JP2006136341A - 可溶性ｌｄｌリセプター - Google Patents

Abstract

【課題】本発明はウイルス感染から哺乳動物を防御することができる可溶性ＬＤＬリセプターに関し、このものはインターフェロンで処理した細胞または組換えＤＮＡ法により単離される。
【解決手段】ヒトＷＩＳＨ細胞をインターフェロンで処理し、種々のクロマトグラフィー法（モノクローナル抗体Ｃ７による親和性クロマトグラフィーを含む）により精製することにより可溶性ＬＤＬリセプターが産生される。
また、実質的に成熟ＬＤＬリセプターのアミノ酸残基４から２９２に対応するアミノ酸配列を有する可溶性ＬＤＬリセプターをコードするＤＮＡ分子よりなる発現ベクターで形質転換される細胞株を培養することにより、可溶性ＬＤＬリセプターを産生することができる。
可溶性ＬＤＬリセプター、そのムテイン、融合蛋白、それらの塩、官能性誘導体および活性画分は、ウイルス感染から哺乳動物を防御するための薬剤組成物の活性成分として使用される。
【選択図】なし

Description

本発明は可溶性低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）リセプター、その産生方法およびそれを含む薬剤組成物に関する。

インターフェロン（ＩＮＦ）は種々の細胞に産生される融合蛋白であり、動物細胞において抗ウイルス状態を誘導する。インターフェロンには抗原性により区別される３つの大きな型（α、βおよびガンマ）がある。ＩＮＦ−αとＩＮＦ−βはウイルスまたは核酸により誘導される１６６または１６５個のアミノ酸残基の関連する蛋白であり、種々の組織の細胞（免疫細胞を含む）により産生される。ＩＮＦ−ガンマは１３０−１４３個のアミノ酸残基の蛋白であり、マイトジェン（分裂促進因子）により活性化されたＴ細胞や大きい顆粒性リンパ球により産生される。ＩＦＮの産生は普通一過性であり、誘導物質が消失するとまもなく停止する。これらに関する最近の総説は、テイラーとグロスバーグ（Taylor S.L. and Grossberg S.E.）、Virus Research, 15, 1-26を参照。

これらの３つの充分性状解析されたインターフェロンのほかに、部分的に性状解析されたインターフェロン種がいくつか報告されている。１群のＩＮＦ−α様（ＩＮＦ−αｌ）遺伝子および偽遺伝子（pseudogenes）（クラスIIＩＮＦ−αまたはＩＦＮ−オメガとしても知られている）が発見され報告されている（レベル（Revel, M.）、「抗ウイルス薬剤とインターフェロン：その活性の分子学的基礎」（"Antiviral Drugs and Interferon : The Molecular Basis of theirActivity"）、ベッカー（Y. Becker）編、マルチヌスメイジョフ出版（Martinus MeijhofPubl.）、ボストン、357-434 ；キャポン（Capon, D.J.）ら、1985, Molec. Cell. Biol.,5, 768-779 ；ハウプトマンとスワートリイ（Hauptmann, R. and Swertly,P.）、1985, Nuc. Acid.Res., 13, 4739-4749）。これらは、約１７２個のアミノ酸残基を有するウイルスで誘導されるインターフェロンであり、リンパ球に産生されるヒトＩＮＦ−αの天然の混合物中に存在する（アドルフ（Adolf, G.R.）、1990, Virology, 175, 410-417）。

ヒト抹消血の単核球白血球をマイトジェンで処理するとＩＮＦ−ガンマとＩＦＮ−δという名前の新規ＩＦＮ−様物質（ウィルキンソンとモリス（Wilkinson M. and Morris,A.）、1983, Biochem.Biophys. Res. Comm.111, 498-503）が産生された。ＩＦＮ−δは耐酸性であり、染色体２１のトリソミーを有するヒト繊維芽細胞上でのみ活性がありＷＩＳＨ細胞上では活性がなかった。これは上記の３つの既知のＩＦＮ型とは抗原性が異なっていた。

酸に不安定なアルファインターフェロンはいくつかの文献に記載された。酸に不安定なアルファインターフェロンは、最近インフルエンザワクチンを受けたヒトのリンパ球、インフルエンザウイルスでインビトロで刺激されたリンパ球の培養物で誘導された（ブラックウィル（Blackwill, F.R.）ら、1983, J. Exp. Med.,157, 1059-1063）。このタイプのＩＦＮは抗ＩＮＦ−α血清で中和され、マンディンダーバー（Mandin Darby）ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞上で活性であった。このような酸に不安定なアルファ型のＩＦＮが全身性ループスエリトマドーデス患者の血清中に存在することが報告された（クリペル（Klippel, J.H.）ら、1985, AnnalsRhem. Disease, 44, 104-108）。酸に不安定なＩＮＦ−αは、ヒトの抹消血リンパ球のセンダイウイルス誘導によりＩＮＦ−αと同様に産生された（マツオカ（Matsuoka, H）ら、1985, J. Gen. Virol.,66, 2491-2494）。酸に不安定なＩＮＦ−αは抹消血単核細胞の培養により自発的に産生された（フィッシャーとルービンシュタイン（Fischer, D.G. and Rubinsein, M.）、1983, Cellular Immunology, 81, 426-434）。

ＩＦＮ−イプシロンと呼ばれる別のタイプのインターフェロンが、ウイルスに接触した上皮細胞から産生された。これはＩＦＮ−βと一緒に産生されたが、上皮細胞上で活性があり、他の細胞では活性がなかった（ジャービスとコソウスキー（Jarvis, A.P. and Kosowsky, D.I.）、1984、米国特許第4,614,651 号）。

他のサイトカインの中で、ＴＮＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−１は抗ウイルス活性を示すと報告された（メスタン（Mestan, J.）ら、1986, Nature, 323, 816-819；ウォングとゲデル（Wong, G.H.W. and Goedell, D.） 1986, Nature, 323, 819-822 ；ビリュー（Billiau, A.）、1987, Antiviral Research, 8, 55-70）。ＴＮＦは免疫細胞にのみ産生され、ＩＬ−１とＴＮＦはＩＮＦ−βの産生を誘導することにより抗ウイルス活性を示すことが示唆された（ビリュー（Billiau, A.）、前述）。

インターフェロンで誘導される蛋白がいくつか同定されており、そのあるものはＩＦＮの抗ウイルス状態の誘導に有用であることが証明されている。最も良く研究されているのは、（２’−５’）オリゴアデニレートシンセターゼである。これはＡＴＰを重合させてｐｐｐ（Ａ２’−５’ｐ）ｎＡ（ここでｎは好ましくは２または３であるが、１５までの長さでもよい）にする酵素である（ケールとブラウン（Kerr, I.M. and Brown, R.E.）、1978, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 75, 256-260）。このようなオリゴマーは潜在型のリボヌクレアーゼ（ＲＮＡＳＥ−Ｆ）（これはリボゾームＲＮＡやポリゾームを分解する）を活性化して、ウイルス合成や細胞性蛋白合成を阻害する。別のＩＦＮに誘導される細胞外酵素は２’−５’ホスホジエステラーゼであり、これはｔＲＮＡのＣＣＡ末端を除去して蛋白合成を阻害する（シュミット（Schmidt, A.）ら、1979, Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4788-4792）。ＩＦＮに誘導される第３の公知の細胞外酵素は７０Ｋｄ蛋白キナーゼであり、これは開始因子（Initiaation Factor）ｅＩＦ−２をリン酸化することにより、ｍＲＮＡの蛋白への翻訳の開始を阻害する（オーツキ（Ohtsuki, K.）ら、1980, Nature,287, 65-67）。他のＩＦＮに誘導される細胞外蛋白には核ＩＦＮ−応答性因子（nuclear ＩＦＮ−Responsive Factors）（ＩＲＦ−１とＩＲＦ−２）（これはＩＦＮ−応答性遺伝子を制御する）；メタロチオネイン（metalothionein）（これは５６Ｋｄ蛋白であるが、ＩＦＮに誘導される抗ウイルス状態での役割は不明である）；補体別経路のＢ因子そして齧歯類のＭｘ遺伝子生成物（これはインフルエンザに対する耐性に関係している）がある（テイラーとグロスバーグ（Taylor, I.L. and Grossberg, S.E.）の総説、1990, VirusResearch, 15, 1-26）。他のＩＦＮに誘導される細胞関連ポリペプチドは、ＩＦＮ処理と［³⁵Ｓ］メチオニンパルス後の２−Ｄゲル上で同定されたが、これらの蛋白の構造や機能はそれ以上性状解析されなかった（ウェイル（Weil, J.）ら、1983, Nature, 301, 437-439）。クラスＩおよびIIのＭＨＣ抗原、ＩｇＧ、Ｆｃリセプターおよび細胞骨格成分などの、ＩＦＮに誘導されるいくつかの細胞表面蛋白が同定された（レベル（Revel, M.）の総説、1984、「抗ウイルス薬剤とインターフェロン：その活性の分子学的基礎」（"Antiviral Drugs and Interferon : The Molecular Basis of theirActivity"）、ベッカー（Y. Becker）編、357-434、マルチヌスメイジョフ出版（Martinus Meijhof Publ.）、ボストン）。

培地に分泌される、ＩＦＮに誘導される別の蛋白が文献に開示されており、例えばβ２−ミクログロブリン（細胞表面のクラスＩＭＨＣ抗原）（ドレイ（Dolei, A.F.）ら、Antiviral Res.,1, 367-373）、プラスミノーゲンアクチベーターおよびリンホトキシン（ＩＦＮによりリンパ球中に誘導された）がある（ジョーンズ（Jones, C.M.）ら、1982, J. IFN. Res.,2, 377-386；ワラックとハーン（Wallach, D. and Hahn, T.）、1983, CellularImmunol., 76, 390-396）。ＩＮＦ−ガンマで処理された単球はＴＮＦを放出し、これは全体的な抗ウイルス作用を増強した（ゲラード（Gerrard, T.）ら、1989, J. IFN. Res.,2, 115-124）。ＩＮＦ−ガンマに誘導される分子量３０，０００（細胞外）の蛋白と分子量２５，０００（細胞内）の蛋白が記載された（ルスター（Luster A.D.）ら、1988、J. Biol. Chem.263, 12036-12043）が、その役割は求められなかった。

ＩＦＮに誘導される多くの蛋白が開示されているが、可溶性ＬＤＬリセプターに関連しているものは１つもない。これまでのところ別の蛋白としての可溶性ＬＤＬリセプターの存在は開示されていない。全サイズの低比重リポ蛋白リセプター（ＬＤＬＲ）は、膜貫通型の糖蛋白であり、界面活性剤の非存在下では不溶性である。これは８２２個のアミノ酸残基からなり、分子量は１６４，０００である。その知られている唯一の役割はＬＤＬとＶＬＤＬを内部化することである。その構造は数個のドメインよりなり、そのいくつかは他の蛋白と同じである。Ｎ−末端リガンド結合ドメインは２９２個のアミノ酸残基よりなり、７つのシステインに富む不完全リピート（cysteine-rich imperfect repeats）で配置されている。このドメインの後には、ＥＧＦ前駆体（４００個のアミノ酸残基）に相同性の領域、２２個のアミノ酸残基の単一の膜貫通型のドメインおよび５０個のアミノ酸残基の細胞質ドメインがある（シュナイダー（Schneider, W. J.）ら、J. Biol.Chem. 257, 2664-2673, 1982；ヤマモト（Yamamoto, T.）ら、Cell 39, 27-38, 1984）。しかしＬＤＬリセプターの抗ウイルス性については全く言及されていない。

ヒト繊維芽細胞または上皮細胞をインターフェロンで処理すると、抗ウイルス活性を示す蛋白が産生され、細胞培養液の上清中に蓄積することがわかった。この蛋白は均一になるまで精製され、ＬＤＬリセプターの可溶性細胞外領域として同定された。

従って本発明は、可溶性ＬＤＬリセプター、そのムテインおよび融合蛋白、それらの塩、官能性誘導体および活性画分を与える。リセプター蛋白の抗ウイルス活性は、例えばＷＩＳＨ羊膜細胞と投与抗原（challenge）としての水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）よりなる系で測定することが便利である。

本発明はまた、蛋白性不純物に対して均一になるまで精製されているＬＤＬリセプターの細胞外部分（７５０個のアミノ酸残基）に対応する可溶性ＬＤＬリセプターを与える。

本発明は特に、少なくとも成熟ＬＤＬリセプターのリガンド結合ドメインよりなる（しかしこれに限定されない）可溶性ＬＤＬリセプター、そしてさらに詳しくは成熟ＬＤＬリセプターの少なくとも４から約２９２個のアミノ酸残基に対応する可溶性ＬＤＬリセプターに関する。

本発明はまた、実質的に図１０に示すアミノ酸配列よりなる可溶性ＬＤＬリセプターに関する。

別の面で本発明は、可溶性ＬＤＬリセプターの調製法、適当な細胞のインターフェロンによる処理、上清からの可溶性ＬＤＬリセプターの単離およびその精製に関する。

さらに本発明は、上記蛋白またはその活性ムテインまたは融合蛋白をコードする核酸配列よりなる組換えＤＮＡ分子、それらを含む発現ベクターおよびこれで形質転換される宿主細胞、そして形質転換細胞を適当な培地中で培養することよりなる、可溶性ＬＤＬリセプター、その活性ムテインまたは融合蛋白を産生するための方法に関する。

可溶性ＬＤＬリセプター、そのムテイン、融合蛋白、それらの塩、官能性誘導体および活性画分は、ウイルス感染から哺乳動物を保護するための薬剤組成物の活性成分として使用される。

図１は、添加されたインターフェロンではない抗ウイルス活性の存在の証拠を示す。ヒト羊膜ＷＩＳＨ細胞への水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）の細胞変性作用に対する種々のインターフェロンの防御作用は、種々の条件下で測定される。測定は９６穴のプレート中で行われ、各列はＩＦＮの連続２倍希釈系列である。左から最初のカラムのＩＦＮの最終濃度は２５ＩＵ／ｍｌである。上から列１：添加されたＩＮＦ−αと２４時間後に添加されたＶＳＶ；列２：添加されたＩＮＦ−α、２４時間後に洗浄された細胞、添加された新鮮なＩＮＦ−αと添加されたＶＳＶ；列３：添加されたＩＮＦ−α、２４時間後に添加された中和性抗ＩＮＦ−α抗体、次に添加したＶＳＶ；列４から６と７から９は最初の３つの例と同じものであるが、それぞれＩＮＦ−αと抗ＩＮＦ−β抗体、およびＩＮＦ−ガンマと抗ＩＮＦ−ガンマ抗体を使用した。

図２は、ＴＳＫ−ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

図３は、ハイドロキシアパタイトバイオゲルＨＴＰカラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

図４は、スーパーホーマンス（Superformance）ＴＭＡＥ−６５−Ｓ陰イオン交換ＨＰＬＣカラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

図５は、フェニルセファロース疎水性相互作用カラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

図６は、逆相アクアポア（Aquapore）ＲＰ−３００ＨＰＬＣカラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

図７は、逆相ＨＰＬＣカラムによる再クロマトグラフィーからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

図８は、精製操作の最後の工程で得られた種々の画分のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す。１３％のアクリルアミドゲルが使用され、銀で染色した。レーンは：１−７、限外濾過で濃縮されたＲＰ−３００クロマトグラフィー（図７）からの画分１０−１６の一部（４００μｌ）；８、対照試料緩衝液；９、左側に示した分子量マーカー。

図９は、スーパーローズ（Superose）１２サイズ排除ＨＰＬＣカラムからの抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。

図１０は、微量配列解析装置（microsequencer）の元々のアウトプットを示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（図７）の画分１０−１２（各０．４ｍｌ）をプールし、限外濾過により濃縮し、得られた試料（１μｇ）を蛋白微量配列解析にかけた。

図１１は、図１０に示す蛋白微量配列解析装置により得られた配列の探索のアウトプットを示す。

図１２は、モノクローナル抗体Ｃ７カラムで部分的に精製した可溶性ＬＤＬリセプターの免疫親和性クロマトグラフィーからの種々の画分の抗ウイルス活性を示す。バーは：load−カラムにのせたもの；effl.−溶出液（非結合画分）；el.1-4−溶出１−４である。

図１３は、免疫親和性クロマトグラフィー（図１２に示されている）からの種々の画分のウェスタンブロット解析を示す。蛋白はニトロセルロースに電気ブロットされ、モノクローナル抗体Ｃ７および¹²⁵Ｉ−蛋白Ａで可視化した。レーンは：１、分子量マーカー；２、load；３、非結合；４、洗浄；５、溶出２；６、溶出３；７、モノクローナル抗体Ｃ７である。

図１４は、種々のインターフェロンによるＷＩＳＨ細胞中の細胞表面ＬＤＬリセプターの投与量応答誘導を示す。細胞は１９インターフェロンとインキュベートされ、培地に２％胎児牛血清を含む培地、細胞表面ＬＤＬリセプターのレベルはモノクローナル抗体Ｃ７と¹²⁵Ｉ−蛋白Ａにより測定した。

インターフェロンで処理した細胞は培地中に、インターフェロンではない抗ウイルス活性を有する蛋白を分泌することが明らかになった。この蛋白はすべての３つの型のヒトインターフェロンに対する抗体（いずれもＮＩＨ標準物質であり中和性モノクローナル抗体である）によっては中和されない。この蛋白はＬＤＬリセプターの細胞外リガンド結合ドメインよりなることが同定された。

この可溶性ＬＤＬリセプターは、任意のインターフェロンに対して応答して抗ウイルス状態に入る哺乳動物細胞により培地中に分泌される。例としては、羊水から得られる繊維芽細胞または上皮細胞がある（例えばＵ細胞、ＷＩＳＨ細胞）。

インターフェロンと異なり、可溶性ＬＤＬリセプターは細胞中に抗ウイルス状態を誘導しないが、それ自身が抗ウイルス性である。すなわち可溶性ＬＤＬリセプターとウイルスで同時に処理された細胞は溶解しないが、ウイルスのみまたはウイルスとＩＮＦ−ガンマで同時に処理した細胞は感染し１２時間後に溶解する。これはＩＮＦ−ガンマで処理した細胞が抗ウイルス状態が確立されるには約１０時間かかるため、ＩＮＦ−ガンマはウイルスに対する防御能を直ちには与えないことを示している。これに対して可溶性ＬＤＬリセプターは細胞に添加された時直ちに細胞を防御する。

サイズ排除クロマトグラフィーで試験すると、可溶性ＬＤＬリセプターの見かけの分子量は約４０，０００である。

可溶性ＬＤＬリセプターの産生のためには、培養して増殖させた適当な細胞を適当な培地中でＩＦＮで処理して、３７℃で数時間インキュベートする。こうして産生された可溶性ＬＤＬリセプターは培地中に分泌され、上清から単離される。適当な細胞とはインターフェロンに応答して抗ウイルス状態に入ることができる細胞である。ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−βおよびＩＮＦ−ガンマでも同様の結果が得られたが、ＩＮＦ−ガンマは可溶性ＬＤＬリセプターの抗ウイルス活性測定の条件下（可溶性ＬＤＬリセプターの添加と培養細胞へのウイルス抗原投与を同時に行う）では抗ウイルス活性を示さないため、ＩＮＦ−ガンマが好ましい。

本発明の好適な実施態様において、ヒトＷＩＳＨ細胞は、血清代替物を補足したＭＥＭ中でＩＮＦ−ガンマとともに処理され、次に３７℃でさらにインキュベートされる。１７時間後に可溶性ＬＤＬリセプターの最も高い力価が得られた。次に可溶性ＬＤＬリセプターを含有する細胞の上清を採取し公知の方法で濃縮する（例えば限外濾過または半固体性ポリエチレングリコール２０，０００に対する透析）。次に濃縮した上清をクロマトグラフィー法で精製する。

好適な実施態様において、精製された可溶性ＬＤＬリセプターは以下の工程よりなる方法により産生される：
ａ． ＷＩＳＨ細胞をコンフルーエントになるまで培養し、無血清培地中で３０Ｕ／ｍｌのＩＮＦ−ガンマで細胞を誘導し、１７時間後に細胞上清を集める；
ｂ． 例えば分子量カットオフが約１０，０００の膜で限外濾過して、上記上清を約３０倍濃縮する；
ｃ． 工程（ｂ）の濃縮した上清を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて抗ウイルス性因子の部分精製活性画分を得る；
ｄ． 工程（ｃ）の部分精製画分をハイドロキシアパタイトのクロマトグラフィーにかけて抗ウイルス性因子の部分精製画分を得る；
ｅ． 工程（ｄ）の部分精製画分を陰イオンＨＰＬＣにかけて抗ウイルス性因子の部分精製画分を得る；
ｆ． 工程（ｅ）の部分精製画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけて抗ウイルス性因子の部分精製画分を得る；そして
ｇ． 工程（ｆ）の部分精製画分を大体中性のｐＨで逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけて部分精製抗ウイルス性因子を得る。次にこの工程を繰り返して均一な抗ウイルス性因子（ヒトＷＩＳＨ細胞に対する水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）による細胞変性作用を阻害する能力により規定される）を得る。

工程（ｃ）のイオン交換クロマトグラフィーはｐＨ約８でＴＳＫ−ＤＥＡＥカラム上で行い、塩濃度を上昇させて溶出する。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーは好ましくはバイオゲルＨＴＰカラム（バイオラッド（BioRad）、米国）でｐＨ６．８で行い、リン酸緩衝液で溶出する。陰イオン交換ＨＰＬＣは好ましくは、スーパーホルマンス（Superformance）ＴＭＡＥカラムでＴＳＫ−ＤＥＡＥと同様の方法で行う。疎水性相互作用クロマトグラフィーは好ましくは、フェニルセファロースカラムで塩濃度を減少させて溶出する。逆相ＨＰＬＣは好ましくはアクアポア（Aquapore）ＲＰ３００カラムでｐＨ７．５で、アセトニトリルの濃度勾配で行う。

別の好適な実施態様において、可溶性ＬＤＬリセプターは上記実施態様の工程ａ、ｂおよびｃよりなる方法で精製し、次に可溶性ＬＤＬリセプターに対するモノクローナル抗体のカラムで免疫親和性クロマトグラフィーを行う。

モノクローナル抗体は好ましくはハイブリドーマＣ７（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６９１）より作成されるものである。部分精製した可溶性ＬＤＬリセプターを中性のｐＨでカラムにかけ、カラムを０．５ＭのＮａＣｌで中性で洗浄し５０ｍＭのＮａ_２ＣＯ_３（ｐＨ１１）により精製された状態で溶出され、直ちに中和される。

好ましくはすべての精製操作においてクロマトグラフィーは蛋白濃度を追跡して行う（２８０ｎｍでの吸光度、または代表的画分とフルオレスカミンとの「オンライン」の反応の蛍光）。各画分の抗ウイルス活性は、本明細書に記載の生物活性測定法に従ってＷＩＳＨ細胞中のＶＳＶ−誘導ＣＰＥ（細胞変性作用）の阻害により求められる。

本明細書において「ムテイン」（"muteins"）という用語は、天然の可溶性ＬＤＬリセプターの１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基により置換されているか、または１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が可溶性ＬＤＬリセプターの天然の配列に添加されていて、得られる生成物の抗ウイルス活性を大きく変えることのないものを意味する。これらのムテインは公知の合成法および／または部位特異的突然変異誘発、または適当な任意の他の公知の方法により調製される。

「融合蛋白」という用語は、可溶性ＬＤＬリセプターまたはムテインに他の蛋白が融合しており、体内での滞在時間がより長いポリペプチドを意味する。すなわち可溶性ＬＤＬリセプターは他の蛋白、ポリペプチドなど（例えば免疫グロブリンまたはその断片）に融合される。

本明細書において「塩」という用語は、可溶性ＬＤＬリセプター、ムテインおよびこれらの融合蛋白のカルボニル基の塩およびアミノ基の付加塩を意味する。カルボキシル基の塩は当該分野で公知の方法で作成され、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、第三鉄または亜鉛などの無機塩、および例えばアミン（トリエチルアミン）、アルギニンまたはリジン、ピペリジン、プロカインなどとの有機塩がある。酸付加塩としては、例えば塩酸または硫酸のような鉱酸との塩、および例えば酢酸またはシュウ酸のような有機酸との塩がある。

本明細書において「官能性誘導体」とは、可溶性ＬＤＬリセプターおよびその融合蛋白やムテインの誘導体（これらは当該分野で公知の方法により、Ｎ−末端またはＣ−末端上の残基にある側鎖として存在する官能基から調製される）を包含し、これらが薬剤として許容されるものである限り、すなわち蛋白の活性を損なわずこれらを含む組成物に有害な性質を与えることがない限り、これらは本発明に含まれる。これらの誘導体には例えばポリエチレングリコール側鎖があり、これは抗原性部位を隠してしまい、体内での可溶性ＬＤＬリセプターの滞在時間を延長する。他の誘導体としては、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニウムまたは第１級または第２級アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシル部分（例えばアルカノイルまたはカルボキシルアロイル基）と形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体、またはアシル部分と形成される遊離ヒドロキシ基（例えばセリンまたはスレオニン残基）のＯ−アシル誘導体がある。「官能性誘導体」という用語にはまた、決定された配列より長いかまたは短いアミノ酸配列を有する蛋白（ただしこれらがウイルス感染を阻害する能力を有する限り）が含まれる。

可溶性ＬＤＬリセプター、その融合蛋白およびムテインの「活性画分」として、該蛋白分子自身または関連分子またはそこに結合した残基（例えば糖またはリン酸塩残基、または蛋白分子または糖残基の凝集物）のポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体が、ウイルス感染を阻害する能力を有する限り、本発明に包含される。

本発明はまた、可溶性ＬＤＬリセプター、融合蛋白、ムテインまたはこれらの活性画分をコードするヌクレオチド配列よりなるＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を有する複製可能な発現ビーイクル（vehicle）、これで形質転換した宿主およびこのような形質転換宿主により産生された蛋白に関する。「ＤＮＡ分子」という用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよびこれらの組合せを含む。

組換え可溶性ＬＤＬリセプターの産生は別の方法により行われる。１つの方法では、プラスミッドｐＬＤＬＲ−２（ヤマモト（Yamamoto）ら、前述）から可溶性ＬＤＬリセプターの公知のｃＤＮＡを取る。このＤＮＡを適当なオリゴヌクレオチドで部位特異的突然変異誘発をさせ、停止コドンとポリアデニル化コドンを成熟ＬＤＬリセプターのコドン２９２の後ろに挿入する。次にこの作成体を当該分野で公知の方法により適当に作成された発現ベクターに挿入する（マニアチス（Maniatis）らを参照、前述）。合成ＤＮＡリンカーまたは平滑末端（blunt end）結合法を用いて、ホモポリマーテーリング法または制限結合法により、２本鎖ｃＤＮＡをプラスミッドベクターに結合させる。ＤＮＡリガーゼを用いてＤＮＡ分子を結合させ、アルカリ性ホスファターゼで処理して好ましくない結合を避ける。

ＬＤＬリセプターのリガンド結合ドメインと、例えばＩｇＧ₂重鎖の定常領域よりなる融合蛋白の産生は、以下のようにして行う：ｐＬＤＬＲのＤＮＡを部位特異的突然変異誘発により、成熟ＬＤＬリセプターのコドン２９２のすぐ後ろにユニークな（唯一の）制限部位を導入する。ＩｇＧ₂重鎖の定常領域を有するプラスミッド（例えばｐＲＫＣＯ４₂Ｆｃ₂（ビルン（Byrn R.A.）ら、1990, Nature（ロンドン）344, 667-670）を部位特異的突然変異誘発により、ＩｇＧ₂重鎖のＡｓｐ２１６のできるだけ近くに、融合蛋白の段階で翻訳が可能であるように、同じユニークな制限部位を導入する。５’の非翻訳配列を含みリーダーとＬＤＬリセプターの大体最初の２９５アミノ酸よりなるｄｓＤＮＡを、突然変異したｐＬＤＬリセプターのＥｃｏＲＩとユニークな制限部位での消化により調製する。突然変異ｐＲＫＣＯ４₂Ｆｃ₂は同様に消化されて、プラスミッドとＩｇＧ₁を有する大きな断片を産生する。次にこの２つの断片を結合して、ＬＤＬリセプターのＮ−末端の約２９５個のアミノ酸とＩｇＧ₂重鎖（ヒンジ領域とＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）のＣ−末端の約２２７個のアミノ酸よりなるポリペプチドをコードする新しいプラスミッドを作成する。ＥｃｏＲＩによる消化によりプラスミッドから、融合蛋白をコードするＤＮＡを単離し、次に有効な発現ベクターに挿入する。

可溶性ＬＤＬリセプター、そのムテインまたは融合蛋白を発現することを可能にするために、発現ベクターは遺伝子発現と蛋白産生を可能にするように目的の蛋白をコードするＤＮＡに結合した転写および翻訳制御情報を有する特異的ヌクレオチド配列を含むべきである。まず遺伝子が転写されるために、遺伝子の前にＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーターがなければならない（ここにポリメラーゼが結合し転写過程が開始される）。このようなプロモーターは種々使用されており、これらは異なる効率で作用する（強いプロモーターおよび弱いプロモーター）。これらは原核細胞および有核細胞で異なる。

本発明で使用されるプロモーターは構成性（例えばバクテリオファージラムダのｉｎｔプロモーター、ｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａ遺伝子、およびｐＰＲ３２５のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のＣＡＴプロモーターなど）、または誘導性（例えばバクテリオファージラムダの主要な右プロモーターおよび左プロモーター（Ｐ_LとＰ_R）を含む原核プロモーター、大腸菌のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃ２、ｏｍｐＦおよびｇａｌプロモーター、またはｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーターなど）でもよい（グリック（Glick, B.R.）、1987、J. Ind. Microbiol. 1:277-282）。

原核細胞で高レベルの遺伝子発現を達成するためには、強いプロモーターを使用して多量のｍＲＮＡを産生させる以外に、リボゾーム結合部位を用いてｍＲＮＡが有効に翻訳されていることを確保することが必要である。１つの例は、開始コドンから適当に位置しており、１６ＳＲＮＡの３’末端配列に相補的なシャインダルガルノ配列（ＳＤ配列）である。

原核宿主には、宿主の性質により異なる転写および翻訳制御配列が使用される。これらはウイルス（例えばアデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サルウイルスなど）由来であり、ここでは高レベルの発現をする特定の遺伝子に関連した制御シグナルがある。例としてはヘルペスウイルスのＴＫプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、酵母ｇａｌ４遺伝子プロモーターなどがある。抑制と活性化を可能にする転写開始制御シグナルが選択され、こうして遺伝子の発現が制御される。

本発明の可溶性ＬＤＬリセプターまたはその断片またはムテインまたはこれらの融合蛋白をコードするヌクレオチド配列、および機能的に結合した転写および翻訳制御シグナルよりなるＤＮＡ分子は、目的の遺伝子配列を宿主細胞染色体へ取り込むことができるベクターに挿入される。導入されたＤＮＡを染色体中へ安定的に取り込む細胞を選択することができるように、発現ベクターを含む宿主細胞の選択を可能にする１つまたはそれ以上のマーカーを使用する。このマーカーは栄養素要求性宿主（autotrophic host）に原栄養性（prototrophy）、殺生物剤（biocide）耐性（例えば抗生物質、銅などの重金属に対する耐性など）を与えることもできる。選択マーカーは発現されるＤＮＡ遺伝子配列に直接結合しているかまたはコトランスフェクション（cotransfection）により細胞内へ導入される。１本鎖結合性蛋白ｍＲＮＡの最適な合成のためには追加の要素も必要であり、これらの要素にはスプライスシグナル、および転写プロモーター、エンハンサー、そして停止シグナルがある。このような要素を導入しているｃＤＮＡ発現ベクターには、オカヤマ（Okayama, H.）, 1983, Mol. Cel. Biol. 3:280に記載されたものがある。

好適な実施態様において、導入されたＤＮＡ分子は受容性宿主中で自律増殖が可能なプラスミッドまたはウイルスベクターに取り込まれる。特定のプラスミッドまたはウイルスベクターの選択に重要な因子は：ベクターを含む受容性細胞が容易に認識され、ベクターを含まない受容性細胞から容易に選択されること；特定の宿主におけるベクターのコピー数が好ましいこと；そしてベクターが異なる宿主細胞間を「往復」（"shuttle"）できることが好ましい。

好適な原核性ベクターには、大腸菌中で複製が可能なもの（例えばｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４など）（マニアチス（Maniatis）ら、前述）；バシルス（Bacillus）のプラスミッド（例えばｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＴ１２７など）（グリクザン（Gryczan, T.）、「バシルスの分子生物学」（"The Molecular Biology of the Bacilli"）、アカデミックプレス、ニューヨーク(1982)、307-322）；ｐＩＪ１０１などのストレプトミセス（Streptomyces）のプラスミッド（ケンダル（Kendall, K.J.）ら、(1987) J. Bacteriol. 169:4177-4183）：φＣ３１のようなストレプトミセス（Streptomyces）のバクテリオファージ（チャター（Chater, KF.）ら、「アクチノミセターレス生物学に関する第６回国際シンポジウム」（"Sixth International Symposium on
ActinomycetalesBiology"）、アカデミアイカイド（Akademiai Kaido）、ブダペスト（Budapest）、ハンガリー、(1986) 43-54）、およびシュードモナス（Pseudomonas）のプラスミッド（ジョン（John, J.F.）ら、(1986) Rev. Infect. Dis. 8:693-704、およびツザキ（Tzaki, K.）(1978) Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742）がある。

好適な真核プラスミッドには、ＢＰＶ、バクシニア（vaccinia）、ＳＶ４０、２−ミクロンサークル（2-micron circle）など、またはこれらの誘導体がある。このようなプラスミッドは当該分野で公知である（ボツスタイン（Botstein, D.）ら、(1982) Miami Wint Symp.19:265-274；ブローチ（Broach, JR.）、「酵母サッカロミセスの分子生物学：ライフサイクルと遺伝」（"The Molecular Biologyof the Yeast Saccharomyces:Life Cycleand Inheritance"）、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring HarborLaboraory）、コールドスプリングハーバー（Cold SpringHarbor）、ニューヨーク、445-470 (1981)；ブローチ（Broach, JR.）、(1982) Cell 28:203-204；ボロン（Bollon, D.P.）ら、(1980) J. Clin. Hematol.Oncol. 10: 39-48；マニアチス（Maniatis T.
）、「細胞生物学：総合論文、第３巻：遺伝子発現」（"Cell Biology:A Comprehensive Treatise, Vol. 3: Gene Expression"）、アカデミックプレス（Adademic Press）、ニューヨーク、563-608(1980)）。

作成体を含むベクターまたはＤＮＡ配列が発現のためにいったん調製されると、保存ベクターは任意の種々の適当な手段により適当な宿主細胞に導入される（例えば形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション（electroporation）、リン酸カルシウム沈澱法、直接微量注入（microinjectiion）など）。

本発明で使用される宿主細胞は原核性でも真核性でもよい。好適な原核宿主細胞は大腸菌（E.coli）、バシルス（Bacillus）、ストレプトミセス（Streptomyces）、サルモネラ（Salmonella）、セラチア（Serratia）などの細菌である。最も好適な原核宿主は大腸菌である。特に関係がある細菌宿主は大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ ３１４４６）、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１５３７）、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ- 、ラムダ- 、原栄養性（ＡＴＣＣ ２７３２５））、および他の腸内細菌（サルモネラティフィムリウム（Salmonella typhimurium）またはセラチアナルセサンス（Serratia narcescens）、および種々のシュードモナス（Pseudomonas）種である。このような条件下ではこの蛋白はグリコシル化されない。原核宿主はレプリコンや発現プラスミッド中の調節配列と融和性でなければならない。

しかし可溶性ＬＤＬリセプターはシステインに富む蛋白であるため、原核宿主より真核宿主が好ましい。哺乳動物細胞は翻訳後に蛋白に対して正しい折り畳み（folding）、正しいジスルフィド結合形成および正しい部位でのグリコシル化などの修飾を可能にするため、好適な真核宿主は哺乳動物細胞（例えばヒト、サル、マウスおよびチャイニーズハムスターオバリー（ＣＨＯ）細胞）である。また酵母細胞や昆虫細胞は翻訳後のペプチド修飾（高マンノースグリコシル化を含む）が可能である。酵母や昆虫細胞での目的の蛋白の産生に使用される強いプロモーター配列や高コピー数のプラスミッドを用いる、多くの組換えＤＮＡ戦略が存在する。酵母細胞はクローン化哺乳動物遺伝子上のリーダー配列を認識し、リーダー配列を有するペプチドを分泌する。

ベクターの導入の後には、宿主細胞はベクター含有細胞の増殖を選択する選択培地中で増殖される。クローン化遺伝子配列が発現されると、可溶性ＬＤＬリセプター、融合蛋白、またはムテインまたはこれらの断片が産生される。次に発現された蛋白は単離され、抽出、沈澱、クロマトグラフィー、電気泳動など、またはカラム中のゲルマトリックスに固定化された抗可溶性ＬＤＬリセプターモノクローナル抗体（例えばハイブリドーマＣ７，ゲルシーゲル（Belsiege U.）ら、J. Biol.Chem., 256, 11923-11931, 1981）を用いる親和性クロマトグラフィーなどの通常の方法などの任意の従来法により精製される。上記組換え可溶性ＬＤＬリセプターを含む粗調製物をカラムに通すと、可溶性ＬＤＬリセプターは特異的抗体によりカラムに結合し、不純物はカラムを通過する。洗浄後高ｐＨ（例えばｐＨ１１）でゲルから蛋白を溶出する。

可溶性ＬＤＬリセプター、そのムテイン、融合蛋白およびこれらの塩、官能性誘導体、およびこれらの活性画分は、哺乳動物においてウイルス疾患の治療に有効である。

本発明は、単独の活性成分としてまたは他の抗ウイルス剤（例えばインターフェロン）とともに、薬剤として許容される担体、本発明の可溶性ＬＤＬリセプター、その活性ムテイン、融合蛋白およびこれらの塩、官能性誘導体、およびこれらの活性画分よりなる薬剤組成物に関する。これらの組成物はウイルス疾患に対して使用される。投与法は同様の薬剤に対して使用される任意の方法でよく、治療すべき症状に依存する（例えば全身性のウイルス血症の場合は静脈内または筋肉内または皮下、また局所感染の場合は局所注射または局所投与、または連続的な注入など）。

本発明の薬剤は、可溶性ＬＤＬリセプター、その誘導体を単独または他の抗ウイルス剤と組合せて、薬剤として許容される担体、安定剤および賦形剤を混合し、投与型（例えば投与バイアル中で凍結乾燥）で、投与用に調製される。投与すべき活性化合物の量は、投与経路、治療すべき疾患および患者の状態に依存する。例えば局所投与は、体重に対して全身性のウイルス血症の場合の静脈内注入より少量の蛋白でよい。

以下の非限定例により本発明を例示する。

例１：可溶性ＬＤＬリセプターの抗ウイルス活性の予備的同定
ＩＦＮで誘導した細胞の上清中の未知の抗ウイルス因子の存在は種々の実験で証明された。

抗ウイルス作用は、ヒトＷＩＳＨ細胞と抗原投与としてのＶＳＶを用いるウイルス細胞変性作用（ＣＰＥ）測定法（ルービンスアイン（Rubinstein, S）ら、(1981) J. Virol. 37:755-758）により測定した。最初の試験はＩＮＦ−α、ＩＮＦ−βおよびＩＮＦ−ガンマを用いて行い、３つのすべてのＩＦＮに対して同様の結果が得られた。

図１に示した実験（表１に要約されている）では、ヒト羊膜ＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣ ＣＣＣＬ−２５）を９６穴マイクロタイタープレートに接種した。数時間後１０％胎児牛血清を補足したＭＥＭ（最小基本培地）中のＩＮＦ−α、ＩＮＦ−βおよびＩＮＦ−ガンマの５０Ｕ／ｍｌから始まる連続２倍希釈系列を、（上から）それぞれ１−３、４−６および７−９列の細胞のモノレーヤーに添加し、細胞を３７℃で一晩インキュベートした。列１、５および９の培地は取らなかった。列２、６および１０の培地を吸引し、細胞モノレーヤーを１回洗浄し、新鮮な培地を加えた。列３、７および１１では培地を各ＩＦＮの新鮮な希釈物で置換し、それぞれ列４、８および１２ではＩＮＦ−α、ＩＮＦ−β（ＮＩＨ標準物質）に対する中和性抗体およびＩＮＦ−ガンマに対する中和性抗体（モノクローナル抗体１６６．５、ノビック（Novick）ら、(1983) EMBO 3(2), 1527）を加えた。増殖培地中のＶＳＶをすべてウェル（穴）に添加した。感染した培養物をさらに一晩インキュベートし、次にウイルス細胞変性作用の程度を目視により評価できるようにクリスタルバイオレットで染色した。
（表１）

表１：ＩＦＮ作用における抗ウイルス因子の役割

図１ 処理(1) ５０％ＣＰＥ 単位／ml(2) 活性％
の列 の希釈倍率

１ ＩＮＦ−α 24 時間、標準測定法 400 1000 100
２ ＩＮＦ−α 24 時間、洗浄 100 250 25
３ ＩＮＦ−α 24 時間、ＩＦＮを置換 200 250 25
４ ＩＮＦ−α 24 時間、中和 300 375 37
５ ＩＮＦ−β 24 時間、標準測定法 400 1000 100
６ ＩＮＦ−β 24 時間、洗浄 200 500 50
７ ＩＮＦ−β 24 時間、ＩＦＮを置換 400 1000 100
８ ＩＮＦ−β 24 時間、中和 400 1000 100
９ ＩＮＦ−γ 24 時間、標準測定法 800 1000 100
１０ ＩＮＦ−γ 24 時間、洗浄 200 250 25
１１ ＩＮＦ−γ 24 時間、ＩＦＮを置換 400 500 50
１２ ＩＮＦ−γ 24 時間、中和 800 1000 100


(1) 標準測定法では、９６穴マイクロタイタープレート中のＷＩＳＨ細胞のモノレーヤーに、（列１、５および９）ＩＦＮを連続２倍希釈系列で加えた（図１の右から左）。２４時間後にＶＳＶを加え、１８時間後細胞を固定し染色した。他の場合は、ＶＳＶの抗原投与の直前に、洗浄（列２、６および１０）、新鮮な培地中のＩＦＮで置換（列３、７および１１）または抗ＩＦＮ中和性抗体の添加（列４、８および１２）を行った。
(2) ＩＦＮ標準物質（列１、５および９）の力価を１０００Ｕ／ｍｌとした。

まず５０％ＣＰＥを与えたＮＩＨ標準物質ＩＦＮ（列１、５および９）の希釈率を求めた。図１の列２、６および１０に示すように、２４時間後とＶＳＶ抗原投与の直前に洗浄すると、３つのすべてのＩＦＮの力価が有意に低下した。ＩＦＮの新鮮な希釈物で培地を置換するとＩＮＦ−α（列３）とＩＮＦ−ガンマ（列１）による防御のレベルが低下したが、ＩＮＦ−β（列７）では低下しなかった。ＩＦＮに２４時間接触させた後に増殖培地に中和性抗ＩＦＮ抗体を添加すると、ＩＮＦ−α（列４）の活性にはほんのわずかの影響しか与えず、ＩＮＦ−βとＩＮＦ−ガンマ（それぞれ列８と１２）の活性には全く影響を与えなかった。

ＩＦＮは特異的細胞表面リセプターとの相互作用の後に細胞内に抗ウイルス状態を誘導するため、抗ウイルス状態が確立したらこれらを除去しても細胞はウイルスに対して防御され続ける。従って抗ウイルス状態の確立の後にＩＦＮを除去しても見かけのＩＦＮの力価は変化しないと考えられる。しかし上記の実験ではウイルスを抗原投与（列２、６および１０）する前に培地を置換すると、特定のＩＦＮ試料の見かけの抗ウイルス力価は、有意に低かった。培地を新鮮なＩＦＮで置換した場合も、ＩＮＦ−α（列３）とＩＮＦ−ガンマ（列１１）では防御のレベルは、置換しない場合よりも低かった。従って培地はウイルス感染から細胞を防御する非インターフェロン成分を有していた。

ＩＦＮの添加後に細胞をインキュベートし、増殖培地を置換することなくウイルス抗原投与の前に抗ＩＦＮ中和抗体を添加すると、ＩＮＦ−αの抗ウイルス活性のみわずかに低下した（列４）がＩＮＦ−βまたはＩＮＦ−ガンマ（それぞれ列８と１２）の活性は低下しなかった。これらの結果は、ＩＦＮ含有培地を除去した時観察された活性の低下はＩＦＮ分子の除去によるのではなく、むしろ充分な抗ウイルス防御能を与えるのに必要な他の分子の除去によることを示唆している。

ＩＦＮのＣＰＥ低下測定法においてインビトロで、培地中の抗ウイルス活性の増強が証明された。ＩＦＮ抗ウイルス活性においてインビボでも活性細胞外成分がある役割を果たしている可能性がある。分泌された成分が連続的に除去されている全身性の疾患でＩＦＮを使用するとき、このような因子の投与はＩＦＮの作用を大いに増強するかも知れない。

例２：抗ウイルス蛋白の産生と精製

２．１ 粗抗ウイルス蛋白の産生
スピナーフラスコ中のフィブラセルディスク（Fibracell discs）（ステリリン（Sterilin）、英国）上で、１０％胎児牛血清（ＦＣＳ）を補足したＭＥＭよりなる培地中で、コンフルーエントになるまでヒト羊膜細胞ＷＩＳＨ（ＡＴＣＣＣＣＬ−２５）を増殖させた。コンフルーエントのところで培地を捨て、ディスクを無血清ＭＥＭで数回洗浄した。次に細胞を、蛋白を含まない血清代替物ＡＤＣ−１（１：５０、バイオロジカルインダストリーズ（Biological Industries）、ベイトヘメック（Beit Haemek）、イスラエル）、ヘペス２０ｍＭ、インスリン０．２μｇ／ｍｌおよびＩＮＦ−ガンマ（３０Ｕ／ｍｌ）を補足したＭＥＭ（１．３リットル）中でインキュベートした。３７℃で１７時間インキュベートを続けた。次に培地を集め、遠心分離し（５０００×ｇ、１５分）、上清を集め、使用するまで短時間（２４時間まで）４℃で無菌条件下で保存したか、または−２０℃に保存した。蛋白を含まない培地とＩＮＦ−ガンマをさらに加えることにより、培養細胞を産生のために連続的に使用することができた。

２．２ 粗抗ウイルス因子の濃縮
抗ウイルス性因子はポリエチレングリコール２０，０００に対して透析するか、または限外濾過により濃縮することができる。上記工程２．１の粗細胞上清（１．５リットル）を分子量カットオフが１０，０００のポリスルホン膜（ＰＴＧＣミニタンプレート）を用いてミニタン（Minitan）装置（ミリポア（Millipore）、米国）中で限外濾過して約３０倍濃縮した。粗保持物（retentate）をホウ酸ナトリウム緩衝液、２０ｍＭ、ｐＨ８（緩衝液Ａ）で洗浄し、容量を約５０ｍｌにした。この物質を直ちに使用するかまたは使用するまで−２０℃に保存した。

２．３ ＴＳＫ−ＤＥＡＥでのクロマトグラフィー
ＴＳＫ−ＤＥＡＥカラム（２．５×３３ｃｍ、トーソー（Tosoh）、日本）を緩衝液Ａで平衡化させた。上記のミニタン工程２．２からの濃縮抗ウイルス性因子を、流速８ｍｌ／分でカラムにかけた。次にカラムを緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ａ中の５０、１００、２００および５００ｍＭのＮａＣｌで段階的に溶出した。１２ｍｌの画分を集め生物測定法で測定した。カラムを２８０ｎｍの吸光度により追跡した（図２）。２００ｍＭのＮａＣｌで溶出した蛋白のピークは、中和性の抗ＩＮＦ−ガンマモノクローナル抗体Ｎｏ．１６６−５の存在下で試験した時抗ウイルス活性を有していた。これを集め、ＹＭ−１０膜（分子量カットオフ１０，０００、アミコン（Amicon）、米国）の限外濾過により約２０ｍｌの容量に濃縮した。この物質を使用するまで−２０℃に保存した。

２．４ ハイドロキシアパタイトのクロマトグラフィー
ハイドロキシアパタイトバイオゲルＴＨＰカラム（２．５×４ｃｍ、バイオラッド（BioRad）、米国）を水で平衡化させた。工程２．３の濃縮した０．２ＭのＮａＣｌの蛋白ピーク（１６６ｍｇ）を、流速２ｍｌ／分でバイオゲルＨＴＰカラムにかけた。カラムを水で洗浄し、１５ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で溶出した。２ｍｌの画分を集め、抗ウイルス活性を試験した。カラムを２８０ｎｍの吸光度で追跡した（図３）。抗ウイルス活性は１５ｍＭのリン酸ナトリウム溶出液中で見いだされ、これを集め限外濾過により濃縮した。

２．５ 陰イオン交換ＨＰＬＣ
陰イオン交換ＨＰＬＣカラム（スーパーホルマンス（Superformance）−ＴＭＡＥ−６５０Ｓ、イー・メルク（E. Merck）、ドイツ）を緩衝液Ａであらかじめ平衡化させた。工程２．４からの７３ｍｇの蛋白を含有する濃縮したプールを遠心分離（１０，０００×ｇ、５分）し、上清を流速１ｍｌ／分でカラムにかけた。カラムを緩衝液Ａで洗浄し、次に緩衝液Ａ中の５０、１００、２００および５００ｍＭのＮａＣｌで段階的に溶出した。２．５ｍｌの画分を集め、抗ウイルス活性を測定した。カラムを２８０ｎｍの吸光度で追跡した（図４）。活性は２００ｍＭのＮａＣｌ画分で溶出した。この画分を集め使用するまで−２０℃で保存した。

２．６ 疎水性相互作用クロマトグラフィー
フェニルセファロースカラム（１．５×６．５ｃｍ、ファルマシア（Pharmacia）、スエーデン）を緩衝液Ａ中の１．５ＭのＮａＣｌで平衡化させた。工程２．５の２００ｍＭのリン酸ナトリウムの蛋白ピーク（１０ｍｇ）を１．５ＭのＮａＣｌにし、フェニルセファロースカラムにかけた（１ｍｌ／分）。カラムを緩衝液Ａ中１．５ＭのＮａＣｌで洗浄し、非結合ピークを集めた。カラムを緩衝液Ａ中の１ＭのＮａＣｌ、緩衝液Ａおよび ＣＨ₃ＣＮ／５０％緩衝液Ａで段階的に溶出した。抗ウイルス活性は非結合画分（１．５ＭのＮａＣｌ）で得られた。カラムを２８０ｎｍで追跡した（図５）。

２．７ 逆相ＨＰＬＣ
工程２．６の非結合のプールした画分（１．２ｍｇ）を、２０ｍＭヘペス緩衝液ｐＨ７．５であらかじめ平衡化したアクアポアＲＰ３００ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（４．６×３０ｍｍ）にかけた。カラムを洗浄し、同じ緩衝液中のアセトニトリル勾配により流速０．５ｍｌ／分で溶出した。１ｍｌの画分を集め、抗ウイルス活性を試験した。抗ウイルス活性は１４％アセトニトリルで溶出し、蛋白ピークに関連していた。しかしこのピークは隣接するピークから完全に分離はしなかった（図６）。カラムはフルオレスカミンを基礎とするカラム後の反応系により追跡した（スタインとモシェラ（Stein S. and Moschera J.）、1981, Methods in Enzymology, 79:7-16）。

活性画分（５６μｇ）をプールし、２０ｍＭヘペス緩衝液ｐＨ７．５で２倍希釈し、アクアポアＲＰ３００カラムで再クロマトグラフィーをした（図７）。各画分の少量（４００μｌ）を限外濾過により濃縮し、ドデシル硫酸ナトリウムとβ−メルカプトエタノールの存在下でポリアクリルアミド（１３％）ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。蛋白バンドは銀染色により目視できるようにした。レーンは：レーン１−７、ＨＰＬＣの１０−１６の画分；レーン８、対照試料緩衝液；レーン９、左側に示した分子量マーカー（図８）。

例３：抗ウイルス性因子の性状解析

３．１ 抗ウイルス活性の生物測定法
この測定法は、ＩＦＮ活性を測定するために使用される細胞変性作用（ＣＰＥ）阻害測定法に類似している（ルービンスタイン（Rubinstein S.）ら、(1981) J. Virol. 37:755-758）。抗ウイルス活性はヒトＩＮＦ−βのＮＩＨ標準物質に対して較正されている。これはまたＩＮＦ−α標準物質でも較正してあるが、ＩＮＦ−ガンマ（これはこれらの測定条件下ではウイルスから細胞を防御しない）では較正していない。以下の方法が使用される。

９６穴平底プレート中で１０％ＦＣＳを補足したＭＥＭの１００μｌ中で４５，０００細胞／ウェルを接種して、コンフルーエントなモノレーヤーのＷＩＳＨ細胞を第１日目に調製する。プレートを５％ＣＯ_２中で３７℃でインキュベートする。第２日目に抗ウイルス性因子の試料を別のプレート中で連続２倍希釈をする（１００μｌ）。１０００Ｕ／ｍｌのＩＮＦ−ガンマを中和するのに充分な中和性モノクローナル抗ＩＮＦ−ガンマ抗体（１６６−５）を各ウェルに加え、溶液をＷＩＳＨ細胞とともにプレートに移し、次に直ちに適当な量（下記）の保存ＶＳＶ（５０μｌ）で抗原投与する。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。測定は標準物質ＩＮＦ−βで較正されている。第３日目に、ウイルス抗原投与の約２０時間後に対照ウェル中の細胞変性作用を顕微鏡で観察する。これが８０％以上の場合、プレートの水を切ってモノレーヤーをクリスタルバイオレット（７０％メタノール水溶液中で０．５％）で染色し、多量の水道水で洗浄し、顕微鏡下で観察して終点を求める。この測定のためのＶＳＶの適当な量は、測定条件下で標準ＩＮＦ−βの連続２倍希釈に加えられた場合、２０−２４時間のインキュベート後約３−６Ｕ／ｍｌのＩＮＦ−β希釈で５０％ＣＰＥを与える、保存ＶＳＶの希釈率である。

３．２ 抗ウイルス性因子は蛋白である
抗ウイルス性因子が蛋白であることを証明するために３つの実験を行った。
ａ． 分子量＞１０，０００。抗ウイルス活性はＰＥＧ２０，０００に対する透析およびカットオフ１０，０００ダルトンの膜の限外濾過により濃縮できることは、この抗ウイルス性因子が巨大分子であることを示している。

ｂ． 熱に対する不安定性。モノ（Mono）Ｑ陰イオン交換工程（例２の工程２．５と同じ）からの活性画分を、１００℃の浴中で１０分加熱し抗ウイルス活性を試験した。この処理の後には活性は認められなかった。表２を参照。

ｃ． トリプシン感受性。モノ（Mono）Ｑ陰イオン交換工程からの活性画分を蛋白：酵素比５：１で、ＴＰＣＫ−処理したトリプシン（ワーシントン（Worthington））で室温でインキュベートした。対照画分はトリプシンなしで同様に保存し、対照トリプシンを同様にして作成した。抗ウイルス活性の６６％はトリプシン処理により失われたため、抗ウイルス性因子はトリプシン感受性であると結論された。

ｄ． 抗ウイルス性因子はインターフェロンではない。インターフェロンは細胞内に、インターフェロンの除去後も続く抗ウイルス状態を誘導する蛋白であると規定される。細胞をモノＱ工程からの抗ウイルス性因子含有培地と２４時間インキュベートし、培地を除去し、細胞を洗浄してＶＳＶで抗原投与した。従って抗ウイルス性因子はインターフェロンではなく、その作用機構はインターフェロンのものとは異なると結論された。

ｅ． 抗ウイルス性因子はおそらく分解性酵素ではない。抗ウイルス性因子の作用部位と作用様式はいまだに未知である。これらの問題を明らかにするために、異なるウイルスでさらに試験が必要である。この因子がウイルスを分解する酵素（例えば蛋白分解性酵素）であるか否かを試験するために、１つの簡単な実験を行った。この目的のためにＶＳＶを、この因子の連続２倍希釈系列と３７℃で異なる時間インキュベートした。次にウシＭＤＢＫ細胞をウェルに加え、ＣＰＥの程度を求めた。ＶＳＶは抗ウイルス性因子の添加の直後に細胞と混合された時、または抗ウイルス性因子と３７℃で５時間あらかじめインキュベートされた時、ＶＳＶは同定度のＣＰＥを与えることが見いだされた。従って抗ウイルス性因子はおそらくウイルス分解性酵素ではないと結論された。
（表２）

表２：抗ウイルス性因子の熱とトリプシンに対する感受性

試料 活性
Ｕ／ｍｌ ％
保存（モノＱ）抗ウイルス性因子、一晩、室温 ７５ １００
保存抗ウイルス性因子＋トリプシン、一晩、室温 ２５ ３３
保存抗ウイルス性因子（モノＱ）、室温、１０分 ６５ １００
保存抗ウイルス性因子、１００℃、１０分 ０ ０

３．３ 抗ウイルス性因子のサイズ排除クロマトグラフィー
ＴＳＫ−ＤＥＡＥ工程からの抗ウイルス性因子（０．４ｍｌ）を、ほとんど生理的条件下でリン酸緩衝化生理食塩水中でサイズ排除カラム（スーパーローズ１２、１×３０ｃｍ、ファルマシア（Pharmacia））で分画した。カラムをあらかじめ平衡化し、流速０．５ｍｌ／分でリン酸緩衝化生理食塩水で溶出した。１ｍｌの画分を集め、各画分について抗ウイルス活性を測定した。カラムを２８０ｎｍで追跡した（図９）。カラムは分子量マーカーとしてのウシ血清アルブミン（６７Ｋ）とカルボニックアンヒドラーゼ（carbonic anhydrase）（３０Ｋ）で較正した。抗ウイルス活性は見かけの分子量４０，０００のピークで溶出することが見いだされた。しかしこのピークは広めであった。

３．４ 抗ウイルス性因子の種特異性
抗ウイルス性因子はヒトＷＩＳＨ細胞上で活性であることが見いだされた。これはまたウシＭＤＢＫ細胞および齧歯類Ｌ細胞上で活性があることが見いだされた。従ってこの因子は種特異性はないと結論された。

３．５ 蛋白配列解析と抗ウイルス性因子の同定
最後のＲＰ−ＨＰＬＣ工程（例２の２．７を参照）からの画分１０−１２の少量（４００μｌ）をプールし、限外濾過で濃縮し、濃縮物（０．５μｇ）をモデル４７５蛋白微量配列解析装置（アプライドバイオシルテムズ（Applied Biosystems）、米国）で微量配列解析をした。この系で同定した得られたＮ−末端１５個のアミノ酸残基の配列を図１０に示す。サイクル１０のアミノ酸は同定しなかったが、サイクル３のＰｒｏはあまり自信がなく同定した（ピコモル比で示されている）。

得られたアミノ酸配列をＮＢＲＦ蛋白データバンクと比較し、前駆体ＬＤＬリセプターの残基２５（成熟ＬＤＬリセプターの残基４）から始まるヒト低比重リポ蛋白（ＬＤＬ）リセプターのＮ−末端配列と１００％同じであった。サイクル３、１０および１５のアミノ酸は、予備的修飾なしには同定できないシステイン残基であるため、配列解析装置では正しく同定されなかった。単離されたリセプターと公知のＬＤＬリセプターの同一性を図１１にしめす。

分子量の推定のために用いた２つの方法によれば、本発明の可溶性抗ウイルス性蛋白の分子量は２９，０００または４０，０００である。従って抗ウイルス性蛋白はＬＤＬリセプターのＮ−末端システインの豊富なドメインに対応すると結論された。エッサー（Esser）（エッサー（Esser V.）ら、(1988), J. Biol.Chem. 263, 13282-13290）によれば、２９２個のアミノ酸残基のシステインに富むＮ−末端ドメインは、ＬＤＬリセプターのリガンド結合ドメインであり、その計算された分子量はグリコシル化の程度により約３３，０００−３８，０００である。

例４：抗ウイルス性因子の免疫親和性クロマトグラフィー

抗ウイルス性因子とｓＬＤＬＲの最も直接的な証明は、モノクローナル抗体Ｃ７カラムでの粗抗ウイルス性蛋白の親和性クロマトグラフィーにより得られた。この抗体はウシおよびヒトＬＤＬＲのリガンド結合ドメインに対するものである。（バイシーゲル（Beisiegel, U.）ら、(1981) J. Biol. Chem.,256, 11923-11931）。ハイブリドーマＣ７（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６９１）をマウスで腹水として増殖させ、硫酸アンモニウム分画法により免疫グロブリンを単離した。Ｃ７免疫グロブリン（１９ｍｇ）を１ｍｌのアガロースに結合させた。ＴＳＫ−ＤＥＡＥ工程（"load"（「のせた量」）、１４ｍｌ、３７．８ｍｇ蛋白、２８００単位）の２００ｍＭのＮａＣｌ画分からの部分精製したＡＶＨを、このカラムにかけた。溶出液（"effl."）を集め、カラムをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．５Ｍの食塩７０ｍｌで洗浄し（"wash"）、次にＰＢＳ（３０ｍｌ）で洗浄した。次にカラムを５０ｍＭのＮａ₂ＣＯ₃（ｐＨ１１）で溶出し（el.2およびel.3）、回収率は３２％であった（図１２）。溶出した画分の蛋白の量は０．１５ｍｇであり、精製の程度は８３であった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色により多くのバンドが得られた。しかしモノクローナル抗体Ｃ７のウェスタンブロット（ゲルは非還元条件下）では（図１３）、load画分、effluent画分そしてwash画分にもリセプターは検出されなかった（それぞれレーン２、３および４）。しかしel.2とel.3では（レーン５と６）可溶性ＬＤＬリセプターの２８Ｋのバンドが得られた。またel.2とel.3では弱い４０Ｋバンドと１００Ｋバンド（これらはおそらくＬＤＬリセプターの大きな細胞外断片であろう）を含む高分子量バンドが見られた。２００Ｋの近くの強いバンドはＣ７試料（レーン７）と同一であったため、おそらくカラムから漏れたモノクローナル抗体Ｃ７であり、蛋白Ａと反応したのであろう。

例５：インターフェロンによる細胞表面ＬＤＬＲの誘導

可溶性ＬＤＬリセプターも細胞表面リセプターも同じ遺伝子を有するため、インターフェロンが可溶性ＬＤＬリセプターを誘導する能力は、これが細胞表面ＬＤＬリセプターも誘導することができることを示唆する。完全なサイズのＬＤＬリセプターを誘導することができるか否かを試験するために、コンフルーエントにまで増殖させたＷＩＳＨ細胞を、２％胎児牛血清を含む培地中で種々のインターフェロンと培養した。細胞を洗浄し、モノクローナル抗体Ｃ７と４℃で２時間インキュベートし、洗浄し、¹²⁵Ｉ−蛋白Ａ（約８０，０００ｄｐｍ）と４℃で２時間インキュベートし、トリプシンで集め計測した。経時変化の実験ではＩＮＦ−ガンマ（１００Ｕ／ｍｌ）によるＬＤＬリセプターの最大の誘導は５時間と２３時間の間で起きた。次にＷＩＳＨ細胞を異なるインターフェロンと１９時間培養して用量応答試験を行った。その結果ＩＮＦ−ガンマはＬＤＬリセプターの最も強力な誘導体であり、最大の誘導は１０−５０Ｕ／ｍｌで見られた。ＩＮＦ−αはより弱い誘導体であり、ＩＮＦ−βは全くＬＤＬリセプターを誘導体しなかった（図１４）。蛋白合成阻害剤シクロヘキシミドの存在下ではＬＤＬリセプターの誘導もその基礎レベルも消失していた。

添加されたインターフェロンではない抗ウイルス活性の存在の証拠を示す。 ＴＳＫ−ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。 ハイドロキシアパタイトバイオゲルＨＴＰカラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。 スーパーホーマンス（Superformance）ＴＭＡＥ−６５−Ｓ陰イオン交換ＨＰＬＣカラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。 フェニルセファロース疎水性相互作用カラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。 逆相アクアポア（Aquapore）ＲＰ−３００ＨＰＬＣカラムからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。 逆相ＨＰＬＣカラムによる再クロマトグラフィーからの蛋白と抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。 精製操作の最後の工程で得られた種々の画分のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析を示す。１３％のアクリルアミドゲルが使用され、銀で染色した。レーンは：１−７、限外濾過で濃縮されたＲＰ−３００クロマトグラフィー（図７）からの画分１０−１６の一部（４００μｌ）；８、対照試料緩衝液；９、左側に示した分子量マーカー。 スーパーローズ（Superose）１２サイズ排除ＨＰＬＣカラムからの抗ウイルス活性の溶出パターンを示す。 微量配列解析装置（microsequencer）の元々のアウトプットを示す。ＲＰ−ＨＰＬＣ（図７）の画分１０−１２（各０．４ｍｌ）をプールし、限外濾過により濃縮し、得られた試料（１μｇ）を蛋白微量配列解析にかけた。 図１０に示す蛋白微量配列解析装置により得られた配列の探索のアウトプットを示す。 モノクローナル抗体Ｃ７カラムで部分的に精製した可溶性ＬＤＬリセプターの免疫親和性クロマトグラフィーからの種々の画分の抗ウイルス活性を示す。バーは：load−カラムにのせたもの；effl.−溶出液（非結合画分）；el.1-4−溶出１−４である。 免疫親和性クロマトグラフィー（図１２に示されている）からの種々の画分のウェスタンブロット解析を示す。蛋白はニトロセルロースに電気ブロットされ、モノクローナル抗体Ｃ７および¹²⁵Ｉ−蛋白Ａで可視化した。レーンは：１、分子量マーカー；２、load；３、非結合；４、洗浄；５、溶出２；６、溶出３；７、モノクローナル抗体Ｃ７である。 種々のインターフェロンによるＷＩＳＨ細胞中の細胞表面ＬＤＬリセプターの投与量応答誘導を示す。細胞は１９ インターフェロンとインキュベートされ、培地に２％胎児牛血清を含む培地、細胞表面ＬＤＬリセプターのレベルはモノクローナル抗体Ｃ７と¹²⁵Ｉ−蛋白Ａにより測定した。

Claims (23)

1. 可溶性ＬＤＬリセプター蛋白、そのムテインと融合蛋白、それらの塩、官能性誘導体および活性画分。
2. 蛋白性不純物に対して均一になるまで精製されている、請求項１に記載の可溶性ＬＤＬリセプター。
3. 実質的に成熟ＬＤＬリセプターの細胞外ドメインよりなる、請求項１または２に記載の可溶性ＬＤＬリセプター。
4. 実質的に成熟ＬＤＬリセプターのリガンド結合ドメインよりなる、請求項１または２に記載の可溶性ＬＤＬリセプター。
5. 実質的に成熟ＬＤＬリセプターのアミノ酸残基４から約２９２に対応するアミノ酸配列を有する、前記請求項のいずれか１項に記載の可溶性ＬＤＬリセプター。
6. 実質的に図１０に示すアミノ酸配列を含む、前記請求項のいずれか１項に記載の可溶性ＬＤＬリセプター。
7. 適当な細胞のインターフェロンによる処理、その上清からの可溶性ＬＤＬリセプターの単離およびそれらの精製よりなる、前記請求項のいずれか１項に記載の可溶性ＬＤＬリセプターの調製法。
8. 使用される細胞はインターフェロンに応答して抗ウイルス状態に入ることができるものである、請求項７に記載の方法。
9. インターフェロンはインターフェロン−ガンマである、請求項８に記載の方法。
10. 以下の工程よりなる請求項７に記載の方法：
    ａ） インターフェロンに応答して抗ウイルス状態に入ることができる細胞をコンフルーエントになるまで増殖させて；
    ｂ） 細胞をインターフェロンで誘導し；
    ｃ） 培養上清を採取し；
    ｄ） 上清を濃縮し；
    ｅ） 工程ｄ）の濃縮した上清を陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて；
    ｆ） 工程ｅ）で得られた画分をハイドロキシアパタイトのクロマトグラフィーにかけて；
    ｇ） 工程ｆ）で得られた画分を陰イオンＨＰＬＣにかけて；
    ｈ） 工程ｇ）で得られた画分を疎水性相互作用クロマトグラフィーにかけて；
    ｉ） 工程ｈ）で得られた画分を逆相ＨＰＬＣにかけて；
    ｋ） 工程ｉ）を繰り返して均一になるまで精製された可溶性ＬＤＬリセプターを得る。
11. １つまたはそれ以上のクロマトグラフィー工程は、抗ＬＤＬリセプターモノクローナル抗体カラムの免疫親和性クロマトグラフィーで置換される、請求項１０に記載の方法。
12. モノクローナル抗体はＣ７（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６９１）であり、可溶性リセプターは高いｐＨで溶出される、請求項１１に記載の方法。
13. ヒトＷＩＳＨ細胞が使用される請求項１０に記載の方法。
14. 実質的に成熟ＬＤＬリセプターのリガンド結合ドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する可溶性ＬＤＬリセプターをコードするＤＮＡ分子。
15. 実質的に成熟ＬＤＬリセプターのアミノ酸残基４から２９２に対応するアミノ酸配列を有する可溶性ＬＤＬリセプターをコードする、請求項１４に記載のＤＮＡ分子。
16. 図１０のアミノ酸配列を含む可溶性ＬＤＬリセプターをコードする、請求項１４に記載のＤＮＡ分子。
17. 請求項１１から１３までのいずれか１項に記載のＤＮＡ分子にハイブリダイズし、可溶性ＬＤＬリセプターをコードするＤＮＡ分子。
18. 請求項１４から１７までのいずれか１項に記載のＤＮＡ分子よりなる発現ベクター。
19. 請求項１８に記載の発現ベクターで形質転換される細胞株。
20. 請求項１９に記載の形質転換細胞株を培養し、培地から可溶性ＬＤＬリセプターを回収することよりなる、組換え可溶性ＬＤＬリセプターの産生方法。
21. 随時薬剤として許容される担体を一緒に含む、可溶性ＬＤＬリセプター、そのムテインおよび融合蛋白、それらの塩、官能性誘導体および活性画分よりなる薬剤組成物。
22. 別の抗ウイルス剤をさらに含む、請求項２１に記載の薬剤組成物。
23. 別の抗ウイルス剤はインターフェロンである、請求項２２に記載の薬剤組成物。