JPH05502218A - 治療用組成物；ｈｉｖ感染の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 治療用組成物、ＨＩＶ感染の治療方法 本発明は、ＨＩＶ感染の治療方法および組成物に関するものである。特に、本発 明は、ＨＩＶ感染細胞を特異的に認識可能なトキシン−接合リガンドの使用によ るそのような細胞を標的とする細胞毒性薬剤、ならびにかかるトキシン−接合リ ガンド類の調製に向けられた関連技術に関する。

後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）は、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）とし て同定されているレトロウィルスを原因とする（１−６）。ＨＩＶに感染したほ とんどの個体は、ＨＩＶレトロウィルスに対する細胞性レセプタを発現する細胞 の進行性消耗により特徴付けられる（８）ＡＩＤＳにまで進展し続ける（７）。

ＡＩＤＳにおいては、Ｂ−細胞機能の異常、異常性抗体応答、欠陥をもった卓球 細胞機能、弱められたサイトカイン産生（９−１２）、抑制されたナチュラルキ ラーおよび細胞毒性細胞の機能（１３）、および可溶性抗原に対するリンパ球細 胞の認識および応答能力の欠陥（１４）を含む多くの異常性が記述されている。

ＡＩＤＳに伴う他の免疫的異常も報告されている（１５．　１６）。ＡＩＤＳ患 者における重要な免疫的欠陥のうちに、Ｔ４　（ＣＤ４）ヘルパー／インデュー サーリンパ球母集団の消耗がある（１．２．１１．１２）。

ＡＩＤＳにおいて観察される十分な免疫不全にもかかわらず、原因となる機構は 明確に認識されていない。いくつかの仮定が存在している。一つの観点は、免疫 応答における欠陥が、ＨＩＶによるヘルパーＴ細胞の選択的感染に帰因し、これ により正常な免疫応答に必要なヘルパーＴ細胞機能の損傷および細胞の消耗を生 しるとするものである（１−６．１７）。最近、インビトロおよびインビボの研 究で、免疫応答において補助細胞として基本的な役割を演しることが知られてい る単球細胞にもＨＩＶが感染し得ることが示された（１８．１９）。

ＨＩＶは、感染細胞における正常サイトカイン産生を妨害することによる免疫不 全を導くこともあり、このことは例えばＩＬ−１およびＩＬ−２欠損として２次 的免疫不全を生じるであろう（２０）。これらのモデルのいずれによっても、複 製的ウィルスの感染より、むしろ）ｆｌＶ自体の成分か、ＡＩＤＳに伴われる免 疫的異常の原因となるであろうかという疑問は、何ら解決されない。

ＨｒＶ感染の結果である１次的な免疫的異常性は、ＣＤ４細胞表面糖蛋白質を発 現するＴリンパ球の進行性消耗および機能的損傷である（２９）。ＣＤ４は、イ ムノグロブリン超遺伝子超集団と相同性を有する非多形性糖蛋白質である（３０ ）。ＣＤ４は、ＣＤ８表面抗原といっしょになって、クラス■およびクラス１■ 主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原との関連において、名目上の抗原標的との 相互作用の能力により区別される成熟末梢血Ｔ細胞（３１）の明確な下位分類を 定義する（３２−３６）。多くの場合について、ＣＤ４＋Ｔ＝細胞は、細胞毒性 サプレッサＴ細胞として特徴付けられているＣＤ４＋Ｔ細胞か同定されているに もかかわらず、ヘルパー／インデューサＴ細胞表現型を示す（３７−３９）。

ＣＤＪ＋ヘルパーインデューサＴ細胞機能の損失は、多分、後天性免疫不全症候 群（ＡＩＤＳ）の特徴である日和見感染および悪性症状を導く細胞性および液性 免疫の深刻な欠陥の原因であろう（２９）。

ＣＤ４それ自体か、　“ＨＴＶ−１”に対する細胞性受容体の基本的成分である 可能性は、ＣＤ４ブロック″ＨＩＶ−１”感染および合胞体誘発に対するモノク ローナル抗体の観察により初めて示された（４０−４２）。

体形態の例示、ならびに“ＨｒＶ−１”の向性か、ＣＤ４ｃＤＮΔの安定した発 現に続く通常非許容的なヒト細胞に与えられ得ることの知見により確認された（ ４４）。更に、　“ＨＩ　Ｖ−１”感染個体における中枢神経系機能不全の高い 負担を反映する　“ＨＩＶ−１”の神経向性の特性（４５）　、ならびにＡＩＤ Ｓ患者の脳組織および脳を髄液中に“ＨＩＶ−１”を検出する能力は（４６−５ ０）、ニューロングリアの細胞および単球マクロファージ起点におけるＣＤ４の 発現の説明を与えるものと思われる（５１−５３）。

ＣＤ４前駆体の既知の配列は、疎水性のシグナルペプチド、約３７０個のアミノ 酸の細胞外領域、クラス日ＭＨＣベータ鎖の膜−スパン領域に対して育意な同等 性をもった高度に疎水性の広がり、および４０残基の高度に荷電をもった細胞内 配列を予言している（５８）。

ＣＤ４の細胞外領域自体は、イムノグロブリン軽鎖の変化および結合（Ｖ−Ｊ） 領域ならびにイムノグロブリン遺伝子超集団の他の構成物中の関連領域に対して 、それぞれアミノ酸および構造の類似性を有する４個の連続する領域からなるこ とが見出された（前記遺伝子超集団の下位クラスは、造語“粘着（ａｄｈｅｓｉ ｏｎｓ）”により定義されている）。これらのＣＤ４の構造的に類似する領域は 、Ｖ１Ｊ＋　、Ｖ２．Ｌ、ＶＩＪ、およびＶ４Ｊ４領域（文献２３の図３中に領 域１−４と命名されている）と称されている。

ＨＩＶｅｎｖ蛋白質もまた広範囲に記述されており、また多くのＨＩＶ株由来の アミノ酸配列およびＨＩＶｅｎｖをコードするＲＮＡ配列か知られている（２２ ）。

ＨＩＶピリオンは、宿主細胞の外部膜から誘導される膜またはエンベロープによ りおおわれている。該膜は、カルボキシル末端領域で膜二重層に連結するエンベ ロープ糖蛋白質（ｇｐ１６０）の母集団を含んでいる。各糖蛋白質は、２個の分 節を含む。約］、２０ＫＤの相対分子量のためにｇｐ１２０と称されているＮ− 末端分節は、該ピリオンを取りまく水性環境中に向けて突出している。

ｇｐ４１と称されるＣ−末端領域は、膜に広かっている。

ｇｐ１２０およびｇｐ４１は、蛋白分解的切断に感受性のペプチド結合によって 、共存的に連結されている。

少くとも２種類の免疫系細胞、単球およびＴリンパ球かＨＩＶ（ヒト免疫不全ウ ィルス）に感染する。ＣＤ４受容体を有するこれらの単球およびＴ−細胞のみか ＨＩＶに感染されると考えられている。ＨＩＶウィルス被覆蛋白質（ｇｐ１６０ ）の保存領域は、内在化し細胞内にＲＮＡウィルスを運ぶＣＤ４受容体に結合す る。一旦細胞内に入ると、ウィルスは、その逆転写酵素によりＲＮＡのＤＮＡ複 写物を作る。ヌクレオシド類似体は、ウィルスＲＮＡの転写において鎖破壊物と して作用することにより、細胞を保護する。それらは伸長されるポリマー中に組 込まれるか、次のヌクレオシドを鎖に結合するために必要な官能基を欠いており 、かくして鎖は中断され、非機能的なものとなる。

非感染細胞の保護に向けられた現在のＡＩＤＳ治療は、ウィルス性ＲＮＡ複写を 阻害するヌクレオチド類似体（ＡＺＴおよびＤＤＣ等）の約４時間毎の経口投与 からなる。これらの薬剤は、５０−５００μＭの濃度においてはウィルス複製を 阻害するが、より高濃度（約１　ｍＭ）においてはそれらは細胞分裂に必要な健 常細胞のＤＮＡポリメラーゼをも阻害する。現在の治療は、薬剤の大量投与（ダ ラム／日の程度）を必要とする。該薬剤は経口的に取込まれ、すべての細胞に吸 収される形態であるため、全身がそれらに曝される。毒性がそれらの使用の深刻 な制限となり、形成不全および貧血が最も重大な副作用である。

ヌクレオシド誘導体類は、ＤＮＡに取込まれる（そしてそれらの鎖分裂活性を発 現する）に先立って、ホスホリル化されなければならず、それらはウィルス感染 に感受性のすへての細胞中に同等量存在するのではないキナーゼを必要とする。

従って、経口ヌクレオシド類似体療法は、既に感染した細胞に対しては無効であ り、高濃度のヌクレオシド類をヌクレオチド類に変換することができる感受性細 胞（すなわち分裂細胞）の保護のみが可能である。これらの理由のため、この治 療法は制限され、また疾患の進行を遅らせるのみである。

ＨＩＶ感染治療の種々の別法および付加的方法が研究されてきた。ある一時期に おいて特に有用であることが立証されるであろうと考えられていた一方法は、標 的細胞へのウィルスの付着を阻害する細胞表面粘着の使用であった（２３−２５ ）。この方法は、単離されたＣＤ４分子またはその変異体を、感染細胞から放出 された血漿産生ウィルス粒子に理論的に付く量をもって、ＡＩＤＳ患者に投与す ることを含む。循環するウィルス粒子に付着させることにより、ＣＤ４または変 異体が標的細胞に対するウィルス付着を阻害する作用をし、かくして感染工程を 阻止することが期待される。

前述したＨＪＶ惑染の治療とは別の方法は、細胞毒性薬剤を用いたＨＩＶ感染感 受性“標的”細胞に対する免疫素技術の応用に関連する。免疫毒は、抗体、典型 的にはモノクローナル抗体と植物性トキシンリシンのＡ鎖等のトキシン分子との 接合体である。トキシン類と細胞−反応性リガントとの接合体か、インビトロお よびインビボの両者において標的細胞を特異的に除去し得ることが示されている （２６）。このような接合体は、接合体−抗原複合体のエンドサイト−シスおよ びＡ鎖のサイドシル中への転座の後に蛋白質合成を阻害し、細胞を殺す（２６） 。

ＨＩＶ感染治療のために提案された免疫素技術は、ＨＩＶｅｎｖ糖蛋白質または 他のレトロウィルス蛋白質のトキシン接合体の使用を含む（２７，２８）。レト ロウィルスｅｎｖ蛋白質のトキシン接合体に関しては、細胞毒素と接合するｇｌ ）１２０またはｇｐ４１分子等の構造か、トキシン残基を標的とし、しかしてＨ ＩＶを保持しているであろう細胞、ＣＤ４”Ｔ−細胞を殺す作用をするてあろう ことが提案されている。この方法において、感染の悪質な周期およびウィルス複 製か破壊され得ることか望まれる。

別法として、ｅｎｖまたはＣＤ４蛋白質のいずれかに対して特異性を有する抗体 類から形成された免疫毒（または免疫接合体）を採用することか提案されている 。前者の場合、ＨＩＶ感染Ｔ細胞かその細胞表面上にレトロウィルスｅｎｖ決定 基を示す傾向を有することの観察から、抗−ＨＩＶ活性が予測される。しかして 、かかる免疫毒素が、抗−ｅｎｖ　ＩＪガントによってＨＩＶ感染細胞を特異的 に認識するであろうことが提案されている。対照的に、抗−ＣＤ４−トキシン構 造物は、トキシンを全てのＣＤ４”細胞に分配し、しかしてｅｎｖ　−トキシン 接合体のように感染の対象となる細胞を殺すであろうことか想像される。前述の 免疫毒の方法は、ＡＩＤＳ治療においである種の期待を支持しているか、それら の有効性は臨床的に証明されなければならない。

かくしてＨＩＶ感染の治療について多くの方法が試みられ、あるいは記述されて きたが、この疾患の生命をおびやかす面に向けて特に期待をよせられる治療はま だない。従って、この疾患に向けられ、その広がりを止める基礎を提供する医科 学を改善するであろう抗−ＨＩＶ治療および臨床様式の新規で改良されたものの 劇的な必要性は続いている。

本発明は、該疾患の初期においてウィルス性蛋白質を産生ずる細胞を除去するこ とによりＡＩＤＳの攻撃を阻止あるいは遅延させるであろう方法を提供すること により、先行技術の１種以上の欠陥に向けたものである。ここに開示される方法 論は、この疾患の病原性において寄与するであろうウィルス性蛋白質の放出なら びに感染の拡大を阻止するであろうことか提案される。

本発明は、一般的な意味においてレトロウィルスｅｎｖ決定因子に対して結合親 和性を有するＣＤ４−５！Ｉ連リガンドを提供し、ここにおいて該結合性リガン トはトキシンＡＭまたはその機能的同等物等のトキシン分子に接合される。本発 明のレトロウィルスｅｎｖ結合性リガンドは、“ＣＤ４ｇｐ１２０結合性リガン ド“と称される。本発明の目的において、　“ＣＤ４　ｇｐ１２０結合性リガン ドは、ｇｐｌ　２０ｅｎｖ糖蛋白質に結合可能なＣＤ４あるいはＣＤ４誘導また は変異蛋白質もしくはペプチドとして定義される。

ｇｐ１２０と複合体形成し、しかして本発明の目的とする作用をするであろう種 々のＣＤ４蛋白質またはペプチドか知られている。例えば、　“可溶性ＣＤ４” とも称されるＣＤ４蛋白質の細胞外分節は、細胞外物質と相互作用する分子上の 部位であり、ＨＩＶｅｎｖ決定因子と相互作用する細胞外部位はまさにこれであ る。しかして、ＣＤ４の細胞外分節、それらから誘導されるｅｎｖ−結合性領域 およびペプチドは、ｅｎｖ−領域への結合という同じ目的で作用する生物学的に 機能的同等アミノ酸類を組入れたペプチド類等を含めて、本発明の目的のための ’ＣＤ４　ｇｐ１２０結合性リガンド”と考えられる。

本発明の新規構造物は、ＨｒＶに感染した個体等の治療を要する個体に、治療的 量のｇｐ１２０結合性リガンド−トキシン接合体の投与によって採用される。驚 くべきことに、そのような構造物は、ＨＩＶ−感染細胞を選択的に殺すか、その 一方非ＨＴＶ−感染細胞は比較的に元のまま影響を受けずに残されることが発明 者らによって発見された。更に本発明の驚くへき面は、このような免疫毒素を用 いたＨＴＶ−感染細胞の処置によって、細胞か更に感染力を導くような様式では ウィルス粒子を放出しないことの発見に関連する。この点は、ＨＩＶに苦しむ細 胞に対してトキシンの特異的標的とすることか、有利な効果を有するてあろうこ とは、先験的には予測し得ないことであるから、重要なことである。すなわち、 予測されることは、ＨＩＶ−感染細胞の殺生は、単にＨｒＶ粒子を放出し、実質 的に感染力を増強するであろうことである。本発明者らは、それではないことを 発見した。

本発明のある実施態様において、該ＣＤ４　ｇｐ１２０結合性リガンドは、しか して膜内外領域を除く全ての領域を含む天然型ＣＤ４分子等の可溶性ＣＤ４分子 を含んでなる。例えば、組換えＤＮＡ技術により、疎水性の先行および膜内外領 域が除去された天然ＣＤ４の“細胞外”部位である、いわゆる　“可溶性”ＣＤ ４を使用する場合に、特に有利であることが認識される。ＣＤ４変異体を含めて ＣＤ４の組換え調製に関連する特定の技術について、ここに参考として組入れる 文献２３−２５を参照することができる。

更なる実施態様において、全ＣＤ４分子あるいは可能性ＣＤ４変異分子を使用す るより、ｇｐ１２０結合性リガンドとして、ｇｐ１２０結合領域を含むＣＤ４領 域の短いペプチドまたは部位を採用することもてきる。この点に関して、ＣＤ４ の最初の領域かその構造中にｇｐ１２０結合領域を含むことが見出されている。

しかして本発明のためには、ＣＤ４の領域ｌの、少なくともｇｐ１２０結合領域 を構造中に含むペプチドを使用することができる。

領域ｌは、典型的にはＣＤ４のアミノ酸１から１００または１０９までを含むと 考えられ、ここにおいて−２５が先行配列の開始ＭＥＴ残基である（例えば文献 ２３参照）。組換えＤＮＡ技術の応用を、ＣＤ４の領域ｌまたはその誘導体およ び変異体を少なくとも含む適当なＣＤ４ペプチドの調製のために利用することか てきる。

ＣＤ４の最初の２つの領域の使用が、特に有効であると考えられている。

一般に、接合体にクラスＩ］結合活性を与えないｇｐ１２０結合性リガンドを組 込んだ構造物を調製することか望ましい。クラスＩ［部位は、免疫的に相互作用 能力において細胞を区別するクラスｒＩ主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）上に見出 される。従って、細胞結合−ＣＤ４は細胞結合−クラス１１分子に結合し、また ＣＤ４＋細胞がクラス１１“細胞と物理的に相互作用することを許容する。この ことが、ＣＤ４“かクラスＩド単球またはＢ細胞と相互作用することの基礎であ る。可溶性ＣＤ４は、インビトロにおいてクラス１１＋細胞に結合するものとは 思われないにもかかわらず、このことはインビボにおける問題である。インビボ において結合か起こるのてあれば、クラスＴＩ“細胞は殺されるであろう。

ＣＤ４の最初または“ｖｌ”領域内で、種々の領域かｇｐ１２０結合部位として 提案されているが、Ｖ１領域内の正確な位置または複数の位置については議論の 余地がある。報告では、ｇｐ１２０結合部位をＣＤ４のアミノ酸１８−４４　（ ９５）、４１−５７　（９６）、または８ｌ−９２（６８）内の種々の位置に置 いている。これらの部位は、合胞体形成および／またはｇｐ＋２０のＣＤ４への 直接結合のいずれかに関連すると言われている（９７゜９８）。ペプチド８１． −９２に関しては、８４位のＣｙｓおよび８５位のＧｌｕにおいて、ペプチドの 合胞体形成を阻害すべくベンジル化されていることか示されている（６８）。

しかしなから、本発明者らは、ペプチド中に組込まれ、本発明に従ってｇｐ１２ ０結合性リガンドとして使用される場合、これらの領域のうち、４１−５１配列 が特に有利であることを発見した。

従って、本発明の特定の実施態様において、ｇｐ１２０結合性リガンドは、その 配列中にｇｐ１２０に結合可能な比較的短い広がりのアミノ酸配列を含む蛋白質 またはペプチドを含んでなるものとして定義されるであろう。このためにペプチ ド中に組込まれる特に有用な一配列は、ＣＤ４のアミノ酸４１−５２　： Ｇ　１ｙ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｇ　Ｉｙ−Ｐｒｏ−３ｅ ｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−ＡＳｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−ＡＳｐ−３ｅｒ　；ま たは生物学的な機能同等物を含む。

前記のようなアミノ酸配列は、短いペプチドリガンドとして直接的に使用でき、 あるいはより大きいペプチドまたは蛋白質構造中に組込むことかでき、それはな おもペプチド中に結合性領域を含むことによってｇｐ１２０結合部位に結合する 能力を保持する。このような構造物の調製のために、組換えＤＮＡ技術の採用を 選択することかでき、あるいは、別法としてペプチド合成技術により単純にペプ チド性構造物を調製してもよい。

一般に、結合およびトキシン分配のそれぞれの機能を行なう比較的小さい接合体 を調製する方か有利であることが提案されている。そのような比較的短い結合性 リガンドの使用は、１）クラス１１結合部位の不在；２）接合体の低減された抗 原性：３）接合体の組織への良好な侵入；４）天然ＣＤ４に比べてペプチド上の 炭化水素が欠失し、“肝臓−指向性”を阻止するであろうこと；および５）ＣＤ ４遺伝子発現のために感染細胞を使用する必要がなく、低い費用で製造できるこ とを含めて、好ましいことか示され、また潜在的有位性が与えられるものと信じ られている。

比較的短いペプチドが結合性リガンドとして使用される実施態様において、高い 親和性、より良好な空間的配位およびより長い半減期を含めて、ある種の優位性 かペプチドとトキシン鎖間に連結スペーサ領域を組込むことによって実現される であろうことが提案されている。模範的スペーサ領域は、実質的に任意の血清可 溶性、好ましくは自系の蛋白質を含み、特には、ＢＳＡ、Ｈ３Ａ。

ポリ−Ｇｌｙ、ポリーＡｌａ等の蛋白質であり、またビス−イミドエステルまた はＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル等の非蛋白質構造をも含む。

本発明のりガント−トキシン接合体組成物は、典型的にはトキシン分子またはス ペーサ領域にジスルフィド結合を介して接合するｇｐ１２０結合性リガンドを含 んてなる。このことは、抗−細胞的治療に関連して接合体中にレシンＡ鎖を使用 することが要求された場合に、ジスルフィド結合が重要であることが見出された ためである。

機構は完全には明らかにされてはいないが、ジスルフィド結合は、結合性リガン ドによって標的細胞に分配されたレシンＡ＠の膜結合および引続く内在化を許容 するものと思われ、これによってＡ鎖部分を解放してその抗細胞効果を及ぼす。

当然のことながら、このような構造物を抗−細胞的治療に使用する意図がない場 合、例えば単にｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体に対する抗体調製のため、あるいはｒＣ Ｄ４−ｄｇＡを例えば抗−ｄｇＡまたは抗−ＣＤ４抗体について結合アッセイに 使用するためである場合には、ジスルフィド結合は重大なものではないてあろう 。

リシンＡ鎖と結合機能との間の交差結合の配置は、この配置か薬理学的に重要な 役割を演じるものと思われる点で、考慮することが重要であることが提案されて いる。

このことは、　“膜結合”に対するジスルフィド結合の弱み、ならびにその標的 細胞表面への結合時にトキシンを放出する能力を含む変数の複雑な組の関数のよ うなものである。

結合性リガンドとトキシンＡ鎖との間のジスルフィド結合を提供する方法による 接合体の一般的構築は、ここに参考として取入れる文献１０および９０に見られ るように、この分野において知られている。ジスルフィド結合は、各蛋白質のソ ステイン残基間で直接に、例えばエルマン試薬を用いて還元され誘導された蛋白 質においてジスルフィド交換反応の方法によって達成されてもよい。

しかしながら、リガンド中のシスティンは結合のためには手に入り難く、結合性 リガンドとトキシンとの間の直接ジスルフィド結合形成は、一般には好ましくな い。反応性ＳＦ（基を与えるためのシスティンの還元は、リガンドの機能的完全 性を損うであろう。更には、毒素リガンドが“スペーサ”なしに結合される場合 には、リガンドの結合部位は立体的に妨害されることもある。

従って、改善された放出特性および結果としての治療的パラメタを与えるであろ う交差結合基を使用することが一般的に好ましいことが分かるであろう。５ＰＤ Ｐ、５ＡＴＡ、２ＩＴおよびＳＭＰＴ等に例示されるように（１０）　、種々の ジスルフィド基を存した交差結合剤かこの分野で知られている。一般的に言えば 、好適な交差結合剤は、ｌ）リジンのアミノ基に共有結合する能力等を存し：２ ）ジスルフィドまたはその他の所望の放出可能な官能基が組込まれる構造を含ん でいる。交差結合剤の有用な基は、上記の異項二官能性交差結合剤を含む。

安定性、収率および得られた接合体の長いインビボ半減期に関して所望の特性を 有することか見出される特に有用な交差結合剤は、５ＡＴＡ　（Ｎ−スクシンイ ミジル−８−チオアセテート）およびＳＭＲＴ　（Ｎ−スクシンイミジル−オキ シカルボニル−アルファーメチル−アルファー（２−ピリジルジチオ）トルエン ）を含み、それぞれ非妨害および妨害されたジスルフィド結合を有している。Ｓ ＭＰＴが特に好ましい。他のやはり好ましい交差結合剤は５ＰＤＰである。本発 明に従った交差結合接合体のための更なる種々の官能基か、この分野で知られて おり、ここで引用されるものについて置換することができる。

さらにもう一つの態様においては、免疫グロブリン関連もしくは誘導領域、たと えば結合性リガンドまたはトキシンのどちらかのアミノ末端またはカルボキシ末 端にリゲートされた領域からなる１種または２種以上の追加の結合性ペプチド領 域を使用することが望ましいこともある。免疫グロブリン「不変」鎖部を、たと えばＣＤ４−トキシン接合体のｇｐ１２０結合性リガンド部中に組込むと、結合 性タンパク質をトキシン部分との間に「空間ノを与えることが可能になり、これ によって立体的妨害が回避され、さらに長いインビボ半減期が得られる。

免疫グロブリンネ変部ドメインを使用する場合には、Ｈ鎖のＦＣ部またはヒンジ 部からの適当な領域を使用することができる。

本発明のトキシン分子は代表的には、トキシンＡ鎖またはその毒性誘導体を包含 する。本発明の実施において、適当な抗細胞性を有するものと信じられる多くの １Ｊｆｉが当技術で知られている。本発明に係り使用することかできる代表的Ａ 鎖には、リソン、プソイドモナス外毒素、ジフテリア毒素、モデクチンまたはア ブリンのＡ鎖あるいはリポソームー不活性タンパク質、たとえばゲロニン、サポ ニンとして知られている「遊離Ａ鎖」が包含される。

これらの中では、レシンＡ鎖分子か最も好ましく、これはその高い固有の抗細胞 活性およびおだやかな副作用だけを示すというヒトにおける臨床上の結果にもと づいている。

完全ＡＭ分子に加えて、抗細胞作用を発揮するのに必要なＡ鎖の一部を単純に使 用することか望ましいこともある。たとえば、レシンＡＭ分子を、その初めの３ ０個のアミノ酸を分離することによって先端切断することかでき、このようにし ても、本発明に係り使用するのに充分の抗細胞活性を発揮するトキシン分子を得 ることができることか見い出された。このような末端形成は遺伝子工学または、 たとえばナガラーゼ（９１）によるタンパク質分解的分解によって達成される。

このような生成物を、本発明においては「先端切断Ａ鎖」と称する。

本発明のさらに好ましい態様においては、脱グリコジル化Ａ鎖、たとえば脱グリ コジル化しシンＡ鎖（ｄｇＡ　）またはその変異体を使用する。脱グリコジル化 Ａ鎖は、天然産生Ａ鎖分子中に組込まれている炭水化物部分（たとえば、マンノ ース、フコース）を分解させるように処理されているＡｍである。Ａ鎖のオリゴ 糖側鎖上にマンノース／フコースか存在すると、肝臓による迅速なりリアランス が促進され、これらの構造物を認識するレセプターを存する肝臓細網内皮細胞に よって、トキシンまたはＡ鎖の治療効果か減少される。本発明者は、脱グリコジ ル化Ａ鎖の使用によって、接合体の効力の増加および半減期の増長、ならびに肝 臓柔軟細胞による接合体のクリアランスの防止による循環系内の肝臓毒性の減少 の画点において特別の利益を得ることができることを見い出した。

脱グリコジル化しシンＡ鎖は好適であるけれども、その他の非グリコジル化トキ シンＡ鎖またはリポソームー不活性タンパク質も本発明に係り使用できないわけ ではない。いづれの場合にも、脱グリコジル化Ａ鎖の調製および使用はＴｈｏｒ ｐｅ等（５９）およびＦｕｌｔｏｎ等（６０）のような文献に記載されているよ うに、当技術で公知であり、これらの記載を引用してここに組入れる。さらにま た、脱グリコジル化Ａ鎖は現在、Ｉｎ１ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ａｕ５ｔ　ｉｎ、　Ｔｅｘａｓから市販されている。

さらにまた、組換え手段によるレシンＡ鎖の調製は現在、知られており、たとえ ば０°Ｈａｒｅ等（６０）により開示されている。この文献を引用してここに組 入れる。従って、ＣＤ４部分の場合と同様に、現在、インビトロ変異技術を使用 することによって、アミノ酸構造を変えることができる。アミノ酸間の相互反応 力の知見にもとづくアミノ酸配列の変更または修飾の賢明な選択によって、ＡＩ 配列を容易に修飾または変更することができ、改善された毒性、薬理学的性質ま たは放出性を有する変異タンパク質を選択するための手段が提供される。

本発明のさらにもう一つの態様においては、数個のＣＤ４ｇｐ１２０結合性リガ ンドを１個のトキシンＡ鎖部分に接合させることもてきる。たとえばトキシン部 分１個に対して５個程度のｇｐ１２０結合性リガンドを含有するような構造物は 特に治療的に有益であろうことか提案される。たとえば、このような構造物はＨ ＩＶ感染細胞のｅｎｖ標的に対し特に高い結合親和性を有し、これによって、こ れらの感染細胞にトキシンを分配する能力か増強され、これらの細胞を殺生する 。

単独の、または抗体に結合させたレシンＢ鎖はレシン含有免疫毒素の特異的細胞 毒性を極めて強めることか本発明者によって見い出された。Ｂ鎖は天然トキシン の広範囲の細胞結合能力に関与するトキシン複合体の「レクチン」結合性領域で ある。本発明者は、Ｂ鎖が免疫毒性作用を刺激するばかりでなく、またＢ鎖の化 学的熱変性によって（８８）　、細胞結合性機能から、この作用を薬理学的に分 離することかできることを発見した。これによって、Ａ鎖接合体と組合せてトキ シンＢ鎖を使用すると、ＨＩＶ感染細胞に対する特異的細胞毒性に関しても存利 であるものと予想される。

Ｂ鎖は別の結合剤、たとえばＣＤ４）キシン接合体に対して結合親和性を有する 抗体（８７）に接合させた「非変更」状態で使用することができるか、これは一 般に好ましくない。さらに好ましい構造物では、炭水化物結合に関与する領域が 分離されるように変更した「変更Ｊ　Ｂｆａを使用する。一般に、これには、た とえばクローン化したレシンＢ鎖（８９）に遺伝子工学技術を使用することによ って、少なくともアミノ酸残基Ａ　ｓｍ　−２５５（および多分、Ｔｙｒ−２４ ８および（または）Ａｓｐ−２３４）を含む変更を包含する。

従って、本発明の成る態様においては、トキシンまたは結合性リガンド分節に付 着させた形で、変更Ｂ鎖をＣＤ　４　ｅｎｖ結合性リガンド−トキシン接合体に 、あるいは第一の接合体に対して特異性を有する別の結合性リガンドに、追加の 接合体の形態で配置して使用することが望ましい。

さらにもう一つの態様において、本発明はりガント−トキシン接合体の改良され た調整方法に関する。特に有用な方法は、先ず選択されたリンカ−により誘導体 化されたｇｐ１２０結合性リガンドを調整し、次いでこの誘導体化結合性リガン ドを還元された形態の選ばれたトキシンＡ鎖とともにインキュベートすることを 包含する。当然のこととして、リンカ−は還元されたトキシン部分と共有結合す ることができるか、またはその逆であることがてき、しかも細胞内で活性トキシ ンを放出することかできるようにする誘導体化に係り選択される。

本発明者達は、通常７２時間のインキュベーションによって調整される免疫毒素 の調整に通常、すすめられる時間よりも短い時間にわたり、この混合物をインキ ュベートすることによって、改良された調整が達成されることを見い出した。一 方、本発明のトキシン接合体の場合には、諸反応体を７２時間より短い付着条件 にさらすことか好ましいことか見い出された。これらの条件の下で、生成した接 合体混合物は驚くへきことに、諸反応体がさらに長時間にわたり付着条件にさら された組成物に比較して、集合物質を含有していないことか見い出された。

さらにまた、本発明のこの好適技法は、特に大規模調整に適用することができ、 一般にほとんと集合していない接合体を高収率で、改善された無菌性で、あるい はさらに少なくさえあるエンドトキシン含有量をもって提供することを可能にす る。

本明細書で使用するものとして、「大規模」の用語は、該当デザインが総生成物 の約１ｇ以上、多くの場合に、２〜５ｇ程度またはそれ以上の量で調製される反 応混合物を意味する。これに対して、「小規模Ｊの用語は約０．１ｇまでの程度 の調製を意味する。

誘導体化ｇｐ１２０結合性リガンドをトキシン部分に共有結合させるために最も 好ましい条件は、約１２〜約７２時間、結合条件の下にインキュベートすること を包含し、多くの場合に、約１８〜３６時間が特に有用であり、そしてまた多く の場合に、約２４時間か最適である。

当然のこととして、特に大規模調製に、好適な結合性リガンドは、代表的に、Ｃ Ｄ４またはその活性付属部分てあり、そして好適リンカ−は代表的には、ＳＭＰ Ｔ、５ＡＴＡまたは５ＰＤＰである。

従って、本発明の重要な態様は、ＣＤ４ｇｐ１２０結合性リガンド−トキシン接 合体を治療有効量で配合した医薬組成物の調製にある。当然のこととして、医薬 組成物の調製においては、非接合物質を実質的に含有しておらず、さらにまたい づれの望ましくない夾雑物も含有していない接合体を使用することが望ましい。

従って、本発明によって調製された接合体を精製技術の使用によって精製する必 要性が一般に見い出される。接合体を非常に高度に単離、精製するために、本発 明者によって見い出された技術を以下に示す。

すなわち、成る態様において、本発明は、ｇｐ１２０リガンド−トキシン接合体 のような接合体を包含する免疫接合体の精製技術に関する。本発明に係る接合体 の精製に有用であることが見い出された特定の技術には、Ｂｌｕｅ−（または） 　Ｒｅｄ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　、組換えｇｐ１２０に接合さセｆ：　５ｅｐｈ ａｒｏｓｅを使用するアフィニティクロマトグラフィ技術、５ｅｐｈａｃｒｙｌ における分子排除クロマトグラフィまたはＨＰＬＣによるゲル透過が含まれる。

ｒＣＤ４−ｄｇＡに係り最良の結果は、Ｂｌｕｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅとＨＰＬ Ｃりａマドグラフィとの組合せによって得られる。

本発明の接合体を含有する医薬組成物は、代表的には、精製接合体を医薬的に許 容される、非経口投与用の稀釈剤または賦形剤と組合せることによって調製され る。種種の適当な担体ベヒクルおよびそれらの処方は、たとえば文献６３に記載 されており、この文献をここに引用して組入れる。適当な担体には、安定剤、た とえば緩衝剤および他のタンパク質およびｐＨ安定剤、塩類なとを含有する無菌 水溶液が包含される。代表的に、所望の接合体の無菌水性組成物は、好ましい量 の投与かできるように、約０．５〜約１．０ｍｇ／ｍｌの投与量濃度を有する。

成る態様において、投与しようとする接合体の適当な投与量は、特定の患者に幾 分依存する。免疫毒素の投与に係る当業者にとって、血管漏出症候群（ＶＬＳ） 、筋肉痛、疲労感および（または）発熱などの問題になる副作用の発現に依存し て、接合体を２００〜４００ｍｇの程度で投与することか望ましいことは明白で あろう。その他の考慮点としては、接合体を２〜７回の分割投与として投与する ことが含まれる。

さらにもう一つの提案として、クロロキンを単独で、または本発明の接合体とと もに投与することによって追加の効果を実現することかてきることかある。クロ ロキンは単独で、ＨＶＩ感染細胞に対して有意の抗細胞活性を示すことが本発明 者達によって見い出された。さらにまた、クロロキンは本発明のトキシン接合体 と協力して、それらの抗）［ＩＶ活性を改善する作用をする。両方の場合に、こ のような処置か必要な患者に対するクロロキンの投与量は、クロロキンの他の適 応症、たとえばマラリアの処置に対して通常投与される量と同様である。一般に 、約３　ｍｇ／　ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの投与量でｉｏ日間、さらに特に約８ 　ｍｇ／　ｋｇ　〜１０　ｍｇ／　ｋｇの投与量て１０日間、投与することか望 ましく、約１０ｍｇ／ｋｇが一般に、好適投与量である。

成る環境の下では、本発明に係る接合体のようなトキシン接合体を含有する治療 組成物の投与から、問題になる反応または毒性が発現することがある。発現可能 な副作用は、僅かな発熱から筋肉痛まで、およびまたＶＬＳが起る可能性まであ る。これらの副作用の多くは、処置を受ける個人の免疫システムの応答にまた関 与する。本発明者達は、このような症状の幾分の軽減は免疫応答を弱める１種ま たは２種以上の薬物の使用によって実現できるものと予想している。このような 薬物には、リンホカインまたはサイトキニン産生を含む、可能なＴ細胞応答なら びにいづれの付属ＮＫ細胞でもアドレスする薬剤が含まれる。

従って、成る態様においては、副作用に関与しうるいづれの可能なり細胞部分さ えも抑圧するために、高投与量のステロイド類またはシクロスポリンＡなどの薬 剤を投与することか望ましい°。さらにまた、いづれの可能なＴ細胞応答をも抑 圧するために、抗リンホカイン抗体を投与することが望ましいこともあり、この ような薬剤には、抗ＩＬ２　（抗インターロイキンｍ、ＡＬＳまたは抗ＣＤ３、 ＣＤ５またはＣＤ７さえもか含まれる。さらに、リンホカイン　レセプターに対 する抗体、たとえばアルファーＩＬ２ＲまたはアルファーＩ　Ｌ　４　Ｒ，ある いはまたＴ細胞それら自体に対する抗体、たとえば抗−ＣＤ４　（この抗体は使 用されるトキシン接合体中に見い出されないエピトープに対するものでなければ ならない）　、ＣＡｍ　ＰＡＴＨ−１あるいは抗ＣＤ３．５．７などを投与する ことによって、いくらかの効果を得ることができる。

本明細書に添付されている図面を以下に簡単に説明する： Ｆｉｇｌ、ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ接合体の精製ａ）　Ｂｌｕｅ　５ｅｐｈａｒｏ ｓｅ　ＣＬ−４８（ＳＭＰＴ−誘導接合体） １）ｒ　ＣＤ　４　；　２）ｄｇＡｚ　：　３）ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ　；４） ｄｇＡ＋ ｂ）　５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００ＨＲ（ＳＡＴＡ−誘導接合体） Ｉ）集合ｒＣＤ４−ｄｇＡ　；２）ｒＣＤ４−ｄｇＡ　（分子量８０　ＫＤａ） 　；　３）ｄｇＡ ｃ）　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ｒｇｐ’　１２０　（ＳＭＰＴ−誘導接合体）■） 未結合（ｄｇＡ）　；２）結合し、ｐＨ３，０で溶出されたもの（ｒ　ＣＤ　４ −ｄｇＡ） ｄ）ＴＳＫ　３０００ＳＷ（ＳＭＰＴ−由来接合体）１）集合ｒ　ＣＤ　４−ｄ ｇＡ　；　２）ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ　−（分子量８２Ｋｄａ）　：　３）ｒ　 ＣＤ　４　；　４）ｄｇＡＦｉｇ２．ｒ　ＣＤ４−ｄｇＡおよびそのタンパク質 成分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ ａ）分子量標準；ｂ）ＳＭＰＴ（または５ＡＴＡ）を用いてｄｇＡまたはｄｇＡ ＋から調製されたｒＣＤ４−ｄｇＡ；ｃ）５％２−メルカプトエタノールにより 還元されたｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ　；ｄ）ＳＭＰＴ　（または５ＡＴＡ）により 誘導体化されたｒＣＤ４；細胞に対して毒性である；Ａ）ＨＩＶ−１に慢性的に 感染しているヒトＴ細胞ラインＨ９（４回の実験のうちの代表的１回）；Ｂ）未 感染Ｈ９細胞（４回の実験のうちの代表的１回）。

ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ　（−０−）　、Ｆａｂ’　−ＭＯＰＣ−２１−ｄｇＡ（ −〇−’）（７６）およびｒＣＤ４−（△）を９６ウエルの微量滴定プレート中 の完全培地（ＲＰＭＩ、１２％牛脂児血清（Ｆｅ２）および抗生物質）に三重形 式で板状接種した。細胞は４ＸＩＯ’細胞／ｍｌの最終濃度で加え、これらのプ レートを３７℃で１６時間インキュベートした（５％ＣＯ２＞。これらの細胞を 、〔３Ｈ〕チミジン１ｕＣｉで６時間パルス標識し、Ｔｉｔｒｅｔｅｋ自動収穫 機上で収穫した。〔３Ｈ〕チミジン取り込みは、ＬＫＢベータカウンターで測定 した。結果は対照（未処置細胞）のパーセンテージとして表わされている。

Ｆｊｇ４．　ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡによるＨＩＶ感染Ｈ９細胞の殺生は、ｒＣＤ ４のｇ１２０結合部位（Ｌｅｕ−３ａ）に対する過剰のｒＣＤ４、ｒｇｐ１２０ （７８）またはＭＡｂｓによってブロックされるが、ＣＤ４上のもう一つのエピ トープ（ＭＡｂ　４５６）はブロックされない（７９）、ｒＣＤ４−ｄｇＡは４ Ｘ１０−”Ｍの最終濃度で使用した。ＨＩＶ感染Ｈ９細胞を含有する微量滴定プ レートはインキュベートした。（”Ｈ）チミジンを加え、これらの細胞をＦｉｇ ３に記載されているように収穫した。

結果は未処置細胞における〔３Ｈ〕チミジン取り込みのパーセンテージで表わさ れている。棒線は４回の実験の平均を表わす。実験中のＳＤは２０％であった。

ａ）細胞をｒＣＤ４−ｄｇＡて処置した；３７°Ｃで１時間、 ｌ）培地 ２）　ＢＡＳ、２５．ｃｚｇ／ｍｌ；および０．　ｌ　２５．２，５および２５ μｇ／ｍｌの（３〜５）　ｒｇｐ　１２０とともにインキュベートした。

ｂ）細胞はｒＣＤ４−ｄｇＡで処置した１３７°Ｃて１時間、 １）培地 ２）ＭＡｂ４５６．２５μｇ／ｍｌ とともにインキュベートした：および Ｃ）細胞はｒＣＤ４または対照とともに、３７℃で１時間、インキュベートした 。次いで、ｒＣＤ４−ｄｇＡを４ｘｌＯ−”Ｍの最終濃度で加えた。細胞はＦｉ ｇ３に記載のとおりに、インキュベートし、パルス標識し、次いて収穫した。ｒ ＣＤ４−ｄｇＡ処置細胞は初めに、１）培地。

２）ＢＳＡ、２５μｇ／ｍｌ；および０．　ｌ　２５．２．５および２５μｇ／ ｍｌの各（３〜５）ｒＣＤ４、とともに培養した。

Ｆｉｇ５．このｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体はクラスＩＩ”Ｄａｕｄｉ細胞を殺生し ない。クラスＩＩ−ｄｇＡ　（７９）に対するｒＣＤ４−ｄｇＡ（・）またはＭ Ａｂ　Ｃｏ）を９６ウエルの微量滴定プレート中で滴定した。Ｄａｕｄｉ細胞は ４ＸＩＯ’／ｍｌの最終濃度まで加えた。プレートは３７°Ｃで１６時間、イン キュベートした。細胞を遠心分離し、ロイシンを含有していない培地中に再懸濁 し、〔３Ｈ〕ロイシンによりパルス標識しく５ｕＣｉ／ウエル）、次いでＦｉｇ ２に記載されているように収穫した。３回行なわれた実験のうちの代表的１回の 実験が示されている。

Ｆｉｇ６．　ｒ　ＣＤ　４／ｒｇｐ　１２０競合結合検定。

蛍光シグナルの抑制パーセントを１００％（１−〔試料−バックグラウンド）／ 総シグナルーバックグラウンド）〕として計算した。競合体はｒ　ＣＤ　４　＝ ＳＡＴＡ　−ｄｇＡ　（■）　、ｒ　ＣＤ　４−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ　（ロ）およ びｒ　ＣＤ　４　：抑嘆（○）であった。各接合体の結合性はそのｒＣＤ４含有 量にもとづいていた。棒線はｒＣＤ４曲線に対するＳ、　Ｄ　を示す。

Ｆｉｇ７゜３種のｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体およびＯＶＡ−ｄｇＡ　（対照）のＨ ＩＶ感染Ｈ９細胞に対する毒性。

（○）ｒＣＤ４−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ　；（・）ｒＣＤ４−ＳＡＴＡ−ｄｇＡ；　 （△）ｒＣＤ４−３ＭＣＣ−ｄｇＡ；（Ａ）ＯＶＡ−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ、５回（ ＳＭＰＴ）および８回（ＳＡＴＡ）の実験のうちの代表的１回の実験に係りグラ フを作成した。

Ｆｉｇ８゜マウスにおけるｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体およびそれらのタンパク質成 分の消失曲線。この結果は３回行なった実験のうちの１回からのものである。

−△−：　ｒ　ＣＤ　４−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ；−口一二ｒＣＤ４−３ＡＴＡ−ｄ ｇＡ；　−〇−：ｒＣＤ４−３ＭＣＣ−ｄｇＡ接合体ニー・−：　ｄｇＡ　、− ム−：ｒＣＤ４゜ Ｆｉｇ９゜ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の調製。Ｒ＝ピリジル；Ｘ＝オキシカルボニ ル−α−メチル−トルエン（ジスルフィド結合を保護）。

ＦｉｇｌＯ０ｒＣＤ４−ＭＰＴとｄｇＡ　−Ｓ　Ｈとの反応によるｒＣＤ４−ｄ ｇＡ形成の運動学的様相。（・）ｒＣＤ４−ｄｇＡ　（８０ＫＤａ　）　；　（ ○）ｒＣＤ４−ｄｇＡ（集合したもの）。

Ｆｉｇｌｌ。ｒＣＤ４−ｄｇＡの精製。Ａ、　Ｂｌｕｅ−３ｅｐｈａ−ｒｏｓｅ 　ＣＬ−４８（ｒｃＤ４＝３５％；ｒＣＤ４−ｄｇＡ　＋ｄｇＡ　＝　６５％） 　；　Ｂ、　５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ−２００ＨＲ（集合したｒ　ＣＤ　４−ｄ ｇＡ＝　１０％；　ｒＣＤ４−ｄｇＡ＝４２％；ｄｇＡ＝４８％）。

Ｆｉｇ１２゜ｒＣＤ４−ｄｇＡおよびその成分の５ＤＳ−ＰＡＧＥ、１）ｒＣＤ ４　；　２）ｄｇＡ；　３）精製ｒＣＤ４−ｄｇＡ；４）遊離のｄｇＡを含有す るｒＣＤ４−ＭＰＴ＋ｄｇＡ−ＳＨ（３０ＫＤａ　）　と遊離ｒＣＤ４　（４５ ＫＤａ）とｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体（７５ＫＤａおよび９７　ＫＤａ　）と集合 したｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体（１２０〜１５０ＫＤａ）との混合物。

Ｆｉｇ１３は、Ｖ［ドメインを含有するＣＤ４の初めの１００個のアミノ酸の一 次構造を示す。アミノ酸７８−９４はＪａｍｅｓｏｎ等により同定されており（ ９５）、４１−５５はＡｎｔｒｏｓ等により同定されており（９６）　、そして ８１−９２はＬｉｆｓｏｎ等により同定されている（６８）。

１６位置および８１位置のシスティン残基間にジスルフィド結合か存在する。ア ミノ酸１−９４はＶｒドメインを表わし、そして９４−１１２はＪ１分節を表わ す。

Ｆｉｇ１４は、ペプチド４ｌ−５７−ＢＳＡ接合体にょるｇｐ１２０−被覆細胞 に対するＨＲＰ−標識ＣＤ４の結合の抑制をグラフで示すものである。ｒＣＤ４ 濃度（μＭ）（Ａ）は（−・−）によって示されており、一方ベブチドー５−Ｓ −ＢＳＡ＃！度（４Ｍペプチド）（Ｂ）は（−〇−）により示されている。

Ｆｉｇ１５は、ＣＤ４−ｄｇＡおよびペプチド（４１−５７）　−３−３−ＢＳ Ａ−３−３−ｄｇＡｉ、−ヨルＨｒＶ　−１感染ヒトＨ９細胞の殺生を示すもの である。ＨＩＶ−Ｈ９に対するペプチド−３−Ｓ−ＢＳＡ−３−３−ｄｇＡの効 果は（０）によって、ｒＣＤ４−ｄｇＡのＨＴＶ−Ｈ９に対する効果は（△）に よって、そしてＨ９に対するペプチド−３−３−ＢＳＡ−３−３−ｄｇＡの効果 は（ム）によって示されている。

Ｆｉｇ１６は、レシンＡ鎖分子の成る部分の一次構造を示すものであり、ヒドロ キシルアミン開裂点（１，４１一本発明は、ｇｐ１２０結合性リガンドとトキシ ンＡ鎖との間の接合体であると広く定義されるＣＤ４−トキシン接合体の調製お よび使用に関するものである。この接合体のＣＤ４部分の調製は、文献２３〜２ ５に記載されているように、当技術において一般に周知である。これらの刊行物 には、ＣＤ４およびＣＤ４変異体の組換え調製法か記載されており、この中には トキシンＡ鎖接合体に係り好適リガンドであると考えられる「可溶性ＪＣＤ４が 含まれている。

種々の種および起源からのトキシンＡ鎖の調製は当技術で一般に周知であり、− 例として、文献６３があげられる。「トキシンＡｔ１ｉＪの用語は、レシン、ジ フテリア、モデクシン、アブリンなどを含む全てのトキシンＡ鎖ならびにこれら のＡ鎖の生物学的な機能同等物を包含するものとする。前述の要旨の記載におい て述べたように、レシンＡＭは一般に、本発明の実施に好適である。さらにまた 、現在達成されているレシンＡ鎖のクローン形成において（６９）　、この分子 を操作し、変異構造および「仕立てられた」生物学的性質を有するトキシンＡ鎖 を提供することもてきる。さらにまた、脱グリコジル化Ａ鎖の使用は、レシンＡ 鎖に比較してこの分子が改善された薬力学的性質を存することから、特に好まし い。

最も好適なｇｐ１２０結合性リガンドは一般に、それらの構造中にＣＤ４−誘導 ｇｐ１２０結合性領域が組入まれでいる小型ペプチドである。好ましくは、使用 されるペプチジル領域は、通常、ＣＤ４によって認識されるクラスＩＩ結合性部 位を認識し、ここに結合する配列を含有していないものである。このことは、多 くのクラス　１１”細胞か一般に、ＨＩＶ感染しないことから、幾分重要である 。すなわち、クラス１１細胞を標的にすることはいづれの場合にも禁忌であり、 ＨＩＶ感染を直接に抑圧するというよりもむしろ、未感染細胞の本体を枯渇させ る傾向かありうる。従って、クラス１１結合活性のないｇｐ１２０結合性リガン ドを使用することか一般に望ましく、トキシン接合体をＨＩＶ−由来ｅｎｖ決定 因子を存する細胞にだけ向けることが望ましい。

従って、本発明の実施においては、ＣＤ４のドメインｌから誘導されるｇｐ１２ ０結合性配列を有するペプチドの使用が一般に望ましい（ドメイン１は、ＣＤ４ アミノ酸配列のアミノ酸のほぼｌ−はぼｌ　ＯＯ／１０９からなり、そのプレド メイン１リーダー配列はアミノ酸−２５−−１からなる、文献２３参照）。

ドメイン１はＣＤ４タンパク質全体の中に含まれていることは勿論のことである 。従って、所望により、本発明の態様の実施において、ＣＤ４タンパク質全体を 使用することかできる。しかしながら、天然のＣＤ４タンパク質を使用すると、 その分子のサイズから一般に望ましくなく、この分子を薬理学的におよびクラス １１標的に対する結合性に係り望ましくないものにし、かつまた治療的に望まし くないものにする。

前記したように、これらの問題を解決できる手段として、「可溶性ＪＣＤ４を使 用する手段がある。この可溶性ＣＤ４は、理由は不明であるが、クラス］Ｉ結合 部位がＣＤ４の第一または第ニドメイン内に、あるいはそれらの接合部位に明ら かに含まれていても、クラス１１標的への結合に失敗する。しかしながら、可溶 性のまたは細胞外のＣＤ４てさえも、はぼ３６８のアミノ酸からなる比較的大型 のリガンドであるので、理想的ではない。

本発明の目的に対して理想的な結合性リガンドは、ｅｎｖ決定因子と複合体を適 当に形成するのに丁度十分のアミノ酸配列を有するリガンドであり、これによっ て、ＨＩＶ感染細胞に対してトキシンが分配される。すなわち、前述の「可溶性 Ｊ　ＣＤ４に対する改良として働くことかてきるリガンドは、ＣＤ４の第一ドメ インに実質的に相当するペプチド（アミノ酸１−１．００／１０９）、あるいは このような配列の生物学的な機能同等物である（Ｆｉｇ１３参照）。−例として 、本発明者達は、ＣＤ４の４個の細胞外ドメイン（９８，９９）、または脱グリ コジル化しシンＡ鎖（ｄｇＡ）に結合させたその初めの２つのドメインのどちら かを含有する免疫接合体がｚｏ−１０〜１０−”ＭのＩＣ，。て、ＨＩＶ感染細 胞を選択的に殺すことができることを見い出した。

しかしながら、可溶性ＣＤ４にまさる、さらに別の利益かＣＤ４のアミノ酸４１ ．−５７（初めのＭＥＴを−２５として測定）によって示されるように、さらに 短いペプチド部分の使用によって得られることが提案される。ＣＤ４のこの部分 のアミノ酸配列は、下記のとおりである： ＧＩｙ−３ｅｒ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ＧＩｙ−Ｐｒｏ−３ｅｒ− Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒこの配列は 、好ましくは結合性リガンドとトキシンとの間に配置されたＢＳＡ、Ｈ３Ａ、Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドエステルなとのスペーサー域と連結させて、ｇｌ） １２０結合性リガンドートキシン接合体に直接に使用できることを本発明者は証 明した。このようなスペーザー域は、かなりの有益な機能を果すことかできるも のと考えられる。少なくとも、スペーサーは比較的多数の結合性リガンドまたは トキシン分子を、１個の接合体中に組込むことを可能にする。他の可能な利点に は、大きい親和性、良好な空間配置あるいは循環系における長い残留時間か含ま れる。いづれの場合にも、血清可溶性タンパク質または非タンパク質巨大分子、 特に同厚タンパク質の使用は本発明に係り有用性か見い出されるものと提案され る。

さらに、ＣＤ４の４１−５７域が直接に使用される場合には、接合の前に、その カルボキシ末端に、追加の短い長さのアミノ酸を付加すると有利であることを本 発明者は見い出した。これらの追加のアミノ酸の使用は、結合性部分とスペーサ ー分子との間の立体障害を防止する役目を果たし、結合性部分のさらに自由な回 転を可能にするものと考えられる。本発明者達は、慣用的に、そのカルボキシ末 端に２個のアミノ酸−Ａｌａ−Ｃｙｓを付加したものを使用した。

このカルボキシ末端としてシスティン残基を使用すると、ジスルフィド結合形成 による直接接合か可能になる。

しかしなから、この域の長さおよび配列特徴は、これかその組合された結合性リ ガンドに対し良好な接近能力を存しているかぎり、特に臨界的ではない。

従って、好適態様においては、ｇｐ４２０結合性リガンドとして、前記のアミノ 酸配列またはその一部分が組込まれており、少なくとも約１２〜約２５のアミノ 酸の長さ、好ましくは約２０のアミノ酸の長さを有するペプチドを使用すると好 ましい。この長さの結合性リガンドは、さらに広い生体分布、減少された代謝に よる破壊、クラス［［結合性部位か存在しないこと、減少された肝臓帰還、すな わち代謝分解の点で特に有利であるものと考えられる。

当然のこととして、ペプチド結合性リガンドが１７のアミノ酸長さを有している 場合には、前記に示した結合性領域から実質的になる配列を有する。しかしなが ら、さらに長いペプチドを考えた場合には、このペプチドは、このペプチジル部 分の固存の結合能力を保有しているような様相で前記配列か組込れていることが 必要であるだけであるものと考えられる。

ＣＤ４配列の考察から誘導される配列または配列部分か組込まれているタンパク 質またはペプチドに加えて、本発明は、このような配列を変え、しかもｇｐ１２ ０結合性の機能を果すペプチドを得ることも包含している。−例として、ＣＤＪ 中に見い出されるｇｐ１２０結合性領域のような相補構造体によって、相互反応 性結合能力を明白に失なうことなく、タンパク質構造中の他のアミノ酸を置き換 えることができることが提案される。本発明者達の仮説によれば、結合能力の明 白な損失をともなうことなく、多分、改善さえされるものとして、ｇｐ１２０結 合性リガンドの配列に種々の変化をなすことかてきる。

タンパク質の相互反応性生物学的機能に関与するアミノ酸のバイトロバシックイ ンデックス（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｎｄｅｘ）の重要性はｋｙｔｅ等によっ て一般的に記載されており（８６）　、この文献によって、成るアミノ酸を、類 似のバイトロバシックインデックスまたはコア（ｃｏｒｅ）を存する別のアミノ 酸と置き換えることができ、それても類似の生物学的活性か保留されることが見 い出されている。

下記の表に示されているように、アミノ酸には、それらの疎水性および電荷特性 にもとづいて、バイトロバシックインデックスが定められている。このアミノ酸 の相対的バイトロバシック特性は生成したタンパク質の二次構造を決定し、次い でこのタンパク質と基質分子との相互反応を定めるものと考えられる。

スレオニン　−０，７ トリプトフアン　−０，９ アスパラギン酸　−３，５ 類似の結合特性を有するペプチドは、交換されたアミノ酸が基本アミノ酸の±２ 単位内、さらに好ましくは±１単位内にある場合に、調製できるものと考えられ る。

従って、たとえば、＋４．５のバイトロバシックインデックスを存するイソロイ シンをバリン（＋４．２）またはロイシン（＋３．８）の代りに置き換えること かでき、このように置き換えても、同様の生物学的活性を有するタンパク質を得 ることができるものと考えられる。別様には、この配列の他の末端において、ア ルギニン（−４，５）の代りに、リジン（−３，９）を使用することなどができ る。

従って、これらのアミノ酸置き換えは一般に、たとえば請求電性、電荷などの点 て、Ｒ−基の置き換えと比較的似ている。一般に、前記特性を考慮した好ましい 置き換えには、下記のものが含まれる：元の残基　置き換え残基の例 Ａｌａ　ｇｌｙ；　ｓｅｒ Ａｒｇ　１ｙｓ Ａｓｎ　ｇｌｎ：　ｈｉｓ Ｇｌｎ　ａｓｎ Ｈｉｓ　ａｓｎ：　ｇＩｎ しＹＳ　ａｒｇ；　ｇｉｎ：　ｇｌｕ Ｍｅｅ　ｌｅｕ；　ｔｙｒ 本発明の目的に係り、ｇｐ１２０結合性リガントにおけるこのような変更もしく は修飾、あるいは接合体のトキシンＡ鎖部分における変更または修飾に関しては 、これらの構造体と生物学的な機能同等物と言うことかできる。

本発明の目的に係り、「生物学的な機能同等物」としては、親の分子と同種の生 物学的機能を有するが、程度が必ずしも同一ではないタンパク質またはペプチド 構造体か考えられる。

前述したように、本発明に係り使用するのに好適なトキシン部分は、炭水化物残 基を除去する処理が施されたトキシンＡ鎖、いわゆる脱グリコジル化Ａ＠である 。本発明者は、脱グリコジル化しソンＡ鎖の使用によって最良の結果を得た。こ の脱グリコジル化Ａ鎖は、Ｉｎ１ａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ａｕ５ｔ ｉｎ、　Ｔｘから、現在市販されている。

しかしながら、上記したように、薬理学的観点からは、適度の生物学的応答を有 するかぎり、できるだけ小さいペプチドを使用することか一般に望ましい。従っ て、適度の抗細胞応答を存する小型のＡ鎖ペプチドを使用することか望ましい。

この目的には、Ｎａｇａｒａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）によって、３ＯＮ−末端アミノ 酸を除去することにより、先端切断されているが、適度のトキシン活性を依然と して有するレシンＡ鎖か見い出されている。所望により、この先端切断Ａ鎖は本 発明に係る接合体に使用することができるものと考えられる。

別法として、構造物のｇｐ１２０結合性リガンド部分の場合と同様に、トキシン Ａ鎖部分に組換えＤＮＡ技術を適用することによって、本発明に係る追加の有意 の効果か提供される。

現在、レシンＡ鎖のクローン形成はＯ’Ｈａｒａ等の文献（６９）によって可能 にされており、過度のトキシン活性を依然として示す、小さいまたはその他の様 相の変異ペプチドの同定および調製か可能にされている。さらにまた、現在、レ シンＡＭがクローン化されているということは、特定部位変異の適用を可能にし 、これによって、たとえば上述した［生物学的な機能同等物Ｊにもとづいて、Ａ Ｍ誘導ペプチドを容易に調製でき、かつまた分別でき、かくして本発明に係り使 用できる追加の存用な部分を得ることかできる。

本発明の接合体のトキシンＡ鎖領域を結合性リガンド部分と交差結合させること は、本発明の重要な点である。

要旨の記載で述べたように、生物学的活性を有する接合体が望まれる場合には、 所望の機能を果す交差結合剤か必要であると考えられる。この理由は不明である が、結合性リガンドは一度、標的細胞にトキシンを分配したならば、このトキシ ン部分が結合性リガンドから容易に分離される必要かあるという理由がある。交 差結合剤のタイプおよび交差結合がどのように行なわれたかは、生成した接合体 の薬力学的性質を変える傾向がある。最終的に、目標の作用部位以外の身体の全 ての部分に見い出される条件の下では一体性を保持し、目標の作用部位では、良 好な放出特性を有する接合体が望ましい。従って、特に、使用される交差結合剤 および交差結合される構造を含む特定の交差結合反応は、幾分、重要である。

交差結合剤は、２種の異なるタンパク質（たとえばトキシンと結合性リガンド） の官能性基を一緒に結びつけるようにデザインされた分子架橋である。段階的様 式で２種の異なるタンパク質を結合させるためには、望ましくないホモポリマー の形成を排除する異項二官能性交差結合剤を使用することかできる。代表的な異 項二官能性交差結合剤は２種の反応性基を含存している；一つは一級アミノ基と 反応しくたとえば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）そして他の一〇はチオール 基と反応する（たとえばピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲン等）。こ の交差結合剤は、その−級アミン反応性基によって、タンパク質の一方（たとえ ば、ｒＣＤ４）のりジン残基（一つまたは二つ以上）と反応することができ、こ の第一のタンパク質とすてに結合している交差結合剤はもう一種のタンパク質（ たとえば、ｄｇＡ）のシスティン残基（遊離スルフヒドリル基）と反応する。い づれの交差結合剤でも、これらの２種の反応性基の間に存在するスペーサーアー ムは種々の長さおよび化学組成を有することができる。

このスペーサーアームか長いと、接合体成分の柔軟性を良好なものにすることが でき、他方、架橋部分における成分が幾分変っていると（たとえば、ベンゼン基 ）、反応性基に対する格別の安定性または種々の作用に対する、この化学的安定 性の増加をうることができる（たとえば、還元剤に対するジスルフィド結合の耐 性）。

最も好適な交差結合剤はＳＭＰＴであり、これは隣接するベンゼン環とメチル基 とによって、「立体的に妨害されている」ジスルフィド結合を含む二官能性交差 結合剤である。このジスルフィド結合の立体的妨害は、組織および血液中に存在 しうるグルタチオンのようなチオレートアニオンによる攻撃から、結合を防護す る機能を果たし、これによって、接合体が結合性リガンドによって作用部位に供 給される前に、接合体が膜結合するのを防ぐ助けとなる。多くの他の公知りガン トと同様に、ＳＭＰＴリガンドはシスティンのＳＨまたは一般アミン（たとえば 、リジンのニブシロンアミノ基）なとの官能性基を交差結合させる能力を有する 。もう一種の使用てきる交差結合剤には、開裂性ジスルフィド結合を有する異項 二官能性光活性フェニルアジド類、たとえばスルホスクシンイミジル−Ｚ−（ｐ −アジドサリシルアミド）エチル−１，３′−ジチオプロピオネートか含まれる 。

このＮ−ヒドロキシスクシンイミジルは一般アミノ基に対しては作用せず（アミ ドとして）、そしてフェニルアジドは（光分解すると）、アミノ酸残基のいづれ とも非選択的に反応する。

［妨害Ｊ交差結合剤は、本発明の実施において一般に好適であるか、非妨害結合 剤もまた、本発明の実施に使用でき、宥和であることもある。その他の保護され ているジスルフィドを含有しているとは考えられない、有用な交差結合剤には、 ５ＡＴＡ、５ＰＤＰおよび２−イミノチオラン（１０）か含まれる。このような 交差結合剤の使用は当業者に充分に理解されている。

当然のこととして、その生物学的活性に係り、接合体の使用が望ましくない場合 には、ジスルフィド官能基を含む交差結合剤の使用は必須ではない。代表的交差 結合剤には、以下で詳述するＳＭＣＣ交差結合剤か含まれる。

ジスルフィド結合を含有していないその他の多くの交差結合剤か知られており、 本発明にしたがい使用することかできる。このような使用は、たとえば接合体に 対する抗体を作ることが望まれる場合、および接合体の「免疫原性Ｊか完全に残 されていて、抗体の生成に使用される動物のワクチン生成を確実なものにするこ とが望まれる場合か予想される。このようなＣＤ４−トキシン接合体抗体は種々 の場合、たとえば接合体で処置しようとする患者からの臨床試料などの選ばれた 試料中の接合体の存在および（または）接合体レベルの測定のためのスクリーニ ングか望まれる場合、に有用である。抗体の調製には、多（の方法が知られてお り、これらの方法はいづれも、本発明に係る抗接合体抗体の調製に適するものと 考えられる。従って、本発明者はまた、本発明にしたがって生成される接合体か 治療目的以外の目的に対しても、その有用性が見い出されるものと見做している 。

接合された後に、この接合体を精製し、未接合Ａ鎖または結合性リガンドなどの 夾雑物を除去することは重要なことである。未接合Ａ鎖の分離は重要であり、こ れは毒性の増大の可能性かあるためである。さらにまた、接合した部分と未接合 の部分との間の結合部位に対する競合の可能性を回避するために、未接合結合性 リガンドを除去することも重要である。いづれの場合にも、多くの精製技術が以 下の例に記載されており、これらの方法はそれらを臨床的に有用なものとするの に充分の純度の接合体を提供する方法であることか見い出された。一般に、最も 好適な技術は、Ｂｌｕｅ−３ｅｐｈａｒｏｓｅの使用とゲル濾過またはゲル透過 工程との組合せである。Ｂｌｕｅ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅはＣ１ｂａｃｒｏｎ　Ｂ ｌｕｅ　３ＧＡとアガロースとからなるカラムｖ　ｌ−リックスであり、これは 免疫接合体の精製に有用であることが見い出されている（　７１　）　。Ｂｌｕ ｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用すると、Ａ鎖結合によるイオン交換の性質か組合 され、未接合結合からの接合結合の分離が良好に行なわれる。

Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、遊離の（接合されていない）結合性リガンド （たとえばｒＣＤ４）を接合体調製物がら排除することができる。遊離の（未接 合）トキシン（たとえば、ｄｇＡ）を排除するためには、慣用のゲル濾過法また は高速液体クロマトグラフィを使用する分子排除クロマトグラフィが好ましい。

充分に精製された接合体を調製した後に、これを非経口投与できる医薬組成物の 形態に調製することが望ましい。これは、最後の精製に、適当な医薬組成物用の 媒質を使用することによって達成される。

本発明に係る適当な医薬組成物は一般に、所望の接合体約ｌＯ〜約１００ｍｇを 許容される調剤用稀釈剤または賦形剤、たとえば無菌水溶液と混合し、接合体の 最終濃度を約１〜約２ｍｇ／ｍｌにしたものからなる。このような組成物は典型 的には、緩衝剤、たとえばリン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）　、あるいは追加の 添加剤、たとえば調剤用賦形剤、ＢＳＡまたはＨＳＡなどの安定剤、あるいは塩 化ナトリウムなどの塩類を含有する。非経口投与のためには一般に、それらの無 菌性、無免疫原性および無発熱性を確実にすることによって、これらの医薬組成 物を、さらに医薬として許容されるものにすることか望ましい。このような方法 は一般に、文献７０に例示されているように、当技術で周知である。エンドトキ シン夾雑は、安全レベル、たとえばｏ、　５　ｎｇ／　ｍｇタンパク質以下に維 持されるべきである。さらにまた、ヒトに投与するためには、ＥＤＡ　０ｆｆｉ ｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ標準によって要求される純度標準、−膜安定性 、発熱性および無菌性に適合しなければならない。

ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の好ましい非経口用組成は、ｐＨ６〜７の０．１４５Ｍ 塩化ナトリウム溶液中の１〜２ｍｇ接合体／ｍｌである。この組成物は一１０″ Ｃ〜−７０°Ｃで少なくとも一年間、保存することができる。

法例は、本発明の実施に係る好ましい態様、たとえば乞 方法、試薬などＷ説明するものであるばかりではなく、また本発明の一つまたは 二つ以上の態様の驚くべき、あるいはその他の予想外の効果を証明するものであ る。下記の研究は、各態様の実施に精通している本発明者によって見い出された 技術、検定法、試薬などを用いて行なわれたことが認識されるべきである。しか しながら、これらの研究は例示するだけのものであり、多くの修正および変更は 、これらの例および本明細書の記載から当業者にとって明白である。

ヒト組換えＣＤ４　（ｒＣＤ４）および脱グリコジル化リジンＡＭ（ｄｇＡ、） の接合体を、３種の異なる交差−リンカ（ＳＡＴＡＳＮ−スクシンイミジル−８ −チオアセテート；　ＳＭＣＣ，Ｎ−スクシンイミジル＝（４−カルボキシ−シ クロへキシル−メチル）−マレイミド：およびＳＭＰＴ、Ｎ−スクシンイミジル −オキシカルボニル−アルファーメチル−アルファー（２−ピリジルジチオ（ト ルエン））〕を使用して調製した。交差リンカのうちの２種（すなわちＳＭＰＴ および５ＡＴＡ）を用いて調製した接合体は、ｒＣＤ４とｄｇＡとの間にジスル フィド結合（各々、妨害対非妨害的）を含んでいた。第３のＳＭＣＣは、チオエ ーテル結合を含んでいた。

］、Ｍ換えＣＤ４　（ｒＣＤ４） 天然蛋白質のアミノ酸１−３６８を含む組換えＣＤ４（ｒＣＤ４）をＳｍ１ｔｈ らにより記述されているようにして調製した（６１；２３−２５も参照）。ｒＣ Ｄ４について用いられた吸光係数（Ａ１％、Ｉ　ｃｍ／　２８０　ｎｍ）および 分子量は、それぞれ１５および４５ｋＤａてあった。

以下に議論するある生物学的研究において使用するために、ｒＣＤ４をＮａ　（ ”［〕（Ａｍｅｒｓｈａｍ、　ＵＫ）により１０ＤＯ−ＧＥＮ試薬（Ｐｉｅｒｃ ｅ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＩＬ）を用いて標識した。比活性は、約１　ｕｃｉ／ ｕｇてあった。下記に議論される他の研究のために、ｒＣＤ４を、ビオチンのＮ −ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　。

ＭＯ）の５０倍モル過剰量を用いてビオチン化した（６２）。

２、　脱グリコリル化すシンＡ鎖（ｄｇＡ）脱グリコジル化リジンＡ、Ｉ（ｄｇ Ａ）は、Ｉｎ１ａｎｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｕｓｔｉｎ　、　ＴＸ）か ら購入し、Ｆｕｌｔｏｎら（６３）により記述されているように調製し、特徴付 けを行なった。ｄｇＡの吸光係数および分子量は、それぞれ７．７および３２ｋ Ｄａであった。ｄｇＡ調製物のいくらかについては、５ｍＭジチオスレイトール （ＤＴＴ）　（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　、　ＭＯ）（最終濃度）を用 いて暗室内で室温にて３０分間還元させた。ＤＴＴを、３ｍＭ　ＮＡ、ＥＤＴＡ を含む０．１Ｍリン酸緩衝溶液、ｐＨ７，５（ＰＢＥ）にて平衡化したセファデ ックスＧ−２５Ｍ上でのゲルろ過により除去した。該還元ｄｇＡを、ジメチルホ ルムアミド（ＤＭＦ）（ＰｉｅｒｃｅＳＲｏｃｋｖｉｌｌｅ、　［Ｌ）に最終濃 度２ｍＭとして溶解したエルマン試薬（５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息 香酸）　（ＤＴＮＢ）　）　（Ｐｉｅｒｃｅ、　ＲｏｃｋｅｖｉＬＩｅ、ＩＬ　 ）を用いて、室温にて３０分間処理を行なった。該エルマン化ｄｇＡを該反応混 合物からＰＢＥ中のセファデックスＧ−２５Ｍでのゲルろ過により分離した。該 エルマン化ｄｇＡを、Ｆｕｌｔｏｎら（６４）に記載されているように１０ＤＯ −ＧＥＮ試薬を用いてＮａ〔１２５Ｊ）により標識し、比活性は、約１　ｕＣｉ ／ｕｇであった。

ｄｇＡは、２種類の異性体、ｄｇＡ＋およびｄｇＡｚからなる（６３）。これら の異性体の分離は、ｏ、ｏｓＭｐｓＥにより平衡化されたｐＨ７，５のブルーセ ファロースＣＬ−４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、 　ＮＪ　）　（２０ｘｏ、　８　ｃｍ）を用いて行なわれた。捕捉されたｄｇＡ ＋十ｄｇＡ２蛋白質を、連続的ＮａＣｌ勾配（０，５Ｍまで）により溶出させた 。ｄｇＡ＋およびｄｇＡ　２の両者は、２つの明確なりロマト的ピークをもって 溶出され、最後のピークか純粋なｄｇＡ＋を含んでいた。

３、Ｎ−スクシンイミジル−８−チオアセテート（ＳＡＴＡ）交差−リンカを用 いたｒＣＤ４−ｄｇＡの調製 ＰＢＥ中にｐＨ７，５，４ｍｇ／ｍｌで溶解されたｒＣＤ４を、１０ｕｌの５Ａ ＴＡ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）（６５）と混合 し、ＤＭＦに４．７ｍｇ／ｍｌで溶解しくモル比５ＡＴＡ／ｒＣＤ４＝２．３） 、該混合物を室温にて３０分間インキュベートした。誘導されたｒＣＤ４を、Ｐ ＢＥにて平衡化したセファデックスＧ−２５Ｍによるゲルろ過にて小分子から分 離した。チオアセチル化ｒＣＤ４を、５０ｍＭヒドロキシルアミン（Ｓｉｇｍａ 、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ　、　ＭＯ）（最終濃度）にてｐＨ７，５で処理して脱アセチル化し 、直にｐＨ７，５のニルマン化ｄｇＡ溶液と、ｄｇＡ／ｒＣＤ４が２となるモル 比をもって混合した。ｄｇＡおよびチオール化ｒＣＤ４溶液の両者の蛋白質濃度 は、２−３ｍｇ／ｍｌの範囲であった。室温にて２時間インキュベートした後、 該混合物を精製した。ある実験においては、２種類の蛋白質の一方か、Ｎａ　（ ＋２’Ｉ）により標識されている。

４、Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−アルファーメチル−アルファー （２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）交差リンカを用いたｒＣＤ４−ｄ ｇＡの調製 ｐＨ７，５のＰＢＥに４ｍｇ／ｍｌにて溶解された１！ＳのｒＣＤ４を（６６） 　、ＤＭＦに１０ｍｇ／ｍｌにて溶解された１０ｕｌのＳＭＰＴ　（モル比Ｓ　 Ｍ　Ｐ　Ｔ　／　ｒ　ＣＤ　４　＝２．９）と混合し、該混合物を室温にて３０ 分間インキュベートした。該誘導ｒＣＤ４を、ＰＢＥにて平衡化したセファデッ クスＧ−２５Ｍ上のゲルろ過により小分子から分離し、ただちに新たに還元した ｄｇＡ　（非＝エルマン化）とｐＨ７，５にてｄｇＡ／　ｒ　ＣＤ　４モル比２ をもって混合した。再反応物の蛋白質濃度は、１−２　ｍｇ／ｍｌの範囲であっ た。０．２２　ｍｕフィルタを通過させて除菌した後、該混合物を精製のために 室温にて４８時間インキュベートした。ある実験においては、２種の蛋白質のう ち一方をＮａ（１！Ｓ［）により標識した。

５、Ｎ−スクシンイミジル−（４−カルポキシーシクロヘキシル−メチル）マレ イミド（ＳＭＣＣ）交差リンカを用いたｒＣＤ４−ｄｇＡの調製 ｐＨ７，０のＰＢＨに２ｍｇ／ｍｌで溶解させたｒＣＤ４　１ｍｌを、ＤＭＦに １０ｍｇ／ｍｌで溶解させたＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ　５Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　 、ｒＬ）　１０ｕｌ　（６７）と混合しくＳＭＣＣ／ｒＣＤ４のモル比＝６．８ ）、該混合物を室温にて６０分間インキュベートした。該誘導ｒＣＤ４をｐＨ６ ，０のＰＢＥで平衡化したセファデックスＧ−２５Ｍ上のゲルろ過により小分子 から分離し、ただちに新たに還元したｄｇＡ　（非−エルマン化）とｐＨ６，０ にてｄｇＡ／ｒＣＤ４モル比２をもって混合した。再反応物の蛋白質濃度は、２ ｍｇ／ｍｌであった。室温にて１時間、および４°Ｃにて１６時間のインキュベ ート後、該混合を精製した。

６、　ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ）とｄｇＡとの接合体の調製および精製 ＯＶＡ（ＳｉｇｍａＳＳｔ、　Ｌｏｕｉｓ　、　ＭＯ）（分子量４３　ｋＤａ） およびｄｇＡを含む対照接合体を、５ＡＴＡまたはＳＭＰＴを用いてｒＣＤ４に ついて記述したと同じ方法にて調製した。該ＯＶＡ−ｄｇＡ混合物をブルーセフ ァロース−ＣＬ−４ＢおよびＣｏｎＡ−セファロース−４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ、　Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）上のクロマトグラフィにより精製 した。該ＣｏｎＡ−セファロース−４Ｂカラム（５Ｘ０．８ｃｍ）は、１ｍＭの ＣａＣｌ１　、ＭｇＣ１ｚおよびＭｎＣＩ　２を含む０．０２Ｍ）リスーＭＣＩ 緩衝液、ｐＨ７，０により平衡化され、該ＯＶＡ、−ｄｇＡ接合体は、トリス− ＨＣｌ緩衝溶液中の０．２５Ｍアルファーメチル−Ｄ−マンノシドにより溶出さ れた。これらの接合体を、インビトロ細胞毒性アッセイを含む種々のアッセイに おいて対照として使用した。

？、ｒＣＤ４／ｄｇＡのモル比 ｒＣＤ４に対するｄｇＡ鎖のモル比は、　＋２″Ｉ−ｄｇＡまたは”Ｊ−ｒＣＤ ４のそれぞれの比放射能、および、次の吸光係数、ｄｇＡについて７．７、ｒＣ Ｄ４について１５、ｒＣＤ４−ｄｇＡについて１２．０により計算した。

粗製接合体の精製のために、３種類の方法を適用した：ａ）ブルーセファロース ／セファクリルＳ−２００ＨＲ：　ｂ）ブルーセファロース／セファロース−ｒ ｇｐ１２０；およびｃ）ＴＳＫ−３０００カラム上てのＨＰＬＣによるゲル透過 。

これらの各方法は、次のとおりに行なった：１、　ブルーセファロースＣＬ−４ Ｂカラムでのクロマトグラフィー ｄｇＡ　２０　ｒｎｇの結合容量を有する１０ｍ１のゲルを入れた２０Ｘ０．８ ｃｍのカラムを、ｒＣＤ４−ｄｇＡの精製に使用した。該カラムを、０．０５Ｍ 　ＰＢＥにて平衡化し、それぞれ５０ｍ１の０．０５Ｍ　ＰＢＥおよび０．５　 Ｍ　ＮａＣ１を容れたファルマシア勾配作製装置を使用して連続的ＮａＣ１勾配 （０，５Ｍまで）により溶出させた。

２、　セファロース−ｒｇｌ＋１２０でのアフィニティークロマトグラフィー 組換え型ウィルスエンベロープ糖蛋白質ｇｐ１２０（ｒｇｐ　１　２　０　）　 （Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ、５ｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎ−ｃｉｓｃｏ、 　ＣＡ）を製造者のプロトコールに従って活性化したＣＨ−セファロース−４８ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　ｐｉｓｃａｔａＷａｙ　。

ＮＪ）に、最終濃度Ｏ１ｓ　ｍｇ　ｒｐｇ　ｌ　２０　／ｍｌ充填ゲルにて結合 させた。該セファロース−ｒｇｐ　１２０は、０．１２５ｍｇｒＣＤ４／ｍｇ　 ｒｇｐｌ　２０を結合した。セファロース−ｒｇｐ　１２０カラム（４ｘ１．８ ｃｍ）に結合したｒＣＤ４およびｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体を、０．１５Ｍ　Ｎａ Ｃｌを含む０．１Ｍグリシン緩衝溶液、ｐＨ３，０にて溶出させた。

３、　ゲル透過高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬ、Ｃ）試料を、分析用７． ５Ｘ６００ｍｍＴＳＫ３０００ＳＷカラム（Ｓｅｐｈａｒｏｇｅｌ、　ＬＫＢ　 、　Ｂｒｏｍｍａ、スウェーデン）または調製用２１．５Ｘ６００ｍｍ　ＴＳＫ 　ｃｓｏｏｏｓｗｃカラム（Ｌｌｌｔｒｏｐａｃ、　ＬＫＢ　、　Ｂｒｏｍｍａ 、スウェーデン）のいずれかに負荷し、分離をｐＨ７，５のＰＢＥにて、流速１ ｍｌ／分（Ｓｐｈｅｒｏｇｅ　ｌ）および３ｍ１／分（Ｕｌｔｒｏｐａｃ）にて 行なった。ピークの保持時間を、既知の分子量を有する標準蛋白質（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ　ＳＰｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）のものと比較した。

４、　セファクリル−３−２００ＨＲでのゲルろ過ゲルろ過を、ＰＢＥで平衡化 した８０Ｘ１．８ｃｍカラム上で行なった。該カラムは、マウスＦ　（ａｂ’　 ）　２（ｌ　Ｏ０ｋＤａ）、ｒ　ＣＤ　４　（４５ｋＤａ）およびｄｇＡ　（３ ２ｋＤａ）によって検量されている。

５、ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ接合体の分子量および組成該接合体を構築するために 用いた交差−リンカに関係なく、最終精製調製物は、約１．０のｒ　ＣＤ　４　 ／ｄｇＡ比（表１の下段参照）ならびにセファクリルＳ−２００ＨＲのゲルろ過 およびＨＰＬＣにて測定される分子量８Ｏ−８２ｋＤａを有していた。しかしな から、非還元条件下での５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、７５ｋＤａおよび９２ ｋＤａの２つの電気泳動バンドが観察された（図２）、ｒＣＤ４またはｄｇＡ部 分のいずれかを（１２Ｊ）により標識したｒＣＤ４−ＳＭＰＴ−ｄｇＡを電気泳 動し、該ゲルのオートラジオグラフを作製することによって、２つの電気泳動バ ンドの各々の中に、ｒＣＤ４およびｄｇＡの存在が確認された。両電気泳動種（ ７５ｋＤａおよび９２　ｋＤａ　）は、どちらの部分が標識されているかに関係 なく標識されていた。両電気泳動種は、両バンド共にセファロース−ｒｇｐ１２ ０に特異的に結合し、かつＩ）Ｈ３，０にて溶出されることから（図１ｃ）、共 に生物学的に活性なｒＣＤ４を含んでいた。

ｒＣＤ４−ｄｇＡの２種類の形態の存在に関する一つの説明は、一方の種が、１ 分子のｄｇＡ／　ｒ　ＣＤ　４分子（７５ｋＤａ）を含み、他方が２分子のｄｇ Ａ／　ｒ　ＣＤ　４分子（１０５ｋＤａ）を含むことである。しかしながら、こ の説明はより遅い電気泳動バンドの分子量の測定値（９２ｋＤａ）と理論値（ｌ 　Ｏ５ｋＤａ）との不一致に基づき、また更に重要なことには、ｒＣＤ４に対す るｄｇＡの比が、両方のバンドにおいて０．９８±０．０２であることから起こ り得ないものと思われる。該蛋白質の二重性の存在の別の可能性ある説明は、一 つの種がｒ　ＣＤ　４−　ｄｇＡ　＋　（遅いバンド）を含み、他方がｒＣＤ４ 　ｄｇＡｚ　（速いバンド）を含むことである。しかしながら、精製されたｄｇ Ａ　＋を用いて調製されたｒ　ＣＤ　４−ＳＭＰＴ−ｄｇＡも同様な電気泳動的 二重性（図３、ランドＢ）を含むという知見からそうでないことが示される。最 も起こり得る説明は、ｒＣＤ４上にｄｇＡと接合し得る２種類の異なる部位があ り、異なる分子形状およびストークス半径を有して５ＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル上を異なる速度で走る２種類の型の接合体形成を導くことである。還元性条 件下において、ＳＭＰＴまたは５ＡＴＡのいずれかを用いて調製されたｒＣＤ４ −ｄｇＡは、ｒＣＤ４およびｄｇＡに対応する２つのバンドを生じた。ＳＭＣＣ −誘導接合体は還元されずに修飾されない電気泳動二重性を維持した。

６、　ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電％のゲル勾配のファル マシアファストシステム（Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ）を使用する５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅにより、還元性および非還元性条件の両者において分析した。該ゲルを、製造 者の指示に基づいて０．１％ファストゲルブルーＲまたは０．４％硝酸銀のいず れかを用いて染色した。電気泳動バンドに存在する放射能の割合は、５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥに続いて、バイオ−ラド（モデル６２０）ビデオデンシトメータを使用し てオートラジオグラフの走査デンシトメトリーにより測定した（６４）。次の蛋 白質を、分子量評価の標準として使用した（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、　Ｐｉｓｃ ａｔａｗａｙ、ＮＪ）　：アル’７フーラクトアルブミン（２４，４ｋＤａ）、 大豆トリプシンインヒビタ（２０，Ｉ　ＫＤａ）、カルボニックアンヒドラーゼ （３０ｋＤａ）、ＯＶＡ　（４３ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６７ｋＤａ） 、およびホスホリラーゼｂ（９４ｋＤａ）。

７、　スルフィドリル基の測定 ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体中の多くの遊離ＳＨ基に加えて、ｒＣＤ４に導入された 多くのＳＨ基を、ＤＴＮＢを用いて測定した（７９）。

８、結果 ブルーセファロース（ｄｇＡを結合する）上の勾配クロマトグラフィーにより、 ｒＣＤ４の主要部はｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体から除去されていた（ｒＣＤ４はブ ルーセファロースに結合しない）（図１）。調製に使用した交差リンカに関係な く、ｒＣＤ４−ｄｇＡは常に第３のピーク中に溶出され、ｄｇＡ　＋およびｄｇ Ａｚに隣接していた（図１、ａ）。分子量の大きいｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体（分 子量約１００　ｋＤａ）は、ブルーセファロースに強固に結合し、従って０．０ ５　Ｍ　ＮａＯＨおよび０．５　Ｍ　ＮａＣ１の混合物によってのみ溶出された 。ブルーセファロースクロマトグラフィーの後にｒＣＤ４−ｄｇＡ調製物に残る 残留ｄｇＡは、セファクリルＳ−２００ＨＲ上のゲルろ過（図１ｂ）またはセフ ァロース−ｒｇｐ　Ｉ　２０上のアフイニテイクロマトグラフィー（図１ｃ）の いずれかにより除去され得る。

クロマトグラフィーの概評（図１ｂ）に示されるように、ゲルろ過は見かけの分 子量８０ｋＤａを有する接合体から高分子量の物質を更に分離し得ることからよ り進んだ精製物を与えた。部分精製（純度８０％）は、セファロゲルＴＳＫ３０ ００ＳＷカラム（図１ｄ）またはウルトラバックＴＳＫ３０００ＳＷＧカラムに よるＨＰＬＣを使用した単一精製工程によって達成できた。ＨＰＬＣ分離をブル ーセファロースクロマトグラフィー後に適用した場合、ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体 は、ＴＳＫ３０００ＳＷカラムかｒＣＤ４−ｄｇＡのｒＣＤ４からの分離を促進 することがらセファクリルＳ−２００ＨＲを使用した場合より良好な純度を有す る。ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の収率および純度を表１に示した。

“　接合体中のｒＣＤ４の量（全蛋白質の６０％）は、ｍ製に用いたｒＣＤ４の 初期量の百分率で表わしである。４回の実験の平均。

ゝ　ブルーセファロースＣＬ−４ＢおよびセファクリルＳ−２００ＨＲ後。銀染 色５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（非還元）のデンシトメトリーにより計算。

’　ｇｌ）１２０ｉ、：対するｒｃＤ４の親和性ハ４．１　＋０．５　ｘｌｏ− ’Ｍ（３回の実験の平均）。

４　３７°Ｃにおける１６時間のインキュベーション後の細胞毒性活性。同じア ッセイに用いた新たに解凍した接合体のＩＣｓ。を１００％とした。３回の実験 の平均。

°　放射標識接合体の注射から４時間後における放出された遊離ｄｇＡ鎖の百分 率。

１　アルファ相は最初の３０分間、ベータ相は続く８時間である。ｄｇＡについ ては、アルファー２０分；ベータ＝２２８分。ｒＣＤ４については、アルフッ２ １０分；ベータ＝Ｉ０５分。

１３回の実験の平均。

ｈ　２回の実験の平均。

Ｉ　ｄｇのＬＤ、、は、３ｏｕｇ／ｇマウスてあった。

」　３回の実験の平均。

１５回の実験の平均。

１　８回の実験の平均。

９、　説明 ３種類の異なるリンカを使用する接合体を構築し、それらの収率、純度、生化学 的構造、インビトロ活性およびインビボの挙動について比較した。該接合体中の ２種類は、５ＡＴＡまたはＳＭＰＴ交差−リンカを使用してｒＣＤ４およびｄｇ Ａ間のジスルフィド結合をもって構築され、第３のものはＳＭＣＣを用いてチオ ヱーテル結合をもって構築された。３種類の交差−リンカは、ｒＣＤ４上のＥ− アミノ基を誘導し、またｄｇＡのシスティンの天然ＳＨを使用する。３種類の接 合体すべてについて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドによって活性基が導入され 、ｒＣＤ４の第一アミノ基および活性ビリジルジスルフィド基のアミド結合か確 立される。

該接合体の生化学的分析が行なわれ、結果はそれらが大きさおよびｒＣＤ４とｄ ｇＡの組成において類似していることを示している。かくして： １）該３種類の接合体は、１分子のｄｇＡに共存的に結合する１分子のｒＣＤ４ を含む。該接合体類は、ゲルろ過およびＨＰＬＣにより測定される見かけの分子 量８゜−８２ｋＤａを存していたが、５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した場合には 、７５および９２ｋＤａの２種類の形態がらなっていた。７５および９２ｋＤａ の種は、それぞれ単一のｒＣＤ４および単一のｄｇＡを含んでいた。異なった量 または梨のｄｇＡ　（ｃｆｇＡ＋および６ｇＡ２）をもった２種類のｒＣＤ４− ｄｇＡ接合体を示す二重性の可能性は、適切な実験により除外された。この不規 則的構造は、誘導されたｒＣＤ４か２種類の異なった分子の母集団を含む場合に 生成するであろう。しかしながら、ｒＣＤ４調製物の不均質性は、等電点フォー カシングを含むいずれの技術によっても示されず、ｒＣＤ４分子上の電荷の分布 において、何ら有意な差異かないことか示唆された。

２）還元および細胞非含有ラビット赤血球溶血物アッセイにおける２種類のジス ルフィド結合接合体の分析によって測定されるように、５ＡＴＡおよびＳＭＰＴ を用いて調製される接合体中のｄｇＡ　鎖は、それらの調製に用いたｄｇＡと同 様に活性を有していた。

３）数種の異なる精製方法を使用し、各接合体の最終収率は約２０％であり、ま た３種類の接合体はすへてｒｇｐ　１２０−結合活性を保持していた。ｒＣＤ４ −ｄｇＡ接合体の精製は、リシンＡ鎖−含存イムノトキシンの精製に先に使用さ れたクロマトグラフィー材料であるブルーセファロース上でのクロマトグラフィ ーを含んでいた（７１）。この基本的技術は、より長いカラムを使用し、またｐ ｉ（７，５におけるブルーセファロースのイオン交換性を利用するために塩勾配 を適用することにより部分的に修飾された。イオン交換およびｃｌｇＡ−結合性 の組合せは、妥当な収率および許容可能な程度の純度をもってｒＣＤ４−ｄｇＡ 接合体の分離を可能とした。

引続くセファクリルＳ−２００ＨＲ上でのゲルろ過またはセファロース−ｒｇｐ 　Ｉ　２０上のアフィニティクロマトグラフィーは、約９０％の純度であり痕跡 量の遊離のｄｇＡおよびｒＣＤ４ならびにある程度の分子量の大きい物質を伴う ｒＣＤ４−ｄｇＡ調製物を生じた。ｒＣＤ４−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ接合体の最高の 純度（〉９５％）は、ブルーセファロースクロマトグラフィーとＴＳＫ　Ｇ３０ ００　ＳＷＧ上のＨＰＬＣとの組合せにより達成された。

例ｒｒ【 ｒＣＤ４−リシンＡ鎖によるＨＩＶ−感染細胞の処置チオール化ｒＣＤ４（Ｎ− スクシンイミジル−８−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）により誘導）（７ ２）を、エルマン試薬により誘導されたｄｇＡ（７４）に対して、例Ｉにおいて 上述したと同様な方法により結合させた。該接合体を、遊離のｄｇＡを除去する ためにセファクリルＳ−２００（ＨＲ）上のゲルろ過により、また遊離のｒＣＤ ４を除去するためにセファロース抗−リシンＡ鎖カラムにて’ａ　ＫＩ　した。

接合体のｄｇＡおよびｒＣＤ４成分の活性を評価した。

ジチオスレイトールによる還元後、接合体から放出されたｄｇＡは、細胞非含有 ラビット赤血球アッセイにおける蛋白質合成阻害能力について天然またはエルマ ン化ｄｇＡと対比できるものであった（７４）。（ＩＣ，。（１２）＝４　Ｘ　 １０−”　Ｍ対２×１０−目Ｍ〕。該ｒＣＤ４−ｄｇＡは、チオール化ｒＣＤ４ に対比できるｇｐ１２０結合活性を、また天然ｒＣＤ４の２５〜５０％を、溶液 または同相結合アッセイにおいて存していた（７５）。

ｒＣＤ４−ｄｇＡを用いたヒトＴ細胞株Ｈ９由来のＨＩＶ感染細胞の処置は、Ｉ 　Ｃｓ。とじて１．５±０．５３Ｘ１０−”　Ｍ　（４回の実験についての平均 ±ＳＤ）をもって９０％以上のＤＮＡ合成を阻害した（図３）。対照的に、遊離 のｒＣＤ４または無関係な同様の大きさの抗体リシンＡ＃Ｉ接合体（Ｆａｂ’　 −ＭＯＰＣ−２１（Ｉ　ｇＧ、−ｄＧＡ））ｉ；！、わずかｌ／１０００（７） 有効性（ＩＣ５Ｇ＞　ｉ　ｏ−７Ｍ）にすぎなかった。ｒＣＤ４−ｄｇＡ、ｒＣ Ｄ４およびＦ　ａ　ｂ’　−ＭＯＰＣ−２１−ｄｇＡのいずれも非感染Ｈ９細胞 を、濃度＞　５　Ｘ　ｌ　Ｏ−”Ｍにおいて殺すことはなかった（ＩＮ３Ｂ）。

従って、ｒＣＤ４−　ｄｇＡの毒性は、特異的であった。

ｒＣＤ４−ｄｇＡの細胞毒性効果は、可溶性ｒｇｐ　１２０（図４Ａ）、ＣＤ４ のｇｐ１２０結合性部位に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）（Ｌｅｕ−３ ａ　（＋　４））または可溶性ｒＣＤ４　（図４Ｃ）によって、濃度依存性をも って効果的に阻止された。対照的に、ウシ血清アルプミ：／　（ＢＳＡ）（図４ ＡおよびＣ）またはｇｐ１２０結合性に関連しない他のＣＤ４エピトープに対す るＭＡｂｓは、ｒＣＤ４−ｄｇＡの細胞毒性を阻害しなかった（図４）。したが って、ＨＩＶ−感染Ｈ９ＩＩＢ胞に対するｒＣＤ４−ｄｇＡの細胞毒性は、接合 体のｒＣＤ４成分のｇｐ１２０に対する特異的結合により起こった。

次に、ｒＣＤ４−ｄｇＡか主要組織適合性エピトープを発現する細胞を殺すか否 かを測定した（３回の実験の平均±５Ｄ）（図５）　、　ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ のＤａｕｄ　ｉ細胞に対する＞５Ｘ１．０−”Ｍ濃度における殺傷能力の欠如は 、ｒＣＤ４−ｄｇＡのクラス１１分子に対する低い結合親性、またはクラスｒｒ 抗原かｒＣＤ４−ｄｇＡとの結合後において内在化されないことによるであろう 。

ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の薬理的および生物学的性質１、ＨＩＶ−感染および非 感染細胞に対するＣＤ４−ｄｇＡ接合体の細胞毒性 ＨＩＶ−感染ヒトＨ９細胞に対するｒＣＤ４−ｄｇＡの細胞毒性を測定するアッ セイを一般的に次のように行なった：接合体の連続希釈物を９６穴マイクロタイ タープレート中の完全培地（ＲＰＭＩ、１２％ＦＣＳおよび抗生物質類）中に３ 組の形態で塗布した。次いで、細胞を、最終濃度４ＸＩＯ’細胞／ｍｌとなるよ うに加え、該プレートを３７°Ｃ（５％ＣＯ□）にて３６時間インキュベートし た。次いで細胞を、１ｕＣｉの〔３Ｈ〕チミジンにより６−８時間パルス処理し 、タイターチック自動回収装置した。３組の別々の実験を、それぞれ感染および 非感染ヒト上９細胞を用いて行なった。

５ＡＴＡ−結合接合体を用いた例１■に示した研究に合致して、ｒＣＤ４−ＳＭ ＰＴ−ｄＢＡおよびｒＣＤ４−３　Ａ　Ｔ　Ａ　−ｄｇＡも同様にインビトロに おいてＨＩＶ−感染Ｈ９細胞に対して毒性を有していた（図７および表１）、ｒ ＣＤ４−３ＭＣＣ−ｄｇＡは、対象接合体であるＯＶＡ−ｄｇＡに比しても毒性 かなく（表Ｉ）、抗体およびＡ鎖の接合体は、２成分間にジスルフィド結合か存 在する場合にのみ毒性を有することを示唆している（８１）。重要な点は、非感 染Ｈ９ｍ胞に対しては、いずれの接合体も毒性か無いことである。

細胞毒性の研究は、ＳＭＰＴまたは５ＡＴＡのいずれかを用いて調製したｒＣＤ ４−ｄｇＡか、同様な能力（ＩＣａ。＝１．７−２．ＯＸ　１．　Ｏ柑’　Ｍ） をもってＨＩＶ−感染Ｈ９ｍ胞を殺傷することを示した。ｒＣＤ４−３ＭＣＣ− ｄｇＡは、ｇｐ＋２０−結合活性を示すにもかかわらず、関連のない接合体（Ｏ ＶＡ−ｄｇＡ）に比べて高い毒性（５Ｘ　Ｉ　Ｏ−”Ｍ）を示すことはなかった 。２種の、活性接合体は、ＨＴＶ−感染細胞に対して、非感染細胞に対するより １０００倍高い毒性を有し、また対照接合体ＯＶ　Ａ　−ｄｇＡは、感染または 非感染細胞のいずれであろうと非毒性であった。

２、ｒＣＤ４および誘導体のｒｇｐ１２０への結合ｒＣＤ４．５ＡＴＡまたはＳ ＭＰＴ接合体のｒｇｐ１２０に対する結合を、自動化液相競合結合アッセイを適 用して測定した。該アッセイには、ｒｇｐ１２０のｒＣＤ４に対する溶液相結合 の評価のためにＰａｎｄｅｘＳｃｒｅｅｎ装置（Ｐａｎｄｅｘ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ、Ｉｎｓ、）を使用し、またＰ　Ｂ　Ｓ　ｐ）１７．５．１％ＢＳＡ 、０．０２％アジド（ＰＢＳＡ）中に５０−２　ｕｇ／ｍｌを計り取って別々の ９６穴プレートに入れたｒＣＤ４またはｒＣＤ４接合体を１穴あたり０．０３ｍ １を使用して実施した。ＰＢＳＡ中の９ｕｇ／［＋１１の濃度のｒＣＤ４−ビオ チン０．０３ｍ１を加え、次いでＰＢＳＡ中の１５ｕｇ／ｍｌの濃度のｒｇｐ１ ２００．０３ｍＩを加えた。該反応混合物を混合しつつ室温にて３時間インキュ ベートした。遊離または結合ｐｇｐｉ２゜を、ポリスチレンビーズに吸着させた 抗−ｒｇｐ１２０モノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）との反応によって免疫沈降 させた。該免疫沈降のため、０．０２　［＋１１の抗−ｒｇｐ１２０ＭｏＡｂ− 被覆ビーズを、装置により最初にパンデックスプレートに加えた。次いて０．０ ３ｍ１の反応混合物を該バンデックスプレート中の粒子に移した。１５分間のイ ンキュベーションに続けて、０．０２ｍ１のストレブトアビジンーフィコエリト リン接合体をＰＢＳＡ中に１１５０に希釈して入れた。該プレートを暗室中で１ ５分間インキュベートし、次いでＰＢＳＳｏ、０５％トゥイーン２ｏにより洗浄 し、蛍光強度を測定した。

ｒＣＤ４．５ＡＴＡおよびＳＭＰＴ接合体の阻害曲線を図６に例示しである。こ れらの曲線は、相互に若干ずれているか、曲線間の差異は統計上有意なものでは ない。

これらのデータは、装置により提供されるソフトウェアを使用する５ｃａｔｃｈ ａｒｄ分析によって、ｒＣＤ４および接合体の結合親和性（Ｋｄ）の計算にも使 用した（８ｏ）。

これらの結果は、ＳＭＰＴとの接合による親和性の若干の欠損があることを示し たが、この差異は実験誤差の範囲内のものであった（表■参照）。

３、ｒＣＤ４のＤａｕｄｉ細胞への結合ｒＣＤ４のＤａｕｄｉ細胞への結合を、 放射標識ｒＣＤ４を用いた直接結合アッセイ、またはビオチン結合ｒＣＤ４およ びフルオレセイン−アビジンを用いた間接アッセイにより評価した。細胞（１０ ’　１０．１ｍ１）を、それぞれ４°Ｃにて、種々の量の”’Ｉ−ｒＣＤ４　（ １−５００ｎｇ／　０．１　ｍｌ）またはビオチン結合ｒＣＤ４（０，１−２５ μｇ１０．１ｍ１．）により３時間または３０分間処理した。１０％ウシ胎仔性 血清（Ｆｅ２）および０１１％ナトリウムアジドを含む冷リン酸緩衝塩溶液（Ｐ ＢＳ）により２回洗浄後、細胞ペレットの放射能を測定（放射標識ｒＣＤ４を使 用した場合）するか、あるいは細胞懸濁処理した。該細胞を、洗浄し、フル第１ ／セインー活性化細胞ソーターＦ　Ａ　ＣＳ　（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓ ｏｎ、０ｘｎａｒｄ、ＣＡ）にて分析した。

ＭＨＣクラス（［“ヒトＤａｕｄ　ｉ細胞に対する　１２５Ｉ−標識またはビオ チン結合ｒＣＤ４の有意な結合は観察されなかった（Ｋ＞　１０”　Ｍ−’）Ｏ このことは、ｒＣＤ４およびｒＣＤ４−ｄｇＡのいずれもか細胞表面ＭＨＣクラ ス１ｒ抗原に結合し得ないことを示している（８２）。結合アッセイにより測定 されたように、ｒＣＤ４分子およびそれを用いて調製された接合体は、クラス目 ＋Ｄａｕｄｉ細胞に結合しなかった。クラス［１分子は、推定されるＣＤ４に対 する天然のリガンドであることから、このことは、細胞−結合ＣＤ４が細胞−結 合クラスＩＩ抗原に結合可能である一方（８２）　、可溶性ｒＣＤ４は、細胞− 結合クラスＩＩ分子に結合しないことを示している。この知見は抗−クラスＩｆ −ｄｇＡ接合体が同じアッセイで毒性であるにもかかわらず、ｒ　ＣＤ　４−４ −３ＡＴＡ−ｄがＤａｕｄｉ細胞を殺傷しないという例［［１に示した研究に合 致する。

４、ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ接合体の安定性５ＡＴＡ−およびＳＭＰＴ−誘導ｒＣ Ｄ４−ｄｇＡ接合体の安定性を、ＨＩＶ−感染ヒトＨ細胞にて毒性試験を行なう 前に、該接合体を新鮮ヒト血漿中で３７°Ｃにて１６時間インキュベートするこ とにより試験した。

上記表Ｉに示されるように、両液合体の細胞毒性は、ヒト血漿中での３７℃、１ ６時間のインキュベーションにより約５０％低減した。５ＡＴＡ−およびＳＭＰ Ｔ−誘導接合体の残留細胞毒性の差異は、統計的に有意なものではなかった。

ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体のインビボにおける解離について、正常マウスへの放射 標識接合体の注射後４時間において遊離ｄｇＡの放出を測定することにより更に 研究を行なった。マウス細胞はｒＣＤ４−ｄｇＡを結合せず、従って接合体がイ ンビボにおいて細胞に特異的に取込まれることがないモデルにおける接合体安定 性のための良好なモデルを与えることに注意したい。かくして、ｒＣＤ４−ｄｇ Ａ注射後、血清試料を収集し、ウサギ抗−リシンＡ頌を用いて免疫沈降させた。

沈殿を５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィにより分析した（方法を参 照）。結果は、ｒ　ＣＤ　４−ＳＭＰＴ−ｄｇＡが、ｒＣＤ４−３ＡＴＡ−ｄｇ Ａより４倍遅くインビボにて分解され（表■）、またｒＣＤ４−３ＭＣＣ−ｄｇ Ａか最も安定である（１％未満のｄｇＡ放出）ことを示している。

ＨＩＶ−感染Ｈ９１Ｈ胞上の細胞毒性アッセイにおいて、試験する場合、放射標 識５ＡＴＡ−またはＳＭＰＴ−結合接合体の注射後３時間（一つの半減期）にて 回収されたマウス血漿は、新たに解凍された接合体のものと同等なＩＣ，。（２ Ｘ　１０−”　Ｍ）を示した。

安定性試験は以下のように行なわれた：放射標識接合体（約１０　”ｃｐｍ／動 物）をマウスに注射後、該動物を放血せしめ、ヘパリン処理車を回収した。血漿 中の遊離および接合ｄｇＡを、ウサギ抗−リシンＡ鎖およびヤギ抗−ウサギ［ｇ （８３）を用いて調製した免疫複合体により沈殿させた。該沈殿物を１％ＳＤＳ 中で煮沸し、１２％５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動にかけた。乾燥ゲルのオート ラジオグラムをバイオ−ラドビデオデンシトメータを用いて走査した。ｄｇＡ下 の領域およびｒＣＤ４−ｄｇＡビークを、放出ｄｇＡに対応する放射能の百分率 を決定するために両ピーク下の全領域で割った。この値を、ｒＣＤ４−ｄｇＡ接 合体のインビボ分離を評価するために使用した。

血液から回収されたｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の機能的活性を、ＨＩＶ−感染Ｈ９ 細胞上の細胞毒性アッセイを行なうことにより測定した。マウスに、既知量の放 射能（約５　ｘ　１０’ｃｐｍ／ｕｇ　）をもった放射標識５ＡＴＡ−またはＳ ＭＰＴ−結合接合体を注射した。３時間後、動物を放血せしめ既知量の接合体を 含むヘパリン処理血漿を、インビトロ細胞毒性アッセイにおいて新たに解凍した 接合体と比較した。

ヒト血漿中での安定性を測定するために、接合体を未希釈ヒト血漿またはＰＢＳ 中で３７°Ｃにて１６時間インキュベートし、次いで新たに解凍した接合体を並 行して細胞毒性アッセイに使用した。

該インビトロ安定性試験は、５ＡＴＡ−およびＳＭＰＴ−誘導ｒＣＤ４−ｄｇＡ 接合体の両者が、同様な化学的安定性を有し、両者共に３７°Ｃにおいて１６時 間後に細胞毒性能力の約５０％を失なうことを示した。しかしながら、インビボ （マウス血中）においては、ＳＭＰＴ−結合接合体は、５ＡＴＡ−結合接合体よ り４倍少ない遊離ｄｇＡを放出し、より安定であった。この結果は、ＳＭＰＴを 用いて調製されたイムノトキシンが、５ＡＴＡと同様に露出したジスルフィド結 合を生じる交差リンカである２−イミノチオレーンを用いて調製された対応する イムノトキシンより６倍遅くインビボで分解されることを示したＴｈｏｒｐｅら の報告（８５）と一致する。

ＳＭＰＴは、組織および血中に存在するグルタチオン等のチオレート陰イオンの 攻撃からジスルフィド結合を保護する、隣在するベンゼン環およびメチル基によ り立体的に妨害されたジスルフィド結合を生成する。

５ＡＴＡ−およびＳＭＰＴ−結合接合体をマウスに注射し、３時間後にそれらの 血清をＨＩＶ−感染Ｈ９細胞をインビトロにて殺傷させるために使用して測定さ れるように、残留接合体の活性の損失はなかった。この結果は、両ｒＣＤ４−ｄ ｇＡ接合体が、循還する感染細胞によるそれらの反応を許容するために充分な時 間、それらの細胞毒性活性を保持することを示している。

５、ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体のインビボ消滅Ｆｕｌｔｏｎらの方法を使用した（ ６４）。概略は、接合体をＩ　０ＤＯ−ＧＥＮ技術によりＮａ　［：”’［〕を 用いて標識し、マウスの後−眼窩溝に注射した（約４Ｘ１０’ｃｐｍ　／　５　 ｕｇ／動物）。（１２５［）レベルを、５分、１０分、３０分、１時間、２時間 、４時間、および８時間において、血液のヘパリン処理試料（７５ｕｌ）につい て測定した。血中に残留する全放射能を、ガンマ計数器にて分別量を測定し、全 血体積を体重の７％として測定した（６４）。酸沈殿可能な放射能は、血漿分別 量の１０％トリクロロ酢酸による沈殿にて測定した。循環系に残留する注射され た放射能の百分率を、注射された酸−沈殿可能な放射能の百分率として計算した 。消去のアルファー（３０分間）およびベーター相（８時間）の両者についての 半減期（ＴＩ／２）を、時間に対する酸沈殿放射能の百分率を零に外挿して図的 にめた（８４）。

マウスに注射された放射標識ｒＣＤ４−ｃ１ｇＡの血漿レベルは、消滅の２つの 主要な相、すなわち３０分間以内に完全に終わる速い初期アルファ相、およびよ り遅いベータ相を示した。３種類の接合体は、すべてか８時間以内に約９０％が 消滅した（図８）。３種の接合体の、Ｔ１７２ベ一タ間には統計的に有意な差異 かなかった。しかしなから、ＳＭＰＴ−誘導ｒＣＤ４−ｄｇＡは、５ＡＴＡ−誘 導接合体よりわずかに長い半減期を有していた（表１）。この差異は、■ｇＧお よびｄｇＡにより調製されたＳＭＰＴ接合体を用いた先の研究から予測されてい るものに比べて大きいものではない。ｒＣＤ４の半減は、ｄｇＡとの接合後に、 両相において顕著に増大する（２−５倍）ことに注意すべきである。

放射性ヨウ素化蛋白質の器官分布を、前述のように麻酔したマウスのＰＢＳによ る潅流後に測定した（６４）。

器官を取出し、重量測定およびガンマ計数測定を行なった。器官試料をはさみで 細断し、０．５％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　−４０により抽出し、そして清澄化抽出 物を１０％トリクロロ酢酸により沈殿させた。酸沈殿放射能の百分率を測定し、 値を種々の組織中の蛋白質結合放射能の計算に使用した。放射標識蛋白質を蓄積 する器官の容量は、器官に保持された注射放射能投与量の百分率を、該器官の正 身重量で割って計算した。

放射標識接合体またはその蛋白質成分の注射から１時間後の種々の器官抽出物の 酸沈殿性により測定された標識接合体の組織分布を、表Ｉ＋に示した。この表に 要約される結果から、以下の結論が引出される：ａ）ｒＣＤ４−８Ｍ　Ｐ　Ｔ　 −ｄｇＡおよびｒ　ＣＤ　４−３ＭＣＣ−ｄｇＡ接合体は、膵臓中にｒ　ＣＤ　 ４−４−３ＡＴＡ−ｄの３倍高い水準で選択的に蓄積される＋ｂ）ｒＣＤ４−３ ＭＣＣ−ｄｇＡは、５ＡＴＡ−結合接合体の約３倍高い水準で肝臓に濃縮される ；ｃ）ｒＣＤ４−３ＡＴＡ−ｄｇＡ接合体は、他の２種の接合体より低い蓄積を これらの器官（肝臓および牌ｍ）で示すか、腎臓には蓄積される。

マウスのインビボでの研究において、ＳＭＣＣ−結合接合体は、対照、すなわち チオール媒介還元に感受性であろうジスルフィド結合を欠く接合体として作用す る。

インビボにおける消去の研究は、ｒＣＤ４が１０分間のＴ１７２アルフアをもっ て容易に消去されることを示した。

３０分間で、わずかに７％が血清中に残った。ｄ［ｉＡも、２０分間の短いＴ１ ７２アルフアを有していた。３０分間で、２６％か血清中に残った。対照的に、 ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体は、存意に長いＴ１７２アルフア（４０−６０分間）を 有していた。３０分間で、４０％以上か血清中に残った。かくして、ｒＣＤ４− ｄｇＡに対する接合は、ｒＣＤ４に有意に血清半減期を与える。３種類のすへて の接合体について、８時間後に循環系に残留する蛋白質の百分率は、１０％を若 干下回った。ここにおいて、実質的にすべてのｒＣＤ４が消去された。５ＡＴＡ −結合（１７７分間）およびＳＭＰＴ−結合（２０９分間）接合体の８時間ベー タ相半減期の差異は、統計的に有意なものではなかった。

６、ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ接合体の毒性種々のｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の蛋白質 合成阻害能力を、無細胞アッセイにおいて試験した。ＩＣｓ。は、ｄｇＡ、　ｒ ＣＤ４−ＳＡＴＡ−ｄｇＡおよびｒ　ＣＤ　４−ＳＭＰ　Ｔ−ｄｇＡについて１ ０−”Ｍ、またＳＭＣＣ−誘導接合体につイテ＞　１０−”Ｍテあツタ（表［［ ）　。ＳＭＣＣ接合体は、遊離のｄｇＡが還元によって放出され得ないことから 、アッセイにおいて毒性を有さなかった。

マウスにおけるｒ　ＣＤ　４−４−３ＡＴＡ−ｄおよびｒＣＤ４−ＳＭＰＴ−ｄ ｇＡのＬＤ、。は、同様であった（表１）。これらの研究において、増大させた 量のｒＣＤ４−　ｄｇＡ接合体を、体重１５ｇの４匹のＣ３Ｈ／ＨＥＪマウスの ３群に腹腔内的に注射し、１０日以内に起きた死亡に基づいてＬＤ、。を計算し た。ＳＭＰＴ−結合ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体については、体重２０ｇの４匹のＢ ＡＬＢ／ｃマウスの３群を使用して２回の反復によりアッセイを行なった。Ｃ３ Ｈ／ＨＥＪおよびＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃ７ウスの両者について平均値を計算し た。

非毒性接合体ｒ　ＣＤ　４−ＳＭＣＣ−ｄｇＡのＬＤ！、は、測定しなかった。

２種類の活性接合体、ｒＣＤ４−３ＡＴ　Ａ　−ｄｇＡおよびｒＣＤ４−ＳＭＰ Ｔ−ｄｇＡのＬＤ６．は、それぞれ１１００ｕおよび１１６ｕｇ／ｇマウスであ った。

このことは、ＩｇＧ−ｄｇＡ接合体のＬＤ、。（１５−２０％ｇ／　ｇ　７ウス ）（，８５）との比較において、該ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体は、蛋白質に基づい て６倍低く、またｄｇＡに基づいて１０倍低い毒性をもつことを示している。

７、ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ接合体の病巣分布処置群は、４匹の２５−３２ｇのＣ Ａ　Ｆ　＋雄マウスからなり、それらはＳＭＰＴ−結合ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ、 　５ＡＴＡ−結合ｒＣＤ４−ｄｇＡのいずれかのＬＤｓｏの５％、１０％および ２０％、ｄｇＡのＬＤ、、の２０％、または食塩水を含む１ｍｌ溶液を、腹腔内 的に投与された。マウスは７日後にベンドパルビタールの腹腔内的注射により処 置された。組織を大ざっばに切断して１０％緩衝ホルマリン中で固定した。肝臓 、膵臓、腎臓、肺、心臓、脳下垂体および横隔膜筋をパラフィン中に包埋し、５ ミクロンの薄片とし、ヘマトキシリンおよびニオシンにより染色した。病巣を主 観的に無し、最少、中程度、顕著として評点し、０，１．３または３の等級をつ け、各群について平均した。器官内、またはＬＤ、。投与量の５％、１０％また は２０％を注射されたマウスのいずれにも大きい病巣はなかった。ＩＪｌｌ微鏡 的に、すべての動物の肝臓、腎臓、膵臓、および脳には病巣が無かった。

病巣は、起始点近くの後脚、横隔膜および心臓の骨格筋に見られた。病巣は、形 態的よりむしろ程度において変化した（表ＩＩＩ　）。それらは、断片化され、 ヒアリン質化され、およびしばしばマクロファージおよび少数の好中球に浸潤あ るいは包接された筋線維からなっていた。

炎症性細胞は、正常線維に隣接して包囲する筋内膜に浸潤していた。炎症性応答 は、筋形質核の増殖を伴い、また再生ストラップ細胞は、下垂体および横隔膜筋 系の両者において退行する線維と混合されて報告されている。

下垂体筋中の病巣は、他の非感染筋肉を放置して分散された筋肉東向にしばしば 濃縮される。該病巣は、下垂体骨格筋において横隔膜または心臓中のものより一 貫して突出している。

表ＩＩｌ ｌＩｒＣＤ４−３ＡＴＡ−ｄおよびｄｇＡ注射マウスの筋障害の平均評点ｒＣＤ ４−ＳＭＰＴ−ｄｇＡ　’ ５　０．００”　０．００　０．００ １０　０．００　０．２５　１．２５ ２０　０．００　０．００　１．７５ ｒＣＤ４−３ＡＴＡ−ｄｇＡ　” ５　０．２５　０．７５　２．２５ １０　０．３３　０．２５　２．２５ ２０　０．２５　０．２５　１．２５ ｇＡ　ｂ ２０　０．３３ｂＯ，３３２，６０ 対照　ｏ、ｏｏ　ｏ、ｏｏ　ｏ、ｏ。

“　４匹の動物についての平均病巣評点ｂ　３匹の動物についての平均病巣評点 心筋病巣は広範囲に分散し、また４匹の動物にのみ見出され、ｒＣＤ４−３ＡＴ Ａ−ｄｇＡにより、およびｄｇＡにより処置された各群からの一匹であった。心 筋病巣は、最少であり、通常１または２の心筋線維に集中または限定されていた 。退行した心筋線維は、ヒアリン質化され、好塩基性顆粒球により斑状化され、 マクロファージおよび好中球に浸潤され、また一部についてはマクロファージの 浸潤によって閉塞されていた。

横隔膜および下垂体骨格筋からの筋断面における再生の証拠は、筋障害が可逆的 であることを示している。心筋障害は、そのような損傷後、再生しないが、心筋 障害の病巣は最少であり、広く分散し、いずれのマウスにおいても心疾患は生じ なかった。

ＳＭＰＴとは対照的に、接合体調製のための５ＡＴＡの使用は、下垂体骨格およ び横隔膜に記録された筋障害を悪化させる。加つるに、５ＡＴＡ−結合接合体は 、ノロ臓に病巣を生じた。ｒ　ＣＤ　４−ＳＭＰＴ−ｄｇＡを注射した動物にお いては、心臓の病巣は見出されなかった。

この結果は、ＳＭＰＴを用いて調製された接合体は心筋線維に対して毒性でなく 、また、５ＡＴＡを用いて調製されたｒＣＤ４−ｄｇＡよりも骨格筋に対する毒 性か低いことを示唆している。いずれの動物も心疾患の徴候を、臨床的にも剖検 的にも示さなかった。

総合的にみて、これらの結果は、ＳＭＰＴを用１．ｚて調製されたｒＣＤ４−ｄ ｇＡは、ＡＩＤＳ患者を治療するｊコめの治療薬として更に開発されるべく選択 される接合体であることを示唆している。

例　Ｖ ＣＤ４ペプチド性接合体の調製 ＢＳＡ−ｄｇＡに結合されたＣＤ４の４１．−５７位のアミノ酸か組込まれたペ プチドを含んでなる短いペプチド性接合体は、ＨＩＶ−感染細胞を選択的に殺す ことができる。該ペプチドＢＳＡ接合体も、ＣＤ４およびｇｐ　１２０間の相互 作用を阻害する。Ｂ　Ｓ　Ａ　−ｄｇＡとの接合に先立って、該ペプチドは約２ ．３　ｋＤａの分子量を有し、また更に柔軟性（Ａｌａ　）を与え、かつ該ペプ チドにジスルフィド結合能力（Ｃｙｓ　）を与えるためにカルボキシル末端への Ａｌａ−Ｃｙｓの付加を含めた。この例示的研究においては、５５位のＡｌａを 比活性３．８　ｘ　ｌ　Ｏ’　ｃｐｍ　７ｍｇで［：’Ｈ）により標識した。高 い濃度においてさえ、該ペプチドは単独ではＣＤ４とｇｐ１２０との結合を阻害 することができないが、それがジスルフィド結合を介してＢＳＡにカップルされ た場合に、この接合体は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−標識ＣＤ４の ｇｐ１２０への結合を、４領域ｒＣＤ４分子（図１４）の１００倍高濃度におい てではあるが、阻害することができた。

ペプチド４１−５７のＢＳＡへのカップリングは、Ｎ−スクシンイミジル−８− チオアセテート（ＳＡＴＡ）およびＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジル ジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の混合物のモル過剰量を用いてＢＳＡをチ オール化することにより行なわれた。

次いで、チオール化ＢＳＡを該ペプチドと反応させ、接合体をヒドロキシルアミ ンにより脱アセチル化し、還元されたエルマン化ｄｇＡと反応させた。別法とし て、ＢＳＡ分子を５ＡＴＡにより千オール化し、カルボジイミド゛処理によりペ プチドに接合させた。接合体をヒドロキシルアミンにより脱アセチル化し、還元 されたエノしマン化ｄｇＡにカップリングして接合体を得た。

該反応は次のとおりである。

ＰＹ−Ｓ−３−ＢＳＡ−Ｓ−ＣＯＣＨ，＋ペプチドー３Ｈ↓ ↓ ペプチド−３−３−ＢＳＡ−Ｓ−３−ｄｇＡ該ペプチド／ＢＳＡモル比は、放射 能測定およびペプチド−３−Ｓ−ＢＳＡ接合体の蛋白質濃度の測定から、約８で あった。該ペプチドは、ｄｇＡ分子に直接結合され、引続いて５ＰＤＳを用いて ｄｇＡをチオール化し、ＤＴＴにて還元し、エルマン化試薬（ＤＴＮＢ）と反応 に付されてもよい。ｄｇＡ分子は、わずか２個のレジン残基（１個のαＮＨ，お よび１個の反応性システィン残基に加えて）を含むため、処理されたｄｇＡ上に はＳＨ−含有ペプチドへのカップリングのために、４個未満のチオール基か利用 可能である。

該ペプチド−Ｓ−３−ＢＳＡ−ｄｇＡおよびペプチド−ＢＳＡ−３−Ｓ−ｄｇＡ を、ＴＳＫ−３０００上のＨＰＬＣにより反応混合物から部分精製した。該接合 体は、この方法によっては完全に分離することができないペプチド−５−３−Ｂ ＳＡを不純物として含んでいた。該ペプチドーｄｇＡ接合体を、セファデックス Ｇ−２５上のゲルろ過により精製し、未反応ペプチド非含有としたが、痕跡量の 遊離ｄｇＡを含んでいた。

ペプチド−３−３−ＢＳＡ−Ｓ−３−ｄｇＡのＭｒは、約１２０ｋＤａ、（ＨＰ ＬＣおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定）であり、１分子のＢＳＡおよび１分子 のｄｇＡに対して結合される８分子のペプチドに対応している。

該接合体中のｄｇＡの、蛋白質合成阻害能力を、無細胞ウサギ赤血球アッセイを 接合体の還元に続けて行なうことにより測定した。ＩＣｓ。は、未結合−ｄｇＡ 　（ｌ　Ｏ−”Ｍ）と同様であった。ＣＤ４−ｄｇＡとの比較におけるペプチド −接合体の細胞毒性を測定するために、感染対非感染Ｈ９細胞を免疫接合体と共 に７２時間培養し、次いで［３旧−ロイシンにより６時間標識した。結果が図１ ｂに示され、それは該ペプチド−３−３−ＢＳＡ−３−３−ｄｇＡがｒＣＤ４− ｄｇＡより約２から８倍高いＩＣ５，を有して感染された標的細胞を殺し得るこ とを示している。

ペプチド−３−Ｓ−ｄｇＡを含む接合体は、ＣＤ４のｇｐ１２０に対する結合を 阻害しないが、それらのＨＩＶ−感染細胞殺傷能力については測定していない。

ＣＤ４の４１−５７位残基を含むペプチドは、モル比６−８ペプチド／ＢＳＡ分 子をもってＢＳＡに結合された場合にのみ、ＣＤ４のｇｐ１２０への結合を阻害 することかできた。このことは、ｇｐ１２０に対するペプチド構築物の親和性か 、真正の２または４領域ｒＣＤ４分子よりも低いことを示唆している。この低い 親和性は、ＨＩＶ−感染細胞の殺傷について２−から８−倍低い有効性をもつも のであろう。これらの結果は、ペプチド４１−５７がｇｐ１２０分子と最適に相 互作用するには短すぎることを示唆している。従って、例えば５７−８４位の残 基も含むより長いペプチドを使用することにより、更なる利点か実現されるであ ろうことが提案される。

このペプチドは、ジスルフィドループを含まないであろうことから、ＣＤ４の天 然のＶｌ領域の空間配置を示さないであろう。更に、真正のＣＤ４分子のｇｐ１ ２０−結合性部位は、変性緩衝溶液中てのジスルフィド結合の還元により失なわ れているため（１００）、このジスルフィドループは、高い親和性結合のために 必要であろう。

ｇｐ１２０に対する改善された親和性を有するペプチドを創製するために、２種 類の方法を取り得ることが提案される。第１には、４１−８４位の残基を含むペ プチドを、チオール化または非チオール化ｄｇＡ、あるいはＢＳＡについて記述 したようにチオール化されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）にカンブリングさせ る。第２の場合において、アミノ酸残基１６−８４（２個のシスティンの間）を 含むペプチドを合成的、または組換えＤＮＡ技術により得る。結合親和性を増大 させるために、５−１０個のグリシン残基をシスティンの付加の前に最後のＣ− 末端アミノ酸残基に導入することか提案され、これはＨＳＡまたはｄｇＡにカッ プリングさせるために重要である。

このポリグリシンの腕は、ペプチドのｇｐ１２０−結合性部位をより弁動な方法 で露出させ、かくして結合親和性を増大させるであろう。

Ｂ、ペプチド−接合体の血清半減期の延長ペプチドとｄｇＡとのみを含む活性接 合体を得た場合には、それは多分、短い血清半減期を有するであろう。該接合体 の半減期を延長するために、ｇｐ１２０−結合性ペプチドを他の分子と化学的に カップリングさせて、より長い血清半減期を与えることか提案される。一つの可 能性ある分子は、ペプスタチン（イソ−バレリル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−４ −アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタノイル−アラニル−４−アミノ− ３−ヒドロキシ−６−メチル−ヘプタン酸を含むペンタペプチド）である。ペプ スタチンは、カテプシンＤおよびレニン−アンジオテンシン反応の強力な阻害剤 である。ペプスタチンのｒＬ−２との共存的投与は、この蛋白質の分解を低減し 、その血清半減期を延長した（１０１）。従って、ペプスタチンを該ペプチドの Ｎ−末端に結合し、かくして接合体により長い血清半減期を付与することが可能 であろう。別法として、ペプスタチンを該ペプチド接合体と共存的に投与するこ ともできる。

Ｃ１異なる担体蛋白質 初期の研究において、ｄｇＡに結合するためにＢＳＡかペプチドの担体として使 用された。ヒトにおいてこれらの接合体を使用するために、免疫応答を避けるた めにヒト蛋白質を用いることか好ましいてあろう。このことは、いくつかの方法 において行なわれ得る：１、ＨＳＡは、ＢＳＡを置換し得る。ＨＳＡのヒトにお ける半減期は７日間である。更に、接合体のＭｒは、ＨＳＡのトリプシン断片を 用いることにより（Ｍｒの３０％）、同じ半減期をもって低減し得る（１０２） 。

このことは、５５−６０　ｋＤａの接合体を創製するであろう。

２、　発明者らの実験室において行なわれた他の実験は、ｄｇＡに結合されたヒ トモノクローナル抗ｇｐ４１が、ＨＩＶ−感染細胞に対して効果的なイムノトキ シン（ＩＴ）であることを示した（１０３）。この限りにおいて、ＣＤ４ペプチ ドが精製ヒト抗−ｇｐ４１モノクローナル抗体またはそのＦａｂ　’断片に結合 され、次いでこの構築物がｄｇＡに結合される。ｇｐ４１およびｇｐ１２０の両 者に結合可能な分子の生成は、それらかｇｐ４１またはｇｐ１２０のいずれかの 低密度の発現をするとしても、接合体にすべてのＨＩＶ−感染細胞に対する効果 的結合を許容する。

このことは、免疫接合体の能力をも改善するであろう。

基を介してｄｇＡに結合され、引続いて５ＡＴＡにより導入される脱アセチル化 チオール基を介するエルマン化ペプチドと接合される。この接合体は、担体とし ての真正のｇｐ４１分子と共に循環系内でより長い半減期を有する。

Ｄ、接合体の膜透過輸送の増加 ペプチドを含む接合体の、ＣＤ４−ｄｇＡに比べてより低い細胞毒性活性は、Ｈ ＩＶ−感染細胞の膜を通過するペプチド接合体のより低効率の転座の結果であろ う。水溶性接合体の膜透過輸送を増大するために、担体部分（例えば、ＩＳＡま たはＩｇ）をステアリン酸等のアンカーを導入することにより、更に疎水性にす ることができる（１０４）。最近、リシンＡ鎖に２つの脂肪酸基を導入すること によりその毒性が増大し、天然リシンのものと対比できるまでとなることが示さ れた（１０４）。

ＨＳＡまたは１ｇ分子に脂肪酸を導入することにより、接合体の特異性を低減す ることなく毒性を増大することが可能であろう。

Ｅ、接合体のｄｇＡ分節の変更 ｄｇＡの免疫原性を低減し、接合体に活性部位のみを導入するために、ｄｇＡを 種々の化学種および酵素により処理してＮ−グリコシダーゼ活性を保持した最短 の分節か調製されるであろう。このような処理は次を含む（図ｄｇＡ分子は、ヒ ドロキシルアミンによる切断に感受性の唯一のアスパラギニルーグリシルペプチ ド結合（１４１−１４２位）を含む。ｄｇＡをヒドロキシルアミンにより切断す ることによって、２個の断片が得られる。一方は、Ｎ−末端部分の最初の１４１ アミノ酸残基を含み、他方は、Ｃ−末端部分の１４２−２６５位のアミノ酸残基 を含む。両断片は、無細胞ウサギ赤血球アッセイにおいて蛋白質合成阻害能力を 試験される。

２）シアノゲンブロマイド ｄｇＡ（１−１４１）断片は、メチオニン残基を含まないことからシアノゲンブ ロマイドによる開裂に対して感受性ではない。１．４２−２６５位の断片は３個 のメチオニンを有し、それぞれ３２．１３．６３および１２個のアミノ酸を含む 異なった大きさの４個の断片に分解される。４種のすべてのペプチドを単離して ウサギ赤血球アッセイにおいて活性試験され得る。毒性活性が４種の断片のうち １種以上に伴われる場合には、これらの断片がｇｐ１２０−結合性ペプチドに対 する接合に使用される。

３）パパイン ｄｇＡ分子をブルーセファロースに固定し、室温にてパパインで処理すると、約 ７　ｋＤａのＭｒを有するｄｇＡの一断片がブルーセファロースに結合して残留 し、ＮａＣ１により溶出され得る。該ペプチドはシスティンを含まず、アルギニ ンに富み、Ａ鎖のＮ−末端部分（残基１−６０）を含むことを示唆している。予 備実験において、この断片の毒性活性は、初期ｄｇＡの２０％であった。これら の結果は、断片１−１４１（ヒドロキシルアミンを用いて得た）は、毒性部位を 含むであろうことを示唆している。

それはブルーセファロースに結合し、その大きさはパパイン開裂によって更に減 少されるであろう。

Ｆ、化学修復によるｄｇＡの免疫原性の低減該分子の免疫原性を減少する試剤を 用いた化学修飾による、ｄｇＡの免疫原性低減のために設計された実験を行なっ た。このような試剤は、ＰＥＧである。別法として、いくつかのアミノ酸残基の 電荷を、分子の陽イオン化により変化させ得る（例えば、スクシニル化）。

例Ｖｔ リシンＡ鎖ＣＤ４接合体の大規模調製 Ａ、序論 上記例に示したように、組換えヒトＣＤ４抗原（ｒＣＤ４）およびリシンＡ鎖の 脱グリコジル化形態（ｄｇＡ）とのジスルフィド結合接合体は、ヒト免疫不全ウ ィルス（ＨＴＬＶ、、、、またはＨＩＶ−１）に感染したヒトＴ細胞株（Ｈ９） を効果的に殺傷する。それらのインビボにおける安定性および毒性に加え、イン ビトロにおける接合体の有効性に影響を与える主要な因子は、ｒＣＤ４および（ ｆｇＡ分子間にジスルフィド結合を導入するために使用する交差リンカの化学的 性質にあることが見出された。

更に、Ｎ−スクシンイミジル−オキシカルボニル−α−メチル−（２−ピリジル ジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）を用いて調製されたｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体か、 インビボにおける安定性を付与するｒＣＤ４とｄｇＡとの間の妨害されたジスル フィド結合を有する活性体であることから有利であることが示された。従って、 ＳＭＰＴを用いて調製されたｒＣＤ４−ｄｇＡを、ＨＩＶ−感染個体の治療のた めの治療用薬剤として使用するために選択される交差リンカとした。この例にお いて、ｒＣＤ４７ＳＭＰＴ−ｄｇＡの大規模調製のための標準化方法ならびにｒ ＣＤ４−ｄｇＡの物理化学的および生物学的性質の記述か示さアミノ酸Ｉから３ ６８位までを含む組換え蛋白質を記述（７５）に従って調製し、０．０５％のト ウイーン２０を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に５ｒｎｇ／ｍｌの濃度で溶解 させた。吸光係数（１０ｍｇ／ｍｌにおいて）および分子量が、それぞれ１５お よび４５ｋＤａのｒＣＤ４が用いられた。

２・　０Ａ リジンのｄｇＡ鎖を、Ｉｎ１ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ａｕｓｔｉ ｎ、ＴＸ）から入手し、前述ＣＦｕｌｔｏｎら、１９８６）のようにして調製お よび特徴付けを行なった。該蛋白質を、５０％グリセロールを含むＰＢＳ中に、 約４ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させ、−２０’Ｃて保存した。ｄｇＡについての吸 光係数および分子量は、それぞれ７．７および３０ｋＤａですへての方法は、優 良実験室実務（ＧＬＰ）（９３）基準に従って、滅菌、エンドトキシン非含有の 蒸留水（逆浸透法で得た）、緩衝溶液および装置類を用い、記述されているよう に（９４）　、完全自動化生物適合性液体クロマトグラフィー系を使用して実施 した。この例における４段階の調製および精製方法は、４８時間および２４時間 でそれぞれ行なった（図９）。

４、ｒＣＤ４の誘導 ｒ　ＣＤ　４　（５ｍｇ／ｍｌ）を含む溶液２００−４００＋＋＋１を、４−８ ｍ１のＳ　Ｍ　Ｐ　Ｔ　（６，５ｔａｇ／ｍｌジメチルホルムアミド上で冷却し 、０．　０　０　３　Ｍ　ＮａＪＤＴＡを含む窒素置換した０、０５Ｍリン酸緩 衝溶液、ｐＨ７．５　（ＰＢＥ）により平衡化したセファデックスＧ−２５バイ オプロセスカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　、　Ｕｐｐｓａｌａ　、　Ｓｗｅｄｅ ｎ）　（　２　５　ｘ　３　０　ｃｍ）（流速５Ｌ／時）に４°Ｃにてかけた。

蛋白質画分を、ら線カートリッジＡｍ１ｃｏｎ　ＣＨ２濃縮器（ＹＭ−３０）に 自動的に回収し、２ｍｇ／ｍｌに濃縮した。ＭＰＴを含有しないｒＣＤ４−ＭＰ Ｔ溶液を、還元ｄｇＡと反応させる前に氷上にて１時間未満保持した。ｒＣＤ４ 分子あたりのＭＰＴ基の平均数を、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（１０ｍＭ、 最終濃度）により室温にて１５分間処理した分別量の３４３０ｍにおける吸光度 を測定し、次の式二ＭＰＴ基／ＣＤ４　１分子＝　Ａ　２４３　Ｘ　６７．５　 ／　Ａ　２８０Ｘ　８．　Ｉ　Ａ　２４：Ｉ　Ｘ　５．１を用いて決定した。

５、ｄｇＡの還元 ２５０〜５００ｍ１のｄｇＡ溶液（約４ｍｇ／ｍｌ）を、２５〜５０ｍ１のＤ　 Ｔ　Ｔ　（７，７ｍｇ／ｍｌ）を用いて攪拌しツツ処理した。該混合物を暗室中 で室温にて１時間インキユベートシた。該混合物を水中で冷却し、窒素置換ＰＢ Ｅにより平衡化した４°ＣのセファデックスＧ−２５バイオプロセスカラム（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａ　、　Ｕｐｐｓａｌａ　、　Ｓｗｅｄｅｎ）　（２５ｘ３０ｃ ｍ）（流速５Ｌ／時間）にかけた。蛋白質画分を、Ａｍ１ｃｏｎ　ＣＨ２濃縮器 （ＹＭ−１０）に自動的に回収し、２ｍｇ／ａ＋Ｉに濃縮した。新たに還元した ｄｇＡを、直ちにｒＣＤ４−ＭＰＴ溶液と重量比１　ｌをもって混合しくｄｇＡ ／ｒＣＤ４モル比＝１．５）、比況１物を０．２２ｍμの処分可能なフィルタを 通したろ過により除菌した。接合反応は、窒素下にて室温で４８時間継続した。

６、ｒＣＤ４−ｄｇＡの精製 １　ＣＬ　−４Ｂバイオプロセスカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ 　、　Ｓｗｅｄｅｎ）　（１１，６ｘ　３０ｃｍ）　（流速２Ｌ／時間）に４° Ｃにてかけた。同緩衝溶液を用いて洗い出した画分を放出しく未反応ｒＣＤ４を 含む）、該カラムを更にＰＢＥ中の０．５　Ｍ　ＮａＣ１により溶出した。溶出 蛋白質（ｒ　ＣＤ　４−ｄｇＡ十ｄｇＡ）を、約７００ｍ１に濃縮し、氷上で冷 却後に、Ｏｙｌ　４５Ｍ　ＮａＣｌにて平衡化したセファクリルＳ−２００８Ｒ バイオプロセスカラム（Ｐｈａｒｍａ　−ｃｉａ　、　Ｕｐｐｓａｌａ　、　Ｓ ｗｅｄｅｎ）　（２５ｘ　６０ｃｍ）　（流速４Ｌ／時間）に４　’Ｃにて負荷 した。第１のピークは、凝集ｒＣＤ　４−ｄｇＡ　（１５０ｋＤａ　）を含み、 第２のピークはｒＣＤ４−ｄｇＡ　（８０ｋＤａ　）　、および第３のピークは ｄｇＡ（３０ｋＤａ）を含んでいた。

ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体を１−２　ｍｇ／ｍｌに濃縮し、０．２２ｍμ処分可能 フィルタを通したろ過によって除菌した。

試料を、エンドトキシン非含有バイアル（Ｗｈｅａｔｏｎ血清ボトル、５ｏｕｔ ｈｌａｎｄ　Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃｓ、　Ｃａｒｒｏｌｌｔｏｎ、　ＴＸ）にバイ アルあたり１０および２０ｍｇの分別量を入れ、ラミナーフローフード（ｌａｍ ｉｎａｒ　ｆｌｏｗ　ｈｏｏｄ　）中にて封止した。該バイアルを直ちに−７０ ’Ｃにて急速凍結してこの温度にて活性の変化なしに１年間保存した。

７、ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の分析 記述したように、無細胞ウサギ赤血球アッセイ、Ｈ１■＝感染Ｈ９細胞アッセイ （９５）　Ｄａｕｄｉ細胞の結合および殺傷（９２，９４）　、５ＯＳ−ＰＡＧ Ｅ　（９４）、Ｌｉｍｕｌｕｓ　ａｍｏｅｂａ溶解物（ＬＡＬ）アッセイ、マウ スにおけるＬＤ、。測定、血中からの消去、およびマウス中の組織反応性を実施 した。

ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の相対結合値（対非−接合ｒＣ組換えｇｐｌ　２０　（ Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ、　、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）２μ ｇ／穴を用いて４°Ｃにて一夜被覆し、次いでアルブミンの１００μｍを用いて 室温下、３時間で封止した。種々の濃度のｒＣＤ４−ｄｇＡまたはｒＣＤ４　（ ３−１００ｎｇ／ｍｌ）を１００μｍ中に加え、該プレートを室温にて２時間イ ンキュベートした。ｇｐ１２０−被覆穴に対するｒＣＤ４誘導体の結合を、西洋 ワサビペルオキシダーゼ−標識抗−ＣＤ　４　（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ 、、　５ａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、　ＣＡ　）およびテトラメチルベンジジン／ 過酸化水素基質を用いて測定した。吸光度を、ＥＬＩＳＡプレート読取装置（Ｂ ｉｏｒａｄ、　５ｏｕｔｈ　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡ）により、４５０ｎｍフ ィルタを用いて記録した。

各試料について、吸光度をｒＣＤ４濃度（ｎｇ／ｍｌ）に対してプロットするこ とにより、線形の回帰曲線が作られた。試料（ｒＣＤ４−ｄｇＡ）の線形曲線の 勾配値を標準（ｒＣＤ４）について除することによって、ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合 体の相対結合値を計算した。ｄｇＡ　−Ｓ　ＨによるｒＣＤ４−ｄｇＡ接合の動 力学を、０．７５　ｘ　６０ｃｍ（１７）ＴＳＫ３０００ＳＷカラム（Ｓｐｅｒ ｈｏｇｅｌ　、Ｌ　Ｋ　Ｂ、　Ｂｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上の高速液体クロ マトグラフィー（ＨＰＬＣ）を にかけることにり追った。ｒＣＤ４−ＭＰＴとｄｇＡ　−ＳＨとの混合後、種々 の時間間隔をもって０．２ｍ分別量を取出し、ＨＰＬＣにより流速１ｍｌ／分に てＰＢＥ中で分析した。ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の増大する百分率を時間（時） に対してプロットし、該曲線を最大量のｒＣＤ４−　ｄｇＡ接合体を生成するイ ンキュベーション時間を決定するために使用した。

少量の高度に精製したｒＣＤ４−ｄｇＡを調製するために、ブルーセファロース およびセファクリルＳ−２００ＨＲクロマトグラフイーによる精製後に得られた ｒＣＤ４−ｄｇＡ調製物の分別量（２ｍｌ）を、更に３０ｍｇの蛋白質を処理で きる調製用ＴＳＫ　Ｇ３０００ＳＷカラム（ＵＩｔｒｏｐａｃ、　Ｌ　Ｋ　Ｂ、 　Ｂｒｏｍｍａ、Ｓｗｅｄｅｎ）（２，Ｉｘ　６０　ｃｍ＞上で３ｍ１／分の流 速によりＨＰＬＣにかけた。高度に精製されたｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体を４°Ｃ にて無菌的に保持した。

ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の大規模調製は、一般的にはＳＭＰＴを交差−リンカと して用いたｒＣＤ４−ｄｇＡの少量調製について既に記述した方法と同様である （９２）。

カップリング方法の臨界的段階は、図１０に示すように、ｒＣＤ４−ＭＰＴと還 元ｄｇＡ　−Ｓ　Ｈとのインキュベーション時間である。カップリング反応は、 ４８時間後に完了することが分かる。インキュベーション時間を７２時間まで延 長すると〔イムノトキシン（ＩＴ、）の調製について推奨されているように（６ ６）　）　、凝集ｒＣＤ４−　ｄｇＡの割合か増大し、従って８０ｋＤａのｒＣ Ｄ４−ｄｇＡの収率および純度を低減する。ｒＣＤ４分子に導入されるＭＰＴ基 の平均数は、１．０〜１．５の範囲（平均２．１±０．３）であり、少なくとも ３分の１のｒＣＤ４分子かＳＭＰＴによる処理後、一つのジスルフィド基をもっ て作用に利用可能なものの一方のみを有する新たに還元されたｄｇＡ　−Ｓ　Ｈ と反応し得る。

この反応は、図９に示すように、ｒＣＤ４−Ｓ−３−ｄｇＡ接合体形成を導く。

２個のＭＰＴ基により誘導されたｒＣＤ４がｄｇＡと反応する場合、高分子量（ Ｍｒ）の接合体〔例えば（ｒＣＤ４）（ｄｇＡ）２　）か形成される。

ｒＣＤ４を、中程度に過剰なＳＭＰＴ（３，５モルＳＭＰＴ１モルｒＣＤ４）に より処理することにより、いくらかのｒＣＤ４分子が誘導されず、従って還元ｄ ｇＡと反応出来ない。実際、還元型チオプロピルセファロース（Ｓｅｒｖａ　、 　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　、　ＭＯ）上のｒＣＤ４−ｄｇＡのクロマトグラフィー により、約２５％のＳＭＰＴ−処理ｒＣＤ４は、カラムに結合せず、このｒＣＤ Ｊ分画が、ＭＰＴジスルフィド基を何ら含んでいなかったことか示された。この 理由のため、それはブルーセファロースクロマトグラフィー後に回収され、別の 接合について更に使用することができる。

ＳＭＰＴによる誘導、およびセファデックスＧ−２５によるＰＢＥ中Ａルろ過後 、該ｒＣＤ４−ＭＰＴは、トウィーン２０無しでＰＢＥ中に可溶であり、従って 、この洗浄剤は接合および精製処理においては必要でない。

接合のために使用するＰＢＥのｐＨおよびイオン強度も、また、ｄｇＡ　（遊離 またはｒＣＤ４に結合）とブルーセファロースとの相互作用を許容し、従って、 透析工程は、接合体の精製前に必要でない。

３、クロマトグラフィー系の設計と操作ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の精製（図９） に加え、ｒＣＤ４−ＭＰＴおよびｄｇＡ　−Ｓ　Ｈの調製は、イムノトキシン類 の大規模調製について記述されているように工程制御装置により制御された自動 回路に組込まれた４種のファルマシアバイオプロセス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂ ｉｏｐｒｏｃｅｓｓ）カラムの使用を含む。該クロマトグラフィー系は、種々の 濃度のＮａＯＨｃｏ、　１−０．２５　Ｍ）を用いた推奨される浄化およびｕｔ 棄工程に適合している。カラム中への粒子の侵入してろ過される。緩衝溶液類は 、ベルサフロウ（Ｖｅｒｓａ−ｆｌｏｗ）カプセルフィルター（０，４５，ｍμ ）　（Ｇｅｌｍａｎ、Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ　、　Ｍ　Ｉ　）を通してＷａｔｓｏ ｎ−Ｍａｒｌｏ＊　５０１　Ｕポンプにより、冷却箱中においてクロマトグラフ ィー系と共に４°Ｃに保持された滅菌的エンドトキシン非含有の円筒状ポリペプ チド槽（１１４Ｌ）　（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕ ｒｇｈ、　Ｐ　Ａ　）中に圧送される。これらのリザーノくから、冷却され、窒 素−フラッシュされた緩衝溶液類か他の同様なポンプによってクロマトグラフィ ー系に圧送される。興味ある蛋白質画分は、やはり冷却箱中に保持されたＣＨ２ 濃縮器中に直接に回収される（９４）。

４、クロマトグラフィー的分離能 過剰量のＤＴＴまたはＭＰＴ　（ＳＭＰＴ）からの蛋白質の分離は、セファデッ クスＧ−２５カラムに５００ｍ１（該カラムのベッド体積の３％）を越えない体 積て負荷した場合に良好な効率をもって達成された。このことは、ｒＣＤＪ中の 痕跡量のＭＰＴ　（ＳＭＰＴ）およびｄｇＡ中のＤＴＴが低い収率の原因となる ため重要である。

ブルーセファロースの使用は、はとんどすべての未反応ｒＣＦ４の除去を生じ、 一方セフアクリルＳ−２００ＨＲ上の最終クロマトグラフィ一工程は、ｄｇＡか らのｒＣＤ４−ｄｇＡの明確な分離を生じたが、Ｍｒが８０ｋＤａを越えるｒＣ Ｄ４−ｄｇＡ分子からの分離は不完全であった（図１１）。従って、図１２に示 したようにｒＣＤ４−ｄｇＡの最終調製物の純度は９０％であり、高Ｍｒ接合体 、いくらかの遊離のｒＣＤ４および痕跡量のｄｇＡを共に含んでいる。７５ｋＤ ａおよび９７ｋＤａを有する２つの電気泳動バンドのそれぞれは、１分子のｄｇ Ａ鎖に結合した１分子のｒＣＤ４を含むことに注意すべきである（９２）。ｒＣ Ｄ４−ｄｇＡの純度は、調製用カラム上でのＨＰＬＣによる追加の精製により改 善でき、これは高Ｍｒ接合体および遊離ｄｇＡのほとんど全てを除去する。

残念なから、利用可能な大きさのＨＰＬＣカラムは、１００ｍｇ１５時間以上の 精製ができず、従ってこの方法は大規模方法には使用できない。

５、収率 約２５％のｒＣＤ４か分子に導入されるジスルフィド基を持たず、また同じ割合 のｒＣＤ４が多分１分子あたり１個以上のＭＰＴ基を含むという事実を考慮する と、ｒＣＤ４−ＭＰＴ（１個のＭＰＴ基を含む）とｄｇＡ　−ＳＨとの接合体の 理論収率は、約５０％である。ｒＣＤ４−３−３−ｄｇＡ形成の百分率をＨＰＬ Ｃ（図１０）により追跡すると、それは最大３０％を示す。共に濃縮工程が続い て行なわれる２回のクロマトグラフィ一工程の後（ブルーセファロースおよびセ ファクリルＳ−２００ＨＲ）、有意な量のｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体が、フィルタ ーへの蛋白質の吸着、あるいはら線カートリッジ濃縮器の使用容積のために失な われた。従って、最終収率は、反応に導入されたｒＣＤ４または最初のｄｇＡよ り若干少ないものの２０％を越えることはなかった。最終のクロマトグラフィ一 工程で単離された遊離のｄｇＡ（ｒＣＤ４と未反応のもの）は、最初のｄｇＡの 約２５％であり、これは更に別の接合において使用可能である。

６、ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の性質 大規模方法により得られるｒＣＤ４−ｄｇＡ調製物の定常的検査は、表ＩＶに表 されるアッセイを含む。ＧＬＰ−拡大規模方法により得られたｒＣＤ４−ｄｇＡ は、無菌的であり、極微量のエンドトキシンを含んでいた（　ＦＤＡによる限界 値の１００倍少ない量）。他の性質は、既に報告した小規模方法により調製され たｒＣＤ４−ｄｇＡのものと対比できるものであった（９２）。

Ｄ、議論 前述の例により示されたように、ＳＭＰＴ交差−リン力を用いたｒＣＤ４−ｄｇ Ａ接合体の調製は、実験的な目的で少量（ｍｇ）を調製するために用いた手法に 比較して、調製物の収率、純度または生物学的活性を損うことなくダラム量の接 合体を得へく拡大することができる。ｒＣＤ４−ｄｇＡの調製および精製に使用 したクロマトグラフィー系は、Ｆａｂ　’−ｄｇＡの調製に使用された系（９４ ）とある意味において対比可能であるが、より少ないクロマトグラフィ一工程お よびより単純化された手法を使用している。この事実から明らかなように、重要 なことにエンドトキシンによる夾雑は、１０倍程低かった。ｒＣＤ４−ｄｇＡ調 製物中の不純物（約１０％）は、追加の調製用ＨＰＬＣによるこれらの不純物の 除去後にも、何ら有意な活性（ＩＣｓ。）の上昇が記録されなかったことから、 細胞毒性活性を低減していなかった。

マウスにおける該接合体のＬＤ、。（９１μｇ／ｇマウス）は、ヒトにおける６ 　００　ｍｇ／ｍ”、例えば７０ｋｇの患者あたり約１ｇのｒＣＤ４−ｄｇＡと 同等であろう。この↓ マウスに対するｒＣＤ４−ｄｇＡの比較的低い毒性　／μｇ／ｇ）は、そのＨＩ Ｖ−感染Ｈ９ヒト細胞に対する有望な細胞毒性（ＩＣ，。＝Ｉ　Ｏ−”　Ｍ）お よびクラスＩＩ抗原との相互作用の欠如と組合せて、ｒＣＤ４−ｄｇＡがＡＩＤ Ｓ患者の治療用の安全かつ特異的薬剤であることを示唆している。更に、そのマ ウス循環系における長い半減期に加えてｒＣＤ４−ｄｇＡのインビボにおける良 好な安定性は、該接合体が臨床的に有用であろうことを示している。

本発明の組成物および方法を好ましい実施態様をもって記述したが、当業者には 本発明の概念、精神および範囲を離れることなく、ここに記述された組成物方法 および方法における工程あるいは工程の配列に対して変法が適用できることは明 らかであろう。更に特定的には、化学的および生理学的に関連するある試剤をも って、ここに記述された試剤を置換してもよく、これにより同等または類似した 結果か達成されるであろうことも明らかである。当業者にとって明らかな、かか る類似の置換および修飾のすべては、添付された請求の範囲により定義される発 明の精神、範囲および概念に包含されるものとみなされる。

文献 以下に掲げる文献は、ここにおいて使用する方法論、技術および／または組成物 に関して補充し、説明し、背景を示し、あるいは教示する範囲において参考とし て取２、Ｐｏｐｏｖｉｃｅｔａ！、　（１９８４）、　５ｃｉｅｎｃｅ、２２４ ５００゜ ６　１　０　；　Ｆａｕｃｉ、１ｂｉｄ、、ｐ、　６　１　７　。

１６、５ｔａｈｌ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）　、Ａｍ、Ｊ、Ｍｅｄ、、　７３ 　：ｌ　７１゜ １７、　Ｖｉｌｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８４）　、Ｌａｎｃｅｔ、±ニア　 ５３゜ １８、　Ｋｏｅｎｉｇ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）　、５ｃｉｅｎｃｅ　、２３ ３：１０８９゜ １９、　Ｌｅｖｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　、ＶｉｒｏＬｏｇｙ、１４７　 ：４４　ｌ。

２０、　Ｓｉｅｇｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８５）　、Ｊ、Ｃｌ１ｎ、［ｎｖ ｅｓｔ、。

７５：１９５７゜ ２１、　Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ−Ｒｕｎｄｌｅｓ　ｅｔ　ａｔ、（１９８３）　 、Ｊ。

Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、３　：　ｌ　５　６　。

２２、　Ｍｏｄｒｏｗｅｔａｌ、（１９８７）、Ｊ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ。

６１　（２）　：５７０゜ ２３、ヨーロッパ特許公開番号環０．３１４，３１７Ａ　１号２４、Ｃａｐｏｎ 　ｅｔ　ａｌ、米国特許出願番号第１０４．３２９号、１９８７年１０月２日出 願 ２５、Ｃａｐｏｎ　ｅｔ　ａｌ、米国特許出願番号第２５０，７８５号、１９８ ９年９月２８日出願 ２６、Ｖｉｔｅｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　、　５ｃｉｅｎｃｅ　、 　２３８：１０９８　；Ｂｌａｋｅｙｅｔａｌ、（１９８６）、　Ａｄｖ。

Ａｌｌｅｒｇｙ；　Ｐａ５ｔａｎ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　、土ユニ　６ ４１゜２７、米国特許出願番号第１５５．３３６号、１９８８年２月１２日出願 ２８、米国特許８願番号第３２３，４８６号、１９８９年３月１４日出願 ２９、Ｌａｎｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　ｒｍｍ ｕｎｏｌ、、。

３３、Ｅｎｇｌ、ｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８１）　、　Ｊ、　［ｍｍｕｎ ｏｌ、　。

１２７：２１２４ ３４、　５ｐｉｔｚ　（１９８２）、　Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、　、１２９：３ ９、Ｋｒｅｎｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８２）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ。

４１、Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８４）　、　Ｎａｔｕｒｅ　 ［Ｌｏｎ−ｄｏｎ］、３１２ニア６７゜ ４２．　ＭｃＤｏｕｇａＩ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　、Ｊ、Ｉｍｍｕｒ＋ｏ １．　。

１３５：３１５１゜ ４３、　ＭｃＤｏｕｇａｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）、５ｃｉｅｎｃｅ、２ ３　１４７、　Ｅｐｓｔｅｉｎ　（＋９８５）、ＡＩＤＳＲｅｓ、、１　：４４ ７゜７２５゜ ５７、　Ｍｉｔｓｕｙａｅｔａｌ、（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ、３２５　：５ ９、　Ｔｈｏｒｐｅ　ｅｔ　ａｌ、（１９８５）　、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、。

１７０４−１７０７゜ ・　２６１８−２６２５゜ ：　５９２４−５９３　１゜ ２１６：７３１゜ ｅｄｉｔｉｏｎ、（１９８０）　、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｃｏｍｐ ａｎｙ。

ｅｄｉｔｅｄ　ｔｏｙ　０ｓｌｏ　ｅｔ　ａｌ、。

７１、　Ｋｎｏｗｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、。

１２０：４４０−４４３゜ ７２、　Ｄｕｎｃａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８３）、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ 、。

１３２　・　６８゜ ７３、　Ｅｌｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９５９）、Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ 。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、８２　：　７０　； Ｆｕｌｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、（１９８６）、Ｉｍｍｕｎｏｌ、、Ｉ　３　６　： ３１０３゜ ７４、　Ｐｒｅｓｓｅｔａｌ、（１９８６）、ｒｍｍｕｎｏｌ、Ｌｅｔｔ、。

１４：３７゜ ７５、　Ｓｍ１ｔｈ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　、５ｃｉｅｎｃｅ　、２３８ 　：１７０４゜ ７６、　Ｉｃｅ。は、ＤＮＡまたは蛋白質合成を５０％低減する接合体の濃度で ある。

７７、接合体の毒性を評価する通常の方法は、細胞を（”］　ロロインまたは（ ”Ｓｌメチオニンによりパルス−標識することである。このことは、ミクロタイ タープレートを遠心し、細胞をそれらの標識前に欠損培地に再懸濁することを必 要とする。安全のために、これはＨＩＶ−感染細胞を用いて行なってはならない 。従って、〔３Ｈ１チミジンが標識に使用された。

７８、　Ｌａ５ｋｙ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８６）　、　５ｃｉｅｎｃｅ　、２ ３３８０、　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　、ｒｍｍｕｎｏｌ 、　Ｌｅｔｔ、。

１７：１５９−１２０゜ ８１、　Ｂｌａｋｅｙ　ｅｔ　ａｌ、（１９８８）　、　Ｐｒｏｇｒｅｓｓｓ　 ｉｎＡｌｌｅｒｇｙ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｔｈｅｒａｐ ｙ）、　（Ｈ。

Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ｅｄ、）　ｐｐ、　５０−９０　、　ｌ（ａｒｇｅｒ、　Ｂ ａ５ｅｌ。

Ｓｗｉ　ｔｚｅｒｌａｎｄ。

８２、　Ｄｏｙｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　（１９８７）　、　Ｎａｔｕｒｅ、３３０ 　：２５６−２５９゜ ６３９６−６４０３゜ ８７、　Ｕｈｒｅｔａｌ、、　Ｕ、Ｓ、　Ｐａｔｅｎｔ　４．　６６４．　９１ １゜１ｓｓｕｅｄ　Ｍａｙ　１３．　ｌ　９８７゜８８、　Ｖｉｔｅｔｔａ、　 Ｅ、（１９８８）、　Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、　、　１３６：１８８０−１８８７ ゜ ８９、　Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、（１９８７）　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８４　：５６４０−５６４４゜９０、　Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａ ｋ　ｅｔ　ａｌ、（１９８７）　、ｉｎ　ｒｍｍｕｎｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ：　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ　ｉｎ　Ｒａｄｉｏ−ｉｍａｇｅ ｒｙ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　、ｅｄ、Ｃ，Ｗ。

Ｖｏｇｅｌ、０ｘｆｏｒｄ　Ｕ、Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ、２８−５５　。

９３、　Ｓｉｍｍｏｎｓ、Ｐ、Ｌ、（１９８７）　ｉｎ：　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ ｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｔｈａｎｓｆｅｒ、Ｔ ａｍｐａ、Ｆｌｏｒｉｄａ。

４６９−４８１゜ ９７、　Ｋａｌｙａｎａｒａｍａｎ、ｅｔ　ａｌ、（１９９０）　、Ｊ、ＡＩＤ Ｓ　。

＋１６６−１１６８． １００、　Ｉｂｅｇｂｕ、ｅｔａｌ、（１９８９）、Ｊ、［ｍｍｕｎｏｌ、。

１４２：２２５０〜２２５６゜ １０１、　０ｈｎｉｓｈｉ、ｅｔ　ａｌ、　（１９９０）　、　Ｃａｎ、　Ｒｅ ｓ、　、　５０：１１．０７−１１．１２゜ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、ＩＡ ＋０　２０　３０　４Ｃ１５０６０７０溶出体稽（ｍｏ 凄出体ｆ１　（ｍＬ） ［璽Ｃ１１［ ２０４０６０８０ｔｏ。

溶出体積（ｍｏ ２８ｏ０ｍ、、、　ｒ厘ｃ、ＩＩＩ Ｆ■（，２ ＦＩＧ、１２ ゝｌ−１５０ 対照の百分率 対照の百分率 対数濃度（Ｍ） ＦＩＧ、４Ａ Ｆ璽（Ａｌ１ ＦＩＧ、４［ 対数Ｊ度（Ｍ） ｒｃＤ４ｉ１度（ｎｇ／ｍｌ） １ＩＩｌｌｌの百分率 −１２・Ｉ＋−１０−９−８・７ 対数Ｊ度（Ｍ） ０．５１２　４　６　８ 時間 ｒＣＤ４−ｄｇＡ接合体の百分、　ＦＩＧＷＩＯＦＩＧ、１５ モル濃度 ８出体稽（ＬＩ Ｆ−Ｇ、１１７ ２８０ｎｍの吸光度 溶出体積（Ｌ） Ｆ■Ｇ、１１１３ 阻害百分率　Ｆ−〇、１橿ト 手続補正書（自発） ｌ″ｌｆｆ４’ｊ５１２５Ｂ３

Claims (28)

【特許請求の範囲】
1. １．ｇｐ１２０結合性リガンド接合体と、それに結合されるトキシンＡ鎖または その誘導体を含むトキシン分子を含んでなり、前記ｇｐ１２０結合性リガンドは 長さにおいて約１２から約１１０個までのアミノ酸のペプチドを含んでなる物の 組成物。
2. ２．該ｇｐ１２０結合性リガンドが、ＣＤ４の領域１のｇｐ１２０結合性リガン ド領域を少なくとも含むＣＤ４ペプチド、またはその生物学的な機能同等物を含 んでなる請求の範囲１項に記載の組成物。
3. ３．該ｇｐ１２０結合性リガンドが、ＣＤ４の領域１を含んでなる請求の範囲２ 項に記載の組成物。
4. ４．該ｇｐ１２０結合性リガンドが、長さにおいて約１２から約２５個のアミノ 酸のペプチドを含んでなる請求の範囲１項に記載の組成物。
5. ５．該ＣＤ４ペプチドが、クラスＩＩ結合性部位を含まない請求の範囲２項に記 載の組成物。
6. ６．該ｇｐ１２０結合性リガンドが、ＣＤ４のアミノ酸４１から５７までを含む 構造のペプチドまたはその生物学的な機能同等物を含んでなる請求の範囲４項に 記載の組成物。
7. ７．該ｇｐ１２０結合性リガンドが、前記アミノ酸配列を有するペプチドから基 本的に構成される請求の範囲６項に記載の組成物。
8. ８．該ペプチドとトキシンＡ鎖との間に配置されるスペーサ領域を更に含む請求 の範囲７項に記載の組成物。
9. ９．該スペーサ領域が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはＨＳＡを 含んでなる請求の範囲８項に記載の組成物。
10. １０．該結合性リガンドが、そのカルボキシ末端に配置された２から１０個まで のアミノ酸を更に含む請求の範囲１項に記載の組成物。
11. １１．該結合性リガンドが、カルボキシ末端システィン残基を含む請求の範囲１ 項に記載の組成物。
12. １２．該ｇｐ１２０結合性リガンドがトキシン分子に対してジスルフィド結合を 含むリンカを介して接合される請求の範囲１項に記載の組成物。
13. １３．該ｇｐ１２０結合性リガンドが、トキシン分子に対してＳＭＰＴリンカを 介して接合される請求の範囲１２項に記載の組成物。
14. １４．該トキシン分子がリシンＡ領分子を含んでなる請求の範囲１項に記載の組 成物。
15. １５．該リシンＡ鎖分子が切断リシンＡ鎖分子を含んでなる請求の範囲１４項に 記載の組成物。
16. １６．該トキシン分子が、脱グリコシル化リシンＡ鎖を含んでなる請求の範囲１ 項に記載の組成物。
17. １７．各トキシン分子に対して１から５個のｇｐ１２０結合性リガンドが接合さ れる請求の範囲１項に記載の組成物。
18. １８．リシンＢ鎖部分を更に含む請求の範囲１項に記載の組成物。
19. １９．請求の範囲１項から１８項までのいずれか１項に記載の組成物の、治療的 有効量を、医薬的に許容される希釈剤との組合せにおいて含む医薬組成物。
20. ２０．ＨＩＶ−感染細胞を含む細胞母集団に、ＨＩＶ−感染細胞を選択的に殺す に有効な量の請求の範囲１項から１９項までのいずれか１項に記載の組成物を作 用させることを含んでなるＨＩＶ−感染細胞を選択的に殺す方法。
21. ２１．トキシン分子に接合するｇｐ結合性リガンドを含む抗−ＨＩＶ組成物を調 製するにあたり、工程；ｇｐ１２０結合性リガンドを得； 前記リガンドを選択したリンカを用いて誘導し；トキシンＡ鎖またはその誘導体 を得； 前記トキシンＡ鎖または誘導体を還元条件に付して還元されたトキシン部分を得 ； 前記誘導結合性リガンドを前記還元トキシン部分と共に７２時間未満の時間イン キュベートして結合性リガンドートキシン接合体を形成し；および該結合性リガ ンドートキシン接合体を精製すること、を含んでなる調製方法。
22. ２２．前記ｇｐ１２０結合性リガンドが、ＣＤ４分子またはそのｇｐ１２０結合 性誘導体を含む請求の範囲２１項に記載の方法。
23. ２３．前記トキシンＡ鎖または誘導体が、リシンＡ鎖を含む請求の範囲２１項に 記載の方法。
24. ２４．前記リンカがＳＭＰＴを含む請求の範囲２１項に記載の方法。
25. ２５．該抗−ＨＩＶ組成物が、請求の範囲１項による組成物を含む請求の範囲２ １項に記載の方法。
26. ２６．誘導された結合リガンドおよび還元されたトキシン部分が、約２４時間イ ンキュベートされる請求の範囲２１項に記載の方法。
27. ２７．工程（ｆ）が、前記結合性リガンドートキシン接合体をブルーセファロー スにかけることを含む請求の範囲２１項に記載の方法。
28. ２８．大規模量が調製される請求の範囲２１項に記載の方法。