JPH03504802A - 特定のウイルス感染に対する細胞毒性剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特定のウィルス感染に対する細胞毒性側技術分野 本発明は一般的にはウィルス感染の防止に関する。より詳細には、本発明は特定 のウィルスに感染された細胞を選択的に殺す組換え融合タンパク質を発現するキ メラ遺伝子の構築：ヒト免疫不全ウィルスに対する活性結合部位を含むＣＤ４の 組換え可溶性一部切除体；そして実質的に長い半減期、結合活性、およびモノマ 一体に関して生体内でＨＩＶ惑染感染またはＨＩＶヴイリオンを殺すように天然 免疫系の成分に指示する能力を育する多価生成物に関する。ＨＩＶ感染細胞に対 して選択的細胞毒性を育するハイブリッド融合タンパク質が調製された。

発明の背景 有効な治療法がなく、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）に感染した個体の全て ではないにしろほとんどが後天性免疫不全症候群〔エイズ（ＡＩＤＳ））に進行 し、そして最終的には微生物の日和見感染と悪性腫瘍とを併発して死亡すると考 えられている。さらに、有効なワクチンがなく、感染した個体の数は実質的に増 加していると考えられている。

抗ウィルス剤、免疫調節剤および特定のＨＩＶ機能の阻害剤がエイズに関する高 い罹患率および死亡率を低下させるための可能性のある処置法として試験されて いる。

しかしながら、ＨＩＶ感染細胞を選択的に殺すことを目的とした利用可能な細胞 毒性剤はこれまで開発されていない。

ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の分岐菌種は全て表面のＣＤ４に結合することによ りヒトＴリンパ球に感染するから、ＣＤ４誘導体はエイズの治療に極めて適当で ある。

最近の報告には、ヒト免疫グロブリン重鎮定常領域配列に結合した可溶性ＣＤ４ を含む組換えタンパク質が記載されている（Ｃａｐｏｎ等、　Ｎａｔｕｒｅ　（ Ｌｏｎｄｏｎ）　８３７．５２５−５３１）。

しかしながら、分子は補体成分Ｃ１を結合せず、そしてＨＩＶＪＩ染細胞または ヴイリオンに対する活性は存在しなかった。本発明のハイブリッドタンパク質は これまで知られておらず記載もされていない特性を有する。

ＣＤ４は、後天性免疫不全症候群の原因であるヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ ）に対するレセプターの必須成分として作用するヒトヘルパーＴリンパ球の不可 欠な膜糖タンパク質である（Ｐｏｐｏｖｊｃ等、　１９８４．　ＣＬｉｎ、　Ｒ ｅｓ、　３３゜５６ＯＡアブストラクト；およびＭａｄｄｏｎ等、　１９８６． 　Ｃｅ１ｌ　４７、　＄３３−３４８）。ＨＩＶ結合および細胞との融合は標的 細胞表面でのウィルスエンベロープ糖タンパク質の外ｍサブユニット（ｇｐ　１ ２０）とＣＤ４との特異的な相互作用により媒介される［ＭｃＤｏｕｇａｌ等、 　１９８６．５ｃｉｅｎｃｅ　２３１゜３８２−３８５；　５ｏｄｒｏｓｋｉ等 、　１９８６．　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　　３２２゜４７０−４７４ 　、およびＬｕｎｄｉｎ等、　　１９８７．　Ｊ、　　Ｉｔｘｗｒｕｎｏｌ、　 Ｍｅｔｈｏｄｓ９７．９３−１００１　　。

最近の研究から、ＣＤ４分子およびその他の種からの対応物の構造についての相 当な洞察が得られた。ヒトＣＤＮＡから推定される一次配列（Ｍａｄｄｏｎ等、 　１９８５．　Ｃｅ１１４２、９３−１０４）およびＮ末端タンパク質配列分析 から推定される一次配列（Ｆｉｓｈｅｒ等、　１９８Ｂ、　Ｎａｔｕｒｅ、３８ Ｌニア６−７８＞は、プロセシングされた分子がアミノ酸４３３個の長さであり 、長いＮ末端の細胞外領域、それに続（トランスメンプランセグメントおよびＣ 末端細胞質尾部を有することを示す。外部領域は、著しい配列相同性および二次 構造の特徴を免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと共有するアミノ酸残基１００個 のＮ末端ドメインを含む。

外部領域の残部（２７０残基）は免疫グロブリンファミリーと構造的な関連を示 す３つの付加的なドメインからなるようにみえる（Ｃｌｅｒｋ等＋　１９８７． 　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４．１６４９−１６５３）。ＣＤ４遺伝子内の８つの領域 に対するコード配列を分断するイントロンの発見（Ｌｉ　ｔｔｍａｎ、　Ｄ、Ｒ ，、１９８７，Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　ＩｒｎｍｕｎｏＬ、　５．５６１−５８ ４）は構造的およびおそらく機能的ドメインの上記認識を支持する。第１、第２ および第４外部ドメイン内の内部ドメインジスルフィド結合をおそらく結合する システィン残基の保存された対の存在が特に興味深い（Ｃ１ａｓｓｏｎ等。

１９８６、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔｌｓＡ　８３ ．４４９９−４５０３）。

ｃＤＮＡ配列決定から推定されるこれらの構造的特徴は抗ＣＤ４モノクローナル 抗体（ｍＡｂ）のパネルを用いるエピトープ分析により補足された。そのような 研究は互いの、ＨＩＶ結合部位および細胞膜の種々のエピトープの位置関係を解 明した（Ｌｕｎｄｉｎ等、同上；　Ｒａｏ等、１９８１、　Ｃｅ１１．　／＋＋ ｍｕｎｏｌ　８０．３１０−８１９；および５ａｔｔｅｎｔａｕ等、　　１９８ ６．５ｃｉｅｎｃｅ　２３４．　１１２０−１１２３）　ｏ　しかしながら、Ｈ ＩＶエンベロープ糖タンパク質への結合に包含されるＣＤ４分子の領域はこれま で同定されていなかった。

発明の要約 それ故に本発明の目的は、細胞毒性に必須の領域を含有するタンパク質毒素配列 に結合した細胞のレセプター配列からのウィルス結合性領域を含むハイブリッド タンパク質の適当な発現ベクター内での合成を指示するキメラ遺伝子を提供する ことである。

本発明の別の目的は、ヒトＣＤ４分子のＨＩＶ結合性部分とシュードモナス外毒 素Ａ　（Ｐｓｅｕｄｏｒｒｒｏｎａｓ　ｅｘｏｔｏｘｉｎＡ）の活性領域とから なる単離された実質的に純粋な融合タンパク質を提供することである。

本発明のもう一つの目的は、ＣＤ４の最初の２つの免疫グロブリン様ドメインを 表現し、そして活性ＨＩＶ結合部位の免疫的および機能的特性を有する約１８０ 個のアミノ酸残基を含むポリペプチド分子からなる抗ＨＩＶ組成物を提供するこ とである。

本発明の目的はまた、モノマー可溶性ＣＤ４より高い親和性でＨＩＶ感染細胞の 表面上のｇｐ１２０に選択的に結合し、そして免疫系の成分（補体およびＡＤＣ Ｃ）にＨＩＶ感染と戦うように指示し得るマルチマーヒトＣＤ４免疫グロブリン 組換えタンパク質を提供することである。

本発明の別のもう１つの目的は、本発明の薬剤がヒトに投与されたとき、外米タ ンパク質と通常生じる熱免疫応答が最低限に抑えられるようなヒト配列だけを含 む抗ＨＩＶ薬剤を提供することである。

本発明のＺσの目的は、本発明のハイブリッドタンパク質により、ＨＩＶ感染細 胞を殺すか、またはＨＩＶ活性を中和する方法を提供することである。

さらに、ＨＩＶによる宿主細胞の感染を阻害するための本発明の一部切除Ｃ，Ｄ ４分子の有効量を、ＨＩＶ感染宿主に投与することからなる、ＨＩＶ感染を阻害 する方法を提供することも本発明の目的である。

本発明のもう一つの目的は、ＨＩＶ感染細胞を選択的に殺すための本発明の融合 タンパク質の有効量とＨＩＶ惑染感染を接触させることからなる、エイズウィル ス感染を防止する方法を提供することである。

本発明のその他の目的および利点は本明細書の以下の詳細な記載から明らかにな るであろう。

図面の簡単な説明 本発明の上記目的およびその他の目的ならびに態様および多くの利点は、添付し た図面を参照して以下の詳細な説明を読むとよりよく理解されるであろう。

図１はＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０を発現するのに使用されるプラスミドの模 式図である。

図２はＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０のカラムクロマトグラフィーの結果（図２ Ａ）およびゲル電気泳動の結果（図２Ｂ）である。

図３ハＣＤ　４　（１７８）　−ＰＥ　４０（７）ＨＩ　Ｖ！シンへ−ブタンバ ク質ｇｐ１２０への結合を共沈殿法（図３Ａ）および免疫蛍光顕微鏡法（図３Ｂ 、３Ｃ，８Ｄおよび８Ｄ）により示す図面である。

図４はＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質を発現する細胞上でのＣＤ４　（１ ７８）−ＰＥ４０の選択的細胞毒性効果を示す図面であろ： ４Ａ、組換えワクチニアウィルスによりコード化されたＨＩＶ−１エンベロープ 糖タンパク質を発現する細胞。

黒ヌリの記号は、チミジンキナーゼ遺伝子座内に挿入され、ワクシニア７．５に プロモータに連結されたＨＩＶ−Ｉｇｐ１６０遺伝子を含むワタシニア組換え体 ｖＰＥ−１６に感染させた細胞を示す。白ヌキの記号は、ワクシニア７．５にプ ロモータに連結され、そしてチミジンキナーゼ遺伝子座内に挿入されたバクテリ オファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む対照ワクシニア組換え体ｖＴＦ ７−３に感染させた細胞を示す。使用された毒素調剤は、Δ、ムＰＥ５Ｏ，・Ｐ Ｅ４０、口、■ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０である。

４Ｂ、ＨＩＶ−１に慢性的に感染させた細胞。黒ヌリの記号はＨＩＶ−１（ＬＡ Ｖ）ゲノムの単一組み込みコピーを含む８Ｅ５ヒトＴｍ胞系を示す。産生された ヴイリオンは逆転写酵素遺伝子における未熟な鎖停止突然変異により非感染性で ある。白ヌキの記号は親の感染されなかったＡ３．０１細胞系を示す。使用され た毒素調剤は、△、ムＰＥ５Ｏ，・ＰＥ４０、口、ｌｌＣＤ４（１７Ｂ）−ＰＥ ４０である。

図５はプラスミドｐ　ＣＤ　４　ｔの構築を模式的に示す図面である。プラスミ ドｐＴＫ７−５は唯一のＢａＩＩ旧部位により分断されたバクテリオファージエ フ遺伝子１０プロモータ（Ｐ　ｔｖ）およびＴ７ターミネータ（ＴＴ□）を含む 。この領域はワクシニアウィルスチミジンキナーゼ左合配列（ＴＫＬ）および右 側配列（ＴＫｍ）により両側を挟まれている。２つの部分的に相補的な合成オリ ゴヌクレオチド（ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＧＧＣＣＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴ ＣＧＡＣおよびＧＡＴＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＧＧＣＣＴＧＡＡ ＴＴＣ）を用いることにより製造されたアダプタは該アダプタのＢａｌＨＩ３’ 突出部を用いることによりｐＴＦ７−５のＢａＩＩ旧部位内に連結された。Ｂａ ｙ旧部位は所望の組換え体おいて破壊される。従って、反応混合物はＢａｒｒｒ 旧で消化されて挿入物を欠く再環化されるプラスミドを線状化し、そしてアンピ シリン耐性形質転換体が制限地図決定によりスクリーニングされて所望の配向に ある挿入物を含むものが同定された。プラスミドｐＥＢ−２はｌｃｏ　ＲＩおよ びＳｔｕ　Ｉのための唯一の部位を含み、３つの全ての読み枠における終止コド ンを供給するユニバーサル終止配列（ＵＴＳ）が上記部位に続き、次に唯一のＳ ａＬ　１部位が続く。所望されるＣＤ４ＤＮＡ断片はｐＣＤ４−０２Ｍ４をＮｈ ｅ　Ｉ　　（ＣＤ４　ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド６７８位の単一部位でプラス ミドを切断する）で消化し、次にＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片およびｄ ＮＴＰで互い違いの末端中に充填し、そして次にＥｃｏ　Ｒ１で消化することに より得られた。ＣＤ４のＡＴＧ開始コドンを含む生成する０、６８キロベースＥ ｃｏ　Ｒ１−Ｎｈｅ　Ｉ断片は、Ｅｃｏ　Ｒ１−５ｔｕ　１部位で消化されたｐ ＢＥ−２内に強制的にクローン化された。ベクター内のＳｔｕ　１部位は組換え 体において破壊される。従って、反応混合物はＳｔｕ　Ｅで消化され、そしてｐ ＣＤ４はアンピシリン耐性形質転換体の制限地図決定により同定された。ｐＣＤ ４のＤＮＡ分析は、ＣＤ４配列の最後のアミノ酸がプロセシングされた翻訳生成 物の１７７位のロイシンであり、そしてプロリンおよびアスパラギンの２つの追 加のＣ末端残基がベクター内のＵＴＳ配列の部分の翻訳から誘導されることを示 した。

図６は代謝標識された一時的発現物の分析の結果を示す図面である。一時的代謝 標識反応はｖＴＦ７−３で感染させ、そしてプラスミドｐＥＢ−２またはｐ　Ｃ Ｄ　４　ｒのいずれかでトランスフェクションさせた細胞内で行われ、そして培 地が集められた。免疫沈降のために、トランスフェクション培地１．１ｄ、プロ テアーゼインヒビター緩衝液０．９９−および２０％（容量／容量）ノニデット （Ｎｏｎｉｄｅｔ）　Ｐ　−４０を含有する反応混合物が調製された。プロティ ンＡアガロースの２０％（容量／容量）懸濁液０．１３−と４℃で１時間保温す ることにより試料を清澄化し、次に遠心分離を行った。上澄に以下のネズミのｍ Ａｂ　：ＭＴｌ　５１，０ＫＴ４およびＯＫＴ　４　Ａ（全て１ｇＧ、）の各々 ２μｇを添加した。−晩保温後、プロティンＡアガロースの２０％懸濁液０．０ ５１ｎ１を添加し、そして保温を回転機上４℃で３時間続けた。試料を遠心分離 し、そしてベレットと上澄を保存した。ベレットを洗浄し、そして８Ｍ尿素含有 の試料緩衝液０．　１−で処理し、そして一部の０．０９−をゲル電気泳動によ り分析した。（図６Ａ）全培地画分（０，０５ｒｄ）および放射免疫沈降後に残 る相当する上澄画分の１２％ゲル上での分析。列１および２はそれぞれｐ　ＣＤ 　４　ｒでトランスフェクションさせた細胞の全培地、相当する免疫沈降上澄で あり、列３および４はそれぞれｐＥＢ−２でトランスフェクションされた細胞の 全培地、相当する免疫沈降上澄である。（図６　Ｂ）　ｐ　ＣＤ　４　ｒでトラ ンスフェクションさせた細胞（列５）およびｐＥＢ−２でトランスフェクション させた細胞（列６）の培地からの免疫沈降物の１５％ゲル上での分析。左側の矢 印はＣＤ４断片バンドの位置を示し、そして中央の数字は分子量マーカーＣＭｔ 　Ｘ　１０−”として表現される）を示す。

図７はＣＤ４断片のエピトープ分析の結果を示す図面である。細胞はｖＴＦ７− ３での感染およびｐ　ＣＤ　４　ｒでのトランスフェクションの後ｌ″ＳＳ−シ ステイン謝標識した。培地を集めた。このトランスフェクション培地ｏ、５５ｍ ／、プロテアーゼインヒビター緩衝液０．５５−１２０％（容量／容量）ノニデ ットＰ−４００゜０７−および０．０２％（重量／容量）アジ化ナトリウム含存 リン酸緩衝化食塩水１．５８１ｎｌを含有する混合物が調製された。図２に示し たようにプロティンＡ−アガロースの２０％懸濁液０．２８−で混合物を清澄伍 し、そして一部の０．２７ｍｔ’（最初のトランスフェクション培地０．０５ｒ ｎｌを示す）を上記のｍＡｂｌμｇで処理した。４℃で一晩保温した後、マウス ＩｇＧに対するウサギ抗血清の飽和量で予め被覆し、それにより異なるサブクラ スの抗体と結合するかもしれない問題を回避したプロティンＡアガロースの２０ ％（容量／容量）懸濁液０．０５ｍｔ’を各試料に添加した。試料を４℃で４時 間回転機上で保温し、そしてベレットを集め、洗浄した。それらを８Ｍ尿素含有 の試料緩衝液０．０９−中に溶解させ、そして１２％アクリルアミドゲルに注入 した。列１は全トランスフェクション培地（０，０５ｄ）、列２は対照ｍＡｂ　 （２Ｅ１２．１）で得られた免疫沈降である。免疫沈降は一式の抗ＣＤ４ｍＡｂ で得られた。列３．ＭＴ１５１；列４．Ｌｅｕ３Ａ；列５，０ＫＴ４　、列６． ０ＫＴ４Ａ；列７，０ＫＴ４Ｂ：列８，０ＫＴ４Ｃ；列９゜０ＫＴ４Ｄ、列１０ ．０ＫＴ４　Ｂ　、列１１，０Ｋ７４Ｆ。

分子量マーカーは左側に示されている（Ｍ＋　Ｘ　１０−”として表現される） 。

図８はＣＤ４断片とｇｐｔ２ｏとの相互作用を示す図面である。ｖＴＦ　７−３ での感染およびｐＣＤ４でのトランスフェクションの後代謝標識した細胞からの 培地がＣＤ４断片源として使用された。ｖＴＦ７−３＋ｖＰＥ−６で二重に感染 させた非標識または代謝標識細胞からの培地がｇｐ１２０源として作用した。分 子量マーカーは左側に示されている（Ｍ＋　Ｘ　１０−”として表現される）。

（図８Ａ）抗ｇｐ　１２０ｍＡｂを用いることによるＣＤ４断片とｇｐ１２０の 共沈殿。最初の反応混合物は上記培地の各々０．０７５ｍｍ’、プロテアーゼイ ンヒビター緩衝液０．０５−および２０％（容量／容量）ノニデツ）Ｐ−４０を 含む。単一および二重ウィルス感染培地の場合、標識培地１部と非標識培地１９ 部との混合物が使用された。室温（約２２−２５℃）で４時間の予備保温の後、 一部の０．１４−を除去し、そして上記のｍＡｂを添加した（抗ｇｐ１２０、ハ イブリドーマ９０２上澄０．１ｍｌ；抗ＣＤ４、ＯＫ”ｌ’４Ａ１μｇ）、免疫 複合体は、マウスＩｇＧに対するウサギ抗血清で予備被覆したプロティンＡ−ア ガロースで集められ、図７に示したように１２％ゲル上での電気泳動に供された 。

列１．トランスフェクション培地とｖＴＦ７−８＋ｖＰＥ−６二重感染培地を含 有する保温からの全反応混合物。免疫沈降は以下の添加物を含む反応から得られ た：列２．トランスフエクシヨン培地とｖＴＦ７−３＋ｖＰＥ−Ｇ二重感染培地 、抗体なし；列３，２．５％ウシ胎児血清、ｖＴＦ７−３＋ｖＰＥ−６二重感染 培地を含有する通常の培地、抗ｇｌ）１２０；列４．トランスフェクション培地 、２．５％ウシ胎児血清を含有する通常の培地、抗ｇｌ）１２０；列５．トラン スフェクション培地。

ｖＴＰ　７−３単一感染培地、ｇｐ１２０；列６．トランスフェクション培地、 ｖＴＦ７−３＋ｖＰＥ−６二重感染培地、ｇｐ１２０．列７．トランスフェクシ ョン培地。

２．５％ウシ胎児血清を含有する通常の培地、抗ＣＤ４゜（図８Ｂ）抗ＣＤ４ｍ ＡｂによるＣＤ４断片の免疫沈降のｇｐ１２０阻害。最初の反応混合物は代謝標 識されたトランスフェクション培地０．０５ｄ、プロテアーゼイ００．０１１ｎ Ｉおよび０．０２％（重量／容量）アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝化食 塩水０．０４−を含む。混合物に下記の非標識培地を補足し、そして室温で５時 間保温した。抗ＣＤ４ｍＡｂＯＫＴ４Ａ１０ナノグラムを添加し、そして４℃で 一晩保温を続けた。免疫複合体を集め、そして図６に示したように操作し、そし て１２％ゲル上に電気泳動した。初期保温の間に添加した補足培地は以下のとお りだった二列８，２．５％ウシ胎児血清を含有する通常の培地；列９．ｖＴＦ７ −３単一感染培地；列１０．ｖＴＦ７−３＋ｖＰＥ−６二重感染培地。

図９は本発明により製造されたＣＤ４免疫グロブリンハイブリツドタンパク質の 模式図である。

図１０はハイブリッドタンパク質の発現のための以下のプラスミドの構築に使用 された中間体プラスミドｐＣＤ　４　ＣＨ１の構築を模式的に示す図面である。

図１１はＣＤ４　（１０９）ＣＨを発現するｐｃＤ４１ＴＭＩＯおよびｐＣＤ４ １部ＭＩ　ＯＧの構築を模式的に示す図面である。

図１２はＣＤ４　（１７８）ＣＨを発現するｐｃＤ４１７Ｍ２０およびｐＣＤ４ １部Ｍ２０Ｇの構築を模式的に示す図面である。

図１３はＣＤ４　（３７２）ＣＨを発現するｐｃＤ４１ＴＭ３０およびｐＣＤ４ １部Ｍ３０Ｇの構築を模式的に示す図面である。

図１４はＣＤ４　（１８１）ＣＬを発現するｐＣＤ４１部Ｍ４０およびｐＣＤ４ 　ＩＴＭ４０Ｇの構築を模式的に示す図面である。

図１５ｉ１ＣＶ−１細胞内でＣＤ４　（１０９）ＣＨ，ＣＤ４　（１７８）ＣＨ およびＣＤ４　（３７２）ＣＨの発現を示す図面である。免疫複合体はＳＤＳポ リアクリルアミドゲル（１０％）電気泳動により５％β−メルカプトエタノール の存在下の還元条件下で分析された。列１゜３．５．７および９はそれぞれ、ｐ 　Ｅ　Ｂ　２　（Ｂｅｒｇｅｒ等。

１９８８、　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　８５ ．２３５７−２３６１）、ｐ　ＣＤ　４　Ｌ　Ｔ　Ｍ　１　（Ｍｉｚｕｋａｍｉ 等、　１９８８．　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＪＳＡ 　８５．９２７３−９２７７）　、り　ＣＤ　４１　ＴＭ　１０、ｐＣＤ４１部 Ｍ２０およびｐＣＤ４　ＩＴＭ３０によるＣＶ−１細胞のトランスフェクション により得られた培養培地の分析を示す。列２，４，６．８および１０はそれぞれ 、ｐＥＢ２、ｐｃＤ４ＬＴＭ１、ｐｃＤ４１ＴＭ１０、Ｉ）ＣＤ４１部Ｍ２０お よびｐＣＤ４１部Ｍ３０によるＣＶ−１細胞のトランスフェクションにより得ら れた細胞の抽出物の分析を示す。分子量マーカーは右側に示されている（単位は キロダルトン）。

図１６は非還元条件下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル（７，５％）により分 析されたＣＶ−１細胞内に発現されたＣＤ４　（１０９）ＣＨ，ＣＤ４　（１７ ８）ＣＨおよびＣＤ４　（３７２）ＣＨのパターンを示す図面である。列１，２ ．３．４および５はそれぞれ、ｐＥＢ２、ｐｃＤ４ＬＴＭ１、ｐＣＤ４１部ＭＩ 　Ｏ，ｐＣＤ４　ＩＴＭ２０およびｐｃＤ４ＩＴＭ３０によるＣＶ−１細胞のト ランスフェクションにより得られた細胞の抽出物の分析を示す。列６，７，８． ９および１０はそれぞれ、ｐＥＢ２、ｐｃＤ４ＬＴＭ１、ｐＣＤ４１部ＭＩ　０ １ｐＣＤ４１部Ｍ２１よびｐＣＤ４１部Ｍ３０によるＣＶ−１細胞のトランスフ ェクションにより得られた培養培地の分析を示す。

図１７はＣＶ−１細胞内でのＣＤ４　（１７８）ＣＨとＣＤ４　（１８１）ＣＬ の共発現を示す図面である。免疫複合体はＳＤＳポリアクリルアミドゲル（７， ５％）電気泳動により還元条件下（列１−４）または非還元条件下（列５−８） で分析された。列１および５はｐＴＭ３トランスフェクション細胞の培養培地の 分析を示し、列２および６はｐＣＤ４１ＴＭ２０Ｇ）ランスフエクション細胞の 培養培地の分析を示し、列３および７はｐＣＤ４１ＴＭ４０Ｇ）ランスフエクシ ョン細胞の培養培地の分析を示し、そして列４および８はｐＣＤ４１ＴＭ２　。

ＧとｐＣＤ４１ＴＭ４０Ｇとの二重トランスフェクション細胞の培養培地の分析 を示す。

図１８はＣＤ４　（１７６）ＣＨとＣＤ４　（１８１）　ＣＬテトラマー複合体 の構造を模式的に示す図面である。

図１９はＲＰＭ１８２２６細胞内でのＣＤ４（１０９）ＣＨ，ＣＤ４　（１７８ ）ＣＨおよびＣＤ４　（３７２）ＣＨの発現を示す図面である。免疫複合体はＳ ＤＳポリアクリルアミドゲル（７，５％）電気泳動により還元条件下（列１−８ ）または非還元条件下（列９−１６）で分析された。列１．９および２．１１は それぞれ非トランスフェクション細胞の培養培地および抽出物の分析を示し、列 ３，１１および４．１２はそれぞれｐｃＤ４１７Ｍｌ（ｌランスフエクション細 胞の培養培地および抽出物の分析を示し、列５，１３および６，１４はそれぞれ ｐＣＤ４１７Ｍ２０　）ランスフエクション細胞の培養培地および抽出物の分析 を示し、そして列７，１５および８．１６はそれぞれｐＣＤ４１７Ｍ３０　）ラ ンスフエクシタン細胞の培養培地および抽出物の分析を示す。

図２０はＣＶ−１ｈランスフエクシヨン細胞から分泌されたＣＤ４　（１７８） ＣＨおよび可溶性ＣＤ４（３７２）の結合特性の分析を示す図面である。列１− ６は可溶性ＣＤ４の分析を示し、列７−１２はＣＤ４（１７Ｂ）ＣＨの分析を示 す。培養培地は以下の抗体およびリガンドと保温され、そして各列で分析された 。列１および７（添加せず）、２および８（ｏＫＴ４）、３および９（ＯＫＴ４ Ａ）　、４および１０　（ｇｐ１２０）、５および１１　〔抗ヒトＩｇＧ　（Ｆ ｃ））　、６および１２（プロティンＡ−アガロース）。５ｏｌｃＤ４および１ ７８Ｈはそれぞれ可溶性ＣＤ４　（３７２）およびＣＤ４（１７８）ＣＨを示す 。

図２１はＲＰＭＩ８２２６）ランスフエクション細胞から分泌されたＣＤ４　（ １７８）ＣＨの結合特性の分析を示す図面である。培養培地は以下の抗体および リガンドと保温され、モして各列で分析された。列１　（ＯＫＴ４）、２　（Ｏ ＫＴ４Ａ）、３　（ｇｐ１２０）、４　　（抗ヒト１ｇＧ　（Ｆｃ））、５　（ プロティンＡ−アガロース）、６（抗ヒト重鎖）。１７８ＨおよびＩｇＬはそれ ぞれＣＤ４　（１７８）ＣＨおよび１ｇ軽鎖（λ型）を示す。

図２２はＣＶ−１細胞に共発現されたＣＤ４（１７８）ＣＨおよびＣＤ４　（１ ８１）ＣＬの結合特性の分析を示す図面である。ｐＣＤ４　ＩＴＭ２０Ｇおよび ９００４１７Ｍ４０Ｇの二重トランスフェクション細胞の培養培地は以下の抗体 およびリガンドと保温され、そして各列で分析された。列１（添加なし）、列２ 　（ＯＫＴ４）　、３（ＯＫＴ４Ａ）　、４　（ｇｐ　１２０）、５　（抗ヒト ＩｇＧ（Ｆｃ））、６　（プロティンＡ−アガロース）、７（抗ヒトに鎖）。１ ７８Ｈおよび１６１ＬはそれぞれＣＤ４（１７８）ＣＨおよびＣＤ４　（１８１ ）ＣＬを示す。

発明の詳細な説明 本発明の上記目的および種々のその他の目的ならびに効果は、特定のウィルス感 染された細胞に対する選択的毒性を有する組換え融合タンパク質をコード化する キメラ遺伝子により達成される。本発明の原理的な面は、毒素またはそれらの細 胞毒性部分がレセプタータンパク質（またはそれらの断片）に遺伝学的に付着し 、その結果、全てのウィルスは侵入のために細胞のレセプターに依存するから融 合タンパク質がウィルスに感染された細胞に結合するということである。ＣＤ４ は異なるタイプのＨＩＶにより要求される１つの上記のようなレセプターである 。本発明によれば、そのようなキメラ遺伝子はヒ）ＣＤ４分子のＨＩＶ−ｇｐ１ ２０結合性領域とヒト免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖分子の定常領域と からなる組換えハイブリッドタンパク質をコード化する。

従って、本発明は部分的であるが、必須のＣＤ４結合融合細胞毒性物により明ら かにされる。同様の原理がその他のウィルスに対しても当てはまる。

特記しない場合、本明細書で使用されている全ての技術および科学的用語は本発 明の属する技術の通常の熟練者により通常理解されているものと同様の意味を有 する。

本明細書に記載されている同様または等価のあらゆる方法および材料が本発明の 実施または試験において使用され得るけれども、好ましい方法および材料はここ で記載される。以下に記載される全ての刊行物は参照により本明細書に編入され る。特記しない限り、本明細書で使用されている技術は当業者に十分に公知の標 準的なものである。

本明細書で使用されている「実質的に純粋」という語は少な（とも８０％の純度 のモノマーハイブリッドタンパク質である生成物を意味する。

本明細書で使用されている「選択的」という語は本発明の融合タンパク質がその 他の細胞の活性に重大な影響を与えることなくＨＩＶ感染細胞のような細胞を優 先的に攻撃することを意味する。

下記の本発明の詳細な記載の第１部は特定のウィルス感染細胞を選択的に殺す組 換え融合タンパク質を発現するキメラ遺伝子の構築に関する。

下記の本発明の詳細な記載の第２部はヒト免疫不全ウィルスに対する活性結合部 位を含むＣＤ４の組換え可溶性一部切除体に関する。

下記の本発明の詳細な記載の第３部は実質的に長い半減期、結合活性、およびモ ノマ一体に関して生体内でＨＩＶ感染細胞またはＨＩＶヴイリオンを殺すように 天然免疫系の成分に指示する能力を存する多価生成物に関する。

第１部 材料および方法 ＣＤ４　（１７８）〜ＲＥ４０のための発現ベクターの構築 プラスミドｐＶＣ４０３を以下のように構築した。ｐＶＣ４０３はアミノ酸配列 データに基づく成熟ＣＤ４　（ＣＤ４　（１７８）参照〕の最初のアミノ酸１７ ８個とＰＥ（ＰＥ４０参照）のアミノ酸１−３および２５Ｂ−６１３をコード化 する融合遺伝子を有する。融合遺伝子はＴ７遅延プロモータの制御下にある。ｐ Ｖｃ４０３を有するＥ、　ｃｏｌｉ　ＢＬ　２１株（λＤＥ３）はＩ　ＰＴＧ誘 導下で融合タンパク質を発現するために使用された。Ｔ７ブロモータからのＢ− ラクタマーゼ遺伝子に向けての転写の方向は図１の黒ヌリ矢印で示されている。

丸で囲まれた数字はＣＤ４のアミノ酸であり、四角で囲まれた数字はＰＥのアミ ノ酸である。ＣＤ４　（１７８）配列の境界およびＰＥ４０配列の開始は図上部 に示されている。

ｐＶＣ４０３の構築 Ｔ７ブロモータに付着したＰＥ遺伝子の全長を有するプラスミドｐＶＣ４はＮｄ ｅｌおよびＡｓｐ７１８で切断し、そして成熟ＣＤ４の最初のアミノ酸１６個の コドンおよびＮｄｅｌとＡｓｐ７１８の粘着端を含む５２ｂｐリンカ−に連結し た。

この中間体プラスミド（ｐＶＣ４０１）は３個のＲｓａ　１部位を成熟ＣＤ４の 最初の１６個のコドンとＰＥ遺伝子の残部との間に有する。ｐＶｃ４０１をＲｓ ａ　ｌで部分的に切断し、次にＸｈｏｌで切断し、そして２．８Ｋｂ断片を単離 した。Ｔ７ブロモータ下流の成熟ＣＤ４の最初のアミノ酸１７８個ＣＣＤ４　（ １７Ｂ））とＰＥ４０との間に融合遺伝子を有するプラスミドｐｃＤ４ｓＰＥ４ ０ＴＭ１はＲ８ａｌとＸｈｏ　ｌで制限され、１．３Ｋｂ断片を単離した。

ｐｃＤ４ｓＰＥ４０ＴＭ１（７）構築を以下ニ示した。ｐｃＤ４ＳＰＥ４０ＴＭ １から（７）１．３Ｋｂ断片をｐＶＣ４０１からの２．８Ｋｂ断片と連結しプラ スミドＩ）ＶＣ４０３を製造した。このプラスミドは、その他の種々のＰＥ遺伝 子を導くのに使用され得るＣＤ４　（１７８）とＰＥ４０遺伝子との結合部にＮ ｄｅ１部位を有する。

ｐＣＤ４ＳＰＥ４０ＴＭＩの構築 ＣＤ、４のアミノ末端の２つの免疫グロブリン様ドメインを含む０　、　７０　 ｋ　ｂ　ＢｃｏＲ［−８ａ、１［断片はｐＣＤ４ｆから切り出され、そしてＭ１ ３ｍｐ１８にクローン化された。

生成する組換え７７一ジｍｐ１８ｃＤ４ＴＭ１をｄｕｔ−ｕｎｇ−株中で増殖さ せ、そして単鎖鋳型ＤＮＡを、ＣＤ４の１７８番目のアミノ酸であるアラニン残 基をコード化するコドン直後にヒスチジンとメチオニン残基をコード化するＮｄ ｅ［部位（ＣＡＴＡＴＧ）を含む３３ｍｅｒオリゴヌクレオチドＴＭ２１でアニ ール化した。第２の鎖合成の後、二本鎖ＤＮＡを野生型株に形質転換し、そして 突然変異クローンｍｐ　１８ＣＤ４ＴＭ２１をＮｄｅｌ消化により選択した。

融合タンパク質のための最後の発現プラスミドをより容易に得るために、中間体 プラスミドｐｃＤ４ＰＢ４０ＴＭＩを以下のように構築した。ＰＥ４０を含む１ ．２３ｋｂ断片は、ｐＶＣ８を８ｃｏＲ［で消化し、ＤＮＡポリメラーゼ１クレ ノー断片で粘着端に充填し、そしてそれをＸｂａ　ｆで消化することによりｐＶ Ｃ８から切出された。

断片をｐｃＤ４ＬＴＭ１　（３７２個のアミノ酸ＣＤ４のための発現プラスミド ）の５．２１ｋｂ断片と連結した。

断片はプラスミドを５ａｉｌで消化し、ＤＮＡポリメラーゼ■クレノー断片で粘 着端に充填し、そしてそれをＮｈｅｌで消化することにより得られ、ｐＣＤ４　 ＰＥ４０ＴＭＩを得た。このプラスミドから５．７２ｋｂＮｄｅ＋（部分的）− ＢｃｏＲＩ断片を切出し、そしてｍｐ　１８ＣＤ４ＴＭ２１の０　、　６９　ｋ 　ｂ　Ｎｄｅｆ　−ＥｃｏＲＩ断片と連結し、ｐＣＤ４ＳＰＥ４０ＴＭ１を得た 。このプラスミドはアミノ末端にＣＤ４の最初の１７８個のアミノ酸、次に２分 子を結合するのに使用されるＮｄｅ１部位から誘導されたヒスチジンとメチオニ ン残基、次いでカルボキシ末端のＰＥ４０配列からなるアミノ酸５４６個の融合 タンパク質を発現し得る。

プラスミドｐＶｃ４０３の寄託は、アメリカ合衆国。

２０８５２メリーランド、ロックヴイレ、パークロウン・ドライブ１２３０１の アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９８８年６月 ２９日に行い、寄託番号は６７７３９である。寄託物は寄託日から３０年間また は最後の寄託試料の請求日から５年のより長い方の間生存したまま保管され、も し生存していない場合は再寄託するであろう。そして法律に特に制限のない場合 一般に分譲される。特許および商標庁の長官は請求に応じて寄託物を利用するで あろう。

ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０の精製および特徴づけプラスミドｐＶｃ４０３を 有するＢＬ２１（λＤＥ３）をＬＢ培培地チアンピシリン１００μｇ／ｍｌ）と ともに３７°Ｃで増殖させ、１ｎＭイソプロピルＤ−チオガラクトシド（ＩＰＴ Ｇ）　で０Ｄｓｓｅ、、０．６＋：：誘導し、そして保温を３７℃で９０分間続 けた。細胞をベリプラズマとスフェロプラストに分画した。スフェロプラストを ＴＥ（５０ｍＭ）リスｐＨ８，０，１ｍＭ　　ＥＤＴＡ）中に懸濁し、１００ワ ツトで各々３０秒間超音波処理し、そして１１０００００Ｘで６０分間回転させ 、上澄（サイトプラズマ）とペレット（細胞封入体を含む）に分離した。局在実 験のために、ペレットをＴＥ中に懸濁し、そして種々のフラクシヨンをＡＤＰリ ボシル化アッセイおよび５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、クマーシーブルー染色および ＰＥに対するウサギ抗体との免疫プロッティングを用いて分析した。

ＣＤ４　（１７Ｂ）−ＰＥ４０の部分精製のために、変性／再生法が使用された 。ｐＶＣ４０３を有するＢＬ２１（λＤＥ３）の培養液５００−を導き、細胞封 入体ペレットを上記のように調製した。ペレットを抽出緩衝液（グアニジ：／Ｍ ＣＩ　　７Ｍ、）リスＨｃ１　０．１ＭｐＨ８，０，ＥＤＴＡ　　１ｍＭおよび ＤＴＴｌｍＭ）６、　　５ｒｎ１中に懸濁し、そして２０秒間８回超音波処理を 行う。懸濁液を冷室で１時間攪拌し、そして１０００００×ｇで１５分遠心分離 し、上澄みを確保する。上澄み（６，５−を迅速に撹拌しながら冷リン酸緩衝化 食塩水５００ｒｎｌに滴下して添加する。４８時間後、一部を以下のように精製 する：緩衝液Ａ（）リスＨＣ１２０ｍＭｐＨ７，７）に対して８時間、１１で２ 回交換して１１０−を透析し、０．４５ｍフィルターを通してろ過し、そしてモ ノＱカラム（ＨＲ５１５）に１ｍ、／分の流速で注入する。カラムを５−緩衝液 Ａで洗浄し、次に２５−グラジェント（０−０，５Ｍ　　ＮａＣ１）で、そして 最後に緩衝液Ａ中のＬＭ　　ＮａＣ１５−で展開する。

一部の１１Ｎｉを集め、そして全タンパク質、ＡＤＰリボシル化活性および固定 化された抗ＰＥ抗体と抗ＣＤ４モノＰｅ１−フリーズ）とを用いるエリザによる 反応性を分析した。タンパク質濃度はブラッドフォード試薬を用い標準としてウ シ血清アルブミンで決定された。ＡＤＰリボシル化活性は単位／ｍｌとして表現 された；１単位は同じアッセイ条件下で決定されたＰＥ４０　１μｇの活性に等 しい。５ＤＳ−ＰＡＧＥのために、試料はラエムリ試料緩衝液と煮沸され、モし て１０−１５％グラジェントゲル（Ｐｈａ　ｓ　ｔＧｅ　１　ｓ、ファルマシア ）上で電気泳動された。精製の分析は図２に示されている。

（ａ）再生可溶性ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０のモノＱカラムクロマトグラフ ィー 再生された材料１１０ｄＣタンパク質６■）をモノ１カラムに注入し、タンパク 質をＮａＣ１グラジェントで溶出し、モして１−のフラクションを集めた。

（ｂ）精製の種々の段階での試料の５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクマーシーブルーで 染色するか（列１−３）、またはＰＥに対するポリクローナル抗体で免疫ブロッ ティングしたＣ列４−６）。列１および４．スフェロプラスト；列２および５． モノＱカラムからのフラクション１９；列３および６．実際のＰＢ＜１１００ｎ 、タンパク質標準の分子量はＫｄで示されている。実際のＰＥの分子量は６６Ｋ ｄである。

ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１２０へのＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０の 結合の表示 この特定の結合性相互作用を示すのに２つの方法が用いられた。第１はＣＤ４　 （１７８）　−ＰＥ４０＋ＰＥに対する抗体と一緒の標識されたｇｐ１２０の共 沈殿を含む。〔’Ｓ）−メチオニン標識ｇり　１２０を含む培地がワクシニア／ バクテリオファージエフハイブリッド発現系を用いて上記したように得られた。

ＣＶ−１細胞を２つのワクシニアウィルス組換え体に共感染させた：バクテリオ ファージＴ７ブロモータの制御下でｇｌ）　１２０の分泌体（ＨＩＶ−１，ＩＩ ＩＢ単離体）をコード化するｖＰＥ６およびワクシニアウィルス７．５にプロモ ータにより駆動されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコード化するＶＴＦ７−８゜■ Ｓ標識ｇｐ１２０を含む培地５１を粗製再生ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０　９ ０ｆと４℃で４時間予備保温した。抗ＰＥ抗血清（２μりを添加し、そして４℃ で一晩保温した後、免疫複合体をプロティンバーアガロース（カルビオケム）１ ０１と沈殿させた。洗浄した免疫沈降物を１０％ゲル上で５ＤＳ−ＰＡＧＥによ り分析し、そして蛍光写真によりタンパク質バンドを可視化した。分析は図３人 に示されている。（”Ｓ）−標識ｇｐ１２０を含む培地の混合物から沈殿させた 免疫複合体は列３に示されている。対照として、抗ＰＥ（列１）またはＣＤ４　 （１７８）−ＰＥ４０　（列２）のいずれかが省かれた。

第２の方法は免疫蛍光を含む。６−２３１１プレート（コスタ−）の３５ｍｍ中 のＣＶ〜１細胞の群落単層をｇｐ１６０をコード化する組換えワクシニアウィル ス（ＨＩＶ−１，Ｉ［［Ｂ単離体）にワクシニア７．５にプロモータの制御下で 感染させた。感染の多重度は１．５だった。

対照として、細胞をｖＴＦ７・−３（上記参照）に感染させた。感染１０時間後 、ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０（モノＱカラムのフラクション１９１図２参照 ）を最終毒素濃度５０μｇ／ｍｌまでＰＢＳ＋０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アル ブミン中に添加した。４℃で１時間後、皿をすすぎ、そしてポリクローナル抗Ｐ Ｅ抗血清ＣＰＢＳ＋０．２％（ｗ　／　ｗ　）ウシ血清アルブミン中１＋５０Ｑ ）とさらに１時間４℃で保温した。細胞を次にローダミンに結合したアフィニテ ィー精製ヤギ抗ウサギＩｇＧと保温した。細胞をホルムアルデヒドで固定し、マ ウントし、そして写真撮影した。図３Ｂ、８Ｃ，３Ｄおよび３Ｅに示された分析 において、ＨＩＶ−１ｇｐ１６０遺伝子を含む組換えワクシニアウィルス（３Ｂ および３Ｇ）または対照ワクシニア組換え体（３Ｄおよび３Ｂ）のいずれかに感 染させた。３Ｂおよび３Ｄは蛍光顕微鏡写真であり、３Ｃおよび３Ｅは相当する 位相顕微鏡写真である。

バーは３５０倍で２０μｍを示す。

ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を発現する細胞に対する選択的細胞毒性の表示 ２つの試験系が使用された。第１は組換えワクシニアウィルスによりコード化さ れたＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を発現する細胞を含む。２回のアッセイが ２４ウエルプレートの１８ｍｍウェル（コスタ−）で行われた。

ＣＶ−１細胞を９０％群落まで増殖させた（ウェルあたり２Ｘ１０”細胞）。示 された組換えワクシニアウィルスを、２．５９６ウシ胎児血清を補足したダルベ ツコのＭＥＭｏ、２５ｍ１中に２０の感染多重度でウェルに添加した。時折揺ら しながら９０分後、培地を除去し、そして通常のメチオニン濃度１０％を含有す る同様の培地ｌ−に置き換えた。７．５時間後、ダルベツコのリン酸緩衝化食塩 水中の上記毒素調剤０．０５＋ｎｌを示された最終濃度となるように添加した。

保温を４時間続けた後にｌｌ５−メチオニン２０μＣｉを無メチオニン培地０． ０５ｄ中の各ウェルに添加した。１時間後、標識培地を除去し、次にウェルをダ ルベツコのリン酸緩衝化食塩水１−で２回すすぐ。０１１％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清 アルブミンを含む０．１Ｎ　　ＮａＯＨ０，５−中に細胞を集め、そしてタンパ ク質をトリクロ酢酸で沈殿させ、そしてシンチレーションカウンターにより放射 活性を測定した。

結果は対照（毒素無添加）の含有量に対する％として表現される。図４Ａに示さ れた分析において、黒ヌリの記号は、ｇｐｉｅｏをコード化するワクシニア組換 え体に感染させた細胞を示し、一方、白ヌキの記号は、バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼをコード化する対照ワタシニア組換え体ｖＴＦ７−３に感染 させた細胞を示す（図３の記載参照）。使用された毒素調剤は、（△、ム）ＰＥ 、（０，・）ＰＥ４０、（ロ、閣）ＣＤ４　（１７８）　−ＰＥ４０である。

第２の試験系はＨＩＶに遺伝的に感染させた細胞を使用した。８Ｅ５はＨＩＶ− １（ＬＡＶ）ゲノムの単一組み込みコピーを含むヒトＴ細胞系である。産生され たヴイリオンは逆転写酵素遺伝子における未熟な鎖停止突然変異により非感染性 である。対照として、親の感染されなかったＡ３．０１細胞系が使用された。ア ッセイは２４ウエルプレート中で２回行われた。１０％ウシ胎児血清を補足した ＲＰＭ１１部十メチオニンを欠く同様の培地８部を含有する培地０．９−中の上 記細胞系７×１０″細胞を個々のウェルに接種した。示された毒素調剤はダルベ ツコのＰＥ３０．０２Ｔｎｉ中に添加され、示された最終濃度１１１％を得た。

１７．５時間後、完全培地０゜１−中のｌｌ５−メチオニン１０μＣｉを各ウェ ルに添加し、そして保温を１時間続けた。

次にウェルの内容物を遠心管に定量的に移し、ベックマン遠心機中２８０Ｏｒｐ ｍで１０分間回転させた。上澄みを除去し、そしてペレットを０．１％（ｗ／ｖ ）ＳＤＳ中に懸濁した。ホワットマンＧＦ／Ｃフィルターを用いてトリクロロ酢 酸沈殿により一部の５（１’を分析した。結果は対照（毒素無添加）の含有量に 対する％として表現される。バックグランドの値はＰＥ５ｇと細胞をけ保温する ことにより得られた。３％のみの対照含育物を示すこの値は計算の際に差し引か れ、図４Ｂに示されたデータを得た。黒ヌリの記号は８Ｅ５細胞を示し、一方、 白ヌキの記号はＡ３．０１細胞を示す。使用された毒素調剤は、（△、ム）ＰＥ 、（０，・）ＰＥ４０、（口、ＩＩ）ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０である。

結果 図１に示されるように、ＣＤ４の最初のアミノ酸１７８個とＰＥのアミノ酸１− ３と２５（−８１３をコード化するキメラ遺伝子が構築された（図１）。ＰＥの この部分（ＰＥ４０と示される）はドメインＩを欠（が、しかしそれぞれ転移お よびＡＤＰリボシル化に関するドメイン■および■を保持する。プラスミドｐＶ ｃ４０３はまた、Ｅ、　ｃｏＬｉ　ＢＬ２１　（λＤＥ　３）中での高い発現の ための、バクテリオファージＴ７遅延プロモータおよびシンーダルガルノリポソ ーム結合性配列を含む。ＣＤ４（１７８）−ＰＥ４０と表されるキメラタンパク 質は大量に合成され、細胞内に保持され、そして超音波処理されたスフェロプラ ストの１１００００Ｘベレツト中の細胞封入体と主として結合していることがわ かる。変性タンパク質は約ｅｏｏｏｏの予想Ｍｒを有し、免疫プロット分析（下 記参照）によりＰＥに対するポリクローナル抗体と反応した。

不溶性タンパク質のグアニジンでの変性および急速希釈を含む精製スキームが使 用された。エリザは、天然ＰＥに対するポリクローナル抗体ならびにモノクロー ナル抗体０ＫＴ４ＡおよびＢＬ４と反応させたＣＤ４（１７８）−ＰＥ４０の再 生体はＣＤ４を導くことを示した。

ハイブリッドタンパク質の酵素活性はアフィニティー捕獲法により示されており ；３０％までのＡＤＰリボシル化活性は０ＫＴ４Ａモノクロ一ナル抗体により選 択的に免疫沈降され得る。

ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０の高度に精製されたモノマ一体はモノＱカラム上 での再生タンパク質のクロマトグラフィーにより得られた（図２Ａ）。ドデシル 硫酸カトリウム（ＳＤＳ）の存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動による 各フラクションの分析は、フラクション１９がＰＥに対するウサギポリクローナ ル抗体と反応するモノマー融合タンパク質を少なくとも８０％の純度で含有する ことを示した（図２）。ＴＳＫ−２５０ゲルろ過カラムでのフラクシヨン１９の さらなる精製は、融合タンパク質が６００００Ｍｒタンパク質と予想される溶出 容量の対称ピークとして溶出されることを示した。

ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動は約ａｏｏｏ。

ダルトンのタンパク質に相当する単一バンドの存在を示した。

ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０のｇｐ１２０への結合能力を決定するために、２ つのアッセイが用いられた（図３）。最初はＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０を可 溶性（”Ｓ）−メチオニン標識ｇｐ１２０と混合し、そして抗ＰＥ血清とで得ら れた免疫複合体をプロティン八アガロースに結合し、モしてＳＤＳポリアクリル アミドゲル電気泳動により解析した。図３Ａに示されるように、標識ｇｐ１２０ をＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０と共に特異的に共沈殿させた。第２は、ＣＤ４ 　（１７８）−ＰＥ４０の細胞結合ｇｌ）１２０への結合を免疫蛍光顕微鏡によ り確認した。ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質は発現系に基づくワクシニアを用 いてＣＶ−を細胞中に産生された。外部ｇｌ）１２０と膜透過ｇｐ４１サブユニ ットの両方はｇｐ１６０をコード化する組換えワクシニアウィルスに感染させた 細胞の表面に存在し；さらに、そのような細胞はＣＤ４産生ヒト細胞と混合した とき大きいシンジチアを形成する。図３Ｂは、ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０が ｇｐ１６０をコード化する組換えワクシニアウィルスに感染させたＣＶ−１細胞 に結合するが、しかし対照の組換えワクシニアウィルスに感染させた細胞には結 合しないことを示した。さらに、特定の対照は、ＣＤ４（１７８）−ＰＥ４０ま たは抗ＰＥ抗体のいずれかが省かれているならば蛍光が観察されないことを示し た。以上、これらの結果は、ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０が溶液または細胞表 面においてｇｐ１２０と結合することを示す。

実際のＰＥの細胞への結合、次いで細胞質への内在化および転移によって、結果 的に、伸長ファクター２のＡＤＰリボシル化およびタンパク質合成の引き続く阻 害および細胞死を導く。ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を発現し、タンパク質 合成の阻害を導（細胞によりＣＤ４（１７８）−ＰＥ４０が選択的に内在化およ び転移されるか否かを決定するために２つのアッセイが用いられた。

１つは、組換えワクシニアウィルスに感染させた細胞への効果が調べられた。

図４Ａは、ｇｐ１６０をコード化する組換えワクシニアウィルスに感染させたＣ Ｖ−１細胞内でのタンパク質合成がＣＤ４　（１７ｇ）　−ＰＥ４０への暴露４ 時間後にかなり阻害されたことを示す（ＩＤロ２７ｎｇ／ａｔ’）。

一方、対照の組換えワクシニアウィルスに感染させた細胞はハイブリッド毒素に 対する感受性はより低かった（　Ｉ　Ｄｉｅ＞　１０００　ｎ　ｇ／ｍｊ）　ｏ 実際のＰＥが使用された場合、ｇｐ１６０発現性および対照組換えワクシニアウ ィルスに感染させた細胞は同程度に感受性だった（ＩＤ　ｓｏ”　１００　ｎ　 ｇ　／　Ｊ）　　；それらはまた、細胞結合性ドメインを欠＜ＰＥ４０に対して 同程度に不惑受性だった（　ＩＤ５ｓ＞　１０００　ｎ　ｇ／ｍｊ）　。ＨＩＶ ｘンベローブタンパク質の発現は細胞をハイブリッド毒素に対して非常に感受性 にすること、および特異性はＣＤ４部分により与えられることを我々は結論する 。

ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０の選択性および効果を評価するための第２の系と して、非感染ヒトリンパ細胞系（Ａ３．０１）およびＨＩＶに遺伝的に感染され る娘細胞系（８Ｅ５）が標的として試験された。８Ｅ５細胞はそれらが単一の組 み込まれたウィルスゲノムを含み、ｇｐ１２０を包含するＨＩＶタンパク質を構 造的に合成し、ＣＤ４産生細胞と混合されるときシンジチアを形成し、そして新 しい粒子を産生ずるから、試験的な研究に特に適している。ＣＤ４　（１７８） −ＰＥ４　Ｃ１）８Ｅ５細胞への添加はタンパク質合成の阻害を導＜：１１００ ｎ／艷のＩＤ５＝（毒素添加後１７．５時間で測定された）は、ＨＩＶ感染細胞 がハイブリッド毒素に対して高度に感受性であることを示す（図４Ｂ）。一方、 ｆｉＡ３．０１細胞におけるタンパク質合成はこれらの条件下でＣＤ４（１７８ ）−ＰＥ４０に対して耐性である。両方の細胞系は実際のＰＥに対して中程度に 感受性であり（ＩＤｓ＊＝５００ｎｇ／ｍｊ）、そしてＰＥ４０により影響され なハイブリッド毒素の治療可能性の評価において、所望の標的以外のｍ胞に対す る影響を考慮しなければならない。ＣＤ４に対する天然レセプターは抗原提示細 胞表面のクラス■主要組織適合（ＭＨＣ）分子であると考えられているから、Ｂ リンパ球およびマクロファージはキメラ毒素により影響され得る。しかしながら 、示された試験は、ＣＤ４　（１７Ｂ）−ＰＥ４０がラジ細胞（大量のＭＨＣク ラス■分子を発現するＢ細胞系）においてタンパク質合成を阻害しないことを示 した。この結果は、試験管内では可溶性ＣＤ４がＣＤ４／ＭＨＣクラス■相互作 用への阻害効果を有しないという発行された報告と一致し、そしてＣＤ４のモノ マ一体がクラス■抗原に対する比較的弱いアフィニティーを存し得るということ を示唆する。

これらの結果は、ＨＩＶ感染リンパ球が、有力なシュードモナス外毒素への第２ および第３のドメインに連結されたヒトＣＤ４の１７８個のアミノ酸部分を含む Ｅ、　ｃｏｌｉ内で産生されたハイブリッド毒素により選択的に殺されたことを 示す。組換えワクシニアウィルス発現ベクターでの追加の実験は、キメラ毒素に 対する感受性がＨＩＶエンベロープタンパク質の発現から生じることを示した。

ＨＩＶ感染および組換えワクシニアウィルス感染細胞系の両方に対して、選択性 はキメラタンパク質のＣＤ４ｇ分により媒介される。３つの実験においてタンパ ク質合成の５０％阻害に必要な精製再生ＣＤ４（１７８）−ＰＥ４０の濃度は− あたり２７ないし１００ｓｇの範囲である。その他のＰＥ融合タンパク質でのデ ータに基づいて、動物に重大な非特異的毒性なしにそのようなレベルを達成する ことは困難でない。さらに、ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０はＨＩＶ−１の変形 株ならびにＨＩＶ−２に感染された細胞に対して有用であり得る。なぜならば、 これらの全てのウィルス株のエンベロープタンパク質は広い抗原変異にもかかわ らずＣＤ４に対して結合特異性を保持するからである。

要するに、ここに示されたデータは、融合タンパク質ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ ４０がＨＩＶ感染細胞を特異的にそして有効に殺すことを明らかに証明する。こ のことは、この組換え毒素をエイズの制御および治療のための治療剤として使用 することを可能にする。本発明に係る治療用組成物はＨＩＶ感染細胞を殺すため の有効量の組換え毒素を薬学的に許容性のビヒクルと共に含有し、必要ならば例 えば生理学的食塩水、緩衝溶液等も含有する。

毒素はあらゆる経路により、全身または局部に、よりよい効果が得られるように 投与され得る。エイズを制御または治療する方法は、エイズ感染細胞と、ＨＩＶ 感染細胞を殺すか、またはＨＪＶＩｇ染に続いて生じる融合およびシンジチア形 成を阻害するための有効量の組換え毒素（ＣＤ４　（Ｉ　７８）−ＰＥ４０融合 タンパク質〕とを接触させることからなる。

本発明は少なくとも以下の点でエイズのその他の治療とは全（異なり、そしてそ れらに比べ有効であることをここで記載することは重要である。

１、ＣＤ４の可溶性誘導体は、おそら（ウィルスの細胞結合ＣＤ４への結合能力 と競合することにより、培養液中で細胞のＨＩＶ感染性を阻害することが報告さ れていた。あらゆる特定の理論と関連させることなしに、本明細書に記載された 本発明は異なる機構、すなわちＨＩＶに既に感染された細胞を殺すことにより作 用することが考えられる。この点に関し、可溶性ＣＤ４がウィルスを細胞に感染 させた後に添加された場合効果はより低いことが報告されていたが、これとは異 なり感染後に細胞を殺すＣＤ４毒素が生じた。ハイブリッド毒素がＨＩＶ感染細 胞の標的撲滅に加えて可溶性ＣＤ４でみられた感染性の競合的阻害を生じること は記載されるべきである。

■。タンパク質毒素（リシン）に化学的に結合した抗ｇｐ１２０マウスモノクロ ーナル抗体からなる免疫毒素を用いるＨＩＶ感染細胞の選択的撲滅もまた報告さ れていた。しかしながら、本発明のＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０融合タンパク 質はこの免疫毒素に比べて多（の利点を存する：（ａ）免疫毒素の場合、使用さ れる抗体はタイプ特異性であり、そしてＨＩＶ−１の異なる単離体からのｇｐ１ ２０に結合しない。これに対し、ＣＤ４　（１７８）−ＰＥ４０はＨＩＶ−１の 異なる株ならびＪ：ＨＩＶ−２に対して使用され得る。なぜならば、これらの全 てのウィルスはレセプターとしてＣＤ４を使用するからである。

ＣＤ４レセプター特異性に対するこの要求のために、ＣＤ４毒素ハイブリツドタ ンパク質に耐性であるＨＩＶの変種が生じるであろうことはきわめて疑わしく、 一方タイブ特異性モノクローナル抗体にもはや結合しない変種はしばしば生じる 。ら）免疫毒素は制御が難しい化学的カップリング操作により製造され、それ故 に結合体の均一性を求めることが困難で、収率が低い。これに対し、組換えＣＤ ４　（１７８）−ＰＥ４０融合タンパク質は標準的な方法を用いてバクテリア発 現系で大量に産生され得る。（Ｃ）　　免疫毒素のマウス免疫グロブリン成分は ヒトの生体成分の免疫原になる可能性があり、それ故にその効果を損なう。これ に対しＣＤ４融合タンパク質では、ｇｐ１２０発現性細胞の標的化がヒトＣＤ４ の断片により達成され、ヒトにおいて免疫原になる可能性がない。

■、ジフテリア毒素断片Ａを含むリポソームによる試験管内でのＨＩＶ感染細胞 の選択的撲滅もまた報告されていた。明らかに、これは本発明の融合タンパク質 の方法論と全く異なっている。

本発明のある一面を記載したが、当業者により行われ得る種々の変形を次に記載 する。

Ａ、ＣＤ４部分における変形 これは例えば、ＣＤ４配列における長さの相違により達成される。ＣＤ４配列の より短いか、またはより長い変形物はＨＩＶ感染細胞の選択的撲滅を達成する毒 素に結合され得ることが見出され得る。ＣＤ４配列の長さはｇｐ１２０に対する 親和性、ｇｌ）１２０対クラス■抗原に対する相対的親和性、体内の異なる領域 への物理的な接近しやすさ、および免疫原性に重要な意味を有し得る。

さらに、部位特異的な突然変異誘発は通常細胞の抗原に対するＣＤ４の親和性を 低下させ、および／またはｇｐ１２０に対する親和性を増加させるために使用さ れ得る。

そのような突然変異は有効な治療投与と望ましくない毒性副作用との間の窓を広 げるであろう。

Ｂ、毒素部分における変形 ＰＥの変性はなされ得る。選択的突然変異誘発または欠失により、ＰＥ配列の免 疫原性は低下され得、そして高められたハイブリッド毒素の能力（例えばリシン やジフデリア毒素Ａで転移を引き起こすことにより）は本明細書に記載された融 合技術の範囲内で同様に使用され得る。

Ｃ１発現系 バクテリア 例えばある種のｆ！、　ｃｏＬｉ発現系を用いることにより、ハイブリッド毒素 の分泌体は変性／再生に使用され得る。

真核生物 哺乳類、ワタシニアウイルス、バクロウィルス、および酵母発現系もまた、当業 者に十分公知の有利な発現系として使用され得る。

第２部 材料および方法 酵素 制限エンドヌクレアーゼは二ニー・イングランド・バイオラプスまたはベセスダ ・リサーチ・ラボラトリーズから入手された。ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノー 断片およびＴ４ＤＮＡリガーゼはニュー・イングランド・バイオラプスから入手 された。

抗体 ネズミ抗ＣＤ４ｍＡｂは以下の供給源から入手された：ＭＴ１５１．ベーリンガ ーーｖンハイム；Ｌｅｕ３Ａ。

ベクトン・ディッキンソン；０ＫＴ４，０ＫＴ４人、０ＫＴ４Ｂ、０ＫＴ４Ｃ， ０ＫＴ４Ｄ、０ＫＴ４Ｂおよび０Ｋ７４Ｆ、エム、タレ、オルト・ダイアグノス テイクス。２８１のネズミ抗ｇｐ１２０ｍＡｂが使用された＝２Ｂ１２．１（エ ピトープ、ペアバートン、オレゴン）およびハイブリドーマ９０２からの組織培 養上澄み（ビー、チェセブ口、ナショナル・インステイチュート・オブ・アレル ギー・アンド・インフエクシャス・デイズイーズ、ハミルトン、マサチューセッ ツ）。マウスＩｇＧに対するウサギ抗血清（重鎮＋軽鎖）はＩＣＮから購入した 。

プラスミド ＣＤ４ｃＤＮＡはディー、リフトマン（カルホルニア大学、サンフランシスコ） により寄贈された。プラスミドｐＣＤ４−ＧＥＭ４　（ナショナル・インステイ チュート・オブ・アレルギー・アンド・インフェクシャス・デイズイーズ、ベセ スダ、メリーランドのニー、ラブソンから入手された）は、ｐＧＥＭ４　（プロ メガ・バイオチク。

マジソン、ウイスコンシン）のＥｃｏ　ＲＩ−ＢａＩＩ＋旧部位内にクローン化 された５　”　Ｅｃｏ　Ｒ１および３　’　Ｂａｒｎ旧リンカ−（Ｍａｄｄｏｎ 等、同上）を有するＣＤ４ｃＤＮＡの全長コピーを含む。ｐＴＦ　７−５は唯一 の１ａｒｔｔ旧部位により分断され、そして右側および左側ワクシニアチミジン キナーゼ遺伝子配列により両側が挟まれているバクテリオファージＴ７ブロモー タおよびターミネータを含む（図１参照）。

組換えプラスミドの構築および調製はＭａｎｉａｔｉｓ等、１９８２、　ＭｏＬ ｅｃｕＬａｒ　ＣＬｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ＭａｎｕａＬ　 　（コールド・スプリング・ハーバ−研究所、コールド・スプリング・ハーバ− 、ニューヨーク）により概略が記載された方法に従って行われた。ＤＮＡ断片は エルティップｄ法（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆５ｃｈｕｅｌｌ）を使用すること により低融点アガロースゲルから精製された。プラスミドはアルカリＮａ　Ｄ　 ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４溶解法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ等＋　１９７９．　ＮｕｃＬｅｉｃ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１３−１５２３）により単離され、そしてＣ ｓＣ１／臭化エチジウム平衡密度勾配遠心分離により精製された。

ウィルスおよび細胞 ワクシニアウィルス組換え体ｖＴＦ　７−８はワクシニアＰ７．５プロモータの 制御下にあるバクテリオファージエフ遺伝子１　（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコ ード化する）を含む（Ｆｕｅｒｓｔ等＋　１９８６．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、 　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＩＪｓＡ　８３．８１２２−８１２６）　。ｖ　Ｐ　Ｅ　６はＨＩＶ−１！ンベ ローブ遺伝子（ＩＩＩＢ単離体、クローンＢＨ８）に連結されたバクテリオファ ージＴ７ブロモータを、コンセンサスレトロウィルスエンベロープ部位人ｒｇ− Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇをコード化する配列の直前に試験管内突然変異により挿 入された終止コドンと共に含むｐＴＦ　７−５から誘導されたワクシニア組換え 体である。このウィルスはｖＴＦ７−３に二重に感染された細胞中でｇｐ１２０ の分泌体の高レベルの発現を導く。

ＣＶ−１サル肝臓細胞を１０％０％ウシ胎清を含有するダルベツコの変形イーグ ル培地中で増殖させた。

発現条件 一時的発現のためのトランスフェクション試験はＦｕｅｒｓｔ等、同上に記載さ れたものと同様の条件を用いて行われた。ＣＶ−１細胞を２５ｊフラスコ中に９ ０−９５％の集落まで増殖させ（２，５Ｘ１０＠細胞）、そして２．５％ウシ胎 児血清を存する培地中で細胞あたり３０プラ一ク形成性単位（ｐ　ｆ　ｕ）の多 重度でｖＴＦ　７−３に感染させた。フラスコを時折ゆらして３７℃で３０分間 ウィルスを吸着させ、その後、接種物を除去し、そしてリン酸カルシウム沈殿さ れたプラスミドＤＮＡ５μｇを含むトランスフエフシコン緩衝液１−で置き換え た。時折ゆらして３７℃で３０分間保温した後、２．５％ウシ胎児血清を含有す る培地５−を添加した。３７℃で４時間後培地を除去し、そして２．５％の透析 ウシ胎児血清を含有するシスティンを含まない培地２−４ｙｄと共に１５−６０ 分間細胞を保温した。この培地を次に−あたりＬ−（”Ｓ）システィン０．１− ０．３ｍＣ１（アマルシャム、１．３Ｃｉ／ｍｍｏｌ　；　ＩＣ１＝３７ＧＢｑ ）を補足した同一培地２．２５−に置き換えた。標識は３７℃で４−５時間行わ れ、その後２．５％ウシ胎児血清を含有する完全培地０．２５−を添加した。３ ６時間後、培地を集め、そしてサバント高速微量遠心分離機中、最初に２００Ｏ ｒｐｍで５分間、次に１１０００Ｏｒｐで３０分間遠心分離した。生成する上澄 みは次の分析に使用された。

分泌されたｇｌ）１２０の試験のために、二重ウィルス感染が報告されたもの（ Ｐｕｅｒｓｔ等、　１９８７．　ＭｏＬ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｒ、　７．２５ ３８−２５４４）と同様のプロトコルを用いて行われた。上記のようにフラスコ 中で増殖させたＣＶ−１細胞を２．５％ウシ胎児血清を含有する培地１−中のｖ ＴＦ７−３およびｖＰＥ６　（細胞あたり各々１５ｐｆｕ）に感染させた。３７ ℃で９０分の後、ウィルス接種物を除去し、そして２．５％ウシ胎児血清を含有 する新鮮培地で置き換えた。非標識感染の場合、保温を３７℃で２３時間続け、 その後培地を集めた。代謝標識のために、保温を１０．５時間続け、その後培地 を除去し、そして細胞を２．５％透析ウシ胎児血清含有のシスティン非含有培地 中室温で１５分保温した。この培地を次に−あたり（”Ｓ）システィン０．１ｍ Ｃ１を補足した同様の培地２．２５−に置き換えた。保温をさらに７時間続け、 そして次に培地を集めた。３７℃での標識５時間の後、２．５％ウシ胎児血清含 有の完全培地０．２５−を添加した。これらの感染からの培地はトランスフェク ション試験のために上記のように遠心分離した。

対照感染は、ウィルス接種物がｖＴＦ　７−３のみを含有する（細胞あたり３０ ｐｆｕ）ことを除いて同様に行われた。

放射免疫沈降 特定の反応条件は上記した図面の説明のものど同様である。プロテアーゼインヒ ビター緩衝液は０．１ｍＭＮα−（ｐ−トシル）リジンクロロメチルケトン、０ ゜１ｍＭＬ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン、５０ ｍＭヨードアセトアミド、０゜０１ｍＭロイペプチン、およびアプロチニンを０ ．０２％（重量／容量）アジ化ナトリウムと共にリン酸緩衝化食塩水中−あたり ７０力リクライン単位含有する。プロティンＡ−アガロース（カルビオケム）で 集められた免疫複合体は沈殿され、そしてサバント高速微量遠心分離機中、３０ ００ｒｐｍで５分間の遠心分離により３回洗浄された。

Ｎ　ａ　Ｄ　ｏ　ｄ　Ｓ　Ｏ４／ポリアクリルアミドゲル電気泳動Ｌａｅｍｍｌ ｉ　等、　　１９７０．　　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２２７．　６８ ０−６８５の方法が図面中に記載されたアクリルアミドゲル濃度で用いられた。

ゲルはＥＮ”ＨＡＮＣＥ　にューイングランド・ヌクリアー）を用いる蛍光写真 により分析された。

１４Ｃ−メチル化タンパク質分子量マーカー（アマルシャム）はりゾチーム（Ｍ ｒ１４０００）、カルボン酸アンヒドラーゼ（Ｍｒ３００００）、卵黄アルブミ ン（Ｍｒ４６０００）、ウシ血清アルブミ：ｚ（Ｍｒ６９０００）、ホスホリラ ーゼｂ（Ｍｒ９３０００）およびミオシン（Ｍｒ２０００００）だった。

結果 可溶性ＣＤ４断片の発現 本研究において使用された発現系はＰｕｅｒｓｔ等、同上の記載に基づいている 。哺乳類細胞をワクシニアプロモータに連結されたバクテリオファージＴ７ＲＮ Ａポリメラーゼ遺伝子含有の組換えワクシニアウィルス（ｖＴＦ　７−３）に感 染させ、次にバクテリオファージＴ７ブロモータと転写ターミネータ領域により 両端が挟まれた当該標的遺伝子含有のプラスミドベクターでトランスフェクショ ンさせた。Ｔ７ＲＮＡボメラーゼはトランスフェクションされた細胞の細胞質に おいて当該遺伝子の高レベルの転写を媒介する。本発明に従って、プラスミドベ クター　（ｐＥＢ−２）はＴ７ブロモータと転写ターミネータとの間に、２つの 新規な単一制限部位ＣＥｃｏ　Ｒ１およびＳｔｕ　Ｉ）を含み、その直後にユニ バーサル翻訳終止配列が続くことが示された。このベクターをｆ！ｃｏ　Ｒ［お よびＳｔｕ■で切断した後、ＥｃｏＲ１部位および３１プラント末端を含むあら ゆるＤＮＡ断片を適当な配向に強制クローン化し得る。ＤＮＡ挿入部が、翻訳開 始コドンであるが、しかし特定の遺伝子のための隣接コード領域の一部を含むな らば、一部切除されたポリペプチドが発現される。合成終止コドンが枠内にある かによって、短縮されたポリペプチドもまた、ベクターによりコード化された３ 個までの付加的なＣ末端アミノ酸を含有し得る。

本研究のために、ＣＤ４ｃＤＮＡのＥｃｏ　Ｒ［−５ｈｅ　Ｉ　ＤＮＡ断片はｐ ＥＢ−２に挿入され、もう１つのプラスミドを得、これはｐＣＤ４と表される（ 図５）。報告され４は通常のＮ末端を有するＣＤ４の一部切除変種をコード化す ることが予想される：単一配列の切断は成熟ＣＤ４の最初の１７７個のアミノ酸 （最初の２つの免疫グロブリン様ドメイン）を含有し、そしてコンセンサスＮ結 合グリコジル化部位を含有しないポリペプチドを生じるであろう。それ故に、こ の断片は培地中に分泌されることが予想される。ｐ　ＣＤ　４　ｔのＤＮＡ配列 分析は、この断片もまたＣ末端プロリンおよびベクターのＵＴＳ配列から誘導さ れるアルギニン残基を含むことを示した。

図６ＡおよびＢは、ｖＴＦ７−３で感染させ、そして異なるプラスミドでトラン スフェクションさせた細胞を用いる代謝標識された一時的発現の結果を示す図面 である。ＮａＤｏｄＳＯ，／ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析は、対照プラ スミドｐＥＢ−２でトランスフェクションさせた細胞の培地がポリペプチドバン ドの複合パターンを含み（列３）；ｐｃＤ４＋でトランスフェクションさせた細 胞からの培地は同様のポリペプチドバンドの複合パターンならびにこのプラスミ ドによりコード化された一部切除ＣＤ４ポリペプチドと予想される位置に付加的 な淡いバンドを含む（列１）ことを示した。種々のネズミ抗ＣＤ４ｍＡｂの混合 物での免疫沈降分析は、このバンドがＣＤ４分子の断片を実際に示すものである ことを証明した。それは免疫沈降の後に培地から選択的に除去され（列２）、そ してｐ　ＣＤ　４　、でトランスフェクションさせた細胞の培地からは特異的に 沈降したが（列５）、しかしｐＥＢ−２でのものは沈降しなかった（列６）。培 地フラクションから免疫沈降し得るこの標識ポリペプチドの量は、界面活性剤可 溶化細胞ペレットフラクションからの沈降可能量をはるかに越えていた（データ は示されていない）。それ故に、ｐ　ＣＤ　４　ｒはＣＤ４分子の細胞外領域の Ｎ末端の１７７個のアミノ酸残基（およびベクターからの２つの残基）からなる 所望の断片をコード化すること、および該断片は培地中に可溶性の形態で分泌さ れ、そして抗ＣＤ４ｍＡｂとの反応性を示すことが結論される。

エピトープ分析 種々のアッセイを用いることにより、さまざまな実験が、特定の抗ＣＤ４ｍＡｂ はＣＤ４とＨＩＶエンベロープ糖タンパク質との相互作用を阻害する能力におい て広（異なることが示された（ＭｃＤｏｕｇａｌ等、同上；　５ｏｄｒｏｓｋｉ 等、同上；　Ｌａ５ｋｙ　１９８７．　Ｃｅ１Ｌ　５０．９７５−９８５；　Ｌ ｕｄｉｎ等。

同上；ＭｃＤｏｕｇａｌ　１９８６．　Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏＬ、　１３７．２９ ３７−２９４４；　５ａｔｔｅｎａｔｕ等、同上）。それ故に、エピトープがｐ ＣＤ４、によりコード化された可溶性ＣＤ４断片上に発現されることを試験する のは興味深い。図７はｐ　ＣＤ　４　ｔでのトランスフェクション後に代謝標識 された細胞の培地からの標識免疫沈降分析により得られた結果を示す。重要なこ とには、特定のｍＡｂと断片との反応性と、ＣＤ４工ンベロープ糖タンパク質相 互作用を阻害するためのｍＡｂの能力と間に密接な関係が見出された。従って、 強い免疫沈降はｍＡｂＭＴ１５１、Ｌｅｕ３Ａ、０ＫＴ４Ａ、０ＫＴ４Ｂ、０Ｋ Ｔ４Ｄ、０ＫＴ４Ｂおよび０Ｋ７４Ｆとで得られ、それらの全ては膜結合または 可溶性ｇｐ１２０とＣＤ４との相互作用を阻害することを示した。

これに対し、ｍＡｂＯＫＴ４は断片を免疫沈降させず、これは膜結合または可溶 性ｇｐ１２０とのＣＤ４相互作用を阻害し得ないという報告と一致した。ｍＡｂ ＯＫＴ４Ｃは、完全なＨＩＶとＣＤ４との相互作用を阻害しない（ＭｃＤｏｕｇ ａｌ等、同上；　５ａｔｔｅｎａｔｕ等、同上）、そして可溶性ｇｐ１２０のＣ Ｄ４への結合を阻害する能力が比較的弱い（Ｌｕｎｄｉｎ等、同上）という報告 と一致して、断片とのほとんど検出できない反応性を示した。

種々の抗ＣＤ４ｍＡｂはまた、リンパ細胞系の表面のＣＤ４に対する特定の抗体 の結合を阻害するためのトランスフェクションされた細胞からの非標識培地の能 力を測定する他のアッセイにおいて試験された。結果は免疫沈降分析を支持した ：　ｐ　ＣＤ　４　ｒでトランスフェクションされた細胞からの培地はｍＡｂＭ Ｔ１５１、Ｌｅｕ３人および０ＫＴ４Ａの結合を阻害したが、しかしｍＡｂＯＫ Ｔ４の結合には影響を与えなかった（データは示していない）。それ故に、ＨＩ Ｖ阻害性抗ＣＤ４ｍＡｂにより検出されたエピトープはＣＤ４の細胞外領域のＮ 末端の１７７個のアミノ酸残基内に包含されること、およびこれらのｍＡｂに対 する機能的エピトープは全長ＣＤ４の半分以下が合成されるとき産生され得るこ とが結論される。

ＣＤ４断片と可溶性ｇｐ１２０との相互作用ＣＤ４断片がｇｐ１２０と特異的相 互作用し得る否かを次に決定した。これらの分子の複合体の形成を試験するため に、可溶性ｇＰ１２０を発現する代謝標識された細胞からの培地をＣＤ４断片を 発現する代謝標識された細胞からの培地と混合した。次に、ネズミ抗ｇｐ１２０ ｍＡｂがｇｐ１２０と一緒になったＣＤ４断片と特異的に共沈殿するかどうかを 評価した。そのような共沈殿試験の結果は図８Ａに示されている。多（の標識バ ンドがｇｌ）１２０およびＣＤ４断片を含有する培地の初期混合物中に観察され た（列１）；抗ｇｐ　１２０ｍＡｂは２種のタンパク質：ｇｐ１２０およびＣＤ ４断片を特異的に沈殿させた（列６）。ＣＤ４断片バンドの同定は、断片含有培 地が反応から省かれたときのその不在により（ｇｐ１２０バンドだけが観察され る）（列３）および断片含有培地が抗ＣＤ４ｍＡｂと免疫沈降したとき単一バン ドでの移動により（列７）確認された。

通常の培地（列４）またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアウィル スでだけ感染させた代謝標識細胞からの培地（列５）のいずれかがｇｐ１２０含 有培地の代わりに使用されたとき断片バンドの不在から判断して、抗ｇｌ）１２ ０免疫沈降物中のＣＤ４断片の存在はｇｐ１２０との実際の複合体から生じた。

免疫沈降後に残留する上澄みの分析は、この実験条件下では、はとんど全てのＣ Ｄ４断片がｇｐ１２０と複合体形成し、そして抗ｇｌ）１２０ｍＡｂによる複合 体の免疫沈降はほぼ完全であることを示した（データは示されていない）。これ は結合反応に対する高い親和性を示した。

この相互作用の特異性をさらに分析するために、可溶性非標識ｇｌ）１２０が抗 ＣＤ４ｍＡｂによるＣＤ４断片の免疫沈降に競合するかどうかを決定した。図８ Ｂに示されるように、ｇｐ１２０を含有する非標識培地はＯＫＴ４ＡｍＡｂによ るＣＤ４断片の免疫沈降を強（阻害した（列１と３を比較せよ）。一方、ｇｐ１ ２０を含有しない培地（Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現するワクシニアでのみ感 染させた細胞からのもの）は効果がなかった（列２）。それ故に、ＣＤ４断片の ｇｐ１２０との相互作用は全く特異的であると結論された。

要するに、ここで示された結果は、最初の２つの免疫グロブリン様ドメインを含 むＣＤ４のＮ末端の１７７個のアミノ酸残基内にＨＩＶ結合性部位の局在の直接 の証拠を供給する。

本発明は今、ＨＩＶ感染の予防のための組成物を調製することを可能にする。そ のような組成物（よ、最初の２つの免疫グロブリンタイプのドメインをＣＤ４分 子のＮ末端側の半分からの最初の１７７個のアミノ酸残基内１こ含むＣＤ４の組 換え可溶性一部切除体の、宿主細胞へのＨＩＶの結合を阻害する有効量からなる 。宿主細胞のＨＩＶ感染を阻害する方法は、本発明のＣＤ４の組換え可溶性一部 切除体のＨＩＶに結合する有効量を供給することからなる。

第３部 あらゆる特定の理論または仮説と関連することなし番こ、ＣＤ４免疫グロブリン ノ−イブリツドタンノくり質に関する本発明の第３部の以下のユニークな面を次 善こ示す。

（ａｌ　　本発明は、体液の抗体を通常包含する基本的な宿主の免疫学的防御機 構に依存する。ＣＤ４のｇｐ１２０結合領域を免疫グロブリンの可変領域に置換 すること番こより、生成する分子は全てＨＩＶエンベロープ変形物（；対して高 い親和性を獲得し、さらに選択されたエフェクター機能が使用された特定の重鎮 定常領域番こより与えられた。このことはＨＩＶエンベロープ糖タンノくり質の 保存された決定基に対する高親和性抗体を高めるＨＩＶ感染個体の衰弱と関連す る問題を解決する。

（ｂ）　　本発明のハイブリッド分子はヒト配列のみを含有し、それにより外来 タンパク質に対する宿主免疫応答からの問題を最低限に抑える。

（Ｃ）本発明は遺伝的に細胞毒性である分子を使用しない。従って、ＣＤ４毒素 および免疫毒素を含む治療のような非特異的毒性に関する問題が非常に少ない。

（ｄＪ　　本発明のＣＤ４免疫グロブリンノ１イブリツドタンパク質はジスルフ ィド結合されたマルチマーである（特定の構築物に基づいてダイマーまたはテト ラマー）。多価は、モノマ−ＣＤ４誘導体に比べ、細胞表面およびヴイリオンの 両方に、ＣＤ４のｇｐ１２０に対する結合活性を非常に高める。これはまた、ウ ィルスの感染性の直接中和または細胞から細胞への融合により広がったウィルス の阻害を引き起こす。

（ｅ）　　免疫グロブリン領域はまた、循環中のＣＤ４誘導体の寿命を引き延ば し、それにより直接中和およびエフェクター介在機構により仲介される存利な効 果を引き起こす。

（ｆ）ＣＤ４免疫グロブリンハイブリツドタンパク質は完全なヴイリオンならび にＨＩＶ感染細胞を溶解させ得るが、一方ＣＤ４毒素は細胞に対してのみ作用す る。実際に、ある種のレトロウィルスの補体媒介溶解に対する支持がある（Ｃｏ ｏｐｅｒ等、１９７９．　　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｓｅｗｒｉｎ、　Ｉｒｒｒｒｒ ｒｕｎ。

ｐａｔｈｏＬ、　　２．　２８５−３２０）　　。

本発明のＣＤ４免疫グロブリンハイブリツドタンパク質を製造するためには（図 ９に模式的に示されているように）、多くのファクターが考慮されなければなら ない。

第１は使用すべきＣＤ４の領域である。それはｇｐ１２０に対する高い親和性の 結合部位を非常に正確に含有していなければならない。ＣＤ４の一部切除可溶性 誘導体での試験（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、　１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌ ｏｎｄｏｎ）　３３１゜８４−８６　；　　Ｂｅｒｇｅｒ等、同上）は細胞外領 域のアミノ末端の半分（およそ１８０個のアミノ酸残基、最初の２つの免疫グロ ブリン様ドメインを示す）はｇｐ１２０結合性部位を含むことを示す。部位関連 突然変異誘発研究（Ｃ１ａｙｔｏｎ等、　１９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎ ｄｏｎ）　３３５．３６３−３６６；　　Ｌａｎｄａｕ等、　１９８８．　Ｎａ ｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３３４．１５９−１６２；　　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ 等、　１９８８．　ＣｅＬＬ、　５４．６５−７２；　Ｍｉｚｕｋａｍｉ等、同 上〕は、アミノ末端の免疫グロブリン様ドメイン（およそ最初の１００個のアミ ノ酸）が特に重要であり、ｇｐ１２０結合に十分であることを示唆する。

ＣＤ４配列の選択における考慮のためのその他のファクターは分泌形態における 相当する免疫グロブリンハイブリッドタンパク質の発現の容易性、循環中のそれ らの安定性、体内でのそれらの異なる部位への接近しやすさ、およびＭＨＣクラ ス■抗原（細胞のＣＤ４が相互作用すると考えられている抗原提示細胞上の表面 分子）に結合する決定基をも含む可能性を包含する。可溶性ＣＤ４での実験（Ｈ ｕｓｓｅｙ等、　１９８Ｂ、　Ｎ（ｌｔｕγｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３３１．７ ８−８１）およびＣＤ４シユードモナス外毒素ハイブリツドタンパク質での実験 （Ｂｅｒｇｅｒ等、同上）がこれらの効果が可溶性ＣＤ４とＭＨＣクラス■分子 との弱い結合親和性により無視されるであろうことを示唆するけれども、そのよ うな結合は、通常の作用においてＣＤ４細胞の活性を弱める可能性がある。

第２の考慮はヒト免疫グロブリン配列の選択である。

有効なアプローチはＣＤ４の活性領域を免疫グロブリン重鎮の定常領域に結合す ることである。生成した分子は補体に結合する、ならびに抗体依存細胞介在細胞 毒性（ＡＤＣＣ）に関与する細胞の表面のＦｃレセプターに結合する領域を包含 する。免疫グロブリンに関しては、ヒトＩｇＧ１が好ましい。これはこの免疫グ ロブリンサブクラスが補体およびＡＤＣＣの両方による媒介細胞撲滅に最も有効 であることがわかっているからである（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ等、１９８７．　 Ｊ、　Ｅｘｐ、　ｌｅｄ、　１６６、１３５１−１３６１）　。このＩｇＧセグ メントはＣＨＩ、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。生成するハイブリッ ドタンパク質を次に、ｇｐ１２０、ＣＤ４およびヒトＩｇＧに対する抗体、プロ ティンＡ１補体（特にＣｓ）および免疫系の適当な細胞（例えばマクロファージ ）上のＦｃレセプターに特異的に結合するジスルフィドホモダイマーとして分泌 させる。　考慮する第３のファクターはＣＤ４−１ｇＧ重鎖タンパク質とヒト軽 鎖との共発現である。これらの条件下、通常のヒトＩｇＧに対するジスルフィド 結合したヘテロテトラマー類似体が製造され、それによりＣＤ４重鎖ハイブリッ ド分子の発現および分泌を高める。さらに、公知の補体結合性配列を含むヒトＩ ｇＧの異なるサブクラスはそれらの補体結合性能が非常に異なるから、補体の結 合は重鎮定常領域の関連配列の単なる存在以外のファクターに依存するかもしれ ない。従って、より高次の構造が重要であり、そしてそれは軽鎖とのへテロテト ラマー構造に依存するようである。

このアプローチの特別な態様はＣＤ４重鎖分子の、通常のヒト軽鎖とではなく、 ヒト軽鎖の定常領域に結合したＣＤ４配列を含む組換えタンパク質との共発現を 含む。

生成するヘテロテトラマーは各々ＣＤ４配列の４種のコピーを含み、この多価は 感染細胞およびＨＩＶヴイリオン表面上のｇｐ１２０に対する極めて高い結合活 性を導く。キメラ遺伝子の構築およびノｈイブリツドタンノくり質の発現が今例 示される。

材料および方法 材料 制限酵素は二ニー・イングランド・ノくイオラブスまたはベセスダ・リサーチ・ ラボラトリーズから購入した。

Ｔ４　ＤＮＡリガーゼはニュー・イングランド・ノくイオラブスから購入した。

以下の抗体は示した供給源から入手された：０ＫＴ４および０ＫＴ４Ａ（オルソ ・ファーマシューテイカルズ）；抗Ｌｅｕ３Ａ　（ベクトン・ディッキンソン） ；ネズミ抗ヒトに鎖ｍＡｂ　（ベーリンガー・マンハイム）；ハイブリドーマ９ ０２からのネズミ抗ｇｐ１２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ナショナル・イ ンステイチュート・オブ・アレルギー・アンド・インフエクシャス・デイズイー ズ、ハミルトン、マザチューセッツ）；ビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧおよび ビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ ーズ）；ビオチニル化ヤギ抗ヒトλ軽鎖抗体（アマルシャム）。

プロティ′ンＡ−アガロースおよびストレブタビジンアガロースはベセスダ・リ サーチ・ラボラトリーズから購入した。

中間体プラスミドｐｃＤ４ｃＨ１の構築ハイブリッドタンパク質の発現のための プラスミドの容易な構築のために、中間体プラスミドｐｃＤ４ｃＨ１が以下のよ うにして構築された（図１０）。ヒトＣＤ４ｃＤＮＡ全体を含む１．７　ｋ　ｂ 　ＢｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片がｐＤＥ４−０８Ｍ４　（ナショナル・インステ ィチュート・オブ・アレルギー・アンド・インフェクシャス・ディズイーズ、ベ セスダ、メリーランドから入手された）から単離された。結合（Ｊ）領域および ３つの定常ドメイン（ＣＨｌ、ＣＨ２，およびＣＨ３）を包含する部分的ヒト免 疫グロブリンＧｌ　（ＩｇＧ１）重鎖ｃＤＮＡを含む１　、　２　ｋ　ｂ　Ｂａ ｍＨＩ−Ｓｍａｌ　（部分）断片がｐ　ＧＭＨ６（Ｌｉｕ等。

１９８７、　Ｇｅｎｅ　５４．３３−４０）から単離された。これらの２つの断 片をｐＥＢ２の５ｊｕｌとＢｃｏＲ１部位にクローン化し、ｐｃＤ４ｃＨ１を得 た。

ｐＣＤ４　ＩＴＭＩ　ＯおよびｐＣＤ４１ＴＭＩ　ＯＧの構築 ハイブリッドタンパク質、ＣＤ４の最初の免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（ １−１，０９）およびヒトＩｇＧ１重鎖分子の３つのＣドメインからなるＣＤ４ （１０９）ＣＨ（図９）を発現するために、ｐｃＤ４１ＴＭ１０およびｐＣＤ４ １ＴＭＩ　ＯＧが以下のように構築された（図１１）。ＣＤ４のアミノ末端の１ ０４個のアミノ酸をコード化する０　、　　４６　ｋ　ｂ　ＢｃｏＲＩ−Ｎｒｕ ｌ断片がＣＤ４ｃＤＮＡの１０３番目と１０４番目のコドンの間にＮｒｕＩ部位 （ＴＣＧＣＧＡ）が挿入されたｐＣＭ３４から単離された（Ｍｊｚｕｋａｍｊ等 、同上）。２つの合成オリゴヌクレオチド： ７Ｍ４４　（ＧＡＣＡＣＣＣＡＣＣＴＧＣＴＴＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣ Ｃ）および ７Ｍ４５　（ＣＴＴＣ；ＧＴＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＴＧＧＧＴＧＴＣ） からなるアダプターと一緒になった断片はｐ　ＣＤ　４　ＣＨｌのＡｐａｌおよ びＥｃｏＲ１部位内に連結された。なお、Ａｐａ１部位はＣＨＩドメインのアミ ノ末端領域に存在する。生成するプラスミドｐＣＤ４１ＴＭ１０はバクテリオフ ァージＴ７ブロモータの制御下にＣＤ４　（１０９）ＣＨを発現し得る。ｐＣＤ ４１ＴＭＩ　ＯＧは、選択マーカーとしてのＥｃｏ−ｇｐｔ転写ユニットを含む ９７Ｍ３からの６．ｌｋｂのＸｂａｌ−Ｓａｉ＋断片と、ｐＣＤ４１ＴＭＩ　Ｏ からのＣＤ４　（１０９）ＣＨのためのコード配列を含む２．２ｋｂのＸｂａｌ −Ｓａｌｔ断片とを連結することにより構築された。

ｐｃＤ４１ＴＭ２０およびｐＣＤ４１７Ｍ２０Ｇの構築 ハイブリッドタンパク質、ＣＤ４のアミノ末端の２つのＩｇ様トドメイン１−１ ７８）およびヒトＩｇＧ１重鎖分子の３つの定常ドメインからなるＣＤ４　（１ ７８）ＣＨ（図９）を発現するために、ｐＣＤ４１ＴＭ２０およびｐｃＤ４１Ｔ Ｍ２０Ｇが以下のように構築された（図１２）。２つの合成オリゴヌクレオチド ：７Ｍ４　Ｂ　（ＣＴＡＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣ）および Ｔ　Ｍ　４７　（ＣＴ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ　ＣＧ　Ｇ　）か らなるアダプターがｐｃＤ４ｃＨ１のＡｐａｌおよびＮｈｅ１部位内に連結され た。なお、Ｎｈｅｆ部位はＣＤ４の第２ドメインのカルボキシ末端領域に存在す る。生成するプラスミドｐｃＤ４１ＴＭ２０はバクテリオファージＴ７ブロモー タの制御下にＣＤ４　（１７８）ＣＨを発現し得る。

ｐＣＤ４　ＩＴＭ２　ＱＣ；は、選択マーカーとしてのＥｃ。

−ｇｐ　を転写ユニットを含むｐＴＭ３からの６．ｌｋｂのＸｂａｌ　−Ｓａｌ に断片と、ｐＣＩ）４１ＴＭ２０からのＣＤ４（１７８）ＣＨのためのコード配 列を含む２，４ｋｂのＸｂａｌ　−５ａｉｌ断片とを連結することにより構築さ れた。

ｐＣＤ４　ＩＴＭ３０およびｐｃＤ４１ＴＭ３０Ｇの構築ハイブリッドタンパク 質、ＣＤ４のアミノ末端の４つのドメイン（Ｉｉ７２）およびヒトＩｇＧ１重鎮 分子の３つの定常ドメインからなるＣＤ４　（３７２）ＣＨ（図９）を発現する ために、ｐｃＤ４ＩＴＭ３０およびｐＣＤ４　ＩＴＭ３０Ｇが以下のように構築 された（図ＩＡ配列のヌクレオチド５９８−１２５２に相当する０゜６５　ｋ　 ｂ　５ａｃｌ−Ｈｐａｌｌ断片がｐＣＤ４ＧＥＭ４から単離された。２つの合成 オリゴヌクレオチド：７Ｍ４　Ｂ　（ＣＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＡＴＧＧＣＣＴＣ ＣＡ　ＣＣＡ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　ＣＣ）および７Ｍ４９　（ＣＴＴＧＧＴＧＧＡ ＧＧＣＣＡＴＴＧＧＣＴＧＣＡＣ） からなるアダプターと一緒になった断片がｐＣＤ４ＣＨ１のＡｐａｌおよびＳａ ｃ■部位内に連結された。なお、５ａｃｌ部位はＣＤ４の第２ドメインのカルボ キシ末端領域に存在する。生成するプラスミドｐｃＤ４１７Ｍ３０はバクテリオ ファージＴ７ブロモータの制御下にＣＤ４　（３７２）ＣＨを発現し得る。ｐＣ Ｄ４　ＩＴＭ３０Ｇは、選択マーカーとしてのＥｃｏ−ｇＰｉ転写ユニットを含 むｐＴＭ３からの６．ｌｋｂのＸｂａｌ−Ｓａｉｌ断片と、ｐＣＤ４　ＩＴＭｈ ｏからのＣＤ４　（３７２）ＣＨのためのコード配列を含む３．０ｋｂのＸｂａ ｌ−ＳａｌＩ断片とを連結することにより構築された。

ｐＣＤ４１７Ｍ４０Ｇの構築 ハイブリッドタンパク質、ＣＤ４のアミノ末端の１８１個のアミノ酸、Ｈｔｎｄ ｌｌ［制限部位の導入により人為的に生成された１個のアミノ酸（１，ｅｕ）、 ヒトＩｇに軽鎖の結合領域の３個のアミノ酸（Ｇ　１　ｎ−Ｍｅ　ｔ−Ｌｙ　ｓ ）およびヒトＩｇに軽鎖の全定常領域からなるＣＤ４　（１８１）　ＣＬ　Ｃ図 ９）を発現するために、ｐｃＤ４１ＴＭ４０Ｇが以下のように構築された（図１ ４）。ヒトＩｇに軽鎖の結合領域および全定常領域の部分をコード化する０、３ ５ｋｂの旧ｎｄｍ　−Ｘｈｏｌ断片が１）ＩＮ０１４８０から単離された。ここ で、ＨｉｎｄＩＩＩ部位はヒトＩｇに軽鎖ｃＤＮＡの結合領域内に導入され、そ してＸｈｏＩ部位はヒト１ｇに軽鎖ｃＤＮＡの非コード性領域内に導入されてい る。２つの合成オリゴヌクレオチド：ＴＭ６２　（ＣＴＡＧＣ’ｒＴＴＣＣＡＧ Ａ）およびＴＭ６３　（ＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＧ）からなるアダプターと一 緒になった断片が、ｐＣＤ４ＬＴ　Ｍ　１　（Ｍｉｚｕｋａｍｉ等、同上）の誘 導体であるｐＣＤ４ＬＴＭＩＧのＮｈｅｌおよびＳａｌ１部位内に連結された。

このプラスミドは選択マーカーとしてのＥｃｏ−ｇｐｔ転写ユニットを含む。

ＣＶ−１およびＲＰＭＩ８２２６細胞におけるハイプリッドタンパク質の発現 一時的発現およびハイブリッドタンパク質の〔１Ｓ〕システイン（アマルシャム ）での代謝標識はＰｕｅｒｓｔ等。

１９８６、　　Ｐｒｏｃ、　　Ｍａｔｅ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳ Ａ　８３．　８１２２−８１２６の記載に従ってワクシニアＰ７．５プロモータ （Ｆｕｅｒｓｔ等。

同上）の制御下でバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現する ｖＴＦ　７−３に予め感染させた細胞内にハイブリッドタンパク質のための発現 プラスミドをトランスフェクションすることにより行われた。次の分析のために 、培養培地２，５−に１０倍濃縮プロテアーゼインヒビター緩衝液（Ｂｅｒｇｅ ｒ等、同上’）０．２ｄおよび２０％（容量／容量）ノニデットＰ−４００゜１ ４２−を補足した。細胞を、１０倍濃縮プロテアーゼインヒビター緩衝液０．１ −を有するリン酸緩衝化食塩水１．２５ｍ！！に懸濁し、そして２０％（容量／ 容量）ノニデブ）Ｐ−４００，０７１１ｎＩを添加して溶解させた。

処理培養培地０．２３−または細胞抽出物０．１１５−にそれぞれ、０ＫＴ４Ａ および抗Ｌｅｕ−３Ａを０゜５ないし１．０マイクログラム添加し、そして４℃ で８時間保温した。プロティンＡ−アガロースの２０％（容量／容量）懸濁液０ ．１ｍｊを添加して免疫複合体を集め、モしてＢｅｒｇｅｒ等、同上に記載され たように洗浄した。プロティンＡ−アガロースに結合した複合体は８Ｍ尿素含存 のラエムル試料緩衝液中で煮沸することにより可溶化され、モしてＳＤＳポリア クリルアミドゲルで分析された（Ｂｅｒｇｅｒ等、同上）。ゲルをエンハンスに ューイングランド・バイオラプス）で処理し、そして蛍光写真により可視化した 。

種々の抗体およびリガンドのハイブリッドタンパク質への結合条件 処理した培養培地０．１１５１ｎＩを結合性実験のために使用した。ｍ人ｂＯＫ Ｔ４．０ＫＴ４Ａおよびマウス抗ヒトＩｇに鎖への結合のために、培地にｍＡｂ ｏ、５マイクログラムを添加し、４℃で８時間保温し、次いでビオチニル化ヤギ 抗マウスＩｇＧを１０マイクログラム添加し、４℃で８時間保温した。ストレブ タビジンアガロースの２０％（容量／容量）懸濁液０．１−を添加して、回転機 上４℃で１時間保温を続けた。試料を処理し、そしてＢｅｒｇｅｒ等、同上に記 載されたように還元条件下でのＳＤＳポリアクリルアミドゲル（７，５％）電気 泳動で分析された。ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体、およびヤギ抗ヒトＩｇλ軽 鎖抗体への結合のために、培地にビオチニル化ヤギ抗体１０マイクログラムを添 加し、４℃で８時間保温した。ストレブタビジンアガロースの２０％懸濁液０． １−を添加して、上記と同様に試料を処理した。ＨＩＶ−１ｇｐ１２０への結合 のために、培地にその中でｇｐ１２０が二重感染系（Ｆｕｅｒｓ　を等＋　１９ ８７＋　Ｎ。

Ｌ、　ＣｅＬＬ、　８ｉｏ１．７．２５３８−２５４４）　ｉ：基づいたワクシ ニアウィルスにより発現された培養培地０．１−を混合し、そして４℃で２時間 保温した。複合体にハイブリドーマ９０２上澄み０．１−を添加し、４℃で８時 間保温し、次にビオチニル化ヤギ抗マウスＩｇＧ１０マイクログラムを添加し、 ４℃で８時間保温した。ストレブタビジンアガロースの２０％懸濁液０．１ｍｊ を添加して、上記と同様に試料を処理した。プロティンＡ−アガロースの結合の ために、培地にプロティンＡ−アガロースの２０％（容量／容量）懸濁液を直接 添加し、そして回転機上４℃で１時間保温を続けた。試料を次に洗浄し、上記と 同様に処理した。

結果 ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域に連結した異なる長さく１−１０９．１−１７８およ び１−１７２）のヒトＣＤ４細胞外領域を有する３種のハイブリッドタンパク質 〔ＣＤ４　（１０９）ＣＨ，ＣＤ４　（１７８）ＣＨおよびＣＤ４　（３７２） ＣＨ）　、およびＣＤ４のアミノ末端の１８１個のアミノ酸とヒト１ｇ軽鎖定常 領域とからなる１種のハイブリッドタンパク質（ＣＤ４　（１８１）ＣＬ）が設 計された（図９）。これらのハイブリッドタンノ（り質を発現するためにワクシ ニアウィルスに基づく発現系が使用され、そしてこれらのハイブリッドタンパク 質の発現のためのプラスミドが構築された（図１Ｏ−１４）。

これらのプラスミドにおいてハイブリッドタンパク質のためのコード配列はＴ７ ブロモータ下流に置かれ、そしてＴ７ＲＮＡポリメラーゼの共発現下で発現され 得る。

最初に、ＣＶ−１細胞におけるＣＤ４　（１０９）ＣＨ。

ＣＤ４　（１７８）ＣＨおよびＣＤ４　（３７２）ＣＨの発現が調べられた（図 １５）。培養培地および細胞フラクションの両方において、３８キロダルトン（ ｋｄ）、６５ｋｄおよび８８ｋｄのタンパク質が、抗ＣＤ４ｍＡｂとの免疫沈降 、次にプロティンＡ−アガロースでのトラッピングの後の、それぞれｐＣＤ４１ ＴＭＩ　Ｏ，ｐＣＤ４ＩＴＭ２０およびｐＣＤ４　ＩＴＭ３０のトランスフェク ションにより検出された。ＣＤ４　（１０９）ＣＨ，ＣＤ４　（１７８）ＣＨお よびＣＤ４　（３７２）ＣＨの計算された全アミノ酸残基数はそれぞれ４３９． ５０８および７０２である。発現されたタンパク質の観察された分子量は残基数 により計算されたものよりわずかに大きい。

この相違はタンパク質のグリコジル化に原因があると思われる；Ｉｇ！ａのＣＨ ２ドメインおよびＣＤ４の第３および第４１ｇ様ドメインは各々アスパラギン結 合グリコジル化部位を１個有する。合成されたタンパク質のかなりの部分がＩｇ 軽鎖発現の不在下でさえも培養培地中に分泌された；このことはＩｇ重鎖分泌が 軽鎖発現の不在下で低いから（Ｐｅｐｅ等、　Ｊ、　ＩｔｙｔｕｎｏＬ、　１３ ７．２３６７−２３７２）、予期されなかったことである。

ＣＶ−１細胞中に発現されたハイブリッドタンパク質のサブユニット構造は非還 元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された（図１６） 。還元剤の不在下で、ＣＤ４　（１０９）ＣＨ，ＣＤ４　（１７８）ＣＨおよび ＣＤ４　（３７２）ＣＨはおよそダイマ−の位置である高分子量部分に移動した ；これに対し、ＣＤ４の１−３７２のアミノ酸残基からなるＣＤ４の可溶体はお よそモノマー位置に移動した。この結果は、ＣＤ４　（１０９）ＣＨ，ＣＤ４　 （１７８）ＣＨおよびＣＤ４（３７２）ＣＨが培養培地および細胞内部の両方に おいてジスルフィド結合したダイマーとして存在することを示す。

次に、その他のハイブリッドタンパク質ＣＤ４（１８１）ＣＬの発現がＣＶ−１ 細胞（７）ｐＣＤ４１７Ｍ４０Ｇでのトランスフェクションにより行われた（図 １７）。

ｐＣＤ４　ＩＴＭ４０Ｇだけとのトランスフェクションにより、ＣＶ−１細胞ハ ホトＡトＣＤ　４　（１８１）　ＣＬ−Ｃ”ある３４−３８ｋｄのタンパク質を 発現した。このタンパク質の主な部分は還元剤の不在下でもモノマー位置に移動 したが、これはＣＤ４　（１８１）ＣＬがモノマーとして存在することを示す。

これに対し、ＣＤ４　（１７８）ＣＨは非還元条件下でダイマー位置に移動した が、これはＣＤ４　Ｃ１７８）ＣＨがジスルフィド結合したダイマーとして存在 することを示す。両方のタンパク質がｐｃＤ４１ＴＭ２０ＧとｐＣＤ４１ＴＭ４ ０Ｇとの共トランスフェクションにより共発現されたとき、高分子量（〉２００ ｋｄ）を有する新規タンパク質バンドが非還元条件で出現した。このバンドは天 然１ｇ分子に類似する、ＣＤ４　（１７８）ＣＨ（０２つ＋７）ｔｊユ：−ット と’ｃＤ４　（１８１）ＣＬの２つのサブユニットからなるヘテロテトラマー構 造によるものに酷似し、従って４つのＨＩＶ−ｇｐ１２０結合性部位を含む（図 １８）。

次に、ＣＤ４　（１０９）ＣＨ，ＣＤ４　（１７８）ＣＨおよびＣＤ４　（３７ ２）ＣＨの通常のヒトＩｇλ軽鎖との共発現は、ｐＣＤ４　ＪＴＭＩ　Ｏ１ｐｃ Ｄ４１ＴＭ２０およびｐＣＤ４１７Ｍ３０を、ヒトＩｇλ軽鎖を分泌するヒトミ エローマ細胞系（人ＴＣＣＣＣＬ　　１５５）であるＲＰＭＩ８２２６内にトラ ンスフェクションすることにより行われた（図１９）。これらの３種のハイブリ ッドタンパク賃金ては合成され、そして多くの発現したタンパク質は細胞内に蓄 積しているけれども、培養液１０９）ＣＨ，ＣＤ４　（１７８）ＣＨおよびＣＤ ４　（３７２）ＣＨとの共免疫沈降が観察され、これらのハイブリッドタンパク 質が宿主細胞系により合成されたヒト１ｇλ軽鎖と複合体を形成することを示し た。タンパク質複合体が非還元条件下でＳＤＳポリアクリルアミドゲルにより分 析すると、高分子量を存する新規タンパク質バンドが各複合体に対して出現した 。ｐＣＤ４１ＴＭＩ　ｏ。

ｐＣＤ４１ＴＭ２０およびｐｃＤ４１ＴＭ３０でトランスフェクションされた細 胞の培養培地中の主要複合体の予想分子量は、それぞれ１８０ｋｄ、２１０ｋｄ 、および＞２２０ｋｄである。この結果は、これらの複合体が各ハイブリッドタ ンパク質の２つのサブユニットおよび宿主細胞からのヒトＩｇλ軽鎖の２つのサ ブユニットからなるテトラマー構造であることを示す。それ故に、これらの分子 は天然１ｇ分子に類似の構造を有し得る。

ＣＤ４　（１７８）Ｃ）（の種々のリガンドおよび抗体への結合特性が次に調べ られた。発現され、モしてＣＶ−１トランスフエクシヨン細胞から分泌されたＣ Ｄ４　（１７８）ＣＨがまず分析された（図２０）。全体の細胞外の４種のＩｇ 様トドメイン含有するＣＤ４の可溶性体もまた発現され、そして対照として分析 された。ＣＤ４（１７８）ＣＨはＨＩＶｇｐ１２０．０ＫＴ４Ａ、抗ヒト１ｇＧ （Ｆｃ）抗体、およびプロティンＡ−アガロースに結合したが、０ＫＴ４に結合 しなかった。可溶性ＣＤ４はＨＩＶｇｐ１２０．０ＫＴ４および０ＫＴ４Ａに結 合した。しかしながら、それは抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体、およびプロティン人 −アガロースに結合しなかった。ｇｐｘｚｏおよび０ＫＴ４Ａへの結合領域はＣ Ｄ４の最初のドメイン中に同定された（Ｃ１ａｙｔｏｎ等、同上；Ｌａｎｄａｕ 等、同上；　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ等、同上；　Ｍｉｚｕｋａｍｉ等、同上）。

一方、０ＫＴ４への結合領域はＣＤ４の第３または第４のドメインに存在すると 信じられている。これらの結果はＣＤ４　（１７Ｂ）ＣＨおよび可溶性ＣＤ４の 試験されたリガンドおよび抗体への結合特性と一致する。

トランスフェクションされたＲＰＭ１８２２８ｍ胞により宿主誘導ヒトＩｇλ鎖 と共発現されたＣＤ４（１７８）ＣＨは次に種々のリガンドおよび抗体への結合 特性のために試験された（図２１）。ハイブリッドタンパク質はｇｐ１２０．０ ＫＴ４Ａ、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体、およびプロティンＡ−アガロースに結合 したが、しかし０ＫＴ４に結合しなかった。Ｉｆλ鎖を抗ヒトＩｇλ鎖抗体と免 疫沈降させた場合、ＣＤ４　（１７Ｂ）　ＣＨもまたそれと共免疫沈降されたが 、これはＣＤ４（１７８）ＣＨが宿主誘導λ鎖と複合体を作ることを示す。

ＣＶ−１細胞中で共発現されたＣＤ４　（１７８）ＣＨおよびＣＤ４　（１８１ ）ＣＬもまた、種々のリガンドおよび抗体に対する結合特性に対して分析された （図２２）。

０ＫＴ４はＣＤ４　（１７８）ＣＨおよびＣＤ４（１８１）ＣＬを免疫沈降させ なかったせれども、０ＫＴ４Ａはこれらの両方のハイブリッドタンパク質を免疫 沈降させた。

ｇｐ１２０もまた両方のタンパク質に結合し得る。抗ヒト１ｇＧ（Ｆｃ）抗体、 およびプロティンＡ−アガロースはＣＤ４　（ｉ　７８）ＣＨを免疫沈降させ得 、そしてそれと−緒にＣＤ４　（１８１）ＣＬを共沈殿させ得る。抗ヒトにｍＡ ｂはＣＤ４　（１８１）ＣＬを免疫沈降させ得、そしてそれと−緒にＣＤ４　（ １７Ｂ）ＣＨを共沈殿させ得る。これらの結果は、図１７に示した結果と共に、 ＣＶ−１ｍ胎胞中共発現されたＣＤ４　（１７８）ＣＨおよびＣＤ４　（１８１ ）ＣＬはへテロテトラマー構造のタンパク質複合体を形成し、その中で各サブユ ニットは種々のリガンドおよび抗体に対する固有の結合特性を保持していること を示す。

要するに、本発明のこの部分は、ヒトＩｇＧの重鎮および軽鎖成分の定常領域に 結合したヒトＣＤ４のｇｐ１２０結合領域からなるマルチマー組換えタンパク質 の構築、ＨＩＶ活性を中和するか、ＨＩＶ感染細胞を殺すか、またはＨＩＶヴイ リオンを溶解することによりＨＩＶ増殖を阻害する特性を少なくとも存する生成 組換えタンパク質を教示する。

本発明のユニークな組換えタンパク質の有用性は、ＨＩＶを殺すかまたはＨＩＶ 感染を阻害するための本発明に係る組換えハイブリッドタンパク質の有効量、お よび薬学的に許容性の担体からなる治療または予防用組成物の製造を可能にする ことである。ＨＩＶ感染を治療するか、または阻害する方法は、ＨＩＶ感染を撲 滅するか、または阻害するために、ＨＩＶに対して保護または治療の必要な宿主 に上記組成物の有効量を投与することからなる。

本発明に係る組換えハイブリッドタンパク質の産生のためのプラスミドｐＣＤ４ １ＴＭＩ　０ＧＳｐＣＤ４１７Ｍ２０Ｇ、ｐＣＤ４１ＴＭ３０ＧおよびｐＣＤ４ １ＴＭ４０Ｇの寄託は、アメリカ合衆国、２０８５２メリーランド、ロックヴイ レ、パークロウン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクション（ＡＴＣＣ）に１９８９年４月２７日に行い、寄託番号はそれぞれ６ ７９４０．６７９４１．６７９４２および６７９４３である。寄託物は寄託日か ら３０年間または寄託試料の最後の請求日から５年のより長い方の間生存したま ま保管され、もし生存していない場合は再寄託するであろう。そして法律に特に 制限のない場合一般に分譲される。特許および商標子の長官は請求に応じて寄託 物を利用するであろう。

本明細書に記載された実施例および実施態様は説明のためのものであり、そして 本明細書の記載から種々の変形または変更は当業者には考えられ得るものであり 、それらは本発明の範囲内に包含されるものである。

ＡＤＰ’／ホ“シｌＬイと　已古ｆ生　（Ｈ）ＦＩＧ、２Ｂ １２３　や　　　４５６ ％之：ｔＢ； ＦＩＧ、６Ａ　　　　　　　　　　ＦＩＧ、６ＢＱ ＣＤ４（１０９）ＣＨ；　４３９ａａ　（ｐｃＤ４１ＴＭ１０Ｇ）ＦＩＧ、Ｉ！ ＦＩＧ、＋２ ＦＩＧ、１５ ＦＩＧ、Ｉ６ ＦＩＧ、［７ Ｆ　ｉ　Ｇ、２０ ＦＩＧ、２１ 国際調査報告 ｎ＋ｍ晰−＋　ａ紳鵜ｍｍｍｍ１ｌ、　ｒ　＋−Ｔ　／　ｕｓ　８９．１０　Ｊ 　２６７

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞毒性に必須の領域を含有するタンパク質毒素配列に結合した細胞のレセ プター配列からのウイルス結合性領域を含む、ハイブリッドタンパク貧の適当な 発現ベクター内での合成を指示するキメラ遺伝子。
2. ２．細胞のレセプター配列がＣＤ４からのものであり、タンパク質毒素配列がシ ュードモナス外毒素Ａからのものである請求項１記載の遺伝子。
3. ３．ＣＤ４（１７８）−ＰＥ４０融合タンパク質の合成を指示する請求項２記載 の遺伝子。
4. ４．クローニングベクター内に挿入された請求項３記載の遺伝子。
5. ５．クローニングベクターがＡＴＣＣ寄託番号第６７７３９号の機能的特性を有 する請求項４記載の遺伝子。
6. ６．細胞毒性に必須の領域を含有するタンパク質毒素配列に結合した細胞のレセ プター配列からのウイルス結合性領域を含むハイブリッドタンパク質からなる細 胞毒性剤。
7. ７．細胞のレセプター配列がＣＤ４からのものであり、タンパク質毒素配列がシ ュードモナス外毒素Ａからのものである請求項６記載の細胞毒性剤。
8. ８．ＣＤ４（１７８）−ＰＥ４０組換え融合タンパク質である請求項７記載の細 胞毒性剤。
9. ９．最初の２つの免疫グロブリン型ドメインを含み、ヒト免疫不全ウイルスエン ベロープ糖タンパク質の外部サブユニットであるｇｐ１２０に結合する成熟ヒト ＣＤ４のＮ末端にある１７７個のアミノ酸残基を含む組換え分子。
10. １０．ヒトＩｇＧの定常領域に組換えにより連結されたヒトＣＤ４のｇｐ１２０ 結合性領域を含むハイブリッドタンパク質。
11. １１．マルチマーである請求項１０記載のハイブリッドタンパク質。
12. １２．ダイマーである請求項１１記載のハイブリッドタンパク質。
13. １３．共発現されたＣＤ４−ヒト重鎖定常領域と通常ヒトＩｇＧ軽鎖とからなる ヘテロテトラマーである請求項１１記載のハイブリッドタンパク質。
14. １４．ＣＤ４−ヒト軽鎖定常領域構築物と共発現された、共発現されたＣＤ４ヒ ト重鎖定常領域構築物とからなるヘテロテトラマーである請求項１１記載のハイ ブリッドタンパク質。
15. １５．補体成分Ｃｌｑに対する結合親和性を有する請求項１１記載のハイブリッ ドタンパク質。
16. １６．ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質を発現するＨＩＶ感染された細胞の補体 依存性溶解を媒介する請求項１１記載のハイブリッドタンパク質。
17. １７．遊離ＨＩＶヴィリオンの補体依存性溶解を媒介する請求項１１記載のハイ ブリッドタンパク質。
18. １８．抗体依存性である細胞の細胞毒性を媒介する請求項１１記載のハイブリッ ドタンパク質。
19. １９．抗体依存性である細胞の細胞毒性を媒介する細胞のＦｃレセプターへの結 合親和性を有する請求項１１記載のハイブリッドタンパク質。
20. ２０．ウイルス感染の増殖を防止する請求項６記載の細胞毒性剤の有効量および 必要ならば薬学的に許容性の殺菌非毒性担体を含む組成物。
21. ２１．ＨＩＶ感染の増殖を防止するための請求項２０記載の組成物。
22. ２２．宿主細胞へのＨＩＶの結合を阻害するための請求項９記載のペプチドを有 効量含有する組成物。
23. ２３．ＨＩＶ感染を阻害するか、またはＨＩＶ感染した細胞およびヴィリオンを 殺す請求項１０記載のハイブリッドタンパク質の有効量および薬学的に許容性の 担体を含む組成物。
24. ２４．ウイルス感染された細胞と、ウイルス感染された細胞を殺す請求項６記載 の薬剤の細胞毒性量を接触させることからなるウイルス感染を防止する方法。
25. ２５．ＨＩＶ感染された細胞と、ＨＩＶ感染された細胞を殺す請求項６記載の薬 剤の細胞毒性量を接触させることからなるＨＩＶ感染を防止する方法。
26. ２６．宿主細胞に請求項９記載のペプチドの有効量を供給し、宿主細胞でのｇｐ １２０と中性ＣＤ４との相互作用を阻害することからなる宿主細胞のＨＩＶ感染 を予防する方法。
27. ２７．ＨＩＶ感染された細胞またはヴィリオンを請求項２３記載の組成物の有効 量と接触させ、ＨＩＶ感染された細胞を選択的に殺すか、またはＨＩＶ活性を阻 害することからなるＨＩＶ感染を防止する方法。