DE69724451T2

DE69724451T2 - Kombinationtherapie mit einem tnf-bindendem protein zür behandlung von durch tnf verursachten erkrangungen

Info

Publication number: DE69724451T2
Application number: DE69724451T
Authority: DE
Inventors: M. Alison BENDELE; M. Regina SENNELLO; K. Carl EDWARDS
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-12-08
Publication date: 2004-03-18
Anticipated expiration: 2017-12-09
Also published as: US20020119924A1; JP2001513754A; HK1022440A1; CA2273850A1; US20040047863A1; DK0942740T3; US20040048799A1; WO1998024463A2; EP0942740B1; US6306820B1; DE69724451D1; AU5696198A; ATE247974T1; PT942740E; WO1998024463A3; EP0942740A2; ES2207759T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der TNF-vermittelten Erkrankungen. Noch spezifischer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Kombinationstherapie zum Zwecke der Vorbeugung oder Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen.
Hintergrund der Erfindung
Entzündung ist eine Abwehrreaktion des Körpers gegen solche Verletzungen wie sie beispielsweise durch die mechanische Beschädigung, Infektion oder antigene Stimulation verursacht werden. Ein entzündliche Reaktion kann pathologisch werden, wenn die Entzündung durch einen nicht geeigneten Stimulus wie beispielsweise ein Autoantigen induziert wird, in einer übermäßigen Art und Weise exprimiert wird oder nach Entfernung der verletzenden Agenzien deutlich fortbesteht. Eine solche entzündliche Reaktion kann die Herstellung bestimmter Cytokine mit einschließen.
Während die Etiologie der Entzündung wenig verstanden wird, wurden kürzlich beachtenswerte Informationen bezüglich der molekularen Aspekte der Entzündung gewonnen. Diese Untersuchung führte zur Identifizierung bestimmter Cytokine, von denen angenommen wird, dass sie eine prominente Rolle in der Vermittelung der Entzündung spielen. Cytokine sind extrazelluläre Proteine, die das Verhalten von Zellen modifizieren, insbesondere von solchen Zellen, die sich in der unmittelbaren Umgebung der Cytokinsynthese und Freisetzung befinden. Tumornekrosefaktoren (TNFs) sind eine Klasse an Cytokinen, die durch verschiedene Zelltypen hergestellt werden, einschließlich Monocyten und Makrophagen.
Mindestens zwei TNFs wurden kürzlich beschrieben, insbesondere TNF-alpha (TNF-α) und TNF-beta (TNF-β oder Lymphotoxin), und jedes ist als ein trimeres Molekül aktiv und es wird angenommen, dass es zelluläre Signale durch das Crosslinken von Rezeptoren initiiert (Engelmann et al. (1990), J. Biol Chem., 265: 14497–14504).
Verschiedene Beweisführungen implizieren, dass TNF-α, und TNF-β wesentliche entzündliche Cytokine darstellen. Diese bekannten TNFs besitzen wichtige physiologische Effekte auf einer Reihe verschiedener Targetzellen, welche an entzündlichen Antworten auf eine verschiedene Anzahl an Stimuli wie beispielsweise Infektion und Verletzungen beteiligt sind. Die Proteine veranlassen beiderseits Fibroblasten und synoviale Zellen, latente Collagenasen und Prostaglandin E₂ zur Sekretion und veranlassen Osteozytenzellen, die Knochenresorption zu stimulieren. Diese Proteine steigern die adhäsiven Eigenschaften von Endothelzellen für Neutrophile. Sie veranlassen ebenfalls Endothelzellen, koagulierende Aktivität zu sekretieren und reduzieren ihre Fähigkeit zu Lyse von Clots. Weiterhin richten sie die Aktivität von Adipozyten weg von der Lagerung von Lipiden durch die Inhibierung der Expression des Enzyms Lipoprotein Lipase. TNFs veranlassen ebenfalls Hepatozyten, eine Klasse an Proteinen zu synthetisieren, die als "akute Phasenreaktanten" bekannt sind, und welche auf den Hypothalamus als Pyrogene einwirken (Selby et al. (1988), Lancet, 1(8583): 483; Stames, Jr. et al. (1988) J. Clin. Invest., 82: 1321; Oliff et al. (1987), Cell 50: 555 und Waage et al. (1987), Lancet, 1(8529): 355).
Eine Erkrankung oder ein medizinischer Zustand wird als eine "TNF-vermittelte Erkrankung" betrachtet, falls die spontane oder experimentelle Erkrankung mit gesteigerten Mengen an TNF in Körperflüssigkeiten oder Geweben assoziiert ist, die dem Fokus der Erkrankung oder Indikation innerhalb des Körpers benachbart sind. TNF-vermittelte Erkrankungen können ebenfalls an den folgenden zwei Bedingungen erkannt werden: (1) pathologische Erkenntnisse assoziiert mit einer Krankheit können in Tieren durch die Verabreichung von TNF experimentell imitiert werden und (2) die in experimentellen Tiermodellen induzierte Pathologie der Erkrankung kann durch die Behandlung mit Agenzien inhibiert werden oder verschwinden, die die Aktion von TNF inhibieren. Viele TNF-vermittelte Erkrankungen genügen zweien dieser drei Bedingungen, und andere werden allen drei Bedingungen genügen.
TNF-vermittelte Erkrankungen wie beispielsweise rheumatoide Arthritis und psoriatische Arthritis sind chronische Gelenkerkrankungen, die Millionen Menschen weltweit in unterschiedlicher Größenordnung betreffen und behindern. Rheumatoide Arthritis ist eine Erkrankung der artikulären Gelenke, in welchen der Knorpel und Knochen langsam durch ein proliferatives invasives verbindendes Gewebe wegerodieren, genannt Pannus, welches aus der synovialen Membran stammt. Die Erkrankung kann peri-artikuläre Strukturen wie beispielsweise Schleimbeutel, Sehnenscheiden und Bänder wie auch extra-artikuläre Gewebe wie beispielsweise das subkutane, kardiovaskuläre System, Lungen, Milz, Lymphknoten, skeletale Muskeln, Nervensystem (zentrales und peripheres) und Augen miteinbeziehen (Silberberg (1985), Anderson's Pathology, Kissan (Hrsg.), II: 1828).
Es wird angenommen, dass rheumatoide Arthritis aus der Darbietung eines relevanten Antigens an einen immunogenetisch empfänglichen Wirt resultiert. Die Antigene, die möglicherweise eine Immunantwort initiieren, die in rheumatoider Arthritis resultiert, können endogen oder exogen sein. Mögliche endogene Antigene schließen Collagen, Mucopolysaccharide und rheumatoide Faktoren ein. Exogene Antigene schließen Mycoplasmen, Mycobakterien, Spirochäten und Viren mit ein. Nebenprodukte der Immunreaktion entzünden die Synovia (z. B. Prostaglandine und Sauerstoffradikale) und lösen destruktive Gelenksveränderungen aus (z. B. Collagenase).
Es gibt ein breites Spektrum an Erkrankungsgraden, jedoch durchlaufen viele Patienten einen Gang an unterbrechenden Rückfällen und Abschwächungen mit einem allumfassenden Muster einer langsam fortschreitenden Gelenkzerstörung und Deformierung. Die klinischen Manifestationen können symmetrische Polyarthritis von peripheren Gelenken mit Schmerz, Empfindlichkeit, Anschwellen und Verlust der Funktion von betroffenen Gelenken; morgendliche Steifheit; und Verlust von Knorpel, Erosion von Knochenteilen und Subluxation von Gelenken nach persistenter Entzündung. Extra-artikuläre Manifestationen schließen rheumatoide Knötchen, rheumatoide Vaskulitis, pleuropulmonare Entzündungen, Skleritis, Siccasyndrom, Felty-Syndrom (Splenomegalie und Neutropenie), Osteoporose und Gewichtsverlust (Katz (1985), Am. J. Med., 79: 24 und Krane und Simon (1986), Advances in Rheumatology, Synderman (Hrsg.), 70(2): 263–284). Die klinischen Manifestationen resultie ren in einem hohen Grad an Morbidität, was in einer Störung des täglichen Lebens des Patienten resultiert.
Weiterhin liegen die präklinischen Ergebnisse mit verschiedenen voraussagenden Tiermodellen für rheumatoide Arthritis nahe, dass die Inhibition von TNF-α, einen wesentlichen Einfluss auf das Fortschreiten und die Schwere der Erkrankung besitzen können (Dayer et al. (1994), European Cytokine Network, 5(6): 563–671 und Feldmann et al. (1995), Annals Of The Ney York Academy Of Sciences, 66: 272–278). Weiterhin haben kürzlich humane klinische Versuche bei rheumatoider Arthritis mit Inhibitoren für TNF vielversprechende Ergebnisse gezeigt (Rankin et al. (1995), British Journal Of Rheumatology, 3(4): 4334–4342; Elliott et al. (1995), Lancet, 344: 1105–1110; Tak et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39: 1077– 1081; Paleolog et al. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39: 1082–1091 und Moreland et al. (1997), New England Journal of Medicine, 337: 141–147).
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen bereitzustellen. Diese und andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung offensichtlich werden.
Als ein weiteres Beispiel beschreibt WO 96 20729 (UNIVERSITY OF SOUTH FLORIDA, 11. Juli 1996) ein Verfahren zur Behandlung akuter Pankreatitis durch die Verabreichung eines Tumornekrosefaktors (TNF) Antagonisten, wie beispielsweise einem rekombinanten TNF-löslichen Rezeptor (rTNFsr) wie auch rTNFsr in Kombination mit Interleukin-1-Rezeptorantagonist (II-1ra).
Die Unterdrückung von TNF-abhängigen entzündlichen Erkrankungen, wie beispielsweise Arthritis wird in WO 94 06476 A (IMMUNEX CORPORATION, 31. März 1994) diskutiert. WO 94 06476 A stellt ein Verfahren zur Behandlung eines Menschen mit Arthritis bereit, umfassend den Schritt der Verabreichung von TNF-Antagonisten (TNFr), wie beispielsweise lösliches TNFr, an einen Menschen.
WO 92 07585 A (CELLTECH LIMITED, 14. Mai 1992) beschreibt die Herstellung eines pharmazeutischen Produkts, das einen anti-TNF-Antikörper oder ein TNF-Bindungsfragment davon und ein Xanthinderivat in einer kombinierten Zusammenstellung umfasst. Die Zusammensetzung wird in der Behandlung von Sepsis und septischem oder endotoxischem Schock verwendet.
Kavanaugh A. F. et al. ("ANTI-TNF-ALPHA MONOCLONAL ANTIBODY (MAB) TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS (RA) PATITNS WITH ACTIVE DISEASE ON METHOTREXAT (MTX); RESULTS OF A DOUBLEBLIND, PLACEBO CONTROLLED MULTICENTER TRIAL" Arthritis & Rheumatism, Bd. 39, Nr. 9, September 1996, Seite 123 XP002048557) behandelt die Behandlung rheumatoider Arthritis unter Verwendung einer Kombination von anti-TNF-Antikörper und Methothrexat.
Weitehrin beschreibt WO 98 05357 A (THE KENNEDY INSTITUTE OF RHEUMATOLOGY, 12. Februar 1998) eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Methothrexat und einen anti-TNF-Antikörper zur Behandlung einer TNF-vermittelten Erkrankung umfasst, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis, Chron'sche Erkrankung und akute und chronische Immunerkrankungen, die mit der Transplantation assoziiert sind.
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, Verwendungen; Dosierungseinheiten und Zusammensetzung für die Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen bereitzustellen. Diese und andere Gegenstände der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden Beschreibung offensichtlich werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines TNF-Bindungsproteins in der Kombination mit einem COX2 Inhibitor zur Herstellung eines Medikaments zur Vorbeugung und Behandlung TNF-vermittelter Erkrankungen in einem Patienten. Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Besonderen auf die Verwendung von einem TNF-bindenden Protein in Kombination mit einem COX2 Inhibitor zur Herstellung eines Medikaments zur Vor beugung und Behandlung TNF-vermittelter Erkrankungen, einschließlich rheumatischer Erkrankungen, und der systemischen Entzündung und Gewichtsverlust des Körpers, der damit assoziiert ist. Die Art der Behandlung, auf die hier Bezug genommen wird, ist für Säugetiere vorgesehen, einschließlich Menschen.
Kurze Beschreibung der Figuren
Verschiedene Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aufgrund der Durchsicht der Figuren offensichtlich werden, wobei:
1 eine Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 1) beschreibt, die Asp¹-Thr¹⁶¹ kodiert, einen reifen, rekombinanten, humanen und löslichen TNF-Rezeptor Typ I. Ebenfalls beschrieben ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) von Asp¹-Thr¹⁶¹. Der Aminoterminus der Aminosäuresequenz kann methionyliert oder nicht-methionyliert sein.
2 beschreibt eine Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 3), die Leu¹-Thr¹⁷⁹ kodiert, einen reifen rekombinanten humanen löslichen TNF-Rezeptor Typ II. Ebenfalls beschrieben ist die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) von Leu¹-Thr¹⁷⁹. Der Aminoterminus der Aminsäuresequenz kann methionyliert oder nicht-methionyliert sein.
3 beschreibt die Effekte von c105 sTNFR-I in Hantelform alleine, Methotrexat allein und die Kombination von c105 sTNFR-I in Hantelform und Methotrexat gegen den Gelenksdurchmesser der verwendeten arthritischen Ratten in Beispiel 1.
4 beschreibt die Effekte von c105 sTNFR-I in Hantelform alleine, Methotrexat alleine und die Kombination von c105 sTNFR-I in Hantelform und Methotrexat gegen die finalen Pfotengewichte (Index der Arthritis), Splenomegalie (Index der systemischen Entzündung) und Änderungen des Körpergewichts der verwendeten arthritischen Ratten in Beispiel 1.
5 beschreibt die finale Analyse (Inhibition bei Abbruch) der Effekte von c105 sTNFR-I in Hantelform allein, Methotrexat alleine und die Kombination von c105 sTNFR-I in Hantelform und Methotrexat gegen den Gelenksdurchmesser der verwendeten arthritischen Ratten in Beispiel 1.
6 beschreibt die Effekte von sTNFR-II/Fc alleine, Methotrexat allein und die Kombination von sTNFR-II/Fc mit Methotrexat gegen die finalen Pfotengewichte (Index der Arthritis), Splenomegalie (Index der systemischen Entzündung) und Änderungen des Körpergewichts der verwendeten arthritischen Ratten in Beispiel 2.
7 beschreibt die Effekte von sTNFR-II/Fc alleine, Methotrexat alleine und die Kombination von sTNFR-II/Fc mit Methotrexat bei den verwendeten arthritischen Ratten in Beispiel 2.
8 beschreibt die Effekte von s105 sTNFR-I in Hantelform alleine, fas Fusionsprotein alleine und die Kombination von c105 sTNFR-I in Hantelform und fas Fusionsprotein gegen LPS/D-Galactosamin-Lethalität in Ratten in Beispiel 3.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Zusammensetzungen der Erfindung sind geeignet, einem von einer entzündlichen Gelenkserkrankung betroffenen Patienten, eine effektive Menge eines TNF-Bindungsproteins in Kombination mit einem COX2-Inhibitor zu verabreichen. Der bevorzugte Patient ist menschlich.
TNF-Bindungsproteine werden im Stand der Technik beschrieben ( EP 308 378 , EP 422 339, GB 2 218 101, EP 393 438, WO 90/13575, EP 398 327, EP 412 486, WO 91/03553, EP 418 014, JP 127,800/1991, EP 433 900, US-Patent 5,136,021, GB 2 246 569, EP 464 533, WO 92/01002, WO 92/13095, WO 92/16221, EP 512 528, EP 526 905, WO 93/07863, EP 568 928, WO 93/21946, WO 93/19777, EP 417 563, WO 95/34326, WO 96/28546 und PCT Anmeldungsnummer PCT/US97/12244).
Beispielsweise lehren EP 393 438 und EP 422 339 die Aminosäure und Nukleinsäuresequenzen eines löslichen TNF-Rezeptors Typ I (ebenfalls bekannt als sTNF-I oder 30 kDa TNF-Inhibitor) und eines löslichen TNF-Rezeptors Typ II (ebenfalls bekannt als sTNFR-II oder 40 kDa TNF-Inhibitor), allgemein benannt als "sTNFRs", wie auch modifizierten Formen davon (z. B. Fragmente, funktionale Derivate und Varianten). EP 393 438 und EP 422 339 beschreiben ebenfalls Verfahren zur Isolierung der Gene, die für die Kodierung des Inhibitors verantwortlich sind, zur Klonierung der Gene in geeignete Vektoren und Zelltypen sowie zum Exprimieren der Gene zur Erzeugung des Inhibitors.
sTNFR-I und sTNFR-II sind Mitglieder der Nervenwachstumsfaktor/TNR-Rezeptorsuperfamilie von Rezeptoren, welche den Nervenwachstumsfaktorrezeptor (NGF, nerve growth factor), B-Zellantigen CD40, 4-1BB, das Ratten T-Zell-Antigen MRC OX40, das fas Antigen und die CD27- und CD30-Antigene (Smith et al. (1990), Science, 248: 1019–1023) miteinschließen. Das am meisten konservierte Merkmal unter dieser Gruppe an Zelloberflächenrezeptoren ist die cysteinreiche extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne, welche in vier sich wiederholende Motive von etwa vierzig Aminosäuren aufgeteilt werden kann und welche 46 Cysteinreste an Positionen besitzt, die sehr gut konserviert sind (Smith et al. (1990), siehe oben).
Zum Zweck dieser Erfindung werden sTNFRs und modfizierte Formen davon, einschließlich Polypeptide, in welchen Aminosäuren von sTNFR-I und sTNFR-II entfernt wurden ("Deletionsvarianten"), insertiert wurden ("Additionsvarianten"), oder substituiert wurden ("Substitutionsvarianten") allgemein "TNFbp(s)" genannt. [Soweit nicht anders angedeutet soll die Aminosäurenummerierung für hier beschriebene Moleküle zu denen korrespondieren, die für die reife Form des Moleküls (z. B. ohne die Signalsequenz) gezeigt wurde, wie durch die Aminosäuren Asp¹-Thr¹⁶¹ von SEQ ID NO: 2 beschrieben, mit irgendeinem initialen MET in jeder solchen Sequenz, welches die Aminosäurepositionsnummer "0" besitzt].
Es wird von Fachleuten bevorzugt, dass viele Kombinationen an Deletionen, Insertionen und Substitutionen (individuell oder allgemein "Variante(n)") innerhalb der Aminosäurese quenzen der sTNFRs durchgeführt werden können, vorausgesetzt, dass das erhaltene Molekül biologisch aktiv ist (z. B. die Fähigkeit besitzt, TNF zu binden).
Eine sTNFR-Variante(n) kann schnell gescreent werden, um seine physikalischen Eigenschalten zu bestimmen. Es wird bevorzugt, dass solche Variante(n) ähnliche TNF-inhibierten Eigenschaften aufweisen, jedoch nicht notwendigerweise alle die gleichen Eigenschaften zeigen und nicht notwendigerweise in der gleichen Größenordnung wie das korrespondierende nicht-modifizierte sTNFR.
Es gibt zwei grundlegende Variablen in der Konstruktion einer Aminosäuresequenzvariante/von Aminosäuresequenzvarianten: der Ort der Mutagenesestelle und die Art der Mutation. In der Planung der Variante(n) wird der Ort jeder Mutagenesestelle und die Art jeder Mutation von der/den biochemischen Eigenschaften) abhängen, die modifiziert werden soll. Jede Mutagenesestelle kann individuell oder in Serien modifiziert werden z. B. durch (1) Entfernen des Target-Aminosäurerestes, (2) Insertieren von einem oder mehreren Aminosäureresten benachbart zur Targetstelle oder (3) anfängliche Substitution mit einer Auswahl von konservativen Aminosäuren in Abhängigkeit von den erreichten Erfolgen, anschließend mit einer radikaleren Selektion.
Deletionen von Aminosäuresequenzen reichen im Allgemeinen von etwa 1 bis 30 Aminosäureresten, vorzugsweise von etwa 1 bis 20 Aminosäureresten, noch bevorzugter von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten und am meisten bevorzugt von etwa 1 bis 5 aufeinanderfolgenden Resten. aminoterminale, carboxyterminale und internale Intrasequenzdeletionen sind beabsichtigt. Deletionen innerhalb der Aminosäuresequenzen der sTNFRs können beispielsweise in Regionen niedriger Homologie mit den Sequenzen anderer Mitglieder der NGF/TNF-Rezeptorfamilie durchgeführt werden. Deletion innerhalb der Aminosäuresequenzen der sTNFRs in Bereichen substantieller Homologie mit den Sequenzen anderer Mitglieder der NGF/TNF-Rezeptorfamilie werden eher in signifikanter Art und Weise die biologische Aktivität modifizieren. Genauer ist die Sequenzähnlichkeit zwischen NGF/TNF-Rezeptorfamilienmitgliedem insbesondere in der Region sehr hoch, die zu den ersten zwei Disulfidschleifen der Domäne 1 korrespondiert, sowie zur gesamten Domäne 2, und zur ersten Disulfidschleife von Domäne 3 (Banner et al. (1993), Cell, 73: 431–445). Die Anzahl an gesamten Deletionen und/oder konsekutiven Deletionen werden vorzugsweise so ausgewählt, dass die Tertiärstruktur in der betroffenen Domäne erhalten wird, z. B. Cysteincrosslinking.
EP 393 438 lehrt einen 40 kDa TNF-Inhibitor Δ51 und einen 40 kDa TNF-Inhibitor Δ53, welcher verkürzte Versionen des rekombinanten 40 kDa TNF-Inhibitorproteins mit voller Länge darstellt, wobei 51 bzw. 53 Aminosäurereste am Carboxyterminus des reifen Proteins entfernt wurden. Entsprechend würde es ein Fachmann bevorzugen, dass die vierte Domäne von beiderseits dem 30 kDa TNF-Inhibitor und dem 40 kDa-Inhibitor nicht für die TNF-Inhibition notwendig ist.
Tatsächlich haben verschiedene Gruppen diese Auffassung bestätigt. Domänen-Deletionsderivate der 30 kDa TNF-Inhibitoren wurden erzeugt, und solche Derivate ohne die vierte Domäne besaßen vollständige TNF-Bindungsaktivität, während solche Derivate ohne die erste, zweite bzw. die dritte Domäne keine TNF-Bindungsaktivität mehr besaßen (Corcoran et al. (1994), Eur. J. Biochem., 223: 831–840, Chih-Hsueh et al. (1995), The Journal of Biological Chemistry, 270(6): 2874–2878 und Scallon et al. (1995), Cytokine 7(8): 759–770).
Die PCT-Anmeldung Nr. PCT/US97/12244 lehrt verkürzte Formen von sTNFR-I und sTNFR-II, welche die vierte Domäne nicht enthalten (Aminosäurereste Thr¹²⁷-Asn¹⁶¹ von sTNFR-I und Aminosäurereste Pro¹⁴¹-Thr¹⁷⁹ von sTNFR-II); einen Teil der dritten Domäne (Aminosäurereste Asn¹¹¹-Cys¹²⁶ von sTNFR-I und Aminosäurereste Pro¹²³-Lys¹⁴⁰ von sTNFR-II); und optional solche, die nicht einen Teil der ersten Domäne enthalten (Aminosäurereste Asp¹-Cys¹⁹ von sTNFR-I und Aminosäurereste Leu¹-Cys³² von sTNFR-II). Die verkürzten sTNFRs der vorliegenden Erfindung schließen die Proteine mit ein, die durch die Formel R₁-[Cys¹⁹-Cys¹⁰³]-R₂ und R₄-[Cys³²-Cys¹¹⁵]-R₅ dargestellt werden. Diese Proteine sind verkürzte Formen von sTNFR-I bzw. sTNFR-II.
Durch "R₁-[Cys¹⁹-Cys¹⁰³]-R₂" werden eines oder mehrere Proteine verstanden, wobei [Cys¹⁹-Cys¹⁰³] die Reste 19 bis 103 von sTNFR-I darstellen, wobei das Schema der Num merierung der Aminosäurereste in 1 dargestellt wird, um einen Vergleich zu erleichtern; wobei R₁ eine methionylierte oder nicht-methionylierte Aminogruppe von Cys¹⁹ oder vom Aminosäurerest/von Aminosäureresten am Aminoterminus darstellt, die aus irgendeinem von Cys¹⁸ bis Asp¹ ausgewählt wurden und wobei R₂ eine Carboxygruppe von Cys¹⁰³ oder von Aminosäureresten vom carboxyterminalen Ende darstellen, die aus irgendeinem von Phe¹⁰⁴ bis Leu¹¹⁰ darstellen.
Beispielhafte verkürzte sTNFR-I der vorliegenden Erfindung schließend die folgenden Moleküle mit ein (allgemein 2,6 D sTNFR-I genannt): NH₂-[Asp¹-Cys¹⁰⁵]-COOH (ebenfalls benannt als sTNFR-I 2,6 D/C105]; NH₂-[Asp¹-Leu¹⁰⁸]-COOH (ebenfalls benannt als sTNFR-I 2,6 D/C106); NH₂-[Asp¹-Asn¹⁰⁵]-COOH (ebenfalls bezeichnet als sTNFR-I 2,6 D/N105); NH₂-[Tyr⁹-Leu¹⁰⁸]-COOH (ebenfalls als sTNFR-I 2,3 D/d8 bezeichnet; NH₂-[Cys¹⁹-Leu¹⁰⁸]-COOH (ebenfalls als sTNFR-I 2,3 D/d18 bezeichnet); und NH₂-[Ser¹⁶-Leu¹⁰⁸]-COOH (ebenfalls als sTNFR-I 2,3 D/d15 bezeichnet), entweder methionyliert oder nicht-methionyliert, und Varianten und Derivate davon.
Unter "R₃-[Cys³²-Cys¹¹⁵]-R₄" wird eines oder mehrere Proteine verstanden, wobei [Cys³²-Cys¹¹⁵] die Reste Cys³² bis Cys¹¹⁵ von sTNFR-II darstellt, wobei das Schema der Nummerierung der Aminosäurereste in 2 dargestellt wird, um einen Vergleich zu erleichtern; wobei A₃ eine methionylierte oder nicht-methionylierte Aminogruppe von Cys³² darstellt oder von einem Aminosäurerest/ von Aminosäureresten des Aminoterminus, ausgewählt aus irgendeinem von Cys³¹ bis Leu¹, und wobei R₄ eine Carboxygruppe von Cys¹⁵ oder von einem Aminosäurerest/ von Aminosäureresten am Carboxyterminus darstellt, ausgewählt aus irgendeinem von Ala¹¹⁶ bis Arg¹²².
Eine Aminosäuresequenzaddition kann Isertionen einer amino- und/oder carboxyterminalen Fusion mit einschließen, die sich in der Länge von einem Rest bis hundert oder mehr Resten bewegen, wie auch internale Intrasequenzinsertionen von einzelnen oder multiplen Aminosäureresten. Internale Additionen können sich im Allgemeinen von etwa 1 bis 20 Aminosäureresten bewegen, vorzugsweise von etwa 1 bis 10 Aminosäureresten, noch bevorzugter von etwa 1 bis 5 Aminosäureresten und am meisten bevorzugt von etwa 1 bis 3 Aminosäureresten. Additonen innerhalb der Aminsäuresequenzen der sTNFRs können in Regionen niedriger Homologie mit den Sequenzen anderer Mitglieder der NGF/TNF-Rezeptorfamilie durchgeführt werden. Additionen innerhalb der Aminosäuresequenz des sTNFRs in Bereichen wesentlicher Homologie mit den Sequenzen anderer Mitglieder der NGF/TNF-Rezeptorfamilie werden sehr wahrscheinlich die biologische Aktivität signifikant modifizieren. Additionen schließen bevorzugt Aminosäuresequenzen mit ein, die aus den Sequenzen der Mitglieder der NGF/TNF-Rezeptorfamilie abgeleitet wurden.
Eine aminoterminale Addition beabsichtigt, die Addition eines Methionins mit einzuschließen (beispielsweise als ein Artifakt der direkten Expression in einer bakteriellen rekombinanten Zellkultur). Ein weiteres Beispiel einer aminoterminalen Addition schließt die Fusion einer Signalsequenz an den Aminoterminus von reifen sTNFRs mit ein, um die Sekretion von Proteinen aus rekombinanten Wirtzellen zu erleichtern. Solche Signalsequenzen werden im Allgemeinen aus den ins Auge gefassten Spezien der Wirtszellen erhalten und sind daher damit homolog. Für prokaryotische Wirtzellen, die die native Signalsequenz der sTNFRs nicht erkennen und prozessieren, können die Signalsequenzen durch ein prokaryotische Signalsequenz ausgetauscht werden, die beispielsweise aus der Gruppe von alkalischer Phosphatase, Penicillinase oder Hitze-stabilen Enterotoxin II Leadersequenzen ausgewählt wurde. Zur Expression in Hefezellen kann die Signalsequenz beispielsweise aus der Gruppe der Hefeinvertase, Alphafaktor oder der Leadersequenz der sauren Phosphatase ausgewählt werden. Bei Expression in Säugetierzellen sind die nativen Signalsequenzen ( EP 393 438 und EP 422 339 ) zufriedenstellend, obwohl andere Signalsequenzen aus Säugetieren geeignet sein können, beispielsweise Sequenzen, die aus anderen NGF/TNF-Rezeptorfamilienmitgliedern abgeleitet wurden.
Ein Beispiel einer aminoterminalen oder carboxyterminalen Addition schließt chimäre Proteine mit ein, die die aminoterminale oder carboxyterminale Fusion eines TNFbp(s) mit allen Teilen oder einem Teil der konstanten Domäne der schweren oder leichten Kette von humanem Immunglobulin umfasst (individuell oder kollektiv, ("sTNFRFc(s)"). Solche chimären Polypeptide werden bevorzugt, bei denen der Immunglobulinanteil alle Domänen außer der ersten Domäne der konstanten Region der schweren Kette von humanem Immunglobulin umfasst , wie beispielsweise IgG (z. B., IgG1 oder IgG3), IgA, IgM oder IgE. Ein Fachmann wird es bevorzugen, dass jegliche Aminosäure des Immunoglobulinanteils mit einem oder mehreren Aminosäuren deletiert oder substituiert werden kann, oder eine oder mehrere Aminosäuren addiert werden können, so lange wie der Anteil des TNF-bindenden Proteins noch immer TNF bindet und der Immunoglobulinanteil eine oder mehrere seiner charakteristischen Eigenschaften zeigt.
Eine andere Gruppe von Variante(n) ist eine Aminosäuresubstitutionsvariante(n) der Aminosäuresequenz von sTNFRs. Diese ist eine/sind Variante(n), wobei mindestens ein Aminosäurerest in einem sTNFR entfernt wurde und verschiedene Reste an seiner Stelle insertiert wurden. Eine Substitutionsvariante/Substitutionsvarianten schließen allelische Variante(n) mit ein, welche durch natürlich vorkommende Veränderungen der Nukleotidsequenz in der Population der Spezies charakterisiert werden, welche in einer Änderung der Aminosäure resultieren oder dies nicht tun. Ein Fachmann kann jegliche Information bei der Selektion möglicher Mutationsstellen verwenden, die über die Bindungs- oder aktive Stelle des Polypeptids bekannt sind.
Ein Verfahren zur Identifizierung von Aminosäureresten oder Regionen zur Mutagenese eines Proteins wird "Alanin-Scanning-Mutagenese" genannt, wie durch Cunningham und Wells (1989) beschrieben, Science 244: 1081–1085.
In diesem Verfahren wird ein Aminosäurerest oder eine Gruppe von Targetresten identifiziert (z. B. geladene Reste wie beispielsweise Arg, Asp, His, Lys und Glu) und durch eine neutrale oder negativ geladene Aminosäure (bevorzugt Alanin oder Polyalanin) ersetzt, um die Interaktion der Aminosäuren mit dem umgebenden wässrigen Umfeld innerhalb oder außerhalb der Zelle zu beeinflussen. Solche Domänen/Reste, die gegenüber den Substitutionen eine funktionelle Sensitivität zeigen, werden anschließend durch die Einführung weiterer oder alternativer Reste an den Stellen der Substitution verfeinert. Daher ist die Stelle zur Einführung einer Modifikation der Aminosäuresequenz vorbestimmt. Um die Leistung einer Mutation an einer bestimmten Stelle zu optimieren, kann eine Alanin-Scanning- oder Random-Mutagenese durchgeführt werden und die Variante(n) kann/können auf die optimale Kombination der gewünschten Aktivität und den Grad der Aktivität gescreent werden.
Die Stellen, die für die Austauschmutagenese von größtem Interesse sind, schließen Stellen mit ein, an welchen besondere Aminosäurereste innerhalb eines sTNFR im Wesentlichen unterschiedlich von anderen Spezies oder anderen Familienmitgliedern der NGF/TNF-Rezeptorfamilie in Bezug auf die Seitenkettengröße, Ladung und/oder Hydrophobizität sind. Andere interessante Stellen schließen solche mit ein, in welchen besondere Reste eines sTNFR unter anderen Spezies oder anderen Mitgliedern NGF/TNF-Rezeptorfamilie identisch sind, wie beispielsweise Positionen, die im Allgemeinen wichtig für die biologische Aktivität eines Proteins sind.
Andere interessante Stellen schließen solche mit ein, in welchen besondere Reste ähnlich oder identisch mit solchen sind, wie beispielsweise denen in sTNFR-I-ähnlichen Proteinen und sTNFR-II-ähnlichen Proteinen. Die folgende Information wurde entsprechend in Bezug auf sTNFR-I erläutert (Banner et al. (1993), oben, und Fu et al. (1995), Protein Engineering, 8(12): 1233–1241). Die Reste Tyr⁹, Thr³⁹, His⁵⁵ in Domäne 1, die Reste Phe⁴⁹, Ser⁶³, Asp⁸² in Domäne 2 und die Reste Tyr⁹² und Ser¹⁰⁷ in Domäne 3 wurden als potentiell wichtig für die Stabilisierung der Struktur der Domänen 1, 2 bzw. 3 identifiziert. Die Reste Pro¹² und His⁵⁵ wurden als potentiell interagierend mit Ser⁸⁶-Tyr⁸⁷ auf der Untereinheit C von TNF-α identifiziert. Die Rest Glu⁴⁵-Phe⁴⁹ wurden als in einem Loop vorhanden identifiziert, welcher möglicherweise mit den Resten Leu²⁹-Arg³² der TNF-α-Untereinheit A interagiert. Der Rest Glu⁴⁸ wurde als potentiell interagierend mit Asn¹⁹-Pro²⁰ auf der Untereinheit A von TNF-α erkannt. Die Reste His⁵⁸-Leu⁶⁰ wurden als in einer gedehnten Strangkonformation vorliegend identifiziert und Nebenketteninteraktionen mit den Resten Arg³¹-Ala³³ auf der Untereinheit A von TNF-α wurden potentiell mit dem Rest His⁵⁵ von sTNFR-I identifiziert und spezifisch interagierend mit Rest Arg³¹. Die Reste Lys⁶⁴-Arg⁶⁶ wurden als in einer gedehnten Strangkonformation vorliegend identifiziert und es wurde festgestellt, dass diese Nebenketten und Hauptketten Interaktionen mit den Resten Ala¹⁴⁵-Glu¹⁴⁶ und dem Rest Glu⁴⁶, auf der Untereinheit A von TNF-α, aufweisen. Der Rest Met⁶⁹ wurde als potentiell interagierend mit Rest Tyr¹¹⁵ auf Untereinheit A von TNF-α identifiziert. Die Reste His⁹⁴-Phe¹⁰¹ wur den dahingehend idenfifiziert, dass sie eine Schleife bilden, welche mit den Resten Thr⁷²-Leu⁷⁵ und Asn¹³⁷ der Untereinheit C von TNF-α interagieren, mit dem Rest Trp⁹⁶ von sTNFR-I spezifisch interagieren mit den Resten Ser⁷¹-Thr⁷² auf der Untereinheit C von TNF-α, Leu¹⁰⁰ von sTNFR-I in großer Nähe mit Rest Asn¹³⁷ auf Untereinheit C von TNF-α ist und der Rest Gln¹⁰² von sTNFR-I mit dem Rest Pro¹¹³ auf Untereinheit A von TNF-α spezifisch interagiert.
Weiterhin gibt es zu den Cysteinen, die die 3 Paare an Disulfidbindungen innerhalb jeder der vier Domänen des Moleküls bilden, verschiedene andere konservierte Reste, welche einen Beitrag zur Stabilisierung der tertiären Faltung jeder Domäne tiefem.
Es gibt zwei Hauptklassen, in welche diese stabilisierenden Reste fallen. Der erste Typ trägt zur Abschirmung der Schwefelatome der Disulfidbindung vom Lösungsmittel bei. Ein Beispiel dieser Reste in Domäne 3 ist Tyr⁹². In Domäne 4 hilft Phe¹³³, die Disulfidbindung von Cys¹²⁸-Cys¹³⁹ abzuschirmen. Alle vier Domänen besitzen entweder ein Tyr oder ein Phe an diesen strukturell gleich konservierten Stellen. Die zweite Klasse der stabilisierenden Reste bilden Hydrogenbindungen innerhalb ihrer jeweiligen Domänen. Innerhalb Domäne 3 formt Asn¹²³ und Ser¹⁰⁷ eine Wasserstoffbindung und Ser¹⁰⁷ bildet eine weitere Wasserstoffbindung mit Tyr¹²⁴. Für Domäne 4 schließen diese Reste Asn¹⁴⁴ und Ser¹⁴¹ mit ein.
Weiterhin gibt es Wasserstoffbindungen zwischen Domäne 3 und 4, welche nicht zwischen anderen Domänen beobachtet werden. Diese Wasserstoffbindungen sind (1) Asn¹⁰⁵ Sauerstoff der Hauptkette und Asn₁₃₇ Stickstoff der Nebenkette und (2) Ser¹⁰⁷ Sauerstoff der Nebenkette und Asn¹³⁷ Stickstoff der Hauptkette.
Ein Fachmann wird es bevorzugen, dass die Stellen zu Beginn mittels Substitution in einer verhältnismäßig konservativen Art und Weise modifiziert werden. Solche konservativen Substitutionen werden in Tabelle 1 unter der Überschrift "Bevorzugte Substitutionen" aufgeführt. Falls solche Substitutionen in einem Wechsel der biologischen Aktivität resultieren, können wesentliche Änderungen eingeführt werden (beispielhafte Substitution) und/oder andere Additionen/Deletionen können durchgeführt werden und die erhaltenen Produkte gescreent werden.
TABELLE 1: Aminosäuresubstitutionen
Bei der Durchführung solcher Änderungen kann der hydropathische Index von Aminosäuren in Betracht gezogen werden. Die Wichtigkeit des hydrophathischen Aminosäureindex bei der Übertragung der interaktiven biologischen Funktion auf einem Protein wird im Stand der Technik im Allgemeinen verstanden (Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol., 157: 105– 131). Es ist bekannt, dass verschiedene Aminosäuren durch andere Aminosäuren ersetzt werden können, die einen ähnlichen hydropathischen Index oder Wert besitzen und immer noch eine ähnliche biologische Aktivität behalten.
Es ist wird ebenfalls im Stand der Technik verstanden, dass die Substitution von ähnlichen Aminosäuren effektiv auf der Basis der Hydrophilie durchgeführt werden kann, insbesondere, wenn das funktionell äquivalente Protein oder Peptid, das dabei erzeugt wird, wie im vorliegenden Fall zur Verwendung in immunologischen Ausführungsformen vorgesehen ist. US-Patent 4,554,101 hält fest, dass die größte lokale durchschnittliche Hydrophilie eines Proteins, wie sie durch die Hydrophilie seiner angrenzenden Aminosäure bestimmt wird, mit seiner Immunogenität und Antigenität korreliert, z. B. mit einer biologischen Eigenschaft des Proteins.
US-Patent 4,554,101 lehrt ebenfalls die Identifizierung und Herstellung von Epitopen aus primären Aminosäuresequenzen auf der Basis der Hydrophilie. Durch die in US-Patent 4,554,101 beschriebenen Verfahren wäre ein Fachmann in der Lage, Epitope zu identifizieren, beispielsweise innerhalb der Aminosäuresequenz eines sTNFRs. Diese Regionen weiden ebenfalls als "epitope Core-Regionen" bezeichnet. Verschiedene wissenschaftliche Publikationen haben sich der Vorhersage von Sekundärstrukturen verschrieben und der Identifikation von Epitopen aus Analysen von Aminosäuresequenzen. (Chou und Fasman (1974), Biochemistry, 13(2): 222–245, Chou und Fasman (1974), Biochemistry, 13(2): 211–222, Chou und Fasman (1978), Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45–148, Chou und Fasman (1978), Ann, Rev. Biochem., 47: 251–276 und Chou und Fasman (1979), Biophys. J., 26: 367–384.
Weiterhin sind zur Zeit Computerprogramme erhältlich, die bei der Vorhersage von antigenen Bereichen und epitopen Core-Regionen von Proteinen Hilfestellung leisten. Beispielhaft sind solche Programme mit eingeschlossen, die auf der Jameson-Wolf-Analyse beruhen (Jameson and Wolf (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1): 181–186 und Wolf et al. (1988), Comput. Appl. Biosci., 4(1): 187–191; das Programm PepPlot^® (Brutlag et al., (1990), CABS, 6: 237–245 und Weinbergen et al. (1985), Science, 228: 740–742; und andere Programme für die Vorhersage der tertiären Proteinstruktur (Fetrow und Bryant (1993), BIOTECHNOLOGY, 11: 479–483).
Im Gegensatz dazu können wesentliche Modifikationen in den funktionellen und/oder chemischen Merkmalen der sTNFRs durch die Auswahl von Substitutionen hervorgerufen werden, die sich wesentlich in ihrem Effekt auf die Erhaltung (a) der Struktur des Polypeptid-Backbones im Bereich der Substitution, beispielsweise als ein Blatt oder helikale Konformation, (b) der relativen Ladung oder Hydrophobizität des Proteins als die Targetstelle oder (c) die Größe der Seitenkette unterscheiden. Natürlich vorkommende Reste können abhängig von ihren gewöhnlichen Seitenketteneigenschaften in Gruppen eingeteilt werden:

1) hydrophob: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
2) neutral hydrophil: Cys, Ser, Thr,
3) sauer: Asp, Glu;
4) basisch, Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) aromatisch: Trp, Tyr, Phe; und
6) Reste, die die Kettenorientierung beeinflussen: Gly, Pro.

Nicht-konservative Substitutionen können den Austausch eines Mitgliedes einer dieser Gruppen gegeneinander mit einschließen. Solche ausgetauschten Reste können in Regionen der sTNFRs eingeführt werden, welche beispielsweise mit anderen Mitgliedern der NGF/TNF-Rezeptorfamilie homolog sind, oder in nicht-homologe Regionen des Proteins.
Eine Anzahl an Aminosäuresubstitutionen oder Deletionen kann durchgeführt werden, um N-ver-knüpfte oder O-verknüpfte Glycosylierungsstellen zu modifizieren oder hinzuzufügen, was zu einem Protein mit geänderter Glycosylierung führt. Die Sequenz kann so modifiziert werden, dass Glycosylierungsstellen addiert oder N-verknüpfte oder O-verknüpfte Glycosylierungsstellen aus den sTNFRs entfernt werden. Eine Asparagin-verknüpfte Glycosylierungserkennungsstelle umfasst eine Tripeptidsequenz, welche spezifisch durch geeignete zelluläre Glycosylierungsenzyme erkannt wird. Diese Tripeptidsequenzen sind entweder Asn-Xaa-Thr oder Asn-Xaa-Ser, wobei Xaa jegliche Aminosäure außer Pro sein kann.
Nachgewiesene oder vorhergesagte Asparaginreste des 30 kDa TNF-Inhibitors liegen an den Positionen 14, 105 und 111 vor.
Spezifische Mutationen der Sequenz der sTNFRs können die Substitution einer nichtnativen Aminosäure am Aminoterminus, Carboxy-Terminus oder an jeder Stelle des Proteins mit einschließen, welche durch die Addition eines N-verknüpften oder O-verknüpften Kohlenwasserstoffes modifiziert wird. Solche Modifikationen können von besonderer Nützlichkeit bei der Addition einer Aminosäure (z. B. Cystein) sein, was für die Verknüpfung eines wasserlöslichen Polymers zur Bildung eines Derivats vorteilhaft ist. Beispielsweise beschreibt WO 92/16221 die Herstellung von z. B. sTNFR-I-Muteinen, wobei ein Asparaginrest an der Position 105 des nativen humanen Proteins gegen Cystein (c105 sTNFR-I) ausgetauscht ist.
In einer besonderen Ausführungsform wird eine Polypeptidvariante bevorzugt werden, die im Wesentlichen mit der Aminosäure des sTNFR homolog ist, aus welcher dieses abgeleitet ist. De Begriff "im Wesentlichen homolog", wie hier verwendet, beschreibt einen Grad an Homologie, welcher mindestens 80% beträgt, vorzugsweise mindestens 90%, noch bevorzugter mindestens 95% und am meisten bevorzugt sogar 99%. Die Prozentwerte der Homologie, wie sie hier beschrieben wurden, wird als Prozentwert von Aminosäureresten berechnet, die in der kleineren der beiden Sequenzen gefunden werden, welche sich mit identischen Aminosäureresten in einem Alignment anordnen, wenn beim Vergleich vier Lücken mit einer Länge von 100 Aminosäuren eingeführt werden können, um das Alignment zu unterstützen, wie durch Dayhoff (1972) beschrieben, Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D. C. Ebenfalls im Begriff "im Wesentlichen homolog" mit eingeschlossen ist eine/sind Variante(n) von sTNFRs, welche mit Hilfe der Kreuz-Reaktivität mit Antikörpern mit den Aminosäuresequenzen von SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 4 isoliert werden können oder dessen Gene mittels Hybridisierung mit der DNA von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 oder mit Segmenten davon isoliert werden können.
Polypeptidderivate
Chemisch modifizierte Derivate der TNFbp(s), in welchen das Protein mit einem Polymer verknüpft ist, um die Eigenschaften des Proteins zu modifizieren (hier als "Derivate" bezeichnet) sind im Schutzbereich der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen. Solche Derivate können durch einen Fachmann anhand dieser Beschreibung hergestellt werden. Konjugate können unter Verwendung von glycosyliertem, nicht-glycosyliertem oder derglycosyliertem TNFbp(s) und geeigneten chemischen Resten hergestellt werden. Typische nicht-glycosylierte Proteine und wasserlösliche Polymere werden verwendet werden.
Wasserlösliche Polymere sind wünschenswert, da das Protein, an welches es gebunden ist, nicht in einer wässrigen Umgebung ausfällt, wie beispielsweise in einer physiologischen Umgebung. Vorzugsweise wird das Polymer pharmazeutisch für die Herstellung eines therapeutischen Produkts oder einer Zusammensetzung geeignet sein. Ein Fachmann wird fähig sein, das gewünschte Polymer auf der Grundlage solcher Betrachtungen auszuwählen, ob das Polymer/Proteinkonjugat therapeutisch verwendet werden wird und, falls dies der Fall ist, aufgrund des therapeutischen Profils des Proteins (z. B. während der fortwährenden Freigabe; Resistenz gegen Proteolyse; Effekte, falls vorhanden, auf Dosierung; biologische Aktivität; Einfachheit der Handhabung; Grad oder Fehlen der Antigenität und andere bekannte Effekte eines wasserlöslichen Polymers auf ein therapeutisches Protein).
Geeignete, klinisch akzeptable, wasserlösliche Polymere schließen mit ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Polyethylenglycol(PEG), Polyethylenglycolpropionaldehyd, Copolymer von Ethylenglycol/Propylenglycol, Monomethoxy-Polyethylenglycol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol(PVA), Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-Dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinanhydrid-Copolymer, Poly(β-aminsäure) (andere Homopolymers oder Randomcopolymer), Poly(n-vinylpynolidon)polyethylenglycol, Polypropylenglycolhomopolymere(PPG) und andere Polyalkylenoxide, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymere, polyoxyethylierte Polyole(POG) (z. B. Glycerin) und andere polyoxyethylierte Polyole, polyoxyethyliertes Sorbitol, oder polyoxyethylierte Glucose, Coloninsäuren oder andere Kohlenwasserstoffpolymere, Ficoll oder Dextran und Mischungen davon. Wie hier verwendet, bedeutet Polyethylenglycol jede Form, welche bedeutet Polyethylenglycol jede Form, welche verwendet wurde, um andere Proteine zu derivatisieren, wie beispielsweise Mono-(C1-C10)alkoxy- oder Aryloxy-Polyethylenglycol.
Polyethylenglcolpropionaldehyd kann aufgrund seiner Stabilität in Wasser Vorteile bei der Herstellung besitzen.
Die wasserlöslichen Polymere können jeweils jedes mögliche Molekulargewicht besitzen und können verzweigt oder nicht-verzweigt sein. Im Allgemeinen gilt, dass je höher das Molekulargewicht oder die Anzahl der Verzweigungen sind, desto höher ist das Verhältnis von Polymer : Protein. Die wasserlöslichen Polymere besitzen jeweils ein durchschnittliches molekulares Gewicht von etwa 2 kDa bis etwa 100 kDa (der Begriff "etwa" deutet an, dass in den Präparationen eines wasserlöslichen Polymers einige Moleküle etwas mehr wiegen mögen, und andere etwas weniger als das genannte molekulare Gewicht). Das durchschnittliche molekulare Gewicht von jedem wasserlöslichen Polymer liegt bevorzugt zwischen etwa 5 kDa und etwa 40 kDa, noch bevorzugter zwischen etwa 10 kDa und etwa 35 kDa und am meisten bevorzugt zwischen etwa 15 kDa und etwa 30 kDa.
Es gibt einige Anlagerungsverfahren, die einem Fachmann zur Verfügung stehen, einschließlich Acylierungsreaktionen oder Alkylierungsreaktionen (bevorzugt zur Erzeugung eines am Aminoterminus chemisch modifizierten Proteins) mit einem reaktiven wasserlöslichen Molekül. Siehe beispielsweise EP 0 401 384 ; Malik et al. (1992), Exp. Hematol., 20: 1028–1035; Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(2): 4–10, published by Mediscript, Mountain, Court, Friem Barnet Lane, London N20 OLD, UK; EP 0 154 316 ; EP 0 401 384 ; WO 92/16221; WO 95/34326; WO 95/13312; WO 96/11953; WO 96/19459 und WO 96/19459 und die anderen Publikationen, welche hier genannt werden und sich auf Pegylierung beziehen.
Ein nicht-verzweigtes Monomethoxy-Polyethylenglycolaldehymolekül, welches ein durchschnittliches molekulares Gewicht von entweder etwa 20 kDa oder etwa 33 kDa besitzt (z. B. zwischen 30 kDa und 35 kDa), oder ein tertiär-Butyl-Polyethylenglycolaldehyd, welches ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 33 kDa besitzt (z. B. zwischen 30 kDa und 35 kDa), kann ebenfalls über reduktive Alkylierung an das/die TNFbp(s) konjugiert werden.
Die Pegylierung kann ebenfalls spezifisch unter Verwendung von wasserlöslichen Polymeren ausgeführt werden, die mindestens eine reaktive Hydroxygruppe besitzen (z. B. Polyethylenglycol). Das wasserlösliche Polymer kann mit einer aktivierenden Gruppe umgesetzt werden, wobei ein "aktivierter Linker" gebildet wird, der bei der Modifizierung verschiedener Proteine nützlich ist. Die aktivierten Linker können monofunktional, bifunktional oder multifunktional sein.
Aktivierende Gruppen, welche verwendet werden können um das wasserlösliche Polymer an zwei oder mehr Proteine zu verknüpfen schließen folgende mit ein: Sulfon, Malinimid, Sulfhydryl, Thiol, Triflat, Tresylat, Azidirin, Oxiran und 5-Pyridyl. Nützliche Reagenzien besitzen eine reaktive Sulfongruppe, die in den Verfahren verwendet werden kann, einschließlich und ohne Begrenzung Chlorsulfon, Vinylsulfon und Divinylsulfon. Diese PEG-Derivate sind gegen Hydrolyse für ausgedehnte Zeiträume in wässrigen Umgebungen bei pH-Werten von etwa 11 oder weniger stabil und können Verknüpfungen mit Molekülen Bilden, um Konjugate zu formen, welche ebenfalls hydrolytisch stabil sind. Zwei insbesonders nützliche homofunktionelle Dervate sind PEG-bis-Chlorosulfon und PEG-bis-Vinylsulfon (WO 95/13312).
WO 97/04003 (ehrt Verfahren zur Herstellung von Sulfon-aktivierten Linkern durch Erhalten einer Verbindung, welche eine reaktive Hydroxylgruppe besitzt und durch Konvertieren der Hydroxylgruppe zu einem reaktiven Michael-Akzeptor, um einen aktivierten Linker unter der Verwendung von Tetrahydrofuran (THF) als Lösungsmittel für diese Umwandlung zu bilden. Die Anmeldung lehrt ebenfalls ein Verfahren zur Aufreinigung der aktivierten Linker, welches hydrophobe Interaktionschromatographie verwendet, um die Linker in Abhängigkeit ihrer Größe und Endgruppenfunktionalität aufzutrennen.
Polyvalente Formen
Polyvalente Formen können hergestellt werden, z. B. Moleküle, die mehr als einen aktiven Rest umfassen. In einer Ausführungsform kann das Molekül multiple Tumomekrosefaktorbindungsstellen für den TNF-Liganden besitzen. Zusätzlich kann das Molekül mindestens eine Tumornekrosefaktorbindungsstelle und, in Abhängigkeit von der gewünschten Charakteristik der polyvalenten Form, mindestens eine Stelle für ein anderes Molekül besitzen (z. B. ein TNFbp(s), und einen Interleukin-I-Rezeptorantagonisten ("IL-1ra") wie unten beschrieben).
In einer Ausführungsform kann die polyvalente Form beispielsweise durch chemisches Koppeln von mindestens einem TNFbp(s) und einem anderen Rest mit jeglichem klinisch geeigneten Linker (z. B. einem wasserlöslichen Polymer) konstruiert werden. Im Grundsatz muss der Linker keine neue Immonogenität verleihen noch durch die neuen Aminosäurereste die Hydrophobie und das Ladungsgleichgewicht der Struktur verändern, welches seine Bioverteilung und Aufklärung beeinflusst.
Die wasserlöslichen Polymere können auf der Basis der hier aufgeführten Monomere Homopolymere, Random oder Blockcopolymere, Terpolymere mit gerader oder verzweigter Kette, substituiert oder unsubstituiert sein. Das Polymer kann jegliche Länge oder Molekulargewicht besitzen, jedoch können diese Merkmale die biologischen Eigenschaften beeinflussen. Die durchschnittlichen Molekulargewichte des Polymers, die insbesondere nützlich zur Verringerung der Aufklärungsraten in pharmazeutischen Anwendungen sind, bewegen sich in der Größenordnung von 2000 bis 3500 Daltons. Zusätzlich kann die Länge des Polymers variiert werden, um die erwünschte biologische Aktivität zu optimieren oder zu übertragen.
Die aktiven Reste können unter Verwendung konventioneller Kopplungstechniken verknüpft werden (siehe WO 92/16221, WO 95/13312 und WO 95/34326. Beispielsweise beschreiben WO 92/16221 und Wo 95/34326 die Herstellung von verschiedenen dimerisierten sTNFR-I-Molekülen, z. B. dimerisiertem c105 sTNFR-I.
Alternativ kann ein bivalentes Molekül aus zwei Tandemrepeats von sTNFRs bestehen, welches durch eine Polypeptidlinkerregion getrennt wird. Das Design des Polypeptidlinkers ist im Design ähnlich zu der Insertion von kurzen Schleifensequenzen zwischen den Domänen im de novo Design von Proteinen (Mutter (1988), TIBS, 13: 260–265 und Regan und DeGrado (1988), Science, 241: 976–978). Verschiedene unterschiedliche Linkekonstrukte wurden erzeugt und es wurde gezeigt, dass diese für die Bildung von einzelkettigen Antikörpern nützlich sind; die am stärksten funktionellen Linker variieren in der Größe von 12 bis 25 Aminosäuren (Aminosäuren, welche nicht-reaktive Nebengruppen besitzen, z. B. Alanin, Serin und Glycin), welche zusammen eine hydrophile Sequenz bilden, und besitzen ein wenig gegensätzlich geladene Reste, um die Löslichkeit zu steigern und sind flexibel (Whitlow and Filpula (1991), Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2: 97–105; und Brigido et al. (1993) J. Immunol., 150: 469–479). Es wurde gezeigt, dass ein für einzelkettige Antikörper geeigneter Linker effektiv ist, um eine dimere Form des human sTNFR-II zu erzeugen (Neve et al. (1996), Cytokine, 851: 365–370).
Zusätzlich kann ein TNFbp(s) chemisch an Biotin gekoppelt werden, und das erhaltene Konjugat kann anschließend an Avidin binden gelassen werden, was in tetravalenten Avidin/Biotin/TNFbp(s) Molekülen resultiert. Ein TNFbp(s) kann ebenfalls kovalent an Dinitrophenol (DNP) oder Trinitrophenol (TNP) gekoppelt werden und die erhaltenen Konjugate werden mit anti-DNP oder anti-TNP-IgM gefällt, um dekamere Konjugate zu bilden.
Rekombinante Fusionsproteine können ebenfalls erzeugt werden, wobei jedes rekombinante chimäre Molekül eine TNFbp(s)-Sequenz aminoterminal oder carboxyterminal an allen Teilen oder einem Teil der konstanten Domänen fusioniert hat, jedoch mindestens an eine konstante Domäne der schweren oder leichten Kette von humanem Immunglobulin. Beispielsweise kann ein chimäres TNFbp(s)/IgG1 (oder IgG1/TNFbp(s)) Fusionsprotein aus einem chimären Gen erzeugt werden, das eine leichte Kette enthält: ein TNFbp(s)/humanes Chimär der leichten kappa Kette (TNFbp(s)/Ck) oder ein humanes Chimär der leichten kappa Kette TNFpb(s)(Ck/TNFbp(s)); oder ein chimäres Gen enthaltend eine schwere Kette: ein TNFbp(s)/humanes Chimär der schweren gamma-1 Kette (TNFbp(s)/Cg-1) oder ein humanes Chimär schweren gamma-1 Kette TNFbp(s) (Cg-1(TNFbp(s)). Nach der Transkription und Translation eines chimären Gens einer schweren Kette, oder eines Gens, das eine leichte Kette enthält und eines chimären Gens mit einer schweren Kette können Genprodukte in einem einzelnen chimären Molekül vereinigt werden, das ein TNFbp(s) bivalent darstellt. Zusätzliche Details, die sich auf die Konstruktion solcher chimären Moleküle beziehen, werden in den US-Patenten 5,116,964, WO 89/09622, WO 91/16437 und EP 315 062 offenbart.
Rekombinante Fusionsproteine können ebenfalls hergestellt werden, wobei jedes rekombinante chimäre Molekül mindestens ein TNFbp(s) besitzt, wie hier beschrieben, und mindestens einen Teil der Region 186–401 von Osteoprotogerin, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 96309363.8 beschrieben. Entweder kann/können das/die TNFbp(s) oder der Teil von Osteoprotogerin am Aminoterminus oder am Carboxyterminus des chimären Moleküls sein.
Synthese von TNFbp(s)
Die Herstellung von TNFbp(s) wird im Folgenden genauer beschrieben. Solche Proteine können beispielsweise durch rekombinante Techniken oder durch chemische in vitro-Synthesen hergestellt werden.
Polynukleotide
Aufgrund der vorliegenden Beschreibung und unter Verwendung universaler Kodontabellen kann ein Fachmann leicht alle Nukleinsäuresequenzen bestimmen, welche die Aminosäuresequenz der TNFbp(s) kodieren.
Rekombinanten Expressionstechniken, die in Übereinstimmung mit der unten gezeigten Beschreibung durchgeführt werden, mögen befolgt werden, um jedes solcher Polynukleotide zu erzeugen und die kodierten Proteine zu exprimieren. Beispielsweise kann durch die Insertion eines Nukleinsäuresequenz, welches ein TNFbp(s) kodiert, in einen geeigneten Vektor, ein Fachmann leicht große Mengen der erwünschten Nukleotidsequenz erzeugen.
Die Sequenzen können anschließend verwendet werden, um Detektionssonden oder Amplifikationsprimer zu erzeugen. Alternativ kann ein Polynukleotid, welches ein TNFbp(s) kodiert in einen Expressionsvektor insertiert werden. Durch Einführen des Expressionsvektors in einen geeigneten Wirt, kann das gewünschte Protein in großen Mengen erzeugt werden.
Wie weiterhin hier beschrieben gibt es eine Vielzahl an Wirt/Vektor-Systemen, welche für die Vermehrung der gewünschten Nukleinsäuresequenzen und/oder die Herstellung der gewünschten Proteine verfügbar ist. Diese schließen mit ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Plasmide, virale oder insertionale Vektoren, und prokaryotische und eukaryotische Wirte. Ein Fachmann kann ein Wirt/Vektor-System anpassen, welches fähig ist heterologe DNA zu vermehren oder zu exprimieren, um die Sequenzen der vorliegenden Erfindung zu erzeugen oder zu exprimieren.
Weiterhin wird es durch Fachleute bevorzugt sein, dass in Betrachtung der vorliegenden Beschreibung die Nukleinsäuresequenzen innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung liegen, einschließlich der Nukleinsäuresequenzen der 1 und 3, wie auch der degenerierten Nukleinsäuresequenzen davon, Nukleinsäuresequenzen, welche eine Variante(n) der sTNFRs kodieren, und solchen Nukleinsäuresequenzen, welche an komplementäre Sequenzen der Nukleinsäuresequenzen von 1 und 3 unter Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, oder unter äquivalenten Bedingungen dazu, welche im Abschnitt unten zum Screeningverfahren der cDNA-Bibliothek beschrieben ist.
Durch die vorliegende Erfindung werden ebenfalls rekombinante DNA-Konstrukte bereitgestellt, welche Vektor-DNA zusammen mit DNA-Sequenzen mit einschließen, die die gewünschten Proteine kodieren. In einem jedem solchen DNA-Konstrukt ist die Nukleinsäuresequenz, welche ein gewünschtes Protein kodiert (mit oder ohne Signalpeptide) in einem operativen Zusammenhang mit einer geeigneten Expressionskontrolle oder regulatorischen Sequenz, welche fähig ist, die Replikation und/oder Expression des gewünschten Proteins in einem ausgewählten Wirt zu steuern.
Rekombinante Expression
Herstellung von Polynukleotiden
Eine Nukleinsäuresequenz, die ein TNFbp(s) kodiert, kann leicht auf eine Vielzahl von Arten erhalten werden, einschließlich und ohne Begrenzung durch chemische Synthesen, durch cDNA oder durch das Screening von genomischen Bibliotheken, durch das Screening von Expressionsbibliotheken und/oder durch PCR-Amplifikation von cDNA. Diese und andere Verfahren, welche zur Isolierung solcher Nukleinsäuresequenzen nützlich sind, werden in Sambrook et al (1989) beschrieben, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, von Ausubel et al (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols Press; und von Berger und Kimmel (1987), Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, Bd. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA.
Chemische Synthesen einer Nukleinsäuresequenz, welches ein gewünschtes Protein kodiert, können durch Verwendung von Verfahren durchgeführt werden, die im Stand der Technik gut bekannt sind, wie beispielsweise solche, die durch Engels et al., (1989) beschrieben wurden, Angew. Chem. Intl. Ed., 28: 716–734 und Wells et al. (1985), Gene, 34: 315. Diese Verfahren schließen inter alia die Phosphortriester, Phosphoramidit und H-Phosphonatverfahren der Nukleinsäuresequenzsynthese mit ein. Große Nukleinsäuresequenzen wie beispielsweise solche, die länger als etwa 100 Nukleotide in der Länge enthalten, können als unterschiedliche Fragmente synthetisiert werden. Die Fragmente können anschließend miteinander ligiert werden, um eine geeignete Nukleinsäuresequenz zu bilden. Ein bevorzugtes Verfahren ist eine Polymer-gestützte Synthese unter Verwendung der Standardchemie für Phosphoramidite.
Alternativ kann eine geeignete Nukleinsäuresequenz durch Screening einer geeigneten cDNA-Bibliothek erhalten werden (z. B. eine Bibliothek die aus einer oder mehr Gewebequellen hergestellt wurde, und von denen angenommen wird, dass sie das Protein exprimieren oder einer genomischen Bibliothek (eine Bibliothek, die aus gesamter genomischer DNA hergestellt wurde). Die Quelle der cDNA-Bibliothek ist gewöhnlicherweise eine Gewebe- oder Zellquelle aus jeglicher Spezies, von der angenommen wird, dass sie das gewünschte Protein in vernünftigen Mengen exprimiert. Die Quelle der genomischen Bibliothek kann jegliches Gewebe oder Gewebe von jedem Säugetier oder anderen Spezies sein, von denen angenommen wird, dass sie ein Gen besitzen, welches das gewünschte Protein kodiert.
Jedes Hybridisierungsmedium kann auf die Anwesenheit einer DNA, welche ein gewünschtes Protein kodiert, unter Verwendung einer oder mehrer Nukleinsäuresonden gescreent werden (Oligonukleotide, cDNA oder genomische DNA-Fragmente, welche ein akzeptables Maß an Homologie zu der cDNA oder dem zu klonierenden Gen besitzen), welches selektiv mit cDNA(s) oder einem Genen) hybridisieren wird, welches in der Bibliothek vorhanden ist. Die Sonden, welche gewöhnlicherweise für solche Screeningverfahren verwendet werden, kodieren eine kleine Region einer DNA-Sequenz aus dem gleichen oder einer ähnlichen Spezies, wie die Spezies aus der die Bibliothek hergestellt wurde. Alternativ können die Sonden degeneriert sein, wie hier diskutiert.
Die Hybridisierung wird gewöhnlicherweise durch Annealing der Oligonukleotidsonde oder cDNA an die Klone unter Bedingungen der Stringenz durchgeführt, welche nicht-spezifische Bindung verhindern, jedoch eine Bindung von solchen Klonen ermöglichen, die ein signifikantes Maß an Homologie mit der Sonde oder dem Primer aufweisen. Typische stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind teilweise abhängig von der Größe (z. B. Anzahl an Nukleotiden in der Länge) der cDNA oder der Oligonukleotidsonde, und davon, ob die Probe degeneriert ist. Die Möglichkeit der Identifizierung eines Klons wird ebenfalls bei der Planung des Hybridisierungsmediums in Betracht gezogen (z. B. ob eine cDNA oder eine genomische Bibliothek gescreent wird).
Wird ein DNA-Fragment (wie beispielsweise cDNA) als Sonde verwendet, schließen typische Hybridisierungsbedingungen solche mit ein, welche in Ausubel et al (1994) beschrieben wurde, siehe oben. Nach der Hybridisierung wird das Hybridisierungsmedium mit einer geeigneten Stringenz in Abhängigkeit verschiedener Faktoren gewaschen, wie beispiels weise der Sondengröße, der erwarteten Homologie der Sonde zum Klon, dem gescreenten Hybridisierungsmedium, der Anzahl an gescreenten Klonen und Ähnlichem.
Beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Hybridisierung in 6 × SSC bei 62–67°C, gefolgt von einem Waschschritt in 0,1 × SSC bei 62–67°C für ungefähr eine Stunde. Alternativ sind beispielhafte stringente Hybridisierungsbedingungen eine Hybridisierung bei 45–55% Formamid, 6 × SSC bei 40–45°C, gefolgt von einem Waschschritt in 0,1 × SSC bei 62–67°C für ungefähr eine Stunde. Ebenfalls mit eingeschlossen sind DNA-Sequenzen, welche an die in den 1 und 3 gezeigten Nukleinsäuresequenzen unter relaxierten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, und welche ein TNFbp(s) kodieren. Beispiele solcher relaxierter stringenter Hybridisierungsbedingungen sind 6 × SSC bei 45–55°C oder eine Hybridisierung mit 30–40% Formamid bei 40–45°C, gefolgt von einem Waschschritt in 1–2 × SSC bei 55°C für ungefähr 30 Minuten. Siehe auch Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, Seiten 387 bis 389.
Es gibt es ebenfalls beispielhafte Protokolle für stringente Waschbedingungen, wobei Oligonukleotidsonden verwendet wurden, um Hybridisierungsmedien zu screenen. Beispielsweise verwendet ein erstes Protokoll 6 × SSC mit 0,05% Natriumpyrophosphat bei einer Temperatur von etwa 35°C bis 63°C, in Abhängigkeit der Länge der Sonde. Beispielsweise werden 14 Basissonden bei 35–40°C gewaschen, 17 Basissonden bei 45–50°C, 20 Basissonden bei 52–57°C, und 23 Basissonden bei 57–63°C. Die Temperatur kann um 2–3°C gesteigert werden, wenn der Hintergrund an nicht-spezifischer Bindung als hoch erscheint. Ein zweites Protokoll verwendet Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) zum Waschen. Eine solche stringente Waschlösung ist 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 0,2% SDS.
Ein anderes Verfahren zur Erhaltung einer geeigneten Nukleinsäuresequenz, welche ein TNFbp(s) kodiert, ist die Polymerasekettenreaktion (PCR). In diesem Verfahren wird cDNA aus Poly(A)⁺RNA oder Gesamt-RNA unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase hergestellt. Zwei Primer, gewöhnlicherweise komplementär zu zwei getrennten Regionen der cDNA (Oligonukleotide), welche das gewünschte Protein kodieren, werden anschließend zur cDNA zusammen mit einer Polymerase wie beispielsweise Taq-Polymerase zugegeben, und die Polymerase amplifiziert die cDNA-Region zwischen den beiden Primern.
Die Oligonukleotidsequenzen, welche als Sonden oder Primer ausgewählt wurden, sollten eine adäquate Länge besitzen und genügend eindeutig sein, so dass die Menge an nichtspezifischer Bindung minimiert wird, welche während des Screenings oder der PCR-Amplifikation auftreten kann. Die eigentliche Sequenz der Sonden oder Primer basiert gewöhnlich auf konservierten oder hochhomologen Sequenzen oder Regionen.
Optional können die Sonden oder Primer vollständig oder teilweise degeneriert sein, z. B. können sie eine Mischung an Sonden/Primem enthalten, welche alle die gleiche Aminosäuresequenz kodieren, jedoch verschiedene Kodons dafür nutzen. Eine Alternative zur Herstellung degenerierter Sonden ist das Einsetzen eines Inosins in eine oder alle solcher Kodonpositionen, welche in den Spezies variieren. Die Oligonukleotidsonden oder Primer können, wie hier beschrieben, durch chemische DNA-Syntheseverfahren hergestellt werden.
Vektoren
DNA, die die erwünschten Proteine kodiert, kann in Vektoren zur weiteren Klonierung (Amplifikation der DNA) oder zur Expression insertiert werden. Geeignete Vektoren sind kommerziell erhältlich oder können spezifisch konstruiert werden. Die Selektion oder Konstruktion eines geeigneten Vektors wird davon abhängig sein (1) ob es für DNA-Amplifikation oder DNA-Expression verwendet wird, (2) die Größe der DNA, die in den Vektor insertiert werden soll und (3) ob die geplante Wirtszelle mit dem Vektor transformiert werden soll.
Die Vektoren schließen gewöhnlicherweise eine Nukleinsäuresequenz mit ein, welches ein gewünschtes Protein kodiert, und operativ mit einem oder mehreren der folgenden Expressionskontroll- oder regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, welche fähig sind, die Expression eines gewünschten Proteins durch eine ausgewählte Wirtszelle zu führen, zu kontrol lieren oder anderweitig zu beeinflussen. Jeder Vektor enthält in Abhängigkeit seiner Funktion (Amplifikation von DNA oder Expression von DNA) und seiner Kompatibilität mit der geplanten Wirtszelle verschiedene Komponenten. Die Vektorkomponenten schließen generell mit ein, sind jedoch nicht beschränkt auf eine oder mehrere der folgenden Elemente: eine Signalsequenz, einen Ursprung der Replikation (origin of replication), einen oder mehrere Selektions- oder Markergene, einen Promotor, ein Enhancerelement, eine Transkriptionsterminationssequenz und Ähnliches. Diese Komponenten können aus natürlichen Quellen erhalten werden oder durch bekannte Verfahren synthetisiert werden.
Beispiele geeigneter prokaryotischer Klonierungsvektoren schließen Bakteriophagen wie beispielsweise Lambda-Derivate oder Plasmide aus E. coli (z. B. pBR322, col E1, pUC, den F-Faktor und Bluescript^®-Plasmid-Derivate (Stratagene, La Jolla, CA)) mit ein. Andere geeignete Expressionsvektoren, von denen viele Arten im Stand der Technik für die unten beschriebenen Wirtszellen bekannt sind, können ebenfalls für diese Zwecke verwendet werden.
Signalsequenz
Die Nukleinsäure, welche eine Signalsequenz kodiert, kann am 5'-Ende der Sequenz insertiert werden, die das gewünschte Protein kodiert, z. B. kann es eine Komponente eines Vektors sein oder es kann ein Teil einer Nukleinsäure sein, die ein gewünschtes Protein kodiert. Die Nukleinsäuren, welche die nativen Signalsequenzen der sTNFRs kodieren, sind bekannt ( EP 393 438 , EP 422 339 und WO 96/28546).
Ursprung der Replikation (Origin of Replication)
Expressions- und Klonierungsvektoren schließen im Allgemeinen jeweils eine Nukleinsäuresequenz mit ein, welche den Vektor befähigt sind, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. In einem Klonierungsvektor ist diese Sequenz üblicherweise eine, welche den Vektor befähigt, unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren und welche einen Replikationsursprung (origin of replication) oder eine autonom repli zierende Sequenz mit einschließt. Solche Sequenzen sind gut bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet und verschiedene Replikationsursprünge (z. B. Simian Virus 40 (SV40), Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Klonierungsvektoren in Säugetierzellen verwendbar. Im Allgemeinen ist der Replikationsursprung bei Expressionsvektoren aus Säugetieren nicht notwendig (beispielsweise wird der SV40 Replikationsursprung nur daher offen verwendet, da er den frühen Promotor enthält).
Selektionsgene
Die Expressions- und Klonierungsvektoren enthalten jeweils typischerweise ein Selektionsgen. Dieses Gen kodiert ein "Marker"-Protein, welches für das Überleben oder das Wachstum der transformierten Wirtszellen notwendig ist, wenn sie in einem selektiven Kulturmedium gezogen werden. Wirtszellen, welche nicht mit dem Vektor transformiert wurden, werden nicht das Selektionsgen enthalten und daher im Kulturmedium nicht überleben. Typische Selektionsgene kodieren Proteine, die (a) eine Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine verleihen, z. B. Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin; (b) auxotrophe Mängel ergänzen; oder (c) kritische Nährstoffe bereitstellen, welche aus dem Kulturmedium nicht verfügbar sind.
Andere Selektionsgene können verwendet werden, um die zu exprimierenden Gene zu amplifizieren. Die Amplifikation ist ein Verfahren, wobei Gene, welche einer größeren Anforderung bei der Herstellung eines Proteins unterliegen, das kritisch im Wachstum ist, im Tandem innerhalb der Chromosomen auf aufeinanderfolgenden Generationen rekombinanter Zellen wiederholt werden. Beispiele geeigneter selektierbarer Marker für Säugetierzellen schließen Dihydrofolatreduktase (DHFR) und Thymidinkinase mit ein. Die Zelltransformanten werden einem Selektionsdruck ausgesetzt, wobei ausschließlich die Transformanten so angepasst sind, dass sie durch Hilfe des im Vektor vorhandenen Markers überleben. Der Selektionsdruck wird aufgebaut durch das Kultivieren der transformierten Zellen unter Bedingungen, in welchen die Konzentration des Selektionsargens im Medium sukzessive geändert wird, was zur Amplifikation beiderseits des Selektionsgens und der für das ge wünschte Protein kodierenden DNA führt. Im Ergebnis werden gesteigerte Mengen des gewünschten Proteins ausgehend von der amplifizierten DNA synthetisiert.
Beispielsweise werden mit Hilfe des DHFR-Selektionsgens transformierte Zellen zunächst durch das Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, welches Methotrexat enthält, einem kompetitiven Antagonisten von DHFR. Eine geeignete Wirtszelle bei der Verwendung von Wildtyp DHFR ist die Zellinie aus Eierstöcken chinesischer Hamster (Chinese hamster ovary cell line), welche in der DHFR-Aktivität einen Mangel aufweist (Urlaub und Chasin (1980), Proc. Natl. Acad. Sci., USA 77(7): 4216–4220). Die transformierten Zellen werden anschließend gesteigerten Werten an Methrotrexat ausgesetzt. Dies führt zur Synthese multiplen Kopien des DHFR-Gens und begleitend zu multipler Kopien anderer DNA, welche im Expressionsvektor vorhanden ist, wie beispielsweise der DNA, die ein gewünschtes Protein kodiert.
Promotor
Expressions- und Klonierungsvektoren werden jeweils typischerweise einen Promotor enthalten, welcher durch den Wirtsorganismus erkannt wird und operativ mit einer Nukleinsäuresequenz verknüpft ist, welches das gewünschte Protein kodiert. Ein Promotor ist eine nicht-translatierte Sequenz, welche sich stromaufwärts (5') zum Startkodon eines strukturellen Gens (allgemein innerhalb etwa 100 bis 1000 Bp) befindet, welche die Transkription und Translation einer bestimmten Nukleinsäuresequenz kontrolliert. Ein Promotor kann konventionell in eine von zwei Klassen eingeteilt werden. Induzierbare Promotoren und konstitutive Promotoren. Ein induzierbarer Promotor induziert gesteigerte Werte der Transkription aus DNA unter seiner Kontrolle in Antwort auf einige Änderungen in den Kulturbedingungen, wie beispielsweise der Anwesenheit oder der Abwesenheit eines Nährstoffs oder einer Änderung in der Temperatur. Eine große Anzahl an Promotoren sind gut bekannt, welche durch eine Vielzahl möglicher Wirtszellen erkannt werden. Ein Promotor kann operativ mit einer DNA verknüpft sein, die ein gewünschtes Protein kodiert, durch das Entfernen des Promotors aus der Ursprungs-DNA mittels Verdau durch Restriktionsenzyme und Einsetzen der gewünschten Promotorsequenz. Die nativen Promotorsequenzen von sTNFRs können verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression der DNA zu regeln, die ein gewünschtes Protein kodiert. Ein heterologer Promotor wird gleichwohl bevorzugt, falls er eine bessere Transkription und höhere Ausbeuten des exprimierten Proteins im Vergleich zum nativen Promotor erlaubt und falls dieser mit dem Wirtszellsystem kompatibel ist, welches für die Verwendung ausgewählt wurde. Beispielsweise kann jede native Promotorsequenz anderer NGF/TNF-Rezeptorfamilienmitglieder verwendet werden, um die Amplifikation und/oder Expression der DNA zu regeln, die ein gewünschtes Protein kodiert.
Geeignete Promotoren zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten schließen die beta-Lactamase und die Lactosepromotorsysteme mit ein; wie auch alkalische Phosphatase; ein Tryptophan (trp)-Promotorsystem; ein System aus dem bakteriellen Lumineszenz (luxR)-Gen und Hybridpromotoren, beispielsweise den tac-Promotor. Andere bekannte bakterielle Promotoren sind ebenfalls geeignet. Deren Nukleotidsequenzen wurden veröffentlicht, was einen Fachmann in die Lage versetzt, jede ausgewählte Sequenz in die gewünschte DNA-Sequenz unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren zu ligieren, welche benötigt werden, um alle erforderlichen Restriktionsschnittstellen bereitzustellen.
Geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten sind ebenfalls im Stand der Technik gut bekannt. Geeignete Promotoren zur Verwendung mit Säugetierwirtszellen sind gut bekannt und schließen solche mit ein, welche aus den Genomen von Viren wie beispielsweise Polyomavirus, Fowlpoxvirus, Adenovirus (wie beispielsweise Adenovirus 2), bovinem Papillomavirus, AFV-Virus (avian sarcoma virus), Cytomegalovirus, einem Retrovirus, einem Hepatitis-B-Virus und, am meisten bevorzugt, SV40, erhalten wurden. Andere geeignete Promotoren aus Säugetieren schließen heterologe Promotoren aus Säugetieren mit ein, z. B. die heat-shock-Promotoren und den Actin-Promotor.
Enhancerelemente
Die Expressions- und Klonierungsvektoren werden jeweils typischerweise eine Enhancersequenz enthalten, um die Transkription höherer Eukaryoten bei einer DNA-Sequenz zu steigern, welche ein gewünschtes Protein kodiert. Enhancer sind cis-agierende Elemente der DNA, die gewöhnlicherweise von etwa 10–300 Bp lang sind, und welche auf dem Promotor agieren, um dessen Transkription zu steigern. Enhancer sind verhältnismäßig unabhängig in der Orientierung und Position. Sie wurden 5' und 3' zur Transkriptionseinheit gefunden. Enhancer aus Hefe werden vorteilhaft mit Hefe-Promotoren verwendet. Verschiedene Enhancersequenzen sind bekannt, welche aus Säugetiergenen erhältlich sind (z. B. Globin, Elastase, Albumin, Alpha-Feto-Protein und Insulin). Weiterhin sind virale Enhancer wie beispielsweise der SV40-Enhancer, der Enhancer aus den frühen Promotoren von Cytomegalovirus, der Enthancer aus Polyoma und der Enhancer aus Adenovirus beispielhafte Enhancerelemente zur Aktivierung von eukaryotischen Promotoren. Während ein Enhancer in einen Vektor bei einer Position 5' oder 3' zu einer DNA gespliced werden kann, welcher ein gewünschtes Protein kodiert, ist er typischerweise an der 5'-Seite des Promotors lokalisiert.
Transkriptionstermination
Die in eukaryotischen Wirtszellen verwendeten Expressionsvektoren werden jeweils typischerweise eine Sequenz enthalten, welche für die Termination der Transkription und für die Stabilisierung der mRNA notwendig ist. Solche Sequenzen sind allgemein aus den 5' und gelegentlich aus den 3' nicht-translatierten Regionen eukaryontischer DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nukleotidsegmente, welche als polyadenylierte Fragmente in den nicht-translatierten Anteil der mRNA transkribiert sind, welcher ein gewünschtes Protein kodiert.
Vektorkonstruktion
Die Konstruktion eines geeigneten Vektors, welcher eine oder mehrere der hier aufgeführten Komponenten enthält (zusammen mit der gewünschten kodierenden Sequenz) kann durch Standardligationsverfahren durchgeführt werden. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden geschnitten, zugeschnitten und in der gewünschten Reihenfolge erneut ligiert, um den benötigten Vektor zu erzeugen. Um zu bestätigen, dass die korrekte Sequenz konstruiert wurde, kann die Ligationsmischung verwendet werden, um E. coli zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten können durch hier beschriebene bekannte Techniken selektiert werden. Anschließend werden Mengen des Vektors aus den Transformanten hergestellt, mittels Restriktionsendonukleaseverdau analysiert und/oder sequenziert, um die Anwesenheit des gewünschten Konstrukts zu bestätigen.
Ein Vektor, welcher in Säugetierzellengen die transiente Expression einer DNA ermöglicht, die ein gewünschtes Protein kodiert, kann ebenfalls verwendet werden. Im Allgemeinen schließt die transiente Expression die Verwendung eines Expressionsvektors mit ein, welcher geeignet ist, in einer Wirtszelle effektiv zu replizieren, beispielsweise in einer Art, dass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und wiederum große Mengen des gewünschten Proteins synthetisiert, das durch den Expressionsvektor kodiert wird. Jedes transiente Expressionssystem, welches einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfasst, erlaubt die bequeme positive Identifizierung von Proteinen, welche durch klonierte DNAs kodiert werden, wie auch ein schnelles Screening solcher Proteine auf die gewünschten biologischen oder physiologischen Eigenschaften.
Wirtszellen
Jegliche einer Vielzahl von rekombinanten Wirtszellen, von denen jede eine Nukleinsäuresequenz zur Verwendung bei der Expression eines gewünschten Proteins enthält, wird ebenfalls in der vorliegenden Erfindung beschrieben. Beispielhafte prokaryotische und eukaryotische Zellen schließen bakterielle Zellen, Zellen aus Säugetieren, Zellen aus Pilzen, Insektenzellen, Hefe- oder Pflanzenzellen mit ein.
Prokaryotische Wirtszellen schließen mit ein ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, eukaryotische wie beispielsweise Gram-negative oder Gram-positive Organismen (z. B. E. coli (HB101, DH5a, DH10 und MC1061); Bacilli spp., wie beispielsweise B. subtilis; Pseudomonas spp. wie beispielsweise P. aeurginosa; Streptomyces spp.; Salmonella spp. wie beispielsweise S. typhimurium; oder Serratia spp. wie beispielsweise S. marescans. In einer spezifischen Ausführungsform kann ein gewünschtes Protein in E. coli exprimiert werden.
Zusätzlich zu prokaryotischen Wirtszellen kann/können TNFbp(s) in glycosylierter Form durch jede einer Reihe von geeigneten Wirtszellen exprimiert werden, die aus multizellulären Organismen abgeleitet sind. Solche Wirtszellen sind zu komplexer Prozessierung und Glycosylierungsaktivitäten fähig. Grundsätzlich kann jegliche höhere eukaryotische Zellkultur verwendet werden, wobei eine solche Kultur Vertebraten- oder Invertebratenzellen mit einschließt, einschließlich Pflanzen und Insektenzellen. Eukaryotische Mikroben wie beispielsweise filamentöse Pilze oder Hefen können geeignete Wirte für die Expression eines gewünschten Proteins sein. Saccharomyces cerevisiae, oder gewöhnliche Bäckerhefe ist der durchschnittlich am häufigsten verwendete Mikroorganismus unter den eukaryotischen Wirtsorganismen, jedoch ist eine Anzahl anderer Gattungen, Spezies und Stämmen gut bekannt und allgemein erhältlich.
Vertebratenzellen können verwendet werden, da die Vermehrung von Vertebratenzellen in Kultur (Gewebekultur) ein gut bekanntes Verfahren ist. Beispiele nützlicher Säugetierwirtszelllinien schließen mit ein ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Affennieren CV1-Linie transformiert mit SV40 (COS-7), humane embryonale Nierenlinien (293 Zellen oder 293 Zellen subkloniert zum Wachstum in Suspensionskulturen), Babyhamstemierenzellen und Eierstockzellen von chinesischen Hamstern (Chines hamster ovary cells). Andere geeignete Säugetierzelllinien schließen mit einohne jedoch darauf beschränkt zu sein, HeLa, Maus L-929-Zellen, 3T3-Linien, abgeleitet von Swiss, Balb-c- oder NIH-Mäusen, und BHK- oder HaK-Hamsterzelllinien. In einer spezifischen Ausführungsform kann ein gewünschtes Protein in COS-Zellen oder in Bakuloviruszellen exprimiert werden.
Eine Wirtszelle kann mit einer gewünschten Nukleinsäure unter geeigneten Bedingungen transfiziert und vorzugsweise transformiert werden, welche die Expression der Nukleinsäure erlauben. Die Auswahl geeigneter Wirtszellen und Verfahren für die Transformation, Kultur, Amplifikation, Screening und Produkterzeugung und Aufreinigung sind im Stand der Technik gut bekannt (Gething und Sambrook (1981), Nature; 293: 620–625 oder alternativ, Kaufman et al. (1985), Mol. Cell. Biol., 5(7)1750–1759, oder im US-Patent Nr. 4,419,446). Beispielsweise kann für Säugetierzellen ohne Zellwände das Kalziumphosphatfällungsver fahren verwendet werden. Elektroporation, Mikroinjektion und andere bekannte Verfahren können ebenfalls verwendet werden.
Es ist ebenfalls möglich, dass ein gewünschtes Protein durch homologe Rekombination oder mit Hilfe von rekombinanten Herstellungsverfahren unter Verwendung von Kontrollelementen hergestellt werden, welche in die Zellen eingeführt wurden, die bereits die DNA enthielten, welche ein gewünschtes Protein kodiert. Homologe Rekombination ist ein Verfahren, das ursprünglich zum Targeting von Genen entwickelt wurde, um Mutationen in transkriptionsaktiven Genen zu induzieren oder zu konrrigieren (Kucherlapati (1989), Prog. in Nucl. Acid Res. and Mol. Biol., 36: 301). Das grundlegende Verfahren wurde als ein Verfahren zur Einführung spezifischer Mutation in spezifische Regionen des Säugetiergenoms entwickelt (Thomas et al. (1986), Cell, 44: 419–428; Thomas und Capecchi (1987), Cell, 51: 503–512 und Doetschman et al. (1988). Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 8583–8687) oder um spezifische Mutation innerhalb defekter Gene zu korrigieren (Doetschman et al. (1987), Nature, 330: 576–578). Beispielhafte Verfahren werden im US-Patent Nr. 5,272,071; WO 92/01069; WO 93/03183; WO 94/12650 und WO 94/31560 beschrieben.
Kultivierung der Wirtszellen
Das Verfahren zur Kultivierung von jeder der einen oder mehreren rekombinanten Wirtszellen zur Produktion kann aufgrund vieler Faktoren und Überlegungen verändert werden; das optimale Produktionsverfahren für eine gegebene Situation wird einem Fachmann durch minimales Experimentieren offensichtlich sein. Solche rekombinanten Wirtszellen werden in einem geeigneten Medium kultiviert und das exprimierte Protein wird anschließend optional wiedergewonnen, isoliert und aus dem Kulturmedium (oder aus den Zellen, falls intrazellulär exprimiert) durch geeignete Mittel aufgereinigt, welche einem Fachmann bekannt sind.
Im Besonderen kann jede der rekombinanten Zellen, welche verwendet wird, um ein gewünschtes Protein zu erzeugen, in einem Kulturmedium kultiviert werden, welches zur Induzierung von Promotoren, zur Selektion geeigneter rekombinanter Wirtszellen oder zur Amplifizierung des Gens geeignet ist, welches das Protein kodiert. Das Kulturmedium kann, falls notwendig, mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie beispielsweise Insulin, Transferrin oder epidermalen Wachstumsfaktoren) Salzen (wie beispielsweise Natriumchlorid, Kalzium, Magnesium und Phosphat), Puffer (wie beispielsweise HEPES), Nukleoside (wie beispielsweise Adenosin und Thymidin) Antibiotika (wie beispielsweise Gentamicin), Spurenelemente (als anorganische Verbindungen definiert, welche gewöhnlicherweise bei finalen Konzentrationen im mikromolaren Bereich vorliegen), und Glucose und andere Energiequellen ergänzt werden. Andere Ergänzungsmittel können in geeigneten Konzentrationen ebenfalls mit eingeschlossen sein, wie es durch Fachleute bevorzugt wird. Geeignete Kulturbedingungen wie beispielsweise Temperatur, pH und Ähnliches sind ebenfalls Fachleuten in Zusammenhang mit der Verwendung der ausgewählten Wirtszellen gut bekannt.
Das erhaltene Expressionsprodukt kann anschließend bis nahe and die Homogenität unter Verwendung der im Stand der Technik bekannten Verfahren aufgereinigt werden. Beispielhafte Aufreinigungsverfahren werden in EP 393 438 und EP 422 339 gelehrt.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung beschreibt pharmazeutische Präparationen, welche jeweils therapeutisch oder prophylaktisch effektive Mengen eines TNFbp(s) oder ein chemisch modifiziertes Derivat davon (Kollektiv genannt "TNFbp-Produkt(e)") in Mischung mit einem Träger enthalten. Der Träger schließt bevorzugt eine oder mehrere pharmazeutisch und physiologisch geeignete Formulierungsmaterialien in Beimischung mit dem TNFbp-Produkt/ den TNFbp-Produkten mit ein.
Das primäre Lösungsmittel in einem Träger kann von seiner Natur her entweder wässrig oder nicht-wässrig sein. Zusätzlich kann der Träger pharmazeutisch geeignete Hilfsstoffe zur Modifizierung oder Beibehaltung des pHs bevorzugt zwischen 5–6,5 beinhalten, und noch bevorzugter zwischen 5,5–6,0 (z. B. Puffer, wie beispielsweise Citrate oder Phosphate und Aminosäuren wie Glycin); Viskosität; Klarheit; Farbe; Sterilität; Stabilität (z. B. Sucrose und Sorbit); Geruch; Rate der Auflösung (z. B. Lösungsmittel oder lösende Agenzien wie beispielsweise Alkohole, Polyethylenglycole und Natriumchlorid), Rate der Freisetzung, wie auch quellende Agenzien für die lyophilisierende Formulierung (z. B. Mannitol und Glycin); Tenside (z. B. Polysorbat 20, Polysorbat 80, Trition und Pluronic); Antioxidanzien (z. B. Natriumsulfat und Natriumhydrogensulfit); Konservierungsmittel (z. B. Benzoesäure und Salicylsäure); geschmacksverleihende und verdünnende Agenzien; emulgierende Agenzien, suspendierende Agenzien; Lösungsmittel; Füllstoffe; Überlieferungsträger und andere pharmazeutische Adjuvanzien und/oder Arzneihilfsträger. Andere effektive Verabreichungsformen wie beispielsweise parenterale Formulierungen zur langsamen Freisetzung, Nebel zur Inhalation, oralaktive Formulierungen oder Suppositorien sind ebenfalls ins Auge gefasst. Die Zusammensetzung kann ebenfalls partikuläre Präparationen polymerer Verbindungen wie beispielsweise Bulk-Erosionspolymere (z. B. Poly(Milch-Co-Glycolsäure (PLGA)-Copolymere, PLGA-Polymermischungen, Blockcopolymere von PEG, und Milchsäure und Glycolsäure, Poly(cyanoacrylate)); Oberflächenerosionspolymere (z. B. Poly(anhydride) und Poly(orthoester)); Hydrogelester (z. B. pluronische Polyole, Poly(vinylalkohol), Poly(vinylpyrrolidon), Maleinanhydrid-Alkylvinylethercopolymere, Zellulose, Hyaluronsäurederivate, Alginate, Kollagen, Gelatine, Albumin und Hefen und Dextrane) und zusammengesetzte Systeme davon; oder Präparationen von Liposomen oder Mikrosphären. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Rate der in vivo-Freisetzung, und die Rate der in vivo-Klärung der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen. Die optimale pharmazeutische Formulierung für ein gewünschtes Protein wird durch einen Fachmann in Abhängigkeit der Verabreichungsroute und der gewünschten Dosierung bestimmt werden. Beispielhafte pharmazeutische Zusammensetzungen werden in Remington' Pharmaceutical Sciences beschrieben, 18. Ausgabe (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, Seiten 1435–1712; Gombotz und Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6: 332–351; Leone-Bay, et al. (1995), Journal of Medicinal Chemistry, 38: 4263–4269, Haas, et al (1995), Clinical Immunology and Immunopathology, 76(1): 93; WO 94/06457; WO 94/21275, FR 2706772 und WO 94/21235.
Spezifische Zusammensetzung für die nachhaltige Freisetzung sind von den folgenden Vertreibern erhältlich: Depotech (Depofoam^TM, ein multivesikuläres Liposom) und Alkermes (ProLease^TM), eine PLGA-Mikrosphäre). Beispielhafte Formen von Hyaluronan werden in Peyron und Balazs (1974) beschrieben, Path. Biol., 22(8): 731–736, Isdale et al. (1991), J. Drug Dev., 4(2): 93–99; Larsen et al. (1993); Journal of Biomedical Materials Research, 27: 1129–1134; Namiki et al. (1982), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20(11): 501–507; Meyer et al. (1995), Journal of Controlled Release, 35: 67–72; Kikuchi et al. (1996), Osteoarthritis and Cartilage, 4: 99–110; Sakakibara et al. (1994), Clinical Orthopaedics and Related Research, 299: 282–292; Meyers und Brandt (1995) 20: 1732–1739; Laurent et al. (1995), Acta Orthop Scand 66(266): 116–120; Cascone et al. (1995), Biomaterials, 16(7): 569–574; Yerashalmi et al. (1994), Archives of Biochemistry and Biophysics, 313(2): 267–273; Bematchez et al. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27(5): 677–681; Tan et al. (1990), Australian Journal of Biotechnology, 4(1): 38–43; Gombotz und Pettit (1995), Bioconjugate Chem., 6: 332–351; US-Patent Nr. 4,582,865, 4,605,691, 4,636,524, 4,713,448, 4,716,154, 4,716,224, 4,772,419, 4,851,521, 4,957,774, 4,863,907 5,128,326, 5,202,431, 5,336,767, 5,356,883, Europäische Patentanmeldung Nr. 0 507 604 A2 und 0 718 312 A2; und WO 96/05845.
Spezifische Hyaluronanzusammensetzungen sind von den folgenden Vertreibern erhältlich: BioMatrix, Inc. Ridgefield, NJ (Synvisc^TM, eine 90 : 10-Mischung eines Hylanfluids und Hylangels); Fidia S. p. A., Abano Terme, Italien (Hyalgan^TM, das Natriumsalze einer aus einem Hahnenkamm gewonnenen Hyaluronsäure (~500000 bis ~700000 MW)); Kaken Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japan (Artz^TM, eine 1%ige Lösung einer aus einem Hahnenkamm hergestellten Hyaluronsäure, ~700000 MW); Pharmacia AB, Stockholm, Schweden (Healon^TM, eine aus einem Hahnenkamm entwickelte Hyaluronsäure, ~4 × 10⁶ MW); Genzyme Corporation, Cambridge, MA (Surgicoat^TM, eine rekombinante Hyaluronsäure); Pronova Biopolymer, Inc. Portsmouth, NH (Hyaluronsäure FCH, ein hohes molekulares Gewicht (z. B., ~1,5–2,2 × 10⁶ MW) aus Kulturen von Streptococcus zooepidemicus hergestellte Hyaluronsäure; Natriumhyaluronat MV, ~1,0–1,6 × 10⁶ MW und Natriumhyaluronat LV, 1,5–2,2 × 10⁶ MW); Calbiochem-Novabiochem AB, Lautelfingen, Schweiz (Hyaluronsäure, Natriumsalz (1997 Firmenkatalog Nr. 385908), hergestellt aus Streptococcus sp.); Intergen Company, Purchase, NY (eine aus einem Hahnenkamm entwickelte Hyaluronsäure, >1 × 10⁶ MW); Diosynth Inc., Chicago, IL; Amerchol Corp., Edison, NJ und Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japan.
Ist die pharmazeutische Zusammensetzung einmal formuliert, kann sie in sterilen Röhrchen als Lösung, Suspension, Gel, Emulsion, Feststoff oder als ein dehydratisiertes oder lyophilisiertes Pulver aufbewahrt werden. Solche Zusammensetzungen können jeweils entweder in einer gebrauchsfertigen Form oder in einer Form (z. B. lyophilisiert) aufbewahrt werden, welche vor der Verabreichung eine Wiederherstellung erfordem.
Verwendungen
Ein TNFbp-Produkt(e) kann als Reagens für die Forschung und als therapeutisches und diagnostisches Agens nützlich sein. Das TNFbp-Produkt(e) kann daher in vitro und/oder in vivo diagnostischen Assays zur Quantifizierung der Menge von nativem TNFR-I, sTNFR-I, TNFR-II oder sTNFR-II in einer Gewebe- oder Organprobe oder zur Bestimmung und/oder Isolierung von Zellen verwendet werden, welche TNF (Scallon et al. (1995)) exprimieren. In Assays von Geweben oder Organen wird es weniger Radioaktivität von einer Bindung eines ¹²⁵I-TNFbp-Produktes an TNF geben im Vergleich zu einer standardisierten Bindungskurve eines ¹²⁵I-TNFbp-Produkt(s), aufgrund nichtimarkierter nativer sTNFR-I- oder sTNFR-II-Bindung an TNF. In ähnlicher Weise kann die Verwendung eines ¹²⁵I-TNFbp-Produkts/von ¹²⁵I-TNFbp-Produkten verwendet werden, um die Anwesenheit von TNF in verschiedenen Zellttypen zu detektieren.
Ein TNFbp-Produkt(e) kann/können in der Erzeugung von Antikörpern und den resultierenden Antikörpern verwendet werden (insbesondere einschließlich solcher, welche an natives sTNFR-I oder sTNFR-II binden). Antikörper können entwickelt werden, welche an TNFbp-Produkt(e) binden. Ein Fachmann kann gut bekannte veröffentlichte Verfahren verwenden, um monoklonale, polyklonale Antkörper oder rekombinante Antikörper zu erhalten, welche die verschiedenen Proteine, welche durch die Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung kodiert werden, erkennen und an diese binden. Solche Antikörper können anschließend verwendet werden, um die native sTNFR-I und native sTNFR-II aufzureinigen und zu charakterisieren, oder um die Anzahl von TNFR-I oder TNFR-II zu bestimmen, welche auf einer Zelloberfläche exprimiert wird.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Verwendung eines COX2-Inhibitors und eines TNF-Bindungsproteins zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung verschiedener Erkrankungen und medizinischer Erkrankungen (von denen viele als entzündliche Erkrankungen charakterisiert werden können), welche durch TNF vermittelt werden, wie auch die verwandten Folgen und Symptome, welche damit assoziiert sind. Eine nichtausschließliche Liste von akuten und chronischen TNF-vermittelten Erkrankungen schließen folgende mit ein, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein: Cachexie/Anorexie; Krebs (z. B. Leukämie); chronisches Ermüdungssyndrom, Depression, Diabetes (z. B. juveniler Anfall Typ 1 und Diabetes Mellitus); Fibromyelgie oder Analgesie; Transplantatabstoßung (graft versus host rejection); Hyperalgesie; entzündliche Erkrankungen der Innereien; Ischämie, einschließlich zerebraler Ischämie (Gehirnverletzungen als Folge von Trauma, Epilepsie, Blutsturz oder Schlaganfall, von denen jeder zu Neurodegeneration führen kann); Lungenerkrankungen (z. B. adultrespiratorisches Erschöpfungssyndrom und pulmonare Fibrose); Multiple Sklerose; neuroinflammatorische Erkrankungen; okulare Erkrankungen; Schmerz, Pankreatitis, pulmonare Fibrose; Reperfusionsverletzungen; rheumatische Er- krankungen (z. B. rheumatoide Arthritis; Osteoarthritis, juvenile (rheumatoide) Arthritis, seronegative Polyarthritis, Spondylitis Ankylosans, Reitersyndrom und reaktive Arthritis, psoriatische Arthritis, enteropathische Arthritis, Polymyositis, Dermatomyositis, Skleroderma, systemische Sklerose, Vaskulitis, zerebrale Vaskulitis, Lyme-Erkrankung, durch Staphylococcus-induzierte (septische") Arthritis, Sjögrens-Syndrom, rheumatisches Fiber, Polychondritis und polymyalgische rheumatische Erkrankungen und Giant-Cell-Arteriitis); septischer Schock; Nebeneffekte der Bestrahlungstherapie; systemische Lupus Erythematosus; temporale mandibuläre Gelenkserkrankung; Thyroiditis; Gewebetransplantation oder eine entzündliche Erkrankung resultierend aus einer Dehnungs-, Verstauchungs- oder Knorbelverletzung, Trauma, orthopädische Chirurgie, Infektion oder anderen Erkrankungsprozessen.
Das/die TNFbp-Produkt(e) kann einem Patienten in einer therapeutisch effektiven Menge zur Vorbeugung oder Behandlung einer TNF-vermitelten Erkrankung, einschließlich rheu matischen Erkrankungen verabreicht werden. Der Begriff "Patient" beabsichtigt dabei Tiere (z. B. Katzen, Hunde und Pferde) wie auch Menschen mit einzuschließen.
Das TNFbp-Produkt/die TNFbp-Produkte können über topische, enterale oder parenterale Verabreichungswege verabreicht werden, einschließlich und ohne Begrenzung Infusion, interarterielle, intraartikuläre, intrakapsuläre, intrakardiale, intradermale, intramuskuläre, intraorbitale, intrathekale, intravenöse, intraperitoneale, intraspinale und intrasernale Injektionen, intraventikuläre, subkutane, subkutikuläre, subkapsulare, subarachnoide und transtracheale Injektion. Das TNFbp-Produkt/die TNFbp-Produkte können ebenfalls über orale Verabreichungswege oder über schleimhaltige Membrane verabreicht werden, z. B. bukkal, intranasal, rektal oder sublingual für die systemische Übertragung.
Es wird bevorzugt, dass das TNFbp-Produkt/die TNFbp-Produkte über intraartikuläre, intramuskuläre, intravenöse oder subkutane Injektion verabreicht werden. Zusätzlich kann das TNFbp-Produkt/die TNFbp-Produkte durch kontinuierliche Infusion (z. B. konstante oder unterbrochene, implantierte oder externale Vorrichtungen zur Fluss-Modulierung der Infusion), so dass das gewünschte Maß an TNFbp-Produkt/TNFbp-Produkten kontinuierlich im Blut für den Zeitraum der Verabreichung bereitgestellt wird. Dies kann mit Hilfe einer Minipumpe wie beispielsweise einer osmotischen Minipumpe durchgeführt werden. Bei diesen Wegen kann man sicher sei, dass die Menge an Wirkstoff auf dem gewünschten Pegel gehalten wird und man kann Blutproben entnehmen und die Menge an Wirkstoff im Blutstrom beobachten. Verschiedene Pumpen sind kommerziell erhältlich. Beispielsweise von Vertreibern wie z. B. MiniMed Inc., Sylmar, CA (z. B. MT507) und Alza Corp., Palo Alto, CA (z. B. Alzet osmotische Pumpe, Modell 2MLI).
Es ist ebenfalls beabsichtigt, dass andere Arten kontinuierlicher oder beinahe kontinuierlicher Dosierung ausgeführt werden können. Beispielsweise kann eine chemische Derivatisierung in Formen der verzögerten Freigabe des Proteins resultieren, was einen Effekt auf die andauernde Anwesenheit im Blutstrom besitzt, in vorhersagbaren Mengen in Abhängigkeit einer vorher bestimmten Dosierungsvorschrift.
Arten der Verwendung von TNFbp-Produkt/ TNFbp-Produkten für die Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, einschließlich rheumatischer Erkrankungen (z. B. Osteoarthritis, psoriatischer Arthritis und rheumatoider Arthritis) werden in der europäischen Patentanmeldung 567566 beschrieben. Beispielhaft, jedoch ohne Beschränkung, kann in einer spezifischen Ausführungsform eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein TFNbp-Produkt/TNFbp-Produkte intra-artikulär zur Behandlung rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis verabreicht werden. Beispielhaft, jedoch ohne Beschränkung kann in einer anderen spezifischen Ausführungsform eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein TNFbp-Produkt/ TNFbp-Produkte subkutan oder intramuskulär für die Behandlung rheumatoider Arthritis, entzündlicher Bowel-Erkrankung, Cachexie/Anorexie oder Multiple Sklerose verabreicht werden. Beispielhaft, jedoch ohne jede Beschränkung, kann in einer weiteren spezifischen Ausführungsform eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein TNFbp-Produkt/NFbp-Produkte intravenös zur Behandlung von Gehirnverletzungen als Ergebnis eines Traumas, von Epilepsie, Blutsturz oder Gehirnschlag verabreicht werden; oder intraventrikulär für die Behandlung von Gehirnverletzungen als Ergebnis eines Traumas verabreicht werden. Eine spezifische Art für die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Arthritis schließt mit ein: (1) eine einzelne intrakuläre Injektion eines TNFbp-Produkts/von TNFbp-Produkten, welche periodisch so wie benötigt verabreicht werden, um dem Aufflackern von Arthritis vorzubeugen oder dieses zu beseitigen und (2) eine periodische subkutane Injektion von TNFbp-Produkt/TNFbp-Produkten. In einer anderen spezifischen Ausführungsform kann eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein TNFbp-Produkt/TNFbp-Produkte bei der Behandlung von septischem Schock verabreicht werden. Die Initiation der Behandlung von septischem Schock sollte sobald wie möglich nach Sepsis oder den diagnostizierten Anzeichen der Sepsis beginnen. Die Behandlung kann beispielsweise direkt nach Chirurgie oder nach einem Unfall oder nach irgendeinem anderen Ereignis begonnen werden, welches das Risiko der Initiation von septischem Schock mit sich bringt. Arten der Behandlung von adultem respiratorischen Distress-Syndrom schließen mit ein: (1) einzelne oder multiple intratracheale Verabreichungen eines TNFbp-Produkts/von TNFbp-Produkten und (2) Bolus oder kontinuierliche intravenöse Infusion eines TNFbp-Produkts/von TNFbp-Produkten.
Ungeachtet der Art und Weise der Verabreichung benötigt die Behandlung von einer TNFvermittelten Erkrankung einen Dosisplan oder Gesamtdosisvorschrift eines TNFbp-Produkts/TNFbp-Produkten, welche effektiv sind die Symptome der Erkrankung zu reduzieren oder zu beseitigen. Faktoren bei der Bestimmung der geeigneten Dosierungsvorschrift oder Gesamtdosierungsvorschrift kann die zu behandelnde oder zu verhütende Erkrankung oder Zustand mit einschließen, die Schwere der Erkrankung, die Route der Verabreichung und das Alter, das Geschlecht und der medizinische Zustand des Patienten.
Eine weitere Verteinerung der Berechnungen, welche notwendig ist, um die geeignete Dosierung für die Behandlung zu bestimmen, wird routinemäßig durch Fachleute durchgeführt, insbesondere bei Betrachtung der hier beschriebenen Dosierungsinformation und Assays. Die Häufigkeit der Dosierung hängt ebenfalls von pharmakokinetischen Parametern des TNFbp-Produkts/der TNFbp-Produkte in der verwendeten Formulierung ab. Das TNFbp-Produkt/die TNFbp-Produkte können einmalig oder in Fällen schwerwiegender oder andauernder Erkrankungen täglich in niedrigen häufigen Dosierungen verabreicht werden oder mit einer initialen Bolusdosis gefolgt von einer kontinuierlichen Dosis oder einer anhaltenden Freisetzung. Es ist ebenfalls beabsichtigt, dass andere Arten der kontinuierlichen oder fast kontinuierlichen Dosierung durchgeführt werden können. Beispielsweise kann eine chemische Derivatisierung in Formen anhaltender Freisetzung resultieren, welche den Effekt einer kontinuierlichen Anwesenheit im Blutstrom besitzen, in vorhersagbaren Mengen in Abhängigkeit einer vorher bestimmten Dosierungsvorschrift oder Gesamtdosierungsvorschrift. Die Dosierungs- oder Gesamtdosierungsvorschrift kann ebenfalls durch die Verwendung bekannter Assays zur Bestimmung von Dosierungen bestimmt werden, die in Zusammenhang mit geeigneten Dosis/Antwort-Daten verwendet wurden.
Wenn parenteral verabreicht kann jede Dosierungseinheit beispielsweise bis zu 10 mg, im Allgemeinen bis zu 15 mg und noch allgemeiner bis 20 mg enthalten. Bei Verabreichung in eine artikuläre Vertiefung wird die pharmazeutische Zusammensetzung bevorzugt als einzelne Injektion verabreicht, beispielsweise mit einer 3 bis 10 ml Spritze, die eine Dosierung beispielsweise zwischen etwa 5 mg/ml bis 10 mg/ml TNFbp-Produkte) enthält, gelöst in isotonischer Phosphat-gepufterter Salzlösung. Die Herstellung kann in eine artikuläre Vertie fung mit einer Häufigkeit von beispielsweise einmal alle 7 bis 10 Tage verabreicht werden. Auf einer solchen Weise wird die Verabreichung kontinuierlich durchgeführt, während beispielsweise die Dosierung 4 bis 5 mal variiert wird, falls notwendig.
Ein TNFbp-Produkt/TNFbp-Produkte können als ein Zusatz zu anderen Therapien und e- benfalls mit anderen pharmazeutischen Fomulierungen verabreicht werden, welche für die zu behandelnde Indikation geeignet sind. Ein TNFbp-Produkt/TNFbp-Produkte und irgendeine oder mehrere zusätzliche Therapien oder pharmazeutische Formulierungen können getrennt oder in Kombination verabreicht werden.
In einer noch spezifischeren Ausführungsform ist die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines TNFbp-Produkts/von TNFbp-Produkten in Kombination (Vorbehandlung, Nachbehandlung oder begleitende Behandlung) gerichtet mit irgendeinem oder mehreren COX2-Inhibitoren, Pro-Pharmaka oder pharmazeutisch geeigneten Salzen davon zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von TNF-vermittelten Erkrankungen, einschließlich akuter oder chronischer Entzündung. Beispiele von COX2-Inhibitoren, Pro-Pharmaka oder pharmazeutisch geeigneten Salzen davon schließen beispielsweise Celecoxib mit ein. Strukturelle verwandte COX2-Inhibitoren, die ähnliche analgesische und antientzündliche Eigenschaften besitzen, sollen ebenfalls von dieser Gruppe umfasst sein.
Es ist insbesondere vorteilhaft, Zusammensetzungen der anti-entzündlichen Verbindungen in der Form von Dosierungseinheiten zur Vereinfachung der Verabreichung und Vereinheitlichung der Dosierung zu formulieren. "Form der Dosierungseinheit" wie hier verwendet, bezieht sich auf physikalisch getrennte Einheiten, die als einzelne Dosierungen für den zu behandelnden Patienten geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge an anti-entzündlichen Verbindungen enthält, welche danach berechnet wurden, dass sie den gewünschten therapeutischen Effekt in Assoziation mit den benötigten pharmazeutischen Trägem erzielen. Wie hier verwendet, schließt der Begriff "pharmazeutisch geeigneter Träger" jegliche und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und antifungale Agenzien, istonische und absorptionsverzögernde Agenzien und ähnliche Stoffe mit ein, welche mit den aktiven Inhaltsstoffen und mit der Art der Verabreichung und anderen Inhaltsstoffen der Formulierung kompatibel sind und auf den Empfänger nicht schädlich wirken.
Für eine orale therapeutische Verabreichung kann die anti-entzündliche Verbindung durch Arzneimittelhilfsträgern aufgenommen werden und in der Form von eintragenden Tabletten, bukkalen Tabletten, Pastillen, Kapseln, Elixieren, Suspensionen, Sirups, Plättchen und Ähnlichem verwendet werden, oder es kann direkt mit dem Essen in der Diät mit aufgenommen werden. Die Tabletten, Pastillen, Pillen, Kapseln und Ähnliches können ebenfalls folgendes enthalten: einen Bindungsmittel wie beispielsweise Gummi Tragacanth, Akazie, Kornstärke oder Gelatine; Arzneimittelhilfsträger wie beispielsweise Dikalziumphosphat; ein desintegrierendes Agens wie beispielsweise Kornstärke, Alginsäure und Ähnliches; ein Gleitmittel wie beispielsweise Magnesiumstearat; ein Süßungsmittel wie beispielsweise Sucrose, Lactose oder Saccharin, oder ein geschmacksgebens Agens wie beispielsweise Pfefferminz, Öl von Wintergrün oder Kirsche oder Orangengeschmack. Wenn die Form der Dosierungseinheits eine Kapsel ist, kann diese zusätzlich zu der hier beschriebenen Art von Material einen flüssigen Träger beinhalten. Verschiedene andere Materialien können beispielsweise als Beschichtungsmittel vorhanden sein, um die physikalische Form der Dosierungseinheit zu modifizieren. Beispielsweise können Tabletten, Pillen, Kapseln mit Schellack, Zucker oder beidem beschichtet werden. Selbstverständlich sollte jedes Material, welches bei der Herstellung irgendeiner Form der Dosiseinheit verwendet wird, bei den verwendeten Mengen pharmazeutisch rein und im Wesentlichen nicht-toxisch sein. Zusätzlich kann die anti-entzündliche Verbindung in einer Präparation und Formulierung mit fortdauernder Freisetzung mit aufgenommen werden. Die Menge der anti-entzündlichen Verbindung in einer solchen therapeutisch nützlichen Zusammensetzung ist so ausgewählt, dass eine geeignete Dosierung erhalten wird.
Für parenterale therapeutische Verabreichung kann jede anti-entzündliche Verbindung in eine sterile injizierbare Lösung mit aufgenommen werden. Die sterile injizierbare Lösung kann durch die Aufnahme der anti-entzündlichen Verbindung in der benötigten Menge in einem geeigneten pharmazeutisch geeigneten Träger hergestellt werden, mit verschiedenen anderen Bestandteilen, gefolgt von einer Sterilfiltrierung. Im Falle von Dispersionen kann jede Dispersion durch Aufnahme der anti-entzündlichen Verbindung in einen sterilen Träger hergestellt werden, welcher das basisch Dispersionsmedium und die benötigten anderen Inhaltsstoffe enthalten, die hier aufgezählt sind. Im Falle von sterilen injizierbaren Lösungen kann jede durch Aufnahme eines Pulvers der anti-entzündlichen Verbindung hergestellt werden, und optional durch die weitere Aufnahme jedes zusätzlichen gewöhnlichen Inhaltsstoffes aus einer kürzlich steril-filtrierten Lösung davon, wobei das Pulver durch jedes geeignete Verfahren (z. B. Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung) hergestellt wurde.
Die Verwendung solcher Medien und Agenzien ist im Stand der Technik gut bekannt (siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, Seiten 1435–1712). Ergänzende aktive Inhaltsstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen mit aufgenommen werden.
Die spezifische Dosis der anti-entzündlichen Verbindung wird entsprechend dem ungefähren Körpergewicht oder dem Oberflächenbereich des Patienten berechnet. Andere Faktoren bei der Bestimmung der ungefähren Dosis können die zu behandelnde oder der vorzubeugenden akuten oder chronischen entzündlichen Erkrankung oder Zustand mit einschließen, die Schwere der Erkrankung, die Route der Verabreichung und das Alter, Geschlecht und der medizinische Zustand des Patienten. Eine weitere Verfeinerung der Berechnungen, welche notwendig sind, um die ungefähre Dosierung für die Behandlung einschließlich jeder der hier erwähnten Formulierungen zu bestimmen, wird durch Fachleute üblicherweise durchgeführt. Dosierungen können ebenfalls durch die Verwendung bekannter Assays zur Bestimmung von Dosierungen bestimmt werden, die zusammen mit geeigneten Dosis/Antwort-Daten verwendet wurden.
Es ist daher innerhalb des Schutzbereiches dieser Erfindung, dass Dosen der antientzündlichen Verbindungen variiert werden können, welche zur Behandlung einer besonderen akuten oder chronischen entzündlichen Erkrankung ausgewählt wurden, wie beispielsweise rheumatische Erkrankungen, um einen gewünschten therapeutischen Effekt zu erzielen. Besitzt eine der anti-entzündlichen Verbindungen Nebeneffekte, so kann diese den Patien ten während alternierender Behandlungszeiträume einer Kombinationstherapie verabreicht werden.
Tests zur Beobachtung der Verbesserung einer Erkrankung können spezifische Tests mit einschließen, welche beispielsweise auf die Bestimmung systemischer Antworten auf eine Entzündung gerichtet sind, welche die Sedimentationsrate von Erythrocyten (ESR) und die akuten Phasenreaktanten (APR) mit einschließen. Es werden Beobachtungen von der Schwellung, z. B. der betroffenen Körperteile, durchgeführt. Eine Verbesserung in Bezug auf die Steifheit und den Griff (falls anwendbar), und die Verminderung des Schmerzes des Patienten werden ebenfalls beobachtet. Falls der Zustand des Patienten stabil ist, wird der Patient erneut mit der gleichen Dosierung wöchentlich behandelt und wöchentlich beurteilt. Vorausgesetzt, dass der Zustand des Patienten stabil ist, kann die Behandlung fortgesetzt werden. Nach sechs Monaten Behandlung werden anatomische Änderungen des Skeletts durch radiologische Aufnahmen bestimmt, z. B. durch Röntgenstrahluntersuchung.
Zum Ende eines jeden Zeitraums wird der Patient erneut beurteilt. Ein Vergleich der radiologischen Bewertung der Vor- und Nachbehandlung, ESR und APR, deutet die Effektivität der Behandlungen an. Entsprechend der Effizienz der Behandlungen und entsprechend dem Zustand des Patienten kann die Dosierung für die Dauer der Behandlung gesteigert oder konstant beibehalten werden.
Die vorliegende Erfindung richtet sich bevorzugt auf die Verwendung eines COX2-Inhibitors bei der Herstellung eines Medikaments bei der Behandlung oder Vorbeugung von TNF- vermittelten Erkrankungen, einschließlich akuter und chronischer Entzündung, wie beispielsweise rheumatische Erkrankungen und die damit assoziierten Symptome, in Kombination mit der vorangehenden, begleitenden oder anschließenden Verabreichung eines TNF-Bindungsproteins. Eine Kombination ist ein TNFbp-Produkt/ TNFbp-Produkte (z. B. sTNFR-I, sTNFR-II, sTNFR-Fragmente (2,6 D sTNFRs wie beispielsweise 2,6 D sTNFR-I) oder sTNFRFc(s) (sTNFR-I/IgG1 oder sTNFR-II/IgG1) davon), mit einem COX2-Inhibitor.
Beispiele
Standardverfahren für viele der in den folgenden Beispielen beschriebenen Verfahren, oder geeignete alternative Verfahren werden in weithin bekannten Handbüchern der Molekularbiologie wie beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning, zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates/Wiley Interscience, New York (1990) bereitgestellt. Alle Chemikalien besitzen entweder einen analytischen oder USP-Reinheitsgrad.
Beispiel 1
Es wurde ein Tiermodell der rheumatoiden Arthritis verwendet, welches durch ein Adjuvans induziert wurde, um die Kombinationstherapie eines TNF-Bindungsproteins und Methotrexat in männlichen Lewis-Ratten (3–7/Gruppe) zu untersuchen, welche mindestens 200 g wogen.
Am Tag 0 wurde allen Ratten 100 μl Freundsches vollständiges Adjuvans (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) injiziert, zu welchem ein synthetisches Adjuvans, N,N-Dioctyldecyldecyl-N',N-bis(2-hydroxy-ethyl)propandiamin, 50 mg/ml zugegeben wurde. Am Tag 0–14 wurde Methotrexat in 1%iger Carboxymethylcellulose (Sigma) täglich oral zwei Gruppen von Ratten verabreicht (0,06 mg/kg). An den Tagen 8, 10, 12 und 14 wurde aus E. coliabgeleitetes c105 sTNFR-I, welches mit PEG-20000-bis-Vinylsulfon dimerisiert wurde (c105 sTNFR-I in Hantelform; im Allgemeinen in Übereinstimmung mit der Lehre von WO 95/34326 hergestellt), in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert (34 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 4% Sorbitol (Gew.%) in Wasser, pH 6,5) durch subkutane (sc) Injektion (3 mg/kg) einer Gruappe von Ratten verabreicht, welche mit beiderseits Freundschem vollständigen Adjuvans und Methotrexat behandelt wurden und einer anderen Gruppe an Ratten, welche mit Freundschem vollständigen Adjuvans alleine behandelt wurden.
Die Körpergewichte wurden am Tag 0 und an jedem anderen Tag beginnend von Tag 9 bis zum Ende am Tag 15 bestimmt. Messungen mit dem Greifzirkel und eine klinische Bewertung wurden am Tag 9 und jedem weiteren Tag bis zum Ende vorgenommen. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Gewichte vom Körper, den Pfoten und der Milz des Tieres bestimmt.
Wie in den 3 und 4 dargestellt, zeigten Ratten, welche mit c105 sTNFR-I in Hantelform alleine behandelt wurden, etwa 42% Inhibition der Schwellung der Pfote (Bereich unter der Kurve – AUC), keine signifikante Verbesserung in Bezug auf Splenomegalie (nicht gezeigt) und etwa 13,2% Inhibition der Änderung des Körpergewichts (nicht gezeigt). Ratten, welche mit Methotrexat behandelt wurden, zeigten 26% Inhibition der Schwellung der Pfote (AUC), keine Inhibition der Änderung des Gewichts der Milz (nicht gezeigt) und 3% Inhibition der Änderung des Gewichts des Körpers (nicht gezeigt). Die Kombinationstherapie bot eine 75 %ige Inhibition der Schwellung der Pfote (AUC), eine 48 %ige Inhibition der Splenomegalie (nicht gezeigt) und eine 16,2%ige Inhibition der Änderung des Körpergewichts (nicht gezeigt).
Wie in 5 gezeigt, deutet die abschließende Analyse (Inhibition am Ende) der terminalen Gewichte der Pfote und der Milz an, dass c105 sTNFR-I in Hantelform alleine in einer 10,9 %igen Inhibition der Entzündung der Pfote resultierte, in einer 30,4%igen Inhibition der Splenomegalie und in einer 13,2%igen Inhibition der Änderung des Körpergewichts (nicht gezeigt). Die Methotrexatbhandlung alleine ergab ausschließlich eine 3,9%ige Inhibition der Entzündung der Pfote, eine 8,5%ige Inhibition der Splenomegalie und eine 3%ige Inhibition der Änderung des Körpergewichts (nicht gezeigt). Die Kombination von c105 sTNFR-I in Hantelform und Methotrexat ergab eine 46,8%ige Inhibition der Schwellung der Pfote, eine 48%ige Inhibition des Splenomegalie und eine 16,2%ige Inhibition der Änderung des Körpergewichts (nicht gezeigt).
Beispiel 2
Es wurde ein Tiermodell der rheumatoiden Arthritis verwendet, welches durch ein Adjuvans induziert wurde, um die Kombinationstherapie eines TNF-Bindungsproteins und Methotre xat in männlichen Lewis-Ratten (5–7/Gruppe) zu untersuchen, welche mindestens 200 g wogen.
Am Tag 0 wurden allen Ratten 100 μl Freundsches vollständiges Adjuvans (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), injiziert, zu welchem ein synthetisches Adjuvans, N,N-Dioctyldecyldecyl-N', N-bis(2-hydroxy-ethyl)propandiamin, 50 mg/ml zugegeben wurde. Am Tag 0–14 wurde Methotrexat in 1%iger Carboxymethylcellulose (Sigma) täglich oral (0,06 mg/kg) zwei Gruppen von Ratten verabreicht. An den Tagen 9, 11 und 13 wurde von CHO- abgeleitetes sTNFR-II/hlgG1-Fusionsprotein (sTNFR-II Fc; im Allgemeinen in Übereinstimmung mit der Lehre von EP 418 014 hergestellt) welches in eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert ist (34 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 4% Sorbitol (Gew.-%) in Wasser; pH 6,5) durch subkutane Injektion (18 mg/kg) einer Gruppe an Ratten verabreicht, die beiderseits mit Freundschem vollständigen Adjuvans und Methotrexat behandelt wurden, und einer anderen Gruppe an Ratten, welche mit Freundschem vollständigen Adjuvans alleine behandelt wurden.
Die Körpergewichte wurden am Tag 0 und an jedem anderen Tag beginnend von Tag 9 bis zum Ende am Tag 15 bestimmt.
Die Bestimmungen mit einem Greifzirkel und eine klinische Bewertung wurden täglich von Tag 9 bis Beendigung am Tag 15 durchgeführt. Zu diesem Zeitpunkt wurden die Gewichte des Körpers, der Pfoten und der Milz des Tieres bestimmt.
Wie aus 6 ersichtlich, zeigten Ratten, welche mit sTNFR-II Fc alleine behandelt wurden, etwa 8 % Inhibition der Schwellung und der Pfote (Bereich unter der Kurve – AUC) ohne eine signifikante Verbesserung der Splenomegalie (–7%) oder der Änderung des Körpergewichts (–5%). Die Ratten, welche mit Methotrexat behandelt wurden, zeigten 66% Inhibitionen der Schwellung der Pfote (AUC), eine 74%ige Inhibition des Gewichts der Milz und eine 64%ige Inhibition der Änderung des Körpergewichts. Die Kombinationstherapie führt zu einer 96%igen Inhibition der Schwellung der Pfote (AUC), einer 94%igen Inhibition der Splenomegalie und einer 79%igen Inhibition der Änderung des Körpergewichts.
Wie aus 7 ersichtlich, deutet die abschließende Analyse (Inhibition am Ende) der abschließenden Pfotengewichte an, dass sTNFR-II Fc alleine in einer 10%igen Inhibition der Entzündung der Pfote resultiert, eine Methotrexatbehandlung alleine zu einer 74%igen Inhibition der Entzündung der Pfote führt und die Kombination von sTNFR-II Fc und Methotrexat in einer 88%igen Inhibition der Schwellung der Pfote resultiert.
Beispiel 3
Die Kombination immunotherapeutischer Effekte von c105 sTNFR-I in Hantelform und Fusionsprotein wurden unter Verwendung eines Mausmodells der D-Galactosamin (D-GalNH₂) induzierten Lethalität beurteilt. Das D-Galactosamin (D-GalNH₂)/Lipopolysaccharid (LPS)-Modell (Mountz et al., J. Immunology, 155: 4829–4837). In diesem Modell wurden MRL-Ipr/Ipr-Autoimmunmäusen D-GalNH₂ zusammen mit bakte5riellem Endotoxin (LPS) verabreicht, und die Lethalität wurde während der + 96 Stunden nach der Verabreichung beobachtet.
Material und Methoden:
Dihydrofolatreduktase (DHFR) defiziente Eierstockzellen aus chinesischen Hamstern (chinese hamster ovary cells, CHOd-Zellen) wurden mit fas/hlgG1 chimärer cDNA (Mountz, et al. (1996), "Autoimmunity Due to Defective Nur-77, Fas and TNF-R1 Apoptosis" in Mechanisms of Lymphocyte Activation and Immune Regulation, Bd. 6, Seiten 241–262 (Gupta und Cohen (Hrsg.)) Plenem Press, NY) in pDSRα2 transfiziert, allgemein in Übereinstimmung mit der Beschreibung von DeClerck et al. (1991), JCB, 266: 3893–3899. Das Transfektionsverfahren unterschied sich von dem Protokoll in DeClerck et al. (1991), siehe oben, wie folgt: die Zellen wurden mit 800000 Zellen transfiziert, mit 10 Mikrogramm und 8 Mikrogramm an Heringssperma als Träger, und die Zellen wurden am Tag 2 nach der Transfektion aufgeteilt.
Nach der Expression des fas-Fusionsproteins wurde das Protein unter Verwendung einer Protein G Sepharose Fast Flow-Säule im Allgemeinen in Übereinstimmung mit Jungbauer et al. (1989), J. Chrom., 476: 257–268 aufgereinigt. Das aufgereinigte Protein wurde in Phosphat-gepufferter Salzlösung (Gibco BRL, Grand Island, NY) formuliert.
Protokoll:
Nach Fasten über Nacht wurde in 6–8 Wochen alte weibliche MRL-Ipr/Ipr-Mäuse (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) (5/7/Gruppe) eine Kanüle mit Halskatheter eingeführt und man lies sich die Mäuse ein paar Tage erholen. Sie wurden anschließend in Infusionskäfige gesetzt und für eine Woche vor Initiierung der Salzlösungsinfusion akklimatisiert.
Bei Stunde 0 wurde allen Mäusen intraperitoneal 31 Mikrogramm D-GalNH₂ (Sigma) intraperitoneal injiziert, welches in Hank's ausgeglichener Salzlösung (Hanks's Balanced Salt Solution, Gibco BRL) (120 Mikrogramm/ml) suspendiert wurden; und Lipopolysaccharid (LPS) aus E. coli Serotyp 0127:B8 (Sigma) in einer sterilen, Endotoxin-freien Phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) (6 Mikrogramm/Maus).
Bei Stunde 0 + 2 Stunden nach Verabreichung wurde fas-Fusionsprotein, welches in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert wurde (Phosphat-gepufferte Salzlösung, (Gibco BRL, Grand Islan, NY)) intravenös in zweifach seriellen Verdünnungen (Mikrogramm/kg Dosierungen) zwei Gruppen von Mäusen verabreicht.
Bei Stunde 0 + 2 Stunden nach Verabreichung wurde c105 sTNFR-I in Hantelform, das in in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert ist (34 mM NaCl, 10 mM Natriumphosphat, 4% Sorbitol (Gew.-%) in Wasser; pH 6,5) intravenös in 2-fach seriellen Verdünnungen (Mikrogramm/kg Dosierungen) einer Gruppe von Mäusen verabreicht, welche mit beiderseits D GalNH₂ und fas-Fusionsprotein behandelt wurden und einer anderen Gruppe von Mäusen, welche mit d-GalNH₂ alleine behandelt wurde.
ED₅₀-Kurven wurden mit statistischer Software für Macintosh (Statiview^®, Mountain View, CA) erstellt. Die Lethalität folgte innerhalb + 96 Stunden nach Verabreichung.
Ergebnisse:
Wie aus 8 ersichtlich, wurde bei Mäusen, welchen c105 sTNFR-I in Hantelform (100 Mikrogramm/kg; N = 6; I. V.) verabreicht wurden, zum Zeitraum –1 Stunde vor Venrwendung ein vollständiger Schutz (10% Überlebensrate) gegen LPS-Behandlung im Vergleich zu Kontrollmäusen beobachtet (mit Salzlösung behandelt) (N = 6), welchen LPS-D-GalNH₂ (P < 0,01) gegeben wurde. Bei Mäusen, die mit suboptimalen Dosen von c105 sTNFR-I in Hantelform (25 Mikrogramm/kg; N = 6) behandelt wurden, wurde beobachtet, dass sie einen ungefähr 35 %igen Schutz während + 96 Stunden nach Verabreichung besitzen. Alle Mäuse, welche mit fas-Fusionsprotein (100 Mikrogramm/kg; N = 6) behandelt wurden, waren +24 Stunden nach Verabreichung tot. Wenn Mäuse (N = 6) LV. mit beiderseits c105 sTNFR-I in Hantelform (25 Mikrogramm/kg) und fas-Fusionsprotein (100 Mikrogramm/kg) behandelt wurden, wurde gleichwohl eine gesteigerte Überlebensrate (70%) während + 36 Stunden beobachtet im Vergleich zu entweder den c105 sTNFR-I in Hantelform behandelten (25 Mikrogramm) Mäusen, den mit fas-Fusionsprotein (100 Mikrogramm/kg) behandelten Mäusen oder den Kontrolltieren für diese Erkrankung alleine (P < 0,05). Diese Ergebnisse legen nahe, dass c105 sTNFR-I in Hantelform und fas-Fusionsprotein in ihren therapeutischen Effekten in LPS/D-GalNH₂-Modell der akuten Entzündung synergistisch wirken.
Die vorangegangene Beschreibung der Erfindung ist beispielhaft zum Zwecke der Beschreibung und Erklärung.
Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung eines COX2 Inhibitors für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer TNF-vermittelten Erkrankung in einem Patienten in Kombination mit der vorherigen, gleichzeitigen, oder anschließenden Verabreichung eines TNF-Bindungsproteins.
Verwendung eines TNF-Bindungsproteins für die Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung einer TNF-vermittelten Erkrankung in einem Patienten in Kombination mit der vorherigen, gleichzeitigen, oder anschließenden Verabreichung eines COX2 Inhibitors.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, wobei der COX2-Inhibitor Celecoxib ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 und 3, wobei die TNF-vermittelte Erkrankung eine akute oder chronische entzündliche Erkrankung ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 80% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 90% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 95% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 99% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Aminosäure umfasst, die eine Sequenz von SEQ ID NO: 2 besitzt.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine N-terminale oder C-terminale Deletionsvariante von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein nicht glykosiliert ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein glykosiliert ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 5 bis 12, wobei eine zusätzliche Aminosäure an die Sequenz SEQ ID NO: 2 addiert wird und die zusätzliche Aminosäure ein N-terminales Methionin ist, das die Positionsnummer „0" besitzt.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein durch rekombinante DNA-Verfahren hergestellt wird.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die genannte entzündliche Erkrankung eine entzündliche Erkrankung eines Gelenkes ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die genannte entzündliche Erkrankung rheumatoide Arthritis ist.
Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein ein chemisch modifiziertes Derivat davon ist.
Eine Dosiseinheit, umfassend einen COX2-Inhibitor und ein TNF-Bindungsprotein für die Behandlung einer TNF-vermittelten Erkrankung in einem Patienten, wobei die genannte Dosiseinheit die Verabreichung des COX2-Inhibitors vorher, gleichzeitig, oder anschließend and die Verabreichung des TNF-Bindungsproteins erlaubt.
Eine Dosiseinheit, umfassend ein TNF-Bindungsprotein und einen COX2-Inhibitor für die Behandlung einer TNF-vermittelten Erkrankung in einem Patienten, wobei die genannte Dosiseinheit die Verabreichung des TNF-Bindungsproteins vorher, gleichzeitig, oder anschließend and die Verabreichung des COX2 Inhibitors erlaubt.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 19, wobei der COX2-Inhibitor Celecoxib ist.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei die TNF-vermittelte Erkrankung eine akute oder chronische entzündliche Erkrankung ist.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 80% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 90% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 95% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 99% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 25, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Aminosäure umfasst, die eine Sequenz von SEQ ID NO: 2 besitzt.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 26, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine N-terminale oder C-terminale Deletionsvariante von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 27, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein nicht glykosiliert ist.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 27, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein glykosiliert ist.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 22 bis 29, wobei eine zusätzliche Aminosäure an die Sequenz SEQ ID NO: 2 addiert wird und die zusätzliche Aminosäure ein N-terminales Methionin ist, das die Positionsnummer „0" besitzt.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 30, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein durch rekombinante DNA Verfahren hergestellt wird.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 31, wobei die genannte entzündliche Erkrankung eine entzündliche Erkrankung eines Gelenkes ist.
Die Dosiseinheit gemäß einem der Ansprüche 18 bis 31, wobei die genannte entzündliche Erkrankung rheumatoide Arthritis ist.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein TNF-Bindungsprotein oder ein chemisch modifiziertes Derivat davon und einen COX2-Inhibitor für die Behandlung einer TNF-vermittelten Erkrankung in einem Patienten.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 34, wobei der COX2-Inhibitor Celecoxib ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 35, wobei die TNF-vermittelte Erkrankung eine akute oder chronische entzündliche Erkrankung ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 36, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 80% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 36, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 90% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 36, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 95% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 36, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Sequenz umfaßt, die mindestens etwa 99% homolog zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 oder zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 40, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine Aminosäure umfasst, die eine Sequenz von SEQ ID NO: 2 besitzt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 41, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein eine N-terminale oder C-terminale Deletionsvariante von SEQ ID NO: 2 umfasst.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 42, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein nicht glykosiliert ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 42, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein glykosiliert ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 37 bis 44, wobei eine zusätzliche Aminosäures an die Sequenz SEQ ID NO: 2 addiert wird und die zusätzliche Aminosäure ein N-terminales Methionin ist, das die Positionsnummer „0" besitzt.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 45, wobei das genannte TNF-Bindungsprotein durch rekombinante DNA Verfahren hergestellt wird.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 46, wobei die genannte entzündliche Erkrankung eine entzündliche Erkrankung eines Gelenkes ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 34 bis 46, wobei die genannte entzündliche Erkrankung rheumatoide Arthritis ist.