PT88641B - Metodo para a preparacao de uma variante de adesao - Google Patents

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de novos derivados de proteínas de superficie celular homólogos da superfamilia de imunoglobu linas (adesões). São introduzidas variações na sequência de aminoácidos de adesão, as mais importantes das quais são aque las em que os domínios transmembranar e, de preferência, cito plãsmico se tornaram funcionalmente inactivos e em que domi nios extracelulares de adesão substituem uma região variável

GENENTECH, INC.

MÉTODO PARA A PREPARAÇAO DE UMA VARIANTE DE ADESAO

de imunoglobulina. Estas variantes são uteis na terapia ou diagnóstico, em particulra variantes de CD4 são terapêutica mente úteis no tratamento de infecçOes comHIV. Mais concretamente o presente invento diz respeito a um método para a preparação de um variante de adesão que compreende a transfecção de uma célula hospedeira com um ácido nucleico que codifica uma variante da sequência de aminoácidos de uma adesão. E igualmente referido o processo para preparar este ácido nu cleico por mutação especifica de sítio.

3Variantes de adheson

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Isto ê uma Cont/nuaçjão^em parte da U.S.S.N 07/104,329 entregue a 2 de Outubro de 1987.

Fundamento do invento

Este pedido relaciona-se com composições para terapia antiviral ou imunomoduladora. Em particular, está relacionado com composições úteis no tratamento de infecções pelo Vírus da Imunodeficiencia Humana (HIV).

A principal anormalidade imunológica resultante da infecção pelo HIV ê o desaparecimento progressivo e inibição dos linfócitos T expressando a glicoprotel na CD4 da superfície celular (H. Lane et al., Ann. Rev. Immunol. /: ⁴⁷⁷ /1985/). CD4 é uma glicoprcteína não polimórfica com hcmologia relativamente à superfamília de genes da imunoglobulina (P. Maddon et al., Cell 42: 92 /1985/). Juntamente com o antigénio de superfície CD8, CD4 define duas subsêriès distintas de células T periféricas maduras (E. Reinherz et al. Cell 19: 821 /1980/), que se distinguem pela sua capacidade para interactuar com alvos antigênicos nominais no cantexto dos antigénios de complexo major de fuste-compatibilidade (MHC) classe I e classe II, respectivamente (S. Swain, Proc. Natl. Acad. Sei: 78: 710/1981/; E., Engleman et al., J. Immunol. /27 2124 /1981/; H. Spitz et a/., J. Immtinol. 129: 1563 /1982/;

W. Biddison et al., J. Exp. Med. 156: 1065 /1982/; e D. Wilde et al., J. Immunol. 131: 2178 /1983/). De um modo geral, as células T CD4 apresentam o fenótipo de células T ^1,helper'7indutor (e. Reinherz, supra), se bem que tabém tenham sido iden-4-

tifiçadas células T CD4 caracterizado como células T citotóxicas/supressoras (Y. Thomas et al., J. Exp. Med. 154:459 /19817; S. Meuer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79; 4395 /1982/; θ A. Krensky et aj_., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79: 2365 /19827) A perda pelas células T CD4 da função helpar’7indutora estã provávelmente na base dos profundos defeitos da imunidade celular conducentes às infecções oportunísticas e doenças malignas características da síndroma da imunodeficiência adquirida (AIDS) (H. Lane supra).

Estudos acerca da infecção pelo HIV de células T fraccionadas CD4 e CD8 de dadores normais e de pacientes com AIDS revelaram que a deplecão de células T CD4 resulta da capacidade do HIV-I em infectar selectivamente, replicar-se e finalmente destruir esta subsêrie de linfócitos T (D. Klatzmann et al., Science 225: 54 /19847). A possibilidade de o próprio CD4 ser um componente essencial do receptor celular para 0 HIV-I foi inicialmente indicado pela observação de que anticorpos monoclonais dirigidos contra CD4 bloqueiam a infecção pelo HIV-I e a indução de sincícios (A. Dalgleish et al., Nature /London/ 312: 767 /19847; J. Mc Dougal et al.,

J. Immunol. 135: 3151 /19857). Esta hipótese tem sido confirmada pela demonstração de que se forma um complexo molecular entre CD4 e gp120, a principal glicoproteína do invólucro de HIV-I (J. McDougal etaL, Science 231: 382 /19867; e a observação de que o tropismo do HIV-I pode ser conferido a células humanas normalmente não permissivas seguindo a expressão estável de um cDNA de CD4 (P. Madden et aj_., Cel 47: 333 /19867). Ainda, as propriedades neurotrópicas do HIV-I, reflectidas por uma elevada incidência de perturbações do sistema nervoso central em indivíduos infectados com HIV-I (W. Snider et al., Ann. Neurol. 14: 403 /19837) e a capacidade para detectar HIV-I no tecido de cérebro e fluido cerebrospinal de doentes com AIDS (G. Shaw et al., Science 227; 177 /1985.7; L. Epstein, AIDS res. 1: 447 /19857; S. Koenig, Science 233: 1089 /19867; θ- Ho et al., N. Engl. J. Med. 313: 1498 /19857; J. Levy et al., Lancet II: 586 /1985/), parece ter a sua explicação na expressão de

CD4 em células neuronais, de glia e de monócitos/macrôfagos (P. Maddon, Cel 47: 444 /19867; I. Funke et al., J Exp. Med.

165: 1230 /19807; B. Tourvieille et al., Science 234: 610 /1986/).

Além da determinação da susceptibilidade à infecção pelo HIV-I, a manifestação de efeitos na célula hospedeira infectada parece envolver CD4. Anticorpos contra CD4 inibem a fusão de células T CD4 não infectadas com células infectadas pelo HIV-I in vitro; mais, as células multinucleadas gigantes produzidas por este acontecimento morrem pouco depois de se terem formado resultando na depleção da população de células GD4 (d. Lífson et al., Science 232: 1123 /1986/). A formação de sincícios também requere a expressão de gp120 e pode ser induzida pela cocultura de linhas celulares positivas para CD4 com linhas celulares que expressem o gene env de HIV-I na ausência de outras proteínas virais estructurais ou reguladoras (J. Sodrôski et al., Nature 322: 470 /1986/ J. Lifson et al., Nature 322: 725 /1986/). Assim, ao mediar a infecção inicial pelo HIV-I e a eventual morte celular, a interacção entre gp120 e CD4 constitui um dos vários pontos de entrada críticos no ciclo de vida virai acessível à intervenção terapêutica (H. Mitsuya et al., Nature' 325: 773 ./1987/).

A sequência conhecida do precursor de CD4 prevê um peptídeo sinal hidrofóbico,· numa região extracelular de aproximadamente 370 aminoácidos, um segmento altamente hidrofõbico com identidade significativa com o domínio que penetra a membrana da cadeia beta de MHC classe II e uma sequência intracelular altamente carregada de 40 resíduos (P. Madden, Cell 42: 93/1985/). 0 domínio extracelular de CD4 consiste em quatro regiões contíguas cada uma tendo semelhança de aminoácidos e estrutural com os domínios variável e de ligação (V-J) das cadeias livres das imunoglobulinas assim como regiões relacionadas noutros membros da superfamí1 ia de genes de imunoglobulinas (uma subclasse dos quais aqui ê definida pelo termo ,adhesons. Estas regiões estruturalmente se-6*>* ^Λ' \

melhante de CD4 são designados domínios V^Jp ^2^2’ ^3^3 ^e V₄J₄ (denominados 1-4 na Fig. 3).

Uma estratégia útil no desenvolvimento de drogas para o tratamento de muitas anormalidade mediadas por receptores tem sido a identificação de antagonistas que bloqueiam a ligação do ligando natural. Uma vez que a adheson CD4 geralmente se liga aos sítios de reconhecimento do invólucro de HIV parece ser um candidato ao sequestro terapêutico destes sítios de HIV, bloqueando assim a infecciosidade virai. No entanto, CD4 de tamanho completo e outras adhesons são proteínas da membrana celular que estão ancoradas â bicamada Iípidica dos linfócitos. A presença de componentes de membranas será indesejável do ponto de vista de fabrico e purificação. Em adição, uma vez que as adhesons estão normalmente presentes apenas nas superfícies celulares, seria desejável produzir adhesons numa firma que fosse mais estável na circulação. Em adição, mesmo truncada, a adheson CD4 solúvel (geralmente referida como CD4T) pode não ser ôptimamente eficaz como terapêutica uma vez que possui uma semi-vida biológica relativamente curta, liga-se ao HIV não melhor que CD4 da superfície celular, pode não atravessar a placenta ou outras barreiras biológicas e uma vez que sequestra meramente os locais de reconhecimento do HIV em si próprio ser portador de uma função que mate a célula infectada ou o vírus.

Deste modo, constitui um objectivo deste invento produzir adhesons solúveis secretadas. E um outro objectivo produzir derivados de CD4 úteis no tratameii to de AIDS e estados relacionados, de um modo essencialmente não afectado pelo grau extremo de variação genética observada entre vários isolados de HIV-I e seus respectivos polipeptí:.deos env (J. Coffin, Cell 46: 1 /19867). Ainda um outro objectivo é preparar adhesons fundidas a outras polipeptídeos de modo a proporcionar moléculas com novas funções tais como as descritas acima para uso terapêutico ou reagentes de diagnóstico para o ensaio in vitro das adhesons ou seus ligandos.

Em particular, um dos objectivos ê preparar moléculas para dirigir toxinas ou moléculas efectoras (por exemplo o domínio Fc da imunoglobulina) para células portadoras de receptores das adhesons, e.g. HIV gp120 no caso de CD4 e para usar na purificação das adhesons. Constitui ainda um objectivo propor cionar, preparações de adheson altamente purificadas.

Sumário

Os objectivos deste invento são conseguidos através da obtenção de ácidos nucleicos codificadores de uma variante da sequência de aminoácidos de um adhesos, em particular uma variante em que o domínio transmembranar seja modificado de modo a não poder mais integrar-se na membrana celular, i.e. inactivado, por exemplo, por deleção ou substituição. No caso de CD4 tais variantes são designadas CD4.

As variantes de adheson são produzidas por um método compreendendo (a) transformação de uma célula hospedeira com ácido nucleico codificante de uma variar^ te da sequência de aminoácidos de uma adheson, (b) cultura da célula hospedeira e (c) recuperação da adheson variante a partir do meio de cultura da célula hospedeira.

Numa outra execução os objectivos deste invento são conseguidos proporcionando uma variante de adheson seleccionada do grupo consistindo em (a) uma variante da sequência de aminoácidos de adheson tendo um domínio transmembranar inactivado e (b) um polipeptídeo compreendendo um domínio extracelular de adheson fundido à sequência de um polipeptídeo que ê diferente da adheson, esta última ser[

do seleccionada entre uma citotoxina, um imunogênio ou um domínio constante de imunoglobulina.

Numa execução preferida um polipe£ tídeo compreendendo um domínio de ligação a gp120 da adheson CD4 ê fundido no seu extremo C a um domínio constante de imunoglobulina ou é ligado a um polipeptideo citotóxico, como seja o ricino.

As variantes de adheson CD4 aqui proporcionadas são purificadas e formuladas em veículos farmacológicamente aceitável para administração a pacientes necessitados de terapia antiviral ou imunomoduladora, em particular, pacientes infectados com HIV.

Breve descrição dos desenhos

As Figs. 1a-1c descrevem a sequência de aminoácidos e de nucleotídeos de uma forma secretada da adheson CD4 (CD4T). Outras formas de CD4T terminam em Ser 366 ou Pro 368. 0 sítio de processamento do sinal está asinalado com uma seta.

As Figs. 2a-2c descrevem a sequência da aminoácidos e a sequência de nucleotídeos de uma fusão do condutor de gD de herpes e os 27 resíduos N-terminais com o extremo N maduro putativo de CD4T.

A Fig. 3 descreve os elementos estruturais de antigénio CD4 nativo e solúvel, a cadeia pesada (γ) nativa da imunoglobulina G e dois exemplos de quimeras da cadeia pesada de CD4.

As Figs. 4a-4b são um mapa do fraq mento da cadeiarda imunoglobulina empregue na preparação de fusão CD4. Os sítios de inserção são designados r1 e Fc.

A Fig. 5 ê um mapa do fragmento da cadeia leve humana útil nas fusões de CD4 na seta ladeada por V_kd_k (variável leve e de ligação) e C_k (constante leve).

Descrição detalhada

Adhesons são polipeptídeos da superfície celular tendo um domínio extracelular que é homólogo de um membro da superfamília de genes da imunoglobulina, excluindo, no entanto, membros altamente polimórficos desta superfamília seleccionados de grupo dos antigénios major de histocompatibi1 idade classe I e classe II imunoglobulinas e cadeias ρ , γ e dos receptores de células T. Exemplos de adhesons incluem GD2, CD4, CD8, CD28, as cadeias γ,g e ede CD3, OX-2, Thy-1, as moléculas de adesão intracelulares ou de células neuronais (I-CAM ou N-CAM), proteína neurocitoplasmãtica (NCP-3), receptor de poli-Ig, glicoproteína associada à mielina (MAG), receptor de alta afinidade para IgE, a principal glicoproteína da mielina periférica (Po), receptor do factor de crescimento derivado de plaquetas, receptor 1 do factor de estimulação de coLónias, receptor de Fc de macrófagos, receptores de Fc gama e antigénio carcinoembrionârio. Homólogo como aqui é definido significa ter a sequência de um membro^ da superfamília de genes da imunoglobulina ou ter uma sequência que tenha substancialmente a mesma homologia (ou um grau superior) da sequência de aminoãcidos relativamente a um membro conhecido da superfamília tal como os exemplos específicos

-10referidos atrãs para a sequência de um domínio variável ou : constante da imunoglobulina. As adhesons preferidas são CD4, CD8 e receptor de alta afinidade para IgE.

Este invento diz particularmente respeito às variantes de sequência de aminoãcidos de adhesons As variantes da sequência de aminoãcidos de adhesons são pre paradas tendo vários objectivos em mente, incluindo o aumento da afinidade da adheson para o seu parceiro de ligação, facilitando a estabilidade, purificação e preparação de adhexon, aumentando a sua semi-vida no plasma, melhorando a sua eficácia terapêutica como descrito atrás no fundamento, introduzindo funções adicionais e diminuindo a gravidade ou ocorrência de efeitos secundários durante a utilização de terapêutica da adheson. As variantes da sequência de aminoácidos de adheson caem numa classe ou numa combinação das classes que se seguem: variantes de inserção, substituição ou delecção.

Os variantes de inserção da sequên cia de aminoãcidos são aqueles em que um ou mais resíduos de aminoácidos estranhos à adheson são introduzidos num sítio predeterminado na adheson incluindo os extremos C ou N. Tais variantes são referidos como fusões da adheson e produz-se num polipeptídeo diferente. Tais polipeptídeos contêm sequências diferentes das normalmente encontradas na .adheson na posição da inserção. São aqui incluídos vários grupos de fusão. Fusões de adheson imunológicamente activas compreendem uma adheson e um polipeptídeo contendo um epítopo ser ser de adheson. 0 epítopo que não ê de adheson ê qualquer polipejD tídeo imunológicamente competente, i.e., qualquer polipeptídeo que seja capaz de induzir uma resposta imune no animal a que vai ser administrada a fusão ou que ê capaz de ser ligado por anticorpo induzido contra o polipeptídeo que não ê de adheson Epitopos típicos que não sejam de adheson são os incluídos em alergénios, epitopos auto-imunes ou outros imunogénios ou antigénios fortes reconhecidos por anticorpos prê-existentes

-11no recipiente da fusão, incluindo polipeptídeos bacterianos tais como trpLE, beta-galactosidase, polipeptídeos rivais tais como proteína gD de herpes e similares. As fusões imunogénicas são produzidas por ligação cruzada in vitro ou por culturas de células recombinantes transformadas com DNA codificador de um polipeptídeo imunogênico. E preferível que a f£ são imunogênica seja uma em que a sequência imunogênica ê ligada ou inserida no antigénio de adheson ou seu fragmento por uma ligação peptidica linear contendo epítodos de adhe son e pelo menos um epitopo estranho à adheson. Compreen der-se-â que está no âmbito deste invento introduzir os epíto pos algures dentro da molécula de adheson ou seu fragmento. Tais fusões são convenientemente feitas em células hospedei ras recombinantes ou pelo uso de agentes de ligação cruzada bifuncionais. 0 uso de um agente de ligação cruzada para fundir a adheson ao polipeptídeo imunogênico não ê tão desejável como uma fusão linear devido aos produtos da ligação cruzada não serem fãcilmente sintetizados numa forma estruturalmente homogénea.

Estas inserções imiinogênicas são particularmente úteis quando formuladas num veículo farmacológicamente aceitável e administradas a um individuo de modo a induzir anticorpos contra a adheson, anticorpos esses que por sua vez são úteis em diagnóstico ou na purificação de adheson por técnicas de imunoafinidade conhecidas per se.Como alternativa, na purificação de adhesons, os parceiros da ligação para o polipeptídeo que não seja de adheson fu£ dido, e.g. anticorpos, receptores ou ligandos, são usados pa^ ra adsorver a fusão inserida em misturas impuras, após o que a fusão ê eluida e, caso se pretenda, a adheson ê recuperja da da fusão, e.g. por clivagem enzimática.

Outras fusões, que podem ou não s ser também imunológicamente activas, incluem fusões da sequência de adheson com uma sequência sinal heteróloga rela_ tivamente à adheson, fusões de adhesons CD4 modificadas

no domínio transmenbanar, por exemplo, a polipeptídeos tendo uma semi-vida no plasma aumentada(geralmente maior que aproximadamente 20 horas) tais como cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos e fusões com funções citotóxicas. As fusões com sequência sinal são empregues para digirir de modo mais expedito a secreção, da adheson. 0 sinal heterólogo substitui o sinal de adheson nativo e quando a fusão resultante é reconhecida, i.e. processada e clivada pela célula hospedej_ ra, a adheson ê secretada. Os sinais são seleccionados com base na célula hospedeira que se pretende e podem incluir sequências bacterianas, de leveduras, de mamíferos e virais. 0 sinal da glicoproteína gD de herpes ê adequado ao uso em sistemas de expressão de mamíferos.

Proteínas do plasma que possuem semi-vida no plasma aumentada superior â de CD4 modificada no domínio transmembranar, incluem albumina do soro, imunoglobulinas, apolipoproteínas e transferrina. De preferência, a fusão de adheson - proteína do plasma não ê significativamente imunogêniea no animal em que ê usada e a proteina do plasma não provoca efeitos secundários indesejáveis em pacientes devido â sua actividade biológica normal.

Numa execução especifica o domínio constante da adheson e/ou domínio tipo região variável ê conjugado com uma sequência da região constante da imunoglobu_ lina. Os produtos resultantes são aqui referidos como immunoadhesons. São conhecidas as imunoglobulinas e certas va riantes delas e muitas foram preparadas em cultura de cêlu las recombinantes. Por exemplo, ver Patente U.S. 4.745.055;

EP 256.654; Faulkner et aj.., Nature 298:286 (1982); EP 120,694; EP 125.023; Morrison, J. Immun, 123:793 (1979); Kõhler et al, P.N.A.S. USA 77:2197 ( 1980); Raso et aJL, Câncer Res. 4J_:2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2:239 (1984); Morrison, Science 229:1202 ( 1985); Morrison et al., P.N.A.S.' USA 8_1_:6851 ( 1984); EP 255.694; EP 266.663; e W0 88/03559. Também são conhecidas cadeias de imunoglobulinas reordenadas.

Ver por exemplo patente U.S. 4 444 878; WO 88/03565; e EP

763 e referências alicitadas.

Geralmente os domínios das adhesons que são homólogos dassimunoglobulinas e extracelulares no seu ambiente nativo são fundidas no extremo C ao extremo N da região constante das imunoglobulinas em vez da região variável, mantendo pelo menos charneira funcionalmente activa, domínios CH2 e CH3 da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Isto ê geralmente conseguido construindo a sequência de DNA adequada e expressando-a em cultura de células recombinantes. As imunoglobulinas e outros polipeptídeos tendo semi-vida no plasma aumentada são fundidos aos domínios extrecelulares ou de ligação de ligandos de outros adheson de modo semelhante.

Os domínios fronteiriços para as regiões tipo V de CD4 (V1-V4) são, respectivamente, aproximadamente 100-109, aproximadamente 175-184, aproximadamente 289-298 e aproximadamente 360-369 (baseado na sequência de aminoâcidos de precursor CD4 em que a met inicial ê -25; Fig 1a).

As sequências de CD4 contendo qualquer um dos domínios V de CD4 são fundidas à sequência de imunoglobulina. E preferível que a V1V2 ou V1V2V3V4 seja fundida no seu extremo C à região constante do imunoglobulina. 0 sítio preciso em que a fusão é feita não ê crítico; os domínios fronteiriços aqui referidos servem apenas como guia, podendo ser escolhidos outros sítios vizinhos ou mesmo dentro das regiões V de modo a optimizar as características de secreção ou ligação do CD4. 0 sítio óptimo será determinado pela experimentação de rotina. Em geral, observou-se que as fusões são expressas intracelularmente, mas encontra-se uma grande variedade no grau de secreção das fusões dos hospedeiros recombinantes. Por exemplo, a tabela que se segue demonstra as várias fusões de imunoglobulina que foram obtidas pelo método deste invento. Em todos os exemplo das immunoadhesons de CD4, o sinal de CD4 foi usado para dirigir a secreção em células 293. A letra minúscula m representa ori-14gem murina, enquanto que a letra minúscula h designa origem humana. V e C são abreviaturas para os domínios variável e constante, respectivamente, da imunoglobulina. Os índices n£ mêricos indicam o número de unidades parentéticas encontradas no multimero designado. Compreender-se-á que se pense que as cadeias dos multímeros estejam ligadas por pontes dissulfureto do mesmo modo que as imunoglobulinas nativas. As immunoadhesons de CD4 contêm tipicamente os primeiros 366 resíduos N-terminais de CD4 (CD4₂) Ou os primeiros 180 resíduos N-terminais de CD4 (CD4₂) ligados no seu extremo C â cadeia k (leve) ou à região constante da cadeia pesada de IgG1 (γ1).

-15Tabela 1

Gene transfectado	Produto secretado
mV/CCK	mV/cc/c e/ou (mVKCK)2
mV7iC7l	ND
+ A γΐ^γΐ	(π’νΛΟΛ)2(ηινγιΟγι)2 + mVKC/c e/ou (mVKCK)2
hCD4-mCK	hCD4-mCK e/ou (hCD4-mCK)2
hCD4-mC.yi	ND
hCD4-mCK + hCD4-mC7i	(hCD4-mCK)2(hCD4-mC^]^)2 + hCD4-mC, e/ou (hCD4-mCK)2
hCD4-hCK	hCD4-hCK e/ou (hCD4-hCK)2
hCD4-hC7l	(hCD4-hC7l)2
hCD4-hCK + hCD4-hC7l	(hCD4-hCK)2(hCD4-hC7l)2 + hCD4-hCK 'e/ou (hCD4-hCK)2
mVKCK + hCD4-hC.yi	(mVKCK)2<hCD4-hC7i)2 + mV/cc/c e/ou (mVKCK)2

ND = Não detectado

E interessante observar a partir desta tabela que a immunoadhesons CD4-cadeia pesada humana foi secretada como um dímero enquanto que não foi detectada a construção murina análoga (no entanto, isto não exclui a acumulação intracelular da. proteína). A capacidade dos trans formantes hCD4-hCy1 para produzirem dímeros de cadeia pesada

foi inesperada uma vez que trabalho anterior segeriu que as cadeias pesadas das imunoglobulinas não sejam secretadas a menos que os hospedeiros sejam cotransformados com ácido nucleico codificador das cadeias leve e pesada (Valle et al., Nature: 388 271981/?) _ De acordo com este invento, as quimeras de immunoadhesons CD4-IgG são fâcilmente secretadas em que o epítopo CD4 estã presente nos dímeros de cadeia leve, monómeros ou dímeros de cadeia pesada e tetrâmeros de cadeias leves ou pesadas, incluindo heterotetrâmeros em que atê quatro, inclusive, análogos da região variável são derivados de CD4 Sempre que esteja presente o domínio variável não-CD4 de cadeia pesada, obtem-se um anticorpo heterofuneional.

Vários exemplos de anticorpos de immunoadheson heterólogos e quiméricas produzidos de acordo com este invento estão descritos esquemãticamente abaixo. A significa pelo menos uma porção do domínio extracelular de uma adheson o seu sítio de ligação ao ligando; V_L, V_H', C_L e C_H representam domínios variáveis ou constantes de uma imunoglobulina; n ê um inteiro; e Y designa uma porção de ligação cruzada covalente.

(a) AC£;

(b) AC_l-AC_l;

(c) ac_h-[ac_h, ac_l-ac_h, AC_l-V_hC_h, V_LC_L-AC_h,ou v_Lc_L-v_Hc_H];

(d) AC_l-AC_h-[AC_h, AC_l-AC_h, AC_l-V_hC_h, V_LC_L-AC_H,qu V_LC_L-V_HC_H] ;

(e) AC_L-V_HC_H-[AC_H, ac_l-ac_h, ac_l-v_hc_h, v_lc_l-ac_h,i ouv_Lc_L-v_Hc_H];

(f) V_lCl-AC_h-[AC_h, AC_L-AC_H, AC_L-V_HC_H, V_LC_L-AC_H,^ouV_LC_L-V_HC_Hl;

ou [A-Y]_n-[V_LC_L-V_HC_H).

-17Ά

As estruturas apresentadas nesta tabela mostram apenas caracteristicas chave, e.g. não mostram domínios de ligação (J) ou outros das imunoglobulinas, nem são apresentadas ligações dissulfureto. Estas são omitidas no interesse da concisão. No entanto, sempre que tais dominios sejam necessários à actividade de ligação eles devem ser considerados como estando presentes nos locais habituais que oc£ pam nas moléculas de adheson, immunoadheson ou imunoglobu linas conforme o caso. Estes exemplos são representativos de anticorpos divalentes; estruturas mais complexas resultariam do emprego de sequências da cadeia pesada das imunoglobulinas de outras classes, e.g. IgM. 0 sítio de combinação de anticor po V_LV_H da imunoglobulina também designado imunoglobulina companheira, de preferência é capaz de se ligar a um antigênio predeterminado.

Sítios de combinação adequados da imunoglobulina companheira e de parceiros de fusão são obti dos a partir dos subtipos IgG-1, -2, -3 ou -4, IgA, IgE, IgD ou IgM, mas de preferência IgG-1.

Uma execução preferida consiste n£ ma fusão de uma porção N-terminal de CD4, que contem o sitio de ligação à proteína do invólucro gp120 de HIV, à porção C-terminal de F_e de um anticorpo, contendo as funções efectoras de imunoglobulina G^. Existem duas execuções preferidas deste tipo; uma, toda a região constante da cadeia pesada é fundida a uma porção de CD4; numa outra, uma sequência começando na região charneira imediatamente a montante do sítio de clivagem pela papaína que define IgGFc quimicamente (resíduo 216, considerando o primeiro resíduo da região constante da cadeia pesada como sendo 114 /Kobat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest 4⁵. ed, 1987/ ou sítios análogos de outras imunoglobulinas) ê fundido a uma porção de CD4. Estas realizações estão descritas nos exemplos.

-18Mais particularmente, pensa-se que as variantes em que um ou mais domínios tipo imunoglobulina de uma adheson são substituídos pela região variável de uma cadeia de imunoglobulina apresentam uma maior semi-vida no : plasma in vivo. Estas quimeras são construídas de modo semer lante aos anticorpos quiméricos em que num domínio variável de um anticorpo de uma espécie ê substituído pelo domínio variável de uma outra espécie. Ver, por exemplo, EPO 125 023; Munro, Nature 312: (13 de Dezembro de 1984); Neuberger et al., Nature 312: (13 de Dezembro de 1984) ; Sharon et al., Nature 309: (24 de Maio de 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 6851-6855 (1984); Morrison et al. Science 229: 1202-1207 ( 1985); e Boulianne et al., Nature 312: 643-646 ( 13 de Dezembro de 1984). 0 DNA codificador de uma reacção tipo V de CD4 é clivado por uma enzima de restrição num DNA codificador de um domínio fronteiriço ou perto dele e um ponto dentro do DNA codificador do extremo 5' N-terminal do antigénio maduro ou perto dele (onde o uso de um condutor não-CD4 ê contemplado) ou no extremo 5' da região codificadora N-terminal do antigénio ou perto dele (onde se emprega um sinal de CD4 nativo), Este fragmento de DNA ê então facilmente inserido em DNA codificador de uma região constante da cadeia leve ou pesada da imunoglobulina e, caso seja necessário, cortada por mutagênese por deleção. De preferência, esta é uma imunoglobulila humana quando a variante se pertende para terapia in vivo de humanos. 0 DNA codificador das regiões constantes de cadeia leve ou pesada da imunoglobulina ê conhecido ou fácilmente di.s ponível das bibliotecas de cDNA ou ê sintetizado. Ver por exem pio, Adams et al., Biochemistry 19: 271 1 -2719 ( 1980); Gough et al., Biochemistry 19: 2702-2710 ( 1980); Dolli et al., P.N.A.S. USA, 7_7: 6027-603'í (1980); Rice etaL, P.N.A.S USA 79: 7862-7865 ( 1982): Falfner et al.; Nature 298: 286-288 (1982); e Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2/ 239-256 ( 1984).

DNA codificador de cadeia(s) quimêrica(s) de imunoglobulina ou de immunoadheson ê transfectado para uma célula hospedeira para expressão. Se a célula

-19hospedeira for produtora de uma cadeia pesada de imunoglobulina antes da transfecção então precisa-se de transfectar apenas a cadeia leve fundida da adheson para produzir um heteroanticorpo. De modo semelhante, se a célula hospedeira expressar numa cadeia leve então DNA codificador uma fusão de cadeia pesada dê adheson é transfectado para produzir um hetero anticorpo. As imunoglobulinas atrãs referidas tendo um ou mais br£ ços portadores do domínio de adheson e um ou mais braços portadores de regiões variáveis da companheira com especificidade dupla para o ligando de adheson e para um antigénio. Estas são produzidas pelos métodos de DNA recombinante acima des critos ou por processos in vitro. Neste último caso, por exemplo, fragmentos F(ab')₂ da fusão de adherson e uma imunoglobulina são preparados, os fragmentos F(ab')₂ convertidos em fragmentos Fab¹ por redução em condições redutoras suaves e depois reoxidados na presença um do outro em condições acídicas de acordo com métodos conhecidos per se. Ver também patente U.S. 4 444 878.

Num método alternativo para a produção de um anticorpo heterofuncionâl, células hospedeiras pro dutoras de uma fusão de adheson-imunoglobulina, e.g. mielonas transfectados, também são fundidas com células B ou hibridomas que secretem anticorpo tendo a especialidade da companheira pretendida para um antigénio. 0 anticorpo heterobifuncional é recuperado do meio de cultura de tais hibridomas e portanto pode ser produzido de modo algo mais conveniente do que por métodos dirigidos in vivo convencionais (EP 68 763).

Um outro grupo de fusões são aquelas em que uma adheson é conjugada com uma substância tóxica, e.g. um polipeptídeo como seja o ricino (incluindo a cadeia A do ricino desglicosilada), toxina A da difteria ou uma citotoxina não peptídica. Se a toxina fôr um polipeptídeo ê conveniente ligar o polipeptídeo à adheson ou à sua variante sem o domínio transmembranar por meio de agentes convencionais para ligação cruzada de proteínas in vitro (para métodos adequa-20dos à ligação da cadeia A do ricino ou cadeia A desglicosilada e CD4 ver, por exemplo, Duncan et al., Analy Biochem.

132: 68-73 /1983J; Thorpa et aj.., Câncer Res 47: 5924 /19877; e Ghotie et al., Câncer Res. 48: 2610 £Ί986J7 ou por síntese recombinante como uma fusão (ver por exemplo, Patente U.S.

765 382). Como alternativa, sempre que os anticorpos companheiros forem domínios variáveis de imunoglobulina do anticorpo anti-ricino, tais heteroanticorpos de imunoglobulina são empregues para libertar ricino para células infectadas com HIV seguindo o processo geral de Raso et al., Câncer Research, 41: 2073 (1981).

Uma outra classe de variante de adheson são variantes de deleção. As deleções são caracterizadas pela remoção de um mais resíduos de aminoácidos de uma se quência de adheson. Tipicamente, os domínios transmembranares e citoplasmãtias das adhesons são eliminados. No caso de CD4, pelo menos os resíduos 368 a 395 (a região transmembra nar) e geralmente também 396-433 (o domínio citoplasmático), serão eliminados para se optar formas secretadas desta adheson. Parentetieamente, os resíduos de aminoácidos seguem os números dados para CD4 maduro como se verificou, por exemplo, nas figuras 1a-1c.

As variantes de substituição são aquelas em que pelo menos um resíduo na sequência de adheson foi removido e um resíduo diferente inserido no seu lugar. 0 resíduo N-terminal nativo para CD4 maduro sabe-se agora ê lisina. Assim, a sequência apresentada na Fig. 1, com uma asparagina N-terminal, ê uma variante de sequência de aminoácidos de CD4 maduro nativo. A Tabela 2 abaixo descreve substituições que em geral resultarão numa modulação fina das características do antigénio CD.

-21TABELA 2

Residuo original_Substituições exemplares

Ala	ser
Arg	lys
Asn	gin; his
Asp	glu
Cys	ser; ala
Gin	asn
Glu	asp
Gly	pro
His	asn; gin
Ile	leu; vai
Leu	ile; vai
Lys	arg; gin; glu
Met	leu; ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Vai	ile; leu

Alterações substanciais na função ou identidade imunológica são feitas seleccionando substituições que sejam menos conservadoras dos que as da Tabela 2, i.e., seleccionando resíduos que difiram mais significativamen te no seu efeito Qu mantendo (a) a estrutura do esqueleto polipeptídico na área da substituição, por exemplo como uma conformação em folha ou halidoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) o grosso da cadeia late-22-

ral. As substituições que em geral se espera que produzem as maiores alterações nas propriedades de adheson serão aquelas em que (a) um resíduo hidrofílico, e.g.serilo ou treonilo sub£ titui um resíduo hidrofóbico, e.g. leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo ou alenilo; (b) um cisteinilo ou prolilo substitui qualquer outro resíduo; (c) um resíduo tendo uma cadeia lateral electropositiva, e.g. lisilo, arginilo ou histidilo, subtitui um resíduo electronegativo, e.g. glutamilo ou aspartilo; ou (d) um resíduo tendo uma cadeia lateral volumosa, e.g. fenilalamilo, substitui um que não tenha cadeia lateral, e.g. glicilo.

Uma classe preferida de variantes de substituição ou de deleção são aqueles que envolvem a reçgião transmembranar da adheson. A região transmembranar da adheson ê um domínio altamente hidrofóbico ou hipofílico que tem o tamanho correcto para atravessar a bicamada Iípidica da membrana celular. Pensa-se que ancora a adheson à membrana celular.

A deleção ou substituição do domínio transmembranar facilitar a recuperação e proporcionará uma forma solível da adheson através da redução da sua afinidade celular ou para os lípidos de membrana e aumentando a sua solubilidade em ãgua. Se os domínios transmembranares e citoplasmãtico forem eliminados evita-se a introdução de epítopos potencialmente imunogénicos, quer por exposição de polipeptídeos que de outro modo intracelulares que possam ser reconhecidos pelo corpo como estranhos ou pela inserção de polipeptídeos heterólogos que são potencialmente imunogénicos. Uma principal vantagem da adheson com o domínio transmembranar eliminado é que é secretado para o meio de cultura dos hospedeiros recombinantes. Esta variante ê solúvel em água e não possui uma afinidade apreciável para lípidos da membrana celular, simplificando assim considerávelmente e sua recuperação a partir da cultura de células recombinantes.

Serã amplamente aparente a partir da discussão precedente que substituições, deleções, inserções ou qualquer combinações delas são introduzidas para chegar a uma construção final. Gomo uma proposição geral, todas as variantes não terão um domínio transmembranar funcional e de pre ferência não terão uma sequência citoplasmática funcional. Isto ê geralmente conseguido por deleção do dominio importante, se bem que mutagênese adequada de inserção ou de substituição possa também ser eficaz para este fim. Por exemplo, o dominio transmembranar ê substituído por qualquer sequência de aminoãcidos, e.g. uma sequência ao acaso ou homopolinucleica de cer ca de 5 a 50 resíduos hidrofílicos serina, treonina, lisina, arginina, glutamina, ãcido aspãrtico e similares, que em conjunto apresentam um perfil de hidropatia hidrofilico de modo a ser secretado para o meio de cultura de hospedeiros recombinantes. Este variante também deverã ser considerado como uma variante de adheson.

Estas variantes são geralmente pre paradas por mutagênese dirigida específica de sítio de nucleotídeos no DNA codificador da adheson, produzindo assim DNA codificador da variante seguido da expressão do DNA em cultura de células recombinantes. No entanto, as variantes de adhe son também são preparadas por síntese in vitro. Obviamente, as variações feitas no DNA codificador das variantes de adheson não deverão colocar a sequência fora da grelha de leitura e de preferência não criarão regiões complementares que po_s sam produzir estruturas secundárias do mRNA prejudiciais à expressão (EP 75 444A). As variantes do CD4 tipicamente apresentam a mesma actividade de ligação a gp120 do protótipo natural se bem que possam ser seleccionadas variantes de modo a modificar as caracteristicas da adheson CD4 como indicado acima.

Se bem que o sítio para a introdução de uma variação da sequência de aminoácidos seja predeter minado, a mutação per se não necessita de ser predeterminada.

Por exemplo, para optimizar a eficácia de uma mutação num determinado sítio, a mutagênese ao acaso pode ser conduzida no codão ou região alvo e as variantes de adeshon expressas despistadas relativamente â combinação óptima das actividades pretendidas. As técnicas para se fazer mutações de substituição em sítios predeterminados no DNA tendo uma sequência conhe cida são bem conhecidos, por exemplo mutagênese com iniciador de M13.

As variantes de adheson que não são capazes de se ligarem a gp120 de HIV são úteis como imunogênios para induzir anticorpos contra adheson ou como componentes de um kit de imunoensaio (marcado, como um reagente competitivo para o ensaio de gp120 ou não marcado, como padrão para um ensaio de adheson) desde que pelo menos um epitopo de adheson permaneça activo.

DNA codificador de adhesono é o obtido por métodos conhecidos. Ver Reinhertz et al.,e Maddon et al., op cit. Em geral, usam-se procariotas para clonagem de sequências de DNA da variante de CD4. Por exemplo, a ester. pe 294 de ΙΞ. col i K12 (ATCC No.31446) é particularmente útil. Outras estirpes microbianas que podem ser usadas incluem E_. coli UM101 e £. coli. χ1776 (ATCC No.31537). Estes exemplos são ilustrativos mas não limitantes.

DNA codificador de variantes de adheson são inseridos para expressão em vectores contendo promotores e sequências de controlo que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira pretendida. Geralmente o vector possui um sitio de replicação assim como uma ou mais sequências de marcas que são capazes de fornecer se lecção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, ΙΞ. coli.é tipicamente transformada usando um derivado de pBR322 que ê um plasmídeo derivado de uma espécie de EL coli Bolívar, et al., Gene ,2:95 /Ί9777). pBR322 contem genes para resistência à ampicilina e tetraciclina e proporciona assim meios fá-

-25ceis para a identificação de células transformadas. 0 plasmídeo pBR322 ou outro plasmídeo microbiano deve também conter ou ser modificado para conter promotores ou outros elementos de controle vulgarmente usados em construções de DNA recombinante .

Promotores adequados ao uso com hospedeiros procarióticos incluem por exemplo os sistemas promotores da 1 actamase e lactose (Chang et al., Nature, 275: 615 /1978/; e Goeddel 281: 544 £1979/), fosfatase alcalina, o sistema promotor do triptofano (Goeddel Nucleic Acids Res 8: 4057 /19807 e EPO Pedido de Publ. N² 36 776) e promotores híbridos tais como o promotor tac (H. de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 21-25 /19837). No entanto são adequados tam bêm outros promotores bacterianos funcionais. As suas sequências de uncleotídeos são geralmente conhecidos, permitindo assim a um especialistar ligá-los operacionalmente ao DNA codificador da variante de adheson usando adaptadores para for necer quaisquer sítios de restrição necessários (Siebenlist et al., Cell 20: 269 /19807). Os promotores para usar em sistemas bacterianos também conterão uma sequência Shine-Dalgarno (S.D.) operacionalmente ligada ao DNA codificador do antigênio.

Além dos procariotas, também são úteis como hospedeiros de clonagem ou expressão microorganismos eucariôticos como sejam as culturas de levedura. Saccharomyces cerevisiae ou a vulgar levedura de padeiro ê o microorganismo eueariótico mais vulgarmente usado, se bem que esteja disponível uma série de outras estirpes. Para expressão em Saccharomyces usa-se vulgarmente o plasmídeo YRp7 por exemplo, (Stinchcomb, et al., Nature 282: 39 /19797; Kingsman et al., Gene Z: 141 /19797; Tschemper et al., Gene 10: 157 /19807.

Este plasmídeo já contem o gene trpl que proporciona uma marca selectiva para uma estirpe mutante de levedura sem capacidade para crescer um triptofano, por exemplo ATCC No.44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 /1977/)- A presença da lesão

-26x ‘ ;· trp1 como característica do genona da cêlúlâ hospedeira de le vedura proporciona então um meio eficaz de selecção por crescimento na ausência de triptofano.

Sequências promotoras adequadas pa ra usar com hospedeiros leveduras incluem os promotores da 3-fosfoglicerato cinase (Hitzeman et al.,J. Biol. Chem. 255 : 2073 /1980/) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al.,J. Adv. Enzyme Reg. 7_: 149 /1968/; e Holland, Biochemistry í 7: 4900 /1978/, como sejam enolase, gliceraldeído-3-fosfato desj_ drogenase, hexocinase, pirutavo descarboxilase, fosfofrutocinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase e glucocinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores indutíveis tendo a vantagem adicional da transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões do promotor da ãlcool-desidrogenase 2, isocitocrômio C, fosfatase ácida, enzimas degradadoras associadas ao metabolismo do azoto, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose Vectores e promotores adequados para usar na expressão em leveduras estão ainda descritos em R. Hitzemam et al., Publicação de Patente Europeia N⁹ 73 657A. Potenciadores de levedura são também vantajosamente usados com promotores de levedura.

Os promotores para controlar a transcrição a partir de vectores em células hospedeiras de mamíferos podem ser obtidos de várias fontes, por exemplo, os genonas de vírus tais como: polioma, Vírus Símio 40 (SV40), adenovírus, retrovirus, vírus da hepatite B e de preferência citomegalovírus ou de preferência citomegalovírus ou de promotores heterólogos de mamíferos, e.g. o promotor da beta-activa. Os promotores precoce e tardio de vírus SV40 são convenien temente obtidos como um fragmento de restrição que também con'f ~

tem a origem de replicação virai do SV40. Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978). 0 promotor precoce imediato do citonugalovírus humano ê convenientemente obtido como um fragmento de restrição HindIII E. Greenaway, P.J. et al., Gene /8: 355-360 (1982). Certamente, promotores da célula hospedeira ou de espécies relacionadas também aqui são úteis.

A transcrição de DNA em eucariotas superiores ê aumentada pela inserção de uma sequência potenciadora no vector. Os potenciadores são elementos do DNA que actuam em cis, geralmente entre cerca de 10 a 300 pb, que aumentam a capacidade de iniciação da transcrição de um promo tor. Os potenciadores são relativamente independentes da orien tação e posição tendo sido encontrados 5' (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 78: 993 /1981/) e 3' (Lusky, M. L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 /Ί9837) relativamente à unidade de transcrição, dentro de um intrão (Banerji, J.L. et al.,

Cell 33: 729 /1983/) assim como dentro da própria sequência codificadora (Osborne, T.F., et al., Mol. Cell. Biol. 4: 1293 /1984/). Muitas sequências potenciadoras são agora conhecidas em genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, ^-fetopro teína e insulina). Tipicamente, no entanto, usar-se-á um potenciador derivado de um vírus de células eucarióticas. Exemplos incluem o potenciador de SV40 do lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o potenciador do promotor precoce de citomegalovírus, o potenciador de polioma no lado tardio da origem de replicação e potenciadores de adenovírus.

Os vectores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (células de levedura, insectos, plantas, animais, humanas ou .nucleadas) podem também conter sequências necessárias à terminação da transcrição que podem afectar a expressão de mRNA. Estas regiões são transcr/ tas como segmentos poliadenilados na posição não traduzida do mRNA codificador da adheson.

Os sistemas de vectores de expressão de um modo geral conterão um gene de selecção, também designado marca selectiva. São exemplos de marcas selectivas adequadas para células de mamíferos a di-hidrofolato-redutase (DHFR), timidina einase ou neomicina. Quando tais marcas selectivas são transferidas com êxito para uma célula hospedeira de mamífero, a célula hospedqira de mamífero transformada pode sobreviver se colocada sob pressão selectiva. Existem duas categorias distintas de regimes selectivos largamente usados. A primeira categoria é baseada num metabolismo da célula e o uso de uma linha celular mutante que não possua a capacidade de crescer independentemente de um meio suplementado. Dois exemplos são'i células CHD, DHFR e células LTK“ de murganho. Estas células não possuem a capacidade para crescer sem a adição de nutrientes tais como timidina ou hipoxantina. Devido a estas células não possuírem certos genes necessários a uma via de síntese de nucleotídeos completa, não podem sobreviver a menos que os nucleotídeos que faltam sejam fornecidos num meio suplementado. Uma alternativa ao suplemento do meio é introduzir um gene DHFR ou TK intacto nas células sem os respectivos genes, alterando assim as suas necessidades de crescimento. Células individuais que não foram transformadas com o gene DHFR ou TK não serão capazes de sobreviver em meio não suplementado.

A segunda categoria ê selecção dominante que se refere a um esquema de selecção usado em quaj^ quer tipo celular e não necessita de usar uma linha celular mutante. Estes esquemas usam tipicamente uma droga para parar o crescimento de uma célula hospedeira. As células que· possuem um novo gene expressam a proteína que confere resistência à droga e sobreviverão à selecção. Exemplos de tal selecção dominante usam as drogas neomicina, Southern P. e Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1:327 (1982), ãcido micofenólico, Mulligam, R.C. e Berg, P. Science 209: 1422 (1980) ou higromicina, Sugden, B. et al., Mol Cell. Biol. 5:-410-413 (1985). Os três exemplos dados acima empregam genes bacterianos sob o contro-29-

le eucariótico para conferir resistência'à droga apropriada G418 ou neomicina (geneticina), xgpt (ácido micofenólico) ou higromicina, respectivamente.

Amplificação .refere-se ao aumento ou replicação de uma região isolada dentro de um DNA cromossómico da célula. A amplificação ê conseguida usando um agente de selecção e.g. metotrexato (MTX) que inactiva i? DHFR. A amplificação ou a obtenção de cópias sucessivas do gene DHFR resulta em maiores quantidades de DHFR produzido face a maiores quantidades de MTX. A pressão de amplificação ê aplicada apesar da presença de DHFR endógeno, pela adição de quantidades cada vez maiores de MTX ao meio. A amplificação de um gene pretendido pode ser conseguido por cotransfecção de uma célula hospedeira de mamífero em um plasmídeo tendo um DNA codificador de uma proteína pretendida e o DHFR ou gene de amplificação permitindo cointegração. Asseguram-se de que a célula necessita de mais DHFR, necessidade essa que ê satisfeita pela replicação do gene de selecção, seleecionando apenas células que possam crescer na presença de concentrações cada vez maiores de MTX. Desde que o gene codificador de uma proteína heteróloga pretendida se tenha cointegrado com o gene de selecção, a replicação deste gene dá origem â replicação do gene codificador da proteína pretendida. 0 resultado' ê que um maior número de cópias do gene, i.e. um gene amplifi_ cado, codificando a proteína heteróloga pretendida expressam mais da proteína heteróloga pretendida.

As células hospedeiras preferidas para a expressão de variantes do antigénio CD deste invento são linhas celulares de mamífero, os exemplos incluem: linha CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embrionário humano (293, Graham, F.L. et al. J. Gen. Virol. 36: ⁵⁹ e células 293s /subclones de

293 seleccionados para melhor crescimento em suspensão );

células de rim de hamster bêbê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês-DHFR (CHO, Urlaub e Chasin, Proc.

Natl. Acad. Sei. (USA)'77: 4216, /1980/) j células de sertolli de murganho (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23: 243-251 /1980/); células de rim de macaco verde africano (VERO-76,

ATCC CRL-1587); células de carcinona cervical humano (HELA,

ATCC CCL2); células de rim canino (MDCK, ATCC, CCL34); células de figado de buffalo rat (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL75); células de figado humano (Hep GR, HB 8065); tumor mamário de murganho (MMT 060562, ATCC, CCL51); e células TRI (Mather, J.P. et aL, Annals N.Y. Acad. Sei.

383: 44-68 /^982/).

“Transformação significa introdução de DNA num organismo de modo a que o DNA seja replicável quer como elemento extracromóssomico ou por integração cromossómica. Um método adequado à transformação de células hospedeiras ê o método de Graham, F. e van der Eb, A,, Virlogy 52: 456-457 (1973). No entanto, outros métodos para a introdução de DNA em células como seja injecção nuclear ou por fusão de protoplastos podem igualmente ser usados. Se se usarem como hospedeiros células procarióticas ou células que contenham paredes celulares abundantes, o método de trasfecção preferido é o do tratamento com cálcio usando cloreto de cálcio como descrito por Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sei (USA), 69: (1972).

A construção de vectores adequados contendo as sequências codificadoras e de controle pretendidas emprega técnicas de ligação convencionais. Os plasmídeos isolados ou fragmentos de DNA são clivados, cortados e relizados na forma pretendida para formar os plasmídeos necessários. Os ’ processos adequados usados na construção aqui descrita são bem conhecidos. Ver, por exemplo, (Maniatis, T. et al., Molecular Chonig, 133-134 Cold Spring Harbor, /1982/; Current Protocols in Molecular Biology, editado por Ausubel et al; /1987/, publicado por Greene Publishing Associates & Wiley-Interscience).

As sequências'de plasmídeo corre£ tas são confirmadas por transformação de E. coli K12 estirpe 294 (ATCC 31446) com misturas de ligação, os transformante pretendidos seleccionados por resistência à ampicilina ou à tetraciclina conforme adequado, preparados os plasmídeos a partir dos transformantes e depois analisados por digestão em enzimas de restrição e/ou sequênciados pelo método de Messing et al., Nucleic Acids Res £: 309 (1981) ou pelo método de Maxam et al., Methods in Enzymology 65: 499 (1980).

As células hospedeiras são transformadas com os vectores de expressão deste invento. Depois são cultivadas em meios de cultura adequados, e.g. contendo substâncias para redução de promotores, selecção de transformantes ou amplificação de genes. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares são as prêviamente usadas com a célula hospedeira seleccionada para expressão e serão aparentes para o técnico especialista.

As variantes de adheson secreta, das são recuperadas e purificadas a partir dos sobrenadantes de cultura dos hospedeiros recombinantes. Tipicamente, os sobrenadantes são concentrados por ultrafiltração, postos em contacto com uma matriz de afinidade com ligando ou de imunoafinidade de modo a adsorver a variante de adheson e eluidos da matrix. Faeultativamente, a adheson ê purificada por cromatografia de permuta iónica.

Supreendentemente, a purificação de adheson CD4 solúvel a partir de meio de cultura foi inesperadamente difieil. Apesar de ter sido eliminado a região transmembranar do antigénio, o antigénio apresentou uma forte tendência para formar agregados que podiam ser fácilmente removidos da suspensão por centrifugação a 1000 x g e que revestiam ávidamente superfícies tais como membranas de ultrafiltração. Isto parece resultar da redução da concentração de albumina ou outra proteína do soro (geralmente presente na pre-32-

paração bruta) atê um nível particular, abaixo do qual o antigénio truncado não mais permanece em solução. Este fenómeno pode ser agravado pela exposição da adheson CD4 a pH baixo (<cerca pH4). Como resultado, os processos de separação (particularmente Os que empregam eluição ácida, tais como imunoafinidade) deverão ser modificados de modo a que o eluente seja mantido ou imediatamente ajustado aproximadamente à neutralidade. Ainda, um tensioactivo, e.g. um detergente como Tween 80, deverá ser incluido com o antigénio durante o processo de separação. 0 produto final purificado será estabilizado com uma proteína predeterminada como seja a albumina e/ou um detergente.

A adheson purificada ê formulada em escipientes convencionais farmacológicamente aceitáveis.

Administra-se a pacientes tendo infecção por HIV numa dosagem capaz de manter uma concentração superior a cerca de 100 ng de adheson CD4 solúvel/ml de plasma. Para variantes de adheson CD4 tendo diferentes pesos moleculares, cerca de 2 picomoles de receptores solúvel por ml de plasma serão inicialmente avaliados clinicamente de modo a estabelecer uma equivalência estequiométrica com reeptor nativo (ligado a membrana) e solúvel. A dosagem vulgar de CD4 solúvel ê 100 pg/Kg de peso do paciente/dia.

As variantes CD4 terapêuticas são empregues com outras terapias e agentes para o tratamento de AIDS, incluindo AZT, anticorpos neutralizante ou imunocitotoxinas, fragmento de gp120 e vacinas.

Para facilitar a compreensão dos exemplos que se seguem serão descritos métodos e/ou termos que frequentemente surgem.

Plasmídeos são designados pela letras miníscula p precedida e/ou seguida de letras maiusculas

e/ou números. Neste caso os plasmideos dè' partida podem ser adquiridos comercialmente, disponíveis ao público numa base sem restrições ou podem ser construídos a partir de plasmideos disponíveis de acordo com processos publicados. Em adição, plasmideos equivalentes aos descritos são conhecidos e serão óbvios para os técnicos especialistas.

Digestão de DNA refere-se a clivagem catalítica do DNA com uma enzima de restrição que actua apenas em certas sequências no DNA. As várias enzimas de restrição aqui usadas estão disponíveis comercialmente e as suas condições de reacção, cofactores e outros requisitos foram usados conforme é do conhecimento dos especialistas na matéria. Para fins analíticos tipicamente 1 pg de plasmídeo ou de fragmento de DNA ê usado com aproximadamente 2 unidades de enzima em cerca de 20 μ 1 de solução tampão. Com a finalidade de isolar fragmentos de DNA para a construção de plasmideos, tipicamente 5 a 50 pg de DNA são digeridos com 20 a 250 unidades de enzima num volume maior. Os tampões adequados e as quantidades de substracto para enzimas de restrição particulares são especificados pelo fabricante. Os tempos de incubação de aproximadamente 1 hora a 37⁵C são os geralmente usados, mas podem variar de acordo com as instruções do fornecedor. Após digestão a reacção ê sujeita a electroforese directamente num gel de poliacrilamida para isolar o fragmento pretendido.

Recuperação ou isolamento de um dado fragmento de DNA a partir da reacção de digestão significa separação do produto da digestão num gel de poliacrilamida ou de agarose por electroforese, identificação do fragmento com interesse por comparação da sua mobilidade versus a de fragmentos de DNA marcador de peso molecular conhecido, remoção da secção de gel contendo o fragmento pretendido e separação do DNA do gel. Este processo ê conhecido de um modo geral (Lawn, R. et al., Nucleic Acids Res. 9; 6103-6114 /1981/ e Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 /19807).

Desfosfori Tação refere-se à remoção dos fosfatos 5' terminais por tratamento com fosfatase alcalina bacteriana (BAP). Este processo evita que os dois extremos clivados com enzimas de restrição de um fragmento de DNA circularizem ou formem uma ansa fechada que impediria a inserção de um outro fragmento de DNA no sítio de restrição Os processos e reagentes para desforilação e outras manipulações recombinantes são os convencionais. As reacções usando BAP são efectuadas em 50mM Tris a 68²C para suprimir a activi dade de quaisquer exonucleases que possam estar presentes nas preparações de enzima. As reacções decorrem durante 1 hora. Depois da reacção o fragmento de DNA ê purificado em gel.

Ligação refere-se ao processo de formação de ligações fosfodiêster entre dois fragmentos de ácido nucleicO de cadeia dupla (Maniatis, T; et al., Id a146) A menos que de outro modo referido, a ligação pode ser conseguida usando tampões e condições conhecidas com 10 unidades de DNA-ligase de T4 (ligase) por 0,5 pg de quantidades apro ximadamente equinolares dos fragmentos de DNA a serem ligados

Preenchimento ou obtenção de extremos cerses refere-se aos processos pelas quais o extremo da cadeia simples na terminação coesiva de um ácido nuclei co cortado com enzimas de restrição ê convertido numa cadeia dupla. Isto elimina os extremos coesivos e forma um extremo cerse. Este processo ê uma arma versátil para a conversão de um extremo cortado por restrição que possa ser coesivo com os extremos criados por apenas uma ou algumas enzimas de restrição num extremo compatível com qualquer endonuclease de restrição que corte extremos cerses ou outro extremo coesivo preenchido. Típicamente, a obtenção de extremos cerses ê conseguida incubando 2-15 pg do DNA alvo em tampão 10 mM MgC^, 1mM ditiotreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5) a cerca de 37²C na presença de 8 unidades do fragmento Klenow da DNA-polimerase I e os quatro trifosfatos de desoxinucleosídeos 250 pM cada. A incubação termina geralmente após 30 min. por ex-35-

χ'7* tracção com fenol e clorofórmio e precipitação com etanol.

Os exemplos que se seguem ilustram apenas o melhor modo de realizar o invento mas não devem ser encarados como limitantes do invento. Todas as citaçOes da literatura aqui referidas são expressamente incorporadas por referência.

EXEMPLO 1

Construção de vectores para a expressão de CD4 nativo e derivados secretados

Secção 1 plasmídeo usado para a síntese de recombinantes de CD4 humanó foi pSVeCD4DHFR. 0 plasmídeo foi construído como se segue:

XCD4P1 contendo a maior parte da sequência codificadora de CD4 humano (obtido de uma biblioteca de cDNA placentãrio humano usando sondas oligonucleotídicas baseadas na sequência publicada /Maddon et al., 1985_7) foi digerido com EcoRI para produzir a inserção de cDNA. Este fragmento foi recuperado por electroforese em gel de poliacrilamida (fragmento 1).

pUC18 foi digerido com EcoRI e o único fragmento recuperado por electroforese em gel de poliacrilamina (fragmento 2). 0 fragmento 1 foi ligado ao fragmen-36-

to 2 e a mistura de ligação transformada em E_. coli estirpe 294. A cultura transformada foi semeada em caixas tendo meio com ampicilina e as colónias resistentes seleccionadas. 0 DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes e testado por anãlise de restrição quanto â presença dos fragmentos de DNA correctos. Este plasmídeo foi referido como pl)CCD4 pSVeEOHFR (Muesing etaL, Cell 48: 691-701 f1987_7 foi digerido com Kpnl e BamHI e dotado de extremos eerses com DNA-pol imerase I de E[. co li (fragmento Klenow) e os quatro dNTPs. 0 fragmento 3 contendo a região pML-Amp^r, o promotor percoce do SV40, e a LTR de HIV e o gene DHFR de murganho foi recuperado por electroforese em gel, ligado e a mistura de ligação usada para transformar L· coli es tirpe 294. A cultura transformada foi semeada em caixas contendo meio com ampicilina e seleccionadas as colónias resistentes. 0 DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transfor mantes e testado por análise de restrição à presença do sítio de restrição BamHI e à ausência do sitio de restrição Kpnl. Este plasmídeo ê referido como pSUeABKDHFR e permite que frag mentos EcoRI-BamHI sejam inseridos a seguir ao promotor precoce do SV40 e transcritos sob o seu controle, após transfecção numa linha celular adequada.

Fizeram-se oligonucleotídeos sintéticos (adaptadores 1-8, em baixo) para prolongar desde 76 pb 5' do codão de iniciação da tradução de CD4 atê ao sítio de restrição Rsal a 121 pb 3' relativamente ao iniciador, com a sequência AATT extremo 5' de cadeia com sentido para dar origem a um extremo que se poderá ligar a um fragmento de res trição EcoRI. Estes ol igonucleotídeos foram l igados e o fragmento de 204 pb contendo toda a sequência recuperado por elec troforese em gel (fragmento 4).

CD4 adaptado#: AATTCAAGCCCAGAGCCCTGCCATTTCTGTGGGCTCAGGTCCCT CD4 adaptado#; pACTGCTCAGCCCCTTCCTCCCTCGGCAAGGCCACAATGAACCGGGGAGTC CD4adaptador3: pCCTTTTAGGCACTTGCTTCTGGTGCTGCAACTGGCGCTCCTCCCAGC CD4adaptador4:

pAGCCACTCAGGGAAACAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGACCTGT CD4 adaptadorS: pACAGGTCAGTTCCACTGTATCCCCTTTTTTGCCCAGCACCACTTTGTTTCC CD4 adaptador6: pCTGAGTGGCTGCTGGGAGGAGCGCCAGTTGCAGCACCAGAAGCAAGT

CD4 adaptador7: pGCCTAAAAGGGACTCCCCGGTTCATTGTGGCCTTGCCGAGGGAGGAAGGG CD4 adaptadore: GCTGAGCAGTAGGGACCTGAGCCCACAGAAATGGCAGGGCTCTGGGCTTG pUCCD4 foi digerido com Rsal e

Sst e o fragmento de 401 pb contendo parte de sequência codificadora de CD4 recuperado por electroforese em gel (fragmento 5). pUC18 foi digerido com EcoRI e SstI e o fragmento compreendendo o grosso do plasmídeo recuperado por electroforese em gel (fragmento 6). Os fragmentos 4 e 5 foram ligados ao fragmento 6 e a mistura de ligação usada para transformar E:. coli estirpe 294. A cultura transformada foi semeada em placas com meio tendo ampicilina e seleccionadas as colónias resistentes. 0 DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos trans formantes e testado por análise de restrição quanto â presença do fragmento correcto. A sequência DNA sintético inserido foi testada removendo os fragmentos EcoRI-SstI de 605 pb a partir de vários transformantes e ligando-os a M13mp19 que foi digerido com as mesmas enzimas. Após transformação de ΙΞ. col i estirpe JM101, preparou-se e sequenciou-se DNA de cadeia simples. Seleccionou-se um plasmídeo que continha a sequência correcta e designou-se pCD4int.

pCD4int foi digerido com EcoRI e SstI e o fragmento 7 contendo o extremo 5' da região codifica-38-

dora de CD4 foi recuperado por electroforese em gel. pUCCD4 foi digerido com SstI e BamHI e o fragmento de 1139 pb conter^ do a restante região codificadora de CD4 (fragmento 8) recuperado por electroforese em gel.

pSVeZsBKDHFR foi digerido com EcoRI e BamHI e o fragmento 9 compreendendo o grosso do plasmídeo foi isolado. Os fragmentos 7, 8 e 9 foram ligados e a mistura de ligação usada para transformar E.. coli estirpe 294. A cultura transformada foi semeada em placas de meio com ampicilina e seleccionadas as colónias resistentes. 0 DNA deplasmídeo foi preparado a prtir de transformantes e testado por análise de restrição quanto â presença do fragmento correcto. Este plasmídeo ê designado pSVeCD4DHFR e foi usado para dirigir a síntese de CD4 intacto recombinante.

Secção 2

Construiu-se um plasmídeo para dirigir a síntese de um derivado de CD4 sem o domínio transmembranar putativo e a maior parte do domínio citoplasmãtico putativo (Maddon et al). Isto foi feito com a intenção de criar uma forma secretada de CD4, assumindo que estes domínios ancoram a gl icoproteína CD4 à membrana celular e que a sua eliminação resultaria na secreção do produto. Este plasmídeo é designado pSVeCD4ÁN1aDHFR e foi construído como se segue:

pUCCD4 foi digerido com SstI e TagI e o fragmento de 531 pb (fragmento 10) recuperado. pUCCD4 foi digerido com NlalII e TagI e o fragmento de 112 pb (fragmento 11) foi recuperado. pUCCD4 foi digerido com BamHI e NlalII e o fragmento de 301 pb (fragmento 12) recuperado. pCD4int foi digerido com SstI e BamHI e o fragmento 13 compreendendo o grosso do plasmídeo foi recuperado. Os fragmentos 10, 11 e

-3912 foram ligados uns aos outros com o fragmento 13 e a mistura de ligação usada para transformar L· coli estirpe 294. A cultura transformada foi semeada em placas de meio com ampicilina e seleccionadas as colónias resistentes. 0 DNA de pla£ mídeo foi preparado a partir dos transformantes e testado por análise de restrição quanto à presença do fragmento correcto.

DNA de plasmídeo de vários transformantes foi sequenciado para assegurar que o fragmento NlalII de 195 pb tivesse sido eliminado e que a grelha de leitura correcta tenha sido restaurada. 0 plasmídeo resultante foi referido como pCD4AN1a.

pCD4 N1a foi digerido com EcoRI e BamHI e recuperado o fragmento de 1541 pb contendo a sequência de um derivado de CD4 sem os domínios transmembranar e citoplasmático (fragmento 14) e ligado ao fragmento 9 e a mistura de ligação usada para transformar E_. col i estirpe 294. A cultura transformada foi semeada em placas de meio com ampicilina e seleccionadas as colónias resistentes. 0 DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes e testado por análise de restrição quanto à presença do fragmento correcto. Este plasmídeo é designado pSVeCD^NIaDHFR.

pSVeCD4DHFR e pSVeCD4AN1aDHFR foram usados para transfectar células CHO pelo mesmo método usado para estabelecer linhas celulares expressando estávelmente polipeptídeos HIV-I (Muesing, Smith e Capon, Cell 48: 6910701 /1987.7). Estas células foram testadas quanto à produção por radioimunoprecipitação como descrito abaixo. Se bem que não se tenha detectado produto nas experiências iniciais, subsequentes experiências mostraram que o segmento codificador descrito acima podia dirigir a síntese de uma variante de adheson CD4 solúvel em células CHO e células 293.

Secção 3

Um sistema de expressão diferente foi inicialmente usado para a síntese e expressão de uma variante CD4 sem ter os domínios citoplasmático e transmembranar. Este sistema usa o promotor de citomegalovírus e pode ser usado com células em cultura de origem humana. 0 primeiro plasmídeo construído para usar neste sistema continha toda a região codificadora de CD4 e destinou-se a funcionar como controle nos estudos que se seguem. Foi designado pRKCD4 e construiu-se da seguinte forma:

pSVeCD4DHFR foi digerido com EcoRI e BamHI e o fragmento 15 contendo toda a região codificadora de CD4 foi isolado pRK5 (U.S.S.N. 97 472, entregue em 11 de Set, 1987) foi digerido com EcoRI e BamHI e o fragmento 16 compreendendo o grosso do plasmídeo recuperado por electroforese em gel, ligado ao fragmento 15 e a mistura usada para transformar E_. coli estirpe 294. A cultura transformada foi semeada em placas com meio tendo ampicilina e as colónias resistentes seleccionadas. 0 DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes e testado por análise de restrição quanto à presença do fragmento correcto. Este plasmídeo foi designado pRKCD4.

Secção 4 plasmídeo construído a seguir foi destinado a dirigir a expressão do derivado de CD4 secretado atrás referido (Secção 3). A região codificadora de CD4 foi fundida a seguir ao resíduo da aminoácido 368 de CD4 madu ro a uma sequência de pBR322 que codifica mais de 9 resíduos antes de um codão de terminação da tradução. Isto remove os domínios transmembranas e citoplasmático de CD4, os quais se

-41presume ancoram CD4 â superfície celular. 0 plasmídeo ê referido como pRKCD4T e foi construído como se segue:

pSVeCD4DHFR foi digerido com Hpa II, dotado de extremos cerses com o fragmento Klenow e os qu£ tro dNTPs e digerido com BstEI 1. 0 fragmento de 382 pb (fragmento 17) contendo parte da sequência codificadora de CD4 foi recuperado por eleetroforese em gel. pSVeCD4DHFR foi digerido com EcoRI e BstEII e o fragmento de 874 pb (fragmento 18) recuperado. pBR322 foi digerido com HindIII, dotado de estremos cerses com o fragmento Klenow e os quatro dNTPs e digerido com EcoRI. 0 fragmento 19 compreendendo o grosso do plasmídeo foi isolado e ligado aos fraguentos 17 e 18 e a mistura de ligação usada para transformar ΙΞ. coli estirpe 294. A cultura transformada foi semeada em placas contendo meio com ampicilina e as colónias resistentes seleccionadas. 0 DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos transformantes e testado por análise de restrição quanto à presença do fragmento correcto. Este plasmídeo é referido como pCD4Tint.

pRK5 foi digerido com EcoRI e

Smal e o fragmento 20 compreendendo o grosso do plasmídeo iso lado. pCD4Tint foi digerido com EcoRI e EcóRV e o fragmento de 1410 pb contendo a sequência codificadora de CD4 atê ao sítio Hpal I em 1176 pb 3' do codão de iniciação e o fragmento Hindi I Ι-EcoRV de 154 pb do pBR322 foi recuperado (fragmento 21). Os fragmentos 20 e 21 foram ligados' e a misturas de ligação usada para tranformar EL coli estirpe 294. A cultura tran£ formada foi colocada em placas de meio com ampicilina e seleccionadas as colónias resistentes. Preparou-se DNA de plasmídeo a partir dos transformantes e testou-se por anãlise de restrição quanto à presença do fragmento correcto. Este plasmídeo foi referido como pRKCD4T.

-42Secção 5a

Para criar uma forma secretada de CD4 que pudesse ser purificada com um anticorpo dirigido contra a gl icoproteína do vírus tipo I, construiu-se um plasmídeo para expressar um derivado de CD4T no qual a região codificadora do polipeptideo CD4T processodo maduro foi fundida a uma sequência codificadora do peptídeo sinal e os primeiros 27 resíduos da glicoproteína gD madura do Vírus Herpes Simplex tipo I. Este plasmídeo ê referido como pRKGDCD4T e foi construído como se segue:

pgDTrunc.DHFR fõi digerido com

EcoRI e PvulI e o fragmento contendo a região codificadora do peptídeo sinal e os primeiros 27 resíduos da glicoproteína gD madura de HSVi foi isolado (fragmento 22). pRKCD4T foi digerido com EcoRI e BstEII e o fragmento 23 contendo o extremo 3' da sequência codificadora de CD4 e a região de pRK5 foi isolado.

Preparam-se ol igonucleot ídeos siii téticos GD (adaptadores 1-2, em baixo) contendo a sequência codificadora de GD4 desde o codão para o resíduo amino-terminal de CD4 maduro atê ao sítio Rsa a 121 pb 3' da iniciação da tradução e contendo a sequência CTGCTCGAG no extremo 5' da cadeia codificadora (fragmento 24). pRKCD4 foi digerido com Rsal e BstEII e o fragmento do 665 pb contendo parte da região codificadora de GD4 foi recuperado (fragmento 25) e ligado ao fragmento 24. Após digestão com BstEII para assegurar que estava presente apenas um fragmento monomérieo, o fragmento de 724 pb contendo ambas as sequências foi recuperado por elec troforese em gel (fragmento 26).

Os fragmentos 22, 23 e 26 foram ligados e a mistura de ligação usada para transformar E. coli estirpe 294. A cultura transformada foi semeada em plascas

-43com meio tendo ampicilina e as colónias resistentes seleccionadas. Preparou-se DNA de plasmídeo a partir de transformantes e testou-se por análise de restrição quanto à presença do fragmento correcto. A sequência de vários transformantes foi testada para assegurar que a inserção sintética estava correc ta e que a grelha de leitura foi preservada. Este plasmídeo ê referido como pRKGDCD4T.

Estes plasmídeos derivados de pRK5 de preferência foram usados para transfectar células 293s para obtenção de expressão estável de acordo com Muesing, et al Cell 48: 691 (1987) com excepção de além do plasmídeo de interesse ter sido cotranfectado um plasmídeo expressando o gene de resistência à neomicina pRSVneo (Gorman et al. Science 221: 553-555 (1980)). As células 293 também são usadas satisfatóriamente como células hospedeiras 2 dias após transfecção as células foram passadas em meio convencional (1:1 F12-/DME suplementado com L-glutamina, penici1ina-estreptomicina e 10% FBS) com 0,5 mg/ml de G418 (sulfato de Genticina; Gibro) para selecção de linhas celulares estáveis, em vez de meio contendo metotrexato como mostrado por Muesing et al.. As células foram testadas quanto à produção de CD4 ou análogos de CD4 por radioimunoprecipitação. Os estudos de ligação (secção 5c) usaram sobrenadantes condicionados derivados destas células no meio 1:1 F12/DME. Os materiais usados nos ensaios de infe£ ciosidade (secção 5b) foram obtidos como descrito na secção 8 abaixo.

gDCD4 adaptador].:

CTGCTCGAGCAGGGAAACAAAGTGGTGCTGGGCAAAAAAGGGGATACAGTGGAACTGAC gDCD4adaptador2:

pACAGGTCAGTTCCACTGTATCCCCTTTTTTGCCCAGCACCACTTTGTTTCÇCTGCTCGA

-44Secção 5b que se segue constitui um estudo da neutralização da infecciosidade de HIV-I pelos análogos CD4 solúveis. Seguiu-se uma modificação do processo de neutr^ lização de Robert-Guroff et al., Nature 316: 72 (1985). Volumes iguais de sobrenadante do inibidor e de virus (60 microlitros) foram incubados a 4 graus durante 1 hora, em seguida adicionou-se o mesmo volume de H9 (Gallo et al. Science 224 500, 1984) a 5x10°/ml e a incubação continuou durante 1 hora a 37⁹C. Após adsorção, 2,5x10⁵ células em 150 microlitros foram usados para transfectar 2 ml de meio de incubação. Após 4 dias a 37^e, as culturas foram diluídas a 1:2 com meio frasco e incubadas durante mais 3 dias. Colheram-se as culturas e a actividade de transcriptase reversa foi medida (Groopman et al., AIDS Research and Human Retrovirus 71, 1987) e a reactividade de imunofluorescência com soro positivo para HIV -I foi determinada como descrito (poiesg et al., Proc. Nat. Acad. USA 77: 7415, 1980). Os sobrenadantes dos inibidores foram obtidos a partir de culturas de plascas confluentes de células 293s/CDT4, 293s/gDCD4T ou de células 293s não transfectadas substituindo o meio de incubação por meio de crescimento os sobrenadantes 24 horas mais tarde. 0 sobrenadante de inibidor substitui parte do meio de incubação durante os três primeiros dias de cultura como indicada na segunda coluna da Tabela 3. A dose teste de vírus foi de 100 TCID_5Q (Groopman et al. , supra) de HIV-I estirpe HTLV-IIIB replicada em células H9 testadas no mesmo sistema. 0 meio de incubação consistiu em meio RPMI 1640 contendo 2mM L-glutamina, 100 unidades/ ml de penicilina, 100 microgramas/ml de estreptomicina, 2 microgramas/ml de polibreno e 20% de soro fetal de vitela (M.A. Bioproducts).

-45TABELA 3

Sobrenadante inibidor

Diluição do sobrenadante

Inibidor

Imunofluorescência Indirecta (% de células positivas)

Transcriptase reversa (cpm/ml x 10^·)

transfecção simulada	undil.; 1:4
transfecção simulada	undil.;	1:4
CD4T	undil.;	1:4
CD4T	undil.;	1:4
gDCD4T	undil.;	1:4
gDCD4T	undil.;	1:4

65,3	65,5	21.8 /	23,9
61,2	61ζ!	18,5	28.1 /
0/4	18,0	0?ll	5, 94
0,8	16?	0,15	3y72
0/4	26,8	0,14	9?92
	36,1	0,23	11?3

Ambas as formas de CD4 solúvel inibem virtualmente o crescimento de HIV-1, quando incubadas com células infectadas pelo vírus sem diluição prévia (Tabela 2). Numa diluição de 1:4 as preparações de CD4 solúvel foram apenas parcialmente eficazes na inibição da replicação do vírus, no entanto o nível de células fluorescentes positivas e a transcriptase reverse foi ainda sifnificativamente inferior às culturas que receberam sobrenadantes de células sujeitas a transfecção simulada (Tabela 2). Uma vez que não houve diferença significativa no crescimento do vírus entre os sobrenadantes testemunhas diluídas e não diluídas, nem quaiquer sobrenadantes afectaram o crescimento de células H9 não infec·>

tadas (dados não apresentados), concluiu-se as proteínas CD4

solúveis presentes neste sobrenadantes foram responsáveis pela neutralização da infecção de células H9 por HIV-1.

Secção 5c

Para determinar a constante de afinidade para interacção entre gp120 e CD4 ou variante de

CD4, efectuou-se análise ou ligação com saturação usando CD4 solúvel (supra) e CD4 intacto solubi 1 izado com detergente (La.s keu et al. Cell 50: 975 /19875 empregando gp120 radioiodinada marcada com laetoperosidase. As reacções de ligação consisti125 ram em I-gp120 (3 ng para 670 ng, 2,9 nCi/ng) incubado durante i hora a 0 graus (com lisados celulares contendo CD4 intacto (Leskey et al., op cit.) ou sobrenadantes de células contendo CD4T não marcado ou gDCD4T preparado como descrito na secção 5a. As reacções (0,2 ml) tinham uma composição final de 0,5X McDougal Lysis Buffer (McDLB) (1 x McDLB contem 0,5% Nomidat NP40, 0,2% Na desoxicolato, 0,12 M NaCl, 0,002 M Tris-HC1, pH8,0) e foram efectuados em duplicados, na presença ou ausência de 50 microgramas de gp120 purificada não marcada (74 vezes ou um excesso maior). Após incubação, a gp120 ligado foi quantificada por imunoprecipitação e contada num contador gama. Para a imunoprecipitação, as soluções da reacção de ligação foram prê-absorvidas com 5 microlitros de soro no£ mal de coelho durante uma hora a osc e clarificado com 40 microlitros de Pansorbin (10% p/v, Calbioehem) durante 30 minutos a 0 graus. As amostras foram então incubadas durante a noite a 0 graus C eom 2 microlitros de soro normal ou 5 micro litros (0,25 microgramas) do anticorpo monoclonal 0KT4 (Ortho) seguido da colheita dos complexos imunes com 10 microlitros dePansorbin. Os precipitados foram lavados duas vezes em 1X McDLB e uma vez em ãgua, depois eluido com eluição a 100 graus C durante 2 minutos em tampão de amostra (0,12M Tris-HCl pH 6,8, 4% de SDS, 0,7 M mercaptoetanol, 20% de glicerol e 0,1% de azul de bromofenol). As moléculas de CD4 foram ligadas de

-Wmodo saturãvel por gh120 e deram uma curva de ligação de acção de massa simples. Os sobrenadantes de células sujeitas a transfecção simuladas deram um nível de gp12Q especificamente ligada inferior a 1% ao encontrado para sobrenadantes contendo CD4-solúvel. Análise de Scatchard revelou uma única classe de sítios de ligação em cada uma das moléculas, com constantes de dissociação aparentes (Kd) de 1,3x10⁹M, 0,83x10⁹ M e 0,72x10~⁹ M para CD4 intacto, CD4T e gDC4T respectivamente.

Os valores obtidos para a ligação CD4-gp120 em solução são comparáveis à afinidade prêviamente medida para ligação de gp120 a CD4 em células totais (Kd=4,0 x 10~⁹ M. Lasky, Cell, supra).

Secção 6

Para produzir derivados de CD4 secretados que não resíduos de aminoácidos estranhos, construiram-se dois plasmídeos para expressar em células 293. Os plas^ mídeos contêm genes CD4 que foram truncados sem a adição de resíduos extra e são referidos como pRKCD4 N1a e pRKCD4TP e foram construídos como se segue:

fragmento 14 contendo o gene CD4 com o fragmento de restrição N1 a111 eliminado foi ligado ao fragmento 16 que é pRK5 digerido com EcoRI e BamHI. A mistura de ligação foi usada para transformar células /. coli estirpe 294, a cultura transformada foi semeada em placas contendo meio com ampicilina e seleccionadas colónias resistentes. 0 DNA de plasmídeo foi preparado a partir de transformantes e testado por análise de restrição quanto à presença do fragmento correcto. 0 plasmídeo resultante ê designado pRKCD4 N1a.

Fez-se DNA sintético para ligar ao sítio Hpal I em 1176 pb que quando ligado terminaria a tradução a seguir ao resíduo de aminoãcido 370 de CD4 maduro (fragmen-48

to 27). 0 outro extremo deste fragmento foi destinado à ligação a fragmentos de restrição BamHI. pUCCD4 foi digerido com BstEII e HpalI e o fragmento de 382 pb contendo parte do gene CD4 foi recuperado (fragmento 28). Os fragmentos 27 e 28 foram ligados e depois digeridos com BstEII para reduzir os fra£ mentos dimerizados 9 monómeros e o fragmento resultante de 401pb foi recuperado (fragmento 29).

pRKCD4 foi digerido com BstII e

BamHI e o fragmento compreendendo o grosso do plasmídeo (fragmento 30) foi isolado e ligado ao fragmento 29. A mistura de ligação foi transformada em £. coli estirpe 294, a cultura transformada semeada em placas de meio com ampicilina e as colónias resistentes seleccionadas. 0 DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos transformantes e testado por análise de restrição quanto à presença do fragmento correcto. 0 plasmídeo resultante foi referido como pRKCD4TP. Ambos os plasmídeos foram usados para transfectar células 293 para dar origem a linhas celulares estáveis expressando CD4 variante como descrito acima.

Secção 7

Contruiram-se dois plasmídeos para dirigir a expressão de CD4 secretado sem resíduos de aminoácidos estranhos em células CHO. Estes são referidos como pSVeCD4AN1aSVDHFR e pSVeCD4TPSVDHFR e foram construídos como se segue:

pE348HBV.E400D22 foi digerido com Pvul e EcoRl e o fragmento contendo o promotor precoce de SV40 e parte do gene da p-laetamase foi recuperado (fragmento 31). pE348HBV.E400D22 foi digerido com Pvul e BamHI e o fragmento maior contendo o gene da beta-lactamase assim como o promotor precoce de SV40 e o gene DHFR foi isolado (fragmento 32).

Os fragmentos 31 e 32 foram ligados em conjunto com o fragmento 14 e usados para transformar E. ^CQli estirpe 294. A cultura transformada foi semeada em placas com meio tendo ampicilina e as colónias resistentes foram seleccionadas. Preparou-se DNA de plasmídeo a partir de transformantes e testou-se por análise de restrição à presença do fragmento correcto. 0 plasmídeo resultante ê referido como p$VECD4Z>N1 aJVDHFR. Este plasmídeo contam o mesmo fra£ mento de DNA codificador da molécula de CD4 solúvel encontrada no plasmídeo atrás referido pSVeCD4AN1aDHFR (Secção 2).

pRKCD4TP foi digerido com EcoRI e BamHI e o fragmento contendo a região codificadora de CD4 truncada foi isolado e ligado aos fragmentos 31 e 32. A mistura de ligação foi usada para transformar E. coli estirpe 294, a cultura transformada semeada em placas de meio com ampicilina e as colónias resistentes seleccionadas. Preparou-se DNA de plasmídeo a partir dos transformantes e seleccionaram-se as colónias resistentes. 0 DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos transformantes e testado por análise de restrição quanto à presença do fragmento correcto. 0 plasmídeo resultante como pSVeCD4TPSVDHFR. Ambos os plasmídeos foram usados para transfectar células CHO e os transfectante amplificados seleccionados por metotrexato usando processos convencionais.

EXEMPLO 2

As fusões da região V do gene CD4 que é homólogo da região variável dos genes das imunoglobulina (ref. Maddon et al., 1985), â região constante (c) das ca’ /7_r

deiaste γ de imunoglobulina humana são construidas como se segue:

Faz-se DNA sintético para codificar a região C da cadeia fc humana (resíduos (09-214) baseado na sequência publicada por Morin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82: 7025-7029, com a adição no extremo 5' da cadeia codificadora da sequência GGGG, que permite que estecfragmento seja ligado ao sítio BspMI no extremo da região putativa tipo V de CD4. No extremo 3' da região codificadora, adiciona-se um codão de paragem da tradução assim como uma sequência que permita que este extremo seja ligado a fragmentos de restrição BamHI. 0 DNA sintético ê feito em 8 fragmentos, 4 para cada cadeia, 7G-90 bases de comprimento. Estes são emparelhados e ligados antes do isolamento num gel de poliacrilamida (fragment 33).

pRKCD4 ê dirigido com EcoRI e

BspMI e o fragmento de 478 pb contendo a região codificadora do dominio putativo tipo V de CD4 é recuperado (fragmento 34) Os fragmentos 33 e 34 são ligados um ao outro com o fragmento 16 (derivado do vector de expressão pRK5). A mistura de ligação ê usada para transformar j[. col i estirpe 294, a cultura transformador semeada em placas de meio com ampicilina e seleccionados as colónias resistentes. C DNA de plasmídeo ê preparado a partir dos trasformantes e testado por análise de restrição quanto â presença do fragmento correcto. 0 plasmídeo resultante ê referido como pRKCD4CK.

Um plamídeo codificador de uma fusão do dominio tipo V de CD4 com a região Cy2 da imunoglobulina humana ê construído de modo semelhante e referido como pRKCD4C 2. Ambos os plasmídeos não transfectados para células 293, células de micloma ou outras células competentes de modo a obter-se linhas celulares que expressam moléculas de CD4 variante como descrito acima.

-51Expressão em células CHO

Construiram-se plasmideos para dirigir a expressão das imunoadhesons descritas atrãs em células CHO. Estes são referidos como pSV e CD4_4r1SVDHFR, pSVeCD4_2r1SUDHFR, pSVeCD4_e4r] SUDHFR, ρ5νθ004_θ2γ1 SVDHFR, pSV_eCD4_45jSVDHFR e pSVeCD4_2ftSVDHFR.

fragmento 31 foi preparado como descrito atrãs. 0 fragmento 32a foi preparado por digestão do plasmídeo pE348HBV.E400 D22 com BamHI, obtenção de extremos cerses com o fragmento Klenow e os quatro dNTPs, seguido de digestão com Pvul. Os plasmideos pRKCD4₄yp pRKCD4₂ , pRKCD4. e4y1⁵ _PRKCD4_e2r1, pRKCD4₄^ e pRKCD4_2fo foram digeridos separadamente com HindIII, dotados de extremos cerses com o fragmen to Klenow e os quetro dNTPs, depois digerido com EcoRl. Os fragmentos de DNA resultantes foram ligados em conjunto com os fragmentos 31 e 32a e usados para transformar L· coli estirpe 294. Seleccionaram-se colónias e testaram-se quanto à presença do plasmídeo correcto como acima, depois foram usados para transfeetar células CHO e amplificados por selecção com metotrexato usando processos convencionais.

EXEMPLO 3 gDCD4T secretado pelo método do Exemplo 1 foi purificado a partir do meio de cultura celular contendo 10% FBS (soro fetal bovino) ou sem PBS. 0 meio de cultura celular condicionado foi primeiro concentrado por ultrafiltração, depois purificado por cromatografia de imunoafinidade. A coluna de imunoafinidade foi produzida por aco-52-

plamento do anticorpo monoclonal 5B6 de murganho (cujo epítopo está na porção gD de HSV-1. da molécula gDCD4T) a vidro de poro controlado revestido aglicerilo pelo método de Roy et al. 1984. 0 meio de cultura celular concentrado ê aplicado directamente à coluna e as proteínas contaminantes são retiradas por lavagem com tampão de pH neutro. A coluna ê então lavada com tampão neutro contendo cloreto de tetrametilamónio seguido de. tampão neutro contendo Tween 80. 0 gDCD4T ligado ê eluido da coluna com tampão a pH 3 contendo Tween 80 (0,1% p/v) e ê neutralizado imediatamente à medida que ê eluido. 0 gDCD4T eluido e neutralizado ê então concentrado por ultrafi/ tração e dialisado/diafiltrado para mudar o tampão para uma coluna salina fisiológica contendo Tween 80 a aproximadamente 0,1% p/v.

Se não estiver presente o detergente o gDCD4T forma agregados conforme evidenciado pela capacidade da centrifugação a aproximadamente 10 000 Xg durante 2 minutos para remover o gDCD4T da solução. A incubação de gDCD4T a 4^SC em acetato de sódio 0,1 M, 0,5 M NaCl e 0,25 M Tris a pH7 juntamente com BSA, Tween 80 ou glicol como candidatos a estabilizadores mostrou que na ausência de um estabilizador o gDCD4T agrega gradualmente ao longo de 12 dias atê ao ponto em que apenas cerca de 60-70% da proteína permanece solúvel. No entanto, o uso de 0,1% p/v de Tween 80 ou (0,5 mg/ml de BSA assegura que cerca de 100% ou 80% respectivamente, do gDCD4T permanece solúvel ao longo deste período. Surprendentemente o glicerol manteve-se ineficaz como estabilizador e produziu resultados inferiores mesmo relativamente ao controlo. Passados 8 dias cerca de 80% de gDCD4T estava agregado quando guardado na presença de glicerol.

-52a-

EXEMPLO 4

Construiram-se plasmídeos para dirigir a expressão de proteínas contendo diferentes comprimentos do domínio extracelular amino-terminal de CD4 fundido como região constante da imunoglobulina %1 humana. Estes pias mídeos são referidos como pRKCD4_2ri> pRKCD4_e4^, pRKCD4₂^ , pRKCD4_e2y1, pRKCD4_in e pRKCD4_e1y1.

plasmídeo pRKCD4_4r1 contem a posição do gene CD4' desde o codão de iniciação atê ao sítio de fusão a seguir ao codão para o resíduo serina 366 do polipeptideo CD4 maduro, imediatamente seguido da sequência codj_ ficadora da região constante de imunoglobulina humana yp começando no codão para o residuo serina 114 da imunoglobuH na madura humana (Kabat et al).

plasmídeo pRKCD4_e4^.j contem a porção do gene CD4 desde o codão de iniciação até ao sítio de fusão a seguir ao codão do residuo de lisina 360 do polipeptideo CD4 maduro, imediatamente seguido da sequência codj_ ficadora da região constante da imunoglobulina y1 humana, começando no codão do resíduo de serina 114 da imunoglobulina humana madura (Kabat et al.).

plasmídeo pRKCD4₂^ contem a porção do gene CD4 desde o codão de iniciação atê ao sitio de fusão a seguir ao codão do resíduo de glutamina 180 do polipeptideo GD4 maduro, imediatamente seguido da sequência codificadora da região constante da imunoglobulina 7-1 humana, começando no codão do residuo de serina 114 da imunoglobulina 7-1 humana madura (Kabat et al.).

plasmídeo pRKCD4_e2^₁ contem a porção do gene CD4 desde 0 codão de iniciação até ao sitio de fusão a seguir ao codão para 0 residuo de leucina 117 do

-53polipeptídeo CD4 maduro imediatamente seguido da sequência codificadora da região constante da imunoglobulina y1 humana, começando no codão do resíduo de serina 114 da imunoglobulina γ1 humana madura (Kabat et al.).

plasmídeo pRKCD4₁^₁ contém a posição do gene GD4 desde o codão de iniciação atê ao sítio de fusão a seguir ao codão do resíduo de ãcido aspãrtico 105 do polipeptideo CD4 maduro, imediatamente seguido da sequência codificadora da região contante da imunoglobulina γ1 humana, começando no codão resíduo serina 114 da imunoglobulina γ1 humana madura (Kabat et al.).

plasmídeo pRKCD4_g^^ contem a porção do gene CD4 desde o codão de iniciação atê ao sítio de fusão a seguir ao codão do residuo leucina 100 do polipep. tídeo CD4 maduro, imediatamente seguido da sequência codificadora da região constante da imunoglobulina γ1 humana, começando no codão do resíduo de serina 114 da imunoglubolina γ1 humana madura (Kabat et al.).

A construção destes plasmídeos necessita da construção prévia do plasmídeo pRKCD4TP/7'1. Construiu-se como se segue:

Um clone de cDNA codificador da imunoglobulina γ1 humana foi obtido a partir de uma biblioteca de cDNA de figado humano (Clontech Laboratories, Inc.) usando oligonucleotídeos baseados na sequência publicada (Ellison et al., Nucl. Acids Res.¹¹ 10 4071-4079 /1982J e obteve-se um fragmento EcoRI-EagI (o sítio EcoRI foi obtido através de um adaptador) contendo parte da região variável e toda a região constante. Este fragmento foi dotado de extremos cerses com o fragmento Klenow e recuperado por electroforese em gel (Fragmento a1).

plasmídeo.pRKCD4TP foi digerido com Xbal e tratatado com a enzima Klenow e o Fragmento a2 contendo o plasmídeo linearizado foi recuperado por electroforese em gel e ligado ao fragmento a1. A mistura de ligação foi usada para transformar JL col i estirpe 294, a cultura transformada foi semeada em placas de meio com ampicilina e seleccionadas as colónias resistentes. 0 DNA de plasmídeo foi preparado a partir dos transformantes e testado por anãlise de restrição quanto à presença do fragmento correcto na orieii tação correeta (i.e., a região codificadora da imunoglobulina na mesma orientação da região codificadora de CD4 e no extremo 3' da região codificadora de CD4). Este plasmídeo ê referido como pRKCD4TP/*f1 .

Fizeram-se oligonucleotídeos si£ téticos como iniciadores para a mutagénese por deleção para fundir as sequências codificadoras adequadas de IgG1 e CD4 como descrito acima. Estes foram sintetizados como 48-meros compreendendo 24 nucleotídeos de cada lado do sítio de fusão pretendido (i.e., correspondendo aos 8 resíduos COOH-terminais da porção de CD4 pretendida e aos 8 resíduos Nl^-terminais da porção da imunoglobul ina pretendida). 0 plasmídeo pRKCD4TP/7“1 foi usado para transformar £. coli estirpe SR101 e as culturas transformadas semeadas em placas de meio com ampicilina.

As colónias resistentes foram seleccionadas e cultivadas na presença do bacteriófago m13K07 para dar moldes secretados de cadeia e encapsidados de pRKCD4TP/f1. 0 DNA de plasmídeo de cadeia simples foi isolado e usado como molde para as reacções de mutagénese com os oligonucleotídeos sintéticos descritos acima como iniciadores. As reacções de mutagénese foram usadas para transformar EL coli SR101 e as culturas transformadas semeadas em placas de meio com ampicilina. Os transformantes foram testados por hibridação de colónias (ref. Grunstein-Hogness) quanto à presença do sítio de fusão adequado, usando 16 meros como sondas. Estes 16 meros compreendem 8 bases de ambos os lados do sítio de fusão e as condições de hibridação escolhidas foram suficientemente apertadas de modo às SO£

-55das detectarem apenas o produto correctamente fundido. As colónias identificadas como positivas foram seleccionadas e o DNA de plasmídeo foi isolado e usado para transformar E. coli estirpe SR101. As culturas transformadas foram semeadas em placas de meio com ampicilina e as colónias resistentes foram seleccionadas e cultivadas na presença do. bacteriófago m13K07. Prepararam-se os moldes como atrás e seleccionaram-se por sequenciação. Os plasmídeos foram usados para transfectar células 293 usando processos convencionais e testados quanto à expressão e produção como descrito acima.

Expresso Secretado

PRKCD4el7l	-	•
pRKCD4l7l	+	-
pRKCD4e2?i	+	+
pRKCD42^i	+	+
pRKCD4e47x	+	+
pRKCD447^	+	+

Também se construíram plasmídeos para dirigirem a expressão de proteínas de fusão contendo diferentes comprimentos do domínio amino-terminal â porção truii cada da região contante da imunoglobulina v 1 humana, compreeii dendo apenas a região charneira e os domínios constantes CH₂ e CH₃.

Fizeram-se oligonucleotídeos sintéticos como iniciadores para as reacções de mutagênese de mo do a eliminar a sequência de imunoglobulina de Ser114a Cis215 inclusive (Kabat et al.).'Estes foram sintetizados com 48-meros compreendendo 242 nucleotídeos f de cada lado do sítio de

-56fusão pretendido (i.e. correspondendo aos 8 resíduos COOH-terminais da porção CD4 pretendida e aos 8 resíduos NH₂-terminais da parte de imunoglobulina pretendida). Os plasmídeos pRKCD4_4Y>1, pRKCD4₂-^,₁ e pRKCD4₁y₁ foram usados separadamente para transformar coli estirpe SR101 e a cultura transformada semeada em placas de meio com ampicilina. Os transforman tes foram despistados por hibridação de colónias (Grunstein-Hogness) quanto à presença do sítio de fusão adequado usando 46 meros como sondas. Estes 16 meros compreendem 8 bases de cada lado do sítio de fusão e as condições de hibridação escolhidas foram sufieientemente apertadas para as sondas detectarem apenas o produto correctamente fundido. As colónias identificadas como positivas foram seleccionadas e o DNA de plasmídeo isolado e usado para transformar E. coli estirpe SR101. As culturas transformadas foram semeadas em placas de meio com ampicilina e as colónias resistentes seleccionadas e cultivadas na presença do bacteriófago m13K07. Os moldes foram preparados como acima testados por sequênciação.

plasmídeo derivado do plasmídeo pRKCD4_4y1 pRKCD4₂^^ deo pRKCD4 é referido como pRKCD4_4Fc1 ê referido como pRKCD4_2Fc^ ê referido como pRKCD4 , o derivado do plasmídeo e o derivado do plasmí1 Fc 1 · pRKCD4_2Fcp pRKCD4_1Fc1 e pRKCD4_4F^^ são cultivados de modo semelhante ao descrito atrãs e as imunoadhesons¹¹ CD4 sem GH1 recuperadas como aqui descrito algures.

Fusão de cadeia leve

Construiram-se plasmídeos para dirigir a expressão de proteínas contendo diferentes comprimentos do domínio extracelular amino-terminal de CD4 fundido à região constante da imunoglobulina b humana. Estes plasmídeos são referidos com pRKCD4₄y_</ e pRKCD4_e^^.

plasmídeo pRKCD4„. contem a fe porção do gene CD4 desde o codão de iniciação atê ao sítio de fusão a seguir ao imediatamente seguido da sequência da região constante da imunoglobulina humano, começando no codão do resíduo de treomina 109 da imunoglobul ina f_vhumana madura (Kabat et al.).

plasmídeo pRKCD4_e^^ contem a porção do gene CD4 desde o codão de iniciação atê ao sítio de fusão a seguir ao codão do resíduo de lisina 360 do polipeptídeo CD4 maduro, imediatamente seguido da sequência da região constante da imunoglobulina humana, começando no codão do resíduo de treomina 109 da imunoglobulina humana madura jq (Kabat et al_.).

Estes plasmídeos foram construídos de modo análogo ao plasmídeo pRKCD4 descritos atrás, com a seguinte excepção:

A sequência codificadora de jc da imunoglobulina humana (Fig 5) foi ootída de uma biblioteca de cDNA de fígado humano (Clontech Laboratories, Inc.) usando oligonucleotídeos baseados na sequência publicada (Hieter,

P.A. et al., Cell 22: 197-207 /1980J) e obteve-se um fragmento EcoRI-BspMI contendo parte da região variável e toda a região constante. Este fragmento foi dotado de extremos eerses com o fragmento Klenow e quatro dNTPs. Usou-se este fragmento em vez do fragmento a1 para construir o plasmídeo pRKCD4TP/hb.

-58EXEMPLO 5

Cultura, purificação e formulação de variantes CD4

Plasmídeos codificadores de CD4T, proli1-terminal (CD4TP) ou imunoadhesons CD4T foram transfectados com fosfato de cálcio para células CH0-DP7 (numa célula autócrina transformado com proinsulina derivada de CHO; U.S.S. N. 97 472) e os transformantes cultivados em meio selectivo (1:1 HAM F12/DMEM GHT^- contendo 1-10% de soro bovino diafiltrado ou dialisado). Outras células hospedeiras adequadas são células CHO ou células de rim embrionário humano 2930. Os transformantes foram subclonados no mesmo meio mas contendo 500 nm de metotrexato. Seleccionou-se um subclone capaz de secretar GD4T, CD4Tp 500 b, CD4Tp 500 b ê subcultivado num meio DMEM/HAM a cerca de 37²C atê se acumular CD4T na cultura, após o que o meio ê separado das células e o material insolúvel por centrifugação.

meio de cultura de transformantes CD4TP foi concentrado e diafiltrado para baixar a força iónica. 0 concentrado foi passado através de um volume grande de resina de permuta aniónica Q-Sepharose (préviamente equilibrada com 25 mM NaCl, pH 8,5) de modo a adsorver contaminantes do meio de cultura. 0 ponto isoeléctrico de CD4TP ê cerca de 9,5 tornando assim possível discriminar entre formas truncadas de CD4 e a maior parte dos contaminantes por adsorção alternada, respectivamente, numa resina de permuta catiónica como seja carboximeti1- ou sulfonil- Sepharose e uma resl na de permuta, aniónica como seja Sepharose com amónio quaternário. Em adição uma vez que estão presentes domínios altamente positivos no segmento extracelular de CD4 qualquer variante contendo CD4 ê purificado do mesmo modo como CD4TP. 0 meio de cultura não adsorvido do passo de resina de permuta aniónica foi então passado através de uma resina de permuta catió-

-59nica (prêviamente equilibrada com 25 mM NaCl a pH 8,5) pelo que CD4TP foi adsorvido à resina. 0 CD4TP foi eluido com um gradiente de NaCl a pH 8,5, esta variante CD eluíndo a cerca de 0,2 mM NaCl. Adicionou-se sulfato de amónio ao eluato para uma concentração de 1,7 M e a solução foi passada através de uma coluna de resina de cromatografia por interacção hidrofôbica (fenil ou butil Sepharose). 0 CD4TP foi eluido da coluna de interacção hidrofóbica com um gradiente de sulfato de amónio, o CD4TP saindo a cerca de 0,7 M sulfato de amónio. 0 eluji to foi concentrado e o tampão trocado numa coluna G-25 usando tampão de fosfatos salino contendo 0,02% (p/v) de Tween 20 ou Tween 80. 0 CD4TP era solúvel nesta solução, que foi esterificada por filtração e usada para encher frascos como formulação aquosa. Outros tensoactivos poliméricos não iónicos são adequadamente usados com as formulações de CD4, incluindo copolímeros de bloco Pluronic ou polietilenoglicol.

E também possível empregar purificação de GD4 solúvel por imunoafinidade em que o CD4 ê adsorvido a um anticorpo imobilizado contra CD4. Este método sofre da desvantagem da eluição do CD4T em condições ãcidas conduzir à agregação da proteína que so ê evitado parcialmente com níveis elevados de tensoactivo. 0 processo descrito permite o uso de quantidades muito menores de tensoactivo, entre cerca de 0,01 e 0,10% (p/v) de tensoactivo.

processo seguido para a purificação de fusões CD4 com cadeia pesada de imunoglobulina foi concentrar sobrenadantes recombinantes por ultrafiltração e depois adsorver a fusão a proteína A de estafilococus imobilizada em resina. A fusão foi eluida com tampão citrato 0,1 M pH 3 sem sal ou detergente. Esta preparação é tamponada com tampão tris a pH 7,5. As fusões de imunoglobulina com CD4 V1-V4 são ainda facultativamente purificadas pelo processo descrito acima para variantes CD4 não fundidas. As fusões de GD4 e imunoglobulina com CD4 V1-V2 também podem ser purificadas pelo processo acima, excepto não se esperar que o ponto iso-60-

elêctrico desta classe de moléculas seja tão alcalino como o da espécie contendo as quatro regiOes V de CD4.

EXEMPLO 6

Foram determinadas as características de várias variantes de adheson. Como se mostra na tabela 4 as imunoadhesons CD4_{4 1} e CD4_{2 1} mostram um semi-vida no plasma aumentada em coelhos, acoplados com elevada afinidade de ligação a gp120 e uma afinidade para a receptor FC (determinado com células U937) que ê comparável â IgG humana.

TABELA 4 gp!20 KD (nM)^# Fc₇R KD (nM)⁺

Semi-vida de plasma em coelhos (h)

CD4T^{§ CD4}4il

CD4_2ii

ND

2.83+0.25

3.01 + 0.68

0,25

6.4

IgG humano

40_;6

3.52 + 0.5

21dias

«sesè?¹’--³ *

determinado em humanos ⁺ KD foi determinado pelo método de Anderson et al., ¹¹J. Immunol. 125: 2735-2741 (1980) # determinado pelo método de Smith et al., Science 238: 1704-07 (1987) resíduos 1-368 apenas ⁺⁺ A variante de adheson foi injectada intravenosamente coelhos e colheram-se amostras de sangue periódicamente e taram-se quanto à presença da variante de adheson.

Claims (54)

1. REIVINDICAÇÕES:

   13. - Processo para a preparação de um ácido nueleieo codificador de uma variante da sequência de aminoãcidos de uma adesão, caracterizado por se introduzir uma mutação específica de sódio numa sequência de aminoãcidos codificadora de uma adesão.

   23. - Processo de acordo com a re/ vindicação 1, caracterizado por a adesão ser um polipeptideo CD4.

   33. - Processo de acordo com a re/ vindicação 2, caracterizado por a variante ser um polipeptíeo CD4 em que 0 ácido nueleieo codificador do domínio transmembranar foi modificado pelo que 0 polipeptideo CD4 por ele codificado contem um domínio transmembranar inactivado.
2. 4^S. - Processo de acordo com a re/ vindicação 3, caracterizado por 0 domínio transmembranar ter sido inactivado através de sua eliminação ou por substituição do domínio transmembranar por uma sequência de aminoãcidos tendo um perfil de hidropatia substancialmente hidrofílico.

   53. - Processo de acordo com a re/ vindicação 2, caracterizado por a variante compreender uma fusão de (a) um polipeptideo diferente de CD4 e (b) um polipeptídeo CD4.
3. 6^â. - Processo de acordo com a re/ vindicação 5 caracterizado por 0 polipeptideo diferentes do imune naò CD4.

   CD4 ser portador de um epitopo
4. 7^â. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o polipeptídeo diferente de CD4 ser fundido com o extremo amino ou carboxilo de CD4 maduro e o domínio transmembranar de DC4 foi inactivado.
5. 8^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o polipeptídeo diferente compreender uma sequência sinal.
6. 9⁵. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o polipeptídeo diferente conter cerca de 5 a 300 residuos.
7. 10^â. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o polipeptídeo diferente ser capaz de induzir uma resposta imune humoral num animal.
8. 11-. - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o polipeptídeo diferente ser um polipeptídeo virai ou um alergenio.
9. 12^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polipeptídeo diferente ser uma proteína do plasma humano tendo uma semi-vida no pias ma superior aquela em que foi eliminado o dominio transmembra nar.
10. 13⁹. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a variante ser um polipep tídeo de fusão compreendendo pelo menos um domínio tipo V de CD4 fundido com um polipeptídeo compreendendo um dominio cons tante de imunoglobulina.
11. 14^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a adesão ser CD^, CD8 ou o receptor de IgE de alta afinidade.
12. 15^a. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a variante consistir esseii cialmente nas regiões V₁ a V₄ ou V₁ a V₂ do antigénio CD4.
13. 16^a. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pof o ácido nucleico consistir essencialmente na inserção CD4 e pCD4 N1a.
14. 17^a. - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o polipeptídeo diferente ser a alumina, uma lipoproteína ou transferrina.
15. 18^a. - Processo de reivindicação 8, caracterizado por a sequência sequência sinal bacteriana.
16. 19^a. - Processo de reivindicação 15, caracterizado por a variante sencialmente nos resíduos 1-368 de CD4.

    acordo com a sinal ser uma acordo com a consistir es-6520 ^a. - Processo de reivindicação 16, caracterizado por a variante sencialmente nos resíduos 1-180 de CD4.

    acordo com a consistir es21^a. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por o dominio constante da imunoglobulina ser o dominio constante de uma cadeia pesada de IgG.
17. 22^a. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o polipeptídeo diferente ser um polipeptídeo citotoxico.
18. 23^a. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por polipeptídeo citotóxico ser a toxina A da difteria.
19. 24^a. - Processo para a preparação de uma composição caracterizada por se incluir na referida composição uma variante da sequência de aminoácidos de adesão que ê incapaz de se ancorar a membrana celular.
20. 25^a. - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a variante de adesão compreender uma sequência de aminoãcidos de CD4 capaz de se ligar a gpl20.
21. 26^a. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por se incluir ainda um agente para inibição da agregação da variante seleccionada do gru-66po de uma proteína predeterminada e tensioactivo.
22. 27^a. - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o agente ser um tensioactivo.
23. 28^a. - Processo de acordo com a caracterizado por o agente tensioactivo ser reivindicação 27, Tween 80 ou Tween 20
24. 29^a. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por o dominio transmembranar CD4 ter sido eliminado ou ter sido substituído por uma sequêii cia de aminoãcidos tendo um perfil de hidropatia substancialmente hidrofílico.
25. 30^a. - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por se preparar uma composição que e esteril e que ainda compreende um veículo fisiológicamente aceitável.
26. 31^a. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a variante compreender uma sequência de aminoãcidos da imunoglobulina.
27. 32^a. - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a sequência da imunoglobulina compreender uma sequência do dominio constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina.
28. 33^a. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracterizado por o domínio constante estar ligado no seu extremo N ao extremo C de um polipeptideo CD4 com o domínio transmembranar eliminado.
29. 34^a. - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o polipeptideo CD4 conter
30. 35^a. - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracterizado por o polipeptideo CD4 conter
31. 36^a. - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a variante estar na forma de um dimero.
32. 37^a. - Processo de acordo com a reivindicação 36 caracterizado por a composição compreender uma fusão de um dominio tipo V de CD4 a umdominio constante da cadeia pesada de imunoglobulina.
33. 38^a. - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a variante ser seleceionada do grupo constituído por:

    (a) ac_l:

    (b) ac_l-ac_l:· (c) ac_h-[ac_h, ac_l-aç_h, ac_l-v_hc_h, ^vl^cl^_ach· ^ouVl^cl-^vh^ch1:

    (d) ac_l-ac_h-[ac_h, ac_l-ac_h> ac_l-v_hc_h, v_lc_l-ac_h, ^ou v_lc_l-v_hc_h];

    (e) AC_L-V_HC_H-[AC_h, AC_l-AC_h, AC_l-V_H ^cH· ^vL^cL*^acH· ^{ou v}L^cL'^vH^ch]· (f) V_LC_L-AC_H-[AC_H, ac_l-ac_h, ac_l-v_hCh. v_lc_l-ac_h. ^{ou v}L^cL'^vH^ch1. ou (g) [A-Y]_n-[V_LC_L-V_HC_H] em que A e um polipeptideo CD4 contendo um dominio tipo região variável de CD4: V_L, V_H, C_L e representam domínios variáveis ou constantes das cadeias leve e pesada de uma imunoglobulina; n é um inteiro; e y designa o resíduo de um agente de ligação cruzada covalente.
34. 39^â. - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracterizado por os domínios e V_H serem capazes de se ligarem a um antigénio predeterminado.
35. 40^â. - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracterizado por a sequência de imunoglobulina ser obtida a partir de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD ou IgM.
36. 41^â. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a variante compreender um polipeptideo diferente de CD4 que não ê imunogênio em humanos.

    -69<Ssbe—
37. 42^ã. - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por a variante compreender um polipeptídeo que e imunogênico em humanos.
38. 43^â. - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por a variante compreender um polipeptídeo tendo uma semivida no plasma humana humano superior a cerca de 20 horas.
39. 44a. _ p_rocesso de acordo com a reivindicação 41, caracterizado por a variante compreender um polipeptídeo de transferrina humana, apoliproteína ou albumina.
40. 45^â. - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a variante compreender um polipeptídeo citotoxico.
41. 46^â. - Processo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado por 0 polipeptídeo citotóxido ser a cadeia A de ricino ou a toxina A da difteria.
42. 47^â. - Processo para a preparação de um polipeptídeo caracterizado por se incluir no referido polipeptídeo uma sequência de aminoácidos de CD4 capaz de se ligar a gp120 que estâ ligada a (a) polipeptídeo tendo uma semi-vida no plasma superior a cerca de 20 horas ou (b) um polipeptídeo citotóxico.
43. 48^â. - 'Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por o polipeptídeo de (a) ser transfenina, uma apolipproteina ou albumina.
44. 49^â. - Processo de acordo com a reivindicação 47, caracterizado por o polipeptídeo citotóxico estar ligado de modo cruzado ao domínio tipo variavel de CD4 por um agente de ligação cruzada.
45. 50^ã. - Método para a preparação de uma variante de adesão caracterizado por compreender a transfecção de uma célula hospedeira com o ãcido nucleico da reivindicação 1.
46. 51^â. - Método para a preparação de uma variante de adesão caracterizado por compreender a recuperação de uma variante a partir da cultura de uma célula hospedeira transfectada com o ácido nucleico da reivindicação

    1.
47. 52^â. - Método de acordo com a re/ vindicação 51, caracterizado por a adesão ser CD4 e a variante ser recuperada a partir do meio de cultura da célula hospedeira.
48. 53^â. - Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por a variante ser recuperada pela adsorção a uma resina de permuta cationica.
49. 54a. _ Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado:por a variante ser recuperada por adsorção de contaminantes a uma resina de permuta aniónica.
50. 55^a. - Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por a variante não possuir um domínio transmembranar funcional.
51. 56^a. - Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado por a variante ser recuperada por cromatografia de imunoafinidade.
52. 57^a. - Método de acordo com a reivindicação 56, caracterizado por a cromatografia de imunoafinidade ser dirigida contra um polipeptídeo diferente de CD4 que é fundido a CD4.
53. 58^a. - Método para o tratamento de uma infecção por HIV, caracterizado por compreender a administração a um paciente infectado com HIV, de uma dose terapeuticamente eficaz de uma variante da sequência de aminoácidos de CD4; sendo essa dose tal que seja c.p.7 de manter uma concentração correspondente a mais do que cerca de 100 ng de CD4 solúvel por ml de plasma.
54. 59^a. - Vector replicável caracterizado por compreender o ácido nucleico da reivindicação 1.