JPH05500068A - 可溶性一本鎖ｔ細胞レセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２５、請求項２１．２２または２３に記載の発現ベクターを含有する原核または 真核主細胞。

２６、　細菌細胞である請求項２４に記載の宿主細胞。

２７、細菌細胞か大腸菌である請求項２６に記載の宿主細胞。

２８、可溶性−重鎖子細胞レセプターを発現し得る条件下で請求項２４に記載の 宿主細胞を培養することを特徴とする、可溶性−重鎖子細胞レセプターの製造方 法。

２９、治療学的有効量の請求項１に記載の可溶性−重鎖子細胞レセプターを哺乳 動物に段毎することを特徴とする、自己免疫疾患の抑制方法。

３０、治療学的有効量の請求項１に記載の可溶性−重鎖子細胞レセプターおよび 薬理学的に許容し得る担体を含むことを特徴とする、自己免疫疾患、抑制用組成 物。

３１　１または２以上の疎水性アミノ酸残基を親水性アミノ酸残基て置換するこ とにより修飾した、請求項１に記載の可溶性−重鎖子細胞レセプター。

３２　１または２以上の疎水性アミノ酸残基を親水性アミノ酸残基で置換するこ とにより可溶性−重鎖子細胞レセプターを修飾しである、請求項１５に記載のＤ ＮＡ配列。

３３、　１または２以上の疎水性アミノ酸残基を親水性アミノ酸残基で置換する ことにより可溶性−重鎖子細胞レセプターを修飾しである、請求項２０に記載の 発現ベクター。

３４　請求項３３に記載の発現ベクターを含有する原核または真核宿主細胞。

明細書 可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプター 発明の背景 抗原結合レセプターは２種の基本的なタイプに分けられる。すなわち、Ｂ　’Ｊ ンバ球の表面に発現され形質細胞により分泌される免疫グロブリン分子（すなわ ち、抗体）とＴリンパ球の表面上のＴ細胞レセプターとである。

Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、特別の主要ｍ織適合趨合体（ＭＨＣ）生成との 関連で抗原の認識を媒体する複数のサブユニットかるなる分子複合体である［ミ ューアー（Ｍ　ｅｕｅｒ、　Ｓ　、　Ｃ、）ら、Ａ　ｎｎ、　Ｒｅｖ。

ｖｉｓ、　Ｍ、　Ｍ、　）およびブヨークマン（Ｐ　、　Ｊ　、　Ｂ　ｊｏｒｋ ｍａｎ）、Ｎａｔｕｒｅ３３４．３９５〜４０２（１９８８）］。抗原／ＭＨＣ 結合残基（Ｔｉと呼ばれる）は、大部分の末梢Ｔリンパ球上に存在する１つのα サブユニットと１つのβサブユニットからなる９０ｋＤのジスルフィド結合へテ ロダイマーである。両方のサブユニ、トとも免疫グロブリンに似ており、可変ド メインと定常ドメインがらなり、前者の可変ドメインは所定のＴ細胞クローンに 独特の特異性をコードする。これに対して、Ｔｉは、４種の一様な同一構造サブ ユニット（γ、δ、εおよびζ）のセット（まとめてＣＤ３と呼ばれる）と非共 有結合的に会合している。これら６種のレセプターサブユニットはすべて経膜タ ンハリ質であり、εおよびζサブユニット以外はすべてＮ結合したグリカン残基 を有している。Ｔｉαおよびβサブユニットは、それらサブユニットの可変ドメ インの相互作用により抗原および主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に対する結合部 位を形成するように思われ、ＣＤ３サブユニツトはシグナル変換機能を果すと考 えられる。

加えて、ＴｉγサブユニットおよびＴｉδサブユニットを含有するＴ細胞レセプ ターを含むＴ細胞の下位集団（末梢Ｔリンパ球の≦５％）が存在し、該サブユニ ットは、可変ドメインの相互作用により抗原およびＭＭＣに対する結合部位を形 成するヘテロダイマーを形成することが知られている。さらに、少なくとも、ハ プテンである一つの見かけの抗原の場合に、ＭＭＣの不在下で〜ｉｏ”’の親和 性定数にてハブテンに直接結合するサブサイトがＴｉ分子上に存在することを示 す直接的な証拠かいまや存在する［シリシアーノ（Ｓ　１ｌｉｃｉａｎｏ。

Ｒ，Ｆ、）ら、　Ｃｅ１１．４二乙：１６１　〜１７１（１９８６）コ。

各Ｔｉαサブユニ、トおよびＴ１βサブユニットは、システィン残基のジスルフ ィド結合により生成した２つの細胞外ドメインおよびカルボキ７末端疎水性経膜 領域とそれに続く５〜６アミノ酸細胞質テイルを含んでいる。Ｔ細胞レセプター をコードする遺伝子は、別々の遺伝子セグメントから組み立てられ、これら遺伝 子セグメントの一つは一様なカルボキン末端定常領域をコードし、一方、２また は３の他のセグメント（Ｖ、ＤおよびＪ）は抗原およびＭＨＣを認識する分子の 可変領域をコードする。可変領域内には抗原結合ポケットを形成する３つの超可 変領域が存在する。

Ｔ１βサブユニットをコードする遺伝子座の構成は、セグメントが直列に配列し た２つのセット（Ｄβｌ−Ｊβ１−ｃβ１およびＣβ２−Ｊβ２−Ｃβ２）およ び５′Ｖ遺伝子のセットからなる。Ｔｉβタンパク質の２つの定常領域は、翻訳 領域中でわずかに６個のアミノ酸が互いに異なっているだけである。各Ｃβ領域 の５°側には、一群の６つの機能性Ｊセグメントが存在する。ヒトでは染色体７ の７ｑ３５にあるＴｉβ部位内に約５０のＶβ遺伝子が存在することが知られて いる。Ｖα遺伝子プールはＶβ遺伝子に比べると幾らか大きく、〜１００の分離 したＶ遺伝子である。さらに、Ｔ１α遺伝子座は、わずかに一つの定常領域遺伝 子および５ＱＫｂ以上にわたって分散した複数のＪααダグン）（＞２５）を含 んでいるので、Ｔｉβとは識別される［ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｒ，Ｋ、 ）ら、Ｔ　ｍｍｕｎｏｌ、Ｒｅｖ、、シΩ」５．１４９（１９８８）コ。Ｔけサ ブユニットおよびＴｉδサブユニットは、ＴｉαサブユニットおよびＴｉβサブ ユニットと構造が似ている［ブレナー（Ｂ　ｒｅｎｎｅｒａ、　Ｍ、　Ｂ　、　 ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３２２　；　１４５〜１４９（１９８６）］。

表面Ｔ細胞レセプター発現に先立って小胞体中でＴｉサブユニットとＣＤ３サブ ユニ、トが会合することが必須であるので、現在までのところ、分泌形のＴ細胞 レセプターを遺伝解析および工学処理することは実際的ではなかった。さらに、 本発明者らは、経膜セグメントおよび細胞質問セグメントを欠いた先端欠失（ｔ ｒｕｎｃａｔｅｄ）形態のＴｉαサブユニットおよびＴｉβサブユニットを真核 細胞系（ＣＨＯヲ含’：　）、バキュロウィルス−５Ｆ９および酵母中で発現さ せた場合に、会合（ｃｏａｓｓｏｃｉａｔｅ）および／または分泌できなし＼こ とを観察した。

発明の要約 本発明は、上記および当該技術分野における他の問題を回避するものである。

本発明は、可溶性−重鎖子細胞レセプターに関する。好ましくは、本発明の可溶 性−重鎖子細胞レセプターは、アミノ酸リンカ−を介してＴｉαサブユニット断 片に結合したＴｉβサブユニツト断片またはＴ１δサブユニット断片に結合した Ｔ１γサブユニット断片である。

さらに好ましいのは、生物学的に活性な可溶性−重鎖子細胞レセプターである。

本発明はさらに、可溶性−重鎖子細胞レセプターをコードする核酸配列を含む核 酸分子に関する。この可溶性−重鎖子細胞レセプターは、好ましくは、アミノ酸 リンカ−を介してＴ１αサブユニット断片に結合したＴｉβサブユニ、ト断片ま たはＴｉδサブユニット断片に結合したＴｉγサブユニット断片である。また、 核酸分子はＤＮＡ分子であるのが好ましく、核酸配列はＤＮＡ配列であるのが好 ましい。

本発明はさらに、可溶性−重鎖子細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列を含有 する発現ベクターに関する。好ましくは、この可溶性−重鎖子細胞レセプターは 、アミノ酸リンカ−を介してＴｉαサブユニット断片に結合したＴｉβサブユニ 、ト断片またはＴｉδサブユニット断片に結合したＴｉγサブユニット断片であ る。

本発明はまた、可溶性−重鎖子細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列を含有す る発現ベクターを含む原核または真核宿主細胞に関する。好ましくは、この可溶 性−重鎖子細胞レセプターは、アミノ酸リンカ−を介してＴｉαサブユニット断 片に結合したＴｉβサブユニツト断片またはＴｉδサブユニット断片に結合した Ｔｉγサブユニット断片である。

図面の簡単な説明 図１は、−重鎖子細胞レセプターのコンピューター生成モデルを示す。

図２は、フルオレセイノ特異的−重鎖Ｔ細胞レセプターのヌクレオチド配列およ びアミノ酸配列を示す。

図３は、プラスミドｐＴＣＲαβ−Ｉ　Ｌ　Ｅ　、、、ｌよびｐＴＣＲαβ−Ｍ ＥＴｌ−ｔの地図を示す。

図４は、−重鎖子細胞レセプターをコードするＤＮＡ断片のスケール図を示す。

図５は、−重鎖子細胞レセプターの精製を示す。

図６は、−重鎖子細胞レセプターのフルオレセイ７カ・ノブリングセファロース への特異的結合を示す。

発明の詳細な記載 本発明は、可溶性−重鎖子細胞レセプターに関する。好ましくＩよ、この可溶性 −重鎖子細胞レセプターは、アミノ酸ＩＪンカーを介してＴｉαサブユニット断 片に結合したＴ１βサブユニツト断片またはＴ１δサブユニット断片に結合した Ｔｉγサブユニソ）断片である。好ましいのは、Ｔ１βサブユニツト断片のカル ホキ／末端かアミノ酸リンカ−を介してＴｉαサブユニット断片のアミン末端に 結合した一本鎖構築物である。可溶性−重鎖子細胞レセプターは、生物学的に活 性であるのが好ましい。すなわち、本発明の生物学的に活性な可溶性−重鎖子細 胞レセプターは、哺乳動物由来のＴリンパ球の表面上に存在するＴ細胞レセプタ ーにより結合される少なくとも１つの抗原と結合する。

一般に、本発明の生物学的に活性な可溶性−重鎖子細胞レセプターは、完全なＴ 細胞レセプターの一員として単独かまたは特定の主要組織適合分子との関連で１ 種または２種以上の抗原に結合し得る。

しかしながら、生物学的に不活性な一本鎖Ｔ細胞レセプターもまた、たとえば特 定のＴ細胞サブタイプに対する免疫応答を哺乳動物宿主で開始させる免疫原とし て価値を有する。本発明の可溶性−重鎖子細胞レセプターはまた水溶液中に可溶 であるのが好ましい。

本明細書において「断片」とは、ポリペプチド分子またはＤ　Ｎ　Ａ配列につい て使用する場合に、所定のポリペプチド分子またはＤＮＡ配列の部分を意味する 。

本発明において同定したアミノ酸残基はすべて天然のし配列のものである。標準 的なポリペプチド命名法に従い［Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２４３・３５５７〜５９（１９６９）コ、アミノ酸残基の略語は下記対応表に示 す通りである。

Ｓ　Ｓｅｒ　Ｌ−セリン １　１１ｅ　Ｌ−インロイシン ＨＨｉｓ　Ｌ−ヒスチジン Ｑ　ＧＩｎ　Ｌ−グルタミン Ｅ　Ｇｌｕ　Ｌ−グルタミン酸 ＷＴｒｌ）Ｌ−トリプトファン ＲＡｒｇ　Ｌ−アルギニン Ｄ　Ａｓｐ　Ｌ−アスパラギン酸 Ｎ　Ａｓｎ　Ｌ−アスパラギン ＣＣｙｓ　Ｌ−システィン 本明細書においてアミノ酸配列はすべて、左から右に向がって通常のアミン末端 からカルボキシル末端の方間となる式で表しである。

すでに記載したように、本発明の可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプターは、Ｔｉαおよ びＴｉβサブユニツト部分およびＴｉγおよびＴ１δサブユニ、ト部分（以下、 集合的に「Ｔｉサブユニットとも称する）を含んでいる。また、対応する完全な Ｔｉサブユニットの経膜領域を欠いており、かつ抗原結合部位を形成するのに必 要なアミノ酸を含んでいる限り、いかなるＴｉサブユニットの部分も本発明の一 本鎖構築物中に使用することができる。最小限、Ｔ１サブユニ、トの相補性決定 領域（ＣＤＲｓ）は使用しなければならない、、Ｔ１αおよびＴ１βサブユニ、 １・断片およびＴｉγおよびＴｉδサブユニット断片を、完全なＴｉサブユニ、 トの全可変領域に対応するように使用するのか好ましい。この場合には、結合し たＴｉαおよびＴｉβサブユニツト断片は、生物学的に活性であり、水溶液に可 変であることが示されている。

本発明は、可溶性−重鎖〕細胞レセプターにおいど、使用したサブユニット断片 の部分を修飾していないもの（すなわち、使用した配列が、対応する天然のＴ細 胞レセプターのサブユニ、ト中に存在するものと同じであるもの）、修飾したも の（すなわち、天然のＴ細胞レセプターサブユニットの配列の少なくとも１つの アミノ酸残基を欠失、付加または置換させることにより、たとえば、ｌまたは２ 以上の疎水性アミノ酸残基を親水性アミノ酸残基て置換することにより、変化さ せたもの）、およびこれら修飾していないものと修飾したものを組み合わせたも のを包含する。

すでに記載したように、本発明の一本鎖Ｔ［胞レセプターは可溶性であることか 必要である。このことは、本発明の一本ＩＴ細胞レセプターが水性系に可溶でな ければならないことを意味する。この可溶性は、対応する完全なＴｉサブユニ、 トの経膜領域を除去することにより部分的に付与される。ある種の適用（たとえ ば、インビトｏ珍断適用など）の場合には少量の溶解促進剤（界面活性剤など） や有機溶媒を使用することもてきるが、本発明の一本鎖Ｔ細胞レセプターは完全 な水溶液、とりわけ生理緩衝液）ご可溶性であるのが好ましい。

Ｔ１サブユニット断片を結合させるのに使用するアミノ酸リンカ−において、ア ミノ酸の同一性は重要ではない。アミノ酸リンカ−は、これら結合Ｔｉサブユニ ット断片が抗原結合部位を形成するような仕方で会合させることができさえすれ ばよいのである。しかしながら、柔軟性と水溶性を与えるアミノ酸が最も望まし い。柔軟性を与えるアミノ酸のうち、グリノンはβ炭素原子が欠如しているため 最も有効なものとして抜きん出ている。水溶性を増大させるアミノ酸としては、 たとえば、セリン、グルタミン、アスパラキン酸、アルギニンなどが挙げられる 。同様に、アミノ酸リンカ−の長さも、結合したＴｉサブユニット断片が抗原結 合部位を形成し得るようなものでなければならない。アミノ酸リンカ−は、一般 に、長さが約１０〜約３０アミノ酸であり、好ましくは約１５〜約２５アミノ酸 である。特に好ましいアミノ酸リンカ−は下記配列を有するものである。

Ｐ　ｒｏ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｓ　ｅｒ　− Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−３ｅｒ−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　 ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｓ　ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｙ　−Ｇ　 Ｉｙ　−Ｇ　１ｙ−３ｅｒ　−Ｇ　ｌｙ　−Ａ　ｌａ 適当なアミノ酸リンカ−を設計するため、コンピューターモデル化を用いること かできる。たとえば、下記のようにして、２段階で可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプタ ーモデルを構築することができる。まず、アイリス（Ｉ　ｒｉｓ）４　Ｄ／　８ ０　Ｇ　Ｔワークステーション［シリコン・グラフィックス（Ｓｉｌｉｃｏｎ　 Ｇｒａｐｈｉｃｓ）、マウンテンビュー、ＣＡココ上行うｌＮ５ｒＧＨＴソフト ウエア［バイオンム・テクノロジー（Ｂｉｏｓｙｍ　Ｔ　ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　 Ｉ　ｎｃ、　、　）、サンジエゴ、ＣＡ］の「ホモロジー」モジュールを用い、 免疫グロブリンＶＬ−Ｖ、ダイマーの原子座標を３次元鋳型として用い、Ｔ細胞 レセプター可変−αおよび可変−βドメインとＶＬ免疫グロブリンドメインとの 間の最適のアミノ酸配列の整合を構築の開始点として用いて、−重鎖Ｔ細胞レセ プター骨格を構築することができる。抗原結合部位を形成する６つの「超可変」 ループは、上記構築した骨格中に同じ長さのループ［ブルソクヘブン・プロティ ン・データバンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔｅｂａｎｋ ）から得られるコを移植することにより近似することができる。リンカ−の構築 もまた同様に近似することかできる。ついで、得られた未完成のモデルを、プロ グラムＣ０ＮＧＥＮ（プログラムＣＨＡＲＭから得られる）を用いてエネルギー 最小化および５３ピコ秒の動的シミュＬ／−ジョンに供する［プル、り（Ｂ　ｒ ｏｏｋ、　Ｂ、）ら、Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　 Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４．１８７〜２１７（１９８３）；ブルノコレリ（Ｂｒｕｃ ｃｏｌｅｒｉ、　Ｒ，）およびカープルス（Ｋ　ａｒｐｌｕｓ、　Ｍ、　）、Ｂ 　ｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　２６．１３６〜１６８（１９８７）参照］。このプロ トコールにより原子の部分的重複が軽減され、モデルの立体化学が同上する。こ のモデルの図解を図１に示す。

本発明のアミノ酸リンカ−はまた、リンカ−としての機能性とは別に幾つかの異 なる必要に合致するように設計することもできる。

たとえば、このリンカ−に対して産生されたモノクローナル抗体またはポリクロ ーナル抗体を用いれば、たとえＴｉサブユニットドメインが異なっていても、こ のペプチドを含む他の一本鎖Ｔ細胞レセプターを認識することかできる。そのよ うな普遍的な抗体試薬は、イムノアフィニティー法を用いて多くの異なるＴ細胞 レセプターを精製するのに用いることができるであろう。

本発明の可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプターは、種々の方法により製造することがで きる。たとえば、合成手段、すなわち、ポリペプチドをその構成部分から当業者 に知られた方法で化学的に合成することにより得ることができる。たとえば、ヒ ユーストンらのＰ　ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８２　：５１ ３５（１９８５）に記載された固相法を用いることができる。本発明の一本鎖Ｔ 細胞レセプターは、該Ｉ／セブターをコードするＤ　Ｎ　Ａ配列を発現する原核 または真核宿主細胞中で産生させるか、または該レセプターをコードするＤＮＡ 配列によりコードされるｍＲＮ　Ａのインビトロ翻訳により得るのが好ましい。

本発明の一本鎖Ｔ細胞レセプターはまた、化学的力、ブリング法により製造する こともてきる。たとえば、上記Ｔｉサブユニ、ト断片およびアミノ酸リンカ−を 化学的合成法または組換えＤＮＡ法により製造することができる。ついて、種々 のポリペプチドを化学的にカップリングして所望の可溶性一本積Ｔ細胞しセプク ーを得る、−とができる。この目的のために当該技術分野で知られた種々の化学 的カップリング法を用いることができる。たとえば、カルボジイミドカ、ブリン グ法、種々の活性エステル法および酵素触媒結合生成法を用いることができる。

本発明の可溶性−重鎖子細胞レセプターの分離精製は、種々のタンパク質精製法 を用いて所望の程度まで行うことができる。たとえば、逆相高速液体クロマトグ ラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび イムノアフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー法を用いる ことができる。

本発明はまた、可溶性−重鎖子細胞レセプターの誘導体も包含する。そのような 誘導体としては、たとえば、インビトロまたはインビボ診断目的のために１２５ １．１３１１　、１４ｃ、　３５３．３１（、１１１１ｎ、　９Ｂ＋１Ｔｃなど の放射性同位元素で標識した一本鎖Ｔ細胞レセプターが挙げられる。他の誘導体 としては、たとえば、治療目的のためにリシンや糖除去り／ンＡ鎖などの毒素を 結合した可溶性−重鎖子細胞レセプターが挙げらｌ−る。そのような誘導体は、 当該技術分野で知られた方法により調製することができる。

本明細書に記載した方法はまた、ヒト以外の池の動物種に由来する可溶性−重鎖 子細胞レセプター、および広範囲の異なる抗原、たとえばフルオレセイン、外来 主要組織適合分子（Ｍ　Ｍ　Ｃ）およびＭＨＣ抗原との関連でのペプチド抗原な どに対する可溶性−重鎖子細胞レセプターを調製する場合にも用いることができ ることを理解すべきである。これら変更も本発明の範囲に含まれる。

本発明の可溶性−重鎖子細胞レセプターは、様々に使用することができる。たと えば、放射性標識した一本鎖Ｔ細胞レセプターは、自己免疫疾患に応答するもの も含めて、抗原／ＭＨＣ複合体をインビボで同定するためのプローブとして用い ることができる。さらに、本発明の可溶性−重鎖子細胞レセプターは抗原呈示細 胞上の特定の抗原／ＭＨＣ複合体とインビボで結合させるのに用いることができ るため、自己反応性Ｔ細胞クローンの抗原／ＭＨＣとの相互反応を防ぐことによ り該クローンの活性化を防ぐことができる。この点で、本発明の可溶性−重鎖子 細胞レセプターは、これら自己反応性細胞上の経膜ＣＤ３−Ｔｉ複合体の競合拮 抗剤として重要である。この機溝の抗クローン型抗体に対する利点は、非自己ク ローン型を含む種々の自己反応性ＣＤ３−Ｔｉ複合体に潜在的にみられる抗原／ ＭＨＣに本発明の可溶性−重鎖子細胞レセプターが結合することである。

本発明の可溶性−重鎖子細胞レセプターはまた、たとえば慢性肝炎などの感染度 、愚において免疫応答をなくすために用いることかできる。本発明の可溶性−重 鎖子細胞レセプターは、免疫原として抗イデイオタイプ応答を開始することがで き、これにより関連Ｔ細胞レセプター構造を表示するＴ細胞クローンの応答を制 御することができる。本発明の一本鎖構築物はまた、Ｔ細胞レセプター抗原／Ｍ ＨＣ結合領域の性質および免疫グロブリンとＴ細胞レセプターＣＤＲ５との関係 についての情報を得るのにも用いることかできる。巨大分子モデル化および結晶 解析をヒトＴ細胞クローンのインビトロ機能研究およびマウスモデル系でのイン ビボ研究と併用したものは、Ｔ細胞レセプター−抗原相互反応をなくす小さな分 子を開発することをめざした合理的な薬物設計プログラムの基礎として用いるこ とができる。

自己免疫疾患を抑制するために本発明の可溶性−重鎖子細胞レセプターを使用す る場合は、そのような疾患にかかっていることがわかっている種々の浦乳動物、 たとえばヒト、ネコ、イヌなどに約０゜０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ／ＥＥ、好まし くは約０．１〜１．Ｏｆｆ１ｇ／ｋｇ／日の投与範囲にて治療学的有効量の本発 明の可溶性−重鎖子細胞レセプターを１日に１回投与または２〜４回の分割投与 に分けて非経口的に投与する。別のやり方としては、非経口溶液を上記投与量で 連続注入してもよい。投与単位当たり約Ｉ　Ｏ〜約１０．０＋ａｇの一本鎖Ｔ細 胞レセプターを含有する非経口溶液として活性成分を使用する。

本発明の可溶性−重鎖子細胞レセプターはまた、許容される製剤技法に従って保 存剤や安定化剤などの他の生理学的に許容し得る物質とともに通常の仕方により 調製することができる。

本発明はさらに、可溶性−重鎖子細胞レセプターをコードする核酸配列を含む核 酸分子に関する。好ましくは、可溶性−重鎖子細胞レセプターは、アミノ酸リン カ−によりＴｉβサブ二二ノｔ・断片に合したＴｉγサブユニ／トである。核酸 分子はＤＮＡ分子であり、核酸配列はＤＮＡ配列であるのが好ましいか、ＲＮＡ 分子およびＲＮＡ配列も本発明に包含される。さらに好ましいのは、使用したＴ ｉＣとＴｉβサブユニツト断片またはＴｉγとＴｉδサブユニット断片か完全な ＴｉＣとＴ１βサブユニットまたはＴｉγとＴｉδサブユニッの全可変領域に対 応する可溶性−重鎖子細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列である。

本発明のＤＮＡ配列は、種々の方法、たとえば遺伝子工学法により調製すること ができる。適当なＴ１サブユニ、ト断片をコードするＤＮＡ配列を完全なサブユ ニットを鋳型として用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により調製し、ア ミノ酸リンカ−をコードするＤＮＡ配列を化学的合成により調製し、これら種々 のＤ　Ｎ　Ａ配列をライゲートして所望の一本鎖Ｔ細胞レセプターをコードする ＤＮＡ配列を生成するのが好ましい。本発明のＤＮＡ配列はまた、公知の方法を 用いて化学的合成により調製することもてきる。

可溶性−重鎖Ｔｗｉ胞レセプターをコードする本発明のＤＮＡ配列はまた、種々 の変異を調製するのにも用いることができる。そのような変異は、縮重している 、すなわち変異したコドンにより変異体のアミノ酸配列は変化しないか、または 縮重していない、すなわち変異したコドンにより変異体のアミノ酸配列が変化し ている。これらの変異Ｄ　Ｎ　Ａ配列の調製は、たとえば、当該技術分野で知ら れた種々の方法を用いて被コードポリペプチド中の１個または２個以上のアミノ 酸の欠失、置換、挿入、逆位または付加が変異の結果起こるように可溶性−重鎖 子細胞レセプターＤＮＡ配列を変異させることにより行うことかできる。たとえ ば、ティラー（Ｔ　ａｙｌｏｒ、　Ｊ　、Ｗ、　）発注を用いることができる。

加えて、部位特異的突然変異誘発のための牛、トを市販の販売者から購入するこ とができる。たとえば、部位特異的突然変異誘発を行うための牛、１・をアマ− ジャム（アーリントンハイツ、ＩＬ）から購入することかできる。

縮重突然変異および非縮重突然変異の両方とも本発明を行う上で有利である。た とえば、これら変異により、制限エンドヌクレアーゼによる開裂部位を提供した り、産生レベルを高めたり、精製を容易にしたり、溶解度を増大させたり、生物 学的活性を高めたりすることができる。たとえば、抗フルオレセインＴ細胞レセ プターの可変αおよびβドメインに由来する一本鎖Ｔ細胞レセプターでは（図２ ）、疎水性アミノ酸残基であるＰｈｅ　１０．Ｍｅ　ｔ４１、Ｌｅｕｌｌｌ、Ｔ Ｉｅ１５１、Ｐｈｅ　１７２およびＩＩｅ２４４はすへて一本鎖構築物の底部、 抗原結合部位から遠位に集まっている。変異を起こすことのできる他の疎水性ア ミノ酸の例としては、Ｌｅｕ２２、Ｐｈｅ７４、およびＭｅ　ｔ　２１２が挙げ られる。これらアミノ酸のうちの幾つかはおそらく、完全Ｔ細胞レセプターの可 変ドメインと定常ドメインとの間での非共有的相互反応を安定化する役割を果し ている。しかしながら、短くした一本鎖Ｔ細胞レセプターでは、これらの部位が 溶媒に暴露されると構築タンパク質の溶解度の低下につながる。これらアミノ酸 配列をコードしているＤＮＡ配列を極性の大きな側鎖を有するアミノ酸残基をコ ードするＤ　Ｎ　Ａ配列に変異させることにより、被コード一本鎖Ｔ細胞レセプ ターの水性溶解度を増加させることかできる。そのような変異ＤＮＡ分子および ポリペプチド分子はすべて本発明の範囲に包含される。

本発明はまた、可溶性−重鎖子細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列を含有す る発現ベクターに関する。好ましくは、可溶性−重鎖子細胞レセプターは、アミ ノ酸リンカ−によりＴｉβサブユニツト断片に結合したＴ１αサブユニ、ト断片 またはＴｉδサブユニ。

ト断片に結合したＴ１γサブユニット断片である。さらに好ましいのは、可溶性 −重鎖子細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列に機能的に結合した１または２ 以上の制御ＤＮＡ配列を含む発現ベクターである。ここで「機能的に結合した」 とは、制御ＤＮＡ配列が、該可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプターをコードするＤＮＡ 配列の復製および／または発現を指令し得ることを意味する。１または２以上の 疎水性アミノ酸残基を親水性アミノ酸残基で置換することにより可溶性−重鎖子 細胞レセプターを修飾した発現ベクター（および対応宿主細胞）もまた好ましい 。

本発明に使用することのできる発現ベクターは、しばしば「プラスミド」の形態 であり、これはベクターの形態として、染色体に結合していない環状の二本鎖Ｄ ＮＡループをいう。しかしながら２１本発明は、同等の機能を果し、当該技術分 野でその疲知られるようになった他の形態の発現ベクターをも包含する。

本発明に有用な発現ベクターには、一般に複製開始点、発現すべき遺伝子の前部 （すなわち、上流）に位置するプロモーター、発現すべき遺伝子、［１終止配列 および残りのベクターが含まれる。本発明に使用する発現ベクターにはさらに、 当該技術分野で知られた他のＤＮＡ配列、たとえば、発現産物に安定性を付与す る安定性ＩＪ−ター配列、構造遺伝子の発現を調節させる（たとえば、成育培地 中に栄養素を存在させるかまたは存在させないことにより）制御配列、形質転換 宿主細胞中で表現型選択を可能にするマーカー配列、および制限エンドヌクレア ーゼによる開裂のための部位を提供する配列なとも含まれていてよい。実際に使 用する発現ベクターの特性は、使用する宿主細胞と適合するものでなければなら ない。たとえば、哺乳動物細胞系でクローニングする場合は、発現ベクターは、 哺乳動物細胞のゲノムから単離したプロモーター（たとえば、マウスメタロチオ ネインプロモーターなど）またはこれら哺乳動物細胞中で成育するウィルスかろ 単離したプロモーター（たとえば、ワク７ニアウィルス７．５にプロモーターな ど）を含んでいなければならない。

本発明の発現ベクターは、可溶性−末鎖Ｔ細胞レセプターをコードする本発明の ＤＮＡ配列の複製（および好ましくは発現）を少なくとも指令することができる 。本発明のＤＮＡ配列を挿入することのできる適当な発現ベクターは市販されて おり、たとえばｐＵｃ１９およびその誘導体、たとえばｐＢｌｕｅｓｃｒ　１ｐ ｔｓｆｃ（＋／−）（ストラタジーン、ラジョラ、ＣＡ）など、およびｐＢＲ３ ２２およびその誘導体、たとえばｐＩＮ−１、ｐ［Ｎ−１１，ｐｌＮ−１１１、 ｐｌＮ−Ｉ　１１−ｏｍｐＡｌおよびＩ）　ｌＮ−１１１（ｌ　ｐｐ’−’）な どが挙げられる［デユワｔ−（Ｄｕｆｆａｕｄ、Ｇ、Ｄ、）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ 　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　１５３．４９２頁（１９８７）参 照］。

発現ベクターとして特に有用なものは分ｌ必ベクター１）ＰＬ２に由来するもの である。

本発明の発現ベクターは、当該技術分野で知られた標準的な組換えＤＮＡ法によ り構築することができ、その多くはマニアティスらのモレキュラー・クローニン グ・ア・ラボラトリ−・マニュアル（ＭｏＬｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｒ＋ａａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ− ・ラボラトリ−、フールドスブゾングハーバー、ＮＹ（１９８２）に記載されて いる。

本発明はさらに、可溶性−末鎖Ｔ細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列を含有 する発現ベクターを含む宿主細胞に関する。好ましくは、可溶性−末鎖Ｔ細胞レ セプターは、アミノ酸リンカ−によりＴｉβサブユニ、トに結合したＴｉαサブ ユニットまたはＴｉδサブユニットに結合したＴｉγサブユニットである。さら に好ましいのは、可溶性−末鎖Ｔ細胞レセプターに機能的に結合し、該レセプタ ーの１１および／または発現を指令することのできる１または２以上の制御Ｄ　 Ｎ　Ａ配列を含有する発現ベクターを含む宿主細胞である。適当な宿主細胞には 、原核細胞および真核細胞の両方が含まれる。適当な原核細胞としては、たとえ ば細菌細胞が挙げられる。適当な真核細胞とＩ−では、たとえばＣＨＯ細胞か挙 げられる。

宿主細胞として好ましいのは、大腸菌細胞などの細菌細胞である。

特に好ましい宿主細胞は、大腸菌株ＭｃｌＯＯＯである。

本発明の発現ベクターは、当該技術分野で知られた種々の方法により宿主細胞中 に導入することができる。たとえば、発現ベクターによる宿主細胞のトランスフ ェクションは、リン酸カル／ウム６殿法により行うことができる。しかしながら 、発現ベクターを宿主細胞中に導入するための他の方法、たとえばエレクトロボ レーシゴン、核注入法またはプロトプラスト融合法を用いることができる。

発現ベクターが適当な宿主細胞中に導入されたら、大量の可溶性−末鎖Ｔ細胞レ セプターを発現するのが可能な条件で該宿主細胞を培養することかできる。

可溶性−末鎖Ｔ細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベクター を含む宿主細胞の同定は、下記の４つの一般法の１または２以上を用いて行うこ とができる。（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション：（ｂ）ｒマーカー 」遺伝子機能の存在または不在；（Ｃ）宿主細胞中のｍ　ＲＮ　Ａ転写物の産生 を測定することによる転写レベルの評価、および（ｄ）遺伝子産物を免疫学的お よび／または該産物の生物学的活性により検出すること。

第一の方法においては、可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列 に相捕的なりＮＡ配列をプローブとして用いたＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼー ションにより該目的ＤＮＡ配列の存在を検出することかできる。

第二の方法では、組換え発現ベクター宿主系の同定および選択は、ある種の「マ ーカー」遺伝子機能（たとえば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性 など）の存在または不在に基づいて行うことができる。たとえば、可溶性−重鎖 Ｔ細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列か発現ベクターのマーカー遺伝子配列 中に挿入されていると、該−重鎖Ｔ細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列を含 有する組換え体は該マーカー遺伝子機能の不在により同定することがてきる。別 の態様では、可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプターを制御するのに用いたプロモーター と同じかまたは異なるプロモーターの制御下に、該可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプタ ーをコードするＤＮＡ配列と直列にマーカー遺伝子を置（ことができる。誘導ま たは選択に応答してマーカーか発現されると、可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプターを フードするＤ　Ｎ　Ａ配列の発現が示される。

第三の方法では、可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプターｍＲＮＡ転写物の産生をハイブ リダイゼーションアッセイにより評価スることができる。たとえば、ポリアデニ ル化ＲＮＡを単離し、該ＲＮＡ配列に相捕的なプローブを用いたノーザンブロノ ティング法により分析することができる。別のやり方として、宿主細胞の全核酸 を抽出し、上記プローブとのハイブリダイゼーションについてア・７セイするこ とができる。

第四の方法においては、可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプターの発現は、免疫学的に、 たとえばウェスタンブロッティングにより、または生物学的に活性な遺伝子産物 の検出により評価することができる。宿主細胞が遺伝子産物を分泌する場合は、 培養したトランスフェクンヨン宿主細胞から得られた細胞不含培地を抗原結合活 性についてア。

セイすることにより評価することかできる。遺伝子産物か分泌されない場合は、 細胞溶解液についてそのような活性をアッセイすればよい。

ついで、上記種々の方法を用いて可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプターを単離精製する ことかできる。

本発明の発現ヘクター、プラスミドまたはＤＮＡ分子のＤ　Ｎ　、Ａ配列は、当 該技術分野で知られた種々の方法により決定することかで９７７）に記載された マクサム−ギルバート法を用いることができる。

もちろん、すべての発現ヘクターおよびＤＮＡ制御配列が本発明のＤＮＡ配列の 発現に等しく充分に機能するわけてはないことは理解すべきである。同様に、す べての宿主細胞が同発現系において等しく充分に機能するわけではない。しかし 八から、当業者であれば、本明細書に記載した指示に従って、不当な実験を行う ことなく、また本発明の範囲から離れることなく、発現ヘクター、ＤＮＡ制御配 列、および宿主細胞において選択を行うことかできるであろう。

つぎに、本発明を下記実施例に基づいてさらに詳しく説明する。これら実施例は 本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の理解を一層容易 にするものである。

化学製品は、特に断らない限り、すべてシグマ・ケミカル（セントルイス、ＭＯ ）から購入した。オリゴヌクレオチドの調製は、特に断らない限り、モデル３８ １Ａ　ＤＮＡ合成合成子プライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティ−５ＣＡ）上で行った。酵素は、二ニー・ イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）（ビ バリー、Ｍ　Ａ　）より購入し、その指示に従って用いた。使用した大腸菌株に は、ＭＺ１３Ｂ［Ｆ−△１ａｃ−Ｘ１７４△（ｂｒｎＱ　ｐｈｏＢ）ｔｓｘ　ｔ 　ｒｐ（ａｍ）ｒｐｓＬ（ｓｔｒ　つコ　；ＫＳ２６５Ｃ△　ｌａｃ−Ｘ７４ｇ ｌａＥ　ｇｌａＫ　ｒｐｓＬ（ｓｔｒ’）ΔｐｈｏＡ（Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ）ａ　ｒ ａΔ１３９　ｐｈｏＲ］。

Ｍｃ　１０００［：Ｆ−ａ　ｒａＤ１３９　Δ（ａｒａ　−１ｅｕ）７６９７Δ Ｉａｃ　へ７４　ｇａ　ＩＵ　ｇａ　ＩＫ　ｒｐｓＬ］が含まれていた。

９８６）の記載に従ってフルオレセイン（Ｆｌ）特異的Ｔ細胞クローンを得た。

簡単に説明すると、フルオレセイン特異的Ｔ細胞クローンを得るため、フルオレ セイン−５−インチオンアネート（ＦＩＴＣ）を共有結合的１０カツプリングし た照射自己単核細胞でヒト抹消血Ｔリンパ球を刺激した。繰り返し刺激した後、 ＦＩＴＣ結合ポリマーを有効に結合することのできる７１１７３球を蛍光活性化 細切で餞別することにより、みかけの抗原結合細胞をさらに富ませた。その結果 、ＣＤ４−！−，ＣＤ８−およびＣＤＳ±、ＣＤ４−の両クローンか得られ、増 殖アッセイにより、それぞれＭＨＣクラスＩＩおよびＮＩＨＣクラス■に制限さ れていることが決定された。重要なことに、高濃度のＦＩＴＣを抗原呈示細胞（ ＡＰＣ）に直接カップリングすることで達成されるように、ＡＰＣ上に高レベル のみかけの抗原が発現されている場合には、Ｍｌ−ＩＣ制限は克服することがで きた。この相対的なＭＨＣ独立性は、３つの独立の観察により実証することがで きる。第一に、抗りラスＩ抗体は、高度にＦＩＴＣ樟識した目的細胞の細胞溶解 を阻止することができなかった。第二に、多価ＦｒＴＣ結合ポリマーのクローン への結合は可溶性の一価抗原により特異的に阻止することができた。第三に、α −βＴ細胞レセブし−へテロタイマーは、ＦＩＴＣ結合アフィニティーカラムに よりＦｌ特異的クローンの溶解液から特異的に除くことができた。

これらＣＤ４’−、ＣＤＢ＋クローンのうちの一つ（ＲＦＬ３．８）を選択して さらに分析し、λｇｔｌｏ中にｃＤＮＡライブラリーを構築した（上記マニアチ スらの文献参照）。ＲＥＸ［ジャーカド（Ｊｕｒｋａｔ）変異体］からのＴ細胞 レセプターのヒトα鎖およびβ鎖の定常領域ロチ−ビス（Ｄａｖｉｓ、　！ｄ、 　Ｍ、　）ら、Ｎａｔｕｒｅ旦旦」、３９５〜４０２（１９８８）′Ｊに由来す るプローブを用い、上記マニアチスらの文献に記載の方法に従って上記ライブラ リーをスクリーニングし、ランクムブライミング法により＋票識し、Ｔｉβおよ びＴ　ｉαサフ゛ユニ、トをコードする陽性クローンを得た。ＦＬ特異的ＴＣＲ （Ｔ細胞レセプター）αおよびβ可変領域の完全なヌクレオチド配列の決定は、 完全長のＥｃｏＲＩ　ＴｉαおよびＴ１β　ｃＤＮＡ挿入物をｐＵＣ１８中にサ ブクローニングした後（それぞれ、ｐＴＣＲＶαおよびｐＴＣＲＶβ）、サンガ ーらの上記文献の記載に従い両方の鎖についてチェインターミ不−／ヨン法によ り行った。β鎖ｃ　ＤＮＡ配列の分析により、Ｖβ１３，２、Ｄβ１、Ｊβ１． ５およびＣβ１生殖系列要素が含まれていることが示され、一方、α鎖ｃ　Ｄ　 Ｎ　Ａ配列は、これまで特徴付けられていなかったＶαおよびＪαＦ要素を含ん ていることか示されブニ。

Ｃ１−重鎖Ｔ細胞レセプターをフードするＤ　Ｎ　Ａ配列の構築−重鎖Ｔ細胞レ セプター（ｓｃＴＣＲ’ｓ）を製造するため、下記手順を行った。ポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）法［サイキ（Ｓａｉｋｉ、　Ｒ。

に、）ら、５ｃｉｅｎｃｅ２３０．１３５０〜１３５４．（１９８５）：サイキ ら、よびＴ１β鎖の可変ドメインをコードするｃＤＮＡ領域の末端に独特の制限 部位を導入した。Ｔ　ｉβ可変ドメインのカルボキシ末端をＴｉα可変ドメイン のアミノ末端に連結するように設計したリンカ−の末端に対応制限部位を導入し た。リンカ−のアミノ酸配列は、Ｔ細胞レセプターの可変ドメインの全体的な特 徴は免疫グロブリン可変ドメインの既知の結晶解析構造と類似しているという仮 定に基つき、コンピューターモデル化研究により選択した。リンカ−の設計は、 ２つの可変ドメインを架橋してなお柔軟性があり、それゆえ１゛メインの折り： ろに制限がないようとこ充分な数の残基を導入して行った。

さらに詳しく説明すると、合成リンカ−配列により連結したＴ細胞レセプターの α鎖およびβ鎖の可変領域配列をコードする７５６ｂｐのＤＮＡセグメントを下 記３つの断片から組み立てた。

β鎖可変領域は、下記２つのプライマーを用い、β鎖のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ（プラス ミドｐＴＣＲＶβ中）からＰＣＲ法によりＥｃｏＲＩ−Ａｖａｌ断片として得た 。

５’　ブー、１．−−：　５’−ＧＧＧＣＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴ ＧＧＴＧＴＣＡＣＴＣＡＧＡＣＣ−３’３’”７’−７ｒ？−：　５’−ＧＡＴ ＣＴＧＣＣＣＧＧＧＴＡＧＧＡＴＧＧＡＧＡＧＴＣＧＡＧＴＣＣＣ−３’この３ ６３ｂｐ断片は、ＥｃｏＲＩ制限部位（５″プライマーの下線部分）およびＡｖ ａｌ制限部位（３′プライマーの下線部分）を有していた。

α鎖可変領域は、下記２つのプライマーを用い、プラスミドｐＴＣＲＶａ中に含 まれるｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅により得た。

３′　ブライ；７−：　５’−ＧＧＧＣＣＣＡＧＣＴＧＴＣＡＴＴＡＴＧＣＡＡ 、ＴＣＡＣＡＧＡＡＡＧＴＣＴＴＧＴＧＣＣ−３’５′　ブラインー：　５ｌ− ＣＣＣＧＧＧＧＣＧＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＡＧＴＣＣＴ− ３’この３４Ｓｂｐ長断片は、Ｎａｒｌ制限部位（５″プライマーの下線部分） およびＰｖｕ　Ｉ　Ｉ制限部位（３′プライマーの下線部分）を有していた。

両方の場合ともＰＣＲ法は、実質的にＧｅｎｅ−Ａｍｐキｙトの製造業者［パー キン−エルマー／ンータス（Ｐｅｒｋｉｎ　−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ）、ノー ウオーク、ＣＴ］の指示に従って行った。増幅は３０サイクルからなっていた。

各サイクルは、９４°Ｃで１分間溶解し、５０°Ｃで２分間アニールし、７２° Ｃで３分間ポリメライズするというものであった。７２°Ｃでのポリメライズ時 間は、各サイクルの後で５秒ずつ延ばしていった。各ＰＣＲ反応混合物には、α 鎖（ｐＴｃＲｖα）またはβ鎖（ｐＴＣＲＶβ）のｃＤＮＡ挿入物を含有するプ ラスミドＤＮＡ（０，５μｇ）を用いた。すべての反応混合物は２００μｍ中に 含まれ、５単位のＴａｑポリメラーゼ（パーキン−エルマー／シーラス）も含ま れていた。ＰＣＲ生成物を適当な制限酵素（Ｖαの場合はＮａ　ｒ　Ｉ、Ｖβの 場合はＡｖａ　Ｉ）で開裂し、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ、　Ｆ、　Ｍ、　） ら編「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒ ｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ） Ｊ（ジジンウイリー＆サンズ、ＮＹ（１９８７））の記載に従い、４％天然ポリ アクリルアミドゲル上、ｌｘ）リス／ホウ酸塩／ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中て ケル精製を行った。

末端にＡｖａｌおよびＮａｒＩの制限半部値（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｈａｌ ｆ−８ｉｔｅｓ）を有するように設計した６１ｂｐのリンカ−をコートする２つ の相補的なオリゴヌクレオチドを合成した。これらの配列は以下の通りであった 。

センスオリゴヌクレオチド。

アンチセンスオリゴヌクレオチド・ 制限酵素の粘着末端は下線を引いた部分である（センスオリゴヌクレオチドでは ５′末端側のＡｖａｌ半部位および３′末端側のＮａｒＩ半部位、アンチセンス オリゴヌクレオチドでは５′末端側のＮａｒＩ半部位および３”末端側のＡｖａ １半部位半部口れらのすりコヌクレオチドおよび上記ＰＣＲプライマーの合成は 、製造業者の指示にあるようにβ−シンアノエチル法用い、モテル３８０Ｂ　Ｄ ＮＡ合成機（アプライド・ハイオシステムズ）を用いて行った。上記各オリゴヌ クレオチド（約０．１μｇ）をｌＱｍＭｈリス・ＨＣＩ（ｐＨ７，４）および１ ｍＭＭｇｃＩ、を含有する！００μｌ容中て混合することにより、互いにハイブ リダイズさせた。この１６物に３滴のパラフィン油で覆って蒸発を防ぎ、沸騰水 中で１０分間加熱した。

得られたハイブリッドを室温に一夜冷却し、てゆっくりとアニールした。

精ＩＰＣＲ生成物およびリンカ−をそれぞれ１；１０の比でライケートした。ラ イゲーションは、ベセスダ・リサーチ・ラブズ（ガイセルスバーグ、ＭＤ）から のＴ４リガーゼおよび緩衝液を用い、５０μＩの反応ａ合物中、１６°Ｃで１６ 時間行った。６５℃に２０分間加熱して反応混合物中のＤＮＡリガーゼを不活化 した。ライゲーション反応液を制限消化緩衝液（二ニー・イングランド・バイオ ロジー）中で２００μＩに希釈し、Ｅ　ｃ　ｏ　Ｒ，Ｉおよびｐｖｕ　Ｔ　Ｉ（ 各５０単位）を加えた。消化を３７°Ｃで６時間行った。消化したキメラＤＮＡ 断片を１　ｘＴＢＥ中の４％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動により精 製し、臭化エチジウム染色およびＵＶ照射により可視化した。ＤＮＡをゲルから 切り出し、「クラッシュ・アンド・７−’）　（ｃｒｕｓｈ　ａｎｄ　５ｏａｋ ）　Ｊ法（マニアチスらの上記文献参照）により回収した。

ついで、得られたキメラ断片をＰｖｕ［ｒおよびＥｃｏＲｒで開裂したプラスミ ドｐＢＲ３２２中にクローニングした。ｐＢＲ３２２ＤＮＡ（１μｇ）を製造業 者により指示されるようにＥｃｏＲＩおよびＰｖｕｒＩにュー・イングランド・ バイオラブダ）で完全に消化した。１．０％アガロースゲル中で電気泳動した後 、２．３ｋｂヘクタ一断片を溶離した。得られたｐＢＲ３２２由来ベクター（５ ０ｎｇ）をＴ４　ＤＮＡリガーゼ（ヘセスダ・リサーチ・ラブダ）を用い、１６ °Ｃで１６時間、キメラ−重鎖Ｔ細胞レセプターＤＮＡ断片（２００ｎｇ）とラ イゲーションた。得られたライゲーション反応物の一部（１／１０）を用いてコ ンピテントな大腸菌株ＤＨ５（ヘセスダ・リサーチ・ラブダ）を形質転換した。

アンピシリン（１００μｇ　／　ｍｌ）を含有するアガー上にコロニーをブレー ティングした。ついで、アンピシリンまたはテトラサイクリンを含有するアカ− プレート上でコロニーを増殖させた。組換え体（Ｐｖｕ１１部位とＥｃｏＲ１部 位との間に一本鎖Ｔ細胞レセプター断片を挿入したｐＢＲ）はアンピシリン含有 プレート上でのみ成育したが、一方、ｐＢＲ３２２ベクターはアンビンリンとテ トラサイクリンの両方を含有するプレート上で成育した。これらのクローンを診 断制限酵素消化によりさらに試験した。この分析のため、３つのクローンを選択 した。これら３つの各クローン中の一本鎖Ｔ細胞レセプター挿入物を、チェイン ターミネータ−法により両方の鎖について配列決定した。２つのクローン（＃２ および＃５）を発現の研究のために選択し、それぞれｐＴＣＲ＃２およびｐ　Ｔ 　ＣＲ＃　５と命名した。これらプラスミドの地図を図３に示ｊ　（ｐ　Ｔ　Ｃ Ｒ＃　２＝　ｐ　Ｔ　ＣＲＵ　βｒ　Ｌ　Ｅ　＋　ｅ　ｔ　；　ｐＴＣＲ＃５＝ Ｉ）ＴＣＲαβ−ＭＥＴ＋ａＪ。両方のプラスミドとも長さが約３．Ｑｋｂであ る。これらプラスミド中の組換え体レセプター挿入物を図４に模式的に示す。こ れら２つの単離物のＤＮＡ配列ζよ、１カ所以外は同じてあった。単離物＃２で は５５５位のヌクレオチドがＡであり、その結果、１８２番目のコドンであるＡ ＴＡはイソロイシン残基をコードする。単離物＃５ては、５５５位のヌクレオチ ドがＧてあり、その結果、１８２番目のコドンであるＡＴＣｄよメチオニン残基 をコードする。

得られた５ｃＴＣＲ構築物（単離物＃２）のヌクレオチド配列およびそれから誘 導されたアミノ酸配列關訳を図２ｂに示す。アミノ酸＋１〜＋１１１は可変βド メインであり、アミノ酸＋１３５〜＋２４６は可変αドメインである。リンカ− 残基（＋１１２〜＋１３４）には下線を引いである。大腸菌中でシグナル配列な しで発現させるために、Ａ　ｓ　ｎ　−１−１コドンの前にはＡＴＧコドンカく きて（Ｘる。ＥｃｏＲｒ制限部位がＡＴＧの５”側にあることに注意したし１゜ まず、図１に示す構築物およびそのアンチセンスをｐＫＫ２３３−２中にクロー ニングし、大腸菌ＪＭ１０５を形質転換した。全細胞溶解液をドデシル硫酸ナト リウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供して所望の 生成物を同定しようとしたが、おそらく不充分なタンパク質発現レベルおよび／ または変性の結果、特定のバンドは観察されなかった。

ついで、５ｃＴＣＲ構築物を分泌ベクターｐｐｒ−２中にサブクローニングした 。このヘクターを選択したのは、以前に外来タンパク質を大腸菌のベリブラスム 空間中に分泌させるのを指令するのに使用したからである。ベリブラスム分泌の 利点としては、非還元的環境であるためジスルフィド結合の生成が可能であるこ と、およびベリプラスム部分のみを単離すれば汚染性の大腸菌のタンパク質が少 ないことが挙げられる。この系に使用するため、天然または組換えペリブラスム タンパク質の翻訳後に開裂されるリーダー配列の下流に所望のタンパク質を融合 する。ｐＰＬ２ベクターは、アルカリホスファタ・−ゼクンパク質ＣｐｈＯＡｉ ｉ伝子産物）のものを使用する。

５ｃＴＣＲをｐｐＬ２中にサブクローニングすることにより、成熟ｓ　ｃＴＣＲ タンパク質の予測されるアミノ末端側にさらに６個の残基が生成された（図２ａ ）。これら残基は、後で部位特異的突然変異誘発により除去した。

５ｃＴＣＲをコードするＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ　／　Ｐ　ｖ　＋ｉ　Ｉ　Ｉ断片をＩ ）ＰＬ２のＸｍａ　１部位中に挿入するためしり（Ｌｉ、　Ｐ）ら、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌへｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ８５　：　７６８５〜７６８９（１９８ ８）コ、５ｃＴＣＲ断片およびｐＰＬ２ベクターの両方を平滑末端とし、ついで ライゲートしてｐＰＬ２／５ｃＴｃＲ１を生成した（７ニアチスらの上記文献参 照）。

標準法（マニアチスらの上記文献参照）を用いて５ｃＴＣＲベクターの３ｋｂ　 ＫｐｎＩ断片をｍ１３中にサブクローニングした後、構築中に融合部位に導入さ れた６個の非天然古来アミノ酸を、アマーンヤム牛ノドを用い製造業者の指示に 従って部位特異的突然変異により除去した。二本鎖シーフェンシングを用いて変 異を確認し、この３ｋｂ　Ｋｐｎｌ断片を標準法を用いて６ｋｂ　Ｋｐｎ＋ベク ター断片とライゲートし、上記６個の非天然アミノ酸残基を欠失したｐＰＬ２／ ５ｃＴＣＲ２を構築した。構築中のすべての形質転換は、大、揚菌株〜ｒＺ１３ ｂを用いて行った。

Ｅ　大腸菌中での５ｃＴｃＲの発現 構成発現のためリン酸カルシウム沈殿法ニより１）ＰＬ２／５ｃＴＣＲＩおよび ２構築物を大腸菌株ＫＳ２６５（ｐｈｏＡ−、ｐｈｏＲ−）中に導入した。セン スｐＰＬ２／５ｃＴＣＲで形質軸ｍしり大腸菌のコロニーサイズは、アンチセン スｐＰＬ２／５ｃＴＣＲで形質転換した同じ大腸菌に比べて５〜１０倍づ１さが った。センスｐＰＬ２／５ｃＴｃＲ１またはｐＰＬ２／５ｃＴＣＲ２を含有する コロニーの全細胞溶解液をルリアブロース仰Ｂ）−カナマイシンプレート上に筋 状に植えたところ、〜３０ＫＤの推定５ｃＴＣＲ生成物の存在が５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ分析で示された。しが１．２ながら、これらコロニーの液体培地中での成育が らは検出可能な発現が得られなかった。これらの結果は、５ｃＴＣＲ生成物の発 現が該大腸菌にとって有害であり、その発現をなくシ、た変異体が選択されたこ とを示唆していた。

ＫＳ２６５株はｐｈｏＲ−であるためｐｈｏＡプロモーターの生理学的負の制御 力炊失しており、そｎゆえ５ｃＴＣＲを構成的に発現することが可能である。ｓ 　ｃ　Ｔ　ＣＲの毒性作用を除くため、リン酸カルシウム法（マニアチスらの上 記文献参照）を用いて５ｃＴＣＲ／　ｐ　Ｐ　Ｌ　２構築物をｐｈｏＲ＋株であ るＭｃｌＯＯＯ中に導入した。

この株では、後期対数期の大腸菌をリン酸欠乏状態（ｐｈｏＡ遺伝子転写の生理 学的刺激である）に洪することにより負の制御を不活化するまで５ｃＴＣＲの発 現は妨害された。

大腸菌株Ｍ　ｃ　Ｉ　Ｏ００中のブラ：ｚ、　ミＨｐＰＬ２／ｓ　ｃＴＣＲ２は 、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシコン（口、クビル、メリーラント ）にブダペスト条約の下、ＡＴＣＣ６８３２７の受託番号で１９９０年５月１５ 日に寄託しである。

５ｃＴＣＲの発現を誘発するため、５ｃＴＣＲ／ｐＰＬ２て形質転換し硫酸カナ マイシン（３０μｇ／ｍｌ）を含有するシリアブロース中、３７°Ｃて成育させ たＭＣ１００Ｏの新鮮な一夜培養液（４０ｍｌ）をベレット化し、Ｉ、Ｐ（低リ ン酸）培ｆｉｆｆ［ｉ　Ｌ当たり、３４ｇのモルホリンプロパンスルホン酸（Ｍ ＯＰＳ）、０．８ｇのトリシン、２９２ｇのＮａＣ１，１３，６ｍｇのＫｌ−（ ｔＰＯ，，１，６ｇのＫＯＹ（，０，５１ｇ＋７）ＮＨ，ＣＩ、ｉ、０７２ｇの Ｍｇｃ　Ｉ、−６Ｈ，Ｏｌｏ、６４μＩのａ）（ｃ　ｌ、４ｍｇ（７）ＦｅＣＩ ？−４ＨｔＯ１０，１４７２ｇ　１１７）Ｃａ　Ｃｌ　ｔ　・２　Ｈ２０、６、 ８ｕ　ｇのＨ３ＢＯ３，３，２ｕ　ｇのん１ｎｃ１２・４Ｈ２０，１，４４ａｇ のＣｏＣＩｒ’Ｈｚ○、３２ｎｇの０．２６７Ｍ　Ｋ、Ｓ０４．２０ｍ１の７５ ％のカサミノ酸、２０ｍＩの２０％グルコース、Ｉｍｇのチアミン・ＨＣＩ、お よび３０ｍｇの硫酸カナマイシン］（１０ｍｌ）で洗浄し、ＬＰ培地（４Ｌ）中 に再懸濁し、ついで２Ｌフラスコ中にアゾコートした（８Ｘ５００ｍ１）。２５ Ｏｒｐｍで８．５時間π１しなから３７°Ｃで培養液を成育させた。細胞ベレッ トを還元試料緩衝液［１ｍ１当たり　７．６ｍｇのトリス塩基、１００μｍのグ リセロール、１０ｍｇのＳＤＳ、１０μｌのβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ ）、０．５ｍｇのフロモフェノールブルー、ｐＥ（６，８に調節ｊ中、ｉ　ｏ　 ｏ　’ｃで５分間加熱した後、全細胞溶解液を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した 。これらタンパク質をポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜に移し、ク マシー染色によりバンドを可視化し、ついてアプライドバイオ／ステムズ４７０ Ａプロテインシークエンサー上でマツダイラ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ、　Ｐ、　 ）らのＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２旦２．１００３５〜１００３８（１９ ８７）に記載の方法に従い切り出しバンドのアミノ酸配列を決定することにより 、該ゲル上の推定５ｃＴＣＲバンドを確認した。配列決定の目的のため、約１０ ０〜２５０ｐＭのタンパク質を用いた。各シーフェンシングについて最小１０サ イクルが得られた。

上記誘発後、液体培地中で成育させた大腸菌の全細胞溶解液中に〜３０ＫＤの特 定バンドか検出された。ＴＣＲＩおよびＴＣＲ２タンパク質のみかけてのサイズ は予測したもの（たとえば、ＴＣＲ２の場合は２５，８９６ＫＤ）よりもわずか に大きかったか、その同一性はＰＶＤＦブロッティングバンドのアミノ酸配列分 析により確認された（図２ａ）。後者の分析から、ｐｈｏＡリーダー配列がＴＣ ＲｌおよびＴＣＲ２タンパク質から開裂されたことか確認された。しかしながら 、開裂は、ＴＣＲ２の場合に予測されたアミ／末端よりも２個のアミノ酸だけカ ルボキン末端側で起こったので、アミノ末端はＡｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａ　 Ｉ−Ｔｈｒでは＋、ＣくＧＩｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒで始まるものとなった。その後 の研究では、融合生成物によりもたろされる６アミノ酸残基の逆の構造結果を回 避するためにＴＣＰ２を利用した。

Ｆ、５ｃＴＣＲの精製 アミノ酸シークエシンングによりｐｈｏＡリーダー配列か５ｃＴＣＲから開裂さ れたことか示されたので、このタンパク質をベリブラスム空間から単離すること を試みた。しかしながら、５ｃＴＣＲは常に低スピードペレット中に残留するこ とがわかった。塩による洗浄および非変性界面活性剤のいずれも、このタンパク 質をこれらペレットから可溶化することができなかった。驚くべきことに、封入 体精製法を首尾よく用いることができた。この方法では、細胞を４℃にてベレッ ト化しく１０，０００　ｒ　ｐｍ、１０分間、５ｏｒｖａ１１．　ＲＣ５Ｂ）、 ４００ｍ１の５ＱｍＭ）リス−ＨＣＩ　（１）８７．５）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、 ３ｍｇ／ｍｌのリゾチーム中に再１！！濁した。水上で２時間インキュベートし た後、５Ｍ　ＮａＣｌ（２８ｍｌ）および１０％ノニエートーＰ４０（ＮＰ４０ ）（３０ｍｌ）を加えた。氷上でのインキュベーションをさらに３０分間続け、 ブラン゛ノン２５０ンニファイアーを用いて３０秒間の超音波パルス処理を３回 行った。１０、ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠心分離にかけた後、得られたペレット を５０ｍ１のｌＱｍＭｌ−リス−ＨＣＩ　（［）Ｈ７，５）、１ｍＭＥＤＴＡＳ Ｏ，５％ＮＰ４０．１ＭＮａｃｌ中に充分に再懸濁し、再ベレ、ト化した。この ペレットを同様にして同し緩衝液で再洗浄し、ついでＮａＣ１を含まない同じ緩 衝液でさらに２回洗浄した。ついで、上記ペレットを新たに調製したセブバノク ト（Ｓｅｐ　Ｐａｋ’ｄ）Ｃ７クセＪしＱＭＡカートリノン（Ａｃｃｅｌｌ　Ｑ Ｍ、４　Ｃａｒｔｒｉｄｇｅン、ミリボッ２８Ｍ尿素（８ｍｌ）中に溶解した。

この溶液をアリコートし、１０分間マイクロ遠心分離にかけた（フィッシャー） 。上澄み液をコン／　ｚ＋インし、Ｎ、ガスを通した。ＩＭ）リス−ＨＣｌ　（ ｐＨ８）（８０μｍ）およびジチオトレイトール（２４，７ｍｇ）を加えた。室 温で３０分間インキユベ・−トした後、１ｍｌアリコートをＱ、１％トリフルオ ロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ，○中に１・ｌに希釈し、ヒユーレット−／　ｚＨノカー ド（Ｈｅｗｌｅｔ　−Ｐａｃｋａｒｄ）　Ｌ　Ｏ９０液体クロマトグラフに結合 しりＣ４−逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｃ，４−ＲＰＨＰＬＣ）カラム［ ビタノク（Ｖｙｄａｃ）　］上に負荷し、０．１％ＴＦＡ／Ｈ，Ｏで１ｍ１／分 でポンプにかけた。２７〜３０％の０１％ＴＦＡ／アセ）・ニトリル６分間直線 勾配中にフラクションを回収した。各フラクション（５μｌ）を乾燥し［スピー ドバックコンセンｉ　ｌ／−ター（Ｓｐｅｅｄ　ＶａｃＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏ ｒ）、サバン（Ｓａｖａｒｌ）］、還元５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（１０μｌ ）中に再懸濁（２、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、　Ｋ、　）のＮａｔｕｒｅ ２２７．６８０〜６８５（１９７０＞に記載の方法に従って５ＤＳ−１２，５％ ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、クマンーブルー染色した。成熟５ ｃＴＣＲを含有するフラクションをフンバインし、溶媒を蒸発しくスピードバッ クコンセントレータ−）、得られたペレットを新たに調製した８Ｍ尿素中に約２ ｍｇ／ｍｌの濃度（クマシーブルー染色により評ｇｆｉ）にて再懸濁した。

上記封入体精製プロトコールにより、＞４０％の精製が達成されることがわかっ た（図５、レーン２）。類似のみかけの分子ｔ（３２ＫＤおよび２９ＫＤ）を有 する主要な不純物は、アミノ酸ンークエンシングにより、それぞれ非処理５ｃＴ ＣＲおよびカナマイシン耐性遺伝子産物として同定された。これら不純物を処理 ５ｃＴＣＲから分離するため、逆相ＨＰＬＣを用いた。この手順の結果、クマン ーブルー染色ケルにより判断されるように、物質の純度は〉９５％となった（図 ５、レーン３）。

封入体タイプのプロトコールが必要であることは、５ｃＴＣＲがベリブラスム中 に移動した後に不溶性の凝集物を形成していることを示唆していた。８Ｍ尿素中 に溶解した上記精製５ｃＴＣＲを種々の緩衝液中に迅速に希釈しく１．　：　１ ’ＯＯ）、３０分間インキ、ヘートし、マイクロ遠心分離にかけ、ついで５ＤＳ −ＰＡＧＥにより可溶性物質ｖｓペレット化物質ｖｓチューブに吸着した物質の 比を分析することにより、可溶性の研究を行った。これらの実験は、５ｃＴＣＲ は低ｐＨおよびイオン強度の緩衝液（たとえば、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ ５）中で可溶性であることが示された。生理学的緩衝液に界面活性剤を加えると 、このアッセイにおいて可溶性物質を回収することができた。界面活性剤（たと えば、０１％３−二（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニア］プロパンス ルホネート。

ＣＨＡＰＳ）を加えてセントリコン１０．ｓ線装置に粘着するのを防げば、低ｐ 　Ｈ緩衝液中に可溶化した物質を沈殿させることなく１ｍｇ、’ｍｌを越える１ 度に濃縮することができた。それゆえ、５ｃＴＣＲを通常通り、Ｏ１％ＣＨＡＰ Ｓを含有する１　０　ｍ　Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中に濃縮した（および再 び折り畳んだ）。

Ｇ、５ｃＴＣＲの再折り畳み ８Ｍｌ１素中の上記精製５ｃＴＣＲを、５　ｍ　Ｍ還元グルタチオンおよびＱ、 ５ｍＭ酸化グルタチオンを含有するｌＱｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中にｌ： １００に迅速に希釈した。３７°Ｃて２．５時間回転させた後、この溶液をスペ クトラム６（フィッシャー）８０００ＭＷカットオフチュービングに移し、２０ 容量の１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５）に対して２５間透析した。およそ１２ 時間毎に新たな緩衝液を供した。０．１％ＣＨＡＰＳ（ピアス）を加えた後、得 られた再折り畳み５ｃＴＣＲをセントリコン１０マイクロコンセントレータ−（ アミコン）中で１　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　！：　Ｊ縮した。これら条件下で観察 される生成物の一例を図５、レーン４に示す。

Ｈ，ＦＬ−ｓｃＴＣＲを用いた結合研究ＦＬと類似の構造を有する幾つかの染料 が、アミン含有基質に結合させることか可能な形態で入手できる。これら染料の うち３つを選び、１．６−ンアミノへ牛サンスペーサーを介してセファロースビ ーズに結合した。これら染料のビーズへの結合は以下のようにして行った。１， ６−ンヘキシルアミン（アルド１ルノチＸ６９ｍｇ）を０、ＩＭＮａＨＣ○３（ ｐＨ８，３）（１５０ｍｌ）中に溶解し、エタノールアミン（０，８７ｍ１）を 加えた。製造業者の指示に従って膨潤させた臭化シアン活性化セファロース４Ｂ （ファルマシア）（４，４ｇ）を上記１．６−ジヘキ／ルアミン／エタノールア ミン溶液に加え、４°Ｃて一夜、ついで３７°Ｃで１時間回転させた。ＰＢＳ（ １５０ｍＩ）で５回洗浄した後、ビーズを再懸濁し、ＰＢＳ中で１・１容１比の スラリーとして４６１：で貯蔵した。エタノールアミンのみとカップリングさせ た（すなわち、１，６−）へキシルアミンを使用しない）コントロールのビーズ も同様に調製した。ジヘキ／ルアミン結合ビーズをＦＩＴＣ［モレキュラー・ブ ローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）コ、Ｒｈ１ＴＣ（ロータミンＢ イソチオシア不一ト：アルドリノチ）、ＥＩＴＣ（エオシンー５−インチオシア ネート、モレキュラー・ブローブズ）：またはＣＮＦ（５−（および６−）カル ボキシナフトフルオレセイン、スクシンイミジルエステル。モレキュラー・ブロ ーブズ）とカップリングした。各染料の分子量Ｘｌ０−５の量（グラム）をＮ。

Ｎ−ツメチルホルムアミド（７５μり中に溶解し、激しく震盪しながら１００ｍ Ｍホウ酸ナトリウム（ｐＨ８，７５：　７．５ｍ　ｌ）に加えた。この溶液を直 ちに用いて、ホウ酸緩衝液で前置て洗浄しておいたジヘキシルアミン結合ビーズ （１ｍりを再懸濁した。チューブをアルミニウムホイルでラップし、４°Ｃで一 夜、ついで３７°Ｃで１時間回転させた。ついで、これら染料結合ビーズを２０ ０ｍＭグリシン（ｐシン）（１５ｍ　ｌ）で３回、５０％メタノールで２回、お よびＰＢＳで３回洗浄し、ついでＰＢＳ中に再シ濁し１：１容量比のスラリーと して貯蔵した。

ついで、これろビーズを用いて結合研究を以下のようにして行った。染料（また はエタノールアミン）結合セファロースをマイクロ遠心チューブ［ベックマン・ インスッルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）］中、緩衝液（ Ｌｍｌ）で洗浄した。再折り畳み濃縮５ｃＴＣＲ（５μｍ）（５μｇ）を含有す る同緩衝液（５００μｍ）中に再懸濁した後、チューブをアルミニウムホイルで ラップし、４°Ｃて一夜回転した。

新たなマイクロ遠心チューブに移した後、ビーズを緩衝液で３回洗浄し、非還元 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（ＢＭＥを含まない他は上記Ｅで使用したものと同 じ）（６０μｌ）中に再懸濁した。加熱（１００°Ｃで５分間）後、４０μｍの 試料を５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、染料特異的結合および無関係の５ｃＴＣ Ｒ形の相対結合の両方について分析するため、ハイオラドシルバーステイニング キノトを用いて可視化した。

これらの実験は、５ｃＴＣＲの結合競合形として２６ＫＤのみかけのＭＷにて移 動するハンドを示した（図６）。このバンドは、出発物質で認められるバンドの 分布に比べてＦＩＴＣ−セファロースビーズからの溶離液て顕著であったＣｏｖ ｅｒ　−ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｃｌ）。この顕著性は、ＮＰ４０およびデオキシ コール酸塩（ＤＯＣ）を含有スるＰＢＳを緩衝液として用いた場合に最も明ろが であったが、他の界面活性剤を用゛いた場合または界面活性剤の代わりにウシ血 清アルブミン（５ｍｇ／ｍｌ）を用いた場合にも認められた。ＲｈｒＴＣおよび エタノールアミンカップリングビーズはこれら条件下で結合を示さなかったが、 Ｆ　Ｉ　ＴＣ（Ｅ　Ｉ　ＴＣおよびＣＮ　Ｆ　）と同じ正味の電荷を有する２つ のコントロール染料は、相当の結合を示した。しかしながら、ＥＩＴＣおよびＣ ＮＦは、ＦＩＴＣの結果とは違ってタンパク質と明らかに非特異的に相互反応し 、そのためすべての形態の再折り畳み５ｃＴＣＲが同じ親和性で結合した。〜２ ６ＫＤバンドのＦｒＴＣセファロースへの結合は、３ｍＭの５−（５−アミ／ベ ンチルチオクレイジル）フルオレセインにより抑制することができた。

実施例ＩＩ 別の疎水性アミノ酸残基を有する可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプターの実施例Ｉに記 載した可溶性抗フルオレセインー重鎖Ｔ細胞レセプターの溶解性を増大させるた め、表面に暴露されていると予測される幾つかの疎水性可変領域フレームワーク アミノ酸残基をより親水性のアミノ酸残基で置換した。実施例！（Ｃ）に記載の ５ｃＴＣＲ構築物（単離物＃２）（そのヌクレオチド配列およびそれから導かれ るアミノ酸配列を図２ｂに示す）を、ｐｓｓ１分泌ベクターのＢａ１ＩおよびＰ ｓｔ１部位にサブクローニングした。ｐＳＳ　１のＲ製は、ｐＢＩｕｅｓｃｒｉ ｐｌＩＩｓＫ−（ストラタジーン、ラジョラ、カリフォルニア）のポリリンカー （Ｓａ　ｃ　Ｉ−Ｋｐｎ　Ｉ）を切り出しこの領域をアーウイニア・カロトボラ （Ｅｒｗｉｎｉａ　ｃａｒｏｔｏｂｏｒａ）のベクテートワアーゼＢ（ｐｅｌＢ ）リーダー配列（そのリポソーム結合部位とともに）および新たなポリリンカー で置き換えた。このｐｅｌＢリーダーは、鋳型としてｐｓＷｉ−ＶＨｐｏ　Ｉ　 ｙＴａｇ　ＩＥウォード（Ｗａｒｄ）ら、ＮａＬｕｒｅ３４１．５４４−＝５４ ６（１９８９）］を用いＰＣＲにより行った。新たなボッワンカーの構築は、そ の後の５ＣＴＣＲｓの挿入および操作に有用な制限部位を含む２つの重複する合 成オリゴヌクレオチドから行った。ポリリンカーおよびｐｅｌＢリーター（コー ド鎖のみ）のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は以下の通りである。

ＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴ　ＴＣＡＡＡＴＴＣＴＡ　ＴＴＴＣＡＡＧＧＡＧ　ＡＣＡ ＧＴＣＡＴＡＡＴＧ　ＡＡＡ　ＴＡＣＣＴＡ　ＴＴＧ　ＣＣＴ　ＡＣＧ　ＧＣＡ 　ＧＣＣＧＣＴＭｅｔ　ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ａ ｌａ　Ａｌａ　ＡｌａＧＧＡ　ＴＴＧ　ＴＴＡ　ＴＴＡ　ＣＴＣＧＣＧ　ＧＣＣ ＣＡＧ　ＣＣＧ　ＧＣＣＧｌｙ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ、　Ｌｅｕ　Ａｌａ　 Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ得られた発現ベクター（ｐＳＳ　１／ＦＬ−ｓ ｃＴｃＲｌと称する）は、ｐｅｌＢリーダーのすぐ後にインフレームでＶβ、上 記「リンカ−」ついてＶαセグメントをコードしている。この構築物の発現は１ ａｃＺプロモーターの制御下にあり、従ってＩ　ＰＴＧにより誘発することがで きる。ｐｓｓｌに基づくプラスミドをＸＬＩ−ｂｌｕｅ／ＩＱ［株ＸＬＩＢｌｕ ｅ（ストラタジーン）の誘導体ニブラスミドＲＧ　ｌ（ロパート・ガーター（Ｒ ｏｂｅｒｔ　Ｇａｒｃｉｅ）、ダナ・ファーバー曝キキンサー・インスチチュー ト（Ｄａｎａ　Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ　［ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）、ボストン 、マサチューセッツ州から入手）を含有］中に維持した。

後者は、］ａｃｌＱ（Ｉａｃプロモーターのレプレッサー）を構成的に発現する 。

ついで、製造業者の指示に従ってアマ−７ヤムキノトを用い、発現ベクターｐＳ Ｓ　１／ＦＬ−ｓｃＴＣＲｌ中の幾つかのアミノ酸残基を部位特異的突然変異続 発により変異させてｐｓｓｌ／ＦＬ−ｓＣＴＣＲ２を生成させた。具体的に説明 すると、１０位にあるｐｈｅ残基をＳｅｒに変化させ（コドンの変化はＴＴＣ− ＋ＴＣＡ）、４１位にあるＭｅｔ残基をＬ　ｙ　ｓに変化させ（ＡＴＧ　４ＡＡ Ｇ）、１１１位にある［、ｅｕ残基をＴｈｒに変化させ（ＣＴＡ−ＡＣＡ）、１ ５２位にあるｌｌｅ残基をＡｒｇに変化させ（ＡＴＴ−ＣＧＴ）、１４６位にあ るＩｌｅ残基をＳｅｒに変化させた（ＡＴ　Ａ−４Ｔ　ＣＡ）（図２ｂ参照）。

Ｂ　大腸菌中てのｐＳＳ　ｌ／ＦＬ−ｓｃＴＣＲ２の発現修飾５ｃＴｃＲ（ＦＬ −ｓｃＴＣＲ２）の発現を続発するため、ｐＳＳ　１／ＦＬ−ｓ　ｃＴＣＲ２ベ クターを含有するＸＬＩ−Ｂｌｕｅの一夜培養ａ（１６５ｍｌ）を、カナマイフ ン（３０ｕｇ／ｍｌ）、アンピシリン（５０ｕｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリ ン（１２，５μｇ／ｍｌ）を含有するルリアブロース中、３７℃で増殖させ、５ ｍＭＩ　ＰＴＧを含有する同培地で１０１００Ｏに希釈した。この培養液を３７ °Ｃにて２５０ｒｐｍで農産させながら８時間増殖させた。細胞ベレットを５０ ｍＭ）リス−〇ＣＩ、ｐＨ８，５，５ｍＭＥＤＴＡ１　リゾチーム（０，３ｍｇ ／ｍｌ）、１ｍＭ　ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオライド）中に再 懸濁し、水上で２時間インキュベートした。ついで、ＮＰ４０を０．７５％で、 ＮａＣＩを０．３５Ｍで加えた。この＠濁液を超音波処理しくブランフン２５０ ソニフアイアー）、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離にかけた。得られた ベレットを高塩洗浄緩衝液（１，ＯＭ　ＮａＣ］、１１０ｍＭトリスｐＨ８，５ ，０，５％Ｎ　Ｐ　４．　Ｑ、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に再９ −濁し、再ペレット化した。この工程を繰り返し、ついで低塩緩衝液（１０ｍＭ トリス釦Ｈ８，５コ、０．５％ＮＰ４０，１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ） で２回洗浄した。最後に、ベレットを可溶化緩衝０．　（２０ｍ　Ｍ　トリス（ ｐＨ８，０）、５ＱｍＭジチオトレイトール（ＤＤＴ）、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、８ Ｍ尿素）（５ｍｌ）中に再懸濁し、１５．ＯＯＯｒｐｍで１５分間遠心分離にか け、上澄み液を回収した。この尿素で可溶化したＦＬ−ｓｃＴＣＲ２を、ビタソ クＣ４カラム上の逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによりさらに精製した。クロ マトグラフィーの展開は、０．１％トリフルオロ酢酸／′水中のアセトニトリル の勾配を用い、１ｍｌ／分の流速にて行った。

かくして得られたＦＬ−ｓｃＴＣＲ２は、Ｎ−末端配列分析により〉９５％純度 であると判断された。ＦＬ−ｓｃＴＣＲ２を含有するフラクションをフンバイン し、溶媒を蒸発させ（スピード／　Ｘ４ツク）、ベレットを８Ｍ尿素、ｌＱｍＭ ）リス（ｐＨ８，０）および２０ｍＭＤＴＴ中に〜３ｍｇ／ｍｌの濃度にて再懸 濁した。

ＦＬ−ｓｃＴＣＲ２の大腸菌中での発現および分別特性は非修飾５ｃＴＣＲのも のと実質的に同じであることがわかった。

Ｃ，ＦＬ−ｓｃＴＣＲ２の溶解度の研究８Ｍ尿素中に精製ＦＬ−ｓｃＴＣＲ，２ （３ｍｇ／ｍｌ）を含有するアリコートを、２ＱｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５， ０）、２　Ｑ　ｍ　Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、ＰＢＳ（１０ｍＭリン 酸ナトリウム「ｐＨ７，４３，１５０ｍＭＮａｃＩ）または２０ｍＭトリス−Ｈ ＣＩ（ｐＨ８，０）中に３０ｕ、ｇ／ｍｌに希釈した。試料を室温で２時間イン キュベートし、１０分間マイクロ遠心分離にかけ、上澄み液を還元５ＤＳ−ＰＡ ＧＥにより分析した。

修飾５ｃＴＣＲは、非修飾タンパク質に比べて実質的により可溶性であることが わかった。たとえば、非修飾タンパク質とは違って、ＦＬ−ｓｃＴＣＲ２はＰＢ Ｓ中でも、中性ｐＨのトリス−）（ＣＩ中でも溶解した。

Ｄ、ＦＬ−ｓｃＴＣＲ２についての染料結合研究ついで、ＦＬ−ｓｃＴＣＲ２の 抗原特異的結合特性を中性ｐＨにて生理緩衝液中で試験した。Ｆ　ＩＴＣ，Ｒ＋ ＴＣ，ＣＮＦおよびＥＩＴＣを上記のようにしてセファロースビーズに結合させ た。

１ｍ合七ファロ・−スビーズＣ１００１ｘｌ）をマイクＩ？遠心管中、ＰＢＳで 洗浄した。１０％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳ（１ｍｌ）を加え、遠心管をア ルミニウムホイルでラッピングし、４℃で−夜回転させた。再び折り畳んだ濃縮 ＦＬ−ｓｃＴＣＲ２（〜１５μｇ）を含有する同緩衝液（２００μｍ）中に再懸 濁した後、試料をアルミニウムホイルでラッピングし、室温で４時間回転させた 。ついて、ビーズをＰＢＳ（１ｍ　ｌ）およびＰＢＳ、（２００μｌ）で洗浄し た。種々の濃度の５−Ｃ５−アミンベンチルチオウレイジル］フルオレセイン（ ＡＰ−Ｆｌ、モレキュラー・ブローブズ）を含有するＰ　Ｂ　Ｓ　（５０μｍ） 中にビーズを再懸ｌ蜀することにより、ＦＬ−ｓｃＴＣＲ２を溶出させた。平行 実験において、１００μＭのＡＰ−ＦｌをＲＩＴＣ−１ＣＮＦ−１またはＥＩＴ Ｃ−結合セファロースビーズに加えた。１０μｍの５×非還元Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ 　Ａ、　Ｇ　Ｅ試料緩衝液を溶離液に加え、これら溶離液を５ＤＳ−ＰＡＧＥに 供し、ついでポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ、ミリボア）膜に移した 。ＰＶＤＦプロットをアフィニティー精製抗ＦＬ−ｓｃＴＣＲ抗体とともにイン キュベートし、ついでアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（バイオ ラド、リッチモンド、カリフォルニア州）を加え、５−ブロモ−４−クロロ−３ −インドリルホスフェート二ナトリウム塩およびｐ−ニトロブルーテトラゾリウ ムクロリド（バイオラド、リノチモンド、カリフォルニア州）の溶液を加えて発 色させた。５ｃＴＣＲに対するポリクローナル抗血清は精製ＦＬ−ｓｃＴｃＲ１ でウサギを免疫することにより産生させ、特異的抗体の精製は精製ＦＬ−ｓｃＴ ｃＲ１を結合させたアフィゲル１０ビーズ（ピアス）を用いたアフィニティーク ロマトグラフィーにより行った。

■００μＭＡＰ−Ｆｌにより〜２９ＫＤの単一バンドがＦＩＴＣセファロースか ら溶出されることかわかった。これとは対照的に、ＲＩＴＣ−１ＣＮＦ−または Ｅ　ｒＴｃ−結合セ７７ｏ−スビーズから溶出されたバンドはなかった。ＦＩＴ Ｃ−セファロースからはＲＩＴＣによって２９ＫＤ種を溶出することができず、 フルオレセインに対するＦＬ−５ＣＴＣＲ２の特異性をさらに支持していた。さ らに、再び折り畳んだＦＬ−ｓｃＴｃＲ２ｇ製物中のオリゴマーまたは１７ＫＤ にて最も迅速に移動する種のいずれもＦＩＴＣ−結合セファロースから特異的に 溶出することができなかった事実に注意すべきである。これらの発見は、２９Ｋ ＤのＦＬ−ｓｃＴＣＲ２タンパク質のみが抗原結合特性を有することを示唆して いる。本発明者らは、このことを、再び折り畳んだｓ　ｃＴｃＲ混合物の該種牛 のＶβおよびＶαドメインが天然のままであることの証拠と考えている。

図面の詳細な記載 図］、抗フルオレセイン特異性を有する一本鎖Ｔ細胞レセプターの２つのコンピ ューター生成モデルのポリペプチド骨格トレーシング。これら構造は、１セツト の近似構造モデルを生成するために使用したモレキュラーダイナミ・／クシミュ レーションの軌線から選んだ代表例である。モデルは側面図で示してあり、超可 変部位（Ｈ鎖）は右を向いている。可変βドメインは上部にあり、可変αドメイ ンは下部にある（骨格は破線でトレースした）。リンカ−構造部は、図の左上部 の隅に可変βドメインからの突出部として明らかに認めることができる。

ｆｆｆ１２：ＦＬ特特約的５ｃＴＣＲヌクレオチドおよびアミノ酸配列。

ＴＣＲドメインおよびペプチドリンカ−セグメントの順序を示す模式図。ベリブ ラスム分泌系のため、連接配列かｐ　ｈ　ｏ　Ａリーダーと一本鎖ＴＣＲとの間 にＴＣＲｌおよびＴＣＲ２ＴＣＲ，ｌおよびＴＣＲ２のために与えられている。

個々のタンパク質の経験的に得られたアミノ酸配列を示しである。

図３　プラスミドｐＴＣＲαβ−Ｉ　Ｌ　Ｅ　、、、およびプラスミドｐＴＣＲ ａβ−Ｍ　Ｅ　Ｔ　、、、の遺伝子地図。これらプラスミドは、ｐＢＲ３２２か ら得られた。−重鎖Ｔ細胞レセプターキメラ断片をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩお よびＰｖｕｌＩ部位にクローニングした。

両プラスミドは約３．Ｑｋ、Ｂであり、お互いに１つのヌクレオチド位のみが異 なっている。幾つかの制限酵素開要部位の位置を示す。

β鎖に由来するＤ　Ｎ　Ａ配列は黒塗りバーで示してあり、α鎖に由来するＤＮ Ａ配列はハツチングバーで示しである。Ａｍｐｖはアンピシリン耐性を示す細菌 遺伝子である。ＯｒｉはｐＢＲ３２２の複製開始部位である。

図４ニ一本鎖Ｔ細胞レセプターをコードするＤ　Ｎ　Ａ断片のスケール図。Ａは 、単離物＃２中にクローニングしたＤＮＡ断片であり、残基１８２がインロイ７ ンであるキメラタンパク質をコードする。

Ｂは、単離物＃５中にクローニングしたＤＮＡ断片てあり、残基１８２がメチオ ニンであるキメラタンパク質をコードする。メチオニンコドンはＢａ１ｆ制限部 位の一部である（ＡＴＧＧＣＣＡ、メチオニンコドンは肉太タイプで示してあり 、Ｂａ１１部位は下線を引いである）。この酵素で消化すれば、これら２つの単 離物を識別することができる。β鎖に由来するセグメントは箱で示してあり、α 鎖に由来するセグメントはパッチングマークを付しである。中央部の黒塗りセグ メントは「リンカ−」配列を示す。

図５：５ｃＴＣＲの精製。全細胞溶解液、１；細胞溶解液中の不溶性沈殿性物質 の尿素抽出物、２；ＲＰＨＰＬＣ，Ｆ＃製再折り畳み５ｃＴＣＲ（０，５μｇ） 、３：ＲＰＨＰＬＣ精製再折り畳み５ｃＴＣＲ（３μｇ）、４゜レーン１．２お よび３は還元条件下で行い、レーン４は非還元条件下で行った。

図５　：　ｓ　ｃＴＣＲ種のＦＩＴＣ−力、ブワングセフ７０−スへの特異的結 合。ＣＮＦ、ｌ：ＲｈｌＴｃ、２：ＥＩＴＣ１３：ＦＩＴＣ１４；エタノールア ミン、５とそれぞれ力、ブリングしたセファロースビーズから５ｃＴＣＲを溶離 した。

ＦＩＧ、１ ＳＩＮＧＬＥ　ＣＨＡＩＮ　ＴＣＲ ＦＩＧ、２ａ Ｆｉｇｕｒｅ　２ｂ ＧＡＡ　ＴＴＣＡＴＧ　ＭＴ　ＣＣＴ　ＧＧＴ　ＧＴＣＡＣＴ　ＣＡＧ　ＡＣＣ ＣＣＡ　ＡＡＡ　ＴＴＣＣＧＧ　Ｇ丁ＣＣ丁Ｇ　ＡＡＧ　ＡbＡ −３ｔｅｌ　（ｆ）　＋ｍｌ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　ＶａＩＴｈｒ　Ｇｉｎ 　Ｔｈｔ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　ＶａＬ　Ｌｅ普@Ｌｙｓ　Ｔｈｒ ＧＧＡ　ＣＡＧ　ＡＧＣＡＴＧ　ＡＣＡ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　丁ＧＴ　ＧＣＣＣＡ Ｇ　（ＪＩＴ　ＡＴＧ　ＭＣＣＡＴ　ＧＭ　ＴＡＣＡＴＧ　嘯`Ｃ ４１６ＧｌｙＧｌｎ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ａｌ ａ　Ｇｉｎ　ｘｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｈｌｓ　Ｇｌｕ　Ｔ凾秩@Ｍｅｔ　Ｔｙ ｒ ＴｒＧ　ＴＡＴ　ＣＧＡ　ＣＭ　ＧＡＣＣＣＡ　ＧＧＣＡＴＧ　ＧＧＧ　ＣＴＧ 　ＡＧＧ　ＣＴＧ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＴＡＣＴＣＡ　ＧＴＴ@ＧＧＴ ＋３４　τｚｐ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｍａｔ　 Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｑ　Ｌｅｕ工ｌｅ　）！ｉｓ　Ｔｙｒ@Ｓｅｒ　Ｖａｔ　 Ｇｌ’／ ＧＡＧ　ＧＧＴ　ＡＣＡ　ＡＣＴ　ＧＣＣＭＡ　ＣＧＡ　ＧＡＧ　ＧＴＣＣＣＴ 　（ａ入Ｔ　ＧＧＣＴＡＣＡＡＴ　ＧＴＣＴＣＣＡＧＡ　丁sＡ ＊５２　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　 Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｖａｌ@Ｓｅｒ　Ａｒｇ　 Ｌｅｕ ＡＡＡ　ＭＡ　ＣＡＧ　ＭＴ　ＴＴＣＣＴＧ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＴｒＧ　ＧＡＧ 　ＴＣＧ　ＣＣＴ　ＧＣＴ　ＣＣＣＴＣＣＣＡＡ　ＡＣＡ　sＣＴ ＋７０　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　ＩＡｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｘ）ｒｏ　Ｓｅ秩@Ｇｌｎ　Ｔｈｒ 　５ｅｒ Ｇ丁Ｇ　ＴＡＣＴＴＣＴＧＴ　ＧＣＣＡＧＣＡＧＧ　ＡＣＧ　ＧＣＣＡＣＧ　Ｃ ＡＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＣＡＴ　ＴＴＴ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＧfＧ ＋８８　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　阻ｓ　Ｐｈｅ　fｕｙ　Ａｓｐ　Ｇ ｌｙ ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＡ　ＧＴＣＣＡＧ　ＭＡ　ＧＧＡ　ＧＧ Ｇ　ＡＴＴ　ＴＣＡ　ＡＴＴ　ＡＴＡ　ＡＡＣＴＧＴ　ＧＣs　ＴＡＴ １４２　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｘ１ｅ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｘｌｅ　Ａｓｎ@Ｃｙｓ　Ａｌａ　 Ｔｙｒ ＣＡＧ　ＭＣＡＣＴ　ＧＣＧ　ＴＴＴ　ＧＡＣＴＡＣ丁ＴＴ　ＣＣＡ　ＴＧＧ　 ＴＡＣＣＡＡ　ＣＡＡ　ＴＩＣＣＣＴ　ＧＧＧ　ＡＡＡ　ＧfＣ ′１ＣつＣコＵへ５ｎＴｈｒＡｌａＰｈｅＡｓｐ丁ｙｒＰｈｅＰｒｏＴｒｐＴｙ ｒＧｉｎＧｉｎＰｈｅＰｒｏＧｌｙＬｙｓＧユ）・ＣＣＴ　ＧＣＡ　７丁Ａ　Ｔ ＴＧ　ＡＴＡ　ＧＣＣＡＴＡ　ＣＧＴ　ＣＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＧＴ　ＣＡ Ａ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　fＧＡ　ＡＧＡ １７Ｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　工ｌｅ　Ａｌａ　ｒｌｅ　Ａｒｇ　 Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ@Ｇｌｕ　Ｇ】ｙ　 Ａｒｑ ＴＴＣＡＣＡ　ＡＴＣＴＣＣ丁ＴＣＡＡＴ　ＡＡＡ　ＡＧＴ　ＧＣＣＭＧ　ＣＡ Ｇ　ＴＴＣＴＣＡ　７７Ｇ　ＣＡＴ　ＡＴＣＪ’、丁Ｇ　ＣCＡＴ １９６　Ｐｈ＝　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　 Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ@ｌｌｅ　Ｍｅｔ　 Ａｓｐ ＴＣＣＣＡＧ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＧＡＣ丁ＣＡ　ＧＣＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣ７０ 丁　ＧＣＡ　ＧＣＡ　ＡＧＣＴＴＴ　ＴＣＡ　ＧＧＡ　ＭＣ２１４ＳｅｒＧｉｎ ＰｒｏＧｌｙＡｓｐＳｅｒＡｉａＴｈｒＴｙｒｐｈｅＣｙｓＡ、１ａＩｕａ５ｅ ｒｐｈｅＳｅｒＧｌｙＡＳｎＦＩＧ、　３ Ｔ−ＣＥＬＬ　ＲＥＣＥＰＴＯＲＣＨＩＭＥＲＡＩＬε旧３ ＢＥＴＡ　ＡＬＰＨＡ ＦＩＧ、　４ａ ＥＴ１８３ ＦＩＧ、　４ｂ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ 要約書 可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプター 可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプター、該可溶性−重鎖Ｔ細胞レセプターをコードする 核酸配列、とりわけＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を含有する発現ベクター、および 該発現ベクターを含有する宿主細胞。

国際調査報告 １−−１＾−Ｉ″ＰＩ”Ｔ／ＩＫＯ＋　／ｎｔｔａｚ

Claims (34)

【特許請求の範囲】
1. １．可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター。
2. ２．請求項１４に記載の核酸配列によりコードされた可溶性１本鎖Ｔ細胞レセプ ター。
3. ３．アミノ酸リンカーによりＴｉａサブユニット断片に結合したＴｉβサブユニ ツト断片を含む、請求項１に記載の可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター。
4. ４．アミノ酸リンカーによりＴｉδサブユニット断片に結合したＴｉγサブユニ ット断片を含む、請求項１に記載の可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター。
5. ５．Ｔｉβサブユニット断片がＴｉβサブユニットの可変領域であり、Ｔｉａサ ブユニット断片がＴｉａサブユニットの可変領域である、請求項３に記載の可溶 性一本鎖Ｔ細胞レセプター。
6. ６．Ｔｉβ可変領域のカルボキシ末端がアミノ酸リンカーによりＴｉａ可変領域 のアミノ酸末端に結合している、請求項５に記載の可溶性一本領Ｔ細胞レセプタ ー。
7. ７．Ｔｉγサブユニット断片がＴｉγサブユニットの可変領域であり、Ｔｉδサ ブユニット断片がＴｉδサブユニットの可変領域である、請求項４に記載の可溶 性一本鎖Ｔ細胞レセプター。
8. ８．生物学的に活性である、請求項１に記載の可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター。
9. ９．水溶液に可溶性である、請求項１に記載の可溶性一本鎖Ｔ軸胞レセプター。
10. １０．誘導体化したものである、請求項１に記載の可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプタ ー。
11. １１．ラジオアイソトープで標識することにより誘導体化したものである、請求 項１０に記載の可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター。
12. １２．毒素に結合することにより誘導体化したものである、請求項１０に記載の 可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター。
13. １３．哺乳動物由来のＴリンパ球の表面上に存在するＴ細胞レセプターにより結 合される少なくとも１つの抗原に結合する、請求項１に記載の可溶性一本鎖Ｔ細 胞レセプター。
14. １４．可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターをコードする核酸配列。
15. １５．ＤＮＡ配列である請求項１４に記載の核酸配列。
16. １６．可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターが、アミノ酸リンカーによりＴｉａサブユ ニット断片に結合したＴｉβサブユニット断片を含む、請求項１５に記載のＤＮ Ａ配列。
17. １７．可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターが、アミノ酸リンカーによりＴｉδサブユ ニット断片に結合したＴｉγサブユニット断片を含む、請求項１５に記載のＤＮ Ａ配列。
18. １８．Ｔｉβサブユニット断片がＴｉβサブユニットの可変領域であり、Ｔｉａ サブユニット断片がＴｉａサブユニットの可変領域である、請求項１６に記載の ＤＮＡ配列。
19. １９．Ｔｉγサブユニット断片がＴｉγサブユニットの可変領域であり、Ｔｉδ サブユニット断片がＴｉδサブユニットの可変領域である、請求項１７に記載の ＤＮＡ配列。
20. ２０．可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列を含有する発現ベ クター。
21. ２１．可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターをコードするＤＮＡ配列の複製および／ま たは発現を指令することができ該ＤＮＡ配列に機能的に結合した１または２以上 の制御ＤＮＡを含む、請求項２０に記載の発現ベクター。
22. ２２．可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターが、アミノ酸リンカーによりＴｉａサブユ ニット断片に結合したＴｉβサブユニット断片を含む、請求項２０に記載の発現 ベクター。
23. ２３．可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターが、アミノ酸リンカーによりＴｉδサブユ ニット断片に結合したＴｉγサブュニット断片を含む、請求項２０に記載の発現 ベクター。
24. ２４．請求項２０に記載の発現ベクターを含有する原核または真核宿主細胞。
25. ２５．請求項２１、２２または２３に記載の発現ベクターを含有する原核または 真核主細胞。
26. ２６．細菌細胞である請求項２４に記載の宿主細胞。
27. ２７．細菌細胞が大腸菌である請求項２６に記載の宿主細胞。
28. ２８．可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターを発現し得る条件下で請求項２４に記載の 宿主細胞を培養することを特徴とする、可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターの製造方 法。
29. ２９．治療学的有効量の請求項１に記載の可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターを哺乳 動物に投与することを特徴とする、自己免疫疾患の抑制方法。
30. ３０．治療学的有効量の請求項１に記載の可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターおよび 薬理学的に許容し得る担体を含むことを特徴とする、自己免疫疾患抑制用組成物 。
31. ３１．１または２以上の疎水性アミノ酸残基を親水性アミノ酸残基で置換するこ とにより修飾した、請求項１に記載の可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプター。
32. ３２．１または２以上の疎水性アミノ酸残基を親水性アミノ酸残基で置換するこ とにより可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターを修飾してある、請求項１５に記載のＤ ＮＡ配列。
33. ３３．１または２以上の疎水性アミノ酸残基を親水性アミノ酸残基で置換するこ とにより可溶性一本鎖Ｔ細胞レセプターを修飾してある、請求項２０に記載の発 現ベクター。
34. ３４．請求項３３に記載の発現ベクターを含有する原核または真核宿主細胞。