SK166695A3 - Mgdf polypeptide for stimulating growth and megakaryocyte differentiation - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových proteínov, ktoré sú v tomto popise označované dvoma synonymnými názvami, a to Mpl ligandy alebo MGDF. Tieto proteíny stimulujú rast megakaryocytov a zvyšujú diferenciáciu alebo maturáciu megakaryocytov, čo sa v končenom.

, dôsledku prejavuje zvýšením počtu krvných doštičiek. Vynález sa týka spôsobov získavania týchto proteínov v homogénnej forme z * rôznych zdrojov a spôsobu ich prípravy pomocou rekombinantných techník génového inžinierstva.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je nová trieda derivátov MGDF, v ktorých je molekula MGDF pripojená k vodorozpustnému polyméru a spôsob výroby takýchto molekúl. Ešte ďalším aspektom vynálezu sú deriváty MGDF, v ktorých je molekula MGDF pripojená k jednej alebo viacerým polyetylénglykolovým skupinám CPEG) a spôsob ich výroby.

Doterajší stav techniky

Vynález sa týka prinajmenšom dvoch oblastí výskumu. Prvá z nich sa týka vývoja megakaryocytov a nasledujúcej produkcie krvných doštičiek a druhá z nich sa týka polypeptidového členu triedy receptorov rastového faktora (tu označovaného názvom Mpl receptory) a ich ligandov. Obidve tieto oblasti výskumu budú , podrobnejšie charakterizované v nasledujúcom popise.

• A. Produkcia krvných doštičiek z megakaryocytov

Krvné doštičky sú cirkulujúce bunky, ktoré hrajú rozhodujúcu úlohu pri prevencii krvácania a pri koagulácii krvi. Megakaryocyty sú bunkový zdroj krvných doštičiek a vznikajú zo spoločných prekurzorových buniek v kostnej dreni, z ktorých vznikajú všetky hematopoetické bunky. Tieto spoločné prekurzorové bunky sú známe ako pluripotentné kmeňové bunky alebo PPCS.

Hierarchia megakaryocytových progenitorových buniek bola definovaná na základe doby vzniku a veľkosti megakaryocytových (MK) kolónií objavujúcich sa v systémoch in vitro kultúr v odpovedi na príslušné rastové faktory. Tzv. megakaryocyty burst-forming unit megakaryocyte (BFU-MK) sú najprimitívnejšie megakaryocytové progenitorové bunky. 0 BFU-MK sa predpokladá, že nakoniec vytvoria početné megakaryocytové^.jednotky vytvárajúce kolónie (CFU-MK), ktoré sú diferencovanejšie progenitorové bunky megakaryocytov.

Pri následnej diferenciácii megakaryocytových buniek strácajú tieto bunky schopnosť mitózy, ale získavajú schopnosť endoreduplikácie. Endoreduplikácia (alebo endomitóza) je bunkový jav jadrového delenia pri neprítomnosti delenia buniek. Endoreduplikáciou vzinkajú nakoniec polyploidné megakaryocyty. Ďalšia maturácia megakaryocytov vedie k získaniu cytoplazmatických organiel a membránových zložiek, ktoré sú charakteristické pre krvné doštičky.

maturovaných megakaryocytov ktorom sa predpokladá, že je megakaryocytov alebo iného

Krvné doštičky vznikajú z pomocou zle definovaného procesu, o dôsledkom fyzikálnej fragmentácie mechanizmu. Pozorovanie rozsiahlych membránových štruktúr v megakaryocytoch viedlo k vytvoreniu modelu tvorby krvných doštičiek, v ktorom demarkačný membránový systém v hlavných črtách ohraničuje vznikajúce krvné doštičky v tele bunky. Iný model tvorby krvných bol vyvinutý na základe pozorovania, že megakaryocyty tvoria dlhé cytoplazmatické výčnelky obmedzené v intervaloch zodpovedajúcich veľkosti krvných doštičiek, z ktorých sa krvné doštičky pravdepodobne odtrhujú vďaka tlakom vyvolaným krvným tokom v kostnej dreni a/alebo pľúcach. Tieto cytoplazmatické výčnelky boli nazvané Beckerom a DeBruynom (Becker a DeBruyn, Amer. J. Anat. 145: 183 (1976)) prodoštičkami, aby tak bol naznačený ich predpokladaný prekurzorový charakter pri tvorbe doštičiek.

Prehľad rôznych prekurozorových buniek, ktoré sa zúčastňujú na vývoji megakaryocytov a krvných doštičiek je uvedený na obr.

1. Krajná bunka na ľavej strane obrázku predstavuje pluripotentnú kmeňovú bunku (bunku PPSC) a od nej smerom doprava sú umiestené bunky BFU-MK a ďalej potom CFU-MK. Bunka podliehajúca endoreduplikácii, ktorá je umiestená na obr. 1 bezprostredne napravo od PPSC, predstavuje maturovanú megakaryocytovú bunku. V dôsledku endomitózy sa táto bunka stal$ polyploidnou. Ďalšia, štruktúra, smerom doprava, zahrnuje dlhé cytoplazmatické výčnelky vychádzajúce z polyploidného jadra maturovanej megakaryocytovej bunky. Na pravom okraji obr. 1 je znázornený rad krvných doštičiek, ktoré vznikli fragmentáciou cytoplazmatických výčnelkov.

Ďalej je uvedený prehľad niektorých doterajších publikácií, ktoré sa vzťahujú na vyššie uvedený . popis maturácie megakaryocytov a produkciu krvných doštičiek.

1. Willimas, N. a Levine, R. F., British Journal of Haematology 52: 173-180 (1982),

2. Levin, J., Molecular Biology and Differentiation of

Megakaryocytes, vyd. Wiley-Liss, Inc.: 1-10 (1990),

3. Gewirtz, A. M., The Biology of Hematopoiesis, vyd. Wiley-Liss, Inc.: 123-132 (1990), . 4. Han, Z. C., et al., Int. J. Hematol. 5: (1991), . 5. Hieuwenhuis, H. K. a Sixma, J. New Eng. J. of Med. 327:

1812-1813 (1992),

6. Long, M., Stem Cells 11: 33-40 (1993).

Ďalej je uvedený prehľad niektorých doterajších publikácií, ktoré sa vzťahujú na reguláciu produkcie megakaryocytov a krvných doštičiek:

7. Hoffman, R. et al., Blood Cells 13: 75-86 (1987),

8. Hurphy, M. J., Hematology/Oncology Clinics of North America 3 (3): 465-478 (1988)

9. Hoffman, R., Blood 74 (4): 1196-1212 (1989), »

10. Mazur, E. M. a Cohen, J. L., Clin. Pharmacol. Ther., 46 (3):

250-256 (1989),

11. Gewitz, A. M. a Calabretta, B., Int. J. Celí Cloning 8: 267-276 (1990),

12. Williams, N., Progress in Growth Factior Research 2: 81-95 (1990),

13. Gordon, M. S. a Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992),

14. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 372-281 (1993),

15. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 1295-1304 (1993),

Tiež bolo oznámené (pozri Mazur E. M. et al., Blood 76: 290 až 297 (1990)), že humánne aplastické sérum obsahuje kolóniu megakaryocytov stimulujúcu účinnosé faktora stimulujúceho granulocytovú kolóniu prítomných v médiu kondicionovanom lymfocytmi, odlišnú od IL-3. Molekula zodpovedná za túto účinnosť však pri doterajšom techniky nebola izolovaná ani charakterizovaná.

C. Receptory Mpl

Vírus myeloproliferatívnej leukémie (MPLV) je myšací replikačne defektný retrovírus vyvolávajúci akútnu leukémiu infikovaných cicavcov. Zistilo sa, že gén exprimujúci MPLV je zložený z časti génu kódujúceho obal retrovírusu (alebo vonkajší proteínový plášť) vírusu fuzionovaného k sekvencii, ktorá je príbuzná triede receptorov cytokínu zahrnujúceho receptory GM-CSF, G-CSF a EPO.

Expresia génu MPLV popísaná vyššie má zaujímavú biologickú vlastnosť spôsobujúcu, že myšacie proteínové bunky rôznych typov ihneď naberajú závislosť od rastového faktora pri proliferácii a terminálnej maturácii. Okrem toho niektoré Jcultúry buniek kostnej drene akútne transformované MPLV obsahujú megakaryocyty, čo b

naznačuje, že existuje spojenie medzi génom MPLV a rastom a • diferenciáciou megakaryocytov.

V súčasnosti je známe, že gén vírusu MPLV (označovaný skratkou v-Mpl) má v cicavčích bunkách homológ označovaný názvom bunkový gén Mpl (c-Mpl). Použitím prób získaných z v-Mpl bola klonovaná cDNA zodpovedajúca humánnemu génu c-Mpl (pozri prihláška PCT s číslom WO 92/07074,publikovaná 30. apríla 1992, ktorá je bližšie charakterizovaná ďalej). Sekvenčná analýza ukázal, že proteín kódovaný produktom génu c-Mpl patrí k vysokokonzervovanej supertriede receptorov cytokínu, podobne ako homologický produkt v géne v-Mpl.

O tomto bunkovom géne, c-Mpl, sa predpokladá, že má svoju funkčnú úlohu pri hematopoéze. Tento predpoklad je založený na pozorovaní, že jeho expresia bola zistená pomocou ochrany RNAázovou próbou a experimenty RT-PCR v kostnej dreni, slezine a fetálnych pečeniach normálnych myší, ale nie v iných tkanivách.

, c-Mpl je predovšetkým exprimovaný na megakaryocytoch. Tiež bolo ukázané, že humánny bunkový gén, humánny c-Mpl, je exprimovaný v • CD34 pozitívnych bunkách obsahujúcich purifikované megakaryocyty a krvné doštičky. CD34 je antigén, ktorý je indikatívny pre skoré hematopoetické progenitorové bunky. Okrem toho expozície CD34 pozitívnych buniek syntetickým oligodeoxynukleotidom, ktoré sú pozitívne vzhľadom na c-Mpl mRNA alebo informáciu, významne inhibujú schopnosť vytvárať kolónie pokiaľ ide o megakaryocytové progenitory CFU-MK, ale nemajú žiadne účinok na erytroidné alebo granúlomakrofágové progenitory.

Vyššie uvedené údaje a pozorovania naznačujú, že c-Mpl kóduje molekulu povrchu bunky, ktorá je tu označovaná názvom receptor Mpl. Táto molekula sa viaže na ligand aktivujúci receptor, pričom možno dochádza k produkcii a/alebo vývoju megakaryocytov.

Patentová prihláška PCT s číslom WO 9^/07074 je zameraná na sekvenciu proteínu produkovaného génom c-Mpl, a to ako z humánneho, tak aj z myšacieho zdroja. Tento génový produkt , o ktorom sa predpokladá, že je receptorom, ako to bolo vysvetlené vyššie, je zostavený z aspoň troch všeobecných oblastí alebo domén: extracelulárnej domény, transmembránovej domény a intracelulárnej (alebo cytoplazmatickej) domény. Spolu spojené vytvárajú tieto domény intaktný receptor Mpl. Citovaná publikácia PCT sa tiež týka rozpustnej formy tohto receptora, ktorá v podstate zodpovedá extracelulárnej doméne maturovaného proteínu c-Mpl. Táto intracelulárna doména obsahuje hydrofóbnu oblasť, ktorá, ak je pripojená prostredníctvom transmembránovej oblasti k extracelulárnej doméne proteínu, dodáva celému proteínu a nerozpustnosť.

doména produktu

Ak sa na druhej strane génu c-Mpl oddelí od agregovateľnosť extracelulárna transmembránovej domény a intracelulárnej domény, stane sa rozpustnou. Preto je extracelulárna forma proteínu označovaná názvom rozpustná forma tohto receptora.

Nasleduje prehľad niekoľkých doterajších publikácií vzťahujúcich sa na vyššie uvedený popis receptorov a génov v-Mpl a c-Mpl.

t

17. Wendling, R., et al., Leukémia 3 (7): 475-480 (1989),

18. Wendling, R., et al., Blood 73 (5):1161-1167 (1989),

19. Souyri, M., et al., Celí 63: 1137-1147 (1990),

20.	Vigon, I., (1992),	et al.,	Proc.	Natl. Acad. Sci.	USA 89:	5640-5644
21.	Skoda, R. (1993),	C., et	al.,	The EMBO Journal	12 (7) :	2654-2653
22.	Ogawa, M.,	Blood 81	(11) :	2844-2853 (1993):
23.	Methia, N.,	et al.,	Blood	82 (5): 1395-^401	(1993) ,
24.	Wendling F.	, et al.,	Blood 80: 246A (1993) .

D. Potreba činidla schopného stimulovať produkciu krvných doštičiek

Nedávno bolo oznámené, že v lekárskych centrách v Severnej Amerike, západnej Európe a Japonsku stále stúpa počet uskutočnených transfúzií krvných doštičiek (pozri Gordon, M. S. a Hoffman, R., Blood 80 (2): 302 až 307 (1992). Tento nárast sa zdá byť do značnej miery zapríčinený pokrokom v lekárskej technike a väčším prístupom k takýmto technikám, ako sú srdcové chirurgie a transplantácie kostnej drene, srdce a pečene. K veľkému dopytu po zásobách krvných doštičiek prispela tiež intenzifikácia dávok podávaných pri liečbe pacientov postihnutých rakovinou a epidémiou HIV-1.

Používanie krvných doštičiek nesie so sebou možnosť prenosu rôznych infekčných chorôb prenosných krvou, ako aj aloimunizácie. Okrem toho, produkcia krvných doštičiek je nákladná záležitosť a preto zvyšujúce sa použitie krvných doštičiek významne zvyšuje celkové náklady na liečenie. V dôsledku toho existuje akútna potreba vyvinúť nové a zlepšené metódy produkcie krvných doštičiek pre humánne aplikácie.

Ako príklady až doteraz známych pokusov o zvýšenie produkcie krvných doštičiek je možné uviesť nasledujúce pramene.

V US patente č. 5 032 396 bolo oznámené, že interleukín-7 (IL-7) je schopný stimulovať produkciu krvných doštičiek. Interleukín-7 je tiež známy pod označením lymfopoetín-1 a ide o lymfopoetický rastový faktor, ktorý je schopný stimulovať rast Ba T-bunkových progenitorov v kostnej dreni. Publikovaná prihláška PCT s podacím číslom 88/03747, podaná 19. októbra 1988 a Európska patentová prihláška s číslom podania 8830977.2 podaná 24. októbra 1988 popisuje DNA, vektory a spôsoby produkcie cicavčích IL-7 proteínov pomocou techniky Rekombinácie DNA. Dáta uvedené v tomto US patente ukazujú, že IL-7 môže zvýšiť množstvo cirkulujúcich krvných doštičiek v normálnych a subletálne ožiarených myšiach.

V US patente č. 5 087 448 sa uvádza, že megakaryocyty a krvné doštičky je možné stimulovať aby proliferovali u cicavcov tým, že sa na ne pôsobí interleukínom-6. Rekombinantný humánny interleukín-6 je glykoproteín s molekulovou hmotnosťou 26 000, ktorý má niekoľko biologických účinností. Dáta uvedené v tomto patente ukazujú, že IL-6 nemá žiadny účinok na zväčšovanie kolónií megakaryocytov in vitro.

Žiadny z vyššie uvedených patentov neuvádza informácie vzťahujúce sa na ligandy Mpl, ktoré sa zúčastňujú na predloženom vynáleze.

Napriek tomu, že existujú vyššie uvedené publikácie, existuje naďalej silná potreba vyvinúť nové stimulátory megakaryocytov a/alebo doštičiek pre cicavce.

E. Obor vzťahujúci sa na chemicky modifikovaný MGDF

Proteíny na terapeutické použitie sú v súčasnosti dostupné vo vhodných formách a množstvách, predovšetkým v dôsledku pokroku dosiahnutého v technológiách rekombinácie DNA. Funkčné skupiny chemických derivátov takýchto proteínov môžu účinne brániť proteolytickým enzýmom vo fyzickom styku s hlavným reťazcom proteínu a tak zabraňovať ich degradácii. Medzi prídavné výhody pri určitých okolnostiach patrí zvýšenie stability a doby cirkulácie terapeutického proteínu a zníženie imunogenicity. Je však nutné zdôrazniť, že účinok modifikácie konkrétneho proteínu sa nedá predvídať. Prehľadný článok popisujúci modifikáciu proteínu a fúzovanie proteinov je uvedený v publikácii Francis, Focus on Growth Factors 3: 4 až 10 (máj 1992), Vyd. Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, Londýn N20, OLD, Veľká Británia.

>Jednou takouto látkou, ktorá sa používa na prípravu chemických skupín terapuetických proteínových výrobkov, je polyetylénglykol (PEG alebo peg). Tak napríklad Adagen^<R>, čo je pegylovaná adenozíndeamináza, je prípravok schválený na liečenie závažnej kombinovanej imunodeficientnej choroby, pegylovaná superoxiddismutáza bola klinicky skúšaná pri liečení poškodenia hlavy, pegylovaný &-interferón bol skúšaný vo fáze I klinických skúšok liečby hepatítis a bolo oznámené predklinické skúšanie pegylovanej glukocerebrozidázy a pegylovaného hemoglobínu. Bolo ukázané, že pokiaľ ide o niektoré proteíny, spôsobuje pripojenie polyetylénglykolu ochranu pred proteolýzou (Sada et al., J. Fermentation Bioingeneering 71: 137 až 139 (1991)) a sú k dispozícii metódy umožňujúce pripojenie určitých polyetylénglykolových skupín (pozri US patent č. 4 179 337, Davis et al., Non-Imunnogenic Polypeptides, patent vydaný 18. decembra 1979 a US patent č. 4 002 531, Royer, Modifying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby, patent vydaný 11. januára 1977). Prehľad je uvedený v publikácii Abuchowski et al., Enzymes as Drugs (J. S. Holcerberg a J. Roberts eds., str. 367 až 383 (1981)).

Na modifikáciu proteinov boli použité iné vodorozpustné polyméry, ako sú napríklad kopolyméry etylénglykolu a propylénglykolu, karboxymetylcelulóza, dextrán, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidón, poly-1,3-dioxolán, poly-1,3,6-trioxán, kopolymér etylénu a maleínanhydridu a polyaminokyseliny (buď homopolyméry alebo štatistické kopolyméry,.

V prípade polyetylénglykolu bolo použité množstvo rôznych prostriedkov na pripojenie polyetylénglykolových molekúl k proteínu. Obvykle sa molekuly polyetylélnglykolu pripájajú k proteínu prostredníctvom reaktívnych skupín obsiahnutých v proteíne. Na takéto pripojenie sú vhodné aminoskupiny, ako napríklad aminoskupiny v lyzínových zvyškoch alebo pri N-konci. Tak napríklad Royer (US patent č. 4 002 531, pozri vyššie), uvádza, že na pripojenie polyetylénglykolových molekúl k enzýmu bola použitá redukčná alkylácia. V EP,. 0 539 167 (dátum publikácie: 28. apríla 1983, Wright, Peg Imidates and Protein Derivates Thereof) sa uvádza, že peptidy a organické zlúčeniny s ·. voľnou alebo voľnými aminoskupinami sa modifikujú imidátovým derivátom PEG alebo príbuzného vodorozpustného organického polyméru. US patent č. 4 904 584 (Shaw, patent vydaný 27. februára 1990) sa týka modifikácie množstva lyzínových zvyškov v proteínoch s cieľom pripojenia molekúl polyetylénglykolu prostredníctvom reaktívnych aminoskupín.

Jedným špecifickým terapeutickým proteínom, ktorý bol chemicky modifikovaný, je faktor stimulujúci kolóniu granulocytov, G-CSF (pozri Európska patentová publikácia č. EP 0 401 384, EP 0 473 268 a EP 0 335 423) .

Ako ďalší príklad je možné uviesť pegylovaný interleukín-6 (IL-6) popísaný v EP 0 442 724 s názvom Modified hIL-6 (pozri doteraz nevyriešenú patentovú prihlášku USA s podacím číslom 07/632070) . V týchto publikáciách je popísané pripojenie polyetylénglykolových molekúl k IL-6. V EP 0 154 316 (dátum „ publikácie: 11. septembra 1985) je popísaná reakcia lymfokínu s aldehydom polyetylénglykolu.

«

Schopnosť modifikácie MGDF nie je v tomto obore známa, keďže náchylnosť každého jednotlivého proteínu k modifikácii je určená špecifickými štruktúrnymi parametrami takéhoto proteínu. Okrem toho sa nedá na základe znalostí v tomto obore predvídať účinok takejto modifikácie na biologické vlastnosti konkrétneho proteínu. S ohľadom na množstvo klinických aplikácií MGDF (pozri vyššie) je žiadúce, aby bol k dispozícii derivatizovaný MGDF s modifikovanými vlastnosťami. Takéto molekuly by mohli vykazovať zvýšený polčas životnosti a/alebo zvýšenú účinnosť in vivo, ako aj iné vlastnosti.

Pegylácia molekúl proteínu má obvykle za následok vznik zmesi chemicky modifikovaných proteínových molekúl. Ako ilustratívny príklad je možné uviesť, že reakciou molekuly proteínu s piatimi lyzínovými zvyškami a vodnou aminoskupinou pri N-konci sa použitím vyššie uvedených metód môže získať heterogénna zmes látok, z ktorých niektoré obsahujú 6, iné 5, ·. ďalšie 4, ďalšie 3, 2, 1 alebo žiadny polyetylénglykolový zvyšok. Navyše ešte pokiaľ ide o molekuly s niekoľkými polyetylénglykolovými zvyškami, nemusia byť tieto zvyšky pripojené v rovnakých miestach. Často bude žiadúce získať homogénny produkt, ktorý bude obsahovať v podstate len jeden alebo malý počet (napríklad 2 až 3) druhov modifikovaného proteínu, líšiacich sa od seba počtom a/alebo umiestením chemických skupín, ako sú skupiny PEG. Pri určitej terapeutickej indikácii môžu byť napriek tomu zmesi napríklad mono-, dia/alebo tripegylovaných látok niekedy žiadúce alebo tolerovateľné.

Variabilita získaných zmesí od várky k várke môže byť nevýhodná pri vývoji terapeutického pegylovaného proteínového produktu. Pri takomto vývoji je dôležitou vlastnosťou predvídateľnosť biologickej účinnosti. Tak napríklad bolo ukázané, že v prípade neselektívnej konjugácie superoxiddismutázy - s polyetylénglykolom bolo niekoľko frakcií modifikovaného enzýmu úplne inaktívnych (P. McGoff et al., Chem. Pharm. Bull., 36: 3079 • až 0391 (1988). Podobne sa v publikácii Rose et al., Bioconjugate Chemistry 2: 154 až 159 (1991) uvádza selektívne pripojenie linkerovej skupiny karbohydrazidu k C-terminálnej karboxyskupine proteínového substrátu (inzulínu). Takáto predvídateľnosť vlastností terapeutického proteínu sa nedá dosiahnuť, ak sa jeho zloženie mení od várky k várke. Niektoré polyetylénglykolové skupiny nemusia byť viazané tak pevne v niektorých miestach ako iné a to môže mať za následok, že dôjde k dlsociácii takýchto skupín do proteínu. Je samozrejmé, že ak sú skupiny pripojené nepravidelne a ak sú teda aj nepravidelne disociované, farmakokinetika terapeutického proteínu sa nedá presne predvídať.

Tiež by bolo vysoko žiadúce vyvinúť derivatizovaný MGDF produkt, ktorý by neobsahoval žiadnu spojovaciu skupinu medzi polymérnym zvyškom a zvyškom MGDF. Jedným z problémov spoločným pre vyššie uvedené metódy je, že tieto metódy obvykle vyžadujú prítomnosť spojovacej skupiny medzi molekulou proteínu a molekulou polyetylénglykolu. Tieto spojovacie skupiny môžu byť ·. antigénne, čo je tiež nevýhoda pri vývoji terapeutického proteínu.

Spôsob, na ktorom sa nezúčastňuje žiadna spojovacia skupina, je popísaný vo Francis et al., V Stability of protein pharmaceucals: in vivo parhways of degradation and strategies for protein stabilization (Eds. Ahern., T. and Manning, M. C.) Plénum, New York, 1991). Tiež metóda, ktorú popísali Delgado et al. Coupling of PEG to protein By Activatiion with Tresyl chloride, Application In Immunoaffinity Celí Preparátion vo Fisheret al., ed., Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Celí Biology and Biotechnology, Plénum Press, New York, NY, 1989 str. 211 až 213, zahrnuje použitie trezylchloridu, čo má za následok, že medzi zvyškom polyetylénglykolu a zvyškom proteínu nie je prítomná žiadna spojovacia skupina. Táto metóda je ťažko použiteľná pri výrobe terapeutických produktov, keďže použitie trezylchloridu môže viesť k vzniku toxických vedľajších

- produktov.

« Chamov et al. (Bioconjugate Chem. 5: 133 až 140 (1994)) popisujú modifikáciu CD4 imunoadhezínu monometoxypolyetylénglykol(MePEG glykol)aldehydom redukčnou alkyláciou. Autori uvádzajú, že 50 % CD4-Ig je MePEG-modifikovaných selektívnou reakciou na &-aminoskupine pri N-konci (tá istá publikácia, str. 137). Autori tiež uvádzajú, že in vitro väzbová schopnosť modifikovaného CD4-Ig (k proteínu gp 120) sa znižuje v miere korelovateľnej so stupňom MePEGylácie (pozri vyššie uvedená citácia).

Existuje teda potreba vyvinúť deriváty MGDF, predovšetkým pegylovaný MGDF. Tiež existuje potreba vyvinúť metódy alebo spôsoby uskutočňovania takejto derivátizácie.

Podstata vynálezu >Jedným z aspektov tohto vynálezu sú nové polypeptidy, ktoré sú špecifické promotory rastu a/alebo vývoja megakaryocytov (Mpl ·. ligandy, alebo MGDF), ktoré v podstate neobsahujú (tj. ktoré sú izolované) iné proteíny (tj. cicavčie proteíny v prípade Mpl ligandu získaného z cicavčieho zdroja). Takéto proteíny je možné purifikovač z bunkových zdrojov produkujúcich tieto faktory prirodzene alebo po indukcii inými faktormi. Tiež je možné ich pripravovať pomocou rekombinantných techník génového inžinierstva. Mpl ligandy je možné ďalej syntetizovať pomocou chemických technológií alebo kombinácií vyššie uvedených technológií.

Mpl ligandy podía vynálezu je možné získať v natívnej forme z cicavčích zdrojov. Dva príkladné Mpl ligandy izolované z psej aplastickej plazmy sú popísané v príkladovej časti tohto popisu. V iných príkladoch uvedených v tomto popise je však ukázané, že blízko príbuzné Mpl ligandy sú prítomné v aplastickej plazme človeka a tiež ošípanéj. Je pozoruhodné, že účinnosť každého z Mpl ligandov (človeka, ošípanej aj psa) je možné špecificky . inhibovať rozpustnou formou myšacieho Mpl receptora, čo ukazuje, že všetky tieto Mpl ligandy (ako aj ligandy z iných cicavčích « zdrojov, vrátane z myši) sú blízko príbuzné, či už ide o štruktúru alebo úroveň účinnosti.

Očakáva sa, že cicavčie Mpl ligandy z človeka, ošípanej a iných cicavcov bude možné izolovať z prírodných zdrojov pomocou postupov, ktoré sú podrobne popísané v príklade 10. Predmetom vynálezu sú teda vo všeobecnosti cicavčie Mpl ligandy, ako sú napríklad Mpl ligandy pochádzajúce z psa, ošípanej, človeka, myši, koňa, ovce a králika. Osobitná prednosť sa dáva Mpl ligandom, ktoré pochádzajú z psa, ošípanej a človeka.

Okrem toho boli gény kódujúce humánne Mpl ligandy klonované z knižnice humánnych fetálnych obličiek a pečene a sekvenované, ako je to popísané v príkladovej časti uvedenej ďalej. Boli zistené dve humánne polypeptidové sekvencie vykazujúce účinnosť pri bunkovej skúške (pozri príklad 4). Tietp sekvencie sa líšia v

.. dĺžke, ale vykazujú identitu vo veľkom úseku svojich aminokyselinových sekvencii. Totožné časti sú homologické s

·. erytropoetínom. Mpl ligandy sú tu tiež označované ako faktory rastu a vývoja megakaryocytov (MGDF). Ak sa hovorí kdekoľvek v tomto popise o Mpl ligandoch, je toto označenie vždy zameniteľné za označenie MGDF a naopak. Pod označením MGDF polypeptid sa rozumie polypeptid vykazujúci účinnosť spočívajúcu v špecifickej stimulácii alebo inhibícii rastu a/alebo vývoja megakaryocytov. Príklady takýchto polypeptidov sú uvedené v tomto popise.

Bolo zistené, že Mpl ligandy podľa vynálezu sú špecificky účinné v triede megakaryocytov, pričom zvyšujú maturáciu a/alebo proliferáciu megakaryocytov, ako to ukazujú pokusy v príkladoch 2 a 4 popísané ďalej. Pod označením špecificky sa rozumie, že tieto polypeptidy vykazujú biologickú účinnosť relatívne vyššieho stupňa voči megakaryocytom v porovnaní s mnohými inými typmi buniek. Od Mpl ligandov so stimulačným účinkom voči megakaryocytom sa očakáva, že budú vykazovať in vi vo účinnosť stimulujúcu produkciu krvných doštičiek prostredníctvom . stimulácie, maturácie a diferenciácie megakaryocytov.

» Dva prednostné Mpl ligandy s psieho zdroja vykazujú zdanlivú molekulovú hmotnosť približne 25 kDa a 31 kDa podľa stanovenia pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli použitím nátriumdodecylsulfátu (SDS-PAGE) pri neredukčných podmienkach. Obidva tieto proteíny sa purifikujú počas toho istého purifikačného protokolu, ktorý je podrobne popísaný v príkladovej časti uvedenej ďalej.

Dva prednostné humánne ligandy, MGDF-1 a MGDF-2, majú dĺžku 332 a 173 aminokyselín, nepočítajúc do toho 21 aminokyselín predpokladaného signálneho peptidu. Tieto sekvencie a sekvencie tretej príbuznej molekuly, MGDF-3, sú znázornené na obr. 11 a 12.

Ešte ďalším aspektom tohto vynálezu sú spôsoby izolácie a purifikácie Mpl ligandov podľa vynálezu alebo ich fragmentov z cicavčích zdrojov, prednostne z úplnej krvj., séra alebo plazmy..

·. Prednostným východiskovým materiálom je predovšetkým aplastická krv, sérum alebo plazma. Aplastickú krv, sérum alebo plazmu je

·. možné získať spôsobom, pri ktorom sa cicavec ožaruje radiačným zdrojom, ako je napríklad kobalt-60, pri úrovni radiácie približne 400 až 800 rad, aby sa dosiahla aplasticita. Takýto postup je v tomto obore známy, ako je to napríklad zrejmé z publikácií citovaných ako príklady v príklade 1. V prípade človeka je možné ožiarenú krv, plazmu alebo sérum získať od pacientov po radiačnej terapii, napríklad pri liečení rakoviny.

Aplastická krv, sérum alebo plazma sa potom podrobia purifikačnému postupu. Purifikačný postup podľa vynálezu zahrnuje tieto kľúčové stupne: lektínovú afinitnú chromatografiu a Mpl receptor-afinitnú chromatografiu. Každý z týchto stupňov má za následok približne 300 až 500-násobnú purifikáciu 25 a 31kDa proteínu z psej aplastickej plazmy. Vyššie uvedené purifikačné stupne je možné kombinovať s inými štandardnými postupmi purifikácie proteinov s cieľom zvýšenia čistoty Mpl ligandov podľa vynálezu. Takéto prídavné purifikačné postupy sú tiež . podrobne popísané ďalej.

• Ďalším aspektom tohto vynálezu sú polynukleotidy kódujúce expresiu cicavčieho proteínu Mpl Ugandu. Takéto sekvencie DNA môžu zahrnovať izolovanú sekvenciu DNA kódujúcu expresiu cicavčích proteinov Mpl Ugandu, ktorá je popísaná ďalej. Sekvencie DNA môžu tiež zahrnovať 5' a 3' cicavčie nekódujúce sekvencie lemujúce sekvenciu kódujú Mpl ligand. Sekvencie DNA môžu ďalej kódovať aminoterminálny signálny peptid. Takéto sekvencie je možné pripraviť pomocou akýchkoľvek známych metód, vrátane úplnej alebo čiastočnej chemickej syntézy. Kodóny je možné optimalizovať pre expresiu v hostiteľských bunkách, ktoré boli zvolené pre expresiu (napríklad E. coli alebo bunkách CHO).

Predmetom vynálezu sú ďalej tiež molekuly rekombinantnej DNA, z ktorých každá obsahuje DNA vektora s všeobecným vzorcom s všeobecným vzorcom a sekvenciu DNA kódujúcu cicavčí Mpl ligand. Molekula DNA obsahuje DNA Mpl ligandu ^v operatívnom spojení, s regulačnou sekvenciou schopnou riadiť replikáciu a expresiu Mpl ligandu vo zvolenej hostiteľskej bunke. Predmetom vynálezu sú aj hostiteľské bunky (napríklad bakteriálne, cicavčie, hmyzie, kvasinkové alebo rastlinné), ktoré sú transformované takýmito molekulami DNA pre použitie pri expresii proteínu Mpl ligandu.

Molekuly DNA a transformované bunky podľa vynálezu sa používajú pri ďalšom aspekte tohto vynálezu, tj. novom spôsobe výroby rekombinantného cicavčieho proteínu Mpl ligandu alebo jeho peptidových fragmentov. Pri tomto spôsobe sa bunková línia transformovaná sekvenciou DNA kódujúcou expresiu proteínu Mpl ligandu alebo jeho fragmentu (alebo rekombinantná molekula DNA popísaná vyššie) v operatívnom spojení s vhodnou regulačnou sekvenciou alebo sekvenciou kontrolujúcou expresiu tohto proteínu kultivuje pri vhodných podmienkach umožňujúcich expresiu rekombinantnej DNA. Pri tomto nárokovanom spôsobe sa môže používať množstvo známych buniek ako hostiteľské bunky pre expresiu proteínu. V súčasnosti sú prednostné bunkové línie na produkciu Mpl ligandu cicavčie bunkové línie (napríklad bunky > CHO) a bakteriálne bunky (napríklad bunky E. soli).

• V prípade produkcie Mpl ligandu v E. coli sa prednostne používajú pri N-konci exprimovaného proteínu zvyšky Met a Lys, keďže výťažok produktu je v tomto prípade obvykle vyšší. Osobitne prednostným produktom expresie je Met-Lys-humánny MGDF s celkovo 165 aminokyselinami (tj. Met^_a-Lys^_1[1-163]MGDF (číslovanie sa uskutočňuje od prvej aminokyseliny maturovaného proteínu). Po purifikácii produktu exprimovaného v bakteriálnej bunke, akou je

E. coli, sa môžu terminálne zvyšky Met-Lys odstrániť pôsobením dipeptidázy (napríklad katepsínu C).

Exprimovaný proteín Mpl ligandu sa potom izoluje z hostiteľských buniek, bunkového lyzátu alebo kultivačného média pomocou vhodných konvenčných metód. Produkčné médium je možné spracovať pomocou rovnakých purifikačných stupňov alebo ich modifikácií, aké sa používajú pri izolácii Mpl ligandu z aplastickej plazmy (pozri príklad 7) .

Ešte ďalším aspektom tohto vynálezu sú rekombinantné proteíny Mpl ligandu. Tieto proteíny v podstate neobsahujú žiadne iné cicavčie látky, predovšetkým proteíny. Proteíny Mpl ligandu podľa tohto vynálezu sú tiež charakteristické tým, že vykazujú jednu alebo viac fyzikálnych, biochemických, farmakologických alebo biologických účinností charakterizovaných v tomto popise.

Predmetom vynálezu sú ďalej tiež chemicky modifikované MGDF obsahujúce zvyšok MGDF proteínu pripojený k aspoň jednému vodorozpustnému polyméru a spôsoby výroby a použitia takýchto látok. Vynález predovšetkým zahrnuje chemicky modifikovaný MGDF, ktorý je reakčným produktom MGDF s reaktívnymi molekulami polyetylénglykolu, v ktorom sú skupiny PEG pripojené k MGDF. Takéto pripojenie je možné dosiahnuť pomocou pegylačných reakcií uvedených v tomto popise, ako je napríklad acylácia alebo alkylácia. Acylácia alebo alkylácia pomocou PEG sa môže uskutočňovať pri podmienkach, pri ktorých je hlavný produkt monopegylovaný alebo polypegylovaný. Polypegylácia obvykle . zahrnuje pripojenie PEG k epsilon-aminoskupinám lyzínových zvyškov a môže prídavné zahrnovať pegyláciu N-konca polypeptidu.

• Monopegylácia prednostne zahrnuje pripojenie PEG k &-aminoskupine pri N-konci proteínu. Výťažok a homogenitu monopegylačnej reakcie je možné zvýšiť použitím takého typu reakčnej alkylácie, ktorý selektívne modifikuje &-aminoskupinu N-terminálneho zvyšku MGDF proteínu. Tým sa zaistí selektívne pripojenie vodorozpustného polymérneho zvyšku k N-koncu proteínu. Tak sa získa v podstate homogénny prípravok tvorený konjugátom molekúl polyméru a MGDF proteínu, ako aj (v prípade, že sa použije polyetylénglykol) prípravok zahrnujúci molekuly MGDF proteínu, v ktorých je polyetylénglykolový zvyšok priamo kopulovaný k proteínovému zvyšku.

Ďalším aspektom tohto vynálezu sú farmaceutické prostriedky obsahujúce terapeuticky účinné množstvo izolovaného prírodného alebo rekombinantného Mpl ligandu, ktoré sú poprípade derivátizované vodorozpustným polymérom, akp je polyetylénglykol, v kombinácii s farmaceutický vhodným nosičom, riedidlom alebo excipientom. Takéto farmaceutické prostriedky sa môžu používať pri liečení chorobných stavov alebo porúch, ktoré sú charakteristické nedostatkom megakaryocytov a/alebo krvných doštičiek, ako aj in vivo deficienciou Mpl ligandu. Tiež sa môžu používať profylaktický na zlepšenie očakávanej deficiencie megakaryocytov alebo krvných doštičiek (napríklad v dôsledku chirurgického zásahu).

Mpl ligandy podľa vynálezu sa môže používať pri liečení aplastických anémií, napríklad na zvýšenie produkcie krvných doštičiek pacientov so zhoršenou produkciou krvných doštičiek (ako sú napríklad pacienti postihnutý AIDS alebo pacienti, na ktorých sa aplikuje chemoterapia rakoviny). Mpl ligand sa môže použiť na liečenie krvných porúch, ako je napríklad trombocytopénia. Mpl ligand sa tiež môže použiť ako adjuktívna terapia pre pacientov, ktorým bola transplantovaná kostná dreň. Títo pacienti môžu byť ľudia alebo iní cicavci. Očakáva sa, že Mpl ligand z jedného druhu bude užitočný aj pre iný druh.

•

Ďalším aspektom tohto vynálezu je teda spôsob liečenia • týchto a iných patologických stavov, ku ktorým dochádza v dôsledku nedostatku krvných doštičiek, pri ktorom sa pacientom podáva terapeuticky účinné množstvo farmaceutického prostriedku popísaného vyššie. Takéto terapeutické metódy môžu zahrnovať podávanie (simultánne alebo postupné) Mpl ligandu, účinného množstva aspoň jedného iného faktora stimulujúceho megakaryocytovú kolóniu, cytokínu (napríklad EPO), rozpustného

Mpl receptora, hematopoetínu, interleukínu, rastového hormónu alebo protilátky.

Ešte ďalším aspektom tohto vynálezu sú protilátky (napríklad polyklonálne, monoklonálne, humanizované a rekombinantné) a fragmenty protilátok, ktoré sú zamerané proti cicavčiemu Mpl ligandu alebo jeho fragmentu, tj. ktoré sú voči cicavčiemu Mpl ligandu alebo fragmentu reaktívne. Súčasťou tohto aspektu vynálezu sú teda bunky, ktoré sú schopné vylučovať takéto protilátky (napríklad hybridómy, v prípade monoklonálnych protilátok) a spôsoby ich produkcie, ako aj ich použitie pri diagnostických alebo liečebných postupoch.

Ďalším aspektom tohto vynálezu je skúšanie telesných tekutín na prítomnosť Mp ligandu. Pri takomto skúšaní je možné používať protilátky, ktoré špecificky rozoznávajú Mpl ligand. Pritom sa môže použiť prístup s jedinou protilátkou alebo s tzv. sendvičom. Takáto skúška sa môže použiť na stanovenie, či pacient potrebuje externé podávanie Mpl ligandu a/alebo či pacient nevykazuje deficienciu krvných doštičiek alebo ich poruchu. Stanovenie je možné uskutočňovať pomocou definovaného spôsobu použitím súpravy obsahujúcej vzorky na pozitívnu a negatívnu kontrolu, protilátku alebo protilátky a iné štandardné zložky súpravy.

Iné aspekty a výhody tohto vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho podrobného popisu prednostnej realizácie tohto vynálezu.

Množstvo charakteristických znakov a výhod tohto vynálezu je zrejmé z popisu, v ktorom sa používajú odkazy na pripojené obrázky.

Prehľad obr. na výkresoch

Na obr. l je znázornený prehľad vývoja a maturácia megakaryocytov a krvných doštičiek.

Obr. 2 ukazuje, že rozpustný myšací Mpl receptor v podstate úplne inhibuje schopnosť plazmy ožiarených psov (aplastickej psej plazmy či APK9) indukovať vývoj megakaryocytov. Pritom je použité stanovenie vývoja megakaryocytov popísané v príklade 2.

Obr. 3 ukazuje, že aktivita získaná obohacovaním z APK9 lektínovou afinitnou chromatografiou a Mpl receptor-afinitnou chromatografiou (použitím Mpl ligandu) stimuluje rast buniek 1-A6.1 a že rozpustný myšací receptor blokuje tento rast.

Na obr. 4 je uvedený prehľad purifikačných stupňov pri purifikácii 25 a 3lkDa formy psieho Mpl receptora z aplastickej psej plazmy.

Obr. 5 ukazuje purifikáciu Mpl ligandu pomocou HPLC s obrátenými fázami (RP-HPLC). Frakcia 21 obsahuje vysoko purifikovaný 31kDa Mpl ligand, frakcia 22 obsahuje zmes 31kDa a 25kDa Mpl ligandu a frakcia 23 obsahuje vysokopurifikovaný 25kDa Mpl ligand.

Na obr. 6 je frakcie obsahujúcej znázornené porovnanie aktivity 25kDa a/alebo 31kDa proteín Mpl

Mpl ligandu ligandu pri

HPLC s obrátenými fázami (stĺpec C4).

Obr. 7 ukazuje počet megakaryocytov produkovaných v kultúrach CD34-selektovaných buniek periférnej krvi stimulovaných APK9, Mpl ligandom a rôznymi inými faktormi.

•

Obr. 8 ukazuje počet všetkých leukocytov produkovaných v ♦ kultúrach CD34-selektovaných buniek periférnej krvi stimulovaných

APK9, Mpl ligandom a rôznymi inými faktormi.

Obr. 9 ukazuje percentný podiel megakaryocytov produkovaných v kultúrach CD34-selektovaných buniek periférnej krvi stimulovaných APK9, Mpl ligandom a rôznymi inými faktormi.

Obr. 10 ukazuje, že humánny IL-3 sa nezúčastňuje na vývoji megakaryocytov indukovanom Mpl ligandom.

Obr. 11 ukazuje cDNA a dedukovanú aminokyselinovú sekvenciu humánneho MGDF-1 a MGDF-2.

Obr. 12 ukazuje cDNA a dedukovanú aminokyselinovú sekvenciu humánneho MGDF-3.

Obr. 13 ukazuje porovnanie medzi MGDF-1 a ďalšími MGDF (Mpl ligandy) z psieho zdroja (A) a myšacieho zdroja (B).

Na obr. 14 je znázornený príklad acylácie MGDF použitím reaktívnych N-hydroxysukcínimidyl(NHS)esterov monometoxypolyetylénglykolu, ktorá vedie k polypegylovanému produktu.

Na obr. 15 je znázornený príklad nešpecifickej redukčnej alkylácie MGDF použitím monometoxypolyetylénglykolaldehydov, ktorá vedie k polypegylovanému produktu.

Na obr. 16 je znázornený príklad miestne špecifickej redukčnej alkylácie MGDF na &-aminoskupine N-terminálneho zvyšku použitím monometoxypolyetylénglykolaldehydov, pri ktorej vzniká v podstate monopegylovaný produkt.

Na obr. 17 je znázornená analýza HPLC, pri ktorej dochádza k vylučovaniu molekúl podľa veľkosti (SEC), konjugátov MePEG-MGDF pripravených použitím aktivovaných derivátov MePEG s molekulovou hmotnosťou 20 kDa:

A) poly-MePEG-MGDF konjugát NHS-esterom MePEG (PEG 11) , pripravený acyláciou MGDF

B) poly-MePEG-MGDF konjugát MePEG aldehydom (PEG 20),

C) poly-MePEG-MGDF konjugát pripravený pripravený acyláciou MGDF acyláciou MGDF

MePEG aldehydom (PEG 16).

Na obr. 18 sú znázornené počty krvných doštičiek myší ošetrených rekombinantným humánnym HGDF: kosoštvorce = 22-353 MGDF pochádzajúce z buniek CHO, otvorené krúžky = nepegylovaný 22-184 MGDF z E. coli (tj. 1-163 MGDF) a uzatvorené krúžky = pegylovaný 22-184 MGDF z E. coli.

Na obr. 19 je znázornená purifikačná sphéma r-HuMGDF.

Na obr. 20 je znázornený účinok r-HuMGDF (E. coli 1-163 na počet doštičiek myšacieho karboplatinového modelu. Myšiam Balb/c sa intraperitoneálne injekčné (1,25 mg/myš) 0. deň. Skupina, nedostane karboplatín. Po 24 podá jediná dávka karboplatínu ktorej sa podáva len excipient, hodinách sa zvieratám ošetreným karboplatínom podáva subkutánne injekčné buď excipient alebo 100 (mg/kg r-HuMGDF denne až do konca štúdie (počet zvierat v skupine (n) je 10, striedavo sa odoberá krv vždy 5 zvieratám).

Na obr. 21 je znázornený účinok rHuMGDF (E. coli 1-163) na počet krvných doštičiek myší ošetrených ožiarením. Myši Balb/c sa ožiaria jednou dávkou gama žiarenia 500 rad z céziového zdroja 0. deň. Skupina, ktorej sa podáva len excipient nie je ožarovaná. Po 24 hodinách sa ožiareným zvieratám podáva subkutánne injekčné buď excipient alebo 100 (Ag/kg rHuMGDF každý deň až do konca štúdie (počet zvierat v skupine (n) je 8, striedavo sa odoberá krv vždy 4 zvieratám).

' Na obr. 22 je znázornený účinok rHuMGDF (E. coli 1-163) na počet krvných doštičiek myší ošetrených kombináciou ožarovania . a karboplatínu. Myši Balb/c sa ožiaria jednou dávkou gama žiarenia 500 rad z céziového zdroja a podá sa im karboplatín (1,25 mg/myš) 0. deň. Po 24 hodinách sa exponovaným zvieratám podáva subkutánne injekčné buď excipient alebo 100 f*g/kg rHuMGDF každý deň až do konca štúdie (počet zvierat v skupine (n) je 8) . Bez podpory r-HuMGDF väčšina zvierat štúdiu neprežije. V kontrolnej skupine prežije 1 zviera z 8, zatiaľ čo v ošetrenej skupine prežije 8 zvierat z 8.

Na obr. 23 je znázornený účinok r-HuMGDF (E. coli 1-163) na trombocytopéniu indukovanú ožiarením opíc rhesus. Opice rhesus sa ožiaria 700 cGy zo zdroja Co-80. Po 24 hodinách po ožiarení sa opiciam počas ďalších 18 dní subkutánne podáva r-HuMGDF (n = 3) alebo humánny sérový albumín (n = 9) (vždy v dávke 25 f<g/kg/deň) . Analýzy krvných buniek sa uskutočňujú pomocou elektronické analyzátora krvných buniek. Každý symbol _vpredstavuj e priemernú hodnotu (± smerodajná odchýlka).

’· Na obr. 24 je znázornený účinok pegylovaného a glykozylovaného r-HuMGDF na počet krvných doštičiek myší ošetrených karboplatínom a ožarovaním. Myši sa podrobia kombinovanému účinku karboplatínu a ožarovania spôsobom popísaným v štúdii znázornenej na obr. 22. Subkutánne injekcie uvedeného prípravku r-HuMGDF (50 (Ag/kg/deň) sa podávajú každý deň počas celej štúdie, začínajúc 24 hodinami po inzulte. Počty krvných doštičiek sa zisťujú označený deň použitím elektronického počítača buniek (Sysmex, Baxter).

Obr. 25 ukazuje syntetickú génovú sekvenciu rekombinantného humánneho MGDF, aminokyseliny 1 až 163, s obsahom E. coli opt imali zovaných kodónov.

Nasleduje podrobný popis tohto vynálezu.

Nové faktory povzbudzujúce rast cicavčích megakaryocytov • a/alebo produkujúce krvné doštičky, ktoré sú označované názvom Mpl ligandy, ktoré sú predmetom tohto vynálezu, sú homogénne • proteíny, ktoré v podstate nie sú spojené s inými proteínovými látkami. Prednostne sú tieto proteíny z asi 90 %, výhodnejšie z asi 95 % a najvýhodnejšie viac ako 98 %, bez obsahu iných proteínov. Je možné ich produkovať pomocou rekombinantných techník, ktorými je možné zaistiť produkciu veľkých množstiev čistého aktívneho Mpl ligandu užitočného v terapeutických aplikáciách. Alternatívne sa dajú tieto proteíny získať v homogénnej forme z cicavčej aplastickej krvi, plazmy alebo séra, alebo z cicavčej bunkovej línie vylučujúcej alebo exprimujúcej Mpl ligand. Mpl ligand alebo jeho účinné fragmenty je ďalej tiež možné syntetizovať chemicky.

Pod všeobecným označením Mpl ligandy, ako sa používa v popise tohto vynálezu, sa rozumejú Mpl ligandy popísané v tomto popise, ako aj ich účinné fragmenty a varianty, ktoré sú podrobnejšie popísané ďalej .

Prednostné Mp ligandy z psieho zdroja majú zdanlivú molekulovú hmotnosť približne 25 a 31 kDa podľa stanovenia elektroforézou na polyakrylamidovom géli použitím dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) pri neredukčných podmienkach. Obidva proteíny sa purifikujú podľa rovnakého purifikačného protokolu, ktorý je podrobne popísaný v príkladovej časti uvedenej ďalej. Tak napríklad obidva tieto Mpl ligandy viažu lektín z pšeničných klíčkov a imobilizovaný Mpl receptor: 25kDa forma zahrnuje túto aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 1:

Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-LeuArg-Asp-Ser-His-Väl-Leu-His-Xaa-Arg-Leu-Xaa-Gln-Xaa-ProAsp-Ile-Tyr

31kDa forma zahrnuje túto aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2:

Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-LeuArg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His

Aminokyseliny označené skratkou Xaa v SEQ ID NO: 1 a 2 nie sú s určitosťou známe, ale predpokladá sa, že ide o cysteín, serín, treonín alebo (menej pravdepodobne) tryptofán.

Z vyššie uvedených sekvencii je zrejmé, že 31kDa ligand obsahuje prinajmenšom časť 25kDa formy. Predovšetkým prvých 21 aminokyselín 31kDa proteínu sa presne zhoduje s aminokyselinami v 25kDa proteíne. Tento dôkaz a predovšetkým skutočnosť, že obidva tieto proteíny vykazujú účinnosť pr stanovení aktivity Mpl Ugandu charakterizovanom v tomto popise, vedie k záveru, že obidva tieto proteíny sú veľmi príbuzné, či už ide o štruktúru, alebo o účinnosť. Je pravdepodobné, že 31kDa forma tohto proteínu sa od 25kDa formy líši v odlišnej C-terminálnej sekvencii, odlišnej glykozylácii a/alebo odlišnom zostrihu génu kódujúceho tieto proteíny.

Okrem informácií vzťahujúcich sa n^ zloženie sekvencie, . uvedených vyššie, počas sekvenovania 25kDa pásu pred záverečným purifikačným stupňom (použitím HPLC s obrátenými fázami) bola stanovená ďalšia sekvencia. Táto sekvencia je pripojená k 25 kDa pásu pri neredukčných podmienkach, a nie pri redukčných, čo ukazuje, že ide o výsledok štiepenia 25kDa proteínu na dve časti (napríklad proteázou), pričom tieto časti sú spojené disulfidovou väzbou. Táto sekvencia (SEQ ID NO: 3) má toto zloženie:

Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-Val-Leu-Gly-AlaVal-Ala-Leu

Napriek tomu, že presneé umiestenie SEQ ID NO: 3 v sekvencie 25kDa proteínu nie je jasné, usudzuje sa na základe analógie s inými cytokínmi, ako je napríklad erytropoetín, že by táto sekvencia mohla byť umiestená v 25 kDa proteíne v blízkosti aminokyseliny s číslom 114. Je pravdepodobné, aj keď to nebolo doteraz dokázané, že sekvencia SEQ ID NO: 3 sa tiež vyskytuje v 31kDa proteíne, pravdepodobne opäť v blízkosti aminokyseliny s • číslom 114. Vyššie uvedené informácie sú podrobnejšie prediskutované v príklade 7.

v

Po začiatočných purifikačných experimentoch s psími ligandami, ktorých súhrn je uvedený vyššie, bol teraz klonovaný gén kódujúci psí ligand. V dôsledku toho bola stanovená celá dĺžka aminokyselinovej sekvencie psieho ligandu (pozri obr. 13A). Na základe výpočtu molekulovej hmotnosti sa predpokladá, že 25kDa a 31kDa psie ligandy sú C-terminálne upravené formy ligandu s úplnou dĺžkou znázorneného na obr. 13A. Ďalej bol získaný tiež myšací Mpl ligand, ktorého sekvencia je uvedená na obr. 13B.

Tieto purifikované ligandy je tiež možné charakterizovať špecifickou aktivitou pri skúške s humánnymi megakaryocytmi (podľa príkladu 2), ktorá dosahuje hodnotu aspoň 5,7 x 10® megakaryocytových (meg) jednotiek/mg. Megakaryocytová jednotka je definovaná ako množstvo látky, ktoré vedie k produkcii rovnakého množstva megakaryocytov ako 1 (Al štandardnej kontrolnej vzorky. APK9 použitím skúšky popísanej v príklade 2.

Takéto purifikované ligandy sú takisto charakterizované špecifickou aktivitou pri Mpl-dependentnom raste buniek, tj. skúške popísanej v príklade 4, kde táto aktivita dosahuje prinajmenšom hodnotu asi 6,9 x 10® jednotiek bunkového rastu. Jednotka bunkového rastu je definovaná ako množstvo Ugandu, ktoré vedie k rastu 200 1A6.1 buniek pri skúške podľa príkladu 4.

Nasledujúca tabuľka 1 ukazuje prídavné špecifické výpočty aktivity pre skutočné purifikované psie Mpl ligandy vyrobené spôsobom podľa tohto vynálezu.

Tabuľka 1

Mpl Ligand	1A6.1 skúška (jednotky/mg)	Skúška s humánnymi megakaryocytmi (jednotky/mg)
31 kDa	6,5 x 10®	5,7 x 10®
25 kDa	10,5 x 10®	14 x 10®

Vyššie uvedené informácie sú sumarizované v nasledujúcom prehľade, v ktorom je uvedených niekoľko príkladov Mpl ligandov podľa vynálezu, ktoré sú charakterizované jednou alebo viacerými biochemickými a biologickými vlastnosťami:

(a) Mpl ligandy sú izolované z psej aplastickej plazmy, (b) Mpl ligandy maj) zdanlivú molekulovú hmotnosť približne 25 kDa alebo 31 kDa podľa stanovenia pomocou elektroforézy na polykarylamidovom géli použitím dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) pri neredukčných podmienkach, (c) Mpl ligandy zahrnujú tieto aminokyselinové sekvencie:

SEQ ID NO: 1, v prípade 25kDa proteínu alebo SEQ ID NO: 2, v prípade 31kDa proteínu, (d) Mpl ligandy prídavné obsahujú aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 3 (osobitne potom 25kDa protein), (e) Mpl ligandy sa viažu na lektín z pšeničných klíčkov, (f) Mpl ligandy sa viažu na imobilizovaný rozpustný myšací Mpl receptor, (g) aktivita Mpl ligandu je možné inhibovať in vitro rozpustným Mpl receptorom a (h) Mpl ligandy sa viažu na anexovaný stĺpec pri pH od asi 8 do asi 9.

Biologické účinnosti prednostných Mpl ligandov podľa vynálezu sú demonštrované ich schopnosťou špecificky stimulovať rast a vývoj megakaryocytov pri skúške povzbudzovania rastu megakaryocytov podľa príkladu 2. Pri tejto skúške Mpl ligand stimuluje diferenciáciu humánnych buniek CD34* periférnej krvi (tj. buniek CD-34 získaných pomocou imunoadsorpčnej selekcie počas 8-denného obdobia kultivácie. Megakaryocyty sa identifikujú farbením použitím špecifických protidoštičkových antigénových protilátok a spočítajú sa pod mikroskopom. Mpl ligand tiež stimuluje rast faktor-dependentnej bunkovej línie 1A6.1. Pri neprítomnosti Mpl ligandu bunky hynú. Počet 1A6.1 buniek sa stanoví po 2 dňoch kultivácie s Mpl ligandom.

Mpl ligandy popísané vyššie vykazujú špecifické aktivity popísané v tabuľke 1.

Ako zdroj Mpl ligandov bola zistená aplastické krv, plazma alebo sérum. Neočakáva sa však, že by boli £droje týchto ligandov obmedzené na tieto známe látky. Zdroje teda budú zahrnovať tiež iné cicavčie telesné tekutiny, bunky z nich získané atď.

Purifikácia natívnych Mpl ligandov z cicavčích zdrojov je založená na dvoch kľúčových purifikačných stupňoch:

(a) lektínová afinitná chromatografia, prednostne použitím aglutinínu z pšeničných klíčkov a (b) afinitná chromatografia s imobilizovaným Mpl receptorom.

Môžu byť tiež zaradené prídavné stupne s cieľom ďalšej purifikácie proteínu. Takéto stupne zahrnujú napríklad ionitovú chromatografiu, gélovú filtračnú chromatografiu a chromatografiu s obrátenými fázami.

Purifikačné techniky skutočne použité na získanie Mpl ligandu z psej aplastickej plazmy zahrnujú tieto stupne (pozri príklad 7):

(a) lektínovú afinitnú chromatografiu (osobitná prednosť sa dáva chromatografii použitím aglutinínu z pšeničných klíčkov), (b) afinitnú chromatografiu s rozpustným Mpl receptorom (mpl-X) (prednostne použitím imobilizovaného myšacieho Mpl-X) (c) chromatografiu s výmenou iónov (tj. aniónov alebo katiónov), prednostne použitím stĺpca Mono Q, (d) gélovú filtračnú chromatografiu použitím disociaČných podmienok (prednostne použitím Superdex 200 plus SDS) a (e) chromatografiu s obrátenými fázami (prednostne použitím stĺpca C-4).

Homogénny cicavčí Mpl ligand, vrátane humánneho ligandu, je možné získať aplikáciou vyššie uvedených purifikačných postupov, na aplatickú krv, sérum alebo plazmu alebo na iné zdroje cicavčieho Mpl ligandu, napríklad bunkové alebo tkanivové zdroje. Použité purifikačné stupne nie je nutné uskutočňovať v dajakom poradí, ale poradiu, ktoré ej uvedené vyššie sa dáva prednosť. Procedúry, ktoré je možné použiť pri kultivácii buniek (alebo tkanív) s cieľom produkcie Mpl ligandu, sú známe odborníkom v tomto obore a môžu sa napríklad použiť na rozšírenie ponuky východiskových látok.

Mpl ligand alebo jeden alebo viac jeho peptidových fragmentov je tiež možné získať pomocou rekombinantných techník. Aby sa získala sekvencia DNA určitého Mpl ligandu, purifikovaný Mpl ligand sa redukuje a poprípade štiepi proteázou, ako je napríklad trypsín. Enzymatické fragmenty sa izolujú a sekvenujú pomocou konvenčných techník. Alternatívne, ako je to príkladne uvedené v časti popisu zaoberajúceho sa príkladmi realizácie, sa intaktný purifikovaný proteín môže priamo sekvenovať v možnom rozsahu, ktorý je závislý od množstvo dostupného proteínu a potom sa môže sekvenovaná oblasť použiť analogicky ako sekvenované, trypsínom vyštiepené, fragmenty pri nasledujúcom postupe. Oligonukleotidové próby sa syntetizujú použitím genetického kódu, aby boli predvídané všetky možné sekvencie kódujúce aminokyselinové sekvencie sekvenovaného fragmentu alebo fragmentov. Prednostne sa ako próby vytvorí niekoľko degenerovaných sekvencií. Gén Mpl ligandu sa identifikuje použitím týchto prób pri screeningu cicavčej genómovej knižnice alebo iného zdroja. Alternatívne sa môže mRNA z bunkového zdroja Mpl ligandu použiť na vytvorenie cDNA knižnice, ktorá sa dá podrobiť sereeningu s próbami s cieľom identifikácie cDNA kódujúcej Mpl ligandový polypeptid. Ďalej sa dá použiť tiež PCR technika na predĺženie cDNA sekvencie. Pri tom sa používajú vhodné priméry.

Použitím týchto prób na sereening genómovej knižnice sa získa DNA kloň. Aby sa získal kloň s plnou dĺžkou, môžu sa próby založené na získanej sekvencii DNA použiť pre nový sereening knižnice a hybridizáciu k úplnej sekvencii ξ?ΝΑ Mpl ligandu.

a*

Humánnu cDNA pre Mpl ligand je tiež možné získať ’· subklonovaním humánneho genómového klonu s plnou dĺžkou do expresného vektora, jeho transfekciou do buniek COS, prípravou cDNA knižnice z takto transfekovaných buniek COS a hybridizačným sereeningom na cDNA Mpl ligandu. Po identifikácii celej cDNA je možné celú cDNA alebo jej časť kódujúcu aktívny fragment Mpl ligandu zaviesť do ktoréhokoľvek z rôznych expresných vektorov s cieľom vytvorenia expresného systému pre Mpl ligand alebo jeden alebo viac jeho fragmentov.

Pri takomto použití rekombinantných techník sa získajú prednostné sekvencie DNA kódujúce Mpl ligandový polypeptid. Do rozsahu tohto vynálezu patria tiež tie sekvencie DNA, ktoré nie sú asociované so sekvenciami DNA kódujúcimi iné proteíny (tj. sú izolované). Takéto sekvencie kódujú expresiu Mpl ligandových polypeptidov s aktivitou Mpl ligandu (ako je napríklad rast a/alebo vývoj megakaryocytov). Tieto sekvencie DNA zahrnujú sekvencie kódujúce celý Mpl ligand alebo jeho fragment a sekvencie, ktoré hybridizujú, prednostne pri stringentných hybridizačných podmienkach sekvenciám cDNA (pozri T. Maniatis et * al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor

Laboratory (1982), str. 387 až 389).

Ako príklady stringentných hybridizačných podmienok je možné uviesť hybridizáciu v 4 x SSC pri 62 až 67 °C s následným premývaním 0,1 x SSC pri 62 až 67 °C počas asi 1 hodiny. Ako alternatívny príklad stringentných hybridizačných podmienok je možné uviesť hybridizáciu v 45 až 55% formamide, 4 X SSC pri 40 až 45 °C.

Sekvencie DNA hybridižujúce k sekvenciám Mpl ligandu pri relaxovaných hybridizačných podmienkach a kódujúce Mpl ligandové peptidy s biologickými vlastnosťami Mpl ligandu tiež kódujú nové Mpl ligandové polypeptidy podľa tohto vynálezu. Ako príklady takýchto hybridizačných podmienok s relaxovanou stringenciou je možné uviesť 4 X SSC pri 45 až 55 °C alebo,, hybridizáciu s 30 až ·- 40% formamidom pri 40 až 45 °C. Tak napríklad sekvencia DNA, ktorá sa delí o oblasti signifikantnej homológie, napríklad *’ miesta glykozylácie alebo miesta disulfidových väzieb, so sekvenciami Mpl ligandu a ktorá kóduje proteín vykazujúci jednu alebo viac biologických vlastností Mpl ligandu, jasne kóduje Mpl ligandový polypeptid, aj keď sa takáto sekvencia DNA stringentne nehybridizuje k sekvencii alebo sekvenciám Mpl ligandu.

Alelové variácie (zmeny báz v populácii určitého druhu, ku ktorým dochádza v prírode a ktoré môžu, alebo nemusia mať za následok zmenu aminokyseliny) sekvencii kódujúcich sekvencie peptidov Mpl ligandu tiež patria do rozsahu tohto vynálezu, podobne ako príslušné analógy alebo deriváty. Do rozsahu tohto vynálezu patria podobne tiež sekvencie DNA kódujúce polypeptidy Mpl ligandu, ktoré sa však odlišujú využitím v kodóne v dôsledku degenerácií genetického kódu alebo variácií sekvencie DNA Mpl ligandu spôsobených bodovými mutáciami alebo indukovaných modifikáciami s cieľom zvýšenia aktivity, polčasu rozpadu alebo produkcie polypeptidov, ktoré sú nimi kódované.

«

Použitím klonovacieho postupu uvedeného v príklade 11 ’ (ďalej) boli získané aminokyselinové a cDNA sekvencie humánnych proteínov MGDF-1, MGDF-2 a MGDF-3, ktoré sú publikované v tomto popise. MGDF-1 zahrnuje aminokyseliny 22 až 353 na obr. 11, teda celkovo 332 aminokyselín. MGDF-2 predstavuje obmedzenú časť MGDF-1, teda aminokyseliny 22 až 195 z obr. 11. MGDF-2 teda obsahuje 174 aminokyselín. MGDF-3 zahrnuje aminokyseliny 22 až 289 z obr. 12, takže obsahuje 268 aminokyselín, v každom z publikovaných MGDF je súčasťou molekuly polypeptidu podľa tohto vynálezu tiež signálny peptid (aminokyseliny l až 21 na obr. 11 a 12). Tento signálny peptid sa prednostne odstraňuje, aby došlo k rastu megakaryocytov a vývoji ich aktivity. Prehľadne sa dá MGDF 1 až 3 definovať takto:

MGDF-1	aminokyseliny	22	až	353	obr.	11
MGDF-2	aminokyseliny	22	až	195	obr.	11
MGDF-3	aminokyseliny	22	až	28¾	obr.	12

%

Pri skúškach uvedených v tomto popise sú MGDF-1 a MGDF-2 účinné, zatiaľ čo MGDF-3 je neúčinný.

Na základe dát vzťahujúcich sa na aktivitu, ktoré sú uvedené v tomto popise, bola vytvorená hypotéza, že humánny MGDF je exprimovaný in vivo, ako v podstate inaktívny alebo menej aktívny polypeptidový prekurzor obsahujúci premenlivé C-terminálne aminokyseliny. Po odštiepení C-terminálnych aminokyselín (ako aj signálneho peptidu) si upravená forma molekuly zachová aktivitu alebo sa stáva aktívnejšia. Na základe tejto hypotézy sa predpokladá, že MGDF-1 môže vyžadovať úpravu (napríklad štiepenie proteázou), aby vykazoval aktivitu. Túto hypotézu potvrdzuje skutočnosť, že obmedzená forma MGDF-1 (tj. MGDF-2) je účinná.

Kondiciované médium z buniek 293 humánnej obličky (Invitrogen) transfekovaných MGDF-1 génom vykazuje aktivitu pri skúške s bunkami podľa príkladu 4. Na druhej strane, v iných bunkových líniách, napríklad bunkách 32-D, nebola pozorovaná • žiadna aktivita, pokiaľ ide o túto molekulu. Predpokladá sa, že to môže znamenať, že bunky 293 sú schopné spracovať (upraviť) ' molekulou MGDF-1, pravdepodobne jej obmedzením, takže molekula, ktorá je prevážne zodpovedná za aktivitu, má obmedzenú formu. Bunky 32-D nie sú schopné molekulu takto upravovať.

S ohľadom na túto hypotézu sa môžu rôzne aktívne molekuly získať obmedzením sekvencie uvedenej pre MGDF-1 (obr. ll). Štruktúrne znaky konzervované v skupine cytokínov, ako je napríklad erytropoetín, (EPO), zahrnujú štyri &-helikálne zväzky a štyri cysteíny. Pokiaľ ide najviac C-terminálny prvok z funkčne esenciálnych štruktúr.

MGDF-1 sú teda ktorékoľvek o sekvencie MGDF-1, je Cys 172 týchto evolučné konzervovaných Prednostné obmedzené varianty z variantov, ktoré obsahujú

C-terminálne obmedzenie od aminokyseliny 173 do aminokyseliny 353 (súčasne s odštiepením signálneho peptidu). Prednostne bude zo sekvencie MGDF-1 odstránených 50 až 185, osobitne potom 90 až 172, aminokyselín od C-konca. Ako je uvedeqé v tomto popise, za. signálny peptid je považovaný peptid s dĺžkou 21 aminokyselín. Signálny peptid však môže obsahovať 23 aminokyselín vztiahnuté na sekvenciu MGDF-l. V dôsledku toho patria do rozsahu tohto vynálezu tiež polypeptidy zodpovedajúce tu popísaným polypeptidom, ktoré však začínajú v polohe 24 na obr. 11 alebo 12.

Ďalej sú uvedené niektoré špecifické prednostné varianty MGDF-1, ktoré by mohli vykazovať účinnosť (tj. schopnosť vyvolávať rast megakaryocytov a/alebo krvných doštičiek alebo vykazovať inhibičnú/stimulačnú účinnosť na prírodný receptor):

MGDF-4	aminokyseliny
MGDF-5	aminokyseliny
MGDF-6	aminokyseliny
MGDF-7	aminokyseliny
MGDF-8	aminokyseliny
MGDF-11	aminokyseliny

22	až	172	obr.	11
22	až	177	obr.	11
22	až	191	obr.	11
22	až	198	obr.	11
22	až	265	obr.	11
22	až	184	obr.	11

V niektorých klonoch aminokyseliny 133 až 136 v sekvencii MGDF-1 chýbajú, takže sekvencie, ktoré zodpovedajú vyššie uvedeným sekvenciám, pričom v nich však niektoré aminokyseliny chýbajú (a počet aminokyselín pri C-konci je znížený o 4) môžu byť tiež účinné.

V jednom klonu, ktorý má terminačný kodón v polohe 192, bol nájdený zvyšok Ala namiesto zvyšku Thr, ako to je znázornené v polohe 191 na obr. 11. Do rozsahu vynálezu teda patria tiež varianty molekúl MGDF, v ktorých sa v polohe 191 nachádza Ala namiesto Thr.

MGDF-3 vzniká odstránením sekvencie, ktorá je tu označovaná skratkou IVS-5 (intervenčná sekveneia-5), keďže táto sekveneia je upravená zostrihom v piatom exóne tejto sekvencie. Keďže sa 5' koniec IVS-5 sekvencie nachádza v kodóne, jej odstránenie má za následok rámcový posun v zvyšnej sekvencii MGDF, ktorý sa dá pozorovať od východiskovej polohy 160 ^4GDF-3 do konca tejto.

*- molekuly.

Pokiaľ ide o MGDF-3, nebola po transfekcii do buniek 293 a skúšaní kondiciovaného média na aktivitu bunkovou skúškou popísanou v príklade 4 zistená až doteraz žiadna aktivita. Zrejme sú bunky 293 na rozdiel od MGDF-1 neschopné previesť MGDF-3 na účinnú formu. Napriek tomu však vypustením C-terminálnych aminokyselín z MGDF-3 by sa snáď tiež mohlo dospieť k účinnej forme (tento predpoklad sa zakladá na vyššie uvedenej hypotéze o C-terminálnom obmedzení). Tak napríklad C-terminálne obmedzenie MGDF-3 od aminokyseliny 40 do aminokyseliny 102 môže mať za následok dosiahnutie účinnosti. Prednostne sa odštiepujú aminokyseliny 50 až 90. Ako dve špecifické varianty MGDF-2 je možné uviesť

MGDF-9 aminokyseliny

MGDF-10 aminokyseliny až 179 obr. 12 22 až 190 obr. 12

Vo všetkých Mpl ligandoch uvedených v tomto popise, vrátane • príkladných MGDF uvedených vyššie, môže byť pri N-konci prítomný metionylový zvyšok,najmä ak sa tieto polypeptidy exprimujú v bakteriálnych hostiteľských bunkách.

Polypeptidy Mpl ligandu je tiež možné získať pomocou konvenčnej chemickej syntézy. Spôsoby konštrukcie polypepidov podľa vynálezu pomocou syntetických postupov sú známe odborníkom v tomto obore. Synteticky skonštruovaná sekvencie polypeptidu Mpl ligandu môže vykazovať biologické vlastnosti zhodné s vlastnosťami Mpl ligandu vďaka tomu, že vykazuje rovnaké primárne, sekundárne alebo terciárne štruktúrne a konformačné charakteristiky. Takéto polypeptidy sa dajú teda použiť ako biologicky aktívne alebo imunoligické náhrady za prírodné purifikované polypeptidy Mpl ligandu pri terapeutických a imunologických procesoch.

Modifikácie polypeptidov alebo sekvencií DNA kódujúcich Mpl ligand môže odborník v tomto obore uskutočniť pomocou známych *· techník. Modifikácie sekvencií Mpl ligandu, ktoré sú predmetom záujmu, môžu zahrnovať náhradu, vsunutie alebo vypustenie ' zvoleného aminokyselinového zvyšku z kódujúcich sekvencií. Techniky mutagenézy, ktoré sú vhodné na takéto nahradenie, vsunutie alebo vypustenie aminokyselinového zvyšku sú odborníkom v tomto obore dobre známe (pozri napríklad US patent č. 4 518 584). Prednosť sa dáva konzervatívnym zmenám v rozmedzí od l. do 20. aminokyseliny. Prednostné peptidy je možné vytvárať použitím proteolytických enzýmov alebo priamou chemickou syntézou. Takto získané varianty patria do rozsahu významu polypeptidy Mpl ligandu (či Mpl ligandové polypeptidy) a polynukleotidy Mpl ligandu podľa vynálezu.

Špecifické mutácie sekvencií Mpl ligandového polypeptidu môžu zahrnovať modifikácie glykozylačného miesta (napríklad serínu, treonínu alebo asparagínu). K absencii glykozylácie alebo len k čiastočnej glykozylácii dochádza substitúciou alebo deléciou aminokyseliny v akomkoľvek glykozylačnom rozpoznávacom mieste pripojenom k asparagínu alebo v akomkoľvek mieste « molekuly, ktoré je modifikované adíciou O-pripojeného sacharidu. Glykozylačné rozpoznávacie miesto pripojené k asparagínu zahrnuje * tripeptidovú sekvenciu, ktorá je špecificky rozpoznávaná príslušnými bunkový glykozylačnými enzýmami. Tieto tripeptidové sekvencie majú zloženie buď Asn-Xaa-Thr alebo Asn-Xaa-Ser, kde Xaa môže byť akákoľvek aminokyselina odlišná od Pro. Rôzne aminokyselinové substitúcie alebo delécie v jednej alebo obidvoch z polôh 1 a 3 glykozylačného rozpoznávacieho miesta (a/alebo delécie aminokyseliny v polohe 2) má za následok absenciu glykozylácie v modifikovanej tripeptidovej sekvencii. Expresia takto pozmenených nukleotidových sekvencii má za následok vznik variantov, ktoré v tomto mieste nie sú glykozylované.

Prídavné analógy/deriváty MGDF

Iné analógy a deriváty sekvencii MGDF (Mpl ligandov), ktoré si môžu zachovať aktivitu MGDF (Mpl ligandu) buď úplne alebo čiastočne, je tiež možné pripraviť použitíiji techník uvedených v tomto popise. Tiež tieto modifikácie patria do rozsahu vynálezu.

Konkrétnejšie sa dá uviesť, že do rozsahu vynálezu vo všeobecnosti patria chemicky modifikované látky MGDF a spôsoby ich prípravy a použitia. Ako je zrejmé z tohto popisu, modifikácie MGDF a zlepšenia ich vlastností sú možné.

Jedným z aspektov tohto vynálezu je MGDF produkt obsahujúci MGDF protein pripojený k aspoň jednému vodorozpustnému polymérnemu zvyšku.

Iným aspektom tohto vynálezu je MGDF produkt, v ktorom je MGDF protein pripojený k aspoň jednej polyetylénglykolovej molekule.

Ďalším aspektom tohto vynálezu sú MGDF molekuly pripojené k aspoň jednej molekule poyletylénglykolu prostredníctvom acylového alebo alkylového spojenia.

Pegylácia MGDF sa môže uskutočňovať použitím akýchkoľvek pegylačných reakcií, ktoré sú známe v tomto obore (pozri napríklad: Focus on Growth Factors 3 (2): 4 až 10 (1992), EP 0 154 316, EP 0 401 384 a ďalšie publikácie vzťahujúce sa na pegyláciu uvedenú v týchto citáciách. Pegylácia sa prednostne uskutočňuje prostredníctvom acylačnej reakcie alebo alkylačnej reakcie použitím reaktívnej polyetylénglykolovej molekuly (alebo analogickej molekuly reaktívneho vodorozpustného polyméru). Tieto prednostné spôsoby derivátizácie polyetylénglykolu budú podrobnejšie popísané ďalej.

Acylácia

Pegylácia acyláciou vo všeobecnosti zahrnuje reakciu reaktívneho esterového derivátu polyetylénglykolu (PEG) s MGDF proteínom. Pri pegylácii MGDF sa môže použiť akákoľvek známa alebo aj dodatočne objavená reaktívna PEG molekula. Prednostný aktivovaný PEG ester je PEG esterifikovaijý N-hydroxy suke í nimid »· (NHS) . Pod označením acylácia, ako sa používa v tomto popise, sa bez akéhokoľvek obmedzenia rozumie vytvorenie nasledujúcich *· typov väzieb medzi MGDF a vodorozpustným polymérom, ako je PEG: amidových, karbamátových, uretánových a podobných väzieb (pozri Bioconjugate Chem. 5: 133 až 140 (1994)). Reakčná podmienky je možné voliť zo súboru podmienok, ktoré sú známe alebo ktoré budú ešte vyvinuté v obore pegylácie, ale nemali by sa používať podmienky (teplota, rozpúšťadlá a pH), ktoré by mali za následok inaktiváciu MGDF, ktorý má byť modifikovaný. Reakčné podmienky, ktoré sú vo všeobecnosti vhodné pre pegyláciu MGDF sú popísané ďalej. Príkladná reakcia s NHS esterom monometoxy-PEG je znázornená na obr. 14.

Pegyláciou prostredníctvom acylácie sa vo všeobecnosti získa polypegylovaný produkt MGDF, v ktorom sú epsilon-aminoskupiny lyzinu pegylované prostredníctvom acylovej spojovacej skupiny. Prednostnou spojovacou skupinou je amidová skupina. Tiež sa dáva prednosť tomu, aby bol produkt v podstate len (napríklad viac ako z 95 %) mono-, di- alebo tripegylovaný. Pri normálnych « okolnostiach však budú vznikať určité látky s vyšším stupňom pegylácie (až do maximálneho počtu lyzínových epsilon-aminokyselinových skupín MGDF plus jedna &-aminoskupina pri amínovom konci MGDF) v množstve závislom od špecificky použitých reakčných podmienok. Ak to je žiadúce, môžu sa z reakčnej zmesi oddeľovať pegylované látky s vyššou čistotou, predovšetkým oddelením nezreagovaných látok, pomocou štandardných purifikačných techník, ako je okrem iného dialýza, vysoľovanie, ultrafiltrácia, ionitová chromatografia, gélová filtračná chromatografia a elektroforéza.

Alkylácia

Pegylácia prostredníctvom alkylácie vo všeobecnosti zahrnuje reakciu terminálneho aldehydového derivátu PEG s proteínom, ako je MGDF, za prítomnosti redukčného Činidla. Tak ako pri acylácii popísanej vyššie sú vhodné reakčné podmienky popísané ďalej.

>

·> Pri pegylácii alkyláciou môže tiež vznikať polypegylovaný

MGDF. Príklad redukčnej alkylačnej reakcie použitím MGDF s cieľom ** získania polypegylovaného produktu je znázornený na obr. 15. Okrem toho je možné manipulovať s reakčnými podmienkami spôsobom uvedeným ďalej s cieľom favorizácie pegylácie v podstate do polohy &-aminoskupiny pri N-konci MGDF (tj. s cieľom získania monopegylovanej látky). Príklad redukčnej alkylačnej reakcie s MGDF s cielom získania monopegylovaného produktu je znázornený na obr. 16. Ako v prípade monopegylácie, tak aj v prípade polypegylácie sú PEG skupiny prednostne pripojené k proteínu prostredníctvom skupiny so vzorcom -CH₂-NH-. S ohľadom na štruktúru zvyšku -CH₂- je tento typ spojenia označovaný názvom alkylové spojenie.

Pri derivatizácii prostredníctvom redukčnej alkylácie s cielom výroby monopegylovaného produktu sa využíva odlišná reaktivita rôznych typov primárnych aminoskupín (lyzínu v porovnaní s N-koncom), ktoré sú k dispozícii pre derivatizáciu MGDF. Táto reakcia sa uskutočňuje pri hodnote pH (pozri ďalej) • umožňujúcej využiť rozdiely pK* medzi epsilon-aminoskupinami lyzínových zvyškov a alfa-aminoskupinou N-terminálneho zvyšku proteínu. Pri takejto selektívnej derivatizácii sa reguluje pripojenie vodorozpustného polyméru obsahujúceho reaktívnu skupinu, ako je napríklad aldehydová skupina, k proteínu: ku konjugácii s polymérom dochádza prevažne pri N-konci proteínu a nedochádza k významnej modifikácii iných reaktívnych skupín, ako napríklad aminoskupín lyzínového bočného reťazca. Jeden z dôležitých aspektov tohto vynálezu je v podstate homogénna príprava molekúl konjugátu monopolymér/MGDF proteín (týmto označením sa rozumie MGDF proteín, ku ktorému je polymérna molekula pripojená v podstate len (tj. z 95 % alebo viac) v jednej polohe. Konkrétnejšie je možné uviesť, že použitím polyetylénglykolu sa podľa vynálezu môže získať pegylovaný MGDF proteín, ktorý neobsahuje potenciálne antigénne spojovacie skupiny a v ktorom je polyetylénglykolová molekula priamo kopulovaná s MGDF proteínom.

* Prednostným aspektom tohto vynálezu je teda pegylovaný

MGDF, v ktorom je skupina alebo v ktorom sú skupiny PEG pripojené prostredníctvom acylových alebo alkylových skupín. Ako už bolo diskutované vyššie, takéto produkty môžu byť monopegylované alebo polypegylované (napríklad môžu obsahovať 2 až 6, prednostne 2 až 5 PEG skupín). Skupiny PEG sú obvykle pripojené k proteínu na alfa- alebo epsilon-aminoskupinách aminokyselín, ale vo všeobecnosti môžu byt skupiny PEG pripojené k akejkoľvek aminoskupine pripojenej k proteínu, ktorá je dostatočne reaktívna, aby bola pri vhodných reakčných podmienok pripojená k skupine PEG.

Polymérne molekuly použité ako pri acylácii, tak aj pri alkylačnej reakcii, je možné polymérov alebo ich zmesí, vodorozpustný, aby vo vodnom voliť zo súboru vodorozpustných Zvolený polymér by mal byť prostredí, ako je fyziologické prostredie, nedošlo k vyzrážaniu proteínu, ku ktorému má byť tento polymér pripojený. Zvolený polymér by mal byť modifikovaný tak, aby obsahoval jedinú reaktívnu skupinu, ako napríklad jedinú reaktívnu esterovú skupinu (v prípade acylácie) alebo aldehydovú skupinu (v prípade polymerizácie regulovať Prednostný reaktívny propiónaldehyd, ktorý alkylácie), aby bolo možné stupeň pomocou metód uvedených v tomto popise. PEG aldehyd je polyetylénglykolje stály vo vode, alebo jeho monoalkoxyderivát s 1 až 10 atómami uhlíka v alkoxylovej časti alebo aryloxyderivát (pozri US patent č. 5 252 714). Tento pomer môže byť rozvetvený alebo nerozvetvený. Ak sa má konečný produkt použiť na terapeutické účely, mal by byť polymér farmaceutický vhodný. Vodorozpustný polymér je možné voliť zo súboru zahrnujúceho napríklad polyetylénglykoi, monometoxypolyetylénglykol, dextrán, poly(N-vinylpyrolidón), polyetylénglykoi, homopolyméry propylénglykolu, kopolyméry propylénoxidu a etylénoxidu, polyoxyetylované polyoly (napríklad glycerol) a polyvinylalkohol. Pre acylačné reakcie by mal zvolený polymér obsahovať jedinú reaktívnu esterovú skupinu a pre redukčnú alkyláciu by mal zvolený polymér obsahovať jedinú reaktívnu aldehydovú skupinu. Obvykle sa vodorozpustjié polyméry nevolia zo.

* súboru glykozylovych zvyškov, ktoré sa vyskytujú v prírode, keďže sa obvykle účelnejšie pripravujú v cicavčích rekombinantných expresných systémoch. Polymér môže mať akúkoľvek molekulovú hmotnosť a môže byť rozvetvený alebo nerozvetvený.

Z vodorozpustných polymérov, ktoré sú vhodné na použitie podľa vynálezu, sa osobitná prednosť dáva polyetylénglykolu (skrátene PEG). Pod označením polyetylénglykoi sa tu rozumie akákoľvek forma PEG, ktorá bola použitá na derivatizáciu iných proteínov, ako je napríklad monoalkoxypolyetylénglykol s 1 až 10 atómami uhlíka v alkoxylovej časti alebo aryloxypolyetylénglykol.

Pod označením MGDF sa v tomto popise rozumie ktorákoľvek z rôznych foriem MGDF uvedených v tomto popise. Do rozsahu tohto pojmu teda patrí napríklad MGDF s plnou alebo obmedzenou dĺžkou a to ako glykozylovanej, tak aj neglykozylovanej formy. Prednostné molekuly MGDF pre derivatizáciu sú uvedené ďalej.

MGDF-1	aminokyseliny	22	až	353	obr.	11
MGDF-2	aminokyseliny	22	až	195	obr.	11
MGDF-4	aminokyseliny	22	až	172	obr.	11
MGDF-11	aminokyseliny	22	až	184	obr.	11
MGDF-12	aminokyseliny	22	až	353	obr.	11
MGDF-13	aminokyseliny	22	v az	195	obr.	11
MGDF-14	aminokyseliny	22	v az	172	obr.	11
MGDF-15	aminokyseliny	22	až	184	obr.	11

Číslovanie sa vo všetkých prípadoch vzťahuje na číslovanie aminokyselín podľa obr. 11.

Vyššie uvedené prednostné druhy MGDF môžu byt glykozylované, neglykozylované alebo deglykozylované a prednostne sú neglykozylované. Je možné ich pripravovať pomocou rekombinantných postupov ako v bakteriálnych (napríklad E. coli), tak aj v cicavčích (napríklad CHO) bunkách.

Ďalej sú uvedené prednostné podskupiny chemicky derivátizovaných molekúl podľa vynálezu (vždy ide o mono- alebo polypegylovaný produkt, napríklad o produkt obsahujúci 2 až 4 PEG zvyšky pripojené prostredníctvom acylových alebo alkylových skupín):

pegylovaný MGDF-11 pegylovaný MGDF-4 a pegy1ovaný MGDF-2.

Chemická derivatizácia sa všeobecne môže uskutočňovať pri akýchkoľvek vhodných podmienkach pre reakcie biologicky účinných látok s reaktívnymi polymérmi. Spôsoby výroby pegylovaného MGDF budú vo všeobecnosti zahrnovať stupeň a) reakcie polypeptidu MGDF s polyetylénglykolom (ako napríklad reaktívnym alebo aldehydovým derivátom PEG) pri podmienkach, pri ktorých dochádza k pripojeniu k MGDF jednej alebo viacerých skupín PEG a b) stupeň izolácie reakčného produktu alebo produktov. Optimálne reakčné podmienky acylačných reakcií sa budú obvykle určovať prípad od prípadu, v závislosti od známych parametrov a požadovaného výsledku. Tak napríklad čím bude väčší pomer PEG:proteín, tým vyššie bude percentné zastúpenie polypegylovaného produktu.

«

Redukčné alkylácie s cieľom výroby v podstate homogénnej populácie molekúl konjugátu monopolymér/MGDF proteín budú v podstate zahrnovať stupeň a) reakcie MGDF proteínu s reaktívnou molekulou PEG pri redukčných alkylačných podmienkach, pri hodnote pH vhodnej pre selektívnu modifikáciu alfa-aminoskupiny pri amínovom konci MGDF proteínu a b) stupeň izolácie reakčného produktu alebo produktov.

Pod označením podmienky redukčnej alkylácie pri výrobe v podstate homogénnej populácie molekúl konjugátu monopolymér/MGDF proteín sa rozumejú podmienky umožňujúce selektívne pripojenie vodorozpustnej polymérnej látky k N-koncu MGDF. Takéto reakčné podmienky obvykle využijú rozdiely v pK^ medzi aminoskupinami lyzínu a alfa-aminoskupinou pri N-konci (pK_a predstavuje hodnotu pH, pri ktorej je 50 % aminoskupín p£Otónovaných a 50 % * neprotónovaných). Hodnota pH tiež ovplyvňuje použitý pomer polyméru k proteínu. Vo všeobecnosti platí, že pri nižšom pH je nežiadúci vyšší nadbytok polyméru vzhľadom na proteín (tj. čím menej je reaktívna N-terminálna alfa-aminoskupina, tým viac polyméru je potrebného na dosiahnutie optimálnych podmienok). Pri vyššej hodnote pH nemusí byť pomer polymér:proteín tak vysoký (ak sú skupiny reaktívnejšie, je potrebný menší počet polymérnych skupín). Pre ciele tohto vynálezu bude hodnota pH obvykle ležať v rozmedzí od 3 do 9, prednostne od 3 do 6.

Ďalším dôležitým parametrom je molekulová hmotnosť polyméru. Všeobecne platí, že čím je molekulová hmotnosť polyméru vyššia, tým menší počet molekúl polyméru sa môže k proteínu pripojiť. Pri optimalizácii reakčných parametrov je podobne nutné vziať do úvahy tiež stupeň rozvetvenia polyméru. Vo všeobecnosti platí, že čím je molekulová hmotnosť vyššia (alebo čím vyšší je stupeň rozvetvenia), tým vyšší je pomer polymér:proteín. Pri pegylačných reakciách podľa vynálezu sa obvykle dáva prednosť priemernej molekulovej hmotnosti v rozmedzí od asi 2 kDa do asi 100 kDa (pod • pojmom asi sa rozumie rozmedzie ΐ 1 kDa). Prednostné rozmedzie molekulovej hmotnosti je asi 5 až asi 50 kDa, s výhodou asi 12 až asi 25 kDa. Pomer vodorozpustného polyméru k MGDF proteínu bude obvykle ležať v rozmedzí od 1:1 do 100:1, prednostne (v prípade polypegylácie) od 1:1 do 20:1 a (v prípade monopegylácie) od 1:1 do 5:1.

Použitím vyššie uvedených podmienok sa pri redukčnej alkylácii dosiahne selektívne pripojenie polyméru k akémukoľvek

MGDF proteinu obsahujúcemu alfa-aminoskupinu pri amínovom konci a získa sa v podstate homogénny konjugát monopolymér/MGDF proteín. Pod označením konjugát monopolymér/MGDF proteín, ako sa tu používa v tomto popise, sa rozumie MGDF proteín, ku ktorému je pripojená molekula polyméru. Konjugát monopolymér/MGDF proteín bude prednostne obsahovať molekulu polyméru v polohe N-konca a nie na lyzínových bočných aminoskupinách. Vyrobený produkt bude obsahovať prednostne obsahovať viac ako 90 % a s výhodou viac ako 95 % konjugátu monopolymér/MGDF proteín^, pričom zvyšok bude * tvorený nezreagovanými molekulami (tj. molekulami proteinu neobsahujúcimi zvyšok polyméru). V príkladoch uvedených ďalej je ilustrovaný produkt, ktorý je zložený z aspoň asi 90 % konjugátu monopolymér/proteín a asi 10 % nezreagovaného proteinu.

Biologickú aktivitu vykazuje konjugát monopolymér/proteín.

Na redukčnú alkyláciu podľa vynálezu by sa malo používať redukčné činidlo stále vo vodnom roztoku, ktoré je prednostne schopné redukovať len Schiffovu bázu vytvorenú pri začatí redukčnej alkylácie. Prednostné redukčné činidlá sa pritom volia zo súboru zahrnujúceho tetrahydroboritan sodný, nátriumkyanbórhydrid a komplexy dimetylamin/bóran, trimetylamín/bóran a pyridín/bóran. Osobitne vhodné redukčné činidlo je nátriumkyanbórhydrid.

Iné reakčné parametre, ako sú rozpúšťadlá, reakčné doby, teploty atď. a spôsoby purifikácie produktov, je možné určiť prípad od prípadu na základe publikovaných publikácií vzťahujúcich sa na derivatizáciu proteínov vodorozpustnými polymérmi (pozri publikácie citované v tomto popise). Príklady podrobností sú uvedené v príkladovej časti tohto popisu.

Môže byt žiadúce pripraviť zmes konjugátových molekúl polymér/proteín pomocou acylačných a/alebo alkylačných metód. Pritom je výhodné, že je možné zvoliť obsah konjugátu monopolymér/proteín, ktorý má byť v zmesi prítomný. Ak to je žiadúce, môže sa teda pripraviť zmes rôznych proteínov s rôznym počtom pripojených molekúl polyméru (tj. 2, 3, 4 atď.) a táto zmes sa môže zmiešať s konjugátom monopolymér/proteín pripraveným pomocou tu popísaných metód. Tak sa získa zmes s dopredu určeným obsahom konjugátu monopolymér/proteín.

Príklady realizácie uvedené ďalej ilustrujú prípravu chemicky modifikovaného MGDF a prípravu pegylovaného MGHDF acyláciou a alkyláciou. Inými aspektmi tohto vynálezu sú teda tieto spôsoby prípravy.

* Ako chorobné stavy, pri ktorých sa dá dosiahnuť úľava, alebo ktoré je možné modulovať podávaním produktov polymér/MGDF podľa tohto vynálezu, prichádzajú do úvahy chorobné stavy popísané vyššie v súvislosti so všeobecnými aplikáciami molekúl MGDF. V porovnaní s nederivatizovanými molekulami však môžu molekuly polymér/MGDF uvedené v tomto popise vykazovať prídavné účinnosti alebo zvýšené alebo znížené účinnosti alebo tiež iné charakteristiky.

Ďalším aspektom tohto vynálezu sú farmaceutické prostriedky na báze vyššie uvedených chemicky modifikovaných molekúl MGDF. Tieto farmaceutické prostriedky môžu obsahovať ktorúkoľvek z prísad, ktoré tu boli uvedené pre nederivatizované molekuly MGDF.

Keďže množstvo štúdií v súčasnej dobe prebieha, budú sa objavovať informácie vzťahujúce sa na úroveň dávkovania pri liečení rôznych podobných stavov rôznych pacientov a na základe týchto informácií bude odborník v tomto obore schopný určiť vhodné dávkovanie s ohľadom na terapeutický kontext, vek a “ celkový zdravotný stav príjemcu. Obvyklá dávka bude ležať v rozmedzí od 0,01 (*g/kg telesnej hmotnosti (počítané ako hmotnosť samotného proteínu bez chemickej modifikácie) až 300 f*g/kg (vztiahnuté na rovnaký základ). Prednostná dávka bude obvykle ležať v rozmedzí od 5 fv g/kg telesnej hmotnosti do 100 ^g/kg telesnej hmotnosti a osobitne výhodná dávka bude ležať v rozmedzí od 10 ^g/kg telesnej hmotnosti do 70 (a g/kg telesnej hmotnosti.

Predmetom vynálezu je ďalej tiež spôsob výroby polypeptidov

MGDF (tj. Mpl ligandu) alebo ich aktívnych fragmentov. Jeden z týchto spôsobov podľa vynálezu zahrnuje zavedenie cDNA kódujúcej polypeptid Mpl ligandu do expresného vektora s cieľom vytvorenia expresného systému pre Mpl ligand. Týmto vektorom sa transfekuje zvolená hostiteľská bunka a transfekovaná bunka sa kultivuje. Predmetom vynálezu je teda tiež spôsob kultivácie vhodnej bunky alebo bunkovej línie transfekovanej sekvenciou DNA kódujúcou expresiu polypeptidu Mpl ligandu pod kontrolou známych regulačných sekvencií. Regulačné sekvenčne zahrnujú fragmenty ' promotora, fragmenty terminátora a iné vhodné sekvencie, ktoré riadia a kontrolujú expresiu proteínu vo vhodnej hostiteľskej bunke. Exprimovaný faktor sa potom izoluje a purifikuje z kultivačného média (alebo z bunky, ak je exprimovaný intracelulárne) pomocou vhodných spôsobov, ktoré sú známe odborníkom v tomto obore. V súvislosti s polynukleotidmi/polypeptidmi podľa tohto vynálezu je tiež možné použiť metódy popísané v US patente číslo 5 272 071.

Ako vhodné bunky alebo bunkové línie prichádzajú do úvahy cicavčie bunky, ako sú bunky ovárií čínského chrčka (CHO) alebo bunky 3T3. Selekcia vhodných cicavčích hostiteľských buniek a spôsoby transformácie, kultivácie, amplifikácie, screeningu a prípravy produktu, vrátane jeho purifikácie, sú známe v tomto obore, pozri napríklad publikácie Gething a Sambrook, Náture 293: 620 až 625 (1981), Kaufman et al., Moli. Celí. Biol. 5 (7): 1750 až 1759 (1985) alebo Howley et al., US 4 419 446. Ako iné vhodné cicavčie bunkové línie je možné uviesť bunkové línie COS-1 a COS-7 a bunkové línie CV-1. Ako ďalšie príklady cicavčích * hostiteľských buniek je možné uviesť bunkové línie z primátov a bunkové línie z hlodavcov, vrátane transformovaných bunkových línií. Vhodné sú tiež normálne diploidné bunky, kmene buniek získané z in vitro kultivácie primárnych tkanív a tiež primárne explantáty. Vodné bunky môžu byť genotypicky deficientné, pokiaľ ide o selekčný gén, alebo môžu obsahovať dominantne pôsobiaci selekčný gén. Ako iné vhodné cicavčie bunkové línie (na ktoré sa však vynález neobmedzuje) je možné uviesť bunky HeLa, myšacie bunky L929, Línie 3T3 pochádzajúce zo švajčiarskych myší Balb-c alebo NIH a bunkové línie BHK alebo HaK pochádzajúce z chrčka.

Podobne sú ako hostiteľské bunky užitočné pri uskutočňovaní vynálezu tiež bakteriálne bunky. Ako hostiteľské bunky v oblasti biotechnológií sú napríklad dobre známe rôzne kmene E. coli (napríklad HB101, DH5&, DH10 a MC1061). Tiež sa pri tomto spôsobe môžu použiť rôzne kmene Bacillus subtilis, Pseudomonas spp., iné kmene Bacillus, Streptomyces sp., a pod.

Ako hostiteľské bunky pri expresii polypeptidov podľa vynálezu prichádzajú do úvahy tiež mnohé kmene kvasinkových buniek, ktoré sú známe odborníkom v tomto obore. Ak je to žiadúce, môžu sa ďalej podľa vynálezu použiť ako hostiteľské bunky tiež bunky hmyzu (pozri napríklad Miller et al., Genetic Engineering 8: 277 až 298 (1986) a citácie uvedené v tejto publikácii).

Predmetom vynálezu sú tiež rekombinantné molekuly alebo vektory pre použitie pri spôsobe expresie nových polypeptidov Mpl ligandu. Tieto vektory obsahujú sekvencie DNA Mpl ligandu, ktoré samé alebo v kombinácii s inými sekvenciami kódujú polypeptidy Mpl ligandu podľa vynálezu (so signálnymi peptidmi, alebo bez nich) alebo ich účinné fragmenty. Vektor použitý pri tejto metóde obsahuje tiež zvolené regulačné sekvencie v operatívnom spojení s kódujúcimi sekvenciami DNA podľa vynálezu, ktoré sú schopné riadiť ich replikáciu a expresiu v zvolených hostiteľských bunkách.

Jeden z vhodných vektorov je pXm, ktorý je osobitne žiadúci pre expresiu v bunkách COS (Y. C. Yang et al., Celí. 47: 3 až 10 (1986)). Iným vhodným vektorom, ktorý je žiadúci pre expresiu v cicavčích bunkách, napríklad v bunkách CHO je pEMC2Bl. Expresné faktory v cicavčích bunkách, ktoré sú tu popísané, je možné syntetizovať pomocou techník známych v tomto obore. Zložky týchto vektorov, napríklad replikóny, selekčné gény, enhancéry, promotory, a pod.je možné získať z prírodných zdrojov alebo syntetizovať pomocou známych postupov (pozri Kaufman et al., J.

Mol. Biol. 159: 511 až 521 (1982), Kaufman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 689 až 693 (1985). Alternatívne môže DNA vektora zahrnovať celý genóm hovädzieho papilómavírusu alebo jeho časť (Lusky et al., Celí. 36: 391 až 401 (1984)) a je možné ho replikovať v bunkových líniách, ako sú myšacie bunky C127 v podobe stabilného epizomálneho prvku. Transfekcia týchto vektorov do vhodných hostiteľských buniek môže mať za následok expresiu polypeptidov Mpl ligandu.

* Na tento cieľ je tiež možné použiť iné vhodné expresné vektory, z ktorých mnohé typy sú známe v obore cicavčej, hmyzej, kvasinkovej, fungálnej a bakteriálnej expresie.

Z chorôb alebo stavov, ktoré sa dajú liečiť použitím látok a prostriedkov podľa tohto vynálezu, je možné uviesť choroby zahrnujúce už existujúcu alebo očakávanú (napríklad v prípade plánovaného chirurgického zásahu) deficienciu megakaryocytov/krvných doštičiek. Takéto stavy budú obvykle dôsledkom deficiencie (dočasnej alebo stálej) aktívnych Mpl ligandov in vivo. Generickým označením pre deficienciu krvných doštičiek je trombocytopénia a preto spôsoby a prostriedky podľa tohto vynálezu sú všeobecne vhodné na liečenie trombocytopénie.

K trombocytopénii (deficiencii krvných doštičiek) môže dochádzať z rôznych dôvodov, napríklad v dôsledku chemoterapie alebo iných spôsobov liečenia použitím rôznych liečiv, radiačného liečenia alebo chirurgických zásahov, straty krvi pri nehodách. Trombocytopénia môže byť tiež spôsobená špecifickými chorobnými ‘ stavmi, ako je napríklad aplastická anémia, idiopatická trombocytopénia, metastáza nádorov, ktorá vedie k vývinu trombocytopénie, systemický lupus erythematosus, splenomegália, Fanconiho syndróm, deficiencia vitamínu B12, deficiencia kyseliny listovej, May-Hegglinova anomália, Wiskott-Aldrichov syndróm a paroxyzmálna nokturálna hemoglobinúria. Vo všetkých týchto prípadoch je možné použiť zlúčeniny a prostriedky podľa vynálezu. Trombocytopénia môže byť tiež dôsledkom určitých spôsobov liečenia AIDS (napríklad použitím AZT). Zvýšenie počtu krvných doštičiek môže byť tiež dôležité pri určitých poruchách hojenia rán.

S ohľadom na predvídanú deficienciu krvných doštičiek, napríklad v dôsledku plánovaného chirurgického zásahu, je možné Mpl ligand podľa vynálezu podávať niekoľko dní až niekoľko hodín pred tým, ako sú krvné doštičky potrebné. V akútnych situáciách, napríklad v prípade nehody alebo masívnej straty krvi, môže byť Mpl ligand podávaný spolu s krvou ^lebo purifikovanými ** doštičkami.

Mpl ligandy podľa tohto vynálezu môžu byť tiež užitočné pri stimulácii určitých typov buniek odlišných od megakaryocytov, ak sa zistí, že tieto bunky exprimujú Mpl receptor. Do rozsahu tohto vynálezu patrí tiež určenie podmienok, pri ktorých sú tieto bunky, ktoré exprimujú Mpl receptor, responzné voči stimulácii Mpl ligandom.

Molekuly MGDF, ktoré samé o sebe nie sú účinné pri skúškach aktivity uvedených v tomto popise, môžu byť užitočné ako modulátory (napríklad inhibítory alebo stimulanty) Mpl receptorov in vitro alebo in vivo.

Pri liečení vyššie uvedených chorôb alebo stavov sa polypeptidy podľa tohto vynálezu môžu používať samé alebo v kombinácii s inými cytokínmi, rozpustnými Mpl receptormi, hematopoetickými faktormi, interleukínmi, rastovými faktormi alebo protilátkami.

Ďalším aspektom tohto vynálezu sú preto terapeutické prostriedky na liečenie vyššie uvedených chorôb alebo stavov. Tieto prostriedky obsahujú terapeuticky účinné množstvo polypeptidu Mpl ligandu alebo jeho terapeuticky účinného fragmentu v zmesi s farmaceutický vhodným nosičom. Ako nosič prichádza do úvahy voda (v prípade injekčných prostriedkov), ktorá je prednostne doplnená inými látkami obvyklými pri výrobe roztokov určených na podávanie cicavcom. Obvykle sa Mpl ligand na terapeutické ciele podáva vo forme prostriedku obsahujúceho purifikovaný protein v spojení s jedným alebo viacerými fyziologicky vhodnými nosičmi, excipientmi alebo riedidlami. Ako príklady vhodných nosičov je možné uviesť neutrálny purifikovaný roztok chloridu sodného alebo roztok chloridu sodného zmiešaný so sérovým albumínom. Prednostne sa produkt spracúva na prostriedok vo forme lyofilizátu pri spolupoužití vhodných excipientov (napríklad sacharózy). Podľa potreby je možné pridávať aj iné štandardné nosiče, riedidlá a excipienty. Qko príklady je možné uviesť Tris pufer s pH 8,0 a acetátový pufer s pH 5,0, pričom posledné uvedené pufre môžu ďalej obsahovať sorbitol.

Prostriedky podľa vynálezu je možné systematicky podávať parenterálnou cestou. Alternatívne je možné ich podávať intravenózne alebo podávanie, môžu byť forme apyrogénnych subkutánne. Ak sa používa systematické terapeutické prostriedky podľa vynálezu vo parenterálne vhodných vodných roztokov. Príprava takýchto farmaceutický vhodných proteínových roztokov s riadenou hodnotou pH, izotonicitou, stabilitou a pod. je v rozsahu skúseností bežného od odborníka v tomto obore.

Dávkovací režim pri liečení uvedených chorôb a stavov bude určovať ošetrujúci lekár, ktorý bude brať do úvahy rôzne faktory modifikujúce pôsobenie liečiv podľa vynálezu, ako je napríklad vek, stav, telesná hmotnosť, pohlavie a strava pacienta, závažnosť prípadnej infekcie, doba podávania a iné klinické faktory. Obvyklý denný režim by mal zahrnovať podávanie 0,1 až 1000 (*g proteínu Mpl ligandu alebo jeho fragmentu, vztiahnuté na * kg telesnej hmotnosti.

Terapeutické metódy, prostriedky a polypeptidy podľa tohto vynálezu je možné používať samotné alebo v kombinácii s inými cytokínmi, rozpustenými Mpl receptormi, hematopoetickými faktormi, interleukínmi, rastovými faktormi alebo protilátkami pri liečení chorobných stavov, ktoré sú charakterizované aj inými symptómami okrem deficiencie krvných doštičiek. Predpokladá sa, že molekula Mpl ligandu bude užitočná pri liečení foriem trombocytopénie v kombinácii so všeobecnými stimulátormi hematopoézy, ako je IL-3 alebo GM-CSF. Spolu s Mpl ligandom sa tiež môžu používať iné megakaryocytické stimulačné faktory, tj. meg-CSF, faktory kmeňových buniek (SCF), faktor inhibitujúci leukémiu (LIF), onkostatín M (OSM) alebo iné molekuly so stimulačnou účinnosčou na megakaryocyty. Ako prídavné cytokíny alebo hematopoetické faktory vhodné na takéto spoločné podávanie je možné uviesť IL-1 &, IL-1 |i>, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-11, faktor stimulujúci kolónie-1 (CS£-l), GM-CSF, faktor, stimulujúci kolónie granulocytov (G-CSF), EPO, interferón-& (IFN-&), IFN-ρ» alebo IFN-gama. Ďalej môže byt užitočné podávať, buď súčasne alebo postupne, účinné množstvo rozpustného cicavčieho receptoru Mpl, ktorý vykazuje pravdepodobný účinok na fragmentáciu megakaryocytov na krvné doštičky, ak megakaryocyty dosiahli maturovanú formu. Podávanie Mpl ligandu (s cieľom zvýšenia počtu maturovaných megakaryocytov) s následným podávaním rozpustného Mpl receptoru (s cieľom inaktivácie ligandu a umožnenia produkcie krvných doštičiek z maturovaných megakaryocytov) sa považuje za osobitne účinný prostriedok stimulácie tvorby krvných doštičiek. Vyššie uvedené dávkovanie je potom potrebné prispôsobiť s cieľom kompenzácie vyššie uvedených prídavných zložiek terapeutického prostriedku. Pokrok dosiahnutý pri liečení pacienta je možné monitorovať pomocou obvyklých metód.

Iné použitia nových polypeptidov podľa vynálezu zahrnujú vývoj protilátok, ktoré sa vytvárajú štandardnými postupmi. Do rozsahu tohto vynálezu patria aj protilátky reagujúce s Mpl ligandmi podľa tohto vynálezu, ako aj reaktívne fragmenty takýchto protilátok. Tieto protilátky môžu byť polyklonálne, monoklonálne, rekombinantné, chimérické, jednoreťazcové a/alebo bišpecifické atď. Ako fragmenty týchto protilátok prichádzajú do úvahy akékoľvek protilátky, ktoré sú reaktívne voči Mpl ligandu podľa tohto vynálezu, ako je F_a)=>, F_eto, atď. Do rozsahu tohto vynálezu patria tiež hybridómy vytvorené tak, že sa Mpl ligand alebo jeho fragment podá ako antigén zvolenému cicavcovi a potom sa známym spôsobom uskutoční fúzie buniek (napríklad buniek sleziny) zvieraťa s určitými rakovinovými bunkami s cieľom vytvorenia imortalizovaných bunkových línií. Do rozsahu tohto vynálezu patria tiež spôsoby používané na vytvorenie takýchto bunkových línií a protilátky zamerané proti celému humánnemu polypeptidu Mpl ligandu alebo jeho častiam podľa tohto vynálezu.

Tieto protilátky sa môžu používať na terapeutické ciele, ako napríklad na inhibíciu väzby Mpl ligandu a jeho receptora. Tieto protilátky sa ďalej môžu používať pre ^n vivo a in vitro. diagnostické účely, ako napríklad (v značenej forme) na detekciu prítomnosti Mpl ligandu v telesnej tekutine.

Ďalej uvedené príklady slúžia na ďalšie objasnenie predloženého vynálezu. Tieto príklady majú výlučne ilustratívny charakter a rozsah vynálezu v žiadnom ohľade neobmedzujú. V príkladoch sú predovšetkým popísané prednostné realizácie tohto vynálezu. Štandardné metódy realizácie mnohých postupov popísaných v týchto príkladoch, ako aj vhodné alternatívne postupy sú uvedené v uznávaných príručkách molekulárnej biológie, ako je napríklad Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. vydanie,

Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987)	a Ausubel	et al.
(Eds.), Current Protocols In Molecular associates/Wiley Interscience, New York (1990). Príklady realizácie vynálezu Príklad 1 Aplastická psia plazma	Biology,	Greene
Heparinizovaná aplastická psia plazma	(»APK9)	alebo

normálna psia plazma (NK9) bola pripravená spôsobom popísaným v nasledujúcich publikáciách, s tou výnimkou, že bolo recipientom dodané, vztiahnuté na jednotlivca, ožiarenie v dávke 450 rad:

1. Mazur, E. a South, K., Exp. Hematol. 13: 1164-1172 (1985),

2. Arriaga, M., South, K., Cohen, J. L·., a Mazru, E. M. Blood 69: 486-492 (1987) a

3. Mazur,	E., Basilico, D., Newton, J. L.,	Cohen, J. L.,
Charland, (1990) .	C., Sohl, P.A., A	Narendran, A., Blood	76: 1771-1782
	Pri	klad 2
	W Skúška s humánnymi megakaryocytmi
APK9 stimulovať	a frakcionizovaná vývoj humánnych	APK9 bola skúšaná na schopnosť megakaryocytov z progenitorových

buniek CD34*. CD34-selektované bunky boli získané z buniek periférnej krvi spôsobom popísaným v Hokom M. H., Choi E., Nochol J. L., Hornkohl A., Arakawa T. a Hunt P., Molecular Biology of Haematopoiesis 3: 15 až 31, 1994 a boli inkubované v Dulbeccovom médiu modifikovanom podľa Iscova (IMDM, GIBCO, Grand Island, N.Y. USA) doplnenom 1 % Glutamine Pen-strep (Irwine, Sciencific,

Santa Anna, Kalifornia, USA) a 10 %heparinizovanej, na doštičky chudobnej, humánnej AB plazmy. Toto médium obsahovalo tiež 2-merkaptoetanol (10“⁴M), kyselinu pyrohroznovú (110 |ng/ml), cholesterol (7,8 ja g/ml), adenozín, guanín, cytidín, uridín, tymidín, 2-deoxycytozín, 2- deoxyadenozín a 2-deoxyguanozín (vždy 10 jAg/ml, Sigma) , humánny rekombinantný inzulín (10 f*g/ml) , humánny transferín (300 ^g/ml), sójové lipidy (1 %, Boehringer Mannheim), Indianapolis, IN, USA), základný humánny rekombinantný rastový faktor fibroblastov (2 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA, • USA), humánny rekombinantný epidermálny rastový faktor (15 ng/ml), rastový faktor pochádzajúci z krvných doštičiek (10 ng/ml), Amgen, Inc., Thousand Oaks, Kalifornia, USA.

CD34-selektované bunky boli prenesené do jamiek mikrotitračnej misky typu Terasaki (Vanguard, Inc., Neptúne, NJ, USA) v koncentrácii 2 X 10®/ml kultivačného média (konečný objem 15 |Al) . Bunky boli inkubované 8 dní pri 37 °C v komore s riadenou vlhkosťou a atmosférou obsahujúcou 5 % oxidu uhličitého vo vzduchu za prítomnosti 1 % glutaraldehydu s koktejlom monoklonálnych protilátok (anti-GPIb, anti-GPIIb (Biodesigne) a anti-GP-Ib (Dáko, Carpinteria, Kalifornia, USA). Imunitná reakcia boli vyvinutá použitím detekčného systému streptavidín-ji-galaktozidáza (HistoMark, Kirkegaard a Perry). Megakaryocyty identifikované na základe modrého zafarbenia boli spočítané v mikroskope s invertnou fázou pri 100-násobnom zväčšení. Výsledky sú vyjadrené ako priemerný počet megakaryocytov, vztiahnutý na jamku, ± smerodajná odchýlka (SEM) od strednej hodnoty. V niektorých prípadoch (ak sa stupeň, v akqm daná vzorka indukuje vývoj megakaryocytov normalizuje vzhľadom na pozitívnu kontrolnú APK9 pre tento pokus) sa dáta uvádzajú v jednotkách megakaryocytová (meg) jednotky/ml. Jedna takáto jednotka je definovaná ako množstvo látky, ktoré poskytne rovnaký počet megakaryocytov ako 1 (*1 APK9 štandardu. Aktivita sa považuje za aktivitu Mpl Ugandu, pokial je možné ju blokovať MPPL-X (rozpustný receptor Mpl) v koncentrácii 5 až 10 |*g/ml.

Ukazuje sa, že APK9 obsahuje faktor alebo faktory, ktoré v danom systéme stimulujú vývoj humánnych megakaryocytov. CD34-selektované bunky s 10% NK9 počas 8 dní vykazujú zanedbateľný počet modro zafarbených megakaryocytov, zatiaľ čo v prípade CD34-selektovaných buniek inkubovaných s 10% APK9 počas 8 dní je počet modro vyfarbených megakaryocytov veľmi vysoký.

Obr. 2 ukazuje, že zvyšujúce sa koncentrácie Mpl-X pridané ku kultúre humánnych megakaryocytov majú za následok zvyšujúcu sa inhibíciu vývoja megakaryocytov. Pri koncentrácii Mpl-X vyššej ako 5 (xg/ml je inhibícia úplná. Pri tomto pokuse sú CD34-selektované bunky stimulované 5 % APK9. To ukazuje, že pre vývoj humánnych megakaryocytov je potrebná aktivita, ktorá * interaguje s Mpl-X (predpokladaným Mpl ligandom). Ďalej z tohto výsledku vyplýva, že v samotnej APK9 je prítomný Mpl ligand.

Pokusy uskutočňované v súvislosti s vynálezom ďalej ukázali, že aktivita Mpl ligandu, ktorá je potrebná pre vývoj humánnych megakaryocytov, je obsiahnutá v APK9. APK9 (135 ml) bola zriedená šesťnásobne Iscovým médiom a nanesená na afinitný stĺpec Mpl-X.

Nenaviazaná látka (látka, ktorá pretiekla cez stĺpec) bola zhromaždená a pred skúšaním skoncentrovaná na pôvodný objem. Naviazaná látka bola elúovaná do 10 ml IM roztoku chloridu sodného a 20 % zhromaždeného eluátu bolo podrobených diafiltrácii a pred skúšaním štvornásobne skoncentrovaných. CD34-selektované bunky inkubované v samotnom médiu neposkytli megakaryocyty. Bunky inkubované v 5% APK9 (rovnaká várka, aká bola nanesená na stĺpec) viedli k vývinu megakaryocytov v počte 48 t 8, vztiahnuté na jamku. Bunky inkubované v 10% nenaviazanej Játke sa nevyvinuli na

- megakaryocyty. Bunky inkubované v 10% eluáte poskytli megakaryocyty v počte 120 * 44, vztiahnuté na jamku. Aktivita ako *' látky naviazanej na stĺpci, tak aj eluátu, bola pri skúšaní v podstate úplne inhibovaná Mpl-X s koncentráciou 5 fxg/ml.

Príklad 3

Transfekcia myšacieho alebo humánneho Mpl receptora do myšacej bunkovej línie

A. Myšací Mpl receptor cDNA myšacieho Mpl receptora s úplnou dĺžkou bola subklonovaná do expresného vektora obsahujúceho promotor transkripcie s pôvodom z ltr vírusu myšacieho sarkómu Moloney Y. 5 ^g tohto konštruktu a 1 pg selektovaného markérového plazmidu pWLNeo (Stratagene) bolo zavedených súčasnou elektroporáciou do IL-3 dependentnej myšacej bunkovej línie (32D, kloň 23, Greenberger et al., PNAS 80: 2931 až 2936 (1983)). Bunky boli 5 • dní kultivované, potom boli izolované a inkubované v selekčnom médiu s obsahom Genticínu (800 |\g/ml, G418, Sigma) a myšacieho IL-3 (1 ng/ml). Bunky, ktoré prežili, boli potom rozdelené na časti s obsahom vždy 2 x 10“ buniek a kultivované až do nárastu populácie, ktorá sa dal ďalej analyzovať. Šesť populácií bolo skúšaných na povrchovú expresiu Mpl receptoru pomocou analýzy FACS použitím polyklonálneho králičieho antipeptidového séra. Jedna populácia bola vybraná na triedenie použitím rovnakého antipeptidového séra, aké je uvedené vyššie. Jednobunkové klony rodičovskej bunkovej línie boli podrobené selekcii použitím rastu na 10% APK9 s Geneticínom. Po selekcii v APK9 (35 dní) boli bunky uchované v myšacom IL-3 s koncentráciou 1 ng/ml. Pre túto časť práce bol zvolený jeden zo subklonov, 1A6.1.

B. Humánny Mpl receptor

Sekvencia humánneho Mpl receptora s úplnou dĺžkou (Vigon I. et al., PNAS 89: 5640 až 5644 (1992) bola subklonovaná do.

* expresného vektora obsahujúceho promotor transkripcie s pôvodom z vírusu myšacieho sarkómu Moloney (rovnaký vektor, aký bol použitý v prípade myšacieho receptora) . 6 f\g tohto konštruktu a 6 f\g amfotrofického retrovírusového obalového konštruktu (Landau N. R., Littman D. R., J. Virology 66: 5110 až 5113 (1992)) bolo transfekovaných do 3 x 10^e buniek 293 použitím súpravy na transfekciu CaPO₄ mammalian transfecion kit (Stratagene). Rovnaké bunky boli podrobené retransfekcii po dvoch a potom opäť po štyroch dňoch. Deň nasledujúci po poslednej transfekcii, bol dňom, kedy boli bunky 293 kultivované spoločne s IL-3 dependentnou myšacou bunkovou líniou (32D, kloň 23, Greenberger et al., PNAS 80: 2931 až 2936 (1983)). Po 24 hodinách boli bunky izolované a umiestené na pás BSA gradientu (Path-o-cyte, Miles Inc.). Bunky boli expandované v myšacom IL-3 (1 ng/ml) a potom podrobené selekcii na rast v 20% APK9. Potom boli bunky vytriedené na povrchovú expresiu pomocou FACS použitím polyklonálneho králičieho antipeptidového séra. Tieto bunky boli potom použité na skúšanie.

• Príklad 4

Stanovenie Mpl ligandu v 1A6.1

Bunky 1A6.1 boli premytím zbavené kultúry IL-3 a prenesené (1000 buniek/celkový objem 15 ^1, vztiahnuté na jamku) do mikrotitračných misiek typu Terasaki s médiom alfa MEM (Gibco) doplneným 10 % fetálneho teľacieho séra (FCS), Geneticínom (800 (Ag/ml) a zmesou penicilínu a streptomycínu (pen/strep, 1 %,

Gibco). Skúšané vzorky boli pritom podrobené sériovému riedeniu v pomere 1:1. Po 48 hodinách bol pod mikroskopom stanovený počet životaschopných buniek v jamke. Jedna jednotka aktivity bola definovaná ako aktivita, ktorá sa dosiahne za prítomnosti 200 životaschopných buniek v jamke. Aktivita bola definovaná ako aktivita Mpl ligandu, ak bolo možné ju úplne inhibovat prídavkom Mpl-X v koncentrácii 5 až 10 mg/ml. Aktivita Mpl ligandu v APK9 dosahovala v priemere hodnoty 4400 t 539 jednotiek/mililiter aplastickej plazmy. Ak nie je uvedené nigčo iné, sú jednotky «· aktivity Mpl ligandu definované v stanovení 1A6.1.

Skúšky s bunkami transfekovanými génom humánneho Mpl receptora (príklad 3B) boli uskutočňované podstate rovnakým spôsobom, ako skúšky s bunkami 1A6.1.

Príklad 5

Potvrdenie prítomnosti Mpl ligandu v aplastickej plazme alebo sére z myšacieho, psieho, humánneho zdroja a zdroja z ošípanéj

Mpl ligand je prítomný v aplastickej plazme alebo sére z myšacieho, humánneho zdroja a zdroja z ošípanéj (pozri tabuľka 2). Myšiam BDF1 bola plazma odobraná pred ožiarením a 12 dní po ožiarení (500 rad). Plazma bola podrobená skúšaniu použitím buniek 1A6.1, pričom bola zistená aktivita 2000 jednotiek/ml. Túto aktivitu bolo možné v podstate úplne inhibovať Mpl-X (10 ^g/ml). Ožiarená myšacia plazma bola tiež pozitívna pri skúške s • humánnymi megakaryocytmi, kde vykazála aktivitu 1833 jednotiek/mililiter. Psom bola odobraná plazma pred ožiarením a 10 dní po ožiarení (450 rad). Plazma bola skúšaná ako použitím buniek 1A6.1, tak aj použitím humánnych megakaryocytov. Zistená aktivita bola pri obidvoch skúškach úplne inhibovateľná Mpl-X (10 (\g/ml) . Ošípaným bola plazma odobraná perd ožiarením a 10 dní po ožiarení (650 rad). Plazma bola skúšaná ako použitím buniek 1A6.1, tak aj použitím humánnych megakaryocytov. Zistená aktivita Mpl ligandu bola pri obidvoch skúškach úplne inhibovateľná Mpl-X (10 ^g/ml), čo je výsledok porovnateľný s výsledkom zisteným pre aplastickú psiu plazmu. Ďalej boli získané séra od aplastických humánnych pacientov. Táto látka bola odobraná z kostnej drene pacientov podrobených transplantácii. Séra od 6 pacientov boli skúšané použitím buniek 1A6.1, kde bola zistená aktivita 903 jednotiek/mililiter). 88 % tejto aktivity pochádzalo z Mpl ligandu (na základe inhibície Mpl-X s koncentráciu 10 ^g/ml). Séra od 14aplastických pacientov boli tiež podrobené skúške s humánnymi megakaryocytmi. Ako celá skupina», vykazoval i tieto séra.

- podstatnú aktivitu, 941 jednotiek meg/ml. Túto aktivitu bolo možné úplne inhibovať Mpl-X s koncentráciou 10 |»g/ml. Dáta pri použití myšacieho IL-3 sú tu zhrnuté na potvrdenie špecifickosti skúšky 1A6.1. Napriek tomu, že tento rekombinantný cytokín indukuje rast tejto bunkovej línie, nie je inhibovaný Mpl-X s koncentráciou 10 f\g/ml.

Tabuľka 2

Druh	Skúška s bunkami 1A6.1 (j ednotky/ml)	Skúška s humánnymi megakaryocytmi (jednotky meg/ml)
médium	+ Mpl-X
médium	+ Mpl-X
Normálna myš	0 í 0	0 + 0	0+0	0+0
Aplastická myš	2000	0	1833	neuskutočnená
Normálny pes	oto	0 ± 0	0 10	0 10
Aplastický pes	4400 í 539	0 10	792 ± 128	0+0
Normálna ošípaná	0 ± 0	0 í 0	0 + 0	0+1
Aplastická ošíp.	3866 1 1136	0 1 0	1284 + 182	10 1 10
Normálny človek	0+0	0 10	0 + 0	0 10
Aplastický člov.	903 ± 64	114 + 33	941 ± 178	0 10
myšací IL3	6000 t 565	6000 ± 565	neuskutoč.	neuskutoč.

Príklad 6

Stimulácia rastu buniek 1A6.1 Mpl ligandom a vývoj humánnych megakaryocytov

Mpl ligand prinajmenšom asi 100 000 x obohatený lektínovou a afinitnou chromatografiou, pozri príklad 7, stimuluje rast bunkovej línie 1A6.1 a vývoj humánnych megakaryocytov z * CD34-selektovaných buniek periférnej krvi spôsobom, ktorý je závislý od dávky. Za túto aktivitu je zodpovedný Mpl ligand, ako to vyplýva z obr. 2 a 3, keďže aktivity pri obidvoch týchto skúškach sa dajú úplne inhibovaú pôsobením Mpl-X.

Pôvodcovia tohto vynálezu tiež ukázali, že bunky periférnej krvi CD34* purifikované FACS sa po inkubácii s Mpl ligandom (v tomto prípade 100 jednotiek /ml počas 9 dní) vyvinú vo fenotypovo normálne maturované megakaryocyty. To potvrdzuje, že purifikovaný Mpl ligand vykazuje rovnaký účinok na megakaryocyty, ako surová APK9. Okrem toho boli pri tomto pokuse použité purifikované bunky CD34* (100% CD34*) na rozdiel od

CD34-selektovaných buniek, ktoré predstavujú len 30 až 50% CD34*.

Príklad 7

Purifikácia psieho Mpl ligandu

I. Zhrnutie

Proteíny (25 kDa 32 kDa) vykazujúce aktivity predvídané pre ligand Mpl receptoru boli podrobené purifikácii. Proteíny boli purifikované z plazmy ožiarených psov pomocou postupu zahrnujúceho afinitnú chromatografiu s aglutinínom z pšeničných klíčkov (WGA), afinitnú chromatografiu s Mpl receptorom, anexovú chromatografiu, gélovú filtračnú chromatografiu a HPLC s obrátenými fázami C44 (prehľad tohto purifikačného postupu je uvedený na obr. 4). 25kDa a 31kDa Mpl ligandy boli vysoko purifikované až do dosiahnutia zrejmej homogenity a bolo zistené, že majú aminokyselinové sekvencie uvedené v tomto popise.

II. Metódy

A. Vyčírenie plazmy

Zmrazená plazma (celkovo 20 litrov) ožiarených psov (pozri príklad 1) bolo ponechaná sa roztopiť cez_>noc pri 4 °C. Veľké.

* fľaše sa nechali topiť najprv niekoľko hodín pri teplote miestnosti a až potom boli Nerozpustná látky bola centrifugácie pri 11 000 premiestené do chladného priestoru, odstránená pomocou šesťhodinovej x g. Plazma bola zriedená fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom chloridu sodného s pH 7,3 s obsahom 0,01 % azidu sodného (PBS/azid) a prefiltrovaná cez filter s pórmi s priemerom 1,2 f\m. Po čeriacom postupe bolo obvykle dosiahnuté približne dvojnásobná zriedenie východiskovej látky.

B. Afinitná chromátografia s aglutinínom z pšeničných klíčkov

Všetky operácie boli uskutočňované pri 4 °C. Vyčírená plazma (2 várky) bola nanesená na stĺpec s imobilizovaným aglutinínom z pšeničných klíčkov (1 liter, 10 x 12 cm, E Y Laboratories), ktorý bol ekvilibrovaný v PBS/azide. Po nanesení vzorky bola nenaviazaná látky zo stĺpca vymytá PBS/azidom. Po premytí stĺpca 0,5M roztokom chloridu sodného v 20mM Tris-HCl s pH 8 bola aktivita Mpl ligandu naviazaná na stĺpec WGA elúovaná ' roztokom N-acetylglukózamínu (0,35M) (GlcNAc), chloridu sodného (0,5M), Tris-HCl (25mM) s pH 8. Aktivitu ligandu nebolo možné stanoviť v prefiltrovanom výroku ani vo frakciách premývacieho lúhu.

C. Afinitná chromatografia s receptorom Mpl-X

Použitý rozpustný myšací receptor Mpl (Mpl-X) zodpovedá celej extracelulárnej doméne Mpl receptora bez Trp v polohe 483 (pozri Vigone et al., 8: 2607 až 2615 (1993)). Aby sa optimalizovala väzba Mpl ligandu k afinitnému stĺpcu s Mpl-X receptorom, bol WGA eluát skoncentrovaný pomocou membránovej ultrafiltrácie (vylučovacia medza molekulovej hmotnosti 10 000, YM-10, Amicon) a následným zriedením bola koncentrácia chloridu sodného nastavená na 0,2M. Skoncentrovaná vzorka WGA bola nanesená na 20mM stĺpec m-Mpl-X (myšací rozpustný Mpl receptor/CNBr aktivovaná živica Sepharose (2,6 x 4,2 cm, 1,5 mg mMpl-X živica)) pri prietokovej rýchlosti Q,9 ml/min. Stĺpec bol. premývaný PBS/azidom (40 ml, 1,5 ml/min), premývacou kvapalinou s vysokým obsahom soli (405 ml, lOmM Tris-HCl, IM chlorid sodný, lmM CHAPS, pH 8,0). Stĺpec bol elúovaný 20mM CAPS, IM NaCl, 5mM CHAPS s pH 10,5. Vhodné frakcie boli zachytené a hodnota pH každej z nich bola upravená Tris pufrom.

Ako SDS-page, tak absorbancia pri 280 nm elučného profilu afinitného stĺpca s Mpl-X receptorom vykazovala skorý proteínový pík vo frakciách 1 až 4, zatiaľ čo hlavný podiel aktivity Mpl ligandu bol elúovaný po frakcii 5.

D. Anexová chromatografia na stĺpci Mono-Q

Frakcie s najvyššou čistotou z niekoľkých afinitných stĺpcov z Mpl-X receptorom boli spojené, skoncentrované a diafiltrované proti 20mM Tris-HCl, 5mM CHAPS s pH 8,7 do konečného objemu 58,5 ml. Koncentrácia proteínu v produkte bola stanovená na základe absorbancie pri 280 nm (0,12 j\g/ml, čo zodpovedá celkovo asi 7 mg proteínu). Produkt bol nanesený prietokovou rýchlosťou 0,5 ml/min na stĺpec Mono Q HR 5/5 (Pharmacia), ktorý bol ekvilibrovaný v 20mM Tris-HCl a 5mM CHAPS s pH 8,7. Stĺpec bol elúovaný lineárnym gradientom až do 0,36 chloridu sodného v rovnakom pufri počas 27 minút. Potom bol stĺpec premytý počas 6 minút gradientom až do 0,54M chloridu sodného a nakoniec nasledovalo premytie 0,9M chloridom sodným. Boli zachytené frakcie s objemom 1 ml.

Elučný profil stĺpca Mono-Q ukazuje, že žiadny Mpl ligand sa nedá detegovať a len nepatrné množstvo proteínu sa dá detegovať v pretečenej kvapaline a premývacích frakciách. Značná aktivita Mpl ligandu bola elúovaná vo frakciách 5 až 7 počas počiatočných štádií gradientu chloridu sodného. Inflexia aktivity bola pozorovaná vo frakciách 8 až 10 a potom nasledoval druhý hlavný pík zahrnujúci frakcie 11 až 15.

Použitím SDS-PAGE (neredukčné podmienky) bol v aktívnych frakciách pozorovaný výrazný 25kFa pás. Intenzita tohto pásu je priamo úmerná aktivite Mpl ligandu v týchtp frakciách. Tento pás. chýbal vo frakciách 3 a 4 (nulová aktivita), bol významný vo frakciách 5 a 6 (pík aktivita 1A6.1) a podobne intenzívne vyfarbený pás bol tiež prítomný vo frakciách 11 až 14 (pík aktivity 1A6.1). Vyššie uvedený pás bol slabý v spojených frakciách 15 a 16, čo zodpovedá významne nižšej aktivite vo frakcii 16.

E. Experimenty použitím gélovej substancie

Experimenty s gélovou elúciou boli uskutočňované použitím alikvot Mono Q frakcií 5 a 6 alebo Mono Q frakcií 13 a 14. Pri týchto experimentoch boli frakcie 5 a 6 (vždy 6 jwl) spojené, podobne ako frakcie 13 a 14 (vždy 7,5 (\1) . Spojené frakcie boli zmiešané so vzorkou pufra SDS-PAGE (neredukčného) a nanesené na 12% SDS-gély. Po skončení elektroforézy boli vyrezané dráhy, ktoré sú predmetom záujmu (1 mm) a vyrezané prúžky boli narezané na malé kúsky pomocou holiacej čepele. Kúsky boli prenesené do l,5ml mikrotitračných skúmaviek obsahujúcich 0,5 ml PBS/5mM CHAPS,kde boli mierne premiešavané cez noc pri teplote 4 °C.

* Nasledujúci deň boli skúmavky krátko odstredené, boli odobrané alikvótne vzorky a tie boli diafiltrované proti Iscoveho médiu doplnenému BSA, ako nosným proteínom. Diafiltrované vzorky boli použité na skúšanie.

Výsledky ukazujú, že bolo možné pozorovať dva piky aktivity Mpl ligandu. Jeden pík zodpovedal 25kDa oblasti gélu, zatiaľ čo druhý pík aktivity Mpl ligandu bol pozorovaný v 31kDa oblasti.

F. Filtrácia na géli Superdex 200

Frakcie 13 a 16 zo stĺpca na iónovú výmenu na anexe Mono Q, ako ja dve ekvivalentné frakcie z druhej frakcionizácie na stĺpci Mono Q boli spojené a skoncentrované v membránovom ultrafiltračnom zariadení (Centricon-10, Amicon). Bol pridaný SDS do konečnej koncentrácie 0,1% a vzorka bola nastrieknutá na stĺpec Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia). Stĺpec bol ekvilibrovaný v 50mM Tris-HCl, 0,1% SDS s ,^>H 7,5 pri prietokovej rýchlosti 0,3 ml/min, pri teplote miestnosti. Boli zachycované frakcie vždy po 1 minúte. Zistilo sa, že väčšina proteínu zo vzorky sa elúuje vo frakciách 32 až 40, zatiaľ čo aktivita Mpl ligandu bola detegovaná vo frakciách 42 až 46. Analýza frakcií pomocou SDS-PAGE ukázala významný 25kDa pás v aktívnych frakciách.

G. HPLC s obrátenými fázami (C4)

Koncentrované vzorky boli mm stĺpec s obrátenými fázami SynChopak RP-4). Stĺpec bol trifluóroctovej (TFA) vo vode

Frakcie 43 ať 46 (spojené) a frakcie 42 (samá) z filtrácie na Superdex 200 boli skoncentrované v membránovom ultrafiltračnom zariadení (Microcon-10, Amicon) oddelene nanesené na 1 x 100 (vŕtaná mikrokolóna s náplňou ekvilibrovaný v 0,04% kyseline (pufer A). Ako pufer B bolo použitých 0,035% TFA v 80% acetóne. Po nastrieknutí vzorky nasledoval lineárny gradient až do 45% B počas 4 minút a potom lineárny gradient až do 75% B počas 40 minút. Prietoková rýchlosť bola 75 fAl/min. Výsledky purifikácie frakcie 42 sú uvedené na obr. 5. Významné piky aktivity Mpl ligandu boli pozorované vo frakciách 21 až 23. Tieto frakcie boli analyzované na 14% polyakrylamidovom géli pri redukčných a neredukčných podmienkach. Frakcia 21 sa získala z jediného bloku 31kDa pásu, zatiaľ čo frakcia 23 zahrnovala jediný široký 25kDa pás a frakcia 22 obsahovala pásy ako v oblasti 25kDa, tak aj v oblasti 31kDa. Žiadne iné významné pásy neboli pozorované. Je potrebné si povšimnúť, že na základe predchádzajúcich experimentov s gélovou elúciou bola aktivita Mpl ligandu pripisovaná obidvom týmto oblastiam. Jeden menší pás s vysokou molekulovou hmotnosťou bol pozorovaný vo všetkých frakciách neredukujúceho gélu. Tento pás však nebolo možné zistiť v redukujúcom géle.

H. Analýza N-terminálnej sekvencie 25kDa a 31kDa Mpl ligandu.

Analýza N-terminálnej sekvencie bola uskutočňovaná na frakciách C4 RP-HPLC vykazujúcich aktivitu*, Sekvencie zistené u.

* týchto proteínov sú uvedené vyššie. Okrem hlavnej sekvencie zodpovedajúcej 25kDa pásu (prinajmenšom 90 % z celkovo nanesenej vzorky) boli pri sekvenovaní zistené dve menšie sekvencie (ktoré sú pripisované menšiemu kontaminujúcemu pásu popísanému v časti G vyššie). Porovnanie so známymi sekvenciami ukázalo, že menšie sekvencie zodpovedajú ťažkému reťazcu a kapa reťazcu psieho Ig. Ak by to bolo žiadúce, bolo by možné množstvo týchto menších nečistôt ďalej znížiť zariadením prídavného purifikačného stupňa, prednostne ďalšieho stupňa gélovej filtrácie.

I. Porovnanie aktivít Mpl ligandu v C4 purifikovaných frakciách

Obr. 6 ukazuje dáta potvrdzujúce, že aktivity prítomné vo frakciách 22 a 23 z C4 RP-HPLC chromatografického stupňa sú v podstate ekvivalentné. Frakcia 22 obsahuje zmes 25kDa a 31kDa pásu, zatiaľ čo frakcia 23 obsahuje len 25kDa pás. Alikvóty každej frakcie boli zriedené v pomere 1:45 000. Zriedené frakcie stimulovali rast buniek 1A6.1 v podstate rovnako (frakcia 22, 5 400 buniek na jamku, frakcia 23, 6 000 buniek na jamku). Zriedené • frakcie boli inkubované so vzrastajúcimi koncentráciami Mpl-X. Tieto frakcie boli rovnako citlivé voči inhibícii pôsobením Mpl-X, tj. u oboch došlo k úplnej inhibícii použitím koncentrácie

7-1,4 j^g/ml. To ukazuje, že účinný proteín alebo proteíny vo všetkých frakciách sú predstavované Mpl ligandami s ekvivalentnou biologickou aktivitou.

Príklad 8

Porovnanie Mpl ligandu s inými faktormi pri vývoji megakaryocytov periférnej krvi. pridaný humánny

Bolo oznámené, že na rast megakaryocytov alebo ich vývoj má vplyv množstvo rekombinantných faktorov alebo organických zlúčenín, ako je forbolmyristoacetát (PMA). Z tohto dôvodu boli skúmané účinky týchto faktorov naCD34-selektované bunky

Ku kultúre bol, podľa toho, ako je to uvedené, rekombinantný interleukín 3 (IL-3, 1 až 2.

ng/ml), faktor kmeňových buniek (SCF, 50 ng/ml), interleukín 6 (IL-6, 25 ng/ml), erytropoetín (EPO, 1 jednotka/ml), faktor inhibujúci leukémiu (LIF, 10 ng/ml) a faktor stimulujúci kolónie granulocytov a makrofágov (GM-CSF, 25 ng/ml, Amgen, Inc.), interleukín 11 (IL-11, 25 ng/ml, R+D Systems, Mineapolis, MN,

USA), alebo forbolmyristoacetát (PMA, 10^-1°M, Sigma). Mpl ligandu bol použitý v koncentrácii 275 jednotiek/ml a APK9 v 5% (čo zodpovedá 220 jednotkám/ml). Faktory skúšané boli použité v rovnakej koncentrácii ako pri individuálnom skúšaní. Po 8 dňoch kultivácie boli bunky fixované v jamkách a bolo uskutočnené farbenie megakaryocytov (n = 6 jamiek pre každú podmienku) alebo bol stanovený celkový počet buniek (n =3 jamky pre každú podmienky). Dáta sú uvedené ako stredná hodnota + smerodajná odchýlka.

koncentrácii v kombinácii

Obr. 7 ukazuje, že APK9 a Mpl ligand vedie k najvyššiemu počtu megakaryocytov, vztiahnuté na jamku. Tiež IL-3 má za následok vývoj megakaryocytov, predovšetkým v kombinácii s CSF. IL-6, IL-11, ani EPO nemá veľký vplyv na počet megakaryocytov, či • už sa použijú samé alebo v kombinácii s IL-3. Tiež PMA, ILF a GM-CSF vykazuje len malý účinok. Na obr. 8 sú uvedené dáta z rovnakého experimentu, ktoré ukazujú celkový počet buniek zistených v jamke (celularita). APK9 a Mpl ligand majú na celularitu malý vplyv, zatiaľ čo IL-3 a SCF majú stredný vplyv. Najvyšší účinok má kombinácia SCF a IL-3. Dáta uvedené na obr. 7 a 8 boli použité na výpočet percentných megakaryocytov na jamku, čo je uvedené na obr. 9. Je jasné, že faktor, ktorý vyvoláva najvyšší percentný podiel megakaryocytov v jamke s kultúrou, je

Mpl ligand, účinná zložka APK9. Tento výsledok ukazuje na špecifickosť Mpl ligandu vzhľadom na megakaryocyty.

Príklad 9

Aktivita Mpl ligandu spočívajúca v povzbudení megakaryocytov nie je závislá od humánneho IL-3

Mpl ligand stimuluje vývoj humánnych .^megakaryocytov, ak sa. * použije ako prísada k kultivačnému médiu popísanému v príklade 2. Napriek tomu, že IL-3 sa k tomuto médiu nepridá, mohol by byť prítomný v nedetegovateľne nízkych koncentráciách v normálnej humánnej plazme, ktorá je v tomto médiu obsiahnutá. Aj keď by však IL-3 bol prítomný, nezúčastňuje sa na Mpl ligandom indukovanej megakaryopoéze. To je zrejmé z obr. 10. IL-3 v koncentrácii 2 ng/ml vykazuje pri skúške s humánnymi megakaryocytmi aktivitu 14 900 megakaryocytových jednotiek/ml.

Táto aktivita je z 97 % inhibovaná pomocou anti-IL-3 (3,3 ^g/ml,

Genzyme, Cambridge, MA, USA). Mpl ligand v koncentrácii 8 203 meg jednotiek/ml nie je inhibovaný anti-IL-3.

Príklad 10

Analýza Mpl ligandu z ošípanej

I. Zhrnutie

Proteíny z plazmy ožiarenej ošípanej s aktivitou Mpl ligandu ’ boli charakterizované afinitnou chromatografiou WGA,afinitnou chromatografiou s Mpl receptorom, ionitovou chromatografiou a HPLC s reverznými fázami C4. Táto aktivita bola tiež charakterizovaná elúciou z prúžkov SDS-polyakrylamidových gélov.

Chromatograf ia	Poznámka
WGA afinitný stĺpec	4.4 x 10® jednotiek nanesených 3.4 x 10® jednotiek získaných
Stĺpec s receptorom Mpl	2,7 x 10® jednotiek nanesených 2,4 x 10® jednotiek získaných
iónová výmena, stĺpec	2,4 x 10® jedngtiek nanesených
Mono S, pH 6,0	4,4 x 10® jednotiek získaných
HPLC s obrátenými fázami C4	aktivita získaná vo frakciách 23 až 25
experimenty s gélovou	boli jasne rozlíšené dve aktivity,
elúciou	jedna pri asi 18 kDa a druhá pri asi 28 kDa

Príklad 11

Klonovanie humánneho Mpl ligandu, humánneho MGDF

Ďalej sú popísané dva prístupy:

I. Príklad prvého prístupu ku klonovaniu

A. Vytvorenie humánnej MGDF próby

Bolo vytvorené množstvo degenerovaných PCR primérov založených na aminoterminálnej sekvencii psieho proteinu. Na amplifikáciu MGDF génu z humánnej genómovej DNA boli použité rôzne dvojice primérov. Po 40 cykloch amplifikácie použitím negatívneho priméru 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID N0:4) kódujúceho prvých 5 aminokyselín psieho proteinu (SEQ ID NO:1) a pozitívneho priméru 5' GCA RTG YAA CAG RTG NGA RTC 3' (SEQ ID

N0:5) kódujúceho aminokyseliny 16 až 21 sekvencie SEQ ID NO:1 sa PCR produkt analyzuje na 2,0% agarózovom géle v pufri TBA.

Z agarózového gélu bol vyrezaný 63bp pás, ktorý bol reamplifikovaný použitím rovnakej kombinácie primárov. PCR produkt bol klonovaný do PCR II vektora (firma Invitrogen, San Diego, Kalifornia, USA). Množstvo kolónií bolo podrobených sereeningu sekvenovaním DNA. Plazmidová DNA kódujúca peptid, ktorý sa podobá psiemu MGDF proteínu, bola^použitá ako zdroj na vytvorenie rádioaktívnej próby určenej pre sereening cDNA knižnice. Génový fragment kóduje túto aminokyselinovú sekvenciu:

Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-LeuLeu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SEQ ID NO:6)

Agarózový pás obsahujúci humánny HGDF bol použitý na vytvorenie próby pomocou horúcej PCR. Pri typickej PCR reakcii obsahuje celkový objem 100 f*l vzorky tieto prísady:

templátová DNA 5' primér (SEQ ID NO:4) 3' primér (SEQ ID NO:5) 10 X pufer dATP (0,lmM) dTTP (lOmM) dGTP (lOmM) dCTP (0,lmM) dCTP, P³² (10 Ci/ 1) dATP, P³² (10 Ci/ 1) Taq DNA polymeráza voda až 3 (Al 1 (Al, 20 pmol (Al, 20 pmol 10 (Al (jl 2 (Al 2 (Al 2 (Al 5 (Al ⁵ I*¹

0,5 ^1, 2,5 jednotky 77 (Al

Celkový objem

100 (Al

Boli použité nasledujúce amplifikačné podmienky:

Začiatočné zahrievanie teplotná hybridizácia predlžovanie denaturácia °C, 2 minúty °C, 30 sekúnd 72 °C, 30 sekúnd 94 °C, 30 sekúnd

Bolo uskutočnených 40 amplifikačných cyklov použitím zariadenia Perkin Elmer GeneAmp System 9600.

Produkt bol purifikovaný priechodoví cez stĺpec push (Stratagene, San Diego, Kalifornia, USA) . 1|a1 próba bola spočítaná v scintilačnom počítači. K hybridizačnej zmesi boli • · pridané próby obsahujúce 1 a 3 milióny rozpadov/ml.

B. Konštrukcia knižnice z fetálnej pečene

Humánna polyA* RNA z fetálnej pečene bola zakúpená od Clontech Laboratories. Pri syntéze cDNA boli použité asi 4 jng RNA, pričom primovanie bolo uskutočnené použitím štatistického hexaméru, 5' GTA CGC GTT CTA GAN NNN NNT 3’ (SEQ IDN0:7), pripojeného k oligoméru obsahujúcemu miesto Xbal.

Na vytvorenie dvoj reťazcovej cDNA bol použitý protokol Gibco-BRL. Adaptor Eco R I-Bst X I (Invitrogen, San Diego, Kalifornia, USA) bol ligovaný k dvojreťazcovej cDNA a potom nasledovalo štiepenie pomocou reštrikčného enzýmu Xbal. Selekcia cDNA podľa veľkosti bola uskutočnená na stĺpci S500 Sephacryl (Life Technologies, Inc.). cDNA väčšia ako 400 bp boli ligované k cicavčiemu expresnému vektoru vl9.8 (Martin F., Celí 63: 203 až 211 (1990)), ktorý už bol rozštiepený EcoRI aXbal. Kompetentné bunky E. coli DH10 boli transformované a výsledná cDNA knižnica t

bola rozdelená na 7 častí, z ktorých každá obsahovala 100 000 cDNA.

C. Screening lambda knižnice

Knižnica z humánnych fetálnych obličiek v lambda gtll bola zakúpená od firmy Clontech (titer 650 x 10® pfu/ml). Asi 2 milióny plakov bolo podrobených screeningu pomocou próby vytvorenej pomocou PCR (pozri vyššie). Hybridizácia bola uskutočňovaná v 6 X SSC, 5 X Denhardt, 0,1% SDS a jednoreťazcovej DNA z lososej spermy (100 (Ag/ml) počas 15 hodín pri 56 °C.

Bolo uskutočnených niekoľko cyklov screeningu. DNA bola amplifikovaná z jednotlivých plakov a hybridizovaná s vnútorným priemerom, 5' AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3' (SEQ ID NO:8) kódujúcim aminokyseliny 7 až 13 zo SEQ ID NO:6, s cieľom, identifikácie pozitívnych výsledkov.

D. 3 Prime rýchla amplifikácia koncov cDNA (RAČE)

Polyadenylovaná RNA z humánnych fetálnych obličiek a fetálnej pečene bola zakúpená od firmy Clontech. 1 (*g RNA bol reverzne transkribovaný použitím oligo 5' TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TTT 3' (SEQ ID NO:9), ako priméru..

Aby sa vytvoril prvý reťazec cDNA, bola použitá súprava na syntézu cDNA Gibco-BRL (Life Technologies Inc., katalógové číslo 18267-013). Konečný objem bol 30 (Al. Reakcia bola zastavená prídavkom 500mM EDTA do konečnej koncentrácie lOmM a reakčná zmes bola uchovaná pri teplote -20 °C.

Zo začiatku PCR bolo ako templát pre reakciu použitých 0,5^1 cDNA. Ako pozitívny primér bol použitý primér (SEQ ID NO:9) a kompetitor oligo 5' TTC GGC CGG ATA GGC CTT TTT TTT TTT TT-P 3' (SEQ ID NO:10), zatiaľ čo oligonukleotid 5' TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3' (SEQ ID NO:11) kódujúci aminokyseliny 5 až 11 zo SEQ ID NO:6 bol použitý ako negatívny primér. Bolo uskutočnených 40 amplifikačných cyklov použitím tohto protokolu: 94 °C - 30 sekúnd, 65 °C - 30 sekúnd a 72 °C - 30 sekúnd. Predtým bola uskutočnená začiatočná inkubácia pri 94 °C počas 2 minút. Amplifikácia bola uskutočnená v zariadení Pekin Elmer GeneAmp System 9600.

Nesting bol uskutočnený použitím negatívneho priméru 5' GAG

TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3’ (SEQ ID NO: 12) kódujúceho aminokyseliny 8 až 14 zo SEQ ID NO:6. Ako pozitívne priméry boli použité priméry SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:10. Bolo uskutočnených 40 amplifikačných cyklov s teplotnou hybridizáciou pri 65 °C. PCR produkty boli analyzované na 0,8% agarózovom géle a potom fotografované pod UV svetlom. Pritom boli viditeľné pásy okolo 0,8 až 1,2 kb.

Produkty PCR boli potom klonované^ do vektora PCR II. (Invitrogen). Jednotlivé kolónie boli zozbierané a plazmidy boli izolované použitím súprav Qiagen (katalógové čísla 12143 a 12145). Použitím vektorových primérov bolo potom uskutočnené dvojreéazcové, farbivom primované, sekvenovanie. Sekveneie boli analyzované použitím rôznych typov Software GCG.

E. Predĺženie 5’ a 3’ primérmi

Aby sa izolovala sekvencia MGDF génu s úplnou dĺžkou , bolo uskutočňované predlžovanie 3' a 5' primérom použitím rôznych častí knižnice z fetálnej pečene ako templátu. Na amplifikáciu 5 priméru eDNA bolo použitých asi 20 ng eDNA z každej časti, ako templátu. Bol použitý MGDF špecifický pozitívny primér 5' GGA GTC ACG AAG CAG TTG AC 3' (SEQ ID NO:13) kódujúci aminokyseliny 12 až 17 zo SEQ ID NO: 6 a 5' vektor vl9.8 negatívny primér 5' CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3' (SEQ ID NO: 14). Amplifikácia bola uskutočňovaná v 30 cykloch s teplotnou hybridizáciou pri 53 °C. Nesting bol uskutočňovaný v 30 cykloch s pozitívnym primérom 5' GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3' (SEQ ID NO: 15) kódujúcim aminokyseliny 1 až 6 zo SEQ ID NO:6 a vektorovým primérom SEQ ID NO:14.

Na primérovú extenziu 3¹ koncov MGDF eDNA bol použitý pozitívny vektorový primér 5' GGC ATA GTC CGG GAC GTC G 3' (SEQ ID NO:16) a MGDF špecifický primér 5' TCC TCC TGC TTG TGA CCT 3' (SEQ ID NO:17) kódujúci aminokyseliny 1 až 6 SEQ ID NO:6. Amplifikácia bola uskutočňovaná v 30 cykloch s teplotnou hybridizáciou pri 58 °C.

Nestingová amplifikácia bola uskutočňovaná v 30 cykloch použitím MGDF priméru SEQ ID NO:12 a vektorového priméru SEQ ID NO:16. Špecifické pásy boli viditeľné v častiach 1, 7 a 8, ktoré boli klonované do PCR II vektora. Purifikované plazmidové DNA z jednotlivých kolónií boli ďalej purifikované a sekvenované.

F. Izolácia klonov humánneho MGDF s plnou dĺžkou

Mnoho začiatočných klonov neobsahovalo časť pri aminokonci MGDF, keďže časti MGDF a sekvencia bola použitá n priming a nesting. Primér 5' CCA GGA AGG ATT GAC GGG A 3' (SEQ ID NO:18), ktorého sekvencia bola získaná z piatich experimentov s primárovou extenziou popísaných vyššie, bol použitý ako negatívny primér. Ako pozitívny primér pritom poslúžil vektorový primér SEQ ID NO:16. Bolo uskutočnených 35 cyklov amplifikácie s teplotnou hybridizáciou pri 58 °C. Pre nesting v 35 cykloch bol použitý MGDF špecifický primér 5' CAA CAA GTC GAC CTC CAG CCA GAC ACC CCG 3' (SEQ ID NO:19) s miestom Sali a pre nesting v 35 cykloch bol použitý vektorový primér SEQ ID NO:15. PCR produkt bol klonovaný do PCR II vektora a sekvenovaný.

II. Príklad druhého prístupu ku klonovaniu

A. Klonovanie N-terminálnej cDNA psieho MGDF

Degenerované oligonukleotidové priméry boli zhotovené na psej MGDF N-terminálnej aminokyselinovej sekvencii popísanej vyššie v predchádzajúcej časti a boli použité ako primér pri reťazových reakciách iniciovaných polymerázou (PCR pre amplifikáciu MGDF-kódujúcich cDNA sekvencii). Úplná RNA bola pripravená zo vzorky psích obličiek pomocou metódy s guanidíniumizokyanátom (Chomzynski a Sachi, Biochem 162: 156 až 159 (1987)). Prvý reťazec cDNA bol pripravený so štatistickým primárom - adaptérom 5' GGC CGG ATA GGC CAC TCN NNN NNT 3' (SEQ ID NO:20) použitím reverznej transkriptázy MoMULV a bol použitý ako templát pri nasledujúcich reakciách PCR.

PCR bola uskutočňovaná použitím 0,5 fAl (asi 50 ng) cDNA použitím priméru A 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3’ (SEQ ID N0:4) a priméru s negatívnym reťazcom kódujúceho aminokyseliny 1 až 6 zo SEQ ID NO:1 a buď priméru B 5’ GCA RTG NAG NAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO:5) alebo priméru C 5' GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO:21), čo sú priméry pozitívneho reťazca kódujúceho aminokyseliny 16 až 21 zo SEQ ID NO:1 s 3 nukleotidmi navyše pri 5' konci kvôli zvýšeniu stability pri teplotnej hybridizácii. PCR s Taq polymerázou bola uskutočňovaná v 35 až 45 cykloch do tejto doby, dokiaľ neboli na agarózovom géle pre elektroforetickú analýzu zjavné pásy produktu. V prvých dvoch cykloch PCR bol uskutočňovaný rehybridizačný (teplotná hybridizácia) stupeň (37 °C, 2 minúty) a rehybridizácia v zvyšných cykloch bola uskutočňovaná 1 minútu pri 50 °C. V každom reakčnom produkte bolo pozorovaných viac pásov. Pomocou špičky Pasteurovej pipety boli odobrané časti gélu obsahujúce pásy s približne očakávanou veľkosťou (66 bp) a bola uskutočnená ich reamplifikácia s rovnakou dvojicou primérov. DNA produkty boli klonované do vektora PCR II (Invitrogen) podľa inštrukcií výrobcu. Tri klony boli sekvenované a bolo zistené, že kódujú v jednom čítacom rámci očakávanú psiu MGDF sekvenciu, zvyšky 1 až 21. Týmto spôsobom bola získaná jedinečná psia MGDF cDNA sekvencia pokrývajúca oblasť od tretieho nukleotidu kodónu 6 do tretieho nukleotidu kodónu 15. Jeden z týchto klonov bol použitý ako templát na prípravu značenej psej MGDF cDNA próby.

B. Konštrukcia cDNA knižnice z humánnej pečene

RNA bola izolovaná z humánnej fetálnej pečene (Internationl Inštitúte for the Advancement of Medicíne, Exton, PA, USA) lýzou tkaniva v 5,5M guanidíniumtiokyanáte a purifikáciou CsTFA (Pharmacia) centrifugáciou. Polyadenylovaná RNA bola selektovaná použitím perlového produktu oligo (dt)_2B dynabeads (Dynal, podľa inštrukcií výrobcu). Z tejto RNA bola vyrobená dvojreťazcová cDNA použitím plazmidového systému Superscript pre syntézu cDNA (Life Technologies Inc.) s výnimkou použitia odlišného linkerového adaptéra: 5' TTG GTG TGC ACT TGT G 3' (SEQ ID NO:22) a 5' CAC AAG TGC ACA CCA ACC CC 3' (SEQ ID NO:23). Po selekcii podía veľkosti bola táto cDNA smerovane vložená do miest BstXI a Nôti cicavčieho vektora pBCB (pBCB bol získaný z plazmidu Rc/CMV, Invitrogen obsahujúceho hlavný reťazec pucl9, CMV promotor a BGH polyadenylačné miesto). Ligovaná DNA bola zavedená do elektro-kompetentného bakteriálneho Technologies Inc.).

elektroporáciou kmeňa 10 B (Life

C. Screening knižnice cDNA z humánnej fetálnej pečene na MGDF

Filtrové repliky humánnej fetálnej pečeňovej knižnice boli hybridované k rádioaktívne značenému psiemu MGDF N-koniec cDNA PCR produktu (5x SSPE, 2x Denhardt, 0,05% difosforečnan sodný, 0,5% SDS, kvasinkový tRNA lyzát (100 ^1/liter) a denaturovaná lososia spermatová DNA (100 ^g/ml)) 18 hodín pri 64 °C. Filtre boli premyté pri 64 °C v 5x SSPE. 0,5% SDSD a exponované cez noc. Boli izolované a analyzované dva rôzne klony hybridizované k tejto próbe.

D. Expresia humánnych MGDF cDNA klonov

Purifikovaná DNA z MGDF cDNA klonov bola transfekovaná do buniek 293 EBNA (Invitrogen). 1,5 j*g DNA bolo zmiešaných s 7,5 ^1 Lipofectamínu (Life Technologies Inc.) v 100 ^1 DMEM bez obsahu séra. Po 20-minútovej inkubácii pri teplote miestnosti bola zmes DNA-Lipofectamín pridaná k 5 x 10® bunkám (jamka (24-jamková štvorcová miska Greiner) v 400 |4l DMEM s 1 % séra • (Fetal Clone II) a inkubovaná 6 hodín pri 37 °C. K bunkám bolo pridaných 500 |*1 DMAM s 20 % séra (Fetal Clone II) . Po 16 hodinách bolo médium odtiahnuté a bolo pridaných 500 (Al DMEM s 1 % séra (Fetal Clone II). Po ďalších 72 hodinách bolo spracované médium zhromaždené a odstredené použitím rotačného filtra s priemerom pórov 0,2 fxm. Spracované médium bolo podrobené skúške na biologickú aktivitu MGDF.

III. Popis humánnych MGDF klonov a ich aktivita

Použitím vyššie popísaných stratégií klonovania boli získané humánne cDNA klony znázornené na obr. ll (MGDF-l a MGDF-2, SEQ Dl NO:24, 25 a 26, 27) a obr. 12 (MGDF-3, SEQ ID N0:28, 29). Každá z týchto sekvencii uvedených na obrázku obsahuje predpokladanú signálnu sekvenciu aminokyselín 1 až 21, takže maturovaný proteín začína vždy aminokyselinou 22.

Výsledky skúšok aktivity použitím skúšky s bunkami popísanej ^w v príklade 4A (MGDF 1 až 3) sú uvedené v tabuľkách 3 a 4. Podľa tabuľky 3 bolo médium spracované bunkami 293 EBNA transfekovanými jednotlivými konštruktmi zhromaždené po dvoch dňoch kultivácie a potom skúšané na bunkách 1A6.1 (32D/mur-MPL+) + 10 (Ag/ml mur-MPL-X. Podľa tabuľky 4 bolo médium spracované bunkami 293 EBNA transfekovanými jednotlivými konštruktmi zhromaždené po štyroch dňoch kultivácie a potom skúšané na bunkách 32D/mur-MPL+ (príklad 3A) a 32D-Hu-MPL+ (príklad 3B). Ako.je zrejmé, humánny MGDF-l a MGDF-2, ale nie MGDF-3, je aktívny pokiaľ ide o bunkové línie exprimujúce ako myšaciu, tak aj humánnu formu Mpl. Bunková línia exprimujúca humánny Mpl receptor je responzívnejšia vzhľadom na MGDF-l a MGDF-2, ako bunková línia exprimujúca myšací

Mpl receptor.

Tabuľka 3

Kloň	- mur-MPL-X (jednotky/ml)	+ mur-MPL-X (jednotky/ml)
Médium	0	0
PBCO (kontrolný plazmid	0	0
MGDF-l	12 800	800
MGDF-l (opakovanie)	12 800	566
MGDF-2	4 525	400
MGDF-2 (opakovanie)	12 800	1 131
MGDF-3	0	0
MGDF-3 (opakovanie)	0	0
APK9 kontrol.	4 400 ± 400	0

Tabuľka 3

Kloň	32D/mur-MPL+ (jednotky/ml)	32D/hu-MPL+ (jednotky/ml)
MGDF-1	1 600	25 600
MGDF-2	6 400	50 000
MGDF-2 (opakovanie)	6 400	50 000 až 100 000

Nasledujúca tabuľka 5 ukazuje, že aktivity humánneho MGDF-1 a MGDF-2 na bunky 32D/Hu-MPL+ (príklad 3B) sú v podstate úplne inhibované rozpustným humánnym Mpl receptorom (hu-MPL-X). hu-MPL-X bol obsiahnutý v spracovanom médiu oddelenom od buniek CHO produkujúcich tento proteín. Médium spracované bunkami CHO s hu-MPL-X bolo 120x skoncentrované a potom pridané ku kultúram do obsahu 6,6 %. Spracované médium z kontrolných CHO kultúr nevykazovalo žiadny účinok pri tejto skúške. Skúška bola uskutočňovaná spôsobom popísaným v príklade 4B, len s tým rozdielom, že životaschopné bunky boli zisťované po 3 dňoch.

Tabuľka 5

Kloň	-Hu-MPL-X (jednotky/ml)	+ Hu-MPL-X (jednotky/ml)
MGDF-1	530	0
MGDF-2	270	0

Skúška s humánnymi megakaryocytmi

MGDF-1 a ?GDF-2, ale nie MGDF-3, indukuje tvorbu megakaryocytov z CD34-selektovaných buniek z periférnej krvi. Experiment popísaný v tabuľke 6 bol uskutočnené v podstate spôsobom popísaným v príklade 2, len s tým rozdielom , že bunky periférnej krvi boli CD34-selektované bez elutriácie a kultúra bola zozbieraná po 7 dňoch. Spracované médium z 293 EBNA MGDF konštruktu bolo použité pri 20 % fetálneho objemu ±30 j^g/ml mur-MPL-X. APK9 kontrola bola použitá pri 6 % konečného objemu.

Tabuľka 6

Kloň Megakaryocyty na jamku Megakaryocyty na jamku

	(-mur-MPL-X)	(+mur-MPL-X)
vektorová kontrola	0	0
APK9	100 ± 3	0
kontrola
MGDF-1	142 i 48	17+2
MGDF-2	100 ΐ 3	6+2
MGDF-2 (opakovanie)	86 + 10	0
MGDF-3	2+2	0

Príklad 12

Nasledujúci príklad popisuje syntézu 12 rôzne pegylovaných MGDF molekúl, PEG 9 až PEG 12 a PEG 14 až PEG 21. V každom prípade sa ako molekula MGDF pre pegyláciu použilo MGDF - 11 z E.

. coli (aminokyseliny 22 až 184 pri číslovaní začínajúcom od začiatku signálneho peptidu, alebo aminokyseliny 1 až 163 pri • číslovaní začínajúcom od maturovaného proteínu). Podrobnosti vzťahujúce sa na tieto pegylované molekuly sú zhrnuté v tabuľkách 7 až 10 (ďalej).

12.1 Príprava konjugátov poly-MePEG-MGDF acyláciou MGDF aktivovanými MePEG derivátmi

Príprava konjugátov poly-MePEG(20 kDa)-MGDF (PEG 11)

Ochladený (4 °C) roztok MGDF (2,5 mg/ml) v O,1M pufri Bicine s pH 8 bol pridaný k desaťnásobnému molárnemu nadbytku tuhého MePEG-sukeínimidylpropionátu s molekulovou hmotnosťou 20 kDa (Shearwater Polymers, Inc.). Polymér bol rozpustený pri miernom miešaní a ďalšia reakcia bola uskutočnená pri teplote miestnosti.

Stupeň modifikácie proteínu počas reakcie bol monitorovaný. “ HPLC s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti (SEC) použitím stĺpca Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia biotech), ktorý bol elúovaný 0,lM fosfátovým pufrom (fosforečnan sodný) s pH 6,9 pri rýchlosti elúcie 0,7 ml/min.

Analýza reakčnej zmesi pomocou SEC HPLC ukázala po 30 minútach reakčnej doby, že v reakčnej zmesi nie je obsiahnutý žiadny voľný proteín. V tomto okamihu bola koncentrácia proteínu v reakčnej zmesi znížená na 1 mg/ml prídavkom sterilnej vody a hodnota pH zmesi bola upravená na 4 niekoľkými kvapkami 0,5M kyselinou octovou.

Konjugát MePEG-MGDF bol oddelený od nadbytku MePEG a iných vedľajších produktov reakcie ionitovou chormatografiou použitím ionitovej živice SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech).

Reakčná zmes bola nanesená (2,5 mg/ml živice) na stĺpec a nezreagovaný MePEG bol elúovaný 3 objemami stĺpca počiatočného pufra A (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 15% glycerol). Potom ' bol konjugát MePEG-MGDF elúovaný použitím lineárneho gradientu od 0 do 30 % v 10 objemoch stĺpca koncového pufra B (IM chlorid sodný v pufri A). Eluát bol monitorovaný pri 280 nm. Frakcie obsahujúce konjugát poly-Me-PEG-MGDF boli spojené, skoncentrované a sterilizované filtráciou.

Purifikovaný konjugát poly-MePEG-MGDF bol analyzovaný SEC HPLC použitím filtračných stĺpcov TSK-GEL G4000SWXL a G2000SWXL zapojených do série. Proteíny boli detegované na základe UV absorbancie pri 280 nm. Ako markéry molekulovej hmotnosti globulámeho proteínu boli použité Štandardy pre gélovú filtráciu BIO-RAD.

Ako je zrejmé z obr. 17A, podľa SEC HPLC obsahoval produkt dve hlavné zložky (v približnom pomere 2:1), ktorých elučné polohy zodpovedajú globulárnym proteínom s molekulovou hmotnosťou 379,9 kDa a 150,0 kDa (pozri tiež tabuľka 8).

- Konjugáty PEG 9, PEG 10 a PEG 12, vyrobené acyláciou MGDF sukcínimidylestermi, s MePEG s molekulovou hmotnosťou 6 až 50 kDa boli pripravené podobným spôsobom. Hlavné reakčné parametre použité pri týchto postupoch sú zhrnuté v tabuľke 7.

Výsledky analýzy SEC HPLC týchto konjugátov sú uvedené v tabuľke 8.

12.2 Príprava konjugátov poly-MePEG-MGDF redukčnou alkyláciou MGDF MePEGaldehydmi

Príprava poly-MePEG(20 kDa)-MGDF konjugátu (PEG 20)

K ochladenému (4 °C) miešanému roztoku MGDF (2 ml, 2,5 mg/ml) v lOOmM fosforečnane sodnom s pH 5 s obsahom nátriumkyanbórhydridu (20mM NaCNBH₃) bol pridaný desaťnásobný molárny nadbytok monometoxypolyetylénglykolaldehydu (MePEG) s priemernou molekulovou hmotnosťou 20 kDa a v miešaní reakčnej zmesi sa pokračovalo pri rovnakej teplote.

Stupeň modifikácie proteínu počas reakcie bol monitorovaný HPLC s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti (SEC) použitím stĺpca Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia biotech), ktorý bol elúovaný 0,lM fosfátovým pufrom (fosforečnan sodný) s pH 6,9 pri rýchlosti elúcie 0,7 ml/min.

Analýza reakčnej zmesi pomocou SEC HPLC ukázala po 16 hodinách, že viac ako 90 % začiatočného množstva proteínu bolo modifikovaných. V tomto okamihu bola koncentrácia proteínu v reakčnej zmesi znížená na 1 mg/ml prídavkom sterilnej vody a hodnota pH zmesi bola upravená na 4 niekoľkými kvapkami 0,5M kyselinou octovou.

Konjugát MePEG-MGDF bol oddelený od nadbytku MePEG a iných vedľajších produktov reakcie ionitovou chormatografiou použitím ionitovej živice SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech).

>^r Reakčná zmes bola nanesená (2,5 mg/ml živice) na stĺpec a nezreagovaný MePEG bol elúovaný 3 objemami stĺpca počiatočného pufra A (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 15% glycerol). Potom bol konjugát MePEG-MGDF elúovaný použitím lineárneho gradientu od 0 do 30 % v 10 objemoch stĺpca koncového pufra B (IM chlorid sodný v pufri A). Eluát bol monitorovaný pri 280 nm. Frakcie obsahujúce konjugát poly-Me-PEG-MGDF boli spojené, skoncentrované a sterilizované filtráciou.

Purifikovaný konjugát poly-MePEG-MGDF bol analyzovaný SEC HPLC použitím filtračných stĺpcov TSK-GEL G4000SWXL a G20Q0SWXL zapojených do série. Proteíny boli detegované na základe UV absorbancie pri 280 nm. Ako markéry molekulovej hmotnosti globulárneho proteínu boli použité štandardy pre gélovú filtráciu BIO-RAD.

Ako je zrejmé z obr. 17B, podľa SEC HPLC obsahoval produkt dve hlavné zložky (52 a 47 % celkového množstva), ktorých elučné polohy zodpovedajú globulárnym proteínom s molekulovou hmotnosťou * 359,4 kDa a 159,3 kDa (pozri tiež tabuľka 8).

Konjugáty PEG 18, PEG 19 a PEG 21, vyrobené redukčnou alkyláciou MGDF MePEG aldehydom s molekulovou hmotnosťou 6 až 25 kDa boli pripravené podobným spôsobom. Hlavné reakčné parametre použité pri týchto postupoch sú zhrnuté v tabuľke 7.

Výsledky analýzy SEC HPLC týchto konjugátov sú uvedené v tabuľke 8.

12.3 Príprava konjugátov monometoxypolyetylénglykol-MGDF s miestom pripojenia v N-terminálnej &-aminoskupine

Príprava mono-MePEG(20 kDa)-MGDF konjugátu (PEG 16)

K ochladenému (4 °C) miešanému roztoku MGDF (2 ml, 2,5 mg/ml) v lOOmM fosforečnane sodnom s pH 5 s obsahom nátriumkyanbórhydridu (20mM NaCNBH₃) bol pridaný päťnásobný „ molárny nadbytok metoxypolyetylénglykolaldehydu (MePEG) s priemernou molekulovou hmotnosťou 20 kDa a v miešaní reakčnej »· zmesi sa pokračovalo pri rovnakej teplote.

Stupeň modifikácie proteínu počas reakcie bol monitorovaný SEC HPLC použitím stĺpca Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia biotech), ktorý bol elúovaný 0,lM fosfátovým pufrom (fosforečnan sodný) s pH 6,9 pri rýchlosti elúcie 0,7 ml/min.

Analýza reakčnej zmesi pomocou SEC HPLC ukázala po 16 hodinách, že bolo modifikovaných približne 90 % začiatočného množstva proteínu. V tomto okamihu bola koncentrácia proteínu v reakčnej zmesi znížená na 1 mg/ml prídavkom sterilnej vody a hodnota pH zmesi bola upravená na 4 niekoľkými kvapkami 0,5M kyselinou octovou.

Konjugát mono-MePEG(20 kDa)-MGDF bol oddelený od nadbytku MePEG a iných vedľajších produktov reakcie ionitovou , chormatografiou použitím ionitovej živice SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech).

Reakčná zmes bola nanesená (2,5 mg/ml živice) na stĺpec a nezreagovaný MePEG bol elúovaný 3 objemami stĺpca počiatočného pufra A (20 mM fosforečnan sodný, pH 7,2, 15% glycerol). Potom bol konjugát MePEG-MGDF elúovaný použitím lineárneho gradientu od 0 do 25 % v 20 objemoch stĺpca koncového pufra B (IM chlorid sodný v pufri A). Eluát bol monitorovaný pri 280 nm. Frakcie obsahujúce konjugát mono-Me-PEG-MGDF boli spojené, skoncentrované a sterilizované filtráciou.

Homogenita konjugátov mono-MePEG-MGDF bola skúšaná elektroforézou na polyakrylamidovom géle s dodecylsulfátom sodným použitím 4 až 20% dopredu naliatych gradientových gélov (Novex). Bol pozorovaný jeden hlavný pás zodpovedajúci polohe 46,9kDa proteínu.

»·

Purifikovaný konjugát mono-MePEG-MGDF bol analyzovaný SEC HPLC použitím filtračných stĺpcov TSK-Gel G4000SWXL a G2000SWXL zapojených do série. Proteíny boli detegované na základe UV absorbancie pri 280 nm. Ako markéry molekulovej hmotnosti globulárneho proteínu boli použité štandardy pre gélovú filtráciu BIO-Rad.

Ako je zrejmé z obr. 17C, podľa SEC HPLC obsahoval produkt jednu hlavnú zložku, ktorej elučná poloha zodpovedá globulárnemu proteínu s molekulovou hmotnosťou 181,1 kDa (pozri tiež tabuľka 9) .

Konjugáty mono-MePEG-MGDF s PEG 14, PEG 15 a PEG 17, vyrobené redukčnou alkyláciou MGDF MePEG aldehydom s molekulovou hmotnosťou 6 až 25 kDa boli pripravené podobným spôsobom. Hlavné reakčné parametre použité pri týchto postupoch sú zhrnuté v tabuľke 7.

Výsledky analýzy SEC HPLC týchto konjugátov sú uvedené v tabuľke 9.

Tabuľka 7

Zhrnutie reakčných parametrov pri modifikácii MGDF

Kód Reaktívny MePEG Reakčné podmienky

	Typ	m.h.	kone. MGDF (mg/ml)	PH	teplota (°C)	doba (h)	molárny pomer MePEG/ MGDF
PEG 9	NHS ester	6 kDa	2,5	8	t .m.	0,5	15
PEG 10	NHS ester	6 kDa	2,5	8	t .m.	0,5	10
PEG 11	NHS ester	20 kDa	2,5	8	t .m.	0,5	10
PEG 12	NHS ester	50 kDa	2,5	8	t .m.	0,5	5
PEG 14	alde- hyd	6 kDa	2,5	5	4	16	5
PEG 15	alde- hyd	12 kDa	2,5	5	4	16	5
PEG 16	alde- hyd	20 kDa	2,5	5	4	16	5
PEG 17	alde- hyd	25 kDa	2,5	5	4	16	10
PEG 18	alde- hyd	6 kDa	5	5	4	16	10
PEG 18	alde- hyd	12 kDa	5	5	4	16	10
PEG 20	alde- hyd	20 kDa	5	5	4	16	10
PEG 21	alde-	25 kDa	5	5	4	16	10

hyd

m.h = molekulová hmotnosť t.m.= teplota miestnosti

Tabuľka 8

Zhrnutie vlastností poly-MePEG-MGDF podľa SEC HPLC

Kód	Reaktívny MePEG	Zjavná m.h. podľa SEC (kDa)	Obsah zložky (%)
PEG	9	NHS	6	kDa	87,9	75
		ester			52,7	25 (inflexia)
PEG	10	NHS	6	kDa	69,2	14 (inflexia)
		ester			42,9	86
PEG	11	NHS	20	kDa	370,9	68
		ester			155,0	32
PEG	12	NHS	50	kDa	865,6	53
		ester			368,0	47
PEG	18	aldehyd	6	kDa	84,6	60
					41,5	40
PEG	19	aldehyd	12	kDa	218,4	59
					106,7	41
PEG	20	aldehyd	20	kDa	359,4	52
					159,3	47
PEG	21	aldehyd	25	kDa	450,5	54

218,4 46

Tabuľka 9

Zrejmá molekulová hmotnosť konjugátu mono-MePEG-MGDF

Kód	Reaktívny MePEG	Zjavná m.h. podľa SEC (kDa)	Zjavná m.h. podľa SDS PAGE (kDa)
		Typ	m.h. (kDa)	W
PEG	14	aldehyd	6	44,5	27,7
PEG	15	aldehyd	12	104,7	38,3
PEG	16	aldehyd	20	181,1	46,9
PEG	17	aldehyd	25	226,4	55,5

12.4 Príprava konjugátov DiMePEG(12kDa)-MGDF redukčnou alkyláciou

MGDF metoxypolyetylénglykolaldehydom (PEG 12)

Purifikovaná molekula označovaná názvom PEG 22 bola získaná pomocou tohto postupu:

Päťnásobný nadbytok metoxypolyetylénglykolaldehydu (MePEG, tj. látka o vzorcom OHC-(CH₂)₂0-(CH₂-CH₂O)_n-CH₃, kde n prestavuje index, ktorého hodnota zodpovedá molekulovej hmotnosti produktu približne 12 kDa) (Shearwater Polymers) bol pridaný k roztoku MGDF (2,5 mg/ml) (z E. Coli, 1 až 163) v lOOmM octane sodnom, pH a

5,0, pH 5,0, pričom teplota bola udržiavaná na 5 °C. Po 10-minútovom miešaní bolo pridané dostatočné množstvo nátriumkyanbórhydridu (Aldrich), aby koncentrácia tejto látky v reakčnej zmesi bola 20mM.

Vzniknutá zmes bola 16 hodín miešaná približne pri 5 °C. Na konci tejto doby bola pridaná purifikovaná voda (podľa US liekopisu) v dostatočnom množstve na úpravu koncentrácie MGDF na 1 mg/ml. Zmes bola prefiltrovaná cez vákuový filter s rozmermi pórov 0,2 jnm. Týmto spôsobom bolo získaných 90 mg reakčného produktu. K reakčnej zmesi boli pridané malé množstva l,0M primárneho fosforečnanu a IN hydroxidu sodného, aby sa dosiahla koncentrácia fosforečnanu lOmM a pH roztoku 6,8.

Konjugát bol purifikovaný na stĺpci katexovej živice. Bol pripravený 40ml stĺpec pre HPLC s SP-Sephargse s výškou lôžka 7,5. cm. Stĺpec bol ekvilibrovaný ekvilibračným pufrom (lOmM fosforečnan, pH 6,8, 15 % glycerolu). Potom bol na stĺpec nanesený konjugát v množstve 2,2 mg/ml živice rýchlosťou 0,15 objemu stĺpca za minútu. Nasledovalo premývanie ekvilibračným pufrom až do dosiahnutia základnej línie. Elúcia stĺpca bola uskutočnená 10 objemami stĺpca elučného činidla s lineárnym gradientom od pufra A (25mM fosforečnan, pH 7,2, 15 % glycerolu) do pufra B (pufer A + 0,3M chlorid sodný). Prietoková rýchlosč bola udržiavaná na hodnote 0,15 objemu stĺpca za minútu. Eluát bol monitorovaný pri 280 nm.

Jednotlivé frakcie boli analyzované metódou SDS-PAGE a frakcie obsahujúce DiPEG konjugát boli spojené a prefiltrované cez filtračnú jednotku s priemerom pórov 0,2 {<m.

Príklad 13

Biologická účinnosť pegylovaných molekúl MGDF

A. PEG-9 až PEG-12 a PEG-14 až PEG-21 »

Bol zistený počet rekombinantným humánnym MGDF Normálnym myšiam Balb/c sa subkutánne injekciou podáva nepegylovaný MGDF22 až 184 pegylovaný MGDF22 až 184 z koncentrácii uvedenej v popise krvných doštičiek myší liečených a výsledky sú uvedené na obr. 18. raz denne počas celkovo 5 dní MGDF 22-353 z CHO (kosoštvorce), z E. coli (otvorené krúžky) a E. coli (uzatvorené krúžky) v tohto obrázku uvedenom vyššie. 24 hodín po poslednej injekcii boli zvieratám odobrané krvné vzorky z malého laterálneho rezu vo véne chvostu. Analýzy krvných buniek boli uskutočnené pomocou elektronického analyzátora krvných buniek Sysmex (Baxter Diagnostics, Inc., Irvine, Kalifornia, USA). Uvedené dáta predstavujú strednú hodnotu zo stanovení pre štyri zvieratá ± smerodajná odchýlka od tejto strednej hodnoty. Ostatné parametre krvných buniek, ako je celkový počet bielych krviniek alebo červených krviniek, neboli touto liečbou ovplyvnené. „

Vyššie uvedeným spôsobom boli skúšané aj ďalšie formy rekombinantného humánneho MGDF. Počet krvných doštičiek myší liečených označenou formou rHuMGDF v dávke 50 alebo 10 (Ag/kg/deň, sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 10. Tabelované dáta predstavujú strednú hodnotu vypočítanú z hodnôt získaných od štyroch zvierat, pričom smerodajná odchýlka je uvedená kurzívou.

Tabuľka 10

Forma	50 fAg/kg/deň	10 g/kg/deň
stredná hodn. (n=4)	sem	stredná hodn. (n=4)	sem
CHO 22-353	4343	309	2571	80
E. coli
22-184	2021	29	1439	18
PEG 9	2728	56	2369	34
PEG 10	2431	291	1556	126
PEG 11	3778	59	1861	73
PEG 12	3885	156	1740	88
PEG 14	3567	80	2020	63
PEG 15	4402	57	2834	99
PEG 16	4511	239	3215	11
PEG 17	4140	188	3113	261
PEG 18	4586	59	2931	129
PEG 19	3980	330	4189	80
PEG 20	3942	285	3054	339
PEG 21	4195	145	4002	91
Základná
línia	939	25

Kľúč k tabuľke 10

V každom prípade bol ako molekula MGDF na pegyláciu použitý MGDF - 11 z E. coli (aminokyseliny 22 až 184 pri číslovaní začínajúcom od začiatku signálneho peptidu, alebo aminokyseliny 1 až 163, pri číslovaní začínajúcom od maturovaného proteínu). (Pozri vyššie uvedený príklad 12).

Názov	Pegylácia	Priemerná m.h. PEG	Reaktívna molekula
PEG pre	syntézu
PEG 9	polypegylovaný	6 kDa	NHS ester MePeg
PEG 10	polypegylovaný	6 kDa	NHS ester MePeg
PEG 11	polypegy1ovaný	20 kDa	NHS ester MePeg
PEG 12	polypegy1ovaný	50 kDa	NHS ester MePeg
PEG 14	monopegy1ovaný	6 kDa	aldehyd	MePeg
PEG 15	monopegylovaný	12 kDa	aldehyd	MePeg
PEG 16	monopegy1ovaný	20 kDa	aldehyd	MePeg
PEG 17	monopegylovaný	25 kDa	aldehyd	MePeg
PEG 18	polypegylovaný	6 kDa	aldehyd	MePeg
PEG 19	polypegylovaný	12 kDa	aldehyd	MePeg
PEG 20	polypegylovaný	20 kDa	aldehyd	MePeg
PEG 21	polypegylovaný	25 kDa	aldehyd	MePeg

Za počet krvných doštičiek zodpovedajúci základnej línií sa považuje počet krvných doštičiek normálnych zvierat, ktorým neboli podané žiadne lieky.

J zrejmé, že pegylácia rekombinantného humánneho MGDF neovplyvňuje nepriaznivo schopnosť tejto molekuly zvyšovať počet krvných doštičiek recipientných zvierat a naopak, môže zvýšiť aktivitu produktu 22-184 z E coli. na rovnaké alebo vyššiu úroveň, ako je úroveň pozorovaná pre molekulu 22-353 pochádzajúcu z CHO.

B. PEG-22

Výsledky dosiahnuté s PEG-22 sú uvedené na obr. 24. Pozoruhodné je, že k normalizácii počtu krvných doštičiek v prípade použitia PEG-22 došlo o niekoľko djjí skôr ako v prípade.

• použitia MGDF s plnou dĺžkou z CHO, PEG-16 alebo PEG-17.

Príkladl4

Expresia rekombinantného humánneho MGDF (1 až 163) v E. coli

S cieľom expresie r-HuMGDF v E coli bola chemicky syntetizovaná sekvencia kódujúca prvých 163 aminokyselín maturovaného proteínu použitím optimálnych kodónov E. coli. K 5' koncu génu boli pridané sekvencie DNA kódujúce aminokyseliny metionín a lyzín. Protein r-HuMGDF kódovaný touto sekvenciou obsahuje preto 165 aminokyselín, začínajúc reťazcom Met-Lys. Sekvencia tohto génu je uvedená na obr. 25.

Syntéza rHuMGDF (1-163) génu bola uskutočnená v niekoľkých stupňoch. Najprv boli pri použitím optimálnych kodónov E. coli chemicky syntetizované prvé komplementárne oligonukleotidy (s dĺžkou 60 až 70 bp) predstavujúce susedné fragmenty génu. Počas tejto syntézy boli k 5' koncu maturovaného génu pripojené kodóny • pre aminokyselinu metionín a lyzín a k 3’ koncu génu bol pripojený stop kodón. Okrem toho boli na najposlednej šie konce 5' a 3’ pripojené štiepne miesta pre reštrikčné enzýmy Xbal (5' koniec) a Hindlll (3' koniec) a vo vhodnej vzdialenosti pred začiatočným metioninovým zvyškom bolo umiestené syntetické ribozomálne väzbové miesto. Potom bola uskutočnená teplotná hybridizácia komplementárnych oligonukleotidov pre každý fragment génu. V treťom stupni boli jednotlivé syntetické fragmenty génu amplifikované použitím PCR reakcie. Vo štvrtom stupni boli amplifikované fragmenty subklonované do vhodného vektora. V piatom stupni bola uskutočnená verifikácia sekvencii subklonovaných fragmentov. V šiestom stupni boli jednotlivé fragmenty vzájomne ligované a subklonované do vhodného vektora, pričom bol rekonštruovaný r-HuMGDF (1-163) gén s plnou dĺžkou. Nakoniec bola uskutočnená verifikácia rekonštruovaného génu.

Syntetický r-HuMGDF génový fragment lemovaný reštrikčnými miestami Xbal (pri 5' konci) a HindlII (pRi 3' konci) obsahuje ribozomálne väzbové miesto, ATG štart kodón, sekvenciu kódujúcu maturovaný Met-Lys r-HuMGDF proteín a stop kodón.

Vyššie uvedený fragment bol klonovaný do miest Xbal a HindlII laktózou indukovateľného expresného vektora pAMGll. Vektor pAMGll je plazmid s nízkym počtom kópií, ktorého začiatok replikácie je odvodený z pRlOO. Expresný plazmid pAMGll môže byť získaný z plazmidu pCFM1656 (prírastkové číslo zbierky 69576, dátum uloženia: 24. februára 1994) sériou miestne orientovaných zmien báz PCR prekrývajúcich oligomutagenézu. Začne sa miestom BglII (plazmid bp # 180) bezprostredne v smere 5' od promotora replikácie plazmidu P_{c D} a pokračuje sa smerom ku génom replikácie plazmidu, pričom sa uskutočnia tieto zmeny bázových párov:

pAMGll	bp # bp	v pCFM1656	zmenený bp v pAMGll
' #	204	T/A	C/G
*#	428	A/T	G/C
#	509	G/C	A/T
#	617	- _	insert dvoch G/C bp
#	679	G/C	T/A
#	980	T/A	C/G
#	994	G/C	A/T
#	1004	A/T	C/G
#	1007	C/G	T/A
#	1028	A/T	T/A
#	1047	C/G	T/A
#	1178	G/C	T/A
#	1466	G/C	T/A
#	2028	G/C	bp delécia
a ΤΓ	2187	C/G	T/A
JL Tľ	2480	A/T	T/A
M 1Γ	2499-2502	AGTG TCAC	GTCA CAGT
#	2642	TCCGAGC AGGCTCG	bp delécia
#	3435	G/C	A/T
#	3446	G/C	A/T
#	3643	A/T	T/A ' ''
#	4489-4512	- -	insert bps GAGCTCACTAGTGTCGÄCČTGCAG CTCGAGTGATCACAGCŤGGACGTC
(SEQ	• ID NOS: 30,	31)

a sekvencia DNA medzi jedinenčými reštrikčnými miestami AatlI Clal sa nahradia týmito oligonukleotidmi:

AatlI (#4358)

5' CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT3 ' TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA-GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3' -CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5'

Cla¹! (#4438) (SEQ ID NOS: 32, 33)

Expresia r-HuMGDF klonovaného do pAMGll je poháňaná syntetickým promotorom, ktorý je indukovateľný laktózou, ako je napríklad Ps4, ktorého sekvencia je:

’ GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3 ' .

(SEQ ID NO:34)

Promotor Ps4 je potláčaný represorom laktózy (LacI), čo je produkt génu lacl z E. coli.

Plazmid pAMGll-r-HuMGDF sa potom transformuje do E. coli kmeňa K-12, ktorý obsahuje alelu lacl*¹. Alela predstavuje mutáciu * v promotore lacl zvyšujúcu expresiu Lacl, čo má za následok prísnejšiu kontrolu expresie proteínu poháňanú promotorom PS4. V «

tomto kmeni je teda pri neprítomnosti expresie r-HuMGDF potláčaná Lacl. Po prídavku laktózy sa proteín Lacl, ktorý sa naviaže na miesto operátora promotora PS4, redukuje a začne sa transkripcia r-HuMGDF prostredníctvom PS4. Hostiteľský bunka E. coli použitá v tomto príklade je uložená v zbierke ATCC pod prírastkovým číslom 36717 (dátum uloženia: 30.11.1994) .

Hostiteľ, E. coli ATCC č. 69717, bol transformovaný plazmidom pAMGll-r-HuMGDF a bunky boli pestované podľa nasledujúceho fermentačného predpisu: Kmeň E. coli sa inokuluje do pôdy Luria a potom sa zmes asi 12 hodín inkubuje pri 30 °C. Bunky sa pri aseptických podmienkach prenesú do fermentora, ktorý obsahuje vsádzku média (kvasinkový extrakt - 20 g/liter, kyselina citrónová - 3,4 g/liter, hydrogenfosforečnan draselný - 15 g/liter, Dow P2000 - 154 ml, glukóza - 5 g/liter, heptahydrát síranu horečnatého - 1 g/liter, stopové £ovy - 5,5 ml/liter a vitamíny - 5,5 ml/liter). Vo vsádzkovej kultivácii sa pokračuje tak dlho, dokiaľ jednorázová kultúra nedosiahne optickú denzitu 5,0 + 1,0 pri 600 nm. Potom sa začne fermentačná fáza fed-batch, pričom sa najprv privádza dodávané médium obsahujúce glukózu (70 g/liter) a heptahydrát síranu horečnatého (6,75 g/liter). Rýchlosť dávkovania sa prispôsobuje každé 2 hodiny podľa dopredu stanoveného rozvrhu. Druhé dodávané médium obsahujúce tryptikazový peptón (129 g/liter) a.kvasinkový extrakt (258 g/liter) sa začne dávkovať, keď kultúra dosiahne optickú denzitu 20 až 25 pri 600 nm. Prietoková rýchlosť druhého dodávaného média sa udržuje na konštantnej hodnote a pokračuje sa v prispôsobovaní prvého dodávaného média. Teplota počas celej fermentácie sa udržuje približne na hodnote 30 °C a jej hodnota pH sa udržuje na asi 7 pridávaním kyseliny alebo bázy podľa potreby. Požadovaná hladina rozpusteného kyslíka sa udržuje úpravou rýchlosti miešania, prívodu vzduchu a prívodu kyslíka do fermentora. Ak optická denzita kultúry dosiahne hodnotu 57 až 63 pri 600 nm, začne sa pridávanie tretieho dodávaného média. Tretie dodávané médium (laktóza - 300 g/liter) sa do fermentora uvádza konštantnou prietokovou rýchlosťou; uvádzanie prvého dodávaného média sa preruší a rýchlosť privádzania druhého dodávaného média sa upraví na novú konštantnú hodnotu. Fermentácia trvá približne 10 hodín od začatia prívodu tretieho dodávaného média. Na konci fermentácie sa kultúra ochladí na 15 í 5 °C a bunky sa zozbierajú pomocou centrifugácie. Výsledná pasta sa zhromaždí a uloží pri teplote nižšej ako 60 °C.

Purifikácia rekombinantného MGDF produkovaného v E. coli, popísaného vyššie, bola uskutočňovaná takto: bunková pasta (1800 g) bola suspendovaná približne v 18 litroch lOmM EDTA a suspenzia bola spracovaná vo vysokotlakovom homogenizátore pri talku 103 MPa. Suspenzia rozbitých buniek bola odstredená a peleta bola resuspendovaná v 10 litroch lOmM EDTA. Nasledovala nová centrifugácia suspenzie a získaná 200g peleta bola solubilizovaná v 2 litroch lOmM Tris, 8M hydrochloridu guanidínu, lOmM DTT, 5mM EDTA s pH 8,7. Tento roztok bol pomaly zriedený prevedením do 200 litrov lOmM CAPS, 3M močoviny, 30% glycerol\j., 3mM cystamínu a lmM. cysteínu s pH 10,5.

Zriedený roztok bol 16 hodín pomaly miešaný pri teplote miestnosti a potom bolo pH upravené na hodnotu 6,8. Roztok s upravenou hodnotou pH bol vyčírený a nanesený na dvojlitrový stĺpec CM Sepharose ekvilibrovaný lOmM fosforečnanom sodným, 1,5M močovinou a 15% glycerolom s pH 6,8. Po nanesení bol stĺpec premytý lOmM fosforečnanom sodným a 15% glycerolom s pH 7,2. MGDF bol elúovaný gradientom chloridu sodného od 0 do 0,5M a lOmM fosforečnanom sodným s pH 7,2.

CM eluát bol skoncentrovaný a pufer bol vymenený za lOmM fosforečnan sodný s pH 6,5 použitím membrány s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 10 000. Na koncentrovaný roztok (asi 2 mg/ml) bolo pôsobené cathkatepsínom C (500 až IM) počas 90 minút pri teplote okolia.

Potom bol roztok nanesený na 1,2-litrový stĺpec pre HPLC (SP High Performance Sepharose) ekvilibrovaný lOmM fosforečnanom sodným, 15% glycerolom s pH 7,2. Po nanesení bol MGDF elúovaný použitím gradientu chloridu sodného (0,1 až 0,25M) a lOmM fosforečnanu sodného s pH 7,2.

K eluátu zo stĺpca SP High Performance bol pridaný síran amónny až do 0,6M koncentrácie. Eluát bol nanesený na 1,6-litrový stĺpec phenyl Toyopearl ekvilibrovaný lOmM fosforečnanom sodným, 0,6N síranom amónnym, pH 7,2. Pík MGDF bol elúovaný síranom amónnym (gradient od 0,6 do 0M), fosforečnanom sodným (lOmM), pH

7,2.

Eluát zo stĺpca Phenyl Toyopearl bol skoncentrovaný a pufer bol vymenený za lOmM Tris, 5% sorbitol, pH 7,5 použitím membrány s vylučovacou medzou molekulovej hmotnosti 10 000.

Príklad 15

In vivo biologické vlastnosti r-HuMGDF^(E. coli 1-163)

Bola zisťovaná biologická účinnosť r-HuMGDF (E. coli 1-163) ** pripraveného spôsobom popísaným v príklade 14 na hlodavce. Normálnym samiciam myši Balb/c sa počas 5 po sebe idúcich dní subkutánne podávajú injekcie so zvyšujúcou sa dávkou r-HuMGDF. Rozmedzie dávkovania bolo od 15 do 1 500 (Ag/kg/deň. 24 hodín po poslednej injekcii boli zvieratám odobrané krvné vzorky. Analýza krvných buniek bola uskutočnená pomocou elektronického počítača buniek Sysmex (Baxter). Pri logaritmický sa zvyšujúcej koncentrácii cytokínu bol pozorovaný lineárny nárast počtu krvných doštičiek. Pri dávkovaní 1 500 (Ag/kg/deň sa v tomto systéme počet krvných doštičiek zvýšil na 300 % začiatočnej hodnoty (základná línia). Iné parametre krvných buniek, ako je počet bielych alebo červených krviniek alebo hematokrit, neboli pri tomto ošetrení ovplyvnené.

Potkanom, ktorým bola počas 6 dní podávaná dávka r-HuMGDF (E. coli 1-163) 300 (Ag/kg/deň, boli odobrané krvné doštičky a tieto krvné doštičky boli podrobené skúške na schopnosť agregácie « v odpovedi na ADP. Zistené dáta ukazujú, že sa doštičky ošetrených zvierat v podstate nedajú odlíšiť od doštičiek kontrolných zvierat, keďže obidve populácie sú rovnako citlivé voči agonistovi krvných doštičiek, ADP.

r-HuMGDF bol tiež hodnotený na schopnosť odstrániť trombocytopéniu spojenú s chemoterapiou a/alebo ožarovaním. Pri tejto štúdii bol použitý karboplatín, čo je chemoterapeutikum vyvolávajúce hlbokú trombocytopéniu u človeka. Na začiatku štúdie bola myšiam Balb/c subkutánne injekčné podaná dávka 1,25 mg karboplatínu. Po 24 hodinách začali byť myši liečený r-HuMGDP (E. coli - 163) alebo excipientom v dennej dávke 100 ^g/kg/deň, až do dokončenia štúdie. Deviaty deň poklesol počet krvných doštičiek myší liečených excipientom približne na 15 % normálnej hodnoty, zatiaľ čo pokiaľ ide o myši liečené r-HuMGDF, zostal počet krvných doštičiek na úrovni základnej línie (pozri obr. 20).

Pri štúdiách s ožarovaním boli myši podrobené jednej dávke - gama žiarenia (z céziového zdroja, 500 rad). Ide o subletálnu dávku, ktorá má za následok 90% zníženie počtu krvných doštičiek do 11. dňa. Počet krvných doštičiek sa do 21. dňa nevrátil na normálnu hodnotu. Keď bol ožarovaným myšiam od prvého do 20. dňa podávaný r-HuMGDF (E. coli 1-163) raz denne v dávke 100 (Ag/kg/deň, nebol pokles počtu krvných doštičiek tak dramatický a návrat na hodnotu zodpovedajúcu základnej línii bol rýchlejší ako u myší liečených excipientom (pozri obr. 21).

Na vyskúšanie aktivity r-HuMGDF použitím modelu extrémnej a dlhodobej trombocytovej cytopénie, bolo podanie karboplatínu a ožarovanie aplikované v kombinácii (obr. 22). Pri týchto okolnostiach poklesol počet krvných doštičiek na extrémne nízku hodnotu (3 až 5 % normálnej hodnoty) a väčšina zvierat (7 z 8) toto ošetrenie neprežila. Ak však bola týmto zvieratám každý deň celý čas trvanie štúdie podávaná subkutánna injekcia r-HuMGDF v dávke 100 |*g/kg/deň, trombocytopénia bola významne potlačená, návrat na hodnotu zodpovedajúcu základnej línii bol rýchlejší a všetky zvieratá liečené r-HuMGDF (8/8) prežili.

r-HuMGDF bol tiež skúšaný na opiciach rhesus. Normálnym * opiciam rhesus bol subkutánne injekčné podávaný r-HuMGDF v dávke 2,5 alebo 25 ^g/kg/deň, celkovo počas 10 dní (deň 0 až 9). V skupine s nižšou podávanou dávkou sa počet krvných doštičiek 12. deň zvýšil o 400 % a v skupine s vyššou podávanou dávkou bolo toto zvýšenie 700 %, tiež 12. deň. Po ukončení injekčného podávania sa počty krvných doštičiek vrátili na normálnu hodnotu do 25 až 30 dňa. Vyššie popísaným ošetrením nebol ovplyvnený počet bielych a červených krviniek.

r-HuMGDF (E. coli 1-163) bol tiež skúšaný na primátoch s prudkou trombocytopéniou (obr. 23). Modelové zvieratá boli ožiarené (dávkou 700 rad z kobaltového zdroja), čo malo za následok pokles počtu krvných doštičiek 15. deň na 1 až 2 % normálnej hodnoty. Do 35 až 40 dňa sa počet krvných doštičiek vrátil na normálnu hodnotu. Oproti tomu, počet krvných doštičiek ožarovaných zvierat liečených každý deň*, rHu-MGDF v dávke 25. |ig/kg/deň klesol len na 10 % normálnej hodnoty a v priemere nebol nižší ako 20 000/(*l, čo je medzná hodnota, pri ktorej sa, pokiaľ ide o humánnych pacientov postihnutých trombocytopéniou, začne transfúzia krvných doštičiek. Pokiaľ ide o zvieratá liečené r-HuMGDF bol tiež návrat na základnú hodnotu rýchlejší; táto hodnota bola dosiahnutá 20. deň.

Vyššie uvedené dáta zo štúdií o hlodavcoch a primátoch plne podporujú predpoklad, že rHuMGDF (E. coli 1-163) je účinné terapeutické činidlo so schopnosťou významne ovplyvniť klinicky relevantné trombocytopénie.

Príklad 16

Spôsob produkcie r-HuMGDF 1-332 v kultúre buniek CHO

Glykozylovaný r-HuMGDF 1-332 je produkovaný transfekovanými bunkami ovárií čínskeho chrčka exprimujúcimi cDNA pre MGDF 1-332 pod kontrolou vhodného promotora a s pripojením ku génu * kódujúcemu amplifikovateľný selekčný markér DHFR. Vhodný promotor pre expresiu MGDF v bunkách CHO je SR& (pozri Mol. Celí. Biol. 8: 466 až 472 (1988) a WO 91/13160 (1991)). Vhodný vektor pre expresiu MGDF v bunkách CHO je pDSR&2 (pozri WO 90/14363 (1990)). Príkladné bunkové línie CHO sú schopné produkovať sekretovaný MGDF v štandardnom médiu pre bunkové kultúry v množstve v rozmedzí od 10 do 20 mg/liter. Toto množstvo je však možné zvýšiť na 25 až 100 alebo aj viac mg/liter. Pri produkcii MGDF použitím bunkovej línie je možné kultúru expandovať pasážovaním alebo v nádobách pre tkanivové kultúry spôsobom adherentného rastu použitím média, ktoré zahrnuje rovnaké množstvo Dulbeccom modifikovaného Eaglovho média (DMEM) a Hamovho média (DMEM/F12, Gibco). Použité médium môže byť doplnené 5 až 10 % fetálneho hovädzieho séra (FBS) alebo dialyzovaného fetálneho hovädzieho séra a metotrexátom (MTX) (ak to je potrebné, býva typická koncentrácia MTX 200 až 600nM) s cieľom udržania selekčného tlaku. Toto médium by malo byť doplnené prídavnými neesenciálnymi aminokyselinami (NEAA) a glutamínom. Su^penzné kultúry ľahko

- propagujú v rozmedzí od inokulačných denzít 1 až 4 x 10^s buniek/ml. Pri maximálnej denzite asi 1 x 10® buniek/ml sa “** kultúry expandujú zriedením do väčšieho objemu so začiatočnou hodnotou denzity krvných doštičiek pri špecifickej hodnote inokulačnej denzity.

Ak sa má MGDF produkovať v prevaľovaných fľašiach, musí sa vhodný objem suspenznej kultúry s vhodnou denzitoubuniek vytvoriť použitím buď magneticky miešaných rotačných nádob umiestených v prostredí s regulovanou teplotou (37 ± 1 °C) alebo bioreaktora typu miešanej nádrže vybavenej príslušnými meracími a regulačnými prvkami. Prevaľované fľaše (ako napríklad fľaše typu Falcon s objemom 850 cm³) je potrebné zaočkovať na počiatočnú hustotu 1,5 až 3 x 10⁷ buniek, počítané na fľašu a doplniť prídavným rastovým médiom (DMEM/F12 s 5 až 10 % FBS, IX NEAA a IX L-glutamínom) v množstve vhodnom na vytvorenie konfluentnej mnohovrstvy počas 3 až 4 dní (150 až 300 ml/fľašu). Rastové médium by malo byť zo začiatku pufrované hydrogenuhličitanom sodným na pH 6,9 až 7,2 v rovnováhe s oxidom uhličitým s parciálnym tlakom 8 kPa až 12 kPa.

• Fľaše by mali byt zaplnené zmesou 10% oxidu uhličitého vo vzduchu a po upevnení v prevaľovacom zariadení 3 až 4 dni prevaľované pri teplote 37 t 1 °C s frekvenciou otáčania asi 1 min^-1. Po dosiahnutí konfluencie by malo byť vo fľašiach médium vymenené za produkčné médium neobsahujúce sérum. To sa dá uskutočniť vyliatím alebo odsatím rastového média, premytím fliaš izotonickým pufrom, ako je Dulbeccov fosfátom pufrovaný roztok chloridu sodného (D-PBS). v množstve 50 až 100 ml/fľašu a potom pridaním vhodného objemu hydrogenuhličitanom pufrovaného, bez obsahu séra, média

DMEM/F21 (1:1) (200až 300 ml/fľaša) doplneného NEAA a L-glutamínom, ako aj síranom meďnatým, s cieľom minimalizácie kovalentnej agregácie (1 až 20 (*M). Fľaše b mali byť zaplnené 10% oxidom uhličitým vo vzduchu a inkubované pri 37 ± 1 °C v prevaľovacom zariadení otáčajúcom sa s frekvenciou 1 min¹ počas 6 + 1 dní alebo tak, dlho, dokiaľ metabolická aktivita nezníži koncentráciu glukózy na hodnotu nižšiu ako 0,5 mg/liter a/alebo hodnotu pH pod 6,6. Spracované médium sa môže zozbierať vyliatím alebo ašpiráciou z fliaš a nahradiť čerstvým médiom bez obsahu séra popísaným vyššie, s cieľom ďalších zberov. Tento postup sa môže uskutočňovať tak dlho, až nie sú bunky schopné pokračovať v produkcii v prostredí bez obsahu séra a vytekajú z preval'ovaných fliaš.

Zozbierané spracované médium je možné purifikovať pomocou mikrofiltrácie so slepým koncom použitím filtrov s rozmermi pórov 0,45 (Am a/alebo 0,2 μ m (Sartorius Sartobran pH alebo Pall) . Prefiltrované spracované médium je potrebné schladiť na 4 °C a potom buď dočasne uložiť pri teplote 4 °C alebo ihneď skoncentrovať a dialyzovať na nízku iónovú silu použitím ultrafiltračného systému s priečnym tokom (napríklad Filtron YM-50). Ultrafiltrácia a diafiltrácia by sa mala uskutočňovať pri 4 °C s cieľom minimalizácie rozkladu proteínu. Pred stupňami chromatografickej purifikácie by spracované médium malo byť dialyzované proti pufrovanému vodného roztoku (napríklad lOmM fosforečnanu draselnému s pH 6,8).

Kvalitu produktu v spracovanom médiu je možné najlepšie monitorovať použitím analýzy neredukujúcej SDS-PAGE Western Blot. Pomocou tejto analýzy sa môžu zistiť relatívne množstvá agregovaných, monomérnych a proteolyticky degradovaných MGDF vo vzorcoch.

Ďalší spôsob produkcie MGDF z buniek CHO spočíva v adaptácii bunkovej línie exprimujúcej MGDF na médium bez obsahu séra, ako je napríklad Gibco S-SFM II. Bunky je možné adaptovať pomocou sériového pasážovania v médiu, ktoré obsahuje malé prídavky séra alebo sérum vôbec neobsahuje. Ak sa zistí, že bunková línia dobre rastie v takom médiu a produkuje vhodné množstvo vylúčeného MGDF, môže sa v produkcii pokračovať tak, že sa pomocou sériového pasážovania inokulaČná kultúra prevedie do väčšieho rozsahu s väčším objemom kultúry a vzniknutou kultúrou sa zaočkuje vhodná produkčná nádoby (napríklad miešaný nádržový bioreaktor vybavený meracími a regulačnými prvkami). Kultúra sa môže nechať rásť až do maximálnej denzity zaisťujúcej životaschopnosť pri optimálnych rastových podmienkach (pH, živiny, teplota, kyslík, šmykové miešanie). V optimálnej fáze produkcie (ktorá sa dá zistiť experimentálne na základe stanovenia kvantity a kvality produktu) je možné kultúru z bioreaktora zozbierať a bunky sa dajú odstrániť zo spracovaného média hĺbkovou filtráciou (radovo mikrónovou) alebo pomocou submikrónovej mikrofiltrácie s priečnym tokom. Ak sa použije hĺbková filtrácia, malo by byť médium ďalej vyčírené pomocou submikrónovej filtrácie so slepým koncom a až potom podrobené koncentrácii a dialýze, ako je to popísané vyššie.

Vynález bol popísaný ako všeobecne, tak tak aj na svojich prednostných realizáciách. Do rozsahu vynálezu však patria aj najrôznejšie obmeny a modifikácie, ktoré sú odborníci v tomto obore schopný uskutočniť na základe vyššie uvedeného popisu. Nasledujúce patentové nároky pokrývajú tiež všetky vyššie uvedené modifikácie.

Všetky vyššie uvedené citácie osvetľujúce oblasť vynálezu a doterajší stav techniky sú tu citované náhradou za prenesenie ich celého obsahu do popisu celého vynálezu.

100

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE:

(i) PRIHLASOVATEĽ: Bartley, Timothy D.

Bogenberg, Jakob M.

Bosselman, Róbert A.

Hunt, Pamela Kinstler, Olaf, B.

Samal, Babrú B.

(ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Composition and Methods for Stimulating Megakaryocyte Growth andDifferentiation (Látky a spôsoby na stimuláciu rastu a diferenciáciu megakaryocytov) (iii) POČET SEKVENCIÍ: 34 (iv) ADRESA PRE KOREŠPONDENCIU:

(A)	ADRESÁT:	Amgen Inc.,ä
(B)	ULICA:	1840 Dehavilland Drive
(C)	MESTO:	Thousand Oaks
(D)	ŠTÁT:	Kalifornia
(E)	KRAJINA:	USA
(F)	PSČ:	91320-1789 (ZIP)

(v) STROJOVO ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, verzia #1.25 (vi) DÁTA VZŤAHUJÚCE SA NA TÚTO PRIHLÁŠKU:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY:

(B) DÁTUM PODANIA:

(C) ZATRIEDENIE:

(vii) INFORMÁCIE O PATENTOVOM ZÁSTUPCOVI:

(A) MENO: Cook, Róbert R.

(C) SPISOVÁ ZNAČKA: A-290-C

101 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 31 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:1:

>*

Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 15 10 15

Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gin Xaa Pro Asp íle Tyr 20 25 30 (2) INFORMÁCIE 0 SEQ ID N0:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:2:

Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 15 10 15

Ser His Val Leu His 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:3:

102

Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp Val Leu Gly Ala Val Ala 15 10 15

Leu (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 17 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:4:

GCNCCNCCNG CNTGYGA 17 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:5:

GCARTGYAAC ACRTGNGART C 21 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:6:

103

Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 15 10 15 i

Ser His Val Leu His 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: „ (A) DĹŽKA: 21 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:7:

GTACGCGTTC TAGANNNNNN T 21 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:8:

AGTTTACTGA GGACTCGGAG G 21 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:9:

104

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT ΤΤΤΤΤΊΤΤΤΤ 30 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 29 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:10:

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT ΤΤΤΤΤΤΤΤΤ 29 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:11:

TGCGACCTCC GAGTCCTCAG 20 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:12:

GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT

105 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:13:

>·

- GGAGTCACGA AGCAGTTTAC 20 ** (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:14:

CCTTTACTTC TAGGCCTG 18 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny . (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:15:

a

GAGGTCACAA GCAGGAGGA 19 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina

106 (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:16:

GGCATAGTCC GGGACGTCG 19 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE: „ (A) DĹŽKA: 19 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:17:

TCCTCCTGCT TGTGACCTC 19 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 19 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: CDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:18:

CCAGGAAGGA TTCAGGGGA 19 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 30 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:19:

107

CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 30 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 24 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:20:

GGCCGGATAG GCCACTCNNN NNNT 24 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:21:

GCARTGYAAN ACRTGNGART C 21 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 16 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:22:

TTGGTGTGCA CTTGTG

108 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:23:

- CACAAGTGCA CACCAACCCC (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1342 bázových párov (B) TYP: nukleová kyselina (C) REŤAZCOVITOSŤ: jeden reťazec (D) TOPOLÓGIA: lineárny (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTIKA:

(A) MENO/KEÓČ: CDS (B) UMIESTENIE: 99..1094

Claims (46)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. MGDF polypeptid majúci aminokyselinovú sekvenciu látky zvolenej zo súboru zahrnujúceho MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7 a MGDF-8.
2. 2. Izolovaný polynukleotid kódujúc i,. MGDF polypeptid podľa, nároku 1.
3. 3. Izolovaný polynukleotid podľa nároku 2, ktorým je sekvencia DNA.
4. 4. Sekvencia DNA podľa nároku 3, ktorou je sekvencia cDNA.
5. 5. Sekvencia cDNA podľa nároku 4 vykazujúca zodpovedajúcu sekvenciu, ako je znázornená na obr. ll alebo 12.
6. 6. DNA vektor obsahujúci DNA sekvenciu podľa nároku 4.
7. 7. Vektor podľa nároku 6, v ktorom je sekvencia DNA operatívne pripojená k sekvencii DNA riadiacej expresiu.
8. 8. Hostiteľská bunka stabilne transformovaná alebo transfekovaná sekvenciou DNA podľa nároku 4.
9. 9. Hostiteľská bunka podľa nároku 8 exprimujúca MGDF polypeptid kódovaný sekvenciou DNA.
10. 10. Spôsob produkcie . MGDF polypeptidu, vyznačujúci sa t ý m, že sa hostiteľská bunka podľa nároku 9 pestuje vo vhodnom živnom médiu a z buniek alebo z živného média sa izoluje MGDF polypeptid.
11. 11. Spôsob produkcie MGDF polypeptidu podľa nároku 10, vy značujúci sa tým, že hostiteľskou bunkou je E. coli.

    120
12. 12. Spôsob produkcie MGDF polypeptidu podľa nároku 10, vyznačujúci sa tým, že hostiteľskou bunkou je CHO.
13. 13. Protilátka reaktívna voči MGDF polypeptidu podľa nároku l.
14. 14. Monoklonálna protilátka podľa nároku 13.

    •
15. 15. Rekombinantná protilátka podľa nároku 13.
16. 16. MGDF derivát zahrnujúci MGDF polypeptid pripojený k aspoň jednému vodorozpustnému polyméru.
17. 17. MGDF derivát podľa nároku 16, kde MGDF polypeptid je zvolený zo súboru zahrnujúceho MGDF-1, MGDF-2, MGDF-4, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14 a MGDF-15.
18. 18. MGDF derivát podľa nároku 16, kde MGDF polypeptid je rekombinantne produkovaný v bakteriálnej bunke.
19. 19. MGDF derivát podľa nároku 16, kde vodorozpustný polymér je farmaceutický vhodný.
20. 20. MGDF derivát podľa nároku 16, kde vodorozpustný polymér je zvolený zo súboru zahrnujúceho dextrán, poly(N-vinylpyrolidón), polyetylénglykoly, homopolyméry propylénglykolu, kopolyméry propylénoxidu a etylénoxidu, » polyoxyetylované polyoly, polyvinylalkoholy a ich zmesi.
21. 21. MGDF derivát podľa nároku 16, kde vodorozpustným polymérom je polyetylénglykol.
22. 22. MGDF derivát podľa nároku 21, kde polyetylénglykolom je monometoxypolyetylénglykol.
23. 23. MGDF derivát podľa nároku 21, kde polyetylénglykol je

    121 pripojený k MGDF polypeptidu acylovou alebo alkylovou väzbou.
24. 24. MGDF derivát podľa nároku 23, kde polyetylénglykolová skupina je pripojená k N-koncu.
25. 25. MGDF derivát podľa nároku 23, kde polyetylénglykolová skupina má priemernú molekulovú hmotnosť 10 až 50 kDa.
26. 26. MGDF derivát podľa nároku 16, obsahujúci MGDF polypeptid • kovalentne pripojený k dvom molekulám vodorozpustného polyméru.
27. 27. MGDF derivát podľa nároku 26, kde obidve molekuly vodorozpustného polyméru sú polyetylénglykolové molekuly.
28. 28. Spôsob spájania vodorozpustného polyméru s MGDF polypeptidom za vzniku MGDF derivátu podľa nároku 16, pričom vodorozpustný polymér obsahuje reaktívnu aldehydovú skupinu, vyznačujúci sa tým, že sa terminálny aldehydový derivát polyetylénglykolu nechá reagovať s MGDF polypeptidom za prítomnosti redukčného činidla a izoluje sa MGDF polypeptid pripojený k aspoň jednému vodorozpustnému polyméru.
29. 29. Spôsob spájania vodorozpustného polyméru s MGDF polypeptidom za vzniku MGDF derivátu podľa nároku 16, pričom vodorozpustný polymér obsahuje jednu reaktívnu aldehydovú skupinu, vyznačujúci sa tým, že sa

    a) MGDF polypeptid uvedie do styku s vodorozpustným i polymérom pri podmienkach redukčnej alkylácie pri hodnote pH, ktorá je dostatočne kyslá, aby bola &-aminoskupina pri amínovom * konci MGDF polypeptidu reaktívna a

    b) izoluje MGDF polypeptid pripojený k aspoň jednému vodorozpustnému polyméru.
30. 30. Spôsob spájania vodorozpustného polyméru s MGDF polypeptidom za vzniku MGDF derivátu podľa nároku 16, pričom

    122 vodorozpustný polymér obsahuje jednu reaktívnu esterovú skupinu, vyznačujúci sa tým, že sa

    a) MGDF polypeptid uvedie do styku s vodorozpustným polymérom pri podmienkach, pri ktorých dochádza k pripojeniu MGDF polypeptidu k vodorozpustnému polyméru acylovou väzbou a

    b) izoluje MGDF polypeptid pripojený k aspoň jednému vodorozpustnému polyméru.
31. 31. Spôsob podľa niektorého z nárokov 28 až 30, vyznačujúci sa tým, že polymér je farmaceutický vhodný.
32. 32. Spôsob podľa niektorého z nárokov 28 až 30, vyznačujúci sa tým, že vodorozpustný polymér je zvolený zo súboru zahrnujúceho dextrán, poly(N-vinylpyrolidón), polyetylénglykoly, homopolyméry propylénglykolu, kopolyméry propylénoxidu a etylénoxidu, polyoxyetylované polyoly a polyvinylalkoholy.
33. 33. Spôsob podľa niektorého z nárokov 28 až 30, vyznačujúci sa tým, že vodorozpustným polymérom je polyetylénglykol.
34. 34. Monopegylovaný MGDF polypeptid.
35. 35. Monopegylovaný MGDF polypeptid podľa nároku 34, kde MGDF polypeptid je zvolený zo súboru zahrnujúceho MGDF-1, MGDF-2, MGDF-3, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7, MGDF-8, MGDF-11, MGDF-12, MGDF-13, MGDF-14 a MGDF-15.
36. 36. Spôsob spájania molekuly polyetylénglykolu s MGDF polypeptidom za vzniku monopegylovaného MGDF polypeptidu podľa nároku 34, pričom molekula polyetylénglykolu obsahuje obsahuje jednu reaktívnu aldehydovú skupinu, vyznačujúci sa tým, že sa

    123

    a) MGDF polypeptid uvedie do styku s molekulou polyetylénglykolu pri podmienkach redukčnej alkylácie pri hodnote pH, ktorá je dostatočne kyslá, aby bola &-aminoskupina pri amínovom konci MGDF polypeptidu reaktívna a

    b) izoluje sa pegylovaný MGDF polypeptid.
37. 37. Spôsob podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že MGDF polypeptid je vyrobený odštiepením Met“²-Lys^-1 z

    - polypeptidu získaného expresiou DNA kódujúcej polypeptid obsahujúci aminokyseliny 22 až 184 z obr. ll a sekvenciu Met-Lys pri jeho N-konci v bunkách E. coli.
38. 38. Spôsob podľa nároku 36, vyznačujúci sa tým, že MGDF polypeptid je vyrobený

    a. expresiou DNA kódujúcej polypeptid obsahujúci aminokyseliny 22 až 184 z obr. ll a sekvenciu Met-Lys pri jeho N-konci v bunkách E. coli.

    b. izoláciou exprimovaného polypeptidu a

    c. odštiepením Met^-2-Lys¹ z izolovaného polypeptidu.
39. 39. Spôsob podľa nároku 33 alebo 36, vyznačujúci sa tým, že polyetylénglykolová molekula má molekulovú hmotnosť 2 až 100 kDa.

    »
40. 40. Monopegylovaný MGDF polypeptidový produkt pripraviteľný spôsobom podľa nároku 36.
41. 41. V podstate homogénny prípravok MGDF polypeptidu podľa nároku 34, monopegylovaného na &-aminoskupine pri N-konci MGDF polypeptidu.
42. 42. Prípravok podľa nároku 41, kde MGDF polypeptid je monopegylovaný polyetylénglykolom s priemernou molekulovou

    124 hmotnosťou 5 až 50 kDa.
43. 43. Monopegylovaný MGDF polypeptid podľa nároku 34, v ktorom je polyetylénglykolová skupina pripojená k N-koncu polypeptidu.
44. 44. Monopegylovaný MGDF polypeptid podľa nároku 34, ktorého zložka MGDF polypeptidu je vyrobená v E. coli.
45. 45. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa. tým, že obsahuje MGDF derivát podľa nároku 16 a farmaceutický vhodné riedidlo, adjuvans alebo nosič.
46. 46. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje monopegylovaný MGDF polypeptid podľa nároku 34 a farmaceutický vhodné riedidlo, adjuvans alebo nosič.