CZ288926B6 - MGDF derivát, způsob jeho výroby a farmaceutický prostředek s jeho obsahem - Google Patents

Abstract

MGDF deriv t zahrnuje MGDF polypeptid zvolen² ze souboru sest vaj c ho z MGDF-1, MGDF-2, MGDF-4, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14, a MGDF-15 p°ipojen² k alespo jednomu vodorozpustn mu polymeru zvolen mu ze souboru sest vaj c ho z dextranu, poly(N-vinylpyrrolidonu), polyethylenglykolu, homopolymeru propylenglykolu, kopolymer propylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylovan²ch polyol , polyvinylalkohol a jejich sm s . Zp sob v²roby tohoto MGDF deriv tu, kde vodorozpustn²m polymerem je polyethylenglykol obsahuj c reaktivn aldehydovou skupinu, p°i n m se termin ln aldehydov² deriv t polyethylenglykolu nech reagovat s MGDF polypeptidem za p° tomnosti reduk n ho inidla a izoluje se MGDF polypeptid p°ipojen² k polyethylenglykolu obsahuj c mu reaktivn aldehydovou skupinu. Farmaceutick² prost°edek, kter² obsahuje MGDF deriv t uveden² v²Üe a farmaceuticky vhodn °edidlo, adjuvans nebo nosi .\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká derivátů proteinů, které jsou v tomto popisu označovány dvěma synonymními názvy, a to Mpl ligandy nebo MGDF. MGDF znamená „faktor růstu a vývoje megakaryocytů“ (Megakaryocyte Growth and Development Factor). Tyto proteiny stimulují růst megakaryocytů a zvyšují diferenciaci nebo maturaci megakaryocytů, což se v konečném úhrnu projevuje zvýšením počtu krevních destiček. V derivátech je molekula MGDF připojena k vodorozpustnému polymeru, například polyethylenglykolu. Vynález se také týká způsobů výroby těchto derivátů a farmaceutických prostředků s jejich obsahem.

Dosavadní stav techniky

Vynález zahrnuje přinejmenším dvě oblasti výzkumu. První z nich se týká vývoje megakaryocytů a následující produkce krevních destiček a druhý se týká polypeptidového členu třídy receptorů růstového faktoru (zde označovaného názvem Mpl receptory) a jejich ligandů. Obě tyto oblasti výzkumu budou podrobněji charakterizovány v následujícím popisu.

A. Produkce krevních destiček z megakaryocytů

Krevní destičky jsou cirkulující buňky, které hrají rozhodující úlohu při prevenci krvácení a při koagulaci krve. Megakaryocyty jsou buněčným zdrojem krevních destiček a vznikají ze společných prekurzorových buněk v kostní dřeni, z nichž vznikají všechny hematopoietické buňky. Tyto společné prekurzorové buňky jsou známy jako pluripotentní kmenové buňky nebo PPCS.

Hierarchie megakaryocytových progenitorových buněk byla definována na základě doby vzniku a velikosti megakaryocytových (MK) kolonií obsahujících se v systémech in vitro kultur v odpovědi na příslušné růstové faktory. Tzv. megakaryocyty „burst-forming un megakaryocyte“ (BFU-MK) jsou nejprimitivnějšími megakaryocytovými progenitorovými buňkami. O BFUMK se předpokládá, že konec vytvoří početné megakaryocytové jednotky vytvářející kolonie (CFU-MK), které jsou diferencovanějšími progenitovými buňkami megakaryocytů.

Při následné diferenciaci megakaryocytových buněk ztrácejí tyto buňky schopnost mitózy, ale získávají schopnost endoreduplikace. Endoreduplikace (nebo endomitóza) je buněčný jev jaderného dělení za nepřítomnosti dělení buněk. Endoreduplikací vznikají nakonec polyploidní megakaryocyty. Další maturace megakaryocytů vede k získání cytoplazmatických organel a membránových složek, které jsou charakteristické pro krevní destičky.

Krevní destičky vznikají z maturovaných megakaryocytů špatně definovaných procesem, o němž se předpokládá, že je důsledkem fyzikální fragmentace megakaryocytů nebo jiného mechanismu. Pozorování rozsáhlých membránových struktur v megakaiyocytech vedlo k vytvoření modelu tvorby krevních destiček, v němž demarkační membránový systém v hlavních rysech ohraničuje nascentní krevní destičky v těle buňky. Jiný model tvorby krevních destiček byl vyvinut na základě pozorování, že megakaryocyty tvoří dlouhé cytoplazmatické výčnělky omezené v intervalech odpovídajících velikosti krevních destiček, z nichž se krevní destičky pravděpodobně odtrhují díky tlakům vyvolaným krevním tokem v kostní dřeni a/nebo plicích. Tyto cytoplazmatické výčnělky byly nazvány Beckerem a DeBruynem (Becker a DeBruyn, Amer. J. Anat. 145: 1983 (1976)) prodestičkami, aby tak byl naznačen jejich předpokládaný prekurzorový charakter při tvorbě destiček.

Přehled různých prekurzorových buněk, které se podílejí na vývoji megakaryocytů a krevních destiček je uveden na obr. 1. Krajní buňka na levé straně obrázku představuje pluripotentní kmenovou buňku (buňku PPSC) a od nich směrem vpravo jsou umístěny buňky BFU-ML a dále pak CFU-MK. Buňka podléhající endoreduplikaci, která je umístěna na obr. 1 bezprostředně napravo od PPSC, představuje maturovanou megakaryocytovou buňku. V důsledku endomitózy se tato buňka stala polyploidní. Další struktura, směrem vpravo, zahrnuje dlouhé cytoplazmatické výčnělky vycházející z polyploidního jádra maturované megakaiyocytové buňky. Na pravém okraji obr. 1 je znázorněna řada krevních destiček, které vznikly fragmentací cytoplazmatických výčnělků.

Dále je uveden přehled některých dosavadních publikací, které se vztahují kvýše uvedenému popisu maturace megakaryocytů a produkce krevních destiček.

1. Williams, N. a Levine, R.F., British Joumal of Haematology 52: 173-180 (1982);

2. Levin, J., Molecular Biology and Differentiation of Megakaryocytes, vyd. Wiley-Liss, lne., ΙΙΟ (1990);

3. Gewirtz, A. M., The Biology of Hematopoiesis, vyd. WileyLiss, lne.: 123-132 (1990);

4. Han, Z. C., et al., Int. j. Hematol. 5: 3-14 (1991);

5. Hieuwenhuis, Η. K. a Sixma, J. New Eng. J. of med. 327: 1812-1813 (1992);

6. Long, M., Stem Cells 11: 33^10 (1993).

Dále je uveden přehled některých dosavadních publikací, které se vztahují k regulaci produkce megakaryocytů a krevních destiček:

7. Hoffman, R. et al., Blood Cells 13: 75-86 (1987);

8. Hurphy, M. J. Hematology/Oncology Clinics of North America 3 (3): 465-478 (1988);

9. Hoffman, R. Blood 74 (4): 1196-1212 (1989);

10. Mazur, Ε. M. a Cohen, J. L., Clin. Pharmacol. Ther., 46 (3): 250-256 (1989);

11. Gewirtz, A. M. a Calabretta, B., Int. J. Cell Cloning 8:267-276 (1990);

12. Williams, N:, Progress in Growth Factor Research 2: 81-95 (1990);

13. Gordon, M. S. a Hoffman, R. Blood 80 (2): 302-307 (1992);

14. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21:372-281 (1992);

15. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21:1295-1304 (1993);

Také bylo oznámeno (viz Mazur Ε. M. et al., Blood 76: 290 až 297 (1990)), že humánní aplastické sérum obsahuje kolonii megakaryocytů stimulující účinnost faktoru stimulujícího granulocytovou kolonii a faktorů přítomných v médiu kondicionované lymfocyty, odlišnou od IL-3. Molekula zodpovědná za tuto účinnost však za dosavadního stavu techniku nebyla izolována ani charakterizována.

-2CZ 288926 B6

C. Receptory Mpl

Virus myeloproliferativní leukémie (MPLV) je myší replikačně defektní retrovirus vyvolávající akutní leukémii u infikovaných savců. Zjistilo se, že gen exprimující MPLV se skládá zčásti genu kódujícího obal retrovirů (nebo vnější proteinový plášť) viru fúzovaného k sekvenci, která je příbuzná třídě receptorů cytokinu zahrnující receptory GM-CSF, G-CSF a EPO.

Exprese genu MPLV popsaná výše má zajímavou biologickou vlastnost způsobující, že myší progenitorové buňky různých typů ihned nabývají závislost na růstovém faktoru při proliferaci a terminální maturaci. Kromě toho některé kultury buněk kostní dřeně akutně transformované MPLV obsahují megakaryocyty, což naznačuje, že existuje spojení mezi genem MPLV a růstem a diferenciací megakaryocytů.

V současné době je známo, že gen viru MPLV (označovaný zkratkou v-Mpl) má v savčích buňkách homolog označovaný názvem buněčný gen Mpl (c-Mpl). Za použití vzorků získaných zv-Mpl byla klonována cDNA odpovídající humánnímu genu c-Mpl (viz přihláška PCT s číslem WO 92/07074, publikovaná 30. duna 1992, která je blíže charakterizována dále). Sekvenční analýza ukázala, že protein kódovaný produktem genu c-Mpl patří k vysoce konzervované supertřídě receptorů cytokinu podobně jako homologický produkt v genu v-Mpl.

O tomto buněčném genu, c-Mpl, se předpokládá, že má svou funkční úlohu při hemotopoiesi. Tento předpoklad je založen na pozorování, že jeho exprese byla zjištěna pomocí ochrany RNAsovou próbou a experimenty RT-PCR v kostní dřeni, slezině a fetálních játrech normálních myší, ale nikoliv v jiných tkáních. c-Mpl je zejména exprimován na megakaryocytech. Také bylo ukázáno, že humánní buněčný gen, humánní c-Mpl, je exprimován v CD34 pozitivních buňkách obsahujících purifíkované megakaryocyty a krevní destičky. CD34 je antigen, který je indikativní pro časné hematopoietické progenitorové buňky. Kromě toho expozice CD34 pozitivních buněk syntetickým oligodeoxynukleotidům, které jsou pozitivní vzhledem k c-Mpl mRNA nebo informaci, významně inhibují schopnosti vytvářet kolonie u megakaryocytových progenitorů CFU-MK, ale nemají žádný účinek na erythroidní nebo granulomakrofágové progenitory.

Výše uvedené údaje a pozorování naznačují, že c-Mpl kóduje molekulu povrchu buňky, která je zde označována názvem receptor Mpl. Tato molekula se váže k ligandů aktivujícímu receptor, přičemž možná dochází k produkci a/nebo vývoji megakaryocytů.

Patentová přihláška PCT s číslem WO 92/07074 je zaměřena na sekvenci proteinu produkovaného genem c-Mpl, a to jak z humánního, tak z myšího zdroje. Tento genový produkt, o němž se předpokládá, že je receptorem, jak to bylo vysvětleno výše, je sestaven z alespoň tří obecných oblastí nebo domén: extracelulámí domény, transmembránové domény a intracelulámí (nebo cytoplazmatické domény). Spolu spojeny vytvářejí tyto domény intaktní receptor Mpl. Citovaná publikace PCT se také týká rozpustné formy tohoto receptoru, která v podstatě odpovídá extracelulámí doméně maturovaného proteinu c-Mpl. Tato intracelulámí doména obsahuje hydrofobní oblast, která, je-li připojena prostřednictvím tramsmembránové oblasti k extracelulámí doméně proteinu, dodává celému proteinu agregovatelnost a nerozpustnost. Když se na druhé straně extracelulámí doména produktu genu c-Mpl oddělí od transmembránové domény a intracelulámí domény, stane se rozpustnou. Proto je extracelulámí forma proteinu označována názvem „rozpustná“ forma tohoto receptoru.

Následuje přehled několika dosavadních publikací vztahujících se kvýše uvedenému popisu receptorů a genů v-Mpl a c-Mpl.

17. Wendling, R., et a., Leukemia 3 (7): 475-480 (1989);

18. Wendling, R., et al., Blood 73 (5): 1161-1167 (1989);

-3CZ 288926 B6

19. Souyri, M., et a., Cell 63: 1137-1147 (1990);

20. Vigon, I., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5640-5644 (1992);

21. Škoda, R.C., et al., The EMBO Joumal 12 (7): 2645-2653 (1993);

22. Ogawa, M., Blood 81 (11): 2844-2853 (1993);

23. Methia, N., et a., Blood 82 (5): 1395-1401 (1993);

24. Wendling F., et a., Blood 80: 246A (1993).

D. Potřeba činidla schopného stimulovat produkci krevních destiček

Nedávno bylo oznámeno, že v lékařských centrech v Severní Americe, západní Evropě a Japonsku stále stoupá počet provedených transfuzí krevních destiček (viz Gordon, M.S., a Hoffman, R., Blood 80 (2): 302 až 307 (1992). Tento nárůst se zdá být do značné míry zapříčiněn pokrokem v lékařské technice a větším přístupem k takovým technikám, jako jsou srdeční chirurgie a transplantace kostní dřeně, srdce a jater. K velké poptávce po zásobách krevních destiček přispěla také intenzifikace dávek podávaných při léčbě pacientů postižených rakovinou a epidemie HIV-1.

Používání krevních destiček nese s sebou možnost přenosu různých infekčních chorob přenosných krví, jakož i alloimunizace. Kromě toho, produkce krevních destiček je nákladná záležitost, a proto zvyšující se použití krevních destiček významně zvyšuje celkové náklady na léčení. V důsledku toho existuje akutní potřeba vyvinout nové a zlepšené metody produkce krevních destiček pro humánní aplikace.

Jako příklady až dosud známých pokusů o zvýšení produkce krevních destiček je možno uvést následující prameny.

V US patentu č. 5 032 396 bylo oznámeno, že interleukin-7 (IL-7) je schopen stimulovat produkci krevních destiček. Interleukin-7 je také znám pod označením lymfopoietin-1 a jedná se o lyofopoietický růstový faktor, kteiý je schopný stimulovat růst B- a T-buněčných progenitorů v kostní dřeni. Publikovaná přihláška PCT WO 89/03 884 a patent EP 314 415 popisuje DNA, vektoiy a způsoby produkce savčích IL-7 proteinů technikou rekombinace DNA. Data uvedená v tomto US patentu ukazují, že IL-7 může zvýšit množství cirkulujících krevních destiček v normálních a subletálně ozářených myších.

V US patentu č. 5 087 448 se uvádí, ž megakaryocyty a krevní destičky je možno stimulovat kproliferaci v savcích tím, že se na ně působí interletikinem-6. Rekombinantní humánní interleukin-6 je glykoprotein o molekulové hmotnosti 26 000, který má několik biologických účinností. Data uvedená v tomto patentu ukazují, že IL-6 nemá žádný účinek na zvětšování kolonií megakaryocytů in vitro.

Žádný zvýše uvedených patentů neuvádí informace vztahující se kligandům Mpl, které se podílejí na předloženém vynálezu.

Přes existenci výše uvedených publikací existuje nadále silná potřeba vyvinout nové stimulátory

-4CZ 288926 B6

E. Obor vztahující se k chemicky modifikovanému MGDF

Proteiny pro terapeutické použití jsou v současné době dostupné ve vhodných formách a množstvích, zejména v důsledku pokroku dosaženého v technologiích rekombinace NA. Funkce skupiny chemických derivátů takových proteinů mohou účinně bránit proteolytický enzymům ve fyzickém stylu s hlavním řetězcem proteinu, a tak zabraňovat jejich degradaci. Přídavnými výhodami jsou za určitých okolností zvýšení stability a doby cirkulace terapeutického proteinu a snížení imunogenicity. Je však třeba zdůraznit, že účinek modifikace konkrétního proteinu nelze předvídat. Přehledný článek popisující modifikaci proteinu a fúzování proteinů je uveden v publikaci Francis, Focus on Growth Factors 3 : 4 až 10 (květen 1992); Vyd. Mediscript, Mountview Court, Friem Bamet Lané, Londýn N20, OLD, Velká Británie).

Jednou takovou látkou, která se používá pro přípravu chemických skupin terapeutických proteinových výrobků je polyethylenglykol („PEG“ nebo „peg“). tak například Adegen®, což je pegylovaná adenosin deamináza, je přípravek schválený pro léčení závažné kombinované imunodeficientní choroby; pegylovaná superoxid dismutáza byla klinicky zkoušena při léčení poškození hlavy; pegylovaný α-interferon byl zkoušen ve fázi I klinických zkoušek léčby hepatitis; a bylo oznámeno předklinické zkoušení pegylovaná glukocerebrosidázy a pegylovaného hemoglobinu. Bylo ukázáno, že u některých proteinů způsobuje připojení polyethylenglykolu ochranu před proteolýzou (Sada et al., J. Fermentation Bioingeneering 71. 137 až 139 (1991)) a jsou k dispozici metody umožňující připojení určitých polyethylenglykolových skupin (viz US patent č. 4 179 337, Davis et al., „Non-Immunogenic Polypeptides“, patent vydán 18. prosince 1979; a US patent č. 4 002 531, Royer, „Modifying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby“, patent vydán 11. ledna 1977). Přehled je uveden v publikaci Abuchowski et al., Enzymes as Drugs (J. S. Holcerberg aj. Roberts eds., str. 367 až 383 (1981)).

Pro modifikaci proteinů bylo použito jiných vodorozpustných polymerů, jako je kopolymery ethylenglykolu a propylenglykolu, karboxymethylcelulóza, dextran, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon, poly-l,3-dioxolan, poly-l,3,6-trioxan, kopolymer ethylenu a maleinanhydridu a polyaminokyseliny (buď homopolymery nebo statistické kopolymery).

V případě polethylenglykolu bylo použito řada různých prostředků pro připojení polyethylenglykolových molekul k proteinu. Obvykle se molekuly polyethylenglykolu připojují k proteinu prostřednictvím reaktivních skupin obsažených v proteinu. Pro takové připojení se hodí aminoskupiny, jako například aminoskupiny v lysinových zbytcích nebo u N-konce. Tak například Royer (US patent č. 4 002 531, viz výše) uvádí, že pro připojení polyethylenglykolových molekul k enzymu bylo použito redukční alkylace. V EP 0 539 167 (datum publikace: 28. dubna 1993; Wright, „Peg Imidates and Protein Derivates Thereof“) se uvádí, že peptidy a organické sloučeniny svolnou nebo volnými aminoskupinami se modifikují imidátovým derivátem PEG nebo příbuzného vodorozpustného organického polymeru. US patent č. 4 904 584 (Shaw, patent vydán 27. února 1990) se týká modifikace řady lysinových zbytků v proteinech za účelem připojení molekul polyethylenglykolu prostřednictvím reaktivních aminoskupiny.

Jedním specifickým terapeutickým proteinem, který byl chemicky modifikován, je faktor stimulující kolonii granulocytů, „G-CSF“ (viz Evropské patentové publikace č. EP 0 401 384, EP 0 473 268 a EP 0 335 423).

Jako dalším příkladem je možno uvést pegylovaný interleukin-6 (IL-6) popsaná v EP 0 442 724 o názvu „Modified hIL-6“ (viz dosud nevyřízenou patentovou přihlášku USA s podacím číslem 07/632070). V těchto publikacích je popsáno připojení polyethylenglykolových molekul k IL-6. VEP0 154 316 (datum publikace: 11. září 1985) je popsána reakce lymfokinu s aldehydem polyethylenglykolu.

-5CZ 288926 B6

Schopnost modifikace MGDF není v tomto oboru známa, poněvadž susceptibilita každého jednotlivého proteinu k modifikaci je určena specifickými strukturami parametry takového proteinu. Kromě toho nelze na základě znalostí v tomto oboru předvídat účinek takové modifikace na biologické vlastnosti konkrétního proteinu. S ohledem na řadu klinických aplikací MGDF (viz výše) je žádoucí, aby byl k dispozici derivatizovaný MGDF s modifikovanými vlastnostmi. Takové molekuly by mohly vykazovat zvýšený poločas životnosti a/nebo zvýšenou účinnost in vivo, jakož i jiné vlastnosti.

Pegylace molekul proteinu má obvykle za následek vznik směsi chemicky modifikovaných proteinových molekul. Jako ilustrativní příklad je možno uvést, že reakcí molekuly proteinu s pěti lysinovými zbytky a volnou aminoskupinou u N-konce se za použití výše uvedených metod může získat heterogenní směs látek, z nichž některé obsahují 6, jiné 5, další 4, další 3, 2, 1 nebo žádný polyethylenglykolový zbytek. Navíc ještě u molekul s několika polyethylenglykolovými zbytky nemusí být tyto zbytky připojeny ve stejných místech. Často bude žádoucí získat homogenní produkt, který bude obsahovat v podstatě pouze jeden nebo malý počet (například 2 až 3) druhů modifikovaného proteinu, lišících se od sebe počtem a/nebo umístěním chemických skupin, jako jsou skupiny PEG. Při určité terapeutické indikaci mohou být nicméně směsi například mono-, di- a/nebo tripegylovaných látek někdy žádoucí nebo tolerovatelné.

Variabilita získaných směsí od várky k várce může být nevýhodná při vývoji terapeutického pegylovaného proteinového produktu. Při takovém vývoji je důležitou vlastností předvídatelnost biologické účinnosti. Tak například bylo ukázáno, že v případě neselektivní konjugace superoxid dismutázy s polyethylenglykolem bylo několik frakcí modifikovaného enzymu úplně inaktivních (P. McGoff et al., Chem. Pharm. Bull., 36: 3079 až 3091 (1988). Podobně se v publikaci Rose et al., Bioconjugate Chemistry 2: 154 až 159 (1991) uvádí selektivní připojení linkerové skupiny karbohydrazidu k C-terminální karboxyskupině proteinového substrátu (inzulínu). Takové předvídatelnosti vlastností terapeutického proteinu nelze dosáhnout, když se jeho složení mění od várky k várce. Některé polyethylenglykolové skupiny nemusí být vázány tak pevně v někteiých místech jako jiné, a to může mít za následek, že dojde k disociaci takových skupin od proteinu. Je samozřejmé, že jsou-li skupiny připojeny nepravidelně, a jsou-li tedy i nepravidelně disociovány, farmakokinetiku terapeutického proteinu není možno přesně předvídat.

Také by bylo vysoce žádoucí vyvinout derivatizovaných MGDF produkt, který by neobsahoval žádnou spojovací skupinu mezi polymemím zbytkem a zbytkem MGDF. Jedním problémem společným pro výše uvedené metody je, že tyto metody obvykle vyžadují přítomnosti spojovací skupiny mezi molekulou proteinu a molekulou polyethylenglykolu. Tyto spojovací skupiny mohou být antigenní, což je také nevýhodou při vývoji terapeutického proteinu.

Způsob, na němž se nepodílí žádná spojovací skupina, je popsán v Francis et al., v „Stability of Protein pharmaceucals: in vivo pathways of degradation and strategies for protein stabilization“ (Eds. Ahem., T. and Manning, M. C.) Plenům, New York, 1991). Také metoda, kterou popsali Degrado et al., „Coupling of PEG to Protein By Activation witn Tresyl chloride, Applications In Immunoaffmity Cell Preparation“ v Fisher et al., ed., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenům Press, New York, NY, 1989, str. 211 až 213, zahrnuje použití tresylchloridu, což má za následek, že mezi zbytkem polyethylenglykolu a zbytek proteinu není přítomna žádná spojovací skupina. Tato metoda je obtížně použitelná pro výrobu terapeutických produktů, poněvadž použití tresylchloridu může vést ke vzniku toxických vedlejších produktů.

Chamov et al. (Bioconjugate Chem. 5: 133 až 140 (1994)) popisují modifikace CD4 imunoadhesinu monomethoxypolyethylenglykol („MePEG glykol“) aldehyd redukční alkylací. Autoři uvádějí, že 50 % CD4-Ig je MePEG-modifikováno selektivní reakcí na a-aminoskupině u N-konce (tatáž publikace, str. 137). Autoři také uvádějí, že in vitro vazebná schopnost modifikovaného CD4-Ig (k proteinu gq 120) se snižuje v míře korelovatelné se stupněm mePEGylace (viz výše uvedená citace).

-6CZ 288926 B6

Existuje tedy potřeba vyvinout deriváty MGDF, zejména pegylovaný MGDF. Také existuje potřeba vyvinout metody nebo způsoby provádění takové derivatizace.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou chemicky modifikované MGDF obsahující zbytek MGDF proteinu připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému polymeru.

Konkrétně je předmětem vynálezu MGDF derivát zahrnující MGDF polypeptid zvolený ze souboru, sestávajícího z

MGDF-1 obsahujícího aminokyseliny 22 až 353 z obr. 11, MGDF-2 obsahujícího aminokyseliny 22 až 195 z obr. 11, MGDF-4 obsahujícího aminokyseliny 22 až 172 z obr. 11, MGDF-11 obsahujícího aminokyseliny 22 až 184 z obr. 11, MGDF-12 obsahujícího aminokyseliny 27 až 353 z obr. 11, MGDF-13 obsahujícího aminokyseliny 27 až 195 z obr. 11, MGDF-14 obsahujícího aminokyseliny 27 až 172 z obr. 11 a MGDF-15 obsahujícího aminokyseliny 27 až 184 z obr. 11, připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému polymeru zvolenému ze souboru, sestávajícího z dextranu, poly(N-vinylpyrrolidonu), polyethylenglykolu, homopolymeru propylenglykolu, kopolymerů prolyneoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylovaných polyolů, polyvinylalkoholů a jejich směsí.

Dále je předmětem vynálezu způsob výroby MGDF derivátu podle nároku 1, kde vodorozpustným polymerem je polyethylenglykol obsahující reaktivní aldehydovou skupinu, jehož podstata spočívá v tom, že se terminální aldehydový derivát polethylenglykolu nechá reagovat sMGDF polypeptidem za přítomnosti redukčního činidla a izoluje se MGDF polypeptid připojený k polyethylenglykolu obsahujícímu reaktivní aldehydovou skupinu.

Konečně je předmětem vynálezu také farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje MGDF derivát definovaný výše a farmaceuticky vhodné ředidlo, adjuvans nebo nosič.

Vynález zejména zahrnuje chemicky modifikovaný MGDF, který je reakčním produktem MGDF s reaktivními molekulami polyethylenglykolu, v němž jsou skupiny PEG připojeny k MGDF. Takového připojení je možno dosáhnout pegylačními reakcemi uvedenými v tomto popisu, jako je acylace nebo alkylace. Acylace nebo alkylace pomocí PEG se může provádět za podmínek, při nichž je hlavní produkt monopegylován nebo polypegylován. Polypegylace obvykle zahrnuje připojení PEG k epsilon-aminoskupinám lysinových zbytků a může přídavně zahrnovat pegylaci N-konce polypeptidu. Monopegylace přednostně zahrnuje připojení PEG k a- aminoskupině u N-konce proteinu. Výtěžek a homogenitu monopegylační reakce je možno zvýšit použitím takového typu redukční alkylace, kteiý selektivně modifikuje α-aminoskupinu N-terminální zbytky MGDF proteinu. Tím se zajistí selektivní připojení vodorozpustného polymemího zbytku k N-konci proteinu. Tak se získá v podstatě homogenní přípravek tvořený konjugátem molekul polymeru a MGDF proteinu, jakož i (v případě že se použije polethylenglykolu) přípravek zahrnující molekuly MGDF proteinu, v nichž je polyethylenglykolový zbytek přímo kopulován k proteinovému zbytku.

Jiným aspektem tohoto vynálezu jsou farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství izolovaného přírodního nebo rekombinantního Mpl ligandu, které jsou derivatizovány vodorozpustným polymerem, jako je polyethylenglykol, v kombinaci s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem. Takovým farmaceutickým prostředkům se může použít při léčení chorobných stavů nebo poruch, které jsou charakteristické nedostatkem megakaryocytů

-7CZ 288926 B6 a/nebo krevních destiček, jakož i in vivo deficiencí Mpl ligandu. Také se jich může používat profylakticky pro zlepšení očekávané defícience megakaryocytů nebo krevních destiček (například v důsledku chirurgického zásahu).

Mpl ligandů podle vynálezu se může používat při léčení aplastických anemií, například pro zvýšení produkce krevních destiček u pacientů se zhoršenou produkcí krevních destiček (jako jsou pacienti postižení AIDS nebo pacienti, u kterých je aplikována chemoterapie rakoviny). Mpl ligandu se může použít pro léčení krevních poruch, jako je trombocytopenie. Mpl ligandu se také může použít jako adjuktivní terapie u pacientů, kterým byla transplantována kostní dřeň. Těmito pacienty mohou být lidé nebo jiní savci. Očekává se, že Mpl ligand z jednoho druhu bude užitečný i u jiného druhu.

Derivatizovaným Mpl ligandům podle vynálezu je možno použít k léčení těchto a jiných patologických stavů, k nimž dochází v důsledku nedostatku krevních destiček. Při tomto léčení se pacientům podává terapeuticky účinné množství farmaceutického prostředku popsaného výše. Takové terapeutické metody mohou zahrnovat podávání (simultánní nebo postupné) Mpl ligandu, účinného množství alespoň jednoho jiného faktoru stimulujícího megakaryocytovou kolonii, cytokinu (například EPO), rozpustného Mpl receptoru, hematopoietinu, interleukinu, růstového faktoru nebo protilátky.

Jiné aspekty a výhody tohoto vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu přednostních provedení tohoto vynálezu.

Rada charakteristických znaků a výhod tohoto vynálezu je zřejmá z popisu, v němž se používá odkazů na připojené obrázky.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn přehled vývoje a maturace megakaryocytů a krevních destiček.

Obr. 2 ukazuje, že rozpustný myší Mpl receptor v podstatě úplně inhibuje schopnost plazmy ozářených psů („aplastické psí plazmy“ či „APK9“) indukovat vývoj megakaryocytů. Přitom je použito stanovení vývoje magakaryocytů popsané v příkladu 2.

Obr. 3 ukazuje, že aktivita získaná obohacováním z APK9 lektinovou afinitní chromatografií a Mpl receptorafinitní chromatografií (za použití Mpl ligandu) stimuluje růst buněk 1-A6.1 a že rozpustný myší Mpl receptor blokuje tento růst.

Na obr. 4 je uveden přehled purifikačních stupňů při purifikaci 25 a 31kDa formy psího Mpl receptoru z aplastické psí plazmy.

Obr. 5 ukazuje purifikace Mpl ligandu pomocí HPLC s obrácenými fázemi (RP-HPLC). Frakce 21 obsahuje vysoce purifikovaný 31kDa Mpl ligand, frakce 22 obsahuje směs 31kDA a 25kDa Mpl ligandu a frakce 23 obsahuje vysoce purifikovaný 25kDA Mpl ligand.

Na obr. 6 je znázorněno pozorování aktivity Mpl ligandu frakce obsahující 25dKA a/nebo 31kDa protein Mpl ligandu při HPLC s obrácenými fázemi (sloupec C4).

Obr. 7 ukazuje počet megakaryocytů produkovaných v kulturách CD34-selektovaných buněk periferní krve stimulovaných APK9, Mpl ligandem a různými jinými faktory.

Obr. 8 ukazuje počet všech leukocytů produkovaných v kulturách CD34-selektovaných buněk periferní prve stimulovaných APK9, Mpl ligandem a různými jinými faktory.

-8CZ 288926 B6

Obr. 9 ukazuje procentní podíl megakaryocytů produkovaných v kulturách CD34-selektovaných buněk periferní krve stimulovaných APKP, Mpl ligandem a různými jinými faktoiy.

Obr. 10 ukazuje, že humánní IL-3 se nepodílí na vývoji megakaryocytů indukovaném Mpl ligandem.

Obr. 11 ukazuje cDNA a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci humánního MGDF-1 a MGDF-2.

Obr. 12 ukazuje cDNA a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci humánního MGDF-3.

Obr. 13 ukazuje porovnání mezi MGDF-1 a dalšími MGDF (Mpl ligandy) z psího zdroje (A) a myšího zdroje (B).

Na obr. 14 je znázorněn příklad acylace MGDF za použití reaktivních N-hydroxysukcinimidyl (NHS) esterů monomethoxypolyethylenglykolu, která vede k polypegylovanému produktu.

Na obr. 15 je znázorněn příklad nespecifické redukční alkylace MGDF za použití monomethoxypolyethylenglykolaldehydů, která vede k polypegylovanému produktu.

Na obr. 16 je znázorněn příklad místně specifické redukční alkylace MGDF na a-aminoskupině N-terminálního zbytku za použití monomethoxypolyethylenglykolaldehydů, při níž vzniká v podstatě monopegylovaný produkt.

Na obr. 17 je znázorněna analýza HPLC, při níž dochází k vylučování molekul podle velikosti (SEC), konjugátů MePEG-MGDF připravených za použití aktivovaných derivátů MePEG o molekulové hmotnosti 20 kDa:

A) poly-mePEG-MGDF konjugát připravený acylací MGDF NHS-esterem MePEG (PEG 11),

B) poly-mePEG-MGDF konjugát připravený alkylací MGDF MePEG aldehydem (PEG 20),

C) poly-mePEG-MGDF konjugát připravený alkylací MGDF MePEG aldehydem (PEG 16).

Na obr. 18 jsou znázorněny počty krevních destiček u myší ošetřených rekombinantním humánním HGDF: kosočtverce = 22-353 MGDF pocházející z buněk CHO; otevřené kroužky = nepegylovaný 22-184 MGDF z E. coli (tj. 1-163 MGDF); a uzavřené kroužky = pegylovaný 22184 MGDF z E. coli.

Na obr. 19 je znázorněno purifíkační schéma r-HuMGF.

Na obr. 20 je znázorněn účinek r-HuMGDF (E. coli 1-163 na počet destiček u myšího karboplatinového modelu, myším Balb/c se intraperitoneálně injekčně podá jediná dávka karboplatinu (1,25 mg/myš) v den 0. Skupina, jejíž se podává pouze excipient, neobdrží karboplatin. Po 24 hodinách se zvířatům ošetřeným karboplatinem subkutánně injekčně podává buď excipient nebo 100 pg/kg r-HuMGDF denně až do konce studie (počet zvířat ve skupině (n) je 10, střídavě se odebírá krev vždy 5 zvířatům).

Na obr. 21 je znázorněn účinek rHuMGDF (E. coli 1-163) na počet krevních destiček u myší ošetřených zářením. Myši Balb/c se ozáří jednou dávkou gamma záření 500 rad z ceziového zdroje v den 0. Skupina, jíž se podává pouze excipient není ozařována. Po 24 hodinách se ozářeným zvířatům podává subkutánní injekcí buď excipient nebo 100 pg/kg rHuMGDF každý den, až do konce studie (počet zvířat ve skupině (n) = 8, střídavě se odebírá krev vždy čtyřem zvířatům).

Na obr. 22 je znázorněn účinek rHuMGDF (E. coli 1-163) na počet krevních destiček u myší ošetřených kombinací ozařování a karboplatinu. Myši Balb/c se ozáří jednou dávkou gamma

-9CZ 288926 B6 záření 500 rad zceziového zdroje a podá se. jim karboplatin (1,25 mg/myš) v den 0. Po 24 hodinách se exponovaným zvířatům podává subkutánní injekcí buď excipient nebo 100 pg/kg rHuMGDF každý den, až do konce studie (počet zvířat ve skupině (n) = 8). Bez podpory rhuMGDF většina zvířat studii nepřežije. V kontrolní skupině přežije 1 zvíře z 8, zatímco v ošetřené skupině přežije 8 zvířat z 8.

Na obr. 23 je znázorněn účinek r-HuMGDF (E. coli 1-163) na trombocytopenii indukovanou ozářením u opic rhesus. Opice rhesus se ozáří 700 cGy ze zdroje Co-80. Počínaje 24 hodinami po ozáření se opicím po dobu dalších 18 dnů subkutánně podává r-HuMGDF (n = 3) nebo humánní sérový albumin (n = 9) (vždy v dávce 25 pg/kg/den). Analýza krevních buněk se provádějí pomocí elektronického analyzátoru krevních buněk. Každý symbol představuje průměrnou hodnotu (± směrodatná odchylka).

Na obr. 24 je znázorněn účinek pegylovaného a glykosylovaného r-HuMGDF na počet krevních destiček u myší ošetřených karboplatinem a ozařováním. Myši se podrobí kombinovanému účinku karboplatinu a ozařování způsobem popsaným ve studii znázorněné na obr. 22. Subkutánní injekce uvedeného přípravku r-HuMGDF (50 pg/kg/den) se podávají každý den po celou délku studie, počínaje 24 hodinami po inzultu. Počty krevních destiček se zjišťují označený den za použití elektronického počítače buněk (Sysmex, Baxter).

Obr. 25 ukazuje syntetickou genovou sekvenci rekombinantního humánního MGDF, aminokyseliny 1 až 163, mající E. coli optimalizované kodony.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Nové faktory povzbuzující růst savčích megakaiyocytů a/nebo produkující krevní destičky, kteréžto faktory jsou označovány názvem Mpl ligandy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou homogenní proteiny, které v podstatě nejsou spojeny s jinými proteinovými látkami. Přednostně jsou tyto proteiny z asi 90 %, výhodněji z asi 95 % a nejvýhodněji více než 98 % prosté jiných proteinů. Je možno je produkovat rekombinantními technikami, kterými je možno zajistit produkci velkých množství čistého aktivního Mpl ligandu užitečného pro terapeutické aplikace. Alternativně lze tyto proteiny získat v homogenní formě ze savčí aplastické krve, plazmy nebo séra, nebo ze savčí buněčné linie vylučující nebo exprimující Mpl ligand. Mpl ligand nebo jeho účinné fragmenty je dále také možno syntetizovat chemicky.

Pod obecným označením „Mpl ligandy“, jak se ho používá v popisu tohoto vynálezu, rozumějí Mpl ligandy popsané v tomto popisu, jakož i jejich účinné fragmenty a varianty, které jsou podrobněji popsány dále.

Přednostní Mpl ligandy z psího zdroje mají zdánlivou molekulovou hmotnost přibližně 25 a 31 kDA podle stanovení elektroforézou na polyakrylamidovém gelu za použití dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) ze neredukčních podmínek. Oba proteiny se purifikují podle stejného purifikačního protokolu, který je podrobně popsán v příkladové části uvedené dále. Tak například oba tyto Mpl ligandy vážou lektin z pšeničných klíčků a imobilizovaný Mpl receptor. 25kDa forma zahrnuje následující aminokyselinovou sekvenci SEW ID NO: 1:

Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-ValLeu-His-Xaa-Arg-Leu-Xaa-Gln-Xaa-Pro-Asp-Ile-Tyr lkDa forma zahrnuje následující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2:

Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-ValLeu-His

-10CZ 288926 B6

Aminokyseliny označené zkratkou „Xaa“ v SEQ ID NO: 1 a 2 nejsou s určitostí známy, ale předpokládá se, že se jedná o cystein, serin, threonin nebo (méně pravděpodobně) tryptofan.

Zvýše uvedených sekvencí je zřejmé, že 31kDA ligand obsahuje přinejmenším část 25kDA formy. Zejména prvních 21 aminokyselin 31kDA proteinu se přesně shoduje s aminokyselinami ve 25kDa proteinu. Tento důkaz, a zejména skutečnost, že oba tyto proteiny vykazují účinnost při stanovení aktivity Mpl ligandu charakterizovaného v tomto popisu, vede k závěru, že oba tyto proteiny jsou velmi příbuzné, jak pokud se týče struktury, tak pokud se týče účinnosti. Je pravděpodobné, že 31kDA forma tohoto proteinu se od 25kDA formy liší v odlišné C-terminální sekvenci, odlišné glykosylaci a/nebo odlišném sestřihu genu kódujícího typu proteiny.

Kromě informací, vztahujících se ke složení sekvence, uvedených výše, během sekvenování 25kDA pásu před závěrečným purifikačním stupněm (za použití HPLC s obrácenými fázemi) byla stanovena další sekvence. Tato sekvence je připojena k 25kDA pásu za neredukčních podmínek, ale nikoliv za redukčních podmínek, což ukazuje, že se jedná o výsledek štěpení 25kDA proteinu na dvě části (například proteázou), přičemž tyto části jsou spojeny disulfidovou vazbou. Tato sekvence (SEQ ID NO: 3) má následující složení:

Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-V al-Leu-Gly-Ala-V al-Ala-Leu

Přestože přesné umístění SEQ ID NO: 3 v sekvenci 25kDA proteinu není jasné, soudí se na základě analogie s jinými cytokiny, jako je erythropoietin, že by tato sekvence mohla být umístěna v 25kDA proteinu v blízkosti aminokyseliny s číslem 114. Je pravděpodobné, ačkoliv to nebylo dosud prokázáno, že sekvence SEQ ID NO: 3 se také vyskytuje v 31kD proteinu, pravděpodobně opět v blízkosti aminokyseliny s číslem 114. Výše uvedené informace jsou podrobněji prodiskutovány v příkladu 7.

Po počátečních purifíkačních experimentech s psími ligandy, jejichž souhrn je uveden výše, byl nyní klonován gen kódující psí ligand. V důsledku toho byla stanovena celá délka aminokyselinové sekvence psího ligandu (viz obr. 13A). Na základě výpočtů molekulové hmotnosti se předpokládá, že 25kDA a 31kDa psí ligandy jsou C-terminálními upravenými formami ligandu o úplné délce znázorněného na obr. 13A. Dále byl získán také myší Mpl ligand, jehož sekvence je uvedena na obr. 13B.

Tyto purifikované ligandy je také možno charakterizovat specifickou aktivitou při zkoušce s humánními megakaryocyty (podle příkladu 2), která dosahuje hodnoty alespoň asi 5,7 x 10⁹ megaryocytových (meg) jednotek/mg. Megakaryocytová jednotka je definována jako množství látky, které vede k produkci stejného množství megakaryocytů jako 1 μΐ standardního kontrolního vzorku APK9 za použití zkoušky popsané v příkladu 2.

Takové purifikované ligandy jsou rovněž charakterizovány specifickou aktivitou při Mpldependentním růstu buněk, tj. zkoušce popsané v příkladu 4, kterážto aktivita dosahuje přinejmenším hodnoty asi 6,9 x 10⁹ jednotek buněčného růstu/mg. „Jednotka buněčného růstu“ je definována jako množství ligandu, které vede k růstu 200 1A6.1 buněk při zkoušce podle příkladu 4.

Následující tabulka 1 ukazuje přídavné specifické výpočty aktivity pro skutečné purifikované psí Mpl ligandy vyrobené způsobem podle tohoto vynálezu.

Tabulka 1

Mpl	1A6.1 zkouška	Zkouška s humánními
Ligand	(jednotky/mg)	megakaryocyty Gednotky/mg)
31 kDa	6,52 x 109	5,7x10’
25 kDa	10,5 x 109	14 x 109

-11CZ 288926 B6

Výše uvedené informace jsou sumarizovány v následujícím přehledu, v němž je uvedeno několik příkladů Mpl ligandů podle vynálezu, které jsou charakterizovány jednou nebo více biochemickými a biologickými vlastnostmi:

(a) Mpl ligandy jsou izolovány z psí aplastické plazmy;

(b) Mpl ligandy mají zdánlivou molekulovou hmotnost přibližně 25 kDa nebo 31 kDa podle stanovení elektroforézou na polyaktylamidovém gelu za použití dodecylsulfátu sodného (SDSPAGE) za neredukčních podmínek;

(c) Mpl ligandy zahrnují následující aminokyselinové sekvence:

SEQ ID NO: 1, v případě 25kDA proteinu nebo SEQ ID NO: 2, v případě 31 kDa proteinu;

(d) Mpl ligandy přídavně obsahují aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 (zvláště pak 25kDA protein);

(e) Mpl ligandy s vážou k lektinu z pšeničných klíčků;

(f) Mpl ligandy se vážou k imobilizovanému rozpustnému myšímu Mpl receptoru;

(g) aktivitu Mpl ligandu je možno inhibovat in vitro rozpustným Mpl receptorem; a (h) Mpl ligandy se vážou k axenovému sloupci při pH od asi 8 do asi 9.

Biologické účinnosti přednostních Mpl ligandů podle vynálezu jsou demonstrovány jejich schopností specificky stimulovat růst a vývoj megakaryocytů při zkoušce povzbuzování růstu megakaryocytů podle příkladu 2. Při této zkoušce Mpl ligand stimuluje diferenciaci humánních buněk CD34⁺ periferní krve (tj. buněk CD-34 získaných imunoadsorpční selekcí) v průběhu 8denního období kultivace. Megakaryocyty se identifikují barvením za použití specifických protidestičkových antigenových protilátek a spočítají se pod mikroskopem. Mpl ligand také stimuluje růst faktordependentní buněčné linie 1A6.1. Za nepřítomnosti Mpl ligandu buňky hynou. Počet 1A6.1 buněk se stanoví po 2 dnech kultivace s Mpl ligandem.

Mpl ligandy popsané výše vykazují specifické aktivity popsané v tabulce 1.

Jako zdroje Mpl ligandů byly zjištěny aplastická savčí krev, plazma nebo sérum. Neočekává se však, že by byly zdroje těchto ligandů omezeny na tyto známé látky. Zdroje tedy budou zahrnovat také jiné savčí tělesné tekutiny, buňky z nich získané atd.

Purifikace nativních Mpl ligandů ze savčích zdrojů je založena na dvou klíčových purifikačních stupnícH.

(a) lektinová afinitní chromatografie, přednostně za použití aglutininu z pšeničných klíčků a (b) afinitní chromatografie s imobilizovaným Mpl receptorem.

Mohou být též zařazeny přídavné stupně za účelem další purifikace proteinu. Takové stupně zahrnují například ionexovou chromatografii, gelovou filtrační chromatografie a chromatografii s obrácenými fázemi.

Purifikační techniky skutečně použité pro získání Mpl ligandu z psí aplastické plazmy zahrnují následující stupně (viz příklad 7):

-12CZ 288926 B6 (a) lektinovou afínitní chromatografíi (obzvláštní přednost se dává chromatografií za použití aglutininu z pšeničních klíčků);

(b) afínitní chromatografíi s rozpustným Mpl receptorem (Mpl-X) (přednostně za použití imobilizovaného myšího Mpl-X);

(c) chromatografíi s výměnou iontů (tj. aniontů nebo kationtů), přednostně za použití sloupce Mono Q;

(d) gelovou filtrační chromatografií za použití disociačních podmínek (přednostně za použití Superdex 200 plus SDS); a (e) chromatografíi s obrácenými fázemi (přednostně za použití sloupce 0-4).

Homogenní savčí Mpl ligand, včetně humánního ligandu, je možno získat aplikací výše uvedených purifíkačních postupů na aplastickou krev, sérum nebo plazmu nebo na jiné zdroje savčího Mpl ligandu, například buněčné nebo tkáňové zdroje. Použité purifíkační stupně není nutno provádět v nějakém určitém pořadí, ale pořadí, které je uvedeno výše se dává přednost. Procedury, kterých je možno použít při kultivaci buněk (nebo tkání) za účelem produkce Mpl ligandu, jsou známé odborníkům v tomto oboru a může se jich například použít pro rozšíření nabídky výchozích látek.

Mpl ligand nebo jeden nebo více jeho peptidových fragmentů je také možno získat rekombinantními technikami. Pro získání sekvence DNA určitého Mpl ligandu se purifíkovaný Mpl ligand redukuje a popřípadě štěpí proteázou, jako je trypsin. Enzymatické fragmenty se izolují a sekvenují konvenčními technikami. Alternativně, jak je to příkladně uvedeno v části popisu zabývající se příklady provedení, se intaktní purifíkovaný protein může přímo sekvenovat v možném intaktní purifíkovaný protein může přímo sekvenovat v možném rozsahu, který je závislý na množství dostupného proteinu a potom se může sekvenované oblasti použít analogicky jako sekvenovaných, trypsinem vyštěpených, fragmentů při následujícím postupu. Oligonukleotické próby se syntetizují za použití genetického kódu, aby byly předvídány všechny možné sekvence kódující aminokyselinové sekvence sekvenovaného fragmentu nebo fragmentů. Přednostně se jako próby vytvoří několik degenerovaných sekvencí. Gen Mpl ligandu se identifikuje za použití těchto prób při screeningu savčí genomové knihovny nebo jiného zdroje. Alternativně se může mRNA z buněčného zdroje Mpl ligandu použít pro vytvoření cDNA knihovny, již lze podrobit screeningu s próbami za účelem identifikace cDNA kódující Mpl ligandový polypeptid. Dále ze použít také PCR techniky pro prodloužení cDNA sekvence. Přitom se používá vhodných primerů.

Za použití těchto prób pro screening genomové knihovny se získá DNA klon. Pro získání klonů o plné délce se může prób založených na získané sekvence. DNA použít pro nové screening knihovny a hybridizaci k úplné sekvenci DNA Mpl ligandu.

Humánní cDNA pro Mpl ligand je také možno získat subklonováním humánního genomového klonu o plné délce do expresního vektoru, jeho transfekcí do buněk COS, přípravou cDNA knihovny z takto transfekovaných buněk COS a hybridizačních screeningem na cNDA Mpl ligandu. Po identifikaci celé cDNA je možno celou dCNA nebo její část kódující aktivní fragment Mpl ligandu zavést do kteréhokoliv z různých expresních vektorů za účelem vytvoření expresního systému pro Mpl ligand nebo jeden nebo více jeho fragmentů.

Při takovém použití rekombinantních technik se získají přednostní sekvence DNA kódující Mpl ligandový polypeptid. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také tyto sekvence DNA, které nejsou asociovány se sekvencemi DNA kódujícími jiné proteiny (tj. jsou izolované). Takové sekvence kódující expresi Mpl ligandových polypeptidů s aktivitou Mpl ligandu (jak je například růst a/nebo vývoj megakaryocytů). Tyto sekvence DNA zahrnují sekvence kódující celý Mpl ligand

-13CZ 288926 B6 nebo jeho fragment a sekvence, které hybridizují, přednostně za stripgentních hybridizačních podmínek k sekvencím cDNA [viz T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387 až 389].

Jako příklady stringentních hybridizačních podmínek je možno uvést hybridizaci v 4 X SSC při 62 až 67 °C s následným promýváním 0,1 X SSC při 62 až 67 °C po dobu asi 1 hodiny. Jako alternativní příklad stringentních hybridizačních podmínek je možno uvést hybridizaci v 45 až 55% formamidu, 4 X SSC při 40 až 45 °C.

Sekvence DNA hybridizující k sekvencím Mpl ligandu za relaxovaných hybridizačních podmínek a kódující Mpl ligandové peptidy s biologickými vlastnostmi Mpl ligandu také kódují nové Mpl ligandové polypeptidy podle tohoto vynálezu. Jako příklady takových hybridizačních podmínek s relaxovanou stringencí je možno uvést 4 X SSC při 45 až 55 °C nebo hybridizaci s 30 až 40% formamidem při 40 až 45 °C. Tak například sekvence DNA, která sdílí oblasti signifikantní homologie, například místa glykosylace nebo místa disulfídových vazeb, se sekvencemi Mpl' ligandu a která kóduje protein vykazující jednu nebo více biologických vlastností Mpl ligandu, jasně kóduje Mpl ligandový polypeptid, i když se taková sekvence DNA stringentně nehybridizuje k sekvenci nebo sekvencím Mpl ligandu.

Alelové variace (změny bází v populaci určitého druhu, k nimž dochází v přírodě a které mohou, nebo nemusí mít za následek změnu aminokyseliny) sekvencí DNA kódujících sekvence peptidů Mpl ligandu také spadají do rozsahu tohoto vynálezu, podobně jako příslušné analogy nebo deriváty. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají podobně také sekvence DNA kódující polypeptidy Mpl ligandu, které se však odlišují využitím v kodonu v důsledku degenerací genetického kódu nebo variací sekvence DNA Mpl ligandu způsobených bodovými mutacemi nebo indukovaných modifikacemi za účelem zvýšení aktivity, poločasu rozpadu nebo produkce polypeptidů, které jsou jimi kódovány.

Za použití klonovacího postupu uvedeného v příkladu 11 (dále) byly získány aminokyselinové a cDNA sekvence humánních proteinů MGDF-1, MGDF-2 a MGDF-3, které jsou publikovány v tomto popisu. MGDF-1 zahrnuje aminokyseliny 22 až 353 v obr. 11, tedy celkem 332 aminokyselin. MGDF-2 představuje omezenou část MGDF-1, tedy aminokyseliny 22 až 195 z obr. 11. MGDF-2 tedy obsahuje 174 aminokyselin. MGDF-3 zahrnuje aminokyseliny 22 až 286 z obr. 12, takže obsahuje 265 aminokyselin. V každém z publikovaných MGDF je součástí molekuly polypeptidů podle tohoto vynálezu také signální peptid (aminokyseliny 1 až 21 v obr. 11a 12). Tento signální peptid se přednostně odstraňuje, aby došlo k růstu megakaryocytů a vývoji jejich aktivity. Přehledně lze MGDF 1 až 3 definovat takto:

MGDF-1 aminokyseliny 22 až 353 obr. 11

MGDF-2 aminokyseliny 22 až 195 obr. 11

MGDF-3 aminokyseliny 22 až 286 obr. 12

Při zkouškách uvedených v tomto popisu jsou MGDF-1 a MGDF-2 účinné, zatímco MGDF-3 je neúčinný.

Na základě dat vztahujících se k aktivitě, která jsou uvedena v tomto popisu, byla vytvořena hypotéza, že humánní MGDF je exprimován in vivo jako v podstatě inaktivní nebo méně aktivní polypeptidový prekurzor, obsahující proměnlivé C-terminální aminokyseliny. Po odštěpení Cterminálních aminokyselin (jakož i signálního peptidu) si upravená forma molekuly zachovává aktivitu nebo se stává aktivnější. Na základě této hypotézy se předpokládá, že MGDF-1 může vyžadovat úpravu (například štěpení proteázou), aby vykazoval aktivitu. Tuto hypotézu potvrzuje skutečnost, že omezená forma MGDF-1 (tj. MGDF-2) je účinná.

Kondicionované médium z buněk 293 humánní ledviny (Invitrogen) transfekovaných MGDF-1 genem vykazuje aktivitu při zkoušce s buňkami podle příklad 4. Na druhé straně s jiných

-14CZ 288926 B6 buněčných liniích, například buňkách 32-D, nebyla u této molekuly pozorována žádná aktivita. Předpokládá se, že to může znamenat, že buňky 293 jsou schopny zpracovat (upravit) molekulu MGDF-1, pravděpodobně jejím omezením, takže molekula, která je převážně zodpovědná za aktivitu má omezenou formu. Buňky 32-D nejsou schopny molekulu takto upravovat.

S ohledem na tuto hypotézu se mohou různé aktivní molekuly získat omezením sekvence uvedené pro MGDF-1 (obr. 11). Strukturní znaky konzervované ve skupině cytokinů, jako je erythropoietin (EPO) zahrnují čtyři α-helikální svazky a čtyři cysteiny. Pokud se týče sekvence MGDF-1, je Cys 172 nejvíce C-terminálním prvkem z těchto evolučně konzervovaných funkčně esenciálních struktur. Přednostními omezeními variantami MGDF-1 jsou tedy kterékoliv z variant, které obsahují C-terminální omezení od aminokyseliny 173 do aminokyseliny 353 (současně s odštěpením signálního peptidu). Přednostně bude ze sekvence MGDF-1 odstraněno 50 až 185, zvláště pak 90 až 172, aminokyselin od C-konce. Jak je uvedeno v tomto popisu, za signální peptid je považován peptid o délce 21 aminokyselin. Signální peptid však může obsahovat 23 aminokyselin vztaženo na sekvenci MGDF-1. V důsledku toho spadají do rozsahu tohoto vynálezu také polypeptidy odpovídající zde popsaným polypeptidům, které však začínají v poloze 24 na obr. 11 nebo 12.

Dále jsou uvedeny některé specifické přednostní varianty MGDF-1, které by mohly vykazovat účinnost (tj. schopnost vyvolávat růst megakaryocytů a/nebo krevních destiček nebo vykazovat inhibiční/stimulační účinnost na přírodní receptor):

MGDF-4	aminokyseliny 22 až 172	obr. 11
MGDF-5	aminokyseliny 22 až 177	obr. 11
MGDF-6	aminokyseliny 22 až 191	obr. 11
MGDF-7	aminokyseliny 22 až 198	obr. 11
MGDF-8	aminokyseliny 22 až 265	obr. 11
MGDF-11	aminokyseliny 22 až 184	obr. 11
V některých	klonech aminokyseliny 133 až	136 v sekvenci MGDF-1 chybí, takže sekvence,

které odpovídají výše uvedeným sekvencím přičemž v nich však některé aminokyseliny chybí (a počet aminokyselin u C-konce je snížen o 4) mohou být také účinné.

V jednom klonu, který má terminační kodon v poloze 192, byl nalezen zbytek Ala místo zbytku Thr, jak je to znázorněno v poloze 191 na obr. 11. Do rozsahu vynálezu tedy spadají také varianty molekul MGDF, v nichž se v poloze 191 nachází Ala místo THF.

MGDF-3 vzniká odstraněním sekvence, která je zde označována zkratkou IVS-5 (intervenční sekvence-5), poněvadž tato sekvence je upravena sestřihem v pátém exonu této sekvence. Poněvadž se 5' konec IVS-5 sekvence nalézá v kodonu, její odstranění má za následek rámcový posun ve zbývající sekvenci MGDF, který lze pozorovat od výchozí polohy 160 MGDF-3 do konce této molekuly.

U samotného MGDF-3 nebyla po transfekci do buněk 293 a zkoušení kondiciovaného média na aktivitu buněčnou zkoušku popsanou v příkladu 4 zjištěna až dosud žádná aktivita. Zjevně jsou buňky 293 na rozdíl od MGDF-1 neschopné převést MGDF-3 na účinnou formu. Nicméně však vypuštěním C-terminálních aminokyselin z MGDF-3 se snad také mohlo dospět k účinné formě (tento předpoklad se zakládá na výše uvedené hypotéze o C-terminálním omezení). Tak například C-terminální omezení MGDF-3 od aminokyseliny 40 do aminokyseliny 102 může mít za následek dosažení účinnosti.

Přednostně se odštěpují aminokyseliny 50 až 90. Jako dvě specifické varianty MGDF-2 je možno uvést

MGDF-9 aminokyseliny 22 až 179 obr. 12

MGDF-10 aminokyseliny 22 až 190 obr. 12

-15CZ 288926 B6

Ve všech Mpl ligandech uvedených v tomto popisu, včetně příkladných MGDF uvedených výše, může být u N-konce přítomen methionylový zbytek, zejména když se tyto polypeptidy exprimují v bakteriálních hostitelských buňkách.

Polypeptidy Mpl ligandu je také možno získat známou konvenční chemickou syntézou. Způsoby konstrukce polypeptidů podle vynálezu syntetickými postupy jsou známé odborníkům v tomto oboru. Synteticky zkonstruované sekvence polypeptidů Mpl ligandu může vykazovat biologické vlastnosti vhodné s vlastnostmi Mpl ligandu díky tomu, že vykazuje stejné primární, sekundární nebo terciární strukturní a konformační charakteristiky. Takových polypeptidů je tedy možno použít jako biologicky aktivních nebo imunologických náhražek za přírodní purifikované polypeptidy Mpl ligandu při terapeutických a imunologických procesech.

Modifikace polypeptidů nebo sekvencí DNA kódujících Mpl ligand může odborník v tomto oboru provést známými technikami. Modifikace sekvence Mpl ligandu, které jsou předmětem zájmu, mohou zahrnovat náhradu, vsunutí nebo vypuštění zvoleného aminokyselinového zbytku z kódujících sekvencí. Techniky mutageneze, které jsou vhodné pro takové nahrazení, vsunutí nebo vypuštění aminokyselinového zbytku jsou odborníkům v tomto oboru dobře známy [viz například US patent č. 4 518 584]. Přednost se dává konzervativním změnám v rozmezí od 1. do 20. aminokyseliny. Přednostní peptidy je možno vytvářet za použití proteolytických enzymů nebo přímou chemickou syntézou. Takto získané varianty spadají do rozsahu významu „polypeptidy Mpl ligandu“ (či „Mpl ligandové polypeptidy“) a „polynukleotidy Mpl ligandu“ podle vynálezu.

Specifické mutace sekvencí Mpl ligandového polypeptidů mohou zahrnovat modifikace glykosylačního místa (například šeřinu, threoninu nebo asparaginu). K absenci glykosylace nebo jen k částečné glykosylaci dochází substitucí nebo delecí aminokyseliny v jakémkoliv glykosylačním rozpoznávacím místě připojeném k asparaginu nebo v jakémkoliv místě molekuly, které je modifikováno adicí O-připojeného sacharidu. Glykosylační rozpoznávací místo připojené k asparaginu zahrnuje tripeptidovou sekvenci, která je specificky rozpoznávána příslušnými buněčnými glykosylačními enzymy. Tyto tripeptidové sekvence mají složení buď Asn-Xaa-thr nebo Asn-Xaa-Ser, kde Xaa může být jakákoliv aminokyselina odlišná od Pro. Různé aminokyselinové substituce nebo delece v jedné nebo obou z poloh 1 a 3 glykosylačního rozpoznávacího místa (a/nebo delece aminokyseliny v poloze 2) má za následek absenci glykosylace v modifikované tripeptidové sekvenci. Exprese takto pozměněných nukleotidových sekvencí má za následek vznik variant, které v tomto místě nejsou glykosylovány.

Přídavné analogy/deriváty MGDF

Jiné analogy a deriváty sekvencí MGDF (Mpl ligandů), které si mohou zachovat aktivitu MGDF (Mpl ligandu) buď úplně nebo zčásti, je také možno připravit za použití technik uvedených v tomto popisu. Také tyto modifikace spadají do rozsahu vynálezu.

Konkrétněji lze uvést, že do rozsahu vynálezu obecně spadají chemicky modifikované látky MGDF a způsoby jejich přípravy a použití. Jak je zřejmé z tohoto popisu, modifikace MGDF a zlepšení jejich vlastností jsou možné.

Jedním aspektem tohoto vynálezu je MGDF produkt obsahující MGDF protein připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému polymemímu zbytku.

Jiným aspektem tohoto vynálezu je MGDF produkt, v němž je MGDF protein připojen k alespoň jedné polyethylenglykolové molekule.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou MGDF molekuly připojené k alespoň jedné molekule polyethylenglykolu prostřednictvím acylového nebo alkylového spojení.

-16CZ 288926 B6

Pegylace MGDF se může provádět za použití jakýchkoliv pegylačních reakcí, které jsou známy v tomto oboru (viz například: Focus on Growth Factors 3 (2): 4 až 10 (1992); EP 0 154 316; EP 0 401 384 a další publikace vztahující se kpegylaci uvedené v těchto citacích. Pegylace se přednostně provádí prostřednictvím acylační reakce nebo přednostně provádí prostřednictvím acylační reakce nebo alkylační reakce za použití reaktivní polyethylenglykolové molekuly (nebo analogické molekuly reaktivního vodorozpustného polymeru). Tyto přednostní způsoby derivatizace polyethylenglykolu budou podrobněji popsány dále.

Acylace

Pegylace acylací obecně zahrnuje reakci reaktivního esterového derivátu polyethylenglykolu (PEG) s MGDF proteinem. Pro pegylaci MGDF se může použít jakékoliv známo nebo i dodatečně objevené reaktivní PEG molekuly. Přednostním aktivovaným PEG esterem je PEG esterifikovaný N-hydroxysukcinimidem (NHS). Pod označením „acylace“, jak se ho používá v tomto popisu, se bez jakéhokoliv omezení rozumí vytvoření následujících typů vazeb mezi MGDF a vodorozpustným polymerem, jako je PEG: amidových, karbamátových, urethanových a podobných vazeb (viz Bioconjugate Chem. 5: 133 až 140 (1994)). Reakční podmínky je možno volit ze souboru podmínek, které jsou známé nebo které budou ještě vyvinuty v oboru pegylace, ale nemělo by se používat podmínek (teploty, rozpouštědel a pH), které by měly za následek inaktivaci MGDF, který má být modifikován. Reakční podmínky, které se obecně hodí pro pegylaci MGDF jsou popsány dále. Příkladná reakce s NHS esterem monomethoxy-PEG je znázorněn na obr. 14.

Pegylaci prostřednictvím acylace se obecně získá polypegylovaný produkt MGDF, v němž jsou epsilon-aminoskupiny lysinu pegylovány prostřednictvím acylové spojovací skupiny. Přednostní spojovací skupinou je amidová skupina. Také se dává přednost tomu, aby byl produkt v podstatě pouze (například více než z 95 %) mono-, di- nebo tripegylován. Za normálních okolností však budou vznikat určité látky s vyšším stupněm pegylace (až do maximálního počtu lysinových epsilon-aminokyselinových skupin MGDF plus jedna a-aminoskupina u aminového konce MGDF) v množství závislém na specificky použitých reakčních podmínkách. Je-li to žádoucí, mohou se z reakční směsi oddělovat pegylované látky s vyšší čistotou, zejména oddělením nezreagovaných látek, standardního purifikačními technikami, jako je mj. dialýza, vysolování, ultrafiltrace, ionexová chromatografie, gelová filtrační chromatografie a elektroforéza.

Alkylace

Pegylace prostřednictvím alkylace obecně zahrnuje reakci terminálního aldehydového derivátu PEG s proteinem, jako je MGDF, za přítomnosti redukčního činidla. Tak jako u acylace popsané výše jsou vhodné reakční podmínky popsány dále.

Při pegylaci alkylací může také vznikat polypegylovaný MGDF. Příklad redukční alkylační reakce za použití MGDF pro získání polypegylovaného produktu je znázorněn za obr. 15. Kromě toho je možno manipulovat reakční podmínky způsobem uvedeným dále za účelem favorizace pegylace v podstatě pouze do polohy α-aminoskupiny u N-konce MGDF (tj. pro získání monopegylované látky). Příklad redukční alkylační reakce s MGDF pro získání monopegylovaného produktu je znázorněn na obr. 16. Jak v případě monopegylace, tak v případě polypegylace jsou PEG skupiny přednostně připojeny k proteinu prostřednictvím skupiny vzorce -CHr-NH- S ohledem na strukturu zbytku -CH2- je tento typ spojení označován názvem „alkylové spojení“.

Při derivatizaci prostřednictvím redukční alkylace pro výrobu monopegylovaného produktu se používá odlišné reaktivity různých typů primárních aminokyselin (lysinu ve srovnání sNkoncem), které jsou k dispozici pro derivatizaci MGDF. Tato reakce se provádí při hodnotě pH (viz dále) umožňující využít rozdíl pK_a mezi epsilon-aminoskupinami lysinových zbytků a alfa-17CZ 288926 B6 aminoskupinou N-terminálního zbytku proteinu. Při takové selektivní derivatizaci se reguluje připojení vodorozpustného polymeru obsahujícího reaktivní skupinu, jako je aldehydová skupina, k proteinu: ke konjugaci s polymerem dochází převážně u N-konce proteinu a nedochází k významné modifikaci jiných reaktivních skupin, jako aminoskupin lysinového postranního řetězce. Jedním důležitým aspektem tohoto vynálezu je v podstatě homogenní příprava molekul konjugátu monopolymer/MGDF protein (tímto označením se rozumí MGDF protein, k němuž je polymemí molekula připojena v podstatě pouze (tj. z 95 % nebo více) v jedné poloze). Konkrétněji je možno uvést, že za použití polyethylenglykolu se podle vynálezu může získat pegylovaný MGDF protein, který neobsahuje potenciálně antigenní spojovací skupiny a v němž je polyethylenglykolová molekula přímo kopulována s MGDF proteinem.

Přednostním aspektem tohoto vynálezu je tedy pegylovaný MGDF, v němž je skupina nebo v němž jsou skupiny PEG připojeny prostřednictvím acylových nebo alkylových skupin. Jak již bylo diskutováno výše, takové produkty mohou být monopegylovány nebo polypegylovány (například mohou obsahovat 2 až 6, přednostně 2 až 5 PEG skupin). Skupiny PEG jsou obvykle připojeny k protienu na alfa- nebo epsilonaminoskupinách aminokyselin, ale obecně mohou být skupiny PEG připojeny k jakékoliv aminoskupině připojené k proteinu, jež je dostatečně reaktivní, aby byla za vhodných reakčních podmínek připojena ke skupině PEG.

Polymemí molekuly použité jak při acylační, tak při alkylační reakci, je možno volit ze souboru vodorozpustných polymerů nebo jejich směsí. Zvolený polymer by měl být vodorozpustný, aby ve vodném prostředí, jak je fyziologické prostředí, nedošlo k vysrážení proteinu, k němuž má být tento polymer připojen. Zvolený polymer by měl být modifikován tak, aby obsahoval jedinou reaktivní skupinu, jako například jedinou reaktivní esterovou skupinu (v případě acylace) nebo aldehydovou skupinu (v případě alkylace), aby bylo možno stupeň polymerace regulovat metodami uvedenými v tomto popisu. Přednostním reaktivním PEG aldehydem je polyethylenglykolpropionaldehyd, který je stálý ve vodě, nebo jeho monoalkoxyderivát s 1 až 10 atomy uhlíku valkoxylové části nebo aryloxyderivát (viz US patent č. 5. 252 714). Tento polymer může být rozvětvený nebo nerozvětvený. Má-li se konečného produktu použít pro terapeutické účely, měl by být polymer farmaceuticky vhodný. Vodorozpustný polymer je možno volit ze souboru zahrnujícího například polyethylenglykol, monomethoxypolyethylenglykol, dextran, poly(N-vinylpyrrolidon), polyethylenglykol, homopolymery propylenglykolu, kopolymery propylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylenové polyoly (například glycerol) a polyvinylalkohol. Pro acylační reakce by měl zvolený polymer obsahovat jedinou reaktivní esterovou skupinu a pro redukční alkylaci by měl zvolený polymer obsahovat jedinou reaktivní aldehydovou skupinu. Obvykle se vodorozpustné polymery nevolí ze souboru glykosylových zbytků, které se vyskytují v přírodě, poněvadž se obvykle účelněji připravují v savčích rekombinantních expresních systémech. Polymer může mít jakoukoliv molekulovou hmotnost a může být rozvětvený nebo nerozvětvený.

Z vodorozpustných polymerů, které se hodí pro použití podle vynálezu, se obzvláštní přednost dává polyethylenglykolu (zkráceně PEG). Pod označením „polyethylenglykol“ se zde rozumí jakýkoliv forma PEG, které bylo použito pro derivatizaci jiných proteinů, jako je monoalkoxypolyethylenglykol s 1 až 10 atomy uhlíku valkoxylové části nebo aryloxypolyethylenglykol.

Pod označením MGDP se v tomto popisu rozumí kterákoliv z různých forem MGDF uvedených v tomto popisu. Do rozsahu tohoto pojmu tedy spadá například MGDF s plnou nebo omezenou délkou, a to jak glykosylované, tak neglykosylované formy. Přednostní molekuly MGDF pro derivatizaci jsou uvedeny dále.

MGDF-1 aminokyseliny 22 až 353

MGDF-2 aminokyseliny 22 až 195

MGDF-4 aminokyseliny 22 až 172

MGDF-11 aminokyseliny 22 až 184 obr. 11 obr. 11 obr. 11 obr. 11

-18CZ 288926 B6

MGDF-12

MGDF-13

MGDF-14

MGDF-15 aminokyseliny 22 až 353 aminokyseliny 22 až 195 aminokyseliny 22 až 172 aminokyseliny 22 až 184 obr. 11 obr. 11 obr. 11 obr. 11

Číslování se ve všech případech vztahuje k číslování aminokyselin podle obr. 11.

Výše uvedené přednostní druhy MGDF mohou být glykosylovány, neglykosylovány nebo deglykosylovány a přednostně jsou neglykosylovány. Je možno je připravovat rekombinantními postupy jako v bakteriálních (například E. coli), tak savčích (například CHO) buňkách.

Dále jsou uvedeny přednostní podskupiny chemicky derivatizovaných molekul podle vynálezu (vždy se jedná o mono- nebo polypegylovaný produkt, například o produkt obsahující 2 až 4 PEG zbytky připojené prostřednictvím acylových nebo alkylových skupin):

pegylovaný MGDF-11, pegylovaný MGDF-4 a pegylovaný MGDF-2.

Chemická derivatizace se obecně může provádět za jakýchkoliv vhodných podmínek pro reakci biologicky účinných látek s reaktivními polymery. Způsoby výroby pegylovaného MGDF budou obecně zahrnovat stupeň a) reakce polypeptidů MGDF s polyethylenglykolem (jako například reaktivním esterovým nebo aldehydovým derivátem PEG) za podmínek, při nichž dochází k připojení MGDF k jedné nebo více skupin PEG a b) stupeň izolace reakčního produktu nebo produktů. Optimální reakční podmínky acylačních reakcí se budou obvykle určovat případ od případu, v závislosti na známých parametrech a požadovaném výsledku. Tak například, čímž bude větší poměr PEG : protein, tím vyšší bude procentní zastoupení polypegylovaného produktu.

Redukční alkylace pro výrobu v podstatě homogenní „populace“ molekul konjugátu monopolymer/MGDF protein budou v podstatě zahrnovat stupeň a) reakce MGDF proteinu s reaktivní molekulou PEG za redukčních alkylačních podmínek, při hodnotě pH vhodné pro selektivní modifikaci alfa-aminoskupin u aminového konce MGDF proteinu a b) stupeň izolace reakčního produktu nebo produktů.

Pod označením „podmínky redukční alkylace pro výrobu v podstatě homogenní populace molekul konjugátu monopolymer/MGDF protein“ se rozumějí podmínky umožňující selektivní připojení vodorozpustné polymemí látky K N-konci MGDF. Takové reakční podmínky obvykle použijí rozdíly vpK_a mezi aminoskupinami lysinu a alfa-aminoskupinou u N-konce (pK_a představuje hodnotu pH, při níž je 50 % aminoskupin protonováno s 50 % neprotonováno). Hodnota pH také ovlivňuje použitý poměr polymeru k proteinu. Obecně platí, že při nižší pH je žádoucí vyšší nadbytek polymeru vzhledem k proteinu (tj. čím méně je reaktivní N-terminální alfa-aminoskupina, tím více polymeru je zapotřebí pro dosažení optimálních podmínek). Při vyšší hodnotě pH nemusí být poměr polymer : protein tak vysoký (jsou-li skupiny reaktivnější, je zapotřebí menšího počtu polymemích molekul). Pro účely tohoto vynálezu bude hodnota pH obvykle ležet v rozmezí od 3 do 9, přednostně od 3 do 6.

Dalším důležitým parametrem je molekulová hmotnost polymeru. Obecně platí, že čím je molekulová hmotnost polymeru vyšší, tím menší počet molekul polymeru se může k proteinu připojit. Při optimalizaci reakčních parametrů je podobně nutno vzít v úvahu také stupeň rozvětvení polymeru. Obecně platí, že čím je molekulová hmotnost vyšší (než čím vyšší je stupeň rozvětvení), tím vyšší je poměr polymer: protein. Při pegylačních reakcích podle vynálezu se obvykle dává přednost průměrné molekulové hmotnosti v rozmezí od asi 2 kDa do asi 100 kDa (pod pojmem „asi“ se rozumí rozmezí ± 1 kDa. Přednostní rozmezí molekulové hmotnosti je asi 5 až asi 50 kDa, s výhodou asi 12 až asi 25 kDa. Poměr vodorozpustného polymeru kMGDF

-19CZ 288926 B6 proteinu bude obvykle v rozmezí od 1 : 1 do 100 : 1, přednostně (v případě polypegylace) od 1 : 1 do 20 : 1 a (v případě monopegylace) od 1 : 1 do 5 : 1.

Za použití výše uvedených podmínek se při redukční alkylaci dosáhne selektivního připojení polymeru k jakémukoliv MGDF proteinu obsahujícímu alfa-aminoskupinu u aminového konce a získá se v podstatě homogenní konjugát monopolymeru/MGDF protein. Pod označením „konjugát monopolymer/MGDF protein“, jak se ho používá v tomto popisu, se rozumí MGDF protein, k němuž je připojena jediná molekula polymeru. Konjugát monopolymeru/MGDF protein bude přednostně obsahovat molekulu polymeru v poloze N-konce a nikoliv na lysinových postranních aminoskupinách. Vyrobený produkt bude obsahovat přednostně více než 90 % a s výhodou více než 95 % konjugátu monopolymer/MGDF protein, přičemž zbytek bude tvořen nezreagovanými molekulami (tj. molekulami proteinu neobsahujícími zbytek polymeru). V případech uvedených dále je ilustrován produkt, který sestává z alespoň asi 90 % konjugátu monopolymer/protein a asi 10 % nezreagované proteinu. Biologickou aktivitu vykazuje konjugát monopolymeru/protein.

Pro redukční alkylaci podle vynálezu by se mělo používat redukčního činidla stálého ve vodném roztoku, které je přednostně schopno redukovat pouze Schiffovu bázi vytvořenou při zahájení redukční alkylace. Přednostní redukční činidla se přitom volí ze souboru zahrnujícího tetrahydroboritan sodný, natriumkyanborhydrid a komplex dimethylamin/boran, trimethylamin/boran a pyridin/boran. Zvláště vhodný redukčním činidlem je natriumkyanborhydrid.

Jiné reakční parametry, jako jsou rozpouštědla, reakční doby, teploty atd. a způsoby purifikace produktů, je možno určit případ od případu na základě publikovaných publikací vztahujících se k derivatizaci proteinů vodorozpustnými polymery (viz publikace citované v tomto popisu). Příklady podrobností jsou uvedeny v příkladové části tohoto popisu.

Může být žádoucí připravit směs konjugátových molekul polymer/protein acylačními a/nebo alkylačními metodami. Přitom je výhodné, že je možno zvolit obsah konjugátu monopolymer/protein, který má být ve směsi přítomen. Je-li to žádoucí, může se tedy připravit směs různých proteinů s různým počtem připojených molekul polymeru (tj. 2, 3, 4 atd.) a tato směs se může smíchat s konjugátem monopolymer/protein připraveným zde popsanými metodami. Tak se získá směs s předem určeným obsahem konjugátu monopolymer/protein.

Příklady provedení uvedené dále ilustrují přípravu chemicky modifikovaného MGDF a přípravu pegylovaného MGDF acylací a alkylaci. Jinými aspekty tohoto vynálezu jsou tedy tyto způsoby přípravy.

Jako chorobné stavy, u kterých lze dosáhnout úlevy, nebo které je možno modulovat podáváním produktů polymer/MGDF podle tohoto vynálezu, přicházejí v úvahu chorobné stavy popsané výše v souvislost s obecnými aplikacemi molekul MGDF. Ve srovnání s nederivatizovanými molekulami však mohou molekuly polymer/MGDF uvedené v tomto popisu vykazovat přídavné účinnosti nebo zvýšené nebo snížené účinnosti nebo též jiné charakteristiky.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou farmaceutické prostředky na bázi výše uvedených chemicky modifikovaných molekul MGDF. Tyto farmaceutické prostředky mohou obsahovat kteroukoliv z přísad, které zde byly uvedeny pro nederivatizované molekuly MGDF.

Jelikož řada studií v současné době probíhá, budou se objevovat informace vztahující se k úrovni dávkování při léčení různých podobných stavů u různých pacientů a na základě těchto informací bude odborník v tomto oboru schopen určit vhodné dávkování s ohledem na terapeutický kontext, věk a celkový zdravotní stav příjemce. Obvyklá dávka bude ležet v rozmezí o 0,01 pg/kg tělesné hmotnosti (počítáno jako hmotnost samotného proteinu bez chemické modifikace) až 300 pg/kg (vztaženo ke stejnému základu). Přednostní dávka bude obvykle ležet v rozmezí od 5 pg/kg

-20CZ 288926 B6 tělesné hmotnosti do 100 pg/kg tělesné hmotnosti a zvláště vhodná dávka bude ležet v rozmezí od 10 pg/kg tělesné hmotnosti do 70 pg/kg tělesné hmotnosti.

Předmětem vynález je dále také způsob výroby polypeptidů MGDF (tj. Mpl ligandů) nebo jejich aktivních fragmentů. Jeden z těchto způsobů podle vynálezu zahrnuje zavedení cDNA kódující polypeptid Mpl ligandů do expresního vektoru pro vytvoření expresního systému pro Mpl ligand. Tímto vektorem se transfekuje zvolená hostitelská buňka a transfekovaná buňka se kultivuje. Předmětem vynálezu je tedy také způsob kultivace vhodné buňky nebo buněčné linie transfekovaná sekvence DNA kódující expresi polypeptidu Mpl ligandů pod kontrolou známých regulačních sekvencí. Regulační sekvence zahrnují fragmenty promotoru, fragmenty terminátoru a jiné vhodné sekvence, které řídí a kontrolují expresi proteinu ve vhodné hostitelské buňce. Exprimovaný faktor se potom izoluje a purifikuje z kultivačního média (nebo z buňky, je-li exprimován intracelulámě) vhodnými způsoby, které jsou známé odborníkům v tomto oboru. V souvislosti s polynukleotidy/polypeptidy podle tohoto vynálezu je také možno použít metod popsaných v US patentu číslo 5 272 071.

Jako vhodné buňky nebo buněčné linie přicházejí v úvahu savčí buňky, jako jsou buňky ovarií čínského křečka (CHO) nebo buňky 3T3. Selekce vhodných savčích hostitelských buněk a způsoby transformace, kultivace, aplifikace, screeningu a přípravy produktu, včetně jeho purifikace, jsou známé v tomto oboru, viz například publikace Gething a Sambrook, Nátuře 293: 620 až 625 (1981); Kaufman et al., Moll. Cell. Biol. 5 (7): 1750 až 1759 (1985) nebo Howley et al., US 4 419 446. Jako jiné vhodné savčí buněčné linie je možno uvést opičí buněčné linie COS1 a COS-7 a buněčnou linii CV-1. Jako další příklady savčích hostitelských buněk je možno uvést buněčné linie z primátů a buněčné linie z hlodavců, včetně transformovaných buněčných linií. Vhodné jsou také normální diploidní buňky, kmeny buněk získané z in vitro kultivace primárních tkání a také primární explantáty. Vhodné buňky mohou být genotypicky deficientní, pokud se týče selekčního genu nebo mohou obsahovat dominantně působící selekční gen. Jako jiné vhodné savčí buněčné linie (na něž se však vynález neomezuje) je možno uvést buňky HeLa, myší buňky L929, linie 3T3 pocházející ze švýcarských myší Balb-c nebo NIH a buněčné linie BHK nebo HaK pocházející z křečka.

Podobně jsou jako hostitelské buňky užitečné pro provádění vynálezu také bakteriální buňky. Jako hostitelské buňky v oblasti biotechnologií jsou například dobře známy různé kmeny E. coli (například HB101, DH5a, DH10 a MC1061). Také se při tomto způsobu může použít různých kmenů Bacillus subtilis, Pseudomonas spp., jiných kmenů Bacillus, Streptomyces spp. apod.

Jako hostitelské buňky pro expresi polypeptidů podle vynálezu přicházejí v úvahu také mnohé kmeny kvasinkových buněk, které jsou známy odborníkům v tomto oboru. Pokud je to žádoucí, může se dále podle vynálezu použít jako hostitelských buněk také hmyzích buněk (viz například Miller et al., Genetic Engineering 8: 277 až 298 (1986) a citace uvedené v této publikaci).

Předmětem vynálezu jsou také rekombinantní molekuly nebo vektory pro použití při způsobu exprese nových polypeptidů Mpl ligandů. Tyto vektory obsahují sekvence DNA Mpl ligandů, které samotné nebo v kombinaci s jinými sekvencemi kódují polypeptidy Mpl ligandů podle vynálezu (se signálními peptidy, nebo bez nich) nebo jejich účinné fragmenty. Vektor použitý při této metodě obsahuje také zvolené regulační sekvence v operativním spojení s kódujícími sekvencemi DNA podle vynálezu, které jsou schopny řídit jejich replikaci a expresi ve zvolených hostitelských buňkách.

Jedním vhodným vektorem je pXm, který je obzvláště žádoucí pro expresi v buňkách COS (Y.C. Yang et al., Cell. 47: 3 až 10 (1986)). Jiným vhodným vektorem, který je žádoucí pro expresi v savčích buňkách, například v buňkách CHO je pEMC2Bl. Expresní faktory v savčích buňkách, které jsou zde popsány, je možno syntetizovat technikami známými v tomto oboru. Složky těchto vektorů, například replikony, selekční geny, enhancery, promotory apod. je možno získat z přírodních zdrojů nebo syntetizovat známými postupy (viz Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159:

-21CZ 288926 B6

511 až 521 (1982); Kaufman Proč. nati. Acad. Sci. USA 82: 689 až 693 (1985). Alternativně může DNA vektoru zahrnovat celý genom hovězího papallomaviru nebo jeho část (Lusky et a., Cell. 36: 391 až 401 (1984)) a je možno ho replikovat v buněčných liniích, jako jsou myší buňky C127 v podobě stabilního episomálního prvku. Transfekce těchto vektorů do vhodných hostitelských buněk může mít za následek expresi polypeptidů Mpl ligandu,.

K tomuto účelu je také možno použít jiných vhodných expresních vektorů, z nichž četné typy jsou známy v oboru savčí, hmyzí, kvasinkové, fungální a bakteriální exprese.

Z chorob nebo stavů, které lze léčit za použití látek a prostředků podle tohoto vynálezu, je možno uvést choroby zahrnující již existující nebo očekávanou (například v případě plánovaného chirurgického zásahu) deficienci megakaryocytů/krevních destiček. Takové stavy budou obvykle důsledkem deficience (dočasně nebo stálé) aktivních Mpl ligandů in vivo. Generickým označením pro defícienci krevních destiček je trombocytopenie, a proto způsoby a prostředky podle tohoto vynálezu jsou obecně vhodné pro léčení trombocytopenie.

K trombocytopenii (defícienci krevních destiček) může docházet z různých důvodů, například v důsledku chemoterapie nebo jiných způsobů léčení za použití různých léčiv, radiačního léčení nebo chirurgických zásahů, ztráty krve při nehodách. Trombocytopenie může být také způsobena specifickými chorobnými stavy, jako je například aplastická anémie, idiopatická trombocytopenie, metastáza nádorů, která vede k vývinu trombocytopenie, systemický lupus erythematosus, splenomegalie, Fanconiho syndrom, defícience vitaminu B12, deficience kyseliny listové, May-Hegglinova anomálie, Wiskott-Aldrichův syndrom a paroxysmální nokturální hemoglobinurie. Ve všech těchto případech je možno použít sloučenin a prostředků podle vynálezu. Trombocytopenie může být také důsledkem určitých způsobů léčení AIDS (například za použití AZT). Zvýšení počtu krevních destiček může být také důležité při určitých poruchách hojení ran.

S ohledem na předvídanou defícienci krevních destiček, například v důsledku plánovaného chirurgického zásahu, je možno Mpl ligand podle vynálezu podávat několik dnů až několik hodin předtím, než je krevních destiček zapotřebí. V akutních situacích, například v případě nehody nebo masivní ztráty krve, může být Mpl ligand podáván spolu s krví nebo purifikovanými destičkami.

Mpl ligandy podle tohoto vynálezu mohou být také užitečné při stimulaci určitých typů buněk odlišných od megakaryocytů, pokud se zjistí, že tyto buňky exprimují Mpl receptor. Do rozsahu tohoto vynálezu spadá také určení podmínek, za nichž jsou tyto buňky, které exprimují Mpl receptor, responzivní vůči stimulaci Mpl ligandem.

Molekuly MGDF, které samy o sobě nejsou účinné při zkouškách aktivity uvedených v tomto popisu, mohou být užitečné jako modulátory (například inhibitory nebo stimulanty) Mpl receptorů in vitro nebo in vivo.

Při léčení výše uvedených chorob nebo stavů se polypeptidů podle tohoto vynálezu může používat samotných nebo v kombinaci s jinými cytokiny, rozpustnými Mpl receptoiy, hematopoietickými faktoiy, interleukiny, růstovými faktory nebo protilátkami.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou proto terapeutické prostředky pro léčení výše uvedených chorob nebo stavů. Tyto prostředky obsahují terapeuticky účinné množství polypeptidů Mpl ligandu nebo jeho terapeuticky účinného fragmentu ve směsi s farmaceuticky vhodným nosičem. Jako nosič přichází v úvahu voda (v případě injekčních prostředků), která je přednostně doplněna jinými látkami obvyklými při výrobě roztoků určených pro podávání savcům. Obvykle se Mpl ligand k terapeutickým účelům podává ve formě prostředku obsahujícího purifikovaný protein ve spojení s jedním nebo více fyziologicky vhodnými nosiči, excipienty nebo ředidly. Jako příklady vhodných nosičů je možno uvést neutrální pufrovaný roztok chloridu sodného nebo roztok

-22CZ 288926 B6 chloridu sodného smíchaný se sérovým albuminem. Přednostně se produkt zpracovává na prostředek ve formě lyofilizátu za spolupoužití vhodných excipientů (například sacharózy). Podle potřeby je možno přidávat i jiné standardní nosiče, ředidla a excipienty. Jako příklady je možno uvést Tris pufr o pH 8,0 a acetátový pufr o pH 5,0, přičemž posledně uvedené pufry mohou dále obsahovat sorbitol.

Prostředky podle vynálezu je možno systematicky podávat parenterální cestou. Alternativně je možno je podávat intravenózně nebo subkutánně. Pokud se používá systematického podávání, mohou být terapeutické prostředky podle vynálezu ve formě apyrogenních parenterálně vhodných vodných roztoků. Příprava takových farmaceuticky vhodných proteinových roztoků s řízenou hodnotou pH, izotonicitou, stabilitou apod. je v rozsahu zkušeností běžného odborníka v tomto oboru.

Dávkovači režim při léčení výše uvedených chorob a stavů bude určovat ošetřující lékař, který bude brát v úvahu různé faktory modifikující působení léčiv podle vynálezu, jako je například věk, stav, tělesná hmotnost, pohlaví a strava pacienta, závažnost případné infekce, doba podávání a jiné klinické faktory. Obvyklý denní režim by měl zahrnovat podávání 0,1 až 1000 pg proteinu Mpl ligandu nebo jeho fragmentu, vztaženo na kg tělesné hmotnosti.

Terapeutických metod, prostředků a polypeptidů podle tohoto vynálezu se může používat samotných nebo v kombinaci s jinými cytokiny, rozpustnými Mpl receptory, hematopoietickými faktory, interleukiny, růstovými faktory nebo protilátkami při léčení chorobných stavů, které jsou charakterizovány i jinými symptomy kromě defícience krevních destiček. Předpokládá se, že molekula Mpl ligandu bude užitečná při léčení určitých forem trombocytopenie v kombinaci s obecnými stimulátory hematopoiese, jako je IL-3 nebo GM-CSF. Spolu s Mpl ligandem se také může používat jiných megakaryotických stimulačních faktorů, tj. meg-CSF, faktorů kmenových buněk (SCF), faktoru inhibitujícího leukémii (LIF), onkostatinu M (OSM) nebo jiných molekul se stimulační účinnosti na megakaryocytů. Jako přídavné cytokiny nebo hematopoietické faktory pro takové společné podávání je možno uvést IL-1 a, IL-1 β, IL-2, IL3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, faktor stimulující kolonie-1 (CSF-1), GM-CSF, faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF), EPO, interferon-α (IFN-a), IFN-β nebo IFN-gamma. Dále může být užitečné podávat, buď současně nebo postupně, účinné množství rozpustného savčího receptoru Mpl, který vykazuje pravděpodobný účinek na fragmentaci megakaryocytů na krevní destičky, když megakaryocyty dosáhly maturované formy. Podávání Mpl ligandu (za účelem zvýšení počtu maturovaných megakaryocytů) s následným podáváním rozpustného Mpl receptoru (za účelem inaktivace ligandu a umožnění produkce krevních destiček z maturovaných megakaryocytů) se považuje za obzvláště účinný prostředek stimulace tvorby krevních destiček. Výše uvedené dávkování je pak třeba přizpůsobit za účelem kompenzace výše uvedených přídavných složek terapeutického prostředku. Pokrok dosažený u léčeného pacienta je možno monitorovat obvyklými metodami.

Jiná použití nových polypeptidů podle vynálezu zahrnují vývoj protilátek, které se vytvářejí standardními postupy. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají i protilátky reagující s pl ligandy podle tohoto vynálezu, jakož i reaktivní fragmenty takových protilátek. Tyto protilátky mohou být polyklonální, monoklonální, rekombinantní, chimérické, jednořetězcové a/nebo bispecifické atd. Jako fragmenty těchto protilátek přicházejí v úvahu jakékoliv protilátky, které jsou reaktivní vůči Mpl ligandu podle tohoto vynálezu, jako je F_at>, F_ab, atd. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také hybridomy vytvořené tak, že se Mpl ligand nebo jeho fragment podá jako antigen zvolenému savci a potom se známým způsobem provede fúze buněk (například buněk sleziny) zvířete s určitými rakovinnými buňkami za účelem vytvoření imortalizovaných buněčných linií. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také způsoby používané pro vytvoření takových buněčných linií a protilátky zaměřené proti celému humánnímu polypeptidů Mpl ligandu nebo jeho částem podle tohoto vynálezu.

-23CZ 288926 B6

Těchto protilátek se může používat k terapeutickým účelům, jako například pro inhibici vazby Mpl ligandu a jeho receptoru. Těchto protilátek se dále může používat pro in vivo a in vitro diagnostické účely, jako například (ve značené formě) pro detekci přítomnosti Mpl ligandu v tělesné tekutině.

Dále uvedené příklady slouží k dalšímu objasnění předloženého vynálezu. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. V příkladech jsou zejména popsána přednostní provedení tohoto vynálezu. Standardní metody provádění mnoha postupů popsaných v těchto příkladech, jakož i vhodné alternativní postupy jsou uvedeny v uznávaných příručkách molekulární biologie, jako je například Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) a Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols In Molecular Biology, Greene associates/Wiley Interscience, New York (1990).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Aplastická psí plazma

Heparinizovaná aplastická psí plazma („APK.9“) nebo normální psí plazma („NK9“) byla připravena způsobem popsaným v následujících publikacích, s tou výjimkou, že bylo recipientům dodáno, vztaženo na jednotlivce, ozáření v dávce 450 rad:

1. Mazur, E. a South, K., Exp. Hematol. 13: 1164-1172 (1985),

2. Arriaga, M., South, K., Cohen, J. L., a Mazur, Ε. M. Blood 69: 486-492 (1987) a

3. Mazur, E., Basilico, D., Newton, J. L., Cohen, J. L., Charland, C., Sohl, P.A., a Narendran, A., Blood 76: 1771-1782(1990).

Příklad 2

Zkouška s humánními megakaryocyty

APK9 a frakcionovaná APK9 byla zkoušena na schopnost stimulovat vývoj humánních megakaryocytů z progenitorových buněk CD34⁺. CD34-selektované buňky byly získány z buněk periferní krve způsobem popsaným vHokom Μ. H., Choi E., Nichol J. L., Homkohl A., Arakawa T. a Hunt P., Molecular Biology of Haematopoiesis 3: 15 až 31, 1994 a byly inkubovány v Dulbeccově médiu modifikovaném podle Iscova (IMDM, GIBCO, Grand Island, N.Y. USA) doplněném 1 % Glutamine Pen-strep (Irwine, Sciencific, Santa Anna, Kalifornie, USA) a 10 % heparinizované, na destičky chudé, humánní AB plazmy. Toto médium obsahovalo také 2-merkaptoethanol (10 ⁴M), kyselinu pyrohroznovou (110 pg/ml), cholesterol (7,8 pg/ml), adenosin, guanin, cytidin, uridin, thymidin, 2-deoxycytosin, 2-deoxyadenosin a 2-deoxyguanosin (vždy 10pg/ml, Sigma), humánní rekombinantní inzulín (10pg/ml), humánní transferin (300 pg/ml), sojové lipidy (1 %, Boehringer Mannheim), Indianapolis, IN, USA), základní humánní rekombinantní růstový faktor fibroblastů (2 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA, USA), humánní rekombinantní epidermální růstový faktor (15 ng/ml), růstový faktor pocházející z krevních destiček (10 ng/ml, Amgen, lne., Thousand Oaks, Kalifornie, USA. CD34selektované buňky byly přeneseny do jamek mikrotitrové misky typu Terasaki (Vanguard, lne., Neptune, NJ, USA) v koncentraci 2 x 10³/ml kultivačního média (konečný objem 15 μΐ). Buňky byly inkubovány 8 dnů při 37 °C v komoře s řízenou vlhkostí a atmosférou obsahující 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu za přítomnosti 1 % glutaraldehydu s koktejlem monoklonálních protilátek (anti-GPIb, anti-GPIIb (Biodesigne) a anti-GP-Ib (Dako, Carpinteria, Kalifornie, USA). Imunitní reakce byla vyvinuta za použití detekčního systém streptavidin-|3-galaktosidáza

-24CZ 288926 B6 (HistoMark, Kirkegaard a Pěny). Megakaryocyty identifikované na základě modrého zbarveni byly spočítány v mikroskopu s invertní fází při 100-násobném zvětšení. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměrný počet megakaryocytů, vztažený na jamku, ± směrodatná odchylka (SEM) od střední hodnoty. V některých případech (když se stupeň, v jakém daný vzorek indukuje vývoj megakaryocytů normalizuje vzhledem k pozitivní kontrolní APK9 pro tento pokus) se data uvádějí v jednotkách „megakaryocytové (meg) jednotky/ml“. Jedna taková jednotka je definována jako množství látky, které poskytne stejný počet megakaryocytů jako 1 μΐ APK9 standardu. Aktivita se považuje za aktivitu Mpl ligandu, pokud je možno ji blokovat MPL-X (rozpustný receptor Mpl) v koncentraci 5 až 10 pg/ml.

Ukazuje se, že APK9 obsahuje faktor nebo faktory, které vdaném systému stimulují vývoj humánních megakaryocytů. CD34-selektované buňky inkubované s 10% NK9 po dobu 8 dnů vykazují zanedbatelný počet modře vybarvených megakaryocytů zatímco v případě CD34selektovaných buněk inkubovaných s 10% APK.9 po dobu 8 dnů je počet modře vybarvených megakaryocytů velmi vysoký.

Obr. 2 ukazuje, že zvyšující se koncentrace Mpl-X přidané ke kultuře humánních megakaryocytů mají za následek zvyšující se inhibici vývoje magakaryocytů. Při koncentraci Mpl-X vyšší než 5 pg/ml je inhibice úplná. Při tomto pokusu jsou CD34-selektované buňky stimulovány 5 % APK.9. To ukazuje, že pro vývoj humánních megakaryocytů je zapotřebí aktivity, která interaguje s Mpl-X (předpokládaným Mpl ligandem. Dále z tohoto výsledku vyplývá, že v samotné APK9 je přítomen Mpl ligand.

Pokusy prováděné v souvislosti s vynálezem dále ukázaly, že aktivita Mpl ligandu, která je potřebná pro vývoj humánních megakaryocytů, je obsažena vAPK9. APK9 (135 ml) byla zředěna šestinásobně Iscového médiem a nanesena na afmitní sloupec Mpl-X. Nenavázaná látka (látka proteklá sloupcem) byla shromážděna a před zkoušením zkoncentrována na původní objem. Navázaná látka byla eluována do 10 ml 1M roztoku chloridu sodného a 20% shromážděného eluátu bylo podrobeno diafiltraci a před zkoušením čtyřnásobně zkoncentrováno. CD34-selektované buňky inkubované v samotném médiu neposkytly megakaryocyty. Buňky inkubované v 5% APK9 (stejná várka, jaká byla nanesena na sloupec) vedly k vývinu megakaryocytů v počtu 48 ± 8, vztaženo na jamku. Buňky inkubované v 10% nenavázané látce se nevyvinuly v megakaryocyty. Buňky inkubované v 10% eluátu poskytly megakaryocyty v počtu 120 ± 44, vztaženo na jamku. Aktivita jak látky navázané na sloupci, tak eluátu, byla při zkoušení v podstatě úplně inhibována Mpl-X o koncentraci 5 pg/ml.

Příklad 3

Transfekce myšího nebo humánního Mpl receptoru do myší buněčné linie

A. Myší Mpl receptor cDNA Myšího Mpl receptoru o úplné délce byla subklonována do expresního vektoru obsahujícího promotor transkripce pocházející z ltr viru myšího sarkomu Moloney Y. 5 pg tohoto konstruktu a 1 pg selektovatelného markerového plazmidu pWLNeo (Stratagene) bylo zavedeno současnou elektroporací do IL-3 dependentní myší buněčné linie (32D, klon 23; Greenberger et al., PNAS 80: 2931 až 2936 (1983)). Buňky byly 5 dnů kultivovány, potom byly izolovány a inkubovány v selekčním médiu s obsahem Geneticinu (800 pg/ml, G418, Sigma) a myšího IL-3 (1 ng/ml). Přeživší buňky byly potom rozděleny na části s obsahem vždy 2xl0⁵ buněk a kultivovány až do nárůstu populace, kterou bylo možno dále analyzovat. Šest populací bylo zkoušeno na povrchovou expresi Mpl receptoru pomocí analýzy FACS za použití polyklonálního králičího antipeptidového séra. Jedna populace byla vybrána pro třídění za použití stejného antipeptidového séra, jaké je zmíněno výše. Jednobuňkové klony rodičovské buněčné linie byly

-25CZ 288926 B6 podrobeny selekci za použití růstu na 10% APK9 s Geneticinem. Po selekci v APK9 (35 dnů) byly buňky uchovávány v myším IL-3 o koncentraci 1 ng/ml. Pro tuto část práce byl zvolen jeden ze subklonů, 1A6.1.

B. Humánní Mpl receptor

Sekvence humánního Mpl receptoru o úplné délce (Vigon I. et al., PNAS 89: 5640 až 5644 (1992)) byla subklonována do expresního vektoru obsahujícího promotor transkripce pocházející z viru myšího sarkomu Moloney (stejný vektor, jakého bylo použito v případě myšího receptoru). 6 pg tohoto konstrukci a 6 pg amfotrofíckého retrovirového obalového konstruktu (Landau N. R., Littman D. R., J. Virology 66: 5110 až 5113 (1992)) bylo transfekováno do 3 x 10⁶ buněk 293 za použití soupravy pro transfekci „CaPO₄ mammalian transfection kit“ (Stratagene). Stejné buňky byly podrobeny retransfekci po dvou a poté znovu po čtyřech dnech. Den následující po poslední transfekci byly buňky 293 kultivovány společně s IL-3 dependentní myší buněčnou linií (32D, klon 23; Greenberger et al., PNAS 80: 2931 až 2936 (1983)). Po 24 hodinách byly buňky izolovány a umístěny na pás BSA gradientu (Path-o-cyte; Miles lne.). Buňky byly expandovány v myším IL-3 (1 ng/ml) a potom podrobeny selekci na růst ve 20% APK9. Potom byly buňky vytříděny na povrchovou expresi receptoru za pomocí FACS za použití polyklonálního králičího antipeptidového séra. Těchto buněk bylo posléze použito na zkoušení.

Příklad 4

Stanovení Mpl ligandu v 1A6.1

Buňky 1A6.1 byly promytím zbaveny kultury IL-3 a přeneseny (1000 buněk/celkový objem 15 pí, vztaženo na jamku) do mikrotitrových misek typu Terasaki s médiem alfa MEM (Gibco) doplněném 10% fetálního telecího séra (FCS), Geneticinem (800 pg/ml) a směsí penicilinu a streptomycinu (pen/strep, 1 %, Gibco). Zkoušené vzorky byly přitom podrobeny sériovému ředění v poměru 1 : 1. Po 48 hodinách byl pod mikroskopem stanoven počet životaschopných buněk v jamce. Jedna jednotka aktivity byla definována jako aktivita, jíž se dosáhne za přítomnosti 200 životaschopných buněk v jamce. Aktivita byla definována jako aktivita Mpl ligandu, pokud bylo možno ji úplně inhibovat přídavkem Mpl-X v koncentraci 5 až 10 mg/ml. Aktivita Mpl ligandu v APK.9 dosahovala v průměru hodnoty 4400 ± 539 jednotek/mililitr aplastické plazmy. Pokud není uvedeno jinak, jsou jednotky aktivity Mpl ligandu definovány ve stanovení 1A6.1.

Zkoušky s buňkami transfekovanými genem humánního Mpl receptoru (příklad 3B) byly prováděny v podstatě stejným způsobem, jako zkoušky s buňkami 1A6.1.

Příklad 5

Potvrzení přítomnosti Mpl ligandu v aplastické plazmě nebo séru z myšího, psího, vepřového a humánního zdroje

Mpl ligand je přítomen v aplastické plazmě nebo séru z myšího, psího, vepřového a humánního zdroje (viz tabulka 2). Myším BDF1 byla plazma odebrána před ozářením a 12 dnů po ozáření (500 rad). Plazma byla podrobena zkoušení za použití buněk 1A6.1, přičemž byla zjištěna aktivita 2000 jednotek/ml. Tuto aktivitu bylo možno v podstatě úplně inhibovat Mpl-X (10 pg/ml). Ozářená myší plazma byla také pozitivní při zkoušce s humánními megakaryocyty, kde vykázala aktivitu 1833 jednotek/mililitr. Psům byla plazma odebrána před ozářením a 10 dnů po ozáření (450 rad). Plazma byla zkoušena jak za použití buněk 1A6.1, tak za použití humánních megakaryocytů. Zjištěná aktivita byla při obou zkouškách úplně inhibovatelná Mpl-X (10 pg/ml). Vepřům byla plazma odebrána před ozářením a 10 dnů po ozáření (650 rad). Plazma

-26CZ 288926 B6 byla zkoušena jak za použití buněk 1A6.1, tak za použití humánních megakaryocytů. Zjištěná aktivita Mpl ligandu byla při obou zkouškách úplně inhibovatelná Mpl-X (10 pg/ml), což je výsledek srovnatelný s výsledkem zjištěným u aplastické psí plazmy. Dále byla získána séra od aplastických humánních pacientů. Tato látka byla odebrána z kostní dřeně pacientů podrobených transplantaci. Séra od 6 pacientů byla zkoušena za použití buněk 1A6.1, kde byla zjištěna aktivita 903 jednotek/mililitr. 88 % této aktivity pocházelo z Mpl ligandu (na základě inhibice Mpl-X o koncentraci 10 pg/ml). Séra od 14 aplastických pacientů byla také podrobena zkoušce s humánními megakaryocyty. Jako celá skupina vykazovala tato séra podstatnou aktivitu, 941 jednotek meg/ml. Tuto aktivitu bylo možno úplně inhibovat Mpl-X o koncentraci 10 pg/ml. Data za použití myšího IL-3 jsou zde zahrnuta pro potvrzení specifičnosti zkoušky 1A6.1. Přestože tento rekombinantní cytokin indukuje růst této buněčné linie, není inhibován Mpl-X o koncentraci 10 pg/ml.

Tabulka 2

Druh	Zkouška 1A6.1 médium	s buňkami (jednotky/ml) + Mpl-X	Zkouška (jednotky meg/ml) médium	s humánními megakaryocyty + Mpl-X
Normální	0±0	0±0	0±0	0±0
myš Aplastická myš	2000	0	1833	neprovedena
Normální	0±0	0±0	0±0	0±0
pes Aplastický pes	4400 ±539	0±0	792 ± 128	0±0
Normální	0±0	0±0	0±0	0± 1
vepř Aplastický vepř	3866 ± 1136	0±0	1284 ± 182	10± 10
Normální člověk Aplastický člověk	0±0 903 ± 64	0±0 114 ±33	0±0 941 ± 178	0±0 0±0
myší IL3	6000 ±565	6000 ±565	neprovedena	neprovedena

Příklad 6

Stimulace růstu buněk 1A6.1 Mpl ligandem a vývoj humánních megakaryocytů

Mpl ligand přinejmenším asi 100 000 x obohacený lektinovou a afinitní chromatografií, viz příklad 7, stimuluje růst buněčné linie 1A6.1 a vývoj humánních megakaryocytů zCD34selektovaných buněk periferní krve způsobem, který je závislý na dávce. Za tuto aktivitu je zodpovědný Mpl ligand, jak to vyplývá z obr. 2 a 3, poněvadž aktivity při obou těchto zkouškách lze úplně inhibovat působením Mpl-X.

Původci tohoto vynálezu také ukázali, že buňky periferní krve CD34 purifikované FACS se po inkubaci sMpl ligandem (v tomto případě 100 jednotek/ml po dobu 9 dnů) vyvinou ve fenotypově normální maturované megakaryocyty. To potvrzuje, že purifikovaný Mpl ligand vykazuje stejný účinek na megakaryocyty, jako surová APK9. Kromě toho bylo při tomto pokusu použito purifikovaných buněk CD34⁺ (100% CD34⁺) na rozdíl od CD34-selektovaných buněk, které představují pouze 30 až 50% CD34⁺.

-27CZ 288926 B6

Příklad 7

Purifikace psího Mpl ligandu

I. Shrnutí

Proteiny (25 kDa 32 kDa) vykazující aktivity předvídané pro ligand Mpl receptoru byly podrobeny purifíkaci. Proteiny byly purifikovány z plazmy ozářených psů postupem zahrnujícím afmitní chromatografíi s aglutininem z pšeničných klíčků (WGA), afmitní chromatografii s Mpl receptorem, anexovou chromatografií, gelovou filtrační chromatografii a HPLC s obrácenými fázemi C44 (přehled tohoto purifikačního postupu je uveden na obr. 4). 25kDa a 31 kDa Mpl ligandy byly vysoce purifikovány až do dosažení zřejmé homogenity a bylo zjištěno, že mají aminokyselinové sekvence uvedené v tomto popisu.

II. Metody

A. Vyčeření plazmy

Zmrazená plazma (celkem 20 litrů) ozářených psů (viz příklad 1) byla ponechána roztát přes noc při 4 °C. Velké láhve se nechaly tát nejprve několik hodin při teplotě místnosti a teprve poté byly přemístěny do chladného prostoru. Nerozpustná látka byla odstraněna šestihodinovou centrifugací při 11 000 x g. Plazma byla zředěna fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem chloridu sodného o pH 7,3 s obsahem 0,01 % azidu sodného (PBS/azid) a přefiltrována přes filtr spory o průměru 1,2 pm. Po čeřícím postupu bylo obvykle dosaženo přibližně dvojnásobného zředění výchozí látky.

B. Afmitní chromatografie s aglutininem z pšeničných klíčků

Všechny operace byly prováděny při 4 °C. Vyčeřená plazma (2 várky) byla nanesena na sloupec s imobilizovaným aglutininem z pšeničných klíčků (1 litr, 10 x 12 cm, E Y Laboratories), kteiý byl ekvilibrován vPBS/azidu. Po nanesení vzorku byla nenavázaná látka ze sloupce vymyta PBS/azidem. Po promytí sloupce 0,5M roztokem chloridu sodného ve 20mM Tris-HCl o pH 8 byla aktivita Mpl ligandu navázaná na sloupec WGA eluována roztokem N-acetylglukosaminu (0,35M) (GlcNAc), chloridu sodného (0,5M), Tris-HCl (25mM) o pH 8. Aktivitu ligandu nebylo možno stanovit ve přefiltrovaném výtoku ani ve frakcích promývacího louhu.

C. Afmitní chromatografie s receptorem Mpl-X

Použitý rozpustný myší receptor Mpl (Mpl-X) odpovídá celé extracelulámí doméně Mpl receptoru bez Trp v poloze 483 (viz Vigon et al., 8: 2607 až 2615 (1993)). Pro optimalizaci vazby Mpl ligandu k afinitnímu sloupci s Mpl-X receptorem byl WGA eluát zkoncentrován membránovou ultrafiltrací (vylučovací mez molekulové hmotnosti 10 000, YM-10, Amicon) a následným zředěním byla koncentrace chloridu sodného nastavena na 0,2M. Zkoncentrovaný vzorek WGA byl nanesen na 20ml sloupec m-Mpl-X [myší rozpustný Mpl receptor/CNBr aktivovaná pryskyřice Sepharose (2,6 x 4,2 cm, 1,5 mg mMpl-X pryskyřice)] při průtokové rychlosti 0,9ml/min. Sloupec byl promýván PBS/azidem (40 ml, 1,5 ml/min), promývací kapalinou s vysokým obsahem soli (405 ml; lOmM Tris-HCl, 1M chlorid sodný, lmM CHAPS, pH 8,0). Sloupec byl eluován 20mM CAPS, 1M NaCl, 5mM CHAPS o pH 10,5. Vhodné frakce byly zachyceny a hodnota pH každé z nich byla upravena Tris pufřem.

Jak SDS-page, tak absorbance při 280 nm elučního profilu afínitního sloupce s Mpl-X receptorem vykazovala časný proteinový pík ve frakcích 1 až 4, zatímco hlavní podíl aktivity Mpl ligandu byl eluován po frakci 5.

-28CZ 288926 B6

D. Anexová chromatografíe na sloupci Mono-Q

Frakce o nejvyšší čistotě z několika afinitních sloupců z Mpl-X receptorem byly spojeny, zkoncentrovány a diafiltrovány proti 20mM Tris-HCl, 5mM CHAPS o pH 8,7 do konečného objemu 58,5 ml. Koncentrace proteinu v produktu byla stanovena na základě absorbance při 280 nm (0,12 pg/ml, což odpovídá celkem asi 7 mg proteinu). Produkt byl nanesen průtokovou rychlostí 0,5 ml/min na sloupec Mono Q HR 5/5 (Pharmacia), který byl ekvilibrován ve 20mM Tris-HCl a 5mM CHABS o pH 8,7. Sloupec byl eluován lineárním gradientem až do 0,36M chloridu sodného ve stejném pufru v průběhu 27 minut. Potom byl sloupec promyt během 6 minut gradientem až do 0,54M chloridu sodného a nakonec následovalo promytí 0,9M chloridem sodným. Byly zachycovány frakce o objemu 1 ml.

Eluční profil sloupce Mono-Q ukazuje, že žádný Mpl ligand nelze detekovat a jen nepatrné množství proteinu lze detekovat v proteklé kapalině a promývacích frakcích. Značná aktivita Mpl ligandu byla eluována ve frakcích 5 až 7 v průběhu počátečních stádií gradientu chloridu sodného. Inflexe aktivity byla pozorována ve frakcích 8 až 10 a poté následoval druhý hlavní pík zahrnující frakce 11 až 15.

Za použití SDS-PAGE (neredukční podmínky) byl v aktivních frakcích pozorován výrazný 25kDa pás. Intenzita tohoto pásuje přímo úměrná aktivitě Mpl ligandu v těchto frakcích. Tento pás chyběl ve frakcích 5 a 6 (pík aktivity 1A6.1) a podobně intenzivně vybarvený pás byl také přítomen ve frakcích 11 až 14 (pík aktivity 1A6.1). Výše uvedený pás byl slabý ve spojených frakcích 15 a 16, což odpovídá významně nižší aktivitě ve frakci 16.

E. Experimenty za použití gelové eluce

Experimenty s gelovou elucí byly prováděny za použití alikvotů Mono Q frakcí 5 a 6 nebo Mono Q frakcí 13 a 14. Při těchto experimentech byly frakce 5 a 6 (vždy 6 μΐ) spojeny, podobně jako frakce 13 a 14 (vždy 7,5 μΐ). Spojené frakce byly smíchány se vzorkem pufru SDS-PAGE (neredukčního) a naneseny na 12% SDS-gely. Po skončení elektroforézy byly vyříznuty dráhy, které jsou předmětem zájmu (1 mm) a vyříznuté proužky byly nařezány na malé kousky holicí čepelkou. Kousky byly přeneseny do l,5ml mikrocentrifugačních zkumavek obsahujících 0,5 ml PBS/5mM CHAPS, kde byly mírně promíchávány přes noc při teplotě 4 °C. Následujícího dne byly zkumavky krátce odstředěny, byly odebrány alikvotní vzorky a ty byly diafiltrovány proti Iscového médiu doplněnému BSA, jako nosným proteinem. Diafiltrovaných vzorků bylo použito pro zkoušení.

Výsledky ukazují, že bylo možno pozorovat dva píky aktivita Mpl ligandu. Jeden pík odpovídal 25kDa oblasti gelu, zatímco druhý pík aktivity Mpl ligandu byl pozorován v 31kD oblasti.

F. Filtrace na gelu Superdex 200

Frakce 13 až 16 ze sloupce pro iontovou výměnu na anexu Mono Q, jakož i dvě ekvivalentní frakce z druhé frakcionace na sloupci Mono Q byly spojeny a zkoncentrovány v membránovém ultrafiltračním zařízení (Centricon-10, Amicon). Byl přidán SDS do konečné koncentrace 0,1 % a vzorek byl nastříknut na sloupec Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia). Sloupec byl ekvilibrován v 50mM Tris-HCl, 0,1% SDS o pH 7,5 při průtokové rychlosti 0,3 ml/min, při teplotě místnosti. Byly zachycovány frakce vždy po 1 minutě. Zjistilo se, že většina proteinu ze vzorku se eluuje ve frakcích 32 až 40, zatímco aktivita Mpl ligandu byla detekována ve frakcích 42 až 46. Analýza frakcí pomocí SDS-PAGE ukázala významný 25kDa pás v aktivních frakcích.

G. HPLC s obrácenými fázemi (C4)

Frakce 43 až 46 (spojené) a frakce 42 (samotná) z filtrace na Superdex 200 byly zkoncentrovány v membránovém ultrafiltračním zařízení (Microcon-10, Amicon). Koncentrované vzorky byly

-29CZ 288926 B6 odděleně naneseny na 1 x 100 mm sloupec s obrácenými fázemi (vrtaná mikrokolona s náplní SynChropak RP-4). Sloupec byl ekvilibrován v 0,04% kyselině trifluoroctové (TFA) ve vodě (pufr A;). Jako pufru B bylo použito 0,035% TFA v 80% acetonitrilu. Po nastříknutí vzorku následoval lineární gradient až do 45% B během 4 minut a poté lineární gradient až do 75% B během 40 minut. Průtoková rychlost byla 75 μΐ/min. Výsledky purifíkace frakce 42 jsou uvedeny na obr. 5. Významné píky aktivity Mpl ligandu byly pozorovány ve frakcích 21 až 23. Tyto frakce byly analyzovány na 14% polyakiylamidovém gelu za neredukčních a redukčních podmínek. Frakce 21 se skládala z jediného 31kDa pásu, zatímco frakce 23 zahrnovala jediný široký 25kDa pás a frakce 22 obsahovala pásy jak v oblasti 25kDa, tak v oblasti 31kDa. Žádné jiné významné pásy nebyly pozorovány. Je třeba si povšimnout, že na základě dřívějších experimentů s gelovou elucí byla aktivita Mpl ligandu připisována oběma těmto oblastem. Jeden menší pás o vysoké molekulové hmotnosti byl pozorován ve všech frakcích neredukujícího gelu. Tento pás však nebylo možno zjistit v redukujícím gelu.

H. Analýza N-terminální sekvence 25kDa a 3 lkDa Mpl ligandu

Analýza N-terminální sekvence byla prováděna na frakcích C4 RP-HPLC vykazujících aktivitu. Sekvence zjištěné u těchto proteinů jsou uvedeny výše. Kromě hlavní sekvence odpovídající 25kDa pásu (přinejmenším 90 % z celkem naneseného vzorku) byly při sekvenování zjištěny dvě menší sekvence (které jsou připisovány menšímu kontaminujícímu pásu popsanému v části G výše). Porovnání se známými sekvencemi ukázalo, že menší sekvence odpovídají těžkému řetězci a kappa řetězci psího Ig. Pokud by to bylo žádoucí, bylo by možno množství těchto menších nečistot dále snížit zařazením přídavného purifikačního stupně, přednostně dalšího stupně gelové filtrace.

I. Porovnání aktivit Mpl ligandu v C4 purifikovaných frakcích

Obr. 6 ukazuje data potvrzující, že aktivity přítomné ve frakcích 22 a 23 zC4 RP-HPLC chromatografického stupně jsou v podstatě ekvivalentní. Frakce 22 obsahuje směs 25kDa a 31kDa pásu, zatímco frakce 23 obsahuje pouze 25kDa pás. Alikvoty každé frakce byly zředěny v poměru 1 : 45 000. Zředěné frakce stimulovaly růst buněk 1A6.1 v podstatě stejně (frakce 22, 5 400 buněk na jamku; frakce 23, 6 000 buněk na jamku). Zředěné frakce byly inkubovány se vzrůstajícími koncentracemi Mpl-X. Tyto frakce byly stejně citlivé k inhibici působením Mpl-X, tj. u obou došlo k úplné inhibici za použití koncentrace 7-1,4 pg/ml. To ukazuje, že účinný protein nebo proteiny ve všech frakcích jsou představovány Mpl ligandy s ekvivalentní biologickou aktivitou.

Příklad 8

Porovnání Mpl ligandu s jinými faktory při vývoji megakaryocytů

Bylo oznámeno, že na růst megakaryocytů nebo jejich vývoj má vliv řada rekombinantních faktorů nebo organických sloučenin, jako je forbolmyristoacetát (PMA). Z toho důvodu byly zkoumány účinky těchto faktorů na CD34-selektované buňky periferní krve. Ke kultuře byl, podle toho jak je to uvedeno, přidán humánní rekombinantní interleukin 3 (IL—3, 1 až 2 ng/ml), faktor kmenových buněk (SCF, 50 ng/ml), interleukin 6 (IL—6, 25 ng/ml), erythropoietin (EPO, 1 jednotka/ml), faktor inhibující leukémii (LIF, 10 ng/ml) a faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF, 25 ng/ml, Amgen lne.); interleukin 11 (IL—11, 25 ng/ml, R+D Systems, Minneapolis, MN, USA); nebo forbolmyristoacetát (PMA, 10~¹⁰M, Sigma). Mpl ligandu bylo použito v koncentraci 275 jednotek/ml a APK9 v 5% koncentraci (což odpovídá 220 jednotkám/ml). Faktorů zkoušených v kombinaci bylo použito ve stejné koncentraci jako při individuálním zkoušení. Po 8 dnech kultivace byly buňky fixovány v jamkách a bylo provedeno barvení megakaryocytů (n= 6 jamek pro každou podmínku) nebo byl stanoven celkový počet

-30CZ 288926 B6 buněk (n = 3 jamky pro každou podmínku). Data jsou uvedena jako střední hodnota ± směrodatná odchylka.

Obr. 7 ukazuje, že APK9 a Mpl ligand vede k nejvyššímu počtu megakaryocytů, vztaženo na jamku. Také IL-3 má za následek vývoj megakaryocytů, zejména v kombinaci s CSF. IL-6, ILII, ani EPO nemá velký vliv na počet megakaryocytů, ať již se jich použije samotných nebo v kombinaci sIL-3. Také PMA, ILF a GM-CSF vykazuje jen malý účinek. Na obr. 8 jsou uvedena data ze stejného experimentu, která ukazují celkový počet buněk zjištěných vjamce („celularita“). APK9 a Mpl ligand mají na celularitu malý vliv, zatímco IL-3 a SCF mají střední vliv. Nejvyšší účinek má kombinace SCF a IL-3. Dat uvedených na obr. 7 a 8 bylo použito pro výpočet procentních podílů megakaryocytů na jamku, což je uvedeno na obr. 9. Je jasné, že faktorem, který vyvolá nejvyšší procentní podíl megakaryocytů vjamce s kulturou, je Mpl ligand, účinná složka APK9. Tento výsledek ukazuje na specifičnost Mpl ligandu vzhledem k megakaryocytům.

Příklad 9

Aktivita Mpl ligandu spočívající v povzbuzení megakaryocytů není závislá na humánním IL-3

Mpl ligand stimuluje vývoj humánních megakaryocytů, když se ho použije jako přísady ke kultivačnímu médiu popsanému v příkladu 2. Přestože IL-3 se k tomuto médiu nepřidá, mohl by být přítomen v nedetekovatelně nízkých koncentracích v normální humánní plazmě, která je v tomto médiu obsazena. I když by však byl IL-3 přítomen, nepodílí se na Mpl ligandem indukované megakaryopoiesi. To je zřejmé z obr. 10. IL-3 v koncentraci 2 ng/ml vykazuje při zkoušce s humánními megakaryocyty aktivitu 14 900 megakaryocytových jednotek/ml. Tato aktivita je z 97 % inhibována pomocí anti-IL-3 (3,3 pg/ml, Genzyme, Cambridge, MA, USA). Mpl ligand v koncentraci 8 203 meg jednotek/ml není inhibován anti-IL-3.

Příklad 10

Analýza Mpl ligandu z vepře

I. Shrnutí

Proteiny z plazmy ozářeného vepře s aktivitou Mpl ligandu byly charakterizovány afinitní chromatografií WGA, afinitní chromatografií s Mpl receptorem, ionexovou chromatografií a HPLC s reverzními fázemi C4. Tato aktivita byla také charakterizována elucí z proužků SDSpolyakrylamidových gelů.

Chromatografie	Poznámka
WGA afinitní sloupec	4.4 x 10” jednotek naneseno 3.4 x 106 jednotek získáno
sloupec s receptorem Mpl	2,7 x 106 jednotek naneseno 2,4 x 106 jednotek získáno
iontová výměna, sloupec Mono S, pH 6,0	2.4 x 106 jednotek naneseno 4.4 x 106 jednotek získáno
HPLC s obrácenými fázemi C4	aktivita získána ve frakcích 23 až 25
experimenty s gelovou elucí	byly jasně rozlišeny dvě aktivity; jedna při asi 18 kDa a druhá při asi 28 kDa

-31CZ 288926 B6

Příklad 11

Klonování humánního Mpl ligandu, humánního MGDF

Dále jsou popsány dva přístupy:

I. Příklad prvního přístupu ke klonování

A. Vytvoření humánní MGDF próby

Byla vytvořena řada degenerovaných PCR primerů založených na aminoterminální sekvenci psího proteinu. Pro amplifikaci MGDF genu z humánní genomové DNA bylo použito různých dvojic primerů. Po 40 cyklech amplifíkace za použití negativního primerů 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID NO:4) kódujícího prvních 5 aminokyselin psího proteinu (SEQ ID NO:1) a pozitivního primem 5'GCA RTG YAA CAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO:5) kódujícího aminokyseliny 16 až 21 sekvence SEQ ID NO: 1 se PCR produkt analyzuje na 2,0% agarosovém gelu v pufru TBE.

Z agarosového gelu byl vyříznut 63bp pás, který byl reamplifikován za použití stejné kombinace primerů. PCR produkt byl klonován do PCR II vektoru (firma Invitrogen, San Diego, Kalifornie, USA). Rada kolonií byla podrobena screeningu sekvenováním DNA. Plazmidové DNA kódující peptid, který se podobí psímu MGDF proteinu, byl použit jako zdroj pro vytvoření radioaktivní próby určené pro screening cDNA knihoven. Genový fragment kóduje následující aminokyselinovou sekvenci.

Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Arg-Asp-Ser-His-ValLeu-His (SEQ IDNO:6)

Agarosového pásu obsahujícího humánní HGDF bylo použito pro vytvoření próby horkou PCR. Při typické PCR reakci obsahuje celkový objem 100 μΐ vzorku následující přísady:

templátová DNA

5' primer (SEQ ID NO:4) 3' primer (SEQ ID NO:5) lOXpufř dATP(0,lmM) dTTP(lOmM) dGTP(lOmM) dCTP(0,lmM) dCTP, P³² (10 pCi/pl) dATP, P³² (10 μ^μΐ) Taq DNA polymeráza voda až 3 μΐ μΐ, 20 pmol μΐ, 20 pmol μΐ μΙ μΐ μΐ μΐ

5μ1 μΐ

0,5 μΐ, 2,5 jednotky μΐ_____________

100 μΐ

Celkový objem

Bylo použito následujících amplifikačních podmínek:

počáteční zahřívání teplotní hybridizace prodlužování denaturace °C, 2 minuty °C, 30 sekund °C, 30 sekund °C, 30 sekund

Bylo provedeno 40 amplifikačních cyklů za použití zařízení Perkin Elmer GeneAmp Systém 9600.

-32CZ 288926 B6

Produkt byl purifikován průchodem přes sloupec „push“ (Stratagene, San Diego, Kalifornie, USA). Ιμΐ próba byla spočítána ve scintilačním počítači. K hybridizační směsi byly přidány próby obsahující 1 a 3 miliony rozpadů/ml.

B. Konstrukce knihovny z fetálních jater

Humánní polyA⁺ RNA z fetálních jater byla zakoupena od Clontech Laboratories. Pro syntézu cDNA bylo použito asi 4 pg RNA, přičemž primování bylo provedeno za použití statistického hexameru, 5'GTA CGC GTT CTA GAN NNNNNT 3' (SEQ ID NO:7), připojeného k oligomeru obsahujícímu místo Xbal.

Pro vytvoření dvouřetězcové cDNA bylo použito protokolu Gibco-BRL. Adaptor Eco R IBstXI (Invitrogen, San Diego, Kalifornie, USA) byl ligován k dvouřetězcové cDNA, načež následovalo štěpení restrikčním enzymem Xbal. Selekce cDNA podle velikosti byla provedena na sloupci S500 Sephacryl (Life Technologies, lne.). cDNA větší než 400 bp byly ligovány k savčímu expresnímu vektoru vl9.8 (Martin F., Cell 63: 203 až 211 (1990)), který již byl rozštěpen EcoRI a Xbal. Kompetentní buňky E. coli DH10 byly transformovány a výsledná cDNA knihovna byla rozdělena na 7 částí, z nichž každá obsahovala 100 000 cDNA.

C. Screening lambda knihovny

Knihovna z humánních fetálních ledvin v lambda gtl 1 byla zakoupena od firmy Clontech (titr 650 x 10⁶ pfu/ml). Asi 2 miliony plaků bylo podrobeno screeningu pomocí próby vytvoření PCR (viz výše). Hybridizace byla prováděna v 6 X SSC, 5 X Denhardt, 0,1% SDS a jednořetězcové DNA z lososího spermatu (100 pg/ml) po dobu 15 hodin při 56 °C.

Bylo provedeno několik cyklů screeningu. DNA byla amplifikována z jednotlivých plaků a hybridizována s vnitřním primerem, 5' AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3' (SEQ ID NO:8) kódujícím aminokyseliny 7 až 13 ze SEQ ID NO: 6, za účelem identifikace pozitivních výsledků.

D. 3 Primer rychlá amplifikace konců cDNA (RACE)

Polyadenylovaná RNA z humánních fetálních ledvin a fetálních jater byla zakoupena od firmy Clontech. 1 pg RNA byl reverzně transkribován za použití oligo 5' TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TTT 3' (SEQ ID NO: 9), jako primeru.

Pro vytvoření prvního řetězce cDNA bylo použito soupravy pro syntézu cDNA Gibco-BRL (Life Technologies lne., katalogové číslo 18267-013). Konečný objem byl 30 μΐ. Reakce byla zastavena přídavkem 500mMEDTA do konečné koncentrace lOmM a reakční směs byla uchovávána při teplotě -20 °C.

Při počáteční PCR bylo jako templátu pro reakci použito 0,5 μΐ cDNA. Jako pozitivních primerů bylo použito primeru (SEQ ID NO: 9) a kompetitoru, oligo

5' TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TT-P 3' (SEQ ID NO: 10), zatímco oligonukleotidu 5' TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3' (SEQ ID NO: 11) kódujícího aminokyseliny 5 až 11 ze SEQ ID NO:6 bylo použito jako negativního primeru. Bylo provedeno 40 amplifikačních cyklů za použití následujícího protokolu: 94 °C - 30 sekund, 65 °C-30 sekund a 72 °C - 30 sekund. Předtím byla provedena počáteční inkubace při 94 °C po dobu 2 minut. Amplifikace byla prováděna v zařízení Perkin Elmer GeneAmp Systém 9600.

Nesting byl proveden za použití negativního primeru

5' GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3' (SEQ ID NO: 12) kódujícího aminokyseliny 8 až

-33CZ 288926 B6 ze SEQ ID NO: 6. Jako pozitivních primerů bylo použito primerů SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 10. Bylo provedeno 40 amplifikačních cyklů s teplotní hybridizací při 65 °C. PCR produkty byly analyzovány na 0,8% agarosovém gelu a potom fotografovány pod UV světlem. Přitom byly viditelné pásy okolo 0,8 až 1,2 kb.

Produkty PCR byly potom klonovány do vektoru PCR II (Invitrogen). Jednotlivé kolonie byly sesbírány a plazmidy byly izolovány za použití souprav Qiagen (katalogová čísla 12143 a 12145). Za použití vektorových primerů bylo potom provedeno dvouřetězcové, barvivém primované, sekvenování. Sekvence byly analyzovány za použití různých typů software GCG.

E. Prodloužení 5' a 3' primery

Pro izolaci sekvence MGDF genu s úplnou délkou bylo prováděno prodlužování 3' a 5' primerem za použití různých částí knihovny z fetálních jater jako templátu. Pro amplifikaci 5 primerů cDNA bylo použito asi 20 ng cDNA z každé části jako templátu. Byl použit MGDF specifický pozitivní primer 5' GGA GTC ACG AAG CAG TTG AC 3' (SEQ ID NO: 13) kódující aminokyseliny 12 až 17 ze SEQ ID NO: 6 a 5'vektor vl9.8 negativní primer 5'CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3' (SEQ ID NO: 14). Amplifikace byla prováděna ve 30 cyklech s teplotní hybridizací při 53 °C. Nesting byl prováděn 30 cyklů s pozitivním primerem 5' GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3' (SEQ ID NO: 15) kódujícím aminokyseliny 1 až 6 ze SEQ ID NO: 6 a vektorovým primerem SEQ ID NO: 14.

Pro příměrovou extenzi 3' konců MGDF cDNA bylo použito pozitivního vektorového primerů 5'GGC ATA GTC CGG GAC GTC G 3' (SEQ ID NO: 16) a MGDF specifického primerů 5' TCC TCC TGC TTG TGA CCT C 3' (SEQ ID NO: 17) kódujícího aminokyseliny 1 až 6 SEQ ID NO: 6. Amplifikace byla prováděna ve 30 cyklech s teplotní hybridizací při 58 °C.

Nestingová amplifikace byla prováděna 30 cyklů za použití MGDF primerů SEQ ID NO: 12 a vektorového primerů SEQ ID NO: 16. Specifické pásy byly patrné v částech 1, 7 a 8, které byly klonovány do PCR II vektoru. Purifikované plazmidové DNA zjednotlivých kolonií byly dále purifikovány a sekvenovány.

F. Izolace klonů humánního MGDF o plné délce

Mnoho počátečních klonů neobsahovalo část u aminokonce MGDF, poněvadž části MGDF sekvence bylo použito pro priming a nesting. Primerů 5' CCA GGA AGG ATT CAG GGG A 3' (SEQ ID NO: 18), jehož sekvence byla získána z pěti experimentů s příměrovou extenzí popsaných výše bylo použito jako negativního primem. Jako pozitivní primer přitom posloužil vektorový primer SEQ ID NO: 16. Bylo provedeno 35 cyklů amplifikace s teplotní hybridizací při 58 °C. Pro nesting v 35 cyklech bylo použito MGDF specifického primerů 5' CAA CAA GTC GAC CTC CAG CCA GAC ACC CCG 3' (SEQ ID NO: 19) s místem Sáli a pro nesting v 35 cyklech bylo použito vektorového primerů SEQ ID NO: 15. PCR produkt byl klonován do PCR II vektoru a sekvenován.

II. Příklad druhého přístupu ke klonování

A. Klonování N-terminální cDNA psího MGDF

Degenerované oligonukleotidové primery byly zhotoveny na psí MGDF N-terminální aminokyselinové sekvenci popsané v předchozí části a bylo jich použito jako primem při řetězových reakcích iniciovaných polymerázou (PCR pro amplifikaci MGDF-kódujícího cDNA sekvencí). Úplná RNA byla připravena ze vzorku psích ledvin metodou s guanidiniumizokyanátem (Chomzynski a Sacchi, Biochem 162: 156 až 159 (1987)). První řetězec cDNA byl připraven se statistickým primerem - adapterem 5' GGC CGG ATA GGC

-34CZ 288926 B6

CAC TCNNNNNNT 3' (SEQ. ID NO: 20) za použití reverzní transkriptázy MoMULV a bylo ho použito jako templátu při následujících reakcích PCR.

PCR byla prováděna za použití 0,5 μΐ (asi 50 ng) cDNA za použití primeru A

5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID NO: 4) a primeru s negativním řetězcem kódujícího aminokyseliny 1 až 6 ze SEQ ID NO: 1 a buď primeru B

5'GCARTGNAGNACRTGNGARTC3' (SEQ ID NO: 5) nebo primeru C 5' GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO: 21), což jsou primery pozitivního řetězce kódujícího aminokyseliny 16 až 21 ze SEQ ID NO: 1 se 3 nukleotidy navíc u 5' konce pro zvýšení stability při teplotní hybridizaci. PCR s Taq polymerázou byla prováděna 35 až 45 cyklů do té doby, dokud nebyly na agarosovém gelu pro elektroforetickou analýzu patrné pásy produktu. V prvních dvou cyklech PCR byl prováděn rehybridizační (teplotní hybridizace) stupeň (37 °C, 2 minuty) a rehybridizace ve zbývajících cyklech byla prováděna 1 minutu při 50 °C. V každém reakčním produktu bylo pozorováno více pásů produktů. Pomoc špičky Pasteurovy pipety byly odebrány části gelu obsahující pásy o přibližně očekávané velikosti (66 bp) a byla provedena jejich reamplifikace se stejnou dvojicí primerů. DNA produkty byly klonovány do vektoru PCR II (Invitrogen) podle instrukcí výrobce. Tři klony byly sekvenovány a bylo zjištěno, že kódují v jednom čtecím rámci očekávanou psí MGDF sekvenci, zbytky 1 až 21. Tímto způsobem byla získána jedinečná psí MGDF cDNA sekvence pokrývající oblast od třetího nukleotidu kodonu 6 do třetího nukleotidu kodonu 15. Jednoho z těchto klonů bylo použito jako templátu pro přípravu značené psí MGDF cDNA próby.

B. Konstrukce cDNA knihovny z humánních fetálních jater

RNA byla izolována z humánních fetálních jater (Intemational Institute for the Advancement of Medicine, Exton, PA, USA) lyží tkáně v 5,5M guanidiniumthiokyanátu a purifíkací CsTFA (Pharmacia) centrifugací. Polyadenylovaná RNA byla selektována za použití perlového produktu oligo (dT)₂₅ dynabeads (Dynal, podle instrukcí výrobce). Z této RNA byla vyrobena dvouřetězcová cDNA za použití plazmidového systému Superscript pro syntézu cDNA (Life Technologies lne.) s výjimkou použití odlišného linkerového adaptéru:

5' TTG GTG TGC ACT TGT G 3' (SEQ ID NO: 22) a

5' CAC AAG TGC ACA CCA ACC CC 3' (SEQ ID NO: 23). Po selekci podle velikosti byla tato cDNA směrované vložena do míst BstXI a Notl savčího expresního vektoru pBCB (pBCB byl získán z plazmidu Rc/CMV, Invitrogen obsahujícího hlavní řetězec pucl9, CMV promotor a BGH polyadenylační místo). Ligovaná DNA byla elektroporací zavedena do elektrokompetentního bakteriálního kmene 10 B (Life Technologies lne.).

C. Screening knihovny cDNA z humánních fetálních jater na MGDF

Filtrové repliky humánní fetální jatemí knihovny byly hybridizovány k radioaktivně značenému psímu MGDF N-konec cDNA PCR produktu (5x SSPE, 2x Denhardt, 0,05% difosforečnan sodný, 0,5% SDS, kvasinkový tRNA lyzát (100 μΐ/litr) a denaturovaná lososí spermatová DNA (100pg/ml)) 18 hodin při 64 °C. Filtry byly promyty při 64 °C v 5x SSPE, 0,5% SDS a exponovány přes noc. Byly izolovány a analyzovány dva různé klony hybridizované k této próbě.

D. Exprese humánních MGDF cDNA klonů

Purifikovaná DNA z MGDF cDNA klonů byla transfekována do buněk 293 EBNA (Invitrogen). 1,5 pg DNA bylo smícháno se 7,5 μΐ Lipofectaminu (Life Technologies, lne.) ve 100 μΐ séraprostého DMEM. Po 20minutové inkubaci při teplotě místnosti byla směs DNALipofectamine přidána k 5 x 10⁵ buňkám/jamka (24-jamková čtvercová miska Greiner) v 400 μΐ DMEM s 1 % séra (Fetal Cloně Π) a inkubována 6 hodin při 37 °C. K buňkám bylo přidáno 500 μΐ DMEM s 20 % séra (Fetal Cloně II). Po 16 hodinách bylo médium odtaženo a bylo přidáno 500 μΐ DMEM s 1 % séra (Fetal Cloně II). Po dalších 72 hodinách bylo zpracované

-35CZ 288926 B6 médium shromážděno a odstředěno za použití rotačního filtru s průměrem pórů 0,22 pm. Zpracované médium bylo podrobeno zkoušce na biologickou aktivitu MGDF.

III. Popis humánních MGDF klonů a jejich aktivita

Za použití výše popsaných strategií klonování byly získány humánní cDNA klony znázorněné na obr. 11 (MGDF-1 a MGDF-2; SEQ ID NO: 24, 25 a 26, 27) a obr. 12 (MGDF-3; SEQ ID NO: 28, 29). Každá z těchto sekvencí uvedených na obrázcích obsahuje předpokládanou signální sekvenci aminokyselin 1 až 21, takže maturovaný protein začíná vždy aminokyselinou 22.

Výsledky zkoušek aktivity za použití zkoušky s buňkami popsané v příkladu 4A (MGDF 1 až 3) jsou uvedeny v tabulkách 3 a 4. Podle tabulky 3 bylo médium zpracované buňkami 293 EBNA transfekovanými jednotlivými konstrukty shromážděno po dvou dnech kultivace a potom zkoušeno na buňkách 1A6.1 (32D/mur-MPL+) + 10 pg/ml mur-MPL-X. Podle tabulky 4 bylo médium zpracované buňkami 293 EBNA transfekovanými jednotlivými konstrukty shromážděno po čtyřech dnech kultivace a potom zkoušeno na buňkách 32D/mur-MPL+ (příklad 3A) a 32DHu-MPL+ (příklad 3B). Jak je zřejmé, humánní MGDF-1 a MGDF-2, ale nikoliv MGDF-3, je aktivní v buněčných linií exprimujících jak myší, tak humánní formu Mpl. Buněčná linie exprimující humánní Mpl receptor je responzivnější vzhledem k MGDF-1 a MGDF-2 než buněčná linie exprimující myší Mpl receptor.

Tabulka 3

Klon	-mur-MPL-X (jednotky/ml)	+ mur-MPL-X (jednotky/ml)
Médium	0	0
PBCO (kontrolní plazmid)	0	0
MGDF-1	12 800	800
MGDF-1 (opakování)	12 800	566
MGDF-2	4525	400
MGDF-2 (opakování)	12 800	1132
MGDF-3	0	0
MGDF-3 (opakování)	0	0
APK9 kontrolní	4400 ± 400	0

Tabulka 4

Klon	32D/mur-MPL+ (jednotky/ml)	32D/hu-MPL+ (jednotky/ml)
MGDF-1	1600	25 600
MGDF-2	6400	50 000
MGDF-2 (opakování)	6400	50 000 až 100 000

Následující tabulka 5 ukazuje, že aktivity humánního MGDF-1 a MGDF-2 na buňky 32D/HuMPL+ (příklad 3B) jsou v podstatě úplné inhibovány rozpustným humánním Mpl receptorem (hu-Mpl-X), hu-MPL-X byl obsažen ve zpracovaném médiu odděleném od buněk CHO produkujících tento protein. Médium zpracované buňkami CHO shu-MPL-X bylo 120x zkoncentrováno a potom přidáno ke kulturám do obsahu 6,6 %. Zpracované médium z kontrolních CHO kultur nevykazovalo žádný účinek při této zkoušce. Zkouška byla prováděna způsobem popsaným v příkladu 4B, pouze stím rozdílem že životaschopné buňky byly zjišťovány po 3 dnech.

-36CL 288926 B6

Tabulka 5

Klon	-Hu-MPL-X (jednotky/ml)	+ Hu-MPL-X (jednotky/ml)
MGDF-1	530	0
MGDF-2	270	0

Zkouška s humánními megakaryocyty

MGDF-1 a MGDF-2, ale nikoliv MGDF-3, indukuje tvorbu megakaryocytů z CD34-selektovaných buněk z periferní krve. Experiment popsaný v tabulce 6 byl proveden v podstatě způsobem popsaným v příkladu 2, pouze s tím rozdílem, že buňky periferní krve byly CD34-selektovány bez elustrice a kultury byla sklizena po 7 dnech. Zpracovaného média z 293 EBNA MGDF ío konstruktu bylo použito při 20 % finálního objemu ±30 pg/ml mur-MPL-X. APK9 kontroly bylo použito při 6 % konečného objemu.

Tabulka 6

Klon	Megakaryocyty na jamku (-mur-MPL-X)	Megakaryocyty na jamku (±mur-MPL-X)
vektorová kontrola	0	0
APK9 kontrola	100 ±3	0
MGDF-1	142 ±48	17 ± 2
MGDF-2	100 ±3	6±2
MGDF-2 (opakování)	86 ± 10	0
MGDF-3	2±2	0

Příklad 12

Následující příklad popisuje syntézu 12 různě pegylovaných MGDF molekul, PEG 9 až PEG 12 20 a PEG 14 až PEG 21. V každém případě bylo jako molekuly MGDF pro pegylaci použito MGDF

- 11 z E. coli (aminokyseliny 22 až 184 při číslování začínajícím od začátku signálního peptidu, nebo aminokyseliny 1 až 163 při číslování začínajícím od maturovaného proteinu). Podrobnosti vztahující se k těmto pegylovaným molekulám jsou shrnuty v tabulkách 7 až 10 (dále).

12.1 Příprava konjugátů póly—MePEG—MGDF acylací MGDF aktivovanými MePEG deriváty

Příprava konjugátů poly-MePEG (20 kDa)-MGDF (PEG 11)

Ochranný (4 °C) roztok MGDF (2,5 mg/ml) v 0,lM puru Bicine o pH 8 byl přidán 30 k desetinásobnému molámímu nadbytku tuhého MePEG-sukcinimidylpropionátu v molekulové hmotnosti 20 kDA (Shearwater Polymers, lne.). Polymer byl rozpuštěn za mírného míchání a další reakce byla provedena při teplotě místnosti.

Stupeň modifikace proteinu v průběhu reakce byl monitorován HPLC s vylučovací mezí 35 molekulové hmotnosti (SEC) za použití sloupce Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech), který byl eluován 0,lM fosfátovým pufrem (fosforečnan sodný) o pH 6,9 při rychlosti eluce 0,7 ml/min.

Analýza reakční směsi pomocí SEC HPLC ukázala po 30 minutách reakční doby, že v reakční 40 směsi není obsažen žádný volný protein. V tomto okamžiku byla koncentrace proteinu v reakční směsi snížena na 1 mg/ml přídavkem sterilní vody a hodnota pH směsi byla upravena na 4 několika kapkami 0,5M kyseliny octové.

-37CZ 288926 B6

Konjugát MePEG-MGDF byl oddělen od nadbytku MePEG a jiných vedlejších produktů reakce ionexovou chromatografií za použití ionexové pryskyřice SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech).

Reakční směs byl nanesena (2,5 mg/ml pryskyřice) na sloupec a nezreagovaný MePEG byl eluován 3 objemy sloupce počátečního pufru A (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 15% glycerol). Potom byl konjugát MePEG-MGDF eluován za použití lineárního gradientu od 0 do 30% v 10 objemech sloupce koncového pufru B (1M chlorid sodný v pufru A). Eluát byl monitorován při 280 mm. Frakce obsahující konjugát poly-Me-PEG-MGDF byly spojeny, zkoncentrovány a sterilizovány filtrací.

Purifikovaný konjugát poly-MePEG-MGDF byl analyzován SEC HPLC za použití filtračních sloupců TSK-GEL G4000SWXL a G2000SWXL zapojených do série. Proteiny byly detekovány na základě UV absorbance při 280 nm. Jako markérů molekulové hmotnosti globulámího proteinu bylo použito standardů pro gelovou filtraci BIO-RAD:

Jak je zřejmé z obr. 17A, podle SEC HPLC obsahoval produkt dvě hlavní složky (v přibližném poměru 2 : 1), jejichž eluční polohy odpovídají globurálním proteinům o molekulové hmotnosti 379,9 kDA a 150,0 kDA (viz také tabulka 8).

Konjugáty PEG 9, PEG 10 a PEG 12, vyrobené acylací MGDF sukcinimidylestery, s MePEG o molekulové hmotnosti 6 až 50 kDA byly připraveny podobným způsobem. Hlavní reakční parametry použité při těchto postupech jsou shrnuty v tabulce 7.

Výsledky analýzy SEC HPLC těchto konjugátů jsou uvedeny v tabulce 8.

12.2 Příprava konjugátů poly-MePEG-MGDF redukční alkylací MGDF MePEGaldehydy

Příprava poly-MePEG(20 kDa)-MGDF konjugátu (PEG 20)

K ochlazenému (4 °C) míchanému roztoku MGDF (2 ml, 2,5 mg/ml) ve lOOmM fosforečnanu sodném o pH 5 s obsahem natriumkyanborhydridu (20mM NaCNBH₃) byl přidán desetinásobný molámí nadbytek monomethoxypolyethylenglykolaldehydu (MePEG) o průměrné molekulové hmotnosti 20 kDa a v míchání reakční směsi bylo pokračováno při stejné teplotě.

Stupeň modifikace proteinu v průběhu reakce byl monitorován HPLC s vylučovací mezí molekulové hmotnosti (SEC) za použití sloupce Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech), který byl eluován 0,lM fosfátovým pufrem (fosforečnan sodný) o pH 6,9 při rychlosti eluce 0,7 ml/min.

Analýza reakční směsi pomocí SEC HPLC ukázala po 16 hodinách, že více než 90 % počátečního množství proteinu bylo modifikováno. V tomto okamžiku byla koncentrace proteinu v reakční směsí snížena na 1 mg/ml přídavkem sterilní vody a hodnota pH směsi byla upraveny na 4 0,5M kyselinou octovou.

Konjugát MePEG-MGDF byl oddělen od nadbytku mePEG a jiných vedlejších produktů reakce ionexovou chromatografií za použití ionexové pryskyřice SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech).

Reakční směs byla nanesena (2,5 mg/ml pryskyřice) na sloupec a nezreagovaný MePEG byl eluován 3 objemy sloupce počátečního pufru A (20mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 15% glycerol). Potom byl konjugát MePEG-MGDF eluován za použití lineárního gradientu od 3 do 30% v 10 objemech sloupce koncového pufru B (1M chlorid sodný v pufru A). Eluát byl monitorován při 280 nm. Frakce obsahující konjugát poly-MePEG-MGDF byly spojeny, zkoncentrovány a sterilizovány filtrací.

-38CZ 288926 B6

Purifíkovaný konjugát poly-MePEG-MGDF byl analyzován SEC HPLC za použití filtračních sloupců TSK-GEL G4000SWXL a G2000SWXL zapojených do série. Proteiny byly detekovány na základě UV absorbance při 280 nm. Jako markérů molekulové hmotnosti globulámího proteinu bylo použito standardů pro gelovou filtraci BIO-RAD.

Jak je zřejmé z obr. 17B, podle SEC HPLC obsahoval produkt dvě hlavní složky (52 až 47 % celkového množství), jejichž eluční polohy odpovídají globulámím proteinům o molekulové hmotnosti 359,4 kDa a 159,3 kDA (viz také tabulka 8).

Konjugáty PEG 18, PEG 19 a PEG 21, vyrobené redukční alkylaci MGDF MePEGaldehydem o molekulové hmotnosti 6 až 25 kDa byly připraveny podobným způsobem. Hlavní reakční parametry použité při těchto postupech jsou shrnuty v tabulce 7.

Výsledky analýzy SEC HPLC těchto konjugátů jsou uvedeny v tabulce 8.

12.3 Příprava konjugátů monomethoxypolyethylenglykol-MGDF s místem připojení vNterminální a-aminoskupině

Příprava mono-MePEG(20 kDA)-MGDF konjugátu (PEG 16)

K ochlazenému (4 °C) míchanému roztoku MGDF (2 ml, 2,5 mg/ml) ve 100 mM fosforečnanu sodném o pH 5 s obsahem natrimkyanborhydridu (20mM NaCNBHj) byl přidán pětinásobný molámí nadbytek methoxypolyethylenglykolaldehydu (MePEG) o průměrné molekulové hmotnosti 20 kDa a v míchání reakční směsi bylo pokračováno při stejné teplotě.

Stupeň modifikace proteinu v průběhu reakce byl monitorován SEC HPLC za použití sloupce Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia Biotech), který byl eluován 0,lMfosfátovým pufrem (fosforečnan sodný) o pH 6,9 při rychlosti eluce 0,7 ml/min.

Analýza reakční směsi pomocí SEC HPLC ukázala po 16 hodinách, že bylo modifikováno přibližně 90 % počátečního množství proteinu. V tomto okamžiku byla koncentrace proteinu v reakční směsi snížena na 1 mg/ml přídavkem sterilní vody a hodnota pH směsi byla upravena na 4 0,5M kyselinou octovou.

Konjugát mono-MePEG(20 kDA)-MGDF byl oddělen od nadbytku MePEG a jiných vedlejších produktů reakce ionexovou chromatografií za použití ionexové pryskyřice SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech).

Reakční směs byla nanesena (2,5 mg/ml pryskyřice) na sloupec a nezreagovaný MePEG byl eluován 3 objemy sloupce počátečního pufru A (20mMfosforečnan sodný, pH 7,2, 15% glycerol). Potom byl konjugát MePEG-MGDF eluován za použití lineárního gradientu od 0 do 25 % ve 20 objemech sloupce koncového pufru B (1M chlorid sodný v pufru A). Eluát byl monitorován při 280 nm. Frakce obsahující konjugát mono-MePEG-MGDF byly spojeny, zkoncentrovány a sterilizovány filtraci.

Homogenita konjugátů mono-MePEG-MGDF byla zkoušena elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným za použití 4 až 20% předem nalitých gradientových gelů (Novex). Byl pozorován jeden hlavní pás odpovídající poloze 46,9kDA proteinu.

Purifíkovaný konjugát mono-MePEG-MGDF byl analyzován SEC HPLC za použití filtračních sloupců TSK-gel G4000SWXL a G2000SWXL zapojený do série. Proteiny byly detekovány na základě UV absorbance při 280 nm. Jako markérů molekulové hmotnosti globulámího proteinu bylo použito standardů pro gelovou filtraci Bio-Rad.

-39CZ 288926 B6

Jak je zřejmé z obr. 17C, podle SEC HPLC obsahoval produkt jednu hlavní složku, jejíž eluční poloha odpovídá globulámímu proteinu o molekulové hmotnosti 181,1 kDA (viz také tabulka 9).

Konjugáty mono-MePEG-MGDF sPEG 14, PEG 15 a PEG 17, vyrobené redukční alkylací MGDF MePEGaldehydem o molekulové hmotnosti 6 až 25 kDa, byly připraveny podobným způsobem. Hlavní reakční parametry použité při těchto postupech jsou shrnuty v tabulce 7.

Výsledky analýzy SEC HPLC těchto konjugátů jsou uvedeny v tabulce 9.

Tabulka Ί

Shrnutí reakčních parametrů při modifikaci MGDF

Kód	Reaktivní MePEG	Reakční podmínky
	Typ	m.h.	konc. MGDF (mg/ml)	pH	teplota (°C)	doba (h)	molámí poměr MePEG/MGDF
PEG 9	NHS ester	6 kDa	2,5	8	t.m.	0,5	15
PEG 10	NHS ester	6 kDa	2,5	8	t.m.	0,5	10
PEG 11	NHS ester	20 kDa	2,5	8	t.m.	0,5	10
PEG 12	NHS ester	50 kDa	2,5	8	t.m.	0,5	5
PEG 14	aldehyd	6 kDa	2,5	5	4	16	5
PEG 15	aldehyd	12 kDa	2,5	5	4	16	5
PEG 16	aldehyd	20 kDa	2,5	5	4	16	5
PEG 17	aldehyd	25 kDa	2,5	5	4	16	10
PEG 18	aldehyd	6 kDa	5	5	4	16	10
PEG 19	aldehyd	12 kDa	5	5	4	16	10
PEG 20	aldehyd	20 kDa	5	5	4	16	10
PEG 21	aldehyd	25 kDa	5	5	4	16	10

m.h. = molekulová hmotnost

t.m. = teplota místnosti

Tabulka 8

Shrnutí vlastností poly-MePEG-MGDF podle SEC HPLC

Kód	Reaktivní	MePEG	Zjevná m.h. podle SEC (kDa)	Obsah složky (%)
PEG 9	NHS ester	6 kDa	87,9 52,7	75 25 (inflexe)
PEG 10	NHS ester	6 kDa	69,2 42,9	14 (inflexe) 86
PEG 11	NHS ester	20 kDa	370,9 155,0	68 32
PEG 12	NHS ester	50 kDa	865,6 368,0	53 47
PEG 18	aldehyd	6 kDa	84,6 41,5	60 40
PEG 19	aldehyd	12 kDa	218,4 106,7	59 41
PEG 20	aldehyd	20 kDa	359,4 159,3	52 47
PEG 21	aldehyd	25 kDa	450,5 218,4	54 46

-40CZ 288926 B6

Tabulka 9

Zjevná molekulová hmotnost konjugátů mono-MePEG-MGDF

Kód	Reaktivní	MePEG	Zjevná m.h. podle SEC (kDa)	Zjevná m.h. podle SDS PAGE (kDa)
	Typ	m.h. (kDa)
PEG 14	aldehyd	6	44,5	27,7
PEG 15	aldehyd	12	104,7	38,3
PEG 16	aldehyd	20	181,1	46,9
PEG 17	aldehyd	25	226,4	55,5

12,4. Příprava konjugátů DiMePEG(12kDa)-MGDF redukční alkylací MGDF methoxypolyethylenglykolaldehydem (PEG 22)

Purifikovaná molekula označovaná názvem PEG 22 byla získána následujícím postupem:

Pětinásobný nadbytek methoxypolethylenglykolaldehydu (MePEG, tj. látka vzorce OHC(CH2)2O-(CH2-CH2O)_n-CH3, kde n představuje index, jehož hodnota odpovídá molekulové hmotnosti produktu přibližně 12 kDa) (Shearwater Polymers) byl přidán k roztoku MGDF (2,5 mg/ml) (z E. coli, 1 až 163) v lOOmM octanu sodném, pH 5,0, přičemž teplota byla udržována na 5 °C. Po lOminutovém míchání bylo přidáno dostatečné množství natriumyanborhydridu (Aldrich), aby koncentrace této látky v reakční směsi byla 20mM.

Vzniklá směs byla 16 hodin míchána přibližně při 5 °C. Na konci této byla přidána purifikovaná voda (podle US lékopisu) v dostatečném množství pro úpravu koncentrace MGDF na 1 mg/ml. Směs byla přefiltrována přes vakuový filtr s rozměry pórů 0,2 pm. Tímto způsobem bylo získáno 90 mg reakčního produktu. K reakční směsi byla přidána malá množství l,0M primárního fosforečnanu a IN hydroxidu sodného pro dosažení koncentrace fosforečnanu lOmM a pH roztoku 6,8.

Konjugát byl puntíkován na sloupci katexové pryskyřice. Byl přidán 40ml sloupec pro HPLC zSP-Seharose s výškou lože 7,5 cm. Sloupec byl ekvilibrován s ekvilibračním pufrem (lOmM fosforečnan, pH 6,8, 15% glycerolu). Potom byl na sloupec nanesen konjugát v množství 2,2 mg/ml pryskyřice rychlostí 0,15 objemu sloupce za minutu. Následovalo promývání ekvilibračním pufrem až do dosažení základní linie. Eluce sloupce byla proveden 10 objemy sloupce elučního činidla s lineárním gradientem od pufru A (25mM fosforečnan, pH 7,2, 15 % glycerolu) do pufru B (pufr A + 0,3M chlorid sodný). Průtoková rychlost byla udržována na hodnotě 0,15 objemu sloupce za minut. Eluát byl monitorován při 280 nm.

Jednotlivé frakce byly analyzovány metodou SDS-PAGE a frakce obsahující DiPEG konjugát byly spojeny a přefiltrovány přes filtrační jednotku s průměrem pórů 0,2 pm.

Příklad 13

Biologická účinnost pegylovaných molekul MGDF

A. PEG-9 až PEG-12 a PEG-14 až PEG-21

Byl zjištěn počet krevních destiček u myší léčených rekombinantním humánním MGDF a výsledky jsou uvedeny na obr. 18. Normálním myším Balb/c se jednou denně po dobu celkem 5 dnů subkutánní injekcí podává MGDF 22-353 z CHO (kosočtverce), nepegylovaný MGDF22 až 184 z E. coli (otevřené kroužky) a pegylovaný MGDF 22 až 184 z E. coli (uzavřené kroužky)

-41CZ 288926 B6 v koncentraci uvedené v popisu tohoto obrázku uvedené výše. 24 hodin po poslední injekci byly zvířatům odebrány krevní vzorky z malého laterálního řezu v ocasní véně. Analýza krevních buněk byla provedena pomocí elektronického analyzátoru krevních buněk Sysmex (Baxter Diagnostics, lne., Irvine, Kalifornie, USA). Uvedená data představují střední hodnotu ze stanovení u čtyř zvířat ± směrodatná odchylka od této střední hodnoty. Ostatní parametry krevních buněk, jako je celkový počet bílých krvinek nebo červených krvinek nebyly touto léčbou ovlivněny.

Výše uvedeným způsobem byly zkoušeny i další formy rekombinantního humánního MGDF. Počet krevních destiček u myší léčených označenou formou rHuMGDF v dávce 50 nebo 10 pg/kg/den, jsou uvedeny v následující tabulce 10. Tabelovaná data představují střední hodnotu vypočítanou z hodnot od čtyřech zvířat, přičemž směrodatná odchylka je uvedena kurzívou.

Tabulka 10

	50 ug/kg/dep	10 uq/kq/dsi?
Forma	střední hodn.(ri=4)	sem	střední hodn.(n=4)
CHO 22-353	4343	309	2571	80
E. coli 22-184	2021	29	1439	18
PEG9	2728	56	2369	34
PEG 10	2431	291	1556	126
PEG 11	3778	59	1861	73
PEG 12	3885	156	1740	88
PEG14	3567	80	2020	63
PEG 15	4402	57	2834	99
PEG 16	4511	239	3215	11
PEG 17	4140	188	3113	261
PEG 18	4586	59	2931	129
PEG 19	3980	330	4189	80
PEG 20	3942	285	3054	339
PEG 21	4195	145	4002	91

Zákl. linie

939

25

Klíč k tabulce 10

V každém případě bylo jako molekuly MGDF pro pegylaci použito MGDF - 11 z E. coli (aminokyseliny 22 až 184 při číslování začínajícím od začátku signálního peptidu, nebo aminokyseliny 1 až 163, při číslování začínajícím od maturovaného proteinu). Viz výše uvedený příklad 12.)

-42CZ 288926 B6

Název	Pegylace	Průměrná m.h. PEG	Reaktivní molekula PEG pro syntézu
PEG9	polypegylovaný	6 kDa	NHS ester MePeg
PEG 10	polypegylovaný	6 kDa	NHS ester MePeg
PEG 11	polypegylovaný	20 kDa	NHS ester MePeg
PEG 12	polypegylovaný	50 kDa	NHS ester MePeg
PEG 14	monopegylovaný	6 kDa	aldehyd MePeg
PEG 15	monopegylovaný	12 kDa	aldehyd MePeg
PEG 16	monopegylovaný	20 kDa	aldehyd MePeg
PEG 17	monopegylovaný	25 kDa	aldehyd MePeg
PEG 18	polypegylovaný	6 kDa	aldehyd MePeg
PEG 19	polypegylovaný	12 kDa	aldehyd MePeg
PEG 20	polypegylovaný	20 kDa	aldehyd MePeg
PEG 21	polypegylovaný	25 kDa	aldehyd MePeg

Za počet krevních destiček odpovídající základní linii se považuje počet krevních destiček u normálních zvířat, kterým nebyly podány žádné látky.

Je zřejmé, že pegylyce rekombinantního humánního MGDF neovlivňuje nepříznivě schopnost této molekuly zvyšovat počet krevních destiček u recipientních zvířat, a naopak může zvýšit aktivitu produktu 22-184 zE. coli na stejnou nebo vyšší úroveň, než je úroveň pozorovaná u molekuly 22-353 pocházející z CHO.

B. PEG-22

Výsledky dosažené s PEG-22 jsou uvedeny na obr. 24. Pozoruhodné je, že k normalizaci počtu krevních destiček v případě použití PEG-22 došlo o několik dnů dříve než v případě použití MGDF o plné délce z CHO, PEG-16 nebo PEG-17.

Příklad 14

Exprese rekombinantního humánního MGDF (1 až 163) v E. coli

Pro expresi r-HuMGDF v E. coli byla chemicky syntetizována sekvence kódující prvních 163 aminokyselin maturovaného proteinu za použití optimálních kodonů E. coli. K 5' konci genu byly přidány sekvence DNA kódující aminokyseliny methionin a lysin. Protein r-HuMGDF kódovaný touto sekvencí obsahuje proto 165 aminokyselin, počínaje s řetězcem Met-Lys. Sekvence tohoto genu je uvedena na obr. 25.

Syntéza rHuMGDF (1-163) genu byla provedena v několika stupních. Nejprve byly za použití optimálních kodonů E. coli chemicky syntetizovány první komplementární oligonukleotidy (o délce 60 až 70 bp) představují sousední fragmenty genu. Během této syntézy byly k 5' konci maturovaného genu připojeny kodony pro aminokyselinu methionin a lysin a k 3' konci genu byl připojen stop kodon. Kromě toho byla za nejzazší konce 5' a 3' připojena štěpná místa pro restrikční enzymy Xbal (5' konec) a HindlII (3' konec) a ve vhodné vzdálenosti před počátečním methioninovým zbytkem bylo umístěno syntetické ribosomální vazebné místo. Potom byla provedena teplotní hybridizace komplementárních oligonukleotidů pro každý fragment genu. Ve třetím stupni byly jednotlivé syntetické fragmenty genu amplifikovány za použití PCR reakce. Ve čtvrtém stupni byly amplifikované fragmenty subklonovány do vhodného vektoru. V pátém stupni byla provedena verifikace sekvencí subklonovaných fragmentů. V šestém stupni byly jednotlivé fragmenty vzájemně ligovány a subklonovány do vhodného vektoru, přičemž byl

-43CZ 288926 B6 rekonstruován r-HuMGDF (1-163) gen o plné délce. Nakonec byla provedena verifikace rekonstruovaného genu.

Syntetický r-HuMGDf genový fragment lemovaný restrikčními místy Xbal (u 5' konce) a 5 HindlII (u 3' konce) obsahuje ribosomální vazebné místo, ATG start kodon, sekvenci kódující maturovaný Met-Lys r-HuMGDF protein a stop kodon.

Výše uvedený fragment byl klonován do míst Xbal a HindlII laktózou indukovatelného expresního vektoru pAMGl 1. Vektor pAMGl 1 je plazmid s nízkým počtem kopií, jehož počátek 10 replikace je odvozen zpRlOO. Expresní plazmid pAMGl 1 může být získán zplazmidu pCFM1656 (přírůstkové číslo sbírky ATCC 69576, datum uložení: 24. února 1994) sérií místně orientovaných změn bází PCR překrývající oligomutagenezí. Začne se místem BglII (plazmid bp # 180) bezprostředně ve směru 5' od promotoru replikace plazmidu P_copB a pokračuje se směrem ke genům replikace plazmidu, přičemž se provedou následující změny bázových párů:

-44CZ 288926 B6

pAMGll bp ♦	bp v pCFM1656	změněný bp. v pAMGll
* 204	T/A	C/G
* 428	A/T	G/C
# 509	G/C	A/T
# 617	- -	insert dvou G/C bp
# 679	G/C	T/A
# 980	T/A	C/G
* 994	G/C	A/T
* 1004	A/T	C/G
# 1007	C/G	T/A
# 1028	A/T	T/A
# 1047	C/G	T/A
♦ 1178	G/C	T/A
# 1466	G/C	T/A
* 2028	G/C	bp delece
# 2187	C/G	T/A
* 2480	A/T	T/A
# 2499-2502	AGTG	GTCA
	TCAC	CAGT
* 2642	ICCGňGC	bp delece
	AGGCTCG

# 3435

G/C

A/T

* 3446 * 3643	G/C A/T	A/T T/A
*	4489-4512	- -	insert bps GAfiGTCAGTAGTGTGGAGGTGCAG CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC

(SEQ ID NOS: 30,31) a sekvence DNA mezi jedinečnými restrikčními místy AatlI a Clal se nahradí následujícím oligonukleotidem:

-45CZ 288926 B6

AatlI (#4358)

5' CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT3' TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA-GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3 * -CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5 ‘

Clal (#4438) (SEQ ID NOS: 32, 33)

Exprese r-HUMGDF klonovaného do pAMGll je poháněna syntetickým promotorem, který je indukovatelný laktózou, jako je PS4, jehož sekvence je

5¹ GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3 * .

(SEQ ID NO: 34)

Promotor PS4 je potlačován represorem laktózy (Láci), což je produkt genu láci z E. coli.

Plazmid pAMG 11-r-HuMGDF se potom transformuje do E. coli kmene K-12, který obsahuje 15 allalu lacl^q. Allela představuje mutaci v promotoru láci zvyšující expresi láci, což má za následek přísnější kontrolu exprese proteinu poháněnou promotorem PS4. V tomto kmeni je tedy za nepřítomnosti laktózy exprese r-HUMDF potlačena Láci. Po přídavku laktózy se protein Láci, který se naváže na místo operátoru promotoru PS4, redukuje a začne transkripce r-HuMGDF prostřednictvím PS4. Hostitelská buňka E. coli použitá v tomto příkladu je uložena ve sbírce 20 ATCC pod přírůstkovým číslem 69717 (datum uložení: 30. 11. 1994).

Hostitel, E. coli ATCC č. 69717, byl transformován plazmidem pAMGll-r-HuMGDF a buňky byly pěstovány podle následujícího fermentačního předpisu: Kmen E. coli se inokuluje do půdy Luria a potom se směs asi 12 hodin inkubuje při 30 °C. Buňky se za aseptických podmínek 25 přenesou do fermentoru, který obsahuje vsázku média (kvasinkový extrakt - 20 g/litr, kyselina citrónová - 3,4 g/litr, hydrogenfosforečnan draselný - 15 g/litr, Dow P2000 - 15 ml, glukóza 5 g/litr, heptahydrát síranu hořečnatého - 1 g/litr, stopové kovy - 5,5 ml/litr a vitaminy 5,5 ml/litr). Ve vsázkové kultivaci se pokračuje tak dlouho, dokud jednorázová kultura nedosáhne optické denzity 5,0 ± 1,0 při 600 nm. Potom se zahájí fermentační fáze „fed-batch“, 30 přičemž se nejprve přivádí první dodávané médium obsahující glukózu (70 g/litr) a heptahydrát síranu hořečnatého (6,75 g/litr). Rychlost dávkování se přizpůsobuje každé 2 hodiny podle předem stanoveného rozvrhu. Druhé dodávané médium obsahující tiyptikasový pepton (129 g/litr) a kvasinkový extrakt (258 g/litr) se začne dávkovat, když kultura dosáhne optické denzity 20 až 25 při 600 mm. Průtoková rychlost druhého dodávaného média se udržuje na 35 konstantní hodnotě a pokračuje se v přizpůsobování prvního podávaného média. Teplota během celé fermentace se udržuje přibližně na hodnotě 30 °C a její hodnota pH se udržuje na asi 7 přidáváním kyseliny nebo báze podle potřeby. Požadovaná hladina rozpuštěného kyslíku se udržuje úpravou rychlostí míchání, přívodu vzduchu a přívodu kyslíku do fermentoru. Když optická denzita kultury dosáhne 57 až 63 při 600 nm, zahájí se přidávání třetího dodávaného 40 média. Třetí dodávané médiu (laktóza - 300 g/litr) se do fermentoru uvádí konstantní průtokovou rychlostí; uvádění prvního dodávaného média se přeruší a rychlost přivádění druhého dodávaného média se upraví na novou konstantní hodnotu. Fermentace trvá přibližně 10 hodin od

-46CZ 288926 B6 zahájení přívodu třetího dodávaného média. Na konci fermentace se kultura ochladí na 15 ± 5 °C a buňky se sklidí centrifugací. Výsledná pasta se shromáždí a uloží při teplotě nižší než 60 °C.

Purifikace rekombinantního MGDF produkovaného v E. coli, popsaného výše, byla provedena takto: buněčná pasta (1800 g) byla suspendována přibližně v 18 litrech lOmM EDTA a suspenze byla zpracována ve vysokotlakém homogenizéru za tlaku 103 MPa. Suspenze rozbitých buněk byla odstředěna a peleta byla resuspendována v 10 litrech lOmM EDTA. Následovala nová centrifúgace suspenze a získaná 200g peleta byla solubilizována ve 2 litrech lOmM Tris, 8M hydrochloridu guanidinu, lOmM DTT, 5mM EDTA o pH 8,7. Tento roztok byl pomalu zředěn převedením do 200 litrů lOmM CAPS, 3M močoviny, 30 % glycerolu, 3mM cystaminu a lmM cysteinu o pH 10,5.

Zředěný roztok byl 16 hodin pomalu míchán při teplotě místnosti a poté bylo pH upraveno na hodnotu 6,8. Roztok s upravenou hodnotou pH byl vyčiřen a nanesen na dvoulitrový sloupec CM Sepharose ekvilibrovaný s lOmM fosforečnanem sodným, 1,5M močovinou a 15% glycerolem o pH 6,8. Po nanesení byl sloupec promyt lOmM fosforečnanem sodným a 15% glycerolem o pH 7,2. MGDF byl eluován gradientem chloridu sodného od 0 do 0,5M a lOmM fosforečnanem sodným o pH 7,2.

CM eluát byl zkoncentrován a pufr byl vyměněn za lOmM fosforečnan sodný o pH 6,5 za použití membrány s vylučovacím mezí molekulové hmotnosti 10 000. Na koncentrovaná roztok (asi 2 mg/ml) bylo působeno cathepsinem C (500 až 1M) po dobu 90 minut při teplotě okolí.

Potom byl roztok nanesen na l,21itrový sloupec pro HPLC (SP High performance Serparose) ekvilibrovaný s lOmM fosforečnanem sodným, 15% glycerolem o pH 7,2. Po nanesení byl MGDF eluován za použití gradientu chloridu sodného (0,1 až 0,25M) a lOmM fosforečnanu sodného o pH 7,2.

K eluátu ze sloupce SP High Performance byl přidán síran amonný až do 0,6M koncentrace. Eluát byl nanesen na l,61itrový sloupec Phenyl Toyopearl ekvilibrovaný s lOmM sodným, 0,6M síranem amonným, pH 7,2. Pík MGDF byl eluován síranem amonným (gradient od 0,6 do 0M), fosforečnanem sodným (lOmM), pH 7,2.

Eluát ze sloupce Phenyl Toyopearl byl zkoncentrován a pufr byl vyměněn za lOmM Tris, 5% sobritol, pH 7,5 za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000.

Příklad 15

In vivo biologické vlastnosti r-HuMGDF (E. coli 1-163)

Byla zjišťována biologická účinnost r-HuMGDF (E. coli 1-163) připraveného způsobem popsaným v příkladu 14 na hlodavce. Normálním samicím myši Balb/c se po dobu 5 po sobě jdoucích dnů subkutánně podávají injekce se zvyšující se dávkou r-HuMGDF. Rozmezí dávkování bylo od 15 do 1500 pg/kg/den. 24 hodin po poslední injekci byly zvířatům odebrány krevní vzorky. Analýza krevních buněk byla provedena pomocí elektronického počítače buněk Sysmex (Baxter). Při logaritmicky se zvyšující koncentraci cytokinu byl pozorován lineární nárůst počtu krevních destiček, při dávkování 1 500 pg/kg/den se v tomto systému počet krevních destiček zvýšil na 300 % počáteční hodnoty (základní linie). Jiné parametry krevních buněk, jako je počet bílých nebo červených buněk nebo hematokrit, nebyly při tomto ošetření ovlivněny.

Krysám, kterým byla po dobu 6 dnů podávána dávka r-HuMGDF (E. coli 1-163) 300 pg/kg/den byly odebrány krevní destičky a tyto krevní destičky byly podrobeny zkoušce na schopnost agregace v odpovědi na ADP. Zjištěná data ukazují, že destičky od ošetřených zvířat v podstatě

-47CZ 288926 B6 nelze odlišit od destiček kontrolních zvířat, poněvadž obě populace jsou stejně citlivé vůči agonistovi krevních destiček, ADP:

r-HuMGDF byl také hodnocen na schopnost odstranit trombocytopanii spojenou s chemoterapií a/nebo ozařováním. Při této studii bylo použito carboplatinu, což je chemoterapeutikum vyvolávající hlubokou trombocytopenii u člověka. Na počátku studie byla myším Balb/c subkutánní injekcí podána dávka 1,25 mg carboplatinu. Po 24 hodinách začaly být myši léčeny rHuMGDF (E. coli 1-163) nebo excipientem v denní dávce 100 pg/kg/den, až do dokončení studie. Devátý den poklesl počet krevních destiček u myší léčených excipientem přibližně na 15 % normální hodnoty, zatímco u myší léčených r-HuMGDF zůstal počet krevních destiček na úrovni základní linie (viz obr. 20).

Při studiích s ozařováním byly myši podrobeny jedné dávce gamma záření (z ceziového zdroje, 500 rad). Jedná se o subletální dávku, která má za následek 90% snížení počtu krevních destiček do 11. dne. Počet krevních destiček se do 21. dne nevrátil na normální hodnotu. Když byl ozařovaným myším od prvního do 20. dne podáván r-HuMGDF (E. coli 1-163) jednou denně v dávce 100 pg/kg/den, nebyl pokles počtu krevních destiček tak dramatický a návrat na hodnotu odpovídající základní linii byl rychlejší než u myší léčených excipientem (viz obr. 21).

Pro vyzkoušení aktivity r-HuMGDF za použití modelu extrémní a dlouhodobé trombocytové cytopenie, bylo podání carboplatinu a ozařování aplikováno v kombinaci (obr. 22). Za těchto okolností poklesl počet krevních destiček na extrémně nízkou hodnotu (3 až 5 % normální dhonty) a většina zvířat (7 z 8) toto ošetření nepřežila. Když však byla těmto zvířatům každý den po celou dobu studie podávána subkutánní injekce r-HuMGDF v dávce 100 pg/kg/den, trombocytopenie byla významně potlačena, návrat na hodnotu odpovídající základní linii byl rychlejší a všechna zvířata léčená r-HuMGDF (8/8) přežila.

r-HuMGDF byl také zkoušen na opicích rhesus. Normálním opicím rhesus byl subkutánní injekcí podáván r-HuMGDF v dávce 2,5 nebo 25 pg/kg/den, celkem po dobu 10 dnů (den 0 až 9). U skupiny s nižší podávanou dávkou se počet krevních destiček v den 12 zvýšil o 400 % a u skupiny s vyšší podávanou dávkou činilo toto zvýšení 790%, také v den 12. Po ukončení injekčního podávání se počty krevních destiček vrátily na normální hodnotu do den 25 až 30. Výše popsaných ošetření nebyl ovlivněn počet bílých a červených krvinek.

r-HuMGDF (E. coli 1-163) byl také zkoušen na primátech s prudkou trombocytopenii (obr. 23) Modelová zvířata byl ozářena (dávkou 700 rad z kobaltového zdroje), což mělo za následek pokles počtu krevních destiček v den 15 na 1 až 2 % normální hodnoty. Do den 35 až 40 se počet krevních destiček vrátil na normální hodnotu. Naproti tomu počet krevních destiček u ozařovaných zvířat léčených každý den rHu-MGDF v dávce 25 pg/kg/den klesl jen na 10% normální hodnoty a v průměru nebyl nižší ne 20 000/pl, což je mezní hodnota, při níž se u humánních pacientů postižených trombocytopenii zahajuje transfuze krevních destiček. U zvířat léčených r-HuMGDF byl také návrat na základní hodnotu rychlejší; této hodnoty bylo dosaženo v den 20.

Výše uvedená in vivo data ze studií na hlodavcích a primátech plně podporují předpoklad, že rHuMGDF (E. coli 1-163) je účinným terapeutickým činidlem se schopností významně ovlivnit klinicky relevantní trombocytopenie.

Příklad 16

Způsob produkce r-HuMGDF 1-332 v kultuře buněk CHO

-48CZ 288926 B6

Glykosylovaný r-HuMGDF 1-132 je produkován transfekovanými buňkami ovarií čínského křečka exprimujícími cDNA pro MGDF 1-332 pod kontrolou vhodného promotoru a s připojením ke genu kódujícímu amplifikovatelný selekční markér DHFR. Vhodným protomotorem pro expresi MGDF v buňkách CHO je SRa (viz Mol. Cell. Biol. 8: 466 až 472 (1988), a WO 91/13160 (1991)). Vhodným vektorem pro expresi MGDF v buňkách CHO je pDSRa2 (viz WO 90/14363 (1990)). Příkladné buněčné linie CHO jsou schopny produkovat sekretovaný MGDF ve standardním médiu pro buněčné kultury v množství v rozmezí od 10 do 20 mg/litr. Toto množství je však možno zvýšit na 25 až 100 či více mg/litr. Pro produkci MGDF za použití typické buněčné linie je možno kulturu expandovat pasážováním v suspenzi nebo v nádobách pro tkáňové kultury způsobem adherentního růstu za použití média, které zahrnuje stejná množství Dulbeccem modifikovaného Eaglova média (DMEM) a Hamova média F12 (DMEM/F12, Fibco). Použité médium může být doplněno 5 až 10% fetálního hovězího séra (FBS) nebo dialyzovaného fetálního hovězího séra a methotrexatem (MTX) (pokud je ho zapotřebí, bývá typická koncentrace MTX 200 až 600nM) za účelem udržení selekčního tlaku. Toto médium by mělo být doplněno přídavnými neesenciálními aminokyselinami (NEAA) a glutaminem. Suspezní kultury snadno propagují v rozmezí od inokulačních denzit 1 až 4x 10⁵ buněk/ml. Při maximální denzitě asi 1 x 10⁶ buněk/ml se kultury expandují zředěním do většího objemu s počáteční hodnotou denzity krevních destiček při specifikované hodnotě inokulační denzity.

Má-li se MGDF produkovat v převalovaných láhvích, musí se vhodný objem suspenzní kultury o vhodné denzitě buněk vytvořit za použití buď magneticky míchaných rotačních nádob umístěných v prostředí s regulovanou teplotou (37 + 1 °C) nebo biorektoru typu míchané nádrže opatřené příslušnými měřicími a regulačními prvky. Převalované láhve (jako například láhve typu Falcon o objemu 850 cm³) je třeba zaočkovat na počáteční hustotu 1,5 až 3 x 10⁷ buněk, počítáno na láhev a doplnit přídavným růstovým médiem (DMEM/F12 s 5 až 10% FBS, IX NEAA a IX L-glutaminem) v množství vhodném pro vytvoření konfluentní monovrstvy během až 4 dnů (150 až 300ml/láhev). Růstové médium by mělo být zpočátku pufrováno hydrogenuhličitanem sodným na pH 6,9 až 7,2 v rovnováze s oxidem uhličitým o parciálním tlaku 8 kPa až 12 kPa. Láhve by měly být zaplyněny směsí 10 % oxidu uhličitého ve vzduchu a po upevnění v převalovacím zařízení 3 až 4 dny převalovány při teplotě 37 ± 1 °C a frekvenci otáčení asi 1 min'¹. Po dosažení konfluence by mělo být v lahvích médium vyměněno za produkční médium neobsahující sérum. To lze provést vylitím nebo odsátím růstového média, promytím lahví izotonickým pufrem, jako je Dulbeccův fosfátem pufrovaný roztok chloridu sodného (D-PBS), v množství 50 až lOOml/láhev a potom přidáním vhodného objemu hydrogenuhličitanem pufrovaného, séraprostého média DMEM/F12 (1:1) (200 až 300 ml/láhev) doplněného NEAA a L-glutaminem, jakož i síranem měďnatám, za účelem minimalizace kovalentní agregace (1 až 20μΜ). Láhve by měly být zaplyněny 10% oxidem uhličitým ve vzduchu a inkubovány při 37 ± 1 °C v převalovacím zařízení otáčejícím se s frekvencí 1 min'¹ po dobu 6 ± 1 den nebo tak dlouho, dokud metabolická aktivita nesníží koncentraci glukózy na hodnotu nižší než 0,5 mg/litr a/nebo hodnotu pH pod 6,6. Zpracované médium se může sklidit vylitím nebo aspirací z lahví a nahradit čerstvým séraprostým produkčním médiem popsaným výše, za účelem dalších sklizní. Tento postup se může provádět tak dlouho, až již buňky nejsou schopny pokračovat v produkci v séruprostém prostředí a vytékají z převalovaných láhví.

Sklizené zpracované médium je možno purifikovat mikrofíltrací se slepým koncem za použití filtrátů o rozměru pórů 0,45 pm a/nebo 0,2 pm (Sartorium Sartobran pH nebo Pall). Přefiltrované zpracované médium je třeba zchladit na 4 °C a potom buď dočasně uložit při teplotě 4 °C nebo ihned zkoncentrovat a dialyzovat na nízkou iontovou sílu za použití ultrafiltračního systému s příčným tokem (například Filtron YM-50). Ultrafiltrace a diafiltrace by se měla provádět při °C za účelem minimalizace rozkladu proteinu. Před stupni chromatografické purifikace by zpracované médium mělo být dialyzováno proti pufrovanému vodnému roztoku (například lOmM fosforečnanu draselnému o pH 6,8).

-49CZ 288926 B6

Kvalitu produktu ve zpracovaném médiu je možno nejlépe monotorovat za použití analýzy neredukující SDS-PAGE Western Blot. Touto analýzou se mohou zjistit relativní množství agregovaných, monomemích a proteolyticky degradovaných MGDF ve vzorcích.

Další způsob produkce MGDF z buněk CHO spočívá v adaptaci buněčné linie exprimující MGDF na séraprosté médium, jako je Gibco S-SFM II. Buňky je možno adaptovat sériovým pasážováním v médiu, které obsahuje malé přídavky séra nebo sérum vůbec neobsahuje. Když se zjistí, že buněčná linie dobře roste v takovém médiu a produkuje vhodná množství vyloučeného MGDF, může se v produkci pokračovat tak, že se sériovým pasážováním inokulační kultura převede do většího měřítka s větším objemem kultury a vzniklou kulturou se zaočkuje vhodná produkční nádoba (například míchaný nádržový bioreaktor opatřený měřicími a regulačními prvky). Kultura se může nechat růst až do maximální denzity zajišťující životaschopnost za optimálních růstových podmínek (pH, živiny, teplota, kyslík, smykové míchání). V optimální fázi produkce (kterou lze zjistit experimentálně na základě stanovení kvantity a kvality produktu) je možno kulturu z bioreaktoru sklidit a buňky lze odstranit ze zpracovaného média hloubkovou filtrací (řádově mikronovou) nebo submikronovou mikrofiltrací s příčným tokem. Pokud se použije hloubkové filtrace, mělo by být médium dále vyčiřeno submikronovou filtrací se slepým koncem a teprve potom podrobeno koncentraci a dialýze, jakje to popsáno výše.

Vynález byl popsán jak obecně, tak na svých přednostních provedeních. Do rozsahu vynálezu však spadají i nejrůznější obměny a modifikace, které jsou odborníci v tomto oboru schopny provést na základě výše uvedeného popis. Následující patentové nároky pokrývají také všechny výše uvedené modifikace.

Všechny výše uvedené citace osvětlující oblast vynálezu a dosavadní stav techniky jsou zde citovány náhradou za přenesení jejich celého obsahuje do popisu vynálezu.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Barley, Timothy D.

Bogenbergen, Jakob M. Bosselman, Robert A.

Hunt, Pamela Kinstler, Olaf, B. Samal, Babru B.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU:Composition and Methods for Stimulatíng Megakaryocyte

Growth and Differentiation (Látky a způsoby pro stimulaci růstu a diferenciace metakaryocytů) (iii) POČET SEKVENCÍ: 34 (iv) ADRESE PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: Amgen lne., (B) ULICE: 1840 Dehavilland Drive (C) MĚSTO: Thousand Oaks (D) STÁT: Kalifornie (E) ZEMĚ: USA (F) 91320-1789 (ZIP) (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS

-50CZ 288926 B6 (D) SOFTWARE: Patentní Release # 1.0, verze # 1.25 (vi) DATA VZTAHUJÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) ZATŘÍDĚNÍ:

(viil) INFORMACE O PATENTOVÉM ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Cook, Robert R.

(C) SPISOVÁ ZNAČKA: A-290-C (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 1:

Ala	Pro	Pro	Ala	Xaa	Asp Pro Arg	Leu	Leu	Asn Lys	Met	Leu	Arg Asp
1				5			10				15
Ser	His	Val	Leu	His	Xaa Arg Leu	Xaa	Gin	Xaa Pro	Asp	Ile	Tyr
			20			25				30

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 15 10 I⁵

Ser His Val Leu His (2) INFORMACE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

-51CZ 288926 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT 23 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:13:

GGAGTCACGA AGCAGTTTAC 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14

CCTTTACTTC TAGGCCTG 18 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:15:

GAGGTCACAA GCAGGAGGA 19 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů

-54CZ 288926 B6 (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

GGCATAGTCC GGGACGTCG 19 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

TCCTCCTGCT TGTGACCTC 19 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 18:

CCAGGAAGGA TTCAGGGGA 19 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bázových párů (Β) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární

-55CZ 288926 B6 (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ Π) NO:20:

GGCCGGATAG GCCACTCNNN NNNT 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

GC ARTGYAAN ACRTGNGART C 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:

TTGGTGTGCA CTTGTG 16 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:

CACAAGTGCA CACCAACCCC 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1342 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTIKA:

-56CZ 288926 B6 (A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 99..1094 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG

60

TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA

CGCTGTCC AGC CCG GC1 Ser Pro Ala 1

' CCl 1 Prc

• CCT • Pro ’ 5

113

GCT

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

GTC

161

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg 10

Val

Leu

Ser

Lys

Leu 15

Leu

Arg

Asp

Ser

His 20

Val

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

ACA

209

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro

Thr

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

257

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

305

Gin

Met 55

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr

Leu

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

353

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

401

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

449

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly Arg

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

497

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys

ASp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

545

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Met

Leu

Val 145

Gly

Gly

Ser

Thr

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

593

Leu 150

Cys

val

Arg

Arg

Ala 155

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala 160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr 165

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

TTG

641

Ser

Leu

Val

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

ACT

ACT

GGC

TCT

GGG

CTT

689

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala Arg 190

Thr

Thr

Gly

Ser 195

Gly

Leu

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

AAC

737

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Leu

Asn

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC

CAA

ATC

CCC

GGA

TAC

CTG

AAC AGG

ATA

785

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr

Leu

Asn Arg

Ile

215 220 225

-57CZ 288926 B6

Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp Val Leu Gly Ala Val Ala 1 5 10 15

Leu (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

GCNCCNCCNG CNTGYGA 17 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

GCARTGYAAC ACRTGNGART C 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 1 5 10 15

Ser His Val Leu His (2) INFORMACE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

-52CZ 288926 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

GTACGCGTTC TAGANNNNNN T 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových kyselin (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

AGTTTACTGA GGACTCGGAG G 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:9:

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTTT 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT ΤΤΤΠΤΤΤΤ 29 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

TGCGACCTCC GAGTCCTCAG 20

-53CZ 288926 B6

CAC GAA His Glu 230

CTC Leu

TTG AAT Leu Asn

GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC

833

Gly 235

Thr Arg Gly

Leu

Phe Pro 240

Gly

Pro Ser Arg 245

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

881

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

ASp

Ile

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

250

255

260

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

929

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

265

270

275

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

CCC

977

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

280

285

290

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

1025

Thr

Pro

Val

val

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Sex

Ala

Pro

295

300

305

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

TCC

1073

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

310

315

320

325

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

GGG

TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA

1124

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

330

ŤTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT	GGACAAGATT	1184
TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC	TGAAAAGGGA	1244
ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT	ATCAGCAATA	1304
CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCA		1342

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 332 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:

Ser 1

Pro

Ala

Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu

5

10

15

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

20

25

30

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

35

40

45

-58CZ 288926 B6

Gly Glu Trp

Lys

Thr Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp Ile Leu

50

55

60

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

65

70

75

80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

85

90

95

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

100

105

110

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

115

120

125

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

130

135

140

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

145

150

155

160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro

Asn

165

170

175

Arg

Thr

Ser

Gly

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala

Arg

Thr

180

18S

190

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg

Ala

Lys

Xle

195

200

205

Pro

Gly

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp

Gin

Ile

Pro

Gly

210

215

220

Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

His

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly

Thr

Arg

Gly

Leu

Phe

225

230

235

240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser

Gly

245

250

255

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly Tyr

Ser

260

265

270

Pro

Ser

Pro

Thr

His

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

275

280

285

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

290

295

300

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

305

310

315

320

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

325 330 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1342 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární

-59CZ 288926 B6 (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTIKA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 99.621 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG60

TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT113

Ses Pro Ala Pro Pro

GCT Ala

TGT GAC

CTC CGA Leu Arg 10

GTC Val

CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC

161

Cys

Asp

Leu

Ser

Lys

Leu Leu 15

Arg Asp

Ser His Val 20

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

ACA

209

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

25

30

35

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

257

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

40

45

50

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

305

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Xle

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

55

60

65

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

353

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

70

75

80

85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT CTC

CTC

CTT

401

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

90

95

100

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

ctt

CCT

CCA

CAG

GGC AGG

449

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly Arg

105

110

115

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

497

Thr

Thr

Ala

His

Lys Asp

Pro

Asn

Ala

ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin His

120

125

130

-60·

TG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 545

Leu

Leu 135

Arg Gly

Lys

Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr

140

145

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA

ACC

593

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

150

155

160

165

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

C CAAACAGGAC TTCTGGATTG

641

Sex

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

170

TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG	701
CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA	761
ATCCCCGGAT ACCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAATG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT	821
GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC	881
TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TCCTACTGGA	941
CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC	1001
CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC	1061
TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTAAGGTT CTCAGACACT GCCGACATCA	1121
GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCGCCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG	1181
ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC CTGGTAAAAG GGATACACAG GACTGAAAAG	1241
GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGCT ATTTTTTTAA GCTATCAGCA	1301
ATACTCATCA GAGCAGCTAG CTCTTTGGTC TATTTTCTGC A	1342

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 174 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:27:

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

.1

5

10

15

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

20

25

30

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

35

40

45

-61CZ 288926 B6

Gly Glu

Trp Lys Thr Gin

Met Glu Glu 55

Thr Lys Ala Gin Asp 60

Ile

Leu

50

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

65

70

75

80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

85

90

95

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

100

105

110

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

115

120

125

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

130

135

140

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

145

150

155

160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

165

170

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1164 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTIKA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 97..894 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:28:

AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC AGAATGGAGC TGACTGAATT GCTCCTCGTG

GTCATGCTTC TCCTAACTGC AAGGCTAACG CTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT

Ser 1

Pro Ala Pro Pro Ala 5

TGT

GAC

CTC

CGA

GTC

CTC

AGT

AAA

CTG

CTT

CGT

GAC

TCC

CAT

GTC

CTT

Cys

Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

10

15

20

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

ACA CCT

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr Pro

25

30

35

114

162

210

-62CZ 288926 B6

GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG

258

Val

Leu Leu 40

Pro

Ala Val

Asp Phe 45

Ser Leu

Gly

Glu Trp 50

Lys Thr Gin

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

CTG

306

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

55

60

65

70

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

CTC

354

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

75

80

85

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

GGG

402

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

90

95

100

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

ACC

450

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly Arg

Thr

105

110

115

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

CTG

498

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

120

125

130

CTC

CGA

GGA

AAG

GAC

TTC

TGG

ATT

GTT

GGA

GAC

AAA

CTT

CAC

TGC

CTC

546

Leu

Arg

Gly

Lys

Asp

Phe

Trp

Ile

Val

Gly Asp

Lys

Leu

His

Cys

Leu

135

140

145

150

AGC

CAG

AAC

TAC

TGG

CTC

TGG

GCT

TCT

GAA

GTG

GCA

GCA

GGG

ATT

CAG

594

Ser

Gin

Asn

Tyr

Trp

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu

Val

Ala

Ala

Gly

Ile

Gin

155

160

165

AGC

CAA

GAT

TCC

TGG

TCT

GCT

GAA

CCA

AAC

CTC

CAG

GTC

CCT

GGA

CCA

642

Ser

Gin

Asp

Ser

Trp

Ser

Ala

Glu

Pro

Asn

Leu

Gin

Val

Pro

Gly

Pro

no

175

180

AAT

CCC

CGG

ATA

CCT

GAA

CAG

GAT

ACA

CGA

ACT

CTT

GAA

TGG

AAC

TCG

690

Asn

Pro

Arg

Ile

Pro

Glu

Gin

Asp

Thr

Arg

Thr

Leu

Glu

Trp

Asn

Ser

185

190

195

TGG

ACT

CTT

TCC

TGG

ACC

CTC

ACG

CAG

GAC

CCT

AGG

AGC

CCC

GGA

CAT

738

Trp

Thr

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Thr

Gin

Asp

Pro

Arg

Ser

Pro

Gly

His

200

205

210

TTC

CTC

AGG

AAC

ATC

AGA

CAC

AGG

CTC

CCT

GCC

ACC

CAA

CCT

CCA

GCC

786

Phe

Leu

Arg

Asň

Ile

Arg

His

Arg

Leu

Pro

Ala

Thr

Gin

Pro

Pro

Ala

215

220

225

230

TGG

ATA

TTC

TCC

TTC

CCC

AAC

CCA

TCC

TCC

TAC

TGG

ACA

GTA

TAC

GCT

834

Trp

Ile

Phe

Ser

Phe

Pro

Asn

Pro

Ser

Ser

Tyt

Trp

Thr

Val

Tyr

Ala

235

240

245

CTT

CCC

TCT

TCC

ACC

CAC

CTT

GCC

CAC

CCC

TGT

GGT

CCA

GCT

CCA

CCC

882

Leu

Pro

Ser

Ser

Thr

His

Leu

Ala

His

Pro

Cys

Gly

Pro

Ala

Pro

Pro

250 255 260

CCT GCT TCC TGACCCTTCT GCTCCAACGC CCACCCCTAC CAGCCCTCTT931

Pro Ala Ser

265

CTAAACACAT CCTACACCCA CTCCCAGAAT CTGTCTCAGG AAGGGTAAGG TTCTCAGACA991

CTGCCGACAT CAGCATTGTC TCGTGTACAG CTCCCTTCCC TGCAGGGCGC CCCTGGGAGA1051

CAACTGGACA AGATTTCCTA CTTTCTCCTG AAACCCAAAG CCCTGGTAAA AGGGATACAC1111

AGGACTGAAA AGGGAATCAT TTTTCACTGT ACATTATAAA CCTTCAGAAG ČTA1164

-63CZ 288926 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 265 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:

Ser 1

Pro Ala

Pro Pro 5

Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu

10

15

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

20

25

30

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

35

40

45

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

50

55

60

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

65

70

75

80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

85

90

95

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

100

105

110

Pro

Pro

Gin

Gly

Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

115

120

125

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Asp

Phe

Trp

Ile

Val

Gly

130

135

140

Asp

Lys

Leu

His

Cys

Leu

Ser

Gin

Asn

Tyr

Trp

Leu

Trp Ala

Ser

Glu

145

150

155

160

Val

Ala

Ala

Gly

Ile

Gin

Ser

Gin

Asp

Ser

Trp

Ser Ala

Glu

Pro

Asn

165

170

175

Leu

Gin Val

Pro 180

Gly

Pro Asn Pro Arg Ile Pro Glu Gin Asp Thr

Arg

185

190

Thr

Leu

Glu

Trp

Asn

Ser

Trp

Thr

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu

Thr

Gin

Asp

195

200

205

Pro

Arg

Ser

Pro

Gly

His

Phe

Leu

Arg

Asn

Ile

Arg

His

Arg

Leu

Pro

210

215

220

Ala

Thr

Gin

Pro

Pro

Ala

Trp

Ile

Phe

Ser

Phe

Pro

Asn

Pro

Ser

Ser

225

230

235

240

Tyr

Trp

Thr

Val

Tyr

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser

Thr

His

Leu

Ala

His

Pro

245

250

255

Cys

Gly

Pro

Ala

Pro

Pro

Pro

Ala

Ser

260

265

-64CZ 288926 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:30:

GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:31:

CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 80 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:32:

CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT 60

TGTGAGCGCT CACAATTTAT 80 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 86 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:33:

CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA 60

TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT 86

-65CZ 288926 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 89 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLODGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:34:

GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC 60

TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT ⁸⁹

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (24)

1. MGDF derivát zahrnující MGDF polypeptid zvolený ze souboru sestávajícího z

MGDF-1 obsahujícího aminokyseliny 22 až 353 z obr. 11,

MGDF-2 obsahujícího aminokyseliny 22 až 195 z obr. 11,

MGDF-4 obsahujícího aminokyseliny 22 až 172 z obr. 11,

MGDF-11 obsahujícího aminokyseliny 22 až 184 z obr. 11,

MGDF-12 obsahujícího aminokyseliny 27 až 353 z obr. 11,

MGDF-13 obsahujícího aminokyseliny 27 až 195 z obr. 11,

MGDF-14 obsahujícího aminokyseliny 27 až 172 z obr. 11a

MGDF-15 obsahujícího aminokyseliny 27 až 184 z obr. 11 připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému polymeru zvolenému ze souboru sestávajícího z dextranu, poly(N-vinylpyrrolidonu), polyethylenglykolu, homopolymeru propylenglykolu, kopolymerů propylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylovaných polyolů, polyvinylalkoholů a jejich směsí.

2. MGDF derivát podle nároku 1, kde vodorozpustný polymer je farmaceuticky vhodný.

3. MGDF derivát podle nároku 1, kde vodorozpustným polymerem je polyethylenglykol.

4. MGDF derivát podle nároku 3, kde polyethylenglykolem je monomethoxypolyethylenglykol.

5. MGDF derivát podle nároku 3, kde polyethylenglykol je připojen k MGDF polypeptidu acylovou nebo alkylovou vazbou.

6. MGDF derivát podle nároku 5, kde polyethylenglykolová skupina je připojena k N-konci.

7. MGDF derivát podle nároku 5, kde polyethylenglykolová skupina má průměrnou relativní molekulovou hmotnost 10 000 až 50 000.

-66CZ 288926 B6

8. MGDF derivát podle nároku 1, obsahující MGDF polypeptid kovalentně připojený ke dvěma molekulám vodorozpustného polymeru.

9. MGDF derivát podle nároku 8, kde oběma molekulami vodorozpustného polymeru jsou polyethylenglykolové molekuly.

10. Způsob výroby MGDF derivátu podle nároku 1, kde vodorozpustným polymerem je polyethylenglykol obsahující reaktivní aldehydovou skupinu, vyznačující se tím, že se terminální aldehydový derivát polyethylenglykolu nechá reagovat s MGDF polypeptidem za přítomnosti redukčního činidla a izoluje se MGDF polypeptid připojený k polyethylenglykolu obsahujícímu reaktivní aldehydovou skupinu.

11. Způsob výroby MGDF derivátu podle nároku 1, kde vodorozpustný polymer obsahuje jednu reaktivní aldehydovou skupinu, vyznačující se tím, že se

a) MGDF polypeptid uvede do styku s vodorozpustným polymerem za podmínek redukční alkylace při hodnotě pH od 3 do 9 a

b) izoluje se MGDF polypeptid připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému polymeru.

12. Způsob výroby MGDF derivátu podle nároku 1, kde vodorozpustný polymer obsahuje jednu reaktivní esterovou skupinu, vyznačující se tím, že se

a) MGDF polypeptid uvede do styku s vodorozpustným polymerem o relativní molekulové hmotnosti 2000 až 100 000 při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 9 a

b) izoluje se MGDF polypeptid připojený k alespoň jednomu vodorozpustnému polymeru.

13. Způsob podle některého z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že polymer je farmaceuticky vhodný.

14. Způsob podle některého z nároků 10 až 12, vy z n a č uj íc í se t í m, že vodorozpustný polymer je zvolen ze souboru zahrnujícího dextran, poly(N-vinylpyrrolidon), polyethylenglykoly, homopolymery propylenglykolu, kopolymery propylenoxidu a ethylenoxidu, polyoxyethylované polyoly a polyvinylalkoholy.

15. Způsob podle některého z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že vodorozpustným polymerem je polyethylenglykol.

16. MGDF derivát podle nároku 1, kterým je monopegylovaný MGDF polypeptid.

17. Způsob výroby MGDF derivátu podle nároku 16, kde molekula polyethylenglykolu obsahuje jednu reaktivní aldehydovou skupinu, vyznačující se tím, že se

a) MGDF polypeptid uvede do styku s molekulou polyethylenglykolu za podmínek redukční alkylace při hodnotě pH v rozmezí od 3 do 9 a

b) izoluje se pegylovaný MGDF polypeptid.

18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že se použije MGDF polypeptidů získaného

a. expresí DNA kódující polypeptid obsahující aminokyseliny 22 až 184 z obr. 11 a sekvenci Met-Lys u jeho N-konce v buňkách E. coli,

b. izolací exprimovaného polypeptidů a

c. odštěpením Met~²-Lys^-1 z izolovaného polypeptidů.

-67CZ 288926 B6

19. Způsob podle nároku 15 nebo 17, vyznačující se tím, že polyethylenglykolová molekula má relativní molekulovou hmotnost 2000 až 100 000.

20. Monopegylovaný MGDF polypeptid podle nároku 16, který je homogenní a je monopegylován na α-aminoskupině u N-konce MGDF polypeptidů.

21. Monopegylovaný MGDF polypeptid podle nároku 20, kde MGDF polypeptid je monopegylován polyethylenglykolem o průměrné relativní molekulové hmotnosti 5000 až 50 000.

22. Monopegylovaný MGDF polypeptid podle nároku 16, v němž je polyethylenglykolová skupina připojena k N-konci polypeptidů.

23. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje MGDF derivát podle nároku 1 a farmaceuticky vhodné ředidlo, adjuvans nebo nosič.

24. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje monopegylovaný MGDF polypeptid podle nároku 16 a farmaceuticky vhodné ředidlo, adjuvans nebo nosič.