JPH05502037A - 可溶性のトランケートされたガンマ―インターフェロン受容体 - Google Patents

可溶性のトランケートされたガンマ―インターフェロン受容体

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JPH05502037A
JPH05502037A JP3508380A JP50838091A JPH05502037A JP H05502037 A JPH05502037 A JP H05502037A JP 3508380 A JP3508380 A JP 3508380A JP 50838091 A JP50838091 A JP 50838091A JP H05502037 A JPH05502037 A JP H05502037A
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ザヴォドニー,ポール・ジェイ
ナルラ,サットワント・ケイ
ペトロ,メアリー・イー
ランデル,ダニエル・ジェイ
フォセッタ,ジェームズ・ディー
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シェリング・コーポレーション
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    • C07K14/705Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、可溶性のトランケートされた(truncated)γ−インターフ ェロン受容体に関し、特にγ−インターフェロン受容体の可溶性細胞外部分に関 する。
技術背景 γ−インターフェロンは、本明細書において時折IFN−γと呼ばれるが、活性 化されたヘルパーT細胞によって産生されるサイトカインであり;B細胞、マク ロファージおよびT細胞などのいくつかの細胞タイプに直接的効果を持つ。それ は複数の効果を有し[トリンキーりら、Immunology Today、  6 :131−136 (1985)] ;その最も顕著な活性は、それが主要 組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスI及びクラスII遺伝子の発現を誘導す るという事である[ケリーら、J丁mmuno1..132:240−245  (1984): コリンズら、ケの発現は、抗原提示細胞の指標である。クラス II抗原の発現はマクロファージ、成熟型B細胞及びT細胞で見られ:また、γ −インターフェロンはこの発現を促進調節(upregulate)する事が知 られる。これに加え、γ−インターフェロンは、主要な抗原提示細胞ではない上 皮細胞、繊維芽細胞、アストロサイト、内皮細胞及び平滑筋などの細胞内におい て、クラス11抗原をコードする遺伝子の発現を誘導する事が知られている。こ れらのタイプの細胞が実際に抗原を提示するかは不明だが、これらの細胞タイプ におけるクラスII抗原の誘導は自己免疫疾患の進行と相関がある事が示されて いる[マサら、Proc、 Natl、 Acad、 Sci、 USA、旦」 :4219−4213 (1987)]。]γ−インターフェロはクラスII抗 原の主要な刺激物質であるため、この病態の発現に重要な役割を果たしているか も知れない。したがって、γ−インターフェロンあるいはその効果を阻害するも の、たとえば受容体を妨害するレベルで作用するものは、自己免疫疾患の治療に 多大な潜在的な価値と有用性を持つだろう。
ネズミにおけるγ−インターフェロンの効果を、それに対するモノクローナル抗 体を投与する事によって阻害する試みがなされてきた[グラウら、Proc、  Natl。
(治療)をヒトに適用する場合、モノクローナル抗体自体が、この治療効果を減 するであろう中和免疫応答を誘導するかも知れない可能性を、心にとどめておか なければならないだろう。
γ−インターフェロン受容体を発現している組み換え体クローンが知られている [たとえば、「ヒト・インターフェロン−γ受容体の分子クローニングと発現( Molecular Craning and Expression of  the Human Interferon−7Rece垂狽盾秩jJ、 オーグエット、G ら、(見、−45: 273−280 (1988)を参照 のこと];しかじ、これらは細胞質ぐ細胞内)ドメインと膜貫通ドメインを含む 、受容体全体を提供するものである。細胞質ドメインは細胞内のシグナル伝達を 担っているかもしれず、従って、探し出して、血流あるいは他の体液(たとえば 滑液)中のIFN−γに選択的に結合させるために、IFN−γアンタゴニスト をめる際には、余計なものである。更に、細胞質ドメインは免疫系が接触不能な 細胞内に、通常は隠されており:そのため、全長のIFN−γ受容体は、おそら くその細胞内ドメインのために抗原として作用し、中和されるのだろう。もしこ のようなことが起これば、そのような体液中に導入された場合に、INF−γは 除かれ、直ちにその効果が失われるだろう。従って、IFN−γに関連する副作 用を誘引する危険な(してIFN−γと拮抗する、IFN−γに対するアンタゴ ニストの必要性がある。
IFN−γ受容体をコードするDNAと、予想されるアミノ酸配列は、オーグエ ソトら(前出)によって開示されており、彼らは、リーダー配列がアミノ酸(残 基)1からアミノ酸14にあり、膜貫通配列がアミノ酸246から266(これ は、彼らによる番号である)にあると推定している。従って、IFN−γ受容体 の推定される細胞外領域は、アミノ酸15からアミノ酸245にあるとされ、そ の仮定される構造(アミノ酸残基1−14からなるリーダー配列を含み、また、 DNA配列をコードしている)は、配列番号(SEQ ID No):1に示さ れており、ここで、リーダー配列が−14から−1の番号を有し、推定される細 胞外領域が1から231の番号を有している。
以下の議論では、全ての番号付けは、ここで引用される文献の番号付けとは異な るかもしれないが、配列番号(SEQ ID No):lに従って行うものであ る。
IFN−γに特異的に結合する、効果的なrFN−γ受容体にこの配列がどの程 度必要であるかは定かではない。しかし、アミノ酸残基1−198は、効果的な 受容体を提供しないが[ストウーバーら、要旨A3−15、J、 Interf eron Re51、Vol、 95upp1.2 (1989年10月)]、 一方、アミノ酸残基12−231(位置12よりも若い番号から始まる配列を含 む)は、その要旨に従って、即ち、大腸菌中に生産されるような効果的な受容体 に、N末端もしくはC末端において6個のヒスチジン残基を提供することが知ら れている。これらのヒスチジン残基は、おそらくその免疫源性といった、この受 容体の基本的な性質を変化させることができるため、可溶性受容体を薬学的に用 いようとする場合、極めて不都合である。我々自身の研究は、アミノ酸残基6− 221は、効果的な受容体を提供することを示すが、他の配列もまた有効で有り 得ることをも示している。
発明の概要 以上のことから、本発明は、実質的に他のタンパク質を含まない天然型ヒトγ− インターフェロン受容体のグリコジル化された若しくはグリコジル化されていな い細胞外部分からなるγ−インターフェロンに対する可溶性受容体、及びその機 能的に等価な変種を提供する。機能的に等価な変種は、天然に存在する対立遺伝 子型のみならず、1つあるいはそれ以上(たとえば3つまでの)アミノ酸残基の 置換、欠失もしくは付加により生産され、なお実質的に同じ結合活性を維持して いる変種をも含む。この可溶性IFN−γ受容体は、好ましくは下記の配列番号 (SEQ ID No)+2で与えられる式を有し、ここにおいてYは、配列番 号(SEQ ID No):3で与えられる配列のカルボキシル末端(プロリン )から始めて1個あるいはそれ以上のアミノ酸残基の副配列であり: Zは、配列番号(SEQ ID No)+4で与えられる配列のアミノ末端(イ ソロイシン)から始めて1gAあるいはそれ以上のアミノ酸残基の副配列であり 。
そして、m、n及びpは独立にOまたは1である。
従って、この可溶性受容体は、IFN−γ受容体の細胞外部分であり、また、そ れはIFN−γのための受容体結合アッセイにおいて拮抗し、その細胞性受容体 へのIFN−γの結合に対するアンタゴニストである:即ち、それはIFN−γ について、IFN−γ受容体と拮抗する。更にそれは、IFN−γを測るための 結合アッセイに用いられ得る:下記の実施例4Dの方法は、IFN−γアンタゴ ニストの高処理能力を持つスクリーニングのための固相形式に適用することがで きる。
1及び2の位置にあるSer及びArg残基は、潜在的なリポソーム結合部位で あるAGCAGGによってコードされており[通常、AGGAGG:シャインと ダルガーノ、Proc、 Natl、Acad、 Sci、USA 71 :1 342)参照] (1974)(SEQ ID No 1参照)、また、その下 流には7−9塩基対の開始コドンがある。大部分の原核生物、たとえば大腸菌な どの細菌において、翻訳開始失敗の可能性を除くために、我々は6番目の位置の Gly残基で開始するか、あるいは12番目までの後ろの位置で開始するのが好 ましい。このようにして、アミノ酸残基12−221もしくは特定のもっと長い 配列、たとえばアミノ酸残基1及び/またはアミノ酸残基231までからなる、 効果的な可溶性IFN−γ受容体が提供されるであろう。
γ−インターフェロン受容体をコードする全長のcDNAクローン[たとえば、 オーグエットら、q見、旦互:273−280 (1988)(前出)参照]は 、λgtll胎盤cDNAライブラリーから、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて 直接単離された[フリートマンら、Nucl、 Ac1dsRes、16: 8 718 (1988)]。IFN−γ受容体の可溶性部分をコードするcDNA 部分はそこから単離され、それを発現するプラスミドに取り込まれた。
本発明の一つの好ましい態様において、可溶性IFN−γ受容体は上で定義した 通りであり、そこではnが1であり、Yの副配列は配列番号(SEQ IDNo ) ・5で与えられる配列である。
本発明の特に好ましい別の態様において、可溶性IFN−γFN−γ上で定義し た通りであり、そこではm、n及びpが全て1であり、また、Y及びZで表わさ れる配列は完全に存在している。即ち、可溶性IFN−γFN−γアミノ酸残基 1−231の配列を有している。
本発明の特に好ましい更に別の態様において、可溶性IFN−γFN−γ上で定 義した通りであり、そこではm及びnが1であり、pが0てあり、そしてYで表 わされる配列は完全に存在している:即ち、可溶性IFN−γFN−γアミノ酸 残基1−221の配列を有している。
本発明の特に好ましい更に別の態様において、可溶性IFN−γFN−γ上で定 義した通りであり、そこではmがOであり、nが1であり、pがOであり、そし てYで表わされる配列は+61Glyから存在している:即ち、可溶性IFN− γFN−γアミノ酸残基6−221の配列を有している。
本発明の特に好ましい更に別の態様において、可溶性IFN−γFN−γ上で定 義した通りであり、そこではmがOであり、n及びpが1であり、モしてYで表 わされる配列は+61にlyから存在し、Zで表わされる配列は完全に存在して いる:即ち、可溶性IFN−γFN−γアミノ酸残基6−231の配列を有して いる。
本発明の特に好ましい更に別の態様において、可溶性IFN−γFN−γ、mが 1であり、そのため、その配列が初めのセリン残基を付加的に含むことを除いて 、前出の2つの段落で定義した通りである。
図面の簡単な説明 図1は、可溶性IFN−γFN−γコードするDNA配列が挿入された、プラス ミドpDSR3を示している。
図2は、可溶性IFN−γFN−γ大腸菌て発現するためのプラスミドが、どの ようにして構築されたかを模式的に示している。
図3は、rFN−γのU937細胞上への結合と、大腸菌で生産された可溶性I FN−γ受容体タ受容体タンパ抗質表わしたものであり:その結合アッセイは、 実施例4Dで述べられるようにして行われた。
発明の説明 ここで引用される全ての引用文献は、そのままそっくり参考文献としてここに組 み込まれる。
原核生物内でIFN−γ受容体cDNAの細胞外ドメインをコードし、かつ生産 することのできる発現ベクターは、IFN−γ受容体の可溶性(細胞外)部分を 生産する原核生物クローンを得るために用いられた。使用可能な原核生物細胞は 、細菌、特に大腸菌を含み;大腸菌の多くの株は、本発明の実施に用いることが できる。しかし、好ましい大腸菌株は、可溶性のIFN−γ受容体を細胞周辺腔 から培養液中に逃れさせることができる、漏出変異株であり、それは大部分の他 の大腸菌タンパク質の存在によって引き起される困難さなしに、その培養液中か らrFN−γ受容体を容易に単離することができる。そのような細菌の生産及び 組み換え体異種タンパク質の製造におけるそれらの利用は、共に、出願中の07 /429.588号、1989年10月31日出願、において開示されており、 それはここに参考文献として組み込まれている。
Trp、lac、Ipp、λpLなど、いくつかの異なる大腸菌プロモーターを 、本発明の実施に用いることができる。これらのプロモーターは、細胞質内での 異種タンパク質を発現させる。細胞周辺腔への効率的な分泌には、大腸菌のOm pA、大腸菌のアルカリ性ホスファターゼ、大腸菌のりボタンバク質などのシグ ナルペプチド配列を使うことができる。大腸菌における、原核生物様式の発現の ための発現プラスミドは、強力なプロモーター、特に1pp−1acなどの隣接 した二重のプロモーターを含み、それに続いて異種タンパク質を細胞周辺腔へ輸 送することのできるシグナル配列をコードするDNA配列を含む。この最後のD NA配列は、大腸菌の外膜タンパク質であるOmpA由来のシグナル配列が好ま しい。このシグナル配列に続き、IFN−γ受容体cDNAのコード配列が位置 する。
このプラスミドを作製するために用いられた構築法の図式(図2で示されている )は、成熟型コード配列の開始部分に、一つの付加残基、すなわちセリンを導入 した。翻訳終結コドンは、予想される可溶性IFN−γFN−γコードする配列 の最後に導入された。これらの特性を含むプラスミドは、大腸菌突然変異株(た とえば受託番号第53956でATCCから入手可能な株)を形質転換するため に用いた時、OmpAシグナル配列に続いて可溶性IFN−γFN−γ配列を含 む融合タンパク質を生産する。この融合タンパク質は、更に細胞周辺において処 理され、成熟型の可溶性IFN−γFN−γ生じ、これが培養液中に漏出する。
利用可能な真核生物細胞系統は、たとえばCO37、N5−1及びCHO細胞な どの哺乳動物細胞系統、並びに酵母細胞を含み:これに加えて、たとえばポンビ ックス・そり(Bombyx mori)あるいはスポドブテラ・フルジノく一 ダ(Spodoptera frugiperda)などの、昆虫の発現系を用 いることもできる。
本発明を実証するために、U937細胞が、γ−インターフェロン受容体の簡便 な供給源として用いられたが、しかし、ここで述べる可溶性受容体は、もちろん これらの受容体を有するいずれの細胞に対してもIFN−γの結合を阻害するだ ろう。そのような細胞は、たとえばB細胞、T細胞、好酸球、平滑筋細胞、前骨 髄球、マクロファージ、赤血球、単球、顆粒球などを含む。
榎製 下記の実施例3は、大腸菌からの可溶性IFN−γFN−γ精製を説明するもの であるが、その方法は、真核生物細胞、とりわけ哺乳動物細胞及び酵母細胞など の、他の材料からの受容体の精製にも適用可能である。
制限酵素は、ニュー・イングランド・バイオラボ社(New England  Biolabs)、ビバリー、MAから購入したものである。サーマス・アクア ティカス(Thermusaquaticus) D N Aポリメラーゼ及び 10X!衝液は、ストラタジーン社(Stratagene) 、ラホヤ、CA から購入したものである。2本鎖プラスミドDNA塩基配列決定は、ユナイテッ ド・ステーブ・バイオケミカル社(U口1ted 5tates Bioche mical) 、クリーブランド、OHのンーケネース・/く−ジョン2.0を 用いて行われた。λgtllヒト胎ficDNAライブラリーはクロンテ・ンク 社(C1ontech) 、バク・アルド、CAから購入したものである。
2、 合成オリゴヌクレオチド 下記の合成オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ(Appli edBiosystems)社のDNAシンセサイザー・モデル380Aを用い 、標準的な方法によって合成された: AB697: 配列番号(SEQ ID Ne)=6参照:A3758: 配列 番号(SEQ ID No)+7参照:AB759 配列番号(SEQ ID  No):3参照。
AB812+ 配列番号(SEQ ID No):9参照:AB813: 配列 番号(SEQ ID No):io参照。
AB870JF:配列番号(SEQ ID No):11参照:AB871JF :配列番号(SEQ ID No):12参照3、ポリメラーゼ連鎖反応法(P CR)は、前述の通りに行われた[フリートマンら、Nucl ^cidsRe s、(1988)、16:8718]。
4、ヒトIFN−γは、実施例4Aの方法に従って精製するか、あるいは商業的 に入手可能であり、また、それに対する抗体も商業的に入手可能である。たとえ ば、ゲンザイム社(Genzyme Corp、 ) (ボストン、MA)は、 コードHG−IFNで、組み換え体ヒトIFN−γ(純度99%)を提供してお り、また、ウェスタン・プロッティングのために、コードIP−500で、ウサ ギ・ポリクローナル抗−ヒトIFN−γも提供している。
IFN−γ受容体cDNA配列の5°−及び3゛−非翻訳領域と同一の、SEQ  ID No 7及び8で与えられるオリゴヌクレオチドAB758及び759 は、基本的には前述のように、胎盤cDNAライブラリー・ファージ溶解液を使 ったPCRにおいて用いられた[フリートマンら、Nucl、 Ac1ds R es、 (198ライブロック(GRI、エセックス、UK)を用い、以下の条 件:即ち、95℃、2分間の変性、50℃、2分間のプライマー・アニーリング 、72℃で2分間の鎖伸長反応を全て30サイクル行い、最終サイクルの伸長反 応を72°Cで9分間行う条件で行われた。PCR産物は1%アガロースケル中 で電気泳動され、完全長のIFN−γ受容体コード領域に対応する約1.5kb の主バンドが、臭化エチジウムを用いた染色により可視化され、電気溶出により 単離された。その断片が確かに目的のものであることは、5゛ −プライマーと して配列番号(SEQID No) ・7で与えられるオリゴマーA3758と 、IFN−γ受容体の細胞内領域にある配列に対応する内部ブラマーとして、配 列番号(SEQ IDNo)+6で与えられるAB697を用いた2回目のPC Rを行い、約1.2kbの断片が生ずることによって確認された。
Pstl(5°)及び5all(3’)制限酵素部位は、上述のように、PCR において配列番号(SEQ ID No)+9及び10で与えられるオリゴマー AB812及びAB813を用いて、1.5kbの完全長のIFN−γ受容体断 片上に導入された。その結果生じた断片は単離され、PstI及び5alIで切 断され、CO37細胞で発現するためにPstI/5alI切断したpDSRS プラスミド(ATCC受託番号68232)(図1)にライゲーションされた。
その結果得られたライゲーション混合液は、コンピテント大腸菌294(大腸菌 ゲネティック・ストック・センター、生物学科、イエール大学、私書箱6666 、ニューヘブン、CT 06511−7444から容易に入手可能である)を形 質転換するために用いられた。
得られたクローンの内14個から、アルカリ溶解法[バーンボイムとドーリ−1 9^rapid alkaline extraction proceclu re for screening recombinan煤@plasIll id DNA”、IJucl、^cidsRes、、7:1513 (1978)]に よって単離されたプラスミドDNAが制限酵素切断分析及びPCHによって分析 され、調べられた。
7つのクローンが1.5kbのrFN−γ受容体断片を含んでいた。これら7つ のクローンの内、6つからのDNAを塩化セシウム/臭化エチジウム勾配遠心法 [マニアテイスら、”1lolecular Cloning: A Labo ratory Manual−、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ −、コールド・スプリング・ハーバ−1NY]により精製し、基本的に述べられ ているように[マッカチャンとパガー)、”Enhancement of t he 1nfectivity of 51m1an Virus 40 De oxyribonucleic@Ac1d wit h Diethylamino−ethyl−Dextran”、J、 Nat l、 Cancer In5t、、 41 : 351−3T 6 (1968)コ、DEAE−デキストラン法によってC087細胞(5μg DNA/100mM ディンシュ)に対し、一過的にトランスフェクトした。3 7°Cで60−72時間生育させた後、細胞を穏やかなトリプシン処理によって 採取し、領 02%のアジ化ナトリウムを含むRPMI培地に、1×107細胞 /m1となるように再懸濁し、4℃で保存した。次にそれらは、下記の実施例4 で述べる技術を用いて、125■−標識したIFN−γの特異的結合によって、 IFN−γ受容体の発現について調べられた。
3つのクローンが+24)−標識したγ−インターフェロンの特異的結合の上昇 を示した(下記の表I参照)。3つのクローン全て由来のプラスミドDNAは、 ジデオキシ・チェーン・ターミネーノヨン法[サンガーら、”DNA Sequ encing with Chain−terminating Inhibi tors”、Proc、 Natl、^cad、 Sci、 USA、74.5 S 63−6567 (1977)]によって塩基配列決定され:細胞外ドメインの 配列は、発表されている配列と同一であった[オーグエットら、前出]。
cDNAライブラリーから単離され、γ−インターフェロン受容体をコードする DNA断片を用いて、原核細胞における発現プラスミドに可溶性ドメインをクロ ーニングするための、2つの部位を導入するためにプライマーが作製された。
配列番号(SEo 10 NO)+12で与えられるプライマーAB870JF はそのDNAのアミノ末端の近傍にH4ndlTI制限酵素部位を導入するため に作られ(これは位置6でのGlyになるだろう);また、配列番号(SEQl o No)+13で与えられるプライマーA、B871JFは、その分子の可溶 性ドメインのみを単離、及び定義するために役立つであろうBamHI制限酵素 部位及び5TOPコドンを導入するために作られた。(これらのプライマーは、 rFN−γ受容体からそのリーダー配列:即ち、リーダー配列及び膜貫通領域の 間のポリペプチド配列を除いた、可溶性ドメインを単離、定義するものである。
)PCR技術を用いることによって、(完全長の受容体をコードする)DNA断 片及びプライマーが、下記の反応混合液 即ち、10100p l e プライ マー、25ng DNA、10mM dNTPs、1.Oμl TAQポリメリ ンセ緩衝液及び、2単位のTAQポリメラーゼを含む反応混合液に混合された。
この系は、反応液の総容量100μlにおいて、アニーリング、変性及び合成を 30サイクル行うように設定された。PCR後、DNAは1%アガロースゲルで 分離され、γ−インターフェロン受容体をコードする800bpの断片が、臭化 エチジウムを用いた染色によって可視化され、アガロースから単離された。
プラスミドp830−1 (p INI I r、OmpAリーダー) [D  ランゾルら、″Cytoplasmic and Periplasmic E xpression of a Hjgh Ba5ic Prote奄氏AHu m an Interleukin 4. in E、 coli” 、J、 In dust、 Microbiol、、vol、4 (198X)、 及び請求により、DNAX リサーチ・インスティテユート・オン・モレキュラ ー・アンド・セルラー・バイオロジー社、901 カルフォルニア・アベニュー 、バク・アルド、CA 94304−1104のR,カステラインから入手する ことができる]は、HindI I r及びBamHI制限酵素部位を含み、そ れらは、以下のようにしてOpmAリーダーの下流に、読み枠を合わせた状態で IFN−γ受容体をクローニングするために用いられた:即ち、20Mgのプラ スミドDNAを50単位のHlndl I I制限酵素で切断し、次に40単位 のBamHI制限酵素で切断した。切断後、この制限酵素切断断片の混合液は0 65%アガロースゲルで泳動されニブラスミドの骨格を表す7.5kbの断片が 単離された。
適当な分泌シグナルをコードする、他のいずれのプラスミドを代わりに用いるこ とも可能である。
プラスミド骨格を表すこの7.5kb断片(0,1dg)及びγ−インターフェ ロン受容体をコードする800kb断片を、ATP、T4 DNAリガーゼ(1 00単位)及びジチオスレイトールを含む40μ2の混合液中で、16℃、14 時間ライゲーションした。次に、この産物の半分をCaCl2法で調製した大腸 1 (K12)294 (大腸菌ゲネティック・ストック・センター、生物学科 、イエール大学、私書箱6666、ニューヘブン、CT 06511−7444 から容易に入手可能である)の形質転換に用いた。形質転換由来の混合液は、ア ンピシリンプレート上にまかれ、30℃で16−24時間インキュベートされた 。次に、いくつかのコロニーが採取され発酵され、そしてDNAが単離され、上 述の酵素(H4nd r I L BamHI)で切断することによって分析さ れ、そしてクローンpJFR105−6が選択された。
pJFR105−6クローンは、OmpAの下流に挿入され、lpp/lacプ ロモーターの制御下にある断片を有する。このプラスミドは、pBR322由来 であり、発現がイソプロピル−チオ−β−ガラクトシド(IPTG)で誘導でき るように、LAC−I遺伝子を持っている。
実施例3 大腸菌からの、可溶性ヒトγ−インターフェロン受容体の精製ヒトI FN−γ受容体の細胞外ドメインは、プラスミドpJFR105−6を持つ大腸 菌から精製された。細胞は、M9−カザミノ酸培地[IXM9 最少塩(ギブ: l BRL No、M29800B)、3%(w/v)カザミノ酸、2g/lグ ルコース、O,1g/lチアミン及び領 2g/I硫酸マ硫酸マグネシュムコ℃ で、Asao=1. Qとなるまで培養された。IPTGは、0.5mMとなる ように添加され、発酵は30°Cで一夜続けられた(最終培養液 Asao”3 ゜5)。12リツトルの培養液から馴化培地が回収され、その後、遠心により清 澄された。清澄された上清は、5%トリクロル酢酸(TCA)となるように調整 され、4℃で60分間装(ことによってタンパク質が沈澱させられた。不溶性画 分が10.OOOxgの遠心で回収され、再び可溶化するために120m1の2 00mMトリス(pH8)に再懸濁された。4℃で60分間インキュベーション した後、再可溶化された画分由来の残さを遠心で回収した。上清を4M尿素、2 0mMトリス(pH8)に調整し、4℃で30分間インキュベーションし、その 後20mMトリス(pH8) 、4M尿素緩衝液で平衡化したDEAEセファデ ックス8・ファスト・フロー・カラム(ファルマシア社 No、17−0709  01)にかけた。次にこのカラムは、同じトリス/尿素緩衝液中の、O−0, 3M塩化ナトリウム勾配によって溶出された。可溶性のヒトIFN−γ受容体の 細胞外ドメインは、約0.18M NaC1で溶出した。可溶性受容体をまとめ たものは、20mMトリス(pH8)に対して透析され、20mMトリスで平衡 化した5mlのIFN−γ−アフィゲル 10カラムにかけられた。[製造者に よって推奨される方法に従って、ヒト1FN−γがアフィゲル 10(バイオラ ッド社、カタログ番号153−6046)に共有結合で連結された。このアフィ ニティー樹脂は、1mlの支持体樹脂当たり4mgのIFN−γを含んでいた。
]このカラムは、10m1の0.2M Na、CIを含む200mMトリス(p H8)及び、続いて0.5M Na、CIを含む200mMトリス(pH8)で 洗浄された。
その後、可溶性受容体は、200mM炭酸ナトリウム緩衝液、pH10,3,0 ゜5M NaClで溶出された。その両分は中和され、プールされた後、20m Mリン酸ナトリウム、pH7,5に対して透析された。
この方法により、12リツトルの発酵当たり、07から1mgの可溶性IFN− γ受容体が得られた。しかし、約50%の可溶性IFN−γ受容体はTCA不溶 性画分に存在した。この物質は、変性し、再び活性のあるタンパク質を生ずるた めに再編成する事ができるだろう。
プラスミドpGIF4−137 (細菌リポタンパク質(Ipp)プロモーター 及びヒトγ−インターフェロン遺伝子(成熟型タンパク質のアミノ酸4−137 )をコードする、pBR322系の発現ベクター)を持つ大腸菌294は、修飾 GC培地(20g/Iグリセロール、30 g/ Iカザミノ酸(Di fco ) 、20g/I酵母抽出物(Dirco)、5g/l KH2PO,及びIg /l Mg5o4・7H20)中、37℃で培養された。A660が7−10と なったところで、細胞を採取し、超音波破砕によって溶解した。次に、無細胞不 溶性画分は遠心によって単離され、20mMトリス(pH8) 、6M塩塩酸グ アノノンよび5mMノ千オスレイトールに再懸濁され、56℃で30分間熱する ことにより再び可溶化された。
この再可溶化された両分は、次に室温で20mMトリス(pH8)、6M塩塩酸 グアノノンよって平衡化された3X90cmのセプランル200−3FRカラム (ファルマノア AB)にかけられた。分画後、(たとえば、ウェスタン・プロ ット分析で検出されるような)γ−インターフェロンを含む画分はまとめられ、 10 m M N H40A、 c (p H7)で120倍に希釈され、4℃ で一夜混合された。SP−セファデックス3樹脂(ノグマ・ケミカル社)(20 mMトリス、pH8中で、1:1のスラリー10m1)がこの試料に添加され、 4℃て60分間混合された。樹脂を濾過して除き、10mM NH,OAc ( pH7)で洗い、精製されたγ−インターフェロンが1mMNaClで溶出され た。このγ−インターフェロン画分の純度は、SDSポリアクリルアミドケル電 気泳動によって示されるように、95%以上であった。
B、ヒトγ−インターフェロンの標識 125I標識したヒトγ−インターフェロンは、供給者によって述べられた方法 に従い、ポルトン・ハンター試薬にューイングランド・ヌクレアー)を用いて調 製された(標識試薬は、pH8の20mMリン酸ナトリウム中に70μ/mlの γ−インターフェロンを含む)。最終反応混合液は透析によって脱塩され、21 体タンパク質から重合したγ−インターフェロンを分離するために、PBS及び 0. 2%ゼラチンで平衡化したlX24cmのセファデックスG75Rカラム にかけられた。50Ci/mMに標識され、まとめられたγ−インターフェロン は、使用するまで4℃で保存された。
C1大腸菌を用いた試料の調製 プラスミドpJFR1,05−6で形質転換した大腸菌7321 (ATCC受 託番号53956)は、37℃でAaao=1まで栄養培地で培養された。次に この培養は、0.1mMのI PTGで誘導され、37℃で3時間培養が続けら れた。
誘導された培養由来の上清は、上述の結合アッセイを用いて、可溶性IFN−γ 受容体の発現が調べられた。
D、結合アッセイ U−937細胞(ATCCカタログ番号CRL1593)は、5%ツメチル・ス ルホキシド、95%ウシ胎児血清凍結保存品から、あらかじめ保温しておいたR PM11640培地(ハゼルトン・バイオロジクス社)に接種及び培養され、3 7°CにおいてlXl0’細胞/mlを越えない細胞濃度まで培養が進められた 。
細胞は、使用直前に遠心により回収され、0.02%アノ化ナトリウムを含むR PM11640培地に、1.25X10’細胞/mlとなるように再懸濁され、 氷上で保存された。これに続く全ての方法は4°Cて行われ。
受容体結合アッセイは以下のようにして行われた:1アッセイあたり、1.25 X10’のU937細胞が用いられた。(それぞれのアッセイが、図3の1点を 与えた。)+2’I IFN−γは、10.000Cpm相当で添加された。( 可溶性受容体の遺伝子を発現する)プラスミドT892−5Bで形質転換された 細胞の培養由来の上清は、0から100m1まで容量を増加させながら添加され た。このアッセイには、3つの構成成分が存在した:U−937細胞、125■ −標識したIFN−γ及び可溶性rFN−γ受容体を含む試料である。これら3 つの構成成分のうち2つを含む混合液は、4°Cで30分間インキュベーション された。その後、3番目の構成成分が添加され、46Cで120分間インキュベ ーションが継続された。細胞はオイル[150μmのジオクチル・フタル酸(ア ルドリッチ・ケミカル社)及びジブチル・フタル酸(イーストマン・コダック社 )の1:1混合液]を通して遠心された。この遠心管は急速凍結され、細胞沈澱 物がそれぞれの管の底から切り出され、そしてこの沈澱物についた放射活性がγ −カウンターで測定された。
例として、上述の方法を実施する方法は以下のものである。
可溶性受容体を含むと思われる馴化培地の希釈液が、(50μlのRPMI培地 を含む)96ウエルのマイクロタイター・プレートのウェルに加えられた。
(50μmあたり約50.000cpmの)標識されたγ−インターフェロンが それぞれのウェルに添加され、続いて100μlのU−937細胞懸濁液(1゜ 25X107細胞/m1)が添加された。4℃で2時間インキュベーションした 後、それぞれの混合液は、150μmのジオクチル・フタル酸ニジブチル・フタ ル酸(1: 1)を含む0.4mlマイクロ試験管(バイオ−ラッド)にピペッ トで添加された。このアッセイ試験管はスイング・バケット・ローターで遠心さ れ、液体窒素で凍結され、そして(オイル層によって反応液から分離され、凍結 した細胞沈澱物を含む)試験管の先端が切りとられ、ガンマ・カウンターによる 放射活性の分析がなされた。U−937細胞に対するγ−インターフェロンの結 合を阻害できる培地画分は、可溶性IFN−γ受容体を含むとして同定された。
その結果は、表Iに示されている。
I T884−5 1832.8 129.8 1703.01’ 7884− 5 1560.5 77.8 1482.72 T886−5 1.985.0  150.4 1834.62’ T886−5 2404.6 197.6  2207.03 T886−6 2525.9 230.9 2295.03’  T886−6 2092.8 69.8 2023.04 インサートなし  110.7 136.8 04゛ インサートなし 159.4 160.0  05 DNA無添加 125.4 184.4 0(1) 0.1Mg/mlの 非標識IFN−rに結合した”5r IFN−7CpmO(2) 10μg/m lの非標識IFN−7に結合したl2SI IFN−7CpmO(3)特異的結 合=(1)−(2) 図3は、U937細胞状の完全なγ−インターフェロン受容体とγ−インターフ ェロンとの結合が、本発明の可溶性γ−インターフェロン受容体とγ−インター フェロンとの結合と比較された実験の結果を示している。この受容体結合アッセ イでは、U937細胞上のγ−インターフェロン受容体への、″5■−標識した γ−インターフェロンの結合を妨害する際に、大腸菌で生産された可溶性γ−イ ンターフェロン受容体が、投与量依存的に拮抗した。
これらのデータは、可溶性受容体が、γ−インターフェロンの細胞性受容体への 結合の拮抗阻害剤であることを示している。この拮抗阻害を用いた、実験室での 試験法(たとえばスクリーニングアッセイ)において、rFN−γあるいはその 可溶性受容体に、シグナル、たとえば放射性標識、あるいは化学的標識、とりわ け蛍光標識を生じ得る標識を付けることができる。更に、この拮抗阻害によって 、本発明の可溶性γ−インターフェロン受容体は、慢性関節リューマチ、多発性 硬化症、ンヨーグレン症候群及び紅班性狼癒などの、自己免疫疾患の治療におけ る、治療だめの使用法をも発見すると思われる。
本発明の可溶性IFN−γ受容体は、薬学的組成物として投与することがてきる 。そのような組成物は、治療上有効な量の本発明の可溶性受容体及び薬学的担体 あるいは賦形剤を含む。薬学的担体は、本発明の可溶性IFN−γ受容体を患者 に与えるために適当な、適合する、無毒性のいずれの物質であっても良い。たと えば、滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活性の固体が担体に含まれる ことができ、また薬学的に受容できるアジュバント(たとえば、緩衝剤、拡散剤 )もまた組み込まれることができる。一般に、このような薬剤の非経口投与に有 用な組成物はよ(知られており、たとえlfRemington’ s Pha rmaceutical 5cienCeS、第14版(マソク・パブリッンン グ社、イーストン、PA 1980)を参照のこと。それ以外に、本発明の組成 物は、移植可能な薬剤投与システムによって、患者の体内に導入することができ :たとえばアークハートら、Ann、 Rev、 Pharmacol、 To xicol、vol、24、pgs、199−236 (1984)を参照のこ と。
本発明の可溶性IFN−γ受容体は、通常非経口で投与され、静脈内に投与され るのが好ましい。可溶性IFN−γ受容体は免疫原性ではないと期待されている が、従来からあるIV投与セットあるいは皮下のデポから、ゆっくりと投与され ることが好ましい。
非経口投与する場合、可溶性IFN−γ受容体は通常注射に適した投与単位の形 状で、薬学的に受容できる非経口投与賦形剤(たとえば、溶液、懸濁液あるいは 乳剤)とともに製剤されるだろう。そのような賦形剤は本来非毒性で、治療作用 のないものである。そのような賦形剤の例は、通常の生理食塩水、リンケル溶液 、デキストロース溶液及びハング溶液である。固定油及びエチルオレイン酸など の、非水性賦形剤も使うことができる。好ましい賦形剤は5%デキストロース/ 生理食塩水である。賦形剤は、等張性と化学的安定性を増強する物質、たとえば 緩衝剤及び防腐剤などの微量の添加物を含むことができる。可溶性のIFN−γ 受容体は、凝集物、分解産物及び混入タンパク質を実質的に含まない、精製され た形状で、5から500μg/ml、好ましくは20から250μg/mlの濃 度で製剤されることが好ましい。
可溶性IFN−γ受容体の投薬法の選択は、可溶性IFN−γ受容体の血清中の 交換率、自己免疫疾患の患者の血清IFN−γレベル、可溶性IFN−γ受容体 の可能な免疫原性、標的IFN−γへの接近のしやすさ、可溶性IFN−γ受容 体へのIFN−γの親和性に対する、細胞性受容体へのIFN−γの親和性など を含むいくつかの因子に依存する。
特定の状況に対する、本発明の組成物の適当な投与量の決定は、当業者にゆだね られている。通常、治療は最適投与量よりも少ない量から開始される。その後、 投与量はその状況下での至適効果に達するまで、少量ずつ増加される。もし必要 であれば、簡便化のため1日の総投与量を分割し、1日の間にその一部を投薬す ることができる。
可溶性IFN−γ受容体の投与量及び頻度は、患者の年齢、状況及び体格並びに 治療する症状の度合いなどの因子を考慮しながら、担当の医師の判断に従って調 節されるだろう。
投与法に従って、患者に与えられる可溶性IFN−γ受容体の看は、受容可能な レベルの副作用にあった最大量であることが好ましく:そのため与えられる量は 、治療する疾患の度合いに一部依存する。投与量は、1日当たり約0.1から5 00μg/kgが好ましく、−日当たり約1から50μg/kgであることがよ り好ましい。
典型的な推奨される投与法は、自己免疫疾患の症状軽減を果たすために、1日当 たり1μgから5mg、好ましくは1日当たり20μgから1mgを2回から4 回に分けて非経口投与する事である。
本発明の上述の態様の記載は、例証および説明のために示されたものである。
それらは、網羅的に記載するという意図をもってなされたものではなく、また、 本発明を開示された厳密な形式に限定する意図をもってなされたものでもなし1 し、また、明らかに多くの修飾及び変法は、上述の教示に鑑みて可能である。態 様(ま、本発明の原理とその実際的な適用を説明するために選ばれ、記載された のであり、そのため、当業者は、特別の使用に適するように、本発明のこうした 態様と修飾を適切に使用及び実施することができるだろう。本発明の範囲は、こ こに添付された請求の範囲によって定義されるものである。
配列表 配列番号(SEQ ID No)+1 配列の型二 対応するアミノ酸配列をもつDNA配列配列の長さ・ 735塩基 : 245アミノ酸残基鎖の数、 1本鎖 トポロジー・ 直線状 配列の種類: DNA分子及びコードされたタンパク質/ポリペプチド起源生物 名; ヒト 性質: γ−インターフェロンに対する可溶性受容体配列の特徴。
1から42: リーダー配列をコードするDNA43から735: ヒト成熟型 可溶性ガンマ−インターフェロン受容体をコードするDNA 配列: ATG GCr CTCCTCTrr C1’CCTA CCCCTr GrC ATG CAG GGT GTG 42后潤ff GCT GAG烏α℃N℃ヱ GωCO℃α袷α刀πCχλ■187α?r ACA CCA ACT AAT  Grr ACA ATr GAA TCCTAT MCATG AACα71 32ACCGrA GAG Gr入入AG AACTATGGr GTT AA G AAT TC入GAA TGGATT 222GAT GCCTGCA[A AT ATI’ TCr CAT CAT T/IT TGT AAT ATr  ’lff1 GAT 267απmλπ℃αλスTαλMAにズαスαスαゴ Nよa毛χに℃402配列番号(SEQ ID No):2 配列の型: アミノ酸配列 配列の長さ: 231アミノ酸残基 鎖の数、 1本鎖 トポロジー 直線状 配列の種類・ タンパク質/ポリペプチド起源生物名: ヒト 性質: γ−インターフェロンに対する可溶性受容体(リーダー配列を持たない ) (Xaa)n及び(Xaa)pにライては、それぞれ配列番号(SEQ IDN 0):3及び4を参照のこと。
配列: 配列番号(SEQ ID No)=3 配列ノ型: 配列番号(SEQ ID No):2+:おいて、(Xaa)nで 表わされたアミノ酸配列 配列の長さ= 11アミノ酸残基 鎖の数 1本鎖 トポロジー・ 直線状 配列の種類: ポリペプチド 起源生物名: ヒト 性質、 γ−インターフェロン可溶性受容体の第2から第12番目のアミノ酸残 基 配列 配列番号(SEQ ID No):4 配列ノ型: 配列番号(SEQ ID No):2において、(Xaa)pで′  表わされたアミノ酸配列 配列の長さ= 10アミノ酸残基 鎖の数: 1本鎖 トポロジー: 直線状 配列の種類: ポリペプチド 起源生物名: ヒト 性質: γ−インターフェロン可溶性受容体の第222から第231番目のアミ ノ酸残基 配列: 配列番号(SEQ ID No) :5配列の型: 配列番号(SEQ ID  No):2において、0:aa)nで表わされたアミノ酸配列の副配列 配列の長さ= 7アミノ酸残基 鎖の数・ 1本鎖 トポロジー・ 直線状 配列の種類: ポリペプチド 起源生物名: ヒト 性質: γ−インターフェロン可溶性受容体の位置N016から12のアミノ酸 残基 配列 配列番号(SEQ ID No):5 配列の型: AB697と名付けられた合成りNA配列配列の長さ、 23塩基 鎖の数: 1本鎖 トポロジm: 直線状 配列の種類: DNA配列 起源生物名: なし 性質+ IFN−γ受容体の細胞内領域にある配列の相補鎖に対応する、内部C AGACTGGTT ACTACT丁入入A GGT配列番号(SEQ 丁DN O)ニア 配列の型: A、B2S3と名付けられた合成りNA配列配列の長さ・ 20塩 基 鎖の数 1本鎖 トポロジー、 直線状 配列の種類 DNA配列 起源生物名、 なし 性質・ IFN−γ受容体cDNA配列の、5° −非翻訳領域内の配列に対応 配列二 CAGCGACCGT CGGTAGCAGC配列番号(SEQ ID No) :8 配列の型・ AB759と名付けられた合成りNA配列配列の長さ 20塩基 鎖の数: 1本鎖 トポロジー、 直線状 配列の種類: DNA配列 起源生物名、 なし 性質 IFN−γ受容体cDNA配列の、3′−非翻訳領域内の配列の相補鎖に 対応する、3′−プライマー 配列・ CTTCAAAGTT GGTGCAACTT配列番号(SEQ ID No) :9 配列の型: AB812と名付けられた合成りNA配列配列の長さ= 27塩基 鎖の数: 1本鎖 トポロジー、 直線状 配列の種類・ DNA配列 起源生物名 なし 性質:1.5kb完全長のIFN−γ受容体断片の末端にPstI制限酵素部位 を導入するためのオリゴマー 配列 CTATCTGCAG CGACCGTCGG TAGCAG(:配列番号(S EQ ID No):10配列の型: AB813と名付けられた合成りNA配 列配列の長さ 30塩基 鎖の数・ 1本鎖 トポロジー、 直線状 配列の種類: DNA配列 起源生物名、 なし 性質 l、5kb完全長のIFN−γ受容体断片の3゛ −末端に5all制限 酵素部位を導入するためのオリゴマー配列 GTATGTCGACTTCCAAAGTT GGTGCAACTT配列番号( SEQ ID No):11配列の型: A、B870JFと名付けられた合成 りNA配列配列の長さ: 39塩基 鎖の数 1本鎖 トポロン−直線状 配列の種類 DNA配列 起源生物名 なし 性質 可溶性IFN−γ受容体をコードするDNAのアミン末端にある、(位置 No、6の)グリシンに対応するコドンの近傍に、HindlTI制限酵素部位 を導入するための5゛ −プライマー配列: GCGCAAGCTT CTGGCACCGCGGATCTGGGG CCGT CCTCA配列番号(SEQ ID No):12配列の型 AB871JFと 名付けられた合成りNA配列配列の長さ= 39塩基 鎖の数、 1本鎖 トポロジm: 直線状 配列の種類: DNA配列 起源生物名: なし 性質: IFN−γ受容体の細胞外−細胞内/膜貫通連結部に、BamHI制限 酵素部位及び終始コドンを(即ち、位置231におけるグリシンの後に終始コド ンを)導入するための3゛−プライマー配列・ GGCGGATCCT TAACCTTTTA TACTGCTATT G触触 τG品と Δ 125I fj’ンz−IFlj9合蚤(Cpm)Q 要約書 可溶性の、トランケートされた(truncated)γ−インターフェロン受 容体、特にヒト受容体の可溶性細胞外ドメインが、それらをコードするDNA配 列及び、それらを生産する、形質転換された細胞系統とともに提供される。γ− インターフェロンの細胞性受容体への、γ−インターフェロンの結合を阻害する ために、そのような受容体を用いるための方法もまた提供される。
手続補正書 1、事件の表示 PCT/US91102618 2、発明の名称 可溶性のトランケートされたガンマ−インターフェロン受容体3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 名 称 シェリング・コーポレーション4、代理人 住 所 東京都千代田区大手町二丁目2番1号新大手町ビル 206区 5、補正の対象 (別紙) (1)請求の範囲を下記の通り補正する。
「 1、他のタンパク質を実質的に含まない、天然型ヒトIFN−γ膜貫通型細胞性 受容体の、グリコジル化された、若しくはグリコジル化されていない細胞外部分 からなり、配列番号(SEQ IDNo):2で与えられる式 : Yが、配列番号(SEQ ID No):5で与えられるアミノ酸の副配列であ り; Zが、配列番号(SEQ ID NO) コ4で与えられる配列のアミノ末端か ら始まる、1つあるいはそれ以上のアミノ酸の副配列であり;mおよびnがとも に1であり;そして pがOまたは1である〕 ヲ有する、γ−インターフェロン(IFN−γ)に対する可溶性受容体。
2、有効量の請求の範囲第1項の可溶性受容体と、薬学的に受容される担体ある いは賦形剤を含む、医薬組成物。
3、IFN−γに対する受容体を有する細胞へのIFN−γの結合を阻害する方 法であって:有効量の請求の範囲第1項の可溶性IFN−γ受容体を、IFN− γに対する受容体を有する細胞を含む培地に投与し;そして、 該可溶性受容体を細胞の受容体に対して拮抗させる、 段階を含む、上記方法。」 以上 補正書の翻訳文提出書 (特許法第184条の8) 平成 4年10月26日ム個

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 1.他のタンパク質を実質的に含まない、天然型ヒトIFN−γ膜貫通型細胞性 受容体の、グリコシル化された、若しくはグリコシル化されていない細胞外部分 からなる、γ−インターフェロン(IFN−γ)に対する可溶性受容体及び、機 能的に等価なその変種。
  2. 2.配列番号(SEQIDNO):2で与えられる式〔ここで: Yが、配列番号(SEQIDNO):3で与えられる配列のカルボキシル末端か ら始まる、1つあるいはそれ以上のアミノ酸の副配列であり;Zが、配列番号( SEQIDNO):4で与えられる配列のアミノ末端から始まる、1つあるいは それ以上のアミノ酸の副配列であり;m、n及びpが独立に0または1である〕 を有する、請求の範囲第1項記載の可溶性受容体。
  3. 3.m及びnがともに1であり、Yにおける副配列が配列番号(SEQIDNO ):5で与えられる、請求の範囲第2項記載の可溶性受容体。
  4. 4.m、n及びpが全て1で、Y及びZで表わされる配列が完全に存在する;即 ち、可溶性IFN−γ受容体がアミノ酸1−231の配列を有しているか;ある いは、 mが1、nが1、およびpが0であり、そしてYで表わされる配列が完全に存在 する;即ち、可溶性IFN−γ受容体がアミノ酸1−221の配列を有するか; あるいは、 mがO、nが1、およびpがOであり、そしてYで表わされる配列が(6)Gl yで始まる;即ち、可溶性IFN−γ受容体がアミノ酸6−221の配列を有す るか:あるいは、 mが0、n及びpがともに1であり、Yで表わされる配列が(6)Glyで始ま り、Zで表わされる配列が完全に存在する;即ち、可溶性IFN−γ受容体がア ミノ酸6−231の配列を有する、 請求の範囲第2項記載の可溶性受容体。
  5. 5.mが1であり、その配列が最初のセリン残基を含む、請求の範囲第2項記載 の可溶性受容体。
  6. 6.mが1、nが1でpが0であり、そしてYで表わされる配列が(6)Gly で始まる;即ち、可溶性IFN−γ受容体がアミノ酸Ser+6−221を有す る、請求の範囲第2項記載の可溶性受容体。
  7. 7.請求の範囲第1項のグリコシル化されていない可溶性受容体。
  8. 8.mが1、n及びpがともに1であり、またYで表わされる配列が(6)Gl yで始まり、Zで表わされる配列が完全に存在する;即ち、可溶性IFN−γ受 容体がアミノ酸Ser+6−231を有する、請求の範囲第2項記載の可溶性受 容体。
  9. 9.有効量の請求の範囲第1項の可溶性受容体と、薬学的に受容される担体ある いは賦形剤を含む、医薬組成物。
  10. 10.有効量の請求の範囲第2項の可溶性受容体と、薬学的に受容される担体あ るいは賦形剤を含む、医薬組成物。
  11. 11.プラスミドpJFR105−6。
  12. 12.IFN−γに対する受容体を有する細胞へのIFN−γの結合を阻害する 方法であって: 有効量の請求の範囲第1項の可溶性IFN−γ受容体を、IFN−γに対する受 容体を有する細胞を含む培地に投与し;そして、該可溶性受容体を細胞の受容体 に対して拮抗させる、段階を含む、上記方法。
  13. 13.IFN−γに対する受容体を有する細胞へのIFN−γの結合を阻害する 方法であって: 有効量の請求の範囲第2項の可溶性IFN−γ受容体を、IFN−γに対する受 容体を有する細胞を含む培地に投与し;そして、該可溶性受容体を細胞の受容体 に対して拮抗させる、段階を含む、上記方法。
JP3508380A 1990-04-24 1991-04-19 可溶性のトランケートされたガンマ―インターフェロン受容体 Pending JPH05502037A (ja)

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