JPH08503125A - 非ペプチジル成分と複合化されたＣＤ４−ガンマ２およびＣＤ４−ＩｇＧ２免疫複合体、並びにその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、１）非ペプチジル毒素と、２）これに結合したＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体とを含む免疫複合体を提供する。本発明はまた、１）低レベルから中レベルの細胞毒性をもった、ガンマ放射線を放出する放射性核種と、２）これに結合したＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体とを含む免疫複合体を提供する。本発明は更に、１）非ペプチジル毒素と、２）二つの重鎖および二つの軽鎖を含むヘテロ四量体とを含んだ免疫複合体であって、前記二つの重鎖は両者共にａ）ＩｇＧ２重鎖またはｂ）キメラＣＤ４−ＩｇＧ２重鎖の何れかであり、また前記二つの軽鎖は両者共にａ）カッパ軽鎖またはｂ）キメラＣＤ４−カッパ軽鎖の何れかである免疫複合体を提供する。本発明は更に、１）低レベルから中レベルの細胞毒性をもった、ガンマ放射線を放出する放射性核種と、２）二つの重鎖および二つの軽鎖を含むヘテロ四量体とを含んだ免疫複合体であって、前記二つの重鎖は両者共にａ）ＩｇＧ２重鎖またはｂ）キメラＣＤ４−ＩｇＧ２重鎖の何れかであり、また前記二つの軽鎖は両者共にａ）カッパ軽鎖またはｂ）キメラＣＤ４−カッパ軽鎖の何れかである免疫複合体を提供する。本発明は最後に、本発明の免疫複合体を使用する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 非ペプチジル成分と複合化された ＣＤ４−ガンマ２およびＣＤ４−ＩｇＧ２ 免疫複合体、並びにその使用 〔発明の背景〕 本出願を通して、種々の刊行物が括弧内のアラビア数字で参照される。これら 刊行物の完全な引用は、請求の範囲の直前の明細書末尾に列挙してある。これら 刊行物の開示は、本発明が属する技術の状態をより完全に記述するために、参考 として本出願に取り込まれる。 動物ウイルスのライフサイクルは、宿主細胞の多量の感染に必要とされる一連 の現象によって特徴付けられる。複製サイクルの最初のステップは細胞表面への ウイルスの付着であり、この付着は、標的細胞表面の受容体に対するウイルスの 付着タンパク（ＶＡＰ）の特異的な相互作用によって媒介される。ウイルスの宿 主レンジ及び属性は、主にこれら受容体の発現パターンによるものである。従っ て、ＶＡＰとその細胞受容体との相互作用は、ウイルス性疾患の感染および病理 に重要な役割を演じ、また抗ウイルス治療剤の開発を目的とした重要な領域を提 供する。 細胞受容体は、タンパク、糖鎖および脂質を含む膜の全ての成分を具備し得る 。標的細胞表面へのウイルスの付着を媒介する分子の同定は、数例しか行われて いない。最も広範に特性が明らかにされたウイルス受容体タンパクは、ＣＤ４ （Ｔ４）である（１）。ＣＤ４は、主にヘルパーＴリンパ球、単球／マクロファ ージ系列および樹状細胞の細胞表面に発現する非多形性の細胞表面糖タンパクで ある。ＣＤ４は、抗原提示細胞表面の主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）ク ラスII分子と共働して、効率的な細胞性の免疫応答相互作用を媒介する。ＣＤ４ はまた、人間においてはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）との相互作用の標的で ある。 ＨＩＶは表面にＣＤ４を発現している細胞、主にヘルパーＴリンパ球、単球、 マクロファージおよび樹状細胞に感染する。ＨＩＶに感染したヘルパーＴ細胞は 死滅するが、これらＣＤ４⁺Ｔリンパ球の喪失は、ＨＩＶ感染が進行したことを 示す一つのマーカーである。これら細胞の減少は、おそらく、ヒト後天的免疫不 全症候群（ＡＩＤＳ）の発症をもたらす免疫機能喪失の重要な原因である。ヘル パーＴ細胞とは対照的に、他のＣＤ４⁺細胞（樹状細胞、単球およびマクロファ ージでは特に顕著に）は、慢性的にＨＩＶに感染する。これらは長期間に亘って ウイルスを産生し、in vivoでの主要なウイルス貯蔵器になっているように思え る（２，３）。 ＨＩＶ複製サイクルの初期相には、ＨＩＶの外部エンベロープ糖タンパクｇｐ 120と、表面ＣＤ４（Kdは略４×１０^-9）との間の親和性の高い相互作用が含ま れる（２）。幾つかの系統の証拠は、ウイルスの感染性に関するこの必要性を示 している。イン・ビトロにおいて、ＨＩＶに対して耐性である細胞をＨＩＶ感受 性にするためには、ＣＤ４を発現しないヒト細胞内に、ＣＤ４を発現する機能的 ｃＤＮＡを導入すれば 充分である（３）。イン・ビボにおいて、ウイルス感染はＣＤ４を発現している 細胞に限定されるように思える。細胞表面のＣＤ４に対するＨＩＶｇｐ120の結 合に続いて、ウイルス膜および標的細胞膜が融合し、ウイルスキャプシドは標的 細胞の細胞質内に導入されることになる。 ＨＩＶのｇｐ120及びＣＤ４の間の相互作用に関する特性の解明は、両分子を コードするｃＤＮＡクローンの単離によって容易になっている（６，７）。ＣＤ ４は非多形性で且つ系列限定の（lineage-restricled）細胞表面糖タンパクであ り、これは免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの一員である。完全な長さ のＣＤ４、並びに切断された不完全な可溶性ＣＤ４変種（ｓＣＤ４）の両者につ いての高レベルの発現が、安定した発現系において記述されている。多量の精製 ｓＣＤ４が入手可能になったことにより、この複雑な糖タンパクの構造に関する 詳細な理解が可能になっている。成熟ＣＤ４は55キロドルトンの相対分子量（Ｍ ｒ）を有しており、Ｖ１−Ｖ４と称される四つのタンデム免疫グロブリン様領域 を含んだアミノ末端の372アミノ酸細胞外ドメインと、これに続く23アミノ酸の トランスメンブランドメイン及び38アミノ酸の細胞質セグメントとからなってい る。アミノ末端免疫グロブリン様ドメインＶ１は、カッパ軽鎖可変領域との間で 32％の相同性を有している。四つの免疫グロブリン様ドメインのうちの三つ（Ｖ １，Ｖ２およびＶ４）はジスルフィド結合を含んでおり、該分子のカルボキシ末 端部分におけるＮ−結合されたグリコシル化部位が利用される（４，８）。 切断された不完全なｓＣＤ４を用いた実験により、ＨＩＶ・ｇｐ120に対する 高い親和性を決定する領域は、アミノ末端免疫グロブリン様ドメインＶ１内にあ ることが示された（９−１１）。Ｖ１の変異分析によって、免疫グロブリンの第 二相補性決定領域（ＣＤＲ２）との構造的相同性を有する領域を具備した、分離 されたｇｐ120結合部位（成熟ＣＤ４タンパクの残基38-52）が定義された（１１ ）。Ｖ１，Ｖ２が大量に製造されることによって、この二つのアミノ末端免疫グ ロブリン様領域の構造的分析が可能になっている。2．3オングストロームの解像 度で決定された構造によって、該分子は、連続的なベータ鎖で結合された免疫グ ロブリン折り畳み構造を含んだ、二つの密接に関連したドメインを有することが 明らかになった。モノクローナル抗体、クラスIIＭＨＣ分子およびＨＩＶ・ｇｐ 120のための推定される結合部位（変異分析によって決定されたもの）は、分子 表面に存在する（１２，１３）。 ｇｐ120を発現するＨＩＶまたはＨＩＶ感染細胞を標的とするＣＤ４系分子（C D4-based molecules）を用いた、多くの治療戦略が提案されている。これらの戦 略は、ＣＤ４とｇｐ120との間の相互作用に依存するという利点を有している。 この相互作用はウイルス感染のために不可欠であるから、ＣＤ４に基づく戦略は 全てのＨＩＶ株に対して有効であるに違いない。更に、ＣＤ４結合を排除するｇ ｐ120における突然変異を伴って、逸脱変異（escape mulants）が発生すること は殆どありそうにない。これは、ｇｐ120の他の領域（例えば ワクチン・アプローチ）または他のウイルスタンパク（例えば逆転写酵素）を標 的とする治療戦略とは著しく対照的である（この治療はＨＩＶ株の限られたサブ セットに対して有効であり、および／または該ウイルスは突然変異して該治療に 対して耐性になり得る）。 ＣＤ４に基づく治療の一例において、全ＣＤ４細胞外セグメントの可溶性変種 （Ｖ１−Ｖ４、ｓＣＤ４という）が開発されている（１４）。イン・ビボの実験 によって次のことが示される：1）ｓＣＤ４は、ＨＩＶ・ｇｐ120に結合すること によって「分子的おとり」として作用し、ウイルス付着およびこれに続くヒト細 胞の感染を阻害する；2）（これは、ＨＩＶの臨床的単離物に関してよりも、実 験室的単離物に関してより重要であるが、）ｓＣＤ４はウイルス表面からウイル スエンベロープ糖タンパクｇｐ120を「剥ぎ取る」；3）ｓＣＤ４はウイルスに媒 介された細胞融合を阻害することによって、細胞間でのウイルスの広がり、即ち ＨＩＶ感染細胞から非感染細胞へのウイルスの広がりを阻止する（１，１５）。 イン・ビトロでの結果に加え、シミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に感染し たアカゲザルにおいてｓＣＤ４を用いた実験が記載されている。これらの研究は 、ＳＩＶに感染したアカゲザルにｓＣＤ４を投与すると、ウイルス貯蔵器の縮小 を導くことが示された。 ｓＣＤ４を用いたヒト臨床試験のフェーズＩによって、30mg／日の高い投与量 で投与した場合にも、ｓＣＤ４は顕著な毒性または免疫原性を伴わないことが示 された。ＣＤ４細胞 のカウント及びＨＩＶ抗原のレベルに関しては、予備的な抗ウイルス的研究では 結論が出ていない（１６，１７）。 ｓＣＤ４を用いたこれらイン・ビトロ及び霊長類での研究、並びにヒト臨床研 究では勇気づけられる積極的な結果が得られたが、これらは又、幾つかの制約を も規定している。特に、測定されたｓＣＤ４の血清半減期が非常に短い（ヒトで は静脈内投与後30〜45分）。ｓＣＤ４の投与がＨＩＶを身体から排除できると考 えることは困難であり、むしろ感染の広がり及び病気の発症を遅延または防止す るために用いられるであろう。従って、治療レジメにはタンパクを用いた正規の 治療が含まれるであろう。しかし、ｓＣＤ４の短い半減期によって、治療効果を 与える血漿中の十分なレベルを維持することが困難になるであろう。全ての臨床 的単離物は或る濃度で中和され得るが、実験室での単離物と比較して、臨床的な ＨＩＶ単離物の中和には極めて高レベルのＣＤ４が必要とされるという事実によ って、この問題は倍加される（１８）。ＣＤ４に基づく半減期の長い分子を作成 するために、幾つかのグループが、ＣＤ４のｇｐ120結合領域と免疫グロブリン 分子のような他のタンパクとを含むキメラＣＤ４分子を作成している。これらの 分子について以下に詳述する。 ｓＣＤ４の他の欠点は、単球／マクロファージ及び樹状細胞のようなＨＩＶ感染 細胞を殺滅しないことである。これら細胞はＨＩＶの貯蔵器として働き、ヘルパ ーＴリンパ球のような他の細胞に感染するウイルスを慢性的に産生する。上記に 述べたＣＤ４に基づくキメラはまた、ＨＩＶ感染細胞の殺滅 において限られた効率を有するであろう。ＣＤ４とヒト免疫グロブリン・ガンマ １との間のキメラは、in vitroでは、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）によって ＨＩＶ感染細胞を殺滅し得るが、抗腫瘍性モノクローナル抗体を用いた実験によ って、モノクローナル抗体に媒介されたＡＤＣＣはin vivoでは殆ど効果がない ことが示唆されている。このため、他のＣＤ４に基づいたアプローチが開発され てきており、ここではｓＣＤ４が毒素分子に結合される。これらのキメラは、表 面にｇｐ120を発現するＨＩＶ感染細胞に結合して、これを殺滅する。 一つの研究においては、ｓＣＤ４が、リボソームを不活性化してタンパク合成 を阻害し、細胞を死滅させるリシンの脱グリコシル化Ａ鎖に結合された。この融 合タンパクは、五種類の異なったＨＩＶ単離物に感染した細胞を溶解するけれど も、非感染細胞に対しては毒性をもたないことが報告された（１９）。 別の研究においては、ＣＤ４のＶ１Ｖ２ドメインがシュードモナス・エキソト キシンＡのドメインIIおよびIIIに結合された（ｓＣＤ４−ＰＥ４０）（２０） 。この毒素もまたタンパク合成を阻害するが、この場合は延長因子２を不活性化 することによる。このｓＣＤ４−ＰＥ４０融合タンパクは、ＨＩＶエンベロープ 糖タンパクｇｐ120を発現する細胞に結合して、その細胞内におけるタンパク合 成を阻害する（２０）。このｓＣＤ４−ＰＥ４０複合体は、実験室的および臨床 的なＨＩＶ単離物で感染された細胞を殺滅することが示されてい る。このことは、ｓＣＤ４および他のＣＤ４に基づく分子の場合に、ＨＩＶの実 験室的単離物の中和よりも、臨床的単離物を中和することにおいて著しく有効性 に劣ることとは対照的である（１８）。一次（primary）単離物および実験的単 離物の感受性が相違するメカニズムは、ｓＣＤ４が、臨床的単離物からよりも実 験室的単離物のビリオンから、より効率的にｇｐ120を剥ぎ取ることにあるよう に思える（２１）。しかしながら、in vivoにおいてＨＩＶ感染細胞を標的とす るｓＣＤ４−毒素分子を用いるときには、臨床的単離物におけるｇｐ120の剥ぎ 取りに対する耐性は利点である。 ＣＤ４−ＰＥ４０の更なる研究によって、この複合体は、逆転写酵素阻害剤の ＡＺＴと組合わせて用いると、感染細胞の培養物からＨＩＶを排除できることが 示された（２２）。この効果は、種々の異なった細胞タイプと同様に、実験室的 および臨床的単離物について見られている。 更に別の研究においては、ジフテリア毒素のフラグメントが遺伝子的にＣＤ４ のＶ１およびＶ２ドメインと融合された（２３）。この毒素もまた、延長因子２ を不活性化することによって作用する。このＣＤ４−ジフテリア毒素の融合タン パクは、ＨＩＶ感染細胞の殺滅において有効であり且つ特異的であった。理由は 和から内が、長期処理（18日）を行った後には、ＨＩＶに感染した培養物はＣＤ ４−ジフテリア毒素複合体に対して耐性になった。他の毒素複合体についてはこ の現象は見られなかったので、この所見の有意性ないし重要度は不明瞭である。 更に、このＣＤ４−ジフテリア毒素複合 体の研究はＨＩＶの実験的単離物を用いて行われただけであり、一次臨床的単離 物ならびに他の細胞タイプに対する活性を評価することが重要であろう。 これらＣＤ４−毒素複合体は、幾つかの大きな欠点を有している。第一に、ｓ ＣＤ４またはＣＤ４の小さいフラグメントに基づいているため、当該分子の半減 期は非常に短く、他の場合よりも高い投与量および頻繁な投与の必要性をもたら す。第二の欠点は、毒素部分が免疫原性の高い外来タンパクであることである。 この複合体に対する強力な免疫反応の発生は、一人の患者に使用され得る繰り返 し治療回数を制限する。同様の関係において、腫瘍の治療のために、モノクロー ナル抗腫瘍抗体−毒索の複合体と共に免疫抑制剤を投与しなければならないであ ろうことが示唆されている（２４）。しかしながら、免疫系が既に損傷されてい るＨＩＶ感染の場合には、このアプローチを用いることはできないであろう。 本発明においては、ＨＩＶ感染細胞に対して毒性であるＣＤ４系分子の新しい ファミリーが提供される。これらの分子は、ＨＩＶ感染患者に使用し、慢性的に ＨＩＶを産生する細胞を破壊することによってＨＩＶ感染の進行を遅れさせ、ま たは停止させる上で多くの利点を有している。更に、この分子は、例えばＨＩＶ 陽性の母親から生まれた乳児、またはＨＩＶ陽性の体液に晒されるヘルスワーカ ーのような或る種の個体における初期感染を阻止する上でも価値があるであろう 。おそらくは、これらの場合の伝染は主に細胞−細胞のメカニズムで生じ、また 標的個体での感染が開始した直後に感染細 胞を殺滅することによって、感染を制限または防止できるであろう。これらのＣ Ｄ４系分子は、ＣＤ４部分およびガンマ２サブクラスのヒト免疫グロブリン分子 部分からなる融合タンパクと、非ペプチド毒素または細胞毒性放射活性部分との 結合に基づいている。これらの分子は、既述したＣＤ４系分子の全てを凌駕する 顕著な利点を有している。 免疫グロブリンは、その性質によって、これらＣＤ４系細胞毒分子のための適 切な「骨格」を形成する。免疫グロブリンまたは抗体は、液性免疫応答を構成す る抗原結合性の分子であり、Ｂリンパ球によって産生される。免疫グロブリン分 子の基本的なユニットは、二つの同じ重鎖および二つの同じ軽鎖からなる。夫々 の鎖のアミノ末端は、アミノ酸配列が可変の領域（可変領域）を含んでいる。重 鎖および軽鎖の可変領域は相互作用して、二つの抗原結合部位を形成する。夫々 の鎖のカルボキシ末端は、アミノ酸配列が一定である領域（定常領域）を含んで いる。軽鎖は単一の定常領域を含んでいるのに対して、重鎖の定常ドメインは四 つの分離したドメインに分けられる（ＣＨ１，ヒンジ，ＣＨ２，及びＣＨ３）。 免疫グロブリン分子の重鎖には、ミュー（Ｍ）、デルタ（Ｄ）、ガンマ（Ｇ）、 アルファ（Ａ）及びエプシロン（Ｅ）を含む幾つかのタイプが存在する。免疫グ ロブリン分子の軽鎖には、カッパ又はラムダの二つのタイプが存在する。重鎖お よび軽鎖の個々のタイプには、エフェクター機能において異なり得るサブタイプ が存在する。組み立てられた免疫グロブリン分子は、それが具備する重鎖のタイ プに由来した名前が付 される。 モノクローナル抗体の開発によって、動物またはヒトの血清から得られる抗体 の固有の不均一性の問題が解消されてきている。しかしながら、殆どのモノクロ ーナル抗体はマウス起源の細胞に由来しており、従って、ヒトに投与されるとき には免疫原性を有する。より最近では、分子遺伝学とモノクローナル抗体技術と の組み合わせによって、「ヒト化された」キメラ抗体のイン・ビトロでの製造が 開発されている。これらのキメラ抗体においては、ヒト免疫グロブリンにおける 重鎖および軽鎖の可変ドメインが、ネズミモノクローナル抗体に由来する重鎖お よび軽鎖の特異的な可変ドメインで置き換えられる（２５−２７）。この遺伝子 操作の結果、特定の抗原に対する特異性およびヒト免疫グロブリンの特性をもっ た分子が得られる。 ＣＤ４の配列解析および構造解析によって、前記四つの細胞外ドメインは免疫 グロブリン様であることが示された。免疫グロブリンのＦｃ部分は該分子の異化 速度を制御し（14〜21日の血清半減期）、また種々のエフェクター機能を提供す るから、幾つかの報告には、免疫グロブリンの可変領域および定常領域をＣＤ４ の免疫グロブリン様ドメインで置き換えることが記載されている（２１−２４） 。 キメラガンマ１・重鎖二量体をもたらすＣＤ４−ＩｇＧ１重鎖の融合タンパク が記載されている（２８）。これらの分子は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメ インに加えて、ガンマ１・重鎖ＣＨ１ドメインを含んでいる。しかしながら、軽 鎖の不存在下でＣＨ１ドメインが発現されるときは、重鎖の組み立て及び哺乳動 物細胞からの分泌は効率が低い（３２）。その後、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領 域の最初の５アミノ酸を欠いた、高レベルで分泌されるＣＤ４−ＩｇＧ１重鎖の 融合タンパクが記載された（２９）。 また、ＣＤ４−ＩｇＧ１の融合タンパクも記載されている。ここでは、ＣＤ４ のＶ１Ｖ２ドメインが、ガンマ１重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ド メインに融合され、またＣＤ４のＶ１Ｖ２ドメインがカッパ軽鎖の定常領域に融 合された（３３）。ＣＤ４−ＩｇＭ重鎖の融合タンパクもた既述されている（３ ４）。 これらの融合タンパクは、イン・ビトロでのＨＩＶ感染を阻止するために用い られて成功しており、また一つの事例では、実験室的なＨＩＶ株によるチンパン ジーの感染阻止にも成功している。期待された通り、このＣＤ４−免疫グロブリ ン・キメラの半減期は、ｓＣＤ４の半減期よりも著しく長い。しかし、上述した ように、これら分子は既にＨＩＶに感染した患者においてＨＩＶ感染細胞を破壊 することができる。今後、そのＨＩＶの一次単離物に対する効果も確立されるべ きであろう。 これらの融合タンパクは、Ｆｃ受容体結合、Ｆｃ受容体依存性の機構を介した 輸送、および補体活性化のような、免疫グロブリン分子の種々のエフェクター機 能を保持している（２９）。これらのエフェクター機能は幾つかの治療レジメに おける有用性を有しているが、ＣＤ４−免疫グロブリン・ キメラに結合した毒素または放射性核種からなる細胞毒性薬剤を開発する本発明 において、これらは欠点である。 抗体の機能の多くは、Ｆｃ受容体との相互作用を介して媒介される。これら受 容体は、マクロファージ、他の白血球、血小板および胎盤栄養芽細胞を含む種々 の細胞に見出だされる（３５）。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンのＦｃ部分に結合 し、この複合体は細胞タイプに応じて種々の反応をトリガーする。マクロファー ジの場合、この反応にはファゴサイトーシス及びＡＤＣＣが含まれ得る。胎盤栄 養芽細胞については、ＩｇＧ１結合は抗体の胎児への輸送を導く。 ヒト細胞は、異なった免疫グロブリンアイソタイプに特異的な、多くの異なっ たＦｃ受容体を発現する。ヒトＩｇＧ（ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲ III）に結合する三つのタイプのヒトＦｃ受容体が既に記述されている（３５） 。ＦｃγＲＩは、ＦｃγＲIIおよびＦｃγＲIIIよりも、モノマーＩｇＧに対す る極めて高い親和性を有している。ＩｇＧアイソタイプに対するＦｃγＲＩの活 性の序列は、ＩｇＧ１＝ＩｇＧ３＞ＩｇＧ４である。ＩｇＧ２はこの受容体に結 合しない。ＦｃγＲIIは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４よりもＩｇＧ１およびＩｇＧ ３に対してより強く結合する。ＦｃγＲIIIは、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３のみを 認識する。 ＦｃＲ結合能力を有する細胞毒分子は、ＦｃＲを有する細胞を無差別に殺滅し 得る。ＨＩＶ感染細胞を特異的に殺滅するＣＤ４系分子を構築するためには、Ｆ ｃＲ結合を少ししか示さないか、或いは全く示さないＩｇＧ２に基礎を置くのが 理想的であろう。更に、ヒトＩｇＧ１抗体は著しい変化を有するのに対して、ヒ トＩｇＧ２抗体は最小限のアロタイプ変化を示す。従って、免疫グロブリンドメ インを含む組換え分子に対する強力な免疫原性反応を回避するために、多形性の 最も少ない分子が選択された。 このＣＤ４−ＩｇＧ２分子は、先に記述されているＣＤ４−ＩｇＧ１重鎖二量 体よりも有利である。また、これらは過去に開発されたことがあるＣＤ４−毒素 の分子よりも優れている。より詳細にいえば、ＣＤ４のＶ１Ｖ２ドメインを含む ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体が構築された。このキメラ重鎖ホモ二 量体は、哺乳動物細胞内で効率的に組み立てられ、哺乳動物細胞から効率的に分 泌されるので、該キメラ重鎖ホモ二量体を発現する細胞の培地から高効率で回収 し、精製することが可能である。このホモ二量体を構築するために、ヒトガンマ ２・重鎖からの全体のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域が用いられた。 これによって、二量体化および効率的な分泌の原因であるヒト・ＩｇＧ２分子の 定常ドメインを含むキメラ分子がもたらされた。これは、カプロン及びグレゴリ ー（３６）によって記述された、ＣＤ４−ＩｇＧ１重鎖二量体中にＣＨ１ドメイ ンを含み、組換分子の分泌および細胞培養からの回収性に乏しい重鎖二量体とは 対照的である。また、効率的な二量体化を提供するために、本発明のＣＤ４−ガ ンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体中にガンマ２重鎖の全体のヒンジドメインを含ま せた。何故なら、このドメイン中に含まれるシステイン残基は、ホモ二量体の第 二鎖に対してジスルヒド結合を形成し、二つの鎖を正しい空間的配置に位置付け て抗原結合部位の形成を容易にする原因になるからである。 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体に加えて、ＣＤ４−ＩｇＧ２・重鎖 が構築された。これは、ヒトガンマ２重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ ３ドメインに融合されたＣＤ４のＶ１Ｖ２ドメインを含んでいる。また、ＣＤ４ −カッパ・キメラ軽鎖も構築されたが、これはヒトカッパ軽鎖の全定常ドメイン に融合されたＣＤ４のＶ１及びＶ２ドメインを含んでいる。これらのベクターが 同時発現されると、二つのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖および二つのＣＤ４− カッパ・キメラ軽鎖からなるヘテロ四量体が産生される。ＣＨ１ドメインを含む 重鎖の製造は、ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖との効率的な会合を可能とし、ＣＤ ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の効率的な分泌をもたらす。これらＣＤ４− ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体では、重鎖二量体に比較して血清半減期が増大し 、またＨＩＶに対する結合活性が増大する。 これらのＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖二量体およびＣＤ４−ＩｇＧ２・キメ ラヘテロ四量体は、非免疫原性の毒素部分に結合される。二つのクラスの細胞毒 素複合体が発明されている。第一のクラスでは、二量体または四量体が非タンパ ク毒素に結合される。 この毒素の一つの例は、抗腫瘍性抗生物質であるエネジイン（enediyne）族の メンンバー又は誘導体であり、カリケアマ イシン（calicheamicin）、エスペラマイシン類（esperamicins）またはダイネ マイシン類（dynemicins）が含まれる（３７，３８）。これらの毒素は極めて強 力であり、核ＤＮＡを開裂させることによって作用し、細胞を死に至らしめる。 イン・ビボで開裂されて多くの不活性な免疫原性のポリペプチドフラグメントを 与えるタンパク毒素とは異なり、カリケアマイシン、エスペラマイシン類および 他のエネジイン類のような毒素は、本質的に免疫原性の小分子である。これらの 非ペプチド毒素は、モノクローナル抗体および他の分子をラベルするために従来 用いられている技術によって、二量体または四量体に化学的に結合される。これ らの結合技術には、複合体のＦｃ部分にのみ存在するＮ結合された糖残基を介す る部位特異的な結合が含まれる。このような部位指向性結合法は、上記の結合に よって生じ得る、複合体のＣＤ４部分の結合特性に対する影響を低減させる利点 を有している。 細胞毒性複合体の第二のクラスは、細胞障害性の放射線を生じる放射性核種に 結合された二量体または四量体からなっている。使用される放射性核種の例には 、¹²⁵Ｉ，¹³¹Ｉ，⁹⁰Ｙおよび²¹²Ｂｉのようなβ粒子エミッタおよびα粒子エミ ッタが含まれる。 これらアイソトープは、モノクローナル抗体および他の分子をラベルするため に成功裡に使用されている技術によって、二量体または四量体に化学的に結合さ れる。これらの結合技術には、無作意ラベリング及び部位指向性ラベリングが含 まれる。後者の場合のラベリングは、複合体のＦｃ部分にのみ 存在するＮ結合された糖残基のような、二量体または四量体の特異的な部位に向 けられる。 従来の研究では、これらアイソトープでラベルされた抗腫瘍性抗体は、動物モ デル（或る場合にはヒト）において、リンパ種／白血病と同様に固形腫瘍におけ る細胞を破壊するために用いられて成功している（３９）。放射性核種は電離放 射線を生じさせることによって作用し、該放射線は核ＤＮＡにおける多重鎖分裂 （multiple strand break）を生じさせて細胞を死に導く。治療的複合体の製造 に用いられるアイソトープは、短い路程（path length）を有する典型的には高 エネルギーのα粒子またはβ粒子を生じる。このような放射性核種は、該核種に 密着して存在する細胞（例えば複合体が付着または侵入したＨＩＶ感染細胞）を 殺滅する。隣接する細胞に対しては少ししか影響せず、または全く影響しない。 放射性核種は本質的に非免疫原性である。 上記で述べた細胞障害性の二量体および四量体の複合体は、両クラス共に、Ｈ ＩＶ感染に対して使用するものとして従来記述されている他の治療剤を凌駕する 幾つかの利点を有している。これらは、全てのＨＩＶ株を標的としてウイルスの 逸脱変異体の選別を妨げる、ＣＤ４に基づく作用モードを有している。他のＣＤ ４系分子と同様に、この複合体は、ＡＺＴのような他の抗ＨＩＶ薬と組合わせて 使用すると相乗作用を示し得る。ＩｇＧ２のフラグメントに結合されているので 、当該分子は、ｓＣＤ４系分子の場合よりも、イン・ビボでの長い半減期を有し ている。また、これらは二量体または四寮 体であることの利点、即ち、ＨＩＶ感染細胞に対する結合の活性（アビディティ ー）が増大する利点を有している。この複合体はＨＩＶ感染細胞を殺滅し、従っ てイン・ビボにおいてＨＩＶ感染の伝搬速度を低下させ、または感染を完全に排 除する。複合体の全ての成分は、最小の免疫原性を得るために選択されて来てい る。ＩｇＧ２に基づいているので、複合体は、ＦＣ受容体に対して結合するとし ても最小限に結合し、従って非特異的な細胞殺滅を低下させる。 これら放射性複合体の一つの用途は、上記で議論したようにＨＩＶ感染の治療 である。しかし、もう一つの重要な応用は、同様の複合体を、患者のＨＩＶ感染 細胞を検出してその位置を決定するために使用することである。この場合、複合 体は¹¹¹Ｉｎ、¹³¹Ｉまたは^99mＴｃのようなγ放射性アイソトープに結合される 。これらのアイソトープはγ放射線を放出し、この放射線は検出／画像化の目的 のために組織を透過するが、イオン化または細胞死は少ししか生じさせない。^{13 1} Ｉのようなアイソトープの場合は、高エネルギーのβ粒子およびγ線の両方が 生じる。治療的複合体の製造に用いられるこのアイソトープは、夫々の二量体ま たは四量体に付着した¹³¹Ｉの数（比活性；これは当該二量体または四量体の細 胞毒性を支配する）に応じて、典型的に治療的または画像化的である。低い比活 性は画像化のために用いられる。このようなアイソトープは、二官能放射活性金 属キレートでラベルされた白血病特異的なモノクローナル抗体を用いて、マウス の赤血球系腫瘍（erythroid tumors）を画像化するために用 いられてきた（４８）。 診断／画像化の目的のための放射性複合体は、臨床診断での適用と同様に、Ｈ ＩＶ感染のコースを理解するための臨床的研究において価値を有するであろう。 例えば、画像化は、毒素に結合し又は細胞毒性放射性核種に結合した二量体およ び四量体を用いた治療と組合わせて行うことができる。 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体またはＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘ テロ四量体は、ＨＩＶに対する抗体と比較したときに、画像化剤としての利点を 有している。何故なら、ＣＤ４は全てのＨＩＶ株のエンベロープ糖タンパクに対 して、該エンベロープ糖タンパクがＨＩＶまたはＨＩＶ感染細胞の何れの表面に 存在していても、高い親和性で結合するからである。 〔発明の概要〕 本発明は、１）非ペプチジル毒素と、２）これに結合したＣＤ４−ガンマ２・ キメラ重鎖ホモ二量体とを含む免疫複合体を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶ感染細胞を殺滅する方法であって、ＨＩＶ感染細胞を、 該細胞を殺滅するために有効な量の、本発明の免疫複合体と接触させることを具 備した方法を提供する。 本発明は更に、対象におけるＨＩＶ感染細胞ポピュレーションを減少させるよ うにＨＩＶに感染した対象を治療する方法であって、ＨＩＶに感染した対象に対 して、ＨＩＶ感染細胞を殺滅してＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染細胞 ポピュレーションを減少させるために有効な量の、本発明の免疫複合体を投与す ることを具備した方法を提供する。 本発明はまた、対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を減少するように、対象 を処置する方法であって、対象に対して、対象がＨＩＶに感染するに至る可能性 を低下させるために有効な量の、本発明の免疫複合体を投与することを具備した 方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶ感染細胞を殺滅することにより、ＨＩＶに感染した対象 におけるＨＩＶ感染細胞ポピュレーションを減少させるために有効な量の本発明 の免疫複合体と、薬剤的に許容され得るキャリアとを含有する薬剤組成物を提供 する。 本発明はまた、１）低レベルから中レベルの細胞毒性をも った、ガンマ放射線を放出する放射性核種と、２）これに結合したＣＤ４−ガン マ２・キメラ重鎖ホモ二量体とを含む免疫複合体を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を画像化する 方法であって、対象に対して、対象に存在するＨＩＶ感染組織の位置測定を可能 とするために十分な量の本発明の免疫複合体を、該免疫複合体が対象に存在する ＨＩＶ感染組織に特異的に結合することを可能とする条件下で投与することと、 適切な時間が経過した後に、対象に存在するＨＩＶ感染組織に対して特異的に結 合した免疫複合体の位置を測定することにより、ＨＩＶに感染した対象に存在す るＨＩＶ感染組織を画像化することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定する方 法であって、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方法に よって画像化することと、こうして得られた画像を、既知段階のＨＩＶ感染を有 する別のＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対 象におけるＨＩＶ感染の段階を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、ＨＩＶ に感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方法によって画像化するこ とと、こうして得られた画像を、予後が既知であるＨＩＶ感染対象の画像と比較 することによって前記ＨＩＶに感染した対象の予後を決定す ることとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定す る方法であって、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方 法によって画像化することと、こうして得られた画像を、抗ＨＩＶ治療の有効性 が知られているＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、ＨＩＶに感染した 対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定することとを具備した方法を提供する 。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織の画像化を可 能にするために有効な量の本発明の免疫複合体と、薬剤的に許容され得るキャル アとを含有する組成物を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク 負荷を測定する方法であって、対象に存在する細胞膜結合形またはウイルス膜結 合形のＨＩＶエンベロープ糖タンパク量の測定を可能にするために有効な量の本 発明の免疫複合体を、該免疫複合体の細胞膜結合形またはウイルス膜結合形のＨ ＩＶエンベロープ糖タンパクへの特異的結合を可能とする条件下で、対象に対し て投与することと、該対象において細胞膜結合形またはウイルス膜結合形のＨＩ Ｖエンベロープと特異的に結合した前記免疫複合体の量を測定することにより、 ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を測定するこ ととを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染 の段階を決定する方法であって、対象に負荷されたＨＩＶエンベロープ糖タンパ クを本発明の方法によって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロ ープ糖タンパク負荷量を、ＨＩＶ感染段階が知られているＨＩＶ感染対象におけ るＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷量と比較することにより、前記ＨＩＶに感 染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定することとを具備した方法を提供す る。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、対象に おけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を本発明の方法によって測定すること と、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を、予後が知られて いるＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷と比較すること により、前記ＨＩＶに感染した対象における予後を決定することとを具備した方 法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定す る方法であって、対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を本発明の方 法によって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク 負荷を、抗ＨＩＶ治療の有効性が知られているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエ ンベロープ糖タンパク負荷と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対象に おける抗ＨＩＶ治療の有効性を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク 負荷の測定を可能とするために有効な量の本発明の免疫複合体と、薬剤的に許容 され得るキャリアと を含有する組成物を提供する。 本発明はまた、１）非ペプチジル毒素と、２）二つの重鎖および二つの軽鎖を 含むヘテロ四量体とを含んだ免疫複合体であって、前記二つの重鎖は両者共にａ ）ＩｇＧ２重鎖またはｂ）キメラＣＤ４−ＩｇＧ２重鎖の何れかであり、また前 記二つの軽鎖は両者共にａ）カッパ軽鎖またはｂ）キメラＣＤ４−カッパ軽鎖の 何れかである［但し、二つの重鎖もしくは二つの軽鎖の何れか又は四つの全ての 鎖はＣＤ４キメラであり、また前記非ペプチジル毒素は二つの重鎖もしくは二つ の軽鎖の何れか又は四つの全ての鎖に結合されている］免疫複合体を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶ感染細胞を殺滅する方法であって、ＨＩＶ感染細胞を、 該細胞を殺滅するために有効な量の本発明の免疫複合体と接触させることを具備 した方法を提供する。 本発明は更に、ＨＩＶに感染した対象を治療し、該対象におけるＨＩＶ感染細 胞のポピュレーションを減少させる方法であって、ＨＩＶに感染した対象に対し て、ＨＩＶ感染細胞を殺滅するために有効な量の本発明の免疫複合体を投与する ことにより、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染細胞のポピュレーション を減少させることを具備した方法。 本発明はまた、対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を減少するように対象を 処置する方法であって、対象に対して、対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を 低下させるために有効な量の、本発明の免疫複合体を投与することを具備した方 法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶ感染細胞を殺滅することによってＨＩＶに感染した対象 におけるＨＩＶ感染細胞のポピュレーションを減少させるために有効な量の本発 明の免疫複合体と、薬剤的に許容され得るキャリアとを含有する薬剤組成物を提 供する。 本発明はまた、１）低レベルから中レベルの細胞毒性をもった、ガンマ放射線 を放出する放射性核種と、２）二つの重鎖および二つの軽鎖を含むヘテロ四量体 とを含んだ免疫複合体であって、前記二つの重鎖は両者共にａ）ＩｇＧ２重鎖ま たはｂ）キメラＣＤ４−ＩｇＧ２重鎖の何れかであり、また前記二つの軽鎖は両 者共にａ）カッパ軽鎖またはｂ）キメラＣＤ４−カッパ軽鎖の何れかである［但 し、二つの重鎖もしくは二つの軽鎖の何れか又は四つの全ての鎖がＣＤ４キメラ であり、また前記放射性核種は二つの重鎖もしくは二つの軽鎖の何れか又は四つ の全ての鎖に結合されている］免疫複合体を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を画像化する 方法であって、対象に対して、対象に存在するＨＩＶ感染組織の位置測定を可能 とするために十分な量の本発明の免疫複合体を、該免疫複合体が対象に存在する ＨＩＶ感染組織に特異的に結合することを可能とする条件下で投与することと、 適切な時間が経過した後に、対象に存在するＨＩＶ感染組織に対して特異的に結 合した免疫複合体の位置を測定することにより、ＨＩＶに感染した対象に存在す るＨＩＶ感染組織を画像化することとを具備した方法を提供 する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定する方 法であって、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方法に よって画像化することと、こうして得られた画像を、既知段階のＨＩＶ感染を有 する別のＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対 象におけるＨＩＶ感染の段階を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、ＨＩＶ に感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方法によって画像化するこ とと、こうして得られた画像を、予後が既知であるＨＩＶ感染対象の画像と比較 することによって前記ＨＩＶに感染した対象の予後を決定することとを具備した 方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定す る方法であって、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方 法によって画像化することと、こうして得られた画像を、抗ＨＩＶ治療の有効性 が既知であるＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、ＨＩＶに感染した対 象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織の画像化を可 能にするために有効な量の本発明の免疫複合体と、薬剤的に許容され得るキャル アとを含有する組成物を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象に負荷されるＨＩＶエンベロープ糖タン パクを測定する方法であって、対象に存在する細胞膜結合形またはウイルス膜結 合形のＨＩＶエンベロープ糖タンパク量の測定を可能にするために有効な量の本 発明の免疫複合体を、該免疫複合体の細胞膜結合形またはウイルス膜結合形のＨ ＩＶエンベロープ糖タンパクへの特異的結合を可能とする条件下で、対象に対し て投与することと、細胞膜結合形またはウイルス膜結合形のＨＩＶエンベロープ と特異的に結合した前記免疫複合体の量を測定することにより、ＨＩＶに感染し た対象に負荷されたＨＩＶエンベロープ糖タンパクを測定することとを具備した 方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定する方 法であって、対象に負荷されたＨＩＶエンベロープ糖タンパクを本発明の方法に よって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷 量を、ＨＩＶ感染段階が知られているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエンベロー プ糖タンパク負荷量と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対象における ＨＩＶ感染の段階を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、対象に 負荷されたＨＩＶエンベロープ糖タンパクを本発明の方法によって測定すること と、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷量を、予後が知られ ているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷量と比較する ことにより、前記ＨＩＶに感染した対象 における予後を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定す る方法であって、対象に負荷されたＨＩＶエンベロープ糖タンパクを本発明の方 法によって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク 負荷量を、抗ＨＩＶ治療の有効性が知られているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶ エンベロープ糖タンパク負荷量と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対 象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象のＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷量 の測定を可能とするために有効な量の本発明の免疫複合体と、薬剤的に許容され 得るキャリアとを含有する組成物を提供する。 〔図面の簡単な説明〕 図１：Ａ）ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子のドメイン構造；Ｂ）ＣＤ４ −ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のタンパク構造。下に示した配列は、ＣＤ４ （Phe176）とヒトガンマ２・重鎖のヒンジ領域との間の連結部の１文字アミノ酸 コードである。なお、ガンマ２・重鎖のヒンジ領域は四つのシステイン（テキス トの考察を参照）を含んでいる。略語：ＬはヒトＣＤ４のリーダー（シグナル） 配列；Ｖ１Ｖ２はヒトＣＤ４のアミノ末端可変様ドメイン；Ｈはヒトガンマ２・ 重鎖のヒンジ領域；ＣＨ２およびＣＨ３はヒトガンマ２・重鎖の第二および第三 定常領域；＊はＣＨ２ドメイン（残基番 号256-258）上の推定Ｎ結合グリコシル化部位。 図２：Ａ）ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の発現に用いられるキメラ 遺伝子のドメイン構造。上部はＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子；下部はＣ Ｄ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子。Ｂ）ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体 のタンパク構造。略語：ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３はヒト・ガンマ２重鎖の第一、 第二及び第三定常領域；Ｃ−カッパはヒト・カッパ軽鎖の定常領域；＊はＣＨ２ ドメイン（残基番号355-357）上の推定Ｎ結合グリコシル化部位。 図３：ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体（一本鎖）のＤＮＡ配列（配 列ＩＤ番号１）および予想タンパク配列（配列ＩＤ番号２）。夫々の行の末尾の 番号はヌクレオチド位置を示す。各行の末端の番号はヌクレオチド位置を示す。 夫々の行の上の番号は、（１文字コードで与えられる）アミノ酸位置を示す。タ ンパクドメインは配列の上に矢印で示される。 図４：ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体におけるＣＤ４−ＩｇＧ２・キ メラ重鎖のＤＮＡ配列（配列ＩＤ番号３）および予想タンパク配列（配列ＩＤ番 号４）。夫々の行の末尾の番号は、ヌクレオチド位置を示す。夫々の行の上の数 字夫々の行の上の番号は、（１文字コードで与えられる）アミノ酸位置を示す。 タンパクドメインは配列の上に矢印で示される。 図５：ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体におけるＣＤ４−カッパ・キメ ラ軽鎖のＤＮＡ配列（配列ＩＤ番号５） および予想タンパク配列（配列ＩＤ番号６）。夫々の行の末尾の番号は、ヌクレ オチド位置を示す。夫々の行の上の数字夫々の行の上の番号は、（１文字コード で与えられる）アミノ酸位置を示す。タンパクドメインは配列の上に矢印で示さ れる。 図６：形質移入された細胞からのＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の 分泌。Ｃｏｓ−Ｍ５細胞が偽トランスフェクトされ、またはＣＤ４−ガンマ１・ キメラ重鎖哺乳動物発現ベクターＤＮＡをトランスフェクトされ、或いはＣＤ４ −ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１をトランスフェクトされた。トランスフェクトの48-7 2時間後に、該細胞は³⁵Ｓ−メチオニンで放射能ラベルされた。放射能ラベルさ れた培地はプロテインＡ・セファロースビーズで沈殿された。この沈殿されたタ ンパクは、還元性条件下または非還元性条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析 され、フルオログラフィーによって可視化された。レーンＭは偽トランスフェク トされた細胞からの培地；レーン１はＣＤ４−ガンマ１・キメラ重鎖哺乳動物発 現ベクターＤＮＡをトランスフェクト入された細胞からの培地；レーン２はＣＤ ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１・ＤＮＡをトランスフェクトされた細胞からの培地 である。 図７：ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を用いたＨＩＶ−１・ｇｐ12 0の沈殿。Ｃｏｓ−Ｍ５細胞が偽トランスフェクトされ、またはＣＤ４−ガンマ １・キメラ重鎖哺乳動物発現ベクターＤＮＡをトランスフェクトされ、或いはＣ Ｄ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１をトランスフェクトされた。 トランスフェクト後48-72時間の時点で、培地のラベルされていないアリコート が³⁵Ｓ−メチオニンでラベルされたｇｐ120のアリコートと共にインキュベート された。この複合体は、プロテインＡ・セファロースビーズで沈殿された。次い で、この沈殿物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、続いてフルオログラフィ ーにかけられた。レーンＭは偽トランスフェクトされた細胞からの培地；レーン １はＣＤ４−ガンマ１・キメラ重鎖哺乳動物発現ベクターＤＮＡをトランスフェ クトされた細胞からの培地；レーン２はＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１・ＤＮ Ａをトランスフェクトされた細胞からの培地である。 図８：ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の精製。本質的にＣＤ４−ガ ンマ１・キメラ重鎖ホモ二量体またはＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体 を分泌する安定なＣＨＯ細胞が、ローラボトル内で増殖された。馴らし培地をプ ロテインＡ−セファロースカラムに通し、結合した物質をカラムから溶出させた 。次いで、ピーク画分をプールし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに通した。広範な洗浄の後 、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を50mM BES pH 7.0，500mM NaClで 溶出した。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定し、続いて銀染色し、プ ールし、濃縮した。次いで、このプールし濃縮したＣＤ４−ガンマ２・キメラ重 鎖ホモ二量体を、予めＰＢＳで平衡化して流したセファクリル（Sephacryl）・ Ｓ−300HRカラムにかけた。精製ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体に対 応するピーク画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに 続く銀染色によって同定した。次いで、ピーク画分をプールし、濃縮した。この 精製タンパクを、非還元性条件および還元性条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く銀 染色によって分析した。レーン１は、非還元性条件下で流された略1.5μｇタン パクであり、レーン２は還元性条件下で流された略1.5μｇタンパクである。 図９：ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体およびヒト免疫グロブリンガ ンマ１の、ＦｃＲを有するＵ937細胞に対する結合のフローサイトメトリック分 析。Ｕ937細胞を、１μｇ／mlのヒトＩｇＧ１または１μｇ／mlのＣＤ４−ガン マ２二量体と共に４℃で２時間インキュベートし、広範囲に洗浄し、フルオレセ インで標識されたヤギ抗（ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖）抗体と共にインキュベー トした。洗浄に続いて、ベクトン・ディッキンソン社のFacScanフローサイトメ ータで蛍光を分析した。対照ピークは、FITCで標識した抗体のみと共にインキュ ベートされた細胞の蛍光を示している。 図１０：ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ二量体の、安定にトランスフェクト された細胞からの分泌。ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・ キメラ軽鎖の両者を安定に発現すＣるＣＨＯ細胞を、35S−メチオニン及びシス テインで放射能ラベルした。放射性ラベルされた培地を、プロテインＡセファロ ース・ビーズで沈殿させた。（Ａ）沈殿したタンパクを、非還元性条件下でのＳ ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、フルオログラフィーによって可視化した。レーン １は、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ ・キメラ軽鎖の両者を安定に発現するＣＨＯ細胞からの培地である。レーン２は 、トランスフェクトされないＣＨＯ細胞からの培地である。（Ｂ）Ａのレーン１ で分析されたのと同じサンプルが、非還元性条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析 された。このＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからレーンが切り取られ、該ゲル切片を平衡 化緩衝液（62.5mM Tris HCl pH 6.8、2.3%SDS 5% β−メルカプトエタノール、1 0%グリセロール）中において４℃で４５分間インキュベートすることにより、タ ンパクが還元された。このゲル切片を還元性条件下でインキュベートした後、該 ゲル内に含まれるタンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、フルオログラフィ ーによって可視化した。 〔発明の詳細な記述〕 ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ，ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ，及び ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１と夫々命名された二つの発現ベクター及び一つ のプラスミドが、夫々、ＡＴＣＣ受付番号第75193号、第75194号、第40952号の 下に、ＵＳＡ．20852メリーランド州、ロックウイルのアメリカン・タイプ・カ ルチャー・コレクションに寄託されている。これらの寄託は、特許手続上の微生 物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（ブダペスト条約）の規定に従っ て行われた。 特に、本発明は、１）非ペプチジル毒素と、２）これに結合したＣＤ４−ガン マ２・キメラ重鎖ホモ二量体とを含む免疫複合体を提供する。本発明の一実施例 において、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体は、ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐ ｃＤＮＡ１（ＡＴＣＣ第40952号）と命名された発現ベクターによってコードさ れる。 本発明の目的のためには、多くの発現ベクター系を用いることができる。例え ば、或るクラスのベクターは、ウシ・パピローマウイルス、ポリオーマウイルス 、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ ＲＳＶ、ＭＭＴＶまたはＭＯＭＬＶ）、又はＳＶ40ウイルスのような動物ウイル スから誘導されたＤＮＡ要素を利用する。加えて、トランスフェクトされたホス ト細胞の選別を可能にする一以上のマカーを導入することによって、該ＤＮＡを 染色体中に安定に組み込んだ細胞が選択され得る。このマ ーカーは、原栄養株を栄養要求性宿主にしたり、生物致死耐性（抗生物質耐性） や銅等の重金属に対する耐性を与え得る。選別可能なマーカー遺伝子は、発現さ れるＤＮＡ配列に直接結合されてもよく、或いは同時形質転換によって同じ細胞 内に導入してもよい。ｍＲＮＡを最適に合成するために、追加の要素もまた必要 とされ得る。これらの要素には、転写プロモータ、エンハンサー及び停止信号と 同様、スプライス信号が含まれる。このような要素を組み込んだｃＤＮＡ発現ベ クターには、オカヤマによって記載された発現ベクターが含まれる（４０）。 このＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体は、a）哺乳動物細胞に、ＣＤ ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を産生するための発現ベクターをトランス フェクトすること； b）上記でトランスフェクトされた哺乳動物細胞を、ＣＤ４ −ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体が産生される条件下で培養すること；及び c ）こうして産生されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を回収すること によって製造され得る。 上記構造を含むＤＮＡベクター又はＤＮＡ配列が発現のために調製されたら、 この発現ベクターは適切な哺乳動物宿主細胞にトランスフェクトされ、または該 細胞内に導入される。プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法 または他の従来技術のような、トランスフェクション又は導入のための種々の技 術が用いられ得る。プロトプラスト融合の場合には、細胞が培地中で増殖され、 適切な活性についてス クリーニングされる。当該遺伝子の発現によって、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重 鎖ホモ二量体の一つの鎖に対応する融合タンパクの産生がもたらされる。この融 合タンパクは、次いで当業者に公知の方法に従って処理され、キメラ重鎖ホモ二 量体が形成される。 更に、得られたトランスフェクト細胞を培養する方法、並びにこうして産生さ れたキメラ重鎖ホモ二量体を回収するための方法は当業者に周知であり、使用さ れる個々の発現ベクター及び哺乳動物宿主細胞に基づいて変形または最適化され 得る。 本発明の目的にとって、本発明のキメラ重鎖ホモ二量体を発現させるための好 ましい宿主細胞は哺乳動物セルラインであり、例えば、ＳＶ40（ＣＯＳ−７）に よって形質転換されたサル腎ＣＶ１ライン；ヒト胚体腎ライン293；新生ハムス ター腎細胞（ＢＨＫ）；チャイニーズハムスター卵巣細胞ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）； サル腎細胞（ＣＶ１）；アルリカ緑サル腎細胞（ＶＥＲＯ- 76）；ヒト頸部腫瘍 細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ）；ヒト肺細胞（Ｗ 138）；ヒト肝細 胞（ＨepＧ２）；マウス乳癌（ＭＭＴ060562）；マウス・セルライン（Ｃ 127） およびミエローマ・セルラインが含まれる。 本発明において使用されるとき、「非ペプチジル毒素」とは、細胞と接触し又 は細胞に接近したときに細胞を殺滅することができる、アミノ酸またはその残基 を含まない何れかの原子、分子またはこれらの組合わせを意味する。本発明にお いて用いられるとき、「殺滅する」とは、細胞の構造または機能を攪乱して、攪 乱された細胞が少なくともその生活機能を果たせなくすることを意味する。生活 機能には、細胞または感染性ウイルスの生存に必要な機能が含まれる。 上記の非ペプチジル毒素は、エネジイン（enediyne）抗癌性抗生物質またはそ の誘導体であり得る。本発明の一実施例において、このエネジイン抗癌性抗生物 質はカリケアマイシン（calicheamicin）である。本発明の他の実施例において 、非ペプチジル毒素は、メソトレキセート（Methotrexate）、ドクソルビシン（ Doxorubicin）、メルファラン（Melphalan）、クロラムブシル（Chlorambucil） 、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン（Vindesine）、マイトマイシンＣ、cis-プラチナ、 エトポシド（Etoposide）、ブレオマイシン及び5-フルオロウラシルからなる群 から選択される。 上記のエネジイン抗癌性抗生物質族の分子には、カリケアマイシン（calichea micin）、エスペラマイシン類（esperamicins）またはダイネマイシン類（dynem icins）、並びにこれら分子の誘導体および類縁体が含まれる。これら毒素は、 種々の技術によって、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体に結合され得る 。これらの技術には、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のＦｃ部分上の Ｎ結合オリゴ糖側鎖への、毒素の部位特異的な結合が含まれる。或いは、上記の 毒素は、当該二量体のＣＤ４部分およびガンマ２部分の両方に存在するリジンの ようなアミノ酸残基に結合されてもよい。 非ペプチジル毒素はまた、細胞障害性の放射性核種であっ てもよい。細胞障害性の放射性核種は⁹⁰Ｙ，¹³¹Ｉ，¹²⁵Ｉまたは²¹²Ｂｉであり 得る。 これら細胞障害性の放射性核種は、種々の技術によって、当該二量体に結合さ れ得る。これらの技術には、当該二量体のＦｃ部分におけるＮグリコシル化部位 への部位特異的結合が含まれる。或いは、放射性核種は、当該二量体のＣＤ４部 分およびガンマ２部分の両方に存在するチロシンまたはリジンのようなアミノ酸 残基に結合されてもよい。 本発明はまた、ＨＩＶ感染細胞を殺滅する方法であって、ＨＩＶ感染細胞を、 該細胞を殺滅するために有効な量の、本発明の免疫複合体と接触させることを具 備した方法を提供する。当該細胞を殺滅するために有効な免疫複合体の量は、当 業者に公知の方法を用いて容易に決定することができる。 本発明はまた、対象におけるＨＩＶ感染細胞ポピュレーションを減少させるよ うにＨＩＶに感染した対象を治療する方法であって、ＨＩＶに感染した対象に対 して、ＨＩＶ感染細胞を殺滅してＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染細胞 ポピュレーションを減少させるために有効な量の、本発明の免疫複合体を投与す ることを具備した方法を提供する。 好ましい実施例において、上記のＨＩＶに感染した対照はヒトである。 タンパクを含有する薬剤を投与する方法は当業者に周知であり、例えば、皮下 注射、筋肉内注射および静脈内注射が含まれ、これは単独で投与されてもよく、 ＡＺＴまたはＤＤＩのような他の薬剤と組合わせて投与してもよい。 ＨＩＶ感染細胞を殺滅し、てＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染細胞ポ ピュレーションを減少させるために有効な免疫複合体の量は、当業者に公知の方 法を用いて容易に決定することができる。 本発明の好ましい実施例において、投与される免疫複合体の量は、ＨＩＶに感 染した対象におけるＨＩＶ感染細胞のポピュレーションをなくするために有効な ものである。ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染細胞のポピュレーション をなくするために有効な量は、当業者に公知の方法を用いて容易に決定すること ができる。 本発明はまた、対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を減少させるように、対 象を処置する方法であって、対象に対して、対象がＨＩＶに感染するに至る可能 性を低下させるために有効な量の、本発明の免疫複合体を投与することを具備し た方法を提供する。 本発明において用いられるとき、「感染」は、対象自身のＣＤ４+ 細胞のＨＩ Ｖによる浸潤を意味する。ここで用いられる「ＨＩＶ」は、「ＨＩＶ粒子」、「 ＨＩＶビリオン」または「ＨＩＶウイルス」と同義である。こうして、本発明の 免疫複合体は、患者の体内に存在する外因性のＨＩＶ感染ＣＤ４+ 細胞を、これ ら外因性細胞が患者自身のＣＤ４+ 細胞に感染できるようになる前に殺滅するこ とによって、ＨＩＶ感染を防止する働きをする。 本発明において用いられるとき、「可能性を低下させる」とは、感染の可能性 を少なくとも1.25の因子だけ減少させ ることを意味する。対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を低下させるために有 効な免疫複合体の量は、当業者に公知の方法を用いて容易に決定することができ る。 本発明はまた、ＨＩＶ感染細胞を殺滅することにより、ＨＩＶに感染した対象 におけるＨＩＶ感染細胞ポピュレーションを減少させるために有効な量の本発明 の免疫複合体と、薬剤的に許容され得るキャリアとを含有する薬剤組成物を提供 する。 薬剤的に許容され得るキャリアは、当業者に周知である。本発明において、薬 剤的に許容され得るキャリアには0.01-0.1Ｍ）好ましくは0.05Ｍのリン酸緩衝液 、または0.8％生理食塩水溶液が含まれるが、これらに限定されるものではない 。加えて、このような薬剤的に許容され得るキャリアは、水性または非水性の溶 液、懸濁液およびエマルジョンであり得る。非水性溶媒の例は、プロピレングリ コール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、並びにオレイン 酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性キャリアには、水、アル コール／水性溶液、生理食塩水および緩衝媒質を含むエマルジョン又は懸濁液が 含まれる。非経腸的担体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖液（ブ ドウ糖及び塩化ナトリウム）、乳酸リンゲル液、又は固定化オイル（fixed oil ）が含まれる。静脈注射用担体には、液状の栄養補液、リンゲルのブドウ糖液を ベースとするような電解質補液、その他が含まれる。例えば抗菌剤、抗酸化剤、 キレート化剤、不活性ガス等のような保存剤および他の添加 剤も存在せしめ得る（４１）。 本発明はまた、１）低レベルから中レベルの細胞毒性をもった、ガンマ放射線 を放出する放射性核種と、２）これに結合したＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホ モ二量体とを含む免疫複合体を提供する。本発明の一実施例において、ＣＤ４− ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体は、ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１（ＡＴＣ Ｃ受付番号第40952号）と命名された発現ベクターによってコードされる。 ガンマ放射線を放出する放射性核種は、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎまたは^99mＴｃであり 得る。これらガンマ放射線を放出する放射性核種は、種々の技術によって当該二 量体に結合され得る。これらの技術には、当該二量体のＦｃ部分上のＮグリコシ ル化部位、または当該二量体上のジスルフィド結合から生じたスルフィドリル基 （sulphydryl group）への部位特異的結合が含まれる。或いは、この放射性核種 は、当該二量体のＣＤ４部分およびガンマ２部分の両方に存在するチロシンまた はリジンのようなアミノ酸残基に結合されてもよい。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を画像化する 方法であって、対象に対して、対象に存在するＨＩＶ感染組織の位置測定を可能 とするために十分な量の本発明の免疫複合体を、該免疫複合体が対象に存在する ＨＩＶ感染組織に特異的に結合することを可能とする条件下で投与することと、 適切な時間が経過した後に、対象に存在するＨＩＶ感染組織に対して特異的に結 合した免疫複合体の位置を測定することにより、ＨＩＶに感染した対象に存在す るＨＩＶ感染組織を画像化することとを具備した方法を提供する。 ここで使用されるとき、「画像化」とは、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨ ＩＶ感染組織の物理的位置を決定することを意味する。放射性核種を用いた画像 化の一般的な方法は、当業者に周知である。本発明の画像化方法において検出さ れた信号は、ＨＩＶおよびＨＩＶ感染細胞の両者に結合した免疫複合体からの信 号からなっている。ＨＩＶに結合した免疫複合体からの信号と、ＨＩＶ感染細胞 に結合した免疫複合体からの信号とを区別することはできない。従って、所定の 信号の何パーセントがＨＩＶに結合した免疫複合体によるものであり、また何パ ーセントがＨＩＶ感染細胞に結合した免疫複合体によるものかは分らない。 ここで用いられるとき、「組織」とは、ＨＩＶに感染され得る何れかの組織、 即ち、ＣＤ４+ 細胞を含む何れかの組織を意味する。 対象に存在するＨＩＶ感染組織の位置測定を可能とするために十分な本発明の 免疫複合体の量は、当業者に周知の方法に従って決定される。免疫複合体の量は 、飽和量でも不飽和量でもよい。ここで用いられるとき、「飽和量」とは、免疫 複合体のＨＩＶエンベロープ糖タンパク結合部位の数が、ＨＩＶエンベロープ糖 タンパク部位を越えることを意味する。ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ 感染組織への免疫複合体の特異的結合を可能にする条件もまた、当業者に周知の 方法に従って決定される。その例は、後述の実験の部に例示 されている。 対象に存在するＨＩＶ感染組織に特異的に結合した免疫複合体の位置の測定は 、当業者に周知の方法に従って達成される。このような方法には、例えば、ガン マ線カメラを用いて、ＨＩＶに感染した対象中に存在するＨＩＶ感染組織に結合 した免疫複合体から放出される信号を測定することが含まれる。本発明の画像化 方法および定量方法は組合わせることができ、そうするための手段は当該技術に おいて周知である。ここで用いられるとき、「適切な時間」とは、その時間が経 過した後には、非特異的に結合した免疫複合体の全てがＨＩＶに感染した対象か ら排泄される時間であり、且つその時間までは、検出可能な量の免疫複合体が、 ＨＩＶに感染した対象中に存在するＨＩＶ感染組織に結合したまま残存している ような時間を意味する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定する方 法であって、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方法に よって画像化することと、こうして得られた画像を、既知段階のＨＩＶ感染を有 する別のＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対 象におけるＨＩＶ感染の段階を決定することとを具備した方法を提供する。 既知段階のＨＩＶ感染を有する別のＨＩＶ感染対象の画像は、当業者に周知の 方法に従って得ることができる。本発明においては、既知段階のＨＩＶ感染を有 する二以上のＨＩＶ感染対象から得た画像を用いてもよい。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、ＨＩＶ に感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方法によって画像化するこ とと、こうして得られた画像を、予後が既知であるＨＩＶ感染対象の画像と比較 することによって、前記ＨＩＶに感染した対象の予後を決定することとを具備し た方法を提供する。予後が既知であるＨＩＶ感染対象の画像は、当業者に周知の 方法に従って得ることができる。本発明においては、既知の予後を有する二以上 のＨＩＶ感染対象からの画像を用いてもよい。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定す る方法であって、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方 法によって画像化することと、こうして得られた画像を、抗ＨＩＶ治療の有効性 が既知であるようなＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、ＨＩＶに感染 した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定することとを具備した方法を提供 する。 抗ＨＩＶ治療の有効性が既知であるＨＩＶ感染対象の画像は、当業者に周知の 方法に従って得ることができる。本発明においては、抗ＨＩＶ治療の有効性が既 知である二以上のＨＩＶ感染対象からの画像を用いてもよい。抗ＨＩＶ治療には 、例えば薬物療法が含まれる。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶを画像化する方法であ って、対象に対して、対象に存在するＨＩＶの位置測定を可能とするために十分 な量の本発明の免疫複合体を、該免疫複合体が対象に存在するＨＩＶ感染組織に 特異的に結合することを可能とする条件下で投与することと、適切な時間が経過 した後に、対象に存在するＨＩＶに対して特異的に結合した免疫複合体の位置を 測定することにより、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶを画像化すること とを具備した方法を提供する。本発明は更に、本発明の画像化方法を用いること により、ＨＩＶに感染した対象において、ＨＩＶ感染の段階を決定する方法、予 後を決定する方法、および抗ＨＩＶ治療の有効性を決定する方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織の画像化を可 能にするために有効な量の本発明の免疫複合体と、薬剤的に許容され得るキャル アとを含有する組成物を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク 負荷を測定する方法であって、対象に対して、対象に存在する細胞膜結合形また はウイルス膜結合形のＨＩＶエンベロープ糖タンパク量の測定を可能にするため に有効な量の本発明の免疫複合体を、該免疫複合体が対象において細胞膜結合形 またはウイルス膜結合形のＨＩＶエンベロープ糖タンパクに特異的結合すること を可能とする条件下で投与することと、該対象において細胞膜結合形またはウイ ルス膜結合形のＨＩＶエンベロープと特異的に結合した前記免疫複合体の量を測 定することにより、前記ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タ ンパク負荷を測定することとを具備した方法を提供する。 ＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷は、ＨＩＶに感染した 対象におけるＨＩＶおよびＨＩＶ感染細胞の実際の数ではないという意味におい て、絶対数ではない。負荷（burden）はむしろ、この数と単に相関するに過ぎな い。「ＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷」とは、対象においける全ＨＩＶエン ベロープ糖タンパクであって、細胞膜に結合したもの及びＨＩＶ膜に結合したも のの合計を意味する。対象に存在する細胞膜結合形またはウイルス膜結合形のＨ ＩＶエンベロープ糖タンパク量の測定を可能にする本発明の免疫複合体の量は、 飽和量でなければならず、また当業者に周知の方法によって決定され得る。対象 において、細胞膜結合形またはウイルス膜結合形のＨＩＶエンベロープ糖タンパ クに特異的に結合した免疫複合体の測定は、当業者に周知の方法に従って達成さ れる。このような方法には、例えば、ガンマ線カメラを使用することが含まれる 。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定する方 法であって、対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を本発明の方法に よって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷 を、ＨＩＶ感染段階が知られているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエンベロープ 糖タンパク負荷と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩ Ｖ感染の段階を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、対象に おけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を本発明の方法によって測定すること と、こうして測定さ れたＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を、予後が知られているＨＩＶ感染対象 におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷と比較することにより、前記ＨＩＶ に感染した対象における予後を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定す る方法であって、対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を本発明の方 法によって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク 負荷を、抗ＨＩＶ治療の有効性が知られているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエ ンベロープ糖タンパク負荷と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対象に おける抗ＨＩＶ治療の有効性を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク 負荷の測定を可能とするために有効な量の本発明の免疫複合体と、薬剤的に許容 され得るキャリアとを含有する組成物を提供する。 本発明はまた、１）非ペプチジル毒素と、２）二つの重鎖および二つの軽鎖を 含むヘテロ四量体とを含んだ免疫複合体であって、前記二つの重鎖は両者共にａ ）ＩｇＧ２重鎖またはｂ）キメラＣＤ４−ＩｇＧ２重鎖の何れかであり、また前 記二つの軽鎖は両者共にａ）カッパ軽鎖またはｂ）キメラＣＤ４−カッパ軽鎖の 何れかである［但し、二つの重鎖もしくは二つの軽鎖の何れか又は四つの全ての 鎖はＣＤ４キメラであり、また前記非ペプチジル毒素は二つの重鎖もしくは二つ の軽鎖の何れか又は四つの全ての鎖に結合されている］免疫 複合体を提供する。本発明の一実施例において、キメラＣＤ４−ＩｇＧ２重鎖は 、ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ番号第75193号）と命名され た発現ベクターによってコードされ、またキメラＣＤ４−カッパ軽鎖は、ＣＤ４ −ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ番号第75194号）と命名された発現ベクター によってコードされる。 ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコー ドされる重鎖を含むＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体は、ａ）哺乳動物細 胞を、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の重鎖を産生するための発現ベク ター及び軽鎖をコードする発現ベクターで同時トランスフェクトすることと、ｂ ）得られた同時トランスフェクト哺乳動物細胞を、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘ テロ四量体が産生される条件下で培養することと、ｃ）こうして産生されたＣＤ ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を回収することとによって製造され得る。 哺乳動物細胞に同時トランスフェクトする方法は、当該技術において周知であ り、これには上記で議論したものが含まれる。同様に、軽鎖をコードする発現ベ クターは当業者に周知である。 ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコードされ る軽鎖を含むＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体は、ａ）哺乳動物細胞を、 ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の軽鎖を産生するための発現ベクター及 びＩｇＧ２重鎖をコードする発現ベクターで同時トランスフ ェクトすることと、ｂ）得られた同時トランスフェクト哺乳動物細胞を、ＣＤ４ −ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体が産生される条件下で培養することと、ｃ）こ うして産生されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を回収することとによ って製造され得る。 ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによってコー ドされる重鎖と、ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶと命名された発現ベクターによ ってコードされる軽鎖とを含むＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体は、ａ） 哺乳動物細胞を、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の重鎖を産生するため の発現ベクターと、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の軽鎖を産生するた めの発現ベクターとで同時トランスフェクトすることと、ｂ）得られた同時トラ ンスフェクト哺乳動物細胞を、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体が産生さ れる条件下で培養することと、ｃ）こうして産生されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメ ラヘテロ四量体を回収することとによって製造され得る。 非ペプチジル毒素は、エネジイン抗癌性抗生物質またはその誘導体であり得る 。本発明の一実施例において、このエネジイン抗癌性抗生物質はカリケアマイシ ンである。 これらの毒素は、種々の技術によってＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体 に結合され得る。これらの技術には、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の Ｆｃ部分上のＮ結合オリゴ糖側鎖への、毒素の部位特異的な結合が含まれる。或 いは、上記の毒素は、当該四量体のＣＤ４部分およびＩｇＧ ２部分の両方に存在するリジンのようなアミノ酸残基に結合されてもよい。 非ペプチジル毒素はまた、細胞障害性の放射性核種であってもよい。細胞障害 性の放射性核種は⁹⁰Ｙ，¹³¹Ｉ，¹²⁵Ｉまたは²¹²Ｂｉであり得る。 これら細胞障害性の放射性核種は、種々の技術によって、ＣＤ４−ＩｇＧ２・ キメラヘテロ四量体に結合され得る。これらの技術には、当該四量体のＦｃ部分 におけるＮグリコシル化部位への部位特異的結合が含まれる。或いは、放射性核 種は、当該四量体のＣＤ４部分およびＩｇＧ２部分の両方に存在するチロシンま たはリジンのようなアミノ酸残基に結合されてもよい。 本発明はまた、ＨＩＶ感染細胞を殺滅する方法であって、ＨＩＶ感染細胞を、 該細胞を殺滅するために有効な量の本発明の免疫複合体と接触させることを具備 した方法を提供する。当該細胞を殺滅するために有効な免疫複合体の量は、当業 者に公知の方法を用いて容易に決定することができる。 本発明はまた、対象におけるＨＩＶ感染細胞ポピュレーションを減少させるよ うにＨＩＶに感染した対象を治療する方法であって、ＨＩＶに感染した対象に対 して、ＨＩＶ感染細胞を殺滅してＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染細胞 ポピュレーションを減少させるために有効な量の、本発明の免疫複合体を投与す ることを具備した方法を提供する。ＨＩＶ感染細胞を殺滅して、ＨＩＶに感染し た対象におけるＨＩＶ感染細胞ポピュレーションを減少させるために有効な免疫 複合体の量は、当業者に公知の方法を用いて容易に決定することができる。 本発明の好ましい実施例において、投与される免疫複合体の量は、ＨＩＶに感 染した対象におけるＨＩＶ感染細胞のポピュレーションをなくするために有効な ものである。ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染細胞のポピュレーション をなくするために有効な量は、当業者に公知の方法を用いて容易に決定すること ができる。 本発明はまた、対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を減少するように対象を 処置する方法であって、対象に対して、対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を 低下させるために有効な量の、本発明の免疫複合体を投与することを具備した方 法を提供する。対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を低下させるために有効な 発明の免疫複合体の量は、当業者に公知の方法を用いて容易に決定することがで きる。 本発明はまた、ＨＩＶ感染細胞を殺滅することにより、ＨＩＶに感染した対象 におけるＨＩＶ感染細胞ポピュレーションを減少させるために有効な量の本発明 の免疫複合体と、薬剤的に許容され得るキャリアとを含有する薬剤組成物を提供 する。 本発明はまた、１）低レベルから中レベルの細胞毒性をもった、ガンマ放射線 を放出する放射性核種と、２）二つの重鎖および二つの軽鎖を含むヘテロ四量体 とを含んだ免疫複合体であって、前記二つの重鎖は両者共にａ）ＩｇＧ２重鎖ま たはｂ）キメラＣＤ４−ＩｇＧ２重鎖の何れかであり、また 前記二つの軽鎖は両者共にａ）カッパ軽鎖またはｂ）キメラＣＤ４−カッパ軽鎖 の何れかである［但し、二つの重鎖もしくは二つの軽鎖の何れか又は四つの全て の鎖はＣＤ４キメラであり、また前記非ペプチジル毒素は二つの重鎖もしくは二 つの軽鎖の何れか又は四つの全ての鎖に結合されている］免疫複合体を提供する 。本発明の一実施例において、キメラＣＤ４−ＩｇＧ２重鎖は、ＣＤ４−ＩｇＧ ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ番号第75193号）と命名された発現ベクターに よってコードされ、またキメラＣＤ４−カッパ軽鎖は、ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃ ＣＭＶ（ＡＴＣＣ番号第75194号）と命名された発現ベクターによってコードさ れる。 ガンマ放射線を放出する放射性核種は、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎまたは^99mＴｃであり 得る。これらガンマ放射線を放出する放射性核種は、種々の技術によって、ＣＤ ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体に結合され得る。これらの技術には、当該四 量体のＦｃ部分上のＮグリコシル化部位、または当該四量体上のジスルフィド結 合から生じたスルフィドリル基（sulphydryl group）への部位特異的結合が含ま れる。或いは、この放射性核種は、当該四量体のＣＤ４部分およびＩｇＧ２部分 の両方に存在するチロシンまたはリジンのようなアミノ酸残基に結合されてもよ い。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を画像化する 方法であって、対象に対して、対象に存在するＨＩＶ感染組織の位置測定を可能 とするために十分な量の本発明の免疫複合体を、該免疫複合体が対象に存在する ＨＩＶ感染組織に特異的に結合することを可能とする条件下で投与することと、 適切な時間が経過した後に、対象に存在するＨＩＶ感染組織に対して特異的に結 合した免疫複合体の位置を測定することにより、ＨＩＶに感染した対象に存在す るＨＩＶ感染組織を画像化することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定する方 法であって、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方法に よって画像化することと、こうして得られた画像を、既知段階のＨＩＶ感染を有 する別のＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対 象におけるＨＩＶ感染の段階を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、ＨＩＶ に感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方法によって画像化するこ とと、こうして得られた画像を、予後が既知であるＨＩＶ感染対象の画像と比較 することによって、前記ＨＩＶに感染した対象の予後を決定することとを具備し た方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定す る方法であって、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を本発明の方 法によって画像化することと、こうして得られた画像を、抗ＨＩＶ治療の有効性 が既知であるようなＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、前記ＨＩＶに 感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有 効性を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織の画像化を可 能にするために有効な量の本発明の免疫複合体と、薬剤的に許容され得るキャル アとを含有する組成物を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク 負荷を測定する方法であって、対象に存在する細胞膜結合形またはウイルス膜結 合形のＨＩＶエンベロープ糖タンパク量の測定を可能にするために有効な量の本 発明の免疫複合体を、該免疫複合体が、対象における細胞膜結合形またはウイル ス膜結合形のＨＩＶエンベロープ糖タンパクにの特異的に結合するのを可能とす る条件下で、対象に対して投与することと、該対象において細胞膜結合形または ウイルス膜結合形のＨＩＶエンベロープと特異的に結合した前記免疫複合体の量 を測定することにより、前記ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ 糖タンパク負荷を測定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定する方 法であって、対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を本発明の方法に よって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷 を、ＨＩＶ感染段階が知られているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエンベロープ 糖タンパク負荷と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩ Ｖ感染の段階を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、対象に おけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を本発明の方法によって測定すること と、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を、予後が知られて いるＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷と比較すること により、前記ＨＩＶに感染した対象における予後を決定することとを具備した方 法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定す る方法であって、対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を本発明の方 法によって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク 負荷を、抗ＨＩＶ治療の有効性が知られているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエ ンベロープ糖タンパク負荷と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対象に おける抗ＨＩＶ治療の有効性を決定することとを具備した方法を提供する。 本発明はまた、ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク 負荷の測定を可能とするために有効な量の本発明の免疫複合体と、薬剤的に許容 され得るキャリアとを含有する組成物を提供する。 患者全体におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を画像化および測定する ための本発明の方法は、ＨＩＶに感染した対象における個々の器官に対しても同 様に適用することができる。 以下に記載する実験の詳細を参照することによって、本発明をより深く理解す ることができるであろう。しかし、以下 に詳述される具体的な実験は、後述の請求の範囲により完全に記述される本発明 発明の理解を助けるために例示されるものに過ぎないことを、当業者は容易に承 認するであろう。 〔実験の詳細〕 下記の実験の詳細の理解を容易にするために付言すると、頻繁に出てくる一定 の方法および用語は、Maniatis et al.（４２）に良く記載されている。 Ａ．材料及び方法 １．ＣＤ４−ガンマ２．キメラ重鎖ホモ二量体をコード するＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子の作成 プラスミドｐＳＰ６Ｔ４（６）からＥｃｏＲ１／Ｓｔｕ制限酵素断片としてヒ トＣＤ４ｃＤＮＡを切り出した。０．７０キロベース断片を単離し、ＥｃｏＲ１ ／Ｓｍａで消化されたＭ１３ｍｐ１８にクローン化した。その後この中間ベクタ ー（Ｍ１３ｍｐ１８（ＣＤ４））を単離し、Ｐｓｔ１でリニア化し、精製し、細 菌性アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）で処理した。（ヒンジ、ＣＨ２及びＣ Ｈ３エキソンを含む）ヒトガンマ２・重鎖遺伝子（４３）を含むプラスミドｐＢ ｒガンマ２からの２．０Ｋｂ Ｐｓｔ１／Ｐｓｔ１断片を単離し、ＢＡＰ処理し たＭ１３ｍｐ１８／ＣＤ４ベクターにクローン化した。得られた組み換え体を、 その後Ｐｓｔ１断片の正方向に対して（ＣＤ４配列に関して）スクリーニングし 、縦列にＣＤ４（ＥｃｏＲ１／Ｓｔｕ１）−ガンマ２（Ｐｓｔ１／Ｐｓｔ１）を 含むベクターを得た。ＣＤ４−ガンマ２．キメラ重鎖遺伝子を得るために、オリ ゴヌクレオチドに媒介された部位指向性突然変異誘発（oligonucleotide-mediat ed site-directed mutagenesis）を遂行して、ＣＤ４及びガンマ２・重鎖ＤＮＡ 配列を並べて、フレームのＣＤ４ 配列をヒンジエキソンにつなげた。得られたキメラＤＮＡ分子はＣＤ４のＶ１Ｖ ２ドメイン及びそれに続くガンマ２・重鎖のヒンジＣＨ２及びＣＨ３ドメインを 含む蛋白質をコードする（図１Ａ）。突然変異誘発は、形質転換したＴＧ１細胞 （アマシャム）からの組み換えファージから単離された１本鎖ＤＮＡで遂行され た。簡単には、鋳型ＤＮＡを、ＣＤ４のＶ１Ｖ２のＰｈｅ（１７９）をコードす る最終コドンをＩｇＧ２に対するヒンジの最初のコドン（Ｇｌｕをコードする） に接続する配列を含む３４ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５´−ＧＡＣＡＣＡＡＣ ＡＴＴＴＧＣＧＣＴＣＧＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧ−３´）（配列認識番 号７）でアニーリングした（図１Ａ及び図３）。第二の鎖合成の後、２本鎖ＤＮ ＡをコンピテントＴＧ１細胞に形質転換した。単離したプラークをその後新鮮な ＴＧ１細胞で増殖させ、ＤＮＡの塩基配列を決定するために１本鎖ＤＮＡを精製 した。すべての変異をシークエナーゼシステム（ＵＳＢ）を用いてジデオキシ法 により立証及び確認した。正しい配列を有するキメラ遺伝子を含むプラークをそ の後ＴＧ１細胞で増殖させ、この細胞からＲｆＤＮＡ（ＣＤ４−ＩｇＧ２−Ｒｆ と称する）を単離した。 ２．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコード する哺乳類発現ベクター作成 ＥｃｏＲ１を用いたＲｆリニア化に続いて、組み換えＲｆＤＮＡからＣＤ４− ガンマ２．キメラ重鎖遺伝子を単離した。リニア化されたＤＮＡのＥｃｏＲ１部 位をＤＮＡポリメラー ゼＩのクレノウフラグメントを用いてうめた。平坦な末端を有するＤＮＡをその 後Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１５℃で一晩、１００倍モル過剰のＨｉｎｄIII リンカーにつなげた。７０℃、１５分間でＴ４ＤＮＡリガーゼを熱不活性化した 後、ＨｉｎｄIIIリンカーＤＮＡをＨｉｎｄIIIで十分に消化し、ＣＤ４−ガンマ ２・キメラ重鎖遺伝子を含む断片を遊離した。その後このＨｉｎｄIII断片を精 製し、予めＨｉｎｄIIIで消化され、ＢＡＰ処理された発現ベクタ１ーｐｃＤＮ Ａ−１（インビトローゲン）につなげた。得られたプラスミドをその後ＭＣ１０ ６１／Ｐ３細胞に形質転換した。プラスミドＤＮＡを組み換えクローンから単離 し、ＨｉｎｄIII挿入物の存在及びプラスミド中のサイトメガロウイルス（ＣＭ Ｖ）プロモーターに関する挿人物の方向を制限酵素分析により確かめた。得られ たＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードする哺乳動物発現プラスミ ドはＣＤ４ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１と称する。 ３．哺乳動物細胞における ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１の発現 ａ．一時的な発現 10％牛胎児血清を含有するDMEM中で増殖したＣｏｓＭ５細胞を７５％集密に なるように分割した。次の日、標準的なＣａＰＯ（６）沈降法により、この細胞 にＣｓＣｌで精製されたプラスミドＣＤ４ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１・ＤＮＡ１０ μｇを１６〜２０時間でトランスフェクションした。トランスフェクションの後 、この細胞に新鮮な培地を添加した。ト ランスフェクション後４８〜７２時間後に合成された生成物の分析を、トランス フェクタントの³⁵Ｓ−メチオニンによる１２〜１８時間の放射能ラベル及びそれ に続く抗ＣＤ４抗体を用いた培地及び細胞溶解産物の沈降、或いはプロテインＡ −セファロースビーズのみを用いたインキュベーション及びそれに続く還元或い は非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより遂行した（図６）。更に、培地及び細 胞溶解産物の分析をトランスフェクション後４８〜７２時間後に、標準的なウエ スタンブロッティング手順により遂行した。 ｂ．安定な発現 Ｄｈｆｒ−チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に、ＣｓＣｌで精製 されたＤＮＡ２０μｇを、ＣＤ４ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１：ｐ４１０（ｐ４１０ はｄｈｆｒ遺伝子を含む発現プラスミドである）１０００：１のモル比でトラン スフェクションした。しかし他の比率も用いることができる。トランスフェクシ ョン後約３〜５日後に、細胞を選択培地（１０％透析牛胎児血清を含む無ヌクレ オシドアルファＭＥＭ）にまいた。セレクション後約１０〜１５日後に、個々の 細胞クローンを採取し、ＥＬＩＺＡ）プロテインＡ−セファロースビーズを用い た沈降及びそれに続く還元或いは非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ等のいくつか のスクリーニング技術を用いてＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の安定 な発現を分析した。高レベルで発現するクローンを、メソトレキセートの濃度を 増加させた中で増やし、新しく導入されたＤＮＡ配列を連続的に繰り返し増幅さ せた。このように、 １０〜１００μｇ／ｍｌのＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモニ量体を分泌する 安定なＣＨＯ細胞系が樹立された。 ４．ＣＨＯ馴らし培地からの ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の精製 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を分泌するＣＨＯ細胞を、ＩｇＧフ リーの１０％牛胎児血清を補充したアルファＭＥＭを含む培地中で、ローラーボ トル中に高密度になるまで増殖させた。馴らし培地を回収し、遠心により分離し 、この及び次の緩衝液中に界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ）を含む、或いは含まないＰ ＢＳで１：１に希釈した。その後、希釈した培地を、６０ｍｌ／時間の流速で、 予めＰＢＳで平衡にしたプロテインＡ−セファロースファーストフロウの５ｍｌ カラムにかけた。広範囲な洗浄の後、特異的に結合した材料を、１００ｍＭ グ リシン／ＨＣｌ（ｐＨ３．５）を用いて１Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０） のアリコートに直接溶出させ、直ちに溶出フラクションを中和した。その後、フ ラクションを還元及び非還元状態でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに続く銀染色に より分析し、プールした。 その後プールしたフラクションを、１２０ｍｌ／時間の流速で、予め５０ｍＭ ＢＥＳ（ｐＨ７．０）で平衡にしたＳ−セファロースファーストフロウの１０ ｍｌカラムにかけた。サンプルをのせた後、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ 二量体を特異的に溶出させるために、１工程溶出勾配（a stepelution gradient ）（以下の４工程からなる：５カラム体積の５０ｍＭ ＢＥＳ（ｐＨ７．０）、 ４カラム体積の５０ ｍＭ ＢＥＳ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、６カラム体積の５０ｍＭ ＢＥＳ（ｐＨ７．０）、２２５ｍＭＮａＣｌ、及びそれに続く８カラム体積の ５０ｍＭ ＢＥＳ（ｐＨ７．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ）を使用した。ＣＤ４ −ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を、５０ｍＭ ＢＥＳ（ｐＨ７．０）、５０ ０ｍＭ ＮａＣｌ中にカラムから溶出させた。その後ピークフラクションをプー ルし、濃縮して、最終的に蛋白質の濃度を少なくとも１ｍｇ／ｍｌにした。プー ルされ、濃縮されたフラクションをその後、８ｍｌ／時間の流速で、予めＰＢＳ で平衡にしたセファクリル Ｓ−３００ＨＲの１２０ｍｌカラムにかけた。ＣＤ ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のフラクションをＰＢＳ中に特異的に溶出 させ、少なくとも１ｍｇ／ｍｌに濃縮した。 ５．非ペプチド毒素のＣＤ４・ガンマ２重鎖ホモ二量体 への結合 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体との複合化に適した非ペプチド毒素 には、エネジイン（enediyne）坑癌性抗生物質類があるが、これには限られない 。この分子族には、カリケアマイシン（calicheamicins），エスペラマイシン（ esperamicins），およびダイネマイシン（dynemicins）、並びにこれらの分子の 誘導体および類縁体も含まれる。これらの毒素類は、様々な技法によってＣＤ４ −ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体に結合される。一つは、カリケアマイシンγ １を、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体のＦｃ部分上のＮ−結合したオ リゴ糖側鎖に特異的に結合させる例がある。この 場合、オリゴ糖は過ヨウ素酸ナトリウムを使用してアルデヒドに酸化される。カ リケアマイシンγ１の誘導体は、リンカーである３−メルカプトプロピオニル・ ヒドラジドを使用して作成する。この誘導体をＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホ モ二量体のアルデヒド基と反応させる（４４，４５）。該毒素の結合した二量体 は、透析によっておよび／またはサイズ排除カラムクロマトグラフィによって精 製される。 それに代わる方法では、毒素は、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体上 のリジンと結合する。この場合、毒素はＮ−ヒドロキシサクシンイミド（hudrox ysuccinimide）誘導体として調製され、二量体に直接反応される（４４）。複合 体は上述のようにして精製される。 ６．細胞障害放射性同位体のＣＤ４−ガンマ２・キメラ 重鎖ホモ二量体への結合 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体への結合に使用されるのは、高エネ ルギーのαまたはβ粒子を放出する細胞障害放射性核種である。これらの放射性 核種には、⁹⁰Ｙ、¹²⁵１、¹³¹Ｉ（β粒子放出物質）および²¹²Ｂｉ（α粒子放出 物質）が含まれるが、これには限定されない。様々な結合技法が利用可能であり 、それらは、治療用のモノクローナル坑腫瘍抗体を標識するのに使用され成功を 治さめてきている（３９）。使用される方法は、放射性核種の化学的性質、特に 、同位元素が金属性（例えば⁹⁰Ｙ，¹²¹Ｂｉ）であるか非金属性（例えば、¹²⁵Ｉ または¹³¹Ｉのようなハロゲン化物）であるかに依存する。このＣＤ４−ガンマ ２・キメラ重 鎖ホモ二量体は、該分子のＦｃ部分上のグリコシル化部位等の特異部位で標識化 されるか、または、非指向性の方法で、放射性核種が二量体のＣＤ４部分上の部 位も含めた多くの異なる部位を通して結合される。いずれの場合にも、二量体は 、放射線分解の損傷を起こさないような最高の比活性を見付けるために、種々の 比活性で標識される。複合化させた後の二量体の活性を評価するために、また複 合化または放射線分解による損傷が二量体の特性に及ぼし得る可能な影響を評価 するために、多くの機能試験が遂行される（下記セクション８−１３）。 適当な放射性核種結合の技法の例として、下記が上げられるが、これらに限定 されるものではない：商業的に容易に入手可能である¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉについて は、これをクロラミンＴまたはＩｏｄｏ−ｇｅｎ（Pierce Scientific）等の酸 化剤を使用して酸化し、Ｉ⁺カチオンにする。酸化されたハロゲン化物は、チロ シン等の芳香族化合物上で求電子置換反応を経てタンパク質に付加される（３９ ）。クロラミンＴまたはＩｏｄｏ−ｇｅｎの何れの場合も、試薬で被覆されたビ ーズが、二量体およびキャリアフリーのＮａ¹²⁵ＩまたはＮａ¹³¹Ｉの混合物に添 加される（２００μｇ蛋白に対して１ｍＣｉの同位元素の比率。これは他の蛋白 を使用して成功してきた比率である）。適当なインキュベーション期間をおいて 、ビーズが除去され、放射性核種の結合した二量体がサイズ排除ゲルクロマトグ ラフによって遊離の放射性核種から分離される。 金属性放射性核種である⁹⁰Ｙおよび²¹²Ｂの場合は、二官能キレータを使用し て、この同位元素をＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体に結合させる。こ の二官能キレータは、ジエチレントリアミン・ペンタアセテイック・アシッド（ ＤＴＰＡ）等のキレート剤からなり、これは、例えばタンパク上の遊離アミノ基 （例えばリジン残基）と反応する環状無水物を形成することによって、二官能化 されている（３９）。二量体の部位指向性標識化を行うために、該分子のＦｃ部 分上のＮ−結合されたオリゴ糖側鎖に特異的に結合する二官能キレータが使用さ れる。この場合、オリゴ糖は過ヨウ素酸ナトリウムを使用して酸化され、アルデ ヒドにされる。次いで、酸化された二量体はゲルクロマトグラフィ・カラムにか けられ、グリシルチロシルリシル（glcyltyrosyllysyl）−ＤＴＰＡ等の二官能 キレータのアミノ基と反応する（４６）。安定なアミンが、ホウ水素化ナトリウ ムを用いた還元によって形成される。この誘導体化された二量体は、例えば⁹⁰Ｙ （商業的に入手可能な放射性核種）、²¹²Ｂｉ（²²⁴Ｒａ発生系を経て入手可）を 用いて、典型的には１−５０μＣｉ／μｇ蛋白の範囲の比活性で放射能ラベルさ れる。 ７．診断／画像化用放射性核種のＣＤ４−ガンマ２・ キメラ重鎖ホモ二量体への結合 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体に結合させるための診断／画像化用 放射性核種には、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎおよび^99mＴｃ等のγ放射線放出物質が含まれ る。γ放射線を放出する放射性核種を二量体に結合するには、上記のセクショ ン６で述べた様々な結合技法が使用される。 画像化目的のための¹³¹Ｉは、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖二量体に対して 、セクション６で述べたような方法で結合される。けれども画像化用には治療目 的用よりも低い比活性が必要とされる。¹¹¹Ｉｎは商業的に入手可能な金属性放 射性核種であり、⁹⁰Ｙおよび²¹²Ｂｉの結合について上記セクション６で述べた ような二官能キレート剤を使用して二量体に結合される。^99mＴｃは、錫還元技 法等の方法を用いて、二量体に直接結合される（３９）。この技法において、二 量体のジスルフィド結合は、錫還元剤とホスホン酸誘導体との混合物と二量体を 混合することによって還元される。商業的に入手可能な発生器から誘導される^{99 m} Ｔｃがこの混合物に添加され、蛋白質上のスルフヒドリル基によってキレート 化され、安定な複合体を生じる。 ８．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体、または 毒素−二量体の複合体もしくは放射性核種−二量体の 複合体の、ＨＩＶｇｐ１２０に対する結合の例証 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体、またはこの二量体と非ペプチド毒 素または放射性核種との複合体の、ｇｐ１２０に結合する能力が下記のようにテ ストされる。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を発現する細胞からの培 地、精製二量体、或いは毒素複合体または放射性核種複合体が、³⁵Ｓ−メチオニ ンで放射性標識されたＨＩＶｇｐ１２０と共にインキュベートされる。インキュ ベートの後、このコンプレックスはプロテインＡセファロースに吸着される。プ ロテインＡセファロースコンプレックスは遠心分離によって回収され、沈殿物は 還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥと、これに続くフルオログラフィーによって分 析される。 ９．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体または 毒素−二量体の複合体もしくは放射性核種−二量体の 複合体の、ＨＩＶエンベローブ糖タンパクｇｐ１２０ ／ｇｐ４１を発現する細胞に対する結合の例証 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体または毒素と二量体との複合体の結 合が、フローサイトメトリーによって測定された。簡略にいうと、該分子をＨＩ Ｖに感染した細胞、ＨＩＶｇｐ１２０／ｇｐ４１を安定に発現するように加工さ れた細胞、またはｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現しない同系列の対照細胞と共にイ ンキュベートする。十分に洗浄した後、該細胞は、二量体と特異的に反応する抗 体、例えば、ヤギ坑（ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖）と共にインキュベートされる 。この抗体は、フルオロセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で既に複合さ れたものが入手される。さらに洗浄した後、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ 二量体または毒素−二量体の複合体の細胞に対する結合の測定として、細胞に結 合した蛍光体量をフローサイトメトリで測定する。相互作用の特異性を示すため に、ｇｐ１２０とＣＤ４間の相互作用を阻止する過剰のｓＣＤ４または坑ＣＤ４ 抗体（ＯＫＴ４ａ）の存在下で、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体は細 胞と共にインキュベートされる。 放射性核種を結合させたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホ モ二量体の、ＨＩＶｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現する細胞への結合は、その分子 を細胞と共にインキュベートし、十分に洗浄し、細胞に結合した放射活性物質の 量を、適当な検出システム（例えば、液体シンチレ−ションカウンター）を使用 することによって測定される。細胞タイプおよび対照は上述したとおりである。 １０．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体、または 毒素−二量体の複合体もしくは放射性核種−二量体 の複合体によるＦｃＲ結合の例証 ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲIIを発現するＵ９３７マクロファージ細胞系を、こ れらの研究に使用した。ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体、および毒素 −二量体複合体の場合、ＦｃＲの結合は、該分子のＵ９３７細胞に対する結合を フローサイトメトリを使用して分析することによって測定された。結合した分子 を検出する手順は、上記セクション９で論じたようにして遂行された。二量体の 結合は、精製されたヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ２の結合と比較された。該分 子の細胞への結合特異性は、細胞を、高親和性Ｆｃレセプタ−との特異的な相互 作用を阻害するモノクローナル抗ＦｃγＲＩ抗体と共に、予めインキュベートす ることによって決定された。 放射性核種とＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体との複合体のＵ９３７ 細胞との結合は、該分子を細胞と共にインキュベートし、十分に洗浄し、細胞と 結合した放射活性物質を適当な検出システム（例えば、液体シンチレーションカ ウンター）を使用して測定することによって測定される。対照には、放射性標識 された精製ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２が含まれる。結合の特異性は、複合化さ れていない分子および毒素と複合化した分子について、上述したように測定され る。 １１．毒素と複合化されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ 重鎖ホモ二量体および放射性核種と複合化された ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体による、 ｇｐ１２０／ｇｐ４１発現細胞の死滅の例証 種々の標準手法が、細胞障害性ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体複合 体による細胞の死滅を測定するために使用される。ＨＩＶに感染した第一次単球 ／マクロファージ、樹状突起細胞、Ｔリンパ球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）お よびこれらの細胞タイプから派生する細胞系等のいくつかの異なるターゲット細 胞が使用される。ＨＩＶエンベローブ糖タンパクを安定的にまたは一時的に発現 する細胞も使用される。第一次ＨＩＶ分離物に感染した細胞または、第一次分離 物のエンベローブ糖タンパクを発現する細胞、またに実験室のＨＩＶ分離物のエ ンベローブ糖タンパクに感染した細胞または発現する細胞も同様に使用される。 簡略に説明すると、細胞障害性複合体または対照タンパクが、ＨＩＶに感染し た細胞またはＨＩＶエンベローブ糖タンパクを発現するよう加工された細胞と共 にインキュベートされ、その後間隔をおいて、細胞の生存能力が測定される。幾 つかの方法が細胞の生存能力を測定するのに使用される。例 えば、細胞をトリパンブルーで染色する。生存細胞はこの色素を排除するので、 染色された細胞の数は死滅細胞の尺度となる。或いは、テトラゾリウム塩分析が 使用される（４７）。この場合、細胞は、テトラゾリウム塩ＭＴＴ（3-（4,5-ジ メチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）と共に インキュベートされる。この塩は、生細胞中においてテトラゾリウム環がデヒド ロゲナーゼ酵素によって開裂され、スペクトロフォトメトリーで測定することが できる着色物を与えるまでは無色である。別の方法では、標準技法を用いて生細 胞への³Ｈ−チミジンの取り込みを測定することによって、細胞成長率が測定さ れる。 これら全ての試験においては多くの対照が使用され、その中には、ＦｃＲを持 ったＵ９３７細胞のような、ＨＩＶｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現しない細胞のテ ストや、毒素または細胞障害性放射性核種が結合したモノクローナル抗体の、テ ストに使用された細胞上には存在しない抗原に対する反応性のテストが含まれる 。 １２．細胞障害性放射性核種と複合化した、または毒素 と複合化したＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ 二量体の、ＨＩＶに感染した細胞培養への影響の 例証 ＨＩＶ培養に対する、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体と毒素または 放射性核種との複合体の影響を測定するために、多くの標準分析が使用される。 細胞培養中でのウイルスの拡散における複合体の影響を測定するために、上記セ クション１１で記載した種々のタイプの細胞にＨＩＶを感染させる。臨床用株と 実験室用株の両方を、別々の実験で使用する。これらの細胞を、毒素−二量体ま たは放射性核種−二量体の複合体の或る濃度範囲で数日間インキュベートする。 培養物は規則正しく希釈し、複合体を含む新鮮な培地が加えられる。培養物内の 感染の広がりは、実験開始後に規則的な間隔で、細胞上澄液中のｐ２４抗原レベ ルまたは逆転写酵素（ＲＴ）活性を測定する等の多くの手法で測定される。これ らの実験における対照には、未複合のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体 、および毒素あるいは放射性核種に結合している無関係なモノクローナル抗体が 含まれる。 上記の複合体がＨＩＶに感染した細胞およびＨＩＶを培養物から排除できるか どうかを見るために、同様の実験がなされる。この場合、毒素または放射性核種 と複合した二量体を、ＲＴ阻害剤であるＡＺＴのような他の薬物と組合わせるこ との影響も調査される。薬物の一つが又は薬物の組合せによって、培養中におけ る生細胞を維持しながら（上記セクション１１で記載された技法により測定され る）、上澄液でのウイルスのレベルが検出可能なレベル以下に減少させる場合に は、細胞中のＨＩＶプロウイルスＤＮＡの存在が調らべられる。この場合、ポリ メラーゼチェイン反応（ＰＣＲ）技法を使用して、細胞溶解物から得たＨＩＶゲ ノムの領域を増幅させ、増幅されたＤＮＡは、適当なＤＮＡ断片に対するプロー ブとハイブリダイズさせることによって検出される。 １３．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体または 該分子と毒素または放射性核種との複合体の血漿 半減期の測定 血漿半減期の決定は、十分確立された技法によって遂行される。簡略に説明す ると、ウサギまたはサルに対して、精製されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホ モ二量体、またはその毒素誘導体もしくは放射性核種誘導体を、静脈内注射また は筋肉内注射する。注射後の種々の時点で血漿サンプルを採取し、血漿中の薬物 濃度を酵素結合イムノソルベント分析（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。例えば 、９６ウエル・プラスチックＥＬＩＳＡプレートを、精製した抗（ヒトＩｇＧ重 鎖および軽鎖）抗体で被覆する。洗浄後に、血漿の適切な稀釈物、または既知濃 度のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を含む標準をプレートに添加する 。インキュベーションおよび洗浄の後に、マウスモノクローナル抗ＣＤ４抗体と 共にインキュベートし、続いてパーオキシダーゼが結合した抗マウスＩｇＧ抗体 と共にインキュベートし、最後にスペクトロフォトメトリーで測定される発色性 のパーオキシダーゼ基質と共にインキュベートすることによって、二量体が検出 される。 １４．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を生産する ためのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖発現ベクター 又はＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖発現ベクターの作 成 ａ．ＣＤ−ＩｇＧ２・キメラ重鎖哺乳動物発現ベクターの 作成 プラスミドｐＳＰ６Ｔ４（６）から、ヒトＣＤ４・ｃＤＮＡ配列をＥｃｏＲ１ ／Ｓｔｕ１制限酵素断片として切り出す。０．７０キロベース断片を単離し、Ｅ ｃｏＲ１／Ｓｍａ１で消化されたＭ１３ｍｐ１８にクローン化する。その後得ら れたベクター（Ｍ１３ｍｐ１８（ＣＤ４））を単離し、ＢａｍＨ１で消化する。 Ｍ１３ｍｐ１８（ＣＤ４））のＢａｍＨ１部位をＤＮＡポリメラーゼＩのクレノ ウフラグメントで平坦な末端とする。ポリメラーゼを６５℃１５分間で熱不活性 化した後、リニア化したＭ１３ｍｐ１８（ＣＤ４）ベクターをＰｓｔ１で消化し 、精製する。 ヒトガンマ２・重鎖遺伝子のＣＨ１エキソンを含む断片を切り出すために、プ ラスミドｐＢｒガンマ２（４３）をＳａｃIIで消化し、ＳａｃII部位をその後Ｔ ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平坦にする。ポリメラーゼを熱不活性化した後、 この断片をＰｓｔ１で消化する。得られたＣＨ１エキソンを含むＳａｃII（平坦 ）−Ｐｓｔ１断片をその後精製し、前パラグラフで記載したＭ１３ｍｐ１８（Ｃ Ｄ４）ベクターにつなげる。コンピテントＴＧ１細胞の形質転換の後、得られた 組み換え体を、縦列にＣＤ４（ＥｃｏＲ１／Ｓｔｕ１）−Ｃ Ｈ１（ＳａｃII（平坦）／Ｐｓｔ１）を含むＣＤ４及びＣＨ１の両配列の存在に ついて制限酵素分析を用いてスクリーニングする。その後オリゴヌクレオチドに 媒介された部位指向性突然変異誘発を遂行して、フレーム中にＣＤ４及びＣＨ１ 配列を並べる。得られたキメラＤＮＡ分子はガンマ２・重鎖のＣＨ１ドメインに 融合されたＣＤ４のＶ１Ｖ２ドメインを含む。突然変異誘発は、形質転換したＴ Ｇ１細胞からの組み換えファージから単離された１本鎖ＤＮＡ（アマシャム）で 遂行される。鋳型ＤＮＡは、ＣＤ４のＶ１Ｖ２からのＰｈｅ（１７９）をコード する最終コドンをガンマ２・重鎖のためのＣＨ１ドメインの最初のコドン（Ａｌ ａをコードする）に接続する配列を含んだ、３３ｍｅｒオリゴヌクレオチド（５ ´−ＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧ− ３´）（配列認識番号８）と共にアニーリングされる。第二の鎖合成の後、２本 鎖ＤＮＡをコンピテントＴＧ１細胞に形質転換する。単離したプラークを新鮮な ＴＧ１細胞で増殖させ、ＤＮＡの塩基配列を決定するために１本鎖ＤＮＡを精製 する。すべての変異をシークエナーゼシステム（ＵＳＢ）を用いたジデオキシ法 により確認する。次いで、制限酵素分析によって決定される正しい配列をもった キメラ遺伝子を含むプラークをＴＧ１細胞中で増殖させ、この細胞からＲｆＤＮ Ａを単離する。 次に、ＣＤ４−ＣＨ１・キメラ遺伝子からのＲｆＤＮＡを、Ｐｓｔ１による消 化によってリニア化する。Ｐｓｔ１でリニア化されたベクターを、次いでＢＡＰ 処理し、ヒトガンマ２ ・重鎖遺伝子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３エキソンを含むプラスミドｐＢｒガン マ２のＰｓｔ１−Ｐｓｔ１ＤＮＡ断片につなげる。その後、キメラＣＤ４−ＣＨ １断片に関するＰｓｔ１−Ｐｓｔ１断片の正しい方向を制限酵素分析によって立 証する。得られたキメラ遺伝子は、ＣＤ４のＶ１Ｖ２ドメイン及びそれに続くガ ンマ２・重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む蛋白質をコ ードする（図２Ａ）２Ｂ及び４）。 ＥｃｏＲ１を用いたＲｆのリニア化に続いて、組み換えＲｆＤＮＡからＣＤ４ −ＩｇＧ２・キメラ重鎖ＤＮＡ分子を単離する。リニア化されたＤＮＡのＥｃｏ Ｒ１部位を、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで埋める。平坦な末 端を有するＤＮＡは、その後１５℃で一晩、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１００ 倍モル過剰のＨｉｎｄIIIリンカーにつなげられる。７０℃で１５分間の熱処理 によりＴ４ＤＮＡリガーゼを不活性化した後、ＨｉｎｄIIIリンカーＤＮＡをＨ ｉｎｄIIIにより十分に消化し、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖遺伝子を含む断 片を遊離する。次いで、このＨｉｎｄIII断片を精製して、予めＨｉｎｄIIIで消 化され且つＢＡＰ処理された発現ベクターｐｃＤＮＡ−１（インビトローゲン） につなげる。得られたプラスミドは、次いでＭＣ１０６１／Ｐ３細胞中に形質転 換される。プラスミドＤＮＡを組み換えクローンから単離し、このプラスミドに おけるＨｉｎｄIII挿入部の存在と、該挿入部のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ ）プロモーターに関する方向性を制限酵素分析により確かめる。得られ たＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖をコードする哺乳動物発現プラスミドは、ＣＤ ４−ＩｇＧ２ＣＨ−ｐＲｃＣＭＶと称する。 ｂ．ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖 哺乳動物発現ベクターの作成 ヒト・カッパ軽鎖の定常部を、プラスミドｐＣＮカッパ軽鎖からＭｓｅ１断片 として切り出す。次いで、精製された該Ｍｓｅ１断片を、ＤＮＡポリメラーゼ１ のクレノウフラグメントを用いて平坦な末端とする。その後、Ｍ１３ｍｐ１８・ ＲｆをＨｉｎｃIIを用いてリニア化し、平坦な末端を有するＭｓｅ１カッパ軽鎖 断片をベクターの平坦な末端のＨｉｎｃII部位につなげる。ＴＧ１細胞の形質転 換の後、制限酵素分析を行うことによって、この組み換え体はベクター中の挿入 部の存在および該挿入部の正しい方向を確認される。感染したＴＧ１細胞からＲ ｆを精製し、ＥｃｏＲ１及びＳｍａ１を用いて消化する。カッパ軽鎖定常部を含 む精製されたベクターを、その後前記ヒトＣＤ４ｃＤＮＡのＥｃｏＲ１／Ｓｔｕ １断片につなげる。得られた組み換え体は、縦列にＣＤ４（ＥｃｏＲ１／Ｓｔｕ １）−Ｃカッパ（Ｍｓｅ１（平坦）／Ｍｓｅ１（平坦））を含む挿入部の存在、 並びに該挿入部の方向について確認され、またオリゴヌクレオチドに媒介された 部位指向性突然変異誘発を行うために１本鎖ＤＮＡが精製される。鋳型ＤＮＡは 、ＣＤ４のＶ１Ｖ２のＰｈｅ（１７９）をコードする最終コドンをカッパ軽鎖定 常部の最初のコドン（ｔｈｒをコードする）に接続する配列を含んだ３３ｍｅｒ オリゴヌクレオチド（５´−ＧＡＴＧＧＴＧＣＡＧＣＣＡＣＡＧＴＧＡＡＡＧＣ ＴＡＧＣＡＣＣＡＣＧ−３´）（配列認識番号９）に対してアニーリングされる 。第二の鎖合成の後、２本鎖ＤＮＡをコンピテントＴＧ１細胞に形質転換し、単 離したプラークをＤＮＡの塩基配列を決定するために新鮮なＴＧ１細胞で増殖さ せる。変異の存在をジデオキシ法で確認する。正しい配列を有するキメラ遺伝子 を含むプラークをその後ＴＧ１細胞で増殖させ、この細胞からＲｆＤＮＡを単離 する。得られたＤＮＡ分子は、ＣＤ４のＶ１Ｖ２ドメイン及びそれに続くカッパ 軽鎖の定常部を含んだ蛋白質をコードする（図２Ａ、２Ｂ及び５）。 ＥｃｏＲ１によるＲｆリニア化の後、ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖ＤＮＡ分子 を組み換えＲｆＤＮＡから単離する。リニア化されたＤＮＡのＥｃｏＲ１部位を 、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで埋める。次いで、この平坦な 末端を有するＤＮＡを、１５℃で一晩、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１００倍モ ル過剰のＨｉｎｄIIIリンカーにつなげる。７０℃で１５分間の熱処理によりＴ ４ＤＮＡリガーゼを不活性化した後、ＨｉｎｄIIIリンカーＤＮＡをＨｉｎｄIII により十分に消化し、ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子を含む断片を遊離する 。次いで、このＨｉｎｄIII断片を精製した後、予めＨｉｎｄIIIで消化され且つ ＢＡＰ処理された発現ベクターｐｃＤＮＡ−１につなげる。得られたプラスミド を、ＭＣ１０６１／Ｐ３細胞に形質転換する。プラスミドＤＮＡを組み換えクロ ーンから単離した後、このプラスミド内における ＨｉｎｄIII挿入部の存在と、該挿入部のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロ モーターに関する方向性とを、制限酵素分析により確かめる。得られたＣＤ４− カッパ・キメラ軽鎖をコードする哺乳動物発現プラスミドをＣＤ４−ｋＬＣ−ｐ ＲｃＣＭＶと称する。 １５．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を生産する ための哺乳動物細胞におけるＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ −ｐＲｃＣＭＶ及びＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ の同時発現（coexpression） ａ．一時的な発現 10％牛胎児血清を含有するDMEM中で増殖したＣｏｓＭ５細胞を、７５％の集密 度になるように分割する。次の日に、標準的なＣａＰＯ（６）沈降法によって、 この細胞に対して、ＣｓＣｌで精製された５μｇのＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲ ｃＣＭＶ・ＤＮＡと、ＣｓＣｌで精製された５μｇのＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣ ＭＶプラスミドＤＮＡとを、１６〜２０時間でトランスフェクションする。トラ ンスフェクションの後、この細胞に新鮮な培地を添加する。トランスフェクショ ンの４８〜７２時間後に合成された生成物の分析は、トランスフェクタントを³⁵ Ｓ−メチオニンで１２〜１８時間放射能ラベルし、続いて抗ＣＤ４抗体を用いて 培地および細胞溶解産物を沈降させることによって、或いはプロテインＡ−セフ ァロースビーズのみを用いたインキュベーションと、これに続く還元性もしくは 非還元性条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって行われる。更に、培地および細胞溶 解産物の分析が、ト ランスフェクションの４８〜７２時間後に、標準的なウエスタンブロッティング 手順によって行われる。 ｂ．安定な発現 Ｄｈｆｒ−チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）に対して、ＣｓＣｌ で精製された２０μｇのＤＮＡをトランスフェクトする。このＤＮＡは、ＣＤ４ −ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ：ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ：ｐ４１０（ｐ ４１０はｄｈｆｒ遺伝子を含む発現プラスミドである）＝１０００：１０００： １の比であるが、他の比率を用いてもよい。トランスフェクションの約３〜５日 後に、細胞を選別培地（１０％透析牛胎児血清を含むヌクレオシドフリーのアル ファＭＥＭ）にまく。選別の約１０〜１５日後に、個々の細胞クローンを採取す る。次いで、このクローンをＥＬＩＺＡＮプロテインＡ−セファロースビーズを 用いた沈降、並びにそれに続く還元性または非還元性条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ のような幾つかのスクリーニング技術を用いることにより、ＣＤ４−ＩｇＧ２・ キメラヘテロ四量体の安定な発現について分析する。最高レベルで発現したクロ ーンを、メソトレキセートの濃度を増加させながら増やし、新しく導入されたＤ ＮＡ配列を連続的に繰り返し増幅させる。このようにして、高レベルのＣＤ４− ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を分泌する安定なＣＨＯ細胞株が樹立される。 １６．ＣＨＯ馴らし培地培地からの ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の精製 ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を、プロテインＡ −セファロースカラムクロマトグラフィーを用いて精製する。ＣＤ４−ＩｇＧ２ ・キメラヘテロ四量体を分泌するＣＨＯ細胞を、ＩｇＧフリーの１０％ＩｇＧ牛 胎児血清を補充したアルファＭＥＭを含む培地中で、ローラーボトル中に高密度 になるまで増殖させる。馴らし培地を回収し、遠心により清澄化し、界面活性剤 （Ｔｗｅｅｎ）を含むか若しくは含まないＰＢＳで１：１に希釈する。該界面活 性剤は、この緩衝液または引き続く緩衝液中に含まれる。次いで、希釈した培地 を、６０ｍｌ／時間の流速で、予めＰＢＳで平衡化したプロテインＡ−セファロ ース・ファーストフローの５ｍｌカラムにかける。十分な洗浄の後に、結合した 物質を１００ｍＭのグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ３．５）を用いて溶出させた。この フラクションは、１ＭのＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）アリコート中に直接溶 出されて、直ちに中和される。その後、フラクションは還元条件および非還元条 件のＳＤＳ−ＰＡＧＥと、それに続く銀染色により分析され、プールされる。更 なる精製には、ＣＤ４−ＩｇＧ２キメラヘテロ四量体を重鎖二量体から分離する ために、セファロースマトリックスに付着した抗カッパ軽鎖抗体を用いた親和性 クロマトグラフ等の一連のクロマトグラフ工程が含まれる。 １７．非ペプチド毒素のＣＤ４−ＩｇＧ２キメラヘテロ 四量体への結合 ＣＤ４−ＩｇＧ２キメラヘテロ四量体との複合化に適した非ペプチド毒素類に は、エネデイン（enediyne）坑癌抗生物質類があるが、これには限られない。こ の分子族には、カリケ アマィシン（calicheamicins），エスペラマイシン（esperamicins），およびダ イネマイシン（dynemicins）、並びにこれら分子の誘導体および類縁体も含まれ る。これらの毒素類は、様々な技法によってＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖ヘテ ロ四量体に結合される。一つは、カリキアマイシンγ１を、ＣＤ４−ＩｇＧ２・ キメラ重鎖ヘテロ四量体のＦｃ部分上のＮ−結合したオリゴ糖側鎖に特異的に結 合させる例がある。この場合、オリゴ糖は過ヨウ素酸ナトリウムを使用してアル デヒドに酸化される。カリキアマイシンγ１の誘導体は、リンカーである３−メ ルカプトプロピオニル・ヒドラジドを使用して作成する。この誘導体を、ＣＤ４ −ＩｇＧ２・キメラ重鎖ヘテロ四量体のアルデヒド基と反応させる（４４，４５ ）。該毒素の結合した四量体は、透析によっておよび／またはサイズ排除カラム クロマトグラフィによって精製される。 それに代わる方法においては、毒素は、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖ヘテロ 四量体上のリジンと結合する。この場合、毒素はＮ−ヒドロキシサクシンイミド （hudroxysuccinimide）誘導体として調製され、四量体に直接反応される（４４ ）。複合体は上述のようにして精製される。 １８．細胞障害放射性同位体のＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ 重鎖ヘテロ四量体への結合 ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖ヘテロ四量体への結合に使用されるのは、高エ ネルギーのαまたはβ粒子を放出する細胞障害放射性核種である。これらの放射 性核種には、⁹⁰Ｙ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ（β粒子放出物質）および²¹²Ｂｉ（α粒子 放出物質）があるが、これには限定されない。様々な結合技法が利用可能であり 、それらは、治療用のモノクローナル坑腫瘍抗体を標識するのに使用し成功を収 めてきた（３９）。使用される方法は、放射性核種の化学的性質、特に、同位体 が金属性（例えば⁹⁰Ｙ，¹²¹Ｂｉ）であるか非金属性（例えば、¹²⁵Ｉまたは¹³¹ Ｉのようなハロゲン化物）であるかに依存する。このＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ ヘテロ四量体は、該分子のＦｃ部分上のグリコシル化部位等の特異部位で標識さ れるか、または、非指向性の方法で、放射性核種が四量体のＣＤ４部分上の部位 も含めた多くの異なる部位を通して結合される。いづれの場合も、四量体は、放 射線分解の損傷を起こさない最高の比活性を見付けるために、種々の比活性で標 識される。複合化させたの後の四量体の活性を評価するために、また複合化また は放射線分解損傷が四量体の特性に及ぼす可能性な影響を評価するために、数多 くの機能試験が遂行される（下記セクション８−１３）。 適当な放射性核種結合技法の例として、下記が上げられるが、これらに限定さ れるものではない：商業的に容易に入手可能である¹²⁵Ｉまたは¹³¹Ｉについては 、これをクロラミンＴまたはＩｏｄｏ−ｇｅｎ（Pierce Scientific）等の酸化 剤を使用して酸化し、Ｉ⁺カチオンにする。酸化されたハロゲン化物は、チロシ ン等の芳香族化合物上で求電子置換反応を経てタンパク質に付加される（３９） 。クロラミンＴまたはＩｏｄｏ−ｇｅｎの何れの場合も、試薬で被覆されたビー ズが、四量体とキャリアフリーのＮａ¹²⁵ＩまたはＮａ¹³¹Ｉ の混合物に添加される（２００μｇ蛋白に対して１ｍＣｉの同位元素の比率。こ れは、他の蛋白を使用して成功してきた比率である）。適当なインキュベーショ ン期間をおいて、ビーズが除去され、放射性核種の結合した四量体がサイズ排除 ゲルクロマトグラフによって遊離の放射性核種から分離される。 金属性放射性核種である⁹⁰Ｙおよび²¹²Ｂの場合は、二官能キレータを使用し て、この同位元素をＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体に結合させる。この 二官能キレータは、ジエチレントリアミン・ペンタアセテイック．アシッド（Ｄ ＴＰＡ）等のキレート剤からなり、これは、例えばタンパク上の遊離のアミノ基 （例えば、リジン残基）と反応する環状無水物を形成することによって二官能化 されている（３９）。四量体の部位指向性標識行なうために、該分子のＦｃに部 分上にＮ−結合されたオリゴ糖側鎖に特異的に結合する二官能キレータが使用さ れる。この場合、オリゴ糖は過ヨウ素酸ナトリウムを使用して酸化され、アルデ ヒドになる。酸化された四量体は、次いでゲルクロマトグラフィ・カラムにかけ られて、グリシルチロシルリシル（glcyllyrosyllysyl）−ＤＴＰＡ等の二官能 キレータのアミノ基と反応する（４６）。安定なアミンがホウ水素化ナトリウム を使用した還元によって形成される。この誘導体化された四量体は、例えば⁹⁰Ｙ （商業的に入手可能な放射性核種）、²¹²Ｂｉ（²²⁴Ｒａ生成系を経て入手可）を 用いて、典型的には１−５０μＣｉ／μｇ蛋白の範囲の比活性で放射能ラベルさ れる。 １９．診断／画像化用放射性核種のＣＤ４−ＩｇＧ２・ キメラ重鎖ヘテロ四量体への結合 診断／画像化の目的で、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖ヘテロ四量体への結合 に使用される放射性核種には、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎおよび^99mＴｃ等のγ放射線放出 物質が含まれる。γ放射線を放出する放射性核種を四量体に結合するには、上記 のセクション６で述べたような様々な結合技法が使用される。 画像化目的のための¹³¹Ｉは、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体に対し て、セクション６で述べたような方法で結合される。けれども、画像化用には治 療目的用よりも低い特異活性が必要とされる。¹¹¹Ｉｎは商業的に入手可能な金 属性放射性核種であり、⁹⁰Ｙまたは²¹²Ｂｉの結合について上記セクション６で 述べたような二官能キレート剤を用いて、四量体に結合される。^99mＴｃは、錫 還元技法等の方法を用いて、四量体に直接結合される（３９）。この場合、二量 体のジスルフィド結合は、錫還元剤とホスホン酸誘導体との混合物と四量体とを 混合することによって還元される。商業的に入手可能な発生器から誘導される^{99 m} Ｔｃがこの混合物に添加され、蛋白質上のスルフヒドリル基によってキレート 化され、安定な複合体となる。 ２０．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖ヘテロ四量体、 または毒物−四量体あるいは放射性核種−四量体 の複合体の、ＨＩＶｇｐ１２０への結合の例証 ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、或いはこの四量 体と非ペプチド毒素もしくは放射性核種との複合体の、ｇｐ１２０に結合する能 力が下記のようにテストされる。ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を発現 する細胞からの培地、精製四量体、或いは毒素複合体または放射性核種複合体が 、³⁵Ｓ−メチオニン放射性標識されたＨＩＶｇｐ１２０と共にインキュベートさ れる。インキュベートの後、このコンプレックスはプロテインＡセファロースに 吸着される。プロテインＡセファロースコンプレックスは遠心分離によって回収 され、沈殿物は還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥと、これに続く蛍光光度法によ って分析される。 ２１．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体または毒物 −四量体あるいは放射性核種−四量体の複合体の、 ＨＩＶエンベローブ糖蛋白ｇｐ１２０／ｇｐ４１を 発現する細胞に対する結合の例証 ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体または毒物が複合した四量体の結合が 、フローサイトメトリーによって測定された。簡単に説明すると、該分子をＨＩ Ｖに感染した細胞、ＨＩＶｇｐ１２０／ｇｐ４１を安定的に発現するように加工 された細胞、またはｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現しない同系列の対照細胞と共に インキュベートする。十分に洗浄した後、該細胞は、四量体と反応する抗体、例 えば、ヤギ（坑ヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖）と共にインキュベートされる。この 抗体は、フルオロセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で既に複合されてあ るものが入手される。 さらに洗浄した後、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量 体、または毒物−四量体の複合体の細胞に対する結合の測定として、細胞に結合 した蛍光体量をフローサイトメトリで測定する。この相互作用の特異性を示すた めに、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体が、細胞と共に、ｇｐ１２０とＣ Ｄ４間の相互作用を阻止する過剰のｓＣＤ４または坑ＣＤ４抗体、ＯＫＴ４ａの 存在下でインキュベートされる。 放射性核種が結合したＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の、ＨＩＶｇｐ １２０／ｇｐ４１を発現する細胞への結合は、その分子を細胞と共にインキュベ ートし、十分に洗浄し、細胞に結合した放射活性物質の量を、適当な検出システ ム（例えば、ベータカウンター、ガンマカウンター）を使用して測定される。細 胞タイプおよび対照は上述したとおりである。 ２２．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体、または 毒素−四量体の複合体もしくは放射性核種−四量体 の複合体によるＦｃＲ結合の例証 ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲIIを発現するＵ９３７マクロファージ細胞系を、こ れら研究に使用した。ＣＤ４−ＩｇＧ２−キメラヘテロ四量体、および毒素の結 合した四量体の場合、ＦｃＲの結合は、該分子のＵ９３７細胞に対する結合をフ ローサイトメトリーを使用して分析することにより測定された。結合した分子を 検出する過程は、上記セクション２１で論じたように遂行された。四量体の結合 は、精製されたヒトＩｇＧ１およびヒトＩｇＧ２の結合と比較された。該分子の 細胞への結合特異性は、細胞を高親和性Ｆｃレセプターとの特異 的な相互作用を阻害するモノクローナル抗ＦｃγＲＩ抗体と共に、予めインキュ ベートすることで確認された。 放射性核種に複合されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体と、Ｕ９３７ 細胞との結合は、該分子を細胞と共にインキュベートし、十分に洗浄し、細胞と 結合した放射活性物質を適当な検出システム（例えば、液体シンチレーションカ ウンター）を使用して測定することによって測定される。対照には、放射性標識 された精製ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ２が含まれる。結合の特異性は、未複合お よび毒素の複合した分子について上述したように測定される。 ２３．毒素複合および放射性核種複合の ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体による ｇｐ１２０／ｇｐ４１発現細胞の死滅の例証 様々な標準手法が、細胞障害性ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体複合体 による細胞の死滅を測定するために使用される。ＨＩＶに感染した第一次単球／ マクロファージ、樹状突起細胞、Ｔリンパ球、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およ びこれらの細胞タイプから派生する細胞系等のいくつかの異なるターゲット細胞 が使用される。ＨＩＶエンベローブ糖蛋白を安定的にまたは一時的に発現する細 胞も使用される。第一次ＨＩＶ分離物に感染した細胞、または第一次分離物のエ ンベローブ糖蛋白を発現する細胞も、実験室のＨＩＶ分離物のエンベローブ糖蛋 白に感染した細胞または発現する細胞と同様に使用される。 要するに、細胞障害性複合体または対照蛋白が、ＨＩＶに 感染した細胞またはＨＩＶエンベローブ糖蛋白を発現するよう設計された細胞と 共にインキュベートされ、その後間隔をおいて、細胞の生存能力が測定される。 幾つかの方法が細胞の生存能力を測定するのに使用される。例えば、細胞をトリ パンブルーで染色する。生存細胞はこの色素を排除するので、染色された細胞の 数は死滅細胞の尺度となる。代わるものとしては、テトラゾリウム塩分析が使用 される（４７）。この場合、細胞はテトラゾリウム塩ＭＴＴ（3-（4,5-ジメチル チアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）と共にインキ ュベートされる。この塩は、生細胞では、テトラゾリウム環がデヒドロゲナーゼ 酵素によって開裂されるまでは無色であり、開裂されるとスペクトロフォトメト リーで測定できる着色物を与える。それに代わる方法では、生細胞への³Ｈ−チ ミジンの取り込みを標準技法により測定することによって、細胞成長率が決定さ れる。 これら全ての試験においては多くの対照が使用され、その中には、ＦｃＲを持 ったＵ９３７細胞のような、ＨＩＶｇｐ１２０／ｇｐ４１を発現しない細胞のテ ストや、毒素または細胞障害性放射性核種が結合したモノクローナル抗体の、テ ストに使用された細胞上には存在しない抗原に対する反応性のテストが含まれる 。 ２４．細胞障害性放射性核種または毒素と複合化され たＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体の、 ＨＩＶに感染した細胞培養への影響の例証 多くの標準分析が、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量 体と毒素または放射性核種との複合体の、ＨＩＶ培養への影響を測定するために 使用される。細胞培養中でのウイルスの広がりにおける複合体の影響を測定する ために、上記セクション２３に記載した種々のタイプの細胞にＨＩＶを感染させ る。臨床用株と実験室用の株の両方を、別々の実験で使用する。これらの細胞を 、毒物−四量体または放射性核種−四量体の複合体の濃度範囲で数日間インキュ ベートする。培養物は規則正しく希釈し、複合体を含む新鮮な培地が加えられる 。培養物内の感染の広がりは、実験開始後、規則的な間隔で細胞上澄液中のｐ２ ４抗原のレベルまたは逆転写酵素（ＲＴ）活性を測定するといった多くの手法で 測定される。これらの実験における対照には、複合化されないＣＤ４−ＩｇＧ２ ・キメラヘテロ四量体、および毒素あるいは放射性核種に結合した無関係なモノ クローナル抗体が含まれる。 複合体がＨＩＶに感染した細胞およびＨＩＶを培養物から排除するかどうかを 見るために、同様の実験がなされる。この場合、毒素または放射性核種と複合化 した四量体を、ＲＴ阻害剤であるＡＺＴ等の他の薬物と組合わせることの影響も 調査される。薬物の一つ或いは薬物の組合せが、培養中で生細胞を維持しながら （上記セクション２３で記載された技法で測定される）、上澄液でのウイルスの レベルを検出可能なレベル以下に減少させる場合には、細胞中のＨＩＶプロウイ ルスＤＮＡの存在が調らべられる。この場合、ポリメラーゼチェイン反応（ＰＣ Ｒ）技法を使用して、細胞溶解物からのＨＩＶゲノム領域を増幅させ、増幅され たＤＮＡは、適切な ＤＮＡ断片に対するプローブとハイブリダイスさえることによって検出される。 ２５．ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体または 該分子と毒素または放射性核種との複合体の血漿 半減期の決定 血漿半減期の決定は、十分確立された技法によって遂行される。簡単に説明す ると、ウサギまたはサルに対して、精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ 四量体、またはその毒素誘導体もしくは放射性核種誘導体を、静脈内または筋肉 内注射する。注射後の種々の時点で血漿サンプルを採取し、血漿中の薬物濃度を 酵素結合イムノソルベント分析（ＥＬＩＳＡ）によって測定する。例えば、９６ ウエル・プラスチックＥＬＩＳＡプレートを、精製された（抗−ヒトＩｇＧ重鎖 および軽鎖）抗体で被覆する。洗浄後に、血漿の適切な稀釈物、または既知濃度 のＣＤ４−ＩｇＧ２・四量体を含む標準をプレートに添加する。インキュベーシ ョンおよび洗浄した後に、マウスモノクロナル抗ＣＤ４抗体と共にインキュベー トし、続いてパーオキシダーゼが結合した抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベ ートし、最後にスペクトロフォトメトリーで測定される発色性パーオキシダーゼ 基質と共にインキュベートすることによって、四量体が検出される。 Ｂ．結果 １．ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体およびＣＤ ４−ＩｇＧ２キメラヘテロ四量体の作成、発現および 精製 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードするＣＤ４−ガンマ２・キ メラ重鎖遺伝子は、ヒトＣＤ４ｃＤＮＡ（６）のリーダー・Ｖ１Ｖ２セグメント をヒトガンマ２・重鎖遺伝子（４３）のヒンジエキソンに結合させることによっ て生成された（図１Ａ）。得られた組換えＤＮＡ分子（ＣＤ４−ＩｇＧ２−Ｒｆ と称する）は、シグナル配列およびＣＤ４タンパクの２つのアミノ末端免疫グロ ブリン様ドメイン（成熟ＣＤ４の最初の１７９アミノ酸）、並びにこれに続くガ ンマ２・重鎖タンパクのヒンジ（１５アミノ酸）、ＣＨ２（１１０アミノ酸）、 およびＣＨ３（１０７アミノ酸）領域（図３）をコードする。この組換えＤＮＡ 分子は、ガンマ２・重鎖遺伝子内に存在する２つのイントロン（ＨとＣＨ２ドメ インとの間、及びＣＨ２とＣＨ３との間）をも有している。このＣＤ４−ガンマ ２・キメラ遺伝子は、ガンマ２・重鎖のＣＨ１ドメインを特異的に欠いたＣＤ４ −ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体をコードするように設計されている。軽鎖を 伴わないＣＨ１ドメインの発現は、哺乳動物細胞からの効率的な重鎖分泌を防止 する（３２）。 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体において、１本の鎖のヒンジ領域は 、４か所の鎖間ジスルフィド結合の可能性を与える４つのシステイン残基を有し ている（図１Ｂ）。 同様に、天然のヒトＩｇＧ２は、ガンマ２・重鎖の間に４つの鎖間ジスルフィド 結合を有している。 ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子は、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ１ 内にサブクローンされた。このベクターは以下のＤＮＡ要素を有している：即ち 、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖遺伝子の転写を推進するサイトメガロウイルス （ＣＭＶ）の即時初期プロモーター（immediate early promoter）およびエンヘ ンサー；ＳＶ４０ポリアデニレーション配列；およびＣｏｓＭ５細胞においてこ のプラスミドを高いコピー数で複製することを可能にする複製のＳＶ４０オリジ ンである。得られたＣＤ４−ガンマ２・重鎖哺乳動物発現ベクター（ＣＤ４−Ｉ ｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１と称する）はＣｏｓＭ５細胞に形質導入され、この細胞を 形質導入の４８−７２時間後に³⁵Ｓメチオニンで放射性標識した。放射性標識し た培地を、プロテインＡ−セファロースビーズを用いる沈降、およびＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ、次いで蛍光光度法により分析した（図６）。還元条件下において約４７ キロダルトンの相対分子質量（Ｍｒ）で移動するタンパク質が沈殿する。沈殿し た物質を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた場合には、Ｍｒ約９４キロダ ルトンで移動するタンパク質が観察された。これは、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ 重鎖が組み立てられ、ホモ二量体として分泌されていることを示している。加え て、これらの結果は、分泌されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体がプ ロテインＡと結合することから、それらが損なわれていない免疫グロブリンＦｃ ドメインを有しているこ とを示している。さらに、精製された可溶性ヒトＣＤ４に対するウサギ・ポリク ローナル抗血清を用いて、形質導入後の４８−７２時間に培地内に分泌されたタ ンパク質のウェスタンブロット分析による特徴付けを行なった。沈殿により得ら れた結果と同様に、還元条件下で培地をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、次いでニトロ セルロースにウェスタン移動させた場合には、主要な免疫反応性タンパク質はＭ ｒ約４７キロダルトンで移動する。非還元条件下においては、主な免疫反応性タ ンパク質はＭｒ約９４キロダルトンで移動する。まとめると、これらは、ＣＤ４ −ガンマ２・キメラ重鎖が予期された分子量のホモ二量体として産生され、分泌 されていることを示している。 上記の結果は、ガンマ２・重鎖遺伝子の定常領域にコードされるＣＤ４−ガン マ２・キメラ重鎖ホモ二量体のＦｃタンパクが、プロテインＡに結合することを 示している。ＣＤ４部分が果たして機能的に完全であるかを決定するために、Ｃ Ｄ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を、それらのＨＩＶ外部エンベロープ糖 タンパク、ｇｐ１２０への結合能力について検定した（図７）。ＣＤ４−ＩｇＧ ２−ｐｃＤＮＡ１・ＤＮＡを形質導入したＣｏｓＭ５細胞からの非標識培地を、³⁵ Ｓメチオニン標識ｇｐ１２０と共にインキュベートした。プロテインＡ−セフ ァロースビーズと共にインキュベートすることにより、ＣＤ４−ガンマ２・キメ ラ重鎖ホモ二量体／ｇｐ１２０複合体を沈殿させ、この沈殿物を還元条件下にお けるＳＤＳ−ＰＡＧＥ）次いで蛍光光度法により分析した。 これらの結果は、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体が、ＨＩＶｇｐ１２ ０を効率よく認識し、高い親和力で結合することを示している。上記のパラグラ フに記載した結果と総合すると、これらの観察は、ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重 鎖ホモ二量体がＣＤ４およびガンマ２・重鎖の機能的に活性な領域を有している ことを示している。 大量のＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を安定に製造するために、Ｃ Ｄ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１ベクター（酵素ジヒドロフォレート．レダクター ゼ（ｄｈｆｒ）をコードする）を、プラスミドｐ４１０と共に、ｄｈｆｒ−チャ イニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に形質導入した。形質導入の約２週間 後、ヌクレオシド非含有αＭＥＭおよび１０％透析仔ウシ血清（したがって、ｄ ｈｆｒ＋）中で増殖した個々のクローンを単離し、沈殿およびＥＬＩＳＡにより ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の共発現について分析した。最大産生 細胞系を同定し、メトトレキセート中にいれて、メトトレキセートの濃度を段階 的に増加させて、新規に導入されたＤＮＡ配列の増加を選択した。ＣＤ４−ガン マ２・キメラ重鎖ホモ二量体約１０μｇ／ｍｌ／日を発現するＣＨＯ細胞系を、 ローラーボトル内での安定的かつ本質的な生産のために用いた。この細胞を、１ ０％ＩｇＧ非含有仔ウシ血清を含むαＭＥＭ中において、集密状態にまで増殖さ せた。次いで、これらの細胞に一日おきに栄養素が補給され、２日経た馴らし培 地をＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の精製に用いた。馴らし培地をリ ン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）で１：１に希釈し、流速６０ミリリットル／時で、プロテインＡ−セ ファロース・ファースト．フロー（ファルマシア）の５ｍｌカラムに流した。そ の後、該カラムを１０カラム容積のＰＢＳで洗浄し、結合物質を１００ｍＭグリ シン、ｐＨ３．５で溶出させた。溶出した物質は、５０μｌの１Ｍトリス・ＨＣ ｌ、ｐＨ８．０中に直接集めて、溶離液（eluant）を中和した。ＯＤ（２８０） が０．１より大きい分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いで銀染色またはウェスタン ・ブロット分析により分析し、ピーク分画をプールした。ＣＤ４−ガンマ２・キ メラ重鎖ホモ二量体に相当するＭｒを有する単独のバンドがプロテインＡ−セフ ァロースカラムから特異的に溶出された（図８）。溶出したタンパク質は、可溶 ヒトＣＤ４に対するポリクローナル抗血清に免疫反応性を有することがウェスタ ン・ブロット分析により確認された。加えて、精製タンパク質は、³⁵Ｓメチオニ ン標識ｇｐ１２０と高い親和力で結合する能力を保持している。これらの結果は 、哺乳動物細胞におけるＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の安定で高レ ベルの産生、および生物学的な機能を保持するＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホ モ二量体の精製を示している。 イオン交換クロマトグラフィを用いることにより、ＣＤ４−ガンマ２・重鎖ホ モ二量体のさらなる精製を達成した。プロテインＡ−セファロースカラムからの ピーク分画を、５０ｍＭ ＢＥＳ、ｐＨ７．０で予め平衡にした１０ｍｌＳ−セ ファロース・ファースト・フローカラムに流速１２０ｍｌ／ 時で流した。試料を流した後、カラムを塩濃度が増しながら、５０ｍＭ ＢＥＳ 、ｐＨ７．０で広範に洗浄した（材料および方法を参照）。ＣＤ４−ガンマ２・ 重鎖ホモ二量体は、カラムから、５００ｍＭ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ Ｂ ＥＳ、ｐＨ７．０中に特異的に溶出した。イオン交換クロマトグラフィの後のＣ Ｄ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体を含有するピーク分画は、予期せぬこと に、いまだ不純であった。従って、Ｓ−セファロースカラムからのピーク分画を プールし、濃縮して、予めＰＢＳで平衡にした１２０ｍｌセファクリル（Sephac ryl）Ｓ−３００ＨＲカラムに流速毎時８ｍｌで流した。精製ＣＤ４−ガンマ２ ・重鎖ホモ二量体のピーク分画を、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ び銀染色により分析し、かつ精製した分画をプールして非還元条件下（図８、レ ーン１）、もしくは還元条件下（図８、レーン２）においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ） 続く銀染色により分析した。 ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖をコードするＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣキメラ重鎖 遺伝子は、ヒトＣＤ４ｃＤＮＡのリーダー・Ｖ１Ｖ２セグメントをヒトＩｇＧ２ 重鎖遺伝子のＣＨ１エキソンに結合させることにより生成した（図２Ａ）。加え て、ＣＤ４−カッパ軽鎖をコードするＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子を、ヒ トＣＤ４ｃＤＮＡのリーダー・Ｖ１・Ｖ２セグメントをカッパ軽鎖遺伝子の定常 ドメインに結合させることにより生成した（図２Ａ）。これらのＣＤ４−ＩｇＧ ２・キメラ重鎖遺伝子およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺 伝子は、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体をコードし、また該ＣＤ４−Ｉ ｇＧ２・重鎖が、カッパ軽鎖に効率よく結合するＣＨ１ドメインを含むように設 計されている。 ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子の両 者は、哺乳動物発現ベクターｐＲｃＣＭＶもしくはｐＰＰＩ−２にサブクローン される。いずれのベクターも、サイトメガロウイルスの即時初期プロモーターお よびキメラ遺伝子の転写を推進するエンハンサーを有する。ベクターｐＲｃＣＭ Ｖにおいては、ＲＳＶプロモーターおよびエンヘンサーを有する第２の転写カセ ットが耐ネオマイシン遺伝子の転写の指令に用いられる。ｐＰＰＩ−２において は、β−グロビンプロモーを含有する第２の転写カセットがｄｈｆｒ遺伝子の転 写を指令する（前記参照）。大量のＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロテトロマー を安定に製造するために、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖発現ベクターおよびＣ Ｄ４−カッパ・キメラ軽鎖発現ベクターを同時に形質導入した（典型的には、ｐ ＲｃＣＭＶ内でクローンしたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖遺伝子およびｐＰＰ Ｉ−２内でクローンしたＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖遺伝子を１：１の割合で用 いた）。形質導入の約２週間後、１ｍｇ／ｍｌＧ４１８および１０％透析仔ウシ 血清を含有するヌクレオシド非含有αＭＥＭ中で増殖した個々のクローンを単離 し、免疫沈降およびＥＬＩＳＡによって、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖および ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖両者の共発現を解析した。図１０は、選択され、Ｃ Ｄ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖および ＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖両者の発現について解析された１つのクローンを示 す。ＣＨＯ細胞系もしくは形質導入されていないＣＨＯ親細胞系を³⁵Ｓメチオニ ンおよび³⁵Ｓシステインで１６時間放射性標識した。放射性標識した培地を、プ ロテインＡ−セファロースビーズを用いる沈殿および非還元条件下におけるＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥ）次いで蛍光光度法により分析した（図１０Ａ）。非還元条件下に おいて相対分子質量約１４０キロダルトンおよび２１０キロダルトンで移動する ２種のタンパク質が沈殿する。沈殿した物質を還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡ ＧＥにかけた場合には、６９キロダルトンおよび３５キロダルトンの相対分子質 量で移動する２種のタンパク質が観察された。これは、夫々ＣＤ４−ＩｇＧ２・ キメラ重鎖およびＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖の予期された相対分子質量に一致 する（データは表示せず）。非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１４０ キロダルトンで移動するタンパク質がＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖のみを有す るのに対して、非還元条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で２１０キロダルトン で移動するタンパク質は共有結合で結合するＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およ びＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖の両者を含有するというさらなる特徴付けが示さ れている（図１０Ｂ）。これらのデータは、共有結合で結合してＨ₂Ｌ₂（Ｈ＝重 鎖、Ｌ＝軽鎖）構造を有する分子を形成する、２つのＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ 重鎖および２つのＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖を有する２１０キロダルトン．タ ンパク質の予期された分子量に一致する。さらに、非還元 条件下におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に見出される１４０キロダルトン・タンパク 質は、構造Ｈ₂を有するＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラホモ二量体の予期された分子 量に一致する。これらの結果を総合すると、ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖およ びＣＤ４−カッパ・キメラ軽鎖の両者を発現するＣＨＯ細胞系が、ＣＤ４−Ｉｇ Ｇ２・キメラヘテロ四量体を効率よく組み立て且つ分泌することが可能であるこ とを示している。 大量のＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体を産生する細胞系を同定し、メ トトレキセート中に供与し、メトトレキセートの濃度を段階的に増加させて、新 規に導入されたＤＮＡ配列の増殖物を選択した。ＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテ ロ四量体約１０μｇ／ｍｌ／日を発現するＣＨＯ細胞系を、ローラーボトル内で の安定的かつ本質的な産生のために用いた。蛋白質の生産およびプロテインＡ− セファロース・ファースト・フロ−上での精製は、ＣＤ４−ガンマ２・二量体に ついて上述したのと同様であり、産生された蛋白は、還元および非還元条件下に おけるポリアクリルアマイド・ゲル電気泳動、続いて銀染色で分析した時、９０ ％純度のＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体よりも多かった（表示せず）。 ウエスタンブロット分析で、精製されたＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量 体が、可溶性ヒトＣＤ４に対して産生されるポリクローナル抗血清に免疫反応性 がある事が確認された。加えて、精製された蛋白は、³⁵Ｓメチオニン標識された ｇｐ１２０に対して高い親和性をもって結合する能力を保持している（表示せず ）。これらの結果は、哺乳類動物細胞に おいてＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラ重鎖ヘテロ四量体が、安定且つ高レベルで生産 され、生物学的機能を保持したＣＤ４−ＩｇＧ２・キメラヘテロ四量体が精製さ れる事を実証している。 ２．ＣＤ４ガンマ２キメラ重鎖ホモ二量体およびＣＤ４− Ｉｇ２ヘテロ四量体の、ＨＩＶ−１エンベロープ 糖蛋白を発現する細胞への結合、およびＦｃ レセプターを発現するＵ９３７細胞への非結合 フロー血球計算分析（表示せず）によって、ＣＤ４ガンマキメラ重鎖ホモ二量 体およびＣＤ４−ＩｇＧ２ヘテロ四量体が共に、ＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白 を発現する細胞に結合したことが分かった。 精製ＣＤ４−ガンマ２キメラ重鎖ホモ二量体は、Ｕ９３７細胞と顕著には結合 しなかった。これに対し、ヒトＩｇＧ１は、これらの細胞に良く結合した（図９ ）。まったく同様の結果が、ＣＤ４−ＩｇＧ２ヘテロ四量体を使用して得られた （表示せず）。ヒトＩｇＧ２は、Ｕ９３７細胞に対しては、予期されたように最 小限の結合を示した（結果は表示せず）。ヒトＩｇＧ１のＦｃγＲＩに対する結 合の特異性は、モノクローナル坑ヒトＦｃγＲＩ抗体でＵ９３７細胞をあらかじ めインキュベートすることによって実証された。この処理の後、ＩｇＧ１の細胞 への結合は最低であった（結果は表示せず）。これらの結果によって、ＣＤ４− ガンマ２キメラ重鎖ホモ二量体およびＣＤ４−ＩｇＧ２キメラヘテロ四量体は、 ＦｃγＲＩ、高親和性Ｆｃレセプター、あるいはＦｃγＲIIに対 する最小限の結合かまたは結合しない事が実証された。 ３．ウサギにおけるＣＤ４−ガンマ２キメラ重鎖ホモ 二量体およびＣＤ４−ＩｇＧ２キメラヘテロ四量体の 薬物動態学 可溶性ＣＤ４、精製ホモ二量体、または精製ヘテロ四量体のサンプル（０．２ −０．２５ｍｇ）を、５匹の複製ニュージーランド・ホワイト・ウサギの耳静脈 に注入し、血液サンプルを反対側耳の静脈動脈から注入前と、注入後あらかじめ 決められた間隔をおいて採収した。ＣＤ４−ガンマ２キメラ重鎖ホモ二量体また はＣＤ４−ＩｇＧ２キメラヘテロ四量体の濃度は、血漿サンプルの酵素結合イム ノソルベント分析によって決定された。αおよびβ半減期は、二コンパートメン トモデル（PCNONLIN version ４；SCI Software，Lexington，Kentucky）を使用 して計算した。 下記の結果が得られた。 ｓＣＤ４： α半減期： ７．６分 β半減期： １６．８分 ＣＤ４−ガンマ２キメラ重鎖ホモ二量体： α半減期： ３．４時間 β半減期： ３０．０時間 ＣＤ４−ＩｇＧ２キメラヘテロ四量体 α半減期： １．３時間 β半減期： ２６．４時間 これらの値は、別の、ｓＣＤ４およびＣＤ４−イムノグロブリン構築物の研究 でわかった値と同様である（２８）。前記の研究に基づいて、ヒトにおけるター ミナル（β）半減期は、ウサギにおける半減期よりも大きくなることと思われる （２８）。これらの結果によって、ＣＤ４−ガンマ２キメラ重鎖ホモ二量体およ びＣＤ４−ＩｇＧ２キメラヘテロ四量体は、ｓＣＤ４よりもはるかに長いターミ ナル半減期をもち、その結果、ＨＩＶに感染した細胞を死滅させるのに、または これらの細胞をｉｎ ｖｉｖｏで検出するのに適した免疫複合体を作成するのに 最適な候補となることが示された。 ｃ：例：ＨＩＶ感染患者のＨＩＶ感築細胞の、 ¹³¹Ｉ放 射性標識されたＣＤ４−ガンマ２キメラ重鎖ホモ 二量体を使用しての画像化 ¹³¹Ｉ放射性標識されたＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体の投与前、 投与中に、患者は無放射性標識のヨウ素で処理され、甲状腺で、¹³¹Ｉが取り込 まれるのを防止した。ＣＤ４−ガンマ２キメラ重鎖ホモ二量体は、クロラミンＴ 法を使用し、¹³¹Ｉによって１−５ｍＣｉ／ｍｇの特異的活性で標識され、放射 性標識された蛋白は、遊離の放射性ヨウ素からサイズ排除クロマトグラフィーま たはその他適当な技法で分離された。標識された蛋白は、目的の投与レベルを得 るために必要に応じて非標識蛋白と混合される。¹³¹Ｉ放射性標識されたＣＤ４ ガンマ２キメラ重鎖ホモ二量体は、適切な投与量レベル、例えば、最終活性が１ −５ｍＣｉ／患者の範 囲内となるように、１−２０ｍｇ／患者の範囲内で静脈内注射される。 放射性標識された分子のイン・ビボでの位置測定は、注射した後に適当な時間 間隔（例えば、注入後最初の３日は毎日）をおいて、ガンマ線カメラを使用して 遂行される。一つの器官および身体全体の何れもが画像化され、全ウイルス負荷 に加えて、ＨＩＶおよびＨＩＶに感染した細胞の分布が測定される。 〔参照文献〕 配列表 （１）一般的情報 （ｉ）出願人：Progenics Parmaceulicals Inc. （ii）発明の名称：非ペプチジル部分に結合したＣＤ４−ガンマ２ およびＣＤ４−ＩｇＧ２免疫複合体、並びにその使用 （iii）配列の数：９ （iv）通信宛先： （Ａ）名宛人：クーパー ＆ ダンハム （Ｂ）通り：ロックフェラープラザ30 （Ｃ）市：ニューヨーク （Ｄ）州：ニューヨーク （Ｅ）国：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：10112 （ｖ）コンピュータ読取り可能な形態： （Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：ＩＢＭ・ＰＣコンパチブル （Ｃ）オペレーティングシステム：ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ （Ｄ）ソフトウエア：ＰａｔｅｎｔＩｎ リリース＃１．２４ （vi）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：ＰＣＴ／ＵＳ９３（未知） （Ｂ）出願日：１９９３年８月６日 （Ｃ）分類： （vii）先の出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ ０７／９２７，９３１ （Ｂ）出願日：１９９３年８月７日 （viii）アトニー／エージェント情報 （Ａ）氏名：Ｗｈｉｔｅ，Ｊｏｈｎ Ｐ． （Ｂ）登録番号：２８，６７８ （Ｃ）参照／ドケット番号:４１２１５−Ａ−ＰＣＴ／ＪＰＷ／ＡＪ Ｐ （ix）電信情報： （Ａ）電話：（２１２）９７７−９５５０ （Ｂ）テレファックス：（２１２）９７７−９８０９ （Ｃ）テレックス：４２２５２３ ＣＯＯＰ ＵＩ （２）配列認識番号１のための情報； （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１７９６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vii）起源： （Ａ）生物：ホモサピエンス （Ｇ）細胞の型：リンパ球 （xi）配列の記載：配列認識番号１ （２）配列認識番号２のための情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：４３２アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：タンパク （vii）起源： （Ａ）生物：ホモサピエンス （Ｇ）細胞の型：リンパ球 （xi）配列の記載：配列認識番号２ （２）配列認識番号３のための情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：２４８２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vii）起源： （Ａ）生物：ホモサピエンス （Ｇ）細胞の型：リンバ球 （xi）配列の記載：配列認識番号３ （２）配列認識番号４のための情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：５３０アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vii）起源： （Ａ）生物：ホモサピエンス （Ｇ）細胞の型：リンパ球 （xi）配列の記載：配列認識番号４ （２）配列認識番号５のための情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：１１４９塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：ｃＤＮＡ （vi）起源 （Ａ）生物：ホモサピエンス （Ｂ）細胞の型：リンパ球 （xi）配列の記載：配列認識番号５ （２）配列認識番号６のための情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ：３１０アミノ酸 （Ｂ）型：アミノ酸 （Ｃ）鎖：不明 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：タンパク （vi）起源 （Ａ）生物：ホモサピエンス （Ｂ）細胞の型：リンパ球 （xi）配列の記載：配列認識番号６ （２）配列認識番号７のための情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ： 塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：ＤＮＡ （vi）起源 （Ａ）生物：ホモサピエンス （Ｂ）細胞の型：リンパ球 （xi）配列の記載：配列認識番号７ （２）配列認識番号８のための情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ： 塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：ＤＮＡ （vi）起源 （Ａ）生物：ホモサピエンス （Ｂ）細胞の型：リンパ球 （xi）配列の記載：配列認識番号８ （２）配列認識番号９のための情報： （ｉ）配列特性： （Ａ）長さ： 塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：ＤＮＡ （vi）起源 （Ａ）生物：ホモサピエンス （Ｂ）細胞の型：リンパ球 （xi）配列の記載：配列認識番号８

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 51/00 Ｃ０７Ｋ 14/73 ＺＮＡ 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 8310−2Ｊ 7431−4Ｃ Ａ６１Ｋ 49/02 Ｃ 7729−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＹ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１）非ペプチジル毒素と、２）これに結合したＣＤ４−ガンマ２・キメラ 重鎖ホモ二量体とを含む免疫複合体。 ２．請求項１に記載の免疫複合体であって、前記ＣＤ４−ガンマ２・キメラ重 鎖ホモ二量体が、ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１（ＡＴＣＣ第40952号）と命 名された発現ベクターによってコードされる免疫複合体。 ３．請求項１に記載の免疫複合体であって、前記非ペプチジル毒素がエネジイ ン抗癌性抗生物質またはその誘導体である免疫複合体。 ４．請求項３に記載の免疫複合体であって、前記エネジイン抗癌性抗生物質が カリケアマイシンである免疫複合体。 ５．請求項１に記載の免疫複合体であって、前記非ペプチジル毒素が細胞障害 性の放射性核種である免疫複合体。 ６．請求項５に記載の免疫複合体であって、前記細胞障害性の放射性核種が、⁹⁰ Ｙ，¹³¹Ｉ，¹²⁵Ｉまたは²¹²Ｂｉである免疫複合体。 ７．ＨＩＶ感染細胞を殺滅する方法であって、ＨＩＶ感染細胞を、該細胞を殺 滅するために有効な量の、請求項１に記載の免疫複合体と接触させることを具備 した方法。 ８．対象におけるＨＩＶ感染細胞ポピュレーションを減少させるようにＨＩＶ に感染した対象を治療する方法であって、ＨＩＶに感染した対象に対して、ＨＩ Ｖ感染細胞を殺滅してＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染細胞ポピュレー シ ョンを減少させるために有効な量の、請求項１に記載の本発明の免疫複合体を投 与することを具備した方法。 ９．請求項８に記載の方法であって、投与される免疫複合体の量が、ＨＩＶに 感染した対象におけるＨＩＶ感染細胞のポピュレーションをなくすために有効な 量である方法。 １０．対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を減少させるように、対象を処置 する方法であって、対象に対して、対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を低下 させるために有効な量の、請求項１に記載の免疫複合体を投与することを具備し た方法。 １１．ＨＩＶ感染細胞を殺滅することにより、ＨＩＶに感染した対象における ＨＩＶ感染細胞ポピュレーションを減少させるために有効な量の請求項１に記載 の免疫複合体と、薬剤的に許容され得るキャリアとを含有する薬剤組成物。 １２．１）低レベルから中レベルの細胞毒性をもった、ガンマ放射線を放出す る放射性核種と、２）これに結合したＣＤ４−ガンマ２・キメラ重鎖ホモ二量体 とを含む免疫複合体。 １３．請求項１２に記載の免疫複合体であって、前記ＣＤ４−ガンマ２・キメ ラ重鎖ホモ二量体は、ＣＤ４−ＩｇＧ２−ｐｃＤＮＡ１（ＡＴＣＣ受付番号第40 952号）と命名された発現ベクターによってコードされる免疫複合体。 １４．請求項１２に記載の免疫複合体であって、前記ガンマ線を放出する放射 性核種が¹³¹Ｉ、¹¹¹ｎ又は^99mＴｃである免疫複合体。 １５．ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を 画像化する方法であって、対象に対して、対象に存在するＨＩＶ感染組織の位置 測定を可能とするために十分な量の本発明の免疫複合体を、該免疫複合体が対象 に存在するＨＩＶ感染組織に特異的に結合することを可能とする条件下で投与す ることと、適切な時間が経過した後に、対象に存在するＨＩＶ感染組織に対して 特異的に結合した免疫複合体の位置を測定することにより、ＨＩＶに感染した対 象に存在するＨＩＶ感染組織を画像化することとを具備した方法。 １６．ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定する方法であっ て、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を請求項１５に記載の方法 によって画像化することと、こうして得られた画像を、既知段階のＨＩＶ感染を 有する別のＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した 対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定することとを具備した方法。 １７．ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、ＨＩＶに感染し た対象に存在するＨＩＶ感染組織を請求項１５に記載の方法によって画像化する ことと、こうして得られた画像を、予後が既知であるＨＩＶ感染対象の画像と比 較することによって、前記ＨＩＶに感染した対象の予後を決定することとを具備 した方法。 １８．ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定する方法で あって、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を請求項１５に記載の 方法によって画像化することと、こうして得られた画像を、抗ＨＩＶ治療の有効 性が既知であるようなＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、ＨＩＶに感 染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定することとを具備した方法。 １９．ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織の画像化を可能とする ために十分な量の請求項１２に記載の免疫複合体と、薬剤的に許容可能なキャリ アとを含有する組成物。 ２０．ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を測 定する方法であって、対象に対して、対象に存在する細胞膜結合形またはウイル ス膜結合形のＨＩＶエンベロープ糖タンパク量の測定を可能にするために有効な 量の請求項１２に記載の免疫複合体を、該免疫複合体が対象において細胞膜結合 形またはウイルス膜結合形のＨＩＶエンベロープ糖タンパクに特異的に結合する ことを可能とする条件下で投与することと、該対象において細胞膜結合形または ウイルス膜結合形のＨＩＶエンベロープと特異的に結合した前記免疫複合体の量 を測定することにより、前記ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ 糖タンパク負荷を測定することとを具備した方法。 ２１．ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定する方法であっ て、対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を請求項２０に記載の方法 によって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク負 荷を、ＨＩＶ感染段階が知られているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエンベロー プ糖タンパク負荷と比較することにより、 前記ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定することとを具備し た方法 ２２．ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、対象におけるＨ ＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を請求項２０に記載の方法によって測定するこ とと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を、予後が知られ ているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷と比較するこ とにより、前記ＨＩＶに感染した対象における予後を決定することとを具備した 方法。 ２３．ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定する方法で あって、対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を請求項２０に記載の 方法によって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパ ク負荷を、抗ＨＩＶ治療の有効性が知られているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶ エンベロープ糖タンパク負荷と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対象 における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定することとを具備した方法。 ２４．ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷の測 定を可能とするために有効な量の請求項１２に記載の免疫複合体と、薬剤的に許 容され得るキャリアとを含有する組成物。 ２５．１）非ペプチジル毒素と、２）二つの重鎖および二つの軽鎖を含むヘテ ロ四量体とを含んだ免疫複合体であって、前記二つの重鎖は両者共に、ａ）Ｉｇ Ｇ２重鎖またはｂ）キメラＣＤ４−ＩｇＧ２重鎖の何れかであり、また前記二つ の 軽鎖は両者共に、ａ）カッパ軽鎖またはｂ）キメラＣＤ４−カッパ軽鎖の何れか である［但し、前記二つの重鎖もしくは二つの軽鎖の何れか又は四つの全ての鎖 はＣＤ４キメラであり、また前記非ペプチジル毒素は二つの重鎖もしくは二つの 軽鎖の何れか又は四つの全ての鎖に結合されている］免疫複合体。 ２６．請求項２５に記載の免疫複合体であって、前記キメラＣＤ４−ＩｇＧ２ 重鎖は、ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ番号第75193号）と命 名された発現ベクターによってコードされ、また前記キメラＣＤ４−カッパ軽鎖 は、ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ番号第75194号）と命名された発 現ベクターによってコードされる免疫複合体。 ２７．請求項２５に記載の免疫複合体であって、前記非ペプチジル毒素がエネ ジイン抗癌性抗生物質またはその誘導体である免疫複合体。 ２８．請求項２７に記載の免疫複合体であって、前記エネジイン抗癌性抗生物 質がカリケアマイシンである免疫複合体。 ２９．請求項２５に記載の免疫複合体であって、前記非ペプチジル毒素が細胞 障害性の放射性核種である免疫複合体。 ３０．請求項２９に記載の免疫複合体であって、前記細胞障害性の放射性核種 が⁹⁰Ｙ，¹³¹Ｉ，¹²⁵Ｉまたは²¹²Ｂｉである免疫複合体。 ３１．ＨＩＶ感染細胞を殺滅する方法であって、ＨＩＶ感染細胞を、該細胞を 殺滅するために有効な量の請求項２５に 記載の免疫複合体と接触させることを具備した方法。 ３２．対象におけるＨＩＶ感染細胞ポピュレーションを減少させるようにＨＩ Ｖに感染した対象を治療する方法であって、ＨＩＶに感染した対象に対して、Ｈ ＩＶ感染細胞を殺滅してＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染細胞ポピュレ ーションを減少させるために有効な量の、請求項２５に記載の免疫複合体を投与 することを具備した方法。 ３３．請求項３２に記載の方法であって、投与される前記免疫複合体の量が、 ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染細胞のポピュレーションをなくするた めに有効な量である方法。 ３４．対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を減少するように対象を処置する 方法であって、対象に対して、対象がＨＩＶに感染するに至る可能性を低下させ るために有効な量の、請求項２５に記載の免疫複合体を投与することを具備した 方法。 ３５．ＨＩＶ感染細胞を殺滅することにより、ＨＩＶに感染した対象における ＨＩＶ感染細胞ポピュレーションを減少させるために有効な量の請求項２５に記 載の免疫複合体と、薬剤的に許容され得るキャリアとを含有する薬剤組成物。 ３６．１）低レベルから中レベルの細胞毒性をもった、ガンマ放射線を放出す る放射性核種と、２）二つの重鎖および二つの軽鎖を含むヘテロ四量体とを含ん だ免疫複合体であって、前記二つの重鎖は両者共にａ）ＩｇＧ２重鎖またはｂ） キメラＣＤ４−ＩｇＧ２重鎖の何れかであり、また前記二つ の軽鎖は両者共にａ）カッパ軽鎖またはｂ）キメラＣＤ４−カッパ軽鎖の何れか である［但し、二つの重鎖もしくは二つの軽鎖の何れか又は四つの全ての鎖はＣ Ｄ４キメラであり、また前記非ペプチジル毒素は二つの重鎖もしくは二つの軽鎖 の何れか又は四つの全ての鎖に結合されている］免疫複合体。 ３７．請求項３６に記載の免疫複合体であって、前記キメラＣＤ４−ＩｇＧ２ 重鎖は、ＣＤ４−ＩｇＧ２ＨＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ番号第75193号）と命 名された発現ベクターによってコードされ、また前記キメラＣＤ４−カッパ軽鎖 は、ＣＤ４−ｋＬＣ−ｐＲｃＣＭＶ（ＡＴＣＣ番号第75194号）と命名された発 現ベクターによってコードされる免疫複合体。 ３８．請求項３６に記載の免疫複合体であって、前記ガンマ放射線を放出する 放射性核種が、¹³¹Ｉ、¹¹¹Ｉｎまたは^99mＴｃである免疫複合体。 ３９．ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を画像化する方法であ って、対象に対して、対象に存在するＨＩＶ感染組織の位置測定を可能とするた めに十分な量の請求項３６に記載の免疫複合体を、該免疫複合体が対象に存在す るＨＩＶ感染組織に特異的に結合することを可能とする条件下で投与することと 、適切な時間が経過した後に、対象に存在するＨＩＶ感染組織に対して特異的に 結合した免疫複合体の位置を測定することにより、ＨＩＶに感染した対象に存在 するＨＩＶ感染組織を画像化することとを具備した方法。 ４０．ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を 決定する方法であって、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を請求 項３９に記載の方法によって画像化することと、こうして得られた画像を、既知 段階のＨＩＶ感染を有する別のＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、前 記ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定することとを具備した 方法。 ４１．ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、ＨＩＶに感染し た対象に存在するＨＩＶ感染組織を請求項３９に記載の方法によって画像化する ことと、こうして得られた画像を、予後が既知であるＨＩＶ感染対象の画像と比 較することによって、前記ＨＩＶに感染した対象の予後を決定することとを具備 した方法。 ４２．ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定する方法で あって、ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織を請求項３９の方法に よって画像化することと、こうして得られた画像を、抗ＨＩＶ治療の有効性が既 知であるようなＨＩＶ感染対象の画像と比較することにより、前記ＨＩＶに感染 した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定することとを具備した方法。 ４３．ＨＩＶに感染した対象に存在するＨＩＶ感染組織の画像化を可能にする ために有効な量の請求項３６に記載の免疫複合体と、薬剤的に許容され得るキャ ルアとを含有する組成物。 ４４．ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を測 定する方法であって、対象に対して、対 象に存在する細胞膜結合形またはウイルス膜結合形のＨＩＶエンベロープ糖タン パク量の測定を可能にするために有効な量の請求項３６に記載の免疫複合体を、 該免疫複合体が対象における細胞膜結合形またはウイルス膜結合形のＨＩＶエン ベロープ糖タンパクにの特異的に結合するのを可能とする条件下で投与すること と、該対象において細胞膜結合形またはウイルス膜結合形のＨＩＶエンベロープ と特異的に結合した前記免疫複合体の量を測定することにより、前記ＨＩＶに感 染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を測定することとを具備 した方法。 ４５．ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶ感染の段階を決定する方法であっ て、対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を請求項４４に記載の方法 によって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク負 荷を、ＨＩＶ感染段階が知られているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエンベロー プ糖タンパク負荷と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対象におけるＨ ＩＶ感染の段階を決定することとを具備した方法。 ４６．ＨＩＶに感染した対象の予後を決定する方法であって、対象におけるＨ ＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を請求項４４に記載の方法によって測定するこ とと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を、予後が知られ ているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷と比較するこ とにより、前記ＨＩＶに感染した対象における予後を決定することとを具備した 方法。 ４７．ＨＩＶに感染した対象における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定する方法で あって、対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷を請求項４４に記載の 方法によって測定することと、こうして測定されたＨＩＶエンベロープ糖タンパ ク負荷を、抗ＨＩＶ治療の有効性が知られているＨＩＶ感染対象におけるＨＩＶ エンベロープ糖タンパク負荷と比較することにより、前記ＨＩＶに感染した対象 における抗ＨＩＶ治療の有効性を決定することとを具備した方法。 ４９．ＨＩＶに感染した対象におけるＨＩＶエンベロープ糖タンパク負荷の測 定を可能とするために有効な量の請求項３６に記載の免疫複合体と、薬剤的に許 容され得るキャリアとを含有する組成物。