DE3856189T3

DE3856189T3 - Adhäsionsvarianten

Info

Publication number: DE3856189T3
Application number: DE3856189T
Authority: DE
Inventors: Daniel J. San Mateo CAPON; Timothy J. Hillsborough GREGORY
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1987-10-02
Filing date: 1988-10-03
Publication date: 2005-11-10
Anticipated expiration: 2008-10-04
Also published as: NO901311L; NZ226414A; CA1341427C; HK1010790A1; EP0383799A1; DE3856189T2; DK80590A; NO303580B1; DK80590D0; ATE166387T1; DE3856189D1; EP0314317B2; EP0383799B2; JP2888529B2; EP0383799B1; DK175930B1; WO1989002922A1; NO901311D0; ES2121733T3; PT88641A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Anmeldung betrifft Zusammensetzungen für Antiviral- oder Immunmodulations-Therapie. Insbesondere betrifft sie Zusammensetzungen, die sich zur Behandlung von Infektionen des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) eignen.
Die primäre immunologische Anomalie aufgrund von HIV-Infektion ist der fortschreitende Schwund und die zunehmende funktionelle Beeinträchtigung von T-Lymphozyten, die das CD4-Zelloberflächen-Glykoprotein exprimieren (H. Lane et al., Ann. Rev. Immunol. 3, 477 [1985]). CD4 ist ein nicht-polymorphes Glykoprotein mit Homologie zur Immunglobulin-Gen-Überfamilie (P. Maddon et al., Cell 42, 93 [1985]). Zusammen mit dem CD8-Oberflächenantigen definiert CD4 zwei getrennte Untergruppen reifer peripherer T-Zellen (E. Reinherz et al., Cell 19, 821 [1980]), die sich durch ihre Fähigkeit unterscheiden, mit nominellen Antigenzielen in Zusammenhang mit den Haupt-Histokompatibilitätskomplex-(MHC-)Antigenen der Klasse I bzw. Klasse II in Wechselwirkung zu treten (S. Swain, Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 7101 [1981]; E. Engleman et al., J. Immunol. 127, 2124 [1981]; H. Spitz et al., J. Immunol. 129, 1563 [1982]; W. Biddison et al., J. Exp. Med. 156, 1065 [1982]; und D. Wilde et al., J. Immunol. 131, 2178 [1983]). Zumeist zeigen CD4-T-Zellen den Helfer/Inducer-T-Zellphenotyp (E. Reinherz, siehe oben), obwohl CD4-T-Zellen, die als zytotoxische/Suppressor-T-Zellen charakterisiert sind, ebenfalls identifiziert wurden (Y. Thomas et al., J. Exp. Med. 154, 459 [1981]); S. Meuer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4395 [1982]; und A. Krensky et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 2365 [1982]). Der Verlust der CD4-Helfer/Inducer-T-Zellfunktion liegt wahrscheinlich den schweren Defekten der zellulären und humoralen Immunität zugrunde, die zu opportunistischen Infektionen und Malignitäten führen, die für die erworbene Immunschwächekrankheit AIDS typisch sind (H. Lane, s.o.).
Untersuchungen von HIV-I-Infektion fraktionierter CD4- und CD8-T-Zellen normaler Spender und von AIDS-Patienten zeigten, daß der Schwund von CD4-T-Zellen das Ergebnis der Fähigkeit von HIV-I ist, diese T-Lymphozyten-Untergruppe selektiv zu infizieren, sich darin zu replizieren und sie schließlich zu zerstören (D. Klatzmann et al., Science 225, 59 [1984]). Die Möglichkeit, daß CD4 selbst eine wesentliche Kom ponente des zellulären Rezeptors für HIV-I ist, wurde zum ersten Mal durch die Beobachtung aufgezeigt, daß monoklonale, gegen CD4 gerichtete Antikörper HIV-I-Infektion und die Induktion von Synzytien blockieren (A. Dalgleish et al., Nature [London] 312, 767 [1984]; J. McDougal et al., J. Immunol. 135, 3151 [1985]). Diese Hypothese bestätigte sich, als gezeigt wurde, daß sich ein Molekülkomplex zwischen CD4 und gp120, dem wichtigsten Hüllenglykoprotein von HIV-I, bildet (J. McDougal et al., Science 231, 382 [1986]; sowie durch die Entdeckung, daß HIV-I-Tropismus üblicherweise nicht-permissiven menschlichen Zellen nach stabiler Expression einer CD4-cDNA verliehen werden kann (P. Maddon et al., Cell 47, 333 [1986]). Außerdem scheinen sich die neurotropen Eigenschaften von HIV-I, die sich in einer hohen Inzidenz von Dysfunktionen des Zentralnervensystems bei mit HIV-I infizierten Individuen (W. Snider et al., Ann. Neurol. 14, 403 [1983]), und die Fähigkeit, HIV-I im Hirngewebe und Zerebrospinalflüssigkeit von AIDS-Patienten nachzuweisen, äußern (G. Shaw et al., Science 227, 177 [1985]; L. Epstein, AIDS Res. 1, 447 [1985]; S. Koenig, Science 233, 1089 [1986]; D. Ho et al., N. Engl. J. Med. 313, 1498 [1985]; J. Levy et al., Lancet II, 586 [1985]), durch die Expression von CD4 in Zellen neuronalen, glialen und Monozyten/Makrophagen-Ursprungs zu erklären (P. Maddon, Cell 47, 444 [1986]; 1. Funke et al., J. Exp. Med. 165, 1230 [1986]; B. Tourvieille et al., Science 234, 610 [1986]).
Neben der Bestimmung der Anfälligkeit für HIV-I-Infektion scheint die Manifestation zytopathischer Effekte in der infizierten Wirtszelle CD4 zu umfassen. Man stellte fest, daß Antikörper gegen CD4 die Fusion von uninfizierten CD4-T-Zellen mit HIV-I-infizierten Zellen in vitro hemmt; außerdem sterben die durch dieses Ereignis produzierten riesigen multinukleären Zellen kurz nach ihrer Bildung ab, was zum Schwund der Population an CD4-Zellen führt (J. Lifson et al., Science 232, 1123 [1986]). Die Bildung von Synzytien erfordert auch gp120-Expression und kann durch Co-Kultivierung von CD4-positiven Zellinien mit Zellinien, die das HIV-I-env-Gen exprimieren, in Abwesenheit anderer viraler Struktur- oder Regler-Proteine hervorgerufen werden (J. Sodroski et al., Nature 322, 470 [1986]; J. Lifson et al., Nature 323, 725 [1986]). Somit stellt beim Vermitteln sowohl von anfänglicher Infektion durch HIV-I als auch des schließlich erfolgenden Zelltods die Wechselwirkung zwischen gp120 und CD4 einen von mehreren entscheidenden Zugangspunkten im viralen Lebenszyklus dar, die sich für therapeutische Intervention eignen (H. Mitsuya et al., Nature 325, 773 [1987]).
Die bekannte Sequenz des CD4-Vorläufers sagt ein hydrophobes Signalpeptid, einen extrazellulären Bereich von etwa 370 Aminosäuren, einen hochgradig hydrophoben Abschnitt mit signifikanter Identität zur membranüberspannenden Domäne der MHC-β-Kette der Klasse II und eine hochgradig geladene intrazelluläre Sequenz von 40 Resten voraus (P. Madden, Cell 42, 93 [1985]). Die extrazelluläre Domäne von CD4 besteht aus vier fortlaufenden Bereichen, die jeweils Aminosäure- und Strukturähnlichkeit mit den variablen und verbindenden (V-J-)Domänen von leichten Immunglobulin-Ketten aufweisen, und aus verwandten Bereichen bei anderen Mitgliedern der Immunglobulin-Gen-Überfamilie (eine Unterklasse davon ist hierin als „Adhäsone" definiert). Diese strukturell ähnlichen Bereiche von CD4 werden als V₁-, V₂-, V₃- und V₄-Domäne bezeichnet (in 3 mit 1-4 benannt).
Eine erfolgreiche Strategie bei der Entwicklung von Arzneimitteln zur Behandlung vieler rezeptorvermittelter Anomalien war bislang die Identifikation von Antagonisten, die die Bindung des natürlichen Liganden blockieren. Da sich das CD4-Adhäson üblicherweise an die Erkennungsstellen der HIV-Hülle bindet, scheint es ein Kandidat zur therapeutischen Maskierung dieser HIV-Stellen zu sein, wodurch virale Infektivität blockiert wird. CD4 voller Länge und andere Adhäsone sind jedoch Zellmembranproteine, die in der Lipid-Doppelschicht von Zellen verankert sind. Die Gegenwart von Membrankomponenten ist vom Standpunkt der Herstellung und Reinigung ungünstig. Da Adhäsone normalerweise nur auf Zelloberflächen vorhanden sind, wäre es außerdem wünschenswert, Adhäsone in einer Form zu produzieren, die im Kreislauf stabiler ist. Selbst in gekürzter Form ist lösliches CD4-Adhäson (im allgemeinen als CD4T bezeichnet) möglicherweise als Therapeutikum nicht optimal, da es eine relativ kurze biologische Halbwertszeit besitzt, sich nicht besser an HIV bindet als Zelloberflächen-CD4, die Plazenta- oder anderen biologischen Schranken möglicherweise nicht besser überwindet und lediglich die HIV-Erkennungsstellen markiert, ohne selbst eine Viren oder infizierte Zellen abtötende Funktionalität zu tragen.
Demzufolge ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, lösliche, sekretierte Adhäsone zu produzieren. Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, CD4-Derivate, die sich zur Behandlung von AIDS und ähnlichen Krankheiten eignen, in einer Weise zu produzieren, die durch das extreme Ausmaß an bei verschiedenen HIV-I-Isolaten und deren jeweiligen env-Polypeptiden festgestellter genetischer Variation (J. Coffin, Cell 46, 1 [1986]) im wesentlichen unberührt bleibt. Ein weiteres Ziel ist die Herstellung von Adhäsonen, die mit anderen Polypeptiden fusioniert sind, um Moleküle zur therapeutischen Verwendung mit neuartigen Funktionalitäten, wie z.B. den oben beschriebenen, oder diagnostische Reagentien für den in vitro-Assay von Adhäsonen oder deren Liganden bereitzustellen. Ein besonderes Ziel ist die Bildung von Molekülen, um Toxine oder Effektormoleküle (z.B. die Fc-Domäne von Immunglobulin) gegen Zellen zu richten, die Rezeptoren für die Adhäsone tragen, z.B. HIV-gp120 im Falle von CD4, oder um damit die Reinigung der Adhäsone zu vereinfachen. Ein weiteres Ziel ist die Bereitstellung stabiler, hochgradig gereinigter Adhäson-Präparate.
Zusammenfassung
Die Ziele der Erfindung werden durch Bereitstellung von Nukleinsäure erreicht, die für eine Aminosäuresequenzvariante eines Adhäsons (CD4) kodiert, insbesondere eine Variante, in der die Transmembran-Domäne solcherart modifiziert ist, daß sie nicht mehr in der Zellmembran verankert werden kann. Solche Varianten werden als lösliches CD4 bezeichnet.
Adhäsonvarianten werden nach einem Verfahren produziert, das umfasst: (a) das Transformieren einer Wirtszelle mit Nukleinsäure, die für eine Aminosäuresequenz-Variante eines Adhäsons kodiert, (b) das Kultivieren der Wirtszelle und (c) das Gewinnen der Adhäsonvariante aus dem Wirtszellkulturmedium oder aus Lysaten der Wirtszelle.
In speziellen Ausführungsformen werden die Ziele der Erfindung erreicht, indem eine Adhäsonvariante bereitgestellt wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (a) einer CD4-Adhäson-Aminosäuresequenz-Variante mit einer inaktivierten Transmembran-Domäne und (b) einem Polypeptid, umfassend eine extrazelluläre Adhäsondomäne, die mit der Sequenz eines Polypeptids fusioniert ist, das dem Adhäson fremd ist, wobei dieses letztere z.B. für eine extrazelluläre CD4-Domäne aus einem Cytotoxin, einem Immungen oder einem Protein mit einer langen Plasma-Halbwertszeit wie z.B. einer konstanten Immunglobulin-Domäne ausgewählt ist, und für andere extrazelluläre Adhäsondomänen ein konstanter Immunglobulin-Bereich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Polypeptid, das eine gp120-Bindedomäne des CD4-Adhäsons umfaßt, an seinem C-Terminus mit einer konstanten Immunglobulin-Domäne fusioniert oder mit einem zytotoxischen Polypeptid, wie z.B. Ricin, verbunden.
Die hierin bereitgestellten CD4-Adhäsonvarianten werden in pharmakologisch annehmbaren Vehikeln zur Verabreichung an Patienten, die eine antivirale, neuromodulierende oder immunmodulierende Therapie benötigen, vor allem an mit HIV infizierte Patienten, und zur Modulation der Zelladhäsion gereinigt und formuliert.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Die 1a–1c zeigen die Aminosäure- und Nukleotidsequenz einer sekretierten Form des CD4-Adhäsons. Die Signalverarbeitungsstelle ist mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Die 2a–2c zeigen die Aminosäure- und Nukleotidsequenz einer Fusion der Herpes-gD-Leader- und N-terminalen 27 Reste mit dem vermeintlichen reifen N-Terminus von CD4T.
3 zeigt die Strukturelemente des nativen und löslichen CD4-Adhäsons, der nativen menschlichen IgG₁-(γ₁-)Schwerkette und zwei Beispiele für Schwerketten-CD4-Chimären.
Die 4a–4b sind eine Karte des mit Linker versehenen menschlichen IgG₁-(γ₁-)Kettenfragments, das zur Herstellung von CD4-Fusionen verwendet wird. Insertstellen werden als γ₁ und Fc bezeichnet.
5 ist eine Karte des menschlichen κ-Leichtkettenfragments, das sich am Pfeil für CD4-Fusionen eignet, der durch V_KJ_K (leichte Variable und Verbindung) und C_K (leichte Konstante) flankiert ist.
Ausführliche Beschreibung
Adhäsone sind Zelloberflächen-Polypeptide mit einer extrazellulären Domäne, welche die Sequenz eines Mitglieds der Immunglobulin-Gen-Überfamilie aufweist; ausgenommen sind allerdings hochgradig polymorphe Mitglieder dieser Überfamilie, ausgewählt aus der Gruppe von Haupt-Histokompatibilitäts-Antigenen der Klasse I und II, Immunglobulinen und T-Zellen-Rezeptor-α-, β-, γ- und δ-Ketten. Beispiele für Adhäsone sind CD1, CD2, CD4, CD8, CD28, die γ-, δ- und ε-Ketten von CD3, OX-2, Thy-1, die interzellulären oder Neuralzellen-Adhäsionsmoleküle (I-CAM oder N-CAM), mit Lymphozytenfunktion assoziiertes Antigen-3 (LFA-3), neurozytoplasmatisches Protein (NCP-3), Poly-Ig-Rezeptor, mit Myelin assoziiertes Glykoprotein (MAG), IgE-Rezeptor hoher Affinität, das Haupt-Glykoprotein von peripherem Myelin (Po), von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor-Rezeptor, Kolonie stimulierender Faktor-1-Rezeptor, Makrophagen-Fc-Rezeptor, Fc-γ-Rezeptoren und carcinoembryonales Antigen. Bevorzugte Adhäsone sind CD4, CD8 und IgE-Fc-Rezeptor hoher Affinität.
Die vorliegende Erfindung stellt in einem Aspekt ein Immunglobulin-Schwerketten-Dimer bereit, worin die variable Region einer Immunglobulin-Schwerkette durch die Sequenz der extrazellulären Domäne eines Zelloberflächenmitglieds der Immunglo bulin-Gen-Überfamilie ersetzt ist, wobei das Überfamilienmitglied kein Haupt-Histokompatibilitäts-Antigen der Klasse I oder Klasse II, kein Immunglobulin und weder die α-, β-, γ- noch die δ-Kette eines T-Zellenrezeptors ist, wobei das Dimer ein Polypeptid umfasst, das die mit einer konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette fusionierte extrazelluläre Domäne umfasst, und worin im Dimer die extrazelluläre Domäne einen Liganden des Mitglieds der Immunglobulin-Gen-Überfamilie bindet.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Polypeptid bereit, das eine extrazelluläre Domäne von CD4 umfasst, die mit einem Polypeptid fusioniert ist, das nicht zu CD4 gehört.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine CD4-Polypeptid-Aminosäuresequenz-Variante bereit, die eine modifizierte Transmembran-Domäne aufweist, um nicht mehr in der Lage zu sein, in der Zellmembran eingelagert zu werden.
Hierin beschrieben sind Aminosäuresequenz-Varianten von Adhäsonen. Aminosäuresequenz-Varianten von Adhäsonen werden hergestellt, um verschiedene Ziele zu erreichen, z.B. die Erhöhung der Affinität des Adhäsons für seinen Bindepartner, die Erleichterung der Stabilität, Reinigung und Herstellung des Adhäsons, die Verlängerung seiner Plasma-Halbwertszeit, die Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit (siehe oben unter "Hintergrund"), die Einführung zusätzlicher Funktionalitäten und die Herabsetzung der Stärke oder ein verringertes Auftreten von Nebenwirkungen während des therapeutischen Einsatzes des Adhäsons. Aminosäuresequenz-Varianten von Adhäsonen gehören einer oder einer Kombination der folgenden Klassen an: Insertions-, Substitutions- oder Deletionsvarianten.
Aminosäuresequenz-Insertionsvarianten sind jene, in denen ein oder mehrere Aminosäurereste, die dem Adhäson fremd sind, in eine vorbestimmte Stelle im Adhäson eingeführt werden -- einschließlich von C- oder N-Termini. Solche Varianten werden als Fusionen des Adhäsons mit einem anderen Polypeptid bezeichnet. Solche andere Polypeptide enthalten andere Sequenzen als jene, die normalerweise im Adhäson an der eingefügten Position zu finden sind. Mehrere Gruppen von Fusionen werden beschrieben. Immunologisch aktive Adhäsionsfusionen umfassen ein Adhäson und ein Polypeptid, das ein Nicht-Adhäson-Epitop enthält. Das Nicht-Adhäson-Epitop ist jedes immunologisch kompetente Polypeptid, d.h. jedes Polypeptid, das einen Immunresponse im Tier hervorrufen kann, an das die Fusion verabreicht werden soll, oder das von einem gegen das Nicht-Adhäson-Polypeptid gebildeten Antikörper gebunden werden kann. Typische Nicht-Adhäsonepitope sind jene, die von Allergenen, Autoimmunepitopen oder anderen hochwirksamen Immunogenen oder Antigenen getragen werden, die von bereits existierenden Antigenen im Fusionsempfänger erkannt werden, z.B. bakteriellen Polypeptiden, wie z.B. trpLE, β-Galactosidase, viralen Polypeptiden, wie z.B. Herpes-gD-Protein und dergleichen. Immungen-Fusionen werden durch in vitro-Vernetzung oder rekombinante Zellkultur, die mit für ein Immungen-Polypeptid kodierender DNA transformiert ist. Vorzugsweise ist die Immungen-Fusion eine, bei der die Immungen-Sequenz mit dem Adhäsonantigen oder einem Fragment davon über eine oder mehrere Peptidbindungen verbunden oder darin insertiert wird. Diese Produkte bestehen daher aus einer linearen Polypeptidkette, die Adhäsonepitope und zumindest ein dem Adhäson fremdes Epitop enthält. Die Epitope können an einer beliebigen Stelle im Adhäsonmolekül oder einem Fragment davon eingeführt werden. Solche Fusionen erfolgen günstigerweise in rekombinanten Wirtszellen oder unter Einsatz bifunktioneller Vernetzer. Die Verwendung eines Vernetzers zur Fusion des Adhäsons mit dem immunogenen Polypeptid ist nicht so vorteilhaft wie eine lineare Fusion, da die vernetzten Produkte nicht so leicht in strukturell homogener Form zu synthetisieren sind.
Diese immunogenen Insertionen sind besonders nützlich, wenn sie in einen pharmakologisch annehmbaren Träger formuliert und an einen Probanden verabreicht werden, um Antikörper gegen das Adhäson zu bilden, die sich ihrerseits zur Diagnostik oder Reinigung des Adhäsons nach an sich bekannten Immunaffinitätsverfahren eignen. Alternativ dazu werden bei der Reinigung von Adhäsonen Bindepartner für das fusionierte Nicht-Adhäson-Polypeptid, z.B. Antikörper, Rezeptoren oder Liganden, dazu verwendet, die Fusion aus unreinen Gemischen zu adsorbieren; da nach wird die Fusion eluiert und, falls gewünscht, das Adhäson aus der Fusion gewonnen, z.B. durch enzymatische Spaltung.
Andere Fusionen, die immunologisch aktiv sein können oder nicht, sind Fusionen der Adhäsonsequenz mit einer zum Adhäson heterologen Signalsequenz, Fusionen von transmembranmodifizierten CD4-Adhäsonen, z.B. mit Polypeptiden mit verlängerter Plasma-Halbwertszeit (üblicherweise mehr als etwa 20 Stunden), wie z.B. Immunglobulin-Ketten oder Fragmenten davon, sowie Fusionen mit zytotoxischen Funktionalitäten. Signalsequenzfusionen werden durchgeführt, um die Sekretion des Adhäsons rascher zu lenken. Das heterologe Signal ersetzt das native Adhäsonsignal, und wenn die resultierende Fusion erkannt, d.h. von der Wirtszelle verarbeitet und gespalten wird, wird das Adhäson sekretiert. Signale werden auf der Grundlage der geplanten Wirtszelle ausgewählt und können bakterielle Hefe-, Säugetier- und Virensequenzen sein. Das Herpes-gD-Glykoprotein-Signal eignet sich für Säugetier-Expressionssysteme.
Plasmaproteine mit einer verlängerten Plasma-Halbwertszeit als transmembranmodifiziertes CD4 sind z.B. Serumalbumin, Immunglobuline, Apolipoproteine und Transferrin. Vorzugsweise ist die Adhäson-Plasmaprotein-Fusion im Tier, in dem sie eingesetzt wird, nicht signifikant immunogen, und das Plasmaprotein ruft aufgrund seiner normalen biologischen Aktivität in Patienten keine unerwünschten Nebenwirkungen hervor.
In einer spezifischen Ausführungsform ist die extrazelluläre Adhäsondomäne mit dem konstanten Bereich einer Immunglobulin-Sequenz verbunden. Die resultierenden Produkte werden hierin als Immunadhäsone bezeichnet. Immunglobuline und bestimmte ihrer Varianten sind bekannt, und es wurden viele davon in rekombinanter Zellkultur hergestellt. Siehe z.B. US-A-4.745.055; EP-A-256.654; Faulkner et al., Nature 298, 286 (1982); EP-A-120.694; EP-A-125.023; Morrison, J. Immun. 123, 793 (1979); Köhler et al., P.N.A.S. USA 77, 2197 (1980); Raso et al., Cancer Res. 41, 2073 (1981); Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2, 239 (1984); Morrison, Science 229, 1202 (1985); Morrison et al., P.N.A.S. USA 81, 6851 (1984); EP-A-255.694; EP- A-266.663; und WO 88/03559. Neu zusammengesetzte Immunglobulin-Ketten sind auch bekannt. Siehe z.B. US-A-4.444.878; WO 88/03565; und EP-A-68.763 und die darin zitierten Verweise.
Üblicherweise werden die Domänen von Adhäsonen, die zu Immunglobulinen homolog und in ihrer nativen Umgebung extrazellulär sind, C-terminal mit dem N-Terminus des konstanten Bereichs von Immunglobulinen statt dessen variablen Bereichs/Bereichen fusioniert, wobei zumindest funktionell aktive Hinge-, CH2- und CH3-Domänen des konstanten Bereichs einer Immunglobulin-Schwerkette beibehalten werden. Dies erfolgt normalerweise durch Konstruktion der geeigneten DNA-Sequenzen und deren Expression in rekombinanter Zellkultur. Immunglobuline und andere Polypeptide mit verlängerter Plasma-Halbwertszeit werden mit den extrazellulären oder Ligandenbindedomänen anderer Adhäsone in gleicher Weise fusioniert.
Die Begrenzungsdomänen für die V-artigen CD4-Bereiche (V1–V4) sind jeweils etwa 100–109, etwa 175–184, etwa 289–298 und etwa 360–369 (basierend auf der Vorläufer-CD4-Aminosäuresequenz, in der das erste met –25 ist; 1a). CD4-Sequenzen, die beliebige der CD4-V-Domänen enthalten, sind mit der Immunglobulin-Sequenz fusioniert. Vorzugsweise sind die V₁-Domäne von CD4 oder CD4 ohne Transmembran- und zytoplasmatische Domänen an deren C-Termini mit dem konstanten Immunglobulin-Bereich fusioniert. Die genaue Stelle, an der die Fusion erfolgt, ist nicht entscheidend; die hierin angegebenen Begrenzungsdomänen dienen nur der Orientierung, wobei andere Stellen, die an die V-Bereiche angrenzen oder darin liegen, ausgewählt werden können, um die Sekretion oder Bindeeigenschaften des CD4 zu optimieren. Die optimale Stelle wird durch Routineversuche bestimmt. Allgemein wurde festgestellt, daß die Fusionen intrazellulär exprimiert werden, doch hinsichtlich des Sekretionsgrads der Fusionen aus rekombinanten Wirten bestehen starke Schwankungen. Beispielsweise zeigt nachstehende Tabelle die unterschiedlichen Immunglobulin-Fusionen, die nach dem Verfahren der Erfindung erhalten wurden. In allen Beispielen von CD4-Immunadhäsonen wurde das CD4-Signal dazu verwendet, die Sekretion aus 293-Zellen zu lenken. Ein kleingeschriebenes m steht für Mäuseursprung, während ein kleingeschriebenes h für menschlichen Ursprung steht. V und C sind Abkürzungen für variable bzw. konstante Immunglobulin-Domänen. Die tiefgestellten Zahlen geben die Anzahl an in Klammern stehenden Einheiten an, die sich im jeweiligen Multimer befinden. Es ist zu beachten, daß man davon ausgeht, daß die Ketten der Multimere in gleicher Weise wie native Immunglobuline disulfidgebunden sind. Die CD4-Immunadhäsone enthielten typischerweise entweder die ersten 366 N-terminalen Reste von CD4 (CD4₄) oder die ersten 180 N-terminalen Reste von CD4 (CD4₂), die an ihrem C-Terminus mit dem konstanten κ-(Leicht-)Ketten- oder IgG1-Schwerketten-Bereich (γ1) verbunden sind.
Tabelle I
Interessanterweise ist aus obiger Tabelle ersichtlich, daß das menschliche CD4-Schwerketten-Immunadhäson als Dimer sekretiert wurde, während die analoge Mäusekonstruktion nicht nachgewiesen wurde (dies schließt allerdings die intrazelluläre Akkumulation des Proteins nicht aus). Die Fähigkeit der hCD4-hCγ1-Transformanten, Schwerketten-Dimer zu produzieren, war unerwartet, da frühere Arbeiten nahegelegt hatten, daß schwere Immunglobulin-Ketten nur dann sekretiert werden, wenn die Wirte mit Nukleinsäure co-transformiert werden, die sowohl für die schwere als auch für die leichte Kette kodiert (Valle et al., Nature 241, 338 [1981]). Gemäß der Erfindung werden problemlos CD4-IgG-Immunadhäson-Chimären sekretiert, worin das CD4-Epitop in Schwerketten-Dimeren, Leichtketten-Monomeren oder -Dimeren sowie Schwer- und Leichtketten-Heterotetrameren vorhanden ist, worin das CD4-Epi top mit einer oder mehreren leichten oder schweren Ketten fusioniert vorliegt, einschließlich von Heterotetrameren, worin bis zu (einschließlich) alle vier Analoge des variablen Bereichs aus CD4 stammen. Wenn eine variable Leicht-Schwerketten-Nicht-CD4-Domäne vorhanden ist, wird somit ein heterofunktioneller Antikörper bereitgestellt.
Geeignete Begleiter-Immunglobulin-Kombinationsstellen und Fusionspartner werden aus IgG-1-, -2-, -3- oder -4-Untertypen, IgA, IgE, IgD oder IgM, jedoch vorzugsweise aus IgG-1, erhalten.
Eine bevorzugte Ausführungsform ist eine Fusion eines N-terminalen Abschnitts von CD4, der die Bindestelle für das gp120-Hüllenprotein von HIV enthält, mit dem C-terminalen F_c-Abschnitt eines Antikörpers, der die Effektorfunktionen von Immunglobulin G₁ enthält. Es gibt zwei bevorzugte Ausführungsformen dieser Art: in einer davon ist der gesamte konstante Schwerkettenbereich mit einem Abschnitt von CD4 fusioniert; in einer anderen ist eine Sequenz, die im Hinge-Bereich stromauf von der Papain-Spaltstelle beginnt, die IgG F_c chemisch definiert (Rest 216, wobei der erste Rest des konstanten Schwerkettenbereichs als 114 angenommen wird [Kobat et al., „Sequences of Proteins of Immunological Interest", 4. Ausgabe, 1987], oder analoge Stellen anderer Immunglobuline) mit einem Abschnitt von CD4 fusioniert. Diese Ausführungsformen werden in den Beispielen beschrieben.
Genauer gesagt wird angenommen, daß jene Varianten, in denen eine oder mehrere immunglobulin-ähnliche Domänen eines Adhäsons anstelle des variablen Bereichs einer Immunglobulin-Kette substituiert sind, eine verbesserte in vivo-Plasma-Halbwertszeit aufweisen. Diese Chimären sind in ähnlicher Weise wie chimäre Antikörper konstruiert, in denen eine variable Domäne eines Antikörper einer Spezies anstelle der variablen Domäne einer anderen Spezies substituiert ist. Siehe z.B. EP-A-0.125.023; Munro, Nature 312 (13. Dezember 1984); Neuberger et al., Nature 312 (13. Dezember 1984); Sharon et al., Nature 309 (24. Mai 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984); Morrison et al., Science 229, 1202–1207 (1985); und Boulianne et al., Nature 312, 643–646 (13. Dezember 1984).
Die für die immunglobulin-ähnliche(n) Adhäsondomäne(n) kodierende DNA wird durch ein Restriktionsenzym am oder proximal zum 3'-Ende der DNA, die für die immunglobulin-ähnliche(n) Domäne(n) kodiert, und an einem Punkt der oder in der Nähe der DNA, die für das N-terminale Ende des reifen Adhäsonpolypeptids kodiert (wobei die Verwendung eines anderen Leaders möglich ist), oder am oder proximal zum N-terminalen Kodierbereich für das Adhäson (worin das native Adhäsonsignal verwendet wird) gespalten. Dieses DNA-Fragment kann dann problemlos in die DNA insertiert werden, die für einen konstanten Immunglobulin-Leicht- oder -Schwerkettenbereich kodiert, und gegebenenfalls durch Deletionsmutagenese zurechtgeschnitten. Vorzugsweise ist dies ein menschliches Immunglobulin, wenn die Variante zur in vivo-Therapie für Menschen bestimmt ist. DNA, die für konstante Immunglobulin-Leicht- oder -Schwerkettenbereiche kodiert, ist bekannt oder problemlos aus cDNA-Bibliotheken erhältlich oder wird synthetisiert. Siehe z.B. Adams et al., Biochemistry 19, 2711–2719 (1980); Gough et al., Biochemistry 19, 2702–2710 (1980); Dolby et al., P.N.A.S. USA, 77, 6027–6041 (1980); Rice et al., P.N.A.S. USA 79, 7862–7865 (1982); Falkner et al., Nature 298, 286–288 (1982); und Morrison et al., Ann. Rev. Immunol. 2, 239–256 (1984).
DNA, die für die chimäre(n) Immunglobulin- oder Immunadhäson-Kette(n) kodiert, wird zur Expression in eine Wirtszelle transfiziert. Wenn die Wirtszelle vor der Transfektion ein Immunglobulin produziert, muß man nur mit dem Adhäson transfizieren, das mit der leichten oder schweren Ketten fusioniert ist, um einen Heteroantikörper zu bilden. Obige Immunglobuline mit einem oder mehreren Armen, der/die die Adhäsondomäne trägt/tragen, und einem oder mehreren Armen, der/die variable Begleiterbereiche trägt/tragen, führen zu dualer Spezifität für Adhäsonliganden und für ein Antigen. Diese werden nach den oben beschriebenen Rekombinationsverfahren oder durch in vitro-Methoden erzeugt. Im letzteren Fall werden z.B. F(ab')₂-Fragmente der Adhäsonfusion und ein Immunglobulin hergestellt, die F(ab')₂-Fragmente durch Reduktion unter schonenden Reduktionsbedingungen in Fab'-Fragmente übergeführt und dann unter sauren Bedingungen in gemeinsamer Gegenwart nach an sich bekannten Verfahren reoxidiert. Siehe auch US-A-4.444.878.
Zusätzlich dazu sind Verfahren zur Herstellung intakter Heteroantikörper aus Immunglobulinen mit unterschiedlichen Spezifitäten bekannt. Diese Verfahren werden zur in vitro-Produktion heterochimärer Antikörper angewandt, um die Immunadhäson-Ketten einfach durch eines der zuvor verwendeten Immunglobuline zu substituieren.
In einem alternativen Verfahren zur Bildung eines heterofunktionellen Antikörpers werden Wirtszellen, die eine Adhäsion-Immunglobulin-Fusion produzieren, z.B. transfizierte Myelome, auch mit B-Zellen oder Hybridomen fusioniert, die Antikörper sekretieren, der die gewünschte Begleiter-Spezifität für ein Antigen aufweist. Heterobifunktioneller Antikörper wird aus dem Kulturmedium solcher Hybridome gewonnen und kann daher etwas günstiger als nach herkömmlichen in vitro-Auswahlverfahren produziert werden (EP-A-68.763).
Eine weitere Gruppe von Fusionen sind jene, in denen ein Adhäson an eine toxische Substanz gebunden ist, z.B. ein Polypeptid wie Ricin (einschließlich der deglykosylierten Ricin-A-Kette), Diphtherietoxin A oder ein Nicht-Peptidylcytotoxin. Wenn das Toxin ein Polypeptid ist, ist es zweckmäßig, das Polypeptid mit dem Adhäson oder einer transmembrandeletierten Variante davon durch herkömmliche in vitro-Proteinvernetzer zu vernetzen (geeignete Verfahren zur Verbindung der Ricin-A-Kette oder der deglykosylierten A-Kette mit CD4 finden sich z.B. in Duncan et al., Analy. Biochem. 132, 68–73 [1983]; Thorpe et al., Cancer Res. 47, 5924 [1987]; und Ghotie et al., Cancer Res. 48, 2610 [1988]) oder es durch rekombinante Synthese als Fusion zu vernetzen (siehe beispielsweise US-A-4.765.382). Wenn Begleiterantikörper variable Anti-Ricin-Antikörper-Immunglobulin-Domänen sind, werden alternativ dazu solche Immunglobulin-Heteroantikörper verwendet, um Ricin an HIV-infizierte Zellen abzugeben; dabei wird allgemein das Verfahren von Raso et al., Cancer Research 41, 2073 (1981), angewandt.
Eine weitere Klasse von Adhäsonvarianten sind Deletionsvarianten. Deletionen sind durch die Entfernung einer oder mehrerer Aminosäurereste aus einer Adhäsonsequenz gekennzeichnet. Typischerweise werden die Transmembran- und die Cyto plasma-Domäne von Adhäsonen deletiert. Im Fall von CD4 werden zumindest die Reste 368–395 (der Transmembran-Bereich) und normalerweise auch 396–433 (der Cytoplasma-Bereich) deletiert, um sekretierte Formen dieses Adhäsons zu erhalten. In Klammern folgen die Aminosäurereste den für reifes CD4 angegebenen Zahlen (siehe z.B. die 1a–1c). Somit enden CD4T-Moleküle im allgemeinen etwa in der Nähe der Reste 366–368 oder an jeder anderen geeigneten, N-terminal dazu gelegenen Stelle, welche die gp120-Bindefähigkeit der CD4-Variante beibehält.
Substitutionsvarianten sind jene, in denen zumindest ein Rest in der Adhäsonsequenz entfernt und ein anderer Rest an seine Stelle gesetzt wurde. Der native N-terminale Rest für reifes CD4 ist bekanntermaßen Lysin. Somit ist die in 1 dargestellte Sequenz mit einem N-terminalen Asparagin eine Aminosäuresequenz-Variante von nativem reifem CD4. Nachstehende Tabelle 2 beschreibt Substitutionen, die im allgemeinen zur Feineinstellung der Eigenschaften des CD-Antigens führen.
TABELLE 2
Substantielle Änderungen der Funktion und immunologischen Identität erfolgen durch die Wahl von Substitutionen, die weniger konservativ sind als jene in Tabelle 2, d.h. durch Auswahl von Resten, die sich in ihrer Wirkung auf folgendes deutlicher unterscheiden: (a) die Struktur der Polypeptid-Hauptkette im Bereich der Substitution, z.B. als Faltblatt- oder Helix-Konformation, (b) die Ladung oder Hydrophobie des Moleküls an der Zielstelle oder (c) die Sperrigkeit der Seitenkette. Die Substitutionen, von denen im allgemeinen zu erwarten ist, daß sie die stärksten Änderungen der Adhäson-Eigenschaften herbeiführen, sind jene, in denen (a) ein hydrophiler Rest, wie z.B. Seryl oder Threonyl, anstelle eines hydrophoben Rests oder durch einen solchen, wie z.B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl, substituiert ist; (b) ein Cysteinyl oder Prolyl anstelle eines beliebigen anderen Rests oder durch einen solchen substituiert ist; (c) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, wie z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl, anstelle eines elektronegativen Rests, wie z.B. Glutamyl oder Asparagyl, oder durch einen solchen substituiert ist; oder (d) ein Rest mit sperriger Seitenkette, wie z.B. Phenylalanyl, anstelle eines Rests ohne Seitenkette oder durch einen solchen substituiert ist.
Eine bevorzugte Klasse von Substitutions- oder Deletionsvarianten ist jene, die den Transmembran-Bereich des Adhäsons umfaßt. Der Transmembran-Bereich des Adhäsons ist eine stark hydrophobe oder lipophile Domäne, die die richtige Größe aufweist, um die Lipiddoppelschicht der Zellmembran zu überspannen. Man geht davon aus, daß sie das Adhäson in der Zellmembran verankert.
Die Deletion der Substitution der Transmembran-Domäne erleichtert die Gewinnung und Bereitstellung einer löslichen Form des Adhäsons durch Verringerung seiner Lipidaffinität in der Zelle oder der Membran und Verbesserung seiner Wasserlöslichkeit. Wenn die Transmembran- und die Cytoplasma-Domäne deletiert sind, wird entweder durch Freilegung von ansonsten intrazellulären Polypeptiden, die vom Körper als fremd erkannt werden könnten, oder durch Insertion heterologer Polypeptide, die potentiell immunogen sind, die Einführung von potentiell immunogenen Epitopen vermieden. Ein Hauptvorteil des transmembrandeletierten Adhäsons besteht darin, daß es in das Kulturmedium rekombinanter Wirte sekretiert wird. Diese Variante ist was serlöslich und hat keine nennenswerte Affinität für Zellmembranlipide, wodurch seine Gewinnung aus rekombinanter Zellkultur stark vereinfacht wird.
Es ist aus obiger Beschreibung offenkundig, daß Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder beliebige Kombinationen davon eingeführt werden, um zu einem Endkonstrukt zu gelangen. Allgemein gesprochen weisen nicht alle Varianten eine funktionelle Transmembran-Domäne und vorzugsweise keine funktionelle Cytoplasma-Sequenz auf. Dies wird im allgemeinen durch Deletion der relevanten Domäne erreicht, obwohl auch geeignete Insertions- oder Substitutions-Mutagene für diesen Zweck wirksam sind. Beispielsweise wird die Transmembran-Domäne durch eine beliebige Aminosäuresequenz substituiert, z.B. eine statistische oder Homopolynukleinsäure-Sequenz von etwa 5 bis 50 Serin-, Threonin-, Lysin-, Arginin-, Glutamin-, Asparaginsäure- und ähnlichen hydrophilen Resten, die allesamt ein hydrophiles Hydropathie-Profil zeigen, sodaß sie in das Kulturmedium rekombinanter Wirte sekretiert wird. Diese Variante sollte auch als Adhäsonvariante angesehen werden.
Diese Varianten werden üblicherweise durch stellenspezifische Mutagenese von Nukleotiden in der für das Adhäson kodierenden DNA, wodurch für die Variante kodierende DNA produziert wird, und anschließende Expression der DNA in rekombinanter Zellkultur hergestellt. Adhäsonvarianten werden allerdings auch durch in vitro-Synthese produziert. Natürlich dürfen Variationen in der für die Adhäsonvarianten kodierenden DNA die Sequenz nicht aus dem Leserahmen setzen, und sie erzeugen vorzugsweise keine komplementären Bereiche, die eine sekundäre mRNA-Struktur erzeugen könnten, die für die Expression unvorteilhaft ist (EP-A-75.444). Die CD4-Varianten weisen typischerweise die gleiche gp120-Bindeaktivität auf wie der natürlich vorkommende Prototyp, obwohl auch Varianten ausgewählt werden, um die Eigenschaften des CD4-Adhäsons zu modifizieren (siehe oben).
Während die Stelle zur Einführung einer Aminosäuresequenz-Variante vorbestimmt ist, braucht die Mutation an sich nicht vorbestimmt zu sein. Um beispielsweise die Leistung einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, kann statistische Mutagenese am Zielcodon oder im Zielbereich erfolgen, und die exprimierten Adhä sonvarianten können auf die optimale Kombination gewünschter Aktivitäten gescreent werden. Verfahren zur Herstellung von Substitutionsmutationen an vorbestimmten Stellen in DNA mit einer bekannten Sequenz sind allgemein bekannt, z.B. M13-Primer-Mutagenese.
Adhäsonvarianten, die nicht zur Bindung von HIV-gp120 fähig sind, eignen sich trotzdem als Immunogene zur Bildung von Antikörpern gegen das Adhäson oder als Immunassay-Setkomponenten (markiert als kompetitives Reagens für einen gp120-Assay oder unmarkiert als Standard für einen Adhäsonassay), sofern zumindest ein Adhäsonepitop aktiv bleibt.
Die für Adhäsone kodierende DNA wird nach bekannten Verfahren erhalten. Siehe Williams, Immunol. Today 8, 298–303 (1987) und die dort angeführten Verweise. Im allgemeinen werden zum Klonieren von CD4-DNA-Sequenzvarianten; Prokaryoten verwendet. Besonders geeignet sind E.coli-Stamm SR101 (zur Vermehrung von m13-Phage, ein λ-resistenter Stamm von HM 101; Messing et al., Nucl. Acids Res. 9(2), 309–321 [1981]); und E.coli K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446). Andere geeignete Mikrobenstämme sind E.coli B, UM101 und E.coli χ1776 (ATCC Nr. 31537). Diese Beispiele sind veranschaulichend und nicht einschränkend.
Für die Adhäsonvarianten kodierende DNA wird zur Expression in Vektoren insertiert, die Promotoren und Kontrollsequenzen enthalten, die von mit der beabsichtigten Wirtszelle verträglichen Spezies stammen. Die Vektoren tragen üblicher-, aber nicht notwendigerweise eine Replikationsstelle sowie eine oder mehrere Markersequenzen, die für phenotypische Selektion in transformierten Zellen sorgen können. Beispielsweise wird E.coli typischerweise unter Verwendung eines Derivats von pBR322 transformiert, das ein Plasmid aus einer E.coli-Spezies ist (Bolivar et al., Gene 2, 95 [1977]). pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt somit eine einfache Möglichkeit zur Identifizierung transformierter Zellen dar. Das pBR322-Plasmid oder ein anderes mikrobielles Plasmid muß auch Promotoren oder andere Kontrollelemente enthalten (oder so modifiziert werden, daß es diese enthält), die üblicherweise in rekombinanten DNA-Konstruktionen verwendet werden.
Zur Verwendung für prokaryotische Wirte geeignete Promotoren sind z.B. die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 [1978]; und Goeddel et al., Nature 281, 544 [1979], alkalische Phosphatase, das Tryptophan(trp-)Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 [1980] und EP-A-36.776) sowie Hybridpromotoren, wie z.B. der tac-Promotor (H. de Boer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 [1983]). Andere funktionelle bakterielle Promotoren sind jedoch ebenfalls geeignet. Deren Nukleotidsequenzen sind allgemein bekannt, wodurch sie Fachleute auf dem Gebiet mit Linkern oder Adaptoren operabel an für die Adhäsonvariante kodierende DNA ligieren können, um erforderliche Restriktionsstellen bereitzustellen (Siebenlist et al., Cell 20, 269 [1980]). Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Delgarno-(S.D.-)Sequenz, die mit der für das Antigen kodierenden DNA operabel verbunden ist.
Neben Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroben, wie z.B. Hefekulturen, als Klonier- oder Expressionswirte verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae bzw. gemeine Backhefe ist der am meisten verwendete eukaryotische Mikroorganismus, obwohl auch einige andere Stämme üblicherweise zur Verfügung stehen. Zur Expression in Saccharomyces wird z.B. das Plasmid YRp7 verwendet (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 [1979]; Kingsman et al., Gene 7, 141 [1979]; Tschemper et al., Gene 10, 157 [1980]). Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Mutantenstamm von Hefe aufweist, der sich in Tryptophan nicht vermehren kann, z.B. ATCC Nr. 44076 oder PEP4-1 (Jones, Genetics 85, 12 [1977]). Die Gegenwart der trp1-Läsion als Charakteristikum des Hefewirt-Zellgenoms bietet ein wirkungsvolles Selektionsmittel durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung für Hefewirte sind die Promotoren für 3-Phosphoglycerat-Kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 225, 2073 [1980]) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 [1968); und Holland, Biochemistry 17, 4900 [1978)), wie z.B. Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase.
Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil der über Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription sind, sind die Promotorenbereiche für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, mit dem Stickstoff-Stoffwechsel assoziierte Abbauenzyme, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Verwertung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Hefe-Expression werden von R. Hitzeman et al., EP-A-73.657, beschrieben. Zusammen mit Hefe-Promotoren werden günstigerweise auch Hefe-Enhancer eingesetzt.
Promotoren zur Kontrolle der Transkription von Vektoren in Säugetier-Wirtszellen können aus verschiedenen Quellen stammen, z.B. den Genomen von Viren, wie z.B.: Polyomavirus, Affenvirus 40 (SV40), Adenovirus, Retroviren, Hepatitis-B-Virus und am bevorzugtesten Cytomegalovirus, oder von heterologen Säugetier-Promotoren, wie z.B. dem β-Actinpromotor. Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden günstigerweise als ein SV40-Restriktionsframent erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978). Der unmittelbar frühe Promotor des menschlichen Cytomegalovirus wird günstigerweise als HindIII E-Restriktionsfragment erhalten. P.J. Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982); natürlich eignen sich hierin auch Promotoren der Wirtszelle oder verwandter Spezies.
Die DNA-Transkription in höheren Eukaryoten wird durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor verstärkt. Enhancer sind cis-agierende Elemente von DNA (üblicherweise mit etwa 10 bis 300 bp), die eine Erhöhung der Transkriptionsinitiations-Fähigkeit eines Promotors bewirken. Enhancer sind relativ orientierungs- und positionsunabhängig und befinden sich 5' (Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 993 [1981]) und 3' (Lusky, M.L. et al., Mol. Cell Bio. 3, 1108 [1983]) der Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji, J.L. et al., Cell 33, 729 [1983]), sowie innerhalb der Kodiersequenz selbst (Osborne, T.F. et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 [1984]). Mittlerweile sind, viele Enhancersequenzen aus Säugetiergenen bekannt (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin). Typischerweise verwendet man jedoch einen Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus. Beispiele sind der SV40-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270), der frühe Promotor-Enhancer des Cytomegalovirus, der Polyoma-Enhancer auf der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer.
Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen verwendet werden (Hefe-, Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Tier-, menschliche oder andere Zellen mit Zellkern) können auch Sequenzen enthalten, die für die Transkriptionstermination notwendig sind, welche die mRNA-Expression beeinflussen kann. Diese Bereiche werden als polyadenylierte Segmente im untranslatierten Anteil der für das Adhäson kodierenden mRNA transkribiert.
Expressionsvektorsysteme enthalten im allgemeinen ein Selektionsgen, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Beispiele für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind Dihydrofolat-Reduktase (CHFR), Thymidin-Kinase oder Neomycin. Wenn solche selektierbaren Marker erfolgreich in eine Säugetierwirtszelle transferiert werden, kann die transformierte Säugetierwirtszelle überleben, wenn sie selektivem Druck ausgesetzt wird. Es gibt zwei sehr häufig verwendete, unterschiedliche Kategorien selektierbarer Systeme. Die erste Kategorie basiert auf einem Zellmetabolismus und dem Einsatz einer Zellinienmutante, die nicht die Fähigkeit besitzt, sich unabhängig von einem ergänzten Medium zu vermehren. Zwei Beispiele dafür sind DHFR^–-CHO-Zellen und LTK^–-Mäuse-Zellen. Diese Zellen besitzen nicht die Fähigkeit, sich ohne Zusatz von Nährstoffen wie Thymidin oder Hypoxanthin zu vermehren. Da es diesen Zellen an bestimmten Genen mangelt, die für einen vollständigen Nukleotidsynthese-Weg notwendig sind, können sie nur dann überleben, wenn die fehlenden Nukleotide im ergänzten Medium bereitgestellt werden. Eine Alternative zum Ergänzen des Mediums ist die Einführung eines intakten DHFR- oder TK-Gens in Zellen, denen die jeweiligen Gene fehlen, wodurch ihre Wachstumserfordernisse geändert werden. Einzelne Zellen, die nicht mit dem DHFR- oder TK-Gen transformiert wurden, können in nichtergänzten Medien nicht überleben.
Die zweite Kategorie ist die dominante Selektion, die sich auf ein Selektionsschema bezieht, das in jedem Zelltyp Anwendung findet und keine Zellinienmutante erfordert. Diese Schemata greifen typischerweise auf ein Arzneimittel zurück, um das Wachstum einer Wirtszelle zu stoppen. Jene Zellen, die ein neues Gen besitzen, exprimieren ein Protein, das Arzneimittelresistenz verleiht, und die Selektion überleben. Beispiele für eine derartige dominante Selektion verwenden die Arzneimittel Neomycin (Southern, P. und Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1, 327 [1982]), Mycophenolsäure (Mulligan, R.C. und Berg, P. Science 209, 1422 [1980]) oder Hygromycin (Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5, 410–413 [1985]). Die drei oben angeführten Beispiele verwenden bakterielle Gene unter eukaryotischer Kontrolle, um Resistenz gegenüber dem jeweiligen Arzneimittel G418 oder Neomycin (Geneticin), xgpt (Mycophenolsäure) bzw. Hygromycin zu verleihen.
„Amplifikation" bezieht sich auf die Zunahme oder Replikation eines isolierten Bereichs innerhalb der chromosomalen DNA einer Zelle. Die Amplifikation erfolgt mittels eines Selektionsmittels, wie z.B. Methotrexat (MTX), das DHFR inaktiviert. Die Amplifikation oder aufeinanderfolgende Bildung von Kopien des DHFR-Gens führt dazu, daß in Gegenwart größerer Mengen an MTX größere Mengen an DHFR erzeugt werden. Der Amplifikationsdruck wird trotz der Gegenwart von endogenem DHFR ausgeübt, indem dem Medium immer größere Mengen an MTX zugegeben werden. Die Amplifikation eines gewünschten Gens kann durch Co-Transfizieren einer Säugetierwirtszelle mit einem Plasmid erreicht werden, das eine für ein gewünschtes Protein und DHFR oder das Amplifikationsgen, das Co-Integration ermöglicht, kodierende DNA aufweist. Man stellt sicher, daß die Zelle mehr DHFR benötigt, wobei dieser Bedarf durch Replikation des Selektrionsgens gedeckt wird, indem nur jene Zellen selektiert werden, die sich in Gegenwart immer höherer MTX-Konzentra tionen vermehren können. Solange das für ein gewünschtes heterologes Protein kodierende Gen mit dem Auswahlgen co-integriert wird, führt die Replikation dieses Gens zur Replikation des für das gewünschte Protein kodierenden Gens. Dies hat zur Folge, daß mehr Kopien des Gens, d.h. eines amplifizierten Gens, die für das gewünschte heterologe Protein kodieren, eine größere Menge des gewünschten heterologen Proteins exprimieren.
Bevorzugte Wirtszellen zum Exprimieren der CD-Antigenvarianten der Erfindung sind Säugetierzellinien, z.B: Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche Embryonieren-Linien- (293, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36, 59 [1977] und 293S-Zellen [293-Subklone, auf besseres Suspensionswachstum selektiert]); Babyhamsternieren-Zellen (BHK, ATCC CGL 10); chinesische Hamstereierstock-Zellen-DHFR (CHO, Urlaub und Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 77, 4216 [1980]); Mäuse-Sertoli-Zellen (TM4, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23, 243–251 [1980]); Affennieren-Zellen (CV1 ATCC CCL 70); afrikanische Meerkatzennieren-Zellen (VERO-76, ATCC CRL-1587); menschliche Gebärmutterhalskrebs-Zellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenieren-Zellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleber-Zellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Mäuse-Brusttumor-Zellen (MMT 060562, ATCC CCL51); und TRI-Zellen (Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44–68 [1982]).
„Transformation" bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus, sodaß die DNA, entweder als extrachromosomales Element oder durch Chromosomen-Integration, replizierbar ist. Ein geeignetes Verfahren zur Transformation der Wirtszellen ist jenes von Graham, F. und van der Eb, A., Virology 52, 456–457 (1973). Andere Verfahren zum Einbringen von DNA in Zellen, wie z.B. durch Kerninjektion oder Protoplastenfusion, kommen allerdings auch in Frage. Wenn prokaryotische Zellen oder Zellen, die nennenswerte Zellwände enthalten, als Wirtszellen verwendet werden, ist das bevorzugte Transfektionsverfahren die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid (siehe Cohen, F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69, 2110 [1972]).
Die Konstruktion geeigneter Vektoren, welche die gewünschten Kodier- und Kontrollsequenzen enthalten, greift auf herkömmliche und manipulative Ligationsverfahren zurück. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespalten, zurechtgeschnitten und in der gewünschten Form erneut ligiert, um die erforderlichen Plasmide zu bilden. Geeignete Verfahren für die hierin beschriebene Konstruktion sind allgemein bekannt. siehe z.B. Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, 133–134 Cold Spring Harbor (1982); „Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al. (Hrsg.; 1987), veröffentlicht von Greene Publishing Associates & Wiley-Interscience.
Korrekte Plasmidsequenzen werden durch Transformieren von E.coli K12-Stamm 294 (ATCC 31446) mit Ligationsgemischen bestätigt, erfolgreiche Transformanten gegebenenfalls anhand von Ampicillin- oder Tetracyclin-Resistenz selektiert, Plasmide aus den Transformanten erzeugt und dann durch Restriktionsenzymspaltung analysiert und/oder nach dem Verfahren von Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder jenem von Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
Wirtszellen werden mit den Expressionsvektoren der Erfindung transformiert. Anschließend werden sie in geeigneten Kulturmedien kultiviert, die z.B. Substanzen zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifizieren von Genen enthalten. Die Kulturbedingungen, wie z.B. Temperatur, pH-Wert und dergleichen, sind dieselben wie bei der für die Expression ausgewählten Wirtszelle und sind Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt.
Die sekretierten Adhäsonvarianten werden aus den Kulturüberständen oder Lysaten rekombinanter Wirte gewonnen und gereinigt. Typischerweise werden die Überstände durch Ultrafiltration aufkonzentriert, mit einer Ligandenaffinitäts- oder Immunaffinitäts-Matrix in Kontakt gebracht, um die Adhäsonvariante zu adsorbieren, und aus der Matrix eluiert. Gegebenenfalls wird das Adhäson durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt.
Die Reinigung von löslichem CD4-Adhäson aus Kulturmedium war unerwartet schwierig. Obwohl der hydrophobe Transmembran-Bereich des Antigens deletiert worden war, zeigte das Antigen eine starke Tendenz, Aggregate zu bilden, die durch Zentrifugieren bei 1000 × gleicht aus der Suspension entfernt werden konnten und mit denen Oberflächen, wie z.B. Ultrafiltrationsmembranen, sehr leicht überzogen werden. Dies scheint das Ergebnis der Reduktion der Konzentration von Albumin oder eines anderen Serumproteins (üblicherweise im Rohpräparat vorhanden) auf einen bestimmten Wert zu sein, unterhalb dessen das gekürzte Antigen nicht länger löslich bleibt. Dieses Phänomen scheint sich zu verstärken, wenn das CD4-Adhäson bei niedrigem pH (unter etwa pH 4) vorliegt. Daher sollten Trennverfahren (insbesondere jene, die Säureelution vorsehen, z.B. Immunaffinität) so modifiziert werden, daß das Eluat etwa neutral gehalten wird oder sofort zur Neutralität zurückkehrt. Außerdem sollte ein Tensid, z.B. ein Detergens wie Tween 80, während des Trennverfahrens im Antigen enthalten sein. Das gereinigte Endprodukt wird mit einem vorbestimmten Protein, wie z.B. Albumin, und/oder einem Detergens stabilisiert.
Das gereinigte Adhäson wird in herkömmliche, pharmakologisch annehmbare Arzneimittelträger formuliert.
Es wird an Patienten mit HIV-Infektion in einer Dosierung verabreicht, mit der eine Konzentration von mehr als etwa 100 ng lösliches CD4-Adhäson/ml Plasma beibehalten werden kann. Für CD4-Adhäsonvarianten mit unterschiedlichem Molekulargewicht werden zuerst etwa 2 pMol löslicher Rezeptor pro ml Plasma klinisch evaluiert, um stöchiometrische Äquivalenz mit nativem (membrangebundenem) und löslichem Rezeptor festzustellen. Die übliche Dosierung von löslichem CD4 beträgt 100 μg/kg Patientengewicht/Tag.
Die therapeutischen CD4-Varianten werden zusammen mit anderen Therapien und Mitteln zur Behandlung von AIDS eingesetzt, z.B. mit AZT, neutralisierenden Antikörpern und Immuncytotoxinen, gp120-Fragmenten und Impfstoffen.
Zum leichteren Verständnis der folgenden Beispiele werden häufig vorkommende Verfahren und/oder Ausdrücke beschrieben.
„Plasmide" werden durch ein kleingeschriebenes p gekennzeichnet, vor und/oder nach dem Großbuchstaben und/oder Zahlen stehen. Die vorliegenden Ausgangsplasmide sind im Handel erhältlich, öffentlich uneingeschränkt verfügbar oder können aus vorhandenen Plasmiden in Einklang mit veröffentlichten Vorgangsweisen konstruiert werden. Außerdem sind gleichwertige Plasmide Fachleuten auf dem Gebiet allgemein bekannt.
„Spaltung" von DNA bezieht sich auf die katalytische Spaltung der DNA mit einem Restriktionsenzym, das nur an bestimmten Sequenzen in der DNA wirkt. Die verschiedenen hierin verwendeten Restriktionsenzyme sind im Handel erhältlich, und ihre Reaktionsbedingungen, Cofaktoren und anderen Bedingungen wurden in durchschnittlich ausgebildeten Fachleuten bekannter Weise gewählt. Für analytische Zwecke wird typischerweise 1 μg Plasmid oder DNA-Fragment mit etwa 2 Einheiten Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung eingesetzt. Um DNA-Fragmente zur Plasmidkonstruktion zu isolieren, werden typischerweise 5 bis 50 μg DNA mit 20 bis 250 Enzymeinheiten in einem größeren Volumen gespalten. Geeignete Puffer und Substratmengen für bestimmte Restriktionsenzyme sind vom Hersteller angegeben. Inkubationszeiten von etwa 1 Stunde bei 37°C sind üblich, können allerdings je nach Anweisungen des Herstellers variieren. Nach der Spaltung wird das Reaktionsgemisch direkt auf einem Polyacrylamid-Gel einer Elektrophorese unterzogen, um das gewünschte Fragment zu isolieren.
„Gewinnung" oder „Isolierung" eines bestimmten DNA-Fragments aus einer Restriktionsspaltlösung umfaßt die Auftrennung der Spaltlösung auf Polyacrylamid- oder Agarosegel durch Elektrophorese, die Identifikation des Fragments von Interesse durch Vergleich seiner Mobilität mit jener von Marker-DNA-Fragmenten mit bekanntem Molekulargewicht, die Entfernung des Gelabschnitts, der das gewünschte Fragment enthält, und die Abtrennung des Gels von der DNA. Diese Vorgangsweise ist allgemein bekannt (Lawn, R. et al., Nucleic Acids Res. 9, 6103–6114 [1981] und Goeddel, D. et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 [1980]).
„Dephosphorylierung" bezieht sich auf die Entfernung der terminalen 5'-Phosphate durch Behandlung mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Dieses Verfahren verhindert, daß die zwei durch Restriktionsspaltung entstandenen Enden eines DNA-Fragments „ringschließen" oder eine geschlossene Schleife bilden, was die Insertion eines anderen DNA-Fragments an der Restriktionsstelle verhindern würde. Die Verfahren und Reagentien zur Dephosphorylierung und andere Rekombinations-Manipulationen sind herkömmliche. Reaktionen unter Verwendung von BAP erfolgen in 50 mM Tris bei 68°C, um die Aktivität von Exonukleasen zu unterdrücken, die in den Enzympräparaten vorhanden sein können. Die Reaktionen dauerten 1 Stunde lang. Nach der Reaktion wird das DNA-Fragment gelgereinigt.
„Ligation" ist das Verfahren zur Bildung von Phosphodiester-Bindungen zwischen zwei doppelstrangigen Nukleinsäurefragmenten (Maniatis, T. et al., ibid., S. 146). Falls nicht anders angegeben, kann die Ligation mit bekannten Puffern und unter bekannten Bedingungen mit 10 Einheiten T4-DNA-Ligase („Ligase") pro 0,5 μg etwa äquimolekularer Mengen der zu ligierenden DNA-Fragmente durchgeführt werden.
„Füllen" oder „Abstumpfen" bezieht sich auf Vorgangsweisen, durch die das einstrangige Ende im kohäsiven Terminus einer mit Restriktionsenzym gespaltenen Nukleinsäure in einen Doppelstrang umgewandelt wird. Dieses Verfahren eliminiert den kohäsiven Terminus und bildet ein stumpfes Ende. Es ist ein vielseitiges Instrument zur Umwandlung eines restriktionsgespaltenen Endes, das mit den Enden, die durch nur ein oder wenige andere Restriktionsenzyme geschaffen werden, kohäsiv sein kann, in einen Terminus, der mit jeder stumpf spaltenden Restriktions-Endonuklease verträglich ist, oder einen anderen gefüllten kohäsiven Terminus. Typischerweise erfolgt das Abstumpfen durch Inkubieren von 2–15 μg der Ziel-DNA in 10 mM MgCl₂, 1 MM Dithiothreitol, 50 mM NaCl, 10 mM Tris-Puffer (pH 7,5) bei etwa 37°C in Gegenwart von 8 Einheiten des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I und 250 μM jedes der vier Desoxynukleosidtriphosphate. Die Inkubation ist im allgemeinen nach 30-minütiger Phenol- und Chloroformextraktion und Ethanolfällung abgeschlossen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen lediglich die derzeit beste Durchführungsart der Erfindung, sollen diese aber keineswegs einschränken.
Beispiel 1
Konstruktion von Vektoren zur Expression von nativem CD4 und sekretierten Derivaten
Abschnitt 1
Das für die rekombinante Synthese von menschlichem CD4 verwendete Plasmid war pSVeCD4DHFR. Das Plasmid wurde wie folgt konstruiert:
λCD4P1, das einen Großteil der Kodiersequenz von menschlichem CD4 enthielt (erhalten aus einer menschlichen Plazenta-cDNA-Bibliothek unter Verwendung von Oligonukleotid-Sonden auf der Grundlage der veröffentlichten Sequenz [Maddon et al., 1985]), wurde mit EcoRI gespalten, um das cDNA-Insert zu produzieren. Dieses Fragment wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese gewonnen (Fragment 1).
pUC18 wurde mit EcoRI gespalten und das einzige Fragment durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese gewonnen (Fragment 2). Fragment 1 wurde an Fragment 2 ligiert und das Ligationsgemisch in E.coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht, und es wurden resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart der korrekten DNA-Fragmente untersucht. Dieses Plasmid wurde als pUCCD4 bezeichnet.
pSVeE'DHFR (Muesing et al., Cell 48, 691–701 [1987]) wurde mit KpnI und BamHI gespalten und mit E.coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) und den vier dNTPs abgestumpft. Fragment 3, das den pML-Amp^r-Bereich, den frühen SV40-Promotor, HIV-LTR und das Mäuse-DHFR-Gen enthielt, wurde durch Gel-Elektrophorese ge wonnen, ligiert und das Ligationsgemisch in E.coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart der BamHI-Restriktionsstelle und die Abwesenheit der KpnI-Restriktionsstelle untersucht. Dieses Plasmid wurde als pSVeΔBKDHFR bezeichnet und ermöglicht, daß EcoRI-BamHI-Fragmenten nach dem frühen SV40-Promotor insertiert und unter seiner Kontrolle transkribiert werden, gefolgt von der Transfektion in eine geeignete Zellinie.
Synthetische Oligonukleotide (Adaptoren 1–8, siehe unten) wurden so gebildet, daß sie sich von 76 bp 5' vom Initiationscodon der CD4-Translation zur RsaI-Restriktionsstelle an 121 bp 3' vom Initiator erstrecken, wobei die Sequenz AATT am 5'-Ende des Sense-Strangs ein Ende erzeugt, das an ein EcoRI-Restriktionsfragment ligiert werden konnte. Diese Oligonukleotide wurden ligiert und das 204 bp-Fragment, das die gesamte Sequenz enthielt, durch Gel-Elektrophorese gewonnen (Fragment 4).
pUCCD4 wurde mit Rsal und SstI gespalten und das 401 bp-Fragment, das einen Teil der CD4-Kodiersequenz enthielt, durch Gel-Elektrophorese gewonnen (Fragment 5). pUC18 wurde mit EcoRI und SstI gespalten und das Fragment, das den Großteil des Plasmids umfaßte, durch Gel-Elektrophorese gewonnen (Fragment 6). Die Fragmente 4 und 5 wurden an Fragment 6 ligiert und das Ligationsgemisch in E.coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Die Sequenz des insertierten synthetischen DNA wurde geprüft, indem die 605 bp-EcoRI-SstI-Fragmente aus verschiedenen Transformanten herausgeschnitten und in M13mp19 ligiert wurden, das mit den gleichen Enzymen gespalten worden war. Nach der Transformation in E.coli-Stamm JM101 wurde einstrangige DNA hergestellt und sequenziert. Ein Plasmid, das die korrekte Sequenz enthielt, wurde selektiert und wurde als pCD4int bezeichnet.
pCD4int wurde mit EcoRI und SstI gespalten und Fragment 7, das das 5'-Ende des CD4-Kodierbereichs enthielt, durch Gel-Elektrophorese gewonnen. pUCCD4 wurde mit SstI und BamHI gespalten und das 1139 bp-Fragment, das den Rest des CD4-Kodierbereichs enthielt (Fragment 8), durch Gel-Elektrophorese gewonnen.
pSVeΔBKDHFR wurde mit EcoRI und BamHI gespalten und Fragment 9, das den Großteil des Plasmids umfaßte, isoliert. Die Fragmente 7, 8 und 9 wurden ligiert und das Ligationsgemisch in E.coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und die resistenten Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Dieses als pSVeCD4DHFR bezeichnete Plasmid diente dazu, die Synthese von rekombinantem inaktem CD4 zu lenken.
Abschnitt 2
Ein Plasmid wurde konstruiert, um die Synthese eines CD4-Derivats zu lenken, dem die vermeintliche Transmembran-Domäne und ein Großteil der vermeintlichen Cytoplasma-Domäne fehlte (Maddon et al.). Dies erfolgte in der Absicht, eine sekretierte Form von CD4 zu bilden – aufgrund der Annahme, daß diese Domänen das CD4-Glykoprotein an der Zellmembran verankern und daß ihre Deletion zur Sekretion des Produkts führen würde. Dieses als pSVeCD4ΔN1aDHFR bezeichnete Plasmid wurde wie folgt konstruiert:
pUCCD4 wurde mit SstI und TaqI gespalten und das 531 bp-Fragment (Fragment 10) gewonnen. pUCCD4 wurde mit NlaIII und TaqI gespalten und das 112 bp-Fragment (Fragment 11) gewonnen. pUCCD4 wurde mit BamHI und NlaIII gespalten und das 301 bp-Fragment (Fragment 12) gewonnen. pCD4int wurde mit SstI und BamHI gespalten und Fragment 13, das den Großteil des Plasmids enthielt, gewonnen. Die Fragmente 10, 11 und 12 wurden zusammen mit Fragment 13 ligiert und das Ligationsgemisch in E.coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Plasmid-DNA aus verschiedenen Transformanten wurde sequenziert, um sicherzustellen, daß das 195 bp NlaIII-Fragment deletiert worden war und der richtige Leserahmen wiederhergestellt war. Das resultierende Plasmid wurde als pCD4ΔN1a bezeichnet.
pCD4ΔN1a wurde mit EcoRI und BamHI gespalten und das 1541 bp-Fragment, das die Sequenz eines CD4-Derivats ohne Transmembran- und Cytoplasma-Domäne enthielt, gewonnen (Fragment 14) und an Fragment 9 ligiert; das Ligationsgemisch wurde in E.coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Dieses Plasmid wurde als pSVeCD4ΔN1aDHFR bezeichnet.
Sowohl pSVeCD4DHFR als auch pSVeCD4ΔN1aDHFR wurden nach dem gleichen Verfahren in CHO-Zellen transfiziert, wie jenes, das zum Erhalt von Zellinien, die HIV-I-Polypeptide stabil exprimierten, zur Anwendung kam (Muesing, Smith und Capon, Cell 48, 691–701 [1987]). Diese Zellen wurden durch Radioimmunfällung, wie nachstehend beschrieben, auf Produktion untersucht. Während in den ersten Versuchen kein Produkt nachgewiesen wurde, zeigten nachfolgende Experimente, daß das oben beschriebene Kodiersegment tatsächlich die Synthese einer löslichen CD4-Adhäsonvariante sowohl in CHO- als auch in 293-Zellen lenken konnte.
Abschnitt 3
Anfänglich wurde ein anderes Expressionssysem zur Synthese und Expression einer CD4-Variante verwendet, der die Cytoplasma- und die Transmembran-Domäne völlig fehlten. Dieses System nutzt den Cytomegalovirus-Promotor und kann für kultivierte Zellen menschlichen Ursprungs verwendet werden. Das erste zur Verwendung in diesem System eingesetzte Plasmid enthielt den gesamten Kodierbereich für CD4 und sollte in den folgenden Studien als Vergleich dienen. Es wurde als pRKCD4 bezeichnet und wurde wie folgt konstruiert:
pSVeCD4DHFR wurde mit EcoRI und BamHI gespalten und Fragment 15, das den gesamten CD4-Kodierbereich enthielt, isoliert. pRKS (U.S.S.N. 97.472, eingereicht am 11. September 1987) wurde mit EcoRI und BamHI gespalten und Fragment 16, das den Großteil des Plasmids enthielt, durch Gel-Elektrophorese gewonnen und an Fragment 15 ligiert; das Ligationsgemisch wurde in E.coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Dieses Plasmid wurde als pRKCD4 bezeichnet.
Abschnitt 4
Das nächste konstruierte Plasmid sollte die Expression des zuvor (in Abschnitt 3) erwähnten sekretierten Derivats von CD4 lenken. Der Kodierbereich von CD4 wurde nach dem Aminosäurerest 368 von reifem CD4 mit einer Sequenz von pBR322 fusioniert, die für 9 weitere Reste vor einem Translations-Terminationscodon kodiert. Dadurch werden die vermeintliche Transmembran- und Cytoplasma-Domäne von CD4, die vermutlich CD4 an der Zelloberfläche verankern, entfernt. Das Plasmid wurde als pRKCD4T bezeichnet (produziert ein Protein mit der Bezeichnung CD4T) und wurde wie folgt konstruiert: pSVeCD4DHFR wurde mit HpaII gespalten, mit Klenow-Fragment und den vier dNTPs abgestumpft und mit BstEII gespalten. Das 382 bp-Fragment (Fragment 17), das einen Teil der CD4-Kodiersequenz enthielt, wurde mittels Gel-Elektrophorese gewonnen. pSVeCD4DHFR wurde mit EcoRI und BstEII gespalten und das 874 bp-Fragment (Fragment 18) gewonnen. pBR322 wurde mit HindIII gespalten, mit Klenow-Fragment und den vier dNTPs abgestumpft und mit EcoRI gespalten. Fragment 19, das den Großteil des Plasmids umfaßte, wurde isoliert und an die Fragmente 17 und 18 ligiert und das Ligationsgemisch in E.coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments geprüft. Dieses Plasmid wurde als pCD4Tint bezeichnet.
pRKS wurde mit EcoRI und SmaI gespalten und Fragment 20, das den Großteil des Plasmids umfaßte, isoliert. pCD4Tint wurde mit EcoRI und EcoRV gespalten, und das 1410 bp-Fragment, das die CD4-Kodiersequenz bis zur HpaII-Stelle an 1176 bp 3' vom Initiationscodon enthielt, und das HindIII-EcoRV-Fragment von pBR322 wurden gewonnen (Fragment 21). Fragmente 20 und 21 wurden ligiert und das Ligationsgemisch in E.coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Dieses Plasmid wurde als pRKCD4T bezeichnet.
Abschnitt 5a
Um eine sekretierte Form von CD4 zu erzeugen, die mit einem Antikörper gegen Herpesvirus Typ I-Glykoprotein D gereinigt werden kann, wurde ein Plasmid konstruiert, um ein Derivat von CD4T zu exprimieren, in dem der Bereich, der für reifes, verarbeitetes CD4T-Polypeptid kodiert, mit einer Sequenz fusioniert war, die für das Signalpeptid und die ersten 27 Reste des reifen Herpes Simplex-Virus-gD-Glykoproteins vom Typ I kodiert. Dieses als pRKGDCD4T bezeichnete Plasmid wurde wie folgt konstruiert:
pgDTrunc.DHFR wurde mit EcoRI und PvuII gespalten und das Fragment, das den Kodierbereich für das Signalpeptid und die ersten 27 Reste des reifen HSV I-gD-Glykoproteins enthielt, isoliert (Fragment 22). pRKCD4T wurde mit EcoRI und BstEII gespalten und Fragment 23, das das 3'-Ende der CD4-Kodiersequenz und den pRK5-Bereich enthielt, isoliert.
Synthetische Oligonukleotide GD (Adaptoren 1–2, siehe unten) wurden hergestellt, die die Kodiersequenz von CD4 vom Codon für den aminoterminalen Rest von reifem CD4 bis zur Rsa-Stelle an 121 bp 3' von der Translationsinitiation sowie die Sequenz CTGCTCGAG am 5'-Ende des Sense-Strangs enthielten (Fragment 24). pRKCD4 wurde mit Rsal und BstEII gespalten und das 665 bp-Fragment, das einen Teil des Kodierbereichs für CD4 enthielt, gewonnen (Fragment 25) und an Fragment 24 ligiert. Nach Spaltung mit BstEII, um sicherzustellen, daß nur monomeres Fragment vorlag, wurde das 724 bp-Fragment, das beide Sequenzen enthielt, durch Gel-Elektrophorese gewonnen (Fragment 26).
Die Fragmente 22, 23 und 26 wurden ligiert und das Ligationsgemisch in E.coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Die Sequenz mehrerer Transformanten wurde untersucht, um sicherzustellen, daß das synthetische Insert korrekt war und der Leserahmen beibehalten wurde. Dieses Plasmid wurde als pRKGDCD4T bezeichnet.
Diese aus pRKS stammenden Plasmide wurden zur stabilen Expression vorzugsweise in 293S-Zellen transfiziert, wobei hier das Verfahren nach Muesing et al., Cell 48, 691 (1987), zur Anwendung kam, außer daß zusätzlich zum Plasmid von Interesse ein Plasmid, welches das Neomycin-Resistenz-Gen pRSV neo exprimiert (Gorman et al., Science 221, 553–555 [1985]), cotransfiziert wurde. 293-Zellen können auch in zufriedenstellender Weise als Wirtszellen verwendet werden. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen in Standardmedium (1:1 F12/DME, ergänzt mit L-Glutamin, Penicillin-Streptomycin und 10% FBS) mit 0,5 mg/ml G418 (Genticinsulfat; Gibco) zur Selektion stabiler Zellinien und nicht in Medien, die Methotrexat enthielten (wie bei Muesing et al.), übergeführt. Zellen wurden mittels Radioimmunfällung auf Produktion von CD4 oder CD4-Analogen untersucht. Bindungsuntersuchungen (Abschnitt 5c) sahen die Verwendung konditionierter Überstände dieser Zellen im 1:1 F12/DME-Medium vor. Die in Infektivitätsassays (Abschnitt 5b) verwendeten Materialien wurden nach dem Verfahren aus Abschnitt 8 erhalten.
Abschnitt 5b
Im folgenden wird eine Untersuchung der Neutralisierung von HIV-1-Infektivität durch lösliche CD4-Analoge beschrieben. Es wurde ein modifiziertes Neutralisationsverfahren nach Robert-Guroff et al., Nature 316, 72 (1985), angewandt. Gleiche Volumina von Inhibitor, Überstand und Virus (60 μl) wurden bei 4°C 1 Stunde lang inkubiert, dann wurde das gleiche Volumen an H9 (Gallo et al., Science 224, 500 [1984]) mit 5×10⁶/ml zugegeben und die Inkubation 1 Stunde lang bei 37°C fortgesetzt. Nach der Absorption wurden 2,5 x 10⁵ Zellen (150 μl) in 2 ml Inkubationsmedium übertragen. Nach 4 Tagen bei 37°C wurden die Kulturen 1:2 mit frischem Medium gesplittet und weitere 3 Tage lang inkubiert. Die Kulturen wurden geerntet, die Aktivität von reverser Transkriptase gemessen (Groopman et al., AIDS Research and Human Retroviruses 3, 71 [1987]) und die Immunfluoreszenz-Reaktivität mit HIV-1-positivem Serum bestimmt (gemäß Poiesz et al., Proc. Acad. Nat. Sci. USA 77, 7415 [1980]). Inhibitor-Überstände wurden aus konfluenten Plattenkulturen von 293S/CDT4-, 293S/gDCD4T-Zellen oder untransfizierten 293S-Zellen erhalten, indem das Wachstumsmedium durch Inkubationsmedien ersetzt und die Überstände 24 Stunden später geerntet wurden. Inhibitor-Überstand ersetzte einen Teil der oder die gesamten Inkubationsmedien während der ersten drei Tage der Kultur, was aus der zweiten Spalte von Tabelle 3 hervorgeht. Die zugesetzte Virus-Dosis war 100 TCID₅₀ (Groopman et al., s.o.) von HIV-1-Stamm HTLV-IIIB, der in im gleichen System untersuchten H9-Zellen gezüchtet wurde. Die Inkubationsmedien bestanden aus RPMI 1640-Medien, die 2 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 μg/ml Polybren und 20% Kalbsfötenserum enthielten (M.A. Bioproducts) enthielten.
Tabelle 3
Beide Formen von löslichem CD4 konnten – wenn sie mit virusinfizierten Zellen ohne vorherige Verdünnung inkubiert wurden – das Wachstum von HIV praktisch eliminieren (Tabelle 2). Bei einer Verdünnung von 1:4 konnten die löslichen CD4-Präparate das Virenwachstum nur teilweise hemmen, doch die Werte bei fluoreszenzpositiven Zellen und Reverser Transkriptase lag noch immer deutlich unter jenen Kulturen, die scheintransfizierte Zellüberstände erhielten (Tabelle 2). Da zwischen den verdünnten und den unverdünnten Vergleichsüberständen keine signifkante Differenz hinsicht lich des Virenwachstums vorlag und keiner der Überstände das Wachstum uninfizierter H9-Zellen beeinflußte (Daten nicht dargestellt), wurde gefolgert, daß die in diesen Überständen enthaltenen löslichen CD4-Proteine für die Neutralisation der HIV-I-Infektion von H9-Zellen verantwortlich waren.
Abschnitt 5c
Um die Affinitätskonstante für Wechselwirkungen zwischen gp120 und CD4 oder CD4-Varianten zu bestimmen, wurde eine Sättigungsbindungs-Analyse mit löslichem CD4 (s.o.) und mit mit Detergens solubilisiertem intaktem CD4 (Lasky et al., Cell 50, 975 [1987]) unter Verwendung von mit Lactoperoxidase markiertem radioiodiertem gp120 durchgeführt. Die Bindereaktionsgemische bestanden aus ¹²⁵I-gp120 (3 ng bis 670 ng, 2,9 nCi/ng), das 1 Stunde lang bei 0°C mit ZeIIIysaten, die intaktes CD4 enthielten (Lasky et al., a.a.O.), oder Zellüberständen, die unmarkiertes CD4T oder gDCD4T enthielten (hergestellt wie in Abschnitt 5a beschrieben), inkubiert wurde. Die Reaktionsgemische (0,2 ml) wiesen eine Endzusammensetzung von 0,5X McDougal Lyse-Puffer (McDLB) (1X McDLB enthält 0,5% Nonidet NP-40, 0,2% Na-Desoxycholat, 0,12 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, pH 8,0) auf und wurden in Doppelbestimmungen, sowohl in Anwesenheit als auch in Abwesenheit von 50 μg unmarkiertem gereinigtem gp120 (74facher oder höherer Überschuß), durchgeführt. Nach der Inkubation wurde gebundenes gp120 durch Immunfällung qu1fiziert und in einem Gammazähler gezählt. Zur Immunfällung wurden Bindereaktionslösungen mit 5 μl normalem Hasenserum 1 Stunde lang bei 0°C vorabsorbiert und mit 40 μl Pansorbin (10% w/v, Calbiochem) 30 Minuten lang bei 0°C geklärt. Die Proben wurden dann über Nacht bei 0°C mit 2 μl normalem Serum oder 5 μl (0,25 μg) monoklonalem OKT4-Antikörper (Ortho) inkubiert, gefolgt von der Sammlung der Immunkomplexe mit 10 μl Pansorbin. Die Niederschläge wurden zweimal in 1X McDLB und einmal in Wasser gewaschen, dann durch Elution bei 100°C für 2 Minuten in Probenpuffer (0,12 M Tris-HCl, pH 6,8, 4% SDS, 0,7 M Mercaptoethanol, 20% Glycerin und 0,1% Bromphenolblau) eluiert. CD4-Moleküle wurden von gp120 bis zur Sättigung gebunden und ergaben eine einfache Massenwirkungs-Bindungskurve. Überstände von scheintransfizierten Zellen ergaben einen Wert an spezifisch gebundenem gp120 von weniger als 1% des Werts der Überstände mit löslichem CD4. Die Scatchard-Analyse zeigte eine einzige Klasse von Bindungsstellen in jedem Molekül, wobei sich scheinbare Dissoziationskonstanten (Kd) von 1,3 × 10^–9 M, 0,83 × 10^–9 M und 0,72 × 10^–9 M für intaktes CD4, CD4T bzw. gDCD4T ergaben. Die für die CD4-gp120-Bindung in Lösung erhaltenen Werte sind mit der Affinität vergleichbar, die bereits für die gp120-Bindung an CD4 bei ganzen Zellen gemessen wurde (Kd = 4,0 × 10^–9 M. Lasky, Cell, s.o.).
Abschnitt 6
Um sekretierte Derivate von CD4 zu produzieren, die frei von fremden Aminosäureresten waren, wurden zwei Plasmide zur Expression in 293-Zellen konstruiert. Die Plasmide enthielten CD4-Gene, die ohne Zusatz zusätzlicher Reste abgestumpft worden waren, wurden als pRKCD4ΔN1a und pRKCD4TP bezeichnet (produzieren Proteine, die CD4TP und CD4ΔN1a genannt wurden) und wurden wie folgt konstruiert:
Fragment 14, das das CD4-Gen enthielt, worin das 195 bp-NlaIII-Restriktionsfragment deletiert ist, wurde an Fragment 16, d.h. mit EcoRI und BamHI gespaltenes pRKS, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E.coli-Stamm 294 transformiert, die transformierte Kultur auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht. Das resultierende Plasmid wurde als pRKCD4ΔN1a bezeichnet.
Synthetische DNA (5' CGT GAT AGA AGC TTT CTA GAG 3') wurde an der HpaII-Stelle an 1176 bp angebracht, sodaß die Translation nach Aminosäurerest 368 von reifem CD4 terminiert wird (Fragment 27). Das andere Ende dieses Fragments wurde so konstruiert, daß es an BamHI-Restriktionsfragmente ligiert werden kann. pUCCD4 wurde mit BstEII und HpaII gespalten und das 382 bp-Fragment, das einen Teil des CD4-Gens enthielt, gewonnen (Fragment 28). Die Fragmente 27 und 28 wurden ligiert und dann mit BstEII gespalten, um dimerisierte Fragmente zu Mono meren zu reduzieren, und das resultierende 401 bp-Fragment gewonnen (Fragment 29).
pRKCD4 wurde mit BstII und BamHI gespalten und das Fragment, das den Großteil des Plasmids umfaßte (Fragment 30), isoliert und an Fragment 29 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E.coli-Stamm 294 transformiert, die transformierte Kultur auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments überprüft. Das resultierende Plasmid wurde als pRKCD4TP bezeichnet. Beide Plasmide wurden in 293-Zellen transfiziert, um stabile, CD4 exprimierende Zellinien-Varianten zu erzeugen, wie oben beschrieben.
Abschnitt 7
Zwei Plasmide wurden konstruiert, um die Expression von sekretiertem CD4, dem fremde Aminosäurereste fehlen, in CHO-Zellen zu lenken. Die Plasmide wurden als pSVeCD4ΔN1aSVDHFR und pSVeCD4TPSVDHFR bezeichnet (kodieren für Proteine mit der Primärsequenz von CD4ΔN1a und CD4TP) und wurden wie folgt konstruiert:
pE348HBV.E400D22 wurde mit Pvul und EcoRI gespalten und das Fragment, das den frühen SV40-Promotor und einen Teil des β-Lactamase-Gens enthielt, gewonnen (Fragment 31). pE348HBV.E400D22 wurde mit Pvul und BamHI gespalten und das große Fragment, das den Rest des β-Lactamase-Gens sowie den frühen SV40-Promotor und das DHFR-Gen enthielt, isoliert (Fragment 32).
Die Fragmente 31 und 32 wurden zusammen mit Fragment 14 ligiert und in E.coli-Stamm 294 transformiert. Die transformierte Kultur wurde auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments überprüft. Das resultierende Plasmid wurde als pSVECD4ΔN1aSVDHFR bezeichnet. Dieses Plasmid enthielt das gleiche für das lösliche CD4-Molekül kodie rende DNA-Fragment, wie es im obigen Plasmid pSVeCD4ΔN1aDHFR zu finden war (Abschnitt 2).
pRKCD4TP wurde mit EcoRI und BamHI gespalten und das Fragment, das den gekürzten CD4-Kodierbereich enthielt, isoliert und an die Fragmente 31 und 32 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E.coli-Stamm 294 transformiert, die transformierte Kultur auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments überprüft. Das resultierende Plasmid wurde als pSVeCD4TPSVDHFR bezeichnet. Beide Plasmide wurden in CHO-Zellen transfiziert und amplifizierte Transfektanten mittels Methotrexat unter Anwendung von Standardverfahren selektiert.
Beispiel 2
Fusionen des V-Bereichs des CD4-Gens, der zum variablen Bereich von Immunglobulin-Genen homolog ist (siehe Maddon et al., 1985), mit dem konstanten (C-) Bereich menschlicher Immunglobulin-κ- und -γ2-Ketten wurden wie folgt konstruiert: Synthetische DNA wurde hergestellt, um für den C-Bereich der menschlichen κ-Kette (Reste 109–214), basierend auf der von Morin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 7025-7029, veröffentlichten Sequenz, zu kodieren – wobei am 5'-Ende des Kodierstrangs die Sequenz GGGG hinzugefügt wurde, die ermöglicht, dieses Fragment an die BspMI-Stelle am Ende des vermeintlichen V-artigen Bereichs von CD4 zu ligieren. Am 3'-Ende des Kodierbereichs wurde ein Translations-Stopcodon sowie eine Sequenz hinzugefügt, die ermöglicht, daß dieses Ende an BamHI-Restriktionsfragmente ligiert wird. Die synthetische DNA wird in 8 Fragmenten gebildet, 4 für jeden Strang mit einer Basenlänge von 70–90. Diese werden dann vor der Isolation auf Polyacrylamid-Gel anneliert und ligiert (Fragment 33).
pRKCD4 wird mit EcoRI und BspMI gespalten und das 478 bp-Fragment, das den für die vermeintliche V-artige Domäne von CD4 kodierenden Bereich enthielt, ge wonnen (Fragment 34). Die Fragmente 33 und 34 werden zusammen mit Fragment 16 (vom Expressionsvektor pRK5) ligiert. Das Ligationsgemisch wird in E.coli-Stamm 294 transformiert, die transformierte Kultur auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wird aus Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments überprüft. Das resultierende Plasmid wurde als pRKCD4Ck bezeichnet.
Ein für eine Fusion der V-artigen Domäne von CD4 mit dem menschlichen Immunglobulin-Cγ2-Bereich kodierendes Plasmid wird auf ähnliche Weise konstruiert und als pRKCD4Cγ2 bezechnet. Diese beiden Plasmide werden in 293-Zellen, Myelomzellen oder andere kompetente Zellen transfiziert, um Zellinien zu erhalten, die CD4-Varientenmoleküle wie zuvor beschrieben exprimieren.
Beispiel 3
Das nach dem Verfahren aus Beispiel 1 sekretierte gDCD4T wurde aus Zellkulturflüssigkeit gereinigt, die entweder 10% FBS (Rinderfötenserum) oder kein zugesetztes FBS enthielt. Die konditionierte Zellkulturflüssigkeit wurde zunächst durch Ultrafiltration aufkonzentriert und dann mittels Immunaffinitäts-Chromatographie gereinigt. Die Immunaffinitätssäule wurde nach dem Verfahren von Roy et al., 1984, durch Binden von monoklonalem Mäuse-Antikörper 5B6 (dessen Epitop im HSV-1-gD-Abschnitt des gDCG4T-Moleküls liegt) an glycerylbeschichtetes Glas mit gesteuerter Porengröße hergestellt. Die konzentrierte Zellkulturflüssigkeit wurde direkt auf die Säule aufgebracht und die kontaminierenden Proteine mit neutralem pH-Puffer ausgewaschen. Die Säule wurde dann mit neutralem Puffer, der Tetramethylammoniumchlorid enthielt, und anschließend mit neutralem, Tween 80 enthaltendem Puffer gewaschen. Das gebundene gDCD4T wird aus der Säule mit Puffer mit pH 3 (enthielt Tween 80, 0,1% w/v) eluiert und unmittlebar danach neutralisiert. Das eluierte neutralisierte gDCD4T wird dann durch Ultrafiltration aufkonzentriert und dialysiert/diafiltriert, um den Puffer durch eine physiologische Salzlösung zu ersetzen, die Tween 80 mit etwa 0,1% w/v enthielt.
Falls kein Detergens vorhanden war, bildete das gDCD4T Aggregate, was sich dadurch zeigte, daß durch zweiminütige Zentrifugation bei etwa 10.000 × g das gDCD4T aus der Lösung entfernt werden konnte. Die Inkubaton von gDCD4T bei 4°C in 0,1 M Natriumacetat, 0,5 M NaCl und 0,25 M Tris, pH 7, zusammen mit BSA, Tween 80 oder Glycerin als Test-Stabilisatoren zeigte, daß in Abwesenheit von Stabilisator das gDCD4T im Laufe von 12 Tagen allmählich bis zu einem Punkt aggregierte, wo nur etwa 60–70% des Proteins löslich waren. Die Verwendung von 0,1 w/v Tween 80 oder 0,5 mg/ml BSA stellte jedoch sicher, daß etwa 100% bzw. 80% des gDCD4T während dieses Zeitraums löslich blieben. Überraschenderweise war Glycerin als Stabilisator nicht wirksam und führte zu Ergebnissen, die selbst unter dem Vergleich lagen – nach 8 Tagen waren etwa 80% des gDCD4T aggregiert, wenn es in Gegenwart von Glycerin gelagert wurde.
Beispiel 4
Plasmide wurden konstruiert, um die Expression von Proteinen zu lenken, die unterschiedliche Längen der aminoterminalen extrazellulären Domäne von CD4, fusioniert mit dem konstanten Bereich von menschlichem Immunglobulin γ1, enthalten. Diese Plasmide wurden als pRKCD4_2γ1, pRKCD4_e4γ1, pRKCD4_2γ1, pRKCD4_e4γ1, pRKCD4_1γ1 und pRKCD4_e1γ1 bezeichnet.
Plasmid pRKCD4_4γ1 enthielt den Abschnitt des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für Serinrest 366 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der Sequenz, die für den konstanten Bereich von menschlichem Immunglobulin γ1, beginnend am Codon für Serinrest 114 von reifem menschlichem Immunglobulin γ1 (Kabat et al.), kodiert.
Plasmid pRKCD4_e4γ1 enthielt den Abschnitt des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für Lysinrest 360 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der Sequenz, die für den konstanten Bereich von menschlichem Immunglobulin γ1, beginnend am Codon für Serinrest 114 von reifem menschlichem Immunglobulin γ1 (Kabat et al.), kodiert.
Plasmid pRKCD4_2γ1 enthielt den Abschnitt des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für Glutaminrest 180 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der Sequenz, die für den konstanten Bereich von menschlichem Immunglobulin γ1, beginnend am Codon für Serinrest 114 von reifem menschlichem Immunglobulin γ1 (Kabat et al.), kodiert.
Plasmid pRKCD4_e2γ1 enthielt den Abschnitt des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für Leucinrest 177 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der Sequenz, die für den konstanten Bereich von menschlichem Immunglobulin γ1, beginnend am Codon für Serinrest 114 von reifem menschlichem Immunglobulin γ1 (Kabat et al.), kodiert.
Plasmid pRKCD4_1γ1 enthielt den Abschnitt des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für Asparaginsäurerest 105 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der Sequenz, die für den konstanten Bereich von menschlichem Immunglobulin γ1, beginnend am Codon für Serinrest 114 von reifem menschlichem Immunglobulin γ1 (Kabat et al.), kodiert.
Plasmid pRKCD4_e1γ1 enthielt den Abschnitt des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für Leucinrest 100 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der Sequenz, die für den konstanten Bereich von menschlichem Immunglobulin γ1, beginnend am Codon für Serinrest 114 von reifem menschlichem Immunglobulin γ1 (Kabat et al.), kodiert.
Die Konstruktion dieser Plasmide erforderte die vorherige Konstruktion von Plasmid pRKCD4TP/γ1. Dieses wurde wie folgt konstruiert:
Ein cDNA-Klon, der für menschliches Immunglobulin γ1 kodiert, wurde aus einer menschlichen Milz-cDNA-Bibliothek (Clontech Laboratories, Inc.) unter Verwendung von Nukleotiden auf der Basis der veröffentlichten Sequenz (Ellison et al., Nucl. Acids. Res: 10, 4071–4079 [1982]) erhalten, und es wurde ein EcoRI-EagI-Fragment (die EcoRI-Stelle wurde von einem Linker bereitgestellt; siehe die 4a, 4b), das Teil des variablen und den gesamten konstanten Bereich enthielt, erhalten. Dieses Fragment wurde mit Klenow-Fragment abgestumpft und durch Gel-Elektrophorese gewonnen (Fragment a1).
Plasmid pRKCD4TP-kk, das für eine Substitutionsvariante von löslichem CD4 kodiert (Reste 1-368), die einen Lysinrest statt eines Asparagins an Position 1 des reifen Polypeptids enthielt, wurde durch stellengerichtete Mutagenese aus Plasmid pRK-CD4TP konstruiert. Ein synthetisches Oligonukleotid wurde als Primer für eine Mutagenesereaktion gebildet, um die gewünschte Kodiersequenz zu erhalten. Diese wurde als 51-mer synthetisiert, das zusätzlich zur Substitutionsmutation zwei stille Mutationen der natürlichen Sequenz sowie 21 Basen auf jeder Seite der mutierten Codons enthielt:
Plasmid pRKCD4TP wurde in E.coli-Stamm SR101 transformiert, und die transformierten Kolonien wurden auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht. Resistente Kolonien wurden selektiert und in Gegenwart von m13K07-Helfer-Bakteriophage gezüchtet, um sekretierte, mit Capsid umgebene, einstrangige Template von pRKCD4TP zu ergeben. Die einstrangige Plasmid-DNA wurde isoliert und als Templat für Mutagenesereaktionen mit den oben als Primer beschriebenen synthetischen Oligonukleotiden verwendet. Das Mutagenese-Reaktionsgemisch wurde in E.coli SR101 transformiert und die transformierte Kultur auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht. Transformanten wurden durch Koloniehybridisierung (siehe Grunstein-Hogness) auf Gegenwart der geeigneten Sequenz unter Verwendung des folgenden 16-mers als Sonde gescreent:
Die gewählten Hybridisierungsbedingungen waren ausreichend spezifisch, daß die Sonde nur das korrekt fusionierte Produkt detektieren konnte. Als positiv identifizierte Kolonien wurden selektiert, Plasmid-DNA isoliert und in E.coli-Stamm SR101 transformiert. Die transformierten Kulturen wurden auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht, resistente Kolonien ausgewählt und in Gegenwart von m13K07-Bakteriophage gezüchtet. Template wurden wie oben hergestellt und durch Sequenzieren gescreent.
Plasmid pRKCD4TP-kk wurde mit Xbal gespalten und mit Klenow-Enzym behandelt, und Fragment a2, welches das linearisierte Plasmid enthielt, wurde durch Gel-Elektrophorese hergestellt und mit Fragment a1 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E.coli-Stamm 294 transformiert, die transformierte Kultur auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht und resistente Kolonien selektiert. Plasmid-DNA wurde aus den Transformanten erhalten und durch Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments in der korrekten Ausrichtung untersucht (d.h. der Immungloblin-Kodierbereich in derselben Ausrichtung wie der CD4-Kodierbereich und am 3'-Ende des CD4-Kodierbereichs). Dieses Plasmid wurde als pRKCD4TP/γ1 bezeichnet.
Synthetische Oligonukleotide wurden als Primer für Deletions-Mutagenesereaktionen hergestellt, um die geeigneten Kodiersequenzen von IgG1 und CD4 zu fusionieren (siehe oben). Diese wurden als 48-mere synthetisiert, umfassend 24 Nukleotide auf jeder Seite der gewünschten Fusionsstelle (d.h. entsprechend den 8 COOH-terminalen Resten des gewünschten CD4-Teils und den 8 NH₂-terminalen Resten des gewünschten Immunglobulin-Teils). Plasmid pRKCD4TP/γ1 wurde in E.coli-Stamm SR101 transformiert und die transformierten Kulturen auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht. Resistente Kolonien wurden selektiert und in Gegenwart von m13K07- Helfer-Bakteriophage gezüchtet, um sekretierte, mit Capsid umgebene, einstrangige Template von pRKCD4TP/γ1 zu erhalten. Die einstrangige Plasmid-DNA wurde isoliert und als Templat für Mutagenesereaktionen mit den oben als Primer beschriebenen synthetischen Oligonukleotiden verwendet. Die Mutagenesereaktionsgemische wurden in E.coli SR101 transformiert und die transformierte Kultur auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht. Transformanten wurden durch Kolonie-Hybridisierung (siehe Grunstein-Hogness) unter Verwendung von 16-meren als Sonden auf die Gegenwart der geeigneten Fusionsstelle gescreent. Diese 16-mere umfaßten 8 Basen auf jeder Seite der Fusionsstelle, und die gewählten Hybridisierungsbedingungen waren ausreichend spezifisch, damit die Sonden nur das korrekt fusionierte Produkt detektierten. Als positiv identifizierte Kolonien wurden selektiert, Plasmid-DNA isoliert und in E.coli-Stamm SR101 transformiert. Die transformierten Kulturen wurden auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht, resistente Kolonien selektiert und in Gegenwart von m13K07-Bakteriophage gezüchtet. Template wurden wie oben gebildet und durch Sequenzieren gescreent.
Die Plasmide wurden nach Standardverfahren in 293-Zellen transfiziert und wie oben beschrieben auf Expression und Produktion untersucht.
Es wurden auch Plasmide konstruiert, um die Expression von Fusionsproteinen zu lenken, die unterschiedliche Längen der aminoterminalen extrazellulären Domäne von CD4 enthielten, fusioniert mit dem gekürzten Abschnitt des konstanten Bereichs von menschlichem Immunglobulin γ1, der nur den Hinge-Bereich und die konstanten Domänen CH₂ und CH₃ umfaßte.
Synthetische Oligonukleotide wurden als Primer für Mutagenesereaktionen gebildet, um die Immunglobulin-Sequenz von Ser114 bis einschließlich Cys 215 zu deletieren (Kabat et al.). Diese wurden als 48-mere synthetisiert, umfassend 24 Nukleotide auf jeder Seite der gewünschten Fusionsstelle (d.h. entsprechend den 8 COOH-terminalen Resten des gewünschten CD4-Teils und den 8 NH₂-terminalen Resten des gewünschten Immunglobulin-Teils). Die Plasmide pRKCD4_4γ1, pRKCD4_2γ1 und pRKCD4_1γ1 wurden jeweils in E.coli-Stamm SR101 transformiert und die transformierte Kultur auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht. Resistente Kolonien wurden selektiert und in Gegenwart von m13K07-Helfer-Bakteriophage gezüchtet, um sekretierte, mit Capsid umgebene, einstrangige Template dieser Plasmide zu erhalten. Die einstrangige Plasmid-DNA wurde isoliert und als Templat für Mutagenesereaktionen mit den oben als Primern beschriebenen synthetischen Oligonukleotiden verwendet. Die Mutagenesereaktionsgemische wurden in E.coli SR101 transformiert und die transformierte Kultur auf Ampicillinmedium-Platten aufgeracht. Transformanten wurden mittels Kolonie-Hybridisierung (Grunstein-Hogness) unter Verwendung von 16-meren als Sonden auf die Gegenwart der geeigneten Fusionsstelle gescreent. Diese 16-mere umfassen 8 Basen auf beiden Seiten der Fusionsstelle, und die gewählten Hybridisierungsbedingungen waren ausreichend spezifisch, daß die Sonden nur das korrekt fusionierte Produkt detektierten. Als positiv identifizierte Kolonien wurden selektiert, Plasmid-DNA isoliert und in E.coli-Stamm SR101 transformiert. Die transformierten Kulturen wurden auf Ampicillinmedium-Platten aufgebracht, resistente Kolonien selektiert und in Gegenwart von m13K07-Bakteriophage gezüchtet. Template wurden wie oben gebildet und durch Sequenzieren gescreent.
Das von Plasmid pRKCD4_4γ1 stammende Plasmid wurde als pRKCD4_4Fc1, das von Plasmid pRKCD4_2γ1 stammende Plasmid als pRKCD4_2Fc1 und das von Plasmid pRKCD4_1γ1 stammende Plasmid als pRKCD4_1Fc1 bezeichnet.
pRKCD4_2Fc1, pRKCD4_1Fc1 und pRKCD4_4Fc1 wurden in gleicher Weise wie oben kultiviert und CH₁-deletierte CD4-Immunadhäsone so gewonnen, wie hierin an anderer Stelle beschrieben.
Fusionen leichter Ketten
Plasmide wurden konstruiert, um die Expression von Proteinen zu lenken, die unterschiedliche Längen der aminoterminalen extrazellulären Domäne von CD4, fusioniert mit dem konstanten Bereich von menschlichem Immunglobulin κ, enthielten. Diese Plasmide wurden als pRKCD4_4κ und pRKCD4_e4κ bezeichnet.
Plasmid pRKCD4_4κ enthielt den Abschnitt den CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für Serinrest 366 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der Sequenz für den konstanten Bereich von menschlichem Immunglobulin κ, beginnend beim Codon für Threoninrest 109 des reifen menschlichen Immunglobulins κ (Kabat et al.).
Plasmid pRKCD4_e4κ enthielt den abschnitt des CD4-Gens vom Initiationscodon bis zur Fusionsstelle nach dem Codon für Lysinrest 360 des reifen CD4-Polypeptids, unmittelbar gefolgt von der Sequenz für den konstanten Bereich von menschlichem Immunglobulin κ, beginnend beim Codon für Threoninrest 109 des reifen menschlichen Immunglobulins κ (Kabat et al.).
Diese Plasmide wurden – mit der folgenden Ausnahme – in gleicher Weise wie die obigen Plasmide pRKCD4_4γ1 und pRKCD4_e4γ1 konstruiert:
Die menschliche Immunglobulin κ-Kodiersequenz (5) wurde aus einer menschlichen Milz-cDNA-Bibliothek (Clontech Laboratories, Inc.) unter Verwendung von Oligonukleotiden auf der Basis der veröffentlichten Sequenz (Hieter, P.A. et al., Cell 22, 197–207 [1980]) erhalten und ein EcoRI-BspMI-Fragment gebildet, das einen Teil des variablen Bereichs und den gesamten konstanten Bereich enthielt (siehe 5). Dieses Fragment wurde mit Klenow-Fragment und den vier dNTPs abgestumpft. Dieses Fragment wurde anstelle von Fragment a1 eingesetzt und diente dazu, Plasmid pRKCD4TP/hκ zu konstruieren.
Expression in CHO-Zellen
Plasmide wurden oder werden konstruiert, um die Expression der oben beschriebenen Immunadhäsone in CHO-Zellen zu lenken. Sie tragen die Bezeichnungen pSVe-CD4_4γ1SVDHFR, pSVeCD4_2γ1SVDHFR, pSVeCD4_1γ1SVDHFR, pSVeCD4_e4γ1SV-DHFR, pSVeCD4_e2γ1SVDHFR, pSVeCD4_e1γ1SVDHFR, pSVeCD4_4Fc1SVDHFR, pSVe-CD4_2Fc1SVDHFR, pSVeCD4_1Fc1SVDHFR, pSVeCD4_4κSVDHFR und pSVeCD4_2κSV-DHFR.
Fragment 31 wurde wie oben beschrieben hergestellt. Fragment 32a wurde durch Spaltung von Plasmid pE348HBV.E400 D22 mit BamHI, Abstumpfen mit Klenow-Fragment und den vier dNTPs sowie anschließende Spaltung mit Pvul und Isolieren des großen Fragments hergestellt, das den Rest des β-Lactamase-Gens, den frühen SV40-Promotor sowie das DHFR-Gen enthielt. Die Plasmide pRKCD4_4γ1, pRK-CD4_2γ1, pRKCD4_1γ1, pRKCD4_e4γ1, pRKCD4_e2γ1, pRKCD4_e1γ1, pRKCD4_4Fc1, pRK-CD4_2Fc1, pRKCD4_1Fc1, pRKCD4_4κ und pRKCD4_2κ wurden jeweils mit HindIII gespalten, mit Klenow-Fragment und den vier dNTPs abgestumpft und anschließend mit EcoRI gespalten; die für das CD4-Ig-Fusionsprotein kodierenden Fragmente wurden isoliert. Die resultierenden DNA-Fragmente wurden mit den Fragmenten 31 und 32a ligiert und in E.coli-Stamm 294 transformiert. Kolonien wurden wie oben selektiert und auf Gegenwart des korrekten Plasmids überprüft, anschließend in CHO-Zellen transfiziert und durch Methotrexat-Selektion nach herkömmlichen Verfahren amplifiziert.
Beispiel 5
Kultur, Reinigung und Formulierung von CD4-Varianten
Plasmide, die für lösliche CD4-Adhäsone wie z.B. CD4T, CD4TP oder lösliche CD4-Immunadhäsone kodieren, wurden mit Calciumphosphat in CHO-DP7 (eine von CHO abstammende, mit Proinsulin transformierte, autokrine Wirtszelle, U.S.S.N. 97-472) transfiziert und die Transformanten in selektivem Medium (1:1 HAM F12/DMEM GHT^–, umfassend 1–10% diafiltriertes oder dialysiertes Rinderserum) vermehrt. Andere geeignete Wirtszellen sind CHO-Zellen oder menschliche 293S-Embyronieren zellen. Die Transformanten wurden durch Methotrexat-Selektion im gleichen Medium, das allerdings 500 nm Methotrexat enthielt, amplifiziert. Ein Subklon, der CD4TP, CD4tp 500 b sekretieren konnte, wurde selektiert. CD4tp 500 b wurde in einem DMEM/HAM F12-Medium bei etwa 37°C kultiviert, bis sich CD4TP in der Kultur ansammelt; danach wurde das Medium durch Zentrifugation von den Zellen und unlöslichen Stoffen abgetrennt.
Kulturflüssigkeit von CD4TP-Transformanten wurde aufkonzentriert und diafiltriert, um die Ionenstärke zu senken. Das Konzentrat wurde durch ein großes Volumen an Q-Sepharose-Anionenaustauchharz (zuvor mit 25 mM NaCl, pH 8,5, äquilibriert) geleitet, um Verunreinigungen aus der Kulturflüssigkeit zu adsorbieren. Der isoelektrische Punkt von CD4TP betrug etwa 9,5, wodurch es möglich war, gekürzte Formen von CD4 und die meisten Verunreinigungen durch alternierende Adsorption an ein Kationenaustauschharz, wie z.B. Carboxymethyl- oder Sulfonyl-Sepharose, und ein Anionenaustauschharz, wie z.B. quaternäre Ammonium-Sepharose, zu unterscheiden. Da stark elektropositive Domänen im extrazellulären Segment von CD4 vorhanden waren, wurde jede CD4-hältige Variante in gleicher Weise wie CD4TP gereinigt. Die nichtadsorbierte Kulturflüssigkeit aus dem Anionenaustauschharz-Schritt wurde dann durch ein Kationenaustauschharz (zuvor mit 25 mM NaCl mit pH 8,5 äquilibriert) geleitet, wodurch CD4TP an das Harz adsorbiert wurde. Das CD4TP wurde mit einem NaCl-Gradienten mit pH 8,5 eluiert, wobei diese CD4-Variante bei etwa 0,2 M NaCl eluierte. Ammoniumsulfat wurde dem Eluat bis zu einer Konzentration von 1,7 M zugegeben und die Lösung durch eine Säule aus Hydrophobchromatographie-Harz (Phenyl- oder Butyl-Sepharose) geschickt. Das CD4TP wurde mit einem Ammoniumsulfat-Gradienten aus der Hydrophobchromatographie-Säule eluiert, wobei CD4TP bei etwa 0,7 M Ammoniumsulfat austrat. Das Eluat wurde auf einer G-25-Säule mittels phosphatgepufferter Salzlösung, die 0,02% (w/v) Tween 20 oder Tween 80 enthielt, aufkonzentriert und pufferausgetauscht. CD4TP war in dieser Lösung, die sterilfiltriert und als wäßrige Formulierung in Fläschchen abgefüllt wurde, löslich und stabil. Andere polymere, nichtionogene Tenside werden günstigerweise mit den CD4-Formulierungen verwendet, z.B. Pluronic-Blockcopolymere oder Polyethylenglykol.
Es ist auch möglich, Immunaffinitätsreinigung von löslichem CD4 einzusetzen, wobei das CD4 an einen immobilisierten Antikörper gegen CD4 adsorbiert wird. Dieses Verfahren weist den Nachteil auf, daß die Elution des löslichen CD4 unter sauren Bedingungen zu Proteinaggregation führt, die nur bei relativ höheren Tensidwerten deutlich herabgesetzt werden kann. Das obige Verfahren erlaubt die Verwendung viel geringerer Tensidmengen, nämlich etwa 0,01–0,10% (w/v) Tensid.
Das folgende Verfahren zur Reinigung von CD4-Fusionen mit schwerer Immunglobulin-Kette bestand darin, Rekombinations-Überstände durch Ultrafiltration aufzukonzentrieren und anschließend die Fusion an harzimmobilisiertes Staphylokokken-Protein A zu adsorbieren. Die Fusion wurde mit 0,1 M Citratpuffer (pH 3) ohne Salz oder Detergens eluiert. Das Präparat wurde in Tris-Puffer mit pH 7,5 gepuffert. Die Immunglobulin-Fusionen mit CD4 V1–V4 wurden gegebenenfalls mittels des oben beschriebenen Verfahrens für nichtfusionierte CD4-Varianten weiter gereinigt. CD4-Immunglobulin-Fusionen mit CD4 V1–V2 können auch nach der obigen Vorgangsweise gereinigt werden, mit der Ausnahme, daß nicht zu erwarten ist, daß der isoelektrische Punkt dieser Klasse von Molekülen so alkalisch ist wie jener der Spezies, die alle vier V-Bereiche von CD4 enthält.
Beispiel 6
Die Eigenschaften verschiedener Adhäsonvarianten wurden bestimmt. Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, zeigen die Immunadhäsone CD4_4γ1 und CD4_2γ1 eine verbesserte Plasma-Halbwertszeit bei Hasen, zusammen mit gp120-Bindung hoher Affinität und Affinität für Fcγ-Rezeptor (bestimmt mit U937-Zellen), die mit jener des Hauptteils von menschlichem IgG1 vergleichbar ist.
Tabelle 4

Claims

Immunglobulin-Schwerketten-Dimer, worin die variable Region einer Immunglobulin-Schwerkette durch die Sequenz der extrazellulären Domäne eines Zelloberflächenmitglieds der Immunglobulin-Gen-Überfamilie ersetzt ist, wobei das Überfamilienmitglied kein Haupt-Histokompatibilitäts-Antigen der Klasse 1 oder Klasse II, kein Immunglobulin und weder die α-, β-, γ- noch die δ-Kette eines T-Zellenrezeptors ist, wobei das Dimer ein Polypeptid umfasst, das die mit einer konstanten Region einer Immunglobulin-Schwerkette fusionierte extrazelluläre Domäne umfasst, und worin im Dimer die extrazelluläre Domäne einen Liganden des Mitglieds der Immunglobulin-Gen-Überfamilie bindet.
Immunglobulin-Schwerketten-Dimer nach Anspruch 1, die für diesen Liganden zweiwertig ist.
Immunglobulin-Schwerketten-Dimer nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Immunglobulin-Sequenz von IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD oder IgM stammt.
Immunglobulin-Schwerketten-Dimer nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Überfamilienmitglied CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD28, OX-2, Thy-1, ein interzelluläres oder neurales Bindemolekül, Poly-Ig-Rezeptor, mit Myelin assoziiertes Glykoprotein, IgE-Rezeptor mit hoher Affinität, von Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor-Rezeptor, Kolonie stimulierender Faktor-1-Rezeptor, Fc-γ-Rezeptoren oder das carcinoembryonale Antigen ist.
Immunglobulin-Schwerketten-Dimer nach Anspruch 4, worin das Überfamilienmitglied CD2, CD4, CD8, CD28, die γ-, δ- oder ε-Kette von CD3 oder der IgE-Rezeptor mit hoher Affinität ist.
Immunglobulin-Schwerketten-Dimer nach Anspruch 5, worin das Überfamilienmitglied CD4 ist.
Immunglobulin-Schwerketten-Dimer nach Anspruch 1, worin die V₁-Domäne von CD4 oder CD4, das keine Transmembran und zytoplasmatischen Domänen aufweist, an ihrem C-Terminus mit der konstanten Region fusioniert ist.
Polypeptid, umfassend eine extrazelluläre Domäne von CD4, fusioniert mit einem zu CD4 fremden Polypeptid.
Polypeptid nach Anspruch 8, worin das fremde Polypeptid eine Signalsequenz umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 8 oder 9, worin das fremde Polypeptid bei einem Tier eine humorale Immunreaktion hervorrufen kann.
Polypeptid nach Anspruch 10, worin das fremde Polypeptid ein virales Polypeptid oder ein Allergen ist.
Polypeptid nach Anspruch 8, worin das fremde Polypeptid Albumin, Apolipoprotein oder Transferrin ist.
Polypeptid nach Anspruch 8, worin das fremde Polypeptid ein zytotoxisches Polypeptid ist.
CD4-Polypeptid-Aminosäuresequenzvariante mit einer Transmembran-Domäne, die so modifiziert ist, dass sie nicht mehr fähig ist, sich in der Zellmembran anzuordnen.
Variante nach Anspruch 14, worin die Transmembran-Domäne durch Substitution einer Aminosäuresequenz, die ein im Wesentlichen hydrophiles Hydropathie-Profil aufweist, modifiziert worden ist.
Zusammensetzung, umfassend eine CD4-Polypeptid-Aminosäuresequenzvariante, die eine Transmembran-Domäne aufweist, die so modifiziert ist, dass sie nicht mehr zur Verankerung in der Zellmembran fähig ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 16, worin die Variante eine CD4-Aminosäuresequenz umfasst, die zur Bindung von gp120 fähig ist.
CD4-Polypeptidvariante, die ein Fusionsprotein umfasst, in dem ein Polypeptid, das eine variable (V-) menschliche CD4-Antigen-Region umfasst, an seinem C-Terminus mit dem N-Terminus eines Polypeptids fusioniert ist, das eine konstante Region einer Immunglobulin-Kette umfasst, die kovafent mit einem begleitenden Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar assoziiert ist, das eine V_LV_H-Antikörper-Kombinationsstelle umfasst, die zur Bindung an ein vorbestimmtes Antigen fähig ist.
CD4-Polypeptidvariante nach Anspruch 18, die AC_H-(V_LC_L-V_HC_H), (AC_L-AC_H)-(V_LC_L-V_HC_H), (AC_H-V_HC_H)-(V_LC_L-V_HC_H) oder (V_LC_L-AC_H)-(V_LC_L-V_HC_H) ist, worin A eine menschliche CD4-Antigen-V-Region ist, V_L und V_H die variablen Domänen der leichten bzw. schweren Kette eines Immunglobulins sind und C_L und C_H die konstanten Domänen der leichten bzw. schweren Kette eines Immunglobulins sind.
Polypeptid nach Anspruch 18 oder 19, worin das Fusionsprotein die V-J-Domäne des menschlichen CD4-Antigens umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 18 oder 19, worin das menschliche CD4-Antigen die Sequenz Asn-Lys-Val-Val-Leu-Gly-Lys-Lys umfasst.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 18 bis 21, worin die Immunglobulin-Sequenzen von IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgD oder IgM stammen.
Polypeptid nach Anspruch 22, worin die Immunglobulin-Sequenzen von IgG-1 oder IgG-3 stammen.
Polypeptid nach Anspruch 22, worin die Immunglobulin-Sequenzen von IgA oder IgM stammen.
Nukleinsäure, die für ein Dimer nach einem der Ansprüche 1 bis 7 kodiert.
Replizierbarer Vektor, der die Nukleinsäure nach Anspruch 25 umfasst.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend die Nukleinsäure nach Anspruch 25 oder den rekombinanten Vektor nach Anspruch 26.
Verfahren zur Herstellung eines Dimers nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend die Gewinnung des Dimers aus der Kultur einer rekombinanten Wirtszelle nach Anspruch 27.
Nukleinsäure, die für ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 8 bis 13 kodiert.
Replizierbarer Vektor, der die Nukleinsäure nach Anspruch 29 umfasst.
Rekombinante Wirtszelle, die die Nukleinsäure nach Anspruch 29 oder den rekombinanten Vektor nach Anspruch 30 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids nach einem der Ansprüche 8 bis 13, umfassend die Gewinnung des Polypeptids aus der Kultur einer rekombinanten Wirtszelle nach Anspruch 31.
Nukleinsäure, die für ein Polypeptid nach Anspruch 14 oder 15 kodiert.
Verfahren zur Herstellung einer CD4-Polypeptid-Aminosäuresequenzvariante nach Anspruch 14 oder 15, umfassend das Gewinnen der Variante aus der Kultur einer Wirtszelle, die mit der Nukleinsäure nach Anspruch 33 transfiziert ist.
Nukleinsäure, die für eine CD4-Polypeptid-Variante nach einem der Ansprüche 18 bis 25 kodiert.
Verfahren zur Herstellung einer CD4-Polypeptidvariante, umfassend das Transfizieren einer Wirtszelle, die Nukleinsäure exprimiert, welche für ein Immunglobulin mit einer variablen Region kodiert, die gegen ein vorbestimmtes Antigen gerichtet ist, mit Nukleinsäure, die für ein Fusionsprotein kodiert, in dem ein Polypeptid, das eine variable (V-) menschliche CD4-Antigen-Region umfasst, an seinem C-Terminus mit dem N-Terminus eines Polypeptids fusioniert ist, das eine konstante Region einer Immunglobulin-Kette umfasst.
Verfahren nach Anspruch 36, worin die CD4-Polypeptidvariante aus der Wirtszellenkultur gewonnen wird.