ES2067486T5 - Proteina inhibidora de factor de necrosis tumoral (tnf) y su purificacion. - Google Patents
Proteina inhibidora de factor de necrosis tumoral (tnf) y su purificacion.Info
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Abstract
SE AISLA LA PROTEINA INHIBIDORA DE TNF Y SE PURIFICA SUSTANCIALMENTE. LA CITADA PROTEINA TIENE CAPACIDAD PARA INHIBIR: A) LA UNION DE TNF A SUS RECEPTORES, Y B) EL EFECTO CITOTOXICO DEL TNF. LA PROTEINA INHIBIDORA DE TNF, SUS SALES, SUS DERIVADOS FUNCIONALES Y LAS FRACCIONES ACTIVAS DE ELLA, ASI COMO LAS MEZCLAS DE CUALQUIERA DE LOS PRECEDENTES PUEDEN EMPLEARSE PARA ANTAGONIZAR LOS EFECTOS DELETEREOS DEL TNF.
Description
Proteína inhibidora de factor de necrosis tumoral
(TNF) y su purificación.
Esta invención se refiere a la Proteína
Inhibidora de Factor de Necrosis Tumoral (TNF), sus sales, derivados
funcionales y fracciones activas, excepto para precursores que
tienen la capacidad de inhibir la unión de TNF a sus receptores y el
efecto citotóxico de TNF y que se puede utilizar contra los efectos
deletéreos de TNF. La invención también se refiere a un
procedimiento para la purificación de dicha Proteína Inhibidora de
TNF y a la proteína sustancialmente purificada, a su clonaje y su
producción por técnicas de ADN recombinante. Además, se refiere a
composiciones farmacéuticas que comprenden dicha proteína, o sus
sales, derivados funcionales y fracciones activas, para proteger
contra los efectos deletéreos de TNF.
El Factor de Necrosis
Tumoral-alfa (TNF-alfa) y la
Linfotoxina (TNF-beta) (en lo sucesivo, TNF se
refiere tanto al TNF-alfa como al
TNF-beta) son citocinas que tienen muchos efectos
sobre las células (Wallach, D. (1986) en: Interferon 7 (compilado
por Ion Gresser), págs. 83-122, Academic Press,
London, y Beutler, B. y Cerami, A. (1987) New England J. Med.
316: 379-385). Tanto el
TNF-alfa como el TNF-beta inician
sus efectos uniéndose a receptores específicos de la superficie de
las células. Algunos de los efectos probablemente serán beneficiosos
para el organismo: por ejemplo, pueden destruir células tumorales o
células infectadas con virus y aumentar las actividades
antibacterianas de los granulocitos. Pero, de modo bastante
evidente, tanto el TNF-alfa como el
TNF-beta también tienen efectos que pueden ser
sumamente perjudiciales. Hay evidencias de que la producción
excesiva de TNF-alfa puede desempeñar un papel
patógeno fundamental en diversas enfermedades. Así, ahora se sabe
que los efectos de TNF-alfa, principalmente sobre la
vasculatura, son una causa fundamental de los síntomas del choque
séptico (Tracey, K.J. y col. (1986) Science 234:
470-474). En algunas enfermedades, el TNF puede
ocasionar pérdida excesiva de peso (caquexia) porque suprime las
actividades de los adipocitos y causa anorexia, así que el
TNF-\alpha se denominó caquectina. También se
describió como un mediador del daño a tejidos en enfermedades
reumáticas (Beutler, op. cit.) y como un mediador fundamental del
daño observado en las reacciones injerto frente a huésped.
Por lo tanto, existe necesidad de encontrar
maneras de eliminar o antagonizar el TNF formado endógenamente o
administrado exógenamente. La primera tentativa de la solicitante en
este sentido fue el desarrollo de anticuerpos monoclonales que
neutralizan la actividad citotóxica de TNF-alfa y se
demostró que protegían a los ratones contra el efecto letal de
TNF-alfa en condiciones que simulaban la
estimulación de choque séptico (como se describe en la solicitud de
patente europea EP 186.833, publicada el 9 de julio de 1986). Sin
embargo, la terapia con anticuerpos monoclonales murinos,
especialmente si se administran de forma repetitiva, pueden no ser
siempre aconsejables en seres humanos. Por lo tanto, se sintió la
necesidad de desarrollar agentes biológicos que pudieran antagonizar
de modo similar los efectos deletéreos de TNF.
Antes de la fecha de presentación de la solicitud
de prioridad de la presente solicitud, no había información en
cuanto a la existencia de agentes biológicos que pudieran
antagonizar la actividad citotóxica de TNF. Hubo publicaciones que
describían la uromodulina, una glicoproteína inmunosupresora de 85
kDa aislada de la orina de mujeres embarazadas (Muchmore, Andrew V.
y Decker, Jean M. (1985) Science 229;
479-481), que se demostró que era un ligando de alta
afinidad para y un inhibidor potente de interleucina 1
(IL-1) (Muchmore, Andrew V. y Decker, Jean M. (1986)
J. Biol. Chem. 261: 13404-13407; Brown, K.M.
y col. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
9119-9123). Más tarde, se demostró que la
uromodulina era idéntica a la glicoproteína de
Tamm-Horsfall, la proteína más abundante de origen
renal en orina normal (Pennica, Diane y col. (1987) Science
236: 83-88). Otro inhibidor de
IL-1 encontrado en la orina de pacientes febriles se
describió en algunas publicaciones (Liao, Zenghua y col. (1984) J.
Exp. Med. 159: 126-136; Seckinger, Phillippe
y col. (1987) J. Immunol. 139: 1546-1549). Se
demostró que este inhibidor de IL-1 encontrado en la
orina produce numerosas actividades biológicas de ambas formas de
IL-1 recombinante, IL-1 alfa e
IL-1 beta en el mismo grado. Aunque el
TNF-alfa humano comparte algunas de las actividades
biológicas de IL-1, este inhibidor de
IL-1 no inhibió las actividades biológicas de
TNF-alfa (Seckinger, Phillippe y col. (1987) J.
Immunol. 139: 1541-1545).
Tras la fecha de presentación de la solicitud de
prioridad de la presente solicitud, se describió que la uromodulina
y la glicoproteína de Tamm-Horsfall se unen a la
IL-1-alfa recombinante, la
IL-1-beta y el
TNF-alfa en una interacción similar a la de la
lectina y se sugirió que puede desempeñar un papel fundamental en la
regulación de los niveles circulantes de estas linfocinas (Hession,
Catherine y col. (1987) Science 237:
1479-1484). Aunque la uromodulina no inhibe la
actividad citotóxica de TNF-alfa, como se verificó
por lisis de células tumorales diana, interacciona con
TNF-alfa recombinante vía las cadenas de hidratos de
carbono y esta interacción puede ser crítica para promover el
aclaramiento y/o disminuir de toxicidad in vivo de TNF y
otras linfocinas (Sherblom, Anne P. (1988) J. Biol. Chem.
263: 5418-5424). En una publicación reciente
por Seckinger y col. (J. Exp. Med. (1988) 167:
1511-1516), se describió un inhibidor humano
de TNF-alfa, obtenido a partir de la orina de
pacientes febriles, como una proteína de 40-60 KDa
que inhibía la actividad citotóxica de TNF-alfa. Se
observó que era diferente de uromodulina y del inhibidor de
IL-1 mencionado anteriormente.
La presente invención proporciona una Proteína
Inhibidora de Factor de Necrosis Tumoral (TNF) que presenta las
siguientes características:
(a) inhibe la unión de TNF a sus receptores y el
efecto citotóxico de TNF;
(b) cuando preparados crudos de la misma en orina
se cromatografían en una columna de filtración de Ultrogel AcA 44,
el pico principal de la actividad inhibidora de TNF eluye algo antes
que la mayoría de la proteína y muestra un peso molecular aparente
de aproximadamente 40-80 kDa; y
(c) cuando preparados crudos de la misma en orina
se analizan, el punto isoeléctrico de la proteína activa está entre
pH 6 y 8.
En una realización, dicha Proteina Inhibidora de
TNF se puede obtener de la orina humana mediante
(a) sumisión de la fracción, que no es dializable
a través de una membrana con límite de exclusión de peso molecular a
10 kDa a cromatografía de afinidad en lectina;
(b) elución de la proteína adsorbida en la
lectina;
(c) sumisión de la proteína eluida a filtración
en gel o a cromatografía de intercambio iónico; y
(d) recuperación de aquellas fracciones que
inhiben la unión de TNF a sus receptores y el efecto citotóxico de
TNF.
La invención también se refiere a dicha Proteína
Inhibidora de TNF en forma sustancialmente purificada que contiene
la siguiente secuencia de aminoácidos en su porción
N-terminal:
donde X es un resto de aminoácido
no
identificado,
o una sal, derivado funcional o fracción activa
del mismo excepto para precursores, presentando dicha fracción
activa la capacidad de inhibir la unión de TNF a sus receptores y el
efecto citotóxico de TNF.
La invención también se refiere a un
procedimiento para la purificación de la Proteína Inhibidora de
TNF.
La invención se refiere además a moléculas de ADN
recombinante que comprenden la secuencia nucleotídica que codifica
dicha proteína, vehículos de expresión que las comprenden y células
huésped transformadas con ellos y a un procedimiento para producir
la Proteína Inhibidora de TNF por cultivo de dichas células
transformantes en un medio de cultivo adecuado.
La Proteína Inhibidora de TNF de la invención y
sus sales, derivados funcionales y fracciones activas sirven para
utilizarlas como ingredientes activos de composiciones farmacéuticas
para proteger a los mamíferos contra los efectos deletéreos de
TNF.
La Figura 1A indica el modelo de elución de la
Proteína Inhibidora de TNF a partir de una columna de filtración en
gel de Ultrogel ACA 44. Se recogieron fracciones de 2 ml y se
ensayaron para determinar el contenido de proteína por absorción a
258 nm (---), la interferencia con la unión de
I^{125}-TNF-alfa a su receptor de
la superficie de la célula (x---x) y la inhibición de la actividad
citotóxica de TNF-alfa (\bullet---\bullet). El
pico principal de la actividad inhibidora de TNF eluyó poco antes
que la mayoría de la proteína.
La Figura 1B indica el modelo de elución de la
Proteína Inhibidora de TNF cuando se dializa contra agua antes de
aplicarlo a la columna de filtración en gel de Ultrogel ACA 44. Se
recogieron fracciones de 2 ml y se ensayaron como en la Fig. 1A. La
diálisis contra agua no cambió el modelo de elución cuando se
comparó con la Fig. 1A.
La Figura 2 indica la morfología de células A9
murinas tratadas con cicloheximida (CHI) (a), con
TNF-alfa-CHI (b) y con
TNF-alfa-CHI junto con la Proteína
Inhibidora de TNF (c).
La Figura 3 indica los resultados de la segunda
etapa de la purificación de la Proteína Inhibidora de TNF. La
Proteína Inhibidora de TNF purificada en carboximetil (CM) Sepharose
se cargó en 8 porciones de 2 ml en una columna de intercambio de
cationes de Mono S 5/5 y se eluyó con un gradiente lineal de NaCl 0
a 350 mM (- - -) en un tampón que contenía ácido cítrico
10 mM, azida sódica al 0,02%, pH 5,0. A un caudal de 0,5 ml/minuto,
se recogieron fracciones de 0,5 ml y se ensayaron para determinar la
inhibición de la citotoxicidad de TNF sobre células A9 murinas. La
mayoría de la Proteína Inhibidora de TNF eluyó a una concentración
de sal de NaCl 180 a 200 mM (
\stairs). La proteína se detectó por absorción a 280 nm (---).
La Figura 4 indica los resultados de la tercera
etapa de la purificación de la Proteína Inhibidora de TNF. La
proteína activa obtenida por purificación sobre
CM-Sepharose y Mono S se dializó contra un tampón
que contenía borato de sodio 5 mM, azida de sodio al 0,02%, pH 9,0,
y se cargó en una columna de intercambio de aniones de Mono Q 5/5.
Las proteínas unidas se eluyeron a un caudal de 0,5 ml/minuto, con
un gradiente de sal lineal de NaCl de 0 a 60 mM y después NaCl de 60
a 300 mM (- - - -). Se recogieron fracciones de
0,5 ml y se ensayaron para determinar inhibición de citotoxicidad de
TNF sobre células A9 murinas (
\stairs). La proteína se detectó durante la elución midiendo la absorción a 280 nm (---). Como se indica, la mayoría de la actividad eluyó a una concentración de sal de 30 a 40 mM.
La Figura 5 indica la separación de la Proteína
Inhibidora de TNF por HPLC en fase reversa. La proteína activa
eluida a partir de Mono Q 5/5 se inyectó en una porción de 1,6 ml en
una columna de HPLC de Aquapore RP-300 (Brownlee
Labs) que se eluyó con TFA acuoso al 0,3% (tampón F) en agua a un
caudal de 0,5 ml/minuto. Después la columna se eluyó con un
gradiente lineal de acetonitrilo en tampón F de 0 a 20% durante 5
minutos, seguido de un gradiente lineal de 20-50%
durante 60 minutos y después con un gradiente lineal de
50-80% durante 5 minutos
(- - - -). Se recogieron fracciones de 0,5 ml y se
ensayaron para determinar la inhibición de la citotoxicidad de TNF
sobre células A9 murinas. La concentración de proteína se detectó
durante la elución midiendo la fluorescencia relativa de muestras
representativas de cada fracción, después de la reacción
automatizada con fluorescamina (----). La actividad inhibidora de
TNF eluyó como un pico agudo junto con un pico aislado de
proteína.
Figura 6: Muestras del material activo en cada
etapa de la purificación.
La Proteína Inhibidora de TNF de la invención se
puede encontrar en la orina humana. Cuando sus preparados crudos
derivados de concentrado de orina humana se cromatografiaron en una
columna de filtración en gel de Ultrogel ACA 44, demostró un peso
molecular aparente de 40-80 kDa. La proteína
sustancialmente purificada, que está sustancialmente libre de
impurezas proteicas, tiene un peso molecular de aproximadamente
26-28 kDa cuando se analiza por
EGPA-DSS en condiciones reductoras y se mueve como
un solo pico en cromatografía de líquidos de alta resolución en fase
reversa (HPLC). El punto isoeléctrico de la proteína activa
determinado por enfoque isoeléctrico está entre pH 6 y 8. Su
actividad está determinada por su capacidad para inhibir la unión
de TNF-alfa a sus receptores de la superficie de la
célula en células fibroblásticas HeLa y FS11 humanas y/o por su
capacidad para inhibir el efecto citotóxico de
TNF-alfa sobre células A9 murinas.
Además se caracteriza porque contiene en el
extremo N la siguiente secuencia de aminoácidos:
en donde el aminoácido designado X
en la 14ª posición no se identificó y la presencia de cisteína (Cys)
en la 4ª posición es teórica ya que no se puede identificar PTH
(Fenil tiohidantoína) Cys como tal y no se detectó ningún otro resto
en esta
posición.
El término "sales" como se utiliza aquí se
refiere tanto a sales de grupos carboxilo como a sales de adición de
ácidos de grupos amino de la molécula de proteína, que tienen la
capacidad de inhibir la unión de TNF a sus receptores y de inhibir
el efecto citotóxico de TNF sobre las células. Las sales de un grupo
carboxilo se pueden formar por medios conocidos en la técnica e
incluyen sales inorgánicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio,
amonio, férricas o de cinc, y similares, y sales con bases orgánicas
como aquellas formadas, por ejemplo, con aminas, tales como
trietanolamina, arginina o lisina, piperidina, procaína y similares.
Las sales de adición de ácido incluyen, por ejemplo, sales con
ácidos minerales tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o ácido
sulfúrico, y sales con ácidos orgánicos tales como, por ejemplo,
ácido acético o ácido oxálico.
La expresión "derivados funcionales" como se
utiliza aquí abarca derivados con la capacidad de inhibir la unión
de TNF a sus receptores y de inhibir el efecto citotóxico de TNF
sobre las células, que se pueden preparar a partir de los grupos
funcionales que se encuentran como cadenas laterales sobre los
restos o los grupos N o C-terminales, por medios
conocidos en la técnica y se incluyen en la invención con tal que
permanezcan farmacéuticamente aceptables, es decir, que no destruyan
la actividad de la proteína y no confieran propiedades tóxicas a las
composiciones que los contienen.
Estos derivados pueden incluir, por ejemplo,
ésteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos
carboxilo por reacción con amoníaco o con aminas primarias
osecundarias, derivados N-acilados de grupos amino
libres de los restos de aminoácido formados con restos acilo (v.g.,
grupos alcanoílo o aroílo carbocíclicos) o derivados
O-acilados de grupos hidroxilo libres (por ejemplo,
de los restos serilo o treonilo) formados con restos acilo.
Como "fracciones activas" de la Proteína
Inhibidora de TNF, la presente invención abarca cualquier fragmento
de la cadena polipeptídica de la molécula de proteína sola o junto
con moléculas asociadas o restos unidos a ellas, por ejemplo, restos
de azúcar o fosfato, o agregados de la molécula de proteína o de los
restos mismos de azúcar, siempre que dicha fracción tenga la
capacidad de inhibir la unión de TNF a sus receptores y de inhibir
el efecto citotóxico de TNF sobre las células.
La presente invención también se refiere a
mezclas de cualesquiera de los anteriores.
En una caracterización preliminar en el estado
crudo, seobservaron las siguientes propiedades y actividades de la
proteína:
- a)
- La actividad inhibidora de TNF se pudo encontrar en la orina de donantes tanto sanos como enfermos;
- b)
- La proteína activa no fue dializable a través de membranas con un límite de exclusión de peso molecular de 10 kDa;
- c)
- El peso molecular aparente de la Proteína Inhibidora de TNF activa, cuando se cromatografió en una columna de filtración en gel de Ultrogel ACA 44, se encontró que estaba entre 40 y 80 kDa. La diálisis extensiva contra agua no cambió el comportamiento de la proteína en este procedimiento (Fig. 1A y 1B);
- d)
- El punto isoeléctrico de la proteína activa, determinado por enfoque isoeléctrico preparativo estaba entre pH 6 y 8,
- e)
- La proteína activa se unía en parte a Concanavalina-A Sepharose y se pudo eluir específicamente con metil-alfa-D-manopiranósido, lo que sugiere que la proteína está glicosilada;
- f)
- La actividad inhibidora de TNF era lábil al calor;
- g)
- Diversos inhibidores de proteasa no interfirieron con la actividad biológica de la Proteína Inhibidora de TNF, lo que indica que no se pudo explicar por actividades proteolíticas presentes en orina cruda; y
- h)
- La inhibición de la unión de TNF-alfa a sus receptores de la superficie de las células sólo ocurría cuando la mezcla cruda de proteínas que contiene la Proteína Inhibidora de TNF se aplicaba simultáneamente con el TNF (Tabla 1).
Así, la Proteína Inhibidora de TNF de la presente
invención difiere de la uromodulina en varias de las características
anteriores, tales como por (a) su peso molecular aparente en
filtración en gel, (b) su punto isoeléctrico y (c) el hecho de que
no se pudo observar agregación extensiva de la proteína cuando se
dializó contra agua.
Se obtuvieron preparados de la Proteína
Inhibidora de TNF parcialmente purificada por fraccionamiento de las
proteínas urinarias por filtración en gel, de acuerdo con el
siguiente procedimiento: Se concentró orina por ultrafiltración con
una membrana de un límite de exclusión de peso molecular de 10 kDa
y después además por ultrafiltración con una membrana de un límite
de exclusión de peso molecular de 5000 (membrana Amicon YM5). El
concentrado se dializó contra PBS (solución salina tamponada con
fostato) que contenía Mg^{2+} 1 mM, Ca^{2+} 1 mM y después se
cargó en una columna de Concanavalina A-Sepharose
equilibrada con el mismo tampón. La columna se lavó y las proteínas
que se habían unido específicamente a la columna se eluyeron con
metil-alfa-D-manopiranósido
0,5 M. La mayoría de, pero no toda, la actividad que interfiere con
la unión de TNF-alfa a su receptor se encontró que
se adsorbía específicamente en la lectina y se pudo eluir con
metil-alfa-D-manopiranósido.
Una muestra de 3,5 mg de proteínas eluidas con
Concanavalina A se dializó contra PBS y fraccionó por cromatografía
de filtración en gel sobre una columna de Ultrogel ACA 44 de 2 x 45
cm (LKB, Suecia). La absorción de las proteínas eluidas se determinó
a 258 nm (---). Se recogieron fracciones de 2 ml y se examinaron a
una dilución de 1:20 para determinar su capacidad de proteger contra
TNF-alfa siguiendo los procedimientos de ensayo 2.1
(x---x) y 2.2 descritos en lo sucesivo, modificándose dicho último
ensayo para que el TNF-alfa se aplicara a una
concentración de 75 U/ml y se utilizaron células
Balb/c-CL.7 en el ensayo. La viabilidad de las
células se examinó 12 horas más tarde determinando la captación de
tinte rojo neutro (\bullet---\bullet) (Fig. 1A).
Una muestra idéntica de las proteínas que eluyen
a partir de Concanavalina A se sometió a 48 horas de diálisis contra
agua destilada y después se centrifugó para separar proteínas
insolubles. Se liofilizó y después se reconstituyó en PBS y se
sometió a cromatografía sobre la columna de Ultrogel ACA 44 como
antes. Se recogieron fracciones y se ensayaron como antes. No hay
ningún cambio significativo en el modelo de fraccionamiento de la
actividad protectora (Fig. 1B). Cuando se comparó con el tiempo de
retención de marcadores de peso molecular (seralbúmina bovina 67
kDa, ovalbúmina 43 kDa, inhibidor de tripsina de soja 20,1 kDa y
citocromo C 12,3 kDa), se encontró que la actividad eluía algo más
pronto que el pico de proteína principal con actividad máxima a un
peso molecular aparente de aproximadamente 50 a 70 kDa.
Sólo se observa disminución de la unión de
^{125}I-TNF-alfa a las células por
la Proteína Inhibidora de TNF presente en el concentrado de orina
cuando el ^{125}I-TNF-alfa y la
proteína se aplican conjuntamente a las células y no cuando primero
se aplica la proteína a las células y después se retira antes de la
aplicación de TNF-alfa. Esto indica que la
interferencia con la unión de TNF-alfa a las células
no es debida a un efecto de la proteína inhibidora de TNF a las
células ni es debida a la presencia de TNF-alfa
mismo en la orina, sino que más bien refleja alguna clase de
interacción entre la proteína de la invención y el
TNF-alfa.
Se utilizaron dos procedimientos de ensayo para
detectar la actividad de la Proteína Inhibidora del TNF en las
fracciones diferentes durante el procedimiento de purificación.
- El procedimiento de ensayo para la cuantificación de la unión de TNF a las células se realizó como está descrito (Israel, S. y col. (1986) Immunol. Letters 12: 217-224; Holtmann, H. y Wallach, D. (1987) J. Immunol. 139: 1161-1167).
- Las células (células HeLa o fibroblastos de prepucioFS11) se sembraron en DMEM (medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbecco) a una densidad de 2,5 x 10^{5} células/pocillo en placas con pocillos de 15 mm. Después de 24 horas de incubación a 37ºC en CO_{2} al 5%, las placas se transfirieron a hielo, el medio de propagación se retiró y se mezclaron alícuotas de las muestras que contenían la Proteína Inhibidora de TNF con 10 unidades de TNF-alfa marcado con ^{125}I (10^{5} cpm) en 0,15 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) suplementada con Ca^{2+} 1 mM y Mg^{2+} 1 mM, 0,5 mg/ml de seralbúmina bovina (BSA) y azida sódica al 0,1% (PBS/BSA) y se aplicaron a las células e incubaron durante 2 horas a 4ºC. Después, las células se lavaron con PBS/BSA, se transfirieron a viales para medición de radiactividad y se cuantificó su marcador asociado en un contador de radiación gamma. La unión inespecífica se determinó añadiendo exceso de TNF al ensayo y el valor se restó en todos los casos.
Este ensayo biológico se desarrolló en base al
efecto citotóxico de TNF sobre células sensibilizadas con
cicloheximida (CHI) y su cuantificación por el método de captación
de rojo neutro, descrito en Wallach, D. (1984), J. Immunol.
132: 2464-2469.
- -
- Las muestras que se iban a ensayar para determinar la presencia de la proteína se diluyeron seriadamente al doble, a 4ºC, en DMEM y se les añadió un volumen igual del mismo medio conteniendo 40 \mug/ml de TNF-alfa y 400 \mug/ml de cicloheximida (CHI).
- -
- Se sembraron células A9 murinas en placas de microtítulo de fondo plano, de 96 pocillos, (1,5 x 10^{4} células/pocillo) con 100 \mul de DMEM-CS (DMEM conteniendo 5% de suero bovino fetal y 5% de suero bovino).
- -
- Se aplicaron alícuotas de 100 \mul de las mezclas de proteína-TNF-alfa-CHI diluidas seriadamente a cada pocillo y además las células se incubaron durante 14 horas.
- -
- La viabilidad de las células se determinó por incubación con rojo neutro durante 2 horas, separando por lavado todo el exceso de tinte, extrayendo el rojo neutro que había sido captado por las células con mezcla de tampón citrato de Sorenson-etanol, y cuantificándolas colorimétricamente a 570 nm con un Auto-lector Microelisa.
- -
- 1 U/ml de actividad inhibidora de TNF se definió como el factor de dilución que da una protección estadísticamente significativa contra muerte por TNF (p<0,05).
Preferiblemente, el bioensayo se utiliza en la
presente invención para detectar la actividad de la proteína durante
la purificación, ya que es menos laborioso y no implica el uso de
material radiomarcado. No hay necesidad de transferirlas células de
los pocillos individuales a viales de recuento y se pueden puntuar
ensayos múltiples bastante rápidamente con el uso del
Auto-lector Microelisa.
La morfología de las células A9 murinas tratadas
en condiciones de acuerdo con este bioensayo se indica en la Figura
2. En (a) se observan células incubadas con CHI solamente, en (b) se
observan células incubadas con una mezcla de
TNF-alfa-CHI y en (c) se observan
células incubadas con una mezcla de
TNF-alfa-CHI junto con una muestra
de la Proteína Inhibidora de TNF (después de purificación en
CM-Sepharose, como se describe en lo sucesivo). El
efecto protector de la Proteína Inhibidora de TNF contra el efecto
citotóxico de TNF-alfa es muy claro en
(c).
(c).
En la realización preferida de la invención, la
proteína sustancialmente purificada de la invención se produce por
un procedimiento que comprende:
- a)
- recuperar la fracción de la proteína cruda a partir de un concentrado dializado de orina humana;
- b)
- someter dicha fracción de la proteína cruda de la etapa (a) a cromatografía de intercambio iónico para obtener fracciones activas parcialmente purificadas de la Proteína Inhibidora de TNF definida por su capacidad de inhibir tanto la unión de TNF a sus receptores como el efecto citotóxico de TNF;
- c)
- aplicar dichas fracciones activas parcialmente purificadas de la Proteína Inhibidora de TNF procedentes de la etapa (b) a cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en fase reversa para obtener fracciones activas sustancialmente purificadas de la Proteína Inhibidora de TNF definida por su capacidad de inhibir tanto la unión de TNF a sus receptores como el efecto citotóxico de TNF; y
- d)
- recuperar la proteína sustancialmente purificada de la etapa (c) que se mueve como un solo pico en HPLC en fase reversa.
En una realización de dicho procedimiento, la
proteína sustancialmente purificada tiene un peso molecular de
aproximadamente 26 a 28 kDa en EGPA-DSS en
condiciones reductoras.
La cromatografía de intercambio iónico de la
etapa (b) se efectúa preferiblemente en 3 etapas e incluye la
purificación cromatográfica en Carboximetil Sepharose, columnas de
Mono S HR 5/5 FPLC y Mono Q HR 5/5 FPLC, preferiblemente en este
orden. La HPLC en fase reversa preferiblemente se efectúa en una
columna de Aquapore RP300.
En una realización preferida adicional, en todas
las etapas de la purificación, el procedimiento se verificó midiendo
la concentración de proteína (absorbancia a 280 nm o fluorescencia
relativa después de la reacción automática de alícuotas
representativas con fluorescamina) y la inhibición de la actividad
citotóxica de TNF-alfa de acuerdo con el bioensayo
descrito en 2.2 anteriormente.
- Una mezcla de 200 litros de orina de donantes varones sanos se sometió a microfiltración en una membrana Pellicon con un tamaño de poro de 0,45 \mum. El filtrado se concentró por ultrafiltración utilizando una membrana Pellicon con un límite de exclusión de peso molecular de 10 kDa hasta un volumen final de 500 ml. El concentrado se dializó contra solución salina tamponada con fosfato que contenía benzamidina 1 mM y azida sódica al 0,1%.
- Una columna intercambiadora de cationes de CM-Sepharose, de 2,7 x 10 cm (Pharmacia) se prelavó con NaCl 1 mM, tampón de ácido cítrico 10 mM, pH 5,0, que contenía azida sódica al 0,02% (tampón C) y equilibró con tampón de ácido cítrico 10 mM, pH 5,0, que contenía azida sódica al 0,02% (tampón A). El concentrado de orina de la etapa 3.1 anterior se dializó contra 2 cambios de 100 veces el volumen de la muestra de tampón A y se centrifugó durante 15 minutos a 8000 rpm. El sobrenadante se aplicó a 4ºC sobre la columna de CM-Sepharose a un caudal de 2 ml/minuto y se recogieron fracciones de 50 ml. La columna se lavó con tampón A hasta que no se pudo detectar nada de proteína (aproximadamente 1500 ml) y después se eluyó con 5 volúmenes de columna de NaCl 200 mM, tampón de ácido cítrico 10 mM, pH 5,0, que contenía azida sódica al 0,02% (tampón B) (5 fracciones) seguida de elución con 3 volúmenes de columna de tampón C (3 fracciones). Las fracciones se recogieron y ensayaron como se ha indicado. La porción mayoritaria de la actividad biológica de la proteína inhibidora de TNF se encontró en la segunda fracción de la elución con el tampón B.
- La columna de Mono S HR 5/5 (Pharmacia) se prelavó con un tampón de ácido cítrico 10 mM, pH 5,0, que contenía azida sódica al 0,02% (tampón A) hasta que se demostró una línea basal estable (detectada a 280 nm por un detector de UV). Las fracciones activas eluidas de la columna de CM-Sepharose se mezclaron y dializaron contra 2 cambios de 100 veces el volumen de la muestra de tampón A: La muestra se inyectó en 8 porciones de 2 ml sobre la columna hasta que se alcanzó la capacidad de unión máxima de la columna (28 mg). La columna se lavó con tampón A hasta que se vio una línea basal plana. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente de NaCl lineal (0-350 mM) en tampón A. El gradiente se hizo pasar durante 40 minutos a un caudal de 0,5 ml/minuto. Después, la columna se lavó durante 10 minutos con NaCl 350 mM en Tampón A (Tampón D). Las proteínas que no se pudieron eluir en una concentración de NaCl 350 mM se eluyeron después de la columna con Tampón C. Se recogieron fracciones de 0,5 ml y se ensayaron como se ha indicado. Los resultados se expresan en la Figura 3. La porción principal de actividad se encontró que eluía en las fracciones 20-23, que corresponden a NaCl 180-220 mM.
- La columna de Mono Q HR 5/5 (Pharmacia) se prelavó con tampón de borato de sodio 5 mM, pH 9,0, que contenía azida sódica al 0,02% (tampón E) hasta que se alcanzó una línea basal estable. Las fracciones activas eluidas a partir de la columna de Mono S se mezclaron y dializaron contra 2 cambios de 100 volúmenes de muestra de tampón E. La muestra se inyectó en porciones de 2 ml en la columna y la columna se eluyó con tampón E hasta que la línea basal era plana. Las proteínas unidas se eluyeron durante 30 minutos con un gradiente lineal de NaCl de 0 a 60 mM en tampón E, seguido de un gradiente lineal durante 30 minutos de NaCl de 60 a 300 mM en tampón E. Después, la columna se lavó durante 10 minutos con NaCl 300 mM en Tampón E y durante 4 minutos con NaCl 1 M en Tampón E a un caudal de 0,5 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 0,5 ml y se ensayaron para determinar la actividad y el contenido de proteína. Como se indica en la Figura 4, la mayoría de la actividad eluía en las fracciones 15-18 a una concentración de NaCl de aproximadamente 40 mM.
- La columna de HPLC en fase reversa, Aquapore RP 300 4,6 x 30 mm (Brownlee Labs) se prelavó con ácido trifluoro-acético (TFA) acuoso al 0,3% (Tampón F) hasta que se obtuvo una línea basal estable por el sistema de detección de fluorescamina. Las fracciones activas que se eluyeron de la columna de Mono Q se mezclaron e inyectaron en una porción de 1,6 ml sobre la columna. La columna se eluyó con tampón F a un caudal de 0,5 ml/minuto hasta que el fluorímetro no detectó ninguna proteína. Después, la columna se eluyó a un caudal de 0,5 ml/minuto, con un gradiente lineal de 0 a 20% de acetonitrilo en Tampón F durante 5 minutos, seguido de un gradiente lineal de 20 a 50% de acetonitrilo durante 60 minutos y finalmente un gradiente lineal de 50% a 80% de acetonitrilo durante 5 minutos. La columna se lavó después durante 15 minutos con acetonitrilo al 80%. Se recogieron fracciones de 0,5 ml y se ensayaron para determinar el contenido de proteína y la actividad. Como se indica en la figura 4, la actividad eluyó de forma aguda en las fracciones 21-23 (haciendo pico en la fracción 22) junto con un pico de proteína aislado. Estas fracciones correspondieron a acetonitrilo al 27%.
- Con el fin de verificar el resultado de la purificación, se efectuó una electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (EGPA-DSS) (Figura 6) de acuerdo con el método de Laemmli U.K. y col. (1970) Nature 227:680. Una muestra de las fracciones activas que eluye de la columna intercambiadora de iones de las etapas 3.2, 3.3 y 3.4 conteniendo 5 \mug de proteína (Calle B: fracción activa eluida de la columna de CM-Sepharose; calle C: fracciones activas eluidas de la columna de Mono S; y calle D: fracciones activas eluidas de la columna de Mono Q) o una muestra de 40 \mul de las fracciones 21-23 (calles E a G) derivadas de la HPLC en fase reversa, se mezclaron con 3 volúmenes de tampón de muestra concentrado que contenía DSS al 6% (p/v) y beta-mercaptoetanol al 15% v/v y se cargó en un gel de acrilamida al 15%. Como referencia para el peso molecular, una mezcla de marcadores de peso molecular (alfa-lactoalbúmina 14,4 kDa, inhibidor de tripsina de soja 20,1 kDa, anhidrasa carbónica 30 kDa, ovalbúmina 43 kDa, seralbúmina bovina 67 kDa y fosforilasa b 94 kDa) se trató como antes y se cargó en la calle A. Un blanco con tampón muestra se eluyó en la calle H. El gel se electroforetizó a 160 voltios y las bandas de proteína se visualizaron por tinción con plata (Oakley, B.R. y col. Anal. Biochem. 105:361). Como se muestra en la figura 6, la Proteína Inhibidora de TNF purificada se movió como una sola banda con un peso molecular aparente de 26-28 kDa (Calles E-G).
Muestras de la proteína Inhibidora de TNF
sustancialmente purificada de la invención (1-5
\mug, 50-200 pmoles cada una) se aplicaron a
discos de fibra de vidrio revestidos con biobrene, previamente
tratados. Los discos secados se sometieron a ciclos repetitivos de
degradación de Edman en un microsecuenciador de proteína, en fase de
líquido-gas, pulsado, automatizado (Modelo 475) con
un analizador de aminoácidos HPLC PTH (Modelo 120) y una unidad de
adquisición y tratamiento de datos Modelo 900 en línea, todo ello de
Applied Biosystems Inc. Foster City, CA, U.S.A.). La secuencia
obtenida por ordenador se comparó con los datos iniciales y se
corrigió cuando fue necesario. Se efectuaron simultáneamente tres
análisis separados con el fin de confirmar los datos de la
secuencia. El rendimiento inicial fue superior a 40%, lo que indica
que la proteína principal en el preparado (la banda de 27 kDa) está
relacionada con la secuencia resultante.
La secuenciación N-terminal de la
Proteína inhibidora de TNF dio la siguiente secuencia de
aminoácidos:
- El aminoácido designado X en la 14ª posición no se identificó. En cuanto al resto de cisteína (Cys) en la 4ª posición, su presencia es teórica ya que no se puede identificar PTH (Fenil tiohidantoína) Cys como tal y no se detectó ningún otro resto en esta posición. Una investigación computarizada en el banco de proteínas de la National Biomedical Research Foundation (actualización nº 16) por el método FASTP no reveló una homología significativa con ninguna proteína conocida.
Esta invención se refiere además a moléculas de
ADN que comprenden la secuencia de nucleótidos que codifica la
Proteína Inhibidora de TNF de la invención, a los vehículos de
expresión replicables que contienen dichas moléculas de ADN, a los
huéspedes transformados con ellos y a la Proteína Inhibidora de TNF
producida por la expresión de dichos huéspedes transformados. La
expresión "moléculas de ADN" incluye ADN genómico, ADNc, ADN
sintético y sus combinaciones.
El clonaje de la Proteína Inhibidora de TNF se
puede llevar a cabo por diferentes técnicas. De acuerdo con una
estrategia, se producen anticuerpos específicos (policlonales o
monoclonales) frente a la Proteína Inhibidora de TNF y se utilizan
para clonar el ADNc de la Proteína Inhibidora de TNF. Esta
estrategia comprende las tres etapas siguientes:
- Los anticuerpos frente a la Proteína Inhibidora de TNF se pueden producir ya sea utilizando la Proteína Inhibidora de TNF sustancialmente purificada de la presente invención o utilizando uno o más péptidos idénticos a la secuencia conocida de la proteína, v.g., la secuencia N-terminal de la proteína, o fusionando una de las posibles secuencias de nucleótidos deducidas a partir de la secuencia de aminoácidos de la Proteína Inhibidora de TNF al gen que codifica la Proteína A y expresando el producto fusionado, Proteína A - Proteína Inhibidora de TNF, en E. coli. Para obtener anticuerpos policlonales, la Proteína Inhibidora de TNF sustancialmente purificada, o los péptidos sintéticos unidos a una proteína portadora se inyectan en conejos. Para la producción de anticuerpos monoclonales, el gen sintético del producto fusionado Proteína A - Proteína Inhibidora de TNF se expresa en E. coli, la proteína fusionada obtenida se purifica por cromatografía de afinidad en una columna de IgG Sepharose y se inyecta en ratones. Alternativamente, la Proteína Inhibidora de TNF, sustancialmente purificada, de la presente invención se inyecta en ratones.
- Los anticuerpos frente a la Proteína Inhibidora de TNF se utilizan para buscar células que producen la Proteína Inhibidora de TNF por inmunofluorescencia o por manchado Western.
- Se extrae ARNm a partir de células productoras de la Proteína Inhibidora de TNF y se prepara ADNc por el uso de transcriptasa reversa. El ADNc se clona en un vector de expresión tal como \lambdagT11 y se somete a ensayo de barrido por el uso de anticuerpos. El vector de expresión \lambdagt11 se puede utilizar para la inserción de ADN de hasta 7 kb de longitud en un sitio EcoRI 53 bases corriente arriba del codon de terminación de beta-galactosidasa. Por lo tanto, se pueden insertar secuencias foráneas de ADN en este sitio y expresar en condiciones apropiadas como proteínas de fusión. El vector de expresión de \lambdagt11 es particularmente útil para la construcción de bancos de ADNc que se han de barrer con sondas de anticuerpos (Huynh, T.V. y col., en: David Glover (red.), DNA Cloning Techniques: a Practical Approach, IRL Press, Oxford (1984), págs. 49-78) como se describe aquí.
Siguiendo otra estrategia, se produce un
oligonucleótido sintético o una mezcla de oligonucleótidos
sintéticos, cuya secuencia se deriva de la secuencia de un fragmento
de la proteína, v.g., la secuencia de aminoácidos
N-terminales de la Proteína Inhibidora de TNF, y
estos oligonucleótidos o la mezcla de oligonucleótidos se utilizan
como una sonda para clonar el ADNc o el ADN genómico que codifica la
Proteína Inhibidora de TNF.
El ADN genómico puede o no incluir intrones
naturales. Se puede obtener, por ejemplo, por extracción de células
adecuadas y purificación por medios bien conocidos en la técnica.
Los preparados de ADN adecuados, tales como ADN genómico humano, se
disocian enzimáticamente por enzimas de restricción, o se cortan al
azar, y los fragmentos se insertan en vectores recombinantes
apropiados para formar un banco de genes. Después, dichos vectores
se pueden barrer con sondas de oligonucleótidos sintéticos con el
fin de identificar una secuencia que codifica la Proteína
Inhibidora de TNF de la invención.
Alternativamente, se aísla el ARNm de una célula
que expresa la proteína de la invención y se utiliza para producir
ADNc por medios bien conocidos en la técnica. Este ADNc, después de
la conversión en la forma de doble hebra, se puede clonar y el clon
resultante se puede barrer con una sonda apropiada para ADNc que
codifica las secuencias deseadas. Una vez que se ha aislado el clon
deseado, el ADNc se puede manipular sustancialmente de la misma
manera que el ADN genómico. Sin embargo, con el ADNc no habrá
intrones ni secuencias intervinientes.
Con el fin de sintetizar los oligonucleótidos que
se han de utilizar como sondas, es posible efectuar el análisis de
secuencia de la Proteína Inhibidora de TNF intacta o bien obtener
fragmentos peptídicos de ella y caracterizar su secuencia de
aminoácidos. Con el fin de obtener fragmentos peptídicos, los
preparados de proteína purificados se someten a fragmentación, v.g.,
por digestión con proteasas tales como tripsina, quimotripsina o
papaína por métodos bien conocidos en la técnica (Oike, Y. y col.
(1982) J. Biol. Chem. 257: 9751-9758). Los
fragmentos peptídicos producidos por digestión se separan por HPLC
en fase reversa y secuencian por técnicas automáticas de
secuenciación de aminoácidos.
Como ya se ha descrito, la secuencia
correspondiente a los primeros 16 aminoácidos en la porción
N-terminal de laproteína se determinó por análisis
de la Proteína Inhibidora de TNF sustancialmente purificada en un
secuenciador automático y se obtuvo la siguiente secuencia de
aminoácidos:
Una vez que se han secuenciado uno o más
fragmentos peptídicos adecuados o que está determinada una secuencia
parcial de la proteína, se examinan las secuencias de ADN capaces de
codificarlas. Debido a la degeneración del código genético, se puede
utilizar más de un codon para codificar un aminoácido particular y
se pueden producir uno o más oligonucleótidos diferentes, cada uno
de los cuales sería capaz de codificar los fragmentos peptídicos de
la Proteína Inhibidora de TNF (Watson, J.D., en: Molecular
Biology of the Gene, 3ª ed., W.A. Benjamin, Inc. Menlo Park, CA
(1977), págs. 356-357). Sin embargo, sólo un miembro
del grupo contiene la secuencia nucleotídica que es idéntica a la
secuencia nucleotídica del gen. Su presencia dentro del grupo y su
capacidad de hibridarse al ADN incluso en presencia de los otros
miembros del grupo hace posible emplear el grupo no fraccionado de
oligonucleótidos de la misma manera en que se emplearía un solo
oligonucleótido para clonar el gen que codifica el péptido. El uso
de dicho oligonucleótido o grupo de oligonucleótidos que contiene la
secuencia teórica "más probable" capaz de codificar los
fragmentos del gen de la Proteína Inhibidora de TNF (siguiendo las
"reglas del uso de códones", descritas por Lathe, R., y col.
(1985) J. Molec. Biol. 183: 1-12) permite
identificar la secuencia de un oligonucleótido o grupo de
oligonucleótidos complementario que es capaz de hibridarse a la
secuencia "más probable" que codifica la Proteína Inhibidora de
TNF o al menos una porción de ella, o un grupo de estas secuencias.
Después, este oligonucleótido que contiene dicha secuencia
complementaria se puede sintetizar y emplear como una sonda para
identificar y aislar el gen de la Proteína Inhibidora de TNF de la
invención (Maniatis, T. y col. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY
(1982).
Una vez que un oligonucleótido, o un grupo de
oligonucleótidos, adecuado que es capaz de codificar un
fragmentodel gen de la Proteína Inhibidora de TNF (o que es
complementario a dicho oligonucleótido, o grupo de oligonucleótidos)
se identifica utilizando el procedimiento descrito anteriormente,
se sintetiza e hibrida a un ADN o, preferiblemente, a un preparado
de ADNc derivado de células que son capaces de expresar el gen
deseado, preferiblemente después de que la fuente de ADNc se ha
enriquecido para las secuencias deseadas, v.g., extrayendo ARN a
partir de células que producen altos niveles del gen deseado y
después convirtiéndolo en el correspondiente ADNc empleando la
enzima transcriptasa reversa.
Los procedimientos para la hibridación de
ácidosnucleicos son conocidos y están descritos, por ejemplo, en
Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, op.
cit. y en Haymes, B.T. y col., Nucleic Acid Hibridization: A
Practical Approach, IRL Press, Oxford, Inglaterra (1985). Por
hibridación con las sondas del nucleótido o grupo de
oligonucleótidos anteriores, es posible identificar en un banco de
ADNc o genómico, las secuencias de ADN capaces de experimentar dicha
hibridación y después se analizan para determinar en qué medida
contienen secuencias codificantes para la Proteína Inhibidora de TNF
de la invención.
Por la misma técnica o por técnicas similares ha
sido posible clonar satisfactoriamente los genes para varias
proteínas humanas tales como el activador de plasminógeno de tipo
tejido (Pennica, D., y col., (1983) Nature 301:
214-221).
Las moléculas de ADN codificantes de la
ProteínaInhibidora de TNF de la invención, obtenidas por los
métodos descritos anteriormente, se insertan después en vectores de
expresión apropiadamente construidos por técnicas bienconocidas en
este campo (véase Maniatis y col., op. cit.). El ADNc de
doble hebra se une a vectores plasmídicos por unión cola con cola
homopolimérica o por unión con restricción que implica el uso de
enlazantes de ADN sintéticos o técnicas de ligación de extremos
romos. Se utilizan ADN ligasas para ligar las moléculas de ADN y se
evita unión indeseable por tratamiento con fosfatasa alcalina.
Con el fin de expresar una proteína deseada, un
vector de expresión habrá de comprender también secuencias
nucleotídicas específicas que contienen información reguladora de
la transcripción y la traducción ligada al ADN que codifica la
proteína deseada de tal modo que permite la expresión del gen y la
producción de la proteína. Primero, con el fin de que el gen sea
transcrito, debe estar precedido por un promotor reconocible por ARN
polimerasa, al que se une la polimerasa y de este modo inicia el
procedimiento de transcripción. Hay una gama de dichos promotores en
uso, que actúan con eficacias diferentes (promotores fuertes y
débiles). Ellos son diferentes para células procarióticas y
eucarióticas.
Los promotores que se pueden utilizar en la
presente invención pueden ser constitutivos, por ejemplo, el
promotor int de bacteriófago \lambda, el promotor
bla del gen de beta-lactamasa de pBR322 y el
promotor CAT del gen de cloranfenicol acetil transferasa de pPR325,
etc., o inducibles, tales como los promotores procarióticos
incluyendo los principales promotores a derecha e izquierda de
bacteriófago \lambda (P_{L} y P_{R}), los promotores
trp, recA, lacZ, lacI, ompF y
gal de E. coli, o el promotor híbrido
trp-lac, etc. (Glick, B.R., (1987) J. Ind.
Microbiol. 1: 277-282).
Además del uso de promotores fuertes para generar
grandes cantidades de ARNm, con el fin de conseguir altos niveles de
expresión génica en células procarióticas, es necesario utilizar
también sitios de unión de ribosomas para garantizar que el ARNm se
traduce eficientemente. Un ejemplo es la secuencia de
Shine-Dalgarno (secuencia SD) apropiadamente situada
a partir del codon de iniciación y complementaria de la secuencia
3'-terminal de ARN de 16S.
Para huéspedes eucarióticos, se pueden utilizar
diferentes secuencias reguladoras de transcripción y traducción,
dependiendo de la naturaleza del huésped. Se pueden derivarde
fuentes virales, tales como adenovirus, papilomavirus bovino, virus
Simian o similares, donde las señales reguladoras están asociadas
con un gen particular que tiene un alto nivel de expresión. Ejemplos
son el promotor TK del virus Herpes, el promotor precoz de SV40, el
promotor del gen gal4 de levadura, etc. Se pueden elegir señales
reguladoras de la iniciación de la transcripción que permitan la
represión y la activación, de modo que la expresión de los genes se
pueda modular.
Las moléculas de ADN que comprenden la secuencia
de nucleótidos codificante de la Proteína Inhibidora de TNF de la
invención y las señales reguladoras de la transcripción y la
traducción operablemente unidas se inserta en un vector que es capaz
de integrar las secuencias génicas deseadas en el cromosoma de la
célula huésped. Las células que han integrado establemente el ADN
introducido en su cromosoma se pueden seleccionar introduciendo
también uno o más marcadores que permiten la selección de células
huésped que contienen el vector de expresión. El marcador puede
proporcionar prototrofia a un huésped auxotrófico, resistencia
biocida, v.g., antibióticos, o metales pesados, tales como cobre, o
similares. El gen marcador seleccionable se puede unir directamente
a las secuencias génicas de ADN que se han de expresar, o bien se
pueden introducir en la misma célula por
co-transfección. También se pueden necesitar
elementos adicionales para la síntesis óptima de ARNm de proteína de
unión de una sola cadena. Estos elementos pueden incluir señales de
unión, así como promotores de la transcripción, potenciadores y
señales de terminación. Los vectores de expresión de ADNc que
incorporan dichos elementos incluyen aquellos descritos por Okayama,
H., (1983) Mol. Cell Biol. 3: 280.
En una realización preferida, la molécula de ADN
introducida se incorporará en un plásmido o vector viral capaz de
replicación autónoma en el huésped receptor. Factores de importancia
para seleccionar un plásmido particular o vector viral incluyen: la
facilidad con la que las células receptoras que contienen el vector
se pueden reconocer y seleccionar a partir de dichas células
receptoras que no contienen el vector; el número de copias del
vector que se desean en un huésped particular; y de si es deseable
ser capaz de "lanzar" el vector entre células huésped de
especies diferentes.
Vectores procarióticos preferidos incluyen
plásmidos tales como aquellos capaces de replicarse en E.
coli, por ejemplo, pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184, etc.
(véase Maniatis y col., Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, op. cit.); plásmidos de bacilos tales como pC194, pC221,
pT127, etc., (Gryczan, T., The Molecular Biology of the
Bacillus, Academic Press, NY (1982), págs.
307-329); plásmidos de estreptomicetos incluyendo
pIJ101 (Kendall, K.J. y col., (1987) J. Bacteriol. 169:
4177-4183); bacteriófagos de estreptomicetos tales
como \PhiC31 (Chater, K.F. y col., en: Sixth International
Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest,
Hungría (1986), págs. 45-54), y plásmidos de
Pseudomonas (John, J.F., y col. (1986) Rev. Infect. Dis. 8:
693-704), e Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol.
33: 792-742).
Plásmidos eucarióticos preferidos incluyen PBV,
viruela vacuna, SV40, circular de 2 micras, etc., o sus derivados.
Dichos plásmidos son bien conocidos en la técnica (Botstein, D., y
col. (1982) Miami Wint. Symp. 19: 265-274;
Broach, J.R., en: The Molecular Biology Of the Yeast
Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, págs. 445-470
(1981); Broach, J.R., (1982) Cell 28:
203-204; Bollon, D.P., y col., (1980) J. Clin.
Hematol. Oncol. 10: 39-48; Maniatis, T. en:
Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3: Gene
Expression, Academic Press, NY, págs. 563-608
(1980)).
Una vez que el vector o la secuencia de ADN que
contiene el o los productos de construcción se ha preparado para la
expresión, el o los productos de construcción de ADN se pueden
introducir en una célula huésped apropiada por cualquiera de una
gama de medios adecuados: transformación, transfección, conjugación,
fusión de protoplastos, electroporación, precipitación con fosfato
de calcio, microinyección directa, etc.
Las células huésped que se han de utilizar en
esta invención pueden ser procarióticas o eucarióticas. Los huésped
procarióticos preferidos incluyen bacterias tales como E.
coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella,
Serratia, etc. El huésped procariótico más preferido es E.
coli. Huéspedes bacterianos de interés particular incluyen E.
coli K12 cepa 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC
31537), E. coli W3110 (F^{-}, lambda^{-}, prototrófica
(ATCC 27325)), y otras enterobacterias tales como Salmonella
typhimurium o Serratia marcescens y varias especies de
Pseudomonas. En estas condiciones, la proteína no estará
glicosilada. El huésped procariótico debe ser compatible con el
replicón y las secuencias control en el plásmido de expresión.
Los huéspedes eucarióticos preferidos son células
de mamíferos, v.g., células humanas, de monos, ratones y células de
ovario de hámster chino (CHO), ya que proporcionan modificaciones
post-traducción a moléculas de proteína, incluyendo
plegamiento correcto o glicosilación en sitios correctos. También
las células de levadura puede llevan a cabo modificación de péptidos
post-traducción, incluyendo glicosilación. Existen
diversas estrategias de ADN recombinante que utilizan secuencias de
promotores fuertes y alto número de copias de plásmidos que se
pueden utilizar para la producción de las proteínas deseadas en
levadura. La levadura reconoce secuencias líder en productos génicos
mamíferos clonados y secreta péptidos que llevan secuencias líder
(es decir, pre-péptidos).
Después de la introducción del vector, las
células huésped se cultivan en un medio selectivo, que selecciona la
propagación de células que contienen el vector. La expresión de la o
las secuencias génicas clonadas da como resultado la producción de
la Proteína Inhibidora de TNF deseada o uno de sus fragmentos.
Después, la proteína expresada se aísla y purifica de acuerdo con el
método de purificación descrito en la presente solicitud (sección 3
supra) o por cualquier otro procedimiento convencional que
implica extracción, precipitación, cromatografía, electroforesis o
similares.
Un procedimiento de purificación adicional que se
puede utilizar preferentemente para purificar la proteína de la
invención es la cromatografía de afinidad. Para este propósito, se
producen anticuerpos monoclonales frente a la Proteína Inhibidora
de TNF y se inmovilizan en una matriz de gel contenida dentro de una
columna. Los preparados impuros que contienen la proteína
recombinante se hacen pasar a través de la columna. La proteína se
unirá a la columna por el anticuerpo específico mientras que las
impurezas pasarán a través de ella. Después del lavado, la proteína
se eluye del gel por un cambio en el pH o la fuerza iónica.
Los anticuerpos monoclonales utilizados en la
presente invención se pueden preparar utilizando la técnica
convencional de los hibridomas (Kohler y col. (1975) Nature
256:495; Kohler y col. (1976) Eur. J. Immunol. 6:511).
En general, dichos procedimientos implican inmunizar un animal con
el antígeno proteico purificado deseado o con un péptido sintético
que tiene la secuencia N-terminal de la proteína
deseada conjugada con un vehículo adecuado, tal como seralbúmina
bovina. Las células de bazo de dichos animales se aislan y fusionan
con una línea celular de mieloma adecuada. Después de la fusión, las
células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en
medio HAT y después se clonan. Las células de hibridoma obtenidas a
través de dicha selección después se ensayan para identificar
clones que secretan anticuerpos capaces de unirse a la Proteína
Inhibidora de TNF. Después de la identificación, el clon deseado se
puede propagar en masa, ya sea por cultivo en suspensión o en fluido
ascítico, inyectando las células en el peritoneo de ratones huésped
adecuados.
Los anticuerpos monoclonales producidos por
dichos hibridomas, después de su purificación e inmovilización, son
muy eficientes para la purificación de la Proteína Inhibidora de TNF
por un procedimiento de purificación por afinidad utilizando una
columna de inmuno-adsorbente.
La Proteína Inhibidora de TNF, sus sales,
derivados funcionales y fracciones activas excepto para precursores,
y mezclas de cualesquiera de los anteriores, están indicadas para
antagonizar los efectos deletéreos de TNF en mamíferos, es decir,
para tratar condiciones en las que se forma endógenamente o se
administra exógenamente un exceso de TNF.
La presente invención se refiere además a
composicionesfarmacéuticas que comprenden un vehículo
farmacéuticamente aceptable y la Proteína Inhibidora de TNF de la
invención o sus sales, derivados funcionales o fracciones activas,
excepto para precursores, o mezclas de cualesquiera de las
anteriores como uno o más ingredientes activos. Estas composiciones
se pueden utilizar en cualquier situación en la que hay una
producción excesiva de TNF endógeno, tal como en casos de choque
séptico, caquexia, reacciones de injerto-huésped,
enfermedades autoinmunes como artritis reumatoide, etc. El modo de
administración puede ser vía cualquiera de los modos aceptados de
administración para agentes similares y dependerá de la enfermedad
que se ha de tratar, v.g., intravenosamente en caso de choque
séptico o inyección local en caso de artritis reumatoide (por
ejemplo, en la rodilla), o continuamente por infusión, etc. Las
composiciones también se pueden utilizar en casos de intoxicación
por TNF causada por administración exógena de cantidades excesivas
(sobredosificaciones) de TNF.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
se preparan para administración mezclando la proteína o sus
derivados con vehículos, estabilizantes y excipientes
fisiológicamente aceptables, y se preparan en forma de dosificación,
v.g., por liofilización en viales de dosificación. La cantidad de
compuesto activo que se ha de administrar dependerá de la ruta de
administración, la enfermedad que se ha de tratar y el estado del
paciente. La inyección local en caso de estados inflamatorios de
artritis reumatoide requerirán la Proteína Inhibidora de TNF en una
base de peso corporal, como la infusión intravenosa en caso de
choque séptico.
Finalmente, la presente invención se refiere al
uso del anticuerpo anteriormente descrito en la Proteína
Inhibidorade TNF para la purificación de dicha proteína. En una
realización preferida dicho anticuerpo es un anticuerpo
monoclonal.
Claims (31)
1. Una Proteína Inhibidora de Factor de Necrosis
Tumoral (TNF), que tiene las siguientes características:
- (a)
- inhibe la unión de TNF a sus receptores y el efecto citotóxico de TNF;
- (b)
- cuando preparados crudos de la misma en orina se cromatografían en una columna de filtración de Ultrogel AcA 44, el pico principal de la actividad inhibidora de TNF eluye algo antes que la mayoríade la proteína y muestra un peso molecular aparente de aproximadamente 40-80 kDa; y
- (c)
- cuando preparados crudos de la misma en orina se analizan, el punto isoeléctrico de la proteína activa está entre pH 6 y 8;
o una de sus sales, derivados
funcionales o fracciones activas, exzcepto para precursores,
teniendo dicha fracción activa la capacidad de inhibir la unión de
TNF a sus receptores y el efecto citotóxico de
TNF.
2. La Proteína Inhibidora de TNF según la
reivindicación 1, obtenible a partir de orina humana del modo
siguiente:
- (a)
- sometiendo la fracción, que es no dializable a través de una membrana con límite de exclusión de peso molecular a 10 kDa a cromatografía de afinidad en lectina;
- (b)
- eluyendo la proteína adsorbida en la lectina;
- (c)
- sometiendo la proteína eluida a filtración en gel o a cromatografía de intercambio iónico; y
- (d)
- recuperando aquellas fracciones que inhiben la unión de TNF a sus receptores y el efecto citotóxico de TNF.
3. La Proteína Inhibidora de TNF según la
reivindicación 1 ó 2 en forma sustancialmente purificada, que
contiene la siguiente secuencia de aminoácido en su porción
N-terminal
donde X es un resto aminoácido sin
identificar, o una de sus sales, derivados funcionales o fracciones
activas, teniendo dicha fracción activa la capacidad de inhibir la
unión de TNF a sus receptores y el efecto citotóxico de
TNF.
4. La Proteína Inhibidora de TNF de la
reivindicación 3, que tiene un peso molecular de aproximadamente
26-28 kDa cuando la proteína sustancialmente
purificada se analiza por EGPA-DSS en condiciones
reductoras.
5. La Proteína Inhibidora de TNF de la
reivindicación 3 ó 4, que se mueve como un solo pico en
cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en fase
reversa.
6. La Proteína Inhibidora de TNF de una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, que tiene la capacidad de
inhibir la unión de TNF-\alpha a sus receptores de
la superficie de la célula sobre células HeLa y fibroblastos FS11
humanos.
7. La Proteína Inhibidora de TNF según una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, que tiene la capacidad
deinhibir el efecto citotóxico de TNF-\alpha
sobre células A9 murinas.
8. La Proteína Inhibidora de TNF según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se aísla de orina.
9. La Proteína Inhibidora de TNF según la
reivindicación 8, en la que la orina es orina humana.
10. Un procedimiento para el aislamiento de la
Proteína Inhibidora de TNF sustancialmente purificada que
comprende:
- (a)
- recuperar la fracción de la proteína cruda a partir de un concentrado dializado de orina humana;
- (b)
- someter dicha fracción de la proteína cruda de la etapa (a) a cromatografía de intercambio iónico para obtener fracciones activas parcialmente purificadas de la Proteína Inhibidora de TNF definida por su capacidad de inhibir tanto la unión de TNF a sus receptores como el efecto citotóxico de TNF;
- (c)
- aplicar dichas fracciones activas parcialmente purificadas de la Proteína Inhibidora de TNF procedentes de la etapa (b) a HPLC en fase reversa para obtener fracciones activas sustancialmente purificadas de la Proteína Inhibidora de TNF definida por su capacidad de inhibir tanto la unión de TNF a sus receptores como el efecto citotóxico de TNF; y
- (d)
- recuperar la proteína sustancialmente purificada de la etapa (c) que se mueve como un solo pico en HPLC en fase reversa.
11. El procedimiento según la reivindicación 10,
en el que dicha proteína sustancialmente purificada tiene un peso
molecular de aproximadamente 26-28 kDa por
EGPA-DSS en condiciones reductoras.
12. El procedimiento según la reivindicación 10 ó
11, en el que la cromatografía de intercambio iónico de la etapa (b)
se efectúa en 3 etapas e incluye purificación cromatográfica en
columnas de Carboximetil Sepharose, Mono S HR 5/5 FPLC y Mono Q HR
5/5 FPLC, preferiblemente en esta secuencia.
13. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en donde la actividad de las fracciones en
las etapas (b), (c) y (d) se define por la capacidad de la Proteína
Inhibidora de TNF de inhibir la unión de
TNF-\alpha a sus receptores de la superficie de la
célula en células HeLa y fibroblastos FS11 humanos.
14. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 13, en el que la actividad de las fracciones
en las etapas (b), (c) y (d) se define por la capacidad de la
Proteína Inhibidora de TNF de inhibir el efecto citotóxico de
TNF-\alphasobre células A9 murinas.
15. La Proteína Inhibidora de TNF según una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, producida por el
procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14.
16. La Proteína Inhibidora de TNF según una
cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, que es una proteína
recombinante.
17. La Proteína Inhibidora de TNF de la
reivindicación 16, que se produce en un huésped procariótico,
preferiblemente en E. coli, o en un huésped eucariótico,
preferiblemente en una célula de mamífero.
18. Una molécula de ADN que comprende una
secuencianucleotídica que codifica la Proteína Inhibidora de TNF o
uno de sus derivados funcionales o fracciones activas, excepto para
precursores, según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en
el que dicha Proteína Inhibidora de TNF contiene la siguiente
secuencia de aminoácidos en su porción
N-terminal:
en donde X es un resto de
aminoácido no identificado y en donde dicha fracción tiene la
capacidad de inhibir la unión de TNF a sus receptores y el efecto
citotóxico de
TNF.
19. La molécula de ADN de la reivindicación 18,
en la que la secuencia nucleotídica es una secuencia de ADN genómico
o una secuencia de ADNc.
20. Un vehículo de expresión replicable que
comprendela molécula de ADN de la reivindicación 18 ó 19 y capaz,
en una célula huésped transformante, de expresar una Proteína
Inhibidora de TNF de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, 16 ó 17.
21. Una célula huésped transformada con el
vehículo de expresión replicable de la reivindicación 20.
22. La célula huésped según la reivindicación 21,
que es una célula huésped procariótica.
23. La célula huésped según la reivindicación 22,
que es una célula huésped eucariótica.
24. Un procedimiento para producir una proteína
que comprende las etapas de
- (a)
- cultivar una célula huésped transformada según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23 en un medio de cultivo adecuado; y
- (b)
- aislar dicha Proteína Inhibidora de TNF.
25. Una Proteína Inhibidora de TNF,
recombinante,producida por el procedimiento de la reivindicación
24.
26. Una composición farmacéutica que comprende
una Proteína Inhibidora de TNF de acuerdo con una cualquiera delas
reivindicaciones 1 a 9, 15 a 17 ó 25, o una mezcla decualquiera de
los anteriores como ingrediente o ingredientesactivos, junto con un
vehículo farmacéuticamente aceptable, en donde dicha fracción
activa tiene la capacidad de inhibir la unión de TNF a sus
receptores y el efecto citotóxico de TNF.
27. La composición farmacéutica según la
reivindicación 26 para antagonizar el efecto deletéreo de TNF en
mamíferos.
28. La composición farmacéutica según la
reivindicación 26 para el tratamiento de condiciones en las que se
forma endógenamente o se administra exógenamente exceso de TNF.
29. El uso de una proteína según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 9, 15 a 17 ó 25 para la fabricación de
una composición farmacéutica según una cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 29.
30. Uso de un anticuerpo frente a la Proteína
Inhibidora de TNF según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a
9, 15 a 17 ó 25, para la pruficación de dicha proteína.
31. El uso de la reivindicación 30, donde dicho
anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
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