar mejor las funciones efectoras y de ese modo destruir las células diana de manera más eficaz en los pacientes. Por tanto, un medio prometedor para potenciar la potencia anti-tumoral de los anticuerpos es a través de la mejora de su capacidad para mediar funciones efectoras citotóxicas tales como ADCC, ADCP y CDC. Adicionalmente, los anticuerpos pueden mediar el mecanismo anti-tumoral a través de señalización apoptótica o inhibidora del crecimiento que puede producirse cuando un anticuerpo se une a su diana en las células tumorales. Una señalización de este tipo puede potenciarse cuando los anticuerpos se presentan a las células tumorales unidos a células inmunitarias a través del Fc!R. Por tanto, la afinidad aumentada de los anticuerpos a los Fc!R puede dar como resultado efectos antiproliferativos potenciados.

Se han logrado anticuerpos modificados por ingeniería genética para obtener una función efectora optimizada

45 usando modificaciones de aminoácido (véanse por ejemplo los documentos US 2004/0132101 y US 2006/0024298 y referencias citadas en los mismos) y glicoformas modificadas por ingeniería genética (véanse por ejemplo Umaña et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473, Yamane-Ohnuki et al., 2004, Biotechnology and Bioengineering 87(5):614-621).

Modificaciones para optimizar la función efectora

La presente descripción se refiere a anticuerpos que comprenden modificaciones, alterando dichas modificaciones la afinidad a uno o más receptores de Fc, y/o alterando la capacidad del anticuerpo para mediar una o más funciones efectoras. Las modificaciones incluyen modificaciones de aminoácido y modificaciones de glicoforma.

Modificaciones de aminoácido

Tal como se describe en el documento US 2006/0024298, titulado “Optimized Fc Variants”, las modificaciones de aminoácido en las posiciones de la región constante de cadena pesada 221, 222, 223, 224, 225, 227, 228, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 246, 247, 249, 255, 258, 260, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 278, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 288, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 313, 317, 318, 320, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336 y 337, permiten la modificación de las propiedades de unión de Fc!R, de la función efectora y potencialmente de las propiedades clínicas de los anticuerpos.

En particular, las variantes que alteran la unión a uno o más receptores de Fc humanos pueden comprender una modificación de aminoácido en la región constante de cadena pesada, tal como se describe en el presente documento, seleccionada del grupo que consiste en 221K, 221Y, 222E, 222Y, 223E, 223K, 224E, 224Y, 225E, 225K, 225W, 227E, 227G, 227K, 227Y, 228E, 228G, 228K, 228Y, 230A, 230E, 230G, 230Y, 231E, 231G, 231K, 5 231P, 231Y, 232E, 232G, 232K, 232Y, 233A, 233D, 233F, 233G, 233H, 233I, 233K, 233L, 233M, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233V, 233W, 233Y, 234A, 234D, 234E, 234F, 234G, 234H, 234I, 234K, 234M, 234N, 234P, 234Q, 234R, 234S, 234T, 234V, 234W, 234Y, 235A, 235D, 235E, 235F, 235G, 235H, 235I, 235K, 235M, 235N, 235P, 235Q, 235R, 235S, 235T, 235V, 235W, 235Y, 236A, 236D, 236E, 236F, 236H, 236I, 236K, 236L, 236M, 236N, 236P, 236Q, 236R, 236S, 236T, 236V, 236W, 236Y, 237D, 237E, 237F, 237H, 237I, 237K, 237L, 237M, 237N, 237P, 237Q, 237R, 237S, 237T, 237V, 237W, 237Y, 238D, 238E, 238F, 238G, 238H, 238I, 238K, 238L, 238M, 238N, 238Q, 238R, 238S, 238T, 238V, 238W, 238Y, 239D, 239E, 239F, 239G, 239H, 239I, 239K, 239L, 239M, 239N, 239P, 239Q, 239R, 239T, 239V, 239W, 239Y, 240A, 240I, 240M, 240T, 241D, 241E, 241L, 241R, 241S, 241W, 241Y, 243E, 243H, 243L, 243Q, 243R, 243W, 243Y, 244H, 245A, 246D, 246E, 246H, 246Y, 247G, 247V, 249H, 249Q, 249Y, 255E, 255Y, 258H, 258S, 258Y, 260D, 260E, 260H, 260Y, 262A, 262E, 262F, 262I, 262T, 263A, 263I, 15 263M, 263T, 264A, 264D, 264E, 264F, 264G, 264H, 264I, 264K, 264L, 264M, 264N, 264P, 264Q, 264R, 264S, 264T, 264W, 264Y, 265F, 265G, 265H, 265I, 265K, 265L, 265M, 265N, 265P, 265Q, 265R, 265S, 265T, 265V, 265W, 265Y, 266A, 266I, 266M, 266T, 267D, 267E, 267F, 267H, 267I, 267K, 267L, 267M, 267N, 267P, 267Q, 267R, 267T, 267V, 267W, 267Y, 268D, 268E, 268F, 268G, 268I, 268K, 268L, 268M, 268P, 268Q, 268R, 268T, 268V, 268W, 269F, 269G, 269H, 269I, 269K, 269L, 269M, 269N, 269P, 269R, 269S, 269T, 269V, 269W, 269Y, 270F, 270G, 270H, 270I, 270L, 270M, 270P, 270Q, 270R, 270S, 270T, 270W, 270Y, 271A, 271D, 271E, 271F, 271G, 271H, 271I, 271K, 271L, 271M, 271N, 271Q, 271R, 271S, 271T, 271V, 271W, 271Y, 272D, 272F, 272G, 272H, 272I, 272K, 272L, 272M, 272P, 272R, 272S, 272T, 272V, 272W, 272Y, 273I, 274D, 274E, 274F, 274G, 274H, 274I, 274L, 274M, 274N, 274P, 274R, 274T, 274V, 274W, 274Y, 275L, 275W, 276D, 276E, 276F, 276G, 276H, 276I, 276L, 276M, 276P, 276R, 276S, 276T, 276V, 276W, 276Y, 278D, 278E, 278G, 278H, 278I, 278K, 278L, 278M, 278N, 278P, 278Q, 25 278R, 278S, 278T, 278V, 278W, 280G, 280K, 280L, 280P, 280W, 281D, 281E, 281K, 281N, 281P, 281Q, 281Y, 282E, 282G, 282K, 282P, 282Y, 283G, 283H, 283K, 283L, 283P, 283R, 283Y, 284D, 284E, 284L, 284N, 284Q, 284T, 284Y, 285D, 285E, 285K, 285Q, 285W, 285Y, 286E, 286G, 286P, 286Y, 288P, 288E, 288Y, 290D, 290H, 290L, 290N, 290W, 291D, 291E, 291G, 291H, 291I, 291Q, 291T, 292D, 292E, 292T, 292Y, 293F, 293G, 293H, 293I, 293L, 293M, 293N, 293P, 293R, 293S, 293T, 293V, 293W, 293Y, 294F, 294G, 294H, 294I, 294K, 294L, 294M, 294P, 294R, 294S, 294T, 294V, 294W, 294Y, 295D, 295E, 295F, 295G, 295H, 295I, 295M, 295N, 295P, 295R, 295S, 295T, 295V, 295W, 295Y, 296A, 296D, 296E, 296G, 296H, 296I, 296K, 296L, 296M, 296N, 296Q, 296R, 296S, 296T, 296V, 297D, 297E, 297F, 297G, 297H, 297I, 297K, 297L, 297M, 297P, 297Q, 297R, 297S, 297T, 297V, 297W, 297Y, 298A, 298D, 298E, 298F, 298H, 298I, 298K, 298M, 298N, 298Q, 298R, 298T, 298W, 298Y, 299A, 299D, 299E, 299F, 299G, 299H, 299I, 299K, 299L, 299M, 299N, 299P, 299Q, 299R, 299S, 299V, 299W, 299Y, 300A, 35 300D, 300E, 300G, 300H, 300K, 300M, 300N, 300P, 300Q, 300R, 300S, 300T, 300V, 300W, 301D, 301E, 301H, 301Y, 3021, 303D, 303E, 303Y, 304D, 304H, 304L, 304N, 304T, 305E, 305T, 305Y, 313F, 317E, 317Q, 318H, 318L, 318Q, 318R, 318Y, 320D, 320F, 320G, 320H, 320I, 320L, 320N, 320P, 320S, 320T, 320V, 320W, 320Y, 322D, 322F, 322G, 322H, 322I, 322P, 322S, 322T, 322V, 322W, 322Y, 323I, 324D, 324F, 324G, 324H, 324I, 324L, 324M, 324P, 324R, 324T, 324V, 324W, 324Y, 325A, 325D, 325E, 325F, 325G, 325H, 325I, 325K, 325L, 325M, 325P, 325Q, 325R, 325S, 325T, 325V, 325W, 325Y, 326E, 326I, 326L, 326P, 326T, 327D, 327E, 327F, 327H, 327I, 327K, 327L, 327M, 327N, 327F, 327R, 327S, 327T, 327V, 327W, 327Y, 328A, 328D, 328E, 328F, 328G, 328H, 328I, 328K, 328M, 328N, 328P, 328Q, 328R, 328S, 328T, 328V, 328W, 328Y, 329D, 329E, 329F, 329G, 329H, 329I, 329K, 329L, 329M, 329N, 329Q, 329R, 329S, 329T, 329V, 329W, 329Y, 330E, 330F, 330G, 330H, 330I, 330L, 330M, 330N, 330P, 330R, 330S, 330T, 330V, 330W, 330Y, 331D, 331F, 331H, 331I, 331L, 331M, 331Q, 331R, 331T, 331V,

45 331W, 331Y, 332A, 332D, 332E, 332F, 332H, 332K, 332L, 332M, 332N, 332P, 332Q, 332R, 332S, 332T, 332V, 332W, 332Y, 333A, 333F, 333H, 333I, 333L, 333M, 333P, 333T, 333Y, 334A, 334F, 334I, 334L, 334P, 334T, 335D, 335F, 335G, 335H, 335I, 335L, 335M, 335N, 335P, 335R, 335S, 335V, 335W, 335Y, 336E, 336K, 336Y, 337E, 337H y 337N, siendo la numeración según el índice EU.

Tal como se describe en el documento US 2005/0244403, titulado “Immunoglobulin variants outside the Fc region”, las modificaciones de aminoácido en las posiciones de región constante de cadena pesada 118, 119, 120, 121, 122, 124, 126, 129, 131, 132, 133, 135, 136, 137, 138, 139, 147, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 183, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 201, 203, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 216, 217, 218,

55 219, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235 y 236, permiten la modificación de las propiedades de unión de Fc!R, de la función efectora y potencialmente de las propiedades clínicas de los anticuerpos.

Tal como se describe en el documento US 2005/0244403, presentado el 24 de marzo de 2005, titulado “Immunoglobulin variants outside the Fc region”, las modificaciones de aminoácido en las posiciones de región constante de cadena ligera 108, 109, 110, 111, 112, 114, 116, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 131, 137, 138, 140, 141, 142, 143, 145, 147, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 176, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 187, 188, 189, 190, 191, 193, 195, 197, 199, 200, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 210, 211, 212, 213, permiten la modificación de las

65 propiedades de unión de Fc!R, de la función efectora y potencialmente de las propiedades clínicas de los anticuerpos.

En particular, las variantes que alteran la unión a uno o más receptores de Fc humanos pueden comprender una modificación de aminoácido en la región constante de cadena pesada, tal como se describe en el presente documento, seleccionada del grupo que consiste en 118K, 118E, 118Y, 119R, 119E, 119Y, 120R, 120E, 120I, 121E, 5 121Y, 121H, 122E, 122R, 124K, 124E, 124Y, 126K, 126D, 129L, 129D, 131G, 131T, 132D, 132R, 132L, 133R, 133E, 133L, 135I, 135E, 135K, 136E, 136K, 136I, 137E, 138S, 138R, 138D, 139I, 139E, 139K, 147A, 147E, 148Y, 148K, 150L, 150K, 150E, 151A, 151D, 152L, 152K, 153L, 153D, 155E, 155K, 155I, 157E, 157K, 157Y, 159K, 159D, 159L, 160K, 160E, 160Y, 161D, 162D, 162K, 162Y, 163R, 164R, 164E, 164Y, 165D, 165R, 165Y, 166D, 167A, 168L, 169E, 171G, 171H, 172K, 172L, 172E, 173T, 173D, 174E, 174K, 174Y, 175D, 175L, 176D, 176R, 176L, 177R, 177E, 177Y, 178D, 179K, 179Y, 179E, 180K, 180L, 180E, 183T, 187I, 187K, 187E, 188I, 189D, 189G, 190I, 190K, 190E, 191D, 191R, 191Y, 192N, 192R, 192L, 193F, 193E, 194R, 194D, 195R, 195D, 195Y, 196K, 196D, 196L, 197R, 197E, 197Y, 198L, 199T, 199D, 199K, 201E, 201K, 201L, 203D, 203L, 203K, 205D, 205L, 206A, 206E, 207K, 207D, 208R, 208E, 208Y, 209E, 209K, 209Y, 210L, 210E, 210Y, 211R, 211E, 211Y, 212Q, 212K, 212H, 212L, 212Y, 213N, 213E, 213H, 213L, 213Y, 214N, 214E, 214H, 214L, 214Y, 216N, 216K, 216H, 216L, 216Y, 217D, 217H, 217A, 217V, 15 217G, 218D, 218E, 218Q, 218T, 218H, 218L, 218Y, 219D, 219E, 219Q, 219K, 219T, 219H, 219L, 219I, 219Y, 205A, 210A, 213A, 214A, 218A, 221K, 221Y, 221E, 221N, 221Q, 221R, 221S, 221T, 221H, 221A, 221V, 221L, 221I, 221F, 221M, 221W, 221P, 221G, 222E, 222Y, 222D, 222N, 222Q, 222R, 222S, 222T, 222H, 222V, 222L, 222I, 222F, 222M, 222W, 222P, 222G, 222A, 223D, 223N, 223Q, 223R, 223S, 223H, 223A, 223V, 223L, 223I, 223F, 223M, 223Y, 223W, 223P, 223G, 223E, 223K, 224D, 224N, 224Q, 224K, 224R, 224S, 224T, 224V, 224L, 224I, 224F, 224M, 224W, 224P, 224G, 224E, 224Y, 224A, 225D, 225N, 225Q, 225R, 225S, 225H, 225A, 225V, 225L, 225I, 225F, 225M, 225Y, 225P, 225G, 225E, 225K, 225W, 226S, 227E, 227K, 227Y, 227G, 227D, 227N, 227Q, 227R, 227S, 227T, 227H, 227A, 227V, 227L, 227I, 227F, 227M, 227W, 228K, 228Y, 228G, 228D, 228N, 228Q, 228R, 228T, 228H, 228A, 228V, 228L, 228I, 228F, 228M, 228W, 229S, 230A, 230E, 230Y, 230G, 230D, 230N, 230Q, 230K, 230R, 230S, 230T, 230H, 230V, 230L, 230I, 230F, 230M, 230W, 231K, 231P, 231D, 231N, 231Q, 231R,

25 231S, 231T, 231H, 231V, 231L, 231I, 231F, 231M, 231W, 232E, 232K, 232Y, 232G, 232D, 232N, 232Q, 232R, 232S, 232T, 232H, 232A, 232V, 232L, 232I, 232F, 232M, 232W, 233D, 233N, 233Q, 233R, 233S, 233T, 233H, 233A, 233V, 233L, 233I, 233F, 233M, 233Y, 233W, 233G, 234D, 234E, 234N, 234Q, 234T, 234H, 234Y, 234I, 234V, 234F, 234K, 234R, 234S, 234A, 234M, 234G, 235D, 235S, 235N, 235Q, 235T, 235H, 235Y, 235I, 235V, 235F, 235E, 235K, 235R, 235A, 235M, 235W, 235P, 235G, 236D, 236E, 236N, 236Q, 236K, 236R, 236S, 236T, 236H, 236A, 236V, 236L, 236I, 236F, 236M, 236Y, 236W y 236P, siendo la numeración según el índice EU.

En particular, las variantes que alteran la unión a uno o más receptores de Fc humanos pueden comprender una modificación de aminoácido en la región constante de cadena ligera, tal como se describe en el presente documento, seleccionada del grupo que consiste en 108D, 108I, 108Q, 109D, 109P, 109R, 110E, 110I, 110K, 111E, 35 111K, 111L, 112E, 112R, 112Y, 114D, 114I, 114K, 116T, 121D, 122R, 122S, 122Y, 123L, 123R, 124E, 125E, 125K, 126D, 126L, 126Q, 127A, 127D, 127K, 128N, 129E, 129I, 129K, 131T, 137K, 137S, 138D, 138K, 138L, 140E, 140H, 140K, 141E, 141K, 142D, 142G, 142L, 143A, 143L, 143R, 145D, 145T, 145Y, 147A, 147E, 147K, 149D, 149Y, 150A, 151I, 151K, 152L, 152R, 152S, 153D, 153H, 153S, 154E, 154R, 154V, 155E, 155I, 155K, 156A, 156D, 156R, 157N, 158D, 158L, 158R, 159E, 159K, 159L, 160K, 160V, 161K, 161L, 162T, 163E, 163K, 163T, 164Q, 165K, 165P, 165Y, 166E, 166M, 166S, 167K, 167L, 168K, 168Q, 168Y, 169D, 169H, 169S, 170I, 170N, 170R, 171A, 171N, 171V, 172E, 172I, 172K, 173K, 173L, 173Q, 174A, 176T, 180E, 180K, 180S, 181K, 182E, 182R, 182T, 183D, 183L, 183P, 184E, 184K, 184Y, 185I, 185Q, 185R, 187K, 187Y, 188E, 188S, 188Y, 189D, 189K, 189Y, 190E, 190L, 190R, 191E, 191R, 191S, 193E, 193K, 193S, 195I, 195K, 195Q, 197E, 197K, 197L, 199E, 199K, 199Y, 200S, 202D, 202R, 202Y, 203D, 203L, 203R, 204T, 205E, 205K, 206E, 206I, 206K, 207A, 207E, 207L, 208E, 208K, 208T, 210A, 210E, 210K, 211A,

45 211E, 211P, 212E, 212K, 212T, 213L, 213R, siendo la numeración según el índice EU.

Las sustituciones adicionales que también pueden usarse en la presente invención incluyen otras sustituciones que modulan la afinidad del receptor de Fc, la función efectora mediada por Fc!R y/o la función efectora mediada por complemento e incluyen, pero no se limitan a, 298A, 298T, 326A, 326D, 326E, 326W, 326Y, 333A, 333S, 334L y 334A (documento US 6.737.056; Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604; documento US 6.528.624; Idusogie et al., 2001, J. Immunology 166:2571-2572), 247L, 255L, 270E, 392T, 396L y 421K (documentos US 2005/0037000; US 2005/0064514) y 280H, 280Q y 280Y (documento US 2004/0002587).

En otras realizaciones, los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden combinarse con

55 variantes constantes de cadena pesada que alteran la unión de FcRn. Estas incluyen modificaciones que modifican la afinidad de FcRn de una manera específica de pH. En particular, las variantes que aumentan la unión de Fc a FcRn incluyen, pero no se limitan a: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356, documentos US 2005/0276799, WO 2004/035752, WO 2004/092219, US 2005/0014934, US 2005/0032114, WO 2005/037867, US 2005/0226864), 256A, 272A, 286A, 305A, 307A, 311A, 312A, 376A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604, documentos US 2005/0118174, US 6737056, US 2006/0194291, US 2006/0194957, WO 2006/031370, US 2006/0067930), 252F, 252T, 252Y, 252W, 254T, 256S, 256R, 256Q, 256E, 256D, 256T, 309P, 311S, 433R, 433S, 433I, 433P, 433Q, 434H, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H, 308T/309P/311S (Dall Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, documentos US7083784, WO

65 1997/034631, WO 2002/060919, US 2006/0198840), 257C, 257M, 257L, 257N, 257Y, 279E, 279Q, 279Y, inserción de Ser tras 281, 283F, 284E, 306Y, 307V, 308F, 308Y 311V, 385H, 385N, (documentos WO 2006/053301, US 2006/0173170, US 2007/0135620) 204D, 284E, 285E, 286D y 290E (documento WO 2005/047327).

Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden comprender modificaciones isotípicas, es decir modificaciones en una IgG original al tipo de aminoácido en una IgG alternativa. Por ejemplo, tal como se

5 ilustra en la figura 3, puede construirse una variante de híbrido IgG1/IgG3 sustituyendo posiciones de IgG1 en la región CH2 y/o CH3 por los aminoácidos de IgG3 en posiciones en las que difieren los dos isotipos. Por tanto, puede construirse un anticuerpo de IgG variante híbrido que comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en: 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422I, 435R y 436F. En otras realizaciones de la invención, puede construirse una variante de híbrido IgG1/IgG2 sustituyendo posiciones de IgG2 en la región CH2 y/o CH3 por aminoácidos de IgG1 en posiciones en las que difieren los dos isotipos. Por tanto, puede construirse un anticuerpo de IgG variante híbrido que comprende una o más modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en 233E, 234L, 235L, -236G (en referencia a una inserción de una glicina en la posición 236) y 327A.

15 Modificaciones de glicoforma

Muchos polipéptidos, incluyendo los anticuerpos, se someten a una variedad de modificaciones postraducionales que implican a restos de hidratos de carbono, tales como glicosilación con oligosacáridos. Hay varios factores que pueden influir en la glicosilación. Se ha demostrado que la especie, el tejido y el tipo celular son importantes en la forma en que se produce la glicosilación. Además, el entorno extracelular, a través de condiciones de cultivo alteradas tales como la concentración sérica, puede tener un efecto directo sobre la glicosilación. (Lifely et al., 1995, Glycobiology 5(8): 813-822).

Todos los anticuerpos contienen hidratos de carbono en posiciones conservadas en las regiones constantes de la

25 cadena pesada. Cada isotipo de anticuerpo tiene una variedad distinta de estructura unida en N de hidrato de carbono. Aparte del hidrato de carbono unido a la cadena pesada, hasta el 30% de las IgG humanas tienen una región Fab glicosilada. La IgG tiene un único hidrato de carbono biantenario unido en N en la Asn297 del dominio CH2. Para la IgG o bien de suero o bien producida ex vivo en hibridomas o células modificadas por ingeniería genética, las IgG son heterogéneas con respecto al hidrato de carbono unido a Asn297 (Jefferis et al., 1998, Immunol. Rev. 163: 59-76; Wright et al., 1997, Trends Biotech 15:26-32). Para la IgG humana, el oligosacárido central normalmente consiste en GlcNAc2Man3GlcNAc, con diferentes números de otros residuos.

Los restos de hidrato de carbono de la presente invención se describirán con referencia a la nomenclatura usada comúnmente para la descripción de oligosacáridos. Una revisión de la química de hidratos de carbono que usa esta

35 nomenclatura se encuentra en Hubbard et al. 1981, Ann. Rev. Biochem. 50:555-583. Esta nomenclatura incluye, por ejemplo, Man, que representa manosa; GlcNAc, que representa 2-N-acetilglucosamina; Gal que representa galactosa; Fuc para fucosa; y Glc, que representa glucosa. Los ácidos siálicos se describen mediante la notación abreviada NeuNAc, para el ácido 5-N-acetilneuramínico y NeuNGc para el ácido 5-glicolilneuramínico.

El término “glicosilación” significa la unión de oligosacáridos (hidratos de carbono que contienen dos o más azúcares individuales unidos entre sí por ejemplo, desde dos hasta aproximadamente doce azúcares individuales unidos entre sí) a una glicoproteína. Las cadenas laterales de oligosacárido normalmente se unen a la estructura principal de la glicoproteína a través de enlaces o bien en N o bien en O. Los oligosacáridos de la presente invención que se producen generalmente se unen a un dominio CH2 de una región Fc como oligosacáridos unidos en N. La

45 “glicosilación en N” se refiere a la unión del resto de hidrato de carbono a un residuo de asparagina en una cadena de glicoproteína. El experto en la técnica reconocerá que, por ejemplo, cada una de IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 murino, así como los dominios CH2 de la IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgD humanas tienen un sitio único para la glicosilación en N en el residuo de aminoácido 297 (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991).

Para los fines en el presente documento, una “estructura de hidrato de carbono central madura” se refiere a una estructura de hidrato de carbono central procesada unida a una región Fc que generalmente consiste en la siguiente estructura de hidrato de carbono GlcNAc(Fucosa)-Glc-NAc-Man-(Man-GlcNAc)2 típica de oligosacáridos biantenarios. La estructura de hidrato de carbono central madura se une a la región Fc de la glicoproteína,

55 generalmente a través un enlace en N a la Asn297 de un dominio CH2 de la región Fc. Una “GlcNAc bisectada” es un residuo de GlcNAc unido a la manosa %1,4 de la estructura de hidrato de carbono central madura. La GlcNAc bisectada puede unirse enzimáticamente a la estructura de hidrato de carbono central madura mediante una enzima %(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). Las células CHO normalmente no expresan GnTIII (Stanley et al., 1984, J. Biol. Chem. 261: 13370-13378), pero pueden modificarse por ingeniería genética para que lo hagan (Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180).

La presente invención contempla anticuerpos que comprenden glicoformas modificadas o glicoformas modificadas por ingeniería genética. Mediante “glicoforma modificada” o “glicoforma modificada por ingeniería genética” tal como se usa en el presente documento se quiere decir una composición de hidrato de carbono que se une 65 covalentemente a una proteína, por ejemplo a un anticuerpo, difiriendo dicha composición de hidrato de carbono químicamente de la de una proteína original. Las glicoformas modificadas por ingeniería genética pueden ser útiles

para una variedad de fines, incluyendo pero sin limitarse a potenciar o reducir la función efectora mediada por Fc!R. Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden modificarse para controlar el nivel de oligosacáridos fucosilados y/o bisectados que se unen covalentemente a la región Fc.

5 Históricamente, los anticuerpos producidos en las células de ovario de hámster chino (CHO), uno de los huéspedes industriales más comúnmente usados, contienen aproximadamente una población del 2 al 6% que no está fucosilada. Las líneas celulares YB2/0 (mieloma de rata) y Lec 13 (un mutante en lectina de la línea CHO que tiene una GDP-manosa 4,6 deshidratasa deficiente) conducen a la deficiencia de productos intermedios de GDP-fucosa o GDP-azúcar que son los sustratos de la &1,6-fucosiltransferasa (Ripka et al., 1986), sin embargo, pueden producir

10 anticuerpos con del 78% al 98% de especies no fucosiladas. Desgraciadamente, el rendimiento del anticuerpo de estas células es extremadamente insuficiente y por tanto estas líneas celulares no son útiles para obtener productos de anticuerpos terapéuticos comercialmente. El gen de FUT8 codifica para la enzima &1,6-fucosiltransferasa que cataliza la transferencia de un residuo de fucosilo desde la GDP-fucosa a la posición 6 de GlcNac unida en Asn (unida en N) de un N-glicano (Yanagidani et al., 1997, J Biochem 121:626-632). Se sabe que la &1,6

15 fucosiltransferasa es la única enzima responsable de añadir fucosa al hidrato de carbono biantenario unido en N en Asn297 en el dominio CH2 del anticuerpo IgG.

Se conoce bien en la técnica una variedad de métodos para generar glicoformas modificadas (Umaña et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277: 20 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem. 278:3466-3473); (documentos US 6.602.684; US 2003/0157108; US 2003/0003097; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1); Yamane-Ohnuki et al., 2004, Biotechnology and Bioengineering 87(5):614-621; (Potelligent™ technology [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb™ glycosylation engineering technology [GLYCART biotechnology AG, Zürich, Suiza]). Estas técnicas controlan el nivel de oligosacáridos fucosilados y/o bisectados que se unen covalentemente a

25 la región Fc, por ejemplo mediante la expresión de una IgG en diversos organismos o líneas celulares, modificados mediante ingeniería genética o de otro modo (por ejemplo células CHO Lec-13 o células YB2/0 de hibridoma de rata), regulando las enzimas implicadas en la ruta de glicosilación (por ejemplo FUT8 [&1,6-fucosiltranserasa] y/o %14-N-acetilglucosaminiltransferasa III [GnTIII]) o modificando el/los hidrato(s) de carbono una vez que la IgG se ha expresado.

30 Otros métodos para modificar las glicoformas de los anticuerpos de la invención incluyen usar cepas glicomodificadas por ingeniería genética de levadura (Li et al., 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215), musgo (Nechansky et al., 2007, Mol Immunjol 44(7): 1826-8) y plantas (Cox et al., 2006, Nat Biotechnol 24(12):1591-7). Los métodos para modificar glicoformas incluyen, pero no se limitan a, usar una cepa glicomodificada por ingeniería

35 genética de la levadura Pichia pastoris (Li et al., 2006, Nature Biotechnology 24(2):210-215), una cepa glicomodificada por ingeniería genética del musgo Physcomitrella patens en las que las enzimas % 1,2xilosiltransferasa y/o &1,3-fucosiltransferasa están desactivadas (Nechansky et al., 2007, Mol Immunjol 44(7):18268) y al uso de un ARN de interferencia para inhibir la alfa-1,3-fucosiltransferasa y/o la beta-1,2-xilosiltransferasa endógenas en la planta acuática Lemna minor (Cox et al., 2006, Nat Biotechnol 24(12):1591-7).

40 Glicoforma modificada o modificada por ingeniería genética normalmente se refiere al hidrato de carbono u oligosacárido diferente; por tanto, por ejemplo un anticuerpo puede comprender una glicoforma modificada por ingeniería genética. Alternativamente, glicoforma modificada por ingeniería genética puede referirse al anticuerpo que comprende el hidrato de carbono u oligosacárido diferente. Para los fines de glicoformas modificadas descritas

45 en el presente documento, un “anticuerpo original” es un anticuerpo glicosilado que tiene la misma secuencia de aminoácidos y estructura de hidrato de carbono central madura que una glicoforma modificada por ingeniería genética de la presente invención, excepto porque la fucosa está unida a la estructura de hidrato de carbono central madura del anticuerpo original. Por ejemplo, en una composición que comprende la glicoproteína original aproximadamente el 50-100% o aproximadamente el 70-100% de la glicoproteína original comprende una estructura

50 de hidrato de carbono central madura que tiene fucosa unida a la misma.

La presente descripción proporciona una composición que comprende un anticuerpo glicosilado que tiene una región Fc, en la que aproximadamente el 51-100% del anticuerpo glicosilado en la composición comprende una estructura de hidrato de carbono central madura que carece de fucosa, unida a la región Fc del anticuerpo. Más 55 preferiblemente, aproximadamente el 80-100% del anticuerpo en la composición comprende una estructura de hidrato de carbono central madura que carece de fucosa y lo más preferiblemente aproximadamente el 90-99% del anticuerpo en la composición carece de fucosa unida a la estructura de hidrato de carbono central madura. En una realización más preferida, el anticuerpo en la composición comprende tanto una estructura de hidrato de carbono central madura que carece de fucosa como adicionalmente al menos una modificación de aminoácido en la región

60 Fc. En la realización más preferida, la combinación de glicoforma modificada por ingeniería genética y modificaciones de aminoácido proporciona propiedades de unión óptimas del receptor de Fc al anticuerpo.

Propiedades optimizadas de anticuerpos

65 La presente descripción proporciona anticuerpos variantes que están optimizados para varias propiedades terapéuticamente relevantes. Un anticuerpo variante comprende una o más modificaciones de aminoácido en relación con un anticuerpo original, proporcionando dicha(s) modificación(es) de aminoácido una o más propiedades optimizadas. Por tanto, los anticuerpos de la presente descripción son anticuerpos variantes. Un anticuerpo de la presente descripción difiere en las secuencias de aminoácidos de su anticuerpo original en virtud de al menos una

5 modificación de aminoácido. Por tanto, los anticuerpos variantes de la presente descripción tienen al menos una modificación de aminoácido en comparación con el original. Alternativamente, los anticuerpos variantes de la presente descripción pueden tener más de una modificación de aminoácido en comparación con el original, por ejemplo desde aproximadamente una hasta cincuenta modificaciones de aminoácido, preferiblemente desde aproximadamente una hasta diez modificaciones de aminoácido, y lo más preferiblemente desde aproximadamente una hasta aproximadamente cinco modificaciones de aminoácido en comparación con el original. Por tanto, las secuencias de los anticuerpos variantes y las de los anticuerpos originales son sustancialmente homólogas. Por ejemplo, las secuencias del anticuerpo variante en el presente documento presentarán aproximadamente una homología del 80% con la secuencia del anticuerpo original, preferiblemente al menos aproximadamente una homología del 90%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente una homología del 95%.

15 En una realización más preferida, los anticuerpos de la presente invención comprenden modificaciones de aminoácido que proporcionan propiedades de función efectora optimizada en relación con el original. Las sustituciones y las propiedades de función efectora optimizada se describen en los documentos US 2004/0132101, WO 2004/029207 y US 2005/0054832. Las propiedades que pueden optimizarse incluyen, pero no se limitan a, afinidad potenciada o reducida por un Fc!R. Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento se optimizan para presentar afinidad potenciada por un Fc!R de activación humano, preferiblemente Fc!RI, Fc!RIIa, Fc!RIIc, Fc!RIIIa y Fc!RIIIb, lo más preferiblemente Fc!RIIIa. Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden optimizarse para presentar afinidad reducida para el receptor inhibidor humano Fc!RIIb. Se prevé que estos anticuerpos proporcionen propiedades terapéuticas potenciadas en seres humanos, por ejemplo

25 función efectora potenciada y mayor potencia anticancerígena. Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden optimizarse para tener una afinidad reducida o eliminada para un Fc!R humano, incluyendo pero sin limitarse a Fc!RI, Fc!RIIa, Fc!RIIb, Fc!RIIc, Fc!RIIIa y Fc!RIIIb. Se prevé que estos anticuerpos proporcionen propiedades terapéuticas potenciadas en seres humanos, por ejemplo función efectora reducida y toxicidad reducida. Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden proporcionar afinidad potenciada por uno o más Fc!R, aunque afinidad reducida por uno o más de otros Fc!R. Por ejemplo, un anticuerpo puede tener unión potenciada a Fc!RIIIa, aunque unión reducida a Fc!RIIb. Alternativamente, un anticuerpo puede tener unión potenciada a Fc!!RIIa y Fc!RI, aunque unión reducida a Fc!RIIb. Un anticuerpo puede tener afinidad potenciada por Fc!RIIb, aunque afinidad reducida a uno o más Fc!R de activación.

35 La modificación potencia preferiblemente la afinidad de unión por uno o más Fc!R. Mediante “mayor afinidad” o “afinidad mejorada” o “afinidad potenciada” o “mejor afinidad” que una inmunoglobulina original, tal como se usa en el presente documento se quiere decir que una variante de Fc se une a un receptor de Fc con una constante de asociación (KA) de equilibrio significativamente superior o una constante de disociación (KD) de equilibrio inferior que el polipéptido original cuando las cantidades de polipéptido variante y original en el ensayo de unión son esencialmente iguales. Por ejemplo, la variante de Fc con afinidad de unión de Fc!R mejorada puede presentar una mejora de desde aproximadamente 5 veces hasta aproximadamente 1000 veces, por ejemplo desde aproximadamente 10 veces hasta aproximadamente 500 veces en la afinidad de unión del receptor de Fc en comparación con el polipéptido original, cuando se determina la afinidad de unión del receptor de Fc, por ejemplo, tal como se da a conocer en los ejemplos en el presente documento. Por consiguiente, mediante “afinidad reducida” en

45 comparación con un polipéptido de Fc original tal como se usa en el presente documento se quiere decir que una variante de Fc se une a un receptor de Fc con KA significativamente inferior o KD superior que el polipéptido original.

Los datos en el presente estudio indican que IgG1 TN humana se une a Fc!RIIIa V158 humano con una afinidad de aproximadamente 240 nM (ejemplo 1). Esto concuerda con la bibliografía que indica que la unión es de aproximadamente 200-500 nM, tal como se determina mediante Biacore (210 nM tal como se muestra en Okazaki et al, 2004, J Mol Bio 336:1239-49; 250 nM tal como se muestra en Lazar et al, Proc Natl Acad Sci USA 103(11):40054010) y calorimetría (530 nM, Okazaki et al, 2004, J Mol Bio 336:1239-49). Sin embargo, en un estudio se midió una afinidad de tan solo 750 nM (Ferrara et al., 2006, J Biol Chem 281 (8):5032-5036). Aunque la unión a Fc!RIIIa F158 fue inferior al punto de corte de 5 uM aplicado en el presente estudio, la bibliografía indica que la IgG1 TN humana

55 se une al Fc!RIIIa F158 humano con una afinidad de aproximadamente 3-5 uM, tal como se indica mediante calorimetría (2,7 uM, en Okazaki et al, 2004, J Mol Bio 336:1239-49) y Biacore (5,0 uM, Ferrara et al., 2006, J Biol Chem 281(8):5032-5036).

También se da a conocer la optimización de la unión de Fc a un Fc!R humano, sin embargo alternativamente los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden presentar afinidad potenciada o reducida por Fc!R de organismos no humanos, incluyendo pero sin limitarse a roedores y primates no humanos, anticuerpos que se optimizan para unirse a un Fc!R no humano pueden usarse en experimentación. Por ejemplo, se dispone de modelos de ratón para una variedad de enfermedades que permiten someter a prueba propiedades tales como eficacia, toxicidad y farmacocinética para un candidato farmacológico dado. Tal como se conoce en la técnica, 65 pueden injertarse o inyectarse células cancerosas en ratones para imitar a un cáncer humano, un proceso denominado xenoinjerto. Someter a prueba anticuerpos que comprenden anticuerpos que están optimizados para uno o más Fc!R de ratón puede proporcionar información valiosa con respecto a la eficacia de la proteína, a su mecanismo de acción y similares. Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento también pueden optimizarse para obtener una funcionalidad potenciada y/o propiedades de disolución en la forma aglicosilada. Los 5 anticuerpos aglicosilados dados a conocer en el presente documento se unen a un ligando de Fc con mayor afinidad que la forma aglicosilada del anticuerpo original. Dichos ligandos de Fc incluyen, pero no se limitan a, Fc!R, C1q, FcRn y proteínas A y G, y pueden proceder de cualquier fuente incluyendo pero sin limitarse a ser humano, ratón, rata, conejo o mono, preferiblemente ser humano. Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento también pueden optimizarse para ser más estables y/o más solubles que la forma aglicosilada del anticuerpo

10 original.

Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden comprender modificaciones que modulan la interacción con ligandos de Fc distintos de Fc!R, incluyendo pero sin limitarse a proteínas del complemento, FcRn y homólogos del receptor de Fc (FcRH). Los FcRH incluyen, pero no se limitan a, FcRH1, FcRH2, FcRH3, FcRH4,

15 FcRH5 y FcRH6 (Davis et al., 2002, Immunol. Reviews 190:123-136).

Preferiblemente, la especificidad del ligando de Fc del anticuerpo de la presente invención determinará su utilidad terapéutica. La utilidad de un anticuerpo dado para fines terapéuticos dependerá del epítopo o de la forma del antígeno diana y de la enfermedad o indicación que está tratándose. Para algunas dianas e indicaciones, pueden 20 ser preferibles funciones efectoras mediadas por Fc!R potenciadas. Esto puede ser particularmente favorable para anticuerpos anticancerígenos. Por tanto, pueden usarse anticuerpos que comprenden anticuerpos que proporcionan afinidad potenciada por Fc!R de activación y/o afinidad reducida por Fc!R inhibidores. Para algunas dianas e indicaciones, puede ser beneficioso adicionalmente utilizar anticuerpos que proporcionan selectividad diferencial para diferentes Fc!R de activación; por ejemplo, en algunos casos puede desearse unión potenciada a Fc!RIIa y 25 Fc!RIIIa, pero no a Fc!RI, mientras que en otros casos, puede preferirse unión potenciada sólo a Fc!RIIa. Para determinadas dianas e indicaciones, puede ser preferible utilizar anticuerpos que potencian tanto funciones efectoras mediadas por Fc!R como mediadas por complemento, mientras que para otros casos puede ser ventajoso utilizar anticuerpos que potencian o bien funciones efectoras mediadas por Fc!R o bien mediadas por complemento. Para algunas dianas o indicaciones de cáncer, puede ser ventajoso reducir o eliminar una o más funciones

30 efectoras, por ejemplo, desactivando la unión a C1q, a uno o más Fc!R, FcRn, o a uno o más de otros ligandos de Fc. Para otras dianas e indicaciones, puede ser preferible utilizar anticuerpos que proporcionan unión potenciada al Fc!RIIb inhibidor, aunque unión a nivel de TN reducida o eliminada a los Fc!R de activación. Esto puede ser particularmente útil, por ejemplo, cuando el objetivo de un anticuerpo es inhibir la inflamación o enfermedad autoinmunitaria, o modular el sistema inmunitario de alguna forma.

35 Claramente un parámetro importante que determina la selectividad más beneficiosa de un anticuerpo dado para tratar una enfermedad dada es el contexto del anticuerpo, que es qué tipo de anticuerpo se está usando. Por tanto, la selectividad o especificidad del ligando de Fc de un anticuerpo dado proporcionará propiedades diferentes dependiendo de si compone un anticuerpo o un anticuerpo con una pareja conjugada o de fusión acoplada. Por

40 ejemplo, una toxina, radionucleótido u otros conjugados pueden ser menos tóxicos para las células normales si el anticuerpo que los comprende tiene unión reducida o eliminada a uno o más ligandos de Fc. Como otro ejemplo, con el fin de inhibir la inflamación o enfermedad autoinmunitaria, puede ser preferible utilizar un anticuerpo con afinidad potenciada por Fc!R de activación, tal como unirse a estos Fc!R y prevenir su activación. A la inversa, un anticuerpo que comprende dos o más regiones Fc con afinidad potenciada por Fc!RIIb puede acoplarse conjuntamente a este

45 receptor en la superficie de células inmunitarias, inhibiendo de ese modo la proliferación de estas células. Mientras que en algunos casos un anticuerpo puede acoplarse a su antígeno diana en un tipo celular aunque acoplándose a Fc!R en células separadas del antígeno diana, en otros casos puede ser ventajoso acoplarse a Fc!R en la superficie de las mismas células que el antígeno diana. Por ejemplo, si un anticuerpo selecciona como diana un antígeno en una célula que también expresa uno o más Fc!R, puede ser beneficioso utilizar un anticuerpo que potencie o

50 reduzca la unión a los Fc!R en la superficie de esa célula. Esto puede ser el caso, por ejemplo cuando el anticuerpo se está usando como un agente anticancerígeno y el acoplamiento conjunto del antígeno diana y Fc!R en la superficie de la misma célula potencia acontecimientos de señalización dentro de la célula que dan como resultado la inhibición del crecimiento, la apoptosis u otro efecto antiproliferativo. Alternativamente, el acoplamiento conjunto del antígeno y Fc!R en la misma célula puede ser ventajoso cuando el anticuerpo se está usando para modular el

55 sistema inmunitario de alguna forma, proporcionando el acoplamiento conjunto del antígeno diana y Fc!R algún efecto proliferativo o antiproliferativo. Asimismo, los anticuerpos que comprenden dos o más regiones Fc pueden beneficiarse de anticuerpos que modulan la selectividad o especificidad de Fc!R para acoplarse conjuntamente a Fc!R en la superficie de la misma célula.

60 La especificidad del ligando de Fc de los anticuerpos dado a conocer en el presente documento puede modularse para crear diferentes perfiles de función efectora que pueden ser adecuados para epítopos antigénicos, indicaciones

o poblaciones de pacientes particulares. La figura 5 describe varias realizaciones preferidas de perfiles de unión de receptor que incluyen mejoras en, reducciones en o ausencia de efecto en la unión a diversos receptores, en las que tales cambios pueden ser beneficiosos en determinados contextos. Los perfiles de unión a receptor en la figura 5 podrían variar en grado de aumento o disminución a los receptores especificados. Adicionalmente, los cambios de unión especificados podrían ser en el contexto de cambios de unión adicionales a otros receptores tales como C1q o FcRn, por ejemplo mediante combinación con ablación de la unión a C1q para detener la activación del complemento, o mediante la combinación con unión potenciada a C1q para aumentar la activación del complemento.

5 Son posibles realizaciones con otros perfiles de unión de receptor, siendo a modo de ejemplo los perfiles de unión de receptor enumerados.

La presencia de diferentes formas polimórficas de Fc!R proporciona todavía otro parámetro que afecta a la utilidad terapéutica de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento. Mientras que la especificidad y la selectividad de un anticuerpo dado para las diferentes clases de Fc!R afecta significativamente a la capacidad de un anticuerpo para seleccionar como diana un antígeno dado para el tratamiento de una enfermedad dada, la especificidad o selectividad de un anticuerpo para las diferentes formas polimórficas de estos receptores puede determinar en parte qué experimentos de investigación o preclínicos pueden resultar apropiados para las pruebas y finalmente qué poblaciones de pacientes pueden responder o no al tratamiento. Por tanto, la especificidad o la

15 selectividad de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento para polimorfismos de ligando de Fc, incluyendo pero sin limitarse a polimorfismos de Fc!R, C1q, FcRn y FcRH, puede usarse para guiar la selección de experimentos de investigación y preclínicos válidos, el diseño de ensayos clínicos, la selección de pacientes, la dependencia de la dosificación y/u otros aspectos relativos a los ensayos clínicos.

Otras modificaciones

Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden comprender una o más modificaciones que proporcionan propiedades optimizadas que no están relacionadas específicamente con la función efectora per se. Dichas modificaciones pueden ser modificaciones de aminoácido o pueden ser modificaciones que se realizan

25 enzimática o químicamente. Tal/tales modificación/modificaciones proporcionan probablemente alguna mejora en el anticuerpo, por ejemplo una mejora en su estabilidad, solubilidad, función o uso clínico. En el presente documento se da a conocer una variedad de mejoras que pueden realizarse acoplando los anticuerpos de la presente invención con modificaciones adicionales.

La región variable de un anticuerpo tal como se da a conocer en el presente documento puede hacerse madurar por afinidad, es decir, que se han realizado modificaciones de aminoácido en los dominios VH y/o VL del anticuerpo para potenciar la unión del anticuerpo a su antígeno diana. Tales tipos de modificaciones pueden mejorar la cinética de asociación y/o de disociación para la unión al antígeno diana. Otras modificaciones incluyen las que mejoran la selectividad por el antígeno diana frente a dianas alternativas. Estas incluyen modificaciones que mejoran la

35 selectividad por el antígeno expresado en células diana frente a células no diana. Pueden proporcionarse otras mejoras para las propiedades de reconocimiento de diana mediante modificaciones adicionales. Tales propiedades pueden incluir, pero no se limitan a, propiedades cinéticas específicas (es decir cinéticas de asociación y disociación), selectividad por la diana particular frente a dianas alternativas y selectividad por una forma específica de diana frente a formas alternativas. Los ejemplos incluyen variantes de longitud completa frente a variantes alternativas de corte y empalme, formas de la superficie celular frente a solubles, selectividad por diversas variantes polimórficas o selectividad por formas conformacionales específicas del antígeno diana.

Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden comprender una o más modificaciones que proporcionan la internalización reducida o potenciada de un anticuerpo. Los anticuerpos dados a conocer en el 45 presente documento pueden utilizarse o combinarse con modificaciones adicionales con el fin de reducir la internalización celular de un anticuerpo que se produce a través de la interacción con uno o más ligandos de Fc. Podría esperarse que esta propiedad potenciara la función efectora y redujera posiblemente la inmunogenicidad de los anticuerpos de la invención. Alternativamente, los anticuerpos pueden utilizarse directamente o combinados con modificaciones adicionales con el fin de potenciar la internalización celular de un anticuerpo que se produce a través de la interacción con uno o más ligandos de Fc. Por ejemplo, se usa un anticuerpo que proporciona unión potenciada a Fc!RI, que se expresa en células dendríticas y se activa de manera temprana en la respuesta inmunitaria. Esta estrategia podría potenciarse adicionalmente mediante la combinación con modificaciones adicionales, o bien dentro del anticuerpo o bien en una pareja conjugada o de fusión unida, que promueve el reconocimiento y la presentación de fragmentos peptídicos de Fc por moléculas del MHC. Se espera que estas

55 estrategias potencien el procesamiento del antígeno diana y mejoren de ese modo la antigenicidad del antígeno diana (Bonnerot y Amigorena, 1999, Immunol Rev. 172:279-84), estimulando una respuesta inmunitaria adaptativa y una mayor muerte de células dianas por el sistema inmunitario humano. Estas estrategias pueden ser particularmente ventajosas cuando el antígeno seleccionado como diana se desprende de la superficie celular. Una aplicación adicional de estos conceptos surge con las inmunoterapias de vacunas idiotípicas, en las que se usan anticuerpos específicos de clon producidos por células de linfoma del paciente para vacunar al paciente.

Pueden realizarse modificaciones para mejorar las propiedades biofísicas de los anticuerpos, incluyendo pero sin limitarse a la estabilidad, la solubilidad y el estado oligomérico. Las modificaciones pueden incluir, por ejemplo, sustituciones que proporcionan interacciones intramoleculares más favorables en el anticuerpo tal como 65 proporcionar mayor estabilidad, o sustitución de aminoácidos no polares expuestos por aminoácidos polares para obtener mayor solubilidad. En el documento US 2004/0110226 se describen varios objetivos y métodos de

optimización que pueden usarse para modificaciones adicionales mediante ingeniería genética para optimizar adicionalmente los anticuerpos dados a conocer en el presente documento. Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento también pueden combinarse con modificaciones adicionales que reducen el tamaño o el estado oligomérico, de manera que se potencie la penetración del tumor o que se aumenten las tasas de aclaramiento in

5 vivo según se desee.

Otras modificaciones para los anticuerpos dados a conocer en el presente documento incluyen las que permiten formación específica de moléculas homodiméricas u homomultiméricas. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, disulfuros obtenidos mediante ingeniería genética, así como modificaciones químicas o métodos de agregación que pueden proporcionar un mecanismo para generar homodímeros u homomultímeros covalentes. Por ejemplo, métodos de modificación por ingeniería genética y composiciones de tales moléculas se describen en Kan et al., 2001, J. Immunol., 2001, 166: 1320-1326; Stevenson et al., 2002, Recent Results Cancer Res. 159: 104-12; documento US 5.681.566; Caron et al., 1992, J. Exp. Med. 176:1191-1195 y Shopes, 1992, J. Immunol. 148(9):2918

22. Las modificaciones adicionales para las variantes dadas a conocer en el presente documento incluyen las que

15 permiten la formación específica de moléculas heterodiméricas, heteromultiméricas, bifuncionales y/o multifuncionales. Tales modificaciones incluyen, pero no se limitan a, una o más sustituciones de aminoácidos en el dominio CH3, reduciendo las sustituciones la formación de homodímeros y aumentando la formación de heterodímeros. Por ejemplo, se describen métodos de modificación por ingeniería genética y composiciones de tales moléculas en Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270(1): 26-35 y Carter et al., 2001, J. Immunol. Methods 248:7-15. Las modificaciones adicionales incluyen modificaciones en la región bisagra y los dominios CH3, en los que las modificaciones reducen la propensión a formar dímeros.

Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden comprender modificaciones que eliminan sitios de degradación proteolítica. Estas pueden incluir, por ejemplo, sitios de proteasa que reducen rendimientos de 25 producción, así como sitios de proteasa que degradan la proteína administrada in vivo. Se realizan modificaciones adicionales para eliminar sitios de degradación covalentes tales como sitios de desamidación (es decir desamidación de residuos de glutaminilo y asparaginilo para dar los residuos correspondientes de glutamilo y aspartilo), oxidación, y degradación proteolítica. Los sitios de desamidación que son particularmente útiles de eliminar son aquellos que tienen propensión potenciada a la desamidación, incluyendo pero sin limitarse a residuos de asparaginilo y glutamilo seguido por glicinas (motivos NG y QG, respectivamente). En tales casos, la sustitución de cualquier residuo puede reducir significativamente la tendencia a la desamidación. Los sitios de oxidación comunes incluyen residuos de metionina y cisteína. Otras modificaciones covalentes, que o bien pueden introducirse o bien eliminarse, incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, mutilación de grupos amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular

35 Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, págs. 79-86 (1983)), acetilación de aminas N-terminales y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal. Las modificaciones adicionales también pueden incluir pero no se limitan a modificaciones postraducionales tales como glicosilación y fosforilación unida en N o unida en O.

Las modificaciones pueden incluir las que mejoran los rendimientos de expresión y/o purificación de huéspedes o células huésped comúnmente usadas para la producción de productos biológicos. Estas incluyen, pero no se limitan a diversas líneas celulares de mamífero (por ejemplo CHO), líneas celulares de levadura, líneas celulares bacterianas y plantas. Las modificaciones adicionales incluyen modificaciones que eliminan o reducen la capacidad de las cadenas pesadas para formar enlaces disulfuro entre cadenas. Las modificaciones adicionales incluyen modificaciones que eliminan o reducen la capacidad de las cadenas pesadas para formar enlaces disulfuro dentro

45 de una cadena.

Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden comprender modificaciones que incluyen el uso de aminoácidos no naturales incorporados usando, por ejemplo, las tecnologías desarrolladas por Schultz y colaboradores, incluyendo pero sin limitarse a los métodos descritos por Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30, Anderson et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(2):7566-71, Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3 y Chin et al., 2003, Science 341(5635):964-7. Estas modificaciones permiten la manipulación de diversas propiedades funcionales, biofísicas, inmunológicas o de fabricación comentadas anteriormente. Estas modificaciones pueden permitir además la modificación química adicional para otros fines. En el presente documento se dan a conocer otras modificaciones. Por ejemplo, el anticuerpo de la invención puede unirse a uno de

55 una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. Pueden realizarse modificaciones de aminoácido adicionales para permitir la modificación postraducional o química específica o no específica de los anticuerpos. Tales modificaciones, incluyen, pero no se limitan a pegilación y glicosilación. Sustituciones específicas que pueden utilizarse para permitir la pegilación incluyen, pero no se limitan a, introducción de residuos de cisteína novedosos o aminoácidos no naturales de manera que pueden usarse químicas de acoplamiento eficaces y específicas para unirse a PEG o a un resto por lo demás polimérico. La introducción de sitios de glicosilación específicos puede lograrse introduciendo secuencias de N-X-T/S novedosas en los anticuerpos de la presente invención.

Se dan a conocer modificaciones covalentes de anticuerpos y se realizan generalmente, pero no siempre, después

65 de la traducción. Por ejemplo, se introducen varios tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácido específicos del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que puede hacerse reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con los residuos N-o C-terminales.

En algunas realizaciones, la modificación covalente de los anticuerpos dados a conocer en el presente documento comprende la adición de uno o más marcadores. El término “grupo marcador” significa cualquier marcador 5 detectable. El grupo marcador puede acoplarse al anticuerpo a través de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir un posible impedimento estérico. Se conocen en la técnica diversos métodos para marcar proteínas y pueden usarse. En general, los marcadores pertenecen a una variedad de clases, dependiendo del ensayo en que van a detectarse: a) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados; b) marcadores magnéticos (por ejemplo, partículas magnéticas); c) restos activos redox; d) colorantes ópticos; grupos enzimáticos (por ejemplo peroxidasa del rábano, %-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina); e) grupos biotinilados; y f) epítopos polipeptídicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, marcadores de epítopos, etc.). El grupo marcador puede acoplarse al anticuerpo a través de brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico. Se conocen en la técnica diversos

15 métodos para marcar proteínas y pueden usarse. Los marcadores específicos incluyen colorantes ópticos incluyendo pero sin limitarse a cromóforos, fósforos y fluoróforos, siendo estos últimos específicos en muchos casos. Los fluoróforos pueden ser o bien fluoróforos de “molécula pequeña” o bien fluoróforos proteicos. Mediante “marcador fluorescente” se quiere decir cualquier molécula que pueda detectarse a través de sus propiedades fluorescentes inherentes.

Fusiones y conjugados de anticuerpos

Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento pueden ser “proteínas de fusión” de anticuerpos, denominados en ocasiones en el presente documento “conjugados de anticuerpos”. La pareja de fusión o pareja de 25 conjugado puede ser proteica o no proteica, generándose esta última generalmente usando grupos funcionales en el anticuerpo y en la pareja de conjugado. Las parejas de conjugado y de fusión pueden ser cualquier molécula, incluyendo polipéptidos y compuestos químicos de molécula pequeña. Por ejemplo, en Trail et al., 1999, Curr. Opin. Immunol. 11:584-588 se describe una variedad de conjugados de anticuerpos y métodos. Las posibles parejas de conjugado incluyen, pero no se limitan a, citocinas, agentes citotóxicos, toxinas, radioisótopos, agentes quimioterápicos, agentes antiangiogénicos, inhibidores de tirosina cinasa y otros agentes terapéuticamente activos. En algunos casos, las parejas de conjugado pueden considerarse más bien como cargas útiles, es decir que el objetivo de un conjugado es el envío dirigido de la pareja de conjugado a una célula seleccionada como diana, por ejemplo una célula cancerosa o una célula inmunitaria, por el anticuerpo. Por tanto, por ejemplo, la conjugación de una toxina con un anticuerpo dirige la entrega de dicha toxina a células que expresan el antígeno diana. Tal como

35 apreciará un experto en la técnica, en realidad los conceptos y definiciones de fusión y conjugado son solapantes. La designación de un anticuerpo como fusión o conjugado no pretende limitarla a ninguna realización particular dada a conocer en el presente documento. Más bien, estos términos se usan libremente para transmitir el amplio concepto de que cualquier anticuerpo tal como se da a conocer en el presente documento puede unirse de manera genética, química o de otro modo, a uno o más polipéptidos o moléculas para proporcional alguna propiedad deseable.

Los conjugados adecuados incluyen, pero no se limitan a, marcadores tal como se describe más adelante, fármacos y agentes citotóxicos incluyendo, pero sin limitarse a, fármacos citotóxicos (por ejemplo, agentes quimioterápicos) o toxinas o fragmentos activos de tales toxinas. Las toxinas adecuadas y sus fragmentos correspondientes incluyen cadena A de difteria, cadena a de exotoxina, cadena A de ricina, cadena A de abrina, curcina, crotina, fenomicina, 45 neomicina y similares. Los agentes citotóxicos también incluyen agentes radioquímicos obtenidos mediante la conjugación de radioisótopos a anticuerpos, o mediante la unión de un radionúclido a un agente quelante que se ha unido covalentemente al anticuerpo. Las realizaciones adicionales utilizan calicheamicina, auristatinas, geldanamicina, maitansina y duocarmicinas y análogos; para estos últimos, véase el documento U.S. 2003/0050331.

Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden fusionarse o conjugarse con una citocina. Mediante “citocina” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúan sobre otras células como mediadores intercelulares. Por ejemplo, tal como se describe en Penichet et al., 2001, J. Immunol. Methods 248:91-101, las citocinas pueden fusionarse al anticuerpo para proporcionar una serie de propiedades deseables. Los ejemplos de tales citocinas son 55 linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen hormona de crecimiento tal como hormona de crecimiento humana, N-metionil-hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glicoproteicas tales como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de tiroides (TSH) y hormona luteinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado con gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nerviosos tales como NGF-beta; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón-alfa, beta y gamma; factores estimuladores de 65 colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos-macrófagos (GM-CSF); y CSF de granulocitos (G-CSF); interleucinas (IL) tal como IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11,

IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; C5a; y otros factores polipeptídicos incluyendo LIF y ligando kit (KL). Tal como se usa en el presente documento, el término citocina incluye proteínas procedentes de fuentes naturales o procedentes de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

5 Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden fusionarse, conjugarse o unirse operativamente a una toxina, incluyendo pero sin limitarse toxinas de molécula pequeña y toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de las mismas. Por ejemplo, en Thrush et al., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14:49-71 se describe una variedad de inmunotoxinas y métodos de inmunotoxinas. Las toxinas de molécula pequeña incluyen, pero no se limitan a, calicheamicina, maitansina (documento US 5.208.020), tricoteno y CC1065. El anticuerpo puede conjugarse con una o más moléculas de maitansina (por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo). La maitansina puede convertirse, por ejemplo, en May-SS-Me que puede reducirse en May-SH3 y hacerse reaccionar con un anticuerpo modificado (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131) para generar un

15 conjugado de maitansinoide-anticuerpo. Otro conjugado de interés comprende un conjugado de anticuerpo con una

o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos de calicheamicina pueden producir roturas en el ADN bicatenario a concentraciones sub-picomolares. Los análogos estructurales de calicheamicina que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, y11, &21, &3, N-acetil-!11, PSAG y ∋11, (Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:33363342; Lode et al., 1998, Cancer Research 58:2925-2928) (documentos US 5.714.586; US 5.712.374; US 5.264.586; US 5.773.001). Análogos de dolastatina 10 tales como auristatina E (AE) y monometillauristatina E (MMAE) pueden usarse como conjugados para los anticuerpos de la presente invención (Doronina et al., 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84; Francisco et al., 2003 Blood 102(4):1458-65). Las toxinas enzimáticamente activas útiles incluyen, pero no se limitan a, cadena A de difteria, fragmentos activos no de unión de toxina diftérica, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina,

25 proteínas de Aleurites fordii, proteínas diatínicas, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, neomicina y los tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento PCT WO 93/21232. La presente invención también da a conocer un conjugado entre un anticuerpo de la presente invención y un compuesto con actividad nucleolítica, por ejemplo una ribonucleasa o endonucleasa de ADN tal como una desoxirribonucleasa (ADNasa).

Además, un anticuerpo tal como se da a conocer en el presente documento puede fusionarse, conjugarse o unirse operativamente a un radioisótopo para formar un radioconjugado. Una variedad de isótopos radiactivos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, At211,

35 I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32e isótopos radiactivos de Lu.

Un anticuerpo tal como se da a conocer en el presente documento puede conjugarse a un “receptor” (tal como estreptavidina) para su uso en la selección previa como diana de tumores administrándose el conjugado de anticuerpo-receptor al paciente, seguido por la eliminación de conjugado no unido de la circulación usando un agente de aclaramiento y después por la administración de un “ligando” (por ejemplo avidina) que está conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo un radionucleótido). El anticuerpo puede conjugarse o unirse operativamente a una enzima con el fin de emplear terapia con profármaco mediada por enzimas dependiente de anticuerpo (ADEPT). La ADEPT puede usarse conjugando o uniendo operativamente el anticuerpo a una enzima de activación de profármaco que convierte un profármaco (por ejemplo un agente quimioterápico de peptidilo, véase el documento 45 PCT WO 81/01145) en un fármaco anticancerígeno activo. Véanse, por ejemplo, los documentos PCT WO 88/07378 y US 4.975.278. El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima que puede actuar sobre un profármaco de tal manera que lo convierte en su forma citotóxica más activa. La enzimas que son útiles en el método incluyen, pero no se limitan a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfatos en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anticancerígeno 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa de Serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; Dalanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácido; enzimas de escisión de hidratos de carbono tales como beta-galactosidasa y neuramimidasa útiles para convertir profármacos

55 glicosilados en fármacos libres; beta-lactamasa útil para convertir fármacos derivatizados con alfa-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivatizados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como “abzimas”, para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Pueden prepararse conjugados de anticuerpo-abzima para la administración de la abzima a una población de células tumorales. Se contempla una variedad de conjugados adicionales para los anticuerpos de la presente invención. A continuación se describe una variedad de agentes quimioterápicos, agentes antiangiogénicos, inhibidores de tirosina cinasa y otros agentes terapéuticos, que pueden usarse como conjugados de anticuerpo.

65 También se dan a conocer como parejas de fusión y de conjugado, polipéptidos de Fc. Por tanto, un anticuerpo

puede ser un polipéptido de Fc multimérico, que comprende dos o más regiones Fc. La ventaja de una molécula de este tipo es que proporciona múltiples sitios de unión para receptores de Fc con una única molécula de proteína. Las regiones Fc pueden unirse usando un enfoque de ingeniería química. Por ejemplo, pueden unirse Fab y Fc mediante enlaces tioéter que se originan en residuos de cisteína en las regiones bisagra, generando moléculas tales como 5 FabFc2. Pueden unirse regiones Fc usando diseño por ingeniería de disulfuro y/o reticulación química. También pueden unirse regiones Fc genéticamente. Las regiones Fc en un anticuerpo pueden unirse genéticamente para generar regiones Fc unidas en tándem tal como se describe en el documento US 2005/0249723, titulado “Fc polypeptides with novel Fc ligand binding sites”. Los polipéptidos de Fc unidos en tándem pueden comprender dos o más regiones Fc, preferiblemente de una a tres, lo más preferiblemente dos regiones Fc. Puede ser ventajoso explorar varios constructos de modificación por ingeniería con el fin de obtener anticuerpos unidos en homo o hetero-tándem con las propiedades estructurales y funcionales más favorables. Los anticuerpos unidos en tándem pueden ser anticuerpos unidos en homo-tándem, es decir un anticuerpo de un isotipo se fusiona genéticamente a otro anticuerpo del mismo isotipo. Se prevé que dado que hay múltiples sitios de unión de Fc!R, C1q y/o FcRn en polipéptidos de Fc unidos en tándem, pueden potenciarse las funciones efectoras y/o la farmacocinética. Pueden

15 unirse en tándem anticuerpos de diferentes isotipos, denominados anticuerpos unidos en hetero-tándem. Por ejemplo, debido a la capacidad para seleccionar como diana receptores Fc!R y Fc&RI, un anticuerpo que se une tanto a Fc!R como a Fc&RI puede proporcionar una mejora clínica significativa.

Además de anticuerpos, una proteína similar a anticuerpo que está encontrando un papel cada vez mayor en la investigación y la terapia es la fusión de Fc (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200). En el presente documento se pretende que “fusión de Fc” sea sinónimo de los términos “inmunoadhesina”, “fusión de Ig”, “quimera de Ig” y “globulina receptora” (algunas veces con guiones) tal como se usa en la técnica anterior (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200). Una fusión de Fc es una proteína en la que uno o más polipéptidos están operativamente

25 unidos a Fc. Una fusión de Fc combina la región Fc de un anticuerpo, y por tanto sus funciones efectoras y farmacocinética favorables, con la región de unión a diana de un receptor, ligando o alguna otra proteína o dominio de proteína. El papel de este último es mediar el reconocimiento de la diana, y por tanto es funcionalmente análogo a la región variable de anticuerpo. Debido al solapamiento estructural y funcional de fusiones de Fc con anticuerpos, la evaluación sobre anticuerpos dados a conocer en el presente documento también se extiende a Fc.

Prácticamente cualquier proteína o molécula pequeña puede unirse a Fc para generar una fusión de Fc. Las parejas de fusión de proteínas pueden incluir, pero no se limitan a, la región variable de cualquier anticuerpo, la región de unión a diana de un receptor, una molécula de adhesión, un ligando, una enzima, una citocina, una quimiocina o alguna otra proteína o dominio de proteína. Las parejas de fusión de moléculas pequeñas pueden incluir cualquier

35 agente terapéutico que dirige la fusión de Fc a una diana terapéutica. Tales dianas pueden ser cualquier molécula, preferiblemente un receptor extracelular, que participa en la enfermedad.

Las parejas de fusión y de conjugado pueden unirse a cualquier región de un anticuerpo dado a conocer en el presente documento, incluyendo en los extremos N o C-terminales, o en algún residuo entre los extremos terminales. Una pareja de fusión o de conjugado puede unirse al extremo N o C-terminal del anticuerpo, lo más preferiblemente al extremo N-terminal. Puede usarse una variedad de ligadores para unir covalentemente anticuerpos a una pareja de fusión o de conjugado. Mediante “ligador”, “secuencia ligadora”, “espaciador”, “secuencia de anclaje” o equivalentes gramaticales de los mismos, en el presente documento se quiere decir una molécula o grupo de moléculas (tal como un monómero o polímero) que conecta dos moléculas y con frecuencia 45 sirve para colocar las dos moléculas en una configuración preferida. Se conocen ligadores en la técnica; por ejemplo, se conocen bien ligadores homo o hetero-bifuncionales (véase, catalogo de Pierce Chemical Company de 1994, sección técnica sobre ligadores cruzados, páginas 155-200). Pueden usarse varias estrategias para unir moléculas covalentemente entre sí. Estas incluyen, pero no se limitan a, enlaces de polipéptidos entre extremos N y C-terminales de proteínas o dominios de proteína, enlace mediante puentes disulfuro y enlace mediante reactivos de reticulación química. En un aspecto de esta realización, el ligador es un enlace peptídico, generado mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. El ligador puede contener residuos de aminoácido que proporcionan flexibilidad. Por tanto, el péptido ligador puede incluir predominantemente los siguientes residuos de aminoácido: Gly, Ser, Ala o Thr. El péptido ligador debe tener una longitud que es adecuada para unir dos moléculas de tal manera que asumen la conformación correcta una en relación con la otra de modo que conservan la actividad

55 deseada. Las longitudes adecuadas para este propósito incluyen al menos uno y no más de 50 residuos de aminoácido. Preferiblemente, el ligador tiene desde aproximadamente 1 hasta 30 aminoácidos de longitud, siendo los más preferidos ligadores de 1 a 20 aminoácidos de longitud. Los ligadores útiles incluyen polímeros de glicinaserina (incluyendo, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)n (GGGGS)n y (GGGS)n, en los que n es un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros ligadores flexibles, tal como apreciarán los expertos en la técnica. Alternativamente, puede usarse una variedad de polímeros no proteicos, incluyendo, pero sin limitarse a, polietilenglicol (PEG), polipropilenglicol, polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol, como ligadores, es decir que pueden usarse para unir los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento a una pareja de fusión o de conjugado, o para unir los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento a un conjugado.

65 Producción de anticuerpos Se dan a conocer métodos para producir y someter a prueba experimentalmente anticuerpos. Se pretende que los métodos descritos ilustren de manera general que pueden producirse uno o más anticuerpos y someterse a prueba experimentalmente para obtener anticuerpos variantes. Se describen métodos generales para la biología molecular,

5 expresión, purificación y selección de anticuerpos en Antibody Engineering, editado por Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; y Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76; Antibodies: A Laboratory Manual de Harlow & Lane, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.

En una realización de la presente invención se crean ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos de la presente invención y que entonces pueden clonarse en células huésped, expresarse y someterse a ensayo, si se desea. Por tanto, pueden prepararse ácidos nucleicos, y particularmente ADN, que codifican para cada secuencia de proteína. Estas prácticas se llevan a cabo usando procedimientos bien conocidos. Por ejemplo, se describe una variedad de métodos que pueden usarse en la presente invención en Molecular Cloning -A Laboratory Manual, 3ª 15 Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 2001), y Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons). Tal como apreciarán los expertos en la técnica, la generación de secuencias exactas para una biblioteca que comprende un gran número de secuencias es potencialmente cara y requiere mucho tiempo. Mediante “biblioteca” en el presente documento se quiere decir un conjunto de variantes de cualquier forma, incluyendo, pero sin limitarse a, una lista de secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos, una lista de sustituciones de ácido nucleico o de aminoácidos en posiciones variables, una biblioteca física que comprende ácidos nucleicos que codifican para la secuencias de la biblioteca o una biblioteca física que comprende las proteínas variantes, en forma o bien purificada o bien no purificada. Por consiguiente, hay una variedad de técnicas que pueden usarse para generar bibliotecas eficazmente tal como se da a conocer en el presente documento. Tales métodos pueden usarse tal como se describe o se hace referencia en los documentos US 6.403.312; US

25 2002/0048772; US 2002/0090648; US 2003/0130827; PCT WO 01/40091 y PCT WO 02/25588. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, métodos de ensamblaje génico, método basado en PCR y métodos que usan variaciones de PCR, métodos basados en reacción en cadena de la ligasa, métodos de oligómeros combinados tales como los usados en el intercambio sintético, métodos de amplificación propensa a errores y métodos que usan oligómeros con mutaciones al azar, métodos de mutagénesis dirigida al sitio clásica, mutagénesis de casete, y otros métodos de síntesis génica y amplificación. Tal como se conoce en la técnica, hay una variedad de kits y métodos comercialmente disponibles para ensamblaje génico, mutagénesis, subclonación de vectores y similares, y tales productos comerciales encuentran uso en la presente invención para generar ácidos nucleicos que codifican para anticuerpos.

35 Los anticuerpos de la presente invención pueden producirse cultivando una célula huésped transformada con ácido nucleico, preferiblemente un vector de expresión, que contiene ácido nucleico que codifica para los anticuerpos, en las condiciones apropiadas para inducir o provocar la expresión de la proteína. Las condiciones apropiadas para la expresión variarán con la elección del vector de expresión y la célula huésped, y se determinarán fácilmente por un experto en la técnica mediante experimentación de rutina. Puede usarse una amplia variedad de células huésped apropiadas, incluyendo, pero sin limitarse a, células de mamífero, bacterias, células de insecto y levadura. Por ejemplo, una variedad de líneas celulares que pueden usarse en la presente invención se describen en el catálogo de líneas celulares de ATCC®, disponible de la Colección americana de cultivos tipo.

Preferiblemente, los anticuerpos se expresan en sistemas de expresión de mamífero, incluyendo sistemas en los

45 que los constructos de expresión se introducen en las células de mamífero usando virus tales como retrovirus o adenovirus. Puede usarse cualquier célula de mamífero, prefiriéndose particularmente células humanas, de ratón, rata, hámster, y primate. Las células adecuadas también incluyen células de investigación conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a, células T Jurkat, células NIH3T3, CHO, BHK, COS, HEK293, PER C.6, HeLa, Sp2/0, NS0 y variantes de las mismas. Alternativamente, se expresan proteínas de biblioteca en células bacterianas. En la técnica se conocen bien sistemas de expresión bacterianos, e incluyen Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Streptococcus cremoris y Streptococcus lividans. Alternativamente se producen anticuerpos en células de insecto (por ejemplo Sf21/Sf9, Trichoplusia ni Bti-Tn5b1-4) o células de levadura (por ejemplo S. cerevisiae, Pichia, etc.). Alternativamente se expresan anticuerpos in vitro usando sistemas de traducción libres de células. Hay sistemas de traducción in vitro derivados de células tanto procariotas (por ejemplo E. coli) como eucariotas (por ejemplo germen

55 de trigo, reticulocitos de conejo) disponibles y pueden elegirse basándose en los niveles de expresión y las propiedades funcionales de la proteína de interés. Por ejemplo, tal como aprecian los expertos en la técnica, se requiere traducción in vitro para algunas tecnologías de presentación, por ejemplo presentación en ribosoma. Además, los anticuerpos pueden producirse mediante métodos de síntesis química. También sistemas de expresión transgénica tanto animales (por ejemplo leche de vaca, oveja o cabra, huevos de gallina embrionados, larvas de insecto completas, etc.) como vegetales (por ejemplo maíz, tabaco, lenteja acuática, etc.)

Los ácidos nucleicos que codifican para la secuencia de cadena pesada y la secuencia de cadena ligera de los anticuerpos de la presente invención tal como se define en las reivindicaciones pueden incorporarse en un vector de expresión con el fin de expresar la proteína. Puede usarse una variedad de vectores de expresión para la expresión 65 de proteínas. Los vectores de expresión pueden comprender vectores extra-cromosómicos auto-replicantes o vectores que se integran en un genoma huésped. Se construyen vectores de expresión para ser compatibles con el

tipo de célula huésped. Por tanto, los vectores de expresión que pueden usarse según la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a, los que permiten la expresión de proteínas en células de mamífero, bacterias, células de insecto, levadura y en sistemas in vitro. Tal como se conoce en la técnica, está disponible una variedad de vectores de expresión, comercialmente o de otro modo, que pueden usarse en la presente invención para expresar

5 anticuerpos.

Los vectores de expresión comprenden normalmente una proteína operativamente unida con secuencias de control

o reguladoras, marcadores seleccionables, cualquier pareja de fusión y/o elementos adicionales. Mediante “operativamente unido” en el presente documento se quiere decir que el ácido nucleico se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Generalmente, estos vectores de expresión incluyen ácido nucleico regulador transcripcional y traduccional operativamente unido al ácido nucleico que codifica para el anticuerpo y normalmente son apropiados para que la célula huésped exprese la proteína. En general, las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales pueden incluir secuencias promotoras, sitios de unión al ribosoma, secuencias de iniciación y de terminación de la transcripción, secuencias de iniciación y de terminación de la

15 traducción y secuencias potenciadoras o activadoras. Tal como también se conoce en la técnica, los vectores de expresión contienen normalmente un gen de selección o marcador para permitir la selección de células huésped transformadas que contienen el vector de expresión. En la técnica se conocen bien genes de selección y variarán con la célula huésped usada.

Los anticuerpos pueden unirse operativamente a una pareja de fusión para permitir el direccionamiento de la proteína expresada, la purificación, selección, presentación y similares. Las parejas de fusión pueden unirse a la secuencia de anticuerpo mediante secuencias ligadoras. La secuencia ligadora comprenderá generalmente un pequeño número de aminoácidos, normalmente menos de diez, aunque también pueden usarse ligadores más largos. Normalmente, se seleccionan secuencias ligadoras para que sean flexibles y resistentes a la degradación. 25 Tal como apreciarán los expertos en la técnica, puede usarse cualquiera de una amplia variedad de secuencias como ligadores. Por ejemplo, una secuencia ligadora común comprende la secuencia de aminoácidos GGGGS. Una pareja de fusión puede ser una secuencia de direccionamiento o de señal que dirige el anticuerpo y cualquier pareja de fusión asociada a una ubicación celular deseada o a los medios extracelulares. Tal como se conoce en la técnica, determinadas secuencias de señalización pueden dirigir una proteína o bien para secretarse en los medios de crecimiento, o bien en el espacio periplasmático, ubicado entre la membrana interior y exterior de la célula. Una pareja de fusión también puede ser una secuencia que codifica un péptido o proteína que permite la purificación y/o selección. Tales parejas de fusión incluyen, pero no se limitan a, etiquetas de polihistidina (etiquetas de His) (por ejemplo H6 y H10 u otras etiquetas para su uso con sistemas de cromatografía de afinidad por metal inmovilizado (IMAC) (por ejemplo columnas de afinidad de Ni+2)), fusiones de GST, fusiones de MBP, etiqueta de Strep, la 35 secuencia diana de biotinilación de BSP de la enzima bacteriana BirA, y etiquetas de epítopo que se seleccionan como diana por anticuerpos (por ejemplo etiquetas de c-myc, etiquetas FLAG y similares). Tal como apreciarán los expertos en la técnica, tales etiquetas pueden ser útiles para la purificación, para la selección, o ambas. Por ejemplo, un anticuerpo puede purificarse usando una etiqueta de His inmovilizándolo a una columna de afinidad de Ni+2, y después tras la purificación puede usarse la misma etiqueta de His para inmovilizar el anticuerpo a una placa recubierta con Ni+2 para realizar un ELISA u otro ensayo de unión (tal como se describe a continuación). Una pareja de fusión puede permitir el uso de un método de selección para seleccionar anticuerpos (véase a continuación). En la técnica se conocen bien parejas de fusión que permiten una variedad de métodos de selección y todas ellas pueden usarse en la presente invención. Por ejemplo, fusionando los miembros de una biblioteca de anticuerpos a la proteína del gen III, puede emplearse presentación en fagos (Kay et al., Phage display of peptides and proteins: a

45 laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317). Las parejas de fusión pueden permitir marcar anticuerpos. Alternativamente, una pareja de fusión puede unirse a una secuencia específica en el vector de expresión, permitiendo unir de manera covalente o no covalente la pareja de fusión y el anticuerpo asociado con el ácido nucleico que codifica para ellos.

Los métodos de introducción de ácido nucleico exógeno en células huésped se conocen bien en la técnica y variarán con la célula huésped usada. Las técnicas incluyen, pero no se limitan a, transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, tratamiento con cloruro de calcio, transfección mediada por Polybrene, fusión de protoplastos, electroporación, infección viral o de fagos, encapsulación del/de los polinucleótido(s) en liposomas y microinyección directa del ADN en núcleos. En el caso de células de mamífero, la transfección puede ser o bien

55 transitoria o bien estable.

Preferiblemente, los anticuerpos se purifican y aíslan tras la expresión. Pueden aislarse proteínas o purificare de una variedad de maneras conocidas por los expertos en la técnica. Los métodos de purificación convencionales incluyen técnicas cromatográficas, incluyendo intercambio iónico, interacción hidrófoba, afinidad, filtración en gel o por tamaños y fase inversa, llevadas a cabo a presión atmosférica o a alta presión usando sistemas tales como FPLC y HPLC. Los métodos de purificación también incluyen técnicas electroforética, inmunológica, de precipitación, de diálisis y de cromatoenfoque. También son útiles técnicas de ultrafiltración y diafiltración, junto con concentración de proteínas. Tal como se conoce bien en la técnica, una variedad de proteínas naturales se unen a Fc y anticuerpos, y estas proteínas pueden usarse para la purificación de anticuerpos tal como se da a conocer en el presente 65 documento. Por ejemplo, las proteínas bacterianas A y G se unen a la región Fc. Asimismo, la proteína bacteriana L se une a la región Fab de algunos anticuerpos, tal como también lo hace evidentemente el antígeno diana del

anticuerpo. Con frecuencia puede permitirse la purificación mediante una pareja de fusión particular. Por ejemplo, pueden purificarse anticuerpos usando resina de glutatión si se emplea una fusión de GST, cromatografía de afinidad con Ni+2 si se emplea una etiqueta de His, o anticuerpo inmovilizado anti-FLAG si se usa una etiqueta de FLAG. Para directrices generales sobre técnicas de purificación adecuadas, véase, por ejemplo, incorporado en su

5 totalidad como referencia, Protein Purification: Principles and Practice, 3ª Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994. El grado de purificación necesario variará dependiendo de la selección o el uso de los anticuerpos. En algunos casos no se necesita ninguna purificación. Por ejemplo en una realización, si los anticuerpos se secretan, la selección puede tener lugar directamente de los medios. Tal como se conoce bien en la técnica, algunos métodos de selección no implican la purificación de proteínas. Por tanto, por ejemplo, si se convierte una biblioteca de anticuerpos en una biblioteca de presentación en fagos, puede no realizarse la purificación de proteínas.

Experimentación in vitro

Pueden seleccionarse anticuerpos usando una variedad de métodos, incluyendo, pero sin limitarse a, los que usan

15 ensayos in vitro, ensayos in vivo y basados en células, y tecnologías de selección. Pueden usarse tecnologías de selección de alto rendimiento y de automatización en los procedimientos de selección. La selección puede emplear el uso de un marcador o pareja de fusión. El uso de parejas de fusión se comentó anteriormente. Mediante “marcado” en el presente documento se quiere decir que los anticuerpos de la invención tienen uno o más elementos, isótopos o compuestos químicos unidos para permitir la detección en una selección. En general, los marcadores se dividen en tres clases: a) marcadores inmunitarios, que pueden ser un epítopo incorporado como pareja de fusión que se reconoce por un anticuerpo, b) marcadores isotópicos, que pueden ser radiactivos o isótopos pesados, y c) marcadores de molécula pequeña, que pueden incluir colorantes fluorescentes y colorimétricos, o moléculas tales como biotina que permiten otros métodos de marcaje. Pueden incorporarse marcadores en el compuesto en cualquier posición y pueden incorporarse in vitro o in vivo durante la expresión de

25 proteínas.

Preferiblemente, las propiedades funcionales y/o biofísicas de los anticuerpos se seleccionan en un ensayo in vitro. Los ensayos in vitro pueden permitir una amplia gama dinámica para seleccionar propiedades de interés. Las propiedades de los anticuerpos que pueden seleccionarse incluyen, pero no se limitan a, estabilidad, solubilidad y afinidad para ligandos de Fc, por ejemplo Fc!R. Pueden seleccionarse múltiples propiedades simultáneamente o de manera individual. Las proteínas pueden estar purificadas o no purificadas, dependiendo de los requisitos del ensayo. En una realización, la selección es un ensayo de unión cualitativo o cuantitativo para determinar la unión de anticuerpos a una proteína o a una molécula distinta de proteína que se sabe o se piensa que se une al anticuerpo. En una realización la selección es un ensayo de unión para medir la unión al antígeno diana. En una realización 35 alternativamente preferida, la selección es un ensayo para determinar la unión de anticuerpos a un ligando de Fc, incluyendo pero sin limitarse a la familia de Fc!R, el receptor neonatal FcRn, la proteína de complemento C1q y las proteínas bacterianas A y G. Dichos ligandos de Fc pueden ser de cualquier organismo, prefiriéndose seres humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Pueden llevarse a cabo ensayos de unión usando una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo pero sin limitarse a ensayos basados en FRET (transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) y BRET (transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia), AlphaScreen™ (ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificada), ensayo de proximidad por centelleo, ELISA (ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas), SPR (resonancia de plasmón superficial, también conocida como Biacore™), calorimetría de valoración isotérmica, calorimetría diferencial de barrido, electroforesis en gel y cromatografía incluyendo filtración en gel. Estos y otros métodos pueden aprovechar alguna pareja de fusión o

45 marcador del anticuerpo. Los ensayos pueden emplear una variedad de métodos de detección incluyendo, pero sin limitarse a, marcadores cromogénicos, fluorescentes, luminiscentes o isotópicos.

Las propiedades biofísicas de los anticuerpos, por ejemplo estabilidad y solubilidad, pueden seleccionarse pueden seleccionarse usando una variedad de métodos conocidos en la técnica. Puede determinarse la estabilidad de las proteínas midiendo el equilibrio termodinámico entre los estados plegado y desplegado. Por ejemplo, pueden desplegarse anticuerpos de la presente invención usando desnaturalizante químico, calor o pH, y puede monitorizarse esta transición usando métodos incluyendo, pero sin limitarse a, espectroscopía de dicroísmo circular, espectroscopía de fluorescencia, espectroscopía de absorbancia, espectroscopía de RMN, calorimetría y proteólisis. Tal como apreciarán los expertos en la técnica, los parámetros cinéticos de las transiciones de plegamiento y 55 desplegamiento también pueden monitorizarse usando estas y otras técnicas. La solubilidad y la integridad estructural global de un anticuerpo pueden determinare cuantitativa o cualitativamente usando una amplia gama de métodos que se conocen en la técnica. Los métodos que pueden usarse en la presente invención para caracterizar las propiedades biofísicas de anticuerpos incluyen electroforesis en gel, isoelectroenfoque, electroforesis capilar, cromatografía tal como cromatografía de exclusión molecular, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa, mapeo de péptidos, mapeo de oligosacáridos, espectrometría de masas, espectroscopía de absorbancia ultravioleta, espectroscopía de fluorescencia, espectroscopía de dicroísmo circular, calorimetría de valoración isotérmica, calorimetría diferencial de barrido, ultracentrifugación analítica, dispersión de luz dinámica, proteólisis y reticulación, medición de la turbidez, ensayos de retardo de filtro, ensayos inmunológicos, ensayos de unión a tinte fluorescente, ensayos de tinción de proteínas, microscopía y detección de 65 agregados mediante ELISA u otro ensayo de unión. También puede usarse análisis estructural empleando técnicas cristalográficas de rayos X y espectroscopía de RMN. La estabilidad y/o solubilidad pueden medirse determinando la

cantidad de disolución de proteína tras algún periodo de tiempo definido. En este ensayo, la proteína puede estar expuesta o no a alguna condición extrema, por ejemplo temperatura elevada, pH bajo o presencia de desnaturalizante. Dado que la función requiere normalmente una proteína estable, soluble y/o bien plegada/estructurada, los ensayos de unión y funcionales mencionados anteriormente también proporcionan

5 maneras para realizar una medición de este tipo. Por ejemplo, puede someterse a ensayo una disolución que comprende un anticuerpo para determinar su capacidad para unirse a un antígeno diana, después exponerse a temperatura elevada durante uno o más periodos de tiempo definidos, después someterse de nuevo a ensayo para determinar la unión a antígeno. Dado que no se espera que la proteína desplegada y agregada pueda unirse a antígeno, la cantidad de actividad que queda proporciona una medida de la estabilidad y solubilidad del anticuerpo.

Preferiblemente, se examina la biblioteca usando uno o más ensayos basados en células o in vitro. Para tales ensayos, normalmente se añaden anticuerpos, purificados o no purificados, de manera exógena de tal manera que se exponen células a variantes individuales o grupos de variantes que pertenecen a la biblioteca. Estos ensayos se basan normalmente, pero no siempre, en la biología de la capacidad del anticuerpo para unirse a antígeno y mediar 15 en algún acontecimiento bioquímico, por ejemplo funciones efectoras tales como lisis celular, fagocitosis, inhibición de unión ligando/receptor, inhibición de crecimiento y/o proliferación, apoptosis y similares. Tales ensayos con frecuencia implican monitorizar la respuesta de células a anticuerpo, por ejemplo supervivencia celular, muerte celular, fagocitosis celular, lisis celular, cambio en la morfología celular o activación transcripcional tal como expresión celular de un gen natural o gen indicador. Por ejemplo, tales ensayos pueden medir la capacidad de anticuerpos para provocar ADCC, ADCP o CDC. Para algunos ensayos puede necesitarse añadir componentes o células adicionales, es decir además de las células diana, por ejemplo complemento de suero o células efectoras tales como células mononucleares de sangre periférica (CMSP), células NK, macrófagos y similares. Tales células adicionales pueden proceder de cualquier organismo, preferiblemente seres humanos, ratones, rata, conejo y mono. Los anticuerpos reticulados o monoméricos pueden provocar apoptosis de determinadas líneas celulares que 25 expresan el antígeno diana del anticuerpo, o pueden mediar el ataque sobre células diana mediante células inmunitarias que se han añadido al ensayo. En la técnica se conocen métodos para monitorizar la viabilidad o la muerte celular, e incluyen el uso de tintes, fluoróforos, reactivos inmunoquímicos, citoquímicos y radiactivos. Por ejemplo, ensayos de caspasa o conjugados de anexina-flúor pueden permitir medir la apoptosis, y la captación o liberación de sustratos radiactivos (por ejemplo ensayos de liberación de cromo 51) o la reducción metabólica de tintes fluorescentes tales como azul Alamar, pueden permitir monitorizar el crecimiento, la proliferación o la activación celular. En una realización preferida, se usa el ensayo de citotoxicidad basado en EuTDA DELFIA® (Perkin Elmer, MA). Alternativamente, pueden monitorizarse células diana muertas o dañadas midiendo la liberación de una o más proteínas intracelulares naturales, por ejemplo lactato deshidrogenasa. La activación transcripcional también puede servir como método para someter a ensayo la función en ensayos basados en células. En este caso,

35 puede monitorizarse la respuesta sometiendo a ensayo para detectar genes o proteínas naturales que pueden estar regulados por incremento o regulados por disminución, por ejemplo puede medirse la liberación de determinadas interleucinas, o alternativamente puede realizare la lectura mediante un constructo de indicador-GFP o luciferasa. Los ensayos basados en células también pueden implicar la medición de cambios morfológicos de células como respuesta a la presencia de un anticuerpo. Los tipos de células para tales ensayos pueden ser procariotas o eucariotas, y puede emplearse una variedad de líneas celulares que se conocen en la técnica. Alternativamente, se realizan selecciones basadas en células usando células que se han transformado o transfectado con ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos.

Los ensayos in vitro incluyen, pero no se limitan a, ensayos de unión, ADCC, CDC, fagocitosis, citotoxicidad,

45 proliferación, apoptosis, necrosis, parada del ciclo celular, liberación de peróxido/ozono, quimiotaxia de células efectoras, inhibición de tales ensayos mediante anticuerpos con función efectora reducida; intervalos de actividades tales como una mejora de gt;100x o una reducción de gt;100x, combinaciones de activación de receptor y los desenlaces de ensayo que se esperan de tales perfiles de receptor.

Experimentación in vivo

Las propiedades biológicas de los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizarse en experimentos celulares, tisulares y de organismo completo. Tal como se conoce en la técnica, con frecuencia se someten a prueba fármacos en animales, incluyendo, pero sin limitarse a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y monos, con 55 el fin de medir la eficacia de un fármaco para el tratamiento contra una enfermedad o modelo de enfermedad, o para medir la farmacocinética, toxicidad y otras propiedades de un fármaco. Dichos animales pueden denominarse modelos de enfermedad. Con respecto a los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento, surge un desafío particular cuando se usan modelos animales para evaluar el potencial para la eficacia en seres humanos de polipéptidos candidatos, esto se debe, al menos en parte, al hecho de que los anticuerpos que tienen un efecto específico sobre la afinidad para un receptor de Fc humano pueden no tener un efecto de afinidad similar con el receptor de animal ortólogo. Estos problemas pueden agravarse adicionalmente mediante las inevitables ambigüedades asociadas con la correcta asignación de ortólogos auténticos (Mechetina et al., Immunogenetics, 2002 54:463-468), y el hecho de que algunos ortólogos simplemente no existen en el animal (por ejemplo los seres humanos presentan un Fc!RIIa mientras que los ratones no). Con frecuencia se someten a prueba las propiedades 65 terapéuticas en ratones, incluyendo, pero sin limitarse a, ratones desnudos, ratones SCID, ratones con xenoinjerto y ratones transgénicos (incluyendo no deficientes y deficientes). Por ejemplo, puede someterse a prueba un anticuerpo de la presente invención que está previsto como agente terapéutico anticancerígeno en un modelo de cáncer de ratón, por ejemplo un ratón con xenoinjerto. En este método, se injerta un tumor o una línea de células tumorales en, o se inyecta en, un ratón, y posteriormente se trata el ratón con el agente terapéutico para determinar la capacidad del anticuerpo para reducir o inhibir el crecimiento del cáncer y la metástasis. Un enfoque alternativo es 5 el uso de un modelo murino SCID en el que se inyecta a ratones inmunodeficientes linfocitos de sangre periférica (PBL) humanos, confiriendo un sistema inmunitario humano y semifuncional (con una serie apropiada de FcR humanos) a los ratones a los que posteriormente se les han inyectado anticuerpos o polipéptidos de Fc que seleccionan como diana células tumorales humanas inyectadas. En tal modelo, los polipéptidos de Fc que seleccionan como diana el antígeno deseado (tal como her2/neu en células de cáncer de ovario SkOV3) interaccionan con PBL humanos dentro de los ratones para realizar funciones efectoras tumoricidas. Tal experimentación puede proporcionar datos significativos para la determinación del potencial de dicho anticuerpo para usarse como agente terapéutico. Para las pruebas puede usarse cualquier organismo, preferiblemente mamíferos. Por ejemplo, debido a su similitud genética con los seres humanos, los monos pueden ser modelos terapéuticos adecuados, y por tanto pueden usarse para someter a prueba la eficacia, toxicidad, farmacocinética u

15 otra propiedad de los anticuerpos de la presente invención. En última instancia se requieren pruebas de los anticuerpos de la presente invención en seres humanos para su aprobación como fármacos, y por tanto evidentemente se contemplan estos experimentos. Por tanto los anticuerpos de la presente invención pueden someterse a prueba en seres humanos para determinar su eficacia terapéutica, toxicidad, farmacocinética y/u otras propiedades clínicas.

Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden conferir un rendimiento superior a agentes terapéuticos que contienen Fc en modelos animales o en seres humanos. Los perfiles de unión a receptor de tales anticuerpos, tal como se describe en esta memoria descriptiva, pueden seleccionare, por ejemplo, para aumentar la potencia de fármacos citotóxicos o para seleccionar como diana funciones efectoras o células efectoras 25 específicas para mejorar la selectividad de la acción del fármaco. Además, pueden seleccionare perfiles de unión a receptor que pueden reducir algunas o la totalidad de las funciones efectoras reduciendo así los efectos secundarios

o la toxicidad de tal fármaco que contiene Fc. Por ejemplo, puede seleccionarse un anticuerpo con unión reducida a Fc!RIIIa, Fc!RI y Fc!RIIa para eliminar la mayor parte de la función efectora mediada por células, o puede seleccionarse un anticuerpo con unión reducida a C1q para limitar las funciones efectoras mediadas por complemento. En algunos contextos, se sabe que tales funciones efectoras tienen posibles efectos tóxicos, por tanto eliminarlas puede aumentar la seguridad del fármaco que porta Fc y tal seguridad mejorada puede caracterizarse en modelos animales. En algunos contextos, se sabe que tales funciones efectoras median en la actividad terapéutica deseable, por tanto potenciarlas puede aumentar la actividad o potencia del fármaco que porta Fc y tal actividad o potencia mejorada puede caracterizarse en modelos animales.

35 Pueden someterse a prueba anticuerpos optimizados en una variedad de modelos tumorales ortotópicos. Estos modelos animales clínicamente relevantes son importantes en el estudio de la fisiopatología y la terapia de cánceres agresivos tales como cáncer de páncreas, de próstata y de mama. Con frecuencia se usan ratones carentes de sistema inmunitario incluyendo, pero sin limitarse a, ratones SCID o desnudos atímicos, en la puntuación de la diseminación tumoral local y sistémica desde el sitio de inyección al interior del órgano (por ejemplo páncreas, próstata o glándula mamaria) de células tumorales humanas o fragmentos de pacientes donantes.

Pueden someterse a ensayo anticuerpos de la presente invención para determinar la eficacia en modelos animales clínicamente relevantes de diversas enfermedades humanas. En muchos casos, los modelos relevantes incluyen

45 diversos animales transgénicos para antígenos tumorales específicos.

Pueden usarse modelos transgénicos relevantes tales como los que expresan receptores de Fc humanos (por ejemplo, CD16 incluyendo la cadena gamma, Fc!R1, RIIa/b y otros) para evaluar y someter a prueba anticuerpos y fusiones de Fc en cuanto a su eficacia. La evaluación de anticuerpos mediante la introducción de genes humanos que median directa o indirectamente la función efectora en ratones u otros roedores puede permitir estudios fisiológicos de eficacia en cuanto a la toxicidad tumoral u otras enfermedades tales como trastornos autoinmunitarios y AR. Los receptores de Fc humanos tales como Fc!RIIIa pueden presentar polimorfismos tales como el de la posición 158 V o F que permitirán adicionalmente la introducción de polimorfismos humanos específicos y combinaciones de polimorfismos humanos en roedores. Sin embargo, los diversos estudios que implican FcR

55 específicos de polimorfismo no se limitan a esta sección, y engloban todas las evaluaciones y aplicaciones de FcR en general tal como se especifica a lo largo de la totalidad de esta solicitud, los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden conferir una actividad superior a fármacos que contienen Fc en tales modelos transgénicos, en particular las variantes con perfiles de unión optimizados para actividad mediada por Fc!RIIIa humano pueden mostrar una actividad superior en ratones CD 16 transgénicos. Pueden observarse mejoras similares en la eficacia en ratones transgénicos para los demás receptores de Fc humanos, por ejemplo Fc!RIIa, Fc!RI, etc., para anticuerpos con perfiles de unión optimizados para los receptores respectivos. Los ratones transgénicos para múltiples receptores humanos mostrarían actividad mejorada para anticuerpos con perfiles de unión optimizados para los múltiples receptores correspondientes, por ejemplo tal como se expone en la figura 5.

65 Debido a las dificultades y ambigüedades asociadas con usar modelos animales para caracterizar la posible eficacia

de anticuerpos terapéuticos candidatos en un paciente humano, algunos polipéptidos variantes dados a conocer en el presente documento pueden encontrar utilidad como representantes para evaluar la posible eficacia en seres humanos. Tales moléculas representantes imitarán preferiblemente (en el sistema animal) la biología de FcR y/o complemento de un anticuerpo humano candidato correspondiente. Este mimetismo debe manifestarse lo más 5 probablemente mediante afinidades de asociación relativas entre anticuerpos específicos y receptores de animal frente a humanos. Por ejemplo, si se usa un modelo de ratón para evaluar la posible eficacia en seres humanos de un anticuerpo que tiene afinidad potenciada por Fc!RIIIa humano, una variante representante apropiada tendrá afinidad potenciada por Fc!RIII-2 de ratón (CD16-2 de ratón). Alternativamente, si se usa un modelo de ratón para evaluar la posible eficacia en seres humanos de un anticuerpo que tiene afinidad reducida por el Fc!RIIb humano

10 inhibidor, una variante representante apropiada tendrá afinidad reducida por Fc!RII de ratón. También debe observarse que los anticuerpos representantes pueden crearse en el contexto de un anticuerpo humano, un anticuerpo de animal, o ambos.

Las pruebas de anticuerpos pueden incluir el estudio de la eficacia en primates (por ejemplo modelo de mono

15 cynomulgus) para facilitar la evaluación de la depleción de células diana específicas que alojan el antígeno diana. Los modelos de primate adicionales incluyen el, pero no se limitan al, del mono rhesus y polipéptidos de Fc en estudios terapéuticos de enfermedad autoinmunitaria, trasplante y cáncer.

Se realizan estudios de toxicidad para determinar los efectos relacionados con el anticuerpo o la fusión de Fc que no

20 pueden evaluarse en un perfil de farmacología convencional o que sólo se producen tras una administración repetida del agente. La mayoría de las pruebas de toxicidad se realizan en dos especies (una de roedor y una no de roedor) para garantizar que no se pasa por alto ningún efecto adverso inesperado antes de introducir nuevas entidades terapéuticas en el ser humano. En general, estos modelos pueden medir una variedad de toxicidades incluyendo genotoxicidad, toxicidad crónica, inmunogenicidad, toxicidad reproductiva/del desarrollo y carcinogenicidad. Dentro

25 de los parámetros anteriormente mencionados se incluye la medición convencional del consumo de alimentos, peso corporal, formación de anticuerpos, química clínica y exploración macro y microscópica de órganos/tejidos convencionales (por ejemplo cardiotoxicidad). Parámetros de medición adicionales son traumatismo en el sitio de la inyección y la medición de anticuerpos neutralizantes, si los hay. Tradicionalmente, se evalúan agentes terapéuticos de anticuerpos monoclonales, desnudos o conjugados, para determinar la reactividad cruzada con tejidos normales,

30 inmunogenicidad/producción de anticuerpos, toxicidad de conjugado o ligador y toxicidad “inespecífica” de especies radiomarcadas. No obstante, tales estudios pueden tener que individualizarse para tratar preocupaciones específicas y siguiendo las directrices expuestas por la ICH S6 (estudios de seguridad para productos biotecnológicos también indicado anteriormente). Como tal, los principios generales son que los productos están lo suficientemente bien caracterizados y para los se han eliminado impurezas/contaminantes, de modo que el material

35 de prueba es comparable a lo largo de todo el desarrollo y en cumplimiento con las BPL.

La farmacocinética (PK) de los anticuerpos de la invención puede estudiarse en una variedad de sistemas animales, siendo los más relevantes primates no humanos tales como los monos cynomolgus, rhesus. Pueden evaluarse administraciones i.v./s.c. individuales o repetidas a lo largo de un intervalo de dosificación de 6000 veces (0,0540 300 mg/kg) para determinar la semivida (de días a semanas) usando la concentración en plasma y el aclaramiento así como el volumen de distribución en un estado estacionario y puede medirse el nivel de absorbancia sistémica. Los ejemplos de tales parámetros de medición generalmente incluyen concentración en plasma observada máxima (Cmax), el tiempo hasta alcanzar Cmax (Tmax), el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo desde el tiempo 0 hasta el infinito [AUC(0-inf)] y la semivida de eliminación aparente (T1/2). Los parámetros medidos 45 adicionales pueden incluir análisis compartimental de datos de concentración-tiempo obtenidos tras la administración

i.v. y biodisponibilidad. Se han establecido ejemplos de estudios farmacológicos/toxicológicos usando monos cynomolgus para Rituxan y Zevalin en los que los anticuerpos monoclonales frente a CD20 presentan reactividad cruzada. También pueden realizarse estudios de biodistribución, dosimetría (para anticuerpos radiomarcados) y PK en modelos de roedor. Tales estudios evaluarán la tolerancia a todas las dosis administradas, toxicidad frente a

50 tejidos locales, ubicación preferible frente a modelos animales de xenoinjerto en roedor, agotamiento de células diana (por ejemplo células positivas para CD20).

Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden conferir farmacocinética superior a agentes terapéuticos que contienen Fc en sistemas animales o en seres humanos. Por ejemplo, una unión

55 aumentada a FcRn puede aumentar la semivida y la exposición del fármaco que contiene Fc. Alternativamente, una unión reducida a FcRn puede reducir la semivida y la exposición del fármaco que contiene Fc en casos en los que una exposición reducida es favorable tal como cuando tal fármaco tiene efectos secundarios.

Se conoce en la técnica que la serie de receptores de Fc se expresa de manera diferencial en diversos tipos de

60 células inmunitarias, así como en diferentes tejidos. La distribución tisular diferencial de los receptores de Fc puede en última instancia tener un efecto sobre las propiedades farmacodinámicas (PD) y farmacocinéticas (PK) de anticuerpos de la presente invención. Dado que los anticuerpos de la presentación tienen afinidades variables para la serie de receptores de Fc, una selección adicional de los polipéptidos para determinar propiedades PD y/o PK puede ser extremadamente útil para definir el equilibrio óptimo de PD, PK y eficacia terapéutica conferido por cada

65 polipéptido candidato.

Los estudios farmacodinámicos pueden incluir, pero no se limitan a, seleccionar como diana células tumorales específicas o bloquear mecanismos de señalización, medir el agotamiento de señales o células que expresan el antígeno diana, etc. Los anticuerpos de la presente invención pueden seleccionar como diana poblaciones de células efectoras particulares y así dirigir a fármacos que contienen Fc para reclutar determinadas actividades para

5 mejorar la potencia o para aumentar la penetración en un compartimento fisiológico particularmente favorable. Por ejemplo, pueden seleccionarse como diana la localización y la actividad de neutrófilos mediante un anticuerpo que selecciona como diana preferiblemente Fc!RIIIb. Tales efectos farmacodinámicos pueden demostrarse en modelos animales o en seres humanos.

Uso clínico

Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para diversos fines terapéuticos. Tal como apreciarán los expertos en la técnica, los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para cualquier fin terapéutico que usa anticuerpos y similares. Los anticuerpos pueden administrarse a un paciente para tratar trastornos incluyendo,

15 pero sin limitarse a, cáncer, enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias y enfermedades infecciosas.

Un “paciente” tal como se describe en el presente documento incluye tanto seres humanos como otros animales, preferiblemente mamíferos y lo más preferiblemente seres humanos. Por tanto, los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento tienen aplicaciones tanto veterinarias como de terapia en seres humanos. El término “tratamiento”, o “tratar” en el contexto de la presente invención pretende incluir tratamiento terapéutico, así como medidas profilácticas, o supresoras, para una enfermedad o trastorno. Por tanto, por ejemplo, la administración satisfactoria de un anticuerpo antes de la aparición de la enfermedad da como resultado el tratamiento de la enfermedad. Como otro ejemplo, la administración satisfactoria de un anticuerpo optimizado tras la manifestación clínica de la enfermedad para combatir los síntomas de la enfermedad comprende el tratamiento de la

25 enfermedad. “Tratamiento” y “tratar” también engloban la administración de un anticuerpo optimizado tras la aparición de la enfermedad con el fin de erradicar la enfermedad. La administración satisfactoria de un agente tras la aparición y tras haberse desarrollado síntomas clínicos, con posible reducción de los síntomas clínicos y quizás mejora de la enfermedad, comprende tratamiento de la enfermedad. Los “que necesitan tratamiento” incluyen mamíferos que ya tienen la enfermedad o el trastorno, así como aquellos propensos a tener la enfermedad o el trastorno, incluyendo aquellos en los que tiene que prevenirse la enfermedad o el trastorno.

Un anticuerpo tal como se da a conocer en el presente documento puede administrarse a un paciente que tiene una enfermedad que implica una expresión inapropiada de una proteína u otra molécula. Dentro del alcance de la presente descripción, esto pretende incluir enfermedades y trastornos caracterizados por proteínas aberrantes, 35 debido por ejemplo a alteraciones en la cantidad de una proteína presente, ubicación de la proteína, modificación tras la traducción, estado conformacional, la presencia de una proteína mutante o patógena, etc. De manera similar, la enfermedad o el trastorno puede caracterizarse por alteraciones de moléculas incluyendo, pero sin limitarse a, polisacáridos y gangliósidos. Una abundancia en exceso puede deberse a cualquier causa, incluyendo pero sin limitarse a sobreexpresión a nivel molecular, aparición prolongada o acumulada en el sitio de acción, o actividad aumentada de una proteína en relación con lo normal. Dentro de esta definición se incluyen enfermedades y trastornos caracterizados por una reducción de una proteína. Esta reducción puede deberse a cualquier causa, incluyendo, pero sin limitarse a, expresión reducida a nivel molecular, aparición acortada o reducida en el sitio de acción, formas mutantes de una proteína, o actividad reducida de una proteína en relación con lo normal. Una abundancia en exceso o reducción de este tipo de una proteína puede medirse en relación con la expresión,

45 aparición o actividad normal de una proteína, y dicha medición puede desempeñar un papel importante en el desarrollo y/o las pruebas clínicas de los anticuerpos de la presente invención.

Mediante “cáncer” y “canceroso” en el presente documento se hace referencia a o se describe el estado fisiológico en mamíferos que se caracteriza normalmente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluyendo liposarcoma), tumores neuroendocrinos, mesotelioma, schwannoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o tumores malignos linfoides.

Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen tumores malignos hematológicos, tales como linfomas no

55 Hodgkin (LNH). Los cánceres de LNH incluyen, pero no se limitan a, linfoma de Burkitt (LB), linfoma linfocítico pequeño/leucemia linfocítica crónica (LLP/LLC), linfoma de células del manto (LCM), linfoma folicular (LF), linfoma de células B grandes difusas (LCBGD), linfoma de zona marginal (LZM), leucemia de células pilosas (LCP) y leucemia linfoplasmacítica (LLP), linfoma de células B de zona marginal extranodal de tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT), linfoma de células B de zona marginal nodal, linfoma de células grandes mediastínico, linfoma de células grandes intravascular, linfoma por efusión primario, linfoma/leucemia linfoblástica de células B precursoras, linfoma de células T y NK precursoras (linfoma linfoblástico de células T precursoras, linfoma de células NK blástico), tumores de células T y NK maduras, incluyendo leucemia y linfoma de células T periféricas (LTP), leucemia de células T adultas/linfomas de células T y leucemia linfocítica granular grande, leucemia linfocítica crónica de células T/leucemia pro-linfocítica, leucemia linfocítica granular grande de células T, leucemia de células NK agresiva,

65 linfoma de células T/NK extranodal, linfoma de células T de tipo enteropatía, linfoma de células T hepatoesplénico, linfoma de células grandes anaplásico (LCGA), linfoma de células T angioinmunoblástico y angiocéntrico, micosis

fungoide/síndrome de Sézary y linfoma de células T cutáneo (LCTC). Otros cánceres que pueden tratarse mediante los anticuerpos dados a conocer en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, linfoma de Hodgkin, tumores de células precursoras de linfocitos, incluyendo linfoma/leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) y linfoma/leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T), timoma, histocitosis de células de Langerhans, mieloma 5 múltiple, neoplasias mieloides tales como leucemias mielógenas agudas (LMA), incluyendo LMA con maduración, LMA sin diferenciación, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda y leucemias monocíticas agudas, síndromes mielodisplásicos y trastornos mieloproliferativos crónicos (MDS), incluyendo leucemia mielógena crónica (LMC). Otros cánceres que pueden tratarse mediante los anticuerpos dados a conocer en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, tumores del sistema nervioso central tales como glioma, glioblastoma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, ependimoma y retinoblastoma; tumores sólidos de cabeza y cuello (por ejemplo, cáncer nasofaríngeo, carcinoma de glándula salivar y cáncer de esófago), de pulmón (por ejemplo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón), del sistema digestivo (por ejemplo cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastrointestinal, cáncer del conducto biliar o del tracto biliar, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal

15 y carcinoma anal), del sistema reproductor (por ejemplo cáncer de testículos, de pene o de próstata, cáncer uterino, vaginal, vulvar, del cuello uterino, de ovarios y endometrial), de piel (por ejemplo melanoma, carcinoma de célula basales, cáncer de células escamosas, queratosis actínica), de hígado (por ejemplo cáncer de hígado, carcinoma hepático, cáncer hepatocelular y hepatoma), de hueso (por ejemplo osteoclastoma y cánceres óseos osteolíticos), de tejidos y órganos adicionales (por ejemplo cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer de riñón o renal, cáncer de tiroides, cáncer de mama, cáncer del peritoneo y sarcoma de Kaposi) y tumores del sistema vascular (por ejemplo angiosarcoma y hemangiopericitoma).

Las indicaciones oncológicas preferidas que pueden tratarse mediante anticuerpos anti-CD19 de la invención incluyen, pero no se limitan a, todos los linfomas no Hodgkin (LNH), especialmente LNH que no responde al

25 tratamiento/resistente, leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma/leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B), y linfoma de células del manto (LCM).

La autoinmunidad resulta de un fallo de la autotolerancia que implica mecanismos inmunitarios humorales y/o mediados por células. Entre las consecuencias del fallo en la tolerancia central y/o periférica están la supervivencia y la activación de células B y células T autorreactivas. Varias enfermedades autoinmunitarias se definen por una activación excesiva de linfocitos B y/o T. La activación de estas células requiere en colaboración, acoplamiento de antígeno y señales coestimulantes de linfocitos que interaccionan. La depleción, inhibición, anti-proliferación y/o bloqueo de células B mediado por anticuerpos son enfoques terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad autoinmunitaria.

35 Mediante “enfermedades autoinmunitarias” en el presente documento se incluyen rechazo de injerto de islotes alogénico, alopecia areata, espondilitis anquilosante, síndrome antifosfolípidos, enfermedad de Addison autoinmunitaria, autoanticuerpos citoplásmicos antineutrófilos (ANCA), enfermedades autoinmunitarias de la glándula suprarrenal, anemia hemolítica autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, miocarditis autoinmunitaria, neutropenia autoinmunitaria, ooforitis y orquitis autoinmunitarias, trombocitopenia autoinmunitaria, urticaria autoinmunitaria, enfermedad de Behcet, penfigoide bulloso, cardiomiopatía, síndrome de Castleman, enfermedad celiaca-dermatitis, síndrome de disfunción inmunitaria con fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial, síndrome de CREST, enfermedad de aglutinina fría, enfermedad de Crohn, dermatomiositis, lupus discoide, crioglobulinemia mixta esencial, deficiencia de factor VIII,

45 fibromialgia-fibromiositis, glomerulonefritis, enfermedad de Grave, Guillain-Barre, síndrome de Goodpasture, enfermedad de injerto contra huésped (EICH), tiroiditis de Hashimoto, hemofilia A, fibrosis pulmonar idiopática, púrpura trobocitopénica idiopática (PTI), neuropatía de IgA, polineuropatías de IgM, trombocitopenia mediada por el sistema inmunitario, artritis juvenil, enfermedad de Kawasaki, liquen plano, lupus eritematoso, enfermedad de Meniere, enfermedad de tejido conjuntivo mixta, esclerosis múltiple (EM), diabetes mellitus tipo 1, miastenia grave, penfigo vulgar, anemia perniciosa, poliartritis nodosa, policrondritis, síndromes poliglandulares, polimialgia reumática, polimiositis y dermatomiositis, agammaglobinulinemia primaria, cirrosis biliar primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fenómeno de Reynauld, síndrome de Reiter, artritis reumatoide (AR), sarcoidosis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, rechazo de trasplante de órgano sólido, síndrome de persona rígida, lupus eritematoso sistémico (LES), arteritis de Takayasu, arteritis temporal / arteritis de células gigantes, púrpura trombocitopénica

55 trombótica, colitis ulcerosa, uveítis, vasculitis tales como vasculitis herpetiforme por dermatitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener.

Las indicaciones autoinmunitarias referidas que pueden tratarse mediante anticuerpos anti-CD19 de la invención incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES o lupus), esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren y púrpura trobocitopénica idiopática (PTI).

Mediante “trastornos inflamatorios” en el presente documento se incluyen síndrome de dificultad respiratoria aguda (SDRA), artritis séptica aguda, artritis adyuvante, artritis idiopática juvenil, encefalomielitis alérgica, rinitis alérgica, vasculitis alérgica, alergia, asma, aterosclerosis, inflamación crónica debida a infecciones bacterianas o virales

65 crónicas, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), arteriopatía coronaria, encefalitis, enfermedad inflamatoria del intestino, osteolisis inflamatoria, inflamación asociada con reacciones de hipersensibilidad agudas y retrasadas, inflamación asociada con tumores, lesión de nervio periférico o enfermedades desmielinizantes, inflamación asociada con traumatismo tisular tal como quemaduras e isquemia, inflamación debida a meningitis, síndrome de lesión de múltiples órganos, fibrosis pulmonar, septicemia y choque séptico, síndrome de Stevens-Johnson, artropatía no diferenciada y espondiloartropatía no diferenciada.

5 Mediante “enfermedades infecciosas” en el presente documento se incluyen enfermedades provocadas por patógenos tales como virus, bacterias, hongos, protozoos y parásitos. Las enfermedades infecciosas pueden estar provocadas por virus incluyendo adenovirus, citomegalovirus, dengue, Epstein-Barr, hantavirus, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, herpes simple tipo I, herpes simple tipo II, virus de inmunodeficiencia humano (VIH), virus del papiloma humano (VPH), influenza, sarampión, paperas, papovavirus, polio, virus sincitial respiratorio, peste bovina, rinovirus, rotavirus, rubeola, virus SARS, viruela, meningitis viral y similares. Las enfermedades por infecciones también pueden estar provocadas por bacterias incluyendo Bacillus antracis, Borrelia burgdorferi, Campylobacter jejuni, Chlamydia trachomatis, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Diptheria, E. coli, Legionella, Helicobacter pylori, Mycobacterium rickettsia, Mycoplasma neisseria, Pertussis, Pseudomonas aeruginosa, S. pneumonia,

15 Streptococcus, Staphylococcus, Vibria cholerae, Yersinia pestis y similares. Las enfermedades infecciosas también pueden estar provocadas por hongos tales como Aspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candida albicans, Coccidioides immitis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Penicillium marneffei y similares. Las enfermedades infecciosas también pueden estar provocadas por protozoos y parásitos tales como clamidia, kokcidioza, leishmania, malaria, rickettsia, tripanosoma y similares.

Además, pueden usarse anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento para prevenir o tratar estados adicionales incluyendo, pero sin limitarse a, estados cardiacos tales como insuficiencia cardiaca congestiva (ICC), miocarditis y otros estados del miocardio; estados cutáneos tales como rosácea, acné y eczema; estados de huesos y dientes tales como pérdida ósea, osteoporosis, enfermedad de Paget, histiocitosis de células de

25 Langerhans, enfermedad periodontal, osteopenia por desuso, osteomalacia, displasia fibrosa monostótica, displasia fibrosa poliostótica, metástasis ósea, tratamiento de dolor óseo, hipercalciemia maligna humoral, reconstrucción periodontal, lesión de médula espinal y fracturas óseas; estados metabólicos tales como enfermedad de Gaucher; estados endocrinos tales como síndrome de Cushing; y estados neurológicos.

Varios de los receptores que pueden interaccionar con los anticuerpos de la presente invención son polimórficos en la población humana. Para un paciente o población de pacientes dado, la eficacia de los anticuerpos de la presente invención puede verse afectada por la presencia o ausencia de polimorfismos específicos en proteínas. Por ejemplo, Fc!RIIIA es polimórfico en la posición 158, que es comúnmente o bien V (alta afinidad) o bien F (baja afinidad). Se observa que pacientes con el genotipo homocigótico V/V tienen una mejor respuesta clínica al tratamiento con el 35 anticuerpo anti-CD20 Rituxan® (rituximab), probablemente porque estos pacientes montan una respuesta de NK más fuerte (Dall’Ozzo et al. (2004) Cancer Res. 64:4664-9). Los polimorfismos adicionales incluyen, pero no se limitan a, Fc!RIIA R131 o H131, y se sabe que tales polimorfismos o bien aumentan o bien disminuyen la unión de Fc y la posterior actividad biológica, dependiendo del polimorfismo, los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden unirse preferiblemente a una forma polimórfica particular de un receptor, por ejemplo Fc!RIIIA 158 V, o unirse con afinidad equivalente a todos los polimorfismos en una posición particular en el receptor, por ejemplo los polimorfismos tanto 158V como 158F de Fc!RIIIA. Preferiblemente, los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden tener unión equivalente a polimorfismos y pueden usarse en un anticuerpo para eliminar la eficacia diferencial observada en pacientes con diferentes polimorfismos. Tal propiedad puede dar lugar a una sistematicidad superior en la respuesta terapéutica y reducir las poblaciones de pacientes que

45 no responden. Tal Fc variante con unión idéntica a polimorfismos de receptor puede tener una actividad biológica aumentada, tal como ADCC, CDC o semivida en circulación, o alternativamente una actividad reducida, mediante modulación de la unión a los receptores de Fc relevantes. Los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden unirse con afinidad superior o inferior a uno de los polimorfismos de un receptor, o bien acentuando la diferencia existente en la unión o bien invirtiendo la diferencia. Tal propiedad puede permitir la creación de agentes terapéuticos particularmente adaptados para la eficacia con una población de pacientes que presentan tal polimorfismo. Por ejemplo, una población de pacientes que presentan un polimorfismo con una afinidad superior por un receptor inhibidor tal como Fc!RIIB puede recibir un fármaco que contiene un anticuerpo con unión reducida a tal forma polimórfica del receptor, creando un fármaco más eficaz.

55 Preferiblemente, se examinan pacientes para detectar uno o más polimorfismos con el fin de predecir la eficacia de los anticuerpos de la presente invención. Esta información puede usarse, por ejemplo, para seleccionar pacientes para incluirlos o excluirlos de ensayos clínicos o, tras la aprobación, para proporcionar directrices a médicos y pacientes respecto a opciones de tratamiento y dosificaciones apropiadas. Por ejemplo, en pacientes que son homocigóticos o heterocigóticos para Fc!RIIIA 158F, fármacos de anticuerpos tales como el AcM anti-CD20, Rituximab, son mínimamente eficaces (Carton 2002 Blood 99: 754-758; Weng 2003 J. Clin. Oncol. 21: 3940-3947); tales pacientes pueden mostrar una respuesta clínica mucho mejor frente a los anticuerpos de la presente invención. Pueden seleccionarse pacientes para su inclusión en ensayos clínicos para un anticuerpo de la presente invención si su genotipo indica que es probable que respondan significativamente mejor a un anticuerpo de la presente invención en comparación con uno o más agentes terapéuticos de anticuerpos usados actualmente. Las dosificaciones y los

65 regímenes de tratamiento apropiados pueden determinarse usando tal información de genotipo. Pueden seleccionarse pacientes para su inclusión en un ensayo clínico o para recibir la terapia tras la aprobación basándose en su genotipo de polimorfismos, conteniendo tal terapia un anticuerpo diseñado por ingeniería para que sea específicamente eficaz para tal población, o alternativamente conteniendo tal terapia un anticuerpo que no muestra actividad diferencial frente a las diferentes formas del polimorfismo.

5 En el presente documento se dan a conocer pruebas de diagnóstico para identificar a pacientes que es probable que muestren una respuesta clínica favorable a un anticuerpo de la presente invención, o que es probable que muestren una respuesta significativamente mejor cuando se tratan con un anticuerpo de la presente invención frente a uno o más agentes terapéuticos de anticuerpos usados actualmente. Puede usarse cualquiera de varios métodos para determinar polimorfismos de Fc!R en seres humanos conocidos en la técnica.

También se dan a conocer pruebas de pronóstico con muestras clínicas tales como muestras de sangre y de tejido. Tales pruebas pueden someter a ensayo la actividad de función efectora, incluyendo, pero sin limitarse a, ADCC, CDC, fagocitosis y opsonización, o para destruir, independientemente del mecanismo, células cancerosas o

15 patógenas de otro tipo. Preferiblemente, se usan ensayos de ADCC, tales como los descritos anteriormente, para predecir, para un paciente específico, la eficacia de un anticuerpo dado de la presente invención. Tal información puede usarse para identificar a pacientes para su inclusión o exclusión de ensayos clínicos, o para decisiones informadas referentes a dosificaciones y regímenes de tratamiento apropiados. Tal información también puede usarse para seleccionar un fármaco que contiene un anticuerpo particular que muestra actividad superior en tal ensayo.

Formulación

Se dan a conocer composiciones farmacéuticas en las que se formulan un anticuerpo de la presente invención y uno

25 o más agentes terapéuticamente activos. Se preparan formulaciones de los anticuerpos de la presente invención para su almacenamiento mezclando dicho anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed., 1980), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizantes adecuados no son tóxicos para receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, acetato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil-amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil-parabenos tales como metil o propil-parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas;

35 polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; edulcorantes y otros agentes aromatizantes; cargas tales como celulosa microcristalina, lactosa, maíz y otros almidones; agentes aglutinantes; aditivos; agentes colorantes; contraiones de formación de sales tales como sodio; complejos de metales (por ejemplo complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™

o polietilenglicol (PEG). La composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de la presente invención puede estar en una forma soluble en agua, tal como estar presente como sales farmacéuticamente aceptables, que se pretende que incluyan sales de adición tanto de ácido como de base. “Sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables” se refiere a las sales que conservan la eficacia biológica de las bases libres y que no son indeseables 45 desde el punto de vista biológico u otro, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicílico y similares. Las “sales de adición de base farmacéuticamente aceptables” incluyen las derivadas de bases inorgánicas tales como sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio y similares. Se prefieren particularmente las sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas incluyendo aminas sustituidas que se producen de manera natural, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico

55 básicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y etanolamina. Las formulaciones que van a usarse para su administración in vivo son preferiblemente estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles u otros métodos.

Los anticuerpos dados a conocer en el presente documento también pueden formularse como inmunoliposomas. Un liposoma es una vesícula pequeña que comprende diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivo que es útil para la administración de un agente terapéutico a un mamífero. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., 1985, Proc Natl Acad Sci USA, 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA, 77:4030; los documentos US 4.485.045; US

4.544.545 y PCT WO 97/38731. Se dan a conocer liposomas con tiempo de circulación potenciado en el documento

65 US 5.013.556. Los componentes del liposoma se disponen comúnmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípidos de membranas biológicas. Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Se extruyen liposomas a través de filtros de tamaño de poro definido para proporcionar liposomas con el diámetro deseado. Opcionalmente se contiene un agente quimioterápico u otro agente terapéuticamente activo dentro del liposoma (Gabizon et al., 1989, J National Cancer Inst 81:1484).

5 El anticuerpo y otros agentes terapéuticamente activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas mediante métodos incluyendo pero sin limitarse a técnicas de coacervación, polimerización interfacial (por ejemplo usando hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina, o microcápsulas de poli(metacrilato de metilo)), sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) y macroemulsiones. Tales técnicas se dan a conocer en Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed., 1980. Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímero hidrófobo sólido, matrices que están en forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo poli(metacrilato de 2

15 hidroxietilo) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (documento US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como Lupron Depot® (que son microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), poli-(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico) y ProLease® (comercialmente disponible de Alkermes), que es un sistema de administración basado en microesferas compuesto por la molécula bioactiva deseada incorporada en una matriz de poli-DL-lactida-co-glicolida (PLG).

Administración

La administración de la composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente invención,

25 preferiblemente en forma de una disolución acuosa estéril, puede realizarse de una variedad de maneras, incluyendo, pero sin limitarse a, por vía oral, subcutánea, intravenosa, intranasal, intraótica, transdérmica, tópica (por ejemplo, geles, ungüentos, lociones, cremas, etc.), intraperitoneal, intramuscular, intrapulmonar, vaginal, parenteral, rectal o intraocular. En algunos casos, por ejemplo para el tratamiento de heridas, inflamación, etc., el anticuerpo puede aplicarse directamente como una disolución o pulverización. Tal como se conoce en la técnica, la composición farmacéutica puede formularse por consiguiente dependiendo de la manera de introducción.

La administración subcutánea puede ser preferible en algunas circunstancias porque el paciente puede administrarse a sí mismo la composición farmacéutica. Muchos agentes terapéuticos proteicos no son lo suficientemente potentes para permitir la formulación de una dosis terapéuticamente eficaz en el volumen máximo

35 aceptable para la administración subcutánea. Este problema puede tratarse en parte mediante el uso de formulaciones de proteínas que comprenden arginina-HCl, histidina y polisorbato (véase el documento WO 04091658). Los anticuerpos de la presente invención pueden ser más propensos a administración subcutánea debido, por ejemplo, a una potencia aumentada, semivida sérica mejorada o solubilidad potenciada.

Tal como se conoce en la técnica, los agentes terapéuticos proteicos con frecuencia se administran mediante infusión i.v. o bolo. Los anticuerpos de la presente invención también pueden administrarse usando tales métodos. Por ejemplo, la administración puede ser mediante infusión intravenosa con cloruro de sodio al 0,9% como vehículo de infusión.

45 La administración pulmonar puede lograrse usando un inhalador o nebulizador o una formulación que comprende un agente de formación de aerosol. Por ejemplo, puede usarse tecnología inhalable AERx® comercialmente disponible de Aradigm, o sistema de administración pulmonar Inhance™ comercialmente disponible de Nektar Therapeutics. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser más propensos a administración intrapulmonar. Hay FcRn presente en el pulmón y puede fomentar el transporte desde el pulmón hacia el torrente sanguíneo (por ejemplo Syntonix, documento WO 04004798, Bitonti et al. (2004) Proc. Nat. Acad. Sci. 101:9763-8). Por consiguiente, los anticuerpos que se unen a FcRn más eficazmente en el pulmón o que se liberan más eficazmente en el torrente sanguíneo pueden tener una biodisponibilidad mejorada tras la administración intrapulmonar. Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser más propensos a administración intrapulmonar debido, por ejemplo, a solubilidad mejorada o punto isoeléctrico alterado.

55 Además, los anticuerpos de la presente invención pueden ser más propensos a la administración oral debido, por ejemplo, a estabilidad mejorada a pH gástrico y resistencia aumentada a la proteólisis. Además, FcRn parece expresarse en los epitelios intestinales de adultos (Dickinson et al. (1999) J. Clin. Invest. 104:903-11), de modo que anticuerpos de la presente invención con perfiles de interacción con FcRn mejorados pueden mostrar una biodisponibilidad potenciada tras la administración oral. También puede producirse transporte de anticuerpos mediado por FcRn en otras membranas mucosas tales como las de los tractos gastrointestinal, respiratorio y genital (Yoshida et al. (2004) Immunity 20:769-83).

Además, puede usarse cualquiera de varios sistemas de administración conocidos en la técnica para administrar los

65 anticuerpos de la presente invención. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, encapsulación en liposomas, micropartículas, microesferas (por ejemplo microesferas de PLA/PGA) y similares. Alternativamente, puede usarse un implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, incluyendo membranas o fibras. Los sistemas de liberación sostenida pueden comprender una matriz o material polimérico tal como poliésteres, hidrogeles, poli(alcohol vinílico), polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, etileno-acetato de vinilo, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico tales como Lupron Depot®, y poli(ácido D-(-)-3-hidroxibutírico). También

5 es posible administrar un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo de la presente invención, por ejemplo, mediante infección retroviral, inyección directa o recubrimiento con lípidos, receptores de superficie celular u otros agentes de transfección. En todos los casos, pueden usare sistemas de liberación controlada para liberar el anticuerpo en o cerca de la ubicación de acción deseada.

Dosificación

Las cantidades de dosificación y las frecuencias de administración se seleccionan preferiblemente para que sean terapéutica o profilácticamente eficaces. Tal como se conoce en la técnica, pueden ser necesarios ajustes para la degradación de proteínas, administración sistémica frente a localizada y tasa de síntesis de nuevas proteasas, así

15 como la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, momento de la administración, interacción farmacológica y gravedad del estado, y podrán determinarlos con experimentación rutinaria los expertos en la técnica.

La concentración del anticuerpo terapéuticamente activo en la formulación puede variar desde aproximadamente el 0,1 hasta el 100% en peso. Preferiblemente, la concentración del anticuerpo está en el intervalo de 0,003 a 1,0 molar. Con el fin de tratar a un paciente, puede administrarse una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la presente invención. Mediante “dosis terapéuticamente eficaz” en el presente documento se quiere decir una dosis que produce los efectos para los que se administra. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento y se determinará por un experto en la técnica usando técnicas conocidas. Las dosificaciones pueden oscilar entre 0,0001 y 100 mg/kg de peso corporal o más, por ejemplo 0,1, 1, 10 ó 50 mg/kg de peso corporal, prefiriéndose de 1 a 10

25 mg/kg.

En algunos casos, se usa sólo una dosis individual del anticuerpo. En otros casos, se administran múltiples dosis del anticuerpo. El tiempo transcurrido entre administraciones puede ser inferior a 1 hora, de aproximadamente 1 hora, de aproximadamente 1-2 horas, de aproximadamente 2-3 horas, de aproximadamente 3-4 horas, de aproximadamente 6 horas, de aproximadamente 12 horas, de aproximadamente 24 horas, de aproximadamente 48 horas, de aproximadamente 2-4 días, de aproximadamente 4-6 días, de aproximadamente 1 semana, de aproximadamente 2 semanas o de más de 2 semanas.

Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse en regímenes de dosificación metronómicos, o bien

35 mediante infusión continua o bien mediante administración frecuente sin periodos de reposo prolongados. Tal administración metronómica puede implicar la dosificación a intervalos constantes sin periodos de reposo. Normalmente tales regímenes engloban la infusión continua o de dosis baja crónica durante un periodo de tiempo prolongado, por ejemplo de 1-2 días, 1-2 semanas, 1-2 meses o hasta 6 meses o más. El uso de dosis bajas puede minimizar los efectos secundarios y la necesidad de periodos de reposo.

En determinados casos anticuerpo de la presente invención y uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos se administran de manera cíclica al paciente. La terapia cíclica implica la administración de un primer agente en un momento, un segundo agente en un segundo momento, opcionalmente agentes adicionales en momentos adicionales, opcionalmente un periodo de reposo, y después repetir esta secuencia de administración

45 una o más veces. El número de ciclos es normalmente de desde 2 -10. La terapia cíclica puede reducir el desarrollo de resistencia frente a uno o más agentes, puede minimizar los efectos secundarios, o puede mejorar la eficacia del tratamiento.

Terapias de combinación

Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse de manera concomitante con uno o más de otros agentes o regímenes terapéuticos. Los agentes o regímenes terapéuticos adicionales pueden usarse para mejorar la eficacia o seguridad del anticuerpo. Además, los agentes o regímenes terapéuticos adicionales pueden usarse para tratar la misma enfermedad o una comorbididad en vez de para alterar la acción del anticuerpo. Por ejemplo, un

55 anticuerpo de la presente invención puede administrarse al paciente junto con quimioterapia, radioterapia, o tanto quimioterapia como radioterapia. El anticuerpo de la presente invención puede administrarse en combinación con uno o más de otros agentes profilácticos o terapéuticos, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes citotóxicos, agentes quimioterápicos, citocinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes anti-hormonales, inhibidores de cinasas, agentes antiangiogénicos, cardioprotectores, agentes inmunoestimulantes, agentes inmunosupresores, agentes que fomentan la proliferación de células hematológicas, inhibidores de la angiogénesis, inhibidores de proteínas tirosina cinasa (PTK), anticuerpos adicionales, inhibidores de Fc!RIIb u otros receptores de Fc u otros agentes terapéuticos.

Los términos “en combinación con” y “administración conjunta” no se limitan a la administración de dichos agentes

65 profilácticos o terapéuticos exactamente al mismo tiempo. En vez de eso, se quiere decir que el anticuerpo de la presente invención y el otro agente o agentes se administran en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo de tal manera que pueden actuar juntos para proporcionar un beneficio que está aumentado frente al tratamiento sólo o bien con el anticuerpo de la presente invención o bien con el otro agente o agentes. Se prefiere que el anticuerpo y el otro agente o agentes actúen de manera aditiva y se prefiere especialmente que actúen de manera sinérgica. Tales moléculas están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el

5 propósito previsto. El experto médico puede determinar empíricamente, o considerando la farmacocinética y los modos de acción de los agentes, la dosis o las dosis apropiadas de cada agente terapéutico, así como los momentos apropiados y los métodos de administración.

Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse con una o más moléculas adicionales que comprenden anticuerpos o Fc. Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse conjuntamente con uno o más de otros anticuerpos que tienen eficacia en el tratamiento de la misma enfermedad o de una comorbididad adicional; por ejemplo pueden administrarse dos anticuerpos que reconocen dos antígenos que se sobreexpresan en un tipo de cáncer dado, o dos antígenos que median la patogénesis de una enfermedad autoinmunitaria o infecciosa.

15 Los ejemplos de anticuerpos anticancerígenos que pueden administrare conjuntamente incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-antígeno de superficie celular 17-1A tales como Panorex™ (edrecolomab); anticuerpos anti-41BB; anticuerpos anti-4Dc; anticuerpos anti-A33 tales como A33 y CDP-833; anticuerpos anti-integrina &4%1 tales como natalizumab; anticuerpos anti-integrina &4%7 tales como LDP-02; anticuerpos anti-integrina &V%1 tales como F-200, M-200 y SJ-749; anticuerpos anti-integrina &V%3 tales como abciximab, CNTO-95, Mab-17E6 y Vitaxin™; anticuerpos anti-factor de complemento 5 (C5) tales como 5G1.1; anticuerpos anti-CA125 tales como OvaRex® (oregovomab); anticuerpos anti-CD3 tales como Nuvion® (visilizumab) y Rexomab; anticuerpos anti-CD4 tales como IDEC-151, MDX-CD4, OKT4A; anticuerpos anti-CD6 tales como Oncolysin B y Oncolysin CD6; anticuerpos anti-CD7 tales como HB2; anticuerpos anti-CD19 tales como B43, MT-103 y Oncolysin B; anticuerpos anti-CD20 tales como

25 2H7, 2H7.v16, 2H7.v114, 2H7.v115, Bexxar® (tositumomab, anticuerpo anti-CD20 marcado con I-131), Rituxan® (rituximab) y Zevalin® (Ibritumomab tiuxetan, anticuerpo anti-CD20 marcado con Y-90); anticuerpos anti-CD22 tales como Lymphocide™ (epratuzumab, anticuerpo anti-CD22 marcado con Y-90); anticuerpos anti-CD23 tales como IDEC-152; anticuerpos anti-CD25 tales como basiliximab y Zenapax® (daclizumab); anticuerpos anti-CD30 tales como AC10, MDX-060 y SGN-30; anticuerpos anti-CD33 tales como Milotarg® (gemtuzumab ozogamicin), Oncolysin M y Smart M195; anticuerpos anti-CD38; anticuerpos anti-CD40 tales como SGN-40 y toralizumab; anticuerpos anti-CD40L tales como 5c8, Antova™ e IDEC-131; anticuerpos anti-CD44 tales como bivatuzumab; anticuerpos anti-CD46; anticuerpos anti-CD52 tales como Campath® (alemtuzumab); anticuerpos anti-CD55 tales como SC-1; anticuerpos anti-CD56 tales como huN901-DM1; anticuerpos anti-CD64 tales como MDX-33; anticuerpos anti-CD66e tales como XR-303; anticuerpos anti-CD74 tales como IMMU-110; anticuerpos anti-CD80 tales como galiximab e

35 IDEC-114; anticuerpos anti-CD89 tales como MDX-214; anticuerpos anti-CD123; anticuerpos anti-CD138 tales como B-B4-DM1; anticuerpos anti-CD146 tales como AA-98; anticuerpos anti-CD148; anticuerpos anti-CEA tales como cT84.66, labetuzumab y Pentacea™; anticuerpos anti-CTLA-4 tales como MDX-101; anticuerpos anti-CXCR4; anticuerpos anti-EGFR tales como ABXEGF, Erbitux® (cetuximab), IMC-C225 y Mab 425 de Merck; anticuerpos anti-EpCAM tales como anticuerpo anti-EpCAM de Crucell, ING-1 e IS-IL-2; anticuerpos anti-efrina B2/EphB4; anticuerpos anti-Her2 tales como Herceptin®, MDX-210; anticuerpos anti-FAP (proteína de activación de fibroblastos) tales como sibrotuzumab; anticuerpos anti-ferritina tales como NXT-211; anticuerpos anti-FGF-1; anticuerpos anti-FGF-3; anticuerpos anti-FGF-8; anticuerpos anti-FGFR, anticuerpos anti-fibrina; anticuerpos anti-G250 tales como WX-G250 y Rencarex®; anticuerpos anti-gangliósido GD2 tales como EMD-273063 y TriGem; anticuerpos anti-gangliósido GD3 tales como BEC2, KW-2871 y mitumomab; anticuerpos anti-gpIIb/IIIa tales como

45 ReoPro; anticuerpos anti-heparinasa; anticuerpos anti-Her2/ErbB2 tales como Herceptin® (trastuzumab), MDX-210 y pertuzumab; anticuerpos anti-HLA tales como Oncolym®, Smart 1D10; anticuerpos anti-HM1.24; anticuerpos anti-ICAM tales como ICM3; anticuerpos anti-receptor de IgA; anticuerpos anti-IGF-1 tales como CP-751871 y EM-164; anticuerpos anti-IGF-1R tales como IMC-A12; anticuerpos anti-IL-6 tales como CNTO-328 y elsilimomab; anticuerpos anti-IL-15 tales como HuMax™-IL15; anticuerpos anti-KDR; anticuerpos anti-laminina 5; anticuerpos anti-antígeno Y de Lewis tales como Hu3S193 e IGN-311; anticuerpos anti-MCAM; anticuerpos anti-Muc1 tales como BravaRex y TriAb; anticuerpos anti-NCAM tales como ERIC-1 e ICRT; anticuerpos anti-antígeno PEM tales como Theragyn y Therex; anticuerpos anti-PSA; anticuerpos anti-PSCA tales como IG8; anticuerpos anti-Ptk; anticuerpos anti-PTN; anticuerpos anti-RANKL tales como AMG-162; anticuerpos anti-RLIP76; anticuerpos anti-antígeno SK-1 tales como Monopharm C; anticuerpos anti-STEAP; anticuerpos anti-TAG72 tales como CC49-SCA y MDX-220; anticuerpos

55 anti-TGF-% tales como CAT-152; anticuerpos anti-TNF- tales como CDP571, CDP870, D2E7, Humira® (adalimumab) y Remicade® (infliximab); anticuerpos anti-TRAIL-R1 y TRAIL-R2; anticuerpos anti-VE-cadherina-2; y anticuerpos anti-VLA-4 tales como Antegren™. Además, pueden usarse anticuerpos anti-idiotipo incluyendo, pero sin limitarse a, el anticuerpo BEC2 frente al epítopo GD3 y el anticuerpo 105AD7 frente al epítopo gp72. Además, pueden usarse anticuerpos biespecíficos incluyendo pero sin limitarse a anticuerpo anti-GD3/CD20 Bi20.

Los ejemplos de anticuerpos que pueden administrarse conjuntamente para tratar enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, rechazo de trasplante, EICH y similares incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-integrina &4%7 tales como LDP-02, anticuerpos anti-integrina beta2 tales como LDP-01, anticuerpos anti-complemento (C5) tales como 5G1.1, anticuerpos anti-CD2 tales como BTI-322, MEDI-507, anticuerpos anti-CD3 tales como OKT3, SMART 65 anti-CD3, anticuerpos anti-CD4 tales como IDEC-151, MDXCD4, OKT4A, anticuerpos anti-CD11a, anticuerpos anti

CD14 tales como IC14, anticuerpos anti-CD18, anticuerpos anti-CD23 tales como IDEC 152, anticuerpos anti-CD25 tales como Zenapax, anticuerpos anti-CD40L tales como 5c8, Antova, IDBC-131, anticuerpos anti-CD64 tales como MDX-33, anticuerpos anti-CD80 tales como IDEC-114, anticuerpos anti-CD147 tales como ABX-CBL, anticuerpos anti-E-selectina tales como CDP850, anticuerpos anti-gpIIb/IIIa tales como ReoPro/Abcixima, anticuerpos anti-ICAM

5 3 tales como ICM3, anticuerpos anti-ICE tales como VX-740, anticuerpos anti-Fc!R1 tales como MDX-33, anticuerpos anti-IgE tales como rhuMab-E25, anticuerpos anti-IL-4 tales como SB-240683, anticuerpos anti-IL-5 tales como SB-240563, SCH55700, anticuerpos anti-IL-8 tales como ABX-IL8, anticuerpos anti-interferón gamma y anticuerpos anti-TNFa tales como CDP571, CDR870, D2E7, Infliximab, MAK-195F, anticuerpos anti-VLA-4 tales como Antegren. Los ejemplos de otras moléculas que contienen Fc que pueden administrare conjuntamente para tratar enfermedad autoinmunitaria o inflamatoria, rechazo de trasplante, EICH y similares incluyen, pero no se limitan a, la fusión de receptor de TNF p75/Fc Enbrel® (etanercept) e IL-1 trap de Regeneron.

Los ejemplos de anticuerpos que pueden administrarse conjuntamente para tratar enfermedades infecciosas incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos anti-ántrax tales como ABthrax, anticuerpos anti-CMV tales como

15 CytoGam y sevirumab, anticuerpos anti-criptosporidio tales como CryptoGAM, Sporidin-G, anticuerpos anti-Helicobacter tales como Piloran, anticuerpos anti-hepatitis B tales como HepeX-B, Nabi-HB, anticuerpos anti-VIH tales como HRG-214, anticuerpos anti-VSR tales como felvizumab, HNK-20, palivizumab, RespiGam, y anticuerpos anti-estafilococos tales como Aurexis, Aurograb, BSYX-A110 y SE-Mab.

Alternativamente, los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse conjuntamente con una o más de otras moléculas que compiten por la unión a uno o más receptores de Fc. Por ejemplo, administrar conjuntamente inhibidores del receptor Fc!RIIb inhibidor puede dar como resultado una función efectora aumentada. De manera similar, administrar conjuntamente inhibidores de los receptores de activación tales como Fc!RIIIa puede minimizar la función efectora no deseada. Los inhibidores de receptor de Fc incluyen, pero no se limitan a, moléculas de Fc

25 que se modifican por ingeniería genética para actuar como inhibidores competitivos por la unión a Fc!RIIb, Fc!RIIIa u otros receptores de Fc, así como otras inmunoglobulinas y específicamente el tratamiento denominado IVIg (inmunoglobulina intravenosa). El inhibidor puede administrarse y dejar que actúe antes de administrar el anticuerpo. Una manera alternativa de lograr el efecto de dosificación secuencial sería proporcionar una forma farmacéutica de liberación inmediata del inhibidor de receptor de Fc y después una formulación de liberación sostenida del anticuerpo de la invención. Las formulaciones de liberación inmediata y de liberación controlada pueden administrarse por separado o combinarse en una forma farmacéutica unitaria. La administración de un inhibidor de Fc!RIIb también puede usarse para limitar respuestas inmunitarias no deseadas, por ejemplo respuesta de anticuerpos anti-factor VIII tras la administración de factor VIII a pacientes hemofílicos.

35 Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse con un agente quimioterápico. Mediante “agente quimioterápico” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Los ejemplos de agentes quimioterápicos incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclosfosfamida (CYTOXAN ™); sulfonatos de alquilo tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anticuerpos antiadrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; anticuerpos antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolide y goserelina; antibióticos tales como aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina,

45 olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anticuerpos anti-estrógenos incluyendo por ejemplo tamoxifeno, raloxifeno, aromatasa que inhibe 4(5)-imidazoles, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY 117018, onapristona, y toremifeno (Fareston); anticuerpos anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU); análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; regenerador de ácido fólico tal como ácido frolínico; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalán, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina,

55 nimustina, ranimustina; análogos de platino tales como cisplatino y carboplatino; vinblastina; platino; proteínas tales como arginina desiminasa y asparaginasa; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; taxanos, por ejemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; inhibidor de timidilato sintasa (tal como Tomudex); agentes quimioterápicos adicionales incluyendo aceglatona; glicósido de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; difluorometilornitina (DMFO); elformitina; acetato de eliptinio; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubicina; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; sizofurano;

65 espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2,2’,2”-triclorotrietilamina; uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; clorambucilo; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; tenipósido; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina. También pueden usarse sales, ácidos o

5 derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores.

Puede administrarse un agente quimioterápico u otro agente citotóxico como profármaco. Mediante “profármaco” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para las células tumorales en comparación con el fármaco original y puede activarse o convertirse enzimáticamente en la forma original más activa. Véase, por ejemplo Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615th Meeting Belfast, 14:375-382; Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”, Directed Drug Delivery; y Borchardt et al., (ed.); 247-267, Humana Press, 1985. Los profármacos que pueden usarse con la presente invención incluyen pero no se limitan a profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato,

15 profármacos que contienen péptido, profármacos modificados con D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos que contienen beta-lactama, profármacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, 5-fluorocitosina y otros profármacos de 5fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco libre citotóxico más activo. Los ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden derivatizarse para dar una forma de profármaco para su uso con los anticuerpos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los agente quimioterápicos mencionados anteriormente.

Puede usarse Una variedad de otros agentes terapéuticos para su administración con los anticuerpos de la presente invención. El anticuerpo se administra con un agente antiangiogénico. Mediante “agente antiangiogénico” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un compuesto que bloquea, o interfiere en cierta medida con, el 25 desarrollo de vasos sanguíneos. El factor antiangiogénico puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña o una proteína, por ejemplo un anticuerpo, fusión de Fc o citocina, que se une a un factor de crecimiento o receptor de factor de crecimiento implicado en fomentar la angiogénesis. El factor antiangiogénico preferido en el presente documento es un anticuerpo que se une al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). También pueden usarse otros agentes que inhiben la señalización a través de VEGF, por ejemplo agentes terapéuticos basados en ARN que reducen los niveles de expresión de VEGF o VEGF-R, fusiones de VEGF-toxina, VEGF-trap de Regeneron, y anticuerpos que se unen a VEGF-R. Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse con un agente terapéutico que induce o potencia la respuesta inmunitaria adaptativa, por ejemplo un anticuerpo que selecciona como diana CTLA-4. Los agentes antiangiogénesis adicionales incluyen, pero no se limitan a, angiostatina (fragmento de plasminógeno), antitrombina III, angiozima, ABT-627, Bay 12-9566, benefina, 35 bevacizumab, bisfosfonatos, BMS-275291, inhibidor derivado de cartílago (CDI), CAI, fragmento de complemento CD59, CEP-7055, Col 3, combretastatina A-4, endostatina (fragmento de colágeno XVIII), inhibidores de farnesilo transferasa, fragmento de fibronectina, gro-beta, halofuginona, heparinasas, fragmento de hexasacárido de heparina, HMV833, gonadotropina coriónica humana (CGh), IM-862, interferón alfa, interferón beta, interferón gamma, proteína inducible por interferón 10 (IP-10), interleucina 12, kringle 5 (fragmento de plasminógeno), marimastat, inhibidores de metaloproteinasa (por ejemplo TIMP), 2-metodiestradiol, MMI 270 (CGS 27023A), inhibidor de activador de plasminógeno (PAI), factor de plaquetas 4 (PF4), prinomastat, fragmento de prolactina de 16 kDa, proteína relacionada con proliferina (PRP), PTK 787/ZK 222594, retinoides, solimastat, escualamina, SS3304, SU5416, SU6668, SU11248, tetrahidrocortisol-S, tetratiomolibdato, talidomida, trombospondina 1 (TSP-1), TNP-470, factor de crecimiento transformante beta (TGF-%), vasculostatina, vasostatina (fragmento de calreticulina),

45 ZS6126 y ZD6474.

Preferiblemente, el anticuerpo se administra con un inhibidor de tirosina cinasa. Mediante “inhibidor de tirosina cinasa” tal como se usa en el presente documento se quiere decir una molécula que inhibe en cierto grado la actividad tirosina cinasa de una tirosina cinasa. Ejemplos de tales inhibidores incluyen, pero no se limitan a, quinazolinas, tales como PD 153035, 4-(3-cloroanilino)quinazolina; piridopirimidinas; pirimidopirimidinas; pirrolopirimidinas, tales como CGP 59326, CGP 60261 y CGP 62706; pirazolopirimidinas, 4-(fenilamino)-7Hpirrolo(2,3-d)pirimidinas; curcumina (diferuloil-metano, 4,5-bis(4-fluoroanilino)ftalimida); tirfostinas que contienen restos de nitrotiofeno; PD-0183805 (Warner-Lambert); moléculas antisentido (por ejemplo las que se unen a ácido nucleico que codifica para ErbB); quinoxalinas (documento US 5.804.396); trifostinas (documento US 5.804.396);

55 ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering A G); inhibidores de pan-ErbB tales como C1-1033 (Pfizer); Affinitac (ISIS 3521; Isis/Lilly); mesilato de imatinib (STI571, Gleevec®; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); C1-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyet); Semaxinib (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-1C11 (Imclone); o tal como se describe en cualquiera de las siguientes publicaciones de patente: US 5.804.396; PCT WO 99/09016 (American Cyanimid); PCT WO 98/43960 (American Cyanamid); PCT WO 97/38983 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06378 (Warner-Lambert); PCT WO 99/06396 (Warner-Lambert); PCT WO 96/30347 (Pfizer, Inc); PCT WO 96/33978 (AstraZeneca); PCT WO96/3397 (AstraZeneca); PCT WO 96/33980 (AstraZeneca), gefitinib (IRESSA™, ZD1839, AstraZeneca) y OSI-774 (Tarceva ™, OSI Pharmaceuticals/Genentech).

65 El anticuerpo también puede administrarse con uno o más agentes inmunomoduladores. Tales agentes pueden aumentar o disminuir la producción de una o más citocinas, regular por incremento o por disminución la presentación

de antígenos propios, enmascarar antígenos de MHC, o fomentar el estado de proliferación, diferenciación, migración o activación de uno o más tipos de células inmunitarias. Los agentes inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a: fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) tales como aspirina, ibuprofeno, celecoxib, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, indometacina, ketoralaco, oxaprozina, nabumentona, sulindaco, tolmentina, 5 rofecoxib, naproxeno, ketoprofeno y nabumetona; esteroides (por ejemplo glucocorticoides, dexametasona, cortisona, hidroxicortisona, metilprednisolona, prednisona, prednisolona, trimcinolona, azulfidinaicosanoides tales como prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos; así como esteroides tópicos tales como antralina, calcipotrieno, clobetasol y tazaroteno); citocinas tales como TGFb, IFNa, IFNb, IFNg, IL-2, IL-4, IL-10; citocina, quemocina o antagonistas de receptor incluyendo anticuerpos, receptores solubles y fusiones de receptor-Fc contra BAFF, B7, CCR2, CCR5, CD2, CD3, CD4, CD6, CD7, CD8, CD11, CD14, CD15, CD17, CD18, CD20, CD23, CD28, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD52, CD64, CD80, CD86, CD147, CD152, factores de complemento (C5, D) CTLA4, eotaxina, Fas, ICAM, ICOS, IFN&, IFN%, IFN!, IFNAR, IgE, IL-1, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5R, IL-6, IL-8, IL-9 IL-12, IL-13, IL-13R1, IL-15, IL-18R, IL-23, integrinas, LFA-1, LFA-3, MHC, selectinas, TGF%, TNF&, TNF%, TNF-R1, receptor de células T, incluyendo Enbrel® (etanercept), Humira® (adalimumab) y Remicade® (infliximab); globulina heteróloga

15 anti-linfocitos; otras moléculas inmunomoduladoras tales como pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas, anticuerpos anti-idiotípicos para péptidos de unión a MHC y fragmentos de MHC, azatioprina, brequinar, bromocriptina, ciclofosfamida, ciclosporina A, D-penicilamina, desoxispergualina, FK506, glutaraldehído, oro, hidroxicloroquina, leflunomida, malononitriloamidas (por ejemplo leflunomida), metotrexato, minociclina, mizoribina, micofenolato de mofetilo, rapamicina y sulfasasazina.

Alternativamente, pueden administrarse anticuerpos de la presente invención con una citocina. Mediante “citocina” tal como se usa en el presente documento se quiere decir un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son linfocinas, monocinas y hormonas polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluye hormona de crecimiento 25 tal como hormona de crecimiento humana, N-metionil-hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovina; hormona paratiroidea; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorrelaxina; hormonas glicoproteicas tales como hormona estimulante del folículo (FSH), hormona estimulante de tiroides (TSH) y hormona leutinizante (LH); factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; prolactina; lactógeno placentario; factor de necrosis tumoral alfa y beta; sustancia inhibidora mulleriana; péptido asociado con gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento nerviosos tales como NGF-beta; factor de crecimiento de plaquetas; factores de crecimiento transformantes (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a insulina I y II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductivos; interferones tales como interferón alfa, beta y gamma; factores estimulantes de colonias (CSF) tales como CSF de macrófagos (M-CSF); CSF de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y CSF de granulocitos (G-CSF);

35 interleucinas (IL) tales como IL-1, IL-1-alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-15, un factor de necrosis tumoral tal como TNF-alfa o TNF-beta; y otros factores polipeptídicos incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Tal como se usa en el presente documento, el término citocina incluye proteínas procedentes de fuentes naturales o procedentes de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa.

Preferiblemente, se administran conjuntamente citocinas u otros agentes que estimulan células del sistema inmunitario con el anticuerpo de la presente invención. Un modo de tratamiento de este tipo puede potenciar la función efectora deseada. Por ejemplo, pueden administrarse conjuntamente agentes que estimulan células NK, incluyendo pero sin limitarse a IL-2. En otra realización, pueden administrare conjuntamente agentes que estimulan

45 macrófagos, incluyendo pero sin limitarse a C5a, péptidos de formilo tales como N-formil-metionil-leucil-fenilalanina (Beigier-Bompadre et al. (2003) Scand. J. Immunol. 57: 221-8). Además, se administran agentes que estimulan neutrófilos, incluyendo pero sin limitarse a G-CSF, GM-CSF y similares. Además, pueden usarse agentes que fomentan la migración de tales citocinas inmunoestimulantes. Además, agentes adicionales incluyendo, pero sin limitarse a, interferón gamma, IL-3 e IL-7, pueden fomentar una o más funciones efectoras.

Alternativamente, se administran conjuntamente citocinas u otros agentes que inhiben la función de células efectoras con el anticuerpo de la presente invención. Un modo de tratamiento de este tipo puede limitar la función efectora no deseada.

55 Adicionalmente, el anticuerpo puede administrarse con uno o más antibióticos, incluyendo, pero sin limitarse a: antibióticos de aminoglicósido (por ejemplo apramicina, arbekacina, bambermicinas, butirosina, dibekacina, gentamicina, kanamicina, neomicina, netilmicina, paromomicina, ribostamicina, sisomicina, espectrinomicina), aminociclitoles (por ejemplo espirotinomicina), antibióticos de amfenicol (por ejemplo azidamfenicol, cloramfenicol, florfenicol y tiamfemicol), antibióticos de ansamicina (por ejemplo rifamida y rifampina), carbapenemos (por ejemplo imipenem, meropenem, panipenem); cefalosporinas (por ejemplo cefaclor, cefadroxilo, cefamandol, cefatrizina, cefazedona, cefozoprán, cefpimizol, cefpiramida, cefpiroma, cefprozilo, cefuroxina, cefixima, cefalexina, cefradina), cefamicinas (cefbuperazona, cefoxitina, cefminox, cefmetazol y cefotetán); lincosamidas (por ejemplo clindamicina, lincomicina); macrólido (por ejemplo azitromicina, brefeldina A, claritromicina, eritromicina, roxitromicina, tobramicina), monobactamas (por ejemplo aztreonam, carumonam y tigemonam); mupirocina; oxacefemos (por

65 ejemplo flomoxef, latamoxef y moxalactama); penicilinas (por ejemplo amdinocilina, amdinocilina-pivoxilo, amoxicilina, bacampicilina, ácido bencilpenicilínico, bencilpenicilina de sodio, epicilina, fenbenicilina, floxacilina, penamecilina, yodhidrato de penetamato, penicilina o-benetamina, penicilina O, penicilina V, benzoato de penicilina V, penicilina V-hidrabamina, penimepiciclina y fencihicilina de potasio); polipéptidos (por ejemplo bacitracina, colistina, polimixina B, teicoplanina, vancomicina); quinolonas (amifloxacino, cinoxacino, ciprofloxacino, enoxacino, enrofloxacino, feroxacino, flumequina, gatifloxacino, gemifloxacino, grepafloxacino, lomefloxacino, moxifloxacino,

5 ácido nalidíxico, norfloxacino, ofloxacino, ácido oxolínico, pefloxacino, ácido pipemídico, rosoxacino, rufloxacino, esparfloxacino, temafloxacino, tosufloxacino, trovafloxacino); rifampina; estreptograminas (por ejemplo quinupristina, dalfopristina); sulfonamidas (sulfanilamida, sulfametoxazol); tetraciclenos (clortetraciclina, clorhidrato de demeclociclina, desmetilclortetraciclina, doxiciclina, duramicina, minociclina, neomicina, oxitetraciclina, estreptomicina, tetraciclina, vancomicina).

También pueden usarse agentes antifúngicos tales como anfotericina B, ciclopirox, clotrimazol, econazol, fluconazol, flucitosina, itraconazol, ketoconazol, niconazol, nistatina, terbinafina, terconazol y tioconazol.

También pueden usarse agentes antivirales incluyendo inhibidores de proteasa, inhibidores de transcriptasa inversa

15 y otros, incluyendo interferones tipo I, inhibidores de fusión viral e inhibidores de neuramidasa. Los ejemplos de agentes antivirales que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, aciclovir, adefovir, amantadina, amprenavir, clevadina, enfuvirtida, entecavir, foscarnet, gangciclovir, idoxuridina, indinavir, lopinavir, pleconarilo, ribavirina, rimantadina, ritonavir, saquinavir, trifluridina, vidarabina y zidovudina.

Los anticuerpos de la presente invención pueden combinarse con otros regímenes terapéuticos. Por ejemplo, el paciente que va a tratarse con un anticuerpo de la presente invención también puede recibir radioterapia. Puede administrarse radioterapia según protocolos comúnmente empleados en la técnica y conocidos por el experto en la técnica. Tal terapia incluye, pero no se limita a, radiación con cesio, iridio, yodo o cobalto. La radioterapia puede ser irradiación de todo el cuerpo, o puede dirigirse localmente a un sitio o tejido específico en o sobre el cuerpo, tal 25 como el pulmón, la vejiga o la próstata. Normalmente, se administra radioterapia en pulsos a lo largo de un periodo de tiempo de desde aproximadamente 1 a 2 semanas. Sin embargo, la radioterapia puede administrarse a lo largo de periodos de tiempo más largos. Por ejemplo, puede administrarse radioterapia a pacientes que tienen cáncer de cabeza y cuello durante de aproximadamente 6 a aproximadamente 7 semanas. Opcionalmente, la radioterapia puede administrarse como una única dosis o como múltiples dosis secuenciales. El médico experto puede determinar empíricamente la dosis o las dosis apropiadas de radioterapia útiles en el presente documento. El anticuerpo de la presente invención y una o más de otras terapias anticancerígenas pueden emplearse para tratar células cancerosas ex vivo. Se contempla que tal tratamiento ex vivo puede ser útil en el trasplante de médula ósea y particularmente el trasplante de médula ósea autóloga. Por ejemplo, puede emplearse el tratamiento de células o tejido(s) que contiene(n) células cancerosas con anticuerpo y una o más de otras terapias anticancerígenas, tal

35 como se describió anteriormente, para agotar o agotar sustancialmente las células cancerosas antes del trasplante al paciente receptor.

Evidentemente, se contempla que los anticuerpos de la invención pueden emplearse en combinación con todavía otras técnicas terapéuticas tales como cirugía o fototerapia.

Ejemplos

Se proporcionan a continuación ejemplos para ilustrar la presente invención. Estos ejemplos no pretenden restringir la presente invención a ninguna aplicación particular o teoría de funcionamiento.

45 Para referencia a regiones variables de inmunoglobulinas, se numeran las posiciones según el esquema de numeración de Kabat. Para referencia a regiones constantes de inmunoglobulinas, se numeran las posiciones según el índice EU como en Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda).

Ejemplo 1. Anticuerpos anti-CD19 con modificaciones de aminoácidos que potencian la función efectora

Los anticuerpos anti-CD19 de la invención están previstos como candidatos clínicos para agentes terapéuticos anticancerígenos. Para investigar la posibilidad de mejorar la función efectora de un anticuerpo que selecciona como

55 diana CD19, se diseñaron por ingeniería genética versiones variantes de anticuerpos anti-CD19.

La figura 6 proporciona algunas secuencias de regiones variables de cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos anti-CD19 4G7 (Meeker, T.C. et al. 1984. Hybridoma. 3: 305-320) y HD37 (Pezzuto, A. et al. 1987. J. Immunol. 138: 2793-2799) usados en el presente estudio. Las cadenas pesadas y ligeras quiméricas originales de ratón se indican H0 4G7, H0 HD37, L0 4G7 y L0 HD37 respectivamente. También podrían prepararse variantes de la presente invención en el contexto del anticuerpo anti-CD19 B43 (Uckun, F.M. et al. 1998. Blood. 71: 13-29) que tiene propiedades similares a HD37 y comparte CDR idénticas y una identidad de secuencia global del 97% en relación con las secuencias H0 y L0 de HD37 mostradas en la figura 6. Se construyeron los genes para VH y VL de 4G7 y HD37 TN murinos, designados H0 y L0 respectivamente, usando técnicas de síntesis de genes y se subclonaron en 65 el vector de expresión de mamífero pcDNA3.1Zeo (Invitrogen) que comprende las regiones constantes de IgG1 de cadena pesada y kappa ligera (C∀) de longitud completa. Se construyó la variante S239D/I332E (anticuerpo anti

CD19 con función efectora potenciada) en la región Fc de un anticuerpo IgG1/IgG2 híbrido (denominado “híbrido”, figura 2) en el vector pcDNA3.1Zeo usando técnicas de mutagénesis QuikChange (Stratagene). Se secuenciaron todas las secuencias para confirmar la fidelidad de la secuencia. Se cotransfectaron plásmidos que contenían el gen de cadena pesada (VH-CH1-CH2-CH3) (tipo natural o variantes) con plásmido que contenía gen de cadena ligera

5 (VL-CL∀) en células 293T. Se recogieron los medios 5 días tras la transfección, y se purificaron los anticuerpos del sobrenadante usando cromatografía de afinidad de proteína A (Pierce, n.º de catálogo 20334).

Se calcularon las afinidades de unión relativas del anticuerpo IgG1 de 4G7 y S239D/I332E híbrido de 4G7 determinando parámetros de unión en Biacore™ usando un panel de receptores de Fc (figura 7). En resumen, se acopló proteína A/G a una celda de flujo de un chip CM5. En primer lugar, se diluyó IgG hasta 25 nM y se inmovilizó en el canal de proteína A/G hasta (1000 UR. Se diluyó en serie Fc!R-His y se inyectó a 30 ml/min. durante 2 min. seguido por disociación durante 3 min. Para determinar la KD, los sensogramas resultantes se “ajustan por grupos” usando el modelo de interacción 1:1 disponible en el software BIAevaluation. Los valores de KD que eran superiores a 5 X 10-6 M se indican como ND (no determinado) en la figura 7. Los datos indican que el anticuerpo IgG1 TN se

15 une a Fc!RIIIa V158 con una afinidad de aproximadamente 240 nM, que concuerda con la bibliografía (Okazaki et al, 2004, J Mol Bio 336:1239-49; Lazar et al, Proc Natl Acad Sci USA 103(11):4005-4010). La versión variante de Fc se une a Fc!RIIIa V158 con una afinidad de aproximadamente 4,7 nM, lo que indica una potenciación de la afinidad de aproximadamente 50 veces en relación con TN. La unión de anticuerpo anti-CD19 variante a Fc!RIIIa F158 es de aproximadamente 16,7 nM.

Para evaluar la capacidad de las variantes de anticuerpo para mediar en la función efectora contra células que expresan CD19, se sometió a prueba el anticuerpo anti-CD19 con función efectora potenciada en un ensayo de ADCC basado en células. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas de Leukopaks y se usaron como células efectoras, y se usaron células cancerosas positivas para CD19 como células diana. Se 25 sembraron las células diana a 10.000 (Raji y MEC-1) y 20.000 (SUP-B15) células/pocillo en placas de 96 pocillos y se trataron con anticuerpos designados por triplicado. Se añadieron en exceso a las células diana CMSP aisladas usando un gradiente de Ficoll y se cultivaron conjuntamente durante 4 h antes del procesamiento para determinar la actividad LDH usando el kit de detección de citotoxicidad según las instrucciones del fabricante. La figura 8a muestra los resultados del ensayo de ADCC que compara los anticuerpos S239D/I332E híbrido de 4G7 e IgG1 de 4G7, e IgG1 de HD37 y S239D/I332E híbrido de HD37 en la línea celular Daudi (LB). La figura 8b muestra los resultados del ensayo de ADCC que compara los anticuerpos S239D/I332E híbrido de 4G7 e IgG1 de 4G7, y anticuerpo anti-CD20 rituximab en las líneas celulares SUP-B15 (LLA) y Raji (linfoma de Burkitt). Los gráficos muestran que los anticuerpos difieren no sólo en su CE50, que refleja su potencia relativa, sino también en el nivel máximo de ADCC alcanzable por los anticuerpos a concentraciones de saturación, que refleja su eficacia relativa. Se observan

35 potenciaciones considerables en la potencia y la eficacia para los anticuerpos variantes de Fc en comparación con el anticuerpo con la región Fc TN. El anticuerpo IgG1 quimérico tiene muy poca eficacia o potencia. La CE50 de una curva de respuesta a la dosis tal como la de la figura 8 representa la concentración de un compuesto a la que se observa el 50% de su efecto máximo. En un entorno clínico, la potencia refleja la concentración de anticuerpo necesaria para llevar a cabo su efecto terapéutico. Por tanto, los datos en la figura 8 muestran que los anticuerpos anti-CD19 optimizados en Fc actúan in vivo a una concentración o dosis inferior a la de un anticuerpo anti-CD19 o anti-CD20 TN. En la figura 8b, mientras que IgG1 TN anti-CD19 a concentración de saturación media aproximadamente un 10% de la ADCC máxima, el anticuerpo anti-CD19 variante de Fc lisa aproximadamente el 60% de las células diana. En un entorno clínico, la eficacia refleja el beneficio terapéutico máximo del fármaco administrado.

45 Ejemplo 2. Unión de un anticuerpo anti-CD19 con función efectora potenciada a una línea celular tumoral derivada de células B

Se midió la unión relativa de S239D/I332E híbrido de 4G7 a la línea celular Raji. Se determinaron las afinidades de variantes anti-CD19 con función efectora potenciada usando el sistema DELFIA® (PerkinElmer Life Sciences) que se basa en fluorometría de resolución temporal (TRF). Se marca anticuerpo anti-CD19 (H0L0) con europio usando el kit de marcaje con Eu disponible de PerkinElmer Biosciences. Se diluyen en serie variantes (frío) o el tipo natural (TN) no marcados (partiendo normalmente de 1 uM) en etapas semilogarítmicas y se mezclan con una concentración fijada de anticuerpo anti-CD19 marcado (o caliente). Se añade entonces la mezcla de anticuerpos

55 “calientes” y “fríos” a 100.000 células Raji (que tienen una alta densidad de antígeno CD-19 expresado en la superficie) y se incuban sobre hielo durante 30 min. El ensayo se aplica esencialmente como un ensayo de competición para seleccionar anticuerpos anti-CD19 de diferentes afinidades. En ausencia de variantes de afinidad competidoras, Eu-anticuerpo anti-CD19 y CD19 de superficie interaccionan y producen una señal a 613 nm cuando el europio se excita a 340 nm. La adición de la variante o el tipo natural compite con la interacción Eu-anticuerpo anti-CD19-CD19, reduciendo la fluorescencia cuantitativamente para permitir la determinación de afinidades de unión relativas. La figura 9 muestra los resultados de un ensayo de unión a la superficie celular de anticuerpo anti-CD19 con función efectora potenciada a células Raji. Tal como puede observarse, el valor de CE50 calculado es de 1,2 nM.

65 Ejemplo 3. ADCC de un anticuerpo anti-CD19 con citotoxicidad potenciada contra múltiples líneas celulares de

linfoma.

Con el fin de evaluar las propiedades citotóxicas de anticuerpo anti-CD19 con función efectora potenciada, se realizaron ensayos de ADCC con un panel de 14 líneas celulares que representan diversos linfomas y leucemias 5 (figura 10a). Las líneas celulares sometidas a prueba fueron las líneas celulares DoHH-2 y SC1 de linfoma folicular (LF); la línea celular Jeko-1 de linfoma de células del manto (LCM); las líneas celulares Daudi y Raji de linfoma de Burkitt (LB); las líneas celulares MEC1 y WaC3CD5 de leucemia linfocítica crónica (LLC); la línea celular Bonna-12 de leucemia de células pilosas (LCP); la línea celular BV-173 de leucemia mielógena crónica (LMC); y las líneas celulares VAL, SUP-B15, NALM-6, RS4;11 y 697 de leucemia linfoblástica aguda (LLA). Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas de Leukopaks y se usaron como células efectoras, y se usaron células cancerosas positivas para CD19 como células diana. Se sembraron las células diana en placas de 96 pocillos y se trataron con anticuerpos designados por triplicado. Se añadieron en exceso a las células diana CMSP aisladas usando un gradiente de Ficoll y se cultivaron conjuntamente antes del procesamiento para determinar la actividad LDH usando el kit de detección de citotoxicidad según las instrucciones del fabricante. Ambos parámetros,

15 potencia (CE50) y eficacia (% de ADCC), se normalizaron con respeto a los de rituximab (anticuerpo anti-CD20). Esta selección ha demostrado la superioridad citotóxica in vitro de anticuerpo anti-CD19 con función efectora potenciada a lo largo de una amplia gama de líneas celulares, que representan especialmente la enfermedad linfoproliferativa que se origina en estadios tempranos del desarrollo de células. La figura 10b indica las líneas celulares usadas y su tipo de cáncer correspondiente.

Ejemplo 4. Anticuerpos anti-CD19 con potencial reducido para inmunogenicidad.

Debido al amplio uso de la tecnología de hibridomas, un número sustancial de anticuerpos se derivan de fuentes no humanas. Sin embargo, las proteínas no humanas son a menudo inmunogénicas cuando se administran a seres 25 humanos, reduciendo de ese modo en gran medida su utilidad terapéutica. La inmunogenicidad es el resultado de una compleja serie de respuestas a una sustancia que se percibe como foránea, y puede incluir producción de anticuerpos neutralizantes y no neutralizantes, formación de complejos inmunitarios, activación del complemento, activación de mastocitos, inflamación, respuestas de hipersensibilidad y anafilaxia. Varios factores pueden contribuir a la inmunogenicidad de proteínas, incluyendo, pero sin limitarse a, la secuencia de las proteínas, la vía y la frecuencia de administración y la población de pacientes. La inmunogenicidad puede limitar la eficacia y seguridad de una proteína terapéutica de múltiples modos. Puede reducirse directamente la eficacia mediante la formación de anticuerpos neutralizantes. También puede reducirse la eficacia indirectamente, ya que la unión a anticuerpos o bien neutralizantes o bien no neutralizantes conduce normalmente a un rápido aclaramiento del suero. Pueden producirse graves efectos secundarios e incluso muerte cuando se genera una reacción inmunitaria. Preferiblemente, se usa

35 modificación por ingeniería genética de proteínas para reducir la inmunogenicidad de las proteínas que seleccionan como diana CD19 de la presente invención.

Con el fin de reducir el potencial de inmunogenicidad de las proteínas anti-CD19 de la presente invención, se redujo la inmunogenicidad de los anticuerpos anti-CD19 4G7 y HD37 usando un método descrito en el documento US 2006/0008883, titulado “Methods of Generating Variant Proteins with Increased Host String Content and Compositions Thereof”. Los métodos reducen el potencial de inmunogenicidad aumentando el contenido en secuencias humanas del anticuerpo mediante mutaciones. Las cadenas pesadas y ligeras con potencial de inmunogenicidad reducido se denominan H1, H2, H3, H4, etc. y L1, L2, L3, etc. y se muestran en las figura 11 a 14. Las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos originales, 4G7 y HD37, se denominan H0 y L0, respectivamente. 45 Se expresaron combinaciones de las diferentes cadenas pesadas y ligeras y se purificaron y examinaron los anticuerpos resultantes, con nombres tales como H3L3, H3/L3 o H3_L3. Se expresaron anticuerpos anti-CD19 mediante transfección transitoria de vectores que codificaban para las cadenas pesadas y ligeras en células 293T hechas crecer en suero bovino fetal con un contenido ultrabajo en IgG al 10% con piruvato de sodio 1 mM y 1X aminoácidos no esenciales (Gibco®, Invitrogen Hayward CA). Cinco días tras la transacción, se retiró el medio de cultivo y se hizo pasar a través de una columna de proteína A (Pierce Biotechnology Inc, Rockford MD). Las cadenas pesadas pueden prepararse con cualquier tipo de dominio constante incluyendo, en seres humanos, IgG1, IgG2 e híbridos que comprenden IgG1 e IgG2, así como dominios constantes de ratón tales como IgG1 e IgG2a, que pueden denominarse mIgG1 y mIgG2a. Pueden encontrarse las secuencias de cadenas pesadas humanas en la figura 2. Se midió la unión relativa de variantes de anticuerpo anti-CD19 con inmunogenicidad reducida frente a la 55 línea celular Raji. Se determinaron las afinidades de variantes de anticuerpo anti-CD19 con inmunogenicidad reducida usando el sistema DELFIA® (PerkinElmer Life Sciences) que se basa en fluorometría de resolución temporal (TRF). Se marca anticuerpo anti-CD19 con europio usando el kit de marcaje con Eu disponible de PerkinElmer Biosciences. Se diluyen en serie variantes (frío) o el tipo natural (TN) no marcados (partiendo normalmente de 1 uM) en etapas semilogarítmicas con una concentración fijada de anticuerpo anti-CD19 marcado (o caliente). Se añade entonces la mezcla de anticuerpos “calientes” y “fríos” a 100.000 células Raji (que tienen una alta densidad de antígeno CD-19 expresado en la superficie) y se incuban sobre hielo durante 30 min. El ensayo se aplica esencialmente como un ensayo de competición para seleccionar anticuerpos anti-CD19 de diferentes afinidades. En ausencia de variantes de afinidad competidoras, Eu-anticuerpo anti-CD19 y CD19 de superficie interaccionan y producen una señal a 613 nm cuando el europio se excita a 340 nm. La adición de la variante o el 65 tipo natural compite con la interacción Eu-anticuerpo anti-CD19-CD19, reduciendo la fluorescencia cuantitativamente para permitir la determinación de afinidades de unión relativas. La figura 15a muestra resultados de un ensayo de

unión a la superficie celular variantes de 4G7 con inmunogenicidad reducida a células Raji. Basándose en la afinidad de unión y la estabilidad, se eligió la región variable H1L1 de 4G7 para desarrollo adicional. La figura 15b muestra los resultados de un ensayo de ADCC con moldes de inmunogenicidad reducida S239D/I332E híbrido de HD37_H2L1 y S239D/I332B híbrido de 4G7_H1L3 en la línea celular MEC-1 (LLC). Se realizó este ensayo de ADCC

5 como en los ensayos previos. Ambos anticuerpos son activos en esta línea celular y por tanto pueden ser posibles tratamientos para LLC.

Ejemplo 5. Potenciación de la afinidad y estabilidad de anticuerpo anti-CD19 con función efectora potenciada.

Se llevó a cabo la maduración por afinidad de H1L1 del AcM 4G7 con el fin de aumentar adicionalmente la afinidad de unión a CD19 así como la potencia de ADCC. Se realizó la maduración por afinidad en tres fases usando un enfoque de modificación por ingeniería genética de proteínas/computacional. En primer lugar, trabajando con la hipótesis de que los residuos determinantes de especificidad (SDR) (Padlan, E.A. et al. 1995. FASEB J. 9: 133-139) en las CDR de un anticuerpo ya se han optimizado por células B en el proceso de hipermutación somática in vivo, se 15 diseñó una biblioteca de 94 variantes para determinar los residuos en las CDR que eran críticos para la unión al antígeno, y por tanto no deben cambiarse durante el procedimiento de modificación por ingeniería genética. Esta biblioteca consistía en una o dos mutaciones de “sondeo” realizadas en posiciones en las CDR con sitios elegidos usando modelado estructural así como la probabilidad de que una posición sea a menudo un SDR, que se compiló de análisis de estructuras de complejos antígeno-anticuerpo disponibles en el Protein Data Bank (PDB) (MacCallum,

R.M. et al. 1996. JMB 262: 732-745; Almagro, J.C. 2004. J. Mol. Recognit. 17:132-143).

Se introdujeron mutaciones variantes usando el kit de mutagénesis QuikChange en el formato Fab del molde de H1L1 y contenía una etiqueta de 6X-His. Se expresaron Fab variantes en células 293T usando placas de 24 pocillos se analizaron mediante AlphaScreen o citometría de flujo usando células Raji o RS4;11, y determinándose la

25 concentración de cada variante usando un chipo de unión a His mediante Biacore™. De 50 posiciones, se identificaron 17 posiciones que eran críticas para la unión al antígeno, lo que permitió reducir el tamaño de la biblioteca en la siguiente ronda de maduración por afinidad y proporcionó información estructural valiosa en cuanto a qué posiciones se encuentran próximas a la superficie de contacto con el antígeno y constituirían buenas dianas para hallar variantes de afinidad aumentada. Los 17 SDR identificados en el análisis están en excelente acuerdo con el número promedio de SDR presentes en anticuerpos cuyos complejos antígeno-anticuerpo se han resuelto (Almagro, J.C. 2004. J. Mol. Recognit. 17:132-143). Además de la información estructural valiosa obtenida de esta biblioteca, se obtuvieron algunas variantes que tenían una afinidad aumentada.

Se clasificaron las 33 posiciones de CDR restantes en orden de importancia basándose en el análisis de los

35 resultados de la primera biblioteca y mapeando los SDR sobre un modelo estructural del molde de H1L1. A través de este análisis, se determinó que casi toda la superficie de contacto de la unión antígeno-anticuerpo podía explorarse con una frecuencia total de 12,2 aminoácidos por posición ((9,3 nuevas variantes por posición) con un tamaño de la biblioteca de la segunda ronda de 279 variantes. Se usó automatización del diseño de bibliotecas (“Library Design Automation”) (LDA™) (documento US 2006/0234303) para diseñar una biblioteca optimizada de variantes que se afinó tanto para el ajuste como para la cobertura basándose en el número de variantes deseadas. La biblioteca de la segunda ronda final, cuando se ajustó para el formato de alto rendimiento, contenía 265 variantes en 30 posiciones. Esta biblioteca produjo varias variantes que presentaban afinidad de unión aumentada. Se examinaron variantes de Fab anti-CD19 mediante citometría de flujo para determinar la afinidad. Se suspendió la línea celular RS4;11, que se sabe que expresa CD19, en PBS y se sembró en placa a 200.000 células/pocillo en una placa de fondo redondo de

45 96 pocillos. Se añadió una dilución en serie de anticuerpos frente a CD19 a las células RS4;11 a una concentración desconocida. Se incubaron las células sobre hielo durante 30 minutos y entonces se lavaron 4 veces en PBS. Se diluyó un F(ab’)2 marcado con PE anti-Fab 1/50 en PBS, que entonces se usó para resuspender las RS4;11 recubiertas con Fab anti-CD19. Se incubaron las células durante 30 minutos y se lavaron dos veces. Entonces se fijaron las células y se evaluó el ensayo de unión en un citómetro de flujo FACS Canto II. Se usó el MFI para medir la fuerza de unión. A partir de ambas bibliotecas, una y dos, se obtuvo un total de 30 variantes individuales con afinidad aumentada en 11 posiciones.

El análisis de los datos de unión de las primeras dos bibliotecas así como el análisis estructural adicional permitió diseñar una tercera y última biblioteca que contenía combinaciones de 2-8 variantes individuales. Esta biblioteca 55 consistía en 149 variantes en 8 posiciones. A partir de éstas, 20 variantes mostraban un aumento significativo en la afinidad y se seleccionaron para su conversión a formato de longitud completa para la medición simultánea de la afinidad de unión y la ADCC. Para evaluar estas propiedades en disolución, se realizaron ensayos de estabilidad con estas variantes. El conjunto final de mutaciones incluido en las 20 finales eran variantes de cadena pesada T57P, K58E, S100cT, R100dS, y variantes de cadena ligera L27cQ, S27eV, A55N, F96I y F96N. Estudios de estabilidad acelerados revelaron que al menos una de las mutaciones que potenciaban la afinidad creaba inestabilidad en la proteína y provocaba que estas variantes perdieran toda la potencia tras sólo 8 h a 37ºC. Teniendo en cuenta los datos de unión y estabilidad, pudo seleccionarse un AcM candidato madurado por afinidad final que presentaba un aumento de (10 veces en la afinidad de unión en células RS4;11 en relación con el AcM H1L1 (figura 16). También se diseñaron y seleccionaron variantes diseñadas para aumentar la estabilidad a largo 65 plazo de la molécula anti-CD19. La figura 17 muestra datos de unión para variantes incubadas durante 5 días a 37ºC, pH 9,0 en Tris-HCl 200 mM, demostrando la mejora en la estabilidad obtenida a partir de una variante anti

CD19.

Se muestran todas las sustituciones individuales realizadas para lograr una afinidad y/o estabilidad potenciada en la figura 27. La figura 28 indica todas las variantes de región variable anti-CD19 construidas para optimizar la afinidad y

5 estabilidad. La figura 29 indica variantes preferidas y el aumento relativo en la afinidad de unión frente al AcM H1L1 original. Se muestran secuencias para las variantes de cadena pesada con afinidad y/o estabilidad potenciada preferidas en la figura 18. Se muestran variantes de cadena ligera con afinidad y/o estabilidad potenciada preferidas en la figura 19. Se proporcionan secuencias de aminoácidos de variantes de S239D/1332E híbrido de longitud completa que contienen las regiones variables con afinidad y estabilidad mejorada como SEQ ID NO: 86-110. Se proporcionan CDR con afinidad y estabilidad mejorada como SEQ ID NO: 111-131.

Ejemplo 6. Propiedades antiproliferativas de S239D/I332 híbrido de 4G7 sobre células Raji.

Para observar un efecto antiproliferativo in vitro, muchos anticuerpos requieren reticulación, lograda habitualmente

15 mediante un anticuerpo secundario. Se ha propuesto que los efectos in vivo correspondientes para estos anticuerpos pueden ser dependientes de la reticulación mediada por receptores de Fc expresados en la superficie de células efectoras. En este experimento, se hicieron crecer células Raji durante 3 días en presencia de anticuerpo anti-CD20 (rituximab), IgG1 de 4G7 o S239D/I332E híbrido de 4G7 100 ng/ml o anticuerpos control (región variable que no se une a CD19 con Fc de variantes de S239D/I332E híbrido) a concentraciones variables con un exceso molar de 10x de anticuerpo de reticulación. Se midió el crecimiento celular usando un ensayo de luminiscencia dependiente de ATP. Se muestran los resultados para el ensayo anti-proliferación en la figura 20. Tanto S239D/I332E híbrido de 4G7 como IgG1 de 4G7 muestran efectos de antiproliferación más fuertes que rituximab.

Ejemplo 7. Propiedades antiproliferativas de S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 sobre 25 células SU-DHL-6.

En este experimento, se hicieron crecer células SU-DHL-6 o bien durante 3 días en presencia de S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 humanizado y anticuerpos control a concentraciones variables con un exceso molar de 10x de anticuerpo de reticulación y 6000 células/pocillo o bien se hicieron crecer en presencia de una concentración fijada de anticuerpo a 3000 células/pocillo y se midió la viabilidad en puntos de tiempo específicos durante un total de 72 horas. Se muestran los resultados para el ensayo de antiproliferación en la figura 21. S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 muestra efectos de antiproliferación más fuertes que rituximab. S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 también muestra efectos antiproliferativos incluso en ausencia de anticuerpo de reticulación.

35 Ejemplo 8. Fagocitosis de células Raji y RS4:11 con S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7.

A diferencia de células NK que sólo expresan Fc!RIIIa y algunas veces Fc!RIIc, los monocitos y las células efectoras derivadas de monocitos expresan la gama de Fc!R, incluyendo Fc!RI, Fc!RIIa, Fc!RIIb y Fc!RIIIa. Por tanto, la activación y función de células efectoras derivadas de monocitos, incluyendo por ejemplo macrófagos, puede ser dependiente del acoplamiento de complejos inmunitarios de anticuerpos con receptores distintos de sólo Fc!RIIIa. De hecho, tal como se describe en el documento WO 2007/04/635, Desjarlais J.R. et al., la fagocitosis por macrófagos está mediada en parte por el acoplamiento de anticuerpo con Fc!RIIa.

45 Para evaluar la capacidad de S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 para mediar en la fagocitosis, se realizó un ensayo de fagocitosis basado en citometría de flujo. Se cultivaron monocitos CD14+ purificados en factor estimulante de colonias de macrófagos (50 ng/ml) durante 5 días en un incubador humidificado para diferenciar macrófagos. Se usaron células RS4;11 o Raji como dianas. Se marcaron las células diana con PKH67 (Sigma) según las instrucciones del fabricante. Se añadieron las células a una placa de 96 pocillos tras lo cual se añadió una dilución en serie de anticuerpos anti-CD19 modificados en Fc y TN. Entonces se añadieron a los pocillos macrófagos derivados de monocitos a una razón de efector con respecto a diana de 4:1. Se realizaron estos ensayos en presencia de suero humano. Se centrifugó brevemente el cultivo conjunto de células y entonces se incubó en un incubador humidificado durante 4 horas. Se recogieron las células, y se tiñeron los macrófagos con un

55 segundo color fluorescente para distinguirlos de la diana. Se fijaron las células en PFA al 1% y se evaluó la fagocitosis en un citómetro de flujo FACS Canto II. Se determinó la lectura de fagocitosis mediante el número de células dobles positivas dividido entre el número total de células tumorales. Se muestran los resultados del ensayo de fagocitosis en la figura 22. S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 muestra un aumento del nivel de fagocitosis en ambas líneas celulares en comparación con el anticuerpo IgG1 anti-CD19.

Los macrófagos son fagocitos que actúan como eliminadores engullendo células muertas, sustancias foráneas y otros residuos. De manera importante, los macrófagos son células presentadoras de antígeno (APC) profesionales, que captan patógenos y sustancias foráneas en tejidos periféricos, migrando entonces a órganos linfoides secundarios para iniciar respuestas inmunitarias adaptativas activando células T vírgenes. Por tanto, los resultados

65 del experimento previo sugieren que la modificación de anticuerpos anti-CD19 puede permitir mecanismos de acción que incluyen tanto funciones efectoras citotóxicas innatas así como funciones efectoras que pueden conducir posiblemente a respuesta inmunitaria adaptativa a largo plazo.

Ejemplo 9. ADCC de S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 contra múltiples líneas celulares de linfoma usando linfocitos citolíticos naturales (NK) purificados

5 Con el fin de evaluar las propiedades citotóxicas de S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7, se realizaron ensayos de ADCC con células NK purificadas sobre un panel de 6 líneas celulares que representan diversos linfomas y leucemias (figura 23). Se realiza ADCC con células NK purificadas en placas de microtitulación de 96 pocillos. Se purificaron las células NK a partir de CMSP humanas usando el kit de Miltenyi Biotec (n.º de cat. 130-091-152) y se incubaron en FBS al 10%/RPMI1640 durante la noche con IL-2 10 ng/ml. Al día siguiente, se opsonizan 10.000 (WaC3CD5, Namalwa, Bonna-12, Ramos) o 20.000 (RS4;11, BV-173) células diana cancerosas con concentraciones variables de anticuerpo y se usan 50k células NK para cada concentración de anticuerpo por triplicado. Se lavan las células diana tres veces mientras que se lavan las células NK dos veces con RPMI1640 y se resuspenden ambas en PBS al 1%/RPMI1640 y se añaden a las disoluciones de anticuerpo. Tras

15 4 horas de incubación a 37ºC en un incubador humidificado con un 5% de CO2, se cuantificó el ensayo usando el sistema de detección dependiente de fluorescencia CytoTox-One dependiente de LDH de Promega (n.º PAG7891). Se determina la señal de LDH total a partir de las células diana lisadas con Triton-X100 (LDH de la diana total) y se usa para normalizar frente a los valores experimentales ajustados al fondo de LDH espontáneo (fondo espontáneo). Por tanto, % de ADCC = ((valor experimental – fondo espontáneo)/(LDH de la diana total – LDH de la diana))*100. El fondo espontáneo es el valor obtenido de las células diana y NK incubadas conjuntamente en ausencia de anticuerpo. LDH de la diana es el valor de las células cancerosas diana solas que liberan espontáneamente LDH durante la incubación. La figura 23 muestra los resultados del ensayo de ADCC para 6 líneas celulares usando S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7, IgG1 de 4G7 (con región variable con afinidad/estabilidad optimizadas), rituximab (anticuerpo anti-CD20) y un anticuerpo control de isotipo. Para todas las

25 líneas celulares sometidas a prueba, S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 tiene un mejor rendimiento tanto en potencia como en eficacia en comparación con IgG1 de 4G7 y rituximab.

Ejemplo 10. Unión de S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 a células 293T transfectadas con CD19

Se encargó un clon de CD19 humano a Origene (n.º de catálogo SC127938) y se transfectó en células 293T. Se suspendieron las células en PBS y se sembraron en placa a 100.000 células/pocillo. Se añadió una dilución en serie de S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 a las células y entonces se incubaron las células sobre hielo durante 30 minutos y luego se lavaron 4 veces en PBS. Se diluyó 1/50 un F(ab’)2 marcado con

35 PE anti-Fab en PBS, que entonces se usó para resuspender las células 293T recubiertas con S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 anti-CD19. Se incubaron las células durante 30 minutos y se lavaron dos veces. Entonces se fijaron las células y se evaluó la unión en un citómetro de flujo FACS Canto II. La figura 24 presenta los resultados para este ensayo. Los resultados muestran que S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 se une a células 293T transfectadas con CD19 y no se une a las células control (células 293T normales).

Ejemplo 11. S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 reacciona de manera cruzada con CD19 de monos cynomolgus y rhesus.

45 Las pruebas preclínicas de fármacos en monos son normalmente una etapa importante en el descubrimiento de fármacos con el fin de evaluar la posible toxicidad. Se obtuvieron muestras de sangre de cinco monos cynomolgus (Macaca fascicularis; género = Macaca (latín) o macaco (español); especie = fascicularis) y cinco rhesus (Macaca mulatta). Se marcaron directamente con FITC S239D/I332E híbrido con estabilidad + afinidad mejoradas de 4G7 anti-CD19, IgG1 anti-CD19 (inmunogenicidad reducida, pero sin región variable con afinidad/estabilidad optimizadas), rituximab (anticuerpo anti-CD20) y control negativo (Fc potenciada, región variable que no se une). También se marcó rituximab con APC para identificar la fracción de células B de las células. Se usaron CMSP humanas como controles positivos todo el tiempo. Se preincubaron CMSP y muestras de sangre con 2 mg/ml de un anticuerpo control de isotipo con Fc potenciada para bloquear cualquier posible unión a Fc!R. En cada experimento, se incluyeron en el ensayo rituximab-APC y una de las variantes de prueba. Se realiza la detección usando un

55 citómetro de flujo FACS Canto II con fracciones de linfocitos de compuerta basándose en la dispersión frontal y lateral. Se muestran los resultados en la figura 25. El anticuerpo anti-CD19 no madurado por afinidad/estabilidad (así como su anticuerpo murino original) no reacciona de manera cruzada con CD19 de mono cynomolgus o rhesus. Variantes que tienen un aumento de unión y estabilidad de la molécula anti-CD19 permitían la reactividad cruzada de S239D/I332E híbrido con estabilidad y afinidad mejoradas de 4G7 con CD19 tanto de mono cynomolgus como de rhesus.

Ejemplo 12. ADCC de un anticuerpo anti-CD19 con función efectora potenciada con contenido en fucosa reducido

Se evaluaron anticuerpos anti-CD19 con función efectora potenciada (S239D/1332E híbrido de H1L1 de 4G7) con

65 contenido en fucosa reducido. Se utilizó la línea celular Lec13 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 49:533-545 (1986)) para expresar anticuerpos anti-CD19 con contenido en fucosa reducido. Lec13 se refiere a la línea celular

mutante de ovario de hámster chino (CHO) resistente a lecitina que presenta un metabolismo de la fucosa defectuoso y por tanto tiene una capacidad disminuida para añadir fucosa a hidratos de carbono complejos. Se describe la línea celular en Ripka & Stanley, 1986, Somatic Cell & Molec. Gen. 12(1):51-62; y Ripka et al., 1986, Arch. Biochem. Biophys. 249(2):533-545. Se cree que las células Lec13 carecen del transcrito para GDPD-manosa5 4,6-deshidratasa, una enzima clave para el metabolismo de la fucosa. Ohyama et al., 1988, J. Biol. Chem. 273(23): 14582-14587. GDP-D-manosa-4,6-deshidratasa genera GDP-manosa-4-ceto-6-D-desoximanosa a partir de GDPmanosa, que entonces se convierte mediante la proteína FX en GDP-L-fucosa. La expresión de oligosacáridos fucosilados depende de los sustratos donadores de GDP-L-fucosa y fucosiltransferasa(s). La línea celular Lec13 CHO es deficiente en su capacidad para añadir fucosa, pero proporciona IgG con oligosacárido que por lo demás es similar al encontrado en líneas celulares de CHO normales y a partir de suero humano (Jefferis, R. et al., 1990, Biochem. J. 268, 529-537; Raju, S. et al., 2000, Glycobiology 10, 477-486; Routier, F. H., et al., 1997, Glycoconj. J. 14, 201-207). Células HEK293 y CHO normales añaden fucosa a oligosacárido de IgG en un alto grado, normalmente del 80-98%, y las IgG a partir de los sueros están también altamente fucosiladas (Jefferis, R. et al., 1990, Biochem J. 268, 529-537; Raju, S. et al., 2000, Glycobiology 10, 477-486; Routier, F. H., et al., 1997,

15 Glycoconj. J. 14, 201-207; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277(90):26733-26740). Está bien establecido que anticuerpos expresados en células Lec13 transfectadas producen de manera sistemática hidrato de carbono fucosilado a aproximadamente el 10% (Shields et al., 2002, J Biol Chem 277(90):26733-26740).

Se realizaron ensayos de ADCC con células RS4;11 y MEC-1 usando anticuerpos anti-CD19 con y sin variantes con función efectora potenciada y con y sin fucosilación reducida. La figura 26 muestra los resultados de estos ensayos de ADCC. Tanto la potencia como la eficacia de ADCC son similares para anticuerpo anti-CD19 con modificaciones de aminoácidos (4G7_H1L1_híbrido_239D/1332E + fucosa) e IgG1 anti-CD19 con contenido en fucosa reducido (4G7_H1L1_IgG1_TN-fucosa). Se aumenta adicionalmente la potencia de ADCC combinando la modificación de aminoácidos con el contenido en fucosa reducido (4G7_H1L1_híbrido_239D/332E-fucosa). (Figura 26). Este

25 experimento ilustra por tanto que pueden usarse combinaciones de modificaciones de aminoácidos y glicoformas modificadas para optimizar anticuerpos anti-CD19 para propiedades de función efectora.

El uso de la línea celular Lec13 no pretende limitar la presente invención a ese modo particular de reducción del contenido en fucosa. Se conocen en la técnica una variedad de otros métodos para controlar el nivel de oligosacáridos fucosilados y/o bisectados que se unen covalentemente a la región Fc, incluyendo, pero sin limitarse a, expresión en diversos organismos o líneas celulares, modificados por ingeniería genética o de otra forma (por ejemplo, células Lec13 CHO o células YB2/0 de hibridoma de rata), regulación de enzimas implicadas en la ruta de glicosilación (por ejemplo FUT8 [&1,6-fucosiltranserasa] y/o %1-4-N-acetilglucosaminil-transferasa III [GnTIII]), y modificación de hidratos(s) de carbono de modificación tras haberse expresado la IgG (Umaña et al., 1999, Nat

35 Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74-288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; Yamane-Ohnuki et al., 2004, Biotechnology and Bioengineering 87(5):614-621); (documentos US 6.602.684; US 2003/0157108; US 2003/0003097; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1).

El uso de modificaciones particulares para potenciar la función efectora, por ejemplo las sustituciones 239D y 332E y el nivel de fucosa reducido, no pretenden restringir los anticuerpos anti-CD19 a estas modificaciones particulares. Tal como se describió anteriormente en la sección titulada “Modificaciones para optimizar la función efectora”, se da a conocer un gran número de modificaciones, incluyendo modificaciones de aminoácidos y glicoformas modificadas, para anticuerpos anti-CD19 para mejorar sus propiedades de función efectora.

45 Ejemplo 13. Anticuerpos anti-CD19 inhiben la proliferación de células B primarias -aplicaciones de anticuerpos anti-CD19 para tratar enfermedades autoinmunitarias

Se muestra a modo de ejemplo la capacidad de los anticuerpos anti-CD19 dados a conocer en el presente documento para reducir células B a través de la función efectora de ADCC mediante su capacidad para lisar una variedad de líneas celulares representativas de una gama de linajes de células B, tal como se muestra en los ejemplos anteriores. Esta función está mediada por células efectoras tales como células NK y macrófagos que expresan Fc!R, cuyo desencadenamiento induce lisis de las células diana recubiertas con CD19. También puede estar mediado un mecanismo de acción adicional frente a células B activadas por antígeno. La activación por

55 antígeno de células B puede imitarse mediante el uso de anticuerpos frente al receptor de células B (BCR). Esto conduce a su proliferación en cultivo, una medida genérica de la activación.

La unión a antígeno puede imitarse in vitro reticulando BCR (mu o IgM) con anticuerpo anti-mu (anti-), anti-IgM). Con el fin de demostrar esta actividad, se prepararon células mononucleares de sangre periférica (CMSP) a partir de un paquete de leucoforesis mediante gradiente de densidad de Ficoll, y se purificaron células B humanas primarias a partir de CMSP usando un kit de selección negativa magnético adquirido de Miltenyi Biotec. Se realizó el ensayo de proliferación en medio FBS al 10%/RPMI1640 en un total de 100 ul de volumen en placas de microtitulación de 96 pocillos por triplicado. Se indujo la activación de células B usando el fragmento F(ab’)2 de anticuerpo de cabra antimu (Jackson Immunoresearch, Inc.). En 50 ul de medio, se extrajeron alícuotas de diluciones en serie del anticuerpo 65 anti-mu en una placa de microtitulación de 96 pocillos, a la que se añadieron 83.000 células B purificadas en 50 ul de volumen. Entonces se incubó la placa de microtitulación a 37ºC durante 3 días tras lo cual se usó un formato de

ensayo de ATP-luminiscencia (kit Cell TiterGlo de Promega) para detectar las células vivas usando un luminómetro. La figura 30a muestra que hay una dependencia de la dosis de la proliferación de células B con respecto a la concentración de anticuerpo anti-mu.

5 Con el fin de evaluar la capacidad de los anticuerpos anti-CD19 TN (4G7_H3_L1 IgG1_TN) y variante (4G7_H3_L1_híbrido_239D/332E) para modular la proliferación de células B, se llevó a cabo un ensayo para monitorizar la viabilidad de células B humanas primarias en presencia de anticuerpo anti-CD19 y anti-mu coestimulante. Tal como se describió anteriormente, se prepararon CMSP a partir de un paquete de leucoforesis mediante gradiente de densidad de Ficoll, y se purificaron células B humanas primarias a partir de CMSP usando

10 selección negativa magnética. Se realizó el ensayo de proliferación en medio FBS al 10%/RPMI1640 en un total de 100 ul de volumen en placas de microtitulación de 96 pocillos por triplicado. Para inducir la activación de células B, se usó el fragmento F(ab’)2 de anticuerpo de cabra anti-mu. En 50 ul de medio, se realizó una concentración fijada (2 mg/ml) de anticuerpo anti-mu con diluciones en serie de cinco veces de los anticuerpos en una placa de microtitulación de 96 pocillos, a la que se añadieron 100.000 células B purificadas en 50 ul de volumen. Entonces se

15 incubó la placa de microtitulación a 37ºC durante 3 días tras lo cual se usó un formato de ensayo de ATPluminiscencia para detectar las células vivas usando un luminómetro.

Los resultados, proporcionados en la figura 30b, muestran que el anticuerpo anti-CD 19 TN no tiene ningún efecto sobre la proliferación de células B primarias, similar al control negativo con anticuerpo anti-CD30 (CD30 no se

20 expresa en células B). En cambio, el anticuerpo anti-CD19 que comprende modificaciones de Fc, tiene actividad inhibidora significativa contra la viabilidad de células B. De manera notable, la señalización in vitro como resultado de la reticulación del anticuerpo anti-mu imita el acoplamiento a antígeno de BCR, y es un sustituto para el acoplamiento a BCR por el autoantígeno en un entorno autoinmunitario clínico.

25 La patogénesis de la mayoría de las enfermedades autoinmunitarias está acoplada a la producción de autoanticuerpos contra antígenos propios, lo que conduce a una variedad de patologías asociadas. Por ejemplo, LES se caracteriza por la producción de auto-anticuerpos o anticuerpos propios frente a ADN bicatenario. Por consiguiente, en el experimento descrito anteriormente, el acoplamiento a BCR in vitro por anticuerpo anti-mu imita la estimulación de células B en pacientes con lupus in vivo mediante anticuerpos anti-ADN bicatenario. Se producen

30 autoanticuerpos por células plasmáticas diferenciadas de manera terminal que se derivan de células B vírgenes o de memoria. Además, las células B pueden tener otros efectos sobre la patología autoinmunitaria, como células presentadoras de antígeno (APC) que pueden interaccionar con y estimular células T auxiliares, estimulando adicionalmente el ciclo de respuesta anti-autoinmunitaria. Dada la expresión de CD19 en la mayor parte del linaje de células B, oscilando entre células pre-B y células plasmáticas, los anticuerpos de esta invención pueden tener una

35 amplia utilidad para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. Los ejemplos de tales enfermedades autoinmunitarias incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES o lupus), esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren y púrpura trombocitopénica idiopática (PTI).

El presente ejemplo demuestra que los anticuerpos anti-CD19 tal como se da a conocer en el presente documento

40 pueden inhibir sustancialmente la proliferación de células B de una manera dependiente de la dosis, lo que indica que pueden inhibir la activación de células B estimulada por antígeno. La activación de células B por antígeno también puede iniciar el proceso de cambio de clase y en última instancia la diferenciación terminal en células plasmáticas secretoras de anticuerpos. Por tanto, los anticuerpos tal como se da a conocer en el presente documento pueden inhibir estos procesos mediante un mecanismo de acción adicional que no requiere células

45 efectoras. Se espera que esta inhibición tenga un efecto beneficioso sobre la enfermedad autoinmunitaria impidiendo la diferenciación terminal de poblaciones de células B vírgenes y de memoria, impidiendo así la diferenciación de células plasmáticas secretoras de autoanticuerpos. También es posible que aspectos adicionales de la biología de células B tales como la presentación de antígeno se vean afectados por los anticuerpos anti-CD19.

50 gt; Alotipo G1m(a,z) de IgG1 (SEQ ID NO: 80)

gt; Alotipo G1m(a,x,z) de IgG1 (SEQ ID NO: 81)

gt; Alotipo G1m(f) de IgG1 (SEQ ID NO: 82)

gt; Alotipo G1m(a,f) de IgG1 (SEQ ID NO: 83)

gt; Alotipo G2m(n+) de IgG2 (SEQ ID NO: 84)

15 gt; Alotipo G2m(n-) de IgG2 (SEQ ID NO: 85) gt; S239D/I332E híbrido de H1 de 4G7 (SEQ ID NO: 86)

gt; S239D/I332E híbrido de H1.52 de 4G7 (SEQ ID NO: 87)

gt; S239D/I332E híbrido de H1.78 de 4G7 (SEQ ID NO: 88)

gt; S239D/I332E híbrido de H1.191 de 4G7 (SEQ ID NO: 89)

gt; S239D/I332E híbrido de H1.192 de 4G7 (SEQ ID NO: 90)

10 gt; S239D/I332E híbrido de H1.196 de 4G7 (SEQ ID NO: 91)

gt; S239D/I332E híbrido de H1.201 de 4G7 (SEQ ID NO: 92)

gt; S239D/I332E híbrido de H1.202 de 4G7 (SEQ ID NO: 93)

gt; S239D/I332E híbrido de H1.203 de 4G7 (SEQ ID NO: 94)

gt; S239D/I332E híbrido de H1.204 de 4G7 (SEQ ID NO: 95)

gt; L1.26 de 4G7 (SEQ ID NO: 97)

gt; L1.32 de 4G7 (SEQ ID NO: 98)

15 gt; L1.64 de 4G7 (SEQ ID NO: 99)

gt; L1.68 de 4G7 (SEQ ID NO: 100)

gt; L1.96 de 4G7 (SEQ ID NO: 101)

gt; L1.145 de 4G7 (SEQ ID NO: 102)

gt; L1.148 de 4G7 (SEQ ID NO: 103)

15 gt; L1.149 de 4G7 (SEQ ID NO: 104)

gt; L1.154 de 4G7 (SEQ ID NO: 105)

gt; L1.155 de 4G7 (SEQ ID NO: 106) gt; L1.160 de 4G7 (SEQ ID NO: 107)

gt; L1.162 de 4G7 (SEQ ID NO: 108)

gt; L1.163 de 4G7 (SEQ ID NO: 109)

15 gt; L1.164 de 4G7 (SEQ ID NO: 110)

gt; D55A de CDR2 de VH de 4G7 (SEQ ID NO: 111)

YINPYNAGTKYNEKFKG gt; T57P de CDR2 de VH de 4G7 (SEQ ID NO: 112)

25 YINPYNDGPKYNEKFKG gt; K58E de CDR2 de VH de 4G7 (SEQ ID NO: 113) YINPYNDGTEYNEKFKG

gt; D55S de CDR2 de VH de 4G7 (SEQ ID NO: 114) YINPYNSGTKYNEKFKG

gt; D55E de CDR2 de VH de 4G7 (SEQ ID NO: 115) YINPYNEGTKYNEKFKG

gt; S100T de CDR3 de VH de 4G7 (SEQ ID NO: 116) GTYYYGTRVFDY gt; R100dS de CDR3 de VH de 4G7 (SEQ ID NO: 117) GTYYYGSSVFDY gt; S100cT/R100dS de CDR3 de VH de 4G7 (SEQ ID NO: 118)

GTYYYGTSVFDY gt; L27cQ de CDR1 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 119) RSSKSLQNSNGNTYLY gt; L27cQ/S27eV de CDR1 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 120) RSSKSLQNVNGNTYLY

gt; S27eV de CDR1 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 121) RSSKSLLNVNGNTYLY gt; G29A de CDR1 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 122) RSSKSLLNSNANTYLY gt; L27cQ/S27eV/G29A de CDR1 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 123)

RSSKSLQNVNANTYLY gt; S27eA de CDR1 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 124) RSSKSLLNANGNTYLY gt; L27cQ/S27eA/G29A de CDR1 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 125) RSSKSLQNANANTYLY

gt; G29S de CDR1 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 126) RSSKSLLNSNSNTYLY gt; L27cQ/S27eA/G29S de CDR1 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 127) RSSKSLQNANSNTYLY gt; L27cQ/S27eA de CDR1 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 128)

RSSKSLQNANGNTYLY gt; A55N de CDR2 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 129) RMSNLNS gt; F96I de CDR3 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 130) MQHLEYPIT

gt; F96N de CDR3 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 131)

MQHLEYPNT gt; CDR1 de VH de 4G7 (SEQ ID NO: 132): SYVMH

gt; CDR2 de VH de 4G7 (SEQ ID NO: 133): YINPYNDGTKYNEKFKG gt; CDR3 de VH de 4G7 (SEQ ID NO: 134): GTYYYGSRVFDY

10 gt; CDR1 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 135): RSSKSLLNSNGNTYLY gt; CDR2 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 136): RMSNLAS gt; CDR3 de VL de 4G7 (SEQ ID NO: 137): MQHLEYPFT

gt; CDR1 de VH de HD37 (SEQ ID NO: 138): SYWMN gt; CDR2 de VH de HD37 (SEQ ID NO: 139): QIWPGDGDTNYNGKFKG

20 gt; CDR3 de VH de HD37 (SEQ ID NO: 140): RETTTVGRYYYAMDY gt; CDR1 de VL de HD37 (SEQ ID NO: 141): KASQSVDYDGDSYLN gt; CDR2 de VL de HD37 (SEQ ID NO: 142): DASNLVS

gt; CDR3 de VL de HD37 (SEQ ID NO: 143): QQSTEDPWT

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   1. Anticuerpo que se une a CD19, que comprende

   una CDR1 de cadena pesada, una CDR2 de cadena pesada y una CDR3 de cadena pesada representadas en SEQ ID NO: 40; y

   una CDR1 de cadena ligera, una CDR2 de cadena ligera y una CDR3 de cadena ligera representadas en SEQ ID NO: 58, en el que la numeración es según Kabat.

2. 2.

   Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicha cadena pesada comprende SEQ ID NO: 40.

3. 3.

   Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicha cadena ligera comprende SEQ ID NO: 58.

4. 4.

   Anticuerpo según la reivindicación 1, en el que dicha cadena pesada comprende SEQ ID NO: 40 y dicha secuencia de cadena ligera comprende SEQ ID NO: 58.

5. 5.

   Anticuerpo según una de las reivindicaciones 1-4, que comprende además un dominio Fc que tiene sustitución de aminoácido de S239D, en comparación con SEQ ID NO: 7, en el que la numeración es según el índice EU como en Kabat.

6. 6.

   Anticuerpo según una de las reivindicaciones 1-4, que comprende además un dominio Fc que tiene sustitución de aminoácido de I332E, en comparación con SEQ ID NO: 7, en el que la numeración es según el índice EU como en Kabat.

7. 7.

   Anticuerpo según una de las reivindicaciones 1-4, que comprende además un dominio Fc que tiene sustituciones de aminoácido de S239D e I332E, en comparación con SEQ ID NO: 7, en el que la numeración es según el índice EU como en Kabat.

8. 8.

   Composición que comprende una pluralidad de anticuerpos glicosilados según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que aproximadamente el 80-100% del anticuerpo glicosilado en la composición comprende una estructura de hidrato de carbono central madura que carece de fucosa.

9. 9.

   Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un portador farmacéuticamente aceptable.

10. 10.

    Ácido nucleico que codifica para una secuencia de cadena pesada y una secuencia de cadena ligera variable según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

11. 11.

    Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste en linfomas no Hodgkin (LNH), leucemia linfocítica crónica (LLC), linfoma/leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) y linfoma de células del manto (LCM).

12. 12.

    Anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, para su uso en el tratamiento de una enfermedad o un trastorno seleccionado del grupo que consiste en artritis reumatoide (AR), lupus eritematoso sistémico (LES o lupus), esclerosis múltiple, síndrome de Sjogren y púrpura trombocitopénica idiopática (PTI).