JPH05502037A

JPH05502037A - 可溶性のトランケートされたガンマ―インターフェロン受容体

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Publication number: JPH05502037A
Application number: JP3508380A
Authority: JP
Inventors: ザヴォドニー，ポール・ジェイ; ナルラ，サットワント・ケイ; ペトロ，メアリー・イー; ランデル，ダニエル・ジェイ; フォセッタ，ジェームズ・ディー
Original assignee: シェリング・コーポレーション
Priority date: 1990-04-24
Filing date: 1991-04-19
Publication date: 1993-04-15
Also published as: NZ237916A; PT97445B; ATE112312T1; PT97445A; CN1056125A; CA2081309A1; ES2061240T3; DE69104356T2; ZA913043B; IE911355A1; AU657683B2; EP0528847B1; WO1991016431A1; DE69104356D1; AU7778991A; EP0528847A1; HUT62936A; IL97927A0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、可溶性のトランケートされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）γ−インターフェロン受容体に関し、特にγ−インターフェロン受容体の可溶性細胞外部分に関する。

技術背景 γ−インターフェロンは、本明細書において時折ＩＦＮ−γと呼ばれるが、活性化されたヘルパーＴ細胞によって産生されるサイトカインであり；Ｂ細胞、マクロファージおよびＴ細胞などのいくつかの細胞タイプに直接的効果を持つ。それは複数の効果を有し［トリンキーりら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ、　６　：１３１−１３６　（１９８５）］　；その最も顕著な活性は、それが主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩ遺伝子の発現を誘導するという事である［ケリーら、Ｊ丁ｍｍｕｎｏ１．．１３２：２４０−２４５　（１９８４）：　コリンズら、ケの発現は、抗原提示細胞の指標である。クラスＩＩ抗原の発現はマクロファージ、成熟型Ｂ細胞及びＴ細胞で見られ：また、γ −インターフェロンはこの発現を促進調節（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）する事が知られる。これに加え、γ−インターフェロンは、主要な抗原提示細胞ではない上皮細胞、繊維芽細胞、アストロサイト、内皮細胞及び平滑筋などの細胞内において、クラス１１抗原をコードする遺伝子の発現を誘導する事が知られている。これらのタイプの細胞が実際に抗原を提示するかは不明だが、これらの細胞タイプにおけるクラスＩＩ抗原の誘導は自己免疫疾患の進行と相関がある事が示されている［マサら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、旦」：４２１９−４２１３　（１９８７）］。］γ−インターフェロはクラスＩＩ抗原の主要な刺激物質であるため、この病態の発現に重要な役割を果たしているかも知れない。したがって、γ−インターフェロンあるいはその効果を阻害するもの、たとえば受容体を妨害するレベルで作用するものは、自己免疫疾患の治療に多大な潜在的な価値と有用性を持つだろう。

ネズミにおけるγ−インターフェロンの効果を、それに対するモノクローナル抗体を投与する事によって阻害する試みがなされてきた［グラウら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

（治療）をヒトに適用する場合、モノクローナル抗体自体が、この治療効果を減するであろう中和免疫応答を誘導するかも知れない可能性を、心にとどめておかなければならないだろう。

γ−インターフェロン受容体を発現している組み換え体クローンが知られている［たとえば、「ヒト・インターフェロン−γ受容体の分子クローニングと発現（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｒａｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−７Ｒｅｃｅ垂狽盾秩jＪ、オーグエット、Ｇ　ら、（見、−４５：　２７３−２８０　（１９８８）を参照のこと］；しかじ、これらは細胞質ぐ細胞内）ドメインと膜貫通ドメインを含む、受容体全体を提供するものである。細胞質ドメインは細胞内のシグナル伝達を担っているかもしれず、従って、探し出して、血流あるいは他の体液（たとえば滑液）中のＩＦＮ−γに選択的に結合させるために、ＩＦＮ−γアンタゴニストをめる際には、余計なものである。更に、細胞質ドメインは免疫系が接触不能な細胞内に、通常は隠されており：そのため、全長のＩＦＮ−γ受容体は、おそらくその細胞内ドメインのために抗原として作用し、中和されるのだろう。もしこのようなことが起これば、そのような体液中に導入された場合に、ＩＮＦ−γは除かれ、直ちにその効果が失われるだろう。従って、ＩＦＮ−γに関連する副作用を誘引する危険な（してＩＦＮ−γと拮抗する、ＩＦＮ−γに対するアンタゴニストの必要性がある。

ＩＦＮ−γ受容体をコードするＤＮＡと、予想されるアミノ酸配列は、オーグエソトら（前出）によって開示されており、彼らは、リーダー配列がアミノ酸（残基）１からアミノ酸１４にあり、膜貫通配列がアミノ酸２４６から２６６（これは、彼らによる番号である）にあると推定している。従って、ＩＦＮ−γ受容体の推定される細胞外領域は、アミノ酸１５からアミノ酸２４５にあるとされ、その仮定される構造（アミノ酸残基１−１４からなるリーダー配列を含み、また、ＤＮＡ配列をコードしている）は、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１に示されており、ここで、リーダー配列が−１４から−１の番号を有し、推定される細胞外領域が１から２３１の番号を有している。

以下の議論では、全ての番号付けは、ここで引用される文献の番号付けとは異なるかもしれないが、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：ｌに従って行うものである。

ＩＦＮ−γに特異的に結合する、効果的なｒＦＮ−γ受容体にこの配列がどの程度必要であるかは定かではない。しかし、アミノ酸残基１−１９８は、効果的な受容体を提供しないが［ストウーバーら、要旨Ａ３−１５、Ｊ、　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅ５１、Ｖｏｌ、　９５ｕｐｐ１．２　（１９８９年１０月）］、一方、アミノ酸残基１２−２３１（位置１２よりも若い番号から始まる配列を含む）は、その要旨に従って、即ち、大腸菌中に生産されるような効果的な受容体に、Ｎ末端もしくはＣ末端において６個のヒスチジン残基を提供することが知られている。これらのヒスチジン残基は、おそらくその免疫源性といった、この受容体の基本的な性質を変化させることができるため、可溶性受容体を薬学的に用いようとする場合、極めて不都合である。我々自身の研究は、アミノ酸残基６− ２２１は、効果的な受容体を提供することを示すが、他の配列もまた有効で有り得ることをも示している。

発明の概要以上のことから、本発明は、実質的に他のタンパク質を含まない天然型ヒトγ− インターフェロン受容体のグリコジル化された若しくはグリコジル化されていない細胞外部分からなるγ−インターフェロンに対する可溶性受容体、及びその機能的に等価な変種を提供する。機能的に等価な変種は、天然に存在する対立遺伝子型のみならず、１つあるいはそれ以上（たとえば３つまでの）アミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加により生産され、なお実質的に同じ結合活性を維持している変種をも含む。この可溶性ＩＦＮ−γ受容体は、好ましくは下記の配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＋２で与えられる式を有し、ここにおいてＹは、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：３で与えられる配列のカルボキシル末端（プロリン）から始めて１個あるいはそれ以上のアミノ酸残基の副配列であり：Ｚは、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＋４で与えられる配列のアミノ末端（イソロイシン）から始めて１ｇＡあるいはそれ以上のアミノ酸残基の副配列であり。

そして、ｍ、ｎ及びｐは独立にＯまたは１である。

従って、この可溶性受容体は、ＩＦＮ−γ受容体の細胞外部分であり、また、それはＩＦＮ−γのための受容体結合アッセイにおいて拮抗し、その細胞性受容体へのＩＦＮ−γの結合に対するアンタゴニストである：即ち、それはＩＦＮ−γ について、ＩＦＮ−γ受容体と拮抗する。更にそれは、ＩＦＮ−γを測るための結合アッセイに用いられ得る：下記の実施例４Ｄの方法は、ＩＦＮ−γアンタゴニストの高処理能力を持つスクリーニングのための固相形式に適用することができる。

１及び２の位置にあるＳｅｒ及びＡｒｇ残基は、潜在的なリポソーム結合部位であるＡＧＣＡＧＧによってコードされており［通常、ＡＧＧＡＧＧ：シャインとダルガーノ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７１　：１３４２）参照］　（１９７４）（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　１参照）、また、その下流には７−９塩基対の開始コドンがある。大部分の原核生物、たとえば大腸菌などの細菌において、翻訳開始失敗の可能性を除くために、我々は６番目の位置のＧｌｙ残基で開始するか、あるいは１２番目までの後ろの位置で開始するのが好ましい。このようにして、アミノ酸残基１２−２２１もしくは特定のもっと長い配列、たとえばアミノ酸残基１及び／またはアミノ酸残基２３１までからなる、効果的な可溶性ＩＦＮ−γ受容体が提供されるであろう。

γ−インターフェロン受容体をコードする全長のｃＤＮＡクローン［たとえば、オーグエットら、ｑ見、旦互：２７３−２８０　（１９８８）（前出）参照］は、λｇｔｌｌ胎盤ｃＤＮＡライブラリーから、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いて直接単離された［フリートマンら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１６：　８７１８　（１９８８）］。ＩＦＮ−γ受容体の可溶性部分をコードするｃＤＮＡ部分はそこから単離され、それを発現するプラスミドに取り込まれた。

本発明の一つの好ましい態様において、可溶性ＩＦＮ−γ受容体は上で定義した通りであり、そこではｎが１であり、Ｙの副配列は配列番号（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ）　・５で与えられる配列である。

本発明の特に好ましい別の態様において、可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γ上で定義した通りであり、そこではｍ、ｎ及びｐが全て１であり、また、Ｙ及びＺで表わされる配列は完全に存在している。即ち、可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γアミノ酸残基１−２３１の配列を有している。

本発明の特に好ましい更に別の態様において、可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γ上で定義した通りであり、そこではｍ及びｎが１であり、ｐが０てあり、そしてＹで表わされる配列は完全に存在している：即ち、可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γアミノ酸残基１−２２１の配列を有している。

本発明の特に好ましい更に別の態様において、可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γ上で定義した通りであり、そこではｍがＯであり、ｎが１であり、ｐがＯであり、そしてＹで表わされる配列は＋６１Ｇｌｙから存在している：即ち、可溶性ＩＦＮ− γＦＮ−γアミノ酸残基６−２２１の配列を有している。

本発明の特に好ましい更に別の態様において、可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γ上で定義した通りであり、そこではｍがＯであり、ｎ及びｐが１であり、モしてＹで表わされる配列は＋６１にｌｙから存在し、Ｚで表わされる配列は完全に存在している：即ち、可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γアミノ酸残基６−２３１の配列を有している。

本発明の特に好ましい更に別の態様において、可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γ、ｍが１であり、そのため、その配列が初めのセリン残基を付加的に含むことを除いて、前出の２つの段落で定義した通りである。

図面の簡単な説明図１は、可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γコードするＤＮＡ配列が挿入された、プラスミドｐＤＳＲ３を示している。

図２は、可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γ大腸菌て発現するためのプラスミドが、どのようにして構築されたかを模式的に示している。

図３は、ｒＦＮ−γのＵ９３７細胞上への結合と、大腸菌で生産された可溶性ＩＦＮ−γ受容体タ受容体タンパ抗質表わしたものであり：その結合アッセイは、実施例４Ｄで述べられるようにして行われた。

発明の説明ここで引用される全ての引用文献は、そのままそっくり参考文献としてここに組み込まれる。

原核生物内でＩＦＮ−γ受容体ｃＤＮＡの細胞外ドメインをコードし、かつ生産することのできる発現ベクターは、ＩＦＮ−γ受容体の可溶性（細胞外）部分を生産する原核生物クローンを得るために用いられた。使用可能な原核生物細胞は、細菌、特に大腸菌を含み；大腸菌の多くの株は、本発明の実施に用いることができる。しかし、好ましい大腸菌株は、可溶性のＩＦＮ−γ受容体を細胞周辺腔から培養液中に逃れさせることができる、漏出変異株であり、それは大部分の他の大腸菌タンパク質の存在によって引き起される困難さなしに、その培養液中からｒＦＮ−γ受容体を容易に単離することができる。そのような細菌の生産及び組み換え体異種タンパク質の製造におけるそれらの利用は、共に、出願中の０７／４２９．５８８号、１９８９年１０月３１日出願、において開示されており、それはここに参考文献として組み込まれている。

Ｔｒｐ、ｌａｃ、Ｉｐｐ、λｐＬなど、いくつかの異なる大腸菌プロモーターを、本発明の実施に用いることができる。これらのプロモーターは、細胞質内での異種タンパク質を発現させる。細胞周辺腔への効率的な分泌には、大腸菌のＯｍｐＡ、大腸菌のアルカリ性ホスファターゼ、大腸菌のりボタンバク質などのシグナルペプチド配列を使うことができる。大腸菌における、原核生物様式の発現のための発現プラスミドは、強力なプロモーター、特に１ｐｐ−１ａｃなどの隣接した二重のプロモーターを含み、それに続いて異種タンパク質を細胞周辺腔へ輸送することのできるシグナル配列をコードするＤＮＡ配列を含む。この最後のＤＮＡ配列は、大腸菌の外膜タンパク質であるＯｍｐＡ由来のシグナル配列が好ましい。このシグナル配列に続き、ＩＦＮ−γ受容体ｃＤＮＡのコード配列が位置する。

このプラスミドを作製するために用いられた構築法の図式（図２で示されている）は、成熟型コード配列の開始部分に、一つの付加残基、すなわちセリンを導入した。翻訳終結コドンは、予想される可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γコードする配列の最後に導入された。これらの特性を含むプラスミドは、大腸菌突然変異株（たとえば受託番号第５３９５６でＡＴＣＣから入手可能な株）を形質転換するために用いた時、ＯｍｐＡシグナル配列に続いて可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γ配列を含む融合タンパク質を生産する。この融合タンパク質は、更に細胞周辺において処理され、成熟型の可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γ生じ、これが培養液中に漏出する。

利用可能な真核生物細胞系統は、たとえばＣＯ３７、Ｎ５−１及びＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞系統、並びに酵母細胞を含み：これに加えて、たとえばポンビックス・そり（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ）あるいはスポドブテラ・フルジノく一ダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）などの、昆虫の発現系を用いることもできる。

本発明を実証するために、Ｕ９３７細胞が、γ−インターフェロン受容体の簡便な供給源として用いられたが、しかし、ここで述べる可溶性受容体は、もちろんこれらの受容体を有するいずれの細胞に対してもＩＦＮ−γの結合を阻害するだろう。そのような細胞は、たとえばＢ細胞、Ｔ細胞、好酸球、平滑筋細胞、前骨髄球、マクロファージ、赤血球、単球、顆粒球などを含む。

榎製下記の実施例３は、大腸菌からの可溶性ＩＦＮ−γＦＮ−γ精製を説明するものであるが、その方法は、真核生物細胞、とりわけ哺乳動物細胞及び酵母細胞などの、他の材料からの受容体の精製にも適用可能である。

制限酵素は、ニュー・イングランド・バイオラボ社（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、ビバリー、ＭＡから購入したものである。サーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼ及び１０Ｘ！衝液は、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　、ラホヤ、ＣＡから購入したものである。２本鎖プラスミドＤＮＡ塩基配列決定は、ユナイテッド・ステーブ・バイオケミカル社（Ｕ口１ｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）　、クリーブランド、ＯＨのンーケネース・／く−ジョン２．０を用いて行われた。λｇｔｌｌヒト胎ｆｉｃＤＮＡライブラリーはクロンテ・ンク社（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ）　、バク・アルド、ＣＡから購入したものである。

２、　合成オリゴヌクレオチド下記の合成オリゴヌクレオチドは、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社のＤＮＡシンセサイザー・モデル３８０Ａを用い、標準的な方法によって合成された：ＡＢ６９７：　配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｅ）＝６参照：Ａ３７５８：　配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＋７参照：ＡＢ７５９　配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：３参照。

ＡＢ８１２＋　配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：９参照：ＡＢ８１３：　配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：ｉｏ参照。

ＡＢ８７０ＪＦ：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１１参照：ＡＢ８７１ＪＦ：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１２参照３、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）は、前述の通りに行われた［フリートマンら、Ｎｕｃｌ　＾ｃｉｄｓＲｅｓ、（１９８８）、１６：８７１８］。

４、ヒトＩＦＮ−γは、実施例４Ａの方法に従って精製するか、あるいは商業的に入手可能であり、また、それに対する抗体も商業的に入手可能である。たとえば、ゲンザイム社（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、　）　（ボストン、ＭＡ）は、コードＨＧ−ＩＦＮで、組み換え体ヒトＩＦＮ−γ（純度９９％）を提供しており、また、ウェスタン・プロッティングのために、コードＩＰ−５００で、ウサギ・ポリクローナル抗−ヒトＩＦＮ−γも提供している。

ＩＦＮ−γ受容体ｃＤＮＡ配列の５°−及び３゛−非翻訳領域と同一の、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　７及び８で与えられるオリゴヌクレオチドＡＢ７５８及び７５９は、基本的には前述のように、胎盤ｃＤＮＡライブラリー・ファージ溶解液を使ったＰＣＲにおいて用いられた［フリートマンら、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（１９８ライブロック（ＧＲＩ、エセックス、ＵＫ）を用い、以下の条件：即ち、９５℃、２分間の変性、５０℃、２分間のプライマー・アニーリング、７２℃で２分間の鎖伸長反応を全て３０サイクル行い、最終サイクルの伸長反応を７２°Ｃで９分間行う条件で行われた。ＰＣＲ産物は１％アガロースケル中で電気泳動され、完全長のＩＦＮ−γ受容体コード領域に対応する約１．５ｋｂの主バンドが、臭化エチジウムを用いた染色により可視化され、電気溶出により単離された。その断片が確かに目的のものであることは、５゛　−プライマーとして配列番号（ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ）　・７で与えられるオリゴマーＡ３７５８と、ＩＦＮ−γ受容体の細胞内領域にある配列に対応する内部ブラマーとして、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ）＋６で与えられるＡＢ６９７を用いた２回目のＰＣＲを行い、約１．２ｋｂの断片が生ずることによって確認された。

Ｐｓｔｌ（５°）及び５ａｌｌ（３’）制限酵素部位は、上述のように、ＰＣＲにおいて配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＋９及び１０で与えられるオリゴマーＡＢ８１２及びＡＢ８１３を用いて、１．５ｋｂの完全長のＩＦＮ−γ受容体断片上に導入された。その結果生じた断片は単離され、ＰｓｔＩ及び５ａｌＩで切断され、ＣＯ３７細胞で発現するためにＰｓｔＩ／５ａｌＩ切断したｐＤＳＲＳプラスミド（ＡＴＣＣ受託番号６８２３２）（図１）にライゲーションされた。

その結果得られたライゲーション混合液は、コンピテント大腸菌２９４（大腸菌ゲネティック・ストック・センター、生物学科、イエール大学、私書箱６６６６、ニューヘブン、ＣＴ　０６５１１−７４４４から容易に入手可能である）を形質転換するために用いられた。

得られたクローンの内１４個から、アルカリ溶解法［バーンボイムとドーリ−１９＾ｒａｐｉｄ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｃｌｕｒｅ　ｆｏｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎ煤@ｐｌａｓＩｌｌｉｄＤＮＡ”、ＩＪｕｃｌ、＾ｃｉｄｓＲｅｓ、、７：１５１３　（１９７８）］によって単離されたプラスミドＤＮＡが制限酵素切断分析及びＰＣＨによって分析され、調べられた。

７つのクローンが１．５ｋｂのｒＦＮ−γ受容体断片を含んでいた。これら７つのクローンの内、６つからのＤＮＡを塩化セシウム／臭化エチジウム勾配遠心法［マニアテイスら、”１ｌｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ −、コールド・スプリング・ハーバ−１ＮＹ］により精製し、基本的に述べられているように［マッカチャンとパガー）、”Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　１ｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　５１ｍ１ａｎ　Ｖｉｒｕｓ　４０　Ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ@Ａｃ１ｄ　ｗｉｔｈ　Ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−ｅｔｈｙｌ−Ｄｅｘｔｒａｎ”、Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔ、、　４１　：　３５１−３T ６　（１９６８）コ、ＤＥＡＥ−デキストラン法によってＣ０８７細胞（５μｇＤＮＡ／１００ｍＭ　ディンシュ）に対し、一過的にトランスフェクトした。３７°Ｃで６０−７２時間生育させた後、細胞を穏やかなトリプシン処理によって採取し、領　０２％のアジ化ナトリウムを含むＲＰＭＩ培地に、１×１０７細胞／ｍ１となるように再懸濁し、４℃で保存した。次にそれらは、下記の実施例４で述べる技術を用いて、１２５■−標識したＩＦＮ−γの特異的結合によって、ＩＦＮ−γ受容体の発現について調べられた。

３つのクローンが＋２４）−標識したγ−インターフェロンの特異的結合の上昇を示した（下記の表Ｉ参照）。３つのクローン全て由来のプラスミドＤＮＡは、ジデオキシ・チェーン・ターミネーノヨン法［サンガーら、”ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７４．５ S ６３−６５６７　（１９７７）］によって塩基配列決定され：細胞外ドメインの配列は、発表されている配列と同一であった［オーグエットら、前出］。

ｃＤＮＡライブラリーから単離され、γ−インターフェロン受容体をコードするＤＮＡ断片を用いて、原核細胞における発現プラスミドに可溶性ドメインをクローニングするための、２つの部位を導入するためにプライマーが作製された。

配列番号（ＳＥｏ　１０　ＮＯ）＋１２で与えられるプライマーＡＢ８７０ＪＦはそのＤＮＡのアミノ末端の近傍にＨ４ｎｄｌＴＩ制限酵素部位を導入するために作られ（これは位置６でのＧｌｙになるだろう）；また、配列番号（ＳＥＱｌｏ　Ｎｏ）＋１３で与えられるプライマーＡ、Ｂ８７１ＪＦは、その分子の可溶性ドメインのみを単離、及び定義するために役立つであろうＢａｍＨＩ制限酵素部位及び５ＴＯＰコドンを導入するために作られた。（これらのプライマーは、ｒＦＮ−γ受容体からそのリーダー配列：即ち、リーダー配列及び膜貫通領域の間のポリペプチド配列を除いた、可溶性ドメインを単離、定義するものである。

）ＰＣＲ技術を用いることによって、（完全長の受容体をコードする）ＤＮＡ断片及びプライマーが、下記の反応混合液　即ち、１０１００ｐ　ｌ　ｅ　プライマー、２５ｎｇ　ＤＮＡ、１０ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、１．Ｏμｌ　ＴＡＱポリメリンセ緩衝液及び、２単位のＴＡＱポリメラーゼを含む反応混合液に混合された。

この系は、反応液の総容量１００μｌにおいて、アニーリング、変性及び合成を３０サイクル行うように設定された。ＰＣＲ後、ＤＮＡは１％アガロースゲルで分離され、γ−インターフェロン受容体をコードする８００ｂｐの断片が、臭化エチジウムを用いた染色によって可視化され、アガロースから単離された。

プラスミドｐ８３０−１　（ｐ　ＩＮＩ　Ｉ　ｒ、ＯｍｐＡリーダー）　［Ｄ　ランゾルら、″Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ａｎｄ　Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｈｊｇｈ　Ｂａ５ｉｃ　Ｐｒｏｔｅ奄氏AＨｕｍａｎ　Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　４．　ｉｎ　Ｅ、　ｃｏｌｉ”　、Ｊ、　Ｉｎｄｕｓｔ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、ｖｏｌ、４　（１９８X）、及び請求により、ＤＮＡＸ　リサーチ・インスティテユート・オン・モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー社、９０１　カルフォルニア・アベニュー、バク・アルド、ＣＡ　９４３０４−１１０４のＲ，カステラインから入手することができる］は、ＨｉｎｄＩ　Ｉ　ｒ及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を含み、それらは、以下のようにしてＯｐｍＡリーダーの下流に、読み枠を合わせた状態でＩＦＮ−γ受容体をクローニングするために用いられた：即ち、２０ＭｇのプラスミドＤＮＡを５０単位のＨｌｎｄｌ　Ｉ　Ｉ制限酵素で切断し、次に４０単位のＢａｍＨＩ制限酵素で切断した。切断後、この制限酵素切断断片の混合液は０６５％アガロースゲルで泳動されニブラスミドの骨格を表す７．５ｋｂの断片が単離された。

適当な分泌シグナルをコードする、他のいずれのプラスミドを代わりに用いることも可能である。

プラスミド骨格を表すこの７．５ｋｂ断片（０，１ｄｇ）及びγ−インターフェロン受容体をコードする８００ｋｂ断片を、ＡＴＰ、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（１００単位）及びジチオスレイトールを含む４０μ２の混合液中で、１６℃、１４時間ライゲーションした。次に、この産物の半分をＣａＣｌ２法で調製した大腸１　（Ｋ１２）２９４　（大腸菌ゲネティック・ストック・センター、生物学科、イエール大学、私書箱６６６６、ニューヘブン、ＣＴ　０６５１１−７４４４から容易に入手可能である）の形質転換に用いた。形質転換由来の混合液は、アンピシリンプレート上にまかれ、３０℃で１６−２４時間インキュベートされた。次に、いくつかのコロニーが採取され発酵され、そしてＤＮＡが単離され、上述の酵素（Ｈ４ｎｄ　ｒ　Ｉ　Ｌ　ＢａｍＨＩ）で切断することによって分析され、そしてクローンｐＪＦＲ１０５−６が選択された。

ｐＪＦＲ１０５−６クローンは、ＯｍｐＡの下流に挿入され、ｌｐｐ／ｌａｃプロモーターの制御下にある断片を有する。このプラスミドは、ｐＢＲ３２２由来であり、発現がイソプロピル−チオ−β−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導できるように、ＬＡＣ−Ｉ遺伝子を持っている。

実施例３　大腸菌からの、可溶性ヒトγ−インターフェロン受容体の精製ヒトＩＦＮ−γ受容体の細胞外ドメインは、プラスミドｐＪＦＲ１０５−６を持つ大腸菌から精製された。細胞は、Ｍ９−カザミノ酸培地［ＩＸＭ９　最少塩（ギブ：ｌ　ＢＲＬ　Ｎｏ、Ｍ２９８００Ｂ）、３％（ｗ／ｖ）カザミノ酸、２ｇ／ｌグルコース、Ｏ，１ｇ／ｌチアミン及び領　２ｇ／Ｉ硫酸マ硫酸マグネシュムコ℃ で、Ａｓａｏ＝１．　Ｑとなるまで培養された。ＩＰＴＧは、０．５ｍＭとなるように添加され、発酵は３０°Ｃで一夜続けられた（最終培養液　Ａｓａｏ”３゜５）。１２リツトルの培養液から馴化培地が回収され、その後、遠心により清澄された。清澄された上清は、５％トリクロル酢酸（ＴＣＡ）となるように調整され、４℃で６０分間装（ことによってタンパク質が沈澱させられた。不溶性画分が１０．ＯＯＯｘｇの遠心で回収され、再び可溶化するために１２０ｍ１の２００ｍＭトリス（ｐＨ８）に再懸濁された。４℃で６０分間インキュベーションした後、再可溶化された画分由来の残さを遠心で回収した。上清を４Ｍ尿素、２０ｍＭトリス（ｐＨ８）に調整し、４℃で３０分間インキュベーションし、その後２０ｍＭトリス（ｐＨ８）　、４Ｍ尿素緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファデックス８・ファスト・フロー・カラム（ファルマシア社　Ｎｏ、１７−０７０９　０１）にかけた。次にこのカラムは、同じトリス／尿素緩衝液中の、Ｏ−０，３Ｍ塩化ナトリウム勾配によって溶出された。可溶性のヒトＩＦＮ−γ受容体の細胞外ドメインは、約０．１８Ｍ　ＮａＣ１で溶出した。可溶性受容体をまとめたものは、２０ｍＭトリス（ｐＨ８）に対して透析され、２０ｍＭトリスで平衡化した５ｍｌのＩＦＮ−γ−アフィゲル　１０カラムにかけられた。［製造者によって推奨される方法に従って、ヒト１ＦＮ−γがアフィゲル　１０（バイオラッド社、カタログ番号１５３−６０４６）に共有結合で連結された。このアフィニティー樹脂は、１ｍｌの支持体樹脂当たり４ｍｇのＩＦＮ−γを含んでいた。

］このカラムは、１０ｍ１の０．２Ｍ　Ｎａ、ＣＩを含む２００ｍＭトリス（ｐＨ８）及び、続いて０．５Ｍ　Ｎａ、ＣＩを含む２００ｍＭトリス（ｐＨ８）で洗浄された。

その後、可溶性受容体は、２００ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０，３，０゜５Ｍ　ＮａＣｌで溶出された。その両分は中和され、プールされた後、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，５に対して透析された。

この方法により、１２リツトルの発酵当たり、０７から１ｍｇの可溶性ＩＦＮ− γ受容体が得られた。しかし、約５０％の可溶性ＩＦＮ−γ受容体はＴＣＡ不溶性画分に存在した。この物質は、変性し、再び活性のあるタンパク質を生ずるために再編成する事ができるだろう。

プラスミドｐＧＩＦ４−１３７　（細菌リポタンパク質（Ｉｐｐ）プロモーター及びヒトγ−インターフェロン遺伝子（成熟型タンパク質のアミノ酸４−１３７）をコードする、ｐＢＲ３２２系の発現ベクター）を持つ大腸菌２９４は、修飾ＧＣ培地（２０ｇ／Ｉグリセロール、３０　ｇ／　Ｉカザミノ酸（Ｄｉ　ｆｃｏ）　、２０ｇ／Ｉ酵母抽出物（Ｄｉｒｃｏ）、５ｇ／ｌ　ＫＨ２ＰＯ，及びＩｇ／ｌ　Ｍｇ５ｏ４・７Ｈ２０）中、３７℃で培養された。Ａ６６０が７−１０となったところで、細胞を採取し、超音波破砕によって溶解した。次に、無細胞不溶性画分は遠心によって単離され、２０ｍＭトリス（ｐＨ８）　、６Ｍ塩塩酸グアノノンよび５ｍＭノ千オスレイトールに再懸濁され、５６℃で３０分間熱することにより再び可溶化された。

この再可溶化された両分は、次に室温で２０ｍＭトリス（ｐＨ８）、６Ｍ塩塩酸グアノノンよって平衡化された３Ｘ９０ｃｍのセプランル２００−３ＦＲカラム（ファルマノア　ＡＢ）にかけられた。分画後、（たとえば、ウェスタン・プロット分析で検出されるような）γ−インターフェロンを含む画分はまとめられ、１０　ｍ　Ｍ　Ｎ　Ｈ４０Ａ、　ｃ　（ｐ　Ｈ７）で１２０倍に希釈され、４℃ で一夜混合された。ＳＰ−セファデックス３樹脂（ノグマ・ケミカル社）（２０ｍＭトリス、ｐＨ８中で、１：１のスラリー１０ｍ１）がこの試料に添加され、４℃て６０分間混合された。樹脂を濾過して除き、１０ｍＭ　ＮＨ，ＯＡｃ　（ｐＨ７）で洗い、精製されたγ−インターフェロンが１ｍＭＮａＣｌで溶出された。このγ−インターフェロン画分の純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドケル電気泳動によって示されるように、９５％以上であった。

Ｂ、ヒトγ−インターフェロンの標識１２５Ｉ標識したヒトγ−インターフェロンは、供給者によって述べられた方法に従い、ポルトン・ハンター試薬にューイングランド・ヌクレアー）を用いて調製された（標識試薬は、ｐＨ８の２０ｍＭリン酸ナトリウム中に７０μ／ｍｌの γ−インターフェロンを含む）。最終反応混合液は透析によって脱塩され、２１体タンパク質から重合したγ−インターフェロンを分離するために、ＰＢＳ及び０．　２％ゼラチンで平衡化したｌＸ２４ｃｍのセファデックスＧ７５Ｒカラムにかけられた。５０Ｃｉ／ｍＭに標識され、まとめられたγ−インターフェロンは、使用するまで４℃で保存された。

Ｃ１大腸菌を用いた試料の調製プラスミドｐＪＦＲ１，０５−６で形質転換した大腸菌７３２１　（ＡＴＣＣ受託番号５３９５６）は、３７℃でＡａａｏ＝１まで栄養培地で培養された。次にこの培養は、０．１ｍＭのＩ　ＰＴＧで誘導され、３７℃で３時間培養が続けられた。

誘導された培養由来の上清は、上述の結合アッセイを用いて、可溶性ＩＦＮ−γ 受容体の発現が調べられた。

Ｄ、結合アッセイＵ−９３７細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ１５９３）は、５％ツメチル・スルホキシド、９５％ウシ胎児血清凍結保存品から、あらかじめ保温しておいたＲＰＭ１１６４０培地（ハゼルトン・バイオロジクス社）に接種及び培養され、３７°ＣにおいてｌＸｌ０’細胞／ｍｌを越えない細胞濃度まで培養が進められた。

細胞は、使用直前に遠心により回収され、０．０２％アノ化ナトリウムを含むＲＰＭ１１６４０培地に、１．２５Ｘ１０’細胞／ｍｌとなるように再懸濁され、氷上で保存された。これに続く全ての方法は４°Ｃて行われ。

受容体結合アッセイは以下のようにして行われた：１アッセイあたり、１．２５Ｘ１０’のＵ９３７細胞が用いられた。（それぞれのアッセイが、図３の１点を与えた。）＋２’Ｉ　ＩＦＮ−γは、１０．０００Ｃｐｍ相当で添加された。（可溶性受容体の遺伝子を発現する）プラスミドＴ８９２−５Ｂで形質転換された細胞の培養由来の上清は、０から１００ｍ１まで容量を増加させながら添加された。このアッセイには、３つの構成成分が存在した：Ｕ−９３７細胞、１２５■ −標識したＩＦＮ−γ及び可溶性ｒＦＮ−γ受容体を含む試料である。これら３つの構成成分のうち２つを含む混合液は、４°Ｃで３０分間インキュベーションされた。その後、３番目の構成成分が添加され、４６Ｃで１２０分間インキュベーションが継続された。細胞はオイル［１５０μｍのジオクチル・フタル酸（アルドリッチ・ケミカル社）及びジブチル・フタル酸（イーストマン・コダック社）の１：１混合液］を通して遠心された。この遠心管は急速凍結され、細胞沈澱物がそれぞれの管の底から切り出され、そしてこの沈澱物についた放射活性がγ −カウンターで測定された。

例として、上述の方法を実施する方法は以下のものである。

可溶性受容体を含むと思われる馴化培地の希釈液が、（５０μｌのＲＰＭＩ培地を含む）９６ウエルのマイクロタイター・プレートのウェルに加えられた。

（５０μｍあたり約５０．０００ｃｐｍの）標識されたγ−インターフェロンがそれぞれのウェルに添加され、続いて１００μｌのＵ−９３７細胞懸濁液（１゜２５Ｘ１０７細胞／ｍ１）が添加された。４℃で２時間インキュベーションした後、それぞれの混合液は、１５０μｍのジオクチル・フタル酸ニジブチル・フタル酸（１：　１）を含む０．４ｍｌマイクロ試験管（バイオ−ラッド）にピペットで添加された。このアッセイ試験管はスイング・バケット・ローターで遠心され、液体窒素で凍結され、そして（オイル層によって反応液から分離され、凍結した細胞沈澱物を含む）試験管の先端が切りとられ、ガンマ・カウンターによる放射活性の分析がなされた。Ｕ−９３７細胞に対するγ−インターフェロンの結合を阻害できる培地画分は、可溶性ＩＦＮ−γ受容体を含むとして同定された。

その結果は、表Ｉに示されている。

Ｉ　Ｔ８８４−５　１８３２．８　１２９．８　１７０３．０１’　７８８４− ５　１５６０．５　７７．８　１４８２．７２　Ｔ８８６−５　１．９８５．０　１５０．４　１８３４．６２’　Ｔ８８６−５　２４０４．６　１９７．６　２２０７．０３　Ｔ８８６−６　２５２５．９　２３０．９　２２９５．０３’ 　Ｔ８８６−６　２０９２．８　６９．８　２０２３．０４　インサートなし　１１０．７　１３６．８　０４゛　インサートなし　１５９．４　１６０．０　０５　ＤＮＡ無添加　１２５．４　１８４．４　０（１）　０．１Ｍｇ／ｍｌの非標識ＩＦＮ−ｒに結合した”５ｒ　ＩＦＮ−７ＣｐｍＯ（２）　１０μｇ／ｍｌの非標識ＩＦＮ−７に結合したｌ２ＳＩ　ＩＦＮ−７ＣｐｍＯ（３）特異的結合＝（１）−（２）図３は、Ｕ９３７細胞状の完全なγ−インターフェロン受容体とγ−インターフェロンとの結合が、本発明の可溶性γ−インターフェロン受容体とγ−インターフェロンとの結合と比較された実験の結果を示している。この受容体結合アッセイでは、Ｕ９３７細胞上のγ−インターフェロン受容体への、″５■−標識した γ−インターフェロンの結合を妨害する際に、大腸菌で生産された可溶性γ−インターフェロン受容体が、投与量依存的に拮抗した。

これらのデータは、可溶性受容体が、γ−インターフェロンの細胞性受容体への結合の拮抗阻害剤であることを示している。この拮抗阻害を用いた、実験室での試験法（たとえばスクリーニングアッセイ）において、ｒＦＮ−γあるいはその可溶性受容体に、シグナル、たとえば放射性標識、あるいは化学的標識、とりわけ蛍光標識を生じ得る標識を付けることができる。更に、この拮抗阻害によって、本発明の可溶性γ−インターフェロン受容体は、慢性関節リューマチ、多発性硬化症、ンヨーグレン症候群及び紅班性狼癒などの、自己免疫疾患の治療における、治療だめの使用法をも発見すると思われる。

本発明の可溶性ＩＦＮ−γ受容体は、薬学的組成物として投与することがてきる。そのような組成物は、治療上有効な量の本発明の可溶性受容体及び薬学的担体あるいは賦形剤を含む。薬学的担体は、本発明の可溶性ＩＦＮ−γ受容体を患者に与えるために適当な、適合する、無毒性のいずれの物質であっても良い。たとえば、滅菌水、アルコール、脂肪、ワックス及び不活性の固体が担体に含まれることができ、また薬学的に受容できるアジュバント（たとえば、緩衝剤、拡散剤）もまた組み込まれることができる。一般に、このような薬剤の非経口投与に有用な組成物はよ（知られており、たとえｌｆＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎＣｅＳ、第１４版（マソク・パブリッンング社、イーストン、ＰＡ　１９８０）を参照のこと。それ以外に、本発明の組成物は、移植可能な薬剤投与システムによって、患者の体内に導入することができ：たとえばアークハートら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｔｏｘｉｃｏｌ、ｖｏｌ、２４、ｐｇｓ、１９９−２３６　（１９８４）を参照のこと。

本発明の可溶性ＩＦＮ−γ受容体は、通常非経口で投与され、静脈内に投与されるのが好ましい。可溶性ＩＦＮ−γ受容体は免疫原性ではないと期待されているが、従来からあるＩＶ投与セットあるいは皮下のデポから、ゆっくりと投与されることが好ましい。

非経口投与する場合、可溶性ＩＦＮ−γ受容体は通常注射に適した投与単位の形状で、薬学的に受容できる非経口投与賦形剤（たとえば、溶液、懸濁液あるいは乳剤）とともに製剤されるだろう。そのような賦形剤は本来非毒性で、治療作用のないものである。そのような賦形剤の例は、通常の生理食塩水、リンケル溶液、デキストロース溶液及びハング溶液である。固定油及びエチルオレイン酸などの、非水性賦形剤も使うことができる。好ましい賦形剤は５％デキストロース／生理食塩水である。賦形剤は、等張性と化学的安定性を増強する物質、たとえば緩衝剤及び防腐剤などの微量の添加物を含むことができる。可溶性のＩＦＮ−γ 受容体は、凝集物、分解産物及び混入タンパク質を実質的に含まない、精製された形状で、５から５００μｇ／ｍｌ、好ましくは２０から２５０μｇ／ｍｌの濃度で製剤されることが好ましい。

可溶性ＩＦＮ−γ受容体の投薬法の選択は、可溶性ＩＦＮ−γ受容体の血清中の交換率、自己免疫疾患の患者の血清ＩＦＮ−γレベル、可溶性ＩＦＮ−γ受容体の可能な免疫原性、標的ＩＦＮ−γへの接近のしやすさ、可溶性ＩＦＮ−γ受容体へのＩＦＮ−γの親和性に対する、細胞性受容体へのＩＦＮ−γの親和性などを含むいくつかの因子に依存する。

特定の状況に対する、本発明の組成物の適当な投与量の決定は、当業者にゆだねられている。通常、治療は最適投与量よりも少ない量から開始される。その後、投与量はその状況下での至適効果に達するまで、少量ずつ増加される。もし必要であれば、簡便化のため１日の総投与量を分割し、１日の間にその一部を投薬することができる。

可溶性ＩＦＮ−γ受容体の投与量及び頻度は、患者の年齢、状況及び体格並びに治療する症状の度合いなどの因子を考慮しながら、担当の医師の判断に従って調節されるだろう。

投与法に従って、患者に与えられる可溶性ＩＦＮ−γ受容体の看は、受容可能なレベルの副作用にあった最大量であることが好ましく：そのため与えられる量は、治療する疾患の度合いに一部依存する。投与量は、１日当たり約０．１から５００μｇ／ｋｇが好ましく、−日当たり約１から５０μｇ／ｋｇであることがより好ましい。

典型的な推奨される投与法は、自己免疫疾患の症状軽減を果たすために、１日当たり１μｇから５ｍｇ、好ましくは１日当たり２０μｇから１ｍｇを２回から４回に分けて非経口投与する事である。

本発明の上述の態様の記載は、例証および説明のために示されたものである。

それらは、網羅的に記載するという意図をもってなされたものではなく、また、本発明を開示された厳密な形式に限定する意図をもってなされたものでもなし１し、また、明らかに多くの修飾及び変法は、上述の教示に鑑みて可能である。態様（ま、本発明の原理とその実際的な適用を説明するために選ばれ、記載されたのであり、そのため、当業者は、特別の使用に適するように、本発明のこうした態様と修飾を適切に使用及び実施することができるだろう。本発明の範囲は、ここに添付された請求の範囲によって定義されるものである。

配列表配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＋１配列の型二　対応するアミノ酸配列をもつＤＮＡ配列配列の長さ・　７３５塩基：　２４５アミノ酸残基鎖の数、　１本鎖トポロジー・　直線状配列の種類：　ＤＮＡ分子及びコードされたタンパク質／ポリペプチド起源生物名；　ヒト性質：　γ−インターフェロンに対する可溶性受容体配列の特徴。

１から４２：　リーダー配列をコードするＤＮＡ４３から７３５：　ヒト成熟型可溶性ガンマ−インターフェロン受容体をコードするＤＮＡ配列：ＡＴＧ　ＧＣｒ　ＣＴＣＣＴＣＴｒｒ　Ｃ１’ＣＣＴＡ　ＣＣＣＣＴｒ　ＧｒＣＡＴＧ　ＣＡＧ　ＧＧＴ　ＧＴＧ　４２后潤ｆｆ　ＧＣＴ　ＧＡＧ烏α℃Ｎ℃ヱＧωＣＯ℃α袷α刀πＣχλ■１８７α？ｒ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＡＣＴ　ＡＡＴ　Ｇｒｒ　ＡＣＡ　ＡＴｒ　ＧＡＡ　ＴＣＣＴＡＴ　ＭＣＡＴＧ　ＡＡＣα７１３２ＡＣＣＧｒＡ　ＧＡＧ　Ｇｒ入入ＡＧ　ＡＡＣＴＡＴＧＧｒ　ＧＴＴ　ＡＡＧ　ＡＡＴ　ＴＣ入ＧＡＡ　ＴＧＧＡＴＴ　２２２ＧＡＴ　ＧＣＣＴＧＣＡ［ＡＡＴ　ＡＴＩ’　ＴＣｒ　ＣＡＴ　ＣＡＴ　Ｔ／ＩＴ　ＴＧＴ　ＡＡＴ　ＡＴｒ　’ｌｆｆ１　ＧＡＴ　２６７απｍλπ℃αλスＴαλＭＡにズαスαスαゴＮよａ毛χに℃４０２配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２配列の型：　アミノ酸配列配列の長さ：　２３１アミノ酸残基鎖の数、　１本鎖トポロジー　直線状配列の種類・　タンパク質／ポリペプチド起源生物名：　ヒト性質：　γ−インターフェロンに対する可溶性受容体（リーダー配列を持たない）（Ｘａａ）ｎ及び（Ｘａａ）ｐにライては、それぞれ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤＮ０）：３及び４を参照のこと。

配列：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）＝３配列ノ型：　配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２＋：おいて、（Ｘａａ）ｎで表わされたアミノ酸配列配列の長さ＝　１１アミノ酸残基鎖の数　１本鎖トポロジー・　直線状配列の種類：　ポリペプチド起源生物名：　ヒト性質、　γ−インターフェロン可溶性受容体の第２から第１２番目のアミノ酸残基配列配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：４配列ノ型：　配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２において、（Ｘａａ）ｐで′ 　表わされたアミノ酸配列配列の長さ＝　１０アミノ酸残基鎖の数：　１本鎖トポロジー：　直線状配列の種類：　ポリペプチド起源生物名：　ヒト性質：　γ−インターフェロン可溶性受容体の第２２２から第２３１番目のアミノ酸残基配列：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）　：５配列の型：　配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：２において、０：ａａ）ｎで表わされたアミノ酸配列の副配列配列の長さ＝　７アミノ酸残基鎖の数・　１本鎖トポロジー・　直線状配列の種類：　ポリペプチド起源生物名：　ヒト性質：　γ−インターフェロン可溶性受容体の位置Ｎ０１６から１２のアミノ酸残基配列配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：５配列の型：　ＡＢ６９７と名付けられた合成りＮＡ配列配列の長さ、　２３塩基鎖の数：　１本鎖トポロジｍ：　直線状配列の種類：　ＤＮＡ配列起源生物名：　なし性質＋　ＩＦＮ−γ受容体の細胞内領域にある配列の相補鎖に対応する、内部ＣＡＧＡＣＴＧＧＴＴ　ＡＣＴＡＣＴ丁入入Ａ　ＧＧＴ配列番号（ＳＥＱ　丁ＤＮＯ）ニア配列の型：　Ａ、Ｂ２Ｓ３と名付けられた合成りＮＡ配列配列の長さ・　２０塩基鎖の数　１本鎖トポロジー、　直線状配列の種類　ＤＮＡ配列起源生物名、　なし性質・　ＩＦＮ−γ受容体ｃＤＮＡ配列の、５°　−非翻訳領域内の配列に対応配列二ＣＡＧＣＧＡＣＣＧＴ　ＣＧＧＴＡＧＣＡＧＣ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：８配列の型・　ＡＢ７５９と名付けられた合成りＮＡ配列配列の長さ　２０塩基鎖の数：　１本鎖トポロジー、　直線状配列の種類：　ＤＮＡ配列起源生物名、　なし性質　ＩＦＮ−γ受容体ｃＤＮＡ配列の、３′−非翻訳領域内の配列の相補鎖に対応する、３′−プライマー配列・ＣＴＴＣＡＡＡＧＴＴ　ＧＧＴＧＣＡＡＣＴＴ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：９配列の型：　ＡＢ８１２と名付けられた合成りＮＡ配列配列の長さ＝　２７塩基鎖の数：　１本鎖トポロジー、　直線状配列の種類・　ＤＮＡ配列起源生物名　なし性質：１．５ｋｂ完全長のＩＦＮ−γ受容体断片の末端にＰｓｔＩ制限酵素部位を導入するためのオリゴマー配列ＣＴＡＴＣＴＧＣＡＧ　ＣＧＡＣＣＧＴＣＧＧ　ＴＡＧＣＡＧ（：配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１０配列の型：　ＡＢ８１３と名付けられた合成りＮＡ配列配列の長さ　３０塩基鎖の数・　１本鎖トポロジー、　直線状配列の種類：　ＤＮＡ配列起源生物名、　なし性質　ｌ、５ｋｂ完全長のＩＦＮ−γ受容体断片の３゛　−末端に５ａｌｌ制限酵素部位を導入するためのオリゴマー配列ＧＴＡＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣＣＡＡＡＧＴＴ　ＧＧＴＧＣＡＡＣＴＴ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１１配列の型：　Ａ、Ｂ８７０ＪＦと名付けられた合成りＮＡ配列配列の長さ：　３９塩基鎖の数　１本鎖トポロン−直線状配列の種類　ＤＮＡ配列起源生物名　なし性質　可溶性ＩＦＮ−γ受容体をコードするＤＮＡのアミン末端にある、（位置Ｎｏ、６の）グリシンに対応するコドンの近傍に、ＨｉｎｄｌＴＩ制限酵素部位を導入するための５゛　−プライマー配列：ＧＣＧＣＡＡＧＣＴＴ　ＣＴＧＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＧ　ＣＣＧＴＣＣＴＣＡ配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：１２配列の型　ＡＢ８７１ＪＦと名付けられた合成りＮＡ配列配列の長さ＝　３９塩基鎖の数、　１本鎖トポロジｍ：　直線状配列の種類：　ＤＮＡ配列起源生物名：　なし性質：　ＩＦＮ−γ受容体の細胞外−細胞内／膜貫通連結部に、ＢａｍＨＩ制限酵素部位及び終始コドンを（即ち、位置２３１におけるグリシンの後に終始コドンを）導入するための３゛−プライマー配列・ＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴ　ＴＡＡＣＣＴＴＴＴＡ　ＴＡＣＴＧＣＴＡＴＴ　Ｇ触触 τＧ品と　Δ １２５Ｉ　ｆｊ’ンｚ−ＩＦｌｊ９合蚤（Ｃｐｍ）Ｑ要約書可溶性の、トランケートされた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）γ−インターフェロン受容体、特にヒト受容体の可溶性細胞外ドメインが、それらをコードするＤＮＡ配列及び、それらを生産する、形質転換された細胞系統とともに提供される。γ− インターフェロンの細胞性受容体への、γ−インターフェロンの結合を阻害するために、そのような受容体を用いるための方法もまた提供される。

手続補正書１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ９１１０２６１８２、発明の名称可溶性のトランケートされたガンマ−インターフェロン受容体３、補正をする者事件との関係　特許出願人住所名　称　シェリング・コーポレーション４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区５、補正の対象（別紙）（１）請求の範囲を下記の通り補正する。

「１、他のタンパク質を実質的に含まない、天然型ヒトＩＦＮ−γ膜貫通型細胞性受容体の、グリコジル化された、若しくはグリコジル化されていない細胞外部分からなり、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ）：２で与えられる式：Ｙが、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ）：５で与えられるアミノ酸の副配列であり；Ｚが、配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ）　コ４で与えられる配列のアミノ末端から始まる、１つあるいはそれ以上のアミノ酸の副配列であり；ｍおよびｎがともに１であり；そしてｐがＯまたは１である〕ヲ有する、γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）に対する可溶性受容体。

２、有効量の請求の範囲第１項の可溶性受容体と、薬学的に受容される担体あるいは賦形剤を含む、医薬組成物。

３、ＩＦＮ−γに対する受容体を有する細胞へのＩＦＮ−γの結合を阻害する方法であって：有効量の請求の範囲第１項の可溶性ＩＦＮ−γ受容体を、ＩＦＮ− γに対する受容体を有する細胞を含む培地に投与し；そして、該可溶性受容体を細胞の受容体に対して拮抗させる、段階を含む、上記方法。」以上補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成　４年１０月２６日ム個

Claims

【特許請求の範囲】

１．他のタンパク質を実質的に含まない、天然型ヒトＩＦＮ−γ膜貫通型細胞性受容体の、グリコシル化された、若しくはグリコシル化されていない細胞外部分からなる、γ−インターフェロン（ＩＦＮ−γ）に対する可溶性受容体及び、機能的に等価なその変種。
２．配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：２で与えられる式〔ここで：Ｙが、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：３で与えられる配列のカルボキシル末端から始まる、１つあるいはそれ以上のアミノ酸の副配列であり；Ｚが、配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：４で与えられる配列のアミノ末端から始まる、１つあるいはそれ以上のアミノ酸の副配列であり；ｍ、ｎ及びｐが独立に０または１である〕を有する、請求の範囲第１項記載の可溶性受容体。
３．ｍ及びｎがともに１であり、Ｙにおける副配列が配列番号（ＳＥＱＩＤＮＯ）：５で与えられる、請求の範囲第２項記載の可溶性受容体。
４．ｍ、ｎ及びｐが全て１で、Ｙ及びＺで表わされる配列が完全に存在する；即ち、可溶性ＩＦＮ−γ受容体がアミノ酸１−２３１の配列を有しているか；あるいは、ｍが１、ｎが１、およびｐが０であり、そしてＹで表わされる配列が完全に存在する；即ち、可溶性ＩＦＮ−γ受容体がアミノ酸１−２２１の配列を有するか；あるいは、ｍがＯ、ｎが１、およびｐがＯであり、そしてＹで表わされる配列が（６）Ｇｌｙで始まる；即ち、可溶性ＩＦＮ−γ受容体がアミノ酸６−２２１の配列を有するか：あるいは、ｍが０、ｎ及びｐがともに１であり、Ｙで表わされる配列が（６）Ｇｌｙで始まり、Ｚで表わされる配列が完全に存在する；即ち、可溶性ＩＦＮ−γ受容体がアミノ酸６−２３１の配列を有する、請求の範囲第２項記載の可溶性受容体。
５．ｍが１であり、その配列が最初のセリン残基を含む、請求の範囲第２項記載の可溶性受容体。
６．ｍが１、ｎが１でｐが０であり、そしてＹで表わされる配列が（６）Ｇｌｙで始まる；即ち、可溶性ＩＦＮ−γ受容体がアミノ酸Ｓｅｒ＋６−２２１を有する、請求の範囲第２項記載の可溶性受容体。
７．請求の範囲第１項のグリコシル化されていない可溶性受容体。
８．ｍが１、ｎ及びｐがともに１であり、またＹで表わされる配列が（６）Ｇｌｙで始まり、Ｚで表わされる配列が完全に存在する；即ち、可溶性ＩＦＮ−γ受容体がアミノ酸Ｓｅｒ＋６−２３１を有する、請求の範囲第２項記載の可溶性受容体。
９．有効量の請求の範囲第１項の可溶性受容体と、薬学的に受容される担体あるいは賦形剤を含む、医薬組成物。
１０．有効量の請求の範囲第２項の可溶性受容体と、薬学的に受容される担体あるいは賦形剤を含む、医薬組成物。
１１．プラスミドｐＪＦＲ１０５−６。
１２．ＩＦＮ−γに対する受容体を有する細胞へのＩＦＮ−γの結合を阻害する方法であって：有効量の請求の範囲第１項の可溶性ＩＦＮ−γ受容体を、ＩＦＮ−γに対する受容体を有する細胞を含む培地に投与し；そして、該可溶性受容体を細胞の受容体に対して拮抗させる、段階を含む、上記方法。
１３．ＩＦＮ−γに対する受容体を有する細胞へのＩＦＮ−γの結合を阻害する方法であって：有効量の請求の範囲第２項の可溶性ＩＦＮ−γ受容体を、ＩＦＮ−γに対する受容体を有する細胞を含む培地に投与し；そして、該可溶性受容体を細胞の受容体に対して拮抗させる、段階を含む、上記方法。