JPH02200A - 腫瘍壊死因子抑性蛋白質及びその精製 - Google Patents
腫瘍壊死因子抑性蛋白質及びその精製Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
合抑制能力及びT(Fの細胞毒性抑制能力を有しTNF
の有害な効果に対して使用することのできるTNF抑制
蛋白質、その塩、その機能的誘導体及びその活性)2ク
シヨンに関する。また本発明は、 TNF抑制蛋白質の
精製法、実質的に精製された該蛋白質、及び組換えDN
A技術による該蛋白質のクローニング並びにその製造に
関する。更に本発明は、TNFの有害な効果に対して保
護するだめの、上記蛋白質、その塩、その機能的誘導体
、又はその活性フラクションを含む薬学的組成物に関す
る。
TNF−α(以後、TNF−αとTNF−βの両者をT
NFと言5)は細胞に対して多くの効果を及ばずサイト
カインであるC Wallach、 I)、 (198
6Lインターフエロン7C工on Grosser、
Ed、 )、 X)p。
London;Beutler、 B、と(16)ra
ml、 A、 (1987) * N13”zngla
nd 、T、 Med。、31<S:379−385)
。
く結合することによってその効果を始めて発揮する。そ
の効果のいくつかは組織にとって有益なものである。即
ち、TNF−αは、例えば腫瘍細胞またはウィルス感染
細胞を破壊し、顆粒球の抗菌活性を増大する。しかしな
がら、 TNF−αは有害な作用も明らかに有している
。TNF−αが過剰に産生されるとそれはいくつかの疾
患の主たる病原体としての役割りを演するという明らか
な証拠がある。しかして、TNF−αの管脈構造に及ぼ
す作用は、敗血性ショック症状の主たる原因であること
が知られている[ Tracey、 L 、T、 et
am、、 (1986)Science 234 ;
470−474 ) 6 イ<つかの疾患においては
、 TNIIFはアジポサイトの活性を抑制するために
あるいは食欲不振を引き起こす(TNF−αはカシエフ
チンとも言われている〕ために、体重の大幅な減少(悪
態症ンを起こす原因ともなる。またTN1?′−αは、
リューマチ疾患における組織障害のメゾイエイタ−でも
ある ( Beutler、上記と同じ]。マたTNF−αは
、移植片対宿主反応において観察される障害の主たるメ
ゾイエイタ−であることが報告され℃いる。
与されるTNII’−αを中和しあるいはその作用を除
去する方法を開発する必要がある。このような方法を開
発する本発明者らの最初の試みは、TNF−αの細胞毒
性を中和するモノクローナル抗体を開発することであっ
た。そしてこのようなモノクローナル抗体は、敗血性シ
ョックを引き起こすような条件下でTNF−αの致死効
果に対してマウスを保護する作用を有することが明らか
にされた( σ、s、patent 8erialA
06/ 808.262 ;1985年12月12日出
願)。しかしながら、ムリンモノクローナル抗体を用い
た治療は、特に繰返し投与する場合には、ヒトに対して
適切な治療法とは必ずしも言えないものである。従って
、TNF−αの効果を中和することのできる生物学的試
薬を開発することが必要である。
細胞毒性を中和する生物学的試薬の存在を示す報告はな
されていない。35− kdaの免疫抑制糖蛋白質であ
るウロモジリン(uromodulin)が姫娠した女
性の尿から単離されたことを記載する報告はある[ M
uchmore、 Andrev ’V、とD80ke
r。
2 2 9 ; 4 7 9 −481 ]。
の高親和性リガンドでありモして工L−1の強力な抑制
剤であることが示されている[: Muchmore、
Andrew V、とDecker、 Jean M
。
13404−13407 : Br0Wn、に、M、
atal、 < 1986 )Proc、Natl、A
cad、Sci、ff8A 83 :9119−912
31゜また後になって、ウロモゾリンは、正常人の尿中
に最も豊富に存在する腎由来の蛋白質であるタム−ホー
ス7オール糖蛋白質と同じであることが示された( p
ennlca、Diano at al、 (1987
)sctence 236 : 83−88 ] o他
の1つの工L−1抑制因子が発熱患者の尿中に見出され
たことがいくつかの文献に報告されている[ Llao
。
Exp、Med、 159 :126−136 ; 8
eckingar、 Ph1llippe et、 a
m。
546−1549)。この工I、−i抑制因子は組換え
工L−1*工L−1α及び工L−1βに対して多くの生
物学的活性をある程度及ぼすことが示されている。ヒト
TNF−αは工L−1のいくつかの生物学的活性と同じ
活性を有しているが、この工L−1抑制因子はTNF−
αの生物学的活性を抑制しない〔8θckinger。
、工mmun01゜139 : 1541−1545)
。
ースフォール糖蛋白質はレクチン様相互作用により組換
え工L−iα、工L−1β及びTNF−αと結合するこ
とが報告されており、そしてこの事実がこれらリンホカ
インの循還レベルを調節する上で重要な役割りをはたし
ていることが提案されている[ geasion、0a
therine et am、 (1987)scie
nce237 : 1479−1484)。つaモジリ
ンは、標的腫瘍細胞の溶解によってモニターした所、
TNF’−αの細胞毒性を抑制はしないが、糖鎖な介し
てred、 TNF−αと相互に作用し、この相互作用
がTHF及び他のリンホカインの毒性のin ViVO
でのクリアランスの促進及び/又は該毒性のin Vi
VOでの減少に重要であることが示されている( sh
erblom、Anne p、 (1988) J、
B111゜Oh61m、 263 : 541 8
−5424 ]。
と、発熱患者の尿から得られるTNF−αヒト抑制因子
はTNF−αの細胞毒性を抑制する4 0−60 Kd
&の蛋白質であることが記載されている[:J、Bxp
。
L−i抑制因子とも相違することが示されている。
TNF抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導体及びその
活性フラクションが提供される。
するのを阻害する作用を測定するとともに、TNF−α
の細胞毒性の減少度を測定することによって判定できる
。
物を含まない該TNF抑制蛋白質に関する。
。
を含む組換えDNA分子、該分子を含むしてTNIP抑
制蛋白質を製造する方法に関する。
及びその活性22クシヨンは、TNFの有害な効果九対
して哺乳動物を保護するための薬学的組成物の活性成分
として使用される。
過カラムからのTNF抑制蛋白質の溶出パターンを示す
。
蛋白質量(□)、125ニーTNF−αがその細胞表面
レセプターに結合するのを阻止する能力(冶−−べ〕、
及びTNF−α細胞毒性抑制能(−m−)についてテス
トした。TNF抑制活性の主要ピークは、主蛋白質ぎ−
クの少し前に浴出した。
濾過を行なう前に水に対して透析した場合のTNF抑制
蛋白質の溶出パターンを示す。
工)(a)、TnIll−α−OH工(b)、あるいは
TNF−α−OH工とTNF抑制蛋白質(c)で処理し
た時の形態を示す。
示す。カルボキシメチル(cM)セファロースで精製し
たTNF抑制蛋白質を、nono 8515カチオン交
換カラムの8×2一部分に付し、10mMクエン酸及び
0.02%ナトリウムアシドを含むO−350mMsa
czバッファー溶液(pH5,0)のリニア−グラジェ
ント(−−一−−)で溶出した。
ムリンA9細胞に対するTNF II細胞毒性の抑制に
ついてテストした。TNF抑制蛋白質の主要部分は%
1 so−1oomMNat:aの塩濃度で?I出Lし
、−(1222221)。280nmでの吸収によつ℃
核蛋白質をモニターした(□)。
示す。OM−セファロース及びMOno Sで1118
シた活性蛋白質を、5mMナトリウムポレート及び0.
02%ナトリウムアジドを含むバッファー(PH9,0
)に対して透析し、Mono Q 515アニオン交換
カラムに付した。結合蛋白質を、0−60mM NaC
jリニアーグラジェント次いで60−30060−3O
0リニアーグラジエントで、流速0.5wd/分で溶出
させた( −−−−−)。0.5−画分を集め、ムリン
A9m11胞尤対する’rNF’細胞毒性の抑制につい
てテストした。280叱での吸収を測定することによっ
て、溶出中の蛋白質をモニターした( )。図に示し
たように、30−40 mMの塩濃度で活性を示す大部
分が溶出した。
示す。Mono Q515から浴出した活性蛋白質を、
Aquapore RP−300HPLC力2ム(B
rownleeLabs )の1.6一部分に注入しs
0.3 % TFA (バッファー7)水溶液で流速
0.5t11t/分で流した。
ニアーグラジェントで5分間溶出し、次いで20−50
%リニアーグラジェントで60分間、更に50−80%
リニアーグラジェントで5分間溶出した( −−一−−
)。0.5−画分を集め、ムリンa9ifBJ胞に対す
る’I’NIF細胞毒性の抑制についてテストした。7
AIオレスカミ7 (fl、uorescamine
)で自動的に反応後、それぞれの画分のサンプルの相対
螢光度を測定することによって、溶出中の蛋白質濃度を
モニターした(□)。TNF抑制活性部分が、分離した
蛋白質ピークとともにシャープなピークとして浴出した
。
DB PAGE [L(16)mmliσ、 K、 e
t al、 。
)で分析した結果を示す。CM−セファロース、MOn
o S。
μgの蛋白質を含む活性画分のアリコートを、6%sp
s(w/v)及び15%β−メルカプトエタノール(1
1/V )を含む3倍aKサンプルバッファーと混合し
、15%ポリアクリルアミドrルに付した。HPLCR
P 300カラムから溶出した画分2l−25(レーン
Ef、 F、 Ck)のサンプルも同様に処理してrル
に付した。分子量マーカーとして、α−2クトアルデミ
ン14.4 kDa 、大豆トリノシンインヒビター2
0.1 kDa 、カルポニツクアンヒー2−ゼ3 Q
kDa 、オボアルデミン43 kDa。
、 94 kDaの混合物を、シーンムに流した。レー
ン■では、ブランクとしてサンプルバッファーのみを流
した。蛋白質バンドを銀発色により視覚化せしめた。画
分21.22及び23は、見掛は分子t 26−28
kDaの単一バンドを示した。これらの画分は、ムリン
A9細胞に対するTNF−α細胞毒性の抑制についてテ
ストした所、活性を示すことが見出された。
TNFの細胞毒性効果を抑制する能力のあるTN11′
抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導体、及びその活性
フラクションが提供される。
NF−βの両者の生物学的活性を抑制できることが見出
された。しかして、TNF抑制蛋白質によるこれら2つ
のサイト力インC本明細書ではTNFと言う〕の抑制も
本発明に包含される。
ogel AOA 441”ル濾過カラムを用いたクロ
マトグラフィーに付した時には、それは40−80 k
Daの見掛は分子量を示した。蛋白質の不純物を実質的
に含まない、実質的に精製された蛋白質は、還元条件下
でSn2 PAGIにより分析した場合には、約26−
28 kDaの見掛は分子量を示し、逆相高速液体クロ
マトグラフィー(HPLC)では単一ピークとして移動
した。その活性は、ヒト HeLa細胞及びFB11線
維芽細胞の細胞レセプターへのTNF−αの納会を抑制
する能力及び/又はムリンA9細胞に対するTNF−α
の細胞毒性の抑制能力によって測定した。
でいるという特徴を有する。
定されなかった。4番目の位置にシスティン(078)
が存在するのは理論的に裏付けられている。なぜなら、
そのようなものとしてPTH(フェニルチオヒダントイ
ン) cy、sを同定−jルCとができず、他のアミノ
酸残基もこの位置では検出されなかったためである。
の塩及びアミノ基の酸付加塩の両者を指す。カルボキシ
基の塩は公知の方法によって形成することが出来、例え
ば、ナトリウム塩、カルシウム塩、アンモニウム塩、鉄
塩、亜鉛塩などの無機塩:列えは、トリエタノールアミ
ン、アルギニノもしくはりシン、ピペリジン、プロカイ
ンなどのアミンと゛形成される有機塩基との塩等が挙げ
られる。酸付710塩としては、例えば、塩酸、硫酸な
どの無機酸との塩:例えば酢酸、オキデル酸などの有機
酸との塩等が挙げられる。
の側鎖又はNもしくはC−末端の官能基から公知の方法
によって調製される誘導体を包含するものであり、それ
らが薬学的に許容し得るものである限り、即ち、それら
が蛋白質の活性を破壊せずそしてそれらを含む組成物に
対して毒性を与えるものでない限り不発明に包含される
。
族エステル;アンモニア、第1級アミン又は第2級アミ
ンとの反応から得られるカルボキシ基のアミr;アシル
部分(例えばアルカノイル又はカルボサイクリックアロ
イル)との反応で形成されるアミノ酸残基の7リーアミ
ノ酸のN−アシル誘導体;アシル部分との反応で形成さ
れるフリーカルボキシ基(例えばセリル、スレオニル残
基のカルボキシ基)の0−アシル誘導体などが挙げられ
る。
えば、蛋白質分子のみのポリペプチド鎖の断片もしくは
前駆体;関連分子あるいは糖残基、リン酸残基などの残
基な有する蛋白質分子のポリペプチド鎖の断片もしくは
前駆体;蛋白質分子あるいは糖残基自体の凝集体などが
包含される。但しこれらの72クシヨンは、TNFのレ
セプターへの納会を抑制する能力を有しそしてin V
itr。
なければならない。
精製 粗精製物の状態での予備的特徴付けの段階において、T
NF抑制蛋白質の以下の特性及び活性が観察された。
中でも見出される。
しては透析できない。
過カラムを用いたクロマドグ2フイーに付した時の活性
TNF抑制蛋白質の見掛は分子型は、40 kDaと8
0 kDaの間であった。水に対して充分に透析した場
合でも、この方法での蛋白質の挙動には変化はなかつr
、:(第1A及び81!IB図ン。
は、PF′i6と8の間であつ′た。
白質の1部が結会し、そしてそれはメチル−α−D−マ
ンノピラノシドで特異的に溶出′できた。このことは該
蛋白質が糖蛋白質であることを示している。
。
テアーゼインヒビターによっては阻害されなかった。こ
のことは、TNF抑制のメカニズムは粗尿中に存在する
蛋白質加水分解活性によっては説明できないことを示し
ている。
抑制は、TNF抑制蛋白質をTNFと同時に適用した時
にのみ生じた(表1ン。
つかの特性、即ち、(a)’rル濾過での見掛は分子皺
、(b)等電点、及び(c)水に対して透析した時に蛋
白質のかなりの程度の凝集は観察されない、などの特徴
から、ウロモジリンとは相違する。
より、尿蛋白質のrル濾過による分画によって得られる
。
ooo分子量排除膜(Am1con YM 5 メyプ
レン)を用いた限外濾過により、尿を濃縮する。濃縮物
を、1mM Mg2+及びl mMaa”+を含むPB
8(リン酸緩衝化食塩水〕に対して透析し、同じ緩衝液
で平衡化したコンカナバリン−Aセファロースカラムに
付した。カラムを洗浄し、次いでカラムに特異的に結合
した蛋白質を0.5Mメチル−α−D−マンノピラノシ
ドで溶出させた。TNF−αのレセプターへの結合を抑
制する活性を示す、全部ではないが大部分はレクチンに
特異的に吸着され、そしてメチル−α−D−マンノピラ
ノシドで溶出できる。
ンプル’gPB8に対して透析し、次いで2X45cr
ILσltrogel AOA 44カラム(LKB。
出蛋白質の258 nmでの吸収を測定した(−)。
2、1の方法(冶−■)及び2.2の方法によりTNF
−αに対する保護能力を調べた。2.2の方法は、75
σ/−濃度のTNF−αが適用できBa1b /Q−O
L、7細胞が使用できるように改良したものである。1
2時間後に、中性赤色染料の取り込みを測定することに
よって(−) (第1A図]−細胞の生存を調べた。
水に対して48時間透析に付し、次いで不溶性蛋白質を
除くためにスピンした。次いで凍結乾燥し、更にPBS
中で再構成し、上記と同様にしてUltrogθl A
OA 44カラムを用いたクロマトグラフィーに付した
。画分な集め、上記と同様にしてアッセイした。保護活
性の分画パターンには有意な変化は認められなかった(
第1B図ン。
ビター2Q、1kDa及びチトクローム012.3 k
Da>の保持時間と比較した所、約50−70 kpa
の見掛は分子量の最大活性を有する主要蛋白質のピーク
の少し前に、活性部分が溶出することが見出された。
時にのみ、尿濃縮物中に存在するTIIP抑制蛋白質に
よる1315ニーTNF−αの細胞への結合の減少が観
察され、蛋白質を細胞に最初に適用しTNII’−αを
適用する前に蛋白質を除いた場合には、このような結合
の減少は観察されなかった。この事実は、TNFの細胞
への結合の抑制は、TNF抑制蛋白質の細胞九対する効
果によるものでもなく、また尿中にTNF−α自身が存
在することによるものでもなく、むしろ本発明の蛋白質
とTNF−αとのある種の相互作用によるものであるこ
とを示すものである。
おいては、2つのアッセイ法を用いて、#!4なる一分
中のTN?抑制蛋白質の活性をモニターした。
)l、f3.et am、 (1986> Dnmun
ol、Lettθra1 2 : 21 7−224
a、 HOltmann、 H,とWa:Llaah。
161−1167に記載された方法と同様にして実施し
た。
の修正イーグル最少必須培地)に%2.5X108セル
/ウェルの密度で細胞(H8La又はFS11包皮線維
芽細胞)を接種した。59b C02で67℃で24時
間インキュベーション後・、プレートを氷に移し、生育
培地を除き、TNF’抑制蛋白質を含むサンプルのアリ
コートを、ラベル化”5l−TNF−α(I Q5cp
m) 10−2−=ツを含む0.15−リン#LWk衝
化食塩水(PB8)[1mMoa2” 1mMMg”
0.5岬/111tウシ血清アルデきン(BSA)及び
0.1チナトリウムアゾド(PB87BEIム)を1加
〕と混合し、MAmに適用し、久いで4℃で2時間イン
キュベートした。次いで細胞をP B 87B 8 A
でリンスし、放射活性測定用バイアルに移し、ガンマカ
ウンターで2ベル量を定量した。アッセイ系に非ラベル
化TNFを過剰に加えて、非特異的結合址を測定し、全
ての場合においてこの値を差し引いた。
感作細胞に対するTNF’の細胞毒性効果及び中性赤色
染料取り込み法によるその定量(wallach、D
(1984) 1.工mmuno1.152 ”246
4−2469)に基づき開発したものである。
EMで一連の2倍希釈を行ない、これに40σg /
d TNF−α及び400μg/−シクロヘキシイミド
(OHエンを含む同様の培地の等量を加える。
E!1M−08(5%胎児ウシ血清及び5%ウシ血清を
含む)とともにふりンA9細胞を接種する( 1.5X
10’セル/ウエル)。
100μJアリコートをそれぞれのウェルに適用し、更
に細胞を14時間インキュベートした。
を洗い流し、5orenaonクエン酸緩衝液−エタノ
ール混合物で細胞に取り込まれた中性レッドを抽出し、
次いでMiarO,eliaaオートリーダーにより5
70 nInで比色定量を行なうことによって、細胞の
生存を測定した。
意な保護を与える希釈倍率として定義した(P<0.0
5)。
ラベル化物質を使用しないため、精製工程における蛋白
質活性をモニターするのには好ましく用いることができ
る。このバイオアッセイにおいては、個々のウェルから
細胞をカウント用バイアルに移す必要がなく、またMi
croe11saオートリーダーを用いることにより多
くのアッセイ結果をより迅速疋記録することができる。
態は第2図に示した通りである。第2図の(a)には、
OH工だけでインキュベートした細胞が示されており、
(b)にはTNP−α−OH−OH−でインキュベート
した細胞が示されており、(c)にはTNF抑制蛋白質
(前記した0Mセファロースで精製後のもの)とともに
TNF−α−OH−OH−でインキュベートした細胞が
示されている。TNP−αの細胞毒性に対するTNF抑
制蛋白質の保護効果は(c)から極めて明らかである。
製された蛋白質は、以下に示す工程から得られる。
る; (b)、工程(a)で得られる粗蛋白質画分をイオン交
換クロマトグラフィーに付して、TNFのレセプターへ
の結合抑制能力及びTNFの細胞毒性抑制能力で規定さ
れる部分精製されたTNF抑制蛋白質の活性画分を得: (c)、工程〔b)で得られる部分精製されたTNF抑
制蛋白質の活性画分を逆相高圧液体クロマトグラフィー
(HPLC)に付して、 TNFのレセプターへの結合
抑制能力及びTNI!’の細胞毒性抑制能力で規定され
る実質的ICM製されたTNF抑制蛋白質の活性画分を
得:次いで、 (d)、工程(c)の実質的に精製された蛋白質であっ
て、還元条件下での8DB PAGEで約26−28k
I)aの分子量を有し、逆相HPIIOで単一ピークと
して移動し且つTNFのレセプターへの結合抑制能力及
びTNFの細胞毒性抑制能力を有する蛋白質を回収する
。
ルr*シメfルセ770−ス、MonosHR515I
PPLC及びMono Q、 HR515FPLOカラ
ムを好ましくはこの順序で用いて6ステツプで実施する
のが好マシイ。逆相HPLCはAquapore RP
300カラムで実施するのが好ましい。
蛋白質濃度を測定しく 280 nmでの吸光度、又は
代表的なアリコートとフルオレスカミンとの自動化反応
後に相対値光度を測定することによる)、モして前記2
.2で述べたバイオアッセイによりTNF−α細胞毒性
の抑制を測定して、条稍農工程をモニターした。
.45 μm O) Pe1iconメンプレンでのマ
イクロ濾過に付す。次いで、得られる濾液を、10kD
aの分子量排除Pθ1liconメンプレンを用いた限
外濾過で濃縮して終濃度500−とする。得られる濃縮
物を、1mMベンズアミジン及び0.1%ナトリウムア
ジドを含むリン酸緩衝化食塩水に対して透析する。
オン交換カラム(Pharmacia )を、0.02
%ナトリウムアジドを含むi MNaCj、 1QmM
クエン酸緩衝液(pi(5,[])(バッファーa)で
あらかじめ洗浄し、0.02%ナトリウムアシドを含む
1Q mMクエン酸緩衝液(PH5,0)で平衝化した
。上記した6、1の工程の尿濃縮物を、100倍容量の
バッファーAで2回透析し、8000rpmで・15分
間スピンした。得られる上溝を4℃で流速2−7分で0
M−セファロースカラムに付し、50fRt画分を集め
た。蛋白質が検出されなくなるまでバッファーA(約1
500mg)でカラムを洗浄し、次いで0.02%ナト
リウA7ゾドを含む200 mM NaCj。
ーB)の5倍カラム容量で溶出しC5画分)、次いでバ
ッファーCの3倍カラム容量で溶出した(3画分ン。画
分を集め、前記したテストを行なった。
ッファーBによる溶出の第2番目の画分中に見出された
。
Ja )を、0.01%ナトリウムアシドを含む1Qm
Mクエン酸緩衝液(PH5,0)(バッファーA)で、
安定なベースラインが得られるまで(28Q nmにて
Uvディテクターでもモニターした)洗浄した。CM−
セファロースカラムから溶出した活性画分を集め、10
0倍容量のバッファーAで2回透析した。得られるサン
プルを、カラムの最大結合能が達成されるまで(28η
]カラムの8×2一部分に注入した。、平らなベースラ
インが観察されるまで、カラムをバッファーAで洗浄し
た。結合蛋白質を、バッファーAのリニアーNaCjグ
ラゾエント(0−350mM)で溶出した。グラジェン
トを流速0.5d/分で40分間流した。次いでカラム
を550 mMNaczバッフ7−A(バyy7−D)
で10分間洗浄した。35 Q mM Na(:、!の
濃度で溶出しなかった蛋白質が、バッファーCでカラム
から溶出した。0.5−画分を集め、前記したようにし
てテストした。得られる結果は第6図に示した。
の濃度に対応する画分20−23に溶出していることが
判った。
a )を、安定なベースラインが得られるまで、0.0
2%ナトリウムアシドを含む5 mMナトリウムポレー
ト緩衝液(PH9,0)(バッファーE)で洗浄した。
0倍容量のバッファーEで2回透析した。得られるサン
プルをカラムの2一部分に注入し、ベースラインが平ら
になるまでバッファーEをカラムに流した。バッファー
EのリニアーNa(Jグラジエン) 0−60 mMで
60分間、次いでバッファーEのリニアーNaCtグラ
ゾエント60−300mMで30分間、結合蛋白質を溶
出させた。カラムを、300mMNaczバッファーE
で10分間次いで1M Na0fバツフアーEで流速0
.5m/分で4分間洗浄した。0.5−画分を集め、活
性及び蛋白質量をテストした。第4図に示したように、
活性を示す大部分は、約40 mM O) Na(J濃
度の画分15−18中に溶出した。
)逆相HPLC!カラムAquapore RP 30
04.6X 3 Q nm (Brownles La
tl )を、フルオレスカミン検出系で安定なベースラ
インが得られるまで、0.6%トリフルオロ酢#1(T
FA)水溶液(バッファーF)であらかじめ洗浄した。
ムの1.6一部分に注入した。螢光光度計で蛋白質が検
出されなくなるまで、カラムにバッファーFを流速0.
5mg/分で流した。次いで、バッファーFの〇−20
%アセトニトリルリニアーグラゾエントで5分間、20
−50%アセトニトリルリニアーグラジェントで60分
間、最後に50−80%アセトニトリルリニアーグラジ
ェントで5分間、流速0.5d/分で溶出した。次いで
、80チアセトニトリルで15分間カラムを洗浄した。
。第4図に示されるように、単離された蛋白質ピークと
共に画分2l−23(画分22にピークを有する)に活
性部分がシャープに溶出した。これらの画分は27襲ア
セトニトリルに対応していた。
σ、L。
: 68 Qに記載された方法により、ナトリウムド
デシルスルフェートポリアクリルアミrrル電気泳動(
8D8−PAGm)を実施した。上記工程6.2.6,
3及び五4のイオン交換カラムから溶出した5μg蛋白
質を含む活性画分のサンプル(シーyB:oM−セファ
ロースカラムから溶出した活性画分;レーンa : M
ono Bカラムから溶出した活性画分:レーンD :
Mono Qカラムから溶出した活性画分)、あるい
は逆相HPLCで得られる画分21−23の40 pi
サンプル(レーンに−G )を、6%SD8(w/v)
及び15 % (V/V)β−メルカフトエタノールを
含む6倍濃度のサンプルバッファーと混合し、15%ア
クリルアミドrルに付した。対照分子量として、分子量
マーカー混合物(α−ラクトアルブミン14.4 kD
a 、大豆トリプシンインヒビター2Q、i kDa
、カルボニックアンヒドラーゼ3 Q kDa 、オボ
アルプミン43 kDa 、ウシ血清アルブミン671
■a及びホスホリラーゼb94kDa)を上記と同様に
処理し、レーンAに付した。サンプルバッファーをブラ
ンクとしてレーンHに付した。rルを160ボルトで流
し、蛋白質バンドな銀染色により発色させた[ 0ak
ley、 B、 R,at al。
o K 6図に示したように、精製したTNF抑制蛋
白質は、見掛は分子量26−28 kDaを有する単一
ピークとして移動した(レーンに−G)。
に精製されたTNF抑制蛋白質のサンプル(1−5μg
、それぞれ50−250−200pを、あらかじめ処理
したバイオプレン被覆ガラスファイバーディスに適用し
た。この乾燥ディスクを、オンラインII!PLCPT
H−アミノ酸アナライデー(Mode1120)及びデ
ータ入手とプロセッシングユニットMode1900を
備えた自動パルス液ガス相蛋白質マイクロ配列分析機(
Mode1475)(全てApplied Biosy
atem工nc、 Po5terQit7. QA、
[T、8A )でIgman分解繰返シサイクルに付し
た。コンぎニーターで得られる配列ななまデータと比較
し、必要に応じて修正した。配列データを確認するため
、それぞれ独立に3回分析を実施した。最初の収率は4
0%以上であり、このことは、調製物中の主要蛋白質(
27)cDaバンド)は得られる配列と関連しているこ
とを示している。
酸配列を有している。
ティン残基については、その存在は理論的である。なぜ
なら、PTH’(フェニルチオヒダントイン) ayg
がそのように同定できず、池のアミノ酸残基はこの位置
では検出されなかったためである。
e(LiCalRe(16)arah POundat
lon蛋白質ライブ2リー(A16まで]のコンぎニー
ターサーチでは、公知の蛋白質と有意な相同性を示さな
かった。
、本発明のTNF抑制蛋白質をコードするヌクレオチド
配列を含むDNA分子、該DNA分子を含む複製可能な
発現ベクター、該ベクターによって形質転換された宿主
に関する。こコテ言つ1DNA分子”トハ、r / A
DNA、 CDNA。
法によって実施することができる。七の1つのアプロー
チは、TNP抑制蛋白質に対して特異的抗体Cポリクロ
ーナル又はモノクローナル】を得、これを用いてTNF
抑制蛋白質のQDNAをクローン化する方法である。こ
のアプローチは以下に示す6つの工程からなる。
を用いることにより得られる。aち、本発明の実質的に
精製されたTNF抑制蛋白質を用いる方1i:TNF抑
制蛋白質の知られた配列、例えばN−末端配列などと同
じ1つまたはその以上の合成ペゾチVを用いる方法:あ
るいは、 TNP抑制蛋白質のアミノ酸配列から推定さ
れる可能なヌクレオチド配列の1つをプロティンAをコ
ードする遺伝子と融合しE、 coliにてプロティン
A−TIJP’抑制蛋白質融合体を発現せしめることに
よる方法によって得られる。
1J11′抑制蛋白質又はその合成ペゾチドを担体蛋白
質に納会したものをラビットに注射する。
抑制蛋白質融合合成遺伝子なlii、001にて発現せ
しめ、生成する照会蛋白質な工g()セファロースカラ
ムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精
製しマウスに注射する。あるいは、本発明の実質的[!
製されたTNF抑制蛋白質をマウスに直接注射する。
制蛋白質に対する抗体を用いて、螢光抗体法又はウェス
タンプロット法によりTNF抑制蛋白質産生細胞を捜す
。
質産生細胞からInRNAを抽出し、逆転写酵素を用い
てQDNAを調製する。得られるC DNAなλgt1
1などの発現ベクターにクローン化し、抗体を用いてス
クリーニングする。λgt11発現ベクターは、そのβ
−がラクトシダーゼ終止コドンから56塩基上流の非反
復EIQR工部位に7 kbまでのDNAを挿入するの
に用いることができる。従って、゛外来配列DNAをこ
の部位に挿入し、適当な条件下で照会蛋白質として発現
することができる。λgt11発現ベクターは、抗体プ
ローブを用いたスクリーニングを行な5 cDNAライ
ブラリーの構築にt¥fに有用である( Huynh、
T、 V。
d、 )、 DNA OloningTechniqu
es : A Practical Approach
、工RLpress、oxford (1984) p
P−49−78)。
例えばN−末端アミノ酸配列などから得られる配列を有
する合成オリゴヌクレオチド又はその混合物を調製し、
このオリがヌクレオチド又はそのその混合物を、 TN
F抑制蛋白質をコードするゲノムDNA又はODNAを
クローニングするだめのプローブとして用いる。
会もあり含まれない場合もある。ゲノムDNAは、ガえ
ば、適当な細胞から抽出し公知の方法によりfIvl!
1シて得ることができる。ヒトゲノムDNAなどの好適
なりNA調製物は、制限酵素によって酵素的に開裂する
ことができ、またランダムに切ることができ、得られる
断片は遺伝子2イブラリ゛−を構築するために適当な組
換えベクターに挿入される。次いで、得られるベクター
は、本発明のTNF抑制蛋白質をコードする配列を同定
するために合成オリゴヌクレオチドプローブでスクリー
ニングすることができる。
蛋白質を発現する細胞から単離し、これを用いて公知の
方法により0DNAを調製することができる。得られる
CDNAは、2本鎖に変換後、クローン化し、得られる
クローンについて、適当なプローブを用いて目的とする
配クリなコードする(!DNAであるか否かをスクリー
ニングする。目的とするクローンが単離されると、ゲノ
ムDNAと実質的に同様の方法により(! DNAを増
輸する。しかしながら、0DNAの場合にはイントロン
や介在配列は存在しない。
めに、インタフ) TNF抑制蛋白質の配列分析を実施
するか、あるいはそのペプチド断片を得そのアミノ酸配
列のt¥f徴付けを行なうことができる。ペプチド断片
を得るには、精製された蛋白質調製物を、公知の方El
i (01ke、 Y、 at al。
: 9751−9758]により、例えばトリプシン、
キモトリプシン、パパインなどのプロテアーゼを用いた
消化などのフラグメンテーションに付す。消化により得
られるペプチド断片な逆相H1aOで分離し、自動アミ
ノ酸配列分析法により配列決定を行なう。
初の16個のアミノ酸罠対応する配列を、自動配列分析
機を用いて決定した。そして以下に示すアミノ酸配列が
得られた。
され、または蛋白質の部分配列が決定されたら、それら
をコードするDNA配列について調べる。遺伝子コドン
の縮重により、1つまたはそれ以上のコドンな用いて特
定のアミノ酸をコードすることができ、従って1つまた
はその以上の異なるオリイヌクレオチドを調製すること
ができ、これらのいずれもがTNF抑制蛋白質ペゾチド
断片をコードすることができる[ Watson、 J
、 D、 。
Gene; 3rd ed、 ;W、 A、 B19n
jamin、工nc、Men1o Park、OA(i
977 Lpp。356−357)。しかしながら、
これらのオリがヌクレオチrのうち1つだけが、遺伝子
のヌクレオチド配列と同じヌクレオチド配列を含んでい
る。このようなオリゴヌクレオチドが存在しておりそし
てそのオリゴヌクレオチドは他のオリイヌクレオチドが
存在していてもDNAとハイブリダイズすることが出来
るため、単一のオリゴヌクレオチドを用いてペプチドを
コードする遺伝子をクローン化するのと同じ方法で、一
連の未分画のオリゴヌクレオチドをそのまま用いること
ができる。ペプチドをコードするオリデヌクレオチr1
あるいはTNF抑制蛋白質断片をコードすることのでき
る理論的に“最も可能性の高い”配列を含む一連のヌク
レオチytヌクレオチドのセット)を用いることにより
[Lathe、R,et al、 (1985);J、
Molθa、n1o1.183 : 1−12に記載
された1コドン使用ルール”に従い〕、相補性オリゴヌ
クレオチドの配列を同定することが出来、あるいはTN
?抑制蛋白質もしくはその少なくとも1部をコードする
1最も可能性の高い”配列とハイブリダイズすることの
できるヌクレオチドのセットもしくはそのような配列の
セットを同定することが出来る。次いで、このような相
補性配列を含むヌクレオチドを合成し、本発明のTNF
抑制蛋白質の遺伝子を同定し単離するだめのプローブと
して用いることができる[ Maniatid、 T、
et am、lJolecularoloning:
A Laboratory Manual、 cold
SpringHarbor press、 Co1d
Spring Harbor、 N、Y。
の適当なオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドの
セット(あるいはそのようなオリゴヌクレオチドと相補
性を示すオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチVの
セット)が上記したようにして同定されるとそれらオリ
ゴヌクレオチドが合成され、次いで、DNAにハイブリ
ダイズされる。好ましくは目的とする遺伝子を発現でき
る細胞から誘導されたCjDNAg製物とハイブリダイ
ズされる。そしてかかるハイブリダイズは、好ましくは
、目的とする遺伝子を高レベルで産生する細胞からRN
Aを抽出し逆転写酵素を用いて対応するCDNAに変換
すること等によってCDNA源が目的とする配列を豊富
に含むようにした後に、行なうのが好い。
、例えば、Manlatis、 T、、 Molecu
laroloning : A Laboratory
Manual (上記と同じ):Haymes、B、
T、、 et al、、 Nucleic Ac1dH
ybridization : A Practica
l Approach、工RLPress、 0xfo
rd、 England (19f35 )に記載され
ている。上記したヌクレオチド又はオリイヌクレオチド
のセットのプローブを用いいてハイブリダイゼーション
を行なうことにより、CDNA又はゲノムライブラリー
からハイブリダイズするDNA配夕1」を同定すること
ができ、次いで、得られるDNA配列は分析に付されて
、本発明の’IJF’抑制蛋白質のコード配列をどの程
度含んでいるか測定される。
ターなどのいくつかのヒト蛋白質の遺伝子がクローン化
されている( pennica、 D、at al。
1 :)。
質をコードするDNA分子は、−収約方法[Manni
atisθt al (上記と同ン〕により、適当に構
築された発現ベクターに挿入される。ホモポリマーチイ
ル化、又は合成りNAリンカ−もしくは平滑末端すp(
−ジョンを用いた連結化により、2本鎖CDNAがプラ
スミドベクターに連結される。
カリホスファターゼ処理によって望ましくない連結が除
かれる。
可能にし蛋白質の産生な可能にするように、目的とする
蛋白質をコードするDNAに転写及び翻訳調節領域が結
合された特定のヌクレオチド配列が、発現ベクターに含
まれていなければならない。最初に、遺伝子が転写され
るためには、RNAポリメラーゼによって認識されるプ
ロモーターがその遺伝子の上流に存在していなければな
らず、このプロモーターにポリメラーゼが結合して転写
工程が開始される。このようなプロモーターには各種の
プロモーターが使用でき、これらはそれぞれ相違する効
果C強力プロモーター及び弱いプロモーターなど)を持
っている。プロモーターは、真核細胞、原核細胞によっ
ても相違する。
リオファージλのintプロモーター、pBR622の
β−2クタマーゼ遺伝子のb工aプロモーター pPR
325のりa9ムフエニコールアセチルトランスフエラ
ーゼのOA77°r2モーターなどの構成(const
itutive )プロモーター あるいはバクテリオ
ファージλのメジャーライト及びレフトプロモーター(
PL及びRR)、14.C011のtrp、 recA
、 1acZ、 lac工、 ompy及びgalプロ
モーター、 trp4acハイブリッドプロモーターな
どの誘導プロモーター(G11Qk、 B、R,(19
87ンJ、工nd、MiCrObiO1,1: 277
−2821がある。
を使用する外に、原核細胞にて高レベルの遺伝子発現を
達成するためには、mRNAの有効な転写を確かなもの
にすることのできるリポプーム結合部位を使用すること
も必要である。この1つの例が、開始コドンの上流の適
当な位置にあり16 S RNAの6′−末端配列と相
補性を示すシャイン−ダルが〕配列(8D配列)である
。
転写及び翻訳調節配列が使用される。これらは、アデノ
ウィルス、ウシパピローマウィルス、シミニアンウィル
スなどのウィルスから誘導できる。これらの場合には、
調節シグナルは;高レベルの発現を有する特定の遺伝子
に関連している。
0初期プロモーター、酵母gal 4遺伝子プロモータ
ーなどが挙げられる。抑制及び活性化のいずれもが可能
な転写開始調節シグナルを選ぶこともでき、この場合に
は遺伝子の発現を調節することが可能となる。
列、及び作動可能なように連結された転写及び翻訳調節
シグナルを含むDNA分子は、目的とする遺伝子を宿主
細胞のクロモ・戸−ムに組込むことのできるベクターに
挿入される。DNA分子をそのクロモシームに安定に組
込んだ細胞は、1つもしくはそれ以上のマーカーによっ
て選択できる。
択を可能にするものである。マーカーは、栄養要求性宿
主に対して原栄養性を与えるもの、あるいは抗生物質、
銅などの重金属等の抗微生物剤に対して耐性を与えるも
のである。選択マーカー遺伝子は、発現すべきDNA遺
伝子配列に直接連結してもよく、あるいは−緒にトラン
スフェクトして同じ細胞(導入してもよい。更には、1
本鎖結合蛋白質mRNAの合成を最適に行なうためのエ
レメントも必要である。このようなエレメントとしては
、転写プロモーター エンハンサ−1終止シグナルと共
にスプライスシグナルなどがある。
トシては、例えばOkayama、H,、(1983>
Mol、Co1.Blol、 3 : 280に記載さ
れたものなどがある。
において自己複製可能なプラスミドもしくはウィルスベ
クターに導入される。特定のプラスミドもしくはウィル
スベクターを選択する上で重要な要素は、該ベクターが
導入された細胞が容易に認識され且つ該ベクターが導入
されない細胞から区別して容易に選択できるかというそ
の容易性:宿主細胞において存在する目的とするベクタ
ーのコーー数;及び、異なる種の宿主細胞間でベクター
を望ましく移動できるか否かという点である。
022 、 OO’lE1. pSo 101 、p
AOYOI 84などのE、0O11で複製可能なプラ
スミド(Maniatisat al、、 Mo1ec
ular Oloning: A Laborator
yManual (上記と同じ> ) ; pc194
.pc221゜pT127などのバチルスプラスミド(
Gryczan。
of the Bacilli。
I I)P−307−329] : p工J101な
どのストレプトマイセスシラスミW (Kendall
、 L J、 et al、。
: 4177−4183] :φ061などのストレ
ゾトマイセスバクテリオ7アーゾ[chater、 K
、 F、 et al、 *5ixth l:nter
nationa:l symposium on Ac
tlnomy−cetales Biology、 A
kademiai KaidO,Budapest。
54] #’/ニードモナスプラスミド(John、
J、 F、 et al、 。
: 693−704 ); 工zaki、+、
K、 (1978) :rpn、:r。
どがある。
7クシニア、Sσ40,2−ミクロンサークル、これら
の誘導体などが挙げられる。このよ5なプラスきドはよ
く知られたものである[ Botatein、 p、
et am、 (1982) MiamiWint、
8ymp、 19 : 265−274 ; Broa
ch。
ogy of the yeastsaccharom
yces : 1ife aycle and工nhe
ritance。
atOr7. Co1d Elpringuarbor
、 NY、 1)I)、 445−490 (1981
);Broach、 J、R,、(1982) □el
123 : 203−204 ;BOllOn、 D、
P、、 eta:L、 (i 93Q ):J、 01
in、 Hamatol、 0naol、 1Q :
39−48;Maniatis、 T、、 Ce1l
Biology : A Comprehensive
Treatise、 Vo:L、 3 : Gene
Expression、Academicpress、
NY、 I)Il、 563−608 (1980>
)。
れたら、形質転換、トランスフェクション、コンシュデ
ージョン、フロドプラスト融合、エレクトロポレーショ
ン、リン酸カルシウム沈澱、直接マイクロインジェクシ
ョンなどの各種の方法によって、DNA構築体は適当な
宿主に導入される。
れでもよい。好ましい原核細胞宿主としては、例えば、
B、C011,バチルス、ストレゾトマイセス、シン
イドモナス、サルモネラ、セラチアなどのバクテリア等
がある。最も好ましい原核細胞宿主はFJcoliであ
る。特に興味あるバクテリア宿主は、例えば、m、co
llK 12株294(ATOC314466): L
CO1iX1766(ATOO31537) ; F、
coliW311 Q (F−ラムダ−1原栄養性(A
TOO27325));ザルモネラチフイムリウム、セ
ラチアマルセツセンス、各種のプソイドモナスなどの腸
内バクテリア等がある。このような宿主の場合には、蛋
白質はグリコジル化されない。また、原核細胞宿主は、
発現プラスミドのレゾリコーン配列及びコントロール配
列と親和性を有していなければならない。
ャイニーズハムスター卵巣(OHO)IIIB胞などの
哺乳動物細胞であり、これらの細胞は、正確な構成もし
くは正確な部位でのグリコジル化などの、蛋白質分子に
対する翻訳後の修正を行なうことができる。また、酵母
もグリコジル化などの、翻訳後のベプチr修正を行なう
ことができる。強力プロモーター配列、及び酵母での目
的とする蛋白質の産生に利用される高コピー数プラスミ
ドを用いた多くの組換えDNA技術が知られている。酵
母は、クローン化された哺乳動物遺伝子生産物のリーダ
ー配列を認識することができ、リーダー配列を保持した
ペプチド(即ちプレペゾチV)を分泌する。
Mの生育を選択することのできる選択培地で生育される
。クローン化遺伝子配列の発現により、目的とするTN
F抑制蛋白質又はその断片が産生される。次いで、発現
された蛋白質が、本明細書において記述した精!R法(
セクション6〕により、あるいは抽出、沈澱、クロマト
グラフィー電気泳動などを用いた他の慣用的方法により
、単離精製される。
きる更なる精製手段は、アフィニティークロマトグラフ
ィーである。この目的のために、TNF抑制蛋白質に対
するモノクローナル抗体が調製され、カラム中のデルマ
トリックスに吸着される。組換え蛋白質を含む粗調製物
がカラムに流される。この時に、蛋白質は特異的抗体に
結合し、他方不純物はカラムから流出される。洗浄後、
−もしくはイオン強度を変化させて目的とする蛋白質を
デルから浴出する。
ドーマ法[Kohler et am、 (I 97
5 )Nature 256: 495 : KOhl
er at am。
511 )によって調製できる。−収約にこの方法は
、目的とする精製蛋白質抗原、又はウシ血清アルブミン
などの適当な担体に結合した目的とする蛋白質のN−末
端部分の配列を有する合成ペプチドで動物を免疫化する
工程をその方法の1工程として含んでいる。免疫化され
た動物の牌細胞を単離し、適当なミエローマセルライン
と融合させる。融合後、得られるハイシリドーマ細胞な
HAT培地中で維持し、次いでクローン化する。か(し
て得られる)1イブリドーマ細胞をアッセイして、TN
F抑制蛋白質と結合する抗体を分泌するクローンを同定
する。
マウスの腹膜にクローン化細胞を注射して腹水液中で、
目的とするクローン化細胞を大量に生育させる。
のようにして/Sイブリドーマから得られそして精製後
カラムに吸着されたモノクローナル抗体は、TNF抑制
蛋白質のnmに極めて有効である。
活性2ラクジヨンは、哺乳動物でのTNFの有害な効果
を中和するために、即ち、過剰なTNFが内因的に形成
されるあるいは外部から投与される状態を処置するため
に使用される。
としての本発明のTNF抑制蛋白質、その塩、その機能
的誘導体又はその活性フラクションを含む薬学的組成物
に関する。かがる組成物は、敗血性ショック、悪態症、
移植片対宿主反応、リウマチ性関節炎などの自己免疫疾
患等の、内因的なTNFの産生過剰状態に対して使用す
ることができる。投与方法は、同様の薬剤の投与法と同
様であり、そして投与対象者の状態によってその方法は
変動する。即ち、例えば、敗血性ショックの揚会には静
注であり、リウマチ性関節炎の場合には局部注射(1例
えばひざ)あるいは継続点滴などである。本発明の組成
物は、TNIPO)過剰投与によるTNF中毒の状態に
使用することもできる。
学的に許容し得る担体、安定化剤、希釈剤などと混会す
ることによって調製することか出来、そして例えば投与
用バイアル中で凍結乾燥することにより単位投与形態と
することができる。投与すべき活性化合物の置は、投与
ルート、病気、患者の状態などによって変動する。リウ
マチ性関節炎の炎症状態の場合の局所注射は、敗血性シ
ョックなどの静脈点滴の場合より、より少ないTNF抑
制抑制蛋白質体重に応じて投与される。
k濾過カラムからのTNF抑制蛋白質の溶出パターン
を示す。 第1B図は、σltrogel AOA 44デル濾過
に付ず前に水に対して透析した場合のTNF抑制蛋白質
の浴出パターンを示す。 第2図は、生物の形態を示す写真であり、シクロヘキシ
イミド(OHエバa)、TNF−α−OH工(b)、あ
るいはTNF抑制蛋白質とともにTNF−α−OH工(
c)で処理したムリンA9細胞の形態を示す。 第6図は、TNF抑制蛋白質の第2の′IN製工程の結
果を示す。 第4図は、 TNF抑制蛋白質の第6のfpt製工程の
結果を示す。 第5図は、逆相HPL○によるTNF抑制蛋白質の分離
を示す。 第6図は、各精製工程における活性物質を含むサンプル
を19D8 PAGFiで分析した結果を示す写真であ
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)(a)腫瘍壊死因子(TNF)のレセプターへの
結合;及び (b)TNFの細胞毒性効果;を抑制することのできる
TNF抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導体、及び/
又はその活性フラクシヨン。 (2)その粗調製物をUltrogelACA44ゲル
濾過カラムを用いたクロマトグラフィーに付した時に、
約40−80kDaの見掛け分子量を有する請求項1の
TNF抑制蛋白質。 (3)実質的に精製された形態にある請求項1のTNF
抑制蛋白質。 (4)実質的に精製された形態にある該蛋白質を還元条
件下のSDSPAGEにより分析した時に、約26−2
8kDaの見掛け分子量を有する請求項1又は3のTN
F抑制蛋白質。 (5)逆相高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で
単一ピークとして移動する請求項1又は3のTNF抑制
蛋白質。 (6)ヒトHeLa及びFS11線維芽細胞の細胞表面
レセプターにTNF−αが結合するのを抑制する能力を
有する請求項1−5のいずれかのTNF抑制蛋白質。 (7)ムリンA9細胞に対するTNF−αの細胞毒性効
果を抑制する能力を有する請求項1−6のいずれかのT
NF抑制蛋白質。 (8)そのN−末端部分に以下のアミノ酸配列を有する
請求項1−7のいずれかのTNF抑制蛋白質:【遺伝子
配列があります】 (式中、Xは同定されていないアミノ酸残基を示し、4
番目の位置のCysの存在は理論的に裏付けられている
)。 (9)実質的に精製されたTNF抑制蛋白質の製造法で
あつて、 (a)、ヒト尿の透析濃縮物から粗蛋白質画分を回収し
; (b)、上記工程(a)で得られる粗蛋白質画分をイオ
ン交換クロマトグラフィーに付して、TNFのレセプタ
ーへの結合及びTNFの細胞毒性効果を抑制できる能力
によつて規定されるTNF抑制蛋白質の部分精製活性画
分を得; (c)、上記工程(b)で得られる部分精製活性画分を
逆相高圧液体クロマトグラフー(HPLC)に付して、
TNFのレセプターへの結合及びTNFの細胞毒性効果
を抑制できる能力によつて規定されるTNF抑制蛋白質
の実質的に精製された活性画分を得;次いで(d)、上
記工程(c)の実質的に精製された蛋白質であつて、還
元条件下のSDS PAGEで見掛け分子量が約26−
28kDaであり逆相HPLCで単一ピークとして移動
し、TNFのレセプターへの結合及びTNFの細胞毒性
効果を抑制できる能力を有する蛋白質を回収する; ことを含む上記製造法。 (10)工程(b)のイオン交換クロマトグラフィーを
、カルボキシメチルセフアロース、Mono S HR
5/5FPLC及びMono Q HR 5/5 FP
LCを用いて好ましくはこの順序で3工程で行なう請求
項9の製造法。 (11)工程(b)、(c)及び(d)の画分の活性を
、ヒトHeLa及びFS11線維芽細胞の細胞表面レセ
プターへのTNF−αの結合を抑制するTNF抑制蛋白
質の能力によつて規定する請求項9の製造法。 (12)工程(b)、(c)及び(d)の画分の活性を
、ムリンA9細胞に対するTNF−αの細胞毒性効果を
抑制するTNF抑制蛋白質の能力によつて規定する請求
項9又は10の製造法。 (13)請求項9−12のいずれかによつて製造される
請求項1又は3のTNF抑制蛋白質。 (14)請求項3のヒトTNF抑制蛋白質。 (15)組換え蛋白質である請求項1のTNF抑制蛋白
質。 (16)請求項1のTNF抑制蛋白質をコードするヌク
レオチド配列を含むDNA分子。(17)ヌクレオチド
配列がゲノムDNA又はcDNAである請求項16のD
NA分子。(18)請求項16のDNA分子を保持し、
形質転換宿主細胞にて請求項1−8のいずれか又は請求
項15のTNF抑制蛋白質を発現することのできる複製
可能な発現ベクター。(19)請求項18の複製可能な
発現ベクターで形質転換された宿主細胞。 (20)請求項19の原核宿主細胞。 (21)請求項19の真核宿主細胞。 (22)(a)、請求項19の形質転換宿主細胞を適当
な培養培地で培養し;次いで (b)、TNF抑制蛋白質を単離する; ことを含むTNF抑制蛋白質の製造法。 (23)請求項22の製造法によつて製造されるTNF
抑制蛋白質。 (24)薬学的に許容し得る担体、及び活性成分として
のTNF抑制蛋白質、その塩、その機能的誘導体、又は
その活性フラクシヨンを含む薬学的組成物。 (25)哺乳動物におけるTNFの有害な効果を中和す
るのに使用するためのTNF抑制蛋白質、その塩、その
機能的誘導体又はその活性フラクシヨン。 (26)過剰なTNFが内因的に形成される又は外部か
ら投与される状態の処置に使用するためTNF抑制蛋白
質、その塩、その機能的誘導体又はその活性フラクシヨ
ン。
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