DE69934425T2

DE69934425T2 - Thrombopoietin substitute

Info

Publication number: DE69934425T2
Application number: DE1999634425
Authority: DE
Inventors: Chuan-Fa Longmont LIU; Ulrich Newbury Park FEIGE; Janet Montecito CHEETHAM
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen K A Inc
Priority date: 1998-10-23
Filing date: 1999-10-22
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2019-10-23
Also published as: LTC1124961I2; EP2319928B9; CN1325447A; NL300398I1; CY2009012I1; EA003998B1; US20090186822A1; SK287737B6; CY1107526T1; DK1783222T3; CY1114940T1; DE122009000039I1; DK1124961T3; CN1250721C; JP3820105B2; BG66190B1; CY1113107T1; CA2346996C; HK1093075A1; EP1124961B1

Description

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der U.S.-Provisional-Anmeldung Nr. 06/105,348, die am 23. Oktober 1998 eingereicht worden ist.
GEBIET DER ERFINDUNG
Im Allgemeinen betrifft die Erfindung das Gebiet von Verbindungen, insbesondere Peptiden und Polypeptiden, die eine thrombopoietische Aktivität haben. Die Verbindungen der Erfindung können dazu verwendet werden, um die Produktion von Blutplättchen oder Blutplättchen-Vorläufern (z. B. Megakaryocyten) in einem Säugetier zu erhöhen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verbindungen, insbesondere Peptide, die die Fähigkeit haben, in-vitro und in-vivo die Produktion von Blutplättchen und ihren Vorläuferzellen, wie etwa Megakaryocyten, zu stimulieren. Vor einer Diskussion der Natur der erfinderischen Verbindungen wird das Folgende als ein Hintergrund im Hinblick auf zwei Proteine dargestellt, die thrombopoietische Aktivität haben: Thrombopoietin (TPO) und Megakaryocyten-Wachstums- und -Entwicklungsfaktor(MGDF).
Die Klonierung von endogenem Thrombopoietin (TPO) (Lok et al., Nature 369: 568–571 (1994); Bartley et al., Cell 77: 1117–1124 (1994); Kuter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11104–11108 (1994); de Sauvage et al., Nature 369: 533–538 (1994); Kato et al., Journal of Biochemistry 119: 229–236 (1995); Chang et al., Journal of Biological Chemistry 270: 511–514 (1995)) hat unser Verständnis der Megakaryopoiese (Megakaryocytenproduktion) und Thrombopoiese (Blutplättchenproduktion) rasch erhöht.
Endogenes humanes TPO, ein 60- bis 70-kDa-glykosyliertes Protein, das hauptsächlich in der Leber und der Niere produziert wird, besteht aus 332 Aminosäuren (Bartley et al., Cell 77: 1117–1124 (1994); Chang et al., Journal of Biological Chemistry 270: 511–514 (1995)). Das Protein ist zwischen verschiedenen Spezies stark konserviert und hat 23% Homologie mit humanem Erythropoietin (Gurney et al., Blood 85: 981–988 (1995)) am Aminoterminus (Aminosäuren 1 bis 172) (Bartley et al., Cell 77: 1117–1124 (1994)). Es ist gezeigt worden, daß endogenes TPO alle Eigenschaften des biologischen Schlüsselregulators der Thrombopoiese hat. Seine in-vitro-Wirkungen schließen die spezifische Induktion von Megakaryocytenkolonien aus sowohl aufgereinigten murinen hämatopoietischen Stammzellen (Zeigler et al., Blood 84: 4045–4052 (1994)) als auch humanen CD34⁺-Zellen (Lok et al., Nature 369: 568–571 (1994); Rasko et al., Stem Cells 15: 33–42 (1997)), die Erzeugung von Megakaryocyten mit erhöhter Ploidie (Broudy et al., Blood 85: 402–413 (1995)) und die Induktion von terminaler Megakaryocytenreifung und Blutplättchenproduktion (Zeigler et al., Blood 84: 4045–4052 (1994); Choi et al., Blood 85: 402–413 (1995)) ein. Umgekehrt inhibieren synthetische Antisense-Oligodeoxynukleotide auf den TPO-Rezeptor (c-Mpl) in signifikanter Weise die koloniebildende Fähigkeit von Megakaryocyten-Progenitoren (Methia et al., Blood 82: 1395–1401 (1993)). Darüber hinaus sind c-Mpl-knock-out-Mäuse stark thrombocytopenisch und haben einen Mangel an Megakaryocyten (Alexander et al., Blood 87: 2162–2170 (1996)).
Rekombinanter humaner MGDF (rHuMGDF, Amgen Inc., Thousand Oaks, CA) ist ein weiteres thrombopoietisches Polypeptid, das mit TPO verwandt ist. Es wird erzeugt unter Verwendung von E. coli, das mit einem Plasmid transformiert worden ist, enthaltend cDNA die für ein trunkiertes Protein kodiert, das die amino-terminale Rezeptorbindungsdomäne von humanem TPO umfaßt (Ulich et al., Blood 86: 971–976 (1995)). Das Polypeptid wird extrahiert, zurückgefaltet und aufgereinigt, und eine Poly[ethylenglykol] (PEG)-Gruppe wird kovalent an den Amino-Terminus angehängt. Das resultierende Molekül wird hierin als PEG-rHuMGDF oder, kurz, MGDF bezeichnet.
Verschiedene Studien unter Verwendung von Tiermodellen (Ulich, T. R. et al., Blood 86: 971–976 (1995); Hokom, M. M. et al., Blood 86: 4486–4492 (1995)) haben deutlich die therapeutischen Wirksamkeiten von TPO und MGDF bei der Knochenmarkstransplantation und bei der Behandlung von Thrombocytopenie gezeigt, einem Zustand, der oft aus einer Chemotherapie oder einer Bestrahlungstherapie resultiert. Vorläufige Daten bei Menschen haben die Nützlichkeit von MGDF bei der Erhöhung der Blutplättchenzahlen in verschiedenen Umgebungen bestätigt (Basser et al., Lancet 348: 1279–81 (1996); Kato et al., Journal of Biochemistry 119: 229–236 (1995); Ulich et al., Blood 86: 971–976 (1995)). MGDF könnte verwendet werden, um das Blutplättchenspendeverfahren zu verbessern, da die Verabreichung von MGDF die Zahlen zirkulierender Blutplättchen auf ungefähr das Dreifache des ursprünglichen Wertes bei gesunden Blutplättchenspendern erhöht.
TPO und MGDF üben ihre Wirkung durch Bindung an den c-Mpl-Rezeptor aus, der hauptsächlich auf der Oberfläche von bestimmten hämatopoietischen Zellen exprimiert wird, wie etwa Megakaryocyten, Blutplättchen, CD34⁺-Zellen und primitiven Progenitor-Zellen (Debili, N. et al., Blood 85: 391–401 (1995); de Sauvage, F. J. et al., Nature 369: 533–538 (1994); Banley, T. D. et al., Cell 77: 1117–1124 (1994); Lok, S. et al., Nature 369: 565–8 (1994)). Wie die meisten Rezeptoren für Interleukine und Proteinhormone gehört c-Mpl zur Klasse-I-Cytokin-Rezeptor-Superfamilie (Vigon, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5640–5644 (1992)). Eine Aktivierung dieser Klasse von Rezeptoren beinhaltet eine Ligandenbindungs-induzierte Rezeptor-Homodimerisierung, die wiederum die Kaskade von Signal-transduzierenden Ereignissen auslöst.
Im Allgemeinen findet die Interaktion eines Proteinliganden mit seinem Rezeptor oft an einer relativ großen Schnittstelle statt. Jedoch tragen, wie im Falle von humanem Wachstumshormon, das an seinen Rezeptor gebunden ist, gezeigt wurde, nur einige wenige Schlüsselreste an der Schnittstelle tatsächlich zu dem Hauptteil der Bindungsenergie bei (Clackson, T. et al., Science 267: 383–386 (1995)). Dies und die Tatsache, daß der Hauptteil des verbleibenden Proteinliganden nur dazu dient, die Bindungsepitope in der richtigen Topologie darzubieten, macht es möglich, aktive Liganden von viel geringerer Größe zu finden.
Bei den hierzu angestellten Bemühungen hat sich das Phagen-Peptid-Bibliothek-Display-System als eine starke Technik beim Identifizieren von kleinen Peptid-Mimetika von großen Proteinliganden herausgestellt (Scott, J. K. et al., Science 249: 386 (1990); Devlin, J. J. et al., Science 249: 404 (1990)). Unter Verwendung dieser Technik wurden kleine Peptidmoleküle entdeckt, die als Agonisten des c-Mpl-Rezeptors fungieren (Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696–1699 (1997)).
In einer solchen Studie wurden kleine Peptid-Zufallssequenzen, die als Fusion mit den Hüllproteinen eines filamentösen Phagen dargeboten wurden, Affinitäts-eluiert gegen die Antikörper-immobilisierte extrazelluläre Domäne von c-Mpl, und die zurückgehaltenen Phagen wurden in einer zweiten Affinitätsaufreinigungsrunde angereichert. Dieser Bindungsselektions- und Repropagationsprozess wurde viele Male wiederholt, um den Pool von Molekülen, die stärker binden, anzureichern. Als ein Ergebnis wurden zwei Familien von c-Mpl-bindenden Peptiden, die in ihren Sequenzen nicht miteinander verwandt waren, als erstes identifiziert. Mutagenese-Bibliotheken wurden dann erzeugt, um die besten bindenden Moleküle weiter zu optimieren, was schließlich zur Isolierung eines sehr aktiven Peptids mit einer IC₅₀ = 2 nM und einer EC₅₀ = 400 nM führte (Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696–1699 (1997)). Dieses 14-Rest-Peptid, bezeichnet als ein TMP (für TPO-mimetisches Peptid) hat keine offensichtliche Sequenzhomologie mit TPO oder MGDF. Die Struktur dieser TMP-Verbindung ist folgendermaßen:
Ile Glu Gly Pro Thr Leu Arg Gln Trp Leu Ala Ala Arg Ala SEQ ID NO:1
oder
IEGPTLRQWLAARA
unter Verwendung von Einbuchstaben-Aminosäure-Abkürzungen.
Zuvor wurde in einer ähnlichen Studie an EPO-mimetischen Peptiden ein EPO-mimetisches Peptid (EMP) unter Verwendung derselben Technik entdeckt (Wrighton, N. C. et al., Science 273: 458–463 (1996)), und es wurde gefunden, daß es als Dimer bei der Bindung an den EPO-Rezeptor (EPOR) fungiert. Der (Ligand)₂/(Rezeptor)₂-Komplex, der so gebildet wurde, hatte eine C2-Symmetrie gemäß Röntgen-kristallographischen Daten (Livnah, O. et al., Science 273: 464–471 (1996)). Basierend auf dieser strukturellen Information wurde ein kovalent verbundenes Dimer von EMP, bei dem die C-Termini der zwei EMP-Monomere mit einem flexiblen Spacer quervernetzt waren, entworfen, und es wurde gefunden, daß es eine stark verbesserte Bindung, ebenso wie eine in-vitro/in-vivo-Bioaktivität hat (Wrighton, N. C. et al., Nature Biotechnology 15: 1261–1265 (1997)).
Eine ähnliche C-terminate Dimerisierungsstrategie wurde auf das TPO-mimetische Peptid (TMP) (Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696–1699 (1997)) angewandt. Es wurde gefunden, daß ein C-terminal verknüpftes Dimer (C-C-Verbindung) von TMP eine verbesserte Bindungsaffinität von 0,5 nM und eine merkbar verbesserte in-vitro-Aktivität (EC₅₀ = 0,1 nM) in Zellproliferationsassays hatte (Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696–1699 (1997)). Die Struktur dieses TMP-C-C-Dimer wird unten gezeigt:
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung können die Tandem-Dimere weiter an eine oder mehrere Gruppen angehängt sein, die aus Immunglobulinproteinen stammen, die im Allgemeinen als die Fc-Region solcher Immunglobuline bezeichnet werden. Die resultierenden Verbindungen werden als Fc-Fusionen von TMP-Tandem-Dimeren bezeichnet.
Das Folgende ist ein kurzer Hintergrundsabschnitt im Hinblick auf die Fc-Regionen von Antikörpern, die in Verbindung mit einigen der vorliegenden Verbindungen nützlich sind.
Antikörper umfassen zwei funktionell unabhängige Teile, eine variable Domäne, die als „Fab" bekannt ist, die das Antigen bindet, und eine konstante Domäne, die als „Fc" bekannt ist, die die Verbindung zu Effektor-Funktionen herstellt, wie etwa Komplement-Fixierung oder Phagocytose. Der Fc-Teil eines Immunglobulins hat eine lange Plasma-Halbwertszeit, während das Fab kurzlebig ist (Capon, et al., Nature 337: 525–531 (1989)).
Therapeutische Proteinprodukte sind unter Verwendung der Fc-Domäne konstruiert worden, um zu versuchen, eine längere Halbwertszeit bereitzustellen, oder um Funktionen einzubauen, wie etwa Fc-Rezeptor-Bindung, Protein-A-Bindung, Komplementfixierung und Placentatransfer, die alle in der Fc-Region der Immunglobuline liegen ((Capon, et al., Nature 337: 525–531 (1989)). Zum Beispiel ist die Fc-Region eines IgG1-Antikörpers mit CD30-L fusioniert worden, einem Molekül, das an CD30-Rezeptoren bindet, die auf Hodgkin-Tumor-Zellen, anaplastischen Lymphomzellen, T-Zell-Leukämiezellen und anderen malignen Zelltypen exprimiert werden. Siehe U.S.-Patent Nr. 5,480,981. IL-10, ein anti-entzündliches und Anti-Abstoßungs-Mittel ist mit murinem Fcγ2a fusioniert worden, um die kurze Kreislauf-Halbwertszeit des Cytokins zu verbessern (Zheng, X. et al., The Journal of Immunology, 154: 5590–5600 (1995)). Studien haben ebenso die Verwendung von Tumornekrosefaktor- Rezeptor bewertet, der mit dem Fc-Protein vom humanem IgG1 verknüpft war, um Patienten mit einem septischen Schock zu behandeln (Fisher, C. et al., N. Engl. J. Med., 334: 1697–1702 (1996); Van Zee, K. et al., The Journal of Immunology, 156: 2221–2230 (1996)). Fc ist auch mit CD4-Rezeptor fusioniert worden, um ein therapeutisches Protein zur Behandlung von AIDS zu erzeugen. Siehe Capon et al., Nature, 337: 525–531 (1989). Zusätzlich ist Interleukin-2 mit dem Fc-Teil von IgG1 oder IgG3 fusioniert worden, um die kurze Halbwertszeit von Interleukin-2 und seine systemische Toxizität zu überwinden. Siehe Harvill et al., Immunotechnology, 1: 95–105 (1995).
Trotz der Verfügbarkeit von TPO und MGDF bleibt ein Bedarf, zusätzliche Verbindungen bereitzustellen, die eine biologische Aktivität zum Stimulieren der Erzeugung von Blutplättchen (thrombopoietische Aktivität) und/oder von Blutplättchen-Vorläuferzellen, insbesondere Megakaryocyten (megakaryopoietische Aktivität) zu stimulieren. Die vorliegende Erfindung stellt neue Verbindungen mit einer solchen Aktivität (solchen Aktivitäten) und verwandte Aspekte bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Gruppe von Verbindungen bereit, die in der Lage sind, an ein Transmembransignal zu binden und es auszulösen, d. h. den c-Mpl-Rezeptor zu aktivieren, der derselbe Rezeptor ist, der die Aktivität von endogenem Thrombopoietin (TPO) vermittelt. Daher haben die erfinderischen Verbindungen eine thrombopoietische Aktivität, d. h. die Fähigkeit, in-vivo und in-vitro die Produktion von Blutplättchen und/oder megakaryocytopoietische Aktivität, d. h. die Fähigkeit, in-vivo und in-vitro, die Produktion von Blutplättchen-Vorläufern zu stimulieren.
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfinderischen Verbindungen die folgende allgemeine Struktur: TMP₁-(L₁)_n-TMP₂ wobei TMP₁ und TMP₂ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe von Verbindungen, umfassend die Kernstruktur: X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀, wobei
X₂ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glu, Asp, Lys und Val;
X₃ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gly und Ala;
X₄ Pro ist;
X₅ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Thr und Ser;
X₆ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Leu, Ile, Val, Ala und Phe;
X₇ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Arg und Lys;
X₈ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gln, Asn und Glu;
X₉ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Trp, Tyr, Cys, Ala und Phe;
X₁₀ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met und Lys;
L₁ ein Linker, wie hierin beschrieben, ist; und
n 0 oder 1 ist;
und physiologisch akzeptable Salze davon.
In einer Ausführungsform umfasst L₁ (Gly)_n, wobei n von 1 bis 20 ist, und wenn n größer als 1 ist, können bis zur Hälfte der Gly-Reste durch eine andere Aminosäure substituiert sein, ausgewählt aus den verbleibenden 19 natürlichen Aminosäuren oder einem Stereoisomer davon.
Zusätzlich zu der Kernstruktur X₂–X₁₀, oben dargestellt für TMP₁ und TMP₂, sind auch andere verwandte Strukturen möglich, bei denen eines oder mehrere der Folgenden zu der TMP₁- und/oder der TMP₂-Kernstruktur zugegeben wird: X₁ wird an den N-Terminus angehängt, und/oder X₁₁, X₁₂, X₁₃ und/oder X₁₄ werden an den C-Terminus angehängt, wobei X₁, X₁₂, X₁₃ und X₁₄ folgendermaßen sind:
X₁ ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ile, Ala, Val, Leu, Ser und Arg;
X₁₁ ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His und Glu;
X₁₂ ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser und Gln;
X₁₃ ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln und Gly;
X₁₄ ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu und Gly.
In einer zweiten bevorzugten Ausführungsform haben die erfinderischen Verbindungen die allgemeine Formel: (Fc)_m-(L₂)_q-TMP₁-(L₁)_n-TMP₂-(L₃)_r-(Fc)_p wobei TMP₁, TMP₂ und n jeweils wie oben beschrieben sind; L₁, L₂ und L₃ sind Linker-Gruppen, die unabhängig ausgewählt sind aus den Linker-Gruppen, die hierin beschrieben sind; Fc ist eine Fc-Region eines Immunglobulins (wie hierin unten definiert); m, p, q und r sind jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 0 und 1, wobei wenigstens eines von m oder p 1 ist, und wobei weiter, wenn m 0 ist, dann ist q 0, und wenn p 0 ist, dann ist r 0; und physiologisch akzeptable Salze davon. In einer Ausführungsform umfassen L₁, L₂ und L₃ unabhängig (Gly)_n, wobei n 1 bis 20 ist, und wenn n größer als 1 ist, können bis zur Hälfte der Gly-Reste durch eine andere Aminosäure substituiert sein, ausgewählt aus den verbleibenden 19 natürlichen Aminosäuren oder einem Stereoisomer davon.
Derivate der obigen Verbindungen (unten beschrieben) werden ebenfalls durch diese Erfindung umfaßt.
Dei Verbindungen dieser Erfindung sind bevorzugt Peptide, und sie können mittels synthetischen Standardverfahren oder beliebigen anderen Verfahren zum Herstellen von Peptiden hergestellt werden. Die Verbindungen dieser Erfindung, die Nicht-Peptid-Teile umfassen, können mit Standardreaktionen der organischen Chemie synthetisiert werden, zusätzlich zu Standardreaktionen der Peptidchemie, sofern anwendbar.
Die Verbindungen dieser Erfindung können zu therapeutischen oder prophylaktischen Zwecken durch Einbau in geeignete pharmazeutische Trägermaterialien und durch Verabreichung einer wirksamen Menge an einen Patienten verwendet werden, wie etwa einem Menschen (oder einem anderen Säugetier). Andere verwandte Aspekte sind ebenfalls in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Zahlreiche andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden deshalb unter Berücksichtigung der folgenden detaillierten Beschreibung deutlich werden, wobei Bezug genommen wird auf die Zeichnungen, bei denen:
1 beispielhafte Fc-Polynukleotid- und Protein-Sequenzen (SEQ ID NO:3 ist der kodierende Strang mit Leserichtung 5'→3', SEQ ID NO:4 ist der komplementäre Strang mit Leserichtung 3'→5'; und SEQ ID NO:5 ist die kodierte Aminosäuresequenz) von humanem IgG1 zeigt, das bei den Fc-Fusionsverbindungen dieser Erfindung verwendet werden kann.
2 zeigt ein synthetisches Schema zur Herstellung von pegyliertem Peptid 19 (SEQ ID NO:17).
3 zeigt ein synthetisches Schema zur Herstellung von pegyliertem Peptid 20 (SEQ ID NO:18).
4 zeigt die Anzahl an Blutplättchen, die in-vivo in normalem weiblichen BDF1-Mäusen erzeugt worden ist, die mit einer 100 μg/kg-Bolusinjektion verschiedener Verbindungen behandelt worden sind, wie folgt: PEG-MGDF bedeutet ein PEG mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 20 kD, angehängt an die N-terminale Aminogruppe mittels reduktiver Aminierung von Aminosäuren 1–163 von nativem humanem TPO, das in E. coli exprimiert wird (so daß es nicht glykosyliert ist) (Siehe WO 95/26746 mit dem Titel „Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation"); TMP bedeutet die Verbindung von SEQ ID NO:1; TMP-TMP bedeutet die Verbindung von SEQ ID NO: 21; PEG-TMP-TMP bedeutet die Verbindung von SEQ ID NO:18, wobei die PEG-Gruppe ein PEG mit durchschnittlichem Molekulargewicht von 5 kD bedeutet, angehängt, wie in 3 gezeigt; TMP-TMP-Fc wird hierin unten definiert, und Fc-TMP-TMP ist dasselbe wie TMP-TMP-Fc, außer daß die Fc-Gruppe am N-terminalen Ende statt am C-terminalen Ende des TMP-TMP-Peptids angehängt ist.
5 zeigt die Anzahl an Blutplättchen, die in-vivo in normalen BDF1-Mäusen erzeugt worden sind, die mit verschiedenen Verbindungen behandelt worden sind, die über implan tierte osmotische Pumpen über eine 7-tägige Periode abgegeben werden. Die Verbindungen werden auf dieselbe Weise definiert, wie oben für 4 dargelegt.
6A, 6B und 6C zeigen schematische Diagramme von bevorzugten Verbindungen der vorliegenden Erfindung. 6A zeigt eine Fc-Fusionsverbindung, bei der die Fc-Gruppe am N-Terminus des TMP-Dimers fusioniert ist, und wobei der Fc-Teil eine monomere (Einzelketten)-Form ist. 6B zeigt eine Fc-Fusionsverbindung, bei der die Fc-Region am N-Terminus des TMP-Dimers fusioniert ist, und bei der der Fc-Teil Dimer ist, und ein Fc-Monomer ist an ein TMP-Dimer angehängt. 6C zeigt eine Fc-Fusionsverbindung, bei der die Fc-Gruppe am N-Terminus des TMP-Dimers fusioniert ist, und bei der der Fc-Teil Dimer ist und jedes Fc-Monomer an ein TMP-Dimer angehängt ist.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
In einem Versuch, kleine Strukturen als Lead-Verbindungen zur Entwicklung von therapeutischen Mitteln mit stärker erwünschten Eigenschaften zu suchen, wurden ein unterschiedlicher Typ Dimer des TMP und verwandte Strukturen konstruiert, bei denen der C-Terminus eines TMP-Peptids mit dem N-Terminus eines zweiten TMP-Peptids, entweder direkt oder über einen Linker, verknüpft war, und die Effekte dieser Dimerisierungsstrategie auf die Bioaktivität der resultierenden dimeren Moleküle wurde dann untersucht. In einigen Fällen wurden diese sogenannten Tandem-Dimere (C-N-Verknüpfung) dahingehend konstruiert, daß sie Linker zwischen den beiden Monomeren hatten, wobei die Linker bevorzugt aus natürlichen Aminosäuren zusammengesetzt waren, was deshalb ihre Synthese gegenüber rekombinanten Technologien zugänglich machte.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung einer Gruppe von Verbindungen, die eine thrombopoietische Aktivität haben, und von denen gedacht wird, daß sie ihre Aktivität durch Bindung an den endogenen TPO-Rezeptor, c-Mpl, ausüben.
Verbindungen und Derivate
In einer ersten bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfinderischen Verbindungen die folgende allgemeine Struktur: TMP₁-(L₁)_n-TMP₂ wobei TMP₁ und TMP₂ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe von Verbindungen, umfassend die Kernstruktur: X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀, wobei
X₂ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glu, Asp, Lys und Val;
X₃ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gly und Ala;
X₄ Pro ist;
X₅ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Thr und Ser;
X₆ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Leu, Ile, Val, Ala und Phe;
X₇ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Arg und Lys;
X₈ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gln, Asn und Glu;
X₉ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Trp, Tyr, Cys, Ala und Phe;
X₁₀ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met und Lys;
wobei L₁ ein Linker ist, wie hierin beschrieben; und
n 0 oder 1 ist;
und physiologisch akzeptable Salze davon.
In einer Ausführungsform umfaßt L₁ (Gly)_n, wobei n 1 bis 20 ist, und wobei, wenn n größer als 1 ist, bis zur Hälfte der Gly-Reste durch eine andere Aminosäure substituiert sein können, ausgewählt aus den verbleibenden 19 natürlichen Aminosäuren oder einem Stereoisomer davon.
Zusätzlich zu der Kernstruktur X₂–X₁₀, die oben für TMP₁ und TMP₂ dargestellt ist, sind auch andere verwandte Strukturen möglich, bei denen eines oder mehrere der Folgenden zu der TMP₁- und/oder TMP₂-Kernstruktur zugefügt ist: X₁ ist am N-Terminus angehängt, und/oder X₁₁, X₁₂, X₁₃ und/oder X₁₄ sind an den C-Terminus angehängt, wobei X₁, X₁₁, X₁₂, X₁₃ und X₁₄ wie folgt sind:
X₁ ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ile, Ala, Val, Leu, Ser und Arg;
X₁₁ ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His und Glu;
X₁₂ ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser und Gln;
X₁₃ ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln und Gly; und
X₁₄ ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu und Gly.
Der Begriff „TMP" wird verwendet, um eine Gruppe zu bedeuten, die aus wenigstens 9 Untereinheiten (X₂–X₁₀) zusammengesetzt ist, das heißt diese umfaßt, wobei X₂–X₁₀ die Kernstruktur umfassen. Die X₂–X₁₄-Untereinheiten sind bevorzugt Aminosäuren, die unabhängig ausgewählt sind aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren. Jedoch umfaßt die Erfindung Verbindungen, bei denen X₂–X₁₄ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe von atypischen, nicht-natürlich vorkommenden Aminosäuren, die auf dem Gebiet gut bekannt sind. Spezifische bevorzugte Aminosäuren werden für jede Position identifiziert. Zum Beispiel kann X₂ Glu, Asp, Lys oder Val sein. Sowohl die dreibuchstabigen als auch die einbuchstabigen Abkürzungen für Aminosäuren werden hierin verwendet; in jedem Falle sind die Abkürzungen die Standard-Abkürzungen, die für die 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren oder gut bekannte Variationen davon verwendet werden. Diese Aminosäuren können entweder L- oder D-Stereochemie haben (außer Gly, das weder L- noch D- ist), und die TMPs können eine Kombination von verschiedenen Stereochemien umfassen. Jedoch wird die L-Stereochemie für alle Aminosäuren in der TMP-Kette bevorzugt. Die Erfindung stellt ebenfalls reverse TMP-Moleküle bereit, bei denen die Amino-terminale bis Carboxy-terminale Sequenz der Aminosäuren umgekehrt ist. Zum Beispiel wäre das Reverse eines Moleküls mit der normalen Sequenz X₁-X₂-X₃ X₃-X₂-X₁. Die Erfindung stellt ebenfalls retro-reverse TMP-Moleküle bereit, bei denen, wie in einem reversen TMP, die Amino-terminale bis Carboxyterminale Sequenz von Aminosäuren umgekehrt ist und Reste, die normalerweise „L"-Enantiomere in TMP sind, in die „D"-stereoisomere Form verändert worden sind.
Zusätzlich sind auch physiologisch akzeptable Salze der TMPs umfaßt. „Physiologisch akzeptable Salze" bedeutet jegliche Salze, von denen bekannt ist oder später entdeckt worden ist, daß sie pharmazeutisch akzeptabel sind. Einige spezifische bevorzugte Beispiele sind: Acetat, Trifluoracetat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Citrat, Tartrat, Glykolat, Oxalat.
Es wird ebenfalls in Erwägung gezogen, daß „Derivate" der TMPs die oben beschriebenen TMPs ersetzen können. Solche Derivat-TMPs schließen Gruppen ein, bei denen eine oder mehrere der folgenden Modifizierungen gemacht worden sind:
eine oder mehrere der Peptidyl [-C(O)NR-]-Verknüpfungen (Bindungen) sind durch eine nicht-Peptidyl-Verknüpfung, wie etwa eine -CH₂-Carbamat-Verknüpfung [-CH₂-OC(O)NR-]; eine Phosphonat-Verknüpfung; eine -CH₂-Sulfonamid [-CH₂-S(O)₂NR-]-Verknüpfung; eine Harnstoff [-NHC(O)NH-]-Verknüpfung; eine -CH₂-sekundäre Amin-Verknüpfung; oder eine alkylierte Peptidyl-Verknüpfung [-C(O)NR⁶-, wobei R⁶ kurzkettiges Alkyl ist] ersetzt worden;
Peptide, bei denen der N-Terminus in eine -NRR¹-Gruppe, in eine -NRC(O)R-Gruppe, in eine -NRC(O)OR-Gruppe, in eine -NRS(O)₂R-Gruppe, in eine-NHC(O)NHR-Gruppe, bei der R und R¹ Wasserstoff oder kurzkettiges Alkyl sind, unter der Bedingung, daß R und R¹ nicht beide Wasserstoff sind, in eine Succinimidgruppe, in eine Benzyloxycarbonyl-NH-(CBZ-NH-)-Gruppe, oder in eine Benzyloxycarbonyl-NH-Gruppe mit von 1 bis 3 Substituenten an dem Phenylring, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus kurzkettigem Alkyl, kurzkettigem Alkoxy, Chlor und Brom, derivatisiert worden sind; und
Peptide, bei denen der freie C-Terminus zu -C(O)R² derivatisiert worden ist, wobei R² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus kurzkettigem Alkoxy und -NR³R⁴, wobei R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und kurzkettigem Alkyl. Mit „kurzkettig" ist eine Gruppe mit von 1 bis 6 Kohlenstoffatomen gemeint.
Zusätzlich können Modifizierungen von individuellen Aminosäuren in das TMP-Molekül eingeführt werden, indem gezielte Aminosäurereste des Peptids mit einem organischen Derivatisierungsmittel umgesetzt werden, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder terminalen Resten zu reagieren. Die Folgenden sind beispielhaft:
Lysinyl- und Amino-terminale Reste können mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäure-Anhydriden umgesetzt werden. Eine Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung, daß die Ladung der Lysinyl-Reste umgekehrt wird. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von alpha-Amino-enthaltenden Resten schließen Imidoester, wie etwa Methylpicolinimidat, Pyridoxalphosphat, Pyridoxal, Chlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure, O- methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion, und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat ein.
Arginylreste können durch Reaktion mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert werden, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Eine Derivatisierung von Argininresten erfordert, daß die Reaktion wegen des hohen pKa der funktionellen Guanidingruppe unter alkalischen Bedingungen durchgeführt wird. Darüber hinaus können diese Reagenzien mit den Gruppen von Lysin ebenso wie mit der Arginin-Guanidinogruppe reagieren.
Die spezifische Modifizierung von Tyrosylresten per se ist in großem Umfang studiert worden, mit einem besonderen Interesse an der Einführung von spektralen Markierungen in Tyrosylreste durch Reaktion mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan. Am häufigsten kann N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet werden, um O-Acetyl-Tyrosyl-Spezies, beziehungsweise 3-Nitro-Derivate zu bilden.
Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) können durch Reaktion mit Carbodiimiden (R'-N=C=N-R'), wie etwa 1-Cyclohexyl-3-(2-Morpholinyl-(4-Ethyl)-Carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-Azonia-4,4-Dimethylpentyl)-Carbodiimid, selektiv modifiziert werden. Darüber hinaus können Aspartyl- und Glutamyl-Reste in Asparaginyl- und Glutaminyl-Reste durch Reaktion mit Ammoniumionen umgewandelt werden.
Glutaminyl- und Asparaginyl-Reste werden häufig in die entsprechenden Glutamyl- und Aspartyl-Reste deamidiert. Alternativ können diese Reste leicht sauren Bedingungen deamidiert werden. Beide Formen dieser Reste fallen in den Umfang dieser Erfindung.
Eine Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist zum Quervernetzen der Peptide oder ihrer funktionellen Derivate an eine wasserunlösliche Trägermatrix oder an andere makromolekulare Träger nützlich. Häufig verwendete Quervernetzungsmittel schließen z. B. 1,1-bis(Diazoacetyl)-2-Phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimid-Ester, zum Beispiel Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester, einschließlich Disuccinimidylester, wie etwa 3,3'-Dithiobis (Succinimidylpropionat), und bifunktionelle Maleimide, wie etwa bis-N-Maleimido-1,8-Oktan ein. Derivatisierungsmittel, wie etwa Methyl-3-[(p-Azidophenyl)dithio]propioimidat ergeben photoaktivierbare Intermediate, dei in der Lage sind, in der Anwesenheit von Licht Quervernetzungen zu bilden. Alternativ können reaktive wasserunlösliche Matrizes, wie etwa Cyanogenbromid-aktivierte Kohlenhydrate und die in U.S.-Patenten Nr. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537 und 4,330,440 beschriebenen Substrate zur Proteinimmobilisierung verwendet werden.
Andere mögliche Modifizierungen schließen die Hydroxylierung von Prolin und Lysin, die Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonyl-Resten, die Oxidation des Schwefelatoms in Cys, die Methylierung der Alpha-Amino-Gruppen von Lysin, Arginin und Histidinseitenketten (Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecule Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79–86 (1993)), die Acetylierung des N-terminalen Amins und in einigen Fällen die Amidierung der C-terminalen Carboxylgruppen ein.
Solche derivatisierten Gruppen verbessern bevorzugt eine oder mehrere Eigenschaften, einschließlich der thrombopoietischen Aktivität, Löslichkeit, Absorption, biologischen Halbwertszeit und ähnliches der erfinderischen Verbindungen. Alternativ führen derivatisierte Gruppen zu Verbindungen, die dieselben oder im wesentlichen dieselben Charakteristika und/oder Eigenschaften der Verbindungen haben, die nicht derivatisiert ist. Die Gruppen können alternativ jegliche unerwünschte Nebenwirkung der Verbindungen und Ahnliches eliminieren oder abschwächen.
Zusätzlich zu der oben dargestellten Kernstruktur, X₂–X₁₀, sind andere Strukturen, die spezifisch in Erwägung gezogen werden, diejenigen, bei denen eine oder mehrere zusätzliche X-Gruppen an die Kernstruktur angehängt sind. Daher können X₁, und/oder X₁₁, X₁₂, X₁₃ und X₁₄ an die Kernstruktur angehängt sein. Einige beispielhafte zusätzliche Strukturen sind die folgenden: X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁; X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₂; X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃; X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄; X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀; X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁; X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂; X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃; X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄, wobei X₁ bis X₁₄ wie oben beschrieben sind. Jedes der TMP₁ und TMP₂ können dieselben oder hinsichtlich ihrer Sequenz und/oder Länge unterschiedlich sein. In einigen bevorzugten Ausführungsformen sind TMP₁ und TMP₂ dieselben.
Ein besonders bevorzugtes TMP ist das Folgende:
Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala (SEQ ID NO:1)
Wie hierin verwendet bedeutet „umfassend", unter anderem, daß eine Verbindung zusätzliche Aminosäuren an einem oder beiden Termini oder am C-Terminus der gegebenen Sequenz einschließen kann. Jedoch ist, solange wie eine Struktur, wie etwa X₂ bis X₁₀, X₁ bis X₁₄, oder eine der anderen beispielhaften Strukturen vorhanden ist, die verbleibende chemische Struktur relativ weniger wichtig. Natürlich sollte jegliche Struktur außerhalb der X₂-bis-X₁₀-Kern-Struktur oder der X₁-bis-X₁₄-Struktur nicht signifikant die thrombopoietische Aktivität der Verbindung stören. Zum Beispiel wird in Erwägung gezogen, daß ein N-terminaler Met-Rest in diese Erfindung fällt. Zusätzlich sind, obwohl viele der bevorzugten Verbindungen der Erfindung Tandem-Dimere dahingehend sind, daß sie zwei TMP-Gruppen besitzen, andere Verbindungen dieser Erfindung Tandem-Multimere der TMPs, d. h. Verbindungen der folgenden beispielhaften Strukturen: TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃; TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄; TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄-L-TMP₅; wobei TMP₁, TMP₂, TMP₃, TMP₄ und TMP₅ dieselben oder unterschiedliche Strukturen haben können, und wobei jedes TMP und L definiert ist, wie hierin dargestellt, und die Linker jeweils fakultativ sind. Bevorzugt werden die Verbindungen dieser Erfindung 2–5 TMP-Gruppen haben, besonders bevorzugt 2–3 und am bevorzugtesten 2. Die Verbindungen der ersten Ausführungsform dieser Erfindung werden bevorzugt weniger als ungefähr 60, bevorzugter weniger als ungefähr 40 Aminosäuren insgesamt haben (d. h. sie werden Peptide sein).
Wie oben bemerkt, sind die Verbindungen der ersten Ausführungsform dieser Erfindung bevorzugt TMP-Dimere, die entweder direkt gebunden sind oder über eine Linker-Gruppe verknüpft sind. Die monomeren TMP-Gruppen werden in der herkömmlichen Orientierung vom N- bis C-Terminus in Leserichtung von links nach rechts gezeigt. Entsprechend kann gesehen werden, daß die erfinderischen Verbindungen alle so orientiert sind, daß der C-Terminus des TMP₁ entweder direkt oder durch einen Linker an den N-Terminus von TMP₂ angehängt ist. Diese Orientierung wird als eine Tandem-Orientierung bezeichnet, und die erfinderischen Verbindungen können im Allgemeinen als „Tandem-Dimere" bezeichnet werden. Diese Verbindungen werden als Dimere bezeichnet, sogar wenn TMP₁ und TMP₂ strukturell unterschiedlich sind. Das heißt, sowohl Homodimere als auch Heterodimere werden in Erwägung gezogen.
Die „Linker"-Gruppe („L₁") ist fakultativ. Wenn sie vorhanden ist, ist es nicht wesentlich, was ihre chemische Struktur ist, da sie hauptsächlich als ein Spacer dient. Der Linker sollte so gewählt werden, daß er nicht die biologische Aktivität der endgültigen Verbindung stört, und auch so, daß die Immunogenizität der finalen Verbindung nicht signifikant erhöht ist. Der Linker ist bevorzugt aus Aminosäuren zusammengesetzt, die durch Peptidbindungen verknüpft sind. Daher umfaßt in bevorzugten Ausführungsformen der Linker Y_n, wobei Y eine natürlich vorkommende Aminosäure oder ein Stereoisomer davon ist, und wobei „n" ein beliebiges von 1 bis 20 ist. Der Linker ist deshalb aus von 1 bis 20 Aminosäuren zusammengesetzt, die durch Peptidbindungen verknüpft sind, wobei die Aminosäuren ausgewählt sind aus den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren. In einer bevorzugteren Ausführungsform sind die 1 bis 20 Aminosäuren ausgewählt aus Gly, Ala, Pro, Asn, Gln, Cys, Lys. Noch bevorzugter ist der Linker aus einer Mehrzahl von Aminosäuren zusammengesetzt, die sterisch nicht-gehindert sind, wie etwa Gly, Gly-Gly [(Gly)₂], Gly-Gly-Gly [(Gly)₃] .... (Gly)₂₀, Ala, Gly-Ala, Ala-Gly, Ala-Ala, etc. Andere spezifische Beispiele für Linker sind:
(Gly)₃Lys(Gly)₄ (SEQ ID NO:6)
(Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID NO:7)
(diese Struktur stellt eine Glykosylierungsstelle bereit, wenn sie rekombinant in einem Säugetier-Zellsystem erzeugt wird, das in der Lage ist, solche Stellen zu glykosylieren);
(Gly)₃Cys(Gly)₄ (SEQ ID NO:8) und
GlyProAsnGly (SEQ ID NO:9)
Um die obige Nomenklatur zu erklären, bedeutet zum Beispiel (Gly)₃Lys(Gly)₄ Gly-Gly-Gly-Lys-Gly-Gly-Gly-Gly. Kombinationen von Gly und Ala werden auch bevorzugt.
Nicht-Peptid-Linker sind ebenfalls möglich. Zum Beispiel könnten Alkyl-Linker, wie etwa -HN-(CH₂)_s-CO-, wobei s = 2–20, verwendet werden. Diese Alkyl-Linker können weiter durch jegliche nicht-sterische Hinderungsgruppe ersetzt sein, wie etwa kurzkettiges Alkyl (z. B. C₁-C₆), kurzkettiges Acyl, Halogen (z. B. Cl, Br), CN, NH₂, Phenyl, etc.
Ein weiterer Typ des Nicht-Peptid-Linkers ist eine Polyethylen-Glykol-Gruppe, wie etwa: -HN-CH₂-CH₂-(O-CH₂-CH₂)_n-O-CH₂-CO- wobei n so ist, daß das gesamte Molekulargewicht des Linkers im Bereich von näherungsweise 101 bis 5000, bevorzugt 101 bis 500, liegt.
Im Allgemeinen ist entdeckt worden, daß ein Linker einer Länge von ungefähr 0–14 Untereinheiten (z. B. Aminosäuren) für die thrombopoietischen Verbindungen der ersten Ausführungsform dieser Erfindung bevorzugt wird.
Die Peptid-Linker können verändert sein, um Derivate auf dieselbe Weise zu bilden, wie oben für die TMPs beschrieben.
Die Verbindungen dieser ersten Gruppe können weiterhin linear oder zyklisch sein. Mit „zyklisch" wird gemeint, daß wenigstens zwei getrennte, d. h. nicht-aneinandergrenzende, Teile des Moleküls miteinander verbunden sind, zum Beispiel könnten der Amino- und Carboxy-Terminus der Enden des Moleküls kovalent verbunden sein, um ein zyklisches Molekül zu bilden. Alternativ könnte das Molekül zwei oder mehrere Cys-Reste (z. B. in dem Linker) enthalten, die über eine Disulfidbindungsbildung zyklisieren könnten. Es wird weiterhin in Erwägung gezogen, daß mehr als ein Tandem-Peptid-Dimer verknüpft werden kann, um ein Dimer von Dimeren zu bilden. Daher kann zum Beispiel ein Tandem-Dimer, enthaltend einen Cys-Rest, eine intermolekulare Disulfidbindung mit einem Cys eines anderen solchen Dimers bilden. Siehe zum Beispiel die Verbindungm von SEQ ID NO:20, unten.
Die Verbindungen der Erfindung können ebenfalls kovalent oder nicht-kovalent mit einem Trägermolekül assoziiert sein, wie etwa ein lineares Polymer (z. B. Polyethylenglykol, Polylysin, Dextran, etc.), einem verzweigt-kettigen Polymer (siehe zum Beispiel U.S.-Patent 4,289,872 an Denkenwalter et al., erteilt am 15. September 1981; 5,229,490 an Tam, erteilt am 20. Juli 1993; WO 93/21259 von Frechet et al., veröffentlicht am 28. Oktober 1993); einem Lipid; einer Cholesterolgruppe (wie etwa einem Steroid); oder einem Kohlenhydrat oder Oligosaccharid. Andere mögliche Träger schließen ein oder mehrere wasserlösliche Polymeranhängsel ein, wie etwa Polyoxyethylenglycol oder Polypropylenglycol, wie beschrieben in US Patenten Nr: 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 und 4,179,337 ein. Noch weitere nützliche Polymere, die auf dem Gebiet bekannt sind, schließen Monomethoxy-Polyethylenglycol, Dextran, Zellulose oder andere Kohlenhydrat-basierende Polymere, Poly-(N-Vinylpyrrolidon)-Polyethylenglycol, Propylenglycolhomopolymere, ein Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymer, polyoxyethylierte Polyole (z.B. Glycerol) und Polyvinylalkohol, ebenso wie Mischungen dieser Polymere ein.
Ein bevorzugter solcher Träger ist Polyethylenglycol (PEG). Die PEG-Gruppe kann ein übliches Molekulargewicht haben und kann geradkettig oder verzweigtkettig sein. Das durchschnittliche Molekulargewicht des PEG wird bevorzugt von ungefähr 2 kDa bis ungefähr kDa erreichen, bevorzugter von 5 kDa bis ungefähr 50 kDa. Am bevorzugtesten von ungefähr 5 kDa bis 10 kDa.
Die PEG-Gruppen werden im allgemeinen an die Verbindungen der Erfindung über Acylierung, reduktive Alkylierung, Michael-Addition, Thiol-Alkylierung oder andere chemoselektive Selektions/Ligationsmethoden durch eine reaktive Gruppe an der PEG-Gruppe (z.B. eine Aldehyd-, Amino-, Ester-, Thiol-, α-Halogenacetyl-, Maleimido- oder Hydrazinogruppe) an eine reaktive Gruppe an der Zielverbindung (z.B. eine Aldehyd-, Amino-, Ester-, Thiol-, α-Haloacetyl-, Maleimido- oder Hydrazinogruppe) angehängt werden.
Kohlenhydrat (Oligosaccharid)-Gruppen können bequemer Weise an Stellen angehängt werden, von denen bekannt ist, daß sie Glycosylierungsstellen in Proteinen sind. Im allgemeinen werden O-verknüpfte Oligosaccharide an Serin (Ser)- oder Threonin (Thr)-Reste anghängt, während N-verknüpfte Oligosaccharide an Asparagin (Asn)-Reste angehängt sind, wenn sie Teil der Sequenz Asn-X-Ser/Thr sind, wobei X jegliche Aminosäure außer Prolin sein kann. X ist bevorzugt eine der 19 natürlich vorkommenden Aminosäuren, unter Auslassung von Prolin. Die Strukturen von N-verknüpften und O-verknüpften Oligosacchariden und die Zuckerreste, die in jedem Typ gefunden werden, sind unterschiedlich. Ein Zuckertyp, der häufig an beiden gefunden wird, ist N-Acetylneuraminsäure (bezeichnet als Sialinsäure). Sialinsäure ist gewöhnlich der terminale Rest von sowohl N-verknüpften als auch O-verknüpften Oligosacchariden und kann, aufgrund ihrer negativen Ladung, der glycosylierten Verbindung saure Eigenschaften verleihen. Eine solche Stelle (solche Stellen) können in den Linker der Verbindungen dieser Erfindung eingebaut sein und werden bevorzugt durch eine Zelle während der rekombinanten Produktion der Polypeptidverbindungen glycosyliert (z.B. in Säugetierzellen, wie etwa CHO, BHK, COS). Jedoch können solche Stellen durch synthetische oder semi-synthetische Prozeduren, die auf dem Gebiet bekannt sind, weiter glycosyliert sein.
Einige beispielhafte Peptide dieser Erfindung werden unten gezeigt. Es werden Einbuchstaben-Aminosäureabkürzugen verwendet, und der Linker wird gezeigt, getrennt durch Schrägstriche aus Gründen der Klarheit. Zusätzliche Abkürzungen: BrAc bedeutet Bromacetyl (BrCh₂C(O)), und PEG ist Polyethylenglycol.
In jeder der obigen Verbindungen wird ein N-terminales Met (oder M-Rest unter Verwendung des Einbuchstabencodes) ebenfalls in Erwägung gezogen. Multimere (z.B. Tandem- und Nicht-Tandem, kovalent gebunden und nicht-kovalent gebunden) der obigen Verbindungen werden ebenfalls in Erwägung gezogen.
In einer zweiten Ausführungsform dieser Erfindung können die oben beschriebenen Verbindungen an eine oder mehrere Fc-Gruppen weiter fusioniert sein, entweder direkt oder durch Linkergruppen. Im allgemeinen ist die Formel dieser zweiten Verbindungsgruppe: (Fc)_m-(L₂)_q-TMP₁-(L₁)_n-TMP₂-(L₃)_r-(Fc)_p wobei TMP₁, TMP₂ und n jeweils wie oben beschrieben sind; L₁, L₂ und L₃ sind Linkergruppen, die jeweils unabhängig ausgewählt sind aus den oben beschriebenen Linkergruppen; Fc ist eine Fc-Region eines Immunglobulins; m, p, q und r sind jeweils unabhängig ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 0 und 1, wobei wenigstens eines von m oder p 1 ist, und weiterhin, wenn m 0 ist, dann ist q 0, und wenn p 0 ist, dann ist r 0; und physiologisch akzeptable Salze davon.
Entsprechend haben die Verbindungen dieser zweiten Gruppe Strukturen, wie für die erste Gruppe der oben beschriebenen Verbindungen definiert, aber diese Verbindungen sind weiterhin mit wenigstens einer Fc-Gruppe entweder direkt oder durch eine oder mehrere Linkergruppen fusioniert.
Die Fc-Sequenz der obigen Verbindungen kann aus der humanen Immunglobulin IgG-1-schweren Kette, siehe Ellison, J. W. et al., Nucleic Acids Res. 10: 4071–4079 (1982), oder jeder anderen Fc-Sequenz ausgewählt sein, die auf dem Gebiet bekannt ist (z.B. andere IgG-Klassen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf IgG-2, IgG-3 und IgG-4 oder andere Immunglobuline).
Es ist gut bekannt, daß Fc-Regionen von Antikörpern aus monomeren Polypeptidsequenzen zusammengesetzt sind, die zu dimeren oder multimeren Formen über Disulfidbindungen oder über nicht-kovalente Assoziationen verknüpft sein können. Die Anzahl an intermolekularen Disulfidbindungen zwischen monmeren Untereinheiten von nativen Fc-Molekülen reicht von 1–4, abhängig von der Klasse (z.B. IgG, IgA, IgE) oder der Unterklasse (z.B. IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2) des beteiligten Antikörpers. Der Begriff „Fc", wie hierin verwendet, ist für die monomeren, dimeren und multimeren Formen der Fc-Moleküle generisch. Es sollte beachtet werden, daß Fc-Monomere spontan dimerisieren werden, wenn die geeigneten Cys-Reste vorhanden sind, sofern nicht bestimmte Bedingungen vorherrschen, die die Dimerisierung durch Disulfidbrückenbildung verhindern. Sogar, wenn die Cys-Reste, die normalerweise Disulfidbindungen in dem Fc-Dimer bilden, entfernt oder durch andere Reste ersetzt werden, werden die monomeren Ketten im allgemeinen durch nicht-kovalente Wechselwirkungen dimerisieren. Der Begriff „Fc" wird hierin verwendet, um jegliche dieser Formen zu bedeuten: Das native Monomer, das native Dimer (Disulfidbindungsverknüpft), modifizierte Dimere (Disulfid- und/oder nicht-kovalent verknüpft), und modifizierte Monomere (d.h. Derivate).
Varianten, Analoge oder Derivate des Fc-Teils können durch z.B. Durchführung verschiedener Substitutionen von Resten oder Sequenzen konstruiert werden.
Variante (oder analoge) Polypeptide schließen Insertionsvarianten ein, bei denen eine oder mehrere Aminosäurereste eine Fc-Aminosäuresequenz ergänzen. Insertionen können an einem oder beiden Termini des Proteins gelegen sein oder können in internen Regionen der Fc-Aminosäuresequenz positioniert sein. Insertionsvarianten mit zusätzlichen Resten an einem oder beiden Termini können z.B. Fusionsproteine und Proteine, einschließlich Aminosäureanhängsel oder -Markierungen, einschließen. Zum Beispiel kann das Fc-Molekül fakultativ ein N-terminales Met enthalten, insbesondere wenn das Molekül rekombinant in einer bakteriellen Zelle, wie etwa E. coli, exprimiert wird.
In Fc-Deletionsvarianten werden eine oder mehrere Aminosäurereste in einem Fc-Polypeptid entfernt. Deletionen können an einem oder beiden Termini des Fc-Polypeptids oder mit Entfernen von einem oder mehreren Resten innerhalb der Fc-Aminosäuresequenz durchgeführt werden. Deletionsvarianten schließen deshalb alle Fragmente einer Fc-Polypeptidsequenz ein.
In Fc-Substitutionsvarianten werden ein oder mehrere Aminosäurereste eines Fc-Polypeptids entfernt und durch alternative Reste ersetzt. Unter einem Gesichtspunkt sind die Substitutionen in ihrer Natur konservativ, jedoch umfaßt die Erfindung auch Substitutionen, die nicht-konservativ sind.
Zum Beispiel können Cysteinreste deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, um die Bildung von einigen oder allen Disulfid-Quervernetzungen der Fc-Sequenzen zu verhindern. Insbesondere sind die Aminosäuren an Positionen 7 und 10 von SEQ ID NO: 5 Cysteinreste. Man kann jeden dieser Cysteinreste entfernen oder einen oder mehrere solcher Cysteinreste mit anderen Aminosäuren, wie etwa Ala oder Ser ersetzen. Als ein anderes Beispiel können auch Modifikationen durchgeführt werden, um Aminosäuresubstitutionen einzuführen, um, (1) die Fc-Rezeptorbindungsstellen zu entfernen; (2) die Complement (Clq)-Bindungsstelle zu entfernen; und/oder (3) die Antikörper-abhängige zellvermittelte Cytotoxizitäts (ADCC)-Stelle zu entfernen. Solche Stellen sind auf dem Gebiet bekannt, und jegliche Substitutionen sind innerhalb des Umfangs von Fc, wie hierin verwendet. Zum Beispiel siehe Molecular Immunology, Bd. 29, Nr. 5, 633–639 (1992), in Bezug auf ADCC-Stellen in IgG1.
Ebenso können ein oder mehrere Tyrosinreste durch Phenylalaninreste ersetzt werden. Zusätzlich werden andere variante Aminosäureinsertionen, Deletionen (z.B. von 1–25 Aminosäuren) und/oder Substitutionen in Erwägung gezogen und liegen innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung. Konservative Aminosäuresubstitutionen werden im allgemeinen bevorzugt werden. Darüberhinaus können Veränderungen in der Form von veränderten Aminosäuren, wie etwa Peptidomimetika oder D-Aminosäuren sein.
Fc-Sequenzen der TMP-Verbindungen können ebenfalls derivatisiert werden, d. h. sie tragen Modifizierungen, die nicht eine Insertion, Deletion oder Substitution von Aminosäureresten sind. Bevorzugt sind die Modifizierungen kovalent in ihrer Natur und schließen z.B. die chemische Bindung mit Polymeren, Lipiden, anderen organischen und anorganischen Gruppen ein. Derivate der Erfindung können hergestellt werden, um die Kreislaufhalbwertszeit zu erhöhen, oder sie können dahingehend konstruiert sein, daß sie die Zielkapazität für das Polypeptid auf erwünschte Zellen, Gewebe oder Organe verbessern.
Es ist ebenfalls möglich, die Salavage-Rezeptorbindungsdomäne des intakten Fc-Moleküls als den Fc-Teil der erfinderischen Verbindungen zu verwenden, wie etwa beschrieben in WO 96/32478, mit dem Titel „Altered Polypeptids with Increased Half-life". Zusätzliche Mitglieder der Molekülklasse, die hierin als Fc bezeichnet wird, sind diejenigen, die in WO 97/34631 beschrieben sind, mit dem Titel „Immunoglobulin-Like Domains with Increased Half-Lives". Beide veröffentlichten PCT-Anmeldungen, die in diesem Absatz zitiert sind, werden hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
Die Fc-Fusionen können am N- oder C-Terminus von TMP₁ oder TMP₂ oder an sowohl dem N- als auch C-Terminus der TMPs sein. Es ist überraschender Weise entdeckt worden, daß Peptide, in denen eine Fc-Gruppe an den N-Terminus der TMP-Gruppe ligiert ist, bioaktiver als die anderen Möglichkeiten sind, weshalb die Fusion mit einer Fc-Domäne am N-Terminus von TMP₁ (d.h. r und p sind beide 0 und m und q sind beide 1 in der allgemeinen Formel) bevorzugt wird. Wenn die Fc-Kette am N-Terminus des TMP oder Linker fusioniert ist, wird eine solche Fusion im allgemeinen am C-Terminus der Fc-Kette stattfinden und umgekehrt.
Ebenso bevorzugt sind Verbindungen, die Dimere sind (z.B. Tandem und Nicht-Tandem) der in der oben dargestellten allgemeinen Formel dargelegten Verbindungen. In solchen Fällen wird jede Fc-Kette an ein Tandem-Dimer von TMP-Peptiden verknüpft sein. Ein schematisches Beispiel einer solchen Verbindung wird in 6C gezeigt. Ein bevorzugtes Beispiel dieses Typs an Verbindung beruht auf 6C, wobei Fc ein Dimer der Verbindung von SEQ ID NO:5 ist, jedes L₂(Gly)₅ ist, TMP₁ und TMP₂ jeweils die Verbindungen von SEQ ID NO:1 ist, und jedes L₁(Gly)₈. Diese Verbindung wird hierin auch als „Fc-TMP₁-L-TMP₂" bezeichnet. Sie wird auch als ein Dimer (durch den Fc-Teil) von SEQ ID NO:34 dargestellt. Die analoge Verbindung, bei der die Fc-Gruppe durch einen Linker an den C-Terminus der TMP₂-Gruppen in 6C angehängt ist, wird ebenfalls in Erwägung gezogen und wird hierin als TMP₁-L-TMP₂-Fc bezeichnet.
Einige spezifische Beispiele von Verbindungen von der zweiten Gruppe werden wie folgt dargestellt:
In jeder der obigen Verbindungen wird eine zusätzliches N-terminales Met (oder M-Rest unter Verwendung des Einbuchstabencodes) in Erwägung gezogen. Der Met-Rest kann an dem N-Terminus der Fc-Gruppe in denjenigen Fällen angehängt sein, bei denen es eine Fc-Gruppe gibt, die an den N-Terminus des TMP angehängt ist. In den Fällen, bei denen die Fc-Gruppe an den C-Terminus des TMP angehängt ist, könnten die Met-Reste an den N-Terminus der TMP-Gruppe angehängt sein.
In jedem der obigen Fälle ist Fc bevorzugt die Fc-Region der schweren Kette des humanen Immunglobulins IgG1 oder ein biologisch aktives Fragment, Derivat oder Dimer davon, siehe Ellison, J. W. et al., Nucleic Acids Res. 10 : 4071–4079 (1982). Die in SEQ ID NO. 5 gezeigte Fc-Sequenz ist die für die obigen Verbindungen am meisten bevorzugte Fc. Ebenfalls bevorzugt werden die obigen Verbindungen, bei denen die Fc eine dimere Form der Sequenz von SEQ ID NO:5 ist, und jede Fc-Kette ist an ein TMP-Tandem-Dimer angehängt.
Obwohl viele der bevorzugten Verbindungen der zweiten Ausführungsform ein oder mehrere Tandem-Dimere dahingehend einschließen, daß sie zwei verknüpfte TMP-Gruppen besitzen, schließen andere Verbindungen dieser Erfindung Tandem-Multimere der TMPs ein, d. h. Verbindungen der folgenden beispielhaften Strukturen: Fc-TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃; Fc-TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄; Fc-TMP₁-L-TMP₁-L-TMP₃-L-TMP₄-L-TMP₅; TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-Fc; TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄-L-Fc; TMP₁-L-TMP₂-L-TMP₃-L-TMP₄-L-TMP_-5-L-Fc; wobei TMP₁, TMP₂, TMP₃, TMP₄ und TMP₅ dieselben oder verschiedene Strukturen haben können, und wobei Fc und jedes TMP und L wie oben dargelegt definiert ist, und die Linker jeweils fakultativ sind. In jedem obigen Fall kann die Fc-Gruppe monomer oder dimer sein, und in Fällen, bei denen Fc dimer ist, können ein oder mehrere TMP-Multimere an jede Fc-Kette angehängt sein. Ebenfalls in Erwägung gezogen werden andere Beispiele, bei denen die TMP-Dimere oder Multimere an sowohl den N- als auch C-Terminus von einer oder beiden Fc-Ketten angehängt sind, einschließlich des Falls, bei dem TMP-Dimere oder Multimere an alle vier Termini der beiden Fc-Ketten angehängt sind.
Bevorzugt werden die Verbindungen dieser zweiten Ausführungsform der Erfindung von ungefähr 200 bis 400 Aminosäuren insgesamt haben (d.h. sie werden Polypeptide sein).
Verfahren zur Herstellung
Die Verbindungen dieser Erfindung können auf eine Vielzahl von Arten hergestellt werden. Da viele der Verbindungen Peptide sein werden oder ein Peptid einschließen werden, sind Verfahren zum Synthetisieren von Peptiden hier von besonderer Relevanz. Zum Beispiel können Festphasensynthesetechniken verwendet werden. Geeignete Techniken sind auf dem Gebiet gut bekannt und schließen diejenigen ein, die beschrieben sind in Merrifield, in Chem. Polypeptides, S. 335–61 (Katsoyannis and Panayotis eds. 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149 (1963); Davis et al., Biochem. Intl. 10: 394–414 (1985); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); U.S. Pat. No. 3,941,763; Finn et al., The Proteins, 3. Auflage, Bd. 2, S. 105–253 (1976); und Erickson et al., The Proteins, 3. Auflage, Bd. 2, S. 257–527 (1976). Eine Festphasensynthese ist die bevorzugte Herstellungstechnik von einzelnen Peptiden, da sie die kosteneffektivste Methode zum Herstellen von kleinen Peptiden ist.
Die Peptide können ebenfalls in transformierten Wirtszellen unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken hergestellt werden. Um dies zu erreichen, wird ein rekombinantes DNA-Molekül, das für das Peptid kodiert, hergestellt. Verfahren zum Herstellen von solchen DNA- und/oder RNA-Molekülen sind auf dem Gebiet gut bekannt. Zum Beispiel könnten Sequenzen, die für die Peptide kodieren, aus der DNA unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme ausgeschnitten werden. Die relevanten Sequenzen können unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Einschluß von nützlichen Restriktionsstellen für eine darauf folgende Klonierung erzeugt werden. Alternativ könnte das DNA/RNA-Molekül unter Verwendung von chemischen Synthesetechniken, wie etwa dem Phosphoramidit-Verfahren, synthetisiert werden. Ebenfalls könnte eine Kombination dieser Techniken verwendet werden.
Die Erfindung schließt ebenfalls einen Vektor ein, der für die Peptide in einem geeigneten Wirt kodiert. Der Vektor umfaßt das DNA-Molekül, das für das Peptid kodiert, operativ verknüpft mit geeigneten Expressionskontrollsequenzen. Verfahren zum Durchführen dieser operativen Verknüpfung, entweder bevor oder nachdem das Peptid-kodierende DNA-Molekül in den Vektor eingeführt wird, sind gut bekannt. Expressionskontrollsequenzen schließen Promoter, Aktivatoren, Verstärker, Operatoren, ribosomale Bindungsstellen, Startsignale, Stoppsignale, Kappensignale („cap signals"), Polyadenylierungssignale und andere Signale ein, die an der Kontrolle der Transkription oder Translation beteiligt sind.
Der resultierende Vektor, umfassend das Peptid-kodierende DNA-Molekül, wird dazu verwendet, einen geeigneten Wirt zu transformieren. Diese Transformation kann unter Verwendung von auf dem Gebiet gut bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Es kann eine beliebige aus einer großen Anzahl von verfügbaren und gut bekannten Wirtszellen beim Ausüben dieser Erfindung verwendet werden. Die Auswahl eines individuellen Wir tes hängt von einer Anzahl von Faktoren ab, die auf dem Gebiet bekannt sind. Diese Faktoren schließen z.B. die Kompatibilität mit dem gewählten Expressionsvektor, die Toxizität der durch das DNA-Molekül kodierten Peptide für die Wirtszelle, die Transformationsrate, die Leichtigkeit des Aufreinigens der Peptide, Expressionseigenschaften, Biosicherheit und Kosten ein. Es muß ein Kompromiss zwischen diesen Faktoren unter Berücksichtigung der Tatsache eingegangen werden, daß nicht alle Wirte in gleicher Weise für die Expression einer bestimmten DNA-Sequenz effektiv sein können.
Innerhalb dieser allgemeinen Richtlinien schließen nützliche mikrobielle Wirte Bakterien- wie etwa E. coli), Hefe- (wie etwa Saccharomyces sp. und Pichia pastoris) und andere Pilz-, Insekten-, Pflanzen-, Säugetier- (einschließlich humanen) Zellen in Kultur, oder andere auf dem Gebiet bekannte Wirte ein.
Als nächstes wird der transformierte Wirt unter herkömmlichen Fermentationsbedingungen kultiviert, so daß die erwünschten Peptide exprimiert werden. Solche Fermentationsbedingungen sind auf dem Gebiet gut bekannt.
Schließlich werden die Peptide aus der Fermentationskultur oder aus den Wirtszellen, in denen sie exprimiert werden, aufgereinigt. Diese Aufreinigungsverfahren sind auch auf dem Gebiet gut bekannt.
Verbindungen, die derivatisierte Peptide enthalten, oder die Nicht-Peptid-Gruppen enthalten, können mit gut bekannten Techniken der organischen Chemie synthetisiert werden.
Verwendungen der Verbindungen
Die Verbindungen dieser Erfindung haben die Fähigkeit, an den c-Mpl-Rezeptor zu binden und zu aktivieren, und/oder haben die Fähigkeit, die Produktion (sowohl in-vivo als auch in-vitro) von Blutplättchen („thrombopoietische Aktivität") und von Blutplättchen-Vorläufern zu stimulieren („megakaryocytopoietische Aktivität"). Um die Aktivität(en) dieser Verbindungen zu messen, kann man Standard-Assays verwenden, wie etwa diejenigen, die in WO 95/26746 beschrieben sind, mit dem Titel „Compositions and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth and Differentiation". In-vivo-Assays werden weiter in dem Beispielsabschnitt hierin beschrieben.
Die mit den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu behandelnden Zustände sind im allgemeinen diejenigen, die einen existierenden Megakaryocyten/Blutplättchenmangel oder einen erwarteten oder vorherzusehenden Megakaryocyten/Blutplättchenmangel in der Zukunft beinhalten (z.B. wegen einer geplanten Operation oder einer Blutplättchenspende). Solche Zustände können das Ergebnis eines Mangels (temporär oder permanent) von aktiven Mpl-Liganden in vivo sein. Der generische Begriff für einen Blutplättchenmangel ist Thrombocytopenie, und deshalb sind die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung im allgemeinen zum prophylaktischen oder therapeutischen Behandeln von Thrombocytopenie bei dafür bedürftigen Patienten verfügbar.
Die Weltgesundheitsorganisation hat das Ausmaß der Thrombocytopenie im Hinblick auf die Anzahl an im Kreislauf befindlichen Blutplättchen im Individuum klassifiziert (Miller, et al., Cancer 47: 210–211 (1981)). Zum Beispiel wird ein Individuum das keine Anzeichen von Thrombocytopenie zeigt (Grad 0), im allgemeinen wenigstens 100 000 Blutplättchen/mm³ haben. Eine milde Thrombocytopenie (Grad 1) weist auf ein zirkulierendes Niveau an Blutplättchen zwischen 79 000 und 99 000/mm³ hin. Eine moderate Thrombocytopenie (Grad 2) zeigt zwischen 50 000 und 74 000 Blutplättchen/mm³, und eine starke Thrombocytopenie ist durch zwischen 25 000 und 49 000 Blutplättchen/mm³ charakterisiert. Eine lebensbedrohliche oder schwächende Thrombocytopenie ist durch eine zirkulierende Konzentration von Blutplättchen von weniger als 25 000/mm³ gekennzeichnet.
Eine Thrombocytopenie (Blutplättchenmangel) kann aus verschiedenen Gründen vorliegen, einschließlich Chemotherapie und anderer Therapien mit einer Vielzahl von Arzneien, Strahlungstherapie, Operation, Blutverlust in Folge von Unfall und anderen spezifischen Krankheitszuständen. Beispielhafte spezifische Krankheitszustände, die eine Thrombocytopenie beinhalten und in Übereinstimmung mit dieser Erfindung behandelt werden können, sind: Aplastische Anämie; idiopathische oder Immun-Thrombocytopenie (ITP), einschließlich idiopathischer thrombocytopenischer Purpura, die mit Brustkrebs assoziiert ist; HIV-assoziierte ITP und HIV-verwandte thrombotische thrombocytopenische Purpura; Metastasetumoren, die zu Thrombocytopenie führen; systemischer Lupus erythematodes, einschließlich Neugeborenen-Lupus-Syndrom-Splenomegalie; Fanconi-Syndrom, Vitamin-B12-Mangel; Folsäuremangel; May-Hegglin-Anomalie; Wiskott-Aldrich-Syndrom; chronische Lebererkrankung; Myelodysplastisches Syndrom, assoziiert mit Thrombocytopenie; paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie, akute schwerwiegende Thrombocytopenie nach C7E3-Fab (Abciximab)- Therapie; Alloimmun-Thrombocytopenie, einschließlich mütterlicher Alloimmun-Thrombocytopenie; Thrombocytopenie, assoziiert mit Anti-Phospholipid-Antikörpern und Thrombose; Autoimmun-Thrombocytopenie; Arznei-induzierte Immun-Thrombocytopenie, einschließlich Carboplatin-induzierter Thrombocytopenie, Heparin-induzierte Thrombocytopenie; fötale Thrombocytopenie; Schwangerschafts-Thrombocytopenie; Hughes-Syndrom; Lupoide Thrombocytopenie; unfallverursachter und/oder massiver Blutverlust; myeloproliferative Krankheiten; Thrombocytopenie in Patienten mit bösartigen Erkrankungen; Thrombose-Thrombocytopenie-Purpura, einschließlich Thrombose-Microangiopathie, die sich als thrombotische thrombocytopenische Purpura/hämolytisches urämisches Syndrom in Krebspatienten manifestiert; Hämolytische Autoimmun-Anämie; verborgene Perforation des jejunalen Diverticulum; reine rote Blutkörperchen-Aplasie; Autoimmun-Thrombocytopenie; Nephropathia epidemica; Rifampicin-assoziiertes akutes Nierenversagen; Paris-Trousseau-Thrombocytopenie; neonatale Alloimmun-Thrombocytopenie; paroxysmale nächtliche Hämoglobinurie; hämatologische Veränderungen beim Magenkrebs; hämolytische urämische Syndrome in der Kindheit; hämatologische Manifestationen, bezogen auf virale Infektion, einschließlich Hepatitis-A-Virus und CMV-assoziierter Thrombocytopenie. Ebenfalls führen bestimmte Behandlungen von AIDS zu einer Thrombocytopenie (z.B. AZT). Bestimmte Wundheilungskrankheiten können ebenfalls von einer Zunahme der Blutplättchenzahlen profitieren.
Im Hinblick auf erwartete Blutplättchenmängel, z.B. aufgrund einer zukünftigen Operation, könnte eine Verbindung der vorliegenden Erfindung mehrere Tage bis mehrere Stunden vor dem Bedarf für Blutplättchen verabreicht werden. Im Hinblick auf akute Situationen, z. B. unfallsverursachter und massiver Blutverlust, könnte eine Verbindung dieser Erfindung zusammen mit Blut oder aufgereinigten Blutplättchen verabreicht werden.
Die Verbindungen dieser Erfindung können ebenfalls beim Stimulieren bestimmter Zelltypen nützlich sein, die nicht Megakaryocyten sind, sofern gefunden wird, daß solche Zellen den MPL-Rezeptor exprimieren. Krankheiten, die mit solchen Zellen assoziiert sind, die den Mpl-Rezeptor exprimieren, die auf eine Stimulation mit dem Mpl-Liganden reagieren, liegen ebenfalls im Umfang dieser Erfindung.
Die Verbindungen dieser Erfindung können in jeder Situation verwendet werden, bei der eine Produktion von Blutplättchen oder Blutplättchenvorläuferzellen erwünscht ist, oder bei der eine Stimulation des c-Mpl-Rezeptors erwünscht ist. Daher können z.B. die Verbindungen dieser Erfindung dazu verwendet werden, jede Krankheit in einem Säugetier zu behandeln, bei der es einen Bedarf für Blutplättchen, Megakaryocyten und ähnliches gibt. Solche Krankheiten werden im einzelnen in den folgenden beispielhaften Quellen beschrieben: WO95/26746; WO95/21919; WO95/18858; WO95/21920, und diese werden hierin aufgenommen.
Die Verbindungen dieser Erfindung können ebenfalls nützlich sein beim Aufrechterhalten der Lebensfähigkeit oder Lagerungsfähigkeit von Blutplättchen und/oder Megakaryocyten und verwandter Zellen. Entsprechend könnte es nützlich sein, eine wirksame Menge von einer oder mehrerer solcher Verbindungen in einer Zusammensetzung einzuschließen, die solche Zellen enthält.
Mit „Säugetier" ist jedes Säugetier, einschließlich Menschen, Haustieren, einschließlich Hunden und Katzen, exotischen und/oder Zootieren, einschließlich Affen, Labortieren, einschließlich Mäusen, Ratten und Meerschweinchen, Bauernhoftieren, einschließlich Pferden, Vieh, Schafen, Ziegen und Schweinen und ähnlichem gemeint. Das bevorzugte Säugetier ist der Mensch.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls Verfahren zum Verwenden von pharmazeutischen Zusammensetzungen der erfinderischen Verbindungen bereit. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Verabreichung zur Injektion oder zur oralen, nasalen, transdermalen oder anderen Verabreichungsformen vorgesehen sein, einschließlich z.B. mittels intravenöser, intradermaler, intramuskulärer, intramammärer, intraperitonealer, intrathecaler, intraocularer, retrobulbarer, intropulmonaler (z.B. aerosolisierte Arzneien) oder subkutaner Injektion (einschließlich Depot-Verabreichung für eine langfristige Freisetzung); mittels sublingualer, analer, vaginaler oder mittels operativer Implantation, z. B. eingebettet unter der Milzkapsel, Gehirn oder in der Hornhaut. Die Behandlung kann aus einer einzelnen Dosis oder einer Vielzahl von Dosen über eine Zeitperiode bestehen. Im allgemeinen werden von der Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen umfaßt, umfassend wirksame Mengen einer Verbindung der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Löslichkeitsmachern, Emulgatoren, Adjuvantien und/oder Trägern. Solche Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel von verschiedenem Puf fergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH und Ionenstärke, Zusatzstoffe, wie etwa Detergentien und Löslichkeitsmacher (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Füllsubstanzen (z. B. Lactose, Mannitol); den Einbau des Materials in partikuläre Zubereitungen von polymeren Verbindungen, wie etwa Polymilchsäure, Polyglycolsäure etc. oder in Liposomen ein. Hyaluronsäure kann ebenfalls verwendet werden, und dies kann den Effekt einer Förderung einer anhaltenden Verweildauer im Kreislauf haben. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können fakultativ noch andere pharmazeutisch akzeptable flüssige, halbfeste oder feste Verdünnungsmittel haben, die als pharmazeutische Träger, Bindemittel oder Medien dienen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Polyoxyethylensorbitanmonolaurat, Magnesiumstearat, Methyl- und Propylhydroxybenzoat, Stärken, Sacharose, Dextrose, Akaziengummi, Calciumphosphat, Mineralöl, Kakaobutter und Theobrom-Öl. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, Stabilität, die in-vivo-Freisetzungsrate und die in-vivo-Clearance-Rate der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen. Sieh z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe 1990, (Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Seiten 1435–1712, die hierin durch Bezugnahme aufgenommen werden. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form, hergestellt werden oder können in getrocknetem Pulver, wie etwa als lyophilisierte Form, vorliegen. Implantierbare Formulierungen mit verzögerter Freisetzung werden ebenfalls in Erwägung gezogen, ebenso wie transdermale Formulierungen.
Zur Verwendung hierin werden orale feste Dosierungsformen in Erwägung gezogen, die im allgemeinen in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe 1990, (Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) in Kapitel 89 beschrieben werden, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Feste Dosierungsformen schließen Tabletten, Kapseln, Pillen, Pastillen oder Tabletten, Cachets oder Pellets ein. Ebenfalls kann eine Liposomen- oder Protein-Verkapselung verwendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen zu formulieren (z. B. Protein-Microsphären, über die in US-Patent Nr. 4,925,673 berichtet wird). Eine Liposomenverkapselung kann verwendet werden, und die Liposomen können mit verschiedenen Polymeren derivatisiert werden (z. B. US-Patent Nr. 5,013,556). Eine Beschreibung möglicher fester Dosierungsformen für das Therapeutikum wird gegeben von Marshall, K., Modern Pharmaceuticals, Edited by G. S. Banker and C. T. Rhodes, Kapitel 10, 1979, das hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Im allgemeinen wird die Formulierung die erfinderische Verbindung und inerte Inhaltstoffe umfassen, die einen Schutz gegen die Magenumgebung bieten und die Freisetzung des biologisch aktiven Materials im Darm ermöglichen.
Ebenfalls spezifisch in Erwägung gezogen werden orale Dosierungsformen der obigen erfinderischen Verbindungen. Sofern notwendig können die Verbindungen chemisch modifiziert werden, so daß eine orale Verabreichung wirksam ist. Im allgemeinen ist die in Erwägung gezogene chemische Modifizierung das Anhängen von wenigstens einer Gruppe an das Verbindungsmolekül selbst, wobei besagte Gruppe (a) die Inhibition von Proteolyse und (b) die Aufnahme in den Blutstrom vom Magen oder Darm ermöglicht. Ebenso erwünscht ist die Zunahme an Gesamtstabilität der Verbindung und Zunahme der Zirkulationszeit im Körper. Beispiele für solche Gruppen schließen ein: Polyethylenglycol, Copolymere von Ethylenglycol und Propylenglycol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin (Abuchowski and Davis, Soluble Polymer-Enzyme Adducts, Enzymes as Drugs, Hocenberg and Roberts, eds., Wiley-Interscience, New York, NY, (1981), S. 367–383; Newmark, et al., 3. Appl. Biochem. 4: 185–189 (1982)). Andere Polymere, die verwendet werden könnten, sind Poly-1,3-Dioxolan und Poly-1,3,6-Tioxocan. Bevorzugt zur pharmazeutischen Verwendung, wie oben angezeigt, sind Polyethylenglycolgruppen.
Für orale Abgabedosierungsformen ist es auch möglich, ein Salz einer modifizierten aliphatischen Aminosäure zu verwenden, wie etwa Natrium-N-(8-[2-hydroxybenzoyl]amino)caprylat (SNAC), als einen Träger, um die Absorption der therapeutischen Verbindungen dieser Erfindung zu verbessern. Die klinische Wirksamkeit einer Heparinformulierung unter Verwendung von SNAC ist in einem Phase-II-Versuch demonstriert worden, durchgeführt von Emisphere Technologies. Siehe US-Patent 5,792,451, „Oral drug delivery composition and methods".
Das Therapeutikum kann in der Formulierung als feine Multipartikel in der Form von Granula oder Pellets von einer Partikelgröße von ungefähr 1 mm eingeschlossen werden. Die Formulierung des Materials zur Kapselverabreichung könnte ebenfalls als ein Pulver, leicht komprimierte Stopfen oder sogar als Tabletten erfolgen. Das Therapeutikum könnte mittels Kompression hergestellt werden.
Farbstoffe und Aromastoffe könne alle enthalten sein. Zum Beispiel kann das Protein (oder Derivat) formuliert werden (wie etwa mittels Limposomen- oder Mikrosphären- Verkapselung) und dann weiter in einem essbaren Produkt enthalten sein, wie etwa einem gekühlten Getränk, das Farbstoffe und Aromastoffe enthält.
Man kann das Volumen des Therapeutikums mit einem inerten Material verdünnen oder erhöhen. Diese Verdünnungsmittel könnten Kohlenhydrate, insbesondere Mannitol, α-Lactose, wasserfreie Laktose, Zellulose, Saccharose, modifizierte Dextrane und Stärke einschließen. Bestimmte anorganische Salze könnten ebenfalls als Füllstoffe verwendet werden, einschließlich Calciumtriphosphat, Magnesiumcarbonat und Natriumchlorid. Einige kommerziell erhältliche Verdünnungsmittel sind Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress und Avicell.
Zersetzungsmittel können in der Formulierung des Therapeutikums in einer festen Dosierungsform enthalten sein. Materialien, die als Zersetzungsmittel verwendet werden, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Stärke, einschließlich des kommerziellen Zersetzungsmittels, basierend auf Stärke, Explotab. Natriumstärkeglycolat, Amberlite, Natriumcarboxymethylcellulose, Ultramylopectin, Natriumalginat, Gelatine, Orangenschule, saure Carboxymethylcellulose, natürlicher Schwamm und Bentonit können alle verwendet werden. Eine andere Form von Zersetzungsmitteln sind die unlöslichen Kationenaustauschharze. Pulverisierte Gummis können als Zersetzungsmittel und als Bindemittel verwendet werden, und diese können pulverisierte Gummis einschließen, wie etwa Agar, Karaya oder Tragant. Alginsäure und sein Natriumsalz sind ebenfalls als Zersetzungsmittel nützlich.
Bindemittel können verwendet werden, um das therapeutische Mittel zusammenzuhalten, um eine harte Tablette zu bilden, und schließen Materialien aus natürlichen Produkten ein, wie etwa Akaziengummi, Tragant, Stärke und Gelatine. Andere schließen Methylcellulose (MC), Ethylcellulose (EC) und Carboxymethylcellulose (CMC) ein. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC) könnten beide in alkoholischen Lösungen verwendet werden, um das Therapeutikum zu granulieren.
Ein Antireibungsmittel kann in der Formulierung des Therapeutikums eingeschlossen sein, um ein Kleben während des Formulierungsprozesses zu verhindern. Schmiermittel können als eine Schicht zwischen dem Therapeutikum und der Wand der Form verwendet werden, und diese können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf: Stearinsäure, einschließlich ihrer Magnesium- und Calciumsalze, Polytetraflourethylen (PTFE), flüssiges Paraffin, pflanzliche Öle und Wachse. Lösliche Schmiermittel können auch verwendet werden, wie etwa Natrium laurylsulfat, Magnesiumlaurylsulfat, Polyethylenglycol mit verschiedenen Molekulargewichten, Carbowax 4000 und 6000.
Gleitmittel, die die Flußeigenschaften der Arznei während der Formulierung verbessern könnten, und um eine Umordnung während der Kompression zu erleichtern, können zugegeben werden. Die Gleitmittel können Stärke, Talkum, pyrogenes Siliziumdioxid und hydratisiertes Silicoaluminat einschließen.
Um eine Auflösung des Therapeutikum in die wässrige Umgebung zu ermöglichen, könnte ein oberflächenaktives Mittel als ein Befeuchtungsmittel zugegeben werden. Oberflächenaktive Mittel können anionische Detergentien einschließen, wie etwa Natriumlaurylsufat, Dioctylnatriumsulfosucinat und Dioctylnatriumsulfonat. Kationische Detergentien könnten verwendet werden und könnten Benzalkoniumchlorid oder Benzethoniumchlorid einschließen. Die Liste von potentiellen nicht-ionischen Detergentien, die in der Formulierung als oberflächenaktive Mittel eingeschlossen sein könnten, sind Lauromacrogol 400, Polyoxyl-40-Stearat, Polyoxyethylen-hydriertes Castoröl 10, 50 und 60, Glycerolmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Saccharose-Fettsäureester, Methylcellulose und Carboxymethylcellulose. Diese oberflächenaktiven Mittel könnten in der Formulierung des Proteins oder Derivats entweder alleine oder als eine Mischung in verschiedenen Verhältnissen vorhanden sein.
Zusatzstoffe, die die Aufnahme der Verbindung potentiell verbessern, sind z. B. die Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.
Eine Formulierung mit kontrollierter Freisetzung kann erwünscht sein. Die Arznei könnte in eine inerte Matrix eingebaut werden, die die Freisetzung mittels entweder Diffusions- oder Austritts-Mechanismen („leaching mechanisms") ermöglicht, z. B. Gummis. Langsam sich abbauende Matrizen können auch in die Formulierung eingebaut sein, z. B. Alginate, Polysaccharide. Eine andere Form einer kontrollierten Freisetzung dieses Therapeutikums ist mittels eines Verfahrens, basierend auf dem Oros-therapeutischen System (Alza Corp.), d. h. die Arznei wird in einer semipermeablen Membran eingeschlossen, die Wasser eintreten und die Arznei durch eine einzelne kleine Öffnung aufgrund von osmotischen Effekten ausstoßen läßt. Einige enterische Beschichtungen haben ebenfalls einen Effekt der verzögerten Freisetzung.
Andere Beschichtungen können für die Formulierung verwendet werden. Diese schließen eine Vielzahl von Zuckern ein, die in einer Beschichtungspfanne aufgetragen werden können. Das therapeutische Mittel könnte ebenfalls in einer filmbeschichteten Tablette verabreicht werden, und die Materialien, die in diesem Falle verwendet werden, werden in zwei Gruppen aufgeteilt. Die ersten sind die nicht-enterischen Materalien und schließen Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Methylhydroxyethylcellulose, Hydroxpropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Providon und die Polyethylenglycole ein. Die zweite Gruppe besteht aus den enterischen Materialien, die häufig Ester der Phthalsäure sind.
Eine Mischung von Materialien könnte verwendet werden, um die optimale Filmbeschichtung bereit zu stellen. Eine Filmbeschichtung kann in einem Pfannenbeschichter oder in einem Flüssigbett oder mittels Kompressionsbeschichtung erfolgen.
Ebenso hierin in Erwägung gezogen wird ein pulmonale Abgabe des vorliegenden Proteins (oder Derivate davon). Das Protein (oder Derivat) wird an die Lunge eines Säugetiers beim Inhalieren abgegeben und durchschreitet die Schleimhaut der Lunge in den Blutkreislauf. (Andere Berichte hierüber schließen Adjei et al, Pharmaceutical Research 7: 565–560; Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics 63: 135–144 (1990) (Leuprolidacetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology 13 (suppl. 5); S. 143–146 (1989) (Endothelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine 3: 206–212 (1989) (α1-Antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest. 84: 1145–1146 (1989) (α1-Proteinase); Oswein et al., „Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, März 1990 (rekombinantes humanes Wachstumshormon); Debs et atl., The Journal of Immunology 140: 3482–3488b (1988) (Interferon-γ und Tumornecrosefaktor α) und Platz et al., US-Patent Nr. 5,284,656 (Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor) ein.
Zur Verwendung bei der Ausübung dieser Erfindung werden eine große Zahl von mechanischen Vorrichtungen in Erwägung gezogen, die für die pulmonale Abgabe von therapeutischen Produkte konstruiert sind, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Vernebeler, Inhalatoren mit abgemessener Dosis, und Pulverinhalatoren, die alle Fachleuten bekannt sind.
Einige spezifische Beispiele für kommerziell erhältliche Vorrichtungen, die zur Ausübung dieser Erfindung geeignet sind, sind der Ultravent-Vernebeler, hergestellt von Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri; der Acorn-II-Vernebeler, hergestellt von Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; der Ventolin-Inhalator mit abgemessener Dosis, hergestellt von Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina, und der Spinhaler-Pulver-Inhalator, hergestellt von Fisons., Bedford, Massachusetts.
Alle solchen Vorrichtungen erfordern die Verwendung von Formulierungen, die zur Abgabe der erfinderischen Verbindung geeignet sind. Typischerweise ist jede Formulierung für den Typ der verwendeten Vorrichtung spezifisch und kann die Verwendung eines geeigneten Treibmittels beinhalten, zusätzlich zu Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und/oder Trägern, die bei der Therapie nützlich sind.
Die erfinderische Verbindung könnte am vorteilhaftesten in partikulärer Form mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von weniger als 10 μm (oder Micron) hergestellt werden, am bevorzugtesten 0,5 bis 5 μm, für die effektivste Abgabe an die distale Lunge.
Träger schließen keine Kohlenhydrate ein, wie etwa Trehalose, Mannitol, Xylitol, Saccharose, Lactose und Sorbitol. Andere Inhaltstoffe zur Verwendung bei Formulierungen können DPPC, DOPE, DSPC und DOPC einschließen. Natürliche oder synthetische oberflächenaktive Mittel können verwendet werden. Polyethylenglycol kann verwendet werden (sogar abgesehen von seiner Verwendung beim Derivatisieren des Proteins oder Analogon). Dextrane, wie etwa Cyclodextran, können verwendet werden Gallensalze und andere verwandte Verstärker können verwendet werden. Cellulose und Cellulose-Derivate können verwendet werden. Aminosäuren können verwendet werden, wie etwa zur Verwendung in einer Pufferformulierung.
Ebenfalls wird die Verwendung von Liposomen, Microkapseln oder Microsphären, Einschlußkomplexen oder anderen Typen von Trägern in Erwägung gezogen.
Formulierungen, die zur Verwendung mit einem Vernebler geeignet sind, entweder Düsen-Vernebler oder Ultraschall-Vernebler, werden typischerweise die erfinderische Verbindung umfassen, aufgelöst in Wasser bei einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 25 mg biologisch aktiven Proteins pro ml Lösung. Die Formulierung kann auch einen Puffer und einen einfachen Zucker enthalten (z.B. zur Proteinstabilisierung und Regulierung des osmotischen Drucks). Die Verneblerformulierung kann ebenfalls eine oberflächenaktives Mittel enthalten, um Oberflächen-induzierte Aggregation des Proteins zu verringern oder zu verhindern, die durch die Atomisierung der Lösung beim Bilden des Aerosols verursacht wird.
Formulierungen zur Verwendung mit einer Inhalatorvorrichtung mit abgemessener Dosis werden im allgemeinen ein fein zerteiltes Pulver umfassen, enthaltend die erfinderische Verbindung, in einem Treibmittel mit Hilfe eines oberflächenaktiven Mittels suspendiert. Das Treibmittel kann jegliches herkömmliches Material sein, das zu diesem Zweck verwendet wird, wie etwa Chlorfluorkohlenstoff, ein Chlorfluorkohlenwasserstoff, ein Fluorkohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoff, einschließlich Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, die Dichlortetrafluorethanol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan oder Kombinationen davon. Geeignete oberflächenaktive Mittel schließen Sorbitantrioleat und Sojalecithin ein. Ölsäure kann ebenfalls ein oberflächeaktives Mittel nützlich sein.
Formulierungen zur Abgabe aus einer Pulver-Inhalatorvorrichtung werden ein fein zerteiltes trockenes Pulver, enthaltend die erfinderische Verbindung, umfassen und können ebenfalls ein Füllstoff umfassen, wie etwa Lactose, Sorbitol, Saccharose, Mannitol, Trehalose oder Xylitol in Mengen, die die Dispersion des Pulvers aus der Vorrichtung erleichtern, z.B. 50 bis 90 Gew.-% der Formulierung.
Eine nasale Abgabe der erfinderischen Verbindung wird ebenfalls in Erwägung gezogen. Nasale Abgabe erlaubt den Übergang des Proteins in den Blutstrom direkt nach Verabreichung des therapeutischen Produkts an die Nase, ohne die Notwendigkeit zum Ablegen des Produkts in der Lunge. Formulierungen zur nasalen Abgabe schließen diejenigen mit Dextran und Cyclodextran ein. Eine Abgabe über einen Transport über andere Schleimhautmembranen wird ebenfalls in Erwägung gezogen.
Dosierungen
Das Dosierungsschema, das bei einem Verfahren zum Behandeln der oben beschriebenen Zustände verwendet wird, wird durch den behandelnden Arzt bestimmt werden, unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren, die die Wirkung von Arzneien modifizieren, z.B. das Alter, den Zustand, das Körpergewicht, das Geschlecht und die Ernährungsweise des Patienten, die Heftigkeit einer Infektion, die Zeit der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Im allgemeinen sollte die Dosis im Bereich von 0,1 μg bis 100 mg der erfinderischen Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag sein, bevorzugt 0,1 bis 1000 μg/kg, und bevor zugter 0,1 bis 150 μg/kg, verabreicht in täglichen Dosen oder in äquivalenten Dosen in längeren oder kürzeren Intervallen, z.B. jeden zweiten Tag, zweimal wöchentlich, wöchentlich oder zweimal oder dreimal täglich.
Die erfinderische Verbindung kann mit einem anfänglichen Bolus verabreicht werden, gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion, um therapeutische Kreislaufniveaus des Arzneiproduktes aufrecht zu erhalten. Als ein anderes Beispiel kann die erfinderische Verbindung in einer einmaligen Dosis verabreicht werden. Fachleute auf dem Gebiet werden in leichter Weise wirksame Dosierungen und Behandlungsschemata optimieren, bestimmt anhand guter medizinischer Praxis und des klinischen Zustands des einzelnen Patienten. Die Häufigkeit der Dosierung wird von den pharmakokinetischen Parametern der Mittel und der Verabreichungsroute abhängen. Die optimale pharmazeutische Formulierung wird von einem Fachmann bestimmt werden, abhängig von der Verabreichungsroute und der erwünschten Dosierung. Siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) Seiten 1435–1712, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Solche Formulierungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die in-vivo-Freisetzungsrate und die in-vivo-Clearance-Rate der verabreichten Mittel beeinflussen. Abhängig von der Verabreichungsroute kann eine geeignete Dosierung gemäß Körpergewicht, Körperoberfläche oder Organgröße berechnet werden. Eine weitere Verfeinerung der Berechnungen, die notwendig sind, um die geeignete Dosierung zur Behandlung zu bestimmen, beinhaltend jede der oben erwähnten Formulierungen, wird routinemäßig von Fachleuten auf dem Gebiet ohne übermäßiges Experimentieren gemacht, insbesondere im Hinblick auf die Dosierungsinformation und die Assays, die hierin offenbart sind, ebenso wie die pharmakokinetischen Daten, die in den oben diskutierten humanen klinischen Versuchen beobachtet worden sind. Geeignete Dosierungen können durch Verwendung von etablierten Assays zur Bestimmung von Blutniveaudosierungen zusammen mit geeigneten Dosis-Antwort-Daten bestätigt werden. Das endgültige Dosierungsschema wird von dem behandelnden Arzt unter Berücksichtigung verschiedener Faktoren bestimmt werden, die die Wirkung der Arzneien modifizieren, z.B. die spezifische Aktivität der Arznei, die Heftigkeit der Schädigung und der Empfindlichkeit des Patienten, das Alter, der Zustand, das Körpergewicht, das Geschlecht und die Ernährung des Patienten, die Heftigkeit einer Infektion, die Zeit der Verabreichung und andere klinische Faktoren. Während Studien durchgeführt werden, wird es weitere Informationen im Hinblick auf geeignete Dosierungsniveaus und Behandlungsdauer für verschiedene Krankheiten und Zustände geben.
Die therapeutischen Verfahren, Zusammensetzungen und Verbindungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls verwendet werden, alleine oder in Kombination mit anderen Cytokinen, löslichem Mpl-Rezeptor, hämatopoietischen Faktoren, Interleukinen, Wachstumsfaktoren oder Antikörpern bei der Behandlung von Krankheitszuständen, die durch andere Symptome ebenso wie durch Blutplättchenmangel charakterisiert sind. Es wird erwartet, daß die erfinderische Verbindung sich bei der Behandlung von einigen Formen der Thrombocytopenie in Kombination mit allgemeinen Stimulatoren der Hämatopoiese als nützlich herausstellen wird, wie etwa IL-3 oder GM-SCF. Andere megakaryocytische stimulatorische Faktoren, d.h. meg-CSF, Stammzellfaktor (SCF), Leukämie-inhibitorischer Faktor (LIF), Oncostatin M (OSM), oder andere Moleküle mit Megakaryocyten-stimulierender Aktivität können ebenfalls mit Mpl-Ligand verwendet werden. Zusätzliche beispielhafte Cytokine oder hämatopoietische Faktoren für eine solche Co-Verabreichung schließen IL-1 alpha, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, Kolonie-stimulierender Faktor-1 (CSF-1), M-CSF, SCF, GM-CSF, Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), EPO, Interferon-alpha (IFN-alpha), Konsensus-Interferon, IFN-beta, IFN-gamma, Il-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, Thrombopoietin (TPO), Angiopoietine, zum Beispiel Ang-1, Ang-2, Ang-4, Ang-Y, das humane Angiopoietin-artige Polypeptid, Gefäß-Endothel-Wachstumsfakotor (VEGF), Angiogenin, Knochen-morphogenes Protein-1, Knochen-morphogenens Protein-2, Knochen-morphogenes Protein-3, Knochen-morphogenes Protein-4, Knochen-morphogenens Protein-5, Knochen-morphogenes Protein-6, Knochen-morphogenes Protein-7, Knochenmorphogenes Protein-8, Knochen-morphogenes Protein-9, Knochen-morphogenes Protein-10, Knochen-morphogenes Protein-11, Knochen-morphogenes Protein-12, Knochenmorphogenes Protein-13, Knochen-morphogenes Protein-14, Knochen-morphogenes Protein-15, Knochen-morphogenes Protein-Rezeptor IA, Knochen-morphogenes Protein-Rezeptor IB, aus Gehirn stammender neurotropher Faktor, ciliarer neurotropher Faktor, ciliarer neurotropher Faktor-Rezeptor-α, Cytokin-induzierter neutrophilen-chemotaktischer Faktor 1, Cytokin-induzierter neutrophilen-chemotaktischer Faktor 2 α, Cytokin-induzierter neutrophilen-chemotaktischer Faktor 2 β,β-Endothel-Zellwachstumsfaktor, Endothelin 1, epidermaler Wachstumsfaktor, aus Epithel stammender neutrophil-anziehender Fibroblastenwachstumsfaktor 4, Fibroblastenwachstumsfaktor 5, Fibroblastenwachstumsfaktor 6, Fibroblastenwachstumsfaktor 7, Fibroblastenwachstumsfaktor 8, Fibroblastenwachstumsfaktor 8b, Fibroblastenwachstumsfaktor 8c, Fibroblastenwachstumsfaktor 9, Fibroblastenwachstumsfaktor 10, saurer Fibroblastenwachstumsfaktor, basischer Fibroblastenwachstumsfaktor, Glia-Zellinie-abgeleiteter neurotropher Faktor-Rezeptor α1, Gliazellinie-abgeleiteter neurotropher Faktor-Rezeptor α2, wachstumbezogenes Protein, wachstumsbezogenes Protein α, wachstumsbezogenes Protein β, wachstumsbezogenes Protein γ, Heparin-bindender epidermaler Wachstumsfaktor, Hepatocytenwachstumsfaktor, Nepatocytenwachstumsfaktorrezeptor, insulinartiger Wachstumsfaktor I, insulinartiger Wachstumsfaktorrezeptor, insulinartiger Wachstumsfaktor II, insulinartiger Wachstumsfaktor-bindendes Protein, Keratinocytenwachstumsfaktor, Leukämie-inhibitorischer Faktor, Leukämie-inhibitorischer Faktor-Rezeptor α, Nervenwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktorrezeptor, Neurotrophin-3, Neurotrophin-4, Placenta-Wachstumsfaktor, Placenta-Wachtumsfaktor-2, Blutplättchen-abgeleiteter Endothelzellwachstumsfaktor, Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor, Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor A-Kette, Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor AA, Blutplättchenabgeleiteter Wachstumsfaktor AB, Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor B-Kette, Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor BB, Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktorrezeptor α, Blutplättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktorrezeptor β, Prä-B-Zellwachstumsfaktor-stimulierender Faktor, Stammzellfaktorrezeptor, TNF, einschließlich TNF0, TNF1, TNF2, transformierender Wachstumsfaktor α, transformierender Wachstumsfaktor β, transformierender Wachstumsfaktor β1, transformierender Wachstumsfaktor β1.2, transformierender Wachstumsfaktor β2, transformierender Wachstumsfaktor β3, transformierender Wachstumsfaktor β5, latenter transformierender Wachstumsfaktor β1, transformierender Wachstumsfaktor-β-bindendes Protein I, transformierender Wachstumsfaktor-β-bindendes Protein II, transformierender Wachstumsfaktor-β-bindendes Protein III, Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Typ-I, Tumornekrosefaktor-Rezeptor-Typ-II, Urokinase-Typ-Plasminogenaktivator-Rezeptor, Gefäßendothelwachstumsfaktor, und chimäre Proteine und biologisch oder immunologisch aktive Fragmente davon. Es kann weiterhin nützlich sein, eine wirksame Menge eines löslichen Säugetier-Mpl-Rezeptors entweder zeitgleich oder aufeinanderfolgend zu verabreichen, der einen Effekt zu haben scheint, Megakaryocyten sich in Blutplättchen fragmentieren zu lassen, wenn die Megakaryocyten eine reife Form erreicht haben. Daher wird erwartet, daß die Verabreichung einer erfinderischen Verbindung (um die Anzahl an reifen Megakaryocyten zu erhöhen), gefolgt von einer Verabreichung des löslichen Mpl-Rezeptors (um den Liganden zu aktivieren und es den reifen Megakaryocyten zu ermöglichen, Blutplättchen zu produzieren), ein besonders wirksames Mittel zum Stimulieren der Blutplättchenproduktion ist. Die oben aufgeführte Dosierung würde eingestellt werden, um solche zusätzlichen Bestandteile bei der therapeutischen Zusammensetzung auszugleichen. Ein Fortschritt des behandelten Patienten kann mit herkömmlichen Verfahren überwacht werden.
In Fällen, bei denen die erfinderischen Verbindungen zu Zusammensetzungen von Blutplättchen und/oder Megakaryocyten und verwandten Zellen zugegeben werden, wird die einzuschließende Menge im allgemeinen experimentell mittels Techniken und Assay bestätigt werden, die auf dem Gebiet bekannt sind. Ein beispielhafter Mengenbereich ist 0,1 μg – 1 mg erfinderische Verbindung pro 10⁶ Zellen.
Es ist klar, daß die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein spezifisches Problem oder Situation innerhalb der Fähigkeit eines Fachmanns im Lichte der hierin enthaltenen Lehren sein wird. Beispiele für die Produkte der vorliegenden Erfindung und repräsentative Prozesse zu ihrer Isolierung, Verwendung und Herstellung sind unten aufgeführt.
BEISPIELE
I. Im folgenden sind beispielhafte Verfahren zum Herstellen einiger der Verbindungen der hierin offenbarten ersten Gruppe aufgeführt.
A. Materialien und Methoden
Alle Aminosäurenderivate (alle mit L-Konfiguration) und Harze, die bei der Peptidsynthese verwendet werden, wurden von Novabiochem käuflich erworben. Peptid-Synthese-Reagenzien (DCC, HOBt, etc.) wurden in löslicher Form von Applied Biosystems, Inc. erworben. Die beiden PEG-Derivate waren von Shearwater Polymers, Inc. Alle Lösungsmittel (Dichlormethan, N-Methylpyrrolidinon, Methanol, Acetonitril) waren von EM Sciences. Die analytische HPLC wurden auf einem Beckman-System mit einer Vydac-Säule laufen gelassen (0,46 cm × 25 cm, C18-Umkehrphase, 5 mm) bei einer Durchflussrate von 1 ml/min und mit dualer UV-Detektion bei 220 und 280 nm. Lineare Gradienten wurden für alle HPLC-Läufe mit zwei mobilen Phasen verwendet: Puffer A – H₂O (0,1% TFA) und Puffer B – Acetonitril (0,1% TFA). Die numerierten Peptide, auf die hierin Bezug genommen wird, z.B. 17b, 18, 19 und 20, werden in Bezug auf Tabelle 1 numeriert, und einige davon sind weiterhin in 2 und 3 veranschaulicht.
Peptidsynthese. Alle Peptide wurden mittels dem gutetablierten Festphasensyntheseverfahren in Stufen hergestellt. Die Festphasensynthese mit Fmoc-Chemie wurde durchgeführt unter Verwendung eines ABI-Peptid-Synthesizer. Typischerweise begann die Peptidsynthese mit einem vorbeladenen Wang-Harz im 0,1 mmol-Maßstab. Eine Fmoc-Entschützung wurde mit dem Standard-Piperidin-Protokoll durchgeführt. Die Kopplung wurde durchgeführt unter Verwendung von DCC/HOBt. Die Seitenkettenschutzgruppen waren: Glu(O-t-Bu), Thr(t-Bu), Arg(Pbf), Gln(Trt), Trp(t-Boc) und Cys(Trt). Für den ersten Peptid-Precursor zur Pegylierung wurde Dde zur Seitenkettenschützung des Lys an dem Linker verwendet, und Boc-Ile-OH wurde für die letzte Kopplung verwendet. Dde wurden unter Verwendung von wasserfreiem Hydrazin (2% in NMP, 3 × 2min) entfernt, gefolgt von einer Kopplung mit Bromessigsäureanhydrid, vorgebildet durch die Aktion von DCC. Für Peptid 18 wurde die Cysteinseitenkette im Linker mit einer Trityl-Gruppe gestützt. Die endgültige Entschützung und Spaltung aller Peptidylharze wurde bei RT für 4h durchgeführt unter Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA), enthaltend 2,5% H₂O, 5% Phenol, 2,5% Triisopropylsilan und 2,5% Thioanisol. Nach Entfernung von TFA wurde das gespaltene Peptid mit kaltem wasserfreiem Ether ausgefällt. Eine Disulfidbildung des zyklischen Peptids wurde direkt auf dem Rohmaterial unter Verwendung von 15% DMSO in H₂O (pH 7,5) durchgeführt. Alle Rohpeptide wurden mittels präparativer Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt, und die Strukturen wurden mittels ESI-MS und Aminosäureanalyse bestätigt.
Alternativ könnten alle oben beschriebenen Peptide ebenfalls unter Verwendung der t-Boc-Chemie hergestellt werden. In diesem Falle wären die Ausgangsharze das klassische Merrifield- oder Pam-Harz, und die Seitenkettenschutzgruppen wären: Glu(OBzl), Thr(Bzl), Arg(Tos), Trp(CHO), Cys(p-MeBzl). Fluorwasserstoff (HF) würde für die endgültige Spaltung der Peptidylharze verwendet.
Alle dimeren Tandempeptide, die in dieser Studie beschrieben sind, die aus natürlichen Aminosäuren zusammengesetzte Linker haben, können ebenfalls mittels rekombinanter DNA-Technologie hergestellt werden.
PEGylierung. Eine neue konvergente Strategie zur Pegylierung von synthetischen Peptiden wurde entwickelt, die aus einem Kombinieren eines Peptids und einer PEG-Gruppe durch Bilden einer Konjugatverknüpfung in Lösung besteht, wobei jedes jeweils eine spezielle Funktionalität trägt, die mit der jeweiligen anderen gegenseitig reaktiv ist. Die Vorläuferpep tide können in leichter Weise mit der üblichen Festphasensynthese hergestellt werden, wie oben beschrieben. Wie unten beschrieben, sind diese Peptide „präaktiviert" mit einer geeigneten funktionellen Gruppe an einer spezifischen Stelle. Die Vorläufer werden aufgereinigt und vor der Umsetzung mit der PEG-Gruppe vollständig charakterisiert. Eine Ligation des Peptids mit PEG findet gewöhnlich in wäßriger Phase statt und kann in leichter Weise durch analytische Umkehrphase-HPLC überwacht werden. Die pegylierten Peptide können in leichter Weise mit präparativer HPLC aufgereinigt werden und mittels analytischer HPLC, Aminosäureanalyse und Laserdesorptionsmassenspektrometrie charakterisiert werden.
Herstellung von Peptid 19. Peptid 17b (12 mg) und MeO-PEG-SH 5000 (30 mg, 2 äquiv.) wurden in 1 ml wäßrigem Puffer (pH 8) aufgelöst. Die Mischung wurde bei RT für ungefähr 30 Minuten inkubiert, und die Reaktion wurde mittels analytischer HPLC überprüft, was einen > 80%-Ablauf der Reaktion zeigt. Das pegylierte Material wurde mittels präparativer HPLC isoliert.
Herstellung von Peptid 20. Peptid 18 (14 mg) und MeO-PEG-Maleimid (25 mg) wurden in ungefähr 1,5 ml wäßrigem Puffer (pH 8) aufgelöst. Die Mischung wurde bei RT für ungefähr 30 min inkubiert, wonach ~ 70% Transformation abgeschlossen war, überwacht mittels analytischer HPLC durch Aufbringen eines Proben-Aliquot auf die HPLC-Säule. Das pegylierte Material wurde mittels präparativer HPLC aufgereinigt.
Bioaktivitätsassay. Der TPO-in-vitro-Bioassay ist ein mitogener Assay, der einen IL-3-abhängigen Klon von marinen 32D-Zellen verwendet, die mit humanem Mpl-Rezeptor transfiziert worden sind. Dieser Assay wird in größeren Einzelheiten in WO 95/26746 beschrieben. Zellen werden in MEM-Medium gehalten, enthaltend 10% fötalem Klon II („Clone II") und 1 ng/ml mIL-3. Vor der Probenzugabe werden Zellen durch zweimaliges Spülen mit Wachstumsmedium, dem mIL-3 fehlt, hergestellt. Eine ausgedehnte 12 Punkt-TPO-Standardkurve wird erstellt, die von 3333 bis 39 pg/ml reichte. Vier Verdünnungen, von denen geschätzt wurde, daß sie in den linearen Teil der Standardkurve (1000 bis 125 pg/ml) fallen, werden für jede Probe hergestellt und in dreifacher Ausfertigung laufen gelassen. Ein Volumen von 100 μl einer jeden Verdünnung an Probe oder Standard wird zu geeigneten Näpfen einer 96-Napf-Mikrotiterplatte zugegeben, die 10000 Zellen/Napf enthält. Nach 44 Stunden bei 37°C und 10% CO₂ wird MTS (eine Tetrazolium-Verbindung, die von Zellen zu einem Formazan biologisch reduziert wird) zu jedem Napf zugegeben. Näherungsweise sechs Stunden später wird die optische Dichte auf einem Plattenlesegerät bei 490 nm abgelesen. Eine Dosis-Antwort-Kurve (log TPO-Konzentrationen gg. OD-Hintergrund) wird erzeugt, und eine lineare Regressionsanalyse der Punkte, die in den linearen Teil der Standardkurve fallen, wird durchgeführt. Die Konzentrationen von unbekannten Testproben werden bestimmt unter Verwendung der resultierenden linearen Gleichung und einer Korrektur für den Verdünnungsfaktor.
Abkürzungen. HPLC: Hochleistungs-Flüssigchromatographie; ESI-MS: Elektrosprayionisierungsmassenspektrometrie; MALDI-MS: Matrix-assistierte Laserdesorptionsionisierungsmassenspektrometrie; PEG: Poly(ethylenglykol). Alle Aminosäuren werden mit dem Standard-Dreibuchstaben- oder Einbuchstabencode dargestellt. t-Boc: tert-Butoxycarbonyl; tBu: tert-Butyl; Bzl: Benzyl; DCC: Dicyclohexylcarbodiimid; HOBt: 1-Hydroxybenzotriazol; NMP: N-Methyl-2-pyrrolidinon; Pbf: 2,2,4,6,7-Pendamethyldihydro-benzofiuan-5-sulfonyl; Trt: Trityl; Dde: 1-(4,4-Dimethyl-2,6-dioxo-cyclohexyliden)ethyl.
B. Ergebnisse
TMP-Tandemdimere mit Polyglycinlinkern. Das Design von sequenziell verknüpften TMP-Dimeren beruhte auf der Annahme, daß eine dimere Form von TMP für ihre effektive Wechselwirkung mit c-Mpl (dem TPO-Rezeptor) erforderlich war, und daß, abhängig davon, wie sie gegeneinander in dem Rezeptorkontext aufgewickelt waren, die beiden TMP-Moleküle in der C-bis N-Terminus-Konfiguration auf eine Weise miteinander verknüpft sein könnten, die nicht die globale dimere Konformation zerstören würde. Natürlich kann die Aktivität der Tandem-verknüpften Dimere auch von einer richtigen Auswahl der Länge und Zusammensetzung des Linkers abhängen, der die C- und -Termini der beiden sequenziell ausgerichteten TMP-Monomere verbindet. Da keine strukturelle Information des TMP, gebunden an c-Mpl, zur Verfügung stand, wurde eine Reihe von dimeren Peptiden mit Linkern, zusammengesetzt aus 0 bis 10 und 14 Glycinresten (Tabelle 1), synthetisiert. Glycin wurde wegen seiner Einfachheit und Flexibilität ausgewählt. Es wurde erwogen, daß eine flexible Polyglycinpeptidkette die freie Faltung der beiden gebundenen TPM-Repeats in die erforderliche Konformation ermöglichen könnte, während sterisch stärker gehinderte Aminosäuresequenzen unerwünschte Sekundärstrukturen annehmen können, deren Steifheit die korrekte Packung des dimeren Peptids im Rezeptorkontext zerstören könnte.
Die resultierenden Peptide sind für herkömmliche Festphasenpeptidsyntheseverfahren (Merrifiled, R. B., Journal of the American Chemical Society 85: 2149 (1963)) mit entweder Fmoc- oder tBoc-Chemie zugänglich. Anders als die Synthese des C-terminal-verknüpften parallelen Dimers (SEQ ID No.: 2), die die Verwendung eines orthogonal geschützten Lysinrests als anfänglichen Verzweigungspunkt erforderte, um die beiden Peptidketten in einer pseudosymmetrieschen Weise aufzubauen (Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696–1699 (1997)), war die Synthese unserer Tandem-Dimere ein einfaches, schrittweises Zusammenbauen der kontinuierlichen Peptidketten vom C- bis zum N-Terminus. Da eine Dimerisierung von TMP einen dramatischeren Effekt auf die proliferative Aktivität als die Bindungsaffinität hatte, wie für das C-terminale Dimer gezeigt (Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696–1699 (1997)), wurden die synthetischen Peptide direkt auf die biologische Aktivität in einem TPO-abhängigen Zellproliferationsassay unter Verwendung eines IL-3-abhängigen Klons von murinen 32D-Zellen getestet, die mit dem Vollängen-c-Mpl transfiziert worden waren (Palacios, R. et al., Cell 41: 727 (1985)). Wie die Testergebnisse zeigten (siehe Tabelle 1 unten), zeigten alle Polyglycin-verknüpften Tandem-Dimere eine > 1000-fache Potenzzunahme im Vergleich zu dem Monomer und waren sogar potenter als das C-terminale Dimer in diesem Zellproliferationsassay. Die absolute Aktivität des C-terminalen Dimers in unserem Assay war niedriger als die des nativen TPO-Proteins, was von den Ergebnissen, über die zuvor berichtet worden ist, abweicht, bei denen gefunden wurde, daß das C-terminale Dimer genauso aktiv wie der natürliche Ligand ist (Cwirla, S. E. et al., Science 276: 1696–1699 (1997)). Dies könnte auf Unterschieden hinsichtlich der Bedingungen beruhen, die in den beiden Assays verwendet werden. Nichtsdestotrotz zeigte die Differenz hinsichtlich der Aktivität zwischen den Tandem-Dimeren (C-Terminus des ersten Monomers verknüpft mit N-Terminus des zweiten Monomers) und der parallelen Dimere (C-Terminus des ersten Monomers verknüpft mit C-Terminus des zweiten Monomers) in demselben Assay klarerweise die Überlegenheit des Tandem-dimerisierten Produkts im Vergleich mit parallelen Dimer-Produkten. Es interessant festzustellen, daß ein großer Längenbereich durch den Linker toleriert wird. Der optimale Linker mit den ausgewählten TMP-Monomeren (SEQ ID NO:1) ist offensichtlich aus 8 Glycinen zusammengesetzt.
Andere Tandem-Dimere. Im Anschluß an diese erste Reihe von TMP-Tandem-Dimeren wurden mehrere andere Moleküle mit entweder verschiedenen Linkern oder mit Modifikationen innerhalb des Monomers selbst konstruiert. Das erste dieser Moleküle, Peptid 13, hat einen Linker, zusammengesetzt aus GPNG, eine Sequenz, von der bekannt ist, daß sie eine hohe Wahrscheinlichkeit hat, eine Sekundärstruktur vom β-Turn-Typ zu bilden. Obwohl noch ungefähr 100-fach potenter als das Monomer wurde gefunden, daß dieses Peptid > 10-fach weniger aktiv als das GGGG-verknüpfte Analog ist. Daher schien eine Einführung eines relativ steifen β-Turn an der Linker-Region eine geringfügige Verzerrung der optimalen Agonistenkonformation in dieser kurzen Linker-Form zu verursachen.
Das Trp9 in der TMP-Sequenz ist ein stark konservierter Rest bei den aktiven Peptiden, die aus Zufalls-Peptidbibliotheken isoliert worden sind. Es gibt auch ein stark konserviertes Trp in den Konsensussequenzen der EPO-mimetischen Peptide, und es wurde gefunden, daß dieser Trp-Rest an der Bildung eines hydrophoben Kerns zwischen den beiden EPO-mimetischen Peptiden (EMPs) beteiligt ist und zu den hydrophoben Wechselwirkungen mit dem EPO-Rezeptor beitrug (Livnah, O. et al., Science 273: 464–471 (1996)). In Analogie wurde davon ausgegangen, daß der Trp9-Rest im TMP eine ähnliche Funktion bei der Dimerisierung des Peptid-Liganden haben könnte, und es wurden in einem Versuch, die Effekte der durch die beiden Indolringe ausgeübten, nicht-kovalenten hydrophoben Kräfte zu modulieren und abzuschätzen, mehrere Analoge konstruiert, die aus Mutationen am Trp resultieren. Daher wurde in Peptid 14 der Trp-Rest in jedem der beiden TMP-Monomere durch ein Cys ersetzt, und eine intramolekulare Disulfidbindung wurde zwischen den beiden Cysteinen durch Oxidation gebildet, wobei davon ausgegangen wurde, daß dies die hydrophoben Wechselwirkungen zwischen den beiden Trp-Resten bei der Peptiddimerisierung nachahmt. Peptid 15 ist die reduzierte Form von Peptid 14. In Peptid 16 wurden die beiden Trp-Reste durch Ala ersetzt. Wie die Assay-Daten zeigen, waren alle drei Analoge inaktiv. Diese Daten demonstrierten weiterhin, daß Trp für die Aktivität des TPO-mimetischen Peptids wichtig ist, nicht nur für die Dimerbildung.
Die nächsten beiden Peptide (Peptid 17a und 18) enthalten jeweils in ihrem 8-Aminosäure-Linker einen Lys- oder Cys-Rest. Diese beiden Verbindungen sind Vorläufer für die beiden pegylierten Peptide (Peptid 19 und 20), bei denen die Seitenketten des Lys oder Cys durch eine Polyethylenglykol (PEG)-Gruppe modifiziert ist. Es wurde entschieden, eine PEG-Gruppe in der Mitte eines relativ langen Linker einzuführen, so daß der große PEG-Bestandteil (5 kDa) genügend weit von den wichtigen Bindungsstellen in dem Peptidmolekül entfernt ist. PEG ist ein bekanntes biokompatibles Polymer, das zunehmend als ein kovalenter Modifikator verwendet wird, um die pharmakokinetischen Profile von Peptid- und Proteinbasierenden Therapeutika zu verbessern.
Ein modulares, lösungsbasierendes Verfahren wurde für die bequeme Pegylierung von synthetischen oder rekombinanten Peptiden entworfen. Das Verfahren beruht auf der nunmehr gut etablierten chemoselektiven Ligationsstrategie, die die spezifische Reaktion zwischen einem Paar von gegenseitig reaktiven Funktionalitäten verwendet. Daher wurde für pegyliertes Peptid 19 die Lysin-Seitenkette mit einer Bromacetylgruppe voraktiviert, um Peptid 17b zu ergeben, um die Reaktion mit einem Thiol-derivatisierten PEG unterzubringen. Um dies zu erreichen, wurde eine orthogonale Schutzgruppe, Dde, für den Schutz des Lysin-ε-Amins verwendet. Wenn die gesamte Peptidkette zusammengebaut war, wurde das N-terminale Amin erneut mit t-Boc geschützt. Dde wurde dann entfernt, um die Bromacetylierung zu ermöglichen. Diese Strategie ergab ein Rohpeptid hoher Qualität, das in leichter Weise unter Verwendung von herkömmlicher Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt wurde. Die Ligation des Peptids mit dem Thiol-modifizierten PEG fand in wäßrigem Puffer bei pH 8 statt, und die Reaktion war innerhalb von 30 min abgeschlossen. Eine MALDI-MS-Analyse des aufgereinigten pegylierten Materials ergab ein charakteristisches glockenförmiges Spektrum mit einem Inkrement von 44 Da zwischen den angrenzenden Maxima. Für PEG-Peptid 20 wurde ein Cystein-Rest in die Linkerregion gebracht, und seine Seitenketten-Thiolgruppe würde als eine Anhängungsstelle für ein Maleimid-enthaltendes PEG dienen. Ähnliche Bedingungen wurden für die Pegylierung dieses Peptids verwendet. Wie die Assaydaten zeigten, hatten diese beiden pegylierten Peptide sogar eine höhere in-vitro-Bioaktivität im Vergleich mit ihren nicht-pegylierten Gegenstücken.
Peptid 21 hat in seinem 8-Aminosäure-Linker ein potentielles Glykosylierungsmotiv, NGS. Da die beispielhaften Tandem-Dimere aus natürlichen Aminosäuren, verknüpft mit Peptid-Bindungen, gemacht sind, sollte die Expression eines solchen Moleküls in einem geeigneten eukaryotischen Zellsystem ein Glykopeptid produzieren, wobei die Kohlenhydratgruppe an das Seitenketten-Carboxyamid von Asn angehängt ist. Die Glykosylierung ist ein häufiger post-translationaler Modifizierungsprozess, der viele positive Wirkungen auf die biologische Aktivität eines gegebenen Proteins haben kann, indem die wäßrige Löslichkeit und die in-vivo-Stabilität erhöht wird. Wie die Assaydaten zeigen, hielt ein Einbau dieses Glykosylierungsmotivs in den Linker die Bioaktivität hoch. Der synthetische Vorläufer des potentiellen Glykopeptids hatte im Ergebnis eine Aktivität, die vergleichbar ist mit der des -(Gly)₈-verknüpften Analogs. Es wird erwartet, daß dieses Peptid, wenn es glykosyliert ist, dieselbe Größenordnung an Aktivität hat, wie die pegylierten Peptide, wegen der ähnlichen chemophysikalischen Eigenschaften eines PEG und einer Kohlenhydratgruppe.
Das letzte Peptid ist ein Dimer eines Dimers. Es wurde hergestellt durch Oxidieren von Peptid 18, das eine intermolekulare Disulfidbindung zwischen den beiden Cystein-Resten bildete, die an dem Linker gelegen sind. Dieses Peptid wurde so konstruiert, daß es die Möglichkeit ansprach, daß TMP als ein Tetramer aktiv war. Die Assaydaten zeigten, daß dieses Peptid nicht aktiver als ein durchschnittliches Tandem-Dimer auf einer eingestellten molaren Basis war, was indirekt die Idee unterstützt, daß die aktive Form des TMP in der Tat ein Dimer ist, ansonsten hätte die Dimerisierung eines Tandem-Dimers einen weiteren Einfluß auf die Bioaktivität.
Die folgende Tabelle I faßt die relativen Aktivitäten der oben beschriebenen Verbindungen hinsichtlich ihrer relativen Potenzen zusammen, basierend auf den oben beschriebenen in-vitro-Assays.
TABELLE I
MAN BEACHTE: In Tabelle 1 weisen die Zahlen auf näherungsweise 1 log an Aktivität hin, so daß der Unterschied an Aktivität zwischen „1" und „4" näherungsweise 1000-fach ist. Eine Zunahme an 0,5 ist ein intermediärer Punkt, so daß der Unterschied in der Aktivität zwischen „1" und „3,5" näherungsweise 500-fach ist. „ND" bedeutet nicht bestimmt.
II. Das Folgende stellt beispielhafte Verfahren zum Herstellen von einigen der Verbindungen der hierin offenbarten zweiten Gruppe dar.
A. Herstellung einer Fc-Fusionsverbindung des in 6C gezeigten Typs
Eine DNA-Sequenz, die für die Fc-Region von humanem IgG1 kodiert, fusioniert im Leserahmen an ein Dimer des TPO-mimetischen Peptids (SEQ ID NO:34), wurde unter Kontrolle des luxPR-Promoter in dem Plasmid-Expressionsvektor pAMG21, wie folgt, gebracht.
Das Fusionsgen wurde konstruiert unter Verwendung von Standard-PCR-Technologie. Die Matrizen für die PCR-Reaktionen waren der Fusionsvektor, enthaltend die Fc-Sequenz und ein synthetisches Gen, das für den Rest der Verbindung von SEQ ID NO:34 kodiert. Das synthetische Gen wurde aus den 4 überlappenden Oligonukleotiden konstruiert, die unten gezeigt werden:
Die vier Oligonukleotide wurden angelagert („annealed"), um den unten gezeigten Duplex zu bilden:
SEQ ID NO:39 [co-lineare Oligonukleotide 1830-52 und 1830-54]
SEQ ID NO:40 [co-lineare Oligonukleotide 1830-53 und 1830-55]
und SEQ ID NO:41 [die kodierte Aminosäuresequenz]
Dieses Duplex wurde in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von 1830-52 und 1830-55 als die Sense- und Antisense-Primer amplifiziert.
Der Fc-Teil des Moleküls wurde in einer PCR-Reaktion mit Fc-DNA erzeugt unter Verwendung der Primer
Die Oligonukleotide 1830-51 und 1830-52 enthalten eine Überlappung von 24 Nukleotiden, was es den beiden Genen ermöglicht, im korrekten Leserahmen durch Kombinieren der obigen PCR-Produkte in einer dritten Reaktion unter Verwendung der äußeren Primer, 1216-52 und 1830-55, fusioniert zu werden.
Das finale PCR-Genprodukt (das Fusionsgen voller Länge) wurde mit Restriktions-Endonukleasen XbaI und BamHI verdaut und dann in den Vektor pAMG21 (siehe unten), ebenfalls mit XbaI und BamHI verdaut, ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente Wirtszellen des E. coli-Stamms 2596 (GM221, unten beschrieben) transformiert. Die Klone wurden auf die Fähigkeit gescreent, das rekombinante Proteinprodukt zu erzeugen und die Genfusion mit der korrekten Nukleotidsequenz zu besitzen. Die Proteinexpressionsniveaus wurden mit 50 ml Schüttelkolben-Experimenten bestimmt. Vollzell-Lysate wurden auf Expression der Fusion mittels Coomassie-gefäbten PAGE-Gelen analysiert.
Die Aminosäuresequenz des Fusionsproteins wird unter der entsprechenden Nukleotidsequenz gezeigt:

SEQ ID NO:44 [Einzelstrang-Leserichtung 5'→3' oben],
SEQ ID NO:45 [Einzelstrang-Leserichtung 3'→5' oben] und
SEQ ID NO:46 [die kodierte Aminosäuresequenz]
pAMG21
Das Expressionsplasmid pAMG21 ist von der ATCC unter Hinterlegungsnummer 98113 erhältlich, die am 24. Juli 1996 hinterlegt wurde.
GM221 (Amgen-Wirtsstamm #2596
Der Amgen-Wirtsstamm #2596 ist ein E. coli-K-12-Stamm, der so modifiziert wurde, daß er sowohl den Temperatur-empfindlichen Lambda-Repressor cI857s7 in der early-ebg-region und den lacI^Q-Repressor in der late-ebg-Region (68 Minuten) enthält. Die Anwesenheit dieser beiden Repressorgene erlaubt die Verwendung dieses Wirts mit einer Vielzahl von Expressionssystemen, jedoch sind beide dieser Repressoren für die Expression von luxP_R irrelevant. Der nicht-transformierte Wirt hat keine Antibiotika-Resistenzen.
Die Ribosomen-Bindungsstelle des cI857s7-Gens wurde modifiziert, so daß sie eine verbesserte RBS hat. Sie wurde in das ebg-Operon zwischen Nukleotid-Position 1170 und 1411 nach der Nummerierung in der Genbank-Hinterlegungsnummer M64441Gb_Ba unter Deletion der dazwischenliegenden ebg-Sequenz eingeführt.
Das Konstrukt wurde an das Chromosom unter Verwendung eines rekombinanten Phagen abgegeben, bezeichnet als MMebg-cI857s7 verbesserter RBS #4 in F'tet1393. Nach Rekombination und Auflösung verbleibt nur das oben beschriebene chromosomale Insert in der Zelle. Es wurde in F'tet/GM 101 umbenannt.
F'tet/GM101 wurde dann durch die Abgabe eines lacI^Q-Konstruktes in das ebg-Operon zwischen Nukleotidposition 2493 und 2937, nach Zählung in der Genbank-Hinterlegungsnummer M64441Gb_Ba unter Deletion der dazwischenliegenden ebg-Sequenz modifiziert.
Das Konstrukt wurde in das Chromosom unter Verwendung eines rekombinanten Phagen gegeben, bezeichnet als AGebg-LacIQ#5, in F'tet/GM101. Nach Rekombination und Auflösung verbleibt nur das oben beschriebene chromosomale Insert in der Zelle. Es wurde als F'tet/GM221 umbenannt. Das F'tet-Episom wurde aus dem Stamm unter Verwendung von Acridinorange mit einer Konzentration von 25 μg/ml in LB „herausgeheilt" („cured"). Der geheilte Stamm wurde als Tetracyclin-empfindlich identifiziert und wurde als GM221 gelagert.
Das in Plasmid pAMG21 enthaltene Fc-Fusionskonstrukt (hierin als pAMG21-Fc-TMP-TMP bezeichnet), das wiederum in dem Wirtsstamm GM221 enthalten ist, ist beim ATCC unter der Hinterlegungsnummer 98957 mit einem Hinterlegungsdatum 22. Oktober 1998 hinterlegt worden.
Expression. Die Kulturen von pAMG21-Fc-TMP-TMP in E. coli GM221 in Luria-Broth-Medium, enthaltend 50 μg/ml Kanamycin, wurden bei 37°C vor der Induktion inkubiert. Die Induktion der Fc-TMP-TMP-Genprodukt-Expression von dem luxPR-Promoter wurde nach Zugabe des synthetischen Autoinducer N-(3-Oxohexanoyl)-DL-Homoserinlakton zu dem Kulturmedium auf eine Endkonzentration von 20 ng/ml erzielt, und die Kulturen wurden bei 37°C für weitere 3 Stunden inkubiert. Nach 3 Stunden wurden die bakteriellen Kulturen mittels Mikroskopie auf die Anwesenheit von Inclusion Bodies untersucht und wurden dann mittels Zentrifugation gesammelt. Lichtbrechende Inclusion Bodies wurden in induzierten Kulturen beobachtet, was darauf hindeutet, daß das Fc-TMP-TMP am wahrscheinlichsten in der unlöslichen Fraktion in E. coli produziert wurde. Zellpellets wurden direkt durch Resuspension in Laemmli-Probenpuffer, enthaltend 10% β-Mercaptoethanol, lysiert und wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Eine intensive Coomassie-gefärbte Bande von näherungsweise 30 kDa wurde auf einem SDS-PAGE-Gel beobachtet. Das erwartete Genprodukt hätte eine Länge von 269 Aminosäuren und ein erwartetes Molekulargewicht von ungefähr 29,5 kDa. Die Fermentation wurde ebenfalls unter Standardchargenbedingungen im 10-l-Maßstab durchgeführt, was zu ähnlichen Expressionsniveaus des Fc-TMP-TMP führte, wie diejenigen, die im Laborbankmaßstab erhalten wurden.
Aufreinigung von Fc-TMP-TMP.
Die Zellen wurden in Wasser (1/10) mittels Hochdruck-Homogenisierung (2 Durchläufe bei 14.000 PSI) aufgebrochen, und Inclusion Bodies wurden mittels Zentrifugation (4200 UPM in J-6B für 1 Stunde) geerntet. Inclusion Bodies wurden in 6 M Guanidin, 50 mM Tris, 8 mM DTT, pH 8,7 für 1 Stunde bei einem 1/10-Verhältnis löslich gemacht. Die löslich gemachte Mischung wurde 20-fach in 2 M Harnstoff, 50 mM Tris, 160 mM Arginin, 3 mM Cystein, pH 8,5, verdünnt. Die Mischung wurde über Nacht unter Kälte gerührt. An diesem Punkt in der Prozedur dimerisieren die Fc-TMP-TMP-Monomer-Untereinheiten, um die Disulfidverknüpfte Verbindung mit der in 6C gezeigten Struktur zu bilden, und dann ungefähr 10-fach mittels Ultrafiltration aufkonzentriert. Sie wurde dann 3-fach mit 10 mM Tris, 1,5 M Harnstoff, pH 9, verdünnt. Der pH dieser Mischung wurde dann auf pH 5 mit Essigsäure eingestellt. Der Niederschlag wurde mittels Zentrifugation entfernt, und der Überstand wurde auf eine SP-Sepharose-Fast-Flow-Säule geladen, äquilibriert in 20 mM NaAc, 100 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml Proteinbeladung, Zimmertemperatur). Das Protein wurde unter Verwendung eines 20-Säulen-Volumen-Gradienten im selben Puffer im Bereich von 100 mM NaCl auf 500 mM NaCl eluiert. Der Pool von der Säule wurde 3-fach verdünnt und auf eine SP-Sepharose-HP-Säule in 20 mM NaAc, 150 mM NaCl, pH 5 (10 mg/ml Proteinbeladung, Zimmertemperatur) beladen. Das Protein wurde unter Verwendung eines 20-Säulen-Volumen-Gradienten im selben Puffer im Bereich von 150 mM NaCl bis 400 mM NaCl eluiert. Das Elutionsmaximum wurde vereinigt und gefiltert.
III. Das Folgende ist eine Zusammenfassung von in-vivo-Daten in Mäusen mit verschiedenen Verbindungen dieser Erfindung.
Mäuse. Normale weibliche BDF1 näherungsweise 10–12 Wochen alt.
Blutungsschema. Zehn Mäuse pro behandelter Gruppe am Tag 0, zwei Gruppen wurden 4 Tage getrennt für insgesamt 20 Mäuse pro Gruppe begonnen. Fünf Mäuse wurden zu jedem Zeitpunkt bluten gelassen, die Mäuse wurden für mindestens drei Mal die Woche bluten gelassen. Die Mäuse wurden mit Isofluran anästhetisiert, und ein Gesamtvolumen von 140–160 μl Blut wurde durch Punktur des orbitalen Sinus erhalten. Das Blut wurde auf einem Technicon H1E-Blutanalysator ausgezählt, auf dem eine Software für Mäuseblut installiert war. Die gemessenen Parameter waren weiße Blutkörperchen, rote Blutkörperchen, Hämatokrit, Hämoglobin, Blutplättchen, Neutrophile.
Behandlungen. Den Mäusen wurde entweder subkutan für eine Bolus-Behandlung eine Injektion verabreicht, oder sie bekamen micro-osmotische 7-Tage-Pumpen für eine kontinuierliche Abgabe implantiert. Subkutane Injektionen wurden in einem Volumen von 0,2 ml abgegeben. Die osmotischen Pumpen wurden in einen subkutanen Einschnitt eingeführt, der in der Haut zwischen den Scapulae von anästhetisierten Mäusen gemacht worden war. Die Verbindungen wurden in PBS mit 0,1% BSA verdünnt. Alle Experimente schlossen eine Kontrollgruppe ein, bezeichnet als „Träger", die nur mit diesem Verdünnungsmittel behandelt wurden. Die Konzentration der Testartikel in den Pumpen wurde so eingestellt, daß die kalibrierte Flußrate von den Pumpen die in den Graphen angezeigten Behandlungsniveaus ergab.
Verbindungen. Eine Dosistitrierung der Verbindung wurde an Mäuse in micro-osmotischen 7-Tage-Pumpen abgegeben. Die Mäuse wurden mit verschiedenen Verbindungen in einer einzelnen Dosis von 100 μg/kg in osmotischen 7-Tage-Pumpen behandelt. Einige derselben Verbindungen wurden dann an Mäuse als eine einfache Bolus-Injektion verabreicht.
Aktivitätstestergebnisse. Die Ergebnisse der Aktivitätsexperimente werden in 4 und 5 gezeigt. In Dosis-Antwort-Assays unter Verwendung von micro-osmotischen 7-Tage-Pumpen (Daten nicht gezeigt), wurde der maximale Effekt mit der Verbindung von SEQ ID NO:18 gesehen und war bei 100 μg/kg/Tag; Die 10 μg/kg/Tag-Dosis war ungefähr 50% maximal aktiv, und 1 μg/kg/Tag war die niedrigste Dosis, an der eine Aktivität in diesem Assay-System gesehen werden konnte. Die Verbindung in der 10 μg/kg/Tag-Dosis war ungefähr genauso aktiv wie eine 100 μg/kg/Tag nicht-pegyliertes rHu-MGDF im selben Experiment.
IV. Diskussion
Es ist allgemein akzeptiert, daß MGDF in einer Weise wirkt, die menschlichem Wachstumshormon (hGH) ähnlich ist, d. h. ein Molekül des Proteinliganden bindet zwei Moleküle des Rezeptors für seine Aktivierung (Wells, L. A. et al., Ann. Rev. Biochem. 65: 609–634 (1996))). Diese Wechselwirkung wird durch die Wirkung des viel kleineren TMP-Peptids nachgeahmt. Jedoch legen die vorliegenden Studien nahe, daß diese Nachahmung die konzertierte Aktion von 2 TMP-Molekülen erfordert, da eine kovalente Dimerisierung von TMP in entweder einer C-C-parallelen Weise oder einer C-N-sequenziellen Weise die biologische in-vitro-Potenz des ursprünglichen Monomers um einen Faktor von mehr als 10³ erhöhte. Die relativ niedrige Biopotenz des Monomers beruht wahrscheinlich auf einer ineffizienten Bildung des nicht-kovalenten Dimers. Ein vorgeformtes kovalentes Dimer hat die Fähigkeit, die Entropiebarierre für die Bildung eines nicht-kovalenten Dimers zu eliminieren, was ausschließlich durch schwache, nicht-kovalente Wechselwirkungen zwischen zwei Molekülen des kleinen Peptids mit 14 Resten angetrieben ist.
Es ist interessant, festzustellen, daß die meisten der Tandem-Dimere potenter als die C-terminalen, parallelen Dimere sind. Eine Tandem-Dimerisierung scheint dem Molekül eine besser passende Konformation zu verleihen, als es die C-C-parallele Dimerisierung tut. Das anscheinend unsymmetrische Merkmal eines Tandem-Dimers könnte es tatsächlich dem natürlichen Liganden näher gebracht haben, der, als ein unsymmetrisches Molekül, zwei verschiedene Stellen verwendet, um zwei identische Rezeptormoleküle zu binden.
Es wurde davon ausgegangen, daß die Einführung der PEG-Gruppe die in-vivo-Aktivität des modifizierten Peptides verbessert, indem sie einen Schutz gegen proteolytischen Abbau verleiht und indem ihre Clearance durch die Nierenfiltration verlangsamt wird. Es war nicht er wartet, daß die Pegylierung darüberhinaus die in-vitro-Bioaktivität eines dimerisierten Tandem-TMP-Peptids in dem Zell-basierenden Proliferations-Assay erhöhen könnte.
V. Das folgende ist eine Zusammenfassung von in-vivo-Daten in Affen mit verschiedenen Verbindungen dieser Erfindung.
Um hämatologische Paramter in weiblichen Rhesus-Affen zu bewerten, die mit der Verabreichung von TMP über subkutane Verabreichung assoziiert sind, wurde das folgende Protokoll entworfen und durchgeführt. Fünf Gruppen von drei Affen wurden jeweils zusammengebracht. Die Gruppe 1 diente als Kontrolle und erhielt Acetatpuffer (20 mM Natriumacetat, 0,25 M Natriumchlorid, pH 5), enthaltend weder TMP noch pegylierten, rekombinaten humanen MGDF (PEG-rHuMGDF). Die Gruppe 2 erhielt eine oder mehrere Dosierungen von TMP in den unten angezeigten Intervallen; Gruppe 3 erhielt 1000 μg/kg TMP in den unten angezeigten Intervallen; Gruppe 4 erhielt 5000 μg/kg TMP in den unten angezeigten Intervallen; und Gruppe 5 erhielt 100 μg/kg PEG-rHuMGDF in den unten angezeigten Intervallen.
Der Tag, an dem die erste einzelne Dosis verabreicht wurde, wurde als Tag 0 von Zyklus 1 bezeichnet. Im Zyklus 2 wurden die Dosen an den Tagen 21, 23, 25, 28, 30 und 32 verabreicht. Während Zyklus 3 wurde eine einzelne Dosis am Tag 84 verabreicht, und in Zyklus 4 wurde eine einzelne Dosis am Tag 123 verabreicht. Die Tiere wurden auf klinische Anzeichen einmal täglich während der Gewöhnungsperiode beobachtet, drei Mal täglich (vor der Dosierung, unmittelbar 30 Minuten nach der Dosierung und zwei bis drei Stunden nach der Dosierung) an den Dosierungstagen, und einmal täglich and den Nicht-Dosierungstagen. Der Nahrungsverbrauch wurde täglich berechnet, basierend auf der Anzahl an Nahrungsstücken, die gegeben wurden, und der Anzahl an Stücken, die für jedes Tier übrig gelassen wurden von 7 Tagen vor dem Beginn der Dosierungsperiode bis zum Ende der Erholungsperiode. Das Körpergewicht für jedes Tier wurde zwei Mal vor dem Dosierungsschema und zwei Mal während der Dosierungs- und Erholungs-Perioden gemessen. Die Blutproben zur Hämatologie wurden einmal vor dem Beginn der Dosierung hergestellt und einmal an den Tagen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 20, 22, 24, 26, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 55, 62, 69, 76, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 111, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 150. Für die pharmakokinetische Analyse wurden 0,5 ml Serumproben einmal vor der Dosierung und einmal 1, 4 und 24 Stunden nach der Dosierung eingesammelt. Die Proben wurden an den Tagen 0, 21, 32, 84 und 123 gesammelt und bei näherungsweise –70°C bis zur Analyse gelagert. Für die Antikörperanalyse wurden 2 ml-Blutproben eine Woche vor der einzelnen Dosis und einmal an den Tagen 0 (vor der Dosierung), 6, 13, 20, 27, 34, 41, 48, 55, 62, 69, 76, 83, 90, 97, 104, 111, 118, 129, 136, 143 und 150 gesammelt. Die Proben wurden bei –70°C bis zur Analyse gelagert.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß die Blutplättchenwerte in allen behandelten Gruppen zunahmen, wobei die größten Zunahmen bei den PEG-rHuMGDF- und den TMP-Hochdosis-Gruppen beobachtet wurden. Im Zyklus 1 wuchsen die Spitzenblutplättchenwerte näherungsweise 3,3-fach und 3,1-fach in der PEG-rHuMGDF-Gruppe (Tag 9) bzw. der 5000 μg/kg TMP-Gruppe ((Tag 9), im Vergleich mit der mittleren Blutplättchenzählung in der Kontrollgruppe. Die Blutplättchenwerte mit niedriger TMP-Dosis wuchsen näherungsweise 1,5-fach stärker als die Kontrolle an den selben spezifizierten Studientagen an. Ähnliche Antworten wurden in allen anderen Zyklen bemerkt.
Jedoch zeigte in Zyklus 4 die PEG-rHuMGDF-Gruppe einen nicht so stark zugenommenen Blutplättchenwert wie in den vorherigen Zyklen. Die PEG-rHuMGDF-Gruppe hat erhöhte Blutplättchenwerte von näherungsweise 2-fach im Vergleich zur Kontrollgruppe 9 Tage nach der Dosis dieses Zyklus. Zum Vergleich war die mittlere Blutplättchenzählung in der TMP-Gruppe mit höchster Dosis im Zyklus 4 3,3-fach höher als die Kontrollgruppe. Zusätzlich haben die PEG-rHuMGDF-Tiere einen mittleren Blutplättchenzählwert, der 53% niedriger als der mittlere Blutplättchenwert der Kontrollgruppe zum Beginn des Zyklus 4 (pro Dosis), und der mittlere Blutplättchenwert für die Gruppe am Ende des Zyklus 4* (27 Tage nach der Dosis) war 79% niedriger als der der Kontrollgruppe. Für alle TMP-Tiere waren die mittleren Blutplättchenzählwerte am Beginn und Ende von Zyklus 4 ± 15% des Blutplättchenzählwerts in der Kontrollgruppe.
In Zyklus 1 und 2 wurde ein Trend zu einer Abnahme hinsichtlich der Zählwerte der roten Blutkörperchen (RBC) bei allen behandelten Gruppen im Vergleich zur Kontrolle festgestellt. Die Abnahme war am offensichtlichsten an den Tagen 41 – 43, und die stärkste Abnahme hinsichtlich RBC wurde bei der PEG-rHuMGDF-Gruppe festgestellt. Die Zählwerte begannen zu normalen Niveaus zurückzukehren (im Vergleich zur Kontrolle) bereits am Tag 47. Die Niveaus der weißen Blutkörperchen (WBC) während der Zyklen 1 und 2 waren dramatisch angewachsen (2,6-fach) im Vergleich mit der Kontrolle am Tag 35. Eine geringfügige Zunahme wurde in der 5000 μg/kg/TMP-Gruppe am Tag 33 bemerkt. Die Werte kehrten zu normalen (Kontroll-) Niveaus zurück, beginnend am Tag 37. Eine ähnliche Antwort wurde bei Zyklus 3 ohne offensichtliche Veränderung hinsichtlich WBC im Zyklus 4 in einer beliebigen der behandelten Gruppen beobachtet.
Während des Zyklus 3 waren die RBC-Zielwerte geringfügig erniedrigt am Tag 13 (nach der einzelnen Zyklus-3-Dosis) in allen behandelten Gruppen, außer bei der 500 μg/kg TMP-Gruppe. Die RBC-Werte begannen, auf normale Werte zurückzukehren (im Vergleich mit der Kontrolle) am Tag 17.
In. Zyklus 4 nahmen die RBC-Zielwerte in allen behandelten Gruppen im Vergleich mit der Kontrolle ab, außer bei der 500 μg/kg TMP-Gruppe. Anders als in den anderen Zyklen gab es mehr als einen Nadir, der in diesem Zyklus vorhanden war. Diese Abnahme erschien von Tag 1–9 nach der Dosis und begann, sich bereits am Tag 11 zu erholen.
Die Ergebnisse zeigten an, daß eine Zunahme hinsichtlich der Zählwerte der Blutplättchen über die der Kontrolltiere 7 bis 9 Tage nach der Dosierung in allen behandelten Tieren in allen getesteten Zyklen nachgewiesen werden konnte. Es schien, daß die wiederholte Dosisphase eine höhere Antwort bei der Blutplättchenproduktion im Vergleich mit den Einzeldosisphasen bewirkte. Im Zyklus 4 war die Blutplättchenantwort, die durch die PEG-rHuMGDF-Gruppe hervorgerufen wurde, im Vergleich mit den vorherigen Zyklen und im Vergleich mit der der TMP-Antwort hoher Dosis niedriger. Die Abnahmen hinsichtlich der RBC-Zählwerte wurden in den Zyklen 1, 2, 3 und 4 in den meisten behandelten Gruppen zu einem bestimmten Punkt während jedes Zyklus der Studie festgestellt, jedoch kehrten alle Hämatologieparameter auf normale Niveaus (im Vergleich mit der Kontrolle) nach einem Aussetzen der Dosierung zurück.
Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, daß die Behandlung mit TMP in Rhesus-Affen gut toleriert wurde, und daß TMP zu erhöhten Blutplättchenzählwerten nach verschiedenen Behandlungszyklen führte. Es schien nicht, basierend auf den Blutplättchenzählergebnissen, daß es eine biologisch signifikante immun-vermittelte Antwort auf TMP gab. Im Gegensatz zeigte die Behandlung in den verschiedenen Zyklen mit PEG-rHuMGDF eine Inhibition in der Blutplättchenantwort bis zu und einschließlich Zyklus 4, was nahe legt, daß Antikörper auf PEG-rHuMGDF erzeugt worden sind und diese Anti-PEG-Antikörper mit endogenem Rhesus-TPO kreuzreagieren können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verbindung, die an einen mpl-Rezeptor bindet, umfassend die Struktur (Fc)_{m_}(L₂)_qTMP_{1_}(L₁)_{n_}TMP_{2_}(L₃)_{r_}(Fc)_p wobei TMP₁ und TMP₂ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe von Kernverbindungen, umfassend die Struktur: X_{2_}X_{3_}X_{4_}X_{5_}X_{6_}X_{7_}X_{8_}X_{9_}X₁₀ wobei X₂ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Glu, Asp, Lys und Val; X₃ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gly und Ala; X₄ Pro ist; X₅ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Thr und Ser; X₆ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Leu, Ile, Val, Ala und Phe; X₇ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Arg und Lys; X₈ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Gln, Asn und Glu; X₉ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Trp, Tyr, Cys, Ala und Phe; X₁₀ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Leu, Ile, Val, Ala, Phe, Met und Lys; und wobei L₁, L₂ und L₃ Linker-Gruppen sind, die jeweils unabhängig ausgewählt sind aus den Linker-Gruppen, bestehend aus Y_n, wobei Y eine natürlich vorkommende Aminosäure oder ein Stereoisomer davon ist und n 1 bis 20 ist; (Gly)_n, wobei n 1 bis 20 ist, und wenn n größer als 1 ist, bis zur Hälfte der Gly-Reste durch eine andere Aminosäure substituiert sein können, ausgewählt aus den verbleibenden 19 natürlichen Aminosäuren oder einem Stereoisomer davon; (Gly)₃Lys(Gly)₄ (SEQ ID NO:6); (Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID NO:7); (Gly)₃Cys(Gly)₄(SEQ ID NO:8); GlyProAsnGly (SEQ ID NO:9); ein Cys-Rest; und (CH₂)_n, wobei n 1 bis 20 ist, Fc eine Fc-Region eines Immunglobulins ist; n 0 oder 1 ist; m, p, q und r jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus 0 und 1, wobei wenigstens eins von m oder p 1 ist, und wobei weiterhin, wenn m 0 ist, dann ist q 0, und wenn p 0 ist, dann ist r 0; und physiologisch annehmbare Salze davon.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei TMP₁ und TMP₂ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: X_{2_}X_{3_}X_{4_}X_{5_}X_{6_}X_{7_}X_{8_}X_{9_}X_{10_}X₁₁; X_{2_}X_{3_}X_{4_}X_{5_}X_{6_}X₇X_{8_}X_{9_}X_{10_}X_{11_}X₁₂; X_{2_}X_{3_}X_{4_}X_{5_}X_{6_}X_{7_}X_{8_}X_{9_}X_{10_}X_{11_}X_{12_}X₁₃; X_{2_}X_{3_}X_{4_}X_{5_}X_{6_}X_{7_}X_{8_}X_{9_}X_{10_}X_{11_}X_{12_}X_{13_}X₁₄; X_{1_}X_{2_}X_{3_}X_{4_}X_{5_}X_{6_}X_{7_}X_{8_}X_{9_}X₁₀; X_{1_}X_{2_}X_{3_}X_{4_}X_{5_}X_{6_}X_{7_}X_{8_}X_{9_}X_{10_}X₁₁; X_{1_}X_{2_}X_{3_}X_{4_}X_{5_}X_{6_}X_{7_}X_{8_}X_{9_}X_{10_}X_{11_}X₁₂; X_{1_}X_{2_}X_{3_}X_{4_}X_{5_}X_{6_}X_{7_}X_{8_}X_{9_}X_{10_}X_{11_}X_{12_}X₁₃; und X_{1_}X_{2_}X_{3_}X_{4_}X_{5_}X_{6_}X_{7_}X_{8_}X_{9_}X_{10_}X_{11_}X_{12_}X_{13_}X₁₄; wobei X₂–X₁₀ wie definiert sind; X₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ile, Ala, Val, Leu, Ser und Arg; X₁₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Ser, Thr, Lys, His und Glu; X₁₂ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Gly, Ser und Gln; X₁₃ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Arg, Lys, Thr, Val, Asn, Gln und Gly; und X₁₄ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Ile, Val, Leu, Phe, Thr, Arg, Glu und Gly.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei TMP₁ und/oder TMP₂ derivatisiert sind, wie in einem oder mehreren der folgenden dargestellt: eine oder mehrere der Peptidyl [-C(O)NR-]-Verknüpfungen (Bindungen) ist/sind durch eine nicht-Peptidyl-Verknüpfung ersetzt worden, wie etwa eine -CH₂-Carbamat-Verknüpfung [CH₂-OC(O)NR-]; eine Phosphonat-Verknüpfung; eine -CH₂-Sulfonamid[-CH₂-S(O)₂NR-]-Verknüpfung; eine Harnstoff[-NHC(O)NH-]-Verknüpfung; eine -CH₂-Sekundär-Amin-Verknüpfung; oder eine alkylierte Peptidylverknüpfung [-C(O)NR⁶-, wobei R⁶ niederes Alkyl ist]; der N-Terminus ist eine NRR¹-Gruppe; an einer NRC(O)R-Gruppe; an einer -NRC(O)OR-Gruppe; an einer -NRS(O)₂R-Gruppe; an einer NHC(O)NHR-Gruppe, wobei R und R¹ Wasserstoff und niederes Alkyl sind, unter der Bedingung, daß R und R¹ nicht beide Wasserstoff sind; an einer Sucinimid-Gruppe; an einer Benzyloxycarbonyl-NH-(CBZ-NH-)-Gruppe; oder an einer Benzyloxycarbonyl-NH-Gruppe mit von 1 bis 3 Substituenten am Phenylring, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus niederem Alkyl, niederem Alkoxy, Chlor und Brom; der C-Terminus ist -C(O)R², wobei R² ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus niederem Alkoxy und NR³R⁴, wobei R³ und R⁴ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff und niederem Alkyl.
Verbindung nach Anspruch 1, die zyklisch ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei TMP₁ und TMP₂ jeweils Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Ala. (SEQ ID NO:1) sind.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei L₁, L₂ und L₃ jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Y_n, wobei Y ausgewählt ist aus einer natürlich vorkommenden Aminosäure oder einem Stereoisomer davon und n 1 bis 20 ist.
Verbindung nach Anspruch 6, wobei L₁ (Gly)_n umfaßt, wobei n 1 bis 20 ist, und wenn n größer als 1 ist, bis zu der Hälfte der Gly-Reste durch eine andere Aminosäure substituiert sein kann, ausgewählt aus den verbleibenden 19 natürlichen Aminosäuren oder einem Stereoisomer davon.
Verbindung nach Anspruch 6, wobei L₁, L₂ und L₃ unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus (Gly)₃Lys(Gly)₄ (SEQ ID NO:6); (Gly)₃AsnGlySer(Gly)₂ (SEQ ID NO:7); (Gly)₃Cys(Gly)₄ (SEQ ID NO:8); und GlyProAsnGly (SEQ ID NO:9).
Verbindung nach Anspruch 6, wobei L₁, L₂ oder L₃ einen Cys-Rest umfaßt.
Dimer der Verbindung nach Anspruch 9.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei L₁, L₂ oder L₃ (CH₂)_n umfaßt, wobei n 1 bis 20 ist.
Verbindung nach Anspruch 1, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in Mischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Polynukleotid, das für eine Verbindung nach Anspruch 6 oder 10 kodiert.
Vektor, der ein Polynukleotid nach Anspruch 14 umfaßt.
Wirtszelle, die einen Vektor nach Anspruch 15 umfaßt.
Verfahren zum Herstellen einer Verbindung nach Anspruch 6 oder 10, das das Wachsenlassen einer Wirtszelle nach Anspruch 16 in einem geeigneten Nährmedium und das Isolieren der Verbindung aus der Zelle oder dem Nährmedium umfaßt.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1–12 zur Verwendung bei einer Therapie.
Verbindung nach Anspruch 18, wobei die Therapie ein Verfahren zum Steigern der Megakaryocyten- oder Blutplättchen-Produktion in einem dafür bedürftigen Patienten ist, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge der Verbindung an den Patienten umfaßt.
Verbindung nach Anspruch 19, wobei die Menge von 1 μg/kg bis 100 mg/kg beträgt.
Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 zur Herstellung einer Medikaments zur Verwendung in einem Verfahren zum Steigern der Megakaryocyten- oder Blutplättchen-Produktion in einem dafür bedürftigen Patienten, wobei das Verfahren das Verabreichen einer wirksamen Menge der Verbindung an den Patienten umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Menge von 1 μg/kg bis 100 mg/kg ist.