TW201534726A - 熱穩定ｐｈ２０玻尿酸酶變異體及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供經修飾之PH20玻尿酸酶多肽，其在熱應力條件下顯示穩定性及活性。亦提供組成物及調配物以及其用途。

Description

熱穩定PH20玻尿酸酶變異體及其用途 【相關申請案】
主張Ge Wei於2013年7月3日申請之標題為「Thermally Stable PH20 Hyaluronidase Variants And Uses Thereof」的美國臨時申請案第61/957,567號之優先權益。在准許的情況下，上述申請案之主題以全文引用的方式併入本文中。
提供經修飾之PH20玻尿酸酶多肽，其在熱應力條件下顯示穩定性及活性。亦提供組成物及調配物以及其用途。
玻尿酸(透明質酸；HA)為一種存在於許多細胞之細胞外基質中，尤其存在於軟結締組織中之多肽。HA亦存在於哺乳動物之皮膚、軟骨及滑液中。玻尿酸為眼睛玻璃體之主要成分。HA在各種生理過程中，諸如在水及血漿蛋白恆定中起作用(Laurent TC等人(1992)FASEB J 6：2397-2404)。某些疾病與玻尿酸之表現及/或產生及/或累積相關。
降解玻尿酸之酶，諸如玻尿酸酶，為使玻尿酸降解之酶。藉由催化HA降解，降解玻尿酸之酶(例如玻尿酸酶)可用於治療與HA或其他葡糖胺聚糖累積相關之疾病或病症。HA為間質障壁之主要組分，降解玻尿酸之酶(例 如玻尿酸酶)增加組織滲透性，因此可用於增加治療劑之分散及傳遞。各種玻尿酸酶已在治療學上進行使用(例如HydaseTM、VitraseTM及WydaseTM玻尿酸酶)，典型地作為分散及擴散劑與其他治療劑組合。需要可用於治療上的改良之降解玻尿酸之酶，諸如玻尿酸酶，及含有此類酶之組成物。
本文提供稱為尤伯嗜熱蛋白(uber-thermophile)之經修飾之PH20多肽，其顯示熱穩定性。本文所提供之經修飾之PH20多肽在未經修飾之PH20多肽中含有胺基酸置換，從而與在4℃下培育10分鐘之後其玻尿酸酶活性相比，該多肽在52℃下培育10分鐘之後保留其玻尿酸酶活性之至少50%。舉例而言，經修飾之PH20多肽在未經修飾之PH20多肽中含有胺基酸置換，該未經修飾之PH20多肽由SEQ ID NO：7中闡述之胺基酸序列組成，或為可溶性PH20多肽之其C端截短片段，或與SEQ ID NO：7具有至少85%序列一致性之胺基酸序列的或其可溶性C端截短片段。本文所提供之經修飾之PH20多肽包括與在4℃下培育10分鐘之後其玻尿酸酶活性相比，在52℃下培育10分鐘之後保留其玻尿酸酶活性之至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上的多肽。
舉例而言，本文所提供之任何經修飾之PH20多肽在參考SEQ ID NO：3中闡述之序列之胺基酸位置，對應於選自以下之位置的胺基酸位置含有至少一個胺基酸置換：10、11、13、15、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、38、39、41、46、47、48、49、50、58、60、67、69、72、73、83、84、86、87、90、92、93、94、97、98、99、102、105、114、118、120、131、132、135、138、139、141、142、143、144、146、147、148、150、151、 152、154、155、156、158、159、160、161、162、163、165、170、174、195、196、197、198、202、204、205、206、208、213、215、219、220、222、234、235、237、240、247、251、255、259、260、261、263、265、271、276、277、278、282、284、285、290、292、305、306、309、310、311、315、317、318、320、321、328、342、343、349、359、368、369、371、373、374、375、376、377、379、380、388、389、393、399、401、403、406、407、410、412、413、415、417、419、421、428、431、433、434、435、438、439、440、441、442、443、445、446及447，其中對應胺基酸位置藉由將PH20多肽與SEQ ID NO：3中闡述之多肽進行比對來鑑別。
在特定實例中，本文所提供之任何經修飾之PH20多肽含有如下胺基酸置換：在對應於位置10之位置，經G或N置換；在對應於位置11之位置，經G置換；在對應於位置13之位置，經H置換；在對應於位置15之位置，經A或V置換；在對應於位置26之位置，經P、R、S、V、W或Y置換；在對應於位置27之位置，經E或H置換；在對應於位置28之位置，經L置換；在對應於位置29之位置，經E、H、L、S或W置換；在對應於位置30之位置，經A、P或R置換；在對應於位置31之位置，經C、G或L置換；在對應於位置32之位置，經Q、S、V或W置換； 在對應於位置33之位置，經G、M、R或W置換；在對應於位置34之位置，經E、H或W置換；在對應於位置36之位置，經G置換；在對應於位置37之位置，經I或K置換；在對應於位置38之位置，經Y置換；在對應於位置39之位置，經Q、R或T置換；在對應於位置41之位置，經D、T或W置換；在對應於位置46之位置，經H置換；在對應於位置47之位置，經G或R置換；在對應於位置48之位置，經G或Y置換；在對應於位置49之位置，經I置換；在對應於位置50之位置，經C或D置換；在對應於位置58之位置，經K或R置換；在對應於位置60之位置，經K置換；在對應於位置67之位置，經F置換；在對應於位置69之位置，經A或Y置換；在對應於位置72之位置，經D置換；在對應於位置73之位置，經T置換；在對應於位置83之位置，經G、Q或V置換；在對應於位置84之位置，經D置換；在對應於位置86之位置，經D、E、N或R置換；在對應於位置87之位置，經M、P或V置換； 在對應於位置90之位置，經E、T或W置換；在對應於位置92之位置，經V置換；在對應於位置93之位置，經E或S置換；在對應於位置94之位置，經N置換；在對應於位置97之位置，經E或F置換；在對應於位置98之位置，經M置換；在對應於位置99之位置，經S置換；在對應於位置102之位置，經H或N置換；在對應於位置105之位置，經I、R或W置換；在對應於位置114之位置，經G置換；在對應於位置118之位置，經M置換；在對應於位置120之位置，經S置換；在對應於位置131之位置，經C或L置換；在對應於位置132之位置，經A或C置換；在對應於位置135之位置，經Q置換；在對應於位置138之位置，經W置換；在對應於位置139之位置，經R或V置換；在對應於位置141之位置，經M、Q、W或Y置換；在對應於位置142之位置，經Q置換；在對應於位置143之位置，經K置換；在對應於位置144之位置，經G置換；在對應於位置146之位置，經V置換； 在對應於位置147之位置，經G、I或M置換；在對應於位置148之位置，經C、H或K置換；在對應於位置150之位置，經L置換；在對應於位置151之位置，經Q置換；在對應於位置152之位置，經A、I、M或T置換；在對應於位置154之位置，經R置換；在對應於位置155之位置，經A、D、F、H、L、R、S或V置換；在對應於位置156之位置，經A、C或Q置換；在對應於位置158之位置，經H置換；在對應於位置159之位置，經A、H、N、Q或S置換；在對應於位置160之位置，經Y置換；在對應於位置161之位置，經A或D置換；在對應於位置162之位置，經L置換；在對應於位置163之位置，經K、R或S置換；在對應於位置165之位置，經F置換；在對應於位置170之位置，經R置換；在對應於位置174之位置，經W置換；在對應於位置195之位置，經H、L或N置換；在對應於位置196之位置，經T置換；在對應於位置197之位置，經F置換；在對應於位置198之位置，經L置換；在對應於位置202之位置，經M置換； 在對應於位置204之位置，經P置換；在對應於位置205之位置，經A、E、K、L、P、S或T置換；在對應於位置206之位置，經I置換；在對應於位置208之位置，經L、Q或R置換；在對應於位置213之位置，經E或N置換；在對應於位置215之位置，經A、D、E、H、T、V或W置換；在對應於位置219之位置，經A、R、S或T置換；在對應於位置220之位置，經V置換；在對應於位置222之位置，經N置換；在對應於位置234之位置，經M置換；在對應於位置235之位置，經T置換；在對應於位置237之位置，經Q置換；在對應於位置240之位置，經Q置換；在對應於位置247之位置，經I置換；在對應於位置251之位置，經L或M置換；在對應於位置255之位置，經R置換；在對應於位置259之位置，經K或P置換；在對應於位置260之位置，經G或M置換；在對應於位置261之位置，經A或F置換；在對應於位置263之位置，經T置換；在對應於位置265之位置，經I置換；在對應於位置271之位置，經V置換； 在對應於位置276之位置，經E置換；在對應於位置277之位置，經A、C、E或H置換；在對應於位置278之位置，經G、H、K或N置換；在對應於位置282之位置，經G或Q置換；在對應於位置284之位置，經A、Q或S置換；在對應於位置285之位置，經M或Y置換；在對應於位置29 0之位置，經M置換；在對應於位置292之位置，經V置換；在對應於位置305之位置，經D或N置換；在對應於位置306之位置，經D置換；在對應於位置309之位置，經E、H或L置換；在對應於位置310之位置，經Q或R置換；在對應於位置311之位置，經G或K置換；在對應於位置315之位置，經T置換；在對應於位置317之位置，經N置換；在對應於位置318之位置，經K、M、N或Q置換；在對應於位置320之位置，經R置換；在對應於位置321之位置，經A、H或R置換；在對應於位置328之位置，經L或R置換；在對應於位置342之位置，經A置換；在對應於位置343之位置，經V置換；在對應於位置349之位置，經A或E置換； 在對應於位置359之位置，經E置換；在對應於位置368之位置，經H或K置換；在對應於位置369之位置，經H置換；在對應於位置371之位置，經E、F、M或T置換；在對應於位置373之位置，經S置換；在對應於位置374之位置，經A或V置換；在對應於位置375之位置，經T置換；在對應於位置376之位置，經Y置換；在對應於位置377之位置，經T置換；在對應於位置379之位置，經H、S或T置換；在對應於位置380之位置，經I、L、P、T或V置換；在對應於位置388之位置，經H置換；在對應於位置389之位置，經K置換；在對應於位置393之位置，經L置換；在對應於位置399之位置，經R或W置換；在對應於位置401之位置，經G置換；在對應於位置403之位置，經F置換；在對應於位置406之位置，經N置換；在對應於位置407之位置，經F、H、M、P或Q置換；在對應於位置410之位置，經S置換；在對應於位置412之位置，經G、P或S置換；在對應於位置413之位置，經Q或T置換； 在對應於位置415之位置，經W置換；在對應於位置417之位置，經L置換；在對應於位置419之位置，經L置換；在對應於位置421之位置，經I或M置換；在對應於位置428之位置，經P置換；在對應於位置431之位置，經A或G置換；在對應於位置433之位置，經L或T置換；在對應於位置434之位置，經I或M置換；在對應於位置435之位置，經H置換；在對應於位置438之位置，經A置換；在對應於位置439之位置，經C或T置換；在對應於位置440之位置，經M置換；在對應於位置441之位置，經T或V置換；在對應於位置442之位置，經P置換；在對應於位置443之位置，經M置換；在對應於位置445之位置，經Y置換；在對應於位置446之位置，經C、D、E或G置換；或在對應於位置447之位置，經D、E或G置換，每一者參考SEQ ID NO：3中闡述之序列之胺基酸位置。
舉例而言，本文所提供之任何經修飾之PH20多肽含有至少一個如下置換之胺基酸置換：參考SEQ ID NO：3中闡述之序列之胺基酸殘基位置，在對應於位置11之位置經甘胺酸(G)置換；在對應於位置15之位置經A置 換；在對應於位置15之位置經V置換；在對應於位置26之位置經R置換；在對應於位置26之位置經S置換；在對應於位置27之位置經E置換；在對應於位置27之位置經H置換；在對應於位置29之位置經H置換；在對應於位置29之位置經S置換；在對應於位置30之位置經A置換；在對應於位置30之位置經P置換；在對應於位置31之位置經G置換；在對應於位置31之位置經L置換；在對應於位置32之位置經Q置換；在對應於位置32之位置經W置換；在對應於位置33之位置經G置換；在對應於位置33之位置經M置換；在對應於位置33之位置經R置換；在對應於位置33之位置經W置換；在對應於位置34之位置經E置換；在對應於位置34之位置經H置換；在對應於位置34之位置經W置換；在對應於位置37之位置經K置換；在對應於位置38之位置經Y置換；在對應於位置39之位置經Q置換；在對應於位置39之位置經R置換；在對應於位置39之位置經T置換；在對應於位置41之位置經D置換；在對應於位置41之位置經T置換；在對應於位置41之位置經W置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置50之位置經C置換；在對應於位置50之位置經D置換；在對應於位置58之位置經K置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置60之位置經K置換；在對應於位置67之位置經F置換；在對應於位置69之位置經A置換；在對應於位置69之位置經Y置換；在對應於位置83之位置經Q置換；在對應於位置84之位置經D置換；在對應於位置86之位置經D置換；在對應於位置86之位置經E置換；在對應於位置86之位置經R置換；在對應於位置87之位置經P置換；在對應於位置90之位置經W置換；在對應於位置92之位置經V置換；在對應於位置93 之位置經E置換；在對應於位置93之位置經S置換；在對應於位置94之位置經N置換；在對應於位置97之位置經F置換；在對應於位置98之位置經M置換；在對應於位置99之位置經S置換；在對應於位置102之位置經H置換；在對應於位置114之位置經G置換；在對應於位置118之位置經M置換；在對應於位置120之位置經S置換；在對應於位置131之位置經C置換；在對應於位置131之位置經L置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置138之位置經W置換；在對應於位置139之位置經R置換；在對應於位置139之位置經V置換；在對應於位置141之位置經M置換；在對應於位置141之位置經Y置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置144之位置經G置換；在對應於位置146之位置經V置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置148之位置經K置換；在對應於位置150之位置經L置換；在對應於位置151之位置經Q置換；在對應於位置152之位置經I置換；在對應於位置152之位置經M置換；在對應於位置152之位置經T置換；在對應於位置154之位置經R置換；在對應於位置155之位置經A置換；在對應於位置155之位置經D置換；在對應於位置155之位置經F置換；在對應於位置155之位置經H置換；在對應於位置155之位置經L置換；在對應於位置155之位置經R置換；在對應於位置155之位置經S置換；在對應於位置158之位置經H置換；在對應於位置159之位置經A置換；在對應於位置159之位置經H置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置159之位置經Q置換；在對應於位置159之位置經S 置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置161之位置經A置換；在對應於位置162之位置經L置換；在對應於位置163之位置經K置換；在對應於位置163之位置經R置換；在對應於位置163之位置經S置換；在對應於位置165之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置195之位置經H置換；在對應於位置195之位置經L置換；在對應於位置196之位置經T置換；在對應於位置197之位置經F置換；在對應於位置198之位置經L置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置205之位置經E置換；在對應於位置205之位置經K置換；在對應於位置205之位置經L置換；在對應於位置205之位置經T置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置208之位置經Q置換；在對應於位置208之位置經R置換；在對應於位置213之位置經E置換；在對應於位置213之位置經N置換；在對應於位置215之位置經E置換；在對應於位置215之位置經H置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置222之位置經N置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置237之位置經Q置換；在對應於位置240之位置經Q置換；在對應於位置247之位置經I置換；在對應於位置251之位置經L置換；在對應於位置251之位置經M置換；在對應於位置259之位置經K置換；在對應於位置259之位置經P置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置271之位置經V置換；在對應於位置276之位置經E置換；在對應於位置277之位置經A置換；在對應於位置277之位置經C 置換；在對應於位置278之位置經N置換；在對應於位置282之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置285之位置經M置換；在對應於位置292之位置經V置換；在對應於位置305之位置經N置換；在對應於位置306之位置經D置換；在對應於位置310之位置經R置換；在對應於位置311之位置經G置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置317之位置經N置換；在對應於位置321之位置經A置換；在對應於位置321之位置經R置換；在對應於位置328之位置經L置換；在對應於位置328之位置經R置換；在對應於位置342之位置經A置換；在對應於位置368之位置經H置換；在對應於位置368之位置經K置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置371之位置經F置換；在對應於位置373之位置經S置換；在對應於位置377之位置經T置換；在對應於位置379之位置經H置換；在對應於位置379之位置經S置換；在對應於位置379之位置經T置換；在對應於位置380之位置經I置換；在對應於位置380之位置經L置換；在對應於位置380之位置經P置換；在對應於位置380之位置經T置換；在對應於位置388之位置經H置換；在對應於位置406之位置經N置換；在對應於位置407之位置經F置換；在對應於位置407之位置經Q置換；在對應於位置410之位置經S置換；在對應於位置412之位置經G置換；在對應於位置412之位置經P置換；在對應於位置412之位置經S置換；在對應於位置413之位置經Q置換；在對應於位置421之位置經M置換；在對應於位置428之位置經P置換；在對應於位置431之位置經A置換；在對應於位置433之位置經L 置換；在對應於位置433之位置經T置換；在對應於位置438之位置經A置換；在對應於位置439之位置經C置換；在對應於位置441之位置經T置換；在對應於位置443之位置經M置換；在對應於位置445之位置經Y置換；在對應於位置446之位置經C置換；在對應於位置446之位置經D置換；在對應於位置446之位置經E置換；在對應於位置446之位置經G置換；在對應於位置447之位置經E置換；或在對應於位置447之位置經G置換。
在本文所提供之任何經修飾之PH20多肽的實例中，與未經修飾之PH20多肽相比，經修飾之PH20多肽僅含有一個胺基酸置換。在本文所提供之任何經修飾之PH20多肽的其他實例中，與未經修飾之PH20多肽相比，經修飾之PH20多肽含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸置換，或與未經修飾之PH20多肽相比，含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸置換。
舉例而言，本文所提供之經修飾之PH20多肽包括含有至少2個胺基酸置換，諸如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸置換的任何經修飾之PH20多肽，其中胺基酸置換為兩個或兩個以上如下置換：參考SEQ ID NO：3中闡述之序列之胺基酸殘基位置，在對應於位置11之位置經甘胺酸(G)置換；在對應於位置15之位置經A置換；在對應於位置15之位置經V置換；在對應於位置26之位置經R置換；在對應於位置26之位置經S置換；在對應於位置27之位置經E置換；在對應於位置27之位置經H置換；在對應於位置29之位置經H置 換；在對應於位置29之位置經S置換；在對應於位置30之位置經A置換；在對應於位置30之位置經P置換；在對應於位置31之位置經G置換；在對應於位置31之位置經L置換；在對應於位置32之位置經Q置換；在對應於位置32之位置經W置換；在對應於位置33之位置經G置換；在對應於位置33之位置經M置換；在對應於位置33之位置經R置換；在對應於位置33之位置經W置換；在對應於位置34之位置經E置換；在對應於位置34之位置經H置換；在對應於位置34之位置經W置換；在對應於位置37之位置經K置換；在對應於位置38之位置經Y置換；在對應於位置39之位置經Q置換；在對應於位置39之位置經R置換；在對應於位置39之位置經T置換；在對應於位置41之位置經D置換；在對應於位置41之位置經T置換；在對應於位置41之位置經W置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置50之位置經C置換；在對應於位置50之位置經D置換；在對應於位置58之位置經K置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置60之位置經K置換；在對應於位置67之位置經F置換；在對應於位置69之位置經A置換；在對應於位置69之位置經Y置換；在對應於位置83之位置經Q置換；在對應於位置84之位置經D置換；在對應於位置86之位置經D置換；在對應於位置86之位置經E置換；在對應於位置86之位置經R置換；在對應於位置87之位置經P置換；在對應於位置90之位置經W置換；在對應於位置92之位置經V置換；在對應於位置93之位置經E置換；在對應於位置93之位置經S置換；在對應於位置94之位置經N置換；在對應於位置97之位置經F置換；在對應於位置98之位置經M置換；在對應於位置99之位置經S置換；在對應於位置102 之位置經H置換；在對應於位置114之位置經G置換；在對應於位置118之位置經M置換；在對應於位置120之位置經S置換；在對應於位置131之位置經C置換；在對應於位置131之位置經L置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置138之位置經W置換；在對應於位置139之位置經R置換；在對應於位置139之位置經V置換；在對應於位置141之位置經M置換；在對應於位置141之位置經Y置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置144之位置經G置換；在對應於位置146之位置經V置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置148之位置經K置換；在對應於位置150之位置經L置換；在對應於位置151之位置經Q置換；在對應於位置152之位置經I置換；在對應於位置152之位置經M置換；在對應於位置152之位置經T置換；在對應於位置154之位置經R置換；在對應於位置155之位置經A置換；在對應於位置155之位置經D置換；在對應於位置155之位置經F置換；在對應於位置155之位置經H置換；在對應於位置155之位置經L置換；在對應於位置155之位置經R置換；在對應於位置155之位置經S置換；在對應於位置158之位置經H置換；在對應於位置159之位置經A置換；在對應於位置159之位置經H置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置159之位置經Q置換；在對應於位置159之位置經S置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置161之位置經A置換；在對應於位置162之位置經L置換；在對應於位置163之位置經K置換；在對應於位置163之位置經R置換；在對應於位置163 之位置經S置換；在對應於位置165之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置195之位置經H置換；在對應於位置195之位置經L置換；在對應於位置196之位置經T置換；在對應於位置197之位置經F置換；在對應於位置198之位置經L置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置205之位置經E置換；在對應於位置205之位置經K置換；在對應於位置205之位置經L置換；在對應於位置205之位置經T置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置208之位置經Q置換；在對應於位置208之位置經R置換；在對應於位置213之位置經E置換；在對應於位置213之位置經N置換；在對應於位置215之位置經E置換；在對應於位置215之位置經H置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置222之位置經N置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置237之位置經Q置換；在對應於位置240之位置經Q置換；在對應於位置247之位置經I置換；在對應於位置251之位置經L置換；在對應於位置251之位置經M置換；在對應於位置259之位置經K置換；在對應於位置259之位置經P置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置271之位置經V置換；在對應於位置276之位置經E置換；在對應於位置277之位置經A置換；在對應於位置277之位置經C置換；在對應於位置278之位置經N置換；在對應於位置282之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置285之 位置經M置換；在對應於位置292之位置經V置換；在對應於位置305之位置經N置換；在對應於位置306之位置經D置換；在對應於位置310之位置經R置換；在對應於位置311之位置經G置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置317之位置經N置換；在對應於位置321之位置經A置換；在對應於位置321之位置經R置換；在對應於位置328之位置經L置換；在對應於位置328之位置經R置換；在對應於位置342之位置經A置換；在對應於位置368之位置經H置換；在對應於位置368之位置經K置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置371之位置經F置換；在對應於位置373之位置經S置換；在對應於位置377之位置經T置換；在對應於位置379之位置經H置換；在對應於位置379之位置經S置換；在對應於位置379之位置經T置換；在對應於位置380之位置經I置換；在對應於位置380之位置經L置換；在對應於位置380之位置經P置換；在對應於位置380之位置經T置換；在對應於位置388之位置經H置換；在對應於位置406之位置經N置換；在對應於位置407之位置經F置換；在對應於位置407之位置經Q置換；在對應於位置410之位置經S置換；在對應於位置412之位置經G置換；在對應於位置412之位置經P置換；在對應於位置412之位置經S置換；在對應於位置413之位置經Q置換；在對應於位置421之位置經M置換；在對應於位置428之位置經P置換；在對應於位置431之位置經A置換；在對應於位置433之位置經L置換；在對應於位置433之位置經T置換；在對應於位置438之位置經A置換；在對應於位置439之位置經C置換；在對應於位置441之位置經T置換；在對應於位置443之位置經M置換；在對應於位置445之位置經Y 置換；在對應於位置446之位置經C置換；在對應於位置446之位置經D置換；在對應於位置446之位置經E置換；在對應於位置446之位置經G置換；在對應於位置447之位置經E置換；或在對應於位置447之位置經G置換。
在本文所提供之經修飾之PH20多肽的任何以上實例中，該胺基酸置換或該等胺基酸置換包含如下置換：參考SEQ ID NO：3中之位置，在對應於位置15之位置經丙胺酸(A)置換；在對應於位置15之位置經V置換；在對應於位置26之位置經R置換；在對應於位置27之位置經E置換；在對應於位置29之位置經S置換；在對應於位置31之位置經G置換；在對應於位置31之位置經L置換；在對應於位置32之位置經Q置換；在對應於位置33之位置經G置換；在對應於位置33之位置經M置換；在對應於位置33之位置經R置換；在對應於位置33之位置經W置換；在對應於位置34之位置經E置換；在對應於位置34之位置經H置換；在對應於位置38之位置經Y置換；在對應於位置39之位置經R置換；在對應於位置41之位置經W置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置50之位置經C置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置69之位置經A置換；在對應於位置86之位置經D置換；在對應於位置86之位置經E置換；在對應於位置86之位置經R置換；在對應於位置90之位置經W置換；在對應於位置93之位置經E置換；在對應於位置93之位置經S置換；在對應於位置97之位置經F置換；在對應於位置99之位置經S置換；在對應於位置120之位置經S置換；在對應於位置131之位置經L置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置138之位置經W置換； 在對應於位置139之位置經R置換；在對應於位置139之位置經V置換；在對應於位置141之位置經M置換；在對應於位置141之位置經Y置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置146之位置經V置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置148之位置經K置換；在對應於位置150之位置經L置換；在對應於位置151之位置經Q置換；在對應於位置152之位置經I置換；在對應於位置152之位置經M置換；在對應於位置152之位置經T置換；在對應於位置154之位置經R置換；在對應於位置155之位置經A置換；在對應於位置155之位置經F置換；在對應於位置155之位置經L置換；在對應於位置155之位置經R置換；在對應於位置158之位置經H置換；在對應於位置159之位置經H置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置159之位置經Q置換；在對應於位置159之位置經S置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置163之位置經R置換；在對應於位置165之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置198之位置經L置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置205之位置經L置換；在對應於位置205之位置經T置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置208之位置經Q置換；在對應於位置208之位置經R置換；在對應於位置213之位置經N置換；在對應於位置215之位置經E置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置237之位置經Q置換；在對應於位置240之位置經Q置換；在對 應於位置251之位置經L置換；在對應於位置259之位置經K置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置271之位置經V置換；在對應於位置276之位置經E置換；在對應於位置277之位置經A置換；在對應於位置277之位置經C置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置292之位置經V置換；在對應於位置305之位置經N置換；在對應於位置306之位置經D置換；在對應於位置310之位置經R置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置328之位置經R置換；在對應於位置342之位置經A置換；在對應於位置368之位置經K置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置373之位置經S置換；在對應於位置379之位置經H置換；在對應於位置379之位置經S置換；在對應於位置379之位置經T置換；在對應於位置380之位置經I置換；在對應於位置380之位置經L置換；在對應於位置380之位置經P置換；在對應於位置380之位置經T置換；在對應於位置388之位置經H置換；在對應於位置412之位置經G置換；在對應於位置412之位置經P置換；在對應於位置412之位置經S置換；在對應於位置413之位置經Q置換；在對應於位置433之位置經T置換；在對應於位置438之位置經A置換；在對應於位置441之位置經T置換；在對應於位置443之位置經M置換；在對應於位置445之位置經Y置換；在對應於位置446之位置經C置換；在對應於位置447之位置經E置換；或在對應於位置447之位置經G置換。
舉例而言，在本文所提供之經修飾之PH20多肽的任何以上實例中，該胺基酸置換或該等胺基酸置換包括如下置換：參考SEQ IID NO：3中之位置，在對應於位置15之位置經丙胺酸(A)置換；在對應於位置15之位置經V置換；在對應於位置26之位置經R置換；在對應於位置27之位置經E置換；在對應於位置29之位置經S置換；在對應於位置31之位置經G置換；在對應於位置33之位置經G置換；在對應於位置33之位置經M置換；在對應於位置33之位置經R置換；在對應於位置33之位置經W置換；在對應於位置34之位置經E置換；在對應於位置34之位置經H置換；在對應於位置38之位置經Y置換；在對應於位置39之位置經R置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置86之位置經R置換；在對應於位置90之位置經W置換；在對應於位置93之位置經E置換；在對應於位置93之位置經S置換；在對應於位置97之位置經F置換；在對應於位置120之位置經S置換；在對應於位置131之位置經L置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置139之位置經R置換；在對應於位置141之位置經M置換；在對應於位置141之位置經Y置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置148之位置經K置換；在對應於位置152之位置經M置換；在對應於位置152之位置經T置換；在對應於位置154之位置經R置換；在對應於位置155之位置經A置換；在對應於位置155之位置經F置換；在對應於位置155之位置經L置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置159之位置經S置換；在對應於位置160 之位置經Y置換；在對應於位置163之位置經R置換；在對應於位置165之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置198之位置經L置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置205之位置經L置換；在對應於位置205之位置經T置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置208之位置經R置換；在對應於位置213之位置經N置換；在對應於位置215之位置經E置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置240之位置經Q置換；在對應於位置251之位置經L置換；在對應於位置259之位置經K置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置271之位置經V置換；在對應於位置277之位置經A置換；在對應於位置277之位置經C置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置292之位置經V置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置342之位置經A置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置379之位置經H置換；在對應於位置379之位置經S置換；在對應於位置379之位置經T置換；在對應於位置380之位置經L置換；在對應於位置380之位置經P置換；在對應於位置380之位置經T置換；在對應於位置388之位置經H置換；在對應於位置412之位置經G置換；在對應於位置412之位置經P置換；在對應於位置412之位置經S置換；在對應於位置433之位置經T置換；在對應於位置438之位置經A置換；在對應於位置441之位置經T置換；在對應於位置443之 位置經M置換；在對應於位置445之位置經Y置換；在對應於位置446之位置經C置換；在對應於位置447之位置經E置換；或在對應於位置447之位置經G置換。
在另一實例中，在本文所提供之經修飾之PH20多肽的任何以上實例中，該胺基酸置換或該等胺基酸置換包括如下置換：參考SEQ ID NO：3中之位置，在對應於位置27之位置經麩胺酸(E)置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置315之位置經T置換；及在對應於位置379之位置經S置換。
在另一實例中，在本文所提供之經修飾之PH20多肽的任何以上實例中，該胺基酸置換或該等胺基酸置換包括如下置換：參考SEQ ID NO：3中之位置，在對應於位置30之位置經P置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置60之位置經K置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置311之位置經G置換； 在對應於位置315之位置經T置換；或在對應於位置369之位置經H置換。
在本文中之實例中，在本文所提供之經修飾之PH20多肽的任何以上實例中，該胺基酸置換或該等胺基酸置換包括如下置換：參考SEQ ID NO：3中之位置，在對應於位置30之位置經P置換；在對應於位置60之位置經K置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置311之位置經G置換；在對應於位置315之位置經T置換；或在對應於位置369之位置經H置換。
在任何以上實例中，經修飾之PH20多肽在具有SEQ ID NO：3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、388、390、392或400中之任一者中闡述之胺基酸序列或與SEQ ID NO：3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、388、390、392或400至少80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致之胺基酸序列的未經修飾之PH20多肽中含有一個胺基酸置換至多個胺基酸置換。舉例而言，該胺基酸置換或該等胺基酸置換在具有SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中闡述之胺基酸序列或顯示與SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者至少91%序列一致性之胺基酸序列的未經修飾之PH20多肽中。未經修飾之多肽可為人類多肽。
在本文所提供之經修飾之PH20多肽的任何實例中，經修飾之PH20多肽顯示與SEQ ID NO：3中闡述之胺基酸序列至少68%胺基酸序列一致性，諸如與SEQ ID NO：3中闡述之胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%胺基酸序列一致性。本文所提供之任何經修飾之PH20多肽包括作為缺乏信號序列之成熟PH20多肽的經修飾之PH20多肽。在本文中之實例中，經修飾之PH20多肽不含SEQ ID NO：8-31、69、72、387-392、399或400中之任一者中闡述之胺基酸序列或由其組成。
舉例而言，本文提供一種經修飾之PH20多肽，其含有SEQ ID NO：73-386中之任一者中闡述之胺基酸序列或顯示與SEQ ID NO：73-386中之任一者中闡述之胺基酸序列至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性的胺基酸序列。
在本文所提供之經修飾之PH20多肽的任何實例中，經修飾之PH20多肽實質上經純化或分離。本文所提供之任何經修飾之PH20多肽在中性pH值下顯示玻尿酸酶活性。本文所提供之任何經修飾之PH20多肽包括能夠在自細胞表現時分泌且可溶於上清液中之多肽。舉例而言，細胞可為哺乳動物細胞，諸如BHK、CHO、Balb/3T3、海拉(HeLa)、MT2、小鼠NS0(非分泌)及其他骨髓瘤細胞系、融合瘤及異種融合瘤細胞系、淋巴細胞、纖維母細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8或HKB細胞。
本文所提供之任何經修飾之PH20多肽包括藉由糖基化、唾液酸化、白蛋白化、法尼基化、羧化、羥基化或磷酸化中之一或多者修飾或含有其中一或多者的多肽。舉例而言，經修飾之PH20多肽經糖基化，其中該多肽具有至少一個連接於至少三個天冬醯胺(N)殘基(諸如對應於SEQ ID NO：3之胺基酸殘基200、333及358的天冬醯胺殘基)中每一者的N-乙醯基葡糖胺部分。
本文所提供之任何經修飾之PH20多肽亦包括與聚合物，諸如聚葡萄糖 或PEG，或與作為多聚化結構域、毒素、可偵測標記或藥物之部分結合的多肽。舉例而言，經修飾之PH20多肽與Fc結構域結合。本文亦提供含有本文所提供之任何經修飾之PH20多肽直接或經由連接子間接連接於靶向劑之結合物。
本文提供編碼本文所提供之任何經修飾之PH20多肽的核酸分子。亦提供含有本文所提供之任何核酸之載體。載體可為真核或原核載體，諸如哺乳動物載體或病毒載體。舉例而言，載體為腺病毒載體、反轉錄病毒載體或牛痘病毒載體。本文亦提供含有本文所提供之任何載體的細胞。細胞可為哺乳動物細胞或非哺乳動物細胞。舉例而言，細胞為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
本文提供一種產生作為尤伯嗜熱蛋白之經修飾之PH20多肽的方法，其藉由將本文所提供之核酸或載體中之任一者引入能夠將N連接之糖部分併入多肽中之細胞中，在細胞產生所編碼之經修飾之PH20多肽且分泌的條件下培養細胞；以及回收表現之PH20多肽。在此類方法中，核酸可操作地連接於啟動子。細胞可為真核細胞或原核細胞。典型地，細胞為能夠糖基化之細胞。舉例而言，細胞為哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。本文亦提供藉由以上方法產生之經修飾之PH20多肽。
本文提供含有本文所提供之任何經修飾之PH20多肽的醫藥組成物。醫藥組成物可含有醫藥學上可接受之賦形劑。在本文所提供之任何醫藥組成物中經修飾之PH20多肽在無冷凍下儲存超過48小時時，與其在冷凍下儲存相同時段時相比，顯示其玻尿酸酶之超過75%、80%、85%、90%、95%或95%以上。舉例而言，當在無冷凍下儲存超過72小時、96小時、一週、 兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月或六個月時，與其在冷凍下儲存相同時段時相比，顯示該活性。在此等實例中，在無冷凍下儲存組成物將組成物暴露於在18℃至45℃、25℃至42℃或30℃至37℃之間的環境溫度一段時間，包括持續、間歇或變化之時段。
在本文所提供之醫藥組成物之任何實例中，醫藥組成物在不存在如胺基酸、胺基酸衍生物、胺、糖、多元醇、界面活性劑、防腐劑、玻尿酸酶抑制劑或白蛋白之穩定劑之情況下調配。舉例而言，醫藥組成物在不存在鹽之情況下調配或在濃度低於130mM之鹽下調配。
在本文所提供之醫藥組成物之任何實例中，醫藥組成物經調配用於單劑投予或多劑投予。醫藥組成物可經調配用於直接投予。本文所提供之任何醫藥組成物包括液體組成物。
在本文所提供之任何醫藥組成物之實例中，經修飾之PH20之濃度為或為約0.1μg/mL至100μg/mL、1μg/mL至50μg/mL或1μg/mL至20μg/mL。舉例而言，本文所提供之任何醫藥組成物中經修飾之PH20之量在或約在10U/mL至5000U/mL、50U/mL至4000U/mL、100U/mL至2000U/mL、300U/mL至2000U/mL、600U/mL至2000U/mL或100U/mL至1000U/mL之間。本文所提供之任何醫藥組成物之體積為或為約0.5mL至50mL、1mL至10mL或1mL至5mL，例如至少0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL或更多。
本文所提供之任何醫藥組成物包括含有本文所提供之任何經修飾之PH20多肽及治療學上之活性劑的任何醫藥組成物。本文亦提供含有第一組 成物與第二組成物的組合，該第一組成物為本文所提供之任何以上組成物或為含有本文所提供之經修飾之PH20多肽的任何組成物，該第二組成物含有治療劑或治療學上之活性劑。在任何以上組成物或組合中，治療劑為多肽、蛋白質、核酸、藥物、小分子或有機分子。舉例而言，治療學上之活性劑為化學治療劑、鎮痛劑、消炎劑、抗微生物劑、殺阿米巴蟲劑、殺滴蟲劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗驚厥劑、抗抑鬱劑及抗關節炎劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、解熱劑、抗寄生蟲劑、抗組織胺劑、α-腎上腺素促效劑、α阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴張劑、殺生物劑、殺菌劑、抑菌劑、β腎上腺素阻斷劑、鈣通道阻斷劑、心臟血管藥、避孕劑、解充血劑、利尿劑、抑鬱劑、診斷劑、電解質劑、催眠劑、激素藥劑、高血糖劑、肌肉鬆弛劑、肌肉收縮劑、眼用藥劑、擬副交感神經劑、精神強奮劑、鎮靜劑、擬交感神經劑、安神劑、泌尿劑、陰道用劑、殺病毒劑、維生素劑、非類固醇消炎劑、血管收縮素轉化酶抑制劑或睡眠誘導劑。
舉例而言，任何以上組成物或組合中包括，治療劑為抗體、免疫球蛋白、雙膦酸鹽、細胞介素、化學治療劑、凝血因子或胰島素，諸如快速作用之胰島素。任何以上組成物或組合亦包括，治療劑為阿達木單抗(Adalimumab)、阿加糖酶β(Agalsidase Beta)、阿法賽特(Alefacept)、安比西林(Ampicillin)、阿那白滯素(Anakinra)、抗脊髓灰白質炎疫苗(Antipoliomyelitic Vaccine)、抗胸腺細胞(Anti-Thymocyte)、阿奇黴素(Azithromycin)、貝卡普明(Becaplermin)、卡泊芬淨(Caspofungin)、頭孢唑林(Cefazolin)、頭孢吡肟(Cefepime)、頭孢替坦(Cefotetan)、頭孢他啶(Ceftazidime)、頭孢曲松(Ceftriaxone)、西妥昔單抗(Cetuximab)、西司他 汀(Cilastatin)、克拉維酸(Clavulanic Acid)、克林達黴素(Clindamycin)、達貝泊汀α(Darbepoetin Alfa)、達利珠單抗(Daclizumab)、白喉(Diphtheria)、白喉抗毒素(Diphtheria antitoxin)、白喉類毒素(Diphtheria Toxoid)、艾法珠單抗(Efalizumab)、腎上腺素(Epinephrine)、紅血球生成素α(Erythropoietin Alpha)、依那西普(Etanercept)、非格司亭(Filgrastim)、氟康唑(Fluconazole)、促卵泡激素(Follicle-Stimulating Hormone)、促濾泡素α(Follitropin Alpha)、促濾泡素β(Follitropin Beta)、磷苯妥英(Fosphenytoin)、釓雙胺(Gadodiamide)、釓噴酸(Gadopentetate)、加替沙星(Gatifloxacin)、格拉默(Glatiramer)、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(Granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、乙酸戈舍瑞林(Goserelin acetate)、格拉司瓊(Granisetron)、B型流感嗜血桿菌(Haemophilus Influenza B)、氟哌啶醇(Haloperidol)、肝炎疫苗、A型肝炎疫苗、B型肝炎疫苗、替伊莫單抗(Ibritumomab Tiuxetan)、布突默單抗(Ibritumomab)、泰澤坦(Tiuxetan)、免疫球蛋白、流感嗜血桿菌疫苗(Hemophilus influenza vaccine)、流感病毒疫苗、英利昔單抗(Infliximab)、賴脯胰島素(Insulin lispro)、75%中性賴脯魚精蛋白(75% neutral protamine lispro，NPL)/25%賴脯胰島素、50%中性多恩魚精蛋白(50% neutral protamine Hagedorn，NPH)/50%常規胰島素、70% NPH/30%常規胰島素、常規胰島素、NPH胰島素、超胰島素、特慢胰島素(Ultralente insulin)、甘精胰島素(Insulin Glargine)、干擾素、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素阿法肯(Interferon Alphacon)、干擾素α-n、干擾素β、干擾素β-1a、干擾素γ、干擾素α-共同、碘克沙醇(Iodixanol)、碘海醇(Iohexol)、碘帕醇(Iopamidol)、碘佛 醇(Ioversol)、酮咯酸(Ketorolac)、拉羅尼酶(Laronidase)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、利多卡因(Lidocaine)、利奈唑胺(Linezolid)、勞拉西泮(Lorazepam)、麻疹疫苗、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒(Mumps viruse)、麻疹-流行性腮腺炎-風疹病毒疫苗、風疹疫苗、甲羥孕酮(Medroxyprogesterone)、美羅培南(Meropenem)、甲基潑尼松龍(Methylprednisolone)、咪達唑侖(Midazolam)、嗎啡鹼(Morphine)、奧曲肽(Octreotide)、奧馬珠單抗(Omalizumab)、昂丹司瓊(Ondansetron)、帕利珠單抗(Palivizumab)、泮托拉唑(Pantoprazole)、培門冬酶(Pegaspargase)、派非格司亭(Pegfilgrastim)、Peg-干擾素α-2a、Peg-干擾素α-2b、派格索曼(Pegvisomant)、百日咳疫苗(Pertussis vaccine)、哌拉西林(Piperacillin)、肺炎球菌疫苗(Pneumococcal Vaccine)、肺炎球菌結合物疫苗、普敏太定(Promethazine)、瑞替普酶(Reteplase)、促生長激素(Somatropin)、舒巴坦鈉(Sulbactam)、舒馬曲普坦(Sumatriptan)、他唑巴坦(Tazobactam)、替奈普酶(Tenecteplase)、破傷風精製類毒素(Tetanus Purified Toxoid)、替卡西林(Ticarcillin)、托西莫單抗(Tositumomab)、曲安西龍(Triamcinolone)、曲安奈德(Triamcinolone Acetonide)、已曲安奈德(Triamcinolone hexacetonide)、萬古黴素(Vancomycin)、水痘帶狀疱疹免疫球蛋白(Varicella Zoster immunoglobulin)、水痘疫苗、其他疫苗、阿侖單抗(Alemtuzumab)、亞利崔托寧(Alitretinoin)、安樂普利諾(Allopurinol)、六甲蜜胺(Altretamine)、阿米福汀(Amifostine)、阿那曲唑(Anastrozole)、砷、三氧化二砷、天冬醯胺酶、卡介菌(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)疫苗、活BCG、貝瑟羅汀(Bexarotene)、博萊黴素(Bleomycin)、白消安(Busulfan)、靜脈注射用白消 安、口服白消安、卡魯睾酮(Calusterone)、卡培他濱(Capecitabine)、卡鉑(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、卡莫司汀組合聚苯丙生(Carmustines with Polifeprosan)、塞內昔布(Celecoxib)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、順鉑(Cisplatin)、克拉屈濱(Cladribine)、環磷醯胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、阿糖胞苷脂質體(Cytarabine liposomal)、達卡巴嗪(Dacarbazine)、放線菌素d(Dactinomycin)、道諾比星脂質體(Daunorubicin liposomal)、道諾比星(Daunorubicin)、地尼介白素(Denileukin Diftitoxe)、右雷佐生(Dexrazoxane)、多烯紫杉醇(Docetaxel)、小紅莓(Doxorubicin)、小紅莓脂質體(Doxorubicin liposomal)、丙酸屈他雄酮(Dromostanolone propionate)、埃利奧茲B溶液(Elliotts B Solution)、表柔比星(Epirubicin)、依伯汀α(Epoetin alfa)、雌氮芥(Estramustine)、磷酸依託泊苷(Etoposide phosphate)、依西美坦(Exemestane)、氟尿苷(Floxuridine)、氟達拉賓(Fludarabine)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟維司群(Fulvestrant)、吉西他濱(Gemcitabine)、吉妥單抗(Gemtuzumab)、奧唑米星(Ozogamicin)、吉妥單抗奧唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)、羥基尿素(Hydroxyurea)、艾達黴素(Idarubicin)、異環磷醯胺(Ifosfamide)、甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)、伊立替康(Irinotecan)、來曲唑(Letrozole)、甲醯四氫葉酸(Leucovorin)、左旋咪唑(Levamisole)、洛莫司汀(Lomustine)、二氯甲基二乙胺(Mechlorethamine)、氮芥(Nitrogen mustard)、甲地孕酮(Megestrol)、乙酸甲地孕酮(Megestrol acetate)、美法侖(Melphalan)、巰基嘌呤(Mercaptopurine)、美司鈉(Mesna)、甲胺喋呤(Methotrexate)、甲氧沙林(Methoxsalen)、絲裂黴素(Mitomycin)、絲裂黴素C、米托坦(Mitotane)、 米托蒽醌(Mitoxantrone)、諾龍(Nandrolone)、苯丙酸諾龍、諾非單抗(Nofetumomab)、奧普瑞白介素(Oprelvekin)、奧沙利鉑(Oxaliplatin)、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、帕米膦酸鹽(Pamidronate)、培加酶(Pegademase)、噴司他丁(Pentostatin)、哌泊溴烷(Pipobroman)、普卡黴素(Plicamycin)、卟吩姆鈉(Porfimer sodium)、丙卡巴肼(Procarbazine)、奎納克林(Quinacrine)、拉布立酶(Rasburicase)、利妥昔單抗(Rituximab)、沙格司亭(Sargramostim)、鏈脲佐菌素(Streptozocin)、滑石、他莫昔芬(Tamoxifen)、替莫唑胺(Temozolomide)、替尼泊甙(Teniposide)、睾內酯(Testolactone)、硫鳥嘌呤(Thioguanine)、三伸乙基硫代磷醯胺(噻替派(Thiotepa))、拓朴替康(Topotecan)、托瑞米芬(Toremifene)、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、維甲酸(Tretinoin)、尿嘧啶芥(Uracil Mustard)、伐柔比星(Valrubicin)、長春鹼(Vinblastine)、長春新鹼(Vincristine)、長春瑞賓(Vinorelbine)、唑來膦酸鹽(Zoledronate)、阿西維辛(Acivicin)、阿克拉黴素(Aclarubicin)、阿考達唑(Acodazole)、阿克羅寧(Acronine)、阿多來新(Adozelesin)、視黃酸(Retinoic Acid)、9-順-視黃酸(9-Cis-Retinoic Acid)、阿昔迪布(Alvocidib)、安巴腙(Ambazone)、安波黴素(Ambomycin)、阿美蒽醌(Ametantrone)、胺格魯米特(Aminoglutethimide)、安吖啶(Amsacrine)、阿那昔酮(Anaxirone)、安西他濱(Ancitabine)、安麯黴素(Anthramycin)、阿帕茲酮(Apaziquone)、精美司鈉(Argimesna)、曲林菌素(Asperlin)、阿莫司汀(Atrimustine)、阿紮胞苷(Azacitidine)、阿紮替派(Azetepa)、阿佐黴素(Azotomycin)、巴諾蒽醌(Banoxantrone)、巴他布林(Batabulin)、巴馬司他(Batimastat)、貝那昔濱(Benaxibine)、苯達莫司汀(Bendamustine)、苯佐替派(Benzodepa)、 比卡魯胺(Bicalutamide)、比他舍平(Bietaserpine)、比立考達(Biricodar)、比生群(Bisantrene)、二甲磺酸雙奈法德(Bisnafide Dimesylate)、比折來新(Bizelesin)、硼替佐米(Bortezomib)、布喹那(Brequinar)、溴匹立明(Bropirimine)、布度鈦(Budotitane)、放線菌素C(Cactinomycin)、卡奈替尼(Canertinib)、卡醋胺(Caracemide)、卡貝替姆(Carbetimer)、卡波醌(Carboquone)、卡莫氟(Carmofur)、卡柔比星(Carubicin)、卡折來新(Carzelesin)、西地芬戈(Cedefingol)、西馬多丁(Cemadotin)、塞奧羅奈(Cioteronel)、西羅黴素(Cirolemycin)、克蘭氟脲(Clanfenur)、氯法拉濱(Clofarabine)、克立那托(Crisnatol)、地西他濱(Decitabine)、右尼古地平(Dexniguldipine)、右奧馬鉑(Dexormaplatin)、地紮胍寧(Dezaguanine)、地吖醌(Diaziquone)、二溴螺銨(Dibrospidium)、地諾孕素(Dienogest)、地那林(Dinalin)、地斯莫德(Disermolide)、多佛奎達(Dofequidar)、去氧氟尿苷(Doxifluridine)、曲洛昔芬(Droloxifene)、達佐黴素(Duazomycin)、依考莫司汀(Ecomustine)、依達曲沙(Edatrexate)、艾特咔林(Edotecarin)、依福米星(Eflomithine)、艾蘭達(Elacridar)、依林福德(Elinafide)、依沙蘆星(Elsamitrucin)、乙嘧替氟(Emitefur)、恩洛鉑(Enloplatin)、恩普胺酯(Enpromate)、恩紮妥林(Enzastaurin)、依匹哌啶(Epipropidine)、依他前列素(Eptaloprost)、厄布洛唑(Erbulozole)、依索比星(Esorubicin)、依他噠唑(Etanidazole)、依託格魯(Etoglucid)、埃托寧(Etoprine)、依昔舒林(Exisulind)、法屈唑(Fadrozole)、法紮拉濱(Fazarabine)、非瑞替尼(Fenretinide)、氟甲睾酮(Fluoxymesterone)、氟西他濱(Flurocitabine)、磷喹酮(Fosquidone)、福司曲星(Fostriecin)、福曲他明(Fotretamine)、加柔比 星(Galarubicin)、加洛他濱(Galocitabine)、吉羅酚(Geroquinol)、吉馬替康(Gimatecan)、吉美拉西(Gimeracil)、格洛沙腙(Gloxazone)、葡磷醯胺(Glufosfamide)、伊莫福新(Ilmofosine)、伊洛馬司他(Ilomastat)、伊美克(Imexon)、英丙舒凡(Improsulfan)、伊迪斯姆(Indisulam)、氮丙啶丙氧醌(Inproquone)、介白素(Interleukin)、介白素-2、重組介白素、茚托利辛(Intoplicine)、碘苄胍(Iobenguane)、異丙鉑(Iproplatin)、伊索拉定(Irsogladine)、伊沙匹隆(Ixabepilone)、酮曲沙(Ketotrexate)、L-丙胺菌素(L-Alanosine)、蘭瑞肽(Lanreotide)、拉帕替尼(Lapatinib)、來多蒽瓊(Ledoxantrone)、亮丙立德(Leuprolide)、來沙骨化醇(Lexacalcitol)、利阿唑(Liarozole)、洛鉑(Lobaplatin)、洛美曲索(Lometrexol)、洛那法尼(Lonafarnib)、洛索蒽醌(Losoxantrone)、勒托替康(Lurtotecan)、馬磷醯胺(Mafosfamide)、甘露舒凡(Mannosulfan)、馬立馬司他(Marimastat)、馬索羅酚(Masoprocol)、美登素(Maytansine)、甲烯雌醇(Melengestrol)、美諾立爾(Menogaril)、美雄烷(Mepitiostane)、美替辛德(Metesind)、美托咪酯(Metomidate)、氯苯胺啶(Metoprine)、美妥替哌(Meturedepa)、米鉑(Miboplatin)、米潑昔芬(Miproxifene)、米索硝唑(Misonidazole)、米丁度胺(Mitindomide)、米托卡西(Mitocarcin)、米托羅米(Mitocromin)、米托拉酮(Mitoflaxone)、米托潔林(Mitogillin)、丙脒腙(Mitoguazone)、米托馬星(Mitomalcin)、米托萘胺(Mitonafide)、米托喹酮(Mitoquidone)、米托司培(Mitosper)、米托唑胺(Mitozolomide)、米伏布林(Mivobulin)、咪唑立賓(Mizoribine)、莫法羅汀(Mofarotene)、莫哌達醇(Mopidamol)、木利替尼(Mubritinib)、黴酚酸(Mycophenolic Acid)、奈達鉑(Nedaplatin)、 奈拉濱(Nelarabine)、奈莫柔比星(Nemorubicin)、尼曲吖啶(Nitracrine)、諾考達唑(Nocodazole)、諾加黴素(Nogalamycin)、諾拉曲特(Nolatrexed)、諾托曲通(Nortopixantrone)、奧馬鉑(Ormaplatin)、奧他賽(Ortataxel)、奧特拉西(Oteracil)、奧昔舒侖(Oxisuran)、氧芬胂(Oxophenarsine)、帕妥匹隆(Patupilone)、培得星(Peldesine)、培利黴素(Peliomycin)、培利曲索(Pelitrexol)、培美曲塞(Pemetrexed)、奈莫司汀(Pentamustine)、培洛黴素(Peplomycin)、培磷醯胺(Perfosfamide)、哌立福新(Perifosine)、吡鉑(Picoplatin)、吡萘非特(Pinafide)、哌泊舒凡(Piposulfan)、吡非尼酮(Pirfenidone)、吡羅蒽醌(Piroxantrone)、匹蒽醌(Pixantrone)、普維曲德(Plevitrexed)、普洛美坦(Plomestane)、泊非羅黴素(Porfiromycin)、潑尼氮芥(Prednimustine)、普羅帕脒(Propamidine)、螺氯丙醇(Prospidium)、嘌嘧替派(Pumitepa)、嘌呤黴素(Puromycin)、吡唑呋喃菌素(Pyrazofurin)、雷莫司汀(Ranimustine)、利波腺苷(Riboprine)、利曲舒凡(Ritrosulfan)、羅穀亞胺(Rogletimide)、羅喹美克(Roquinimex)、沙巴比星(Sabarubicin)、沙芬戈(Safingol)、賽特鉑(Satraplatin)、司鉑(Sebriplatin)、司莫司汀(Semustine)、辛曲秦(Simtrazene)、西佐喃(Sizofiran)、索布佐生(Sobuzoxane)、索拉非尼(Sorafenib)、司泊索非(Sparfosate)、膦門冬酸(Sparfosic Acid)、司帕黴素(Sparsomycin)、螺旋鍺(Spirogermanium)、螺莫司汀(Spiromustine)、螺鉑(Spiroplatin)、角鯊胺(Squalamine)、鏈黑黴素(Streptonigrin)、鏈伐立星(Streptovarycin)、磺環磷醯胺(Sufosfamide)、磺氯苯脲(Sulofenur)、泰克地那林(Tacedinaline)、他利黴素(Talisomycin)、他莫司汀(Tallimustine)、他瑞奎達(Tariquidar)、牛磺莫司汀(Tauromustine)、 替康蘭(Tecogalan)、喃氟啶(Tegafur)、替洛蒽醌(Teloxantrone)、替莫泊芬(Temoporfin)、替羅昔隆(Teroxirone)、硫米嘌呤(Thiamiprine)、硫唑嘌呤(Tiamiprine)、噻唑呋林(Tiazofurin)、噻氯咪索(Tilomisole)、梯洛龍(Tilorone)、汀考達(Timcodar)、噻莫西酸(Timonacic)、替拉紮明(Tirapazamine)、托皮恩通(Topixantrone)、曲貝替定(Trabectedin)、曲托龍(Trestolone)、曲西立濱(Triciribine)、曲洛司坦(Trilostane)、曲美沙特(Trimetrexate)、四硝酸三鉑(Triplatin Tetranitrate)、曲普瑞林(Triptorelin)、曲磷胺(Trofosfamide)、妥布氯唑(Tubulozole)、烏苯美司(Ubenimex)、烏瑞替派(Uredepa)、伐司撲達(Valspodar)、伐普肽(Vapreotide)、維替泊芬(Verteporfin)、長春地辛(Vindesine)、長春匹定(Vinepidine)、長春氟寧(Vinflunine)、長春米特(Vinformide)、長春甘酯(Vinglycinate)、長春西醇(Vinleucinol)、長春羅新(Vinleurosine)、長春羅定(Vinrosidine)、長春曲醇(Vintriptol)、長春利定(Vinzolidine)、伏羅唑(Vorozole)、鏈黴黃素A(Xanthomycin A)、胍甲環素(Guamecycline)、折尼鉑(Zeniplatin)、亞苄維(Zilascorb)[2-H]、淨司他丁(Zinostatin)、左柔比星(Zorubicin)、佐素奎達(Zosuquidar)、乙醯唑胺(Acetazolamide)、阿昔洛韋(Acyclovir)、膽影酸(Adipiodone)、阿拉曲沙星(Alatrofloxacin)、阿芬太尼(Alfentanil)、過敏原提取物(Allergenic extract)、α 1-蛋白酶抑制劑、前列地爾(Alprostadil)、胺丁卡黴素(Amikacin)、胺基酸、氨基己酸(Aminocaproic acid)、胺茶鹼(Aminophylline)、阿米替林(Amitriptyline)、異戊巴比妥(Amobarbital)、胺利酮(Amrinone)、鎮痛劑、抗脊髓灰白質炎疫苗、抗狂犬病血清、抗破傷風免疫球蛋白、破傷風疫苗、抗凝血酶III、抗蛇毒血清(Antivenom serum)、 阿加曲班(Argatroban)、精胺酸、抗壞血酸、阿替洛爾(Atenolol)、阿曲庫銨(Atracurium)、阿托品(Atropine)、硫代葡萄糖金(Aurothioglucose)、硫唑嘌呤(Azathioprine)、安曲南(Aztreonam)、桿菌肽(Bacitracin)、氯苯胺丁酸(Baclofen)、巴利昔單抗(Basiliximab)、苯甲酸(Benzoic acid)、苯紮托品(Benztropine)、倍他米松(Betamethasone)、生物素、比伐盧定(Bivalirudin)、肉毒抗毒素(Botulism antitoxin)、溴苄乙胺(Bretylium)、布美他尼(Bumetanide)、布比卡因(Bupivacaine)、丁基原啡因(Buprenorphine)、布托啡諾(Butorphanol)、降血鈣素(Calcitonin)、骨化三醇(Calcitriol)、鈣、卷麯黴素(Capreomycin)、卡前列素(Carboprost)、肉鹼(Carnitine)、頭孢孟多(Cefamandole)、頭孢哌酮(Cefoperazone)、頭孢噻肟(Cefotaxime)、頭孢西丁(Cefoxitin)、頭孢唑肟(Ceftizoxime)、頭孢呋辛(Cefuroxime)、氯黴素(Chloramphenicol)、氯普魯卡因(Chloroprocaine)、氯奎寧(Chloroquine)、氯噻嗪(Chlorothiazide)、氯丙嗪(Chlorpromazine)、硫酸軟骨素(Chondroitinsulfuric acid)、絨毛膜促性腺激素α(Choriogonadotropin alfa)、鉻、西多福韋(Cidofovir)、西咪替丁(Cimetidine)、環丙沙星(Ciprofloxacin)、順式阿曲庫銨(Cisatracurium)、可樂定(Clonidine)、可待因(Codeine)、秋水仙鹼(Colchicine)、黏菌素(Colistin)、膠原蛋白(Collagen)、三氟醋酸綿羊可的瑞林(Corticorelin ovine triflutate)、促腎上腺皮質激素(Corticotrophin)、替可克肽(Cosyntropin)、氰鈷胺素(Cyanocobalamin)、環孢靈(Cyclosporine)、半脒胺酸(Cysteine)、達昔單抗(Dacliximab)、達福普汀(Dalfopristin)、達肝素(Dalteparin)、達那肝素(Danaparoid)、丹曲洛林(Dantrclene)、去鐵胺(Deferoxamine)、去胺加壓素(Desmopressin)、地 塞米松(Dexamethasone)、右美托咪啶(Dexmedetomidine)、右泛醇(Dexpanthenol)、聚葡萄糖(Dextran)、聚葡萄糖鐵(Iron dextran)、泛影酸(Diatrizoic 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polysaccharide)、血晶素(Hemin)、草藥(Herbal)、組 織胺、肼酞嗪(Hydralazine)、氫化可的松(Hydrocortisone)、氫嗎啡酮(Hydromorphone)、羥鈷胺素(Hydroxocobalamin)、安泰樂(Hydroxyzine)、茛菪鹼(Hyoscyamine)、伊布利特(Ibutilide)、伊米苷酶(Imiglucerase)、靛藍胭脂紅(Indigo carmine)、吲哚美辛(Indomethacin)、碘、碘普羅胺(Iopromide)、碘他拉酸(Iothalamic acid)、碘克沙酸(Ioxaglic acid)、碘昔蘭(Ioxilan)、異菸肼(Isoniazid)、異丙腎上腺素(Isoproterenol)、日本腦炎疫苗(Japanese encephalitis vaccine)、康黴素(Kanamycin)、氯胺酮(Ketamine)、拉貝洛爾(Labetalol)、來匹盧定(Lepirudin)、左布比卡因(Levobupivacaine)、左旋甲狀腺素(Levothyroxine)、林可黴素(Lincomycin)、碘塞羅寧(Liothyronine)、促黃體激素(Luteinizing hormone)、萊姆病疫苗(Lyme disease vaccine)、錳福地吡(Mangafodipir)、曼思醇(Manthtol)、腦膜炎球菌多醣疫苗(Meningococcal polysaccharide vaccine)、麥啶(Meperidine)、甲哌卡因(Mepivacaine)、美索噠嗪(Mesoridazine)、間羥胺(Metaraminol)、美沙酮(Methadone)、美索巴莫(Methocarbamol)、美索比妥(Methohexital)、甲基多巴酯(Methyldopate)、甲基麥角新鹼(Methylergonovine)、甲氧氯普胺(Metoclopramide)、美托洛爾(Metoprolol)、甲硝噠唑(Metronidazole)、二甲胺四環素(Minocycline)、美維庫銨(Mivacurium)、魚脂酸(Morrhuic 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hydroxide)、吡哆醇(Pyridoxine)、奎尼丁(Quinidine)、奎奴普丁(Quinupristin)、狂犬病免疫球蛋白、狂犬病疫苗、雷尼替丁(Ranitidine)、瑞芬太尼(Remifentanil)、核黃素(Riboflavin)、利福平(Rifampin)、羅比卡因(Ropivacaine)、釤(Samarium)、莨菪鹼(Scopolamine)、硒(Selenium)、舍莫瑞林(Sermorelin)、辛卡利特(Sincalide)、索嗎托諾(Somatrem)、大觀黴素(Spectinomycin)、鏈激酶(Streptokinase)、鏈黴素(Streptomycin)、琥珀醯膽鹼(Succinylcholine)、舒芬太尼(Sufentanil)、磺胺甲基異噁唑(Sulfamethoxazole)、他克莫司(Tacrolimuse)、特布他林(Terbutaline)、特立帕肽(Teriparatide)、睪固酮(Testosterone)、破傷風抗毒素、四卡因(Tetracaine)、硫酸十四烷酯、茶鹼(Theophylline)、硫胺(Thiamine)、硫乙哌丙嗪(Thiethylperazine)、硫噴妥(Thiopental)、甲狀腺刺激激素(Thyroid stimulating hormone)、亭紮肝素(Tinzaparin)、替羅非班 (Tirofiban)、托普黴素(Tobramycin)、苄唑啉(Tolazoline)、甲苯磺丁尿(Tolbutamide)、托西邁(Torsemide)、胺甲環酸(Tranexamic acid)、曲前列環素(Treprostinil)、三氟吡啦嗪(Trifluoperazine)、三甲氧苯醯胺(Trimethobenzamide)、三甲氧苄二胺嘧啶(Trimethoprim)、緩血酸胺(Tromethamine)、結核菌素(Tuberculin)、傷寒疫苗、尿促卵泡素(Urofollitropin)、尿激酶(Urokinase)、丙戊酸(Valproic 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Willebrand factor)、抗血小板劑、群落刺激因子(CSF)、紅血球生成刺激劑、止血劑(hemostatic)、白蛋白(albumin)、免疫球蛋白、凝血酶抑制劑、抗凝血劑、選自以下之類固醇消炎藥：阿氯米松(alclometasone)、阿爾孕酮(algestone)、倍氯米松(beclomethasone)、倍他米松、布地奈德(budesonide)、氯倍他索(clobetasol)、氯倍他松(clobetasone)、氯可托龍(clocortolone)、氯潑尼醇(cloprednol)、皮質酮(corticosterone)、可的松(cortisone)、可的伐唑(cortivazol)、地夫可特(deflazacort)、地奈德(desonide)、去羥米松(desoximetasone)、地塞米松、二氟拉松(diflorasone)、二氟可龍(diflucortolone)、二氟潑尼酯(difluprednate)、甘草次酸(enoxolone)、氟紮可特(fluazacort)、氟氯奈德(flucloronide)、氟米松(flumethasone)、氟尼縮松(flunisolide)、膚輕松(fluocinolone)、醋酸氟輕松(fluocinonide)、氟可丁(fluocortin)、氟可龍(fluocortolone)、氟米龍(fluorometholone)、氟培龍(fluperolone)、氟潑尼定(fluprednidene)、氟潑尼龍(fluprednisolone)、氟氫縮松(flurandrenolide)、氟替卡松(fluticasone)、氟甲醯龍(formocortal)、哈西奈德(halcinonide)、鹵貝他索(halobetasol)、鹵米松(halometasone)、鹵潑尼松(halopredone)、氫可松胺酯(hydrocortamate)、氫化可的松(hydrocortisone)、氯替潑諾(loteprednol etabonate)、馬潑尼酮(mazipredone)、甲羥松(medrysone)、甲潑尼松(meprednisone)、甲基潑尼松龍、糠酸莫米 松(mometasone furoate)、帕拉米松(paramethasone)、潑尼卡酯(prednicarbate)、潑尼龍(prednisolone)、潑尼松(prednisone)、潑尼松龍戊酸酯(prednival)、潑尼立定(prednylidene)、利美索龍(rimexolone)、替可的松(tixocortol)及曲安西龍(triamcinolone)、多可森德(Docosenoid)、前列腺素(prostaglandin)、前列腺素類似物(prostaglandin analog)、抗前列腺素(antiprostaglandin)、前列腺素前驅體、縮瞳劑、膽鹼藥、抗膽鹼酯酶或抗過敏劑。
本文提供一種用於非冷凍儲存穩定PH20玻尿酸酶調配物之系統，其含有本文所提供之任何經修飾之PH20多肽或本文所提供之任何醫藥組成物及適於在無冷凍下儲存之容器。典型地，經修飾之PH20多肽或含有經修飾之PH20多肽之醫藥組成物呈液體形式提供。容器可為小瓶、注射器、套管或袋子或其他容器。容器可為玻璃或塑膠的。
本文提供一種製備可在無冷凍下儲存供直接投予之含有PH20玻尿酸酶之醫藥組成物的方法，其包括提供本文所提供之任何經修飾之PH20多肽，且將多肽用醫藥學上可接受之緩衝劑調配成液體供非經腸投予，諸如供靜脈內或皮下投予。在該方法之實例中，緩衝劑之量為足以維持pH範圍在或約在包括6.0至包括7.8之間，例如pH範圍在或約在包括6.5至包括7.5之間的量。緩衝劑可為Tris、組胺酸、磷酸鹽或檸檬酸鹽，諸如磷酸鈉。在以上方法之實例中，緩衝劑之量在1mM至100mM之間。在該方法之任何以上實例中，PH20多肽在不存在如胺基酸、胺基酸衍生物、胺、糖、多元醇、界面活性劑、防腐劑、玻尿酸酶抑制劑或白蛋白之穩定劑之情況下調配。在以上方法之其他實例中，PH20多肽在不存在鹽之情況下調配或在濃 度低於130mM之鹽下調配。本文亦提供一種醫藥組成物，其藉由任何以上方法製備。
本文提供一種用於治療玻尿酸相關之疾病或病狀的方法，其藉由向個體投予本文所提供之任何醫藥組成物。玻尿酸相關之疾病或病狀為發炎性疾病或腫瘤或癌症。舉例而言，玻尿酸相關之疾病或病狀為水腫、心血管疾病、腫瘤或癌症或如本文所述之由累積或過量玻尿酸所引起或與其相關的其他疾病或病狀。舉例而言，玻尿酸相關之疾病或病狀為腫瘤或癌症，諸如腫瘤為實體腫瘤之腫瘤或癌症。玻尿酸相關之疾病或病狀可為晚期癌症、轉移性癌症或未分化癌症。在特定實例中，玻尿酸相關之疾病或病狀為卵巢癌、原位癌(ISC)、鱗狀細胞癌(SCC)、前列腺癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、乳癌或結腸癌。
本文亦提供一種用於增加治療劑傳遞至個體之方法，其藉由向個體投予任何醫藥組成物及治療劑。在本文中之方法的一些實例中，本文所提供之含有治療劑之任何組合投予個體。在此類方法之實例中，投予經皮下。含有經修飾之PH20多肽之組成物可在投予治療劑之前、與其同時、與其間歇或在其之後投予。
在用於增加治療劑傳遞之以上方法的任何實例中，治療劑為多肽、蛋白質、核酸、藥物、小分子或有機分子。舉例而言，治療劑為化學治療劑、鎮痛劑、消炎劑、抗微生物劑、殺阿米巴蟲劑、殺滴蟲劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗驚厥劑、抗抑鬱劑及抗關節炎劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、解熱劑、抗寄生蟲劑、抗組織胺劑、α-腎上腺素促效劑、α阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴張劑、殺生物劑、殺菌劑、抑菌劑、β腎上腺素阻斷劑、鈣 通道阻斷劑、心臟血管藥、避孕劑、解充血劑、利尿劑、抑鬱劑、診斷劑、電解質劑、催眠劑、激素藥劑、高血糖劑、肌肉鬆弛劑、肌肉收縮劑、眼用藥劑、擬副交感神經劑、精神強奮劑、鎮靜劑、擬交感神經劑、安神劑、泌尿劑、陰道用劑、殺病毒劑、維生素劑、非類固醇消炎劑、血管收縮素轉化酶抑制劑或睡眠誘導劑。在特定實例中，治療劑選自抗體、免疫球蛋白、雙膦酸鹽、細胞介素、化學治療劑、凝血因子及胰島素，諸如快速作用之胰島素。在其他實例中，治療劑選自阿達木單抗、阿加糖酶β、阿法賽特、安比西林、阿那白滯素、抗脊髓灰白質炎疫苗、抗胸腺細胞、阿奇黴素、貝卡普明、卡泊芬淨、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、西妥昔單抗、西司他汀、克拉維酸、克林達黴素、達貝泊汀α、達利珠單抗、白喉、白喉抗毒素、白喉類毒素、艾法珠單抗、腎上腺素、紅血球生成素α、依那西普、非格司亭、氟康唑、促卵泡激素、促濾泡素α、促濾泡素β、磷苯妥英、釓雙胺、釓噴酸、加替沙星、格拉默、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、乙酸戈舍瑞林、格拉司瓊、B型流感嗜血桿菌、氟哌啶醇、肝炎疫苗、A型肝炎疫苗、B型肝炎疫苗、替伊莫單抗、布突默單抗、泰澤坦、免疫球蛋白、流感嗜血桿菌疫苗、流感病毒疫苗、英利昔單抗、賴脯胰島素、75%中性賴脯魚精蛋白(NPL)/25%賴脯胰島素、50%中性多恩魚精蛋白(NPH)/50%常規胰島素、70% NPH/30%常規胰島素、常規胰島素、NPH胰島素、超胰島素、特慢胰島素、甘精胰島素、干擾素、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素阿法肯、干擾素α-n、干擾素β、干擾素β-1a、干擾素γ、干擾素α-一致、碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘佛醇、酮咯酸、拉羅尼酶、左 氧氟沙星、利多卡因、利奈唑胺、勞拉西泮、麻疹疫苗、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹-流行性腮腺炎-風疹病毒疫苗、風疹疫苗、甲羥孕酮、美羅培南、甲基潑尼松龍、咪達唑侖、嗎啡鹼、奧曲肽、奧馬珠單抗、昂丹司瓊、帕利珠單抗、泮托拉唑、培門冬酶、派非格司亭、Peg-干擾素α-2a、Peg-干擾素α-2b、派格索曼、百日咳疫苗、哌拉西林、肺炎球菌疫苗、肺炎球菌結合物疫苗、普敏太定、瑞替普酶、促生長激素、舒巴坦鈉、舒馬曲普坦、他唑巴坦、替奈普酶、破傷風精製類毒素、替卡西林、托西莫單抗、曲安西龍、曲安奈德、已曲安奈德、萬古黴素、水痘帶狀疱疹免疫球蛋白、水痘疫苗、其他疫苗、阿侖單抗、亞利崔托甯、安樂普利諾、六甲蜜胺、阿米福汀、阿那曲唑、砷、三氧化二砷、天冬醯胺酶、卡介菌(BCG)疫苗、活BCG、貝瑟羅汀、博萊黴素、白消安、靜脈注射用白消安、口服白消安、卡魯睾酮、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、卡莫司汀組合聚苯丙生、塞內昔布、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、環磷醯胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂質體、達卡巴嗪、放線菌素d、道諾比星脂質體、道諾比星、地尼介白素、右雷佐生、多烯紫杉醇、小紅莓、小紅莓脂質體、丙酸屈他雄酮、埃利奧茲B溶液、表柔比星、依伯汀α、雌氮芥、磷酸依託泊苷、依西美坦、氟尿苷、氟達拉賓、氟尿嘧啶、氟維司群、吉西他濱、吉妥單抗、奧唑米星、吉妥單抗奧唑米星、羥基尿素、艾達黴素、異環磷醯胺、甲磺酸伊馬替尼、伊立替康、來曲唑、甲醯四氫葉酸、左旋咪唑、洛莫司汀、二氯甲基二乙胺、氮芥、甲地孕酮、乙酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、美司鈉、甲胺喋呤、甲氧沙林、絲裂黴素、絲裂黴素C、米托坦、米托蒽醌、諾龍、苯丙酸諾龍、諾非單抗、奧普瑞白介素、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、帕米 膦酸鹽、培加酶、噴司他丁、哌泊溴烷、普卡黴素、卟吩姆鈉、丙卡巴肼、奎納克林、拉布立酶、利妥昔單抗、沙格司亭、鏈脲佐菌素、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊甙、睾內酯、硫鳥嘌呤、三伸乙基硫代磷醯胺(噻替派)、拓朴替康、托瑞米芬、曲妥珠單抗、維甲酸、尿嘧啶芥、伐柔比星、長春鹼、長春新鹼、長春瑞賓、唑來膦酸鹽、阿西維辛、阿克拉黴素、阿考達唑、阿克羅甯、阿多來新、視黃酸、9-順-視黃酸、阿昔迪布、安巴腙、安波黴素、阿美蒽醌、胺格魯米特、安吖啶、阿那昔酮、安西他濱、安麯黴素、阿帕茲酮、精美司鈉、曲林菌素、阿莫司汀、阿紮胞苷、阿紮替派、阿佐黴素、巴諾蒽醌、巴他布林、巴馬司他、貝那昔濱、苯達莫司汀、苯佐替派、比卡魯胺、比他舍平、比立考達、比生群、二甲磺酸雙奈法德、比折來新、硼替佐米、布喹那、溴匹立明、布度鈦、放線菌素C、卡奈替尼、卡醋胺、卡貝替姆、卡波醌、卡莫氟、卡柔比星、卡折來新、西地芬戈、西馬多丁、塞奧羅奈、西羅黴素、克蘭氟脲、氯法拉濱、克立那托、地西他濱、右尼古地平、右奧馬鉑、地紮胍寧、地吖醌、二溴螺銨、地諾孕素、地那林、地斯莫德、多佛奎達、去氧氟尿苷、曲洛昔芬、達佐黴素、依考莫司汀、依達曲沙、艾特咔林、依福米星、艾蘭達、依林福德、依沙蘆星、乙嘧替氟、恩洛鉑、恩普胺酯、恩紮妥林、依匹哌啶、依他前列素、厄布洛唑、依索比星、依他噠唑、依託格魯、埃托寧、依昔舒林、法屈唑、法紮拉濱、非瑞替尼、氟甲睾酮、氟西他濱、磷喹酮、福司曲星、福曲他明、加柔比星、加洛他濱、吉羅酚、吉馬替康、吉美拉西、格洛沙腙、葡磷醯胺、伊莫福新、伊洛馬司他、伊美克、英丙舒凡、伊迪斯姆、氮丙啶丙氧醌、介白素、介白素-2、重組介白素、茚托利辛、碘苄胍、異丙鉑、伊索拉 定、伊沙匹隆、酮曲沙、L-丙胺菌素、蘭瑞肽、拉帕替尼、來多蒽瓊、亮丙立德、來沙骨化醇、利阿唑、洛鉑、洛美曲索、洛那法尼、洛索蒽醌、勒托替康、馬磷醯胺、甘露舒凡、馬立馬司他、馬索羅酚、美登素、甲烯雌醇、美諾立爾、美雄烷、美替辛德、美托咪酯、氯苯胺啶、美妥替哌、米鉑、米潑昔芬、米索硝唑、米丁度胺、米托卡西、米托羅米、米托拉酮、米托潔林、丙脒腙、米托馬星、米托萘胺、米托喹酮、米托司培、米托唑胺、米伏布林、咪唑立賓、莫法羅汀、莫哌達醇、木利替尼、黴酚酸、奈達鉑、奈拉濱、奈莫柔比星、尼曲吖啶、諾考達唑、諾加黴素、諾拉曲特、諾托曲通、奧馬鉑、奧他賽、奧特拉西、奧昔舒侖、氧芬胂、帕妥匹隆、培得星、培利黴素、培利曲索、培美曲塞、奈莫司汀、培洛黴素、培磷醯胺、哌立福新、吡鉑、吡萘非特、哌泊舒凡、吡非尼酮、吡羅蒽醌、匹蒽醌、普維曲德、普洛美坦、泊非羅黴素、潑尼氮芥、普羅帕脒、螺氯丙醇、嘌嘧替派、嘌呤黴素、吡唑呋喃菌素、雷莫司汀、利波腺苷、利曲舒凡、羅穀亞胺、羅喹美克、沙巴比星、沙芬戈、賽特鉑、司鉑、司莫司汀、辛曲秦、西佐喃、索布佐生、索拉非尼、司泊索非、膦門冬酸、司帕黴素、螺旋鍺、螺莫司汀、螺鉑、角鯊胺、鏈黑黴素、鏈伐立星、磺環磷醯胺、磺氯苯脲、泰克地那林、他利黴素、他莫司汀、他瑞奎達、牛磺莫司汀、替康蘭、喃氟啶、替洛蒽醌、替莫泊芬、替羅昔隆、硫米嘌呤、硫唑嘌呤、噻唑呋林、噻氯咪索、梯洛龍、汀考達、噻莫西酸、替拉紮明、托皮恩通、曲貝替定、曲托龍、曲西立濱、曲洛司坦、曲美沙特、四硝酸三鉑、曲普瑞林、曲磷胺、妥布氯唑、烏苯美司、烏瑞替派、伐司撲達、伐普肽、維替泊芬、長春地辛、長春匹定、長春氟甯、長春米特、長春甘酯、長春西 醇、長春羅新、長春羅定、長春曲醇、長春利定、伏羅唑、鏈黴黃素A、胍甲環素、折尼鉑、亞苄維[2-H]、淨司他丁、左柔比星、佐素奎達、乙醯唑胺、阿昔洛韋、膽影酸、阿拉曲沙星、阿芬太尼、過敏原提取物、α 1-蛋白酶抑制劑、前列地爾、胺丁卡黴素、胺基酸、氨基己酸、胺茶鹼、阿米替林、異戊巴比妥、胺利酮、鎮痛劑、抗脊髓灰白質炎疫苗、抗狂犬病血清、抗破傷風免疫球蛋白、破傷風疫苗、抗凝血酶III、抗蛇毒血清、阿加曲班、精胺酸、抗壞血酸、阿替洛爾、阿曲庫銨、阿托品、硫代葡萄糖金、硫唑嘌呤、安曲南、桿菌肽、氯苯胺丁酸、巴利昔單抗、苯甲酸、苯紮托品、倍他米松、生物素、比伐盧定、肉毒抗毒素、溴苄乙胺、布美他尼、布比卡因、丁基原啡因、布托啡諾、降血鈣素、骨化三醇、鈣、卷麯黴素、卡前列素、肉鹼、頭孢孟多、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢唑肟、頭孢呋辛、氯黴素、氯普魯卡因、氯奎寧、氯噻嗪、氯丙嗪、硫酸軟骨素、絨毛膜促性腺激素α、鉻、西多福韋、西咪替丁、環丙沙星、順式阿曲庫銨、可樂定、可待因、秋水仙鹼、黏菌素、膠原蛋白、三氟醋酸綿羊可的瑞林、促腎上腺皮質激素、替可克肽、氰鈷胺素、環孢靈、半胱胺酸、達昔單抗、達福普汀、達肝素、達那肝素、丹曲洛林、去鐵胺、去胺加壓素、地塞米松、右美托咪啶、右泛醇、聚葡萄糖、聚葡萄糖鐵、泛影酸、安定、二氮嗪、雙環維林、地高辛抗體、地高辛、雙氫麥角胺、地爾硫卓、苯海拉明、雙嘧達莫、多巴酚丁胺、多巴胺、多沙氯銨、多沙普侖、度骨化醇、多西環素、氟哌啶、喘定、依地酸、依酚氯銨、依那普利拉、麻黃素、依前列醇、麥角鈣化醇、麥角新鹼、厄他培南、紅黴素、艾司洛爾、雌二醇、雌激素、依他尼酸、乙醇胺、乙醇、乙碘油、依替膦 酸、依託咪酯、法莫替丁、非諾多泮、芬太尼、氟馬西尼、螢光素、氟非那嗪、葉酸、甲吡唑、福米韋生、方達珀魯、膦甲酸、磷苯妥英、呋喃苯胺酸、釓特醇、釓弗塞胺、更昔洛韋、慶大黴素、升糖素、葡萄糖、甘胺酸、格隆溴銨、高那瑞林、絨毛膜促性腺激素、B型嗜血桿菌多醣、血晶素、草藥、組織胺、肼酞嗪、氫化可的松、氫嗎啡酮、羥鈷胺素、安泰樂、茛菪鹼、伊布利特、伊米苷酶、靛藍胭脂紅、吲哚美辛、碘、碘普羅胺、碘他拉酸、碘克沙酸、碘昔蘭、異菸肼、異丙腎上腺素、日本腦炎疫苗、康黴素、氯胺酮、拉貝洛爾、來匹盧定、左布比卡因、左旋甲狀腺素、林可黴素、碘塞羅寧、促黃體激素、萊姆病疫苗、錳福地吡、曼思醇、腦膜炎球菌多醣疫苗、麥啶、甲哌卡因、美索噠嗪、間羥胺、美沙酮、美索巴莫、美索比妥、甲基多巴酯、甲基麥角新鹼、甲氧氯普胺、美托洛爾、甲硝噠唑、二甲胺四環素、美維庫銨、魚脂酸、莫西沙星、莫羅莫那-CD3、黴酚酸嗎啉乙酯、萘夫西林、納布啡、納美芬、納洛酮、新斯的明、菸鹼醌胺、尼卡地平、硝化甘油、硝普鹽、去甲腎上腺素、奧芬那君、苯唑西林、羥嗎啡酮、土黴素、催產素、巴夫龍、泛醇、泛酸、罌粟鹼、聚乙二醇化干擾素α 2A、青黴素G、潘他米丁、戊唑星、戊巴比妥、全氟丙烷、奮乃靜、苯巴比妥、芬托拉明、苯腎上腺素、苯妥英、毒扁豆鹼、植物甲萘醌、多黏菌素、磷定、丙胺卡因、普魯卡因胺、普魯卡因、丙氯拉嗪、孕酮、普萘洛爾、氫氧化吡啶斯的明、吡哆醇、奎尼丁、奎奴普丁、狂犬病免疫球蛋白、狂犬病疫苗、雷尼替丁、瑞芬太尼、核黃素、利福平、羅比卡因、釤、莨菪鹼、硒、舍莫瑞林、辛卡利特、索嗎托諾、大觀黴素、鏈激酶、鏈黴素、琥珀醯膽鹼、舒芬太尼、磺胺甲基異噁唑、他克莫司、特布他林、 特立帕肽、睪固酮、破傷風抗毒素、四卡因、硫酸十四烷酯、茶鹼、硫胺、硫乙哌丙嗪、硫噴妥、甲狀腺刺激激素、亭紮肝素、替羅非班、托普黴素、苄唑啉、甲苯磺丁尿、托西邁、胺甲環酸、曲前列環素、三氟吡啦嗪、三甲氧苯醯胺、三甲氧苄二胺嘧啶、緩血酸胺、結核菌素、傷寒疫苗、尿促卵泡素、尿激酶、丙戊酸、血管加壓素、維庫銨、維拉帕米、伏立康唑、華法林、黃熱病疫苗、齊多夫定、鋅、齊拉西酮鹽酸鹽、阿克拉黴素、放射菌素、阿德力黴素、偶氮絲胺酸、6-氮尿苷、嗜癌菌素、色黴素、迪諾特寧、6重氮基5側氧基-L-正白胺酸、依諾他濱、氟尿苷、橄欖黴素、吡柔比星、吡曲克辛、蝶羅呤、喃氟啶、殺結核菌素、阿替普酶、阿西莫單抗、貝伐單抗、A型肉毒桿菌毒素、B型肉毒桿菌毒素、卡羅單抗噴地肽、達利珠單抗、α鏈道酶、α替加色羅、噴替酸英西單抗、碘-131、抗生素劑、血管生成抑制劑、抗白內障及抗糖尿病性視網膜病物質、碳酸酐酶抑制劑、散瞳劑、光動力療法藥劑、前列腺素類似物、生長因子、抗贅生物劑、抗代謝物、抗病毒劑、殺阿米巴劑、抗原蟲劑、抗肺結核劑、抗麻風劑、抗毒素及抗蛇毒素、抗血友病因子、抗抑制劑凝集複合物、抗凝血酶III、凝血因子V、凝血因子IX、血漿蛋白組分、馮威里氏因子、抗血小板劑、群落刺激因子(CSF)、紅血球生成刺激劑、止血劑、白蛋白、免疫球蛋白、凝血酶抑制劑、抗凝血劑、選自以下之類固醇消炎藥：阿氯米松、阿爾孕酮、倍氯米松、倍他米松、布地奈德、氯倍他索、氯倍他松、氯可托龍、氯潑尼醇、皮質酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、地奈德、去羥米松、地塞米松、二氟拉松、二氟可龍、二氟潑尼酯、甘草次酸、氟紮可特、氟氯奈德、氟米松、氟尼縮松、膚輕松、醋酸氟輕松、氟可丁、氟可龍、氟 米龍、氟培龍、氟潑尼定、氟潑尼龍、氟氫縮松、氟替卡松、氟甲醯龍、哈西奈德、鹵貝他索、鹵米松、鹵潑尼松、氫可松胺酯、氫化可的松、氯替潑諾、馬潑尼酮、甲羥松、甲潑尼松、甲基潑尼松龍、糠酸莫米松、帕拉米松、潑尼卡酯、潑尼龍、潑尼松、潑尼松龍戊酸酯、潑尼立定、利美索龍、替可的松及曲安西龍、多可森德、前列腺素、前列腺素類似物、抗前列腺素、前列腺素前驅體、縮瞳劑、膽鹼藥、抗膽鹼酯酶或抗過敏劑。
在治療個體之任何以上方法中，投予之組成物為在投予個體之前已在或在無冷凍下儲存之組成物。在本文中之任何方法中，該方法可包括在投予個體之前在無冷凍下儲存組成物。在此等實例中，在無冷凍下儲存組成物將組成物暴露於在18℃至45℃、25℃至42℃或30℃至37℃之間的環境溫度，例如超過25℃之環境溫度。組成物在無冷凍下儲存可超過48小時、72小時、96小時、一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月或六個月。
本文亦提供本文所提供之任何醫藥組成物或組合的醫學用途，其用於治療玻尿酸疾病或病症或用於增加治療劑之傳遞，以治療可藉由治療劑治療之疾病或病狀。舉例而言，本文提供任何本文所提供之醫藥組成物或本文所提供之組合，其用於治療玻尿酸相關之疾病或病症，諸如水腫、心血管疾病、腫瘤或癌症或本文所述或熟習此項技術者已知之其他玻尿酸相關之疾病或病症。本文亦提供任何本文所提供之醫藥組成物或本文所提供之組合，其用於向個體傳遞治療劑。治療劑可為已知治療疾病或病狀之任何治療劑，諸如以上或本文中其他地方所述之任一者。在包括醫藥組成物或組合供使用的醫學用途之任何以上實例中，含有經修飾之PH20的組成物為 非冷凍組成物。因此，本文提供非冷凍PH20醫藥組成物之醫學用途，其用於治療玻尿酸相關之疾病或病狀。本文亦提供非冷凍PH20之醫學用途，其用於增加例如治療劑之傳遞，以治療藉由治療劑治療或可治療之疾病或病狀。
本文提供一種用於鑑別或選擇顯示熱穩定性的經修飾之降解玻尿酸之酶的方法，其含有以下步驟：a)在一定溫度下培育預定時間之後測試經修飾之降解玻尿酸之酶或一群經修飾之降解玻尿酸之酶的成員的活性，該溫度及時間向不含修飾的未經修飾之降解玻尿酸之酶提供熱應力條件；b)在2℃至8℃下培育之後測試經修飾之降解玻尿酸之酶或一群經修飾之降解玻尿酸之酶的成員的活性，其中活性在與a)相同之條件下測試，不同之處在於溫度差異；以及c)選擇或鑑別顯示a)中之活性為b)中之活性至少50%的經修飾之降解玻尿酸之酶。在該方法之態樣中，在步驟c)中，若a)中之活性為b)中之活性的至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上，則選擇或鑑別經修飾之降解玻尿酸之酶。在鑑別或選擇經修飾之降解玻尿酸之酶的方法之任何實例中，活性為玻尿酸酶活性。
在鑑別或選擇經修飾之降解玻尿酸之酶的以上方法之實例中，該方法可進一步包括以下步驟：d)將b)中所選擇或鑑別的經修飾之降解玻尿酸之酶的活性與在相同條件下測試的未經修飾之降解玻尿酸之酶的活性比較；以及e)鑑別或選擇與未經修飾之降解玻尿酸之酶相比，顯示活性之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或100%以上的經修飾之降解玻尿酸之酶。
在鑑別或選擇經修飾之降解玻尿酸之酶的方法之任何方法實例中，熱 應力條件為如在熱攻擊分析中在預定時間下所測定，等於或超過不含修飾的未經修飾之降解玻尿酸之酶的T50的溫度。舉例而言，a)中之活性在比如熱攻擊分析中在預定時間下測定的未經修飾之降解玻尿酸之酶的T50大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃或20℃以上的溫度下測試。在該方法之態樣中，在步驟a)之前，該方法可包括測定如在熱攻擊分析中在預定時間下測定的未經修飾之降解玻尿酸之酶的T50的步驟。
在鑑別或選擇經修飾之降解玻尿酸之酶的任何方法之其他實例中，熱應力條件為等於或超過不含修飾的未經修飾之降解玻尿酸之酶的熔融溫度(Tm)的溫度。舉例而言，a)中之活性在比降解玻尿酸之酶的熔融溫度(Tm)大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃或20℃以上的溫度下測試。在該方法之態樣中，在步驟a)之前，該方法可包括測定降解玻尿酸之酶的熔融溫度(Tm)的步驟。舉例而言，熔融溫度(Tm)可藉由動態光散射、圓二色性(CD)光譜法、螢光發射光譜法或核磁共振(NMR)光譜法測定。
在鑑別或選擇經修飾之降解玻尿酸之酶的方法之任何實例中，a)中之活性在超過44℃，例如超過45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或60℃以上的溫度下測試。在本文中之方法的特定實例中，a)中之活性在超過或為或約為52℃之溫度下測試。在本文中之方法的此等及任何其他實例中，降解玻尿酸之酶，諸如經修飾之降解玻尿酸之酶，在步驟a)及步驟b)中培育至少 5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時或超過6小時之預定時間。舉例而言，在本文中之方法的實例中，a)中之熱應力條件為在超過或為52℃之溫度下培育10分鐘。因此，b)中之條件為在2℃至8℃，諸如為或為約4℃之溫度下培育10分鐘。
在鑑別或選擇經修飾之降解玻尿酸之酶的方法之任何實例中，經修飾之降解玻尿酸之酶與未經修飾之降解玻尿酸之酶相比，含有胺基酸之胺基酸置換、插入或缺失。在特定實例中，經修飾之降解玻尿酸之酶含有一個胺基酸置換或多個胺基酸置換。舉例而言，經修飾之降解玻尿酸之酶與降解玻尿酸之酶的未經修飾之形式相比，含有單個胺基酸置換或兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或更多個胺基酸置換。
在鑑別或選擇經修飾之降解玻尿酸之酶的方法之任何實例中，在a)及/或b)中測試一群經修飾之降解玻尿酸之酶的成員；及在a)及/或b)中分別測試複數個經修飾之降解玻尿酸之酶。在此等實例中，與對應未經修飾之降解玻尿酸之酶相比，複數個經修飾之降解玻尿酸之酶經修飾，以產生一群經修飾之降解玻尿酸之酶，其中在a)及/或b)中之每一者中測試該群中之每一經修飾之蛋白質，其中該群中之每一經修飾之降解玻尿酸之酶與降解玻尿酸之酶的未經修飾之形式相比含有單個胺基酸置換。舉例而言，在該群中，每一經修飾之位置上的胺基酸經多達1-19種除該位置上之原始胺基酸以外的其他胺基酸置換，從而每一經修飾之降解玻尿酸之酶含有不同胺基酸置換。在所產生之群的特定實例中，沿降解玻尿酸之酶之長度的每一胺基酸或其選擇部分經置換。
在鑑別或選擇經修飾之降解玻尿酸之酶的方法之任何實例中，測試之 降解玻尿酸之酶例如藉由與未經修飾之降解玻尿酸之酶相比進行胺基酸置換來修飾。未經修飾之降解玻尿酸之酶可為軟骨素酶或玻尿酸酶。舉例而言，未經修飾之降解玻尿酸之酶為一種玻尿酸酶，其為PH20玻尿酸酶或其缺乏C端糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨附接位點或GPI錨附接位點一部分之截短形式，其中該截短形式顯示玻尿酸酶活性。PH20可為人類、猴、牛、綿羊、大鼠、狐狸、小鼠或天竺鼠PH20。舉例而言，未經修飾之降解玻尿酸之酶具有SEQ ID NO：3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、388、390、392或400中之任一者中闡述之胺基酸序列，或與SEQ ID NO：3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、388、390、392或400中之任一者至少80%序列一致，諸如與SEQ ID NO：3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、388、390、392或400中之任一者至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致的胺基酸序列。詳言之，PH20為人類PH20或其可溶性C端截短形式。舉例而言，未經修飾之降解玻尿酸之酶為具有SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者中闡述之胺基酸序列，或顯示與SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者至少85%序列一致性，諸如與SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性之胺基酸序列的PH20玻尿酸酶。
在本文中鑑別或選擇顯示熱穩定性的經修飾之降解玻尿酸之酶的方法之任何實例中，該方法在活體外進行。該方法亦可藉由重複任何以上步驟複數次來進行，其中在每次重複中，產生所選經修飾之降解玻尿酸之酶的進一步經修飾之降解玻尿酸之酶且進行測試，從而經修飾之降解玻尿酸之 酶進化以在變性條件下顯示增加之穩定性。
本文亦提供一種經修飾之降解玻尿酸之酶，其藉由鑑別或選擇顯示熱穩定性的經修飾之降解玻尿酸之酶的任何以上方法鑑別或選擇。
圖1描繪全長人類PH20(SEQ ID NO：7中闡述)及其可溶性C端截短變異體之胺基酸序列。全長PH20之例示性C端截短變異體之C端胺基酸殘基由粗字體指示。全長PH20之例示性C端截短變異體之全部胺基酸序列亦提供於SEQ ID NO：3及32-66中。全部序列闡述於SEQ ID NO：3中之例示性可溶性PH20之C端胺基酸殘基亦由下劃線指示。胺基酸置換之例示性的非限制性位置突出指示。此等胺基酸置換及本文所述之其他胺基酸置換的對應位置可藉由將相關序列與SEQ ID NO：3、7或32-66中之任一者且尤其與SEQ ID NO：3進行比對來鑑別。
圖2(A-L)描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與其他PH20多肽的例示性比對。「*」意謂比對殘基一致，「：」意謂比對殘基不一致，但類似且在比對位置含有保守胺基酸殘基，且「.」意謂比對殘基類似且在比對位置含有半保守胺基酸殘基。胺基酸置換之例示性的非限制性對應位置突出指示。舉例而言，圖2A描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：10中闡述之黑猩猩PH20的比對。圖2B描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：12中闡述之恆河猴(Rhesus monkey)PH20的比對。圖2C描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：14中闡述之食蟹獼猴(Cynomolgus monkey)PH20的比對。圖2D描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：16中闡 述之牛PH20的比對。圖2E描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：20中闡述之小鼠PH20的比對。圖2F描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：22中闡述之大鼠PH20的比對。圖2G描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：24中闡述之兔PH20的比對。圖2H描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：29中闡述之天竺鼠PH20的比對。圖2I描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：31中闡述之狐狸PH20的比對。圖2J描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：387中闡述之巨臂猿PH20的比對。圖2K描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：389中闡述之狨猴PH20的比對。圖2L描繪SEQ ID NO：3中闡述之人類可溶性PH20與SEQ ID NO：391中闡述之猩猩PH20的比對。
概述
A. 定義
B. PH20玻尿酸酶及熱穩定性
1. 結構
可溶性PH20多肽
2. 功能
3. PH20玻尿酸酶之熱穩定性
C. 經修飾之PH20多肽：尤伯嗜熱蛋白
1. 例示性胺基酸置換
2. 核酸分子
3. 其他修飾及結合物
a. 降低之免疫原性
b. 與聚合物結合
D. 用於鑑別經修飾之熱穩定降解玻尿酸之酶的方法
1. 降解玻尿酸之酶及經修飾之降解玻尿酸之酶的文庫
2. 在熱應力條件下篩檢或測試活性
3. 選擇或鑑別
4. 迭代方法
E. 經修飾之多肽及編碼核酸分子之產生
1. 編碼PH20多肽之核酸的分離或製備
2. 突變或經修飾之核酸及編碼多肽的產生
3. 載體及細胞
4. 表現
a. 原核細胞
b. 酵母細胞
c. 昆蟲及昆蟲細胞
d. 哺乳動物表現
e. 植物及植物細胞
5. 純化
6. 藉由聚乙二醇化進行之多肽修飾
F. 醫藥組成物及調配物、劑量及投藥
1. 調配物(液體、可注射液、溶液及乳液)
a. 凍乾
b. 例示性調配物
i. pH值及緩衝劑
ii. 鹽(例如NaCl)
iii.防腐劑
iv. 穩定劑
2. 用於其他投藥途徑之組成物
3. 劑量及投藥
4. 與治療劑之組合及共調配物
5. 包裝、製品及套組
G. 評估玻尿酸酶活性之方法
1. 玻尿酸酶活性
2. 熱穩定性
可溶性
3. 分析穩定性之其他分析
4. 可溶性
5. 藥效學/藥物動力學
H. 治療方法及組合療法
1. 傳遞治療劑之方法
2. 治療玻尿酸相關之疾病及病狀之方法
3. 其他用途
I. 實施例
A. 定義
除非另有定義，否則本文所用之所有科技術語均具有與熟習本發明所屬技術者通常所瞭解相同之含義。除非另外提及，否則本文中整個揭示內容中所提及之所有專利、專利申請案、公開申請案及公開案、Genbank序列、數據庫、網站及其他公開材料均以全文引用之方式併入。在關於本文術語存在複數種定義之情況下，以此部分中之定義為準。在提及URL或其他此類識別符或位址的情況下，應瞭解雖然此類標識符可變化且網際網路上之特定資訊可變來變去，但可藉由搜索網際網路尋找等效資訊。對其之提及證實此類資訊之可獲得性及公眾傳播。
如本文所使用，降解玻尿酸之酶是指催化玻尿酸聚合物(亦包括透明質酸；(HA))裂解成較小分子量片段之酶。例示性降解玻尿酸之酶為玻尿酸酶，且亦包括能夠將玻尿酸聚合物解聚合之特定軟骨素酶及裂解酶。作為降解玻尿酸之酶的例示性軟骨素酶包括(但不限於)軟骨素ABC裂解酶(亦稱為軟骨素酶ABC)、軟骨素AC裂解酶(亦稱為硫酸軟骨素裂解酶或硫酸軟骨素消除酶)及軟骨素C裂解酶。軟骨素ABC裂解酶含有兩種酶，硫酸軟骨素ABC內裂解酶(EC 4.2.2.20)及硫酸軟骨素ABC外裂解酶(EC 4.2.2.21)。一種例示性硫酸軟骨素ABC內裂解酶及硫酸軟骨素ABC外裂解酶包括(但不限於)來自普通變形桿菌(Proteus vulgaris)及肝素黃桿菌(Pedobacter heparinus)之彼等酶(普通變形桿菌硫酸軟骨素ABC內裂解酶闡述於SEQ ID NO：452中；Sato等人(1994)Appl.Microbiol.Biotechnol.41(1)：39-46)。來自細菌之例示性軟骨素酶AC酶包括(但不限於)來自肝素黃桿菌之闡述於SEQ ID NO：453中之酶；來自維德食物穀菌(Victivallis vadensis)之闡述於SEQ ID NO：454中之酶；及來自金黃節桿菌(Arthrobacter aurescens)之酶(Tkalec等人(2000)Applied and Environmental Microbiology 66(1)：29-35；Ernst等人(1995)Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 30(5)：387-444)。來自細菌之例示性軟骨素酶C酶包括(但不限於)來自鏈球菌屬(Streptococcus)及黃桿菌屬(Flavobacterium)之酶(Hibi等人(1989)FEMS-Microbiol-Lett.48(2)：121-4；Michelacci等人(1976)J.Bool.Chem.251：1154-8；Tsuda等人(1999)Eur.J.Biochem.262：127-133)。
如本文所使用，玻尿酸酶為降解玻尿酸之酶且是指一類降解玻尿酸之酶，即使玻尿酸降解之酶。玻尿酸酶包括(但不限於)細菌玻尿酸酶(EC 4.2.2.1或4.2.99.1)、來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼動物之玻尿酸酶(EC 3.2.1.36)及哺乳動物型玻尿酸酶(EC 3.2.1.35)。玻尿酸酶包括任何非人類來源，包括(但不限於)鼠類、犬類、貓類、野兔、禽類、牛類、綿羊、豬類、馬類、魚類、蛙類、細菌及來自水蛭、其他寄生蟲及甲殼動物之任一者。例示性人類玻尿酸酶包括HYAL1、HYAL2、HYAL3、HYAL4及PH20。玻尿酸酶亦包括可溶性玻尿酸酶，包括綿羊及牛類PH20及可溶性PH20。例示性玻尿酸酶包括SEQ ID NO：6、7-31、69、70、71、72、387-392、399-451中闡述之任一者、其成熟形式(缺乏信號序列)或其對偶基因或物種變異體。玻尿酸酶亦包括顯示玻尿酸酶活性之其截短形式，包括可溶性C端截短變異體。
如本文所使用，PH20是指存在於精子中且為中性活性之玻尿酸酶類型。PH-20存在於精子表面上及溶酶體衍生之頂體中，在頂體中其結合於內部頂體膜。PH20包括彼等任何來源，包括(但不限於)人類、黑猩猩、食 蟹獼猴、恆河猴、鼠類、牛類、綿羊、天竺鼠、兔及大鼠來源。包括前驅體及成熟形式之例示性PH20多肽包括來自以下之PH20多肽：人類(SEQ ID NO：6及7)、黑猩猩(SEQ ID NO：8、9、10、399及400)、恆河猴(SEQ ID NO：11及12)、食蟹獼猴(SEQ ID NO：13及14)、母牛((例如SEQ ID NO：15-18)；小鼠(SEQ ID NO：19及20)；大鼠(SEQ ID NO：21及22)；兔(SEQ ID NO：23及24)；羊(SEQ ID NO：25-27)、天竺鼠(SEQ ID NO：28及29)；狐狸(SEQ ID NO：30及31)；巨臂猿(SEQ ID NO：387及388)、狨猴(SEQ ID NO：389及390)及猩猩(SEQ ID NO：391及392)。對PH20之提及包括前驅PH20多肽及成熟PH20多肽(諸如已移除信號序列之PH20多肽)、具有活性之其截短形式，且包括對偶基因變異體及物種變異體、藉由剪接變異體編碼之變異體及其他變異體，包括具有與SEQ ID NO：7中闡述之前驅多肽至少40%、45%、50%、55%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性的多肽，或其成熟形式。PH20多肽亦包括含有化學或轉譯後修飾之多肽及不含化學或轉譯後修飾之多肽。此類修飾包括(但不限於)聚乙二醇化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羥基化、磷酸化及此項技術中已知之其他多肽修飾。市購牛類或綿羊可溶性玻尿酸酶之實例為Vitrase®玻尿酸酶(綿羊類玻尿酸酶)及Amphadase®玻尿酸酶(牛類玻尿酸酶)。
如本文所使用，可溶性PH20是指特性為其在生理條件下之可溶性的多肽。一般而言，可溶性PH20缺乏糖磷脂醯基錨(GPI)附接序列全部或一部分，或不以其他方式充分錨定至細胞膜。舉例而言，可溶性PH20可為缺乏與糖磷脂醯基錨(GPI)附接序列全部或一部分相對應之鄰接胺基酸序列 的PH20之C端截短變異體。在細胞中表現時，可溶性PH20不為膜錨定且分泌至培養基中。可溶性PH20蛋白質可例如藉由其分配至升溫至37℃之Triton X-114之水相而區分(Bordier等人，(1981)J.Biol.Chem.,256：1604-7)。膜錨定，諸如脂質錨定之玻尿酸酶，將分配至富含清潔劑相，但在用磷脂酶-C處理之後，將分配至清潔劑貧乏之相或水相。可溶性PH20玻尿酸酶包括其中一或多個與玻尿酸酶錨定至膜相關之區域已移除或經修飾的膜錨定之玻尿酸酶，其中該可溶性形式保留玻尿酸酶活性。可溶性玻尿酸酶包括重組可溶性玻尿酸酶及天然來源中所含或自其純化之玻尿酸酶，諸如來自羊或母牛之睪丸提取物。例示性此類可溶性玻尿酸酶為可溶性人類PH20(SEQ ID NO：3或32-66)。其他可溶性玻尿酸酶包括綿羊(SEQ ID NO：25-27)及牛類(SEQ ID NO：16或18)PH20。
如本文所使用，可溶性人類PH20(sHuPH20)包括缺乏人類PH20之C端之鄰接胺基酸序列，使得糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨序列全部或一部分缺失(C端截短PH20多肽)，從而若在細胞中表現，則分泌多肽及/或在生理條件下可溶的人類PH20多肽。舉例而言，可溶性人類PH20多肽包括呈其前驅體形式闡述為SEQ ID NO：6且呈缺乏信號序列之其成熟形式闡述於SEQ ID NO：7中的人類PH20之C端截短多肽，或其對偶基因變異體(例如SEQ ID NO：68-72中之任一者中闡述)。可溶性可藉由說明在生理條件下之可溶性的任何適合之方法評估。例示性此類方法為Triton® X-114分析，其評估分配至水相之情況且如上所述。此外，可溶性人類PH20多肽為若在諸如CHO-S細胞之CHO細胞中產生，則表現且分泌至細胞培養基中之多肽。然而，可溶性人類PH20多肽不限於在CHO細胞中產生之PH20多肽，而亦 可在任何細胞中或藉由任何方法，包括重組表現及多肽合成來產生。對由CHO細胞分泌之提及為定義性的。因此，若多肽可由CHO細胞表現及分泌且可溶於培養基中，亦即當用Triton® X-114萃取時分配至水相中，則其為可溶性PH20多肽，無論其是否如此產生。sHuPH20多肽之前驅多肽可包括信號序列，諸如異源或非異源(亦即天然)信號序列。例示性前驅體為包括信號序列，諸如胺基酸位置1-35上天然35個胺基酸之信號序列(參見例如SEQ ID NO：6之胺基酸1-35)的前驅體。
如本文所使用，關於PH20多肽之「天然」或「野生型」是指本質上存在於包括人類及其他動物之生物體中，藉由天然或天然存在之PH20基因編碼之PH20多肽，包括對偶基因變異體。提及野生型PH20而未提及物種意欲涵蓋具有野生型PH20之任何物種。野生型PH20多肽包括經編碼之前驅多肽、其片段及其加工形式，諸如缺乏信號肽之成熟形式，以及其任何轉譯前或轉譯後加工或修飾之形式。天然PH20多肽亦包括轉譯後修飾之PH20多肽，包括(但不限於)藉由糖基化、羧化及/或羥基化進行修飾之PH20多肽。例示性野生型人類PH20之胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：6及7中且包括其成熟形式之對偶基因變異體的胺基酸序列闡述於SEQ ID NO：68-72中。其他動物產生天然PH20，包括(但不限於)SEQ ID NO：8-31、387-392、399或400中之任一者中闡述之天然或野生型序列。
如本文所使用，修飾是指多肽之胺基酸殘基序列或核酸分子中之核苷酸序列的修飾且分別包括胺基酸及核苷酸之缺失、插入及置換。修飾亦可包括轉譯後修飾或可因與另一部分直接或間接結合或連接而發生的其他分子變化。修飾多肽之方法對熟習此項技術者而言為常規的，諸如藉由使用 重組DNA方法。
如本文所使用，「缺失」在涉及核酸或多肽序列之修飾時是指與一種序列，諸如標靶多核苷酸或多肽或天然或野生型序列相比，一或多個核苷酸或胺基酸缺失。
如本文所使用，「插入」在涉及核酸或胺基酸序列之修飾時描述在標靶、天然、野生型或其他相關序列內包括一或多個其他核苷酸或胺基酸。因而，與野生型序列相比含有一或多個插入之核酸分子在序列線性長度內含有一或多個其他核苷酸。如本文所使用，「添加」至核酸及胺基酸序列描述與另一序列相比核苷酸或胺基酸添加至任一末端上。
如本文所使用，關於修飾之「取代」或「置換」是指在不改變分子長度(如以殘基數目描述)下天然、標靶、野生型或其他核酸或多肽序列中之一或多個核苷酸或胺基酸經替代性核苷酸或胺基酸置換。因而，分子中之一或多個取代不改變分子之胺基酸殘基或核苷酸的數目。與特定多肽相比胺基酸置換可根據沿多肽序列或參考多肽序列之長度的胺基酸殘基編號表示。舉例而言，在胺基酸序列之第19個位置具有半胱胺酸(Cys；C)取代異白胺酸(Ile；I)之胺基酸修飾的經修飾之多肽可表示為「在對應於位置19之位置經Cys或C置換」、I19C、Ile19Cys或簡單地C19，以指示在經修飾之第19位的胺基酸為半胱胺酸。在此實例中，具有取代之分子在未經修飾之多肽之Ile 19具有修飾。
如本文所使用，「經修飾之降解玻尿酸之酶」是指與參考或未經修飾之降解玻尿酸之酶相比含有修飾的降解玻尿酸之酶。修飾可為一或多個胺基酸殘基之胺基酸置換(取代)、插入(添加)或缺失。胺基酸殘基可為天然 或非天然胺基酸。在一些情況下，修飾可為轉譯後修飾。經修飾之降解玻尿酸之酶與參考或未經修飾之降解玻尿酸之酶相比可具有多達150個胺基酸差異，只要所得經修飾之降解玻尿酸之酶顯示玻尿酸酶活性即可。典型地，經修飾之降解玻尿酸之酶含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸修飾。
如本文所使用，未經修飾之降解玻尿酸之酶是指如本文所提供之選擇用於修飾的起始多肽。起始多肽可為多肽之天然存在之野生型形式。此外，起始多肽可改變或突變，使得其不同於天然野生型同功異構物，但儘管如此，在本文中，相對於本文中產生之具有本文所述之特性的隨後經修飾之多肽，仍稱為起始未經修飾之多肽。因而，可選擇此項技術中已知之已經修飾以與未經修飾之參考蛋白質相比，具有所希望之特定活性或特性增加或減少的現有蛋白質，且用作起始未經修飾之多肽。舉例而言，可選擇已自其天然形式藉由一或多個單胺基酸變化而經修飾且具有所希望特性增加或減少(諸如胺基酸殘基改變以改變糖基化)之蛋白質用於修飾，且因此在本文中稱為未經修飾，用於進一步修飾。未經修飾之降解玻尿酸之酶包括人類及非人類降解玻尿酸之酶，包括來自非人類哺乳動物及細菌之降解玻尿酸之酶。例示性未經修飾之降解玻尿酸之酶為SEQ ID NO：2、3、6、7-66、68-72、387-392、399-454中闡述之任一者、或顯示玻尿酸酶活性之其成熟C端截短形式，或顯示與SEQ ID NO：2、3、6、7-66、68-72、387-392、399-454中之任一者至少75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的降解玻尿酸之酶。應瞭解，未經修飾之降解玻尿酸之酶一般為不含修飾(諸如經修飾之降解玻尿酸之酶的胺基酸置換)之酶。
如本文所使用，「經修飾之PH20多肽」或「變異PH20多肽」是指與參考未經修飾之PH20多肽相比，在其胺基酸序列中含有至少一個胺基酸修飾，諸如至少一個如本文所述之胺基酸置換的PH20多肽。經修飾之PH20多肽可具有多達150個胺基酸置換，只要所得經修飾之PH20多肽顯示玻尿酸酶活性即可。典型地，經修飾之PH20多肽含有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個胺基酸置換。應瞭解，經修飾之PH20多肽亦可包括除至少一個如本文所述之胺基酸置換以外的任一或多個其他修飾。
如本文所使用，未經修飾之PH20多肽是指如本文所提供之選擇用於修飾的起始PH20多肽。起始多肽可為多肽之天然存在之野生型形式。此外，起始多肽可改變或突變，使得其不同於天然野生型同功異構物，但儘管如此，在本文中，相對於本文中產生之隨後經修飾之多肽，仍稱為起始未經修飾之多肽。因而，可選擇此項技術中已知之已經修飾以與未經修飾之參考蛋白質相比，具有所希望之特定活性或特性增加或減少的現有蛋白質，且用作起始未經修飾之多肽。舉例而言，可選擇已自其天然形式藉由一或多個單胺基酸變化而經修飾且具有所希望特性增加或減少(諸如胺基酸殘基改變以改變糖基化)之蛋白質用於修飾，且因此在本文中稱為未經修飾， 用於進一步修飾。例示性未經修飾之PH20多肽為人類PH20多肽或其對偶基因或物種變異體或其他變異體，包括成熟及前驅多肽。舉例而言，例示性參考PH20多肽為SEQ ID NO：7、69或72中闡述之成熟全長PH20多肽；或其C端截短形式，諸如SEQ ID NO：3及32-66中之任一者中闡述；或顯示與SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者至少68%、69%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的PH20多肽。參考PH20多肽亦可包括對應前驅體形式，諸如SEQ ID NO：2、6、68、70或71中之任一者中闡述，或其他前驅體形式，或顯示與SEQ ID NO：2、6、68、70或71中之任一者至少68%、69%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的PH20多肽。應瞭解，未經修飾之降解玻尿酸之酶一般為不含修飾(諸如經修飾之降解玻尿酸之酶的胺基酸置換)之酶。
如本文所使用，N連接之部分是指能夠藉由多肽之轉譯後修飾進行糖基化的多肽之天冬醯胺(N)胺基酸殘基。人類PH20之例示性N連接之部分包括SEQ ID NO：3或7中闡述之胺基酸序列的胺基酸N47、N131、N200、N219、N333及N358(對應於SEQ ID NO：6中闡述之人類PH20之胺基酸殘基N82、N166、N235、N254、N368及N393)。
如本文所使用，N-糖基化多肽是指含有至少三個N連接之胺基酸殘基之寡醣連接(例如對應於SEQ ID NO：3或7之胺基酸殘基N200、N333及N358的N連接之部分)的PH20多肽。N-糖基化多肽可包括其中三個、四個、五個及多達全部N連接之部分連接至寡醣之多肽。N連接之寡醣可包 括寡甘露糖、複合、混合或硫酸化寡醣或其他寡醣及單醣。
如本文所使用，N-部分糖基化多肽是指最低限度地含有連接於至少三個N連接之部分之N-乙醯葡萄糖胺聚糖的多肽。部分糖基化多肽可包括各種聚糖形式，包括單醣、寡醣及分支鏈糖形式，包括藉由用EndoH、EndoF1、EndoF2及/或EndoF3處理多肽所形成之形式。
如本文所使用，關於PH20多肽之尤伯嗜熱蛋白是指顯示在52℃下10分鐘之玻尿酸酶活性為在4℃下之活性的至少50%之一種PH20多肽變異體。舉例而言，尤伯嗜熱蛋白是指如在熱攻擊分析中測定，在10分鐘下之T50為至少或約至少或為52℃的一種PH20多肽變異體。舉例而言，尤伯嗜熱蛋白可顯示在52℃下10分鐘之活性為其在4℃下之活性的至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上。尤伯嗜熱蛋白一般亦顯示4℃下無修飾之對應酶或野生型PH20(例如SEQ ID NO：3、7或32-66中之任一者中闡述之人類PH20或其可溶性C端截短片段)之玻尿酸酶活性的至少40%，且52℃下之活性比無修飾之相同酶及/或野生型PH20(例如SEQ ID NO：3、7或32-66中之任一者中闡述之人類PH20或其可溶性C端截短片段)大或增加。尤伯嗜熱蛋白亦包括在超過52℃之溫度下顯示至少50%玻尿酸酶活性的PH20多肽。因而，如在熱攻擊分析中在10分鐘下測定之尤伯嗜熱蛋白之T50可為52℃，或超過52℃，諸如超過53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃或更高。
如本文所使用，特性是指物理或結構特性，諸如三維結構、pI、半衰期、構形及其他此類物理特性。舉例而言，特性改變可顯現為蛋白質之可溶性、聚集或結晶。
如本文所使用，「蛋白質穩定性」是指回應於環境條件(例如升高溫度)，蛋白質之一或多種物理特性維持情況的量度。在一個具體實例中，物理特性為蛋白質共價結構之維持(例如不存在蛋白質裂解、非所需氧化或去醯胺)。在另一具體實例中，物理特性為存在處於恰當摺疊狀態之蛋白質(例如不存在可溶或不溶聚集體或沈澱)。在一個具體實例中，蛋白質穩定性藉由分析蛋白質之生物物理特性，例如熱穩定性、pH值展開特徵、糖基化之穩定移除、可溶性、生物化學功能(例如能夠結合於蛋白質(例如配位體、受體、抗原等)或化學部分等)及/或其組合來量測。在另一具體實例中，生物化學功能藉由相互作用之結合親和力說明。穩定性可使用此項技術中已知及/或本文所述之方法量測。
如本文所使用，升高溫度為等於或超過室溫(例如一般超過25℃)之溫度。一般而言，升高溫度為至少為、超過或為約30℃，諸如包括30℃至包括42℃，且一般包括32℃至包括37℃或包括35℃至包括37℃的溫度。
如本文所使用，關於經修飾之PH20多肽或經修飾之降解玻尿酸之酶的「穩定性」或「穩定」意謂其在升高溫度存在下保留一定活性，諸如為暴露於升高溫度之前的原始或初始玻尿酸酶活性的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或90%以上。一般而言，若與培育或暴露於允許溫度(諸如冷凍溫度，例如2℃-8℃)相比，經修飾之PH20玻尿酸酶在升高溫度下或暴露於升高溫度進行培育之後保留玻尿酸酶活性之至少50%或50%以上，則其為穩定的。分析玻尿酸酶活性之分析為熟習此項技術者已知且在本文描述。應瞭解，酶之穩定性不必為永久或長期的，顯現希望具有活性之持續時間即可。舉例而言，若經修飾之PH20玻尿酸酶在暴露於升高溫度 後或在暴露於升高溫度期間，顯示活性至少2小時、3小時、4小時、6小時、12小時、24小時、一天、兩天、三天、四天、五天、六天、一週、一個月、六個月或一年，則其為穩定的。
如本文所使用，熱穩定性是指對暴露於高溫或升高溫度後所發生之多肽變性之抵抗性的量度，且因此為蛋白質在特定溫度下起作用之能力。若多肽在一溫度下保留多肽活性或特性至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上，則其在該溫度下為熱穩定的。熱穩定性可藉由已知程序或藉由本文所描述之方法量測。在某些具體實例中，熱穩定性藉由量測蛋白質之熔融溫度(Tm)或藉由熱攻擊分析(Tc)來評估。
如本文所使用，熔融溫度(Tm；亦稱為轉變溫度)為50%組成物分子處於摺疊狀態之熱轉變曲線中點所在的溫度。因此，其為使50%大分子變成變性之溫度，且為用於描述蛋白質之熱穩定性的一種標準參數。測定Tm之方法為熟習此項技術者所熟知且包括例如分析光譜法，諸如(但不限於)差示掃描熱量測定(DSC)、圓二色性(CD)光譜法、螢光發射光譜法或核磁共振(NMR)光譜法。
如本文所使用，「熱攻擊」分析(或「熱梯度」分析)是指藉由在一定溫度範圍下培育蛋白質設定時段且測試活性(例如玻尿酸酶活性)所進行之分析。熱攻擊分析可用於測定針對所測試時段保留50%活性之溫度，其為所測試時段之T50值(亦稱為Tc值)。熱攻擊分析可在任何所希望時段下進行，且由使用者決定。
如本文所使用，熱應力條件是指使未經修飾之降解玻尿酸之酶或其他參考降解玻尿酸之酶(例如野生型或天然)易變性或降解，因而不穩定之 溫度條件。出於本文中之目的，熱應力條件典型地為等於或超過如在熱攻擊分析中測定的未經修飾之降解玻尿酸之酶或其他參考降解玻尿酸之酶(例如野生型或天然)的熔融溫度(Tm)或T50值的溫度。舉例而言，熱應力條件可為等於或超過0.5℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、15℃、20℃或20℃以上之溫度。
如本文所使用，關於蛋白質之「可溶性」是指蛋白質在水溶液中為均質的，從而蛋白質分子擴散且不自發沈降。因此，可溶蛋白質溶液為在含有蛋白質之溶液中不存在可見或離散粒子，使得粒子無法輕易濾去之溶液。一般而言，若溶液中無可見或離散粒子，則蛋白質可溶。舉例而言，若蛋白質不含或含有很少的可藉由孔徑為0.22μm之濾紙移除之粒子，則其可溶。
如本文所使用，關於蛋白質之聚集或結晶是指含有蛋白質之溶液中存在可見或離散粒子。典型地，粒子尺寸超過10μm，諸如超過15μm、20μm、25μm、30μm、40μm、50μm或更大。聚集或結晶可因可溶性降低、蛋白質變性增加或形成共價鍵而產生。
如本文所使用，「溫度抗性增加」或「溫度穩定性增加」是指與不含修飾之對應降解玻尿酸之酶相比，經修飾之降解玻尿酸之酶(例如經修飾之PH20)對由升高溫度引起之變性的抗性任何量之增加。舉例而言，溫度抗性增加可顯現為熱穩定性增加，諸如與不含修飾之對應降解玻尿酸之酶相比，經修飾之降解玻尿酸之酶(例如經修飾之PH20)的Tm或T50增加(亦即更高)。在其他實例中，變性與結晶或聚集增加、可溶性降低或活性降低相關或引起其。因此，對變性之抗性意謂蛋白質在暴露於變性條件時，與 參考蛋白質(例如未經修飾之酶或無賦予增加抗性/穩定性之修飾之蛋白質)相比，顯示聚集或結晶減少、可溶性增加或活性(例如玻尿酸酶活性)增加或更大。溫度抗性增加不必為絕對或永久的，但因為在升高溫度下經修飾之降解玻尿酸之酶的變性比未經修飾之酶緩慢得多，使得經修飾之降解玻尿酸之酶的活性或特性實現更長時間而可實現。舉例而言，若經修飾之降解玻尿酸之酶，諸如經修飾之PH20玻尿酸酶，顯示對升高溫度之抗性比對應未經修飾之多肽對相同溫度之抗性大至少或約至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%，則其顯示溫度抗性增加。在一些情況下，經修飾之多肽顯示與未經修飾之多肽相比，105%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、300%、400%、500%或更大的溫度抗性增加。因此，若經修飾之PH20玻尿酸酶在暴露於升高溫度一定時段時，顯示活性為未經修飾或參考PH20玻尿酸酶之活性的至少或約至少110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、250%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%或1000%以上，則其顯示溫度穩定性增加。
如本文所使用，活性是指多肽或其部分之與全長(完整)蛋白質相關的功能活性。功能活性包括(但不限於)生物活性、催化或酶活性、抗原性(結合多肽或與多肽競爭結合於抗多肽抗體之能力)、免疫原性、形成多聚體之能力及特異性結合於多肽之受體或配位體的能力。
如本文所使用，玻尿酸酶活性是指以酶促方式催化透明質酸(亦稱為玻尿酸)裂解之能力。舉例而言，對於人類降解玻尿酸之酶，諸如人類PH20， 玻尿酸酶活性是指以酶促方式催化人類透明質酸裂解之能力。美國藥典(The United States Pharmacopeia，USP)XXII關於玻尿酸酶之分析藉由量測在使酶與HA在37℃下反應30分鐘之後剩餘的較高分子量透明質酸或玻尿酸(HA)受質之量，間接測定玻尿酸酶活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645 United States Pharmacopeia Convention公司，Rockville,MD)。參考標準溶液可用於分析中以確定任何玻尿酸酶之相對活性(以單位計)。測定玻尿酸酶(諸如PH20，包括經修飾之PH20多肽)之玻尿酸酶活性的試管內分析為此項技術中已知且在本文中描述。例示性分析包括本文所描述之微濁度分析，其藉由偵測未裂解透明質酸與血清白蛋白結合時所形成之不溶沈澱來間接量測玻尿酸酶對透明質酸之裂解。可使用參考標準，例如以產生標準曲線，來測定測試之玻尿酸酶的活性(以單位計)。
如本文所使用，中性活性是指PH20多肽能夠在中性pH值下(諸如在介於或約介於pH 6.0至pH 7.8之間的pH值下)以酶促方式催化透明質酸之裂解。
如本文所使用，關於蛋白質組成物之「冷凍」是指儲存在3至5℃(37至41℉)之溫度下。
如本文所使用，關於蛋白質組成物之「無冷凍」或「非冷凍」是指儲存在室溫或環境溫度下。特定條件及溫度無需恆定，且可視場所或環境而改變或處於不斷變化中。舉例而言，溫度可在運送、處置或可在無冷凍下發生之其他用途期間變動。因而，在無冷凍下實現之溫度包括持續、變化或間歇溫度。舉例而言，熱帶氣候之溫度可在15-42℃範圍內變化。一般而言，在無冷凍下，蛋白質組成物可暴露於升高溫度或超過25℃達一定時段， 包括至少為、超過或為約30℃，諸如包括30℃至包括42℃，且一般包括32℃至包括37℃或包括35℃至包括37℃之溫度。
如本文所使用，「室溫」是指一般自約18℃或18℃至約32℃或32℃之範圍，且典型地在20℃至25℃範圍內。其一般為在溫控建築物中存在之溫度。熟習此項技術者瞭解室溫隨位置及盛行條件而變化。舉例而言，室溫可高於諸如意大利(Italy)或德克薩斯(Texas)之較溫暖氣候。此外，室溫可隨季節變化，使得夏季之標準室溫(例如23℃至26℃)可不同於冬季(例如19℃至21℃)。
如本文所使用，「環境溫度」是指諸如在蛋白質組成物之運送、處置及其他儲存期間所出現的周圍環境之溫度。因此，環境溫度可在0℃以下至42℃範圍內變化。對於室內氣候，環境溫度可與室溫相同。對於室外氣候，環境溫度可比室溫冷或溫暖。熟習此項技術者將瞭解環境溫度隨位置及盛行條件而變化。在熱帶氣候，環境溫度一般比其他氣候溫暖。夏季環境溫度一般比冬季環境溫度溫暖。
如本文所使用，夏季環境溫度反映在夏季月份期間(例如五月至九月或八月至七月)可碰到之諸如可在北緯59.9º與南緯37.8º之間存在的溫度極值。舉例而言，此類溫度可在23℃至39℃範圍內變化。
如本文所使用，「熱帶氣候」是指靠近赤道之熱帶地區的氣候(例如可在南緯23.5º與北緯23.5º之間存在)，其中全部十二個月之平均溫度典型地超過18℃，且在一些情況下可能高得多。舉例而言，在如印度(India)塔爾沙漠(Thar Desert)之熱帶地區，五月及六月之盛行熱條件可為每日在46℃至50℃範圍內5-6小時。因此，對熱帶氣候之提及是指溫度在22℃至50 ℃範圍內，且一般日間溫度為30℃至42℃。
如本文所使用，敍述蛋白質「在相同條件下比較」意謂不同蛋白質經相同或實質上相同地處理，使得任一或多種可影響蛋白質或試劑之活性或特性的條件在測試試劑之間不變化或實質上不變化。舉例而言，當經修飾之PH20多肽之玻尿酸酶活性與未經修飾之PH20多肽相比時，如下任一或多個條件在所比較之多肽之間及當中為一致或實質上一致的：諸如多肽之量或濃度；調配物中賦形劑、載劑或除活性劑(例如經修飾之PH20玻尿酸酶)以外之其他組分的存在，包括量；溫度；儲存時間；儲存容器；儲存特性(例如攪動)及/或與暴露或使用相關之其他條件。一般而言，出於本文中之目的，當比較蛋白質時，僅僅溫度變化或不同。
如本文所使用，「預定時間」是指預先確定或決定之時間。舉例而言，預定時間可為預先選擇之時間，其與降解玻尿酸之酶之活性的所希望持續時間相關，視蛋白質之所希望應用或使用而定。預定時間可為數小時、數天、數月或數年。舉例而言，預定時間可為至少約或約2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、12小時、24小時、2天、3天、4天、5天、6天、一週、兩週、三週、一個月、六個月、一年或更長時間。
如本文所使用，「儲存」意謂調配物在製備後不立即投予個體，而是在使用之前在特定條件(例如特定溫度、時間及/或形式(例如液體或凍乾形式))下保持一段時間。舉例而言，液體調配物可在投予個體之前保持或暴露於變化溫度(諸如冷凍(0℃至10℃，諸如2℃至8℃)、室溫(例如溫度至多32℃，諸如18℃至約32℃或32℃)或升高之其他環境溫度(例如30℃至42℃，諸如32℃至37℃或35℃至37℃)一定時段(例如數天或數月)。
如本文所使用，「賦形劑」是指在活性劑之調配物中在缺乏活性劑的情況下投予時不提供活性劑之生物效應的化合物。例示性賦形劑包括(但不限於)鹽、緩衝劑、穩定劑、張力調節劑、金屬、聚合物、界面活性劑、防腐劑、胺基酸及糖。
如本文所使用，穩定化劑(stabilizing agent)或穩定劑(stabilizer)是指添加至調配物中以在必要時防止經修飾之PH20多肽或其他活性劑諸如因本文中之調配物在處置、儲存或使用時所暴露的變性條件而降解的化合物。因而，包括防止蛋白質自組成物中之其他組分降解的試劑。例示性此類試劑為胺基酸、胺基酸衍生物、胺、糖、多元醇、鹽及緩衝劑、界面活性劑、抑制劑或基質、蛋白質(例如白蛋白)及如本文所述之其他試劑。
如本文所使用，「緩衝劑(buffer)」或「緩衝劑(buffering agent)」是指不管添加強酸或強鹼以及溫度、壓力、體積或氧化還原電位之外部影響，均可保持其pH值恆定的物質，一般為溶液。緩衝劑防止另一化學物質之濃度改變，例如防止氫離子濃度(pH值)顯著改變之質子供體及受體系統。所有緩衝劑之pH值均視溫度及濃度而定。維持pH值或範圍之緩衝劑的選擇可藉由熟習此項技術者，基於已知緩衝劑之已知緩衝能力，憑經驗確定。例示性緩衝劑包括(但不限於)碳酸氫鹽緩衝劑、二甲胂酸鹽緩衝劑、磷酸鹽緩衝劑或Tris緩衝劑。舉例而言，Tris緩衝劑(緩血酸胺)為一種基於胺的緩衝劑，其具有8.06之pKa值且具有介於7.9與9.2之間的有效pH值範圍。對於Tris緩衝劑，pH值每℃溫度減少則增加約0.03個單位，且每十倍稀釋則減小0.03至0.05個單位。
如本文所使用，天然存在之α-胺基酸的殘基為在自然界中發現之彼等 20種α-胺基酸的殘基，在人類中該等胺基酸藉由帶電tRNA分子經其同源mRNA密碼子特異性識別而併入蛋白質中。
如本文所使用，核酸包括DNA、RNA及其類似物，包括肽核酸(PNA)及其混合物。核酸可為單股或雙股。當提及視情況諸如經可偵測標記(諸如螢光或放射性標記)進行標記之探針或引子時，涵蓋單股分子。此類分子典型地具有使得其標靶在統計學上獨特之長度或具有低複本數(典型地低於5，一般低於3)，用於探測或引發文庫。一般而言，探針或引子含有與相關基因互補或一致之序列的至少14、16或30個相鄰核苷酸。探針及引子可為10、20、30、50、100或100個以上核酸長。
如本文所使用，肽是指長度為2至40個胺基酸之多肽。
如本文所使用，存在於本文所提供之胺基酸之各種序列中的胺基酸根據其已知之三字母或一字母縮寫鑑別(表1)。存在於各種核酸片段中之核苷酸用此項技術中常規使用之標準單字母名稱表示。
如本文所使用，「胺基酸」為含有胺基及羧酸基之有機化合物。多肽含有兩個或兩個以上胺基酸。出於本文中之目的，胺基酸包括二十種天然存在之胺基酸、非天然胺基酸及胺基酸類似物(亦即α碳具有側鏈之胺基酸)。
如本文所使用，「胺基酸殘基」是指在多肽在其肽鍵處進行化學消化(水解)時所形成之胺基酸。本文所描述之胺基酸殘基假定呈「L」異構體形式。如此表示之呈「D」異構體形式之殘基可取代任何L-胺基酸殘基，只要該多肽保持所希望的功能特性即可。NH2是指在多肽胺基端存在之自由胺基。COOH是指在多肽之羧基端存在之自由羧基。與J.Biol.Chem.,243：3557-3559(1968)及採用之37 C.F.R.§§ 1.821-1.822中所述之標準多肽命名法一致，胺 基酸殘基之縮寫展示於表1中：
應注意，本文中藉由式表示之所有胺基酸殘基序列在胺基端至羧基端之習知方向上均具有左至右之取向。此外，短語「胺基酸殘基」定義廣泛以包括對應表(表1)中所列之胺基酸及經修飾且不尋常之胺基酸，諸如37 C.F.R.§§ 1.821-1.822中提及且以引用之方式併入本文中的彼等胺基酸。此外，應注意，在胺基酸殘基序列開始或末端處之破折號指示與一或多個胺基酸殘基之另一序列、與諸如NH2之胺基端基或與諸如COOH之羧基端基的肽鍵。
如本文所使用，「天然存在之胺基酸」是指多肽中存在之20種L-胺基 酸。
如本文所使用，「非天然胺基酸」是指結構類似於天然胺基酸但在結構上經修飾以模擬天然胺基酸之結構及反應性的有機化合物。因而非天然存在之胺基酸包括例如非20種天然存在之胺基酸的胺基酸或胺基酸類似物且包括(但不限於)胺基酸之D-立體異構體。例示性非天然胺基酸在本文中描述且為熟習此項技術者已知。
如本文所使用，等動力學混合物為胺基酸莫耳比已基於其報導之反應速率調節的混合物(參見例如Ostresh等人，(1994)Biopolymers 34：1681)。
如本文所使用，胺基酸適合的保守取代為熟習此項技術者已知且可一般在不改變所得分子之生物活性下進行。熟習此項技術者認識到，一般而言，在多肽之非必需區域中單胺基酸取代實質上不改變生物活性(參見例如Watson等人Molecular Biology of the Gene，第4版，1987,The Benjamin/Cummings Pub.公司，第224頁)。此類取代可根據如下表2中闡述之取代進行：
其他取代亦為容許的且可憑經驗或根據已知之保守取代確定。
如本文所使用，DNA構築體為含有以在自然界中未發現之方式組合及並置之DNA區段的單股或雙股、線性或環形DNA分子。DNA構築體作為人類操縱之結果存在，且包括操縱分子之純系及其他複本。
如本文所使用，DNA區段為具有指定屬性之較大DNA分子的一部分。舉例而言，編碼指定多肽之DNA區段為在自5'至3'方向閱讀時編碼指定多肽之胺基酸序列的較長DNA分子的一部分，諸如質體或質體片段。
如本文所使用，術語多核苷酸意謂自5'至3'末端閱讀之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸鹼基的單股或雙股聚合物。多核苷酸包括RNA及DNA，且可自天然來源分離、試管內合成或自天然與合成分子之組合製備。多核苷酸分子之長度在本文中根據核苷酸(簡稱為「nt」)或鹼基對(簡稱為「bp」) 給出。在上下文准許之情況下，術語核苷酸用於單股及雙股分子。當該術語應用於雙股分子時，其用於指代整體長度且應理解為等同於術語鹼基對。熟習此項技術者將認識到，雙股多核苷酸之兩股長度可略微不同且其末端可交錯；因而雙股多核苷酸分子內之所有核苷酸無法成對。此類不成對末端一般長度將不超出20個核苷酸。
如本文所使用，「在對應於……之位置」或敍述核苷酸或胺基酸位置「對應於」揭示或參考序列中(諸如序列表中闡述)之核苷酸或胺基酸位置是指在與揭示序列比對以使用標準比對演算法(諸如GAP演算法)最大化一致性後所鑑別之核苷酸或胺基酸位置。SEQ ID NO：3為本文中之一種例示性參考序列。本文中提及位置或胺基酸置換對應於參考SEQ ID NO：3之位置亦意謂位置或胺基酸置換對應於參考SEQ ID NO：7或32-66中之任一者的位置，因為其中該等序列等同於如SEQ ID NO：3中闡述之對應殘基。因而，出於本文中之目的，PH20序列之比對將針對SEQ ID NO：3、7或32-66及尤其SEQ ID NO：3中闡述之胺基酸序列。藉由比對該等序列，熟習此項技術者可例如使用保守及一致胺基酸殘基作為引導來鑑別對應殘基。一般而言，為鑑別對應位置，比對胺基酸序列以獲得最高次序匹配(參見例如：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.編輯，Oxford University Press,New York,1988；Biocomputrng：Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.編輯，Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編輯，Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.及Devereux,J.編輯，M Stockton Press,New York, 1991；Carrillo等人(1988)SIAM J Applied Math 48：1073)。圖2(A-L)例示用於置換之例示性對應殘基之例示性比對及鑑別。
如本文所使用，「序列一致性」是指在測試與參考多肽或多核苷酸之間的比較中一致或類似胺基酸或核苷酸鹼基的數目。序列一致性可藉由核酸或蛋白質序列之序列比對以鑑別類似性或一致性區域來確定。出於本文之目的，序列一致性一般藉由比對以鑑別一致殘基來確定。比對可為局部或全局，但出於本文之目的，比對一般為全局比對，其中比較每一序列之整個長度。可在比較序列之間鑑別匹配、錯配及間隙。間隙為插入比對序列之殘基之間以便比對一致或類似特徵的空胺基酸或核苷酸。一般而言，可存在內部及末端間隙。序列一致性可在考慮間隙下確定為一致殘基之數目/最短序列之長度×100。當使用間隔罰分時，可在針對末端間隙無罰分下來確定序列一致性(例如末端間隙不處罰)。或者，序列一致性可在不考慮間隙下確定為一致位置之數目/總比對序列之長度×100。
如本文所使用，「全局比對」為將兩種序列自開始至末端進行比對之比對，僅僅比對每一序列中之每一字母一次。不管序列之間是否存在類似性或一致性，均進行比對。舉例而言，基於「全局比對」之50%序列一致性意謂在兩種比較序列之完整序列之比對中，每100個核苷酸長度有50%殘基相同。應瞭解，即使當比對序列之長度不相同時，全局比對亦可用於確定序列一致性。除非選擇「末端間隙無罰分」，否則在確定序列一致性時將考慮序列末端之差異。一般而言，對在其大部分長度上享有顯著類似性之序列使用全局比對。用於進行全局比對之例示性算法包括Needleman-Wunsch演算法(Needleman等人J.Mol.Biol.48：443(1970))。用於進行全局比對之 例示性程式可公開獲得，且包括在美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網站(ncbi.nlm.nih.gov/)上可獲得之全局序列比對工具(Global Sequence Alignment Tool)及在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html可獲得之程式。
如本文所使用，「局部比對」為將兩種序列比對，但僅僅比對享有類似性或一致性之彼等序列部分之比對。因此，若一個序列之子區段存在於另一序列中，則確定局部比對。若不存在類似性，則不返回比對。局部比對算法包括BLAST或Smith-Waterman演算法(Adv.Appl.Math.2：482(1981))。舉例而言，基於「局部比對」之50%序列一致性意謂在任何長度之兩種比較序列之完整序列的比對中，100個核苷酸長度之類似性或一致性區域在類似性或一致性區域中具有50%相同殘基。
出於本文之目的，序列一致性可藉由標準比對演算法程式與藉由每一供應商確定之預設間隙罰分一起使用來確定。用於GAP程式之預設參數可包括：(1)一元比較矩陣(含有值1用於一致性及值0用於無一致性)及Gribskov等人Nucl.Acids Res.14：6745(1986)之加權比較矩陣，如Schwartz及Dayhoff編輯，Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation，第353-358頁(1979)所述；(2)每一間隙3.0之罰分及每一間隙中之每一符號另外0.10罰分；以及(3)末端間隙無罰分。任兩種核酸分子之核苷酸序列或任兩種多肽之胺基酸序列是否至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%「一致」或敍述一致性百分比之其他類似變體，其均可使用已知之電腦演算法，基於局部或全局比對來確定(參見例如wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment_software，提供許多已知及可公開獲得 之比對數據庫及程式的鏈接)。一般而言，出於本文之目的，序列一致性使用電腦演算法，基於全局比對來確定，諸如購自NCBI/BLAST之Needleman-Wunsch全局序列比對工具(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？CMD=Web&Page_TYPE=BlastHome)；LAlign(建構Huang及Miller演算法之William Pearson(Adv.Appl.Math.(1991)12：337-357))；以及來自Xiaoqui Huang在deepc2.psi.iastate.edu/aat/align/align.html可獲得之程式。一般而言，當在本文中比較核苷酸序列時，使用末端間隙具有罰分之比對。當比較序列為實質上相同長度時亦可使用局部比對。
因此，如本文所使用，術語「一致性」表示在測試與參考多肽或多核苷酸之間的比較或比對。在一個非限制性實例中，「至少90%一致」是指相對於參考多肽或多核苷酸90%至100%的一致性%。90%或90%以上程度之一致性指示假定出於例示之目的，比較100個胺基酸或核苷酸長度之測試與參考多肽或多核苷酸，測試多肽或多核苷酸中不超過10%(亦即100個中的10個)胺基酸或核苷酸不同於參考多肽。類似比較可在測試與參考多核苷酸之間進行。此類差異可表示為隨機分佈在胺基酸序列整個長度上的點突變，或其可叢集在變化長度之一或多個位置中，達至例如10/100胺基酸差異之可允許最大值(約90%一致性)。差異亦可歸因於胺基酸殘基之缺失或截短。差異定義為核酸或胺基酸取代、插入或缺失。視比較序列之長度而定，在同源性或一致性在約85%-90%以上的程度上，結果可獨立於程式及設定之間隙參數；此類高程度一致性可容易評估，常常不必依賴於軟體。
如本文所使用，對偶基因變異體或對偶基因變異是指佔據相同染色體基因座之基因的任兩種或兩種以上替代形式。對偶基因變異經由突變天然 出現，且可引起群體內之表型多形現象。基因突變可沉默(編碼多肽中無改變)或可編碼具有改變胺基酸序列之多肽。術語「對偶基因變異體」在本文中亦用以指代藉由基因之對偶基因變異體編碼之蛋白質。典型地，基因之參考形式編碼來自一個物種之一群或單個參考成員之多肽的野生型形式及/或主要形式。典型地，包括物種之間及當中變異體的對偶基因變異體典型地具有與來自相同物種之野生型及/或主要形式至少80%、90%或90%以上胺基酸一致性；一致性程度取決於基因及比較為種間還是種內。一般而言，種內對偶基因變異體具有與野生型及/或主要形式至少約80%、85%、90%或95%或95%以上一致性，包括與多肽之野生型及/或主要形式96%、97%、98%、99%或99%以上一致性。本文中對對偶基因變異體之提及一般是指在相同物種之成員中蛋白質之變化。
如本文所使用，可在本文中與「對偶基因變異體」互換使用之「對偶基因」是指基因或其部分之替代形式。對偶基因佔據同源染色體上之同一基因座或位置。當個體具有一個基因之兩種相同對偶基因時，該個體據稱為對該基因或對偶基因同型接合。當個體具有一個基因之兩種不同對偶基因時，該個體稱為對該基因異型接合。特定基因之對偶基因可在單核苷酸或若干核苷酸中彼此不同，且可包括諸如核苷酸取代、缺失及插入之修飾。基因之對偶基因亦可為含有突變之基因的形式。
如本文所使用，物種變異體是指在包括不同哺乳動物物種(諸如小鼠及人類)之不同物種中多肽之變異體。本文所提供之例示性物種變異體為靈長類動物PH20，諸如(但不限於)人類、黑猩猩、獼猴、食蟹獼猴、巨臂猿、猩猩或狨猴。一般而言，物種變異體具有70%、75%、80%、85%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或98%序列一致性。在物種變異體之間及當中的對應殘基可藉由比較及比對序列以最大化匹配核苷酸或殘基之數目，例如使得序列之間的一致性等於或超過95%、等於或超過96%、等於或超過97%、等於或超過98%或等於超過99%來確定。隨後相關位置以在參考核酸分子中指定之編號給出。可人工或藉由眼睛實現比對，尤其是在序列一致性超過80%下。
如本文所使用，實質上純意謂足夠均質以如藉由熟習此項技術者分析此類純度所用之標準分析方法(諸如薄層層析法(TLC)、凝膠電泳及高效液相層析法(HPLC))所測定，看起來不含可容易偵測之雜質，或足夠純，使得進一步純化將不會可偵測地改變物質之物理及化學特性，諸如酶及生物活性。用於純化化合物以產生實質上化學純之化合物的方法為熟習此項技術者所知。然而，實質上化學純之化合物可為立體異構體或異構體之混合物。在此類情況下，進一步純化可增加化合物之比活性。
如本文所使用，經分離或純化之多肽或蛋白質或其生物活性部分實質上不含細胞物質或來自蛋白質所來源之細胞或組織之其他污染蛋白質，或當化學合成時實質上不含化學前驅體或其他化學物質。若製劑如藉由熟習此項技術者分析此類純度所用之標準分析方法(諸如薄層層析法(TLC)、凝膠電泳及高效液相層析法(HPLC))所測定，看起來不含可容易偵測之雜質，或足夠純，使得進一步純化將不會可偵測地改變物質之物理及化學特性，諸如酶及生物活性，則可確定該等製劑為實質上純的。用於純化化合物以產生實質上化學純之化合物的方法為熟習此項技術者所知。然而，實質上化學純之化合物可為立體異構體之混合物。在此類情況下，進一步 純化可增加化合物之比活性。
因此，對實質上純化之多肽，諸如實質上純化之PH20多肽之提及是指實質上不含細胞物質之PH20蛋白質製劑，包括蛋白質與分離其或以重組方式產生其之細胞之細胞組分分離的蛋白質製劑。在一個具體實例中，術語實質上不含細胞物質包括具有低於約30%(以乾重計)非酶蛋白(在本文中亦稱為污染蛋白質)、一般低於約20%非酶蛋白或10%非酶蛋白或低於約5%非酶蛋白的酶蛋白製劑。當酶蛋白以重組方式產生時，其亦實質上不含培養基，亦即培養基佔酶蛋白製劑體積之低於約或為20%、10%或5%。
如本文所使用，術語實質上不含化學前驅體或其他化學物質包括其中蛋白質與蛋白質合成中所涉及之化學前驅體或其他化學物質分開的酶蛋白製劑。該術語包括具有低於約30%(以乾重計)、20%、10%、5%或更少化學前驅體或非酶化學物質或組分的酶蛋白製劑。
如本文所使用，關於例如合成核酸分子或合成基因或合成肽之合成是指藉由重組方法及/或藉由化學合成方法產生之核酸分子或多肽分子。
如本文所使用，藉由重組方式或使用重組DNA方法產生意謂用於表現由經選殖之DNA編碼之蛋白質的熟知分子生物學方法之使用。
如本文所使用，載體(或質體)是指用於將異源核酸引入細胞中用於其表現或複製的離散元件。載體典型地保持游離型，但可經設計以實現基因或其部分整合成基因組之染色體。亦涵蓋作為人工染色體(諸如酵母人工染色體及哺乳動物人工染色體)之載體。此類媒劑之選擇及使用為熟習此項技術者所熟知。
如本文所使用，表現載體包括能夠表現可操作地與能夠實現此類DNA 片段之表現的調節序列(諸如啟動子區域)連接之DNA的載體。此類其他區段可包括啟動子及終止子序列，且視情況可包括一或多個複製起點、一或多個可選標記物、強化子、聚腺苷酸化信號及其類似者。表現載體一般來源於質體或病毒DNA，或可含有兩者之元件。因而，表現載體是指在引入適當宿主細胞時表現所選殖之DNA的重組DNA或RNA構築體，諸如質體、噬菌體、重組病毒或其他載體。適當表現載體為熟習此項技術者所熟知且包括在真核細胞及/或原核細胞中可複製之表現載體及保持游離型之表現載體或整合至宿主細胞基因組中之表現載體。
如本文所使用，載體亦包括「病毒載體(virus vector)」或「病毒載體(viral vector)」。病毒載體為經工程改造之病毒，其可操作地連接於外源基因以將外源基因輸送(作為運載工具或輸送工具)至細胞中。病毒載體包括(但不限於)腺病毒載體、反轉錄病毒載體及牛痘病毒載體。
如本文所使用，在提及DNA區段時「可操作地」或「可操作地連接」意謂區段經配置，使得其共同用於達成其預期目的，例如轉錄引發啟動子下游及任何轉錄序列上游。啟動子通常為轉錄機構結合以引發轉錄且穿過編碼區段進行至終止子的結構域。
如本文所使用，結合物是指直接或間接連接於一或多個其他多肽或化學部分之經修飾之PH20多肽。此類結合物包括融合蛋白、藉由化學結合物產生之結合物及藉由任何其他方法產生，從而至少一個經修飾之PH20多肽直接或間接連接於另一多肽或化學部分之結合物，只要結合物保留玻尿酸酶活性即可。本文所提供之例示性結合物包括直接或間接連接於多聚化結構域(例如Fc部分)、毒素、標記或藥物之PH20多肽。
如本文所使用，融合蛋白是指藉由含有來自一個核酸分子之編碼序列及來自另一核酸分子之編碼序列的核酸序列編碼的多肽，其中該等編碼序列在相同閱讀框架中，使得當融合構築體在宿主細胞中轉錄及轉譯時，產生含有該兩種蛋白質之蛋白質。兩種分子在構築體中可為相鄰的，或由含有1、2、3個或3個以上，但典型地少於10、9、8、7或6個胺基酸之連接子多肽相隔。由融合構築體編碼之蛋白質產物稱為融合多肽。融合多肽之實例包括Fc融合物。
如本文所使用，結合於經修飾之PH20多肽的聚合物是指直接或經由連接子共價連接或以其他方式穩定連接於此類多肽的任何聚合物。此類聚合物典型地延長血清半衰期，且包括(但不限於)唾液酸部分、聚乙二醇(PEG)部分、聚葡萄糖及糖以及諸如用於糖基化之其他部分。
如本文所使用，術語評估或測定意欲包括在獲得產物活性之絕對值以及獲得指示活性程度之指標、比率、百分比、目視或其他值的意義上之定量及定性測定。評估可為直接或間接的。
如本文所使用，「組成物」是指兩種或兩種以上產物或化合物之任何混合物。其可為溶液、懸浮液、液體、粉末、糊狀物、水性、非水性或其任何組合。
如本文所使用，調配物是指含有至少一種活性藥劑或治療劑及一或多種賦形劑之組成物。
如本文所使用，共調配物是指含有兩種或兩種以上活性劑或藥劑或治療劑及一或多種賦形劑之組成物。舉例而言，快速作用之胰島素與降解玻尿酸之酶的共調配物含有快速作用之胰島素、降解玻尿酸之酶及一或多種 賦形劑。
如本文所使用，「組合」是指兩種或兩種以上物品或要素，例如兩種或兩種以上可一起使用之物品之間或當中的任何聯合。例示性組合包括(但不限於)兩種或兩種以上醫藥組成物、含有兩種或兩種以上活性成分(諸如兩種經修飾之PH20多肽)之組成物；經修飾之PH20多肽及抗癌劑，諸如化學治療化合物；經修飾之PH20多肽及治療劑(例如胰島素)；經修飾之PH20多肽及複數種治療及/或顯影劑，或其任何聯合。此類組合可包裝成套組。
如本文所使用，套組為經包裝之組合，視情況包括關於組合使用之說明書及/或用於此類用途之其他反應及組分。
如本文所使用，醫藥學上有效劑或治療劑包括可顯示治療作用以治療疾病或病症之任何生物活性劑。例示性治療劑在本文中描述。治療劑包括(但不限於)麻醉劑；血管收縮劑；分散劑；習知治療藥物，包括小分子藥物，包括(但不限於)雙膦酸鹽；及治療蛋白質，包括(但不限於)胰島素、IgG分子、抗體、細胞介素及凝血因子。
如本文所使用，「胰島素」是指用以增加葡萄糖吸收及儲存及/或減少內源性葡萄糖產生之激素、其前驅體或合成或重組類似物。胰島素及其類似物為熟習此項技術者所熟知，包括人類中及其對偶基因及物種變異體。胰島素轉變為稱為前胰島素原(人類胰島素之110個胺基酸)的前驅多肽，其含有引導蛋白質至使信號序列裂解、產生胰島素原之內質網(ER)的信號肽。胰島素原經進一步加工以釋放C或連接鏈肽(人類胰島素中之31個胺基酸之C鏈)。所得胰島素含有藉由二硫鍵交聯之A鏈(人類胰島素中 21個胺基酸長；SEQ ID NO：393中闡述)及B鏈(人類胰島素中30個胺基酸長；SEQ ID NO：394中闡述)。完全交聯人類胰島素含有三個二硫橋鍵：一個在A鏈位置7與B鏈位置7之間，第二個在A鏈位置20與B鏈位置19之間，且第三個在A鏈位置6與位置11之間。對胰島素之提及包括單體及多聚胰島素，包括六聚胰島素以及人類化胰島素。例示性胰島素多肽為包括人類之哺乳動物來源之胰島素多肽。對胰島素之提及包括呈單鏈或雙鏈形式之前胰島素原、胰島素原及胰島素多肽、具有活性之其截短形式，且包括人類胰島素之對偶基因變異體及物種變異體、藉由剪接變異體編碼之變異體及其他變異體，諸如胰島素類似物。一種例示性胰島素為具有分別在SEQ ID NO：393及394中闡述之人類胰島素A鏈及B鏈之胺基酸序列的人類胰島素，及顯示與A鏈或B鏈中之一者或兩者至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性且用以增加葡萄糖吸收及儲存及/或減少內源性葡萄糖產生的其變異體或類似物。
如本文所使用，「快速作用之胰島素」是指在皮下投予個體後不超過四小時或約不超過四小時顯示峰值胰島素含量之任何胰島素。快速作用之胰島素包括回應於糖尿病個體中在投予快速作用之胰島素時或在投予快速作用之胰島素後約四小時內出現的實際、感覺或預期高血糖病狀(諸如由用餐引起或預期由用餐引起之膳食高血糖病狀)而用於急性投予個體之任何胰島素或任何快速作用之胰島素組成物，從而快速作用之胰島素能夠預防、控制或改善急性高血糖病狀。快速作用之胰島素包括重組胰島素及經分離之胰島素(亦稱為「常規」胰島素)，諸如作為人類胰島素、豬類胰島素及牛類胰島素出售之胰島素，以及經設計以憑藉胺基酸變化而迅速起作 用之迅速作用之胰島素類似物(本文中亦稱為快速作用之胰島素類似物)。例示性常規胰島素製劑包括(但不限於)人類常規胰島素，諸如在商標Humulin®R、Novolin®R及Velosulin®下出售之常規胰島素、USP級人類胰島素(Insulin Human,USP)及USP級人類胰島素注射液(Insulin Human Injection,USP)以及胰島素之酸調配物，諸如Toronto Insulin、Old Insulin及Clear Insulin，以及常規豬胰島素，諸如IletinII®(豬類胰島素)。常規胰島素典型地具有30分鐘至一小時之間的發作時間及投予後2-5小時之峰值胰島素含量。
如本文所使用，迅速作用之胰島素類似物(亦稱為快速作用之胰島素類似物)為具有迅速發作時間之胰島素。迅速胰島素典型地為已諸如藉由引入一或多個胺基酸取代進行工程改造以比常規胰島素迅速地作用之胰島素類似物。迅速作用之胰島素類似物典型地具有注射後10-30分鐘之發作時間，以及在注射後30-90分鐘觀測到峰值胰島素含量。例示性迅速作用之胰島素類似物為在分別在SEQ ID NO：393或394中闡述之人類胰島素之A鏈及/或B鏈中含有一或多個胺基酸變化且顯示在注射後10-30分鐘之發作時間以及注射後30-90分鐘觀測到峰值胰島素含量的人類胰島素類似物。例示性迅速作用之胰島素類似物包括(但不限於)例如賴脯胰島素(例如Humalog®胰島素)、門冬胰島素(例如NovoLog®胰島素)及賴麩胰島素(例如Apidra®胰島素)、作為VIAject®及VIAtab®出售之快速作用之胰島素組成物(參見例如美國專利第7,279,457號)。例示性迅速作用之胰島素類似物之胺基酸序列具有胺基酸序列在SEQ ID NO：393中闡述之A鏈及胺基酸序列在SEQ ID NO：395-397中之任一者中闡述之B鏈。亦包括具有30分鐘或 30分鐘以下之發作時間及在注射後90分鐘之前、典型地30-90分鐘之峰值含量的任何其他胰島素。
如本文所使用，人類胰島素是指基於人類多肽合成或以重組方式產生之胰島素，包括對偶基因變異體及其類似物。
如本文所使用，快速作用之人類胰島素或人類快速作用之胰島素組成物包括快速作用之任何人類胰島素或人類胰島素組成物，但不包括非人類胰島素，諸如常規豬胰島素。
如本文所使用，「疾病或病症」是指在生物體中由包括(但不限於)感染、獲得性病狀、基因病狀之病因或病狀產生且特性為可鑑別之症狀的病理性狀況。
如本文所使用，玻尿酸相關之疾病、病症或病狀是指其中作為原因、結果或在其他方面在疾病或病狀中觀測到玻尿酸含量升高之任何疾病或病狀。玻尿酸相關之疾病及病狀與組織或細胞中升高之玻尿酸表現、增加之間質液壓力、減少之脈管體積及/或組織中增加之含水量相關。舉例而言，此類疾病及病狀包括(但不限於)包括癌症、椎間盤壓力及水腫。例示性疾病及病狀包括(但不限於)富含玻尿酸之癌症，例如腫瘤，包括實體腫瘤，諸如晚期癌症、轉移性癌症、未分化癌症、卵巢癌、原位癌(ISC)、鱗狀細胞癌(SCC)、前列腺癌、胰臟癌、非小細胞肺癌、乳癌、結腸癌及其他癌症。例示性玻尿酸相關之疾病及病狀亦為與升高之間質液壓力相關的疾病，諸如與椎間盤壓力相關之疾病，及水腫，例如由器官移植、中風、腦損傷或其他損傷所引起的水腫。玻尿酸相關之疾病、病症或病狀可藉由投予單獨或與另一治療及/或藥劑組合或除另一治療及/或藥劑之外含有降 解玻尿酸之酶(諸如玻尿酸酶，例如可溶性玻尿酸酶)的組成物來治療。在一個實例中，玻尿酸相關之病狀、疾病或病症之治療包括對增加之間質液壓力(IFP)、減少之脈管體積及組織中增加之含水量中的一或多者之改善、降低或其他有益作用。
如本文所使用，「治療」患有疾病或病狀之個體意謂在治療之後個體之症狀部分或完全緩解或保持靜態。因此治療涵蓋防治、治療及/或治癒。防治是指預防可能疾病及/或防止症狀惡化或疾病進展。治療亦涵蓋本文所提供之經修飾之干擾素及組成物的任何醫藥使用。
如本文所使用，治療意謂使病狀、病症或疾病之症狀或其他指示得以改善或以其他方式有利地改變之任何方式。
如本文所使用，治療作用意謂由個體治療產生之改變、典型地改進或改善疾病或病狀之症狀或治癒疾病或病狀的作用。治療有效量是指組成物、分子或化合物在投予個體後產生治療作用之量。
如本文所使用，術語「個體」是指動物，包括哺乳動物，諸如人類。
如本文所使用，患者是指顯示疾病或病症之症狀之人類個體。
如本文所使用，藉由治療，諸如藉由投予醫藥組成物或其他治療劑改善特定疾病或病症之症狀是指可歸因於組成物或治療劑之投予或與其相關的任何症狀減輕，不論永久性還是暫時性、持續還是短暫。
如本文所使用，預防或防治是指使出現疾病或病狀之風險降低之方法。
如本文所使用，「治療有效量」或「治療有效劑量」是指含有化合物之藥劑、化合物、物質或組成物至少足以產生治療作用之量。因此，其為預防、治癒、改善、阻止或部分阻止疾病或病症之症狀所需的量。
如本文所使用，單位劑型是指適合於人類及動物個體且如此項技術中已知個別包裝的物理離散單元。
如本文所使用，單劑調配物是指含有單劑治療劑用於直接投予之調配物。單劑調配物一般不含任何防腐劑。
如本文所使用，「直接投予」是指用於投予之組成物在無稀釋下調配。
如本文所使用，多劑調配物是指含有多劑治療劑且可直接投予以提供治療劑之若干單劑的調配物。劑量可歷經數分鐘、數小時、數週、數天或數月之過程投予。多劑調配物可容許劑量調節、劑量彙集及/或劑量分開。因為多劑調配物隨時間使用，所以其一般含有一或多種防腐劑以預防微生物生長。
如本文所使用，「非經腸投藥」是指實現全身投藥之投藥途徑。例示性非經腸投藥途徑包括例如靜脈內、皮下或肌肉內投藥。
如本文所使用，一「群」是指含有至少10種不同蛋白質及/或其活性部分，且一般含有至少50、100、500、1000、104、105或更多成員之群。群典型地含有待針對活性進行篩檢之蛋白質，群中包括天然存在之蛋白質(或其活性部分)及/或經修飾之蛋白質。修飾包括沿蛋白質長度之隨機突變及/或靶向或選擇區域中之修飾(亦即聚焦突變)。修飾可為組合的且可包括所有置換，藉由在特定基因座或在所有基因座或其子集之所有胺基酸取代。群可包括全長或更短蛋白質。群之尺寸及特定群藉由使用者確定。本文中術語群可與術語「文庫」互換使用且意謂相同事物。
如本文所使用，「製品」為製備且出售之產品。如本申請案中通篇所用，該術語意欲涵蓋含於相同或分開包裝物品中之治療劑與可溶性PH20，諸如 esPH20，或單獨esPH20。
如本文所使用，流體是指可流動之任何組成物。因而流體涵蓋呈半固體、糊狀物、溶液、水性混合物、凝膠、洗劑、乳膏形式的組成物及其他此類組成物。
如本文所使用，「對照」或「標準」是指實質上與測試樣品一致，不同之處在於未用測試參數處理之樣品，或若其為血漿樣品，則其可來自不受相關病狀影響的普通志願者。對照亦可為內部對照。舉例而言，對照可為具有已知特性或活性之樣品，諸如病毒。
如本文所用，除非上下文以另外方式明確指明，否則單數形式「一種(a/an)」及「該」包括複數參考物。因而，例如，對「一種」藥劑之提及包括一或多種試劑。
如本文所使用，除非明確指示僅指替代物或替代物互斥，否則術語「或」用於意謂「及/或」。
如本文所使用，範圍及量可表示為「約」特定值或範圍。約亦包括準確量。因此「約5個鹼基」意謂「約5個鹼基」以及「5個鹼基」。
如本文所使用，「視情況存在」或「視情況」意謂隨後描述之事件或情形可能發生或不發生，且該描述包括其中該事件或情形發生之情況及其中事件或情形未發生之情況。舉例而言，視情況經取代之基團意謂基團未經取代或經取代。
如本文中所用，除非另外指明，否則關於任何保護基、胺基酸及其他化合物之縮寫均與其常見用法、公認縮寫或IUPAC-IUB生物化學命名委員會一致(參見(1972)Biochem.11：1726))。
為清楚揭示，且不以限制之方式，實施方式分成隨後子部分。
B. PH20玻尿酸酶及熱穩定性
PH20玻尿酸酶(亦稱為精子表面蛋白質、精子黏附分子1或SPAM1)為一種充當擴散劑以增加其他共同投予藥劑之皮下傳遞的治療蛋白質。PH20玻尿酸酶本身亦顯示治療與累積玻尿酸(HA)含量相關之多種疾病及病狀，諸如多種腫瘤及癌症的治療活性。
PH20憑藉其水解玻尿酸(亦稱為透明質酸、玻尿酸鹽或HA)之能力顯示其治療活性，在諸如細胞外基質之結締組織中發現玻尿酸且其為間質障壁之主要成分。玻尿酸為一種廣泛分佈在結締組織、上皮及神經組織中的未硫酸化葡糖胺聚糖。玻尿酸聚合物由重複雙醣單元D-葡糖醛酸(GlcA)及N-乙醯基-D-葡糖胺(GlcNAc)構成，雙醣單元經由交替β-1→4及β-1→3糖苷鍵連接在一起。玻尿酸鏈可達到長度為約25,000個雙醣重複單元或更大，且活體內玻尿酸之聚合物尺寸可在約5,000至20,000,000Da之範圍內。PH20為將透明質酸之β 1→4糖苷鍵水解成各種寡醣長度(諸如四醣及六醣)之內-β-N-乙醯基-己醣胺酶。PH20具有水解活性與糖基轉移酶活性。除降解透明質酸之外，PH20亦可降解硫酸軟骨素，諸如C4-S及C6-S。PH20可在酸性pH值及中性pH值下顯示玻尿酸酶活性。
然而，PH20玻尿酸酶在升高溫度下易於降解及變性。本文提供在約或至少或超過52℃歷時10分鐘之熱應力條件下顯示穩定性的經修飾之PH20玻尿酸酶多肽，且因此稱為尤伯嗜熱蛋白。憑藉熱穩定性，本文所提供之經修飾之PH20多肽耐受熱且顯示改良之蛋白質熱力學穩定性，從而延長產品存放期。此外，經修飾之PH20多肽允許在較寬溫度條件範圍內儲存及使 用。舉例而言，經修飾之PH20多肽可在無冷凍下之變化氣候的條件下採用或儲存。
1. 結構
PH20 cDNA已自大量哺乳動物物種選殖。例示性PH20前驅多肽包括(但不限於)人類(SEQ ID NO：6)、牛類(SEQ ID NOS：15或17)、兔(SEQ ID NO：23)、食蟹獼猴(SEQ ID NO：13)、天竺鼠(SEQ ID NO：28)、大鼠(SEQ ID NO：21)、小鼠(SEQ ID NO：19)、黑猩猩(SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：399)、恆河猴(SEQ ID NO：11)、狐狸(SEQ ID NO：30)、巨臂猿(SEQ ID NO：387)、狨猴(SEQ ID NO：389)或猩猩(SEQ ID NO：391)PH20多肽。mRNA轉錄物典型地經轉譯，產生在N端含有35個胺基酸之信號序列的前驅蛋白質。在傳輸至ER之後，移除信號肽以產生成熟PH20多肽。例示性成熟PH20多肽包括(但不限於)人類(SEQ ID NO：7)、牛類(SEQ ID NOS：16或18)、兔(SEQ ID NO：24)、食蟹獼猴(SEQ ID NO：14)、天竺鼠(SEQ ID NO：29)、大鼠(SEQ ID NO：22)、小鼠(SEQ ID NO：20)、黑猩猩(SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：400)、恆河猴(SEQ ID NO：12)、狐狸(SEQ ID NO：31)、巨臂猿(SEQ ID NO：388)、狨猴(SEQ ID NO：390)或猩猩(SEQ ID NO：392)PH20多肽。舉例而言，人類PH20 mRNA轉錄物經正常轉譯，產生在N端含有35個胺基酸之信號序列(SEQ ID NO：6之胺基酸殘基位置1-35)的509個胺基酸之前驅蛋白質(SEQ ID NO：6)。因而，在傳輸至ER及移除信號肽之後，產生具有SEQ ID NO：7中闡述之胺基酸序列的474個胺基酸之成熟多肽。來自綿羊之PH20的序列亦為已知(參見例如SEQ ID NO：25-27)。
詳言之，人類PH20具有SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列。缺乏信號序列之成熟人類PH20闡述於SEQ ID NO：7中。對偶基因變異體及PH20之其他變異體為已知。已報導PH20之其他序列。舉例而言，已知如SEQ ID NO：68中闡述之前驅序列中闡述之PH20變異體，其在位置48含有Ala且在位置499含有Trp，或SEQ ID NO：69中闡述之與SEQ ID NO：7中闡述之序列相比，分別在位置13及464含有對應差異的其成熟序列(參見例如Gmachl等人(1993)FEBS Lett.,336：545-548；GenBank寄存編號AAC60607)。此外，已鑑別與SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸前驅序列相比，在位置5含有麩醯胺酸(Gln；Q)之PH20之天然變異體(參見例如SEQ ID NO：70，亦參見Varela等人(2011)Nature,469：539-542)。另一天然變異體與SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列相比，在位置47(如SEQ ID NO：71中闡述)，及與SEQ ID NO：3或7中闡述之胺基酸序列相比對應於位置12(如SEQ ID NO：72中闡述)含有丙胺酸(Ala；A)。
PH20多肽之序列及結構高度保守。來自各種物種之PH20蛋白質之間及當中的序列一致性為約50%至90%。長度為35個胺基酸之疏水性N端信號序列一般在PH20玻尿酸酶多肽當中保守。PH20玻尿酸酶含有長度為約340個胺基酸之共同核心玻尿酸酶結構域，對應於SEQ ID NO：6中闡述之前驅人類PH20序列之胺基酸殘基38-374。缺乏信號序列且含有具有對應於SEQ ID NO：6之胺基酸殘基464之C端胺基酸殘基的鄰接胺基酸序列的成熟PH20多肽(例如胺基酸殘基對應於SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列之位置36-464)為玻尿酸酶活性所需的最少序列(參見例如美國專利申請案第10/795,095號，其以美國專利第7,767,429號頒予；亦參見美國公開案第 US20100143457號)。
在共同玻尿酸酶結構域內，至少57個胺基酸在物種之間及當中保守(參見例如Arming等人(1997)Eur.J.Biochem.,247：810-814；ten Have等人(1998)Reprod.Fertil.DeV.,10：165-72；Chowpongpang等人(2004)Biotechnology Letters,26：1247-1252)。舉例而言，PH20玻尿酸酶含有12個保守半胱胺酸殘基，其對應於缺乏信號序列之成熟PH20之胺基酸序列(諸如SEQ ID NO：7中闡述或SEQ ID NO：3中闡述)的胺基酸殘基25、189、203、316、341、346、352、400、402、408、423及429，或其他可溶性C端截短多肽(對應於SEQ ID NO：6中闡述之全長人類PH20之胺基酸殘基60、224、238、351、376、381、387、435、437、443、458及464)。對應於25及316之半胱胺酸殘基及對應於189及203之半胱胺酸殘基形成二硫橋鍵。其他半胱胺酸殘基亦形成二硫橋鍵，參與轉譯後蛋白質成熟及/或活性調節。舉例而言，在SEQ ID NO：6中例示之多肽之半胱胺酸殘基C376與C387之間，C381與C435之間，C437與C443之間，以及C458與C464之間(分別對應於SEQ ID NO：3或7中闡述之成熟多肽的位置C341與C352；C346與C400之間，C402與C408之間，以及C423與C429之間)形成另外四個二硫鍵。
對應於SEQ ID NO：3或7中闡述之胺基酸序列(或其他成熟可溶性C端截短PH20多肽)之胺基酸殘基D111、E113及E249的胺基酸殘基為酶活性位點中之酸性殘基且在PH20物種之間及當中保守。對應於SEQ ID NO：3或7中闡述之胺基酸序列(或其他成熟可溶性C端截短PH20多肽)之胺基酸殘基R176、R246、R252的胺基酸殘基亦在物種之間及當中保守且促進受質結合及/或玻尿酸酶活性。胺基酸突變D111N、E113Q、R176G、E249N及 R252T產生具有不可偵測酶活性或殘餘酶活性之酶(參見例如Arming等人(1997)Eur.J.Biochem.,247：810-814)。
本文中之實施例證實玻尿酸酶活性需要對應於缺乏信號序列之成熟PH20中闡述(諸如SEQ ID NO：3或7中闡述)的胺基酸序列之位置25、111、113、176、189、203、246、249、252、316、341、346、352、400、402、408、423及429的PH20胺基酸殘基，因為此等殘基之突變誘發產生失活酶(例如其不表現或在表現時失活，參見例如表8)。例外為對應於R176K及C316D之胺基酸置換引起產生一定殘餘玻尿酸酶活性之突變體。
基於識別基元NxS或NxT，糖基化亦為PH20玻尿酸酶所需。在對應於SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：3中闡述之成熟胺基酸序列之位置N47、N131、N200、N219、N333及N358或其他可溶性C端截短多肽(對應於SEQ ID NO：6中闡述之人類PH20之胺基酸殘基N82、N166、N235、N254、N368及N393)的胺基酸殘基存在六個N連接之寡醣。詳言之，至少對應於胺基酸殘基N200、N333及N358之N連接之糖基化位點為分泌及/或酶活性所需(參見例如美國公開案第US20100143457號)。舉例而言，含有胺基酸突變N200A、N333A、N358A或N333A/N393A之PH20多肽產生失活蛋白質。糖基化位點之單一突變N47A、N131A、N219A及糖基化位點之雙重突變N47A/N131A、N47A/N219A、N131A/N291A保留活性。對應於SEQ ID NO：6中闡述之人類PH20之胺基酸殘基N368的N連接之糖基化位點在物種之間及當中保守(參見例如Chowpongpang等人(2004)Biotechnology Letters,26：1247-1252)。PH20玻尿酸酶亦含有O連接之糖基化位點。舉例而言，人類PH20在對應於SEQ ID NO：3或7中闡述之胺基酸序列之胺基酸T440(對應於SEQ ID NO：6中 之胺基酸殘基T475)的胺基酸殘基具有一個O連接之寡醣。
除催化位點之外，PH20亦含有玻尿酸結合位點。此位點位於肽2區域，該肽2區域對應於SEQ ID NO：6中闡述之前驅多肽之胺基酸位置205-235及SEQ ID NO：3或7中闡述之成熟多肽之位置170-200。此區域在玻尿酸酶當中高度保守且類似於肝素結合基元。在位置176精胺酸殘基(對應於SEQ ID NO：3或7中闡述之成熟PH20多肽)突變成甘胺酸產生一種僅僅具有野生型多肽之玻尿酸酶活性之約1%的多肽(Arming等人，(1997)Eur.J.Biochem.247：810-814)。
PH20多肽含有附接於蛋白質C端之糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨，該錨將蛋白質錨定至細胞質膜之細胞外層。至少人類、猴、小鼠及天竺鼠PH20經由GPI錨強有力地附接於質膜，其可藉由用磷脂醯肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC；參見例如Lin等人(1994)Journal of Cell Biology,125：1157-1163；Lin等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.,90：10071-10075)處理來釋放。其他PH20酶，諸如牛類PH20，鬆散地附接於質膜且不經由磷脂酶敏感性錨來錨定。如下文所論述，當表現時不附接於膜但分泌之可溶性活性形式可藉由移除所有或一部分GPI錨附接信號位點來產生(亦參見美國專利第7,767,429號；美國公開案第US20100143457號)。此等包括例如SEQ ID NO：3或32-66中之任一者中闡述之可溶性PH20多肽或含有信號序列之其前驅形式。在本文中應瞭解上文中對SEQ ID NO：3或7中闡述之成熟PH20多肽中之位置的提及為在SEQ ID NO：32-66中闡述之C端截短多肽中發現之相同位置(參見圖1)。
GPI錨定蛋白質(例如人類PH20)用可裂解N端信號肽轉譯，該信號 肽將蛋白質引導至內質網(ER)。在此等蛋白質之C端為引導預先形成之GPI錨添加至ER內腔內之多肽的另一信號序列。GPI錨之添加在稱為ω位點之特定胺基酸位置(典型地位於離C端約20-30個胺基酸處)上進行C端部分裂解後發生。雖然似乎無共同序列用來鑑別ω位點之位置，但GPI錨定蛋白質含有C端GPI錨附接信號序列或結構域，其典型地含有8-20個胺基酸之主要疏水性區域，在緊接ω位點下游之8-12個胺基酸的親水性間隔區域之前。此親水性間隔區域常常富含帶電胺基酸及脯胺酸(White等人(2000)J.Cell Sci.113(Pt.4)：721-727)。一般在ω-1位置之前存在約11個胺基酸之區域，其特性為低含量之預測二級結構；ω-1至ω+2存在在裂解位點(ω-位點)周圍之區域，其特性為存在小的側鏈殘基；ω+3與ω+9之間存在間隔區域；且ω+10至C端末端存在疏水性尾部(Pierleoni等人，(2008)BMC Bioinformatics 9：392)。
雖然不存在GPI錨附接信號共同序列，但已發展各種電腦模擬方法及演算法，其可用於鑑別多肽中之此類序列(參見例如Udenfriend等人(1995)Methods Enzymol.250：571-582；Eisenhaber等人(1999)J.Mol.Chem.292：741-758；Kronegg及Buloz,(1999),「Detection/prediction of GPI cleavage site(GPI-anchor)in a protein(DGPI)」,129.194.185.165/dgpi/；Fankhauser等人(2005)Bioinformatics 21：1846-1852；Omaetxebarria等人(2007)Proteomics 7：1951-1960；Pierleoni等人(2008)BMC Bioinformatics 9：392)，包括在生物資訊網站，諸如ExPASy蛋白質組學工具站點(expasy.ch/tools/)容易獲得之方法。因而，熟習此項技術者可確定PH20多肽是否可能含有GPI錨附接信號序列，及因此，該PH20多肽是否為GPI錨定蛋白質。
GPI錨與人類PH20之C端之共價附接及因此PH20之膜結合性質已使用磷脂醯肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)水解研究來證實(參見例如Lin等人(1994)J.Biol.Chem.125：1157-1163)。磷脂醯肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)及D(PI-PLD)使GPI錨水解，將PH20多肽自細胞膜釋放。先前技術文獻報導鑑別出人類PH20之ω位點裂解位點在Ser490與Ala491之間，且對於猴PH20，鑑別出在Ser491與Thr492之間(Lin等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci,(1993)90：10071-10075)。因而，該文獻報導人類PH20之GPI錨附接信號序列位於SEQ ID NO：6中闡述之前驅多肽之胺基酸位置491-509，且ω位點為胺基酸位置490。因而，在此人類PH20模型化中，胺基酸491-509在傳輸至ER後裂解且GPI錨共價附接於位置490之絲胺酸殘基。
可溶性PH20多肽
PH20可呈膜結合或膜締合形式存在，或在自細胞表現時可分泌至培養基中，且從而可呈可溶性形式存在。可溶性PH20可使用此項技術中熟知之方法，包括(但不限於)使用Triton® X-114分析之方法來偵測且與不溶性膜結合之PH20相區別。在此分析中，可溶性PH20玻尿酸酶分配至升溫至37℃之Triton® X-114溶液之水相中(Bordier等人，(1981)J.Biol.Chem.,256：1604-7)，同時膜錨定之PH20玻尿酸酶分配至富含清潔劑相中。因而，除使用演算法評估PH20多肽是否天然經GPI錨定且因此膜結合之外，亦可進行可溶性實驗。
可溶性PH20酶包括含有GPI錨附接信號序列，但鬆散地附接於膜，使得其不含磷脂酶敏感性錨之玻尿酸酶。舉例而言，可溶性PH20多肽包括綿羊或牛類PH20。各種形式之此類可溶性PH20玻尿酸酶已製備且批准用於 包括人類在個體中之治療用途。舉例而言，動物來源之玻尿酸酶製劑包括Vitrase®(ISTA Pharmaceuticals)、經純化之綿羊睾丸玻尿酸酶及Amphadase®(Amphastar Pharmaceuticals)、牛類睾丸玻尿酸酶。可溶性PH20酶亦包括缺乏糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨附接信號序列之一或多個胺基酸殘基且保留玻尿酸酶活性的非人類或人類膜締合PH20玻尿酸酶C端截短形式(參見例如美國專利第7,767,429號；美國公開案第US20100143457號)。因而，代替GPI錨共價附接於ER中之蛋白質C端，且錨定至質膜之細胞外層，此等多肽在自細胞表現時分泌且為可溶性的。在可溶性PH20保留GPI錨附接信號序列一部分的情況下，GPI錨附接信號序列中之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸殘基可保留，從而使多肽為可溶(亦即當自細胞表現時分泌)及活性的。
在C端截短且缺乏所有或一部分GPI錨附接信號序列之例示性可溶性玻尿酸酶包括(但不限於)靈長類動物來源之PH20多肽，諸如人類及黑猩猩PH20多肽。舉例而言，可溶性PH20多肽可藉由SEQ ID NO：7、10、12、14、69、72、388、390、392或400中闡述之多肽或顯示與SEQ ID NO：7、10、12、14、69、72、388、390、392或400至少80%、85%、90%、95%或95%以上序列一致性的其變異體進行C端截短來製得，其中所得多肽為活性、可溶的且缺乏來自GPI錨附接信號序列之所有或一部分胺基酸殘基。
例示性可溶性PH20多肽為C端截短人類PH20多肽，其為成熟(缺乏信號序列)、可溶的且顯示中性活性，且含有SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7中闡述之鄰接胺基酸序列，該鄰接胺基酸序列在SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列之胺基酸殘基464或其之後最低限度地具有C端截短胺基酸殘 基。舉例而言，可溶性PH20多肽包括最低限度地含有SEQ ID NO：6之36-464之鄰接胺基酸序列的C端截短多肽，或包括與在SEQ ID NO：6之胺基酸464之後具有C端胺基酸殘基之鄰接胺基酸序列具有至少85%、例如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%序列一致性的胺基酸序列且保留玻尿酸酶活性。
例示性C端截短人類PH20多肽為成熟多肽(缺乏信號序列)，其包括SEQ ID NO：6中闡述之鄰接胺基酸序列，且在464之後，諸如在SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列的胺基酸位置465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500之後具有C端殘基；或顯示與其至少85%序列一致性，諸如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%序列一致性且保留玻尿酸酶活性之其變異體。舉例而言，例示性C端PH20多肽具有SEQ ID NO：6中闡述之胺基酸序列之胺基酸36至465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500的序列，或顯示與其至少85%序列一致性，諸如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%序列一致性且保留玻尿酸酶活性的其變異體。可溶性PH20多肽包括具有SEQ ID NO：3或32-66中闡述之胺基酸序列或顯示與SEQ ID NO：3或32-66中之任一者中闡述之胺基酸序列至少85%序列一致性，諸如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%序列一致性的胺基酸序列的任何多肽。
詳言之，可溶性人類PH20多肽為一種在SEQ ID NO：6中闡述之序列的胺基酸482之後截短的多肽。此類多肽可由含有信號序列及例如SEQ ID NO：1(含有IgG κ信號序列)或SEQ ID NO：67(含有天然信號序列)中闡述之編碼胺基酸36-482的核酸分子產生。轉譯後加工移除信號序列，留下447個胺基酸之可溶性重組人類PH20(SEQ ID NO：3)。在SEQ ID NO：4或5中闡述之載體表現後產生且含有SEQ ID NO：67中闡述之核酸分子的產物在培養基中產生分泌產物，稱為rHuPH20，其在C端顯示非均質性，使得產物包括可包括各種豐度之SEQ ID NO：3及44-48中之任一或多者的物質混合物。典型地，rHuPH20在促進恰當N-糖基化以保留活性之細胞，諸如哺乳動物細胞，例如CHO細胞(例如DG44 CHO細胞)中產生。Hylenex®(Halozyme)為一種人類重組玻尿酸酶，其藉由含有編碼截短人類PH20多肽(稱為rHuPH20)之核酸的經基因工程改造之中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生。
2. 功能
PH20通常在精子中由單個睾丸特異性基因表現。PH20為參與受精的與精子締合之蛋白質。PH20通常定位在精子表面上，及溶酶體所來源之頂體中，其中其結合於內部膜。PH20為多功能的且顯示玻尿酸酶活性、玻尿酸(HA)介導之細胞信號傳導活性，且當存在於頂體反應(AR)精子上時充當卵母細胞周圍之卵膜的精子受體。舉例而言，PH20天然參與精子-卵子黏附且藉由消化透明質酸來幫助精子穿透卵丘細胞。除作為玻尿酸酶之外，PH20亦似乎為HA誘導之細胞信號傳導的受體，及卵母細胞周圍之卵膜的 受體。歸因於PH20在受精中之作用，PH20可用作免疫避孕之抗原。
雖然PH20在一些情況下可顯示酸活性之活性，但其為一種中性活性玻尿酸酶。PH20之玻尿酸酶活性由質膜及頂體內膜締合之PH20顯示。質膜PH20僅僅在中性pH值下顯示玻尿酸酶活性，而頂體內膜締合之PH20顯示酸活性之酶活性。此等差異之結構基礎歸因於PH20中兩個催化位點之存在。第一催化位點稱為肽1區域，對應於SEQ ID NO：6之胺基酸殘基142-172，其與PH20在中性pH值下之酶活性有關。第二催化位點稱為肽3區域，對應於SEQ ID NO：6之胺基酸殘基277-297，其與較低pH值下之酶活性有關。頂體內膜締合之PH20之結構中的改變在頂體反應之後發生，從而PH20經內切蛋白酶解，但由二硫鍵保持在一起。內切蛋白酶解之結果為肽3區域活化且因而可實現PH20之中性及酸活性(參見例如Cherr等人(2001)Matrix Biology,20：515-525)。此外，在頂體反應之後，藉由自內部頂體膜釋放來產生低分子量形式(例如在猴中產生PH20之53kDa可溶性形式)。低分子量形式亦為酸活性的。
PH20之玻尿酸酶活性解釋在動物睪丸提取物中觀測到之擴散活性，該等動物睪丸提取物已在臨床上使用數十年以增加藥物之分散及吸收(參見例如Bookbinder等人(2006)J Controlled Release,114：230-241)。舉例而言，含有玻尿酸酶之醫藥製劑發展成來自牛類睪丸之分級分離提取物，用於作為擴散劑之治療用途及用於其他應用中(Schwartzman(1951)J.Pediat.,39：491-502)。原始牛類睾丸提取製劑包括例如在商標Wydase®、Hylase®、「Dessau」、Neopermease®、Alidase®及Hyazyme®下出售之提取物。現已知睾丸提取製劑之擴散活性歸因於PH20玻尿酸酶活性。舉例而言，在2001年， 公牛中之精子玻尿酸酶鑑別為玻尿酸酶PH20(Lalancette等人(2001)Biol.Reprod.,65：628-36)。藉由催化透明質酸之水解，PH20玻尿酸酶降低透明質酸之黏度，由此增加組織滲透性。因此，PH20之可溶性形式用作擴散或分散劑，與其他藥劑、藥物及蛋白質結合，以增強其分散及傳遞，且提高共同投予之藥劑、藥物或蛋白質之藥物動力學及藥效學特徵(參見例如美國專利第7,767,429號；Bookbinder等人(2006)J Controlled Release,114：230-241)。
3. PH20玻尿酸酶之熱穩定性
PH20玻尿酸酶在升高溫度下不穩定。如本文中之實施例中所示，稱為rHuPH20之例示性可溶性PH20之T m 為約44℃(參見例如實施例5)。此外，在暴露於超過49℃之溫度僅僅10分鐘後玻尿酸酶活性即降低約50%或更多，且在暴露於55℃或更高的溫度僅僅10分鐘後保留不足20%活性(參見實施例6)。PH20玻尿酸酶之溫度特徵說明其容易因溫度小幅度增加而變性。
PH20玻尿酸酶之熱不穩定性可為發展需要在高溫下儲存及/或在儲存或使用期間以其他方式暴露於高溫(例如超過室溫或環境溫度，諸如超過30℃、35℃、40℃、45℃或45℃以上)的PH20調配物過程中的一個問題。詳言之，溫度在治療蛋白質所暴露之野外條件(諸如與儲存、傳輸、處置及傳遞相關之條件)下可變動。此等環境變化一般不可能控制。舉例而言，治療蛋白質之最終使用者並非一直可獲得冷凍或溫度控制，由此需要蛋白質在無冷凍下儲存長時間。此在經歷熱帶氣候之地區尤其為一個問題。此外，投藥途徑及某些投藥裝置亦可將蛋白質暴露於高溫，包括變動溫度。舉例而言，泵、可植入裝置、儲槽式注射劑及其他持續性蛋白質傳遞可需要調配物在37℃或更高的高溫下在裝置使用壽命內為穩定的。
雖然含有PH20玻尿酸酶或其他降解玻尿酸之酶的調配物之穩定性可藉由多種穩定化物質來實現，但此類物質可不利地影響儲存蛋白質或其他共同調配之蛋白質之下游使用。舉例而言，穩定化劑(例如界面活性劑及其他穩定化劑)可降低長期玻尿酸酶活性，增加聚集，增加變性及/或促進氧化。在與其他藥劑共同調配之PH20玻尿酸酶的調配物中，穩定化劑亦可類似地使其他藥劑之活性、吸收或聚集不穩定。此等作用在升高或變動溫度下可加劇。此意謂即使在穩定化劑存在下，在一些情況下PH20玻尿酸酶調配物亦無法長期或在高溫或變動溫度條件下儲存。在一些情況下，PH20玻尿酸酶用穩定劑儲存可需要在蛋白質可用於下游製程或與其他藥劑共同調配之前移除一或多種穩定化物質。
然而，作為一種治療劑，希望產生儲存供後續使用或用於持續性傳遞的PH20玻尿酸酶之調配物。重要的是，蛋白質在保持蛋白質在包括溫度之各種條件下之穩定性的條件下儲存。本文所提供之經修飾之PH20多肽為對未經修飾之PH20多肽不穩定之溫度耐受的尤伯嗜熱蛋白。以下部分進一步詳細描述本文所提供之尤伯嗜熱蛋白性PH20多肽。下文亦描述PH20尤伯嗜熱蛋白性多肽之組成物、組合、方法及應用。
C. 經修飾之PH20多肽：尤伯嗜熱蛋白
本文提供作為尤伯嗜熱蛋白之經修飾或變異PH20多肽。此等尤伯嗜熱蛋白顯示與不含修飾的未經修飾之PH20多肽(例如野生型PH20，諸如全長成熟PH20或其可溶性C端截短片段)相比增加之熱穩定性。本文所提供之經修飾之PH20多肽為與在4℃下培育10分鐘後的玻尿酸酶活性相比，在52℃下培育10分鐘之後保留其玻尿酸酶活性之至少50%的尤伯嗜熱蛋白。 對未經修飾之玻尿酸酶的受質評估活性。舉例而言，本文所提供之經修飾之PH20多肽為與在4℃下培育10分鐘之後的玻尿酸酶活性相比，在52℃下培育10分鐘之後保留其玻尿酸酶活性之至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上的多肽。
因此，經修飾之PH20多肽可在需要在高溫下儲存及/或在儲存或使用期間以其他方式暴露於高溫(例如超過室溫或環境溫度，諸如超過25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃或更高)的條件下使用。舉例而言，本文所提供之任何經修飾之PH20多肽可在無冷凍下儲存，包括在溫度變動(例如在輸送、傳遞或處置期間)的環境條件下或在熱帶氣候條件下。在另一實例中，本文所提供之任何經修飾之PH20多肽適用於在使用過程中需要暴露於超過25℃且典型地超過30℃、35℃、37℃或更高之升高溫度的持續傳遞方法。在任何此類實例中，本文所提供之任何經修飾之PH20多肽可顯示穩定性(例如保留超過50%玻尿酸酶活性)，藉由暴露於非冷凍或環境溫度(例如超過25℃，諸如在包括30℃至包括42℃之範圍內，諸如至少30℃或37℃或更高)至少72小時、96小時、數天、一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或更長時間實現。
本文所提供之經修飾之PH20尤伯嗜熱蛋白性多肽在不含修飾的未經修飾之PH20多肽(例如野生型PH20，諸如全長成熟PH20或其可溶性C端截短片段)中含有一個或一個以上修飾。修飾可為單個胺基酸修飾，諸如單個胺基酸置換(取代)、插入或缺失，或多個胺基酸修飾，諸如多個胺基酸置換、插入或缺失。例示性修飾為胺基酸置換，包括單個或多個胺基酸置換。胺基酸置換可為保守取代，諸如表2中闡述之保守取代，或非保守 取代，諸如本文中所描述之任一非保守取代。本文所提供之經修飾之PH20多肽可含有與不含修飾之PH20多肽相比，至少為或為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個經修飾之位置。應瞭解，在任一此類實例中，經修飾之PH20多肽為與在4℃下培育10分鐘之後的玻尿酸酶活性相比，在52℃下培育10分鐘之後保留其玻尿酸酶活性之至少50%的多肽。
本文中所描述之修飾可在任何PH20多肽(亦即未經修飾之PH20)中，包括前驅體、成熟或C端截短形式，只要修飾形式顯示玻尿酸酶活性且與在4℃下培育10分鐘之後的玻尿酸酶活性相比，在52℃下培育10分鐘之後保留其玻尿酸酶活性之至少50%即可。
舉例而言，與SEQ ID NO：2、3、6-66、68-72、387-392、399或400中之任一者中闡述之野生型、天然或參考PH20多肽相比，或在具有與SEQ ID NO：3、6-66、68-72、387-392、399或400中之任一者至少65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致之胺基酸序列的多肽中，該等PH20多肽含有修飾。舉例而言，在以下PH20多肽中：具有SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：72中包括或闡述之胺基酸序列的人類PH20多肽；具有SEQ ID NO：16或18中包括或闡述之胺基酸序列的牛類PH20多肽；具有SEQ ID NO：24中包括或闡述之胺基酸序列的兔PH20多肽；具有SEQ ID NO：14中包括或闡述之胺基酸序列的食蟹獼猴PH20多肽；具有SEQ ID NO：29中包括或闡述之胺基酸序列的天竺鼠PH20多肽；具有SEQ ID NO：22中包括或闡述之胺基酸序列的大鼠PH20多肽；具有SEQ ID NO：20中包括或闡述之胺基 酸序列的小鼠PH20多肽；具有SEQ ID NO：10或400中包括或闡述之胺基酸序列的黑猩猩PH20多肽；具有SEQ ID NO：12中包括或闡述之胺基酸序列的恆河猴PH20多肽；具有SEQ ID NO：31中包括或闡述之胺基酸序列的狐狸PH20多肽；具有SEQ ID NO：388中包括或闡述之胺基酸序列的巨臂猿PH20多肽；具有SEQ ID NO：390中包括或闡述之胺基酸序列的狨猴PH20多肽；具有SEQ ID NO：392中包括或闡述之胺基酸序列的猩猩PH20多肽；或具有SEQ ID NO：25-27中之任一者中包括或闡述之胺基酸序列的羊PH20多肽，或在顯示與SEQ ID NO：7、10、12、14、16、18、20、22、24-27、29、31、69、72、388、390、392或400中之任一者至少65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性的序列變異體或截短變異體中，進行修飾。
詳言之，本文提供經修飾之可溶性PH20多肽，其為含有本文所提供之修飾(例如胺基酸置換)之PH20多肽且當自細胞表現時作為可溶性蛋白質分泌至培養基中。舉例而言，在可溶性PH20多肽中進行修飾，該可溶性PH20多肽在含有含GPI錨信號序列之PH20多肽的GPI錨信號序列之C端部分內或靠近其進行C端截短。C端截短可為在C端8個相鄰胺基酸、在C端9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或更多個胺基酸之截短或缺失，只要所得C端截短多肽顯示玻尿酸酶活性且當表現時自細胞分泌(例如至培養基)即可。在一些實例中，在可溶性PH20多肽中進行本文所提供之修飾，該可溶 性PH20多肽為SEQ ID NO：7、10、12、14、69、72、388、390、392或400之C端截短多肽或顯示與SEQ ID NO：7、10、12、14、69、72、388、390、392或400中之任一者至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性的其變異體。
詳言之，本文提供在SEQ ID NO：7闡述之人類PH20多肽或其可溶性C端片段中或具有與SEQ ID NO：7或其可溶性C端片段中之任一者至少68%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致之胺基酸序列的多肽中含有修飾之PH20多肽。舉例而言，在具有SEQ ID NO：3或32-66中闡述之胺基酸序列或顯示與SEQ ID NO：3或32-66中之任一者中闡述的胺基酸序列至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%序列一致性之胺基酸序列的可溶性或C端截短人類PH20多肽中進行本文所提供之修飾。舉例而言，本文所提供之經修飾之PH20多肽含有關於SEQ ID NO：3中闡述之PH20多肽的胺基酸置換或取代、添加或缺失、截短或其組合。亦可在SEQ ID NO：3、7、10、12、14、16、18、20、22、24-27、29、31、32-66、69、72、388、390、392或400中之任一者的含有信號肽之對應前驅形式中進行修飾。舉例而言，本文所提供之修飾可在SEQ ID NO：2、6、8、9、11、13、15、17、19、21、23、28、30、387、389、391或399中之任一者中闡述之前驅形式中或在顯示與SEQ ID NO：2、6、8、9、11、13、15、17、19、21、23、28、30、387、389、391或399中之任一者至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、 91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性的其變異體中進行。
本文所提供之經修飾之PH20多肽顯示與不含修飾之未經修飾之PH20多肽(諸如SEQ ID NO：3-66、68-72、387-392、399或400中之任一者中闡述的未經修飾之PH20多肽)相比至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性。詳言之，本文所提供之經修飾之PH20多肽顯示與SEQ ID NO：3或32-66中之任一者中闡述之可溶性C端截短人類PH20多肽至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性。在本文所提供之經修飾之PH20多肽的實例中，經修飾之PH20多肽不含SEQ ID NO：3-66、68-72、387-392、399或400中之任一者中闡述之胺基酸序列。典型地，經修飾之PH20多肽與人類PH20多肽相比經修飾，且不含SEQ ID NO：8-31、69、72、387-392、399或400中之任一者中闡述之胺基酸序列。
一般而言，可在PH20多肽中進行任何修飾，諸如胺基酸置換、缺失或取代，其限制條件為該修飾不為其中唯一修飾為如下單個胺基酸置換的胺基酸置換：V12A、N47A、D111N、E113Q、N131A、R176G、N200A、N219A、E249Q、R252T、N333A或N358A。此外，在經修飾之PH20多肽僅含有兩個胺基酸置換的情況下，胺基酸置換不為P13A/L464W、N47A/N131A、N47A/N219A、N131A/N219A或N333A/N358A。在另一實例中，在經修飾之PH20多肽僅含有三個胺基酸置換的情況下，胺基酸置換不為N47A/N131A/N219A。本文所提供之例示性修飾在以下詳細描述。
典型地，如在標準玻尿酸酶活性分析中評估，經修飾之PH20多肽顯示不含修飾之未經修飾之PH20多肽(例如野生型PH20，諸如全長成熟PH20或其可溶性C端截短片段)的玻尿酸酶活性的至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上。此類分析描述於部分G中(亦參見實施例3及實施例4)。應瞭解，標準玻尿酸酶分析在未經修飾之PH20多肽耐受之條件及溫度下進行，使得多肽不在導致多肽熱不穩定性之條件下培育(例如在52℃下培育10分鐘)。
為保留玻尿酸酶活性，修飾典型地不在對改變不太耐受或為玻尿酸酶活性所需之彼等位置進行。舉例而言，一般修飾不在參考SEQ ID NO：7或3或其他可溶性C端截短片段中闡述之序列的胺基酸位置，對應於位置7、16、17、18、19、21、25、53、55、56、57、62、64、76、78、80、88、95、100、101、109、111、112、113、115、116、121、123、126、129、185、187、188、189、190、191、194、199、201、203、207、210、223、225、227、228、229、241、243、244、246、249、250、252、254、262、268、295、296、299、303、319、322、329、330、332、333、336、337、340、341、344、345、346、350、352、354、355、362、363、364、365、366、370、372、382、384、386、390、400、402、408、423、424、429或430的位置進行。此外，在修飾在參考SEQ ID NO：3中闡述之序列的胺基酸位置，位置2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、20、22、23、27、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、54、58、59、60、61、63、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、77、79、81、82、83、84、85、86、87、89、90、91、92、94、96、98、99、102、103、104、 105、106、107、108、110、114、117、118、119、122、124、125、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、143、144、145、149、150、152、153、154、155、156、157、158、159、161、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、186、192、193、195、197、198、200、202、204、206、208、209、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、224、226、230、231、232、233、234、235、236、238、239、240、242、245、247、248、251、253、255、256、257、258、260、261、263、264、265、266、267、269、270、271、272、273、274、275、276、278、279、280、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、297、298、300、301、302、304、305、306、307、308、310、311、312、313、314、315、316、317、318、320、321、323、324、325、326、327、331、334、335、338、339、342、343、347、348、349、351、353、356、357、358、359、360、361、367、368、369、371、373、374、375、376、377、378、379、380、381、383、385、387、388、389、391、392、393、394、395、396、397、398、399、401、403、404、405、406、410、411、412、413、414、415、416、417、419、420、422、425、426、427、428、431、432、434、437、438、439、440、441、442、443、444或447中之任一者進行的實例中，修飾不為本文表8中闡述之對應胺基酸置換，該等胺基酸置換為產生失活多肽之胺基酸置換。舉例而言，若修飾為參考SEQ ID NO：3對應於位置2之位置的修飾，則修飾不為與組胺酸(H)、離胺酸(K)、色胺酸(W)或酪胺酸(Y)之置換。
出於本文之目的，對本文中修飾位置及胺基酸(包括胺基酸置換)之 提及參考SEQ ID NO：3中闡述之PH20多肽。熟習此項技術者能夠藉由鑑別諸如SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24-27、28、29、30、31、32-66、68-72、387-392、399或400中闡述之任一者的另一PH20多肽或顯示與SEQ ID NO：6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24-27、28、29、30、31、32-66、68-72、387-392、399或400中之任一者至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性的其變異體中之對應胺基酸殘基，在另一PH20多肽中進行本文所提供之任一修飾。另一PH20多肽中之對應位置可藉由將該PH20多肽相對於SEQ ID NO：3中闡述之PH20多肽比對來鑑別。舉例而言，圖2(A-L)描繪例示性PH20多肽與SEQ ID NO：3的比對及例示性對應位置之鑑別。此外，因為SEQ ID NO：3、7、32-66、69及72均為具有不同C端胺基酸殘基之成熟人類PH20的形式，所以SEQ ID NO：7、32-66、69及72中之任一者中的胺基酸殘基編號與SEQ ID NO：3相同，因此每一者之對應殘基與SEQ ID NO：3中闡述之殘基(參見例如圖1)一致。此外，SEQ ID NO：2、6、70或71中之任一者中闡述之SEQ ID NO為差別僅僅在於信號序列之存在的其前驅形式。
出於修飾(例如胺基酸置換)目的，置換之對應胺基酸殘基可為任何胺基酸殘基，且無需與SEQ ID NO：3中闡述之殘基一致。典型地，藉由與SEQ ID NO：3中之殘基比對所鑑別的對應胺基酸殘基為與SEQ ID NO：3一致之胺基酸殘基或為與其保守或半保守之胺基酸殘基(參見例如圖2A-2L)。亦應理解，本文所提供之例示性置換可在PH20多肽中之對應殘基 進行，只要置換不同於PH20多肽之未經修飾之形式中所存在即可。基於此描述及本文中其他地方之描述，熟習此項技術者能夠產生含有任一或多個所述突變的經修飾之PH20多肽且測試每一者之如本文所述之特性或活性。
PH20多肽中之修飾亦可對亦含有其他修飾，包括一級序列之修飾及不在多肽一級序列中之修飾的PH20多肽。舉例而言，本文中所描述之修飾可在作為融合多肽或嵌合多肽之PH20多肽中。本文所提供之經修飾之PH20多肽亦包括結合於聚合物(諸如PEG試劑)之多肽。
在以下子部分中，描述本文所提供的顯示熱穩定性增加之例示性經修飾之PH20尤伯嗜熱蛋白性多肽及編碼核酸分子。
1. 例示性胺基酸置換
本文所提供之尤伯嗜熱蛋白性PH20多肽可在未經修飾之PH20多肽中含有如表3中闡述之任何胺基酸置換。舉例而言，尤伯嗜熱蛋白性PH20多肽可在未經修飾之PH20多肽中僅含有單個如表3中闡述之胺基酸置換。在其他實例中，尤伯嗜熱蛋白性PH20多肽可在未經修飾之PH20多肽中含有任兩個或兩個以上，諸如三個或三個以上，例如至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個如表3中闡述之胺基酸置換。未經修飾之PH20多肽可為SEQ ID NO：3-66、68-72、387-392、399或400中之任一者中闡述之全長PH20或其可溶性C端截短片段，或顯示與SEQ ID NO：3-66、68-72、387-392、399或400中之任一者至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的多肽。詳言之，經修飾之PH20多肽為SEQ ID NO：3或32-66中之任一者中闡述之可溶性C端截短PH20多肽或顯示與SEQ ID NO：3或 32-66中之任一者至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%。此類經修飾之PH20多肽包括與在4℃下培育10分鐘之後的玻尿酸酶活性相比，在52℃下培育10分鐘之後保留其玻尿酸酶活性之至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上的PH20多肽。
在本文中之實例中，經修飾之PH20多肽含有如下置換中一或多者的胺基酸置換：參考SEQ ID NO：3、7或32-66中之任一者中的位置，在對應於位置27之位置經H置換；在對應於位置29之位置經H置換；在對應於位置34之位置經W置換；在對應於位置37之位置經K置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置58之位置經K置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置102之位置經H置換；在對應於位置141之位置經Y置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置144之位置經G置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置155之位置經D置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置165 之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置213之位置經E置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置277之位置經A置換；在對應於位置277之位置經C置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置306之位置經D置換；在對應於位置311之位置經G置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置380之位置經L置換；或在對應於位置412之位置經S置換。
舉例而言，在本文中之實例中，本文所提供之經修飾之PH20多肽中的例示性胺基酸置換包括(但不限於)如下置換：參考SEQ ID NO：3、7或32-66中之任一者中的位置，在對應於位置11之位置經甘胺酸(G)置換；在對應於位置15之位置經A置換；在對應於位置15之位置經V置換；在對應於位置26之位置經R置換；在對應於位置26之位置經S置換；在對應於位置27之位置經E置換；在對應於位置27之位置經H置換；在對應於位置29之位置經H置換；在對應於位置29之位置經S置換；在對應於位置30之位置經A置換；在對應於位置30之位置經P置換；在對應於位置31之位置經G置換；在對應於位置31之位置經L置換；在對應於位置32之位置經Q置換；在對應於位置32之位置經W置換；在對應於位置33之位置經G置換；在對應於位置33之位置經M置換；在對應於位置33之位置經R置換；在對應於位置33之位置經W置換；在對應於位置34之位置經 E置換；在對應於位置34之位置經H置換；在對應於位置34之位置經W置換；在對應於位置37之位置經K置換；在對應於位置38之位置經Y置換；在對應於位置39之位置經Q置換；在對應於位置39之位置經R置換；在對應於位置39之位置經T置換；在對應於位置41之位置經D置換；在對應於位置41之位置經T置換；在對應於位置41之位置經W置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置50之位置經C置換；在對應於位置50之位置經D置換；在對應於位置58之位置經K置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置60之位置經K置換；在對應於位置67之位置經F置換；在對應於位置69之位置經A置換；在對應於位置69之位置經Y置換；在對應於位置83之位置經Q置換；在對應於位置84之位置經D置換；在對應於位置86之位置經D置換；在對應於位置86之位置經E置換；在對應於位置86之位置經R置換；在對應於位置87之位置經P置換；在對應於位置90之位置經W置換；在對應於位置92之位置經V置換；在對應於位置93之位置經E置換；在對應於位置93之位置經S置換；在對應於位置94之位置經N置換；在對應於位置97之位置經F置換；在對應於位置98之位置經M置換；在對應於位置99之位置經S置換；在對應於位置102之位置經H置換；在對應於位置114之位置經G置換；在對應於位置118之位置經M置換；在對應於位置120之位置經S置換；在對應於位置131之位置經C置換；在對應於位置131之位置經L置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置138之位置經W置換；在對應於位置139之位置經R置換；在對應於位置139之位置經V置換；在對應於位置141之位置經M置換；在對應於位置141之位置經Y置換； 在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置144之位置經G置換；在對應於位置146之位置經V置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置148之位置經K置換；在對應於位置150之位置經L置換；在對應於位置151之位置經Q置換；在對應於位置152之位置經I置換；在對應於位置152之位置經M置換；在對應於位置152之位置經T置換；在對應於位置154之位置經R置換；在對應於位置155之位置經A置換；在對應於位置155之位置經D置換；在對應於位置155之位置經F置換；在對應於位置155之位置經H置換；在對應於位置155之位置經L置換；在對應於位置155之位置經R置換；在對應於位置155之位置經S置換；在對應於位置158之位置經H置換；在對應於位置159之位置經A置換；在對應於位置159之位置經H置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置159之位置經Q置換；在對應於位置159之位置經S置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置161之位置經A置換；在對應於位置162之位置經L置換；在對應於位置163之位置經K置換；在對應於位置163之位置經R置換；在對應於位置163之位置經S置換；在對應於位置165之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置195之位置經H置換；在對應於位置195之位置經L置換；在對應於位置196之位置經T置換；在對應於位置197之位置經F置換；在對應於位置198之位置經L置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置205之位置經E置換；在對應於位置205之位置經K置換；在對 應於位置205之位置經L置換；在對應於位置205之位置經T置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置208之位置經Q置換；在對應於位置208之位置經R置換；在對應於位置213之位置經E置換；在對應於位置213之位置經N置換；在對應於位置215之位置經E置換；在對應於位置215之位置經H置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置222之位置經N置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置237之位置經Q置換；在對應於位置240之位置經Q置換；在對應於位置247之位置經I置換；在對應於位置251之位置經L置換；在對應於位置251之位置經M置換；在對應於位置259之位置經K置換；在對應於位置259之位置經P置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置271之位置經V置換；在對應於位置276之位置經E置換；在對應於位置277之位置經A置換；在對應於位置277之位置經C置換；在對應於位置278之位置經N置換；在對應於位置282之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置285之位置經M置換；在對應於位置292之位置經V置換；在對應於位置305之位置經N置換；在對應於位置306之位置經D置換；在對應於位置310之位置經R置換；在對應於位置311之位置經G置換；在對應於位置置315之位經T置換；在對應於位置317之位置經N置換；在對應於位置321之位置經A置換；在對應於位置321之位置經R置換；在對應於位置328之位置經L置換；在對應於位置328之位置經R置換；在對應於 位置342之位置經A置換；在對應於位置368之位置經H置換；在對應於位置368之位置經K置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置371之位置經F置換；在對應於位置373之位置經S置換；在對應於位置377之位置經T置換；在對應於位置379之位置經H置換；在對應於位置379之位置經S置換；在對應於位置379之位置經T置換；在對應於位置380之位置經I置換；在對應於位置380之位置經L置換；在對應於位置380之位置經P置換；在對應於位置380之位置經T置換；在對應於位置388之位置經H置換；在對應於位置406之位置經N置換；在對應於位置407之位置經F置換；在對應於位置407之位置經Q置換；在對應於位置410之位置經S置換；在對應於位置412之位置經G置換；在對應於位置412之位置經P置換；在對應於位置412之位置經S置換；在對應於位置413之位置經Q置換；在對應於位置421之位置經M置換；在對應於位置428之位置經P置換；在對應於位置431之位置經A置換；在對應於位置433之位置經L置換；在對應於位置433之位置經T置換；在對應於位置438之位置經A置換；在對應於位置439之位置經C置換；在對應於位置441之位置經T置換；在對應於位置443之位置經M置換；在對應於位置445之位置經Y置換；在對應於位置446之位置經C置換；在對應於位置446之位置經D置換；在對應於位置446之位置經E置換；在對應於位置446之位置經G置換；在對應於位置447之位置經E置換；及在對應於位置447之位置經G置換。
舉例而言，在本文中之實例中，經修飾之PH20多肽含有如下置換中一或多者之胺基酸置換：參考SEQ ID NO：3、7或32-66中之任一者中的位置， 在對應於位置29之位置經H置換；在對應於位置37之位置經K置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置306之位置經D置換；在對應於位置311之位置經G置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置369之位置經H置換；或在對應於位置412之位置經S置換。
本文所提供之經修飾之PH20多肽中的例示性胺基酸置換包括(但不限於)如下置換：參考SEQ ID NO：3、7或32-66中之任一者中的位置，在對應於位置15之位置經丙胺酸(A)置換；在對應於位置15之位置經V置換；在對應於位置26之位置經R置換；在對應於位置27之位置經E置換；在對應於位置29之位置經S置換；在對應於位置31之位置經G置換；在對應於位置31之位置經L置換；在對應於位置32之位置經Q置換；在對應於位置33之位置經G置換；在對應於位置33之位置經M置換；在對應於位置33之位置經R置換；在對應於位置33之位置經W置換；在對應於位置34之位置經E置換；在對應於位置34之位置經H置換；在對應於位置38之位置經Y置換；在對應於位置39之位置經R置換；在對應於位置41之位置經W置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置50之位置經C置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置69之位置經A置換；在對應於位置86之位置經D置換；在對應於位置86之位置 經E置換；在對應於位置86之位置經R置換；在對應於位置90之位置經W置換；在對應於位置93之位置經E置換；在對應於位置93之位置經S置換；在對應於位置97之位置經F置換；在對應於位置99之位置經S置換；在對應於位置120之位置經S置換；在對應於位置131之位置經L置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置138之位置經W置換；在對應於位置139之位置經R置換；在對應於位置139之位置經V置換；在對應於位置141之位置經M置換；在對應於位置141之位置經Y置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置146之位置經V置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置148之位置經K置換；在對應於位置150之位置經L置換；在對應於位置151之位置經Q置換；在對應於位置152之位置經I置換；在對應於位置152之位置經M置換；在對應於位置152之位置經T置換；在對應於位置154之位置經R置換；在對應於位置155之位置經A置換；在對應於位置155之位置經F置換；在對應於位置155之位置經L置換；在對應於位置155之位置經R置換；在對應於位置158之位置經H置換；在對應於位置159之位置經H置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置159之位置經Q置換；在對應於位置159之位置經S置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置163之位置經R置換；在對應於位置165之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置198之位置經L置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置205之位置經L置換； 在對應於位置205之位置經T置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置208之位置經Q置換；在對應於位置208之位置經R置換；在對應於位置213之位置經N置換；在對應於位置215之位置經E置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置置235之位經T置換；在對應於位置237之位置經Q置換；在對應於位置240之位置經Q置換；在對應於位置251之位置經L置換；在對應於位置259之位置經K置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置271之位置經V置換；在對應於位置276之位置經E置換；在對應於位置277之位置經A置換；在對應於位置277之位置經C置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置292之位置經V置換；在對應於位置305之位置經N置換；在對應於位置306之位置經D置換；在對應於位置310之位置經R置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置328之位置經R置換；在對應於位置342之位置經A置換；在對應於位置368之位置經K置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置373之位置經S置換；在對應於位置379之位置經H置換；在對應於位置379之位置經S置換；在對應於位置379之位置經T置換；在對應於位置380之位置經I置換；在對應於位置380之位置經L置換；在對應於位置380之位置經P置換；在對應於位置380之位置經T置換；在對應於位置388之位置經H置換；在對應於位置412之位置經G置換；在對應於位置412之位置經P置換；在對應於位置412之位置經S置換；在對應 於位置413之位置經Q置換；在對應於位置433之位置經T置換；在對應於位置438之位置經A置換；在對應於位置441之位置經T置換；在對應於位置443之位置經M置換；在對應於位置445之位置經Y置換；在對應於位置446之位置經C置換；在對應於位置447之位置經E置換；及在對應於位置447之位置經G置換。
舉例而言，在本文中之實例中，經修飾之PH20多肽含有如下置換中一或多者之胺基酸置換：參考SEQ ID NO：3、7或32-66中之任一者中的位置，在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置306之位置經D置換；在對應於位置315之位置經T置換；或在對應於位置369之位置經H置換。
在本文中之實例中，本文所提供之經修飾之PH20多肽中的例示性胺基酸置換包括(但不限於)如下置換：參考SEQ ID NO：3、7或32-66中之任一者中的位置，在對應於位置15之位置經丙胺酸(A)置換；在對應於位置15之位置經V置換；在對應於位置26之位置經R置換；在對應於位置27之位置經E置換；在對應於位置29之位置經S置換；在對應於位置31之位置經G置換；在對應於位置33之位置經G置換；在對應於位置33之位置經M置換；在對應於位置33之位置經R置換；在對應於位置33之位置經W置換；在對應於位置34之位置經E置換；在對應於位置34之位置經H置換；在對應於位置38之位置經Y置換；在對應於位置39之位置經R置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置86之位置經R 置換；在對應於位置90之位置經W置換；在對應於位置93之位置經E置換；在對應於位置93之位置經S置換；在對應於位置97之位置經F置換；在對應於位置120之位置經S置換；在對應於位置131之位置經L置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置139之位置經R置換；在對應於位置141之位置經M置換；在對應於位置141之位置經Y置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置148之位置經K置換；在對應於位置152之位置經M置換；在對應於位置152之位置經T置換；在對應於位置154之位置經R置換；在對應於位置155之位置經A置換；在對應於位置155之位置經F置換；在對應於位置155之位置經L置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置159之位置經S置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置163之位置經R置換；在對應於位置165之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置198之位置經L置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置205之位置經L置換；在對應於位置205之位置經T置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置208之位置經R置換；在對應於位置213之位置經N置換；在對應於位置215之位置經E置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置240之位置經Q置換；在對應於位置251之位置經L置換；在對應於位置259之位置經K置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對 應於位置263之位置經T置換；在對應於位置271之位置經V置換；在對應於位置277之位置經A置換；在對應於位置277之位置經C置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置292之位置經V置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置342之位置經A置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置379之位置經H置換；在對應於位置379之位置經S置換；在對應於位置379之位置經T置換；在對應於位置380之位置經L置換；在對應於位置380之位置經P置換；在對應於位置380之位置經T置換；在對應於位置388之位置經H置換；在對應於位置412之位置經G置換；在對應於位置412之位置經P置換；在對應於位置412之位置經S置換；在對應於位置433之位置經T置換；在對應於位置438之位置經A置換；在對應於位置441之位置經T置換；在對應於位置443之位置經M置換；在對應於位置445之位置經Y置換；在對應於位置446之位置經C置換；在對應於位置447之位置經E置換；及在對應於位置447之位置經G置換。
在本文中之實例中，本文所提供之經修飾之PH20多肽中的例示性胺基酸置換包括(但不限於)如下置換：參考SEQ ID NO：3、7或32-66中之任一者中的位置，在對應於位置27之位置經麩胺酸(E)置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位 置206之位置經I置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置315之位置經T置換；及在對應於位置379之位置經S置換。
在本文中之實例中，經修飾之PH20多肽含有如下置換中一或多者的胺基酸置換：參考SEQ ID NQ：3、7或32-66中之任一者中的位置，在對應於位置30之位置經P置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置60之位置經K置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置311之位置經G置換；在對應於位置315之位置經T置換；及在對應於位置369之位置經H置換。
詳言之，在本文中之實例中，經修飾之PH20多肽含有如下置換中一或多者之胺基酸置換：參考SEQ ID NO：3、7或32-66中之任一者中的位置，在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置284之位置經A置換；或在對應於位置315之位置經T置換。
本文提供SEQ ID NO：73-386中之任一者中闡述的經修飾之PH20多肽，或顯示與SEQ ID NO：73-386中之任一者至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性的多肽。
2. 核酸分子
本文亦提供編碼本文所提供之任何經修飾之PH20多肽的核酸分子。舉例而言，本文提供編碼SEQ ID NO：73-386中之任一者中闡述的任何經修飾之PH20多肽或編碼顯示與SEQ ID NO：73-386中之任一者至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性之多肽的核酸分子。
在特定實例中，核酸序列可經密碼子最佳化，例如以增加編碼序列之表現量。特定密碼子使用視表現經修飾之多肽的宿主生物體而定。熟習此項技術者熟悉用於哺乳動物或人類細胞、細菌或酵母(包括例如大腸桿菌(E.coli)或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中表現的最佳密碼子。舉例而言，密碼子使用資訊可自在kazusa.or.jp.codon可得之密碼子使用數據庫獲得(關於數據庫之描述參見Richmond(2000)Genome Biology,1：reports241)。亦參見Eorsburg(1994)Yeast,10：1045-1047；Brown等人(1991)Nucleic Acids Research,19：4298；Sharp等人(1988)Nucleic Acids Res.,12：8207-8211；Sharp等人(1991)Yeast,657-78。在一些實例中，編碼核酸分子亦可經修飾以含有異源信號序列，從而改變(例如增加)多肽之表現及分泌。例示性異源信號序列為編碼IgG κ信號序列(SEQ ID NO：398中闡述)之核酸。
本文所提供之經修飾之多肽及編碼核酸分子可藉由熟習此項技術者已知之標準重組DNA技術產生。可採用此項技術中已知實現標靶蛋白中任一或多種胺基酸之突變的任何方法。方法包括編碼核酸分子之標準定點或隨機突變誘發或固相多肽合成方法。舉例而言，編碼PH20多肽之核酸分子可進行突變誘發，諸如編碼核酸之隨機突變誘發、易錯PCR、定點突變誘發、 重疊PCR、基因改組或其他重組方法。編碼多肽之核酸可接著引入宿主細胞中以待異源表現。因此，本文亦提供編碼本文所提供之任何經修飾之多肽的核酸分子。在一些實例中，經修飾之PH20多肽以合成方式，諸如使用固相或溶液相肽合成來產生。
3. 其他修飾及結合物
經修飾之PH20多肽包括含有化學或轉譯後修飾的PH20多肽。在一些實例中，本文所提供之經修飾之PH20多肽不含化學或轉譯後修飾。化學及轉譯後修飾包括(但不限於)聚乙二醇化、唾液酸化、白蛋白化、糖基化、法尼基化、羧化、羥基化、磷酸化及此項技術中已知之其他多肽修飾。
此外，除本文所提供之諸如胺基酸置換的任一或多種胺基酸修飾之外，本文所提供之經修飾之PH20多肽可使用此項技術中已知之任何方法，包括化學及重組方法，與任何部分結合或融合，只要所得多肽保留玻尿酸酶活性即可。舉例而言，除本文所提供之諸如胺基酸置換的任一或多種胺基酸修飾之外，本文所提供之經修飾之PH20多肽亦可含有在或不在多肽之一級序列中的其他修飾，包括(但不限於)經碳水化合物部分、聚乙二醇(PEG)部分、唾液酸部分、來自免疫球蛋白G之Fc結構域或任何其他結構域或部分修飾。舉例而言，可進行此類其他修飾以增加蛋白質之穩定性或血清半衰期。
在一些情況下，結構域或其他部分為靶向劑，包括藉由選擇性地結合於細胞表面受體或其他細胞表面部分而將結合物靶向一或多種細胞類型的任何試劑。舉例而言，結構域或其他部分為將結合物靶向腫瘤細胞之靶向劑。在此等實例中，經修飾之PH20多肽(諸如本文所提供之任一者)直接 或間接連接於靶向劑。此類靶向劑包括(但不限於)生長因子、細胞介素、趨化因子、抗體及激素或對偶基因變異體、突變蛋白質或其片段，只要該靶向劑由細胞表面受體內化即可。下文描述例示性的非限制性其他修飾。
a. 降低之免疫原性
可製成本文所提供之經修飾之PH20多肽以降低免疫原性。降低之免疫原性可藉由自多肽消除抗原性抗原決定基的序列變化或藉由改變轉譯後修飾來實現。熟習此項技術者熟悉鑑別多肽中抗原性抗原決定基之方法(參見例如Liang等人(2009)BMC Bioinformatics,10：302；Yang等人(2009)Rev.Med.Virol.,19：77-96)。在一些實例中，一或多種胺基酸可經修飾以移除或改變抗原性抗原決定基。
在另一實例中，改變蛋白質之糖基化亦可實現免疫原性。舉例而言，涵蓋改變肽之糖基化，只要多肽在對應於闡述為SEQ ID NO：3或7之N200、N333及N358之胺基酸殘基的胺基酸殘基最低限度地含有至少N-乙醯葡萄糖胺。
舉例而言，PH20多肽可經修飾，以使得其缺乏海藻糖、尤其雙海藻糖基化。詳言之，本文所提供之PH20多肽不經雙海藻糖基化。此可藉由在不實現雙海藻糖基化之宿主細胞中表現及產生PH20多肽來實現。海藻糖為存在於各種生物體，包括哺乳動物、昆蟲及植物中之去氧已醣。海藻糖基化聚糖藉由海藻糖基轉移酶合成；參見例如Ma等人，Glycobiology,16(12)：158R-184R,(2006)；Nakayama等人，J.Biol.Chem.,276：16100-16106(2001)；及Sturla等人，Glycobiology,15(10)：924-935(2005)。在人類中，海藻糖常作為聚糖結構之末端修飾存在，且α 1,6-連接於N-乙醯葡萄糖胺的海 藻糖之存在已展示在醣蛋白加工及識別中至關重要。在昆蟲中，N-聚糖核心結構顯示具有α 1,6-及α 1,3-鍵之雙海藻糖基化。具有α 1,3-鍵之昆蟲細胞核心海藻糖基化產生在人類中具有免疫原性之碳水化合物抗原決定基(參見例如美國公開案第20070067855號)。舉例而言，本文所提供之PH20多肽可在不能將多肽雙海藻糖基化之宿主細胞中產生。因而，雖然雙海藻糖基化之昆蟲細胞或其他細胞可用於表現多肽，但典型地使用哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。
在一些實例中，去海藻糖基化或海藻糖缺乏之PH20多肽可在具有經修飾之糖基化路徑的昆蟲細胞中，經由使用含有真核寡醣加工基因之桿狀病毒表現載體產生，由此產生「哺乳動物化」昆蟲細胞表現系統(參見例如美國專利第6,461,863號)。或者，抗原性可藉由在缺乏α 1,3-海藻糖基轉移酶(FT3)之昆蟲細胞中表現PH20多肽來消除(參見例如美國公開案第20070067855號)。在其他實例中，去海藻糖基化或海藻糖缺乏之PH20多肽可例如以下細胞系中產生：產生去海藻糖基化蛋白質之細胞系，包括缺乏蛋白質海藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利公開案第2003/0157108號；以及WO 2004/056312)，及基因剔除細胞系，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004))。
b. 與聚合物結合
在一些實例中，本文所提供之經修飾之PH20多肽與聚合物結合。可與PH20多肽結合之例示性聚合物包括天然及合成均聚物，諸如多元醇(亦即多-OH)、多元胺(亦即多-NH2)及聚羧酸(亦即多-COOH)，及其他雜聚物， 亦即含有一或多種不同偶合基團、例如羥基及胺基之聚合物。適合聚合物分子之實例包括選自以下之聚合物分子：聚氧化烯(PAO)，諸如聚伸烷二醇(PAG)，包括聚乙二醇(PEG)、甲氧基聚乙二醇(mPEG)及聚丙二醇、PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧基羰基咪唑(CDI-PEG)、分支鏈聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)；聚羧酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚-D,L-胺基酸、聚乙烯-共-順丁烯二酸酐、聚苯乙烯-共-順丁烯二酸酐；聚葡萄糖，包括羧甲基-聚葡萄糖；肝素；同源白蛋白；纖維素，包括甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、羧乙基纖維素及羥基丙基纖維素；聚葡萄胺糖之水解產物；澱粉，諸如羥乙基-澱粉及羥丙基-澱粉；肝糖；瓊脂糖及其衍生物；瓜爾膠(guar gum)；普魯蘭(pullulan)；菊塘；三仙膠；角叉菜膠；果膠；褐藻酸水解產物及生物聚合物。
典型地，聚合物為聚氧化烯(PAO)，諸如聚氧化乙烯，諸如PEG，典型地為mPEG，且具有很少的能夠交聯之反應基。典型地，聚合物為無毒聚合物分子，諸如(甲氧基)聚乙二醇(mPEG)，其可使用相對簡單化學方法與PH20多肽共價結合(例如與蛋白質表面上之附接基團)。
適用於與PH20多肽附接之聚合物分子包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)及PEG衍生物，諸如甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PEG-縮水甘油醚(Epox-PEG)、PEG-氧基羰基咪唑(CDI-PEG)、分支鏈PEG及聚氧化乙烯(PEO)(參見例如Roberts等人，Advanced Drug Delivery Review 2002,54：459-476；Harris及Zalipsky(編輯)「Poly(ethylene glycol),Chemistry and Biological Applications」ACS Symposium Series 680,1997；Mehvar等人，J.Pharm.Pharmaceut.Sci.,3(1)：125-136,2000；Harris及Chess(2003)Nat Rev Drug Discov.2(3)：214-21；及Tsubery,J Biol.Chem 279(37)：38118-24,2004)。聚合物分子可具有典型地在約3kDa至約60kDa範圍內之分子量。在一些實施例中，與本文所提供之PH20多肽結合的聚合物分子具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60或超過60kDa之分子量。
藉由共價附接(結合)PEG或PEG衍生物(亦即「聚乙二醇化」)來修飾多肽之各種方法為此項技術中已知(參見例如U.S.2006/0104968；U.S.5,672,662；U.S.6,737,505；及U.S.2004/0235734)。用於聚乙二醇化之技術包括(但不限於)專門連接子及偶合化學反應(參見例如Roberts,Adv.Drrug Deliv.Rev.54：459-476,2002)、多個PEG部分附接於單個結合位點(諸如經由使用分支鏈PEG；參見例如Guiotto等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.12：177-180,2002)、位點特異性聚乙二醇化及/或單聚乙二醇化(參見例如Chapman等人，Nature Biotech.17：780-783,1999)及定點酶聚乙二醇化(參見例如Sato,Adv.Drug Deliv.Rev.,54：487-504,2002)(亦參見例如Lu及Felix(1994)Int.J.Peptide Protein Res.43：127-138；Lu及Felix(1993)Peptide Res.6：140-6,1993；Felix等人(1995)Int.J.Peptide Res.46：253-64；Benhar等人(1994)J.Biol.Chem.269：13398-404；Brumeanu等人(1995)J Immunol.154：3088-95；亦參見Caliceti等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10)：1261-77及Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8 Pt 2)：3S-8S)。此項技術中描述之方法及技術可產生具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個以上附接於單個蛋白質分子之PEG或PEG衍生物的蛋白質(參見例如美國2006/0104968)。
此項技術中已描述用於聚乙二醇化之多種試劑。此類試劑包括(但不限於)N-羥基丁二醯亞胺基(NHS)活化之PEG、丁二醯亞胺基mPEG、 mPEG2-N-羥基丁二醯亞胺、mPEG α-甲基丁酸丁二醯亞胺基酯、mPEG丙酸丁二醯亞胺基酯、mPEG丁酸丁二醯亞胺基酯、mPEG羧甲基3-羥基丁酸丁二醯亞胺基酯、同源雙官能PEG-丙酸丁二醯亞胺基酯、同源雙官能PEG丙醛、同源雙官能PEG丁醛、PEG順丁烯二醯亞胺、PEG醯肼、對硝基苯基-碳酸酯PEG、mPEG-苯并三唑碳酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、分支鏈mPEG2丁醛、mPEG乙醯基、mPEG哌啶酮、mPEG甲基酮、mPEG「無連接子」順丁烯二醯亞胺、mPEG乙烯基碸、mPEG硫醇、mPEG鄰吡啶基硫酯、mPEG鄰吡啶基二硫化物、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯基碸PEG-NHS、丙烯酸酯PEG-NHS、螢光素PEG-NHS及生物素PEG-NHS(參見例如Monfardini等人，Bioconjugate Chem.6：62-69,1995；Veronese等人，J.Bioactive Compatible Polymers 12：197-207,1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,324,844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795,569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461；U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990,237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；U.S.2004/0235734；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP 1064951；EP 0822199；WO 01076640；WO 0002017；WO 0249673；WO 9428024；WO 0187925；及WO 2005000360)。
D. 用於鑑別熱穩定降解玻尿酸之酶的方法
本文提供用於鑑別經修飾或變異降解玻尿酸之酶的方法，該酶諸如為經修飾之玻尿酸酶或經修飾之PH20多肽，其與未經修飾之降解玻尿酸之酶相比，顯示耐熱性，且為熱穩定的。在該方法中，對經修飾之降解玻尿酸之酶在熱應力條件(已知將使參考或未經修飾之降解玻尿酸之酶不穩定)下測試或篩檢玻尿酸酶活性，且在熱中性條件(已知為參考或未經修飾之降解玻尿酸之酶耐受)下測試或篩檢活性。
在該方法中，提供一或多種經修飾之降解玻尿酸之酶。在一些實例中，製備經修飾之分子的文庫。變異分子之文庫或群之突變誘發及產生方法在本文中描述且為熟習此項技術者已知，使用標準重組DNA技術。在一個實例中，所測試之酶可彙集及篩檢，從而該方法允許僅選擇顯示耐熱性之彼等酶。在另一實例中，所測試之酶可實體分隔且個別篩檢，諸如藉由以諸如可定址陣列之陣列格式化。
鑑別出與在熱中性條件下相比，在熱應力條件下培育之後保留或顯示活性之至少50%，諸如一般活性之至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上的經修飾之降解玻尿酸之酶。
該方法可重複複數次。舉例而言，方法步驟可重複1、2、3、4或5次。該方法亦可迭代進行，其中鑑別出的經修飾之多肽用作參考多肽來產生用於篩檢之新的經修飾之酶群。在一個實例中，在進行該方法之後，任何鑑別出的經修飾之降解玻尿酸之酶可經修飾或進一步修飾以增加或最佳化活性。藉由實施該方法，鑑別出熱穩定降解玻尿酸之酶。
在隨後子部分中提供該方法之步驟及該方法之組分的描述。
1. 降解玻尿酸之酶及經修飾之降解玻尿酸之酶的文庫
在該等方法中，測試或篩檢一或多種經修飾之降解玻尿酸之酶，諸如玻尿酸酶或PH20多肽。經修飾之降解玻尿酸之酶與未經修飾之降解玻尿酸之酶，諸如此項技術中已知之任何降解玻尿酸之酶相比，可經修飾。降解玻尿酸之酶為降解透明質酸之酶家族，玻尿酸為細胞外基質之基本組分及間質障壁之主要成分。降解玻尿酸之酶藉由使玻尿酸聚合物裂解來用以降解玻尿酸，玻尿酸聚合物由重複雙醣單元D-葡糖醛酸(GlcA)及N-乙醯基-D-葡糖胺(GlcNAc)構成，雙醣單元經由交替β-1→4及β-1→3糖苷鍵連接在一起。藉由催化透明質酸(間質障壁之主要成分)之水解，降解玻尿酸之酶降低透明質酸之黏度，由此增加組織滲透性。因此，在本文所提供之方法中用於修飾的降解玻尿酸之酶包括能夠催化玻尿酸雙醣鏈或聚合物裂解之任何酶。在一些實例中，降解玻尿酸之酶使玻尿酸鏈或聚合物中之β-1→4糖苷鍵裂解。在其他實例中，降解玻尿酸之酶催化玻尿酸鏈或聚合物中β-1→3糖苷鍵之裂解。
降解玻尿酸之酶包括膜結合或呈自細胞分泌之可溶性形式的酶。因而，在降解玻尿酸之酶包括糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨信號序列及/或以其他方式經膜錨定或不溶的情況下，此類降解玻尿酸之酶可藉由C端截短或使所有或一部分GPI錨信號序列缺失以使酶分泌及可溶來呈可溶性形式提供。因而，降解玻尿酸之酶包括C端截短變異體，例如經截短以移除所有或一部分GPI錨信號序列。此類可溶性玻尿酸酶之實例為可溶性PH20玻尿酸酶，諸如美國專利第7,767,429號、美國公開案第US 2004/0268425號及US 2010/0143457中闡述之任一者。
例示性降解玻尿酸之酶為非人類動物或人類玻尿酸酶、細菌玻尿酸酶、來自水蛭之玻尿酸酶或顯示降解玻尿酸活性之軟骨素酶，包括其具有活性的可溶性或截短形式。例示性非人類動物玻尿酸酶為SEQ ID NO：8-31、387-392、399、400、401-416中之任一者中闡述的任一者，或可溶及活性的成熟C端截短變異體，或其活性形式。例示性人類玻尿酸酶為SEQ ID NO：2、3、6、7、32-66、68-72或417-420中之任一者中闡述的任一者，或可溶及活性的成熟C端截短變異體，或其活性形式，及尤其SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者。例示性細菌玻尿酸酶為SEQ ID NO：421-451中之任一者中闡述的任一者，或可溶及活性的成熟C端截短變異體，或其活性形式。具有降解玻尿酸之酶活性的例示性軟骨素酶闡述於SEQ ID NO：452-454，或可溶及活性的成熟C端截短變異體，或其活性形式。
任何此類降解玻尿酸之酶可經修飾且在本文中之方法中篩檢以鑑別在熱應力條件下顯示穩定性的經修飾之降解玻尿酸之酶。舉例而言，經修飾之PH20多肽與未經修飾之PH20多肽，諸如任何已知之PH20多肽天然、野生型或參考多肽相比，可經修飾。舉例而言，經修飾之PH20多肽與PH20多肽之全長、可溶或活性形式，諸如SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者中闡述的任一者，或顯示與SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者至少85%，諸如至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性的多肽相比經修飾。在本文中之方法的特定實例中，起始或未經修飾之PH20多肽具有SEQ ID NO：3中闡述之胺基酸序列。
可篩檢經修飾之降解玻尿酸之酶的文庫或群。降解玻尿酸之酶可藉由 熟習此項技術者已知可改變蛋白質結構之任何方法來修飾。修飾之實例包括蛋白質之一或多個胺基酸的置換、添加及缺失以形成經修飾之降解玻尿酸之酶的文庫或群。熟習此項技術者能夠產生用於本文中之方法中的經修飾或變異蛋白質。突變誘發方法為此項技術中所熟知且包括例如定點突變誘發，諸如QuikChange(Stratagene)，或飽和突變誘發。突變誘發方法包括(但不限於)位點介導之突變誘發、PCR突變誘發、卡匣突變誘發、定點突變誘發、隨機點突變誘發、使用含有尿嘧啶之模板的突變誘發、寡核苷酸定向之突變誘發、經硫代磷酸酯修飾之DNA突變誘發、使用間隙雙螺旋DNA之突變誘發、點錯配修復、使用缺乏修復之宿主菌株的突變誘發、限制選擇及限制純化、缺失突變誘發、藉由總體基因合成之突變誘發、雙股斷裂修復及熟習此項技術者已知之多種其他突變誘發方法。在本文中之方法中，突變誘發可在全長蛋白質上或蛋白質一個區域內實現。突變可合理或隨機進行。
在一些實例中，本文所提供之方法經進行，使得每一突變蛋白質之一致性在測試該蛋白質之前即經推理而知。舉例而言，本文所提供之方法可有助於可定址之突變誘發及篩檢或測試方法。此可允許在所測試蛋白質之活性之間容易比較，無需對所鑑別之蛋白質進行定序。舉例而言，定點突變誘發方法可用於個別地產生突變蛋白質。突變誘發可藉由在特定標靶位置逐一置換單個胺基酸殘基來進行，使得所產生之每一個別突變體為每一單個突變誘發反應之單一產物。突變DNA分子可經設計，藉由突變誘發產生且個別選殖，諸如在可定址陣列中，使得其彼此實體分隔且每一者為獨立突變誘發反應之單一產物。選擇用來置換經最佳化之特定蛋白質上之標 靶位置的胺基酸可為剩餘19種胺基酸中之所有，或僅僅含有所選胺基酸之較受限之群組。在本文所提供之一些方法中，置換之每一胺基酸獨立地經剩餘胺基酸中之19種或經剩餘胺基酸中之少於19種，諸如剩餘胺基酸中之10、11、12、13、14、15、16、17或18種置換。
2. 在熱應力條件下篩檢或測試活性
在該方法中，在熱應力條件下對經修飾之降解玻尿酸之酶測試或篩檢玻尿酸酶活性。熱應力條件無需為對酶而言完全致命的條件或試劑，但一般為使酶活性隨時間不穩定的熱條件。熱應力條件為因實現不含修飾的未經修飾之降解玻尿酸之酶的不穩定性或變性而選擇之條件。舉例而言，熱應力條件為使起始或參考降解玻尿酸之酶(亦即未經修飾之降解玻尿酸之酶)喪失其活性50%或50%以上、其可溶性50%或50%以上或其二級或三級結構50%或50%以上，諸如活性或特性之60%、70%、80%、90%或90%以上的溫度及培育時間。此類條件可藉由熟習此項技術者，針對任何起始或參考降解玻尿酸之酶(亦即未經修飾之降解玻尿酸之酶)，例如基於如熱攻擊分析中測定之T50或基於酶之熔融溫度(Tm)，憑經驗確定。舉例而言，熱應力條件為使起始或參考降解玻尿酸之酶(亦即未經修飾之降解玻尿酸之酶)喪失其活性、可溶性或二級或三級結構超過60%、70%、80%、90%或90%以上的溫度及培育時間。
舉例而言，熱攻擊分析可用於在一定溫度範圍內在所界定之時段內分析降解玻尿酸之酶(亦即未經修飾之降解玻尿酸之酶)的活性以確定熱應力條件。應瞭解，熱應力條件為時間之函數，且引起熱應力之溫度與時間成反比。舉例而言，溫度愈高，實現熱不穩定性之時間量愈短，且溫度愈 低，實現熱不穩定性之時間量愈長。所選時段可由使用者選擇。保留50%玻尿酸酶活性之溫度可經測定且為針對該時段之T50或Tc值，其為在該溫度下培育該時段時特定蛋白質之穩定性的指示物。為鑑別出具有增加之熱穩定性或耐熱性的變異多肽，未經修飾之降解玻尿酸之酶的T50值可用作熱穩定性之參考點，從而在等於或超過針對該時間之T50值的溫度下培育經修飾之降解玻尿酸之酶，歷時該時段。
在另一實例中，熱應力條件可基於參考降解玻尿酸之酶(亦即未經修飾之降解玻尿酸之酶)的熔融溫度(Tm)，使用可推斷或分析分子摺疊狀態之任何方法。舉例而言，可使用分析光譜學技術，諸如動態光散射方法。可測定使50%分子處於摺疊狀態之溫度且為特定酶之Tm，其為特定蛋白質穩定性之指示物。為鑑別出具有增加之熱穩定性或耐熱性的變異多肽，未經修飾之降解玻尿酸之酶的Tm值可用作熱穩定性之參考點，從而在等於或超過針對該時間之Tm值的溫度下培育經修飾之降解玻尿酸之酶預定時間。
因而，在本文中之方法之態樣中，在熱應力條件下，藉由在等於或超過對應參考降解玻尿酸之酶(亦即未經修飾之降解玻尿酸之酶)之T50或Tm的溫度下培育預定時間，對經修飾之降解玻尿酸之酶測試或篩檢玻尿酸酶活性。舉例而言，在熱應力條件下，亦即比對應參考降解玻尿酸之酶(亦即未經修飾之降解玻尿酸之酶)之T50或Tm大1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、20℃、21℃、22℃、24℃、25℃或更多的溫度，歷時預定時間，對經修飾之降解玻尿酸之酶測試或篩檢玻尿酸酶活性。預定時間可為如藉由如下文所述之方法的最終使用者選擇的任何時間。舉例而言，如本文中之實施例中所示，對於稱為rHuPH20(其為人類PH20之可 溶性C端截短片段)之例示性PH20玻尿酸酶，Tm為約44℃。歷時10分鐘之T50為約或低於49℃至52℃。
舉例而言，在實施本文中之方法時，熱應力條件可為經修飾之降解玻尿酸之酶在超過45℃且一般超過50℃，諸如超過51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃或更高的溫度下培育的條件。
培育預定時間可由使用者選擇。培育或暴露可歷時任何所希望的時間長度，且可藉由熟習此項技術者憑經驗確定。作為一實例，在基於參考或經修飾之降解玻尿酸之酶的熱攻擊分析之T50值用作熱穩定性之基線來提高熱穩定性的情況下，使用與T50值相關之時段(亦即熱攻擊進行之時段)。舉例而言，經修飾之降解玻尿酸之酶可在所希望的溫度下培育1分鐘至1個月或約1分鐘至1個月，諸如1分鐘至3週、1分鐘至2週、1分鐘至1週、1分鐘至24小時、1分鐘至12小時，諸如5分鐘至30分鐘、5分鐘至15分鐘、30分鐘至6小時或1小時至4小時，且一般為至少或約至少30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、7小時、8小時、9小時、10小時、11小時或12小時。出於進行高通過量分析或以其他方式快速篩檢候選酶之目的，預定時間經選擇，低於2小時且一般少於1小時、30分鐘、20分鐘、10分鐘或更少。舉例而言，篩檢在該溫度下培育10分鐘之後進行。在培育預定時間之後，樣品返回至熱中性條件以自進一步去穩定化條件移除多肽。
在該等方法中，亦在起始或參考降解玻尿酸之酶(亦即未經修飾之降解玻尿酸之酶)保留或維持活性的熱中性條件下對經修飾之降解玻尿酸之 酶測試或篩檢玻尿酸酶活性。舉例而言，經修飾之降解玻尿酸之酶在2℃至8℃，諸如4℃之溫度下培育預定時間，接著測定玻尿酸酶活性。為進行比較，預定時間與在熱應力條件下測試相同。
因此，經修飾之降解玻尿酸之酶的文庫或群之每一成員在諸如上述任一者之熱應力條件下或暴露於其來培育。相同經修飾之酶亦在諸如上述任一者之熱中性條件下或暴露於其來培育。培育或暴露可在活體內或試管內進行。典型地，分析在試管內進行。比較在兩種條件下的活性以鑑別在暴露於熱應力條件時顯示穩定性的經修飾之降解玻尿酸之酶。此外，在篩檢或鑑別在兩組不同條件下酶之活性時，在分析中變化之唯一條件一般與溫度相關。對於兩組條件，包括(但不限於)時間及/或其他培育條件的分析其他條件可相同。在評估經修飾之降解玻尿酸之酶的任何實例中，應瞭解，不含修飾的未經修飾之降解玻尿酸之酶亦可在類似分析條件下評估以進行比較。
舉例而言，在本文中之方法之態樣中，對經修飾之降解玻尿酸之酶，在52℃下培育10分鐘之後測試或篩檢玻尿酸酶活性，且亦在4℃下培育10分鐘之後測試或篩檢玻尿酸酶活性。每一降解玻尿酸之酶可為一群經修飾之降解玻尿酸之酶之成員。每一降解玻尿酸之酶可在每一條件下與該群中之其他降解玻尿酸之酶(例如經修飾之降解玻尿酸之酶，諸如經修飾之PH20多肽)分開測試。
在培育或暴露時間之後，對含有經修飾之降解玻尿酸之酶(或對照未經修飾之酶)的樣品或組成物評估玻尿酸酶分析。評估玻尿酸酶活性之分析為此項技術中所熟知。此類分析之實例在部分G中描述。在一個實例中， 玻尿酸酶活性可在微濁度分析中評估，其中未降解之HA的量藉由在使酶與HA反應之後添加使HA沈澱之試劑(例如氯化十六烷基吡錠(CPC)或酸化血清)來量測。在另一實例中，玻尿酸酶活性可使用微量滴定分析評估，其中殘餘生物素標記之透明質酸在與玻尿酸酶一起培育之後量測(參見例如Frost及Stern(1997)Anal.Biochem.251：263-269，美國專利公開案第20050260186號)。測定及比較在每一測試條件下的所得活性。
3. 選擇或鑑別
在測試之後，評估玻尿酸酶活性以鑑別在熱應力條件下培育(例如在52℃下培育10分鐘)之後，顯示在熱中性條件下培育(例如在4℃下培育10分鐘)之後所實現活性的超過或至少50%的經修飾之降解玻尿酸之酶。選擇作為方法之截止的所希望之活性水準或量可藉由使用者憑經驗確定，且視諸如特定降解玻尿酸之酶、降解玻尿酸之酶所希望之應用或用途、特定溫度條件及其他類似因素之因素而定。典型地，鑑別出與在熱中性條件下培育之後相比，在熱應力條件下培育之後顯示活性之至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上的經修飾之降解玻尿酸之酶。
或者或另外，暴露於熱應力條件的經修飾之降解玻尿酸之酶的活性與暴露於相同熱應力條件的對應未經修飾之降解玻尿酸之酶的活性相比。在此等實例中，應瞭解經修飾及未經修飾之酶的活性在相同條件(例如時間、溫度、組成)下測試，不同之處在於所測試之特定酶的差異(未經修飾與經修飾)。鑑別出顯示更大活性，諸如未經修飾之降解玻尿酸之酶活性的至少110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、 250%、300%、400%、500%或500%以上的經修飾之降解玻尿酸之酶。
4. 迭代方法
本文所提供之方法亦為迭代的。在一個實例中，在進行該方法之後，任何鑑別為顯示熱穩定性(諸如耐熱性增加)的經修飾之降解玻尿酸之酶經修飾或進一步修飾以增加或最佳化穩定性。第二文庫可藉由在第一鑑別出的經修飾之降解玻尿酸之酶中引入其他修飾來建立。舉例而言，鑑別為賦予穩定性(諸如增加穩定性)之修飾可組合以產生組合文庫。第二文庫可使用本文中所描述之分析及方法測試。
在該方法之迭代態樣的另一實例中，鑑別為不顯示穩定性(諸如增加穩定性)(例如使得其無活性或在熱應力條件下不具有增加活性)的經修飾之降解玻尿酸之酶可進一步經修飾且重新測試在熱應力條件下的穩定性。進一步修飾可靶向與分子之活性及/或穩定性相關的特定區域(例如特定胺基酸殘基)附近。舉例而言，與分子活性及/或穩定性相關之殘基一般為與結構摺疊或分子其他活性相關的關鍵殘基。因此，此類殘基為一般在任何條件下的活性所需。可鑑別關鍵殘基，因為當其突變時蛋白質之正常活性消除或降低。舉例而言，可鑑別當在降解玻尿酸之酶中突變時顯示在正常或對照分析條件下玻尿酸酶活性降低或消除的關鍵殘基。經修飾之蛋白質之另一文庫可用靶向所鑑別之關鍵胺基酸殘基或其附近的胺基酸突變(諸如靠近所鑑別之關鍵胺基酸殘基)產生。在一些實例中，突變可為多達19種其他胺基酸殘基之任何其他胺基酸的胺基酸置換。第二文庫可使用本文中所描述之分析及方法測試。
E. 經修飾之PH20多肽及編碼核酸分子之產生
本文中闡述之經修飾之PH20多肽的多肽可藉由此項技術中熟知用於蛋白質純化及重組蛋白質表現之方法獲得。多肽亦可以化學方式合成。經修飾或變異(包括截短)形式可使用標準重組DNA方法自野生型多肽進行工程改造。舉例而言，經修飾之PH20多肽可諸如藉由定點突變誘發，自野生型多肽進行工程改造。
1. 編碼PH20多肽之核酸的分離或製備
多肽可使用此項技術中已知可用於選殖及分離核酸分子之任何方法選殖或分離。此類方法包括核酸之PCR擴增及文庫篩檢，包括核酸雜交篩檢、基於抗體之篩檢及基於活性之篩檢。
舉例而言，當藉由重組方式產生多肽時，可使用熟習此項技術者已知用於鑑別編碼所希望基因之核酸的任何方法。此項技術中可用之任何方法可用於諸如自細胞或組織來源獲得編碼PH20之全長或部分(亦即涵蓋整個編碼區)cDNA或基因組DNA純系。
用於核酸擴增之方法可用於分離編碼所希望多肽之核酸分子，包括例如聚合酶鏈反應(PCR)方法。此類方法之實例包括使用Perkin-Elmer Cetus熱循環儀及Taq聚合酶(Gene Amp)。含有核酸之物質可用作可分離出編碼所希望多肽之核酸分子的起始物質。舉例而言，DNA及mRNA製劑、細胞提取物、組織提取物、流體樣品(例如血液、血清、唾液)、來自健康及/或患病個體之樣品可用於擴增方法中。來源可來自任何真核物種，包括(但不限於)脊椎動物、哺乳動物、人類、豬類、牛類、貓類、禽類、馬類、犬類及其他靈長類動物來源。核酸文庫亦可用作起始物質來源。引子可經設計以擴增所希望多肽。舉例而言，引子可基於產生所希望多肽之表現序 列設計。引子可基於多肽胺基酸序列之反轉譯設計。必要時，簡併引子可用於擴增。在所希望序列之3'及5'端與序列雜交的寡核苷酸引子可用作引子以藉由PCR序列自核酸樣品擴增。引子可用於擴增整個全長PH20或其截短序列，諸如編碼任何本文所提供之可溶性PH20多肽的核酸。由擴增產生之核酸分子可經定序且證實編碼所希望之多肽。
其他核苷酸序列可接合於編碼多肽之核酸分子，包括含有限制核酸內切酶位點的連接子序列以將合成基因選殖至載體中，例如蛋白質表現載體或經設計用於擴增編碼核心蛋白之DNA序列的載體。此外，指定功能性DNA元件的其他核苷酸序列可操作地連接於編碼多肽之核酸分子。此類序列之實例包括(但不限於)經設計以促進細胞內蛋白質表現之啟動子序列及經設計以促進蛋白質分泌之分泌序列(例如異源信號序列)。此類序列為熟習此項技術者所知。舉例而言，例示性異源信號序列包括(但不限於)SEQ ID NO：398中闡述之人類及小鼠κ IgG異源信號序列。諸如指定蛋白質結合區之鹼基序列的其他核苷酸殘基序列亦可連接於編碼酶之核酸分子。此類區域包括(但不限於)促進或編碼有助於酶吸收至特定標靶細胞中之蛋白質或以其他方式改變合成基因產物之藥物動力學的殘基序列。
此外，可添加標籤或其他部分，例如以輔助多肽之偵測或親和純化。舉例而言，諸如指定抗原決定基標籤或其他可偵測標記物之鹼基序列的其他核苷酸殘基序列亦可連接於編碼酶之核酸分子。此類序列之實例包括編碼His標籤或Flag標籤之核酸序列。
接著所鑑別及分離之核酸可插入適當選殖載體中。可使用此項技術中已知之多種載體-宿主系統。可能載體包括(但不限於)質體或經修飾之病 毒，但載體系統必須與所用宿主細胞相容。此類載體包括(但不限於)噬菌體，諸如λ衍生物；或質體，諸如pCMV4、pBR322或pUC質體衍生物；或Bluescript載體(Stratagene,La Jolla,CA)。其他表現載體包括本文中例示之HZ24表現載體(參見例如SEQ ID NO：4及5)。插入選殖載體中可例如藉由將DNA片段接合至具有互補黏性末端之選殖載體中來實現。插入可使用TOPO選殖載體(Invitrogen,Carlsbad,CA)實現。
若用於分裂DNA之互補限制位點不存在於選殖載體中，則可以酶促方式修飾DNA分子之末端。或者，任何所希望之位點可藉由將核苷酸序列(連接子)接合至DNA末端上來產生；此等接合連接子可含有特定的化學合成之編碼限制核酸內切酶識別序列之寡核苷酸。在一替代方法中，裂解載體及蛋白質基因可藉由同聚物加尾進行修飾。
重組分子可經由例如轉型、轉染、感染、電穿孔及聲孔作用引入宿主細胞中，以便產生基因序列之多個複本。在特定具體實例中，宿主細胞經並有經分離之蛋白質基因、cDNA或合成DNA序列的重組DNA分子轉型能夠產生基因之多個複本。因而，基因可藉由使轉型體生長、自轉型體分離重組DNA分子且在需要時自經分離之重組DNA取得插入基因來大量獲得。
除重組產生之外，本文所提供之經修飾之PH20多肽可藉由使用固相技術進行直接肽合成來產生(參見例如Stewart等人(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co.,San Francisco；Merrifield J(1963)J Am Chem Soc.,85：2149-2154)。試管內蛋白質合成可使用手動技術或自動進行。自動合成可例如使用Applied Biosystems 431A肽合成器(Perkin Elmer,Foster City CA)根據製造商提供之說明書實現。多肽之各種片段可分開化學合成且使用化學 方法組合。
2. 突變或經修飾之核酸及編碼多肽的產生
本文所提供之修飾可藉由諸如熟習此項技術者常規使用之標準重組DNA技術進行。可採用此項技術中已知實現標靶蛋白中任一或多種胺基酸之突變的任何方法。方法包括編碼核酸分子之標準定點突變誘發(使用例如套組，諸如可自Stratagene獲得之QuikChange)，或藉由固相多肽合成方法。
3. 載體及細胞
為重組表現一或多種所希望之蛋白質(諸如本文中所描述之任何經修飾之PH20多肽)，含有所有或一部分編碼蛋白質之核苷酸序列的核酸可插入適當表現載體中，亦即含有插入之蛋白質編碼序列轉錄及轉譯所需之元件的載體。所需轉錄及轉譯信號亦可藉由酶基因之天然啟動子及/或其側接區域提供。
亦提供含有編碼酶之核酸的載體。提供含有載體之細胞。細胞包括真核及原核細胞，且載體為適用於在其中使用之任一者。一般而言，細胞為能夠實現編碼蛋白質糖基化的細胞。
提供含有載體之原核及真核細胞。此類細胞包括細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌(Archea)、植物細胞、昆蟲細胞及動物細胞。藉由使上述細胞在編碼蛋白質由細胞表現之條件下生長且回收所表現之蛋白質，該等細胞用於產生其蛋白質。出於本文之目的，舉例而言，酶可分泌至培養基中。
宿主細胞系可針對其調節插入序列之表現或以所希望方式加工所表現 之蛋白質的能力來選擇。多肽之此類修飾包括(但不限於)乙醯化、羧化、糖基化、磷酸化、脂質化及醯化。轉譯後加工可影響多肽之摺疊及/或功能。不同宿主細胞，諸如(但不限於)CHO(DG44、DXB11、CHO-K1)、海拉、MCDK、293及WI38，具有特定用於此類轉譯後活性的細胞機構及特徵機制，且可經選擇以確保引入之蛋白質的正確修飾及加工。一般而言，選擇能夠將N連接之糖基化引入所表現之多肽的細胞。因此，提供含有載體之真核細胞。例示性真核細胞為哺乳動物中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。舉例而言，二氫葉酸還原酶缺乏之CHO細胞(例如DG44細胞)用於產生本文所提供之多肽。注意，本文所提供之PH20多肽的細菌表現將不會產生催化活性多肽，但當與適當糖基化機構組合時，PH20可人工糖基化。
提供含有與天然或異源信號序列偶合的編碼經修飾之PH20多肽之核苷酸序列的載體，以及其多個複本。載體可經選擇用於在細胞中表現酶蛋白質或使得酶蛋白質表現為分泌蛋白質。
多種宿主-載體系統可用於表現蛋白質編碼序列。此等包括(但不限於)感染病毒(例如牛痘病毒、腺病毒及其他病毒)之哺乳動物細胞系統；感染病毒(例如桿狀病毒)之昆蟲細胞系統；微生物，諸如含有酵母載體之酵母；或經噬菌體、DNA、質體DNA或黏質體DNA轉型之細菌。載體之表現元件在其強度及特異性方面變化。視所用宿主-載體系統而定，可使用多種適合的轉錄及轉譯元件中之任一者。
熟習此項技術者已知用於將DNA片段插入載體中之任何方法可用於構築含有含適當轉錄/轉譯控制信號及蛋白質編碼序列之嵌合基因的表現載體。此等方法可包括試管內重組DNA及合成技術及活體內重組(基因再組 合)。編碼蛋白質或其結構域、衍生物、片段或同源物的核酸序列之表現可藉由第二核酸序列調控，使得基因或其片段在經重組DNA分子轉型之宿主中表現。舉例而言，蛋白質之表現可藉由此項技術中已知之任何啟動子/強化子控制。在一特定具體實例中，啟動子對於所希望蛋白質之基因而言為非天然的。可使用之啟動子包括(但不限於)SV40早期啟動子(Bernoist及Chambon,Nature 290：304-310(1981))、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複序列中所含之啟動子(Yamamoto等人Cell 22：787-797(1980))、疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1441-1445(1981))、金屬硫蛋白基因之調控序列(Brinster等人，Nature 296：39-42(1982))；原核表現載體啟動子，諸如β-內醯胺酶啟動子(Jay等人，(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：5543)或tac啟動子(DeBoer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：21-25(1983)；亦參見Gilbert及Villa-Komaroff,「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」,Scientific American 242：74-94(1980))；植物表現載體啟動子，諸如胭脂鹼合成酶啟動子(Herrera-Estrella等人，Nature 303：209-213(1983))或花椰菜嵌紋病毒35S RNA啟動子(Gardner等人，Nucleic Aeids Res.9：2871(1981))及光合成酶二磷酸核酮糖羧化酶之啟動子(Herrera-Estrella等人，Nature 310：115-120(1984))；來自酵母及其他真菌之啟動子元件，諸如Gal4啟動子、醇去氫酶啟動子、磷酸甘油激酶啟動子、鹼性磷酸酶啟動子及顯示組織特異性且已用於轉殖基因動物中之以下動物轉錄控制區域：在胰臟腺細胞中為活性的彈性蛋白酶基因控制區域(Swift等人，Cell 38：639-646(1984)；Ornitz等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409(1986)；MacDonald,Hepatology 7：425-515(1987))；在胰臟β細胞 中為活性的胰島素基因控制區域(Hanahan等人，Nature 315：115-122(1985))；在淋巴細胞中為活性的免疫球蛋白基因控制區域(Grosschedl等人，Cell 38：647-658(1984)；Adams等人，Nature 318：533-538(1985)；Alexander等人，Mol.Cell Biol.7：1436-1444(1987))；在睾丸、乳房、淋巴及肥大細胞中為活性的小鼠乳房腫瘤病毒控制區域(Leder等人，Cell 45：485-495(1986))；在肝中為活性的白蛋白基因控制區域(Pinkert等人，Genes and Devel.1：268-276(1987))；在肝中為活性的α-胎蛋白基因控制區域(Krumlauf等人，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648(1985)；Hammer等人，Science 235：53-581987))；在肝中為活性的α-1抗胰蛋白酶基因控制區域(Kelsey等人，Genes and Devel.1：161-171(1987))；在骨髓細胞中為活性的β血球蛋白基因控制區域(Magram等人，Nature 315：338-340(1985)；Kollias等人，Cell 46：89-94(1986))；在大腦之寡樹突神經膠質細胞中為活性的髓鞘鹼性蛋白質基因控制區域(Readhead等人，Cell 48：703-712(1987))；在骨胳肌中為活性的肌球蛋白輕鏈-2基因控制區域(Shani,Nature 314：283-286(1985))；及在丘腦下部之促性腺激素細胞中為活性的促性腺激素釋放激素基因控制區域(Mason等人，Science 234：1372-1378(1986))。
在一特定具體實例中，使用含有可操作地連接於編碼所希望蛋白質或其結構域、片段、衍生物或同源物之核酸之啟動子、一或多個複製起點及視情況選用之一或多個可選標記物(例如抗生素抗性基因)的載體。視表現系統而定，特定的起始信號亦為PH20序列高效轉譯所需。此等信號包括ATG起始密碼子及相鄰序列。在PH20或其可溶性形式之起始密碼子及上游序列插入適當表現載體中的情況下，不需要另外的轉譯控制信號。在僅僅 編碼序列或其一部分插入的情況下，必須提供包括ATG起始密碼子之外源性轉錄控制信號。此外，起始密碼子必須在正確的閱讀框架中以確保整個插入物轉錄。外源性轉錄元件及啟動密碼子可源自各種天然與合成來源。表現功效可藉由包括適於所用細胞系統之強化子強化(Scharf等人(1994)Results Probl Cell Differ 20：125-62；Bittner等人(1987)Methods in Enzymol,153：516-544)。
用於大腸桿菌細胞轉型之例示性質體載體包括例如pQE表現載體(可獲自Qiagen,Valencia,CA；亦參見由Qiagen公開之描述該系統之文獻)。pQE載體具有噬菌體T5啟動子(由大腸桿菌RNA聚合酶識別)及雙重lac操縱基因壓製模組以提供重組蛋白質在大腸桿菌中緊緊調控之高水準表現；用於有效轉譯之合成核糖體結合位點(RBS II)；6xHis標籤編碼序列；t0及T1轉錄終止子；ColE1複製起點；及用於賦予安比西林抗性之β-內醯胺酶基因。pQE載體能夠將6xHis標籤置於重組蛋白質之N或C端。此類質體包括pQE 32、pQE 30及pQE 31，其為所有三個閱讀框架提供多個選殖位點且提供N端6xHis標記蛋白質之表現。用於大腸桿菌細胞轉型之其他例示性質體載體包括例如pET表現載體(參見美國專利4,952,496；可獲自Novagen,Madison,WI；亦參見由Novagen公開之描述該系統的文獻)。此類質體包括pET 11a，其含有T7lac啟動子、T7終止子、誘導性大腸桿菌lac操縱基因及lac抑制基因；pET 12a-c，其含有T7啟動子、T7終止子及大腸桿菌ompT分泌信號；以及pET 15b及pET19b(Novagen,Madison,WI)，其含有用於純化之具有His行及在該行上允許在純化後裂解之凝血酶裂解位點的His-TagTM前導序列、T7-lac啟動子區域及T7終止子。
典型地，載體可為質體、病毒載體或此項技術中已知用於在活體內或試管內表現經修飾之PH20多肽的其他載體。舉例而言，經修飾之PH20多肽在哺乳動物細胞，包括例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中表現。用於哺乳動物細胞表現之一種例示性載體為HZ24表現載體。HZ24表現載體來源於pCI載體骨架(Promega)。其含有編碼β-內醯胺酶抗性基因(AmpR)之DNA、F1複製起點、巨細胞病毒即刻早期強化子/啟動子區域(CMV)及SV40晚期聚腺苷酸化信號(SV40)。表現載體亦具有來自ECMV病毒(Clontech)之內部核糖體進入位點(IRES)及小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。
可採用病毒載體，諸如腺病毒、反轉錄病毒或牛痘病毒載體。在一些實例中，載體為缺陷或減毒反轉錄病毒或其他病毒載體(參見美國專利第4,980,286號)。舉例而言，可使用反轉錄病毒載體(參見Miller等人，Meth.Enzymol.217：581-599(1993))。此等反轉錄病毒載體已經修飾以除去病毒基因組包裝及整合至宿主細胞DNA中不需要之反轉錄病毒序列。
在一些實例中，裝備有編碼經修飾之PH20多肽之核酸的病毒可促進其複製且在例如目標組織內擴散。目標組織可為癌性組織，從而病毒能夠在腫瘤內選擇性複製。病毒亦可為非裂解病毒，其中病毒在組織特異性啟動子下選擇性複製。當病毒複製時，PH20多肽與病毒基因共同表現將促進病毒在活體內擴散。
4. 表現
經修飾之PH20多肽可藉由熟習此項技術者已知之包括活體內及試管內方法的任何方法產生。所希望之蛋白質可在適合於產生所需量及形式之 蛋白質(諸如投予及治療所需之量及形式)的任何生物體中表現。表現宿主包括原核及真核生物體，諸如大腸桿菌、酵母、植物、昆蟲細胞、哺乳動物細胞，包括人類細胞系及轉殖基因動物。表現宿主不同之處可在於其蛋白質產生水準，以及存在於所表現之蛋白質上的轉譯後修飾之類型。表現宿主之選擇可基於此等及諸如調控及安全考慮因素、生產成本及純化需求及方法之其他因素進行。
許多表現載體可用且為熟習此項技術者已知且可用於表現蛋白質。表現載體之選擇將受宿主表現系統之選擇影響。一般而言，表現載體可包括轉錄啟動子及視情況選用之強化子、轉譯信號及轉錄及轉譯終止信號。用於穩定轉型之表現載體典型地具有可選標記物，其允許經轉型細胞之選擇及維持。在一些情況下，複製起點可用於擴增載體之複本數。
亦可利用經修飾之PH20多肽或表現為蛋白質融合物。舉例而言，可產生酶融合物以添加另外的功能性至酶。酶融合蛋白之實例包括(但不限於)信號序列、諸如用於定位之標籤(例如6xHis或His6標籤或myc標籤)或用於純化之標籤(例如GST融合物)及用於引導蛋白質分泌及/或膜締合之序列的融合物。
為長期高產率地產生重組蛋白質，希望穩定表現。舉例而言，穩定表現經修飾之PH20多肽的細胞系可使用含有病毒複製起點或內源性表現元件及可選標記基因的表現載體轉型。在引入載體之後，可使細胞在交換至選擇性培養基之前，於豐富培養基中生長1-2天。可選標記物之目的為向選擇賦予抵抗性，且其存在使得成功表現經引入之序列的細胞生長及回收。穩定轉型之細胞的抗性細胞可使用適於細胞類型之組織培養技術增殖。
許多選擇系統可用於回收經轉型之細胞系。此等包括(但不限於)單純性疱疹病毒胸苷激酶(Wigler,M等人(1977)Cell,11：223-32)及腺嘌呤磷酸核糖轉移酶(Lowy,I等人(1980)Cell,22：817-23)基因，其可分別用於TK-或APRT-細胞。此外，抗代謝物、抗生素或除草劑抗性可用作選擇基礎。舉例而言，可使用DHFR，其賦予對甲胺喋呤之抗性(Wigler,M等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci,77：3567-70)；npt，其賦予對胺基糖苷類新黴素及G-418之抗性(Colbere-Garapin,F等人(1981)J.Mol.Biol.,150：1-14)；以及als或pat，其分別賦予對氯磺隆(chlorsulfuron)及草丁膦(phosphinotricin)乙醯基轉移酶之抗性。已描述其他可選基因，例如trpB，其允許細胞利用吲哚代替色胺酸或hisD，其允許細胞利用組胺醇代替組胺酸(Hartman SC及RCMulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci,85：8047-51)。亦可使用可見標記物，諸如(但不限於)花青素、β葡糖醛酸酶及其受質GUS及螢光素酶及其受質螢光素，以鑑別轉型體，且亦定量可歸因於特定載體系統之短暫或穩定蛋白質表現之量(Rhodes CA等人(1995)Methods Mol.Biol.55：121-131)。
可監測PH20多肽之存在及表現。舉例而言，功能多肽之偵測可藉由在適當條件下測試條件培養基之玻尿酸酶活性來測定。本文提供評估所表現之蛋白質之可溶性及活性的例示性分析。
a. 原核細胞
原核生物、尤其大腸桿菌，提供一種用於產生大量蛋白質之系統。大腸桿菌之轉型為一種熟習此項技術者所熟知的簡單且迅速之技術。大腸桿菌之表現載體可含有誘導性啟動子。此類啟動子適用於誘導高水準之蛋白質表現，且表現對宿主細胞顯示一定毒性之蛋白質。誘導性啟動子之實例 包括lac啟動子、trp啟動子、混雜tac啟動子、T7及SP6 RNA啟動子及溫度調控之λ PL啟動子。
諸如本文所提供之任一者的蛋白質可在大腸桿菌之細胞質環境中表現。細胞質為還原性環境，且對於一些分子，此可導致不溶性包涵體形成。諸如二硫蘇糖醇及β-巰基乙醇之還原劑及諸如胍-HCl及尿素之變性劑可用於使蛋白質再溶解。一種替代方法實現細菌周質空間中之蛋白質表現，細菌周質空間提供氧化性環境及類伴侶蛋白及二硫化物異構酶，此等可有助於可溶性蛋白質之產生。典型地，前導序列與待表現之蛋白質融合，其將蛋白質引導至周質。隨後前導序列藉由周質內部之信號肽酶移除。靶向周質之前導序列之實例包括來自果膠酸裂解酶基因之pelB前導序列及來源於鹼性磷酸酶基因之前導序列。在一些情況下，周質表現允許所表現之蛋白質滲漏至培養基中。蛋白質之分泌允許自培養物上清液快速且簡單純化。未分泌之蛋白質可藉由滲透性溶解自周質獲得。類似於細胞質表現，在一些情況下，蛋白質可變得不溶且變性劑及還原劑可用於促進溶解及再摺疊。誘導及生長之溫度亦可影響表現量及可溶性，典型地使用在25℃與37℃之間的溫度。典型地，細菌產生去糖基化蛋白質。因而，若蛋白質之功能需要糖基化，則可在自宿主細胞純化之後試管內添加糖基化。
b. 酵母細胞
諸如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)及甲醇酵母(Prchia pastoris)之酵母為可用於產生蛋白質(諸如本文中所描述之任一者)的熟知酵母表現宿主。酵母 可經游離型複製載體轉型或藉由同源重組經穩定染色體整合轉型。典型地，誘導性啟動子用於調節基因表現。此類啟動子之實例包括GAL1、GAL7及GAL5及金屬硫蛋白啟動子，諸如CUP1、AOX1或其他畢赤酵母(Pichia)或其他酵母啟動子。表現載體常包括可選標記物，諸如LEU2、TRP1、HIS3及URA3，用於選擇及維持經轉型DNA。在酵母中表現之蛋白質常常可溶。與諸如Bip之伴侶蛋白及蛋白質二硫化物異構酶一起共同表現可提高表現量及可溶性。此外，在酵母中表現之蛋白質可指向使用分泌信號肽融合物(諸如來自釀酒酵母之酵母匹配型α-因子分泌信號)及與酵母細胞表面蛋白質之融合物(諸如Aga2p匹配黏附受體或阿斯德米酵母菌(Arxula adeninivorans)澱粉酶)分泌。諸如用於Kex-2蛋白酶之蛋白酶裂解位點可經工程改造以在所表現之多肽離開分泌路徑時自該等多肽移除融合序列。酵母亦能夠在Asn-X-Ser/Thr基元糖基化。
c. 昆蟲及昆蟲細胞
尤其使用桿狀病毒表現之昆蟲細胞適用於表現多肽，諸如PH20多肽。昆蟲細胞表現高水準之蛋白質且能夠實現由高級真核生物使用之大部分轉譯後修飾。桿狀病毒具有限制性宿主範圍，此提高安全性且減少真核表現之調控問題。典型表現載體使用啟動子進行高水準表現，諸如桿狀病毒之多角體蛋白啟動子。常用桿狀病毒系統包括桿狀病毒，諸如苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus，AcNPV)或家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)；及昆蟲細胞系，諸如來源於草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)、一星黏蟲(Pseudaletia unipuncta，A7S)及黑脈金斑蝶(Danaus plexippus，DpN1)之Sf9。 為高水準表現，待表現分子之核苷酸序列緊靠病毒之多角體蛋白起始密碼子下游融合。哺乳動物分泌信號在昆蟲細胞中精確加工且可用於將所表現之蛋白質分泌至培養基中。此外，細胞系一星黏蟲(A7S)及黑脈金斑蝶(DpN1)產生類似於哺乳動物細胞系統，具有糖基化模式之蛋白質。例示性昆蟲細胞為經改變以降低免疫原性之昆蟲細胞，包括具有「哺乳動物化」桿狀病毒表現載體之昆蟲細胞及缺乏酶FT3之昆蟲細胞。
一種在昆蟲細胞中之替代表現系統採用穩定轉型之細胞。諸如Schnieder 2(S2)及Kc細胞(黑腹果蠅(Drosophila melanogaster))及C7細胞(白蚊伊蚊(Aedes albopictus))之細胞系可用於表現。果蠅金屬硫蛋白啟動子可用於在用鎘或銅之重金屬誘導的存在下誘導高表現量。表現載體典型地藉由使用可選標記物(諸如新黴素及潮黴素)維持。
d. 哺乳動物表現
哺乳動物表現系統可用於表現包括PH20多肽之蛋白質。表現構築體可藉由病毒感染(諸如藉由腺病毒)或藉由直接DNA輸送(諸如脂質體、磷酸鈣、DEAE-聚葡萄糖)以及藉由物理方式(諸如電穿孔及顯微注射)輸送至哺乳動物細胞。用於哺乳動物細胞之表現載體典型地包括mRNA加帽位點、TATA盒、轉譯啟動序列(克紮克共同序列(Kozak consensus sequence))及聚腺苷酸化元件。亦可添加IRES元件以允許用另一基因(諸如可選標記物)進行雙順反子表現。此類載體常常包括用於高水準表現之轉錄啟動子-強化子，例如SV40啟動子-強化子、人類巨細胞病毒(CMV)啟動子及勞斯肉瘤病毒之長末端重複序列(RSV)。此等啟動子-強化子在許多細胞類型中為活性的。組織及細胞型啟動子及強化子區域亦可用於表現。例示性啟 動子/強化子區域包括(但不限於)來自諸如彈性蛋白酶I、胰島素、免疫球蛋白、小鼠乳房腫瘤病毒、白蛋白、α胎蛋白、α 1抗胰蛋白酶、β血球蛋白、髓鞘鹼性蛋白質、肌球蛋白輕鏈2及促性腺釋放激素基因控制之基因的啟動子/強化子區域。可選標記物可用於選擇及維持具有表現構築體之細胞。可選標記基因之實例包括(但不限於)潮黴素B磷酸轉移酶、腺苷去胺酶、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶、胺基糖苷磷酸轉移酶、二氫葉酸還原酶(DHFR)及胸苷激酶。舉例而言，表現可在甲胺喋呤存在下進行以僅僅選擇表現DHFR基因之彼等細胞。與細胞表面信號傳導分子(諸如TCR-ζ及Fc ε RI-γ)之融合可引導處於活性狀態下之蛋白質在細胞表面上表現。
許多細胞系可用於哺乳動物表現，包括小鼠、大鼠、人類、猴、雞及倉鼠細胞。例示性細胞系包括(但不限於)CHO、Balb/3T3、海拉、MT2、小鼠NS0(非分泌)及其他骨髓瘤細胞系、融合瘤及異種融合瘤細胞系、淋巴細胞、纖維母細胞、Sp2 0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8及HKB細胞。適於無血清之培養基之細胞系亦為可用的，其促進分泌蛋白質自細胞培養基之純化。實例包括CHO-S細胞(Invitrogen,Carlsbad,CA，目錄號11619-012)及無血清之EBNA-1細胞系(Pham等人，(2003)Biotechnol.Bioeng.84：332-42)。適於在經最佳化以實現最大程度表現之特定培養基中生長之細胞系亦為可用的。舉例而言，DG44 CHO細胞適於在化學定義之不含動物產物之培養基中以懸浮培養生長。
e. 植物
轉殖基因植物細胞及植物可用於表現蛋白質，諸如本文中所描述之任 一者。表現構築體典型地使用直接DNA輸送(諸如微彈轟擊)及PEG介導之輸送至原生質體以及農桿菌介導之轉型來輸送至植物。表現載體可包括啟動子及強化子序列、轉錄終止元件及轉譯控制元件。表現載體及轉型技術通常在雙子葉植物宿主(諸如芥菜屬(Arabodopsis)及菸草)與單子葉植物宿主(諸如玉米及稻穀)之間劃分。用於表現之植物啟動子之實例包括花椰菜嵌紋病毒啟動子、胭脂鹼合成酶(nopaline syntase)啟動子、二磷酸核糖羧化酶啟動子以及泛素及UBQ3啟動子。可選標記物，諸如潮黴素、磷酸甘露糖異構酶及新黴素磷酸轉移酶，常常用於促進經轉型細胞之選擇及維持。經轉型植物細胞可呈細胞、聚集體(愈傷組織)形式維持在培養物中或再生成全植物。轉殖基因植物細胞亦可包括經工程改造以產生玻尿酸酶多肽之藻類。因為植物具有與哺乳動物細胞不同之糖基化模式，所以此可影響在此等宿主中產生之蛋白質的選擇。
5. 純化
經編碼經修飾之PH20多肽之核酸序列轉型的宿主細胞可在適合於表現及自細胞培養物回收編碼之蛋白質的條件下培養。由重組細胞產生之蛋白質一般分泌，但可含於細胞內，視所用序列及/或載體而定。如熟習此項技術者所瞭解，含有編碼PH20之核酸的表現載體可設計成具有促進PH20穿過原核或真核細胞膜直接分泌之信號序列。
因而，用於自宿主細胞純化多肽之方法將視所選擇的宿主細胞及表現系統而定。對於分泌之分子，蛋白質一般在移除細胞之後自培養基純化。對於細胞內表現，細胞可溶解且自提取物純化蛋白質。當諸如轉殖基因植物及動物之轉殖基因生物體用於表現時，組織或器官可用作起始物質以製 備溶解細胞提取物。此外，轉殖基因動物產生可包括可收集之乳汁或蛋中多肽之產生，且必要時，可提取蛋白質且使用此項技術中之標準方法進一步純化。
諸如經修飾之PH20多肽的蛋白質可使用此項技術中已知之標準蛋白質純化技術純化，包括(但不限於)SDS-PAGE、尺寸分級分離及尺寸排外層析法、硫酸銨沈澱及離子交換層析法，諸如陰離子交換層析法。亦可利用親和純化技術來提高製劑之功效及純度。舉例而言，結合PH20玻尿酸酶之抗體、受體及其他分子可用於親和純化。舉例而言，可溶性PH20可自條件培養基純化。
表現構築體亦可經工程改造以添加親和標籤至蛋白質，諸如myc抗原決定基、GST融合物或His6，且分別經myc抗體、麩胱甘肽樹脂或Ni-樹脂親和純化。此類標籤可與如本文中其他地方所描述之編碼可溶性PH20之核苷酸序列接合，此可促進可溶性蛋白質之純化。舉例而言，經修飾之PH20多肽可表現為添加有一或多個其他多肽結構域以促進蛋白質純化之重組蛋白質。此類促進純化之結構域包括(但不限於)金屬螯合肽，諸如允許在固定金屬上純化之組胺酸-色胺酸模組；允許在固定免疫球蛋白上純化之蛋白A結構域；及FLAGS擴展/親和純化系統(Immunex公司，Seattle Wash.)中利用之結構域。在純化結構域與所表現之PH20多肽之間包括可裂解連接子序列(諸如因子XA或腸激酶(Invitrogen,San Diego,CA))可用於促進純化。一種此類表現載體提供含有PH20多肽及腸激酶裂解位點之融合蛋白質的表現。組胺酸殘基促進在IMIAC(固定金屬離子親和層析法)上之純化，而腸激酶裂解位點提供自融合蛋白質純化多肽之方式。
純度可藉由此項技術中已知之任何方法，包括凝膠電泳、正交HPLC方法、染色及分光光度技術評估。表現及純化之蛋白質可使用熟習此項技術者已知之任何分析或方法，例如部分G中描述之任一者來分析。此等包括基於蛋白質之物理及/或功能特性之分析，包括(但不限於)凝膠電泳分析、免疫分析及玻尿酸酶活性分析。
視所用表現系統及宿主細胞而定，所得多肽可因在產生及純化時培養基中存在之肽酶而為非均質的。舉例而言，可溶性PH20在CHO細胞中之培養可產生非均質多肽之混合物。
6. 藉由聚乙二醇化進行之多肽修飾
聚乙二醇(PEG)已廣泛用於生物材料、生物技術及醫學上，主要是因為PEG為一種生物相容的無毒性之水溶性聚合物，典型地為無免疫原性(Zhao及Harris,ACS Symposium Series 680：458-72,1997)。在藥物傳遞領域，PEG衍生物已廣泛用於與蛋白質共價附接(亦即「聚乙二醇化」)以降低免疫原性、蛋白分解及腎臟消除率及增強可溶性(Zalipsky,Adv.Drug Del.Rev.16：157-82,1995)。類似地，PEG已附接至低分子量之相對疏水性藥物以增強可溶性、降低毒性及改變生物分佈。典型地，聚乙二醇化藥物呈溶液形式注射。
一種緊密相關之應用為合成交聯之可降解PEG網狀物或調配物用於藥物傳遞，因為用於設計可降解之可溶性藥物載劑之大部分相同化學作用亦可用於設計可降解凝膠(Sawhney等人，Macromolecules 26：581-87,1993)。亦已知大分子間複合物可藉由混合兩種互補聚合物之溶液形成。此類複合物一般藉由所涉及聚合物之間的靜電相互作用(聚陰離子-聚陽離子)及/或氫 鍵(多元酸-多元鹼)及/或在水性環境中藉由聚合物之間的疏水性相互作用來穩定化(Krupers等人，Eur.Polym J.32：785-790,1996)。舉例而言，在適當條件下混合聚丙烯酸(PAAc)與聚氧化乙烯(PEO)之溶液引起大部分基於氫鍵之複合物的形成。在生理條件下此等複合物之解離已用於傳遞自由藥物(亦即非聚乙二醇化)。此外，互補聚合物之複合物已由均聚物與共聚物兩者形成。
此項技術中已描述用於聚乙二醇化之多種試劑。此類試劑包括(但不限於)多肽與以下各物之反應：N-羥基丁二醯亞胺基(NHS)活化之PEG、丁二醯亞胺基mPEG、mPEG2-N-羥基丁二醯亞胺、mPEG α-甲基丁酸丁二醯亞胺基酯、mPEG丙酸丁二醯亞胺基酯、mPEG丁酸丁二醯亞胺基酯、mPEG羧甲基3-羥基丁酸丁二醯亞胺基酯、同源雙官能PEG-丙酸丁二醯亞胺基酯、同源雙官能PEG丙醛、同源雙官能PEG丁醛、PEG順丁烯二醯亞胺、PEG醯肼、對硝基苯基-碳酸酯PEG、mPEG-苯并三唑碳酸酯、丙醛PEG、mPEG丁醛、分支鏈mPEG2丁醛、mPEG乙醯基、mPEG哌啶酮、mPEG甲基酮、mPEG「無連接子」順丁烯二醯亞胺、mPEG乙烯基碸、mPEG硫醇、mPEG鄰吡啶基硫酯、mPEG鄰吡啶基二硫化物、Fmoc-PEG-NHS、Boc-PEG-NHS、乙烯基碸PEG-NHS、丙烯酸酯PEG-NHS、螢光素PEG-NHS及生物素PEG-NHS(參見例如Monfardini等人，Bioconjugate Chem.6：62-69,1995；Veronese等人，J.Bioactive Compatible Polymers 12：197-207,1997；U.S.5,672,662；U.S.5,932,462；U.S.6,495,659；U.S.6,737,505；U.S.4,002,531；U.S.4,179,337；U.S.5,122,614；U.S.5,324,844；U.S.5,446,090；U.S.5,612,460；U.S.5,643,575；U.S.5,766,581；U.S.5,795,569；U.S.5,808,096；U.S.5,900,461； U.S.5,919,455；U.S.5,985,263；U.S.5,990,237；U.S.6,113,906；U.S.6,214,966；U.S.6,258,351；U.S.6,340,742；U.S.6,413,507；U.S.6,420,339；U.S.6,437,025；U.S.6,448,369；U.S.6,461,802；U.S.6,828,401；U.S.6,858,736；U.S.2001/0021763；U.S.2001/0044526；U.S.2001/0046481；U.S.2002/0052430；U.S.2002/0072573；U.S.2002/0156047；U.S.2003/0114647；U.S.2003/0143596；U.S.2003/0158333；U.S.2003/0220447；U.S.2004/0013637；U.S.2004/0235734；WO05000360；U.S.2005/0114037；U.S.2005/0171328；U.S.2005/0209416；EP 1064951；EP 0822199；WO 01076640；WO 0002017；WO 0249673；WO 9428024；及WO 0187925)。
在一個實例中，聚乙二醇具有在約3kD至約50kD且典型地約5kD至約30kD範圍內之分子量。PEG與藥物共價附接(稱為「聚乙二醇化」)可藉由已知之化學合成技術實現。舉例而言，蛋白質之聚乙二醇化可藉由使NHS活化之PEG與蛋白質在適合反應條件下反應來實現。
雖然已描述用於聚乙二醇化之許多反應，但一般最可適用之反應賦予方向性，利用溫和反應條件，且無需廣泛後續加工來移除毒性催化劑或副產物。舉例來說，單甲氧基PEG(mPEG)僅僅具有一個反應性末端羥基，因而其使用限制所得PEG-蛋白質產物混合物之一定非均質性。活化在與末端甲氧基相對之聚合物末端的羥基一般為所需的以實現有效蛋白質聚乙二醇化，目標為使衍生之PEG更易受親核攻擊。進攻親核試劑通常為離胺醯基殘基之ε-胺基，但若局部條件有利，則其他胺亦可反應(例如組胺酸之N端α-胺或環胺)。在含有單個離胺酸或半胱胺酸之蛋白質中更定向之附接為可能的。後一殘基可由PEG-順丁烯二醯亞胺靶向用於硫醇特異性修 飾。或者，PEG醯肼可與經過碘酸鹽氧化之降解玻尿酸之酶反應且在NaCNBH3存在下還原。更特定言之，聚乙二醇化CMP糖可與降解玻尿酸之酶在適當糖基轉移酶存在下反應。一種技術為其中多個聚合物分子偶合於所討論之多肽的「聚乙二醇化」技術。當使用此技術時，免疫系統難以識別負責形成抗體之多肽表面上之抗原決定基，由此減少免疫反應。對於直接引入人體循環系統中產生特定生理作用之多肽(亦即藥物)，典型的潛在免疫反應為IgG及/或IgM反應，而經由呼吸系統吸入之多肽(亦即工業多肽)可能可引起IgE反應(亦即過敏反應)。解釋免疫反應減少之理論之一為聚合物分子將造成引起抗體形成之免疫反應之多肽表面上的抗原決定基屏蔽。另一理論或至少部分因素為結合物愈重，所得免疫反應減少得愈多。
典型地，為製備本文所提供之聚乙二醇化PH20多肽，PEG部分經由共價附接與多肽結合。用於聚乙二醇化之技術包括(但不限於)專門連接子及偶合化學反應(參見例如Roberts,Adv.Drug Deliv.Rev.54：459-476,2002)、多個PEG部分附接於單個結合位點(諸如經由使用分支鏈PEG；參見例如Guiotto等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.12：177-180,2002)、位點特異性聚乙二醇化及/或單聚乙二醇化(參見例如Chapman等人，Nature Biotech.17：780-783,1999)及定點酶聚乙二醇化(參見例如Sato,Adv.Drug Deliv.Rev.,54：487-504,2002)。此項技術中描述之方法及技術可產生具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10個以上附接於單個蛋白質分子之PEG或PEG衍生物的蛋白質(參見例如美國2006/0104968)。
作為一種用於製備聚乙二醇化PH20多肽之例示性的說明性方法，PEG醛、丁二醯亞胺及碳酸酯每一者已應用於將PEG部分、典型地丁二醯亞胺 基PEG結合於rHuPH20。舉例而言，rHuPH20已與例示性丁二醯亞胺基甲氧基PEG(mPEG)試劑結合，包括mPEG-丙酸丁二醯亞胺基酯(mPEG-SPA)、mPEG-丁酸丁二醯亞胺基酯(mPEG-SBA)及(用於附接「分支鏈」PEG)mPEG2-N-羥基丁二醯亞胺。此等聚乙二醇化丁二醯亞胺基酯在PEG基團與活化交聯劑之間含有不同長度碳主鏈，及單一或分支鏈PEG基團。此等差異可用以例如提供不同反應動力學且可能限制在結合過程期間可用於PEG附接於rHuPH20之位點。
含有直鏈或分支鏈PEG之丁二醯亞胺基PEG(如上所述)可與PH20結合。PEG可用於產生可再生地含有每一玻尿酸酶分子平均具有約三個至六個或三個至六個PEG分子之分子的PH20。此類聚乙二醇化rHuPH20組成物可容易純化，得到具有每毫克蛋白質約25,000或30,000單位之玻尿酸酶活性之比活性且實質上不含非聚乙二醇化PH20(低於5%非聚乙二醇化)的組成物。
使用各種PEG試劑，可製備聚乙二醇化PH20多肽之例示性型式，例如使用mPEG-SBA(30kD)、mPEG-SMB(30kD)及基於mPEG2-NHS(40kD)及mPEG2-NHS(60kD)之分支鏈型式。PH20之聚乙二醇化型式可使用NHS化學反應以及碳酸酯及醛，使用以下試劑中之每一者產生：mPEG2-NHS-40K分支鏈、mPEG-NHS-10K分支鏈、mPEG-NHS-20K分支鏈、mPEG2-NHS-60K分支鏈；mPEG-SBA-5K、mPEG-SBA-20K、mPEG-SBA-30K；mPEG-SMB-20K、mPEG-SMB-30K；mPEG-丁醛；mPEG-SPA-20K、mPEG-SPA-30K；以及PEG-NHS-5K-生物素。聚乙二醇化PH20亦可使用可自Dowpharma(Dow Chemical公司之分公司)獲得之PEG試劑製備；包括經Dowpharma之對硝 基苯基-碳酸酯PEG(30kDa)及經丙醛PEG(30kDa)聚乙二醇化之PH20多肽。
在一個實例中，聚乙二醇化包括mPEG-SBA之結合，例如mPEG-SBA-30K(具有約30kDa之分子量)或PEG丁酸衍生物之另一丁二醯亞胺基酯與PH20多肽之結合。PEG丁酸衍生物之丁二醯亞胺基酯，諸如mPEG-SBA-30K，容易偶合於蛋白質胺基。舉例而言，m-PEG-SBA-30K與rHuPH20(尺寸為約60KDa)之共價結合提供rHuPH20與mPEG之間穩定的醯胺鍵，如以下流程1中所示。
典型地，mPEG-SBA-30K或其他PEG以10：1之PEG：多肽莫耳比添加至適合緩衝液(例如130mM NaCl/10mM HEPES pH 6.8或pH 7之70mM磷酸鹽緩衝液)中的PH20多肽中，接著殺菌，例如無菌過濾，且例如在攪拌下繼續結合，在寒冷房間在4℃下隔夜。在一個實例中，結合之PEG-PH20濃縮且更換緩衝液。
偶合PEG丁酸衍生物之丁二醯亞胺基酯(諸如mPEG-SBA-30K)之其 他方法為此項技術中已知(參見例如U.S.5,672,662；U.S.6,737,505；及U.S.2004/0235734)。舉例而言，諸如PH20多肽之多肽可藉由在硼酸鹽緩衝液(0.1M，pH 8.0)中在4℃下反應一小時而偶合於NHS活化之PEG衍生物。所得聚乙二醇化蛋白質可藉由超過濾來純化。另一方法使多肽與mPEG-SBA在添加三乙胺以升高pH值至7.2-9之去離子水中反應。所得混合物在室溫下攪拌若干小時以使聚乙二醇化完成。
用於PH20多肽(包括例如動物來源之玻尿酸酶及細菌之降解玻尿酸之酶)聚乙二醇化之方法為熟習此項技術者已知。參見例如歐洲專利第EP 0400472號，其描述牛類睪丸玻尿酸酶及軟骨素ABC裂解酶之聚乙二醇化。此外，美國公開案第2006014968號描述來源於人類PH20之人類玻尿酸酶的聚乙二醇化。舉例而言，聚乙二醇化之降解玻尿酸之酶一般每個分子含有至少3個PEG部分。在一些實例中，PH20多肽含有三個至六個PEG分子。在其他實例中，酶可具有5：1與9：1之間的PEG與蛋白質莫耳比，例如7：1。
F. 醫藥組成物及調配物、劑量及投藥
本文提供以上部分C中闡述之任何經修飾之PH20多肽的醫藥組成物用於投藥。醫藥組成物、尤其液體調配物可受活性劑穩定性限制，其易受儲存條件(儲存時間或長度、溫度及/或攪動)及/或組成物中所含之調配物組分影響。詳言之，許多醫藥組成物需要冷凍來儲存，或在無冷凍下有限時間內穩定。舉例而言，建議重組可溶性PH20玻尿酸酶之一種商業製劑(Hylenex®)儲存在低於或等於25℃之室溫下達不超出48小時之時段。此可限制含有PH20玻尿酸酶之醫藥組成物的應用。詳言之，運送及處置操作常常需要或以其他方式將醫藥組成物暴露於18℃至25℃或超過25℃之環境 溫度超過48小時。此外，持續傳遞裝置(諸如可植入裝置)亦需要將酶暴露於升高溫度(例如30℃至37℃)達可使蛋白質不穩定之時段。最後，在許多地區或國家，冷凍不總為便利的選擇，其可將醫藥組成物進一步暴露於可使蛋白質不穩定之超過25℃之升高環境溫度。此在熱帶氣候中尤其為一個問題。
本文中含有本文所提供之任何經修飾之PH20尤伯嗜熱蛋白的醫藥組成物作為液體調配物，在非冷凍條件下穩定長達超過48小時的長時段。因此，醫藥組成物在非冷凍條件下顯示熱穩定性(亦即活性劑保留玻尿酸酶活性之至少50%)至少72小時、96小時、120小時、144小時、一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或更長時間。舉例而言，醫藥組成物在室溫或升高環境溫度條件(諸如熱帶氣候中存在之溫度條件)下顯示熱穩定性。此活性可在存在於非冷凍環境中之波動溫度條件下保留。舉例而言，本文所提供之經修飾之PH20尤伯嗜熱蛋白作為液體調配物，在18℃至25℃範圍內之溫度下穩定(亦即活性劑保留玻尿酸酶活性之至少50%)至少72小時、至少72小時、96小時、120小時、144小時、一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或更長時間。在其他實例中，本文所提供之經修飾之PH20尤伯嗜熱蛋白作為液體調配物在超過25℃之溫度下穩定(亦即活性劑保留玻尿酸酶活性之至少50%)至少72小時、至少72小時、96小時、120小時、144小時、一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或更長時間。
詳言之，本文所提供之醫藥組成物之熱穩定性在超過25℃之持續、變 化或間歇溫度存在下在無冷凍下實現。在一個實例中，本文所提供之醫藥組成物在將組成物暴露於超過25℃之持續、變化或間歇溫度之非冷凍條件下顯示熱穩定性至少72小時、96小時、120小時、144小時、一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或更長時間。舉例而言，本文所提供之醫藥組成物在將組成物暴露於28℃至42℃或30℃至37℃(各端點均排除)之持續、變化或間歇溫度之非冷凍條件下顯示熱穩定性至少72小時、96小時、120小時、144小時、一週、兩週、三週、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月或更長時間。
增加之穩定性特性在於儲存時間改良、碎裂減少及/或聚集體形成減少，同時仍保留例如PH20玻尿酸酶之活性劑的活性。此類調配物可呈「即用型」液體調配物提供，不進一步復原及/或無需進一步稀釋。在一些實例中，調配物亦可製備成凍乾或濃縮形式。
1. 調配物-液體、可注射液、乳液
鑒於管理機構或其他制定機構之批准，根據用於動物及人類中之公認藥典，製備醫藥學上可接受之組成物。典型地，化合物使用此項技術中熟知之技術及程序調配成醫藥組成物(參見例如Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第四版，1985,126)。
調配物一般經製得，適合投藥途徑。組成物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、散劑及持續釋放調配物之形式。組成物可用傳統黏合劑及載劑(諸如三酸甘油酯)調配為栓劑。口服調配物可包括標準載劑，諸如醫藥等級之甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂及其他此類試劑。亦涵蓋表面調配物。調配物應適合投藥模式。
本文中涵蓋非經腸投藥，一般其特性在於經皮下、肌肉內、靜脈內或皮內注射或輸注。用於非經腸投藥之製劑包括可準備用於注射之無菌溶液、在臨用之前準備與溶劑組合的無菌無水可溶產物(諸如凍乾粉末)(包括皮下錠劑)、準備用於注射之無菌懸浮液、在臨用之前準備與媒劑組合的無菌無水不溶產物、以及無菌乳液。可注射液可呈習知形式以液體溶液或懸浮液形式、以適合於在注射之前溶解或懸浮於液體中的固體形式或以乳液形式製備。舉例而言，分開調配或與另一治療劑共同調配的含有經修飾之PH20多肽的組成物可作為呈溶液、糖漿或懸浮液形式之液體形式的醫藥製劑提供。在液體形式中，醫藥製劑可作為有待在使用之前稀釋至治療學上有效濃度之濃縮製劑提供。一般而言，製劑呈無需稀釋使用之劑型提供。在另一實例中，醫藥製劑可呈凍乾形式呈現，在使用之前用水或其他適合媒劑復原。
可注射液設計用於局部及全身投藥。出於本文之目的，局部投藥為直接投予受影響間質組織所希望的。溶液可為水溶液或非水溶液。若經靜脈內投予，則適合的載劑包括生理食鹽水或磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)，及含有增稠劑及增溶劑(諸如葡萄糖、聚乙二醇及聚丙二醇及其混合物)之溶液。
醫藥活性化合物之濃度經調節，以使得注射或輸注提供有效產生所希望之藥理學作用的量。如此項技術中已知，準確劑量視患者或動物之年齡、體重及狀況而定。單位劑量之非經腸製劑可包裝於例如安瓿、藥筒、小瓶或具有針之注射器中。含有醫藥活性化合物之液體溶液或復原粉末製劑之體積隨待治療之疾病及選擇用於包裝之特定製品而變。如此項技術中已知 且實踐，所有用於非經腸投藥之製劑必須無菌。此類非經腸組成物中所含之活性化合物的百分比高度取決於其特定性質，以及化合物之活性及個體需求。
醫藥組成物可包括載劑或其他賦形劑。舉例而言，本文所提供之醫藥組成物可含有以下任一或多者：稀釋劑、佐劑、抗黏附劑、黏合劑、膜衣、填充劑、香料、顏料、潤滑劑、滑動劑、防腐劑、清潔劑、吸附劑或甜味劑及其組合，或經修飾之PH20多肽一起投予之媒劑。舉例而言，用於非經腸製劑中之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑包括水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮及分散劑、乳化劑、鉗合或螯合劑及其他醫藥學上可接受之物質。包括液體製劑之調配物可藉由習知方式用醫藥學上可接受之添加劑或賦形劑製備。
適合醫藥載劑之實例在E.W.Martin之「Remington's Pharmaceutical Sciences」中描述。此類組成物將含有治療有效量之一般呈純化形式之化合物連同適合量之載劑，以便向患者提供適當投藥形式。此類醫藥載劑可為無菌液體，諸如水或油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油及芝麻油。當醫藥組成物經靜脈內投予時，水為典型載劑。亦可採用生理食鹽水溶液及右旋糖水溶液以及甘油溶液作為液體載體，尤其是用於可注射溶液。水性媒劑之實例包括氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringers Injection)、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖及乳酸化林格氏注射液。非水性的非經腸媒劑包括植物來源之不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油及花生油。懸浮劑及分散劑包括(但不限於)山梨醇糖漿、纖維素衍生物或經氫化之食用脂肪、羧甲基纖維素鈉、羥丙 基甲基纖維素及聚乙烯吡咯啶酮。乳化劑包括(但不限於)卵磷脂或阿拉伯膠。清潔劑包括(但不限於)聚山梨醇酯80(TWEEN 80)。非水性媒劑包括(但不限於)杏仁油、油性酯或分級分離植物油。抗微生物劑或防腐劑包括(但不限於)對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸、間甲酚、苯酚。稀釋劑包括(但不限於)乳糖、蔗糖、磷酸二鈣或羧甲基纖維素。潤滑劑包括(但不限於)硬脂酸鎂、硬脂酸鈣或滑石。黏合劑包括(但不限於)澱粉、天然膠(諸如阿拉伯膠)、明膠、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素及其衍生物、聚維酮(povidone)、交聯聚維酮(crospovidone)及熟習此項技術者已知之其他此類黏合劑。等滲劑包括(但不限於)氯化鈉及右旋糖。緩衝劑包括(但不限於)磷酸鹽及檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉劑包括鹽酸普魯卡因。金屬離子之鉗合或螯合劑包括EDTA。其他適合的醫藥賦形劑包括(但不限於)澱粉、葡萄糖、乳糖、右旋糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙二醇、二醇、生理食鹽水、水及乙醇。醫藥載劑亦包括乙醇、聚乙二醇及丙二醇作為與水互溶之媒劑，及氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸用於調節pH值。視需要，組成物亦可含有少量無毒輔助物質，諸如潤濕劑或乳化劑或pH值緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鈉、環糊精衍生物、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉、三乙醇胺油酸酯；穩定劑、可溶性增強劑及諸如乙酸鈉、磷酸鈉、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯及環糊精之其他此類試劑。
詳言之，抑菌或抑制真菌濃度(例如抗微生物有效量)之抗微生物劑 (例如防腐劑)可添加至包裝於多劑容器中之非經腸製劑中，其包括苯酚或甲酚、汞劑、苄醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)及苄索氯銨(benzethonium chloride)。
包括本文所提供之分開調配或共同調配之含PH20調配物的調配物之體積可為適合於提供其之容器的任何體積。在一些實例中，調配物提供於小瓶、注射器或任何其他適合容器中。舉例而言，本文所提供之調配物在或約在0.1mL至500mL之間，諸如0.1mL至100mL、1mL至100mL、0.1mL至50mL，諸如至少或約至少或約或為0.1mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、10mL、15mL、20mL、30mL、40mL、50mL或更多。
a. 凍乾粉末
本文中關注凍乾粉末，其可經復原以呈溶液、乳液及其他混合物形式投予。其亦可經復原且調配成固體或凝膠。
無菌凍乾粉末藉由將酶之化合物溶解於緩衝溶液中來製備。緩衝溶液可含有提高粉末或由粉末製備之復原溶液的穩定性或其他藥理學組分的賦形劑。隨後無菌過濾溶液，接著在熟習此項技術者已知之標準條件下凍乾，得到所希望的調配物。可製備如上文所述之液體調配物。所得混合物經無菌過濾或處理以移除粒子且確保無菌，且分配至小瓶中凍乾。舉例而言，凍乾粉末可藉由將賦形劑(諸如右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖漿、木糖醇、丙三醇、葡萄糖、蔗糖或其他適合試劑)溶解於適合緩衝劑(諸如檸檬酸鹽、磷酸鈉或磷酸鉀或熟習此項技術者已知之其他此類緩衝劑)中來製備。隨後，將所選酶添加至所得混合物中，且攪拌直至其溶解。
製成每一小瓶以含有單劑或多劑之化合物。凍乾粉末可儲存在適當條件下，諸如在約4℃至室溫下。此凍乾粉末用適當緩衝溶液復原提供一種用於非經腸投予之調配物。
b. 例示性調配物
此項技術中已知PH20之單劑調配物。舉例而言，Hylenex®重組(玻尿酸酶人類注射液)每毫升含有8.5mg NaCl(145mM)、1.4mg磷酸二氫鈉(9.9mM)、1.0mg人類白蛋白、0.9mg乙二胺四乙酸二鈉(2.4mM)、0.3mg CaCl2(2.7mM)及調整pH值至7.4之NaOH。人類可溶性玻尿酸酶之其他調配物，諸如美國專利公開案第US2011/0053247號中描述之rHuPH20調配物，包括130mM NaCl、10mM HEPES pH 7.0；或10mM組胺酸、130mM NaCl pH 6.0。本文所提供之任何經修飾之PH20多肽可類似地調配。
除治療有效量之經修飾之PH20多肽及/或其他治療劑之外，包括分開調配及共同調配之含PH20調配物的本文所提供之例示性醫藥組成物在維持活性劑(例如PH20玻尿酸酶及/或其他共同調配之治療劑)穩定性之必需pH值下製備。此類調配物亦可含有一定濃度之鹽，諸如NaCl。
對於儲存長時間之多劑調配物及其他調配物，組成物一般亦含有一或多種防腐劑。一般而言，因為PH20玻尿酸酶為熱穩定的，所以不需要其他穩定化劑。然而，視組成物之應用及目的而定，亦可包括進一步穩定化劑及其他賦形劑。熟習此項技術者能夠憑經驗確定此類包括。下文描述例示性組分。
i. pH值及緩衝劑
在本文中之實例中，本文所提供之醫藥組成物在介於或約介於6.5至 7.8之間，諸如介於或約介於6.5至7.2、7.0至7.8、7.0至7.6或7.2至7.4之間的pH值下製備。本文中對pH值之提及基於在室溫下pH值之量測。應瞭解，pH值在儲存期間可隨時間改變，但典型地將保持在或在約pH 6.5至7.8或至約7.8之間。舉例而言，pH值可變化±0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.3、1.4、1.5或更多。製備時本文所提供之例示性共調配物的pH值為或為約7.0±0.2、7.1±0.2、7.2±0.2、7.3±0.2、7.4±0.2、7.5±0.2或7.6±0.2。必要時，pH值可使用酸化劑調節以降低pH值，或使用鹼化劑調節以提高pH值。例示性酸化劑包括(但不限於)乙酸、檸檬酸、硫酸、鹽酸、磷酸二氫鈉溶液及磷酸。例示性鹼化劑包括(但不限於)磷酸氫二鈉溶液、碳酸鈉或氫氧化鈉。
組成物一般使用維持pH值範圍之緩衝劑製備。任何緩衝劑可用於本文所提供之調配物中，只要其不會不利地影響活性劑(例如PH20玻尿酸酶)之穩定性，且提供所需的必需pH值範圍即可。尤其適合之緩衝劑的實例包括Tris、丁二酸鹽、乙酸鹽、磷酸鹽緩衝劑、檸檬酸鹽、烏頭酸酯、蘋果酸鹽及碳酸鹽。然而，熟習此項技術者將認識到，本文所提供之調配物不限於特定緩衝劑，只要該緩衝劑提供可接受程度之pH值穩定性，或在所指示範圍內之「緩衝能力」即可。一般而言，緩衝劑具有在其pK之約1個pH值單位內的足夠緩衝能力(Lachman等人，The Theory and Practice of Industrial Pharmacy第3版(Lachman,L.,Lieberman,HA.及Kanig,J.L.編輯)，Lea and Febiger,Philadelphia，第458-460頁，1986)。緩衝劑適合性可基於公開之pK列表估計或可藉由此項技術中熟知之方法憑經驗來確定。溶液之pH值可例如使用任何可接受之酸或鹼調節至如上文所描述之範圍內的所希望端點。
可包括於本文所提供之共調配物中的緩衝劑包括(但不限於)Tris(緩血酸胺)、組胺酸、磷酸鹽緩衝液(諸如磷酸氫二鈉)及檸檬酸鹽緩衝液。此類緩衝劑可以介於或約介於1mM至100mM，諸如10mM至50mM或20mM至40mM之間，諸如為或為約30mM的濃度存在於組成物中。舉例而言，此類緩衝劑可以為或約為1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM或更大的濃度存在於組成物中。
ii. 鹽(例如NaCl)
在本文中之實例中，本文所提供之醫藥組成物含有一定濃度之鹽，諸如氯化鈉(NaCl)，其可為PH20玻尿酸酶之活性所需。在本文中之特定實例中，包括本文所提供之分開調配或共同調配之含PH20調配物的醫藥組成物含有濃度介於或約介於10mM至200mM、50mM至200mM、80mM至160mM、100mM至140mM、120mM至180mM、140mM至180mM、120mM至160mM、130mM至150mM、80mM至140mM之間的鹽，諸如NaCl。
一般低於120mM之低鹽濃度可隨時間且視溫度條件而定，對PH20活性產生有害作用。因此，不存在鹽(例如NaCl)或低濃度鹽(例如NaCl)可導致蛋白質不穩定。在本文所提供之醫藥組成物中，歸因於本文所提供之經修飾之PH20多肽所實現的熱穩定性，較低濃度之鹽(例如NaCl)可適合於維持及保存玻尿酸酶活性。因此，在本文中之實例中，醫藥組成物之鹽(例如NaCl)含量低於130mM，諸如10mM至120mM、50mM至120mM、 80mM至120mM、50mM至100mM、50mM至90mM、80mM至100mM或10mM至50mM，包括每一端點。
iii. 防腐劑
在本文中之實例中，多劑調配物或長時間儲存之調配物含有抗微生物有效量之防腐劑或防腐劑混合物，其量具有抑菌或抑制真菌作用。防腐劑之量為維持活性劑(例如PH20玻尿酸酶)活性之量。
可包括於本文所提供之組成物或共調配物中的防腐劑之非限制性實例包括(但不限於)苯酚、間位甲酚(間甲酚)、對羥基苯甲酸甲酯、苄醇、硫柳汞、氯化苯甲烴銨、4-氯-1-丁醇、氯己定二鹽酸鹽、氯己定二葡糖酸鹽、L-苯丙胺酸、EDTA、溴硝醇(2-溴-2-硝基丙-1,3-二醇)、醋酸苯汞、甘油(丙三醇)、咪唑啶基脲、氯己定、去氫乙酸鈉、鄰位甲酚(鄰甲酚)、對位甲酚(對甲酚)、氯甲酚、西曲溴胺(cetrimide)、苄索氯銨、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯或對羥基苯甲酸丁酯及其任何組合。舉例而言，本文所提供之調配物可含有單一防腐劑。在其他實例中，調配物含有至少兩種不同防腐劑或至少三種不同防腐劑。舉例而言，本文所提供之調配物可含有兩種防腐劑，諸如L-苯丙胺酸與間甲酚、L-苯丙胺酸與對羥基苯甲酸甲酯、L-苯丙胺酸與苯酚、間甲酚與對羥基苯甲酸甲酯、苯酚與對羥基苯甲酸甲酯、間甲酚與苯酚或其他類似組合。
在本文所提供之調配物中，調配物中以質量濃度(w/v)百分比(%)計之一或多種防腐劑之總量可例如在或在約0.1%至0.4%，諸如0.1%至0.3%、0.15%至0.325%、0.15%至0.25%、0.1%至0.2%、0.2%至0.3%或0.3%至0.4%之間。一般而言，調配物含有低於0.4%(w/v)防腐劑。舉例而言， 本文所提供之共調配物含有至少或約至少0.1%、0.12%、0.125%、0.13%、0.14%、0.15%、0.16%、0.17%、0.175%、0.18%、0.19%、0.2%、0.25%、0.3%、0.325%、0.35%但低於0.4%之總防腐劑。
iv. 穩定劑
在本文中之實例中，本文所提供之醫藥組成物視情況可含有一或多種其他穩定化劑以維持PH20玻尿酸酶之穩定性。在本文所提供之一些實例中，醫藥組成物不含如胺基酸、胺基酸衍生物、胺、糖、多元醇、界面活性劑、玻尿酸酶抑制劑或其他受質或白蛋白(例如人類白蛋白)之穩定化劑。在本文所提供之其他實施例中，醫藥組成物含有一或多種來自以下穩定化劑之穩定化劑：胺基酸、胺基酸衍生物、胺、糖、多元醇、界面活性劑、玻尿酸酶抑制劑或其他受質或白蛋白(例如人類白蛋白)。
可視情況含於本文所提供之調配物中的穩定劑類型包括胺基酸、胺基酸衍生物、胺、糖、多元醇、鹽及緩衝劑、界面活性劑及其他試劑。舉例而言，本文中之調配物至少含有界面活性劑及適當緩衝劑。視情況，本文所提供之調配物可含有其他另外的穩定劑。其他組分包括例如一或多種張力調節劑、一或多種抗氧化劑或其他穩定劑。
例示性胺基酸穩定劑、胺基酸衍生物或胺包括(但不限於)L-精胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸、離胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、Lys-Lys、Gly-Gly、三甲胺氧化物(TMAO)或甜菜鹼。例示性糖及多元醇包括(但不限於)甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、肌醇、蔗糖或海藻糖。例示性鹽及緩衝劑包括(但不限於)氯化鎂、硫酸鈉、Tris(諸如Tris(100mM))或苯甲酸鈉。例示性界面活性劑包括(但不限於)泊洛沙姆(poloxamer)188(例如 Pluronic®F68)、聚山梨醇酯80(PS80)、聚山梨醇酯20(PS20)。其他穩定劑包括(但不限於)透明質酸(HA)、人類血清白蛋白(HSA)、苯基丁酸、牛膽酸、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)或鋅。
舉例而言，界面活性劑可抑制PH20之聚集且使吸收損失降至最低。界面活性劑一般為非離子型界面活性劑。可包括於本文中之調配物中的界面活性劑包括(但不限於)諸如甘油或山梨糖醇之多元醇的偏及脂肪酸酯及醚、泊洛沙姆及聚山梨醇酯。舉例而言，本文中之調配物中的例示性界面活性劑包括以下任一或多者：泊洛沙姆188(PLURONICS®，諸如PLURONIC® F68)、TETRONICS®、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、PEG 400、PEG 3000、Tween®(例如Tween® 20或Tween® 80)、Triton® X-100、SPAN®、MYRJ®、BRIJ®、CREMOPHOR®、聚丙二醇或聚乙二醇。在一些實例中，本文中之調配物含有泊洛沙姆188、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80，一般為泊洛沙姆188(Pluronic®F68)。
在本文所提供之調配物中，調配物中以質量濃度(w/v)百分比(%)計之一或多種界面活性劑之總量可例如在或在約0.005%至1.0%之間，諸如在或在約0.01%至0.5%、諸如0.01%至0.1%或0.01%至0.02%之間。一般而言，調配物含有至少0.01%界面活性劑且含有低於1.0%，諸如低於0.5%或低於0.1%界面活性劑。舉例而言，本文所提供之調配物的界面活性劑含量可為或約為0.001%、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、0.025%、0.03%、0.035%、0.04%、0.045%、0.05%、0.055%、0.06%、0.065%、0.07%、0.08%或0.09%。在特定實施例中，本文所提供之調配物含有或含有約0.01%至0.05%或至約0.05%界面活性劑。
張力調節劑可包括於本文所提供之調配物中以產生具有所希望重量莫耳滲透濃度之溶液。本文所提供之調配物之重量莫耳滲透濃度在或約在245mOsm/kg至305mOsm/kg之間。舉例而言，重量莫耳滲透濃度為或為約245mOsm/kg、250mOsm/kg、255mOsm/kg、260mOsm/kg、265mOsm/kg、270mOsm/kg、275mOsm/kg、280mOsm/kg、285mOsm/kg、290mOsm/kg、295mOsm/kg、300mOsm/kg或305mOsm/kg。在一些實例中，調配物之重量莫耳滲透濃度為或為約275mOsm/kg。張力調節劑包括(但不限於)丙三醇、NaCl、胺基酸、多元醇、海藻糖及其他鹽及/或糖。特定量可憑經驗確定以保留酶活性及/或張力。
在其他情況下，調配物中包括丙三醇(甘油)。舉例而言，本文所提供之調配物典型地含有低於60mM丙三醇，諸如低於55mM、低於50mM、低於45mM、低於40mM、低於35mM、低於30mM、低於25mM、低於20mM、低於15mM、10mM或更低。丙三醇之量典型地視存在之NaCl之量而定：調配物存在之NaCl愈多，實現所希望之重量莫耳滲透濃度或容積莫耳滲透濃度需要的丙三醇愈少。因而，舉例而言，在含有較高NaCl濃度之調配物中，調配物中包括極少或無丙三醇需求。相比之下，在含有略微較低NaCl濃度之調配物中，可包括丙三醇。舉例而言，本文所提供之調配物所含丙三醇之濃度為40mM至60mM，諸如低於50mM，諸如20mM至50mM，例如為或為約50mM。
本文所提供之調配物亦可含有抗氧化劑以減少或防止氧化，尤其是PH20多肽之氧化。舉例而言，氧化可由高濃度之界面活性劑或玻尿酸寡聚物實現。例示性抗氧化劑包括(但不限於)半胱胺酸、色胺酸及甲硫胺酸。 在特定實施例中，抗氧化劑為甲硫胺酸。本文所提供之調配物可包括濃度在或約在5mM至50mM或至約50mM，諸如5mM至40mM、5mM至20mM或10mM至20mM之間的抗氧化劑。舉例而言，甲硫胺酸可以在或約在5mM至50mM或至約50mM，諸如5mM至40mM、5mM至20mM或10mM至20mM之間的濃度提供於本文中之調配物中。舉例而言，可包括濃度為或為約5mM、10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM、25mM、26mM、27mM、28mM、29mM、30mM、35mM、40mM、45mM或50mM之抗氧化劑，例如甲硫胺酸。在一些實例中，調配物含有10mM至20mM甲硫胺酸，諸如為或為約10mM或20mM甲硫胺酸。
本文所提供之調配物亦可含有胺基酸穩定劑，其有助於製劑之穩定性。穩定劑可為非極性或鹼性胺基酸。例示性非極性及鹼性胺基酸包括(但不限於)丙胺酸、組胺酸、精胺酸、離胺酸、鳥胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸及脯胺酸。舉例而言，胺基酸穩定劑為甘胺酸或脯胺酸，典型地為甘胺酸。穩定劑可為單一胺基酸，或其可為兩種或兩種以上此類胺基酸之組合。胺基酸穩定劑可為天然胺基酸、胺基酸類似物、經修飾之胺基酸或胺基酸等效物。一般而言，胺基酸為L-胺基酸。舉例而言，當脯胺酸用作穩定劑時，其一般為L-脯胺酸。亦可使用胺基酸等效物，例如脯胺酸類似物。調配物中所包括之胺基酸穩定劑(例如甘胺酸)之濃度在0.1M至1M胺基酸，典型地0.1M至0.75M，一般0.2M至0.5M範圍內，例如至少為或為約0.1M、0.15M、0.2M、0.25M、0.3M、0.35M、0.4M、0.45M、0.5M、0.6M、0.7M、0.75M或更多胺基酸。例如甘胺酸之胺基酸可呈 醫藥學上可接受之鹽的形式，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽等使用。例如甘胺酸之胺基酸的純度應為至少98%、至少99%或至少99.5%或更大。
在本文中之實例中，必要時，玻尿酸酶抑制劑包括於調配物中以穩定化PH20，尤其是減小調配物中存在的以其他方式去穩定化之試劑及條件(諸如低鹽、高pH值、存在防腐劑及升高溫度)的作用。此類組分一般不為含有如本文所提供之在此類條件下顯示增加之穩定性的經修飾之PH20多肽的醫藥組成物所需。當提供時，玻尿酸酶抑制劑至少以其平衡濃度提供。熟習此項技術者熟悉各種類別之玻尿酸酶抑制劑(參見例如Girish等人(2009)Current Medicinal Chemistry,16：2261-2288及其中所引用之參考文獻)。熟習此項技術者知道或可藉由此項技術中之標準方法確定本文中之反應或穩定組成物中玻尿酸酶抑制劑之平衡濃度。
用於本文中之組成物的一種例示性玻尿酸酶抑制劑為玻尿酸(HA)。透明質酸(HA，亦稱為玻尿酸及玻尿酸鹽)為PH20之天然受質。HA為一種廣泛分佈在結締組織、上皮及神經組織中的未硫酸化葡糖胺聚糖。其為多達25,000個雙醣單元之聚合物，該等雙醣單元本身由D-葡糖醛酸及D-N-乙醯葡萄糖胺構成。HA分子量在約5kDa至200,000kDa範圍內。任何尺寸HA可作為穩定劑用於組成物中。在一些實例中，HA為由D-葡糖醛酸及D-N-乙醯葡萄糖胺構成之雙醣。在其他實例中，HA為寡醣，諸如四醣，含有2個重複雙醣單元，或者HA可含有多個重複雙醣單元，諸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或更多個雙醣單元。在另一實例中，本文所提供之調配物中所用之HA的分子量為或為 約5kDa至5,000kDa或至約5,000kDa；為或為約5kDa至1,000kDa或至約1,000kDa；為或為約5kDa至500kDa或至約500kDa；為或為約5kDa至200kDa或至約200kDa。用於本文中之調配物中的例示性HA寡醣的分子量為或為約6.4kDa、74.0kDa或234.4kDa。調配物可含有1mg/mL至20mg/mLHA、8mg/mL至12mg/mL，諸如至少或約1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、17mg/mL、18mg/mL、19mg/mL或20mg/mL或更多HA。在一些實例中，HA與PH20之莫耳比為或為約100,000：1、95,000：1、90,000：1、85,000：1、80,000：1、75,000：1、70,000：1、65,000：1、60,000：1、55,000：1、50,000：1、45,000：1、40,000：1、35,000：1、30,000：1、25,000：1、20,000：1、15,000：1、10,000：1、5,000：1、1,000：1、900：1、800：1、700：1、600：1、500：1、400：1、300：1、200：1或100：1或更低。
在一些實例中，菸鹼化合物用作穩定化劑。菸鹼化合物包括(但不限於)菸鹼醯胺、菸鹼酸、菸酸、菸醯胺、維生素B3及/或其鹽及/或其任何組合。在特定應用中，穩定化劑可包括菸鹼化合物、胺基酸(參見例如國際公開案第WO2010149772號)。舉例而言，胺基酸可為精胺酸、麩胺酸及/或其鹽或其組合。
2. 用於其他投藥途徑之組成物
視所治療之病狀而定，本文中亦涵蓋其他投藥途徑，諸如表面應用、經皮貼片、口服及經直腸投予。
舉例而言，用於經直腸投予之醫藥劑型為全身作用之直腸栓劑、膠囊及錠劑。直腸栓劑包括用於插入直腸中之固體主體，其在體溫下熔融或軟 化，釋放一或多種藥理學上或治療學上之活性成分。用於直腸栓劑中的醫藥學上可接受之物質為基質或媒劑及升高熔點之試劑。基質之實例包括可可豆油(可可屬油)、丙三醇-明膠、卡波蠟(聚氧乙二醇)及脂肪酸之單酸甘油酯、二酸甘油酯及三酸甘油酯之適當混合物。可使用各種基質之組合。升高栓劑熔點之試劑包括鯨蠟及蠟。直腸栓劑可藉由壓縮法或藉由模製來製備。直腸栓劑之典型重量為約2至3gm。用於直腸投予之錠劑及膠囊使用相同醫藥學上可接受之物質及藉由與口服調配物相同之方法製造。適合於直腸投予之調配物可呈單位劑量栓劑形式提供。此等可藉由將活性化合物與一或多種習知固體載劑(例如可可豆油)混合且接著使所得混合物成形來製備。
為經口投予，醫藥組成物可呈例如錠劑或膠囊之形式，其藉由習知方式用諸如以下之醫藥學上可接受之賦形劑製備：黏合劑(例如預膠凝玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或二氧化矽)；崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或羥基乙酸澱粉鈉)；或潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉)。錠劑可藉由此項技術中熟知之方法包覆膜衣。
適合於頰內(舌下)投予之調配物包括例如含有活性化合物於調味基質(通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍)中之口含錠；以及含有化合物於惰性鹼基(諸如明膠與丙三醇或蔗糖與阿拉伯膠)中之片劑。
表面混合物如關於局部及全身投予所述來製備。所得混合物可為溶液、懸浮液、乳液或其類似物且調配成乳膏、凝膠、軟膏、乳液、溶液、酏劑、洗劑、懸浮液、酐劑、糊劑、泡沫、氣溶膠、沖洗劑、噴霧、栓劑、 繃帶、經皮貼片或適合於表皮投予之任何其他調配物。
化合物或其醫藥學上可接受之衍生物可調配成氣溶膠供表面應用，諸如藉由吸入(參見例如美國專利第4,044,126號、第4,414,209號及第4,364,923號，其描述用於傳遞適用於治療發炎性疾病、尤其哮喘之類固醇的氣溶膠)。用於投予呼吸道之此等調配物可呈用於噴霧器之氣溶膠或溶液形式，或呈用於吹入之微細粉末形式，單獨或與諸如乳糖之惰性載劑組合。在此類情況下，調配物粒子將典型地具有低於50微米或低於10微米之直徑。
化合物可經調配，呈凝膠、乳膏及洗劑形式用於局部或表面應用，諸如用於表面應用於皮膚及黏膜，諸如眼睛中，以及用於應用於眼睛或用於腦池內或脊柱內應用。涵蓋表面投予用於經皮傳遞以及投予眼睛或黏膜，或用於吸入療法。亦可投予單獨或與其他醫藥學上可接受之賦形劑組合的活性化合物之鼻用溶液。
提供適合於經皮投予之調配物。其可呈任何適合之格式提供，諸如適於與接受者表皮保持緊密接觸長時間之離散貼片。此類貼片含有活性化合物於相對於活性化合物例如0.1至0.2M濃度的視情況存在之緩衝水溶液中。適合於經皮投予之調配物亦可藉由離子導入療法傳遞(參見例如Tyle,P,Pharmaceutical Research 3(6)：318-326(1986))且典型地呈活性化合物之視情況緩衝水溶液的形式。
醫藥組成物亦可藉由控制釋放調配物及/或傳遞裝置投予(參見例如美國專利第3,536,809號；第3,598,123號；第3,630,200號；第3,845,770號；第3,916,899號；第4,008,719號；第4,769,027號；第5,059,595號；第5,073,543號；第5,120,548號；第5,591,767號；第5,639,476號；第5,674,533號及第 5,733,566號)。
3. 劑量及投藥
本文所提供之經修飾之PH20多肽可調配為醫藥組成物供單劑或多劑投予。PH20多肽之含量足以發揮治療學上適用之作用且對所治療之患者無不合需要之副作用。治療學上有效之濃度可藉由在已知之試管內及活體內系統中測試多肽，諸如藉由使用本文所提供或此項技術中已知之分析憑經驗確定(參見例如Taliani等人(1996)Anal.Biochem.,240：60-67；Filocamo等人(1997)J Virology,71：1417-1427；Sudo等人(1996)Antiviral Res.32：9-18；Bouffard等人(1995)Virology,209：52-59；Bianchi等人(1996)Anal.Biochem.,237：239-244；Hamatake等人(1996)Intervirology 39：249-258；Steinkuhler等人(1998)Biochem.,37：8899-8905；D'Souza等人(1995)J Gen.Virol.,76：1729-1736；Takeshita等人(1997)Anal.Biochem.,247：242-246；亦參見例如Shimizu等人(1994)J.Virol.68：8406-8408；Mizutani等人(1996)J.Virol.70：7219-7223；Mizutani等人(1996)Biochem.Biophys.Res.Commun.,227：822-826；Lu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci(USA),93：1412-1417；Hahm等人，(1996)Virology,226：318-326；Ito等人(1996)J.Gen.Virol.,77：1043-1054；Mizutani等人(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.,212：906-911；Cho等人(1997)J.Virol.Meth.65：201-207)且接著自其推斷人類劑量。
待投予用於治療疾病或病狀之經修飾之PH20的量可藉由標準臨床技術確定。此外，試管內分析及動物模型可用於幫助鑑別最佳劑量範圍。可憑經驗確定之精確劑量可視特定酶、投藥途徑、待治療之疾病類型及疾病 嚴重性而定。
因此，應瞭解治療之精確劑量及持續時間隨所治療疾病而變，且可使用已知之測試方案憑經驗確定，或藉由自活體內或試管內測試數據推斷來確定。應注意，濃度及劑量值亦可隨待緩解之病狀的嚴重性變化。應進一步瞭解，對於任何特定個體，應根據個別需求及投予組成物或監督組成物投予之個人的專業判斷來隨時間調節特定的劑量方案，且本文中闡述之濃度範圍僅僅為例示性的且並不意欲限制組成物及含有其之組合的範疇或用途。組成物可每小時、每週、每月、每年或一次性投予。一般而言，劑量方案經選擇以限制毒性。應注意，主治醫師將知道歸因於毒性或骨髓、肝或腎臟或其他組織功能障礙而如何及何時終止、中斷或調整治療至較低劑量。相反地，主治醫師亦將知道在臨床反應不夠的情況下如何及何時調整治療至較高含量(避免毒性副作用)。
典型地，在穩定化溶液或懸浮液或凍乾形式中，經修飾之PH20酶之治療學上有效劑量為或為約10單位(U)至500,000單位、100單位至100,000單位、500單位至50,000單位、1000單位至10,000單位、5000單位至7500單位、5000單位至50,000單位或1,000單位至10,000單位，一般1,000至50,000單位。舉例而言，PH20多肽可以至少或約至少或為10U、20U、30U、40U、50U、100U、150U、200U、250U、300U、350U、400U、450U、500U、600U、700U、800U、900U、1000U、2,000U、3,000U、4,000U、5,000U或更大之劑量投予。調配物可以單位劑型提供，諸如(但不限於)安瓿、注射器及個別包裝之錠劑或膠囊。
PH20酶可單獨投予，或與其他藥理學上有效之藥劑或治療劑一起投 予，總體積為0.1-100mL、1-50mL、10-50mL、10-30mL、1-20mL或1-10mL，典型地10-50mL。典型地，含PH20組成物之注射或輸注量為至少或至少約0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL或更大。本文所提供之調配物的之經修飾之PH20多肽之含量介於或約介於30U(單位)/mL至3000U/mL、300U/mL至2000U/mL或600U/mL至2000U/mL或600U/mL至1000U/mL，諸如至少或約至少30U/mL、35U/mL、40U/mL、50U/mL、100U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、700U/mL、800U/mL、900U/mL、1000U/mL、2000U/mL或3000U/mL之間。舉例而言，本文所提供之調配物的PH20含量為至少100U/mL至1000U/mL，例如至少或約至少或約為或為600U/mL。
PH20多肽可以至少或約為或為100U/mL、150U/mL、200U/mL、300U/mL、400U/mL、500U/mL、600U/mL、800U/mL或1000U/mL之量呈溶液形式提供，或可例如以至少或約為或為2000U/mL、3000U/mL、4000U/mL、5000U/mL、8000U/mL、10,000U/mL或20,000U/mL之量呈更濃形式提供，供直接使用或在使用之前稀釋至有效濃度。PH20多肽組成物可呈液體或凍乾調配物形式提供。
當PH20與治療劑共同調配時，劑量可呈PH20多肽之量與投予治療劑之量的比率提供。舉例而言，PH20多肽可以1個玻尿酸酶單位/治療劑單位(1：1)至50：1或更大投予，例如為或為約1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、11：1、12：1、13：1、14：1、15：1、20：1、25：1、30：1、35：1、40：1、45：1、50：1或更大。
本文所提供之調配物，包括共調配物及/或穩定調配物，可製備用於單劑投予、多劑投予或持續輸注投予。本文中亦涵蓋植入緩慢釋放或持續釋放系統，以便維持恆定劑量(參見例如美國專利第3,710,795號)。
舉例而言，提供醫藥學上及治療學上之活性化合物及其衍生物的調配物用於以單位劑型或多個劑型投予人類及動物。舉例而言，化合物可調配成含有適合量之化合物或其醫藥學上可接受之衍生物的錠劑、膠囊、丸劑、散劑、顆粒、無菌非經腸溶液或懸浮液、口服溶液或懸浮液或油-水乳液。每一單位劑量含有足以產生所希望治療作用之預定量的治療學上之活性化合物，與所需的醫藥載劑、媒劑或稀釋劑結合。單位劑型之實例包括安瓿及注射器及個別包裝之錠劑或膠囊。單位劑型可以其分數或倍數投予。多個劑型為包裝在單一容器中之複數個一致單位劑型，待以分開之單位劑型投予。多個劑型之實例包括小瓶、錠劑或膠囊之瓶子或品脫或加侖之瓶子。因此，多個劑型為在包裝中未分離之多個單位劑量。一般而言，可製備含有在0.005%至100%範圍內之活性成分且其餘部分由無毒載劑構成的劑型或組成物。
本文所提供之組成物典型地經調配用於藉由皮下途徑投予，不過涵蓋其他投藥途徑，諸如熟習此項技術者已知之任何途徑，包括肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮內、病灶內、腹膜內注射、硬膜外、經陰道、經直腸、局部、經耳、經皮投予或任何投藥途徑。適於此類途徑之調配物為熟習此項技術者已知。投予可為局部、表面或全身的，視治療位置而定。局部投予需要治療之區域可藉由例如(但不限於)在手術期間局部輸注、表面塗覆(例如在手術後與傷口敷料結合)、藉由注射、藉助於導管、藉助於栓劑或 藉助於植入物實現。組成物亦可與其他生物活性劑一起連續、間歇或於相同組成物中投予。
在任何既定情況下的最適合途徑視多種因素而定，諸如疾病性質、個體對特定投藥途徑之耐受性、疾病嚴重性及所用特定組成物。典型地，本文所提供之組成物非經腸投予。在一些實例中，投予經修飾之PH20多肽組成物，使得其達至皮膚或組織之間質，由此降解胞間隙供治療劑之後續傳遞。因而，在一些實例中，涵蓋直接投予在皮膚下，諸如藉由皮下投予方法。因而，在一個實例中，局部投予可藉由諸如自注射器或含有注射裝置(諸如針)之其他製品注射來實現。在另一實例中，局部投予可藉由輸注來實現，輸注可藉由使用泵或其他類似裝置來推動。亦涵蓋其他投藥模式。舉例而言，經修飾之PH20多肽，包括半衰期延長之結合形式，諸如其聚乙二醇化形式，可經靜脈內投予。醫藥組成物可調配成適合於每一投藥途徑之劑型。
投藥方法可用以減少所選擇之經修飾之PH20多肽對諸如蛋白降解及經由抗原及免疫原性反應之免疫干預的降解過程的暴露。此類方法之實例包括在治療部位局部投予。治療劑之聚乙二醇化增加對蛋白分解之抗性、延長血漿半衰期且降低抗原性及免疫原性。聚乙二醇化方法之實例為此項技術中已知(參見例如Lu及Felix,Int.J.Peptide Protein Res.,43：127-138,1994；Lu及Felix,Peptide Res.,6：140-6,1993；Felix等人，Int.J.Peptide Res.,46：253-64,1995；Benhar等人，J.Biol.Chem.,269：13398-404,1994；Brumeanu等人，J Immunol.,154：3088-95,1995；亦參見Caliceti等人(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55(10)：1261-77及Molineux(2003)Pharmacotherapy 23(8 Pt 2)：3S-8S)。聚 乙二醇化亦可用於在活體內傳遞核酸分子。舉例而言，腺病毒之聚乙二醇化可提高穩定性及基因轉移(參見例如Cheng等人(2003)Pharm.Res.20(9)：1444-51)。
各種其他傳遞系統為已知的且可用以投予所選擇之PH20多肽，諸如(但不限於)囊封於脂質體中、微米粒子、微膠囊、能夠表現化合物之重組細胞、參與內吞作用之受體及傳遞編碼所選擇之PH20多肽之核酸分子(諸如反轉錄病毒傳遞系統)。
因此，在某些具體實例中，脂質體及/或奈米粒子亦可用於可溶性PH20多肽之投予。脂質體由磷脂形成，磷脂分散在含水介質中且自發形成多層同心雙層微脂粒(亦稱為多層微脂粒(MLV))。MLV一般具有25nm至4μm之直徑。MLV之音波處理引起直徑在200至500埃範圍內且在核心含有水溶液之之單層小微脂粒(SUV)的形成。
磷脂在分散於水中時可形成多種除脂質體以外之結構，視脂質與水之莫耳比而定。在低比率之脂質與水下，形成脂質體。脂質體之物理特性視pH值、離子強度及二價陽離子之存在而定。脂質體可展示對離子及極性物質之低滲透性，但在升高溫度下，進行相變，顯著改變其滲透性。相變包含自緊密填充之有序結構(稱為凝膠狀態)變成鬆散填充之不太有序結構(稱為流體狀態)。此在特徵性相變溫度下發生且引起對離子、糖及藥物之滲透性增加。
脂質體與細胞經由不同機制相互作用：藉由網狀內皮系統之吞噬細胞(諸如巨噬細胞及嗜中性白血球)的內吞作用；藉由非特定的弱疏水力或靜電力，或藉由與細胞表面組分特定的相互作用，吸收至細胞表面；藉由脂 質體之脂質雙層插入質膜中，與漿細胞膜融合，同時釋放脂質體內含物至細胞質；以及藉由輸送脂質體脂質至細胞或亞細胞膜或反之亦然，與脂質體內含物無任何結合。變化脂質體調配物可改變哪一機制起作用，不過一種以上可同時起作用。奈米膠囊可一般以穩定及可複製方式裹住化合物。為避免由細胞內聚合物過載引起之副作用，此類超細粒子(尺寸為約0.1μm)應使用能夠在活體內降解之聚合物設計。涵蓋滿足此等需求之可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯奈米粒子用於本文中，且此類粒子可容易製得。
4. 與治療劑之組合及共調配物
含有經修飾之PH20多肽的醫藥組成物可與另一治療劑共同投予。在此等實例中，經修飾之PH20多肽可分開調配成醫藥組成物，且在含有活性治療劑之第二組成物之前、與其同時、與其間歇性地或在其之後投予。在其他實例中，經修飾之PH20多肽可與其他治療劑之醫藥調配物共同調配。
詳言之，本文提供含有如本文所述之經修飾之PH20多肽及如下治療劑的共調配物：化學治療劑、鎮痛劑、消炎劑、抗微生物劑、殺阿米巴蟲劑、殺滴蟲劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗驚厥劑、抗抑鬱劑及抗關節炎劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、解熱劑、抗寄生蟲劑、抗組織胺劑、α-腎上腺素促效劑、α阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴張劑、殺生物劑、殺菌劑、抑菌劑、β腎上腺素阻斷劑、鈣通道阻斷劑、心臟血管藥、避孕劑、解充血劑、利尿劑、抑鬱劑、診斷劑、電解質劑、催眠劑、激素藥劑、高血糖劑、肌肉鬆弛劑、肌肉收縮劑、眼用藥劑、擬副交感神經劑、精神強奮劑、鎮靜劑、擬交感神經劑、安神劑、泌尿劑、陰道用劑、殺病毒劑、維生素劑、非類固醇消炎劑、血管收縮素轉化酶抑制劑、多肽、蛋白質、核酸、藥物、有 機分子或睡眠誘導劑。舉例而言，本文所提供之經修飾之PH20多肽可與諸如單株抗體之抗體、免疫球蛋白、抗生素、雙膦酸鹽、細胞介素、化學治療劑、凝血因子或胰島素共同調配。可與經修飾之PH20多肽共同調配的例示性治療劑在部分H中描述。
5. 包裝、製品及套組
經修飾之PH20多肽或編碼此類多肽之核酸或其衍生物或變異體的醫藥化合物可包裝成含有包裝材料、有效治療疾病或病症之醫藥組成物及指示醫藥組成物或治療分子將用於治療疾病或病症之標記的製品。所選擇之經修飾之PH20多肽或其衍生物或變異體與治療劑的組合亦可包裝在製品中。典型地，經修飾之PH20多肽包裝成用於非冷凍儲存醫藥組成物之系統。
本文所提供之製品含有包裝材料。用於包裝醫藥產品之包裝材料為熟習此項技術者所熟知。參見例如美國專利第5,323,907號、第5,052,558號及第5,033,252號，每一者全文併入本文中。醫藥包裝材料之實例包括(但不限於)泡殼包裝、瓶子、套管、吸入器、泵、袋子、小瓶、容器、注射器、瓶子及適合於所選擇之調配物及預期投藥及治療模式的任何包裝材料。詳言之，容器或其他材料一般為適合於無冷凍儲存之材料，例如為注射器、套管、瓶、袋子或小瓶。製品可包括針或其他注射裝置以便促進投予(例如表皮下投予)以達成注射目的。包裝選擇視PH20及/或治療劑及此類組成物將一起包裝還是分開包裝而定。在一個實例中，PH20可包裝成與治療劑之混合物。在另一實例中，組分可包裝成分開組成物。
經修飾之PH20多肽、治療劑及/或其製品亦可呈套組形式提供。套組可包括本文中所描述之醫藥組成物及呈製品形式提供之用於投予之物品。 舉例而言，PH20多肽可提供有用於投藥之裝置，諸如注射器、吸入器、劑量杯、滴管或塗覆器。組成物可含於用於投藥之物品中，或可分開提供以在後面添加。套組可視情況包括關於應用之說明書，包括劑量、給藥方案及投藥模式說明。套組亦可包括本文中所描述之醫藥組成物及用於診斷之物品。舉例而言，此類套組可包括用於量測個體中所選擇之蛋白酶之濃度、量或活性的物品。
G. 評估PH20活性及穩定性之方法
分析可用以評估本文所提供之PH20多肽的穩定性及活性。該等分析可用以評估PH20多肽在熱應力條件下，包括在各種溫度下及/或隨時間之玻尿酸酶活性。亦可採用其他評估穩定性之分析，諸如評估可溶性、聚集體形成、結晶、氧化及熟習此項技術者知曉之其他特性的分析。
1. 玻尿酸酶活性
經修飾之PH20多肽之活性可使用此項技術中熟知之方法評估。舉例而言，玻尿酸酶USP XXII分析藉由量測在使酶與HA在37℃下反應30分鐘之後剩餘的未降解之透明質酸或玻尿酸(HA)受質之量，間接測定活性(USP XXII-NF XVII(1990)644-645 United States Pharmacopeia Convention公司，Rockville,MD)。玻尿酸酶參考標準(USP)或官定處方書(NF)標準玻尿酸酶溶液可用於分析中以確定以單位計之任何玻尿酸酶之活性。在一個實例中，使用微濁度分析量測活性。此是基於當玻尿酸與使其沈澱之試劑(諸如酸化血清或氯化十六烷基吡錠(CPC))結合時不溶沈澱之形成。活性藉由將玻尿酸酶與玻尿酸鈉(透明質酸)一起培育設定時段(例如10分鐘)且接著在添加酸化血清或CPC下使未消化之玻尿酸鈉沈澱來量測。在另外 的顯色期之後所得樣品之濁度在640nm下量測。由玻尿酸酶對玻尿酸鈉受質之活性引起的濁度降低為玻尿酸酶之酶活性的量度。
在另一實例中，玻尿酸酶活性可使用微量滴定分析量測，其中殘餘生物素標記之透明質酸在與玻尿酸酶一起培育之後量測(參見例如Frost及Stern(1997)Anal.Biochem.251：263-269，美國專利公開案第20050260186號)。透明質酸之葡糖醛酸殘基上的自由羧基經生物素標記，且生物素標記之透明質酸受質共價偶合於微量滴定盤。在與玻尿酸酶一起培育之後，使用抗生素蛋白-過氧化酶反應偵測殘餘生物素標記之透明質酸受質，且與在與具有已知活性之玻尿酸酶標準品的反應之後的所得值相比。
量測玻尿酸酶活性之其他分析亦為此項技術中已知且可用於本文中之方法中(參見例如Delpech等人，(1995)Anal.Biochem.229：35-41；Takahashi等人，(2003)Anal.Biochem.322：257-263)。
許多玻尿酸酶分析已基於新還原性N-乙醯胺基之產生(Bonner及Cantey,Clin.Chim.Acta 13：746-752,1966)或黏度損失(De Salegui等人，Arch.Biochem.Biophys.121：548-554,1967)或濁度(Dorfman及Ott,J.Biol.Chem.172：367,1948)的量測。使用經純化之受質，所有此等方法均能夠測定糖類內切酶活性之存在或不存在。
實質上純化之葡糖胺聚糖受質亦可用於凝膠變動分析中。將葡糖胺聚糖與待測試糖類內切酶活性之重組PH20(諸如可溶性PH20)混合，該糖類內切酶活性引起凝膠內受質遷移率之變動。此類受質之實例包括(但不限於)硫酸軟骨素-4及6、硫酸皮膚素、硫酸乙醯肝素，其可自Sigma Chemical獲得。人類臍帶玻尿酸可自ICN獲得。舉例而言，每一測試受質可稀釋至 在pH 3.5-7.5之緩衝範圍內0.1mg/ml或約0.1mg/ml。在此類例示性分析中，經純化之可溶性PH20或來自表現PH20之細胞之條件培養基的10μl或約10μl樣品可與90μl或約90μl測試受質在所希望的緩衝液中混合且在37℃下培育3小時。培育之後，樣品用樣品緩衝液(Tris EDTA pH 8.0、溴酚藍及甘油)中和，接著電泳。葡糖胺聚糖可使用此項技術中已知之任何方法偵測，舉例而言，葡糖胺聚糖可藉由使用含0.5%愛爾斯藍(Alcian Blue)之3%冰醋酸將凝膠染色隔夜，接著在7%冰醋酸中褪色來偵測。降解藉由比較在存在及不存在酶下受質遷移率來確定。
玻尿酸酶活性亦可藉由受質凝膠酶譜法來偵測(Guentenhoner等人(1992)Matrix 12：388-396)。在此分析中，樣品施加至含有透明質酸之SDS-PAGE凝膠且藉由電泳分開樣品中之蛋白質。隨後在酶分析緩衝液中培育凝膠且隨後染色以偵測凝膠中之透明質酸。目測玻尿酸酶活性為受質凝膠中之清除區域。
亦可評估包括本文所提供之經修飾之PH20多肽的PH20多肽充當擴散或散佈劑之能力。舉例而言，錐蟲藍染料可在具有或不具有PH20多肽下皮下注射至裸鼠每一側邊上之側向皮膚中。隨後諸如用微型卡尺量測染料面積，以測定PH20多肽充當擴散劑之能力(美國專利公開案第20060104968號)。
PH20多肽之功能活性可使用此等分析中之任一者，相對於參考標準比較及/或正規化。可進行此以確定PH20多肽之功能上等效量為多少。舉例而言，PH20多肽充當擴散或散佈劑之能力可藉由用錐蟲藍將其注射至小鼠側向皮膚來評估，且可確定實現相同量之散佈(例如100單位玻尿酸酶參 考標準)所需的量。因此，所需的PH20多肽之量在功能上等效於100個玻尿酸酶單位。
2. 熱穩定性
蛋白質穩定性可藉由量測作為時間函數之蛋白質活性來確定。蛋白質之展開溫度(Tm)可用作蛋白質之溶液穩定性及活體內穩定性的標記物。特定蛋白質之展開溫度是指使蛋白質喪失其二級結構及典型地其活性之溫度，且可使用熟習此項技術者已知之方法，諸如差示掃描熱量測定來確定。
舉例而言，熱穩定性可使用此項技術中已知之多種非限制性生物物理學或生物化學技術分析。在特定實例中，熱穩定性藉由分析光譜法評估。一種例示性分析光譜法為差示掃描熱量測定(DSC)。DSC採用量熱計，其對伴隨大部分蛋白質或蛋白質結構域展開之吸熱度敏感(參見例如Sanchez-Ruiz等人，Biochemistry,27：1648-52,1988)。為測定蛋白質之熱穩定性，將蛋白質樣品插入量熱計中且溫度升高，直至蛋白質展開。使蛋白質展開之溫度指示整體蛋白質穩定性。
另一種例示性分析光譜法為圓二色性(CD)光譜法。CD光譜法量測組成物之光學活性隨溫度增加的變化。圓二色性(CD)光譜法量測由於結構不對稱性而出現的左旋偏振光對比右旋偏振光的吸收差異。無序或展開結構產生極不同於有序或摺疊結構的CD光譜。CD光譜反映蛋白質對增加溫度之變性作用的敏感性且因此指示蛋白質之熱穩定性(參見例如van Mierlo及Steemsma,J.Biotechnol.,79(3)：281-98,2000)。
另一種用於量測熱穩定性之例示性分析光譜法為螢光發射光譜法(參見van Mierlo及Steemsma，上文)。又一種用於量測熱穩定性之例示性分析 光譜法為核磁共振(NMR)光譜法(參見例如Mierlo及Steemsma，上文)。
在某些具體實例中，熱穩定性藉由使用以上技術中之任一者(例如分析光譜學技術)量測多肽組成物之熔融溫度(Tm)來評估。熔融溫度為熱轉化曲線中點的溫度，其中50%之組成物分子呈摺疊狀態。在一個實例中，PH20多肽(諸如經修飾之PH20多肽)之熔融溫度可藉由在各種條件(例如隨時間之各種溫度)下利用動態光散射量測粒子之流體動力學半徑來測定。粒度增加及熔融溫度降低指示玻尿酸酶變性及隨後聚集。
在其他實施例中，可在生物化學上量測熱穩定性。一種用於評估熱穩定性之例示性生物化學方法為熱攻擊分析。在「熱攻擊分析」中，「多肽」經受一系列升高溫度，歷時設定時段。舉例而言，在一個具體實例中，測試多肽經受一系列增加溫度，例如歷時10分鐘。隨後藉由相關生物化學分析(例如玻尿酸酶分析)來分析蛋白質活性。熱攻擊分析可用以測定使50%玻尿酸酶活性得以保留之溫度(亦即TC值或T50)。Tc或T50值無需等效於生物物理學來源之Tm值。此類分析可以高通過量格式進行。舉例而言，經修飾之降解玻尿酸之酶(例如經修飾之PH20多肽)的文庫可使用此項技術中已知之方法產生。經修飾之多肽可經受熱攻擊。可對經攻擊之測試樣品分析玻尿酸酶活性且穩定之樣品可按比例擴大且進一步特性化。
3. 分析穩定性之其他分析
本文所提供之PH20多肽的穩定性亦可使用此項技術中已知之其他方法及分析，諸如評估純度、回收、結晶或聚集之分析來評估。舉例而言，除基於玻尿酸酶活性評估穩定性之外，可藉由目測、回收百分比、蛋白質純度及表觀熔融溫度來評估穩定性。
舉例而言，蛋白質純度可藉由逆相高效液相層析法(RP-HPLC)量測。如藉由RP-HPLC測定，蛋白質純度為與所有存在之蛋白質物質相比，存在之主要PH20蛋白質峰之百分比。因而，RP-HPLC及熟習此項技術者已知之類似方法可評估酶之降解。蛋白質純度可隨時間評估。回收百分比亦可確定為與在熱中性條件(例如4℃，10分鐘)下參考樣品或相同多肽相比，在熱應力條件(例如52℃，10分鐘)下多肽之相對百分比。PH20多肽穩定性亦可藉由用RP-HPLC量測玻尿酸酶之氧化來測定。氧化百分比為主要(ox-1)與次要(ox-2)峰之峰面積總和的量度。
可用以測定本文所提供之共調配物中玻尿酸酶之穩定性的熟習此項技術者已知之其他方法包括聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)、免疫墨點法、核磁共振(NMR)光譜法、質譜分析、圓二色性(CD)及基於染料之螢光分析。
4. 可溶性
PH20多肽之可溶性可藉由熟習此項技術者已知之任何方法測定。一種用於測定可溶性之方法為清潔劑分配。舉例而言，可溶性PH20多肽可例如藉由在37℃下其分配至Triton® X-114溶液之水相而區分(Bordier等人，(1981)J.Biol.Chem.,256：1604-1607)。膜錨定之多肽(諸如脂質錨定之玻尿酸酶，包括GPI錨定之玻尿酸酶)將分配至富含清潔劑之相中，但在用磷脂酶C處理之後將分配至清潔劑貧乏之相或水相。磷脂酶C為使GPI錨定之蛋白質中存在之磷醯基-甘油鍵裂解的酶。用PLC處理將引起GPI連接之蛋白質自外部細胞膜釋放。
5. 藥效學/藥物動力學
單獨或與另一治療劑組合之PH20多肽(諸如經修飾之PH20多肽)的藥物動力學及藥效學特性亦可在活體內使用動物模型及/或人類個體，諸如在臨床試驗環境中評估。藥物動力學或藥效學研究可使用動物模型進行或可在研究期間用投予PH20多肽或經修飾之PH20多肽之患者進行。
動物模型包括(但不限於)小鼠、大鼠、兔、狗、天竺鼠及非人類靈長類動物模型，諸如食蟹獼猴或恆河猴。在一些情況下，藥物動力學或藥效學研究使用健康動物進行。在其他實例中，研究使用考慮用玻尿酸治療之疾病的動物模型進行，諸如任何玻尿酸相關之疾病的動物模型，例如腫瘤模型。
PH20多肽(諸如經修飾之PH20多肽)之藥物動力學特性可藉由量測投予之後諸如以下之參數來評估：最大(峰值)濃度(Cmax)、峰值時間(亦即當出現最大濃度時；Tmax)、最小濃度(亦即劑量之間的最小濃度；Cmin)、消除半衰期(T1/2)及曲線下面積(亦即藉由繪製時間與濃度曲線所產生之曲線下面積；AUC)。玻尿酸酶之絕對生體可用率可藉由將皮下傳遞之後的玻尿酸酶之曲線下面積(AUCsc)與靜脈內傳遞之後的玻尿酸酶之AUC(AUCiv)比較來測定。絕對生體可用率(F)可使用下式計算：F=([AUC]sc×劑量sc)/([AUC]iv×劑量iv)。在藥物動力學研究中可投予一系列劑量及不同給藥頻率，以評估劑量中增加或降低諸如經修飾之PH20多肽之酶之濃度的影響。
H. 治療方法及組合療法
本文提供本文所提供之任何經修飾之PH20多肽的方法及用途，該等多肽基於其能夠降解諸如玻尿酸之葡糖胺聚糖而顯示玻尿酸酶活性。歸因於 此活性，經修飾之PH20多肽可用作擴散因子以增加皮下投予之治療劑的傳遞及/或生體可用率。包括(但不限於)肽、蛋白質、小分子藥物、核酸或病毒之任何治療劑的傳遞可藉由與本文所提供之經修飾之PH20多肽共同投予來促進或增強。舉例而言，經修飾之PH20多肽可用以增加諸如抗體(例如單株抗體)、細胞介素、免疫球蛋白、胰島素或凝血因子之治療劑傳遞至所希望的位置，諸如藉由增加化學治療劑穿透至實體腫瘤中。經修飾之PH20多肽亦可用以治療特性在於玻尿酸過量或累積之玻尿酸疾病或病症。舉例而言，本文所提供之經修飾之PH20多肽可用於治療腫瘤；用於治療大腦中之葡糖胺聚糖累積；用於治療心血管病症；用於治療眼科病症；用於治療肺病；用於治療脂肪團；及/或用於治療增生性病症。
經修飾之PH20多肽之其他方法及用途包括熟習此項技術者已知之任何方法及用途。舉例而言，已製備PH20玻尿酸酶之各種形式且批准用於人類中之治療用途。舉例而言，動物來源之玻尿酸酶製劑包括Vitrase®(ISTA Pharmaceuticals)、經純化之綿羊睾丸玻尿酸酶及Amphadase®(Amphastar Pharmaceuticals)、牛類睾丸玻尿酸酶。Hylenex®(Halozyme Therapeutics)為一種人類重組玻尿酸酶，其藉由經基因工程改造的含有編碼可溶性rHuPH20之核酸的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞產生(參見例如美國專利第7,767,429號)。玻尿酸酶經批准之治療用途包括用作佐劑以增加皮下灌注之其他治療劑之吸收及分散(皮下流體投予)及用作皮下尿路造影中之佐劑以提高造影劑之吸收的用途。除此等指示之外，玻尿酸酶可用作用於治療其他疾病及病狀之治療劑或美容劑。舉例而言，玻尿酸酶常用於例如眼科手術之前局部麻醉中之球周阻斷。該酶之存在防止另外阻斷之需求且減短至運動不 能(眼睛無法移動)發作之時間。球周及眼球筋膜囊下阻斷為玻尿酸酶用於眼科程序之最常見應用。玻尿酸酶亦可促進諸如眼瞼成形術及面部提昇之美容手術中之運動不能。應瞭解，本文所提供之經修飾之PH20玻尿酸酶可用於使用PH20玻尿酸酶之任何治療方法或組合療法中(參見例如美國公開案第US20040268425號；第US20050260186號；第US20060104968號；以及美國申請案第12/381,844號，以美國公開案第US20100074885號公開；美國申請案第12/386,249號，以美國公開案第US20090311237號公開；美國申請案第12/387,225號，以美國公開案第US20090304665號公開；以及美國申請案第12/386,222號，以美國公開案第US2010003238號公開，每一者以全文引用之方式併入)。
例示性的非限制性方法及用途在以下子部分中描述。
1. 傳遞治療劑之方法
如上所述，玻尿酸酶為一種經由使透明質酸水解來改善結締組織之滲透性的擴散或散佈物質，透明質酸為一種在結締組織及某些專門組織(諸如臍帶及玻璃狀液)之細胞間基質中發現的多醣。當不存在擴散因子時，諸如藥物、蛋白質、肽及核酸之皮下注射材料擴散非常緩慢。然而，與玻尿酸酶共同注射可引起迅速擴散。散佈速率與酶量成比例，且散佈程度與溶液體積成比例。
本文所提供之任何經修飾之PH20多肽可用以促進或增強藥劑及分子傳遞至活體內多種哺乳動物組織中之任一者。其可用以促進小分子藥理劑以及較大分子藥理劑(諸如蛋白質、核酸及核糖核酸)及可含有包括(但不限於)核酸、蛋白質、碳水化合物、脂質、基於脂質之分子及藥物之組 合的大分子組成物的散佈及因此促進其傳遞(參見例如美國公開案第US20040268425號；第US20050260186號；以及第US20060104968號)。任何經修飾之PH20多肽可與治療劑一起共同投予及/或共同調配以提高共同調配或共同投予之藥劑的生體可用率以及藥物動力學(PK)及/或藥效學(PD)特性。可藉由共同投予治療劑與可溶性PH20(諸如本文所提供之經修飾之PH20)提高的PK/PD參數包括諸如以下之量度：Cmax(在吸收之後例如在例如血流中實現之藥劑之最大濃度)、Tmax(實現最大濃度所需的時間)、T1/2(濃度降一半所需的時間)、Cmin(代謝及排泄之後藥劑之最小濃度)、AUC(濃度對比時間之曲線下面積，為生體可用率之整體量的量度)、所關注各種組織中之濃度(包括例如實現所希望濃度之速率、整體含量及維持所希望含量之持續時間)及Emax(實現之最大作用)。
因而，本文所提供之治療方法包括組合療法，其中任何經修飾之PH20多肽與治療劑共同投予，用於治療治療劑所治療之疾病或病症。改善及或以其他方式減輕疾病或病狀之嚴重性的任何治療劑可與本文所提供之經修飾之PH20多肽組合以提高此類治療劑之生體可用率。詳言之，本文所提供之經修飾之PH20多肽可用於參見例如以下申請案中描述之每一及所有組合中：美國公開案第US20040268425號；第US20050260186號；第US20060104968號；及美國申請案第12/381,844號，以美國公開案第US20100074885號公開；美國申請案第12/386,249號，以美國公開案第US20090311237號公開；美國申請案第12/387,225號，以美國公開案第US20090304665號公開；以及美國申請案第12/386,222號，以美國公開案第US2010003238號公開，代替所揭示之玻尿酸酶或玻尿酸酶降解酶。
經修飾之PH20多肽可在治療劑製劑之前、在其之後、與其間歇地或與其同時投予。一般而言，經修飾之PH20多肽在治療劑製劑投予之前或與其同時投予，以允許PH20降解胞間隙中之透明質酸。PH20可投予與治療分子投予部位不同之部位，或可溶性PH20可投予與治療分子投予部位相同之部位。
可與玻尿酸酶一起投予之醫藥、治療及美容藥劑及分子之實例包括(但不限於)化學治療劑或抗癌劑、鎮痛劑、抗生素藥、消炎劑、抗微生物劑、殺阿米巴蟲劑、殺滴蟲劑、抗帕金森劑、抗瘧疾劑、抗驚厥劑、抗抑鬱劑、抗關節炎劑、抗真菌劑、抗高血壓劑、解熱劑、抗寄生蟲劑、抗組織胺劑、α-腎上腺素促效劑、α阻斷劑、麻醉劑、支氣管擴張劑、殺生物劑、殺菌劑、抑菌劑、β腎上腺素阻斷劑、鈣通道阻斷劑、心臟血管藥、避孕劑、美容或美化劑、解充血劑、利尿劑、抑鬱劑、診斷劑、電解質劑、催眠劑、激素藥劑、高血糖劑、肌肉鬆弛劑、肌肉收縮劑、眼用藥劑、擬副交感神經劑、精神強奮劑、鎮靜劑、睡眠誘導劑、擬交感神經劑、安神劑、泌尿劑、陰道用劑、殺病毒劑、維生素劑、非類固醇消炎劑或血管收縮素轉化酶抑制劑及其任何組合。詳言之，治療劑包括抗體(包括單株抗體)、雙膦酸鹽、胰島素、凝血因子、細胞介素及免疫球蛋白。
舉例而言，本文所提供之經修飾之PH20多肽可用以增加化學治療劑之傳遞。玻尿酸酶亦已用於增強化學治療劑之活性及/或腫瘤為化學治療劑之可接近性(Schuller等人，1991,Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.32：173，摘要號1034；Czejka等人，1990,Pharmazie 45：H.9；Baumgartner等人(1988)Reg.Cancer Treat.1：55-58；Zanker等人(1986)Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.27：390)。化 學療法與玻尿酸酶組合有效治療多種癌症，包括泌尿膀胱癌(Horn等人，1985,J.Surg.Oncol.28：304-307)、鱗狀細胞癌(Kohno等人，94,J.Cancer Res.Oncol.120：293-297)、乳癌(Beckenlehner等人，1992,J.Cancer Res.Oncol.118：591-596)及腸胃癌症(Scheithauer等人，1988,Anticancer Res.8：391-396)、前列腺癌、胰臟癌及其他癌症。在此實例中，經修飾之PH20玻尿酸酶增強化學治療劑或其他抗癌劑穿透至實體腫瘤中，由此治療疾病。
含有可溶性PH20之組成物可與抗癌劑一起在瘤內注射或針對播散性癌症或難以達到之腫瘤經靜脈內注射。抗癌劑可為化學治療劑、抗體、肽或基因治療載體、病毒或DNA。此外，在已獲得多重抗藥性之先前化療難治性腫瘤中，玻尿酸酶可用以將腫瘤細胞募集至循環庫(cycling pool)進行敏化(St Croix等人，(1998)Cancer Lett 9月131(1)：35-44)。
在本文所提供之經修飾之PH20多肽投予之後、與其一致或在其之前投予的例示性抗癌劑包括(但不限於)阿西維辛；阿克拉黴素；阿考達唑；阿克羅寧；阿多來新；阿地介白素；阿侖單抗；亞利崔托寧(9-順-視黃酸)；安樂普利諾；六甲蜜胺；阿昔迪布；安巴腙；安波黴素；阿美蒽醌；阿米福汀；胺格魯米特；安吖啶；阿那曲唑；阿那昔酮；安西他濱；安麯黴素；阿帕茲酮；精美司鈉；三氧化二砷；天冬醯胺酶；曲林菌素；阿莫司汀；阿紮胞苷；阿紮替派；阿佐黴素；巴諾蒽醌；巴他布林；巴馬司他；活BCG；貝那昔濱；苯達莫司汀；苯佐替派；貝瑟羅汀；貝伐單抗；比卡魯胺；比他舍平；比立考達；比生群；二甲磺酸雙奈法德；比折來新；博萊黴素；硼替佐米；布喹那；溴匹立明；布度鈦；白消安；放線菌素C；卡魯睾酮；卡奈替尼；卡培他濱；卡醋胺；卡貝替姆；卡鉑；卡波醌；卡莫氟；卡莫 司汀組合聚苯丙生；卡莫司汀；卡柔比星；卡折來新；西地芬戈；塞內昔布；西馬多丁；苯丁酸氮芥；塞奧羅奈；順鉑；西羅黴素；順鉑(Ciplactin)；西羅黴素；順鉑；克拉屈濱；克蘭氟脲；氯法拉濱；克立那托；環磷醯胺；阿糖胞苷脂質體；阿糖胞苷；達卡巴嗪；放線菌素d；達貝泊汀α；道諾比星脂質體；道諾比星/柔紅黴素；道諾比星；地西他濱；地尼介白素；右尼古地平；地可松(Dexona)；右雷佐生；地紮胍寧；地吖醌；二溴螺銨；地諾孕素；地那林；地斯莫德；多西他賽；多佛奎達；去氧氟尿苷；小紅莓脂質體；小紅莓HCl；小紅莓HCl脂質體注射液；小紅莓；曲洛昔芬；丙酸屈他雄酮；達佐黴素；依考莫司汀；依達曲沙；艾特咔林；依氟鳥胺酸；艾蘭達；依林福德；埃利奧特B溶液；依沙蘆星；乙嘧替氟；恩洛鉑；恩普胺酯；恩紮妥林；依匹哌啶；表柔比星；依伯汀α；依他前列素；厄布洛唑；依索比星；雌氮芥；依他噠唑；依託格魯；磷酸依託泊苷；依託泊苷VP-16；依託泊苷；埃托寧；依西美坦；依昔舒林；法屈唑；法紮拉濱；非瑞替尼；非格司亭；氟尿苷；氟達拉賓；氟尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；氟甲睾酮；氟西他濱；磷喹酮；福司曲星；福司曲星；福曲他明；氟維司群；加柔比星；加洛他濱；吉西他濱；吉妥單抗/奧唑米星；吉羅酚；吉馬替康；吉美拉西；格洛沙腙；葡磷醯胺；乙酸戈舍瑞林；羥基尿素；布突默單抗/泰澤坦；艾達黴素；異環磷醯胺；伊莫福新；伊洛馬司他；甲磺酸伊馬替尼；伊美克；英丙舒凡；伊迪斯姆；氮丙啶丙氧醯干擾素α-2a；干擾素α-2b；干擾素α；干擾素β；干擾素γ；干擾素；介白素-2s及其他介白素(包括重組介白素)；茚托利辛；碘苄胍[131-I]；異丙鉑；伊立替康；伊索拉定；伊沙匹隆；酮曲沙；L-丙胺菌素；蘭瑞肽；拉帕替尼；來多蒽瓊；來曲唑； 甲醯四氫葉酸；亮丙立德；亮丙瑞林(Leuprorelin)(亮丙立德)；左旋咪唑；來沙骨化醇；利阿唑；洛鉑；洛美曲索；洛莫司汀/CCNU；洛莫司汀；洛那法尼；洛索蒽醌；勒托替康；馬磷醯胺；甘露舒凡；馬立馬司他；馬索羅酚；美登素；二氯甲基二乙胺；二氯甲基二乙胺/氮芥；乙酸甲地孕酮；甲地孕酮；甲烯雌醇；美法侖；美法侖L-PAM；美諾立爾；美雄烷；巰基嘌呤；6-巰基嘌呤；美司鈉；美替辛德；甲胺喋呤；甲氧沙林；美托咪酯；氯苯胺啶；美妥替哌；米鉑；米潑昔芬；米索硝唑；米丁度胺；米托卡西；米托羅米；米托拉酮；米托潔林；丙脒腙；米托馬星；絲裂黴素C；絲裂黴素；米托萘胺；米托喹酮；米托司培；米托坦；米托蒽醌；米托唑胺；米伏布林；咪唑立賓；莫法羅汀；莫哌達醇；木利替尼；黴酚酸；苯丙酸諾龍；奈達鉑；奈拉濱；奈莫柔比星；尼曲吖啶；諾考達唑；諾非單抗；諾加黴素；諾拉曲特；諾托曲通；奧曲肽；奧普瑞白介素；奧馬鉑；奧他賽；奧特拉西；奧沙利鉑；奧昔舒侖；氧芬胂；太平洋紫杉醇；帕米膦酸鹽；帕妥匹隆；培加酶；培門冬酶；派非格司亭；培得星；培利黴素；培利曲索；培美曲塞；奈莫司汀；噴司他丁；培洛黴素；培磷醯胺；哌立福新；吡鉑；吡萘非特；哌泊溴烷；哌泊舒凡；吡非尼酮；吡羅蒽醌；匹蒽醌；普維曲德；普卡黴素光神黴素；普卡黴素；普洛美坦；普洛美坦；卟吩姆鈉；卟吩姆；泊非羅黴素；潑尼氮芥；丙卡巴肼；普羅帕脒；螺氯丙醇；嘌嘧替派；嘌呤黴素；吡唑呋喃菌素；奎納克林；雷莫司汀；拉布立酶；利波腺苷；利曲舒凡；利妥昔單抗；羅穀亞胺；羅喹美克；鏈黑菌素(Rufocromomycin)；沙巴比星；沙芬戈；沙格司亭；賽特鉑；司鉑；司莫司汀；辛曲秦；西佐喃；索布佐生；索拉非尼；司泊索非；膦門冬酸；司帕 黴素；螺旋鍺；螺莫司汀；螺鉑；螺鉑；角鯊胺；鏈黑黴素；鏈伐立星；鏈脲佐菌素；磺環磷醯胺；磺氯苯脲；蘋果酸舒尼替尼；6-TG；泰克地那林；滑石；他利黴素；他莫司汀；他莫昔芬；他瑞奎達；牛磺莫司汀；替康蘭；喃氟啶；替洛蒽醌；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊甙/VM-26；替尼泊甙；替羅昔隆；睾內脂；硫米嘌呤；硫鳥嘌呤；噻替派；硫唑嘌呤；噻唑呋林；噻氯咪索；梯洛龍；汀考達；噻莫西酸；替拉紮明；托皮恩通；拓朴替康；托瑞米芬；托西莫單抗；曲貝替定(艾那司定(Ecteinascidin)743)；曲妥珠單抗；曲托龍；維甲酸/ATRA；曲西立濱；曲洛司坦；曲美沙特四硝酸三鉑；曲普瑞林；曲磷胺；妥布氯唑；烏苯美司；尿嘧啶芥；烏瑞替派；伐柔比星；伐司撲達；伐普肽；維替泊芬；長春鹼；長春新鹼；長春地辛；長春匹定；長春氟寧；長春米特；長春甘酯；長春西醇；長春羅新；長春瑞賓；長春羅定；長春曲醇；長春利定；伏羅唑；鏈黴黃素A(胍甲環素)；折尼鉑；亞苄維[2-H]；淨司他丁；唑來膦酸鹽；左柔比星；以及佐素奎達，例如：阿地介白素(例如PROLEUKIN®)；阿侖單抗(例如CAMPATH®)；亞利崔托寧(例如PANRETIN®)；安樂普利諾(例如ZYLOPRIM®)；六甲蜜胺(例如HEXALEN®)；阿米福汀(例如ETHYOL®)；阿那曲唑(例如ARIMIDEX®)；三氧化二砷(例如TRISENOX®)；天冬醯胺酶(例如ELSPAR®)；活BCG(例如TICE® BCG)；貝瑟羅汀(例如TARGRETIN®)；貝伐單抗(AVASTIN®)；博萊黴素(例如BLENOXANE®)；靜脈注射用白消安(例如BUSULFEX®)；口服白消安(例如MYLERANTM)；卡魯睾酮(例如METHOSARB®)；卡培他濱(例如XELODA®)；卡鉑(例如 PARAPLATIN®)；卡莫司汀(例如BCNU®、BiCNU®)；卡莫司汀組合聚苯丙生(例如GLIADEL®粉片)；塞內昔布(例如CELEBREX®)；苯丁酸氮芥(例如LEUKERAN®)；順鉑(例如PLATINOL®)；克拉屈濱(例如LEUSTATIN®、2-CdA®)；環磷醯胺(例如CYTOXAN®、NEOSAR®)；阿糖胞苷(例如CYTOSAR-U®)；阿糖胞苷脂質體(例如DepoCyt®)；達卡巴嗪(例如DTIC-Dome υ)；放線菌素d(例如COSMEGEN®)；達貝泊汀α(例如ARANESP®)；道諾比星脂質體(例如DAUNOXOME®)；道諾比星/柔紅黴素(例如CERUBIDINE®)；地尼介白素(例如ONTAK®)；右雷佐生(例如ZINECARD®)；多烯紫杉醇(例如TAXOTERE®)；小紅莓(例如ADRIAMYCIN®、RUBEX®)；小紅莓脂質體，包括小紅莓HCl脂質體注射液(例如DOXIL®)；丙酸屈他雄酮(例如DROMOSTANOLONE®及MASTERONE®注射液)；埃利奧特B溶液(例如Elliott's B Solution®)；表柔比星(例如ELLENCE®)；依伯汀α(例如EPOGEN®)；雌氮芥(例如EMCYT®)；磷酸依託泊苷(例如ETOPOPHOS®)；依託泊苷VP-16(例如VEPESID®)；依西美坦(例如AROMASIN®)；非格司亭(例如NEUPOGEN®)；氟尿苷(例如FUDR®)；氟達拉賓(例如FLUDARA®)；氟尿嘧啶，包括5-FU(例如ADRUCIL®)；氟維司群(例如FASLODEX®)；吉西他濱(例如GEMZAR®)；吉妥單抗/奧唑米星(例如MYLOTARG®)；乙酸戈舍瑞林(例如ZOLADEX®)；羥基尿素(例如HYDREA®)；布突默單抗/泰澤坦(例如ZEVALIN®)；艾達黴素(例如IDAMYCIN®)；異環磷醯胺(例如IFEX®)；甲磺酸伊馬替尼(例如GLEEVEC®)；干擾素α-2a(例如ROFERON-A®)；干擾素α-2b(例如INTRON A®)；伊立替康(例如 CAMPTOSAR®)；來曲唑(例如FEMARA®)；甲醯四氫葉酸(例如WELLCOVORIN®、LEUCOVORIN®)；左旋咪唑(例如ERGAMISOL®)；洛莫司汀/CCNU(例如CeeNU®)；二氯甲基二乙胺/氮芥(例如MUSTARGEN®)；乙酸甲地孕酮(例如MEGACE®)；美法侖/L-PAM(例如ALKERAN®)；巰基嘌呤，包括6-MP(例如PURINETHOL®)；美司鈉(例如MESNEX®)；甲胺喋呤；甲氧沙林(例如UVADEX®)；絲裂黴素C(例如MUTAMYCIN®、MITOZYTREX®)；米托坦(例如LYSODREN®)；米托蒽醌(例如NOVANTRONE®)；苯丙酸諾龍(例如DURABOLIN-50®)；諾非單抗(例如VERLUMA®)；奧普瑞白介素(例如NEUMEGA®)；奧沙利鉑(例如ELOXATIN®)；太平洋紫杉醇(例如PAXENE®、TAXOL®)；帕米膦酸鹽(例如AREDIA®)；培加酶(例如ADAGEN®)；培門冬酶(例如ONCASPAR®)；派非格司亭(例如NEULASTA®)；噴司他丁(例如NIPENT®)；哌泊溴烷(例如VERCYTE®)；普卡黴素/光神黴素(例如MITHRACIN®)；卟吩姆鈉(例如PHOTOFRIN®)；丙卡巴肼(例如MATULANE®)；奎納克林(例如ATABRINE®)；拉布立酶(例如ELITEK®)；利妥昔單抗(例如RITUXAN®)；沙格司亭(例如PROKINE®)；鏈脲佐菌素(例如ZANOSAR®)；蘋果酸舒尼替尼(例如SUTENT®)；滑石(例如SCLEROSOL®)；他莫昔芬(例如NOLVADEX®)；替莫唑胺(例如TEMODAR®)；替尼泊甙/VM-26(例如VUMON®)；睾內酯(例如TESLAC®)；硫鳥嘌呤，包括6-TG；噻替派(例如THIOPLEX®)；拓朴替康(例如HYCAMTIN®)；托瑞米芬(例如FARESTON®)；托西莫單抗(例如BEXXAR®)；曲妥珠單抗(例如HERCEPTIN®)；維甲酸/ATRA(例如 VESANOID®)；尿嘧啶芥；伐柔比星(例如VALSTAR®)；長春鹼(例如VELBAN®)；長春新鹼(例如ONCOVIN®)；長春瑞賓(例如NAVELBINE®)；以及唑來膦酸鹽(例如ZOMETA®)。
舉例而言，例示性抗生素藥包括(但不限於)胺基醣苷(Aminoglycoside)；胺醯醇(Amphenicol)；袢黴素(Ansamycin)；碳頭孢烯(Carbacephem)；卡巴盤尼姆(Carbapenem)；頭胞菌素(Cephalosporin)或頭孢烯(Cephem)；頭黴素(Cephamycin)；克拉維烷(Clavam)；環狀脂肽(Cyclic lipopeptide)；二胺基嘧啶(Diaminopyrimidine)；酮內酯(Ketolide)；林可醯胺(Lincosamide)；巨環內酯(Macrolide)；單醯胺菌素(Monobactam)；硝基呋喃(Nitrofuran)；氧頭孢烯(Oxacephem)；噁唑啶酮(Oxazolidinone)；表黴烯(Penem)、噻烯黴素(thienamycin)及混雜β-內醯胺；青黴素(Penicillin)；多肽抗生素；喹諾酮(Quinolone)；磺醯胺(Sulfonamide)；碸(Sulfone)；四環素(Tetracycline)；以及其他抗有絲分裂劑(諸如氯福克酚(Clofoctol)、梭鏈孢酸(Fusidic acid)、海克西定(Hexedine)、烏洛托品(Methenamine)、呋喃妥英(Nitrofurantoin)、硝羥喹啉(Nitroxoline)、利替培南(Ritipenem)、滔羅定(Taurolidine)、西波莫(Xibomol))。
例示性治療劑亦包括凝血因子或其他血液調節劑，諸如抗血友病因子、抗抑制劑凝血複合物、抗凝血酶III、凝血因子V、凝血因子VIII、凝血因子IX、血漿蛋白部分、馮威里氏因子；抗血小板劑(包括例如阿昔單抗(abciximab)、阿那格雷(anagrelide)、西洛他唑(cilostazol)、氯吡格雷硫酸氫鹽(clopidogrel bisulfate)、雙嘧達莫(dipyridamole)、依前列醇(epoprostenol)、埃替非巴肽(eptifibatide)、替羅非班(tirofiban))；群落刺激 因子(CSF)(包括例如粒細胞CSF及粒細胞巨噬細胞CSF)；紅血球生成刺激劑(包括例如促紅細胞生成素(erythropoietin)，諸如達貝泊汀α)及依伯汀α；止血劑及白蛋白(包括例如抑肽酶、抗血友病因子與血漿之組合、去胺加壓素乙酸鹽及白蛋白)；免疫球蛋白以及B型肝炎免疫球蛋白；凝血酶抑制劑(包括例如直接凝血酶抑制劑及來匹盧定(lepirudin))及替加色羅α；抗凝血劑(包括例如達肝素(dalteparin)、依諾肝素(enoxaparin)及其他肝素，以及華法林(warfarin))。
例示性抗體或其他治療劑包括(但不限於)西妥昔單抗(IMC-C225；Erbitux®)；曲妥珠單抗(Herceptin®)；利妥昔單抗(Rituxan®；MabThera®)；貝伐單抗(Avastin®)；阿侖單抗(Campath®；Campath-1H®；Mabcampath®)；帕尼單抗(Panitumumab)(ABX-EGF；Vectibix®)；蘭比珠單抗(Ranibizumab)(Lucentis®)；布突默單抗；替伊莫單抗(Zevalin®)；托西莫單抗(Tositumomab)；碘I 131；托西莫單抗(Tositumomab)(BEXXAR®)；卡托莫西單抗(Catumaxomab)(Removab®)；吉妥單抗；吉妥單抗奧唑米星(Mylotarg®)；阿巴西普(Abatacept)(CTLA4-Ig；Orencia®)；貝拉西普(Belatacept)(L104EA29YIg；LEA29Y；LEA)；伊派利單抗(Ipilimumab)(MDX-010；MDX-101)；曲美單抗(Tremelimumab)(替西單抗(ticilimumab)；CP-675,206)；PRS-010(參見例如US20090042785)；PRS-050(US7585940；US20090305982)；阿柏西普(Aflibercept)(VEGF捕捉劑，AVE005；Holash等人，(2002)PNAS99：11393-11398)；沃洛昔單抗(Volociximab)(M200)；沃洛昔單抗之F200(嵌合(人類/鼠類)IgG4 Fab片段(M200))；MORAb-009小鼠/人類嵌合IgG1(US20050054048)；可溶性融合蛋白質：連接於截短綠 膿桿菌外毒素A之抗間皮素Fv(SS1P(CAT-5001)；US20070189962)；西妥木單抗(Cixutumumab)(IMC-A12)；尼妥珠單抗(Nimotuzumab)(h-R3)(Spicer(2005)Curr Opin Mol Ther 7：182-191)；紮魯姆單抗(Zalutumumab)(HuMax-EGFR；Lammerts van Bueren等人(2008)PNAS 105：6109-14)；奈吐木單抗(Necitumumab)IMC-11F8(Li等人(2008)Structure 16：216-227)；Sym004(Pedersen等人2010 Cancer Res 70：588-597)；以及mAb-425。
詳言之，治療劑包括(但不限於)免疫球蛋白、干擾素β、干擾素α-2a、干擾素α-1、干擾素α-n3、干擾素β-1、干擾素β-1a、干擾素γ-1b、Peg-干擾素α-2及聚乙二醇化干擾素α-2b、胰島素、雙磷酸鹽(例如帕米膦酸鹽或唑來膦酸鹽)、多烯紫杉醇、小紅莓、小紅莓脂質體及貝伐單抗。
可藉由與本文所提供之經修飾之PH20多肽共同投予及/或共同調配進行組合的其他例示性治療劑包括(但不限於)阿達木單抗、阿加糖酶β、阿法賽特、安比西林、阿那白滯素、抗脊髓灰白質炎疫苗、抗胸腺細胞、阿奇黴素、貝卡普明、卡泊芬淨、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢替坦、頭孢他啶、頭孢曲松、西妥昔單抗、西司他汀、克拉維酸、克林達黴素、達貝泊汀α、達利珠單抗、白喉、白喉抗毒素、白喉類毒素、艾法珠單抗、腎上腺素、紅血球生成素α、依那西普、非格司亭、氟康唑、促卵泡激素、促濾泡素α、促濾泡素β、磷苯妥英、釓雙胺、釓噴酸、加替沙星、格拉默、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)、戈舍瑞林、乙酸戈舍瑞林、格拉司瓊、B型流感嗜血桿菌、氟哌啶醇、肝炎疫苗、A型肝炎疫苗、B型肝炎疫苗、替伊莫單抗、布突默單抗、泰澤坦、免疫球蛋白、流感嗜血桿菌疫苗、流感病毒疫苗、英利昔單抗、胰島素、甘精胰島素、干擾素、干 擾素α、干擾素β、干擾素γ、干擾素α-2a、干擾素α-2b、干擾素α-1、干擾素α-n3、干擾素β、干擾素β-1a、干擾素γ、干擾素α-共同、碘克沙醇、碘海醇、碘帕醇、碘佛醇、酮咯酸、拉羅尼酶、左氧氟沙星、利多卡因、利奈唑胺、勞拉西泮、麻疹疫苗、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹-流行性腮腺炎-風疹病毒疫苗、風疹疫苗、甲羥孕酮、美羅培南、甲基潑尼松龍、咪達唑侖、嗎啡鹼、奧曲肽、奧馬珠單抗、昂丹司瓊、帕利珠單抗、泮托拉唑、培門冬酶、派非格司亭、Peg-干擾素α-2a、Peg-干擾素α-2b、派格索曼、百日咳疫苗、哌拉西林、肺炎球菌疫苗及肺炎球菌結合物疫苗、普敏太定、瑞替普酶、促生長激素、舒巴坦鈉、舒馬曲普坦、他唑巴坦、替奈普酶、破傷風精製類毒素、替卡西林、托西莫單抗、曲安西龍、曲安奈德、已曲安奈德、萬古黴素、水痘帶狀疱疹免疫球蛋白、水痘疫苗、其他疫苗、阿侖單抗、亞利崔托甯、安樂普利諾、六甲蜜胺、阿米福汀、阿那曲唑、砷、三氧化二砷、天冬醯胺酶、卡介菌(BCG)疫苗、活BCG、貝瑟羅汀、博萊黴素、白消安、靜脈注射用白消安、口服白消安、卡魯睾酮、卡培他濱、卡鉑、卡莫司汀、卡莫司汀組合聚苯丙生、塞內昔布、苯丁酸氮芥、順鉑、克拉屈濱、環磷醯胺、阿糖胞苷、阿糖胞苷脂質體、達卡巴嗪、放線菌素d、道諾比星脂質體、道諾比星、道諾黴素(Daunomycin)、地尼介白素、右雷佐生、多烯紫杉醇、小紅莓、小紅莓脂質體、丙酸屈他雄酮、埃利奧茲B溶液、表柔比星、依伯汀α、雌氮芥、依託泊苷(Etoposide)、磷酸依託泊苷、依託泊苷VP-16、依西美坦、氟尿苷、氟達拉賓、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、氟維司群、吉西他濱、吉妥單抗、奧唑米星、吉妥單抗奧唑米星、羥基尿素、艾達黴素、異環磷醯胺、甲磺酸伊 馬替尼、伊立替康、來曲唑、甲醯四氫葉酸、左旋咪唑、洛莫司汀、CCNU、二氯甲基二乙胺、氮芥、甲地孕酮、乙酸甲地孕酮、美法侖、L-PAM、巰基嘌呤、6-巰基嘌呤、美司鈉、甲胺喋呤、甲氧沙林、絲裂黴素、絲裂黴素C、米托坦、米托蒽醌、諾龍、苯丙酸諾龍、諾非單抗、奧普瑞白介素、奧沙利鉑、太平洋紫杉醇、帕米膦酸鹽、培加酶、噴司他丁、哌泊溴烷、普卡黴素、光神黴素、卟吩姆、卟吩姆鈉、丙卡巴肼、奎納克林、拉布立酶、利妥昔單抗、沙格司亭、鏈脲佐菌素、滑石、他莫昔芬、替莫唑胺、替尼泊甙、睾內酯、硫鳥嘌呤、6-硫鳥嘌呤、三伸乙基硫代磷醯胺(噻替派)、拓朴替康、托瑞米芬、曲妥珠單抗、維甲酸、尿嘧啶芥、伐柔比星、長春鹼、長春新鹼、長春瑞賓、唑來膦酸鹽、阿西維辛、阿克拉黴素、阿考達唑、阿克羅甯、阿多來新、阿地白介素、視黃酸、阿利維甲酸、9-順-視黃酸、阿昔迪布、安巴腙、安波黴素、阿美蒽醌、胺格魯米特、安吖啶、阿那昔酮、安西他濱、安麯黴素、阿帕茲酮、精美司鈉、曲林菌素、阿莫司汀、阿紮胞苷、阿紮替派、阿佐黴素、巴諾蒽醌、巴他布林、巴馬司他、貝那昔濱、苯達莫司汀、苯佐替派、比卡魯胺、比他舍平、比立考達、比生群、二甲磺酸雙奈法德、比折來新、硼替佐米、布喹那、溴匹立明、布度鈦、放線菌素C、卡奈替尼、卡醋胺、卡貝替姆、卡波醌、卡莫氟、卡柔比星、卡折來新、西地芬戈、西馬多丁、苯丁酸氮芥、塞奧羅奈、西羅黴素、克蘭氟脲、氯法拉濱、克立那托、地西他濱、右尼古地平、右奧馬鉑、地紮胍寧、地吖醌、二溴螺銨、地諾孕素、地那林、地斯莫德、多佛奎達、去氧氟尿苷、曲洛昔芬、達佐黴素、依考莫司汀、依達曲沙、艾特咔林、依福米星、艾蘭達、依林福德、依沙蘆星、乙嘧替氟、恩洛鉑、恩普胺酯、 恩紮妥林、依匹哌啶、依他前列素、厄布洛唑、依索比星、依他噠唑、依託格魯、埃托寧、依昔舒林、法屈唑、法紮拉濱、非瑞替尼、氟甲睾酮、氟西他濱、磷喹酮、福司曲星、福曲他明、加柔比星、加洛他濱、吉羅酚、吉馬替康、吉美拉西、格洛沙腙、葡磷醯胺、伊莫福新、伊洛馬司他、伊美克、英丙舒凡、伊迪斯姆、氮丙啶丙氧醌、介白素、介白素-2、重組介白素、茚托利辛、碘苄胍、異丙鉑、伊索拉定、伊沙匹隆、酮曲沙、L-丙胺菌素、蘭瑞肽、拉帕替尼、來多蒽瓊、亮丙立德、亮丙瑞林、來沙骨化醇、利阿唑、洛鉑、洛美曲索、洛那法尼、洛索蒽醌、勒托替康、馬磷醯胺、甘露舒凡、馬立馬司他、馬索羅酚、美登素、二氯甲基二乙胺、甲烯雌醇、美法侖、美諾立爾、美雄烷、美替辛德、美托咪酯、氯苯胺啶、美妥替哌、米鉑、米潑昔芬、米索硝唑、米丁度胺、米托卡西、米托羅米、米托拉酮、米托潔林、丙脒腙、米托馬星、米托萘胺、米托喹酮、米托司培、米托唑胺、米伏布林、咪唑立賓、莫法羅汀、莫哌達醇、木利替尼、黴酚酸、奈達鉑、奈拉濱(Neizarabine)、奈莫柔比星、尼曲吖啶、諾考達唑、諾加黴素、諾拉曲特、諾托曲通、奧馬鉑、奧他賽、奧特拉西、奧昔舒侖、氧芬胂、帕妥匹隆、培得星、培利黴素、培利曲索、培美曲塞、奈莫司汀、培洛黴素、培磷醯胺、哌立福新、吡鉑、吡萘非特、哌泊舒凡、吡非尼酮、吡羅蒽醌、匹蒽醌、普維曲德、普洛美坦、泊非羅黴素、潑尼氮芥、普羅帕脒、螺氯丙醇、嘌嘧替派、嘌呤黴素、吡唑呋喃菌素、雷莫司汀、利波腺苷、利曲舒凡、羅穀亞胺、羅喹美克、鏈黑菌素、沙巴比星、沙芬戈、賽特鉑、司鉑、司莫司汀、辛曲秦、西佐喃、索布佐生、索拉非尼、司泊索非、膦門冬酸、司帕黴素、螺旋鍺、螺莫司汀、螺鉑、角鯊胺、鏈黑黴 素、鏈伐立星、磺環磷醯胺、磺氯苯脲、泰克地那林、他利黴素、他莫司汀、他瑞奎達、牛磺莫司汀、替康蘭、喃氟啶、替洛蒽醌、替莫泊芬、替羅昔隆、硫米嘌呤、硫唑嘌呤、噻唑呋林、噻氯咪索、梯洛龍、汀考達、噻莫西酸、替拉紮明、托皮恩通、曲貝替定、艾那司定743、曲托龍、曲西立濱、曲洛司坦、曲美沙特、四硝酸三鉑、曲普瑞林、曲磷胺、妥布氯唑、烏苯美司、烏瑞替派、伐司撲達、伐普肽、維替泊芬、長春鹼、長春地辛、長春匹定、長春氟甯、長春米特、長春甘酯、長春西醇、長春羅新、長春羅定、長春曲醇、長春利定、伏羅唑、鏈黴黃素A、胍甲環素、折尼鉑、亞苄維[2-H]、淨司他丁、左柔比星、佐素奎達、乙醯唑胺、阿昔洛韋、膽影酸、阿拉曲沙星、阿芬太尼、過敏原提取物、α 1-蛋白酶抑制劑、前列地爾、胺丁卡黴素、胺基酸、氨基己酸、胺茶鹼、阿米替林、異戊巴比妥、胺利酮、鎮痛劑、抗脊髓灰白質炎疫苗、抗狂犬病血清、抗破傷風免疫球蛋白、破傷風疫苗、抗凝血酶III、抗蛇毒血清、阿加曲班、精胺酸、抗壞血酸、阿替洛爾、阿曲庫銨、阿托品、硫代葡萄糖金、硫唑嘌呤、安曲南、桿菌肽、氯苯胺丁酸、巴利昔單抗、苯甲酸、苯紮托品、倍他米松、生物素、比伐盧定、肉毒抗毒素、溴苄乙胺、布美他尼、布比卡因、丁基原啡因、布托啡諾、降血鈣素、骨化三醇、鈣、卷麯黴素、卡前列素、肉鹼、頭孢孟多、頭孢哌酮、頭孢噻肟、頭孢西丁、頭孢唑肟、頭孢呋辛、氯黴素、氯普魯卡因、氯奎寧、氯噻嗪、氯丙嗪、硫酸軟骨素、絨毛膜促性腺激素α、鉻、西多福韋、西咪替丁、環丙沙星、順式阿曲庫銨、可樂定、可待因、秋水仙鹼、黏菌素、膠原蛋白、三氟醋酸綿羊可的瑞林、促腎上腺皮質激素、替可克肽、氰鈷胺素、環孢靈、半胱胺酸、達昔單抗、達福 普汀、達肝素、達那肝素、丹曲洛林、去鐵胺、去胺加壓素、地塞米松、右美托咪啶、右泛醇、聚葡萄糖、聚葡萄糖鐵、泛影酸、安定、二氮嗪、雙環維林、地高辛抗體、地高辛、雙氫麥角胺、地爾硫卓、苯海拉明、雙嘧達莫、多巴酚丁胺、多巴胺、多沙氯銨、多沙普侖、度骨化醇、多西環素、氟哌啶、喘定、依地酸、依酚氯銨、依那普利拉、麻黃素、依前列醇、麥角鈣化醇、麥角新鹼、厄他培南、紅黴素、艾司洛爾、雌二醇、雌激素、依他尼酸、乙醇胺、乙醇、乙碘油、依替膦酸、依託咪酯、因子VIII、法莫替丁、非諾多泮、芬太尼、氟馬西尼、螢光素、氟非那嗪、葉酸、甲吡唑、福米韋生、方達珀魯、膦甲酸、磷苯妥英、呋喃苯胺酸、釓特醇、釓弗塞胺、更昔洛韋、慶大黴素、升糖素、葡萄糖、甘胺酸、格隆溴銨、高那瑞林、絨毛膜促性腺激素、B型嗜血桿菌多醣、血晶素、草藥、組織胺、肼酞嗪、氫化可的松、氫嗎啡酮、羥鈷胺素、安泰樂、茛菪鹼、伊布利特、伊米苷酶、靛藍胭脂紅、吲哚美辛、碘、碘普羅胺、碘他拉酸、碘克沙酸、碘昔蘭、異菸肼、異丙腎上腺素、日本腦炎疫苗、康黴素、氯胺酮、拉貝洛爾、來匹盧定、左布比卡因、左旋甲狀腺素、林可黴素、碘塞羅寧、促黃體激素、萊姆病疫苗、錳福地吡、曼思醇、腦膜炎球菌多醣疫苗、麥啶、甲哌卡因、美索噠嗪、間羥胺、美沙酮、美索巴莫、美索比妥、甲基多巴酯、甲基麥角新鹼、甲氧氯普胺、美托洛爾、甲硝噠唑、二甲胺四環素、美維庫銨、魚脂酸、莫西沙星、莫羅莫那-CD3、黴酚酸嗎啉乙酯、萘夫西林、納布啡、納美芬、納洛酮、新斯的明、菸鹼醯胺、尼卡地平、硝化甘油、硝普鹽、去甲腎上腺素、奧芬那君、苯唑西林、羥嗎啡酮、土黴素、催產素、巴夫龍、泛醇、泛酸、罌粟鹼、聚乙二醇化干擾素-α(干擾素α 2a或2b)、青黴素G、潘他米丁、戊唑星、戊巴比妥、全氟丙烷、奮乃靜、苯巴比妥、芬托拉明、苯腎上腺素、苯妥英、毒扁豆鹼、植物甲萘醌、多黏菌素b、磷定、丙胺卡因、普魯卡因胺、普魯卡因、丙氯拉嗪、孕酮、普萘洛爾、氫氧化吡啶斯的明、吡哆醇、奎尼丁、奎奴普丁、狂犬病免疫球蛋白、狂犬病疫苗、雷尼替丁、瑞芬太尼、核黃素、利福平、羅比卡因、釤、莨菪鹼、硒、舍莫瑞林、辛卡利特、索嗎托諾、大觀黴素、鏈激酶、鏈黴素、琥珀醯膽鹼、舒芬太尼、磺胺甲基異噁唑、他克莫司、特布他林、特立帕肽、睪固酮、破傷風抗毒素、四卡因、硫酸十四烷酯、茶鹼、硫胺、硫乙哌丙嗪、硫噴妥、甲狀腺刺激激素、亭紮肝素、替羅非班、托普黴素、苄唑啉、甲苯磺丁尿、托西邁、胺甲環酸、曲前列環素、三氟吡啦嗪、三甲氧苯醯胺、三甲氧苄二胺嘧啶、緩血酸胺、結核菌素、傷寒疫苗、尿促卵泡素、尿激酶、丙戊酸、血管加壓素、維庫銨、維拉帕米、伏立康唑、華法林、黃熱病疫苗、齊多夫定、鋅、齊拉西酮鹽酸鹽、阿克拉黴素、放射菌素、阿德力黴素、偶氮絲胺酸、6-氮尿苷、嗜癌菌素、色黴素、迪諾特寧、6重氮基5側氧基-L-正白胺酸、依諾他濱、氟尿苷、橄欖黴素、吡柔比星、吡曲克辛、蝶羅呤、喃氟啶、殺結核菌素、阿替普酶、阿西莫單抗、貝伐單抗、A型肉毒桿菌毒素、B型肉毒桿菌毒素、卡羅單抗噴地肽、達利珠單抗、α鏈道酶、α替加色羅、噴替酸英西單抗及碘-131。
舉例而言，本文所提供之經修飾之PH20多肽可與胰島素(例如快速作用之胰島素)用於組合療法中，以增加胰島素之皮下傳遞(參見例如美國專利第7,767,429號；美國專利第7,846,431號；美國公開案第US20090304665號；以及美國申請案第13/507,263號；第13/507,262號及第13/507,261號)。 此類方法包括直接投予方法，以及泵及持續輸注方法，包括開泵及關泵系統。舉例而言，可與本文所提供之經修飾之PH20玻尿酸酶一起投予的例示性胰島素為快速作用之胰島素或胰島素類似物。舉例而言，共投予之胰島素包括常規胰島素、門冬胰島素、賴脯胰島素、賴麩胰島素或其他類似的類似物變異體。例示性胰島素為含有SEQ ID NO：393中闡述之A鏈及SEQ ID NO：394中闡述之B鏈的胰島素或與SEQ ID NO：393及394(A及B鏈)中闡述之人類胰島素相比含有一或多個胺基酸修飾的變異體。舉例而言，例示性胰島素類似物為熟習此項技術者已知，且包括(但不限於)SEQ ID NO：393(A鏈)中闡述且具有SEQ ID NO：395-397中之任一者中闡述之B鏈的胰島素類似物。經修飾之PH20可與胰島素共同投予或共同調配以治療可用胰島素治療之任何病狀。治療用途包括(但不限於)治療1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病及用於危重患者中之血糖控制。
2. 治療玻尿酸相關之疾病及病狀(例如腫瘤)的方法
詳言之，任何經修飾之PH20玻尿酸酶可用以治療玻尿酸相關之疾病或病狀。典型地，玻尿酸相關之疾病及病狀與組織、細胞或體液(例如腫瘤組織或腫瘤相關之組織、血液或胞間隙)中玻尿酸(HA)表現升高相關。
可藉由將樣品(例如組織、細胞或體液)中之玻尿酸含量與對照樣品(例如另一組織、細胞或體液)比較來鑑別患有玻尿酸相關之疾病或病狀的個體以評估是否玻尿酸含量升高。與正常組織、細胞或體液(例如類似於所測試之樣品，但自不同個體，諸如正常個體(亦即未患疾病或病狀，或未患所測試之個體所患有之疾病或病狀類型)，例如未患玻尿酸相關之疾病或病狀的個體分離之組織、細胞或體液)相比，升高之玻尿酸表現可升高。 與來自患有類似疾病或病狀，但疾病不那麼嚴重及/或不與玻尿酸相關或表現相對較少之玻尿酸且因而在較小程度上與玻尿酸相關之另一個體的類似組織相比，升高玻尿酸表現可升高。舉例而言，所測試之個體可為患有玻尿酸相關之癌症的個體，其中與患有不太嚴重癌症(諸如早期、分化或其他類型癌症)之個體相比，組織、細胞或流體中之HA量相對升高。在另一實例中，細胞、組織或流體之玻尿酸含量與具有已知量或相對量之HA的對照樣品，諸如流體、組織、提取物(例如細胞或細胞核提取物)、核酸或肽製劑、細胞系、生檢、標準或其他樣品(諸如已知表現相對低含量之HA之樣品，例如腫瘤細胞系，諸如本文中所描述之表現低含量之HA的例示性腫瘤細胞系，例如HCT 116細胞系、HT29細胞系、NCI H460細胞系、DU145細胞系、Capan-1細胞系及來自使用此類細胞系產生之腫瘤模型的腫瘤)相比升高。
玻尿酸相關之疾病及病狀包括與高間質液壓力相關之疾病及病狀，諸如椎間盤壓力、增生性病症(諸如癌症)及良性前列腺增生及水腫。水腫可起因於或顯現在例如器官移植、中風或腦損傷中。增生性病症包括(但不限於)癌症、平滑肌細胞增殖、全身性硬化症、肝硬化、成人呼吸窘迫症候群、特發性心肌病、紅斑狼瘡、視網膜病(例如糖尿病性視網膜病或其他視網膜病)、心肌增生、生殖系統相關之病症(諸如良性前列腺增生(BPH)及卵巢囊腫)、肺纖維化、子宮內膜異位、彈力纖維瘤、錯構瘤、淋巴管瘤病、類肉瘤病、硬纖維瘤。癌症包括實體及淋巴/血液腫瘤及轉移性疾病及未分化腫瘤。與相同組織類型之非癌性組織相比或與相同腫瘤類型之非轉移性腫瘤相比，可進行治療之腫瘤典型地顯示玻尿酸之細胞及/或基 質表現。癌症包括卵巢癌、原位癌(ISC)、鱗狀細胞癌(SCC)、前列腺癌、胰臟癌、其他胃癌、非小細胞肺癌、乳癌、腦癌及結腸癌中之任一或多者。
本文所提供之經修飾之PH20多肽，諸如其聚乙二醇化形式，可用以治療腫瘤。因而，除其間接抗癌作用之外，玻尿酸酶亦具有直接抗癌作用。玻尿酸酶防止移植至小鼠中之腫瘤生長(De Maeyer等人，1992,Int.J.Cancer 51：657-660)且在暴露於致癌物時抑制腫瘤形成(Pawlowski等人，1979,Int.J.Cancer 23：105-109；Haberman等人，1981,Proceedings of the 17th Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology,Washington,D.C.,22：105，摘要號415)。PH20玻尿酸酶已展示治療各種腫瘤(參見例如美國公開案第US2010/0003238號及美國申請案第13/135,817號，作為美國公開案第US20120020951號公開)。
富含玻尿酸之癌症可為其中癌細胞產生HALO之癌症、具有升高之玻尿酸表現的癌症(如藉由免疫染色，例如來自腫瘤之切片之組織學染色所測定)、具有升高之HAS2(玻尿酸合成酶2)之癌症、在試管內不產生玻尿酸酶(HYAL1)之癌症。富含玻尿酸之癌症可藉由任何用於評估玻尿酸表現之方法及其他已知用於分析蛋白質/mRNA表現之方法鑑別。
已鑑別出若干富含玻尿酸之癌症。在一些情況下，玻尿酸表現與不良預後相關，例如存活率及/或無復發存活率降低、癌轉移、血管生成、癌細胞侵入其他組織/區域及不良預後之其他指示物。已在例如富含玻尿酸之腫瘤中觀測到此類相關，該等腫瘤包括卵巢癌、SCC、ISC、前列腺癌、肺癌(包括非小細胞肺癌(NSCLC))、乳癌、結腸癌及胰臟癌(參見例如Anttila等人，Cancer Research,60：150-155(2000)；Karvinen等人，British Journal of Dermatology,148：86-94(2003)；Lipponen等人，Eur.Journal of Cancer,849-856(2001)；Pirinen等人，Int.J.Cancer.95：12-17(2001)；Auvinen等人，American Journal of Pathology,156(2)：529-536(2000)；Ropponen等人，Cancer Research,58：342-347(1998))。因而，富含玻尿酸之癌症可藉由投予玻尿酸酶，諸如本文所提供之經修飾之PH20玻尿酸酶來治療，以治療癌症之一或多個症狀。富含玻尿酸之腫瘤包括(但不限於)前列腺、乳房、結腸、卵巢、胃、頭頸部之腫瘤以及其他腫瘤及癌症。
與過量葡糖胺聚糖相關且可用本文所提供之經修飾之PH20多肽治療的其他玻尿酸相關之疾病或病狀包括(但不限於)心血管疾病(例如在局部缺血再灌注之後；動脈硬化中)；玻璃體切除術及眼科病症及病狀(例如在液化眼睛玻璃狀液之方法中；降低手術後壓力；其他眼部手術程序，諸如青光眼、玻璃體及視網膜手術，以及角膜移植中)；在皮下灌注法中(亦即輸注流體及電解質至皮膚真皮)；美容應用(例如在治療脂肪團、「豬皮」水腫或「橘皮」水腫中)；器官移植(例如與器官移植相關之間質性水腫相關)；以及肺病。
3. 其他用途
在其治療用途之其他實例中，本文所提供之經修飾之PH20多肽可用於達成諸如以下之目的：諸如長春花生物鹼之壞死物質之靜脈旁注射引起的局部壞死之解毒劑(Few等人(1987)Amer.J.Matern.Child Nurs.12,23-26)、治療腱鞘囊腫(Paul等人(1997)J Hand Surg.22(2)：219-21)及治療由靜脈功能不全引起之組織壞死(Elder等人(1980)Lancet 648-649)。經修飾之PH20多肽亦可用以治療腱鞘囊腫(亦稱為腕部囊腫、聖經囊腫或背腱鞘囊腫)， 腱鞘囊腫為手部最常見的軟組織塊且為可在皮膚下面感觸到之流體填充囊。
經修飾之PH20多肽可藉由降解硫酸軟骨素蛋白多糖(CSPG)而用於治療脊髓損傷。在脊髓損傷之後，含有CSPG之膠質瘢痕藉由星形膠質細胞產生。CSPG在抑制軸突生長中起到關鍵作用。此外，CSPG之表現已展示在中樞神經系統(CNS)損傷後增加。可溶性PH20亦可用於在稱為化學髓核溶解術之方法中治療椎間盤突出。軟骨素酶ABC為一種使與玻尿酸酶類似之受質裂解之酶，其可誘使腰椎中椎間盤壓力降低。存在三種類型之椎間盤損傷。突出之椎間盤為完整但凸出之椎間盤。在擠出之椎間盤中，纖維包裹物已撕破且髓核已露出，但仍連接至椎間盤。在分離之椎間盤中，髓核片段已自椎間盤鬆散破裂且游離在髓管中。化學髓核溶解術典型地對突出及擠出之椎間盤有效，但對分離之椎間盤損傷無效。
I. 實施例
以下實施例僅為達成說明之目的而包括，且不意欲限制本發明之範疇。
實施例1
重組人類PH20玻尿酸酶(rHuPH20)之製備
A. 表現可溶性rHuPH20之細胞系的產生
稱為rHuPH20之重組人類PH20玻尿酸酶如公開之美國公開案第US20110053247號(現為美國專利第8,187,855號)中所描述產生。簡言之，將中國倉鼠卵巢(CHO細胞)用稱為pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)質體之質體轉染，該質體之序列闡述於SEQ ID NO：5中(參見例如美國專利第7,767,429號及第7,781,607號以及美國公開案第2006-0104968號)。用 於表現rHuPH20之HZ24質體載體含有pCI載體骨架(Promega)、編碼SEQ ID NO：6中闡述之人類PH20玻尿酸酶之胺基酸1-482的DNA、來自ECMV病毒(Clontech)之內部核糖體進入位點(IRES)及小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。載體編碼可溶性玻尿酸酶且產物稱為rHuPH20。pCI載體骨架亦包括編碼β-內醯胺酶抗性基因(AmpR)之DNA、fl複製起點、巨細胞病毒即可早期強化子/啟動子區域(CMV)、嵌合內含子及SV40晚期聚腺苷酸化信號(SV40)。編碼可溶性rHuPH20構築體之DNA在編碼人類PH20之天然35個胺基酸信號序列之胺基酸位置1的甲硫胺酸之DNA之前含有NheI位點及克紮克共同序列，且在編碼對應於SEQ ID NO：6中闡述之人類PH20玻尿酸酶之胺基酸位置482的酪胺酸之DNA之後含有終止密碼子，接著為BamHI限制位點。
將在針對DHFR(-)細胞經GIBCO改良之CD-CHO培養基(補充有4mM麩醯胺酸及18mL/L普洛尼克(Pluronic)F68/L(Gibco))中生長的未經轉染之DG44 CHO細胞以0.5×106個細胞/毫升接種於搖瓶中，準備用於轉染。細胞在含濕氣培育箱中在5% CO2中在37℃下生長，以120rpm震盪。在轉染之前，對按指數生長之未經轉染之DG44 CHO細胞測試活力。
使未經轉染之DG44 CHO細胞培養物的六千萬個活細胞成球粒且在0.7mL 2x轉染緩衝液(2x HeBS：40mM HEPES pH 7.0、274mM NaCl、10mM KCl、1.4mM Na2HPO4、12mM右旋糖)中再懸浮至2×107個細胞之密度。向再懸浮細胞之每一等分試樣中，添加0.09mL(250μg)線性HZ24質體(經Cla I(New England Biolabs)消化隔夜而線性化)，且在室溫下將細胞/DNA溶液輸送至0.4cm間隙BTX(Gentronics)電穿孔試管中。在無質體DNA 與細胞混合下進行陰性對照電穿孔。細胞/質體混合物在330V及960μF或350V及960μF之電容器放電下進行電穿孔。
在電穿孔之後將細胞自試管移除且輸送至5mL針對DHFR(-)細胞經改良之CD-CHO培養基(補充有4mM麩醯胺酸及18mL/L普洛尼克F68/L(Gibco))中，且使其在含濕氣培育箱中在5% CO2中在37℃下6孔組織培養盤之孔中生長2天，無選擇。
電穿孔後兩天，將0.5mL組織培養基自每一孔移除且使用實施例3中描述之微濁度分析測試玻尿酸酶活性之存在。結果闡述於表4中。
自組織培養孔收集來自轉染2(350V)之細胞，計數且稀釋至每毫升1×104至2×104個活細胞。將細胞懸浮液之0.1mL等分試樣輸送至五個96孔圓底組織培養盤中之每一孔。添加一百微升含有4mM GlutaMAXTM-1補充劑(GIBCOTM,Invitrogen公司)且不含次黃嘌呤及胸苷補充劑之CD-CHO培養基(GIBCO)至含有細胞之孔中(最終體積為0.2mL)。自無甲胺喋呤生長之5個盤鑑別十個純系(表5)。
將六個HZ24純系在培養物中擴展且呈單細胞懸浮液輸送至搖瓶。使用二維無限稀釋策略，將純系3D3、3E5、2G8、2D9、1E11及4D10塗鋪至96孔圓底組織培養盤中，其中以左上手孔中5000個細胞開始，沿盤往下1：2稀釋細胞，且橫跨盤1：3稀釋。經稀釋之純系在每孔500個未經轉染之DG44 CHO細胞背景中生長，以為培養之初始天數提供所需生長因子。每一次純系製備十個盤，其中5個盤含有50nM甲胺喋呤且5個盤不含甲胺喋呤。
純系3D3產生24個可視次純系(13個來自無甲胺喋呤處理，且11個來自50nM甲胺喋呤處理)。在來自24個次純系中之8個的上清液中量測到顯著玻尿酸酶活性(>50單位/毫升)，且此8個次純系擴展至T-25組織培養燒瓶中。自甲胺喋呤處理方案分離之純系在50nM甲胺喋呤存在下擴展。純系3D35M在500nM甲胺喋呤中進一步擴展，在搖瓶中產生玻尿酸酶活性超過1,000單位/毫升之純系(純系3D35M；或Gen1 3D35M)。隨後製備3D35M細胞之主細胞庫(MCB)。
B. 含有可溶性人類PH20(rHuPH20)之Gen2細胞的產生
實施例1.A中描述之Gen1 3D35M細胞系適應於較高甲胺喋呤含量，從而產生第2代(Gen2)純系。將3D35M細胞自建立之含有甲胺喋呤之培養物接種至含有4mM GlutaMAX-1TM及1.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基中。細胞藉由在46天時間內於37℃、7% CO2含濕氣培育箱中生長且繼代9次而適應於較高甲胺喋呤含量。藉由在含有具有2.0μM甲胺喋呤之培養基的96孔組織培養盤中進行限制稀釋，來選殖出擴增之細胞群體。在約4週之後，鑑別純系且選擇純系3E10B用於擴展。3E10B細胞在含有4mM GlutaMAX-1TM及2.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基中生長，繼代20次。產 生3E10B細胞系之主細胞庫(MCB)且冷凍並用於後續研究。
藉由在含有4mM GlutaMAX-1TM及4.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基中培養3E10B細胞，持續擴增細胞系。在第12次繼代之後，將細胞冷凍在小瓶中，作為研究細胞庫(RCB)。將一小瓶RCB解凍且在含有8.0μM甲胺喋呤之培養基中培養。在5天之後，培養基中之甲胺喋呤濃度增加至16.0μM，隨後18天後增加至20.0μM。藉由在含有含4mM GlutaMAX-1TM及20.0μM甲胺喋呤之CD CHO培養基的96孔組織培養盤中進行限制稀釋，選殖出來自在含有20.0μM甲胺喋呤之培養基中第8次繼代之細胞。5-6週後鑑別純系且選擇純系2B2以在含有20.0μM甲胺喋呤之培養基中擴增。在第11次繼代之後，將2B2細胞冷凍在小瓶中，作為研究細胞庫(RCB)。
所得2B2細胞為表現可溶性重組人類PH20(rHuPH20)的缺乏二氫葉酸還原酶(dhfr-)之DG44 CHO細胞。可溶性PH20以約206個複本/細胞之複本數存在於2B2細胞中。使用rHuPH20特異性探針的SpeI-、XbaI-及BamHI/HindIII消化之基因組2B2細胞DNA之南方墨點分析(Southern blot analysis)揭示以下限制消化特徵：在DNA用SpeI消化下，約7.7kb之一條主要雜交亮帶及四條次要雜交亮帶(約13.9、約6.6、約5.7及約4.6kb)；在DNA用XbaI消化下，約5.0kb之一條主要雜交亮帶及兩條次要雜交亮帶(約13.9及約6.5kb)；以及使用以BamHI/HindIII消化之2B2 DNA觀測到約1.4kb之一條單一雜交亮帶。
C. 300L生物反應器細胞培養物中Gen2可溶性rHuPH20之產生
將一小瓶HZ24-2B2解凍且自搖瓶，經由36L旋轉燒瓶，在補充有20甲胺喋呤及GlutaMAX-1TM(Invitrogen)之CD-CHO培養基(Invitrogen,Carlsbad, CA)中擴展。簡言之，將細胞小瓶在37℃水浴中解凍，添加培養基且將細胞離心。使細胞再懸浮於125mL具有20mL新鮮培養基之搖瓶中，且置放於37℃、7% CO2培育箱中。細胞在125mL搖瓶中擴展至多達40mL。當細胞密度達到超過1.5×106個細胞/毫升時，培養物擴展至125mL旋轉燒瓶中100mL培養物體積。燒瓶在37℃、7% CO2下培育。當細胞密度達到超過1.5×106個細胞/毫升時，培養物擴展至250mL旋轉燒瓶中200mL培養物體積，且燒瓶在37℃、7% CO2下培育。當細胞密度達到超過1.5×106個細胞/毫升時，培養物擴展至1L旋轉燒瓶中800mL培養物體積，且在37℃、7% CO2下培育。當細胞密度達到超過1.5×106個細胞/毫升時，培養物擴展至6L旋轉燒瓶中5000mL培養物體積，且在37℃、7% CO2下培育。當細胞密度達到超過1.5×106個細胞/毫升時，培養物擴展至36L旋轉燒瓶中32L培養物體積，且在37℃、7% CO2下培育。
將400L反應器滅菌且添加230mL CD-CHO培養基。在使用之前，檢查反應器之污染情況。約30L細胞自36L旋轉燒瓶以每毫升4.0×105個活細胞之接種密度及260L之總體積輸送至400L生物反應器(Braun)中。參數為：溫度設定點，37℃；葉輪速度40-55RPM；容器壓力：3psi；空氣充氣0.5-1.5L/Min；空氣疊加：3L/min。反應器每天取樣進行細胞計數、pH值檢驗、培養基分析、蛋白質產生及保持。此外，在執行期間，添加養分補給。在120小時(第5天)，添加10.4L補給#1培養基(4×CD-CHO+33g/L葡萄糖+160mL/L Glutamax-1TM+83mL/L酵母提取物+33mg/L重組人類胰島素)。在168小時(第7天)，添加10.8L補給#2(2×CD-CHO+33g/L葡萄糖+80mL/L Glutamax-1TM+167mL/L酵母提取物+0.92g/L丁酸鈉)，且培 養溫度變至36.5℃。在216小時(第9天)，添加10.8L補給3號(1×CD-CHO+50g/L葡萄糖+50mL/L Glutamax-1TM+250mL/L酵母提取物+1.80g/L丁酸鈉)，且培養溫度變至36℃。在264小時(第11天)，添加10.8L補給#4(1×CD-CHO+33g/L葡萄糖+33mL/L Glutamax-1TM+250mL/L酵母提取物+0.92g/L丁酸鈉)，且培養溫度變至35.5℃。觀測到補給培養基之添加大大增強可溶性rHuPH20在最終產生階段之產生。在14或15天或當細胞活力降至低於40%時收穫反應器。該製程產生每毫升17,000單位之最終產率，其中最大細胞密度為一千兩百萬個細胞/毫升。收穫時，藉由穿透電子顯微術(TEM)，針對試管內及活體內黴漿菌、生物負荷、內毒素及病毒，以及酶活性，將培養物取樣。
藉由蠕動泵抽吸培養物，同時穿過四個Millistak過濾系統模組(Millipore)，每一過濾系統模組含有分級至4-8μm之矽藻土層及分級至1.4-1.1μm之矽藻土層，接著纖維素膜；隨後穿過第二單個Millistak過濾系統(Millipore)，其含有分級至0.4-0.11μm之矽藻土層及分級至<0.1μm之矽藻土層，接著纖維素膜；且接著穿過0.22μm最終過濾器，至具有350L容量之無菌單次使用之可撓性袋子中。所收穫之細胞培養物流體補充有10 EDTA及10mM Tris，pH值為7.5。培養物用切向流過濾(TFF)設備，使用四個Sartoslice TFF 30kDa分子量截止(MWCO)聚醚碸(PES)過濾器(Sartorious)濃縮10倍，接著與10mM Tris、20mM Na2SO4 pH 7.5進行10×緩衝液更換至0.22μm最終過濾器，進入50L無菌儲存袋中。
經濃縮之經透濾收穫物針對病毒失活。在病毒失活之前，製備10% Triton® X-100、3%磷酸三(正丁基)酯(TNBP)之溶液。經濃縮之經透濾收 穫物在36L玻璃反應容器中暴露於1% Triton® X-100、0.3% TNBP 1小時，隨後立即在Q管柱上純化。
D. Gen2可溶性rHuPH20之純化
製備Q瓊脂糖凝膠(Pharmacia)離子交換管柱(9L樹脂，H=29cm，D=20cm)。收集洗滌液樣品，以測定pH值、導電性及內毒素(LAL分析)。將管柱用5管柱體積之10mM Tris、20 Na2SO4 pH 7.5平衡。在病毒失活之後，將經濃縮之經透濾收穫物以100cm/hr之流動速率裝載至Q管柱上。將管柱用5管柱體積10mM Tris、20mM Na2SO4 pH 7.5及10mM HEPES、50mM NaCl pH7.0洗滌。將蛋白質用10mM HEPES、400mM NaCl pH 7.0洗提至0.22μm最終過濾器中，進入無菌袋中。測試洗提液樣品之生物負荷、蛋白質濃度及玻尿酸酶活性。在更換開始及結束時讀取A280吸光度讀數。
隨後進行苯基-瓊脂糖凝膠(Pharmacia)疏水性相互作用層析法。準備苯基-瓊脂糖凝膠(PS)管柱(19-21L樹脂，H=29cm，D=30cm)。收集洗滌液且針對pH值、導電性及內毒素(LAL分析)取樣。將管柱用5管柱體積5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨、0.1mM CaCl2 pH值7.0平衡。來自Q瓊脂糖凝膠管柱之蛋白質洗提液補充有2M硫酸銨、1M磷酸鉀及1M CaCl2儲備溶液以分別產生5mM、0.5M及0.1mM之最終濃度。將蛋白質以100cm/hr之流動速率裝載至PS管柱上且收集管柱流出物。將管柱用5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨及0.1mM CaCl2 pH 7.0以100cm/hr洗滌，且將洗滌液添加至所收集之流出物中。與管柱洗滌液組合，流出物通過0.22μm最終過濾器，進入無菌袋中。針對生物負荷、蛋白質濃度及酶活性對流出物取樣。
準備硼酸胺基苯酯管柱(Prometics)。收集洗滌液且對pH值、導電性 及內毒素(LAL分析)取樣。將管柱用5管柱體積5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨平衡。將含有經純化之蛋白質的PS流出物以100cm/hr之流動速率裝載至硼酸胺基苯酯管柱上。將管柱用5mM磷酸鉀、0.5M硫酸銨pH 7.0洗滌。將管柱用20mM二甘胺酸、0.5M硫酸銨pH 9.0洗滌。將管柱用20mM二甘胺酸、100mM氯化鈉pH 9.0洗滌。蛋白質用50mM HEPES、100mM NaCl pH 6.9洗提且通過無菌過濾器，進入無菌袋中。測試洗提樣品之生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。
準備羥基磷灰石(HAP)管柱(Biorad)。收集洗滌液且測試pH值、導電性及內毒素(LAL分析)。將管柱用5mM磷酸鉀、100mM NaCl、0.1 CaCl2 pH 7.0平衡。將經硼酸胺基苯酯純化之蛋白質補充至5mM磷酸鉀及0.1mM CaCl2之最終濃度，且以100cm/hr之流動速率裝載至HAP管柱上。將管柱用5mM磷酸鉀pH 7、100mM NaCl、0.1mM CaCl2洗滌。隨後將管柱用10mM磷酸鉀pH 7、100mM NaCl、0.1mM CaCl2洗滌。蛋白質用70mM磷酸鉀pH 7.0洗提且通過0.22μm無菌過濾器，進入無菌袋中。測試洗提樣品之生物負荷、蛋白質濃度及酶活性。
隨後經HAP純化之蛋白質通過病毒移除過濾器。首先藉由用2L 70mM磷酸鉀pH 7.0洗滌來準備滅菌Viosart過濾器(Sartorius)。在使用之前，針對pH值及導電性對過濾緩衝劑取樣。經HAP純化之蛋白質經由蠕動泵抽吸穿過20nM病毒移除過濾器。在70mM磷酸鉀pH 7.0中之經過濾之蛋白質通過0.22μm最終過濾器，進入無菌袋。測試經過濾之樣品的蛋白質濃度、酶活性、寡醣、單醣及唾液酸特徵分析。亦測試樣品之與製程相關之雜質。
隨後使用10kDa分子量截止(MWCO)之Sartocon Slice切向流過濾(TFF) 系統(Sartorius)將濾液中之蛋白質濃縮至10mg/mL。首先藉由用10mM組胺酸、130mM NaCl pH 6.0洗滌來準備過濾器，且針對pH值及導電性對滲透物取樣。在濃縮之後，對經濃縮之蛋白質取樣且測試蛋白質濃度及酶活性。對經濃縮之蛋白質進行6×緩衝液更換成最終緩衝液：10mM組胺酸、130mM NaCl pH 6.0。在緩衝液更換之後，經濃縮之蛋白質通過0.22μm過濾器，進入20L無菌儲存袋中。對蛋白質取樣且測試蛋白質濃度、酶活性、自由巰基、寡醣特徵分析及重量莫耳滲透濃度。批次編號WRS2用作下文描述之分析中的標準品，結果顯示關於外形之測試描述為透明且無色；pH值為7.4；內毒素含量<0.01EU/mL；重量莫耳滲透濃度為308mOsm/Kg；密度為1.005g/mL；rHuPH20含量為1.3ppm；以及玻尿酸酶活性為145 USP U/mL。
無菌過濾之大塊蛋白質隨後以20mL無菌分配至30mL無菌鐵氟龍小瓶(Nalgene)中。隨後小瓶快速冷凍且儲存在-20±5℃下。
實施例2
PH20突變文庫之產生
A. 選殖及突變誘發
在此實施例中，藉由將編碼人類PH20之DNA選殖至質體中，接著轉染及蛋白質表現，來產生人類玻尿酸酶PH20文庫。
文庫藉由對PH20模板進行突變誘發來產生，該PH20模板為具有Ig κ前導序列之PH20的密碼子最佳化型式。特定言之，為產生變異體文庫，HZ24-PH20(OHO)-IRES-SEAP表現載體(SEQ ID NO：4中闡述)用作模板，其含有SEQ ID NO：1中闡述之編碼PH20之核苷酸序列，其編碼SEQ ID NO： 2中闡述之PH20或SEQ ID NO：3中闡述之缺乏對應於IgK信號序列之殘基1-22的成熟PH20。載體骨架來源於含有DHFR選擇標記物(參見實施例1及SEQ ID NO：5)且添加有IgK前導序列及密碼子最佳化之原始HZ24載體。表現載體亦經修飾以含有用於分泌之鹼性磷酸酶(SEAP)之基因。因此，除編碼PH20之序列之外，HZ24-PH20(OHO)-IRES-SEAP表現載體亦含有連接於用於分泌之鹼性磷酸酶(SEAP)之基因的編碼序列之內部核糖體進入位點(EMCV IRES)，及驅動構築體中PH20及SEAP表現之單一CMV啟動子。其亦含有用於安比西林抗性之基因。參考SEQ ID NO：4中闡述之核苷酸序列，編碼PH20之核苷酸序列對應於核苷酸1058-2464(包括IgK前導序列)，編碼SEAP之核苷酸序列對應於核苷酸2970-4529且安比西林抗性基因對應於核苷酸5778-6635。
製得第一文庫以產生編碼之變異蛋白質，其中使SEQ ID NO：2之殘基23-469(對應於SEQ ID NO：3之殘基1-447或SEQ ID NO：6之殘基36-482)中之每一者變成約15種胺基酸殘基中之一者，以便每一成員包含單一胺基變化。所得文庫含有6753個變異成員，與SEQ ID NO：2之殘基23-469(對應於SEQ ID NO：3之殘基1-447或SEQ ID NO：6之殘基36-482)相比每一成員含有單一胺基酸突變。製備所得文庫之甘油儲備液且儲存在-80℃下。每一成員中之胺基酸置換(mut)列於以下表6中，且對應於參考SEQ ID NO：3(及SEQ ID NO：7或32-66，其為PH20成熟序列或其其他C端截短片段)中闡述之PH20之胺基酸序列的胺基酸置換。文庫中每一PH20變異體之對應突變密碼子(cod)亦列於表6中，且對應於闡述為SEQ ID NO：4之1058-2464的PH20之對應編碼核苷酸中之核苷酸殘基變化。每一成員如下 所述來表現且篩檢玻尿酸酶活性。
2. 表現
為表現每一突變體，將含有編碼變異PH20之一或編碼野生型PH20之cDNA的HZ24-PH20-IRES-SEAP質體DNA使用脂染胺2000(Invitrogen，目錄號11668-027)根據製造商提出之方案轉染至單層CHO-S細胞(Invitrogen,目錄號11619-012)中。在轉染前夜接種CHO-S細胞且在具有10% FBS之DMEM中生長至第二天80%匯合。隨後，CHO-S細胞之培養基用Opti-MEM置換。製備質體DNA與脂染胺之混合物(0.2μg DNA及0.5μL脂染胺)。將脂染胺/DNA混合物添加至CHO-S細胞中且培育隔夜。第二天，細胞補充有不含CD-CHO血清之培養基(Invitrogen，目錄號10743-029)。在轉染之後的各時間點，且一般在轉染之後96小時收集來自轉染細胞之上清液。含有具有SEQ ID NO：3中闡述之胺基酸序列的變異PH20蛋白質或野生型PH20的上清液儲存在-20℃下。上清液活性如以下實施例中所描述來篩檢。
實施例3
評估PH20變異體之玻尿酸酶活性的篩檢分析
1. 生物素標記之HA(bHA)受質之產生
將1.2-MDa HA(Lifecore)進行生物素標記以用作玻尿酸酶活性分析中之受質。首先，將1.2公克(g)1.2 MDa HA在4℃下在攪拌下溶解於600mL ddH2O中，歷時一週，濃度為2mg/mL。然後，645.71mg生物素醯肼溶解於100mL DMSO中，達25mM(6.458mg/mL、38.37mL DMSO中247.8mg) 之濃度。生物素溶液在37℃下短暫升溫，直至溶液清澈。此外，368.61mg磺酸基-NHS溶解於20mL ddH2O中，製成100X溶液(18.4mg/mL磺酸基-NHS)。在反應開始之前，藉由將17.63mg EDC溶解於3mL ddH2O中，達5.7513mg/mL之濃度，製得30mM(1000X)水溶性碳化二亞胺EDC溶液。
在室溫(RT)下且在攪拌下以如下順序向四個(4)1000mL無菌加蓋瓶中添加以下組分：1)200mL 2mg/mL HA溶液；2)80mL 0.5M MES pH 5.0，平緩混合；以及3)91.6mL ddH2O，平緩混合。然後，連續添加24mL 25mM生物素-醯肼及4mL 100X磺酸基-NHS溶液，緊接著添加500μL EDC。在添加每一組分之後，溶液藉由倒轉三次且攪拌來混合。在添加最後組分之後，溶液藉由在4℃下攪拌隔夜來混合。隨後，藉由每100mL添加38.2g，添加鹽酸胍至4M之最終濃度，且使之完全溶解，接著用ddH2O調整溶液體積至600mL。
為透析，將來自結合之HA鹽酸胍溶液每一批之200mL輸送至透析膜。在三天過程期間，溶液相對於ddH2O透析，ddH2O改變至少六次。約840mL之所得體積用ddH2O調至1000mL之最終體積。生物素標記之玻尿酸(bHA)之最終濃度為0.4mg/mL。
2. 玻尿酸酶活性分析
該酶分析為Frost等人(1997)(A Microtiter-Based Assay for Hyaluronidase Activity Not Requiring Specialized Reagents.Analytical Biochemistry(1997)251：263-269)描述之方法的修改，其提供PH20玻尿酸酶活性之一種量度。
首先，生物素標記之HA(bHA)受質結合於塑膠微量滴定盤以產生分析盤。簡言之，將100μl於0.5M碳酸鹽緩衝劑(pH 9.6)中1mg/mL之b-HA 分配至高結合微量培養盤(Immunolon 4 HBX超高結合；Thermo Scientific)之每一孔中。將盤用盤密封物覆蓋且儲存在2-8℃之間達24-48小時。
隨後，分析盤用含有0.05%(v/v)Tween 20之1 X磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌緩衝液(PBST)洗滌。PBST由1X PBS(由目錄號P5368，Sigma(10mM磷酸鹽緩衝液、2.7mM氯化鉀、137mM氯化鈉pH 7.4)，藉由將PBS之一個包裝之內含物置放於具有800mL去離子水之1L刻度圓筒中，藉由攪拌或震盪使之溶解且添加足夠量之水至1L來產生)，藉由添加500μl Tween 20(目錄號6505；EMD Bioscience)至900mL 1 X PBS且添加足夠量之水至1L來產生。使用BioTek ELx405 Select CW盤墊圈(BioTek)，藉由每次洗滌用每孔300μl PBST洗滌緩衝液洗滌五(5)次來進行洗滌。在每次洗滌結束時，盤在紙巾上輕敲以自每孔移除過量液體。在與樣品一起培育之前，添加200μl阻斷緩衝液(含1.0% w/v牛血清白蛋白(BSA)之PBS)至每一孔且分析盤在37℃下事先培育約1小時。阻斷緩衝液藉由添加2.5g BSA(目錄號001-000-162；Jackson Immuno Research)至200mL 1 X PBS中、攪拌、添加足夠量之1 X PBS至250mL且經由0.2μM PES過濾器單元過濾來產生。
如實施例1中所描述產生之轉染變異體或野生型PH20上清液在未經塗佈之4XHB高結合微量培養盤中在分析稀釋緩衝液(pH 7.4 HEPES緩衝液；10 HEPES、50mM NaCl、1mM CaCl2、1mg/mL BSA pH 7.4、0.05% Tween-20)中1：25一式兩份稀釋。對於標準曲線，在分析稀釋緩衝液中一式兩份如下製備rHuPH20(如實施例1中所描述產生，比活性為145U/mL)之1：3連續稀釋液，以3U/mL標準開始：3U/mL、1U/mL、1/3U/mL、1/9U/mL、1/27 U/mL、1/81U/mL及1/243U/mL。一百微升(100μl)每一標準品及樣品輸送至分析盤且在37℃下培育約1.5小時。
在培育之後，將盤用PBST，使用BioTek ELx405 Select CW盤墊圈，藉由每次洗滌每孔用300μl PBST洗滌緩衝液洗滌五(5)次來洗滌。在每次洗滌結束時，盤在紙巾上輕敲以自每孔移除過量液體。隨後，100μl 1：5000稀釋之抗生蛋白鏈菌素-HRP(SA-HRP)添加至盤之每一孔且在環境溫度下培育約1小時。為稀釋，將1mg/mL抗生蛋白鏈菌素-HRP結合物之儲備液(目錄號21126；Thermo Scientific)1：5000稀釋成稀釋緩衝液(1mg/mL BSA、0.025%Tween 20、137mM NaCl、20mM Tris pH 7.5)。在培育之後，盤用PBST，使用BioTek ELx405 Select CW盤墊圈，藉由每次洗滌每孔用300μl PBST洗滌緩衝液洗滌五(5)次來洗滌。在每次洗滌結束時，盤在紙巾上輕敲以自每孔移除過量液體。隨後，在室溫下100μl TMB溶液(目錄號52-00-03,KPL；環境溫度及避光)添加至每一孔中，歷時約五(5)分鐘或直至產生最佳顯色。為使反應停止，100μl 1.0N硫酸或TMB停止溶液(目錄號50-85-06)添加至每一孔中且盤輕敲以進行混合。在添加停止溶液之30分鐘內在450nm下量測光學密度。因為標準品或樣品中之PH20愈多，可用於結合SA-HRP之bHA愈少，所以光學密度(450nm)值與每一樣本中玻尿酸酶活性之濃度成反比。
3. SEAP活性
細胞培養物上清液中分泌之鹼性磷酸酶(SEAP)的活性亦使用胎盤鹼性磷酸酶之比色分析，使用pNPP作為磷酸酶受質(Anaspec SensoLyte pNPP SEAP套組；目錄號72144,Anaspec)根據製造商之說明書量測。吸光度信號 在405nm之光學密度(OD)下量測。
高通過量(HTP)篩檢之標準為轉染上清液產生之SEAP信號0.1且rHuPH20野生型對照之信號產生1U/mL之信號。此外，每一篩檢之標準為標準曲線對於0U/mL標準品對比3u/mL標準品在OD4055下具有信雜比(S/N)，具有低於三種(3)變化係數(CV)10%之標準品，且至少四個(4)標準品在線性範圍內。
實施例4
具有改變之玻尿酸酶活性的PH20變異體
如實施例3中所描述對每一產生之變異體篩檢玻尿酸酶活性。亦量測分泌之鹼性磷酸酶(SEAP)表現且用於相對於PH20野生型正規化每一變異體之PH20活性。鑑別與野生型相比展示改變之玻尿酸酶活性的突變體。
1. 活性突變
選擇當相對於SEAP活性正規化時至少一個複樣展示超過野生型活性之40%的活性突變體。鑑別之活性突變體闡述於表7中。在表中，指示與SEQ ID NO：3中闡述之PH20之胺基酸序列相比的胺基酸置換。該表闡述與每一盤中亦藉由其自身SEAP值正規化的野生型PH20活性之平均值相比，藉由SEAP值正規化的測試複本之平均玻尿酸酶活性。舉例而言，值0.40指示變異體顯示野生型PH20之玻尿酸酶活性之40%，值1指示變異體顯示野生型之類似玻尿酸酶活性且值3.00指示變異體顯示野生型PH20之玻尿酸酶活性之300%或與野生型相比活性增加3倍。
2. 失活突變體
在至少一個複本中展示低於野生型PH20之20%玻尿酸酶活性的其他突變體再次篩檢以證實該等失效突變體失活。為證實失活突變體，對實施例3中描述之玻尿酸酶活性分析進行修改以在量測酶活性之前併入隔夜37℃受質-樣品培育步驟。經修改之分析意欲偵測低於0.2U/mL之PH20活性。
在轉染變異體上清液或野生型PH20添加之前經bHA塗佈之盤的製備及盤的阻斷與實施例3中描述相同。分析如下修改。首先，如實施例2中所描述產生的轉染之變異體上清液或不含突變之野生型PH20在分析稀釋劑中1：25一式兩份稀釋。對於標準曲線，在分析稀釋劑中，以0.1U/mL開始下至0.00014U/mL，一式兩份製備rHuPH20(如實施例1中所描述產生)之1：3連續稀釋液。亦包括空白孔。隨後，100μl經稀釋之樣品或標準品添加至經bHA塗佈及阻斷之盤的預指定孔中且使其在37℃下培育隔夜。在培育之後，洗滌盤且如上文實施例3中所描述偵測與bHA之結合。在添加停止溶液之30分鐘內在450nm下量測光學密度。
鑑別之重新證實之失活突變體闡述於表8中。該表闡述與SEQ ID NO：3中闡述之PH20之胺基酸序列相比的胺基酸置換。
實施例5
rHuPH20之表觀熔融溫度(Tm)
在此實施例中，藉由使用動態光散射量測粒子之流體動力學半徑來測定rHuPH20之熔融溫度(Tm)。粒度增加可能歸因於rHuPH20之變性及後續聚集。當溫度增加時，蛋白質將展開且將引起聚集體形成。
簡言之，rHuPH20(批次HuB,10mg/mL儲備液)在25mM Tris-HCl pH 7.5中稀釋至1mg/mL。Z-平均粒度藉由動態光散射使用Malvern Zeta粒度儀 Nano-ZS量測，其隨溫度增加而變。在低體積石英試管(Helma,3.00mm)中在每一溫度下進行總共3次量測。溫度開始於20℃，以2℃勻變，至66℃之最終溫度，其中在每一溫度下具有5分鐘平衡期間。光散射強度使用裝備有該儀器之173°背部散射偵測器量測且用DTS(分散技術軟體)軟體，使用1.45之蛋白質樣品折射率且使用1.33之作為分散劑之水的折射率，計算累積Z-平均粒子數據。粒度顯著增加之溫度軸線上的拐點視為使蛋白質變性且開始聚集之表觀Tm(熔融溫度)。
結果展示於以下表9中，其闡述rHuPH20在各種溫度下之平均粒度。表9中之數據為每一點3個量測值之平均值，以2℃溫度遞增，具有5分鐘之平衡點。結果展示rHuPH20之Tm為約44℃。
實施例6
野生型PH20及變異F204P之溫度穩定性特徵
1. 與F204P-PH20變異體相比之野生型
實施例2中產生之表現之野生型PH20及PH20變異體F204P的上清液在轉染後96小時收集且在各種溫度下培育之後針對玻尿酸酶活性分析進行篩檢。每一收集之上清液在4℃、45℃、47℃、49℃、51℃、53℃、55℃或57℃下培育10分鐘，接著在冰上冷卻。在培育之後，每一上清液連續稀釋(9倍、27倍、81倍及243倍)且藉由如實施例3中所描述之玻尿酸酶活性分析評估玻尿酸酶活性。每一樣品進行重複反應。在添加TMB之後5分鐘停止反應，且立即使用Molecular Device SPECTRAmax plus在OD 450nm之波長下讀出。藉由使用4參數對數曲線擬合OD 450nm數據來計算標準曲線，且樣品之估計活性由標準曲線及稀釋因子內推而得。在不同溫度下野生型PH20或F204P-PH20之活性表示為在4℃下培育之上清液中特定PH20之活性的百分比，其設定為100%。
結果展示對於野生型PH20及F204P，在45℃及47℃下培育引起玻尿酸酶活性略微降低，在10分鐘培育之後剩餘約80%活性。相比之下，當上清液在超過47℃之溫度下培育時野生型PH20之穩定性實質上降低，而F204P-PH20變異體在較高溫度下展示較大穩定性。舉例而言，野生型PH20在49℃或51℃下預培育之後展示約55%-60%玻尿酸酶活性，在53℃下預培育之後展示約40%玻尿酸酶活性，在55℃下預培育之後展示約20%-25%玻尿酸酶活性，且在57℃下預培育之後展示低於20%玻尿酸酶活性。在49℃、51℃、53℃或55℃下培育之上清液中F204P-PH20變異體展示類似活性，為在4℃下培育之上清液中PH20之玻尿酸酶活性的約60%至80%。在57℃下 培育之上清液中F204P-PH20變異體之玻尿酸酶活性為在4℃下培育之上清液中PH20玻尿酸酶活性之約50%。
2. 在較高溫度下之F204P溫度特徵
因為F204P-PH20變異體在55℃之最高測試溫度下展示其玻尿酸酶活性之50%，所以用F204P-PH20變異體進一步進行分析以評估其在較高溫度下之溫度特徵。進行如部分1中所描述之分析，不同之處在於表現之F204P-PH20變異體之上清液在4℃、55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃或70℃下培育。類似於上述實驗，在55℃下培育之後F204P-PH20變異體之玻尿酸酶活性為約80%，且在57℃下培育之後為約60%。在57℃以上之溫度下培育之上清液中F204P-PH20變異體之活性不斷降低。在59℃或61℃下培育之上清液中F204P-PH20變異體之玻尿酸酶活性為約40%，且在63℃、65℃及70℃下培育之上清液中F204P-PH20變異體之玻尿酸酶活性為約或低於20%。
實施例7
PH20尤伯嗜熱蛋白變異體之分析及鑑別
在52℃下分析選自表7之展示0.4U/mL或更高活性之PH20變異體的玻尿酸酶活性。特定言之，在4℃下或在52℃下預培育上清液10分鐘之後，使用實施例4中描述之分析，對如實施例2中所描述之上清液中1,708個表現之不同變異體篩檢玻尿酸酶活性。選擇與4℃下相比在52℃下培育之後展示更大活性之PH20變異體。
1. 主要篩檢
在樣品與bHA一起培育之前，含有測試之變異PH20樣品的上清液在 HEPES分析緩衝液/轉染上清液中1：25稀釋至未經塗佈之4XHB盤之指定孔中。每一變異體之兩種不同轉染樣品用於在每一溫度下培育(稱為轉染I及轉染II)。因而，每一變異體均在4℃及52℃下一式兩份測試。隨後樣品在4℃或52℃下預培育10分鐘，接著在評估玻尿酸酶活性之前冷卻。作為對照，野生型(未經修飾之)PH20用作對照以比較每一溫度下之活性。
在轉染變異體上清液或野生型PH20添加之前經bHA塗佈之盤的製備及盤的阻斷與實施例3中描述相同。使用rHuPH20之標準曲線如實施例3中所描述製成。一百微升(100μl)每一標準品及樣品輸送至經bHA塗佈及阻斷之盤的預指定孔且在37℃下培育約1.5小時。因而，歸因於表現變異體之兩種轉染樣品(轉染I及轉染II)之初始預培育，每一變異體一式四份測試，接著每一樣品一式兩份地進一步用於bHA分析中。在培育之後，洗滌盤且如上文實施例3中所描述偵測與bHA之結合。在添加停止溶液之30分鐘內在450nm下量測光學密度(OD)。
以下表10闡述在4℃及52℃下每一測試之轉染樣品的複樣之平均OD，以及對於每一轉染，與4℃相比在52℃下殘餘活性%(52℃對4℃之活性%)。亦闡述來自兩個轉染之變異體的平均殘餘活性%。為進行比較，該表亦描繪如在相同分析盤中測試，與4℃相比在52℃下野生型(未經修飾之)PH20對照之活性%。關於序列表中之序列之SEQ ID NO為例示性變異體而提供。
2. 證實篩檢
對176個選擇之變異體完成證實篩檢。證實篩檢如上文所描述進行。結果闡述於表11中。下表闡述每一樣品所有測試之轉染及複本在4℃及52℃下的平均OD，及與4℃相比在52℃下平均殘餘活性%(52℃對4℃之活性%)。為進行比較，該表亦闡述如在相同分析盤中測試，與4℃相比在52℃下野生型(未經修飾之)PH20對照之活性%。
在證實篩檢分析中，對於一些測試之變異體，測試之變異體在4℃下的平均PH20活性比其在主要篩檢分析中實質上低。此差異可能反映在證實篩檢期間測試之上清液中轉染變異體之表現較低。舉例而言，變異N369H在主要篩檢中具有相對於SEAP表現正規化約3.50U/mL之平均活性，但在證實篩檢中幾乎無活性。其他變異體似乎在主要篩檢及證實篩檢中正常表現，如在4℃下類似活性所證明。
因為修改將為熟習此項技術者顯而易見，所以意欲本發明僅由隨附申請專利範圍之範疇限制。
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<120> 熱穩定PH20玻尿酸酶變異體及其用途
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<170> 用於Windows之FastSEQ第4.0版
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<213> 智人
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<223> 編碼含有IgGκ信號序列之PH20 36-482的人類PH20玻尿酸酶
<400> 1
<210> 2
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<212> PRT
<213> 智人
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<223> 含有IgGκ信號序列之人類PH20玻尿酸酶36-482
<400> 2
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<212> PRT
<213> 智人
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<223> 成熟人類PH20 36-482
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<213> 智人
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<213> 智人
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<213> 黑猩猩
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<223> 前驅紅狐PH20
<300>
<308> UniProtKB：Q29152
<309> 2006-11-28
<400> 30
<210> 31
<211> 505
<212> PRT
<213> 紅狐
<220>
<223> 成熟紅狐PH20
<400> 31
<210> 32
<211> 430
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 成熟人類PH20 36-465
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<210> 33
<211> 431
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 成熟人類PH20 36-466
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<211> 432
<212> PRT
<213> 智人
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<223> 成熟人類PH20 36-467
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<212> PRT
<213> 智人
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<223> 成熟人類PH20 36-468
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<212> PRT
<213> 智人
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<223> 成熟人類PH20 36-469
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 成熟人類PH20 36-485
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<212> PRT
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<220>
<223> 成熟人類PH20 36-486
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<212> PRT
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 成熟人類PH20 36-491
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<212> PRT
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<220>
<223> 成熟人類PH20 36-492
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<212> PRT
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<220>
<223> 成熟人類PH20 36-493
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<212> PRT
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<220>
<223> 成熟人類PH20 36-494
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<211> 460
<212> PRT
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<220>
<223> 成熟人類PH20 36-495
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<212> PRT
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<220>
<223> 成熟人類PH20 36-496
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<212> PRT
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<223> 成熟人類PH20 36-498
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<212> PRT
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<223> 成熟人類PH20 36-499
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<212> PRT
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<223> 成熟人類PH20 36-500
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<211> 1446
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 編碼PH20 1-482之DNA
<400> 67
<210> 68
<211> 509
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人類PH20 Ala48及Trp499
<300>
<308> GenBank：AAC60607
<309> 2000-06-05
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<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 成熟人類PH20 Ala13及Trp464
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<211> 509
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 前驅PH20 Gln5
<400> 70
<210> 71
<211> 509
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 前驅PH20 Ala47
<400> 71
<210> 72
<211> 474
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 成熟PH20 Ala12
<400> 72
<210> 73
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基10之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 73
<210> 74
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基10之位置具有N之成熟PH20 36-482
<400> 74
<210> 75
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基158之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 75
<210> 76
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基13之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 76
<210> 77
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基271之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 77
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基93之位置具有s之成熟PH20 36-482
<400> 78
<210> 79
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基26之位置具有P之成熟PH20 36-482
<400> 79
<210> 80
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基159之位置具有N之成熟PH20 36-482
<400> 80
<210> 81
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基208之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 81
<210> 82
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基26之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 82
<210> 83
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基26之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 83
<210> 84
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基26之位置具有Y之成熟PH20 36-482
<400> 84
<210> 85
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基159之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 85
<210> 86
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基447之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 86
<210> 87
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基28之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 87
<210> 88
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基29之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 88
<210> 89
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基90之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 89
<210> 90
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基29之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 90
<210> 91
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基155之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 91
<210> 92
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基29之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 92
<210> 93
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基155之位置具有F之成熟PH20 36-482
<400> 93
<210> 94
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基30之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 94
<210> 95
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基31之位置具有C之成熟PH20 36-482
<400> 95
<210> 96
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基284之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 96
<210> 97
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基342之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 97
<210> 98
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基205之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 98
<210> 99
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基32之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 99
<210> 100
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基32之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 100
<210> 101
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基162之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 101
<210> 102
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基93之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 102
<210> 103
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基31之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 103
<210> 104
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基204之位置具有P之成熟PH20 36-482
<400> 104
<210> 105
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基15之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 105
<210> 106
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基152之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 106
<210> 107
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基152之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 107
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基139之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 108
<210> 109
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基36之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 109
<210> 110
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基37之位置具有I之成熟PH20 36-482
<400> 110
<210> 111
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基445之位置具有Y之成熟PH20 36-482
<400> 111
<210> 112
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基155之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 112
<210> 113
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基380之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 113
<210> 114
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基86之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 114
<210> 115
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基315之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 115
<210> 116
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基369之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 116
<210> 117
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基174之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 117
<210> 118
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基379之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 118
<210> 119
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基428之位置具有P之成熟PH20 36-482
<400> 119
<210> 120
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基46之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 120
<210> 121
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基47之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 121
<210> 122
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基47之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 122
<210> 123
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基431之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 123
<210> 124
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基48之位置具有Y之成熟PH20 36-482
<400> 124
<210> 125
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基49之位置具有I之成熟PH20 36-482
<400> 125
<210> 126
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基41之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 126
<210> 127
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基259之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 127
<210> 128
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基39之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 128
<210> 129
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基277之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 129
<210> 130
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基277之位置具有C之成熟PH20 36-482
<400> 130
<210> 131
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基284之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 131
<210> 132
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基15之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 132
<210> 133
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基72之位置具有D之成熟PH20 36-482
<400> 133
<210> 134
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基73之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 134
<210> 135
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基83之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 135
<210> 136
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基284之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 136
<210> 137
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基83之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 137
<210> 138
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基151之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 138
<210> 139
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基371之位置具有F之成熟PH20 36-482
<400> 139
<210> 140
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基443之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 140
<210> 141
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基86之位置具有N之成熟PH20 36-482
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<210> 142
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基26之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 142
<210> 143
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基87之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 143
<210> 144
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基139之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 144
<210> 145
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基87之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 145
<210> 146
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基90之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 146
<210> 147
<211> 447
<21-2> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基90之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 147
<210> 148
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基215之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 148
<210> 149
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基33之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 149
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基33之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 150
<210> 151
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基33之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 151
<210> 152
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基154之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 152
<210> 153
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基97之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 153
<210> 154
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基33之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 154
<210> 155
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基34之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 155
<210> 156
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基285之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 156
<210> 157
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基305之位置具有N之成熟PH20 36-482
<400> 157
<210> 158
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基102之位置具有N之成熟PH20 36-482
<400> 158
<210> 159
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基105之位置具有I之成熟PH20 36-482
<400> 159
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基105之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 160
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基105之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 161
<210> 162
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基198之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 162
<210> 163
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基141之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 163
<210> 164
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基141之位置具有Y之成熟PH20 36-482
<400> 164
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基97之位置具有F之成熟PH20 36-482
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基41之位置具有D之成熟PH20 36-482
<400> 166
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基41之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 167
<210> 168
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基132之位置具有C之成熟PH20 36-482
<400> 168
<210> 169
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基135之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 169
<210> 170
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基438之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 170
<210> 171
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基165之位置具有F之成熟PH20 36-482
<400> 171
<210> 172
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基251之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 172
<210> 173
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基205之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 173
<210> 174
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基141之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 174
<210> 175
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基141之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 175
<210> 176
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基441之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 176
<210> 177
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基142之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 177
<210> 178
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基379之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 178
<210> 179
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基261之位置具有F之成熟PH20 36-482
<400> 179
<210> 180
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基163之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 180
<210> 181
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基147之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 181
<210> 182
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基34之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 182
<210> 183
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基147之位置具有I之成熟PH20 36-482
<400> 183
<210> 184
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基292之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 184
<210> 185
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基447之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 185
<210> 186
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基213之位置具有N之成熟PH20 36-482
<400> 186
<210> 187
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基379之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 187
<210> 188
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基38之位置具有Y之成熟PH20 36-482
<400> 188
<210> 189
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基152之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 189
<210> 190
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基240之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 190
<210> 191
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基380之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 191
<210> 192
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基380之位置具有P之成熟PH20 36-482
<400> 192
<210> 193
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基380之位置具有I之成熟PH20 36-482
<400> 193
<210> 194
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基159之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 194
<210> 195
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基50之位置具有C之成熟PH20 36-482
<400> 195
<210> 196
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基261之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 196
<210> 197
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基237之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 197
<210> 198
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基407之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 198
<210> 199
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基152之位置具有I之成熟PH20 36-482
<400> 199
<210> 200
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基32之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 200
<210> 201
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基155之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 201
<210> 202
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基156之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 202
<210> 203
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基156之位置具有C之成熟PH20 36-482
<400> 203
<210> 204
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基156之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 204
<210> 205
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基155之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 205
<210> 206
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基86之位置具有D之成熟PH20 36-482
<400> 206
<210> 207
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基131之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 207
<210> 208
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基159之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 208
<210> 209
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基205之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 209
<210> 210
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基208之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 210
<210> 211
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基328之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 211
<210> 212
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基328之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 212
<210> 213
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基161之位置具有D之成熟PH20 36-482
<400> 213
<210> 214
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基373之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 214
<210> 215
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基144之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 215
<210> 216
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基310之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 216
<210> 217
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基29之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 217
<210> 218
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基235之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 218
<210> 219
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基170之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 219
<210> 220
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基58之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 220
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 224
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基87之位置具有P之成熟PH20 36-482
<400> 224
<210> 225
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基99之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 225
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基276之位置具有E之成熟PH20 36-482
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 228
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 230
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基410之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 230
<210> 231
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基159之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 231
<210> 232
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基195之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 232
<210> 233
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基205之位置具有P之成熟PH20 36-482
<400> 233
<210> 234
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基205之位置具有S之成熟PH20 36-482
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 235
<210> 236
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基155之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 236
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基208之位置具有L之成熟PH20 36-482
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基446之位置具有E之成熟PH20 36-482
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基446之位置具有G之成熟PH20 36-482
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基321之位置具有R之成熟PH20 36-482
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<210> 241
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基48之位置具有G之成熟PH20 36-482
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<210> 242
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基215之位置具有A之成熟PH20 36-482
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基215之位置具有D之成熟PH20 36-482
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基215之位置具有T之成熟PH20 36-482
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<210> 248
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基215之位置具有W之成熟PH20 36-482
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基219之位置具有A之成熟PH20 36-482
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<210> 250
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基219之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 250
<210> 251
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基219之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 251
<210> 252
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基219之位置具有T之成熟PH20 36-482
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基321之位置具有A之成熟PH20 36-482
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 255
<210> 256
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 258
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基83之位置具有Q之成熟PH20 36-482
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 259
<210> 260
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 261
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基255之位置具有R之成熟PH20 36-482
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<210> 262
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基251之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 262
<210> 263
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基260之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 263
<210> 264
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基155之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 264
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基247之位置具有I之成熟PH20 36-482
<400> 265
<210> 266
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基317之位置具有N之成熟PH20 36-482
<400> 266
<210> 267
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基29之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 267
<210> 268
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基265之位置具有I之成熟PH20 36-482
<400> 268
<210> 269
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基206之位置具有I之成熟PH20 36-482
<400> 269
<210> 270
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基377之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 270
<210> 271
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基421之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 271
<210> 272
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基155之位置具有D之成熟PH20 36-482
<400> 272
<210> 273
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基277之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 273
<210> 274
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基277之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 274
<210> 275
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基278之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 275
<210> 276
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基278之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 276
<210> 277
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基278之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 277
<210> 278
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基69之位置具有Y之成熟PH20 36-482
<400> 278
<210> 279
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基282之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 279
<210> 280
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基114之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 280
<210> 281
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基118之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 281
<210> 282
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基368之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 282
<210> 283
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基368之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 283
<210> 284
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基163之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 284
<210> 285
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基285之位置具有Y之成熟PH20 36-482
<400> 285
<210> 286
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基290之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 286
<210> 287
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基213之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 287
<210> 288
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基305之位置具有D之成熟PH20 36-482
<400> 288
<210> 289
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基446之位置具有D之成熟PH20 36-482
<400> 289
<210> 290
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基27之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 290
<210> 291
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基309之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 291
<210> 292
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基309之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 292
<210> 293
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基309之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 293
<210> 294
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基310之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 294
<210> 295
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基98之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 295
<210> 296
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基412之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 296
<210> 297
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基120之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 297
<210> 298
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基311之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 298
<210> 299
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基132之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 299
<210> 300
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基39之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 300
<210> 301
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基318之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 301
<210> 302
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基318之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 302
<210> 303
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基318之位置具有N之成熟PH20 36-482
<400> 303
<210> 304
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基318之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 304
<210> 305
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基320之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 305
<210> 306
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基146之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 306
<210> 307
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基321之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 307
<210> 308
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基147之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 308
<210> 309
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基148之位置具有C之成熟PH20 36-482
<400> 309
<210> 310
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基148之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 310
<210> 311
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基148之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 311
<210> 312
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基343之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 312
<210> 313
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基349之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 313
<210> 314
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基349之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 314
<210> 315
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基359之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 315
<210> 316
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基102之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 316
<210> 317
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基406之位置具有N之成熟PH20 36-482
<400> 317
<210> 318
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基407之位置具有F之成熟PH20 36-482
<400> 318
<210> 319
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基371之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 319
<210> 320
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基37之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 320
<210> 321
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基371之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 321
<210> 322
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基371之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 322
<210> 323
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基161之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 323
<210> 324
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基374之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 324
<210> 325
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基374之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 325
<210> 326
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基375之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 326
<210> 327
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基376之位置具有Y之成熟PH20 36-482
<400> 327
<210> 328
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基439之位置具有C之成熟PH20 36-482
<400> 328
<210> 329
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基30之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 329
<210> 330
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基205之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 330
<210> 331
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基433之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 331
<210> 332
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基433之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 332
<210> 333
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基138之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 333
<210> 334
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基26之位置具有S之成熟PH20 36-482
<400> 334
<210> 335
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基94之位置具有N之成熟PH20 36-482
<400> 335
<210> 336
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基380之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 336
<210> 337
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基32之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 337
<210> 338
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基389之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 338
<210> 339
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基393之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 339
<210> 340
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基399之位置具有R之成熟PH20 36-482
<400> 340
<210> 341
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基399之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 341
<210> 342
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基401之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 342
<210> 343
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基403之位置具有F之成熟PH20 36-482
<400> 343
<210> 344
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基259之位置具有P之成熟PH20 36-482
<400> 344
<210> 345
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基86之位置具有E之成熟PH20 36-482
<400> 345
<210> 346
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基407之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 346
<210> 347
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基407之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 347
<210> 348
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基407之位置具有P之成熟PH20 36-482
<400> 348
<210> 349
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基163之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 349
<210> 350
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基260之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 350
<210> 351
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基388之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 351
<210> 352
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基131之位置具有C之成熟PH20 36-482
<400> 352
<210> 353
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基195之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 353
<210> 354
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基413之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 354
<210> 355
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基415之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 355
<210> 356
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基417之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 356
<210> 357
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基419之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 357
<210> 358
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基421之位置具有I之成熟PH20 36-482
<400> 358
<210> 359
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基67之位置具有F之成熟PH20 36-482
<400> 359
<210> 360
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基69之位置具有A之成熟PH20 36-482
<400> 360
<210> 361
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基222之位置具有N之成熟PH20 36-482
<400> 361
<210> 362
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基431之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 362
<210> 363
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基263之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 363
<210> 364
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基50之位置具有D之成熟PH20 36-482
<400> 364
<210> 365
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基434之位置具有I之成熟PH20 36-482
<400> 365
<210> 366
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基434之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 366
<210> 367
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基435之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 367
<210> 368
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基39之位置具有Q之成熟PH20 36-482
<400> 368
<210> 369
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基215之位置具有H之成熟PH20 36-482
<400> 369
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<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基439之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 370
<210> 371
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基440之位置具有M之成熟PH20 36-482
<400> 371
<210> 372
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基150之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 372
<210> 373
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基441之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 373
<210> 374
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基442之位置具有P之成熟PH20 36-482
<400> 374
<210> 375
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基196之位置具有T之成熟PH20 36-482
<400> 375
<210> 376
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基92之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 376
<210> 377
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基160之位置具有Y之成熟PH20 36-482
<400> 377
<210> 378
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基311之位置具有G之成熟PH20 36-482
<400> 378
<210> 379
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基205之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 379
<210> 380
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基31之位置具有L之成熟PH20 36-482
<400> 380
<210> 381
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基447之位置具有D之成熟PH20 36-482
<400> 381
<210> 382
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基34之位置具有W之成熟PH20 36-482
<400> 382
<210> 383
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基58之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 383
<210> 384
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基220之位置具有V之成熟PH20 36-482
<400> 384
<210> 385
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基60之位置具有K之成熟PH20 36-482
<400> 385
<210> 386
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 在對應於胺基酸殘基30之位置具有P之成熟PH20 36-482
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<212> PRT
<213> 白頰長臂猿
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<223> 前驅PH20同功異構物1
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<210> 388
<211> 474
<212> PRT
<213> 白頰長臂猿
<220>
<223> 成熟PH-20同功異構物1
<400> 388
<210> 389
<211> 509
<212> PRT
<213> 白鬢狨
<220>
<223> 前驅PH-20
<300>
<308> NCBI：XP 002752103
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<210> 390
<211> 474
<212> PRT
<213> 白鬢狨
<220>
<223> 成熟PH-20
<400> 390
<210> 391
<211> 511
<212> PRT
<213> 蘇門答臘猩猩
<220>
<223> 前驅PH-20同功異構物1
<300>
<308> NCBI：XP 002818442
<309> 2012-06-17
<400> 391
<210> 392
<211> 476
<212> PRT
<213> 蘇門答臘猩猩
<220>
<223> 成熟PH-20同功異構物1
<400> 392
<210> 393
<211> 21
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人類胰島素A鏈
<400> 393
<210> 394
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人類胰島素B鏈
<400> 394
<210> 395
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人類胰島素B鏈類似物(門冬胰島素)
<400> 395
<210> 396
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人類胰島素B鏈類似物(賴脯胰島素)
<400> 396
<210> 397
<211> 30
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 人類胰島素B鏈類似物(賴麩胰島素)
<400> 397
<210> 398
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgGK信號序列
<400> 398
<210> 399
<211> 509
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<220>
<223> 前驅PH-20
<300>
<308> GenBank：BAK62198
<309> 2011-08-20
<400> 399
<210> 400
<211> 474
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<220>
<223> 成熟PH-20
<400> 400
<210> 401
<211> 450
<212> PRT
<213> 歐洲牛
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 401
<210> 402
<211> 331
<212> PRT
<213> 普通黃胡蜂
<220>
<223> 玻尿酸酶A
<400> 402
<210> 403
<211> 340
<212> PRT
<213> 普通黃胡蜂
<220>
<223> 玻尿酸酶B
<400> 403
<210> 404
<211> 382
<212> PRT
<213> 西方蜜蜂
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 404
<2110> 405
<211> 331
<212> PRT
<213> 斑長黃胡蜂
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 405
<210> 406
<211> 367
<212> PRT
<213> 紙黃蜂
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 406
<210> 407
<211> 462
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 407
<210> 408
<211> 473
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 玻尿酸酶2
<400> 408
<210> 409
<211> 412
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> 玻尿酸酶3
<400> 409
<210> 410
<211> 435
<212> PRT
<213> 野豬
<220>
<223> 玻尿酸酶
<400> 410
<210> 411
<211> 419
<212> PRT
<213> 野豬
<220>
<223> 玻尿酸酶3
<400> 411
<210> 412
<211> 449
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<220>
<223> 玻尿酸酶1
<400> 412
<210> 413
<211> 473
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<220>
<223> 玻尿酸酶2
<400> 413
<210> 414
<211> 412
<212> PRT
<213> 褐家鼠
<220>
<223> 玻尿酸酶3
<400> 414
<210> 415
<211> 476
<212> PRT
<213> 綿羊
<220>
<223> 玻尿酸酶2
<400> 415
<210> 416
<211> 414
<212> PRT
<213> 婆羅洲猩猩
<220>
<223> 玻尿酸酶3
<400> 416
<210> 417
<211> 435
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 玻尿酸酶-1[前驅體]
<400> 417
<210> 418
<211> 473
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 玻尿酸酶-2[前驅體]
<400> 418
<210> 419
<211> 417
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 玻尿酸酶-3[前驅體]
<400> 419
<210> 420
<211> 481
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 玻尿酸酶-4
<400> 420
<210> 421
<211> 793
<212> PRT
<213> 節細菌屬
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶(菌株FB24)
<400> 421
<210> 422
<211> 557
<212> PRT
<213> 食菌蛭弧菌
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 422
<210> 423
<211> 813
<212> PRT
<213> 痤瘡丙酸桿菌
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 423
<210> 424
<211> 1072
<212> PRT
<213> 無乳鏈球菌
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 424
<210> 425
<211> 1072
<212> PRT
<213> 無乳鏈球菌18RS21
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 425
<210> 426
<211> 1081
<212> PRT
<213> 無乳鏈球菌血清型Ia
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 426
<210> 427
<211> 984
<212> PRT
<213> 無乳鏈球菌血清型III
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 427
<210> 428
<211> 807
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(菌株COL)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 428
<210> 429
<211> 420
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(菌株MRSA252)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 429
<210> 430
<211> 806
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(菌株MRSA252)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 430
<210> 431
<211> 815
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(菌株MSSA476)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 431
<210> 432
<211> 807
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(菌株NCTC 8325)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 432
<210> 433
<211> 809
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(牛菌株RF122)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 433
<210> 434
<211> 807
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(牛菌株RF122)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 434
<210> 435
<211> 807
<212> PRT
<213> 金黃色葡萄球菌(菌株USA300)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 435
<210> 436
<211> 1066
<212> PRT
<213> 肺炎鏈球菌
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 436
<210> 437
<211> 1078
<212> PRT
<213> 肺炎鏈球菌(菌株ATCC BAA-255/R6)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 437
<210> 438
<211> 1067
<212> PRT
<213> 肺炎鏈球菌血清型2(菌株D39/N)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 438
<210> 439
<211> 805
<212> PRT
<213> 釀膿鏈球菌血清型M1
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 439
<210> 440
<211> 780
<212> PRT
<213> 釀膿鏈球菌血清型M2(菌株MGAS10)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 440
<210> 441
<211> 868
<212> PRT
<213> 釀膿鏈球菌血清型M4(菌株MGAS10)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 441
<210> 442
<211> 828
<212> PRT
<213> 釀膿鏈球菌血清型M6
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 442
<210> 443
<211> 556
<212> PRT
<213> 釀膿鏈球菌血清型M12(菌株MGAS2)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 443
<210> 444
<211> 635
<212> PRT
<213> 釀膿鏈球菌血清型M12(菌株MGAS2)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 444
<210> 445
<211> 828
<212> PRT
<213> 釀膿鏈球菌血清型M12(菌株MGAS9)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 445
<210> 446
<211> 828
<212> PRT
<213> 釀膿鏈球菌血清型M28
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 446
<210> 447
<211> 522
<212> PRT
<213> 豬鏈球菌
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 447
<210> 448
<211> 1164
<212> PRT
<213> 豬鏈球菌
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 448
<210> 449
<211> 1164
<212> PRT
<213> 豬鏈球菌
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 449
<210> 450
<211> 802
<212> PRT
<213> 費氏弧菌(菌株ATCC 700601/ES114)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 450
<210> 451
<211> 517
<212> PRT
<213> 聚球藻屬(菌株RCC307)
<220>
<223> 玻尿酸裂解酶
<400> 451
<210> 452
<211> 1021
<212> PRT
<213> 普通變形桿菌
<220>
<223> 硫酸軟骨素-ABC內裂解酶
<400> 452
<210> 453
<211> 684
<212> PRT
<213> 肝素黃桿菌
<220>
<223> 軟骨素AC裂解酶
<400> 453
<210> 454
<211> 844
<212> PRT
<213> 維德食物穀菌ATCC BAA-548
<220>
<223> 軟骨素AC裂解酶
<400> 454

Claims (102)

  1. 一種經修飾之PH20多肽，其為顯示熱穩定性之尤伯嗜熱蛋白(uber-thermophile)，其中：該經修飾之PH20多肽在未經修飾之PH20多肽中包含胺基酸置換，從而與在4℃下培育10分鐘之後該多肽之玻尿酸酶活性相比，該多肽在52℃下培育10分鐘之後在中性pH值下保留其玻尿酸酶活性之至少50%；及該未經修飾之PH20多肽由SEQ ID NO7中闡述之胺基酸序列組成，或為可溶性PH20多肽之其C端截短片段，或與SEQ ID NO：7具有至少85%序列一致性之胺基酸序列或其可溶性C端截短片段。
  2. 如申請專利範圍第1項之經修飾之PH20多肽，其在參考SEQ ID NO：3中闡述之序列的胺基酸位置，對應於選自以下之位置的胺基酸位置包含至少一個胺基酸置換：10、11、13、15、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37、38、39、41、46、47、48、49、50、58、60、67、69、72、73、83、84、86、87、90、92、93、94、97、98、99、102、105、114、118、120、131、132、135、138、139、141、142、143、144、146、147、148、150、151、152、154、155、156、158、159、160、161、162、163、165、170、174、195、196、197、198、202、204、205、206、208、213、215、219、220、222、234、235、237、240、247、251、255、259、260、261、263、265、271、276、277、278、282、284、285、290、292、305、306、309、310、311、315、317、318、320、321、328、342、343、349、359、368、369、371、373、374、375、376、377、379、380、388、 389、393、399、401、403、406、407、410、412、413、415、417、419、421、428、431、433、434、435、438、439、440、441、442、443、445、446及447，其中對應胺基酸位置係藉由將該PH20多肽與SEQ ID NO：3中闡述之多肽進行比對(alignment)來鑑別。
  3. 如申請專利範圍第2項之經修飾之PH20多肽，其中該置換為選自以下之胺基酸置換：在對應於位置10之位置，經G或N置換；在對應於位置11之位置，經G置換；在對應於位置13之位置，經H置換；在對應於位置15之位置，經A或V置換；在對應於位置26之位置，經P、R、S、V、W或Y置換；在對應於位置27之位置，經E或H置換；在對應於位置28之位置，經L置換；在對應於位置29之位置，經E、H、L、S或W置換；在對應於位置30之位置，經A、P或R置換；在對應於位置31之位置，經C、G或L置換；在對應於位置32之位置，經Q、S、V或W置換；在對應於位置33之位置，經G、M、R或W置換；在對應於位置34之位置，經E、H或W置換；在對應於位置36之位置，經G置換；在對應於位置37之位置，經I或K置換；在對應於位置38之位置，經Y置換； 在對應於位置39之位置，經Q、R或T置換；在對應於位置41之位置，經D、T或W置換；在對應於位置46之位置，經H置換；在對應於位置47之位置，經G或R置換；在對應於位置48之位置，經G或Y置換；在對應於位置49之位置，經I置換；在對應於位置50之位置，經C或D置換；在對應於位置58之位置，經K或R置換；在對應於位置60之位置，經K置換；在對應於位置67之位置，經F置換；在對應於位置69之位置，經A或Y置換；在對應於位置72之位置，經D置換；在對應於位置73之位置，經T置換；在對應於位置83之位置，經G、Q或V置換；在對應於位置84之位置，經D置換；在對應於位置86之位置，經D、E、N或R置換；在對應於位置87之位置，經M、P或V置換；在對應於位置90之位置，經E、T或W置換；在對應於位置92之位置，經V置換；在對應於位置93之位置，經E或S置換；在對應於位置94之位置，經N置換；在對應於位置97之位置，經E或F置換； 在對應於位置98之位置，經M置換；在對應於位置99之位置，經S置換；在對應於位置102之位置，經H或N置換；在對應於位置105之位置，經I、R或W置換；在對應於位置114之位置，經G置換；在對應於位置118之位置，經M置換；在對應於位置120之位置，經S置換；在對應於位置131之位置，經C或L置換；在對應於位置132之位置，經A或C置換；在對應於位置135之位置，經Q置換；在對應於位置138之位置，經W置換；在對應於位置139之位置，經R或V置換；在對應於位置141之位置，經M、Q、W或Y置換；在對應於位置142之位置，經Q置換；在對應於位置143之位置，經K置換；在對應於位置144之位置，經G置換；在對應於位置146之位置，經V置換；在對應於位置147之位置，經G、I或M置換；在對應於位置148之位置，經C、H或K置換；在對應於位置150之位置，經L置換；在對應於位置151之位置，經Q置換；在對應於位置152之位置，經A、I、M或T置換； 在對應於位置154之位置，經R置換；在對應於位置155之位置，經A、D、F、H、L、R、S或V置換；在對應於位置156之位置，經A、C或Q置換；在對應於位置158之位置，經H置換；在對應於位置159之位置，經A、H、N、Q或S置換；在對應於位置160之位置，經Y置換；在對應於位置161之位置，經A或D置換；在對應於位置162之位置，經L置換；在對應於位置163之位置，經K、R或S置換；在對應於位置165之位置，經F置換；在對應於位置170之位置，經R置換；在對應於位置174之位置，經W置換；在對應於位置195之位置，經H、L或N置換；在對應於位置196之位置，經T置換；在對應於位置197之位置，經F置換；在對應於位置198之位置，經L置換；在對應於位置202之位置，經M置換；在對應於位置204之位置，經P置換；在對應於位置205之位置，經A、E、K、L、P、S或T置換；在對應於位置206之位置，經I置換；在對應於位置208之位置，經L、Q或R置換；在對應於位置213之位置，經E或N置換； 在對應於位置215之位置，經A、D、E、H、T、V或W置換；在對應於位置219之位置，經A、R、S或T置換；在對應於位置220之位置，經V置換；在對應於位置222之位置，經N置換；在對應於位置234之位置，經M置換；在對應於位置235之位置，經T置換；在對應於位置237之位置，經Q置換；在對應於位置240之位置，經Q置換；在對應於位置247之位置，經I置換；在對應於位置251之位置，經L或M置換；在對應於位置255之位置，經R置換；在對應於位置259之位置，經K或P置換；在對應於位置260之位置，經G或M置換；在對應於位置261之位置，經A或F置換；在對應於位置263之位置，經T置換；在對應於位置265之位置，經I置換；在對應於位置271之位置，經V置換；在對應於位置276之位置，經E置換；在對應於位置277之位置，經A、C、E或H置換；在對應於位置278之位置，經G、H、K或N置換；在對應於位置282之位置，經G或Q置換；在對應於位置284之位置，經A、Q或S置換； 在對應於位置285之位置，經M或Y置換；在對應於位置290之位置，經M置換；在對應於位置292之位置，經V置換；在對應於位置305之位置，經D或N置換；在對應於位置306之位置，經D置換；在對應於位置309之位置，經E、H或L置換；在對應於位置310之位置，經Q或R置換；在對應於位置311之位置，經G或K置換；在對應於位置315之位置，經T置換；在對應於位置317之位置，經N置換；在對應於位置318之位置，經K、M、N或Q置換；在對應於位置320之位置，經R置換；在對應於位置321之位置，經A、H或R置換；在對應於位置328之位置，經L或R置換；在對應於位置342之位置，經A置換；在對應於位置343之位置，經V置換；在對應於位置349之位置，經A或E置換；在對應於位置359之位置，經E置換；在對應於位置368之位置，經H或K置換；在對應於位置369之位置，經H置換；在對應於位置371之位置，經E、F、M或T置換；在對應於位置373之位置，經S置換； 在對應於位置374之位置，經A或V置換；在對應於位置375之位置，經T置換；在對應於位置376之位置，經Y置換；在對應於位置377之位置，經T置換；在對應於位置379之位置，經H、S或T置換；在對應於位置380之位置，經I、L、P、T或V置換；在對應於位置388之位置，經H置換；在對應於位置389之位置，經K置換；在對應於位置393之位置，經L置換；在對應於位置399之位置，經R或W置換；在對應於位置401之位置，經G置換；在對應於位置403之位置，經F置換；在對應於位置406之位置，經N置換；在對應於位置407之位置，經F、H、M、P或Q置換；在對應於位置410之位置，經S置換；在對應於位置412之位置，經G、P或S置換；在對應於位置413之位置，經Q或T置換；在對應於位置415之位置，經W置換；在對應於位置417之位置，經L置換；在對應於位置419之位置，經L置換；在對應於位置421之位置，經I或M置換；在對應於位置428之位置，經P置換； 在對應於位置431之位置，經A或G置換；在對應於位置433之位置，經L或T置換；在對應於位置434之位置，經I或M置換；在對應於位置435之位置，經H置換；在對應於位置438之位置，經A置換；在對應於位置439之位置，經C或T置換；在對應於位置440之位置，經M置換；在對應於位置441之位置，經T或V置換；在對應於位置442之位置，經P置換；在對應於位置443之位置，經M置換；在對應於位置445之位置，經Y置換；在對應於位置446之位置，經C、D、E或G置換；及在對應於位置447之位置，經D、E或G置換，每一者參考SEQ ID NO：3中闡述之序列之胺基酸位置。
  4. 如申請專利範圍第1項之經修飾之PH20多肽，其中與在4℃下培育10分鐘之後的其玻尿酸酶活性相比，在52℃下培育10分鐘之後該經修飾之PH20多肽保留其玻尿酸酶活性之至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上。
  5. 如申請專利範圍第1項之經修飾之PH20多肽，其包含至少一個選自如下置換之胺基酸置換：參考SEQ ID NO：3中闡述之序列之胺基酸殘基位置，在對應於位置11之位置經甘胺酸(G)置換；在對應於位置15之位置經A置換；在對應於位置15之位置經V置換；在對應於位置 26之位置經R置換；在對應於位置26之位置經S置換；在對應於位置27之位置經E置換；在對應於位置27之位置經H置換；在對應於位置29之位置經H置換；在對應於位置29之位置經S置換；在對應於位置30之位置經A置換；在對應於位置30之位置經P置換；在對應於位置31之位置經G置換；在對應於位置31之位置經L置換；在對應於位置32之位置經Q置換；在對應於位置32之位置經W置換；在對應於位置33之位置經G置換；在對應於位置33之位置經M置換；在對應於位置33之位置經R置換；在對應於位置33之位置經W置換；在對應於位置34之位置經E置換；在對應於位置34之位置經H置換；在對應於位置34之位置經W置換；在對應於位置37之位置經K置換；在對應於位置38之位置經Y置換；在對應於位置39之位置經Q置換；在對應於位置39之位置經R置換；在對應於位置39之位置經T置換；在對應於位置41之位置經D置換；在對應於位置41之位置經T置換；在對應於位置41之位置經W置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置50之位置經C置換；在對應於位置50之位置經D置換；在對應於位置58之位置經K置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置60之位置經K置換；在對應於位置67之位置經F置換；在對應於位置69之位置經A置換；在對應於位置69之位置經Y置換；在對應於位置83之位置經Q置換；在對應於位置84之位置經D置換；在對應於位置86之位置經D置換；在對應於位置86之位置經E置換；在對應於位置86之位置經R置換；在對應於位置87之位置經P置換；在對應於位置90之位置經W置換；在對應於位置92之位置經V置換； 在對應於位置93之位置經E置換；在對應於位置93之位置經S置換；在對應於位置94之位置經N置換；在對應於位置97之位置經F置換；在對應於位置98之位置經M置換；在對應於位置99之位置經S置換；在對應於位置102之位置經H置換；在對應於位置114之位置經G置換；在對應於位置118之位置經M置換；在對應於位置120之位置經S置換；在對應於位置131之位置經C置換；在對應於位置131之位置經L置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置138之位置經W置換；在對應於位置139之位置經R置換；在對應於位置139之位置經V置換；在對應於位置141之位置經M置換；在對應於位置141之位置經Y置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置144之位置經G置換；在對應於位置146之位置經V置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置148之位置經K置換；在對應於位置150之位置經L置換；在對應於位置151之位置經Q置換；在對應於位置152之位置經I置換；在對應於位置152之位置經M置換；在對應於位置152之位置經T置換；在對應於位置154之位置經R置換；在對應於位置155之位置經A置換；在對應於位置155之位置經D置換；在對應於位置155之位置經F置換；在對應於位置155之位置經H置換；在對應於位置155之位置經L置換；在對應於位置155之位置經R置換；在對應於位置155之位置經S置換；在對應於位置158之位置經H置換；在對應於位置159之位置經A置換；在對應於位置159之位置經H置換； 在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置159之位置經Q置換；在對應於位置159之位置經S置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置161之位置經A置換；在對應於位置162之位置經L置換；在對應於位置163之位置經K置換；在對應於位置163之位置經R置換；在對應於位置163之位置經S置換；在對應於位置165之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置195之位置經H置換；在對應於位置195之位置經L置換；在對應於位置196之位置經T置換；在對應於位置197之位置經F置換；在對應於位置198之位置經L置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置205之位置經E置換；在對應於位置205之位置經K置換；在對應於位置205之位置經L置換；在對應於位置205之位置經T置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置208之位置經Q置換；在對應於位置208之位置經R置換；在對應於位置213之位置經E置換；在對應於位置213之位置經N置換；在對應於位置215之位置經E置換；在對應於位置215之位置經H置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置222之位置經N置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置237之位置經Q置換；在對應於位置240之位置經Q置換；在對應於位置247之位置經I置換；在對應於位置251之位置經L置換；在對應於位置251之位置經M置換；在對應於位置259之位置經K置換；在對應於位置259之位置經P置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F 置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置271之位置經V置換；在對應於位置276之位置經E置換；在對應於位置277之位置經A置換；在對應於位置277之位置經C置換；在對應於位置278之位置經N置換；在對應於位置282之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置285之位置經M置換；在對應於位置292之位置經V置換；在對應於位置305之位置經N置換；在對應於位置306之位置經D置換；在對應於位置310之位置經R置換；在對應於位置311之位置經G置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置317之位置經N置換；在對應於位置321之位置經A置換；在對應於位置321之位置經R置換；在對應於位置328之位置經L置換；在對應於位置328之位置經R置換；在對應於位置342之位置經A置換；在對應於位置368之位置經H置換；在對應於位置368之位置經K置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置371之位置經F置換；在對應於位置373之位置經S置換；在對應於位置377之位置經T置換；在對應於位置379之位置經H置換；在對應於位置379之位置經S置換；在對應於位置379之位置經T置換；在對應於位置380之位置經I置換；在對應於位置380之位置經L置換；在對應於位置380之位置經P置換；在對應於位置380之位置經T置換；在對應於位置388之位置經H置換；在對應於位置406之位置經N置換；在對應於位置407之位置經F置換；在對應於位置407之位置經Q置換；在對應於位置410之位置經S置換；在對應於位置412之位置 經G置換；在對應於位置412之位置經P置換；在對應於位置412之位置經S置換；在對應於位置413之位置經Q置換；在對應於位置421之位置經M置換；在對應於位置428之位置經P置換；在對應於位置431之位置經A置換；在對應於位置433之位置經L置換；在對應於位置433之位置經T置換；在對應於位置438之位置經A置換；在對應於位置439之位置經C置換；在對應於位置441之位置經T置換；在對應於位置443之位置經M置換；在對應於位置445之位置經Y置換；在對應於位置446之位置經C置換；在對應於位置446之位置經D置換；在對應於位置446之位置經E置換；在對應於位置446之位置經G置換；在對應於位置447之位置經E置換；及在對應於位置447之位置經G置換。
  6. 如申請專利範圍第1項之經修飾之PH20多肽，其與該未經修飾之PH20多肽相比僅含有一個胺基酸置換。
  7. 如申請專利範圍第1項之經修飾之PH20多肽，其與該未經修飾之PH20多肽相比含有至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個胺基酸置換。
  8. 如申請專利範圍第7項之經修飾之PH20多肽，其包含至少2個選自如下置換之胺基酸置換：參考SEQ ID NO：3中闡述之序列之胺基酸殘基位置，在對應於位置11之位置經甘胺酸(G)置換；在對應於位置15之位置經A置換；在對應於位置15之位置經V置換；在對應於位置26之位置經R置換；在對應於位置26之位置經S置換；在對應於位置27之位置經E置換；在對應於位置27之位置經H置換；在對應於位 置29之位置經H置換；在對應於位置29之位置經S置換；在對應於位置30之位置經A置換；在對應於位置30之位置經P置換；在對應於位置31之位置經G置換；在對應於位置31之位置經L置換；在對應於位置32之位置經Q置換；在對應於位置32之位置經W置換；在對應於位置33之位置經G置換；在對應於位置33之位置經M置換；在對應於位置33之位置經R置換；在對應於位置33之位置經W置換；在對應於位置34之位置經E置換；在對應於位置34之位置經H置換；在對應於位置34之位置經W置換；在對應於位置37之位置經K置換；在對應於位置38之位置經Y置換；在對應於位置39之位置經Q置換；在對應於位置39之位置經R置換；在對應於位置39之位置經T置換；在對應於位置41之位置經D置換；在對應於位置41之位置經T置換；在對應於位置41之位置經W置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置50之位置經C置換；在對應於位置50之位置經D置換；在對應於位置58之位置經K置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置60之位置經K置換；在對應於位置67之位置經F置換；在對應於位置69之位置經A置換；在對應於位置69之位置經Y置換；在對應於位置83之位置經Q置換；在對應於位置84之位置經D置換；在對應於位置86之位置經D置換；在對應於位置86之位置經E置換；在對應於位置86之位置經R置換；在對應於位置87之位置經P置換；在對應於位置90之位置經W置換；在對應於位置92之位置經V置換；在對應於位置93之位置經E置換；在對應於位置93之位置經S置換；在對應於位置94之位置經N置換；在對應於位置97之位置經F置換； 在對應於位置98之位置經M置換；在對應於位置99之位置經S置換；在對應於位置102之位置經H置換；在對應於位置114之位置經G置換；在對應於位置118之位置經M置換；在對應於位置120之位置經S置換；在對應於位置131之位置經C置換；在對應於位置131之位置經L置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置138之位置經W置換；在對應於位置139之位置經R置換；在對應於位置139之位置經V置換；在對應於位置141之位置經M置換；在對應於位置141之位置經Y置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置144之位置經G置換；在對應於位置146之位置經V置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置148之位置經K置換；在對應於位置150之位置經L置換；在對應於位置151之位置經Q置換；在對應於位置152之位置經I置換；在對應於位置152之位置經M置換；在對應於位置152之位置經T置換；在對應於位置154之位置經R置換；在對應於位置155之位置經A置換；在對應於位置155之位置經D置換；在對應於位置155之位置經F置換；在對應於位置155之位置經H置換；在對應於位置155之位置經L置換；在對應於位置155之位置經R置換；在對應於位置155之位置經S置換；在對應於位置158之位置經H置換；在對應於位置159之位置經A置換；在對應於位置159之位置經H置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置159之位置經Q置換；在對應於位置159之位置經S置換；在對應於位置160之位置經Y 置換；在對應於位置161之位置經A置換；在對應於位置162之位置經L置換；在對應於位置163之位置經K置換；在對應於位置163之位置經R置換；在對應於位置163之位置經S置換；在對應於位置165之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置195之位置經H置換；在對應於位置195之位置經L置換；在對應於位置196之位置經T置換；在對應於位置197之位置經F置換；在對應於位置198之位置經L置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置205之位置經E置換；在對應於位置205之位置經K置換；在對應於位置205之位置經L置換；在對應於位置205之位置經T置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置208之位置經Q置換；在對應於位置208之位置經R置換；在對應於位置213之位置經E置換；在對應於位置213之位置經N置換；在對應於位置215之位置經E置換；在對應於位置215之位置經H置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置222之位置經N置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置237之位置經Q置換；在對應於位置240之位置經Q置換；在對應於位置247之位置經I置換；在對應於位置251之位置經L置換；在對應於位置251之位置經M置換；在對應於位置259之位置經K置換；在對應於位置259之位置經P置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置271之位置經V置換；在對應於位置276之位置經E置換；在對應於位置277之 位置經A置換；在對應於位置277之位置經C置換；在對應於位置278之位置經N置換；在對應於位置282之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置285之位置經M置換；在對應於位置292之位置經V置換；在對應於位置305之位置經N置換；在對應於位置306之位置經D置換；在對應於位置310之位置經R置換；在對應於位置311之位置經G置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置317之位置經N置換；在對應於位置321之位置經A置換；在對應於位置321之位置經R置換；在對應於位置328之位置經L置換；在對應於位置328之位置經R置換；在對應於位置342之位置經A置換；在對應於位置368之位置經H置換；在對應於位置368之位置經K置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置371之位置經F置換；在對應於位置373之位置經S置換；在對應於位置377之位置經T置換；在對應於位置379之位置經H置換；在對應於位置379之位置經S置換；在對應於位置379之位置經T置換；在對應於位置380之位置經I置換；在對應於位置380之位置經L置換；在對應於位置380之位置經P置換；在對應於位置380之位置經T置換；在對應於位置388之位置經H置換；在對應於位置406之位置經N置換；在對應於位置407之位置經F置換；在對應於位置407之位置經Q置換；在對應於位置410之位置經S置換；在對應於位置412之位置經G置換；在對應於位置412之位置經P置換；在對應於位置412之位置經S置換；在對應於位置413之位置經Q置換；在對應於位置421 之位置經M置換；在對應於位置428之位置經P置換；在對應於位置431之位置經A置換；在對應於位置433之位置經L置換；在對應於位置433之位置經T置換；在對應於位置438之位置經A置換；在對應於位置439之位置經C置換；在對應於位置441之位置經T置換；在對應於位置443之位置經M置換；在對應於位置445之位置經Y置換；在對應於位置446之位置經C置換；在對應於位置446之位置經D置換；在對應於位置446之位置經E置換；在對應於位置446之位置經G置換；在對應於位置447之位置經E置換；及在對應於位置447之位置經G置換。
  9. 如申請專利範圍第1項之經修飾之PH20多肽，其中該/該等胺基酸置換選自如下置換：參考SEQ ID NO：3中之位置，在對應於位置15之位置經丙胺酸(A)置換；在對應於位置15之位置經V置換；在對應於位置26之位置經R置換；在對應於位置27之位置經E置換；在對應於位置29之位置經S置換；在對應於位置31之位置經G置換；在對應於位置31之位置經L置換；在對應於位置32之位置經Q置換；在對應於位置33之位置經G置換；在對應於位置33之位置經M置換；在對應於位置33之位置經R置換；在對應於位置33之位置經W置換；在對應於位置34之位置經E置換；在對應於位置34之位置經H置換；在對應於位置38之位置經Y置換；在對應於位置39之位置經R置換；在對應於位置41之位置經W置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置50之位置經C置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置69之位置經A置換；在對應於位置86之位置經D置換； 在對應於位置86之位置經E置換；在對應於位置86之位置經R置換；在對應於位置90之位置經W置換；在對應於位置93之位置經E置換；在對應於位置93之位置經S置換；在對應於位置97之位置經F置換；在對應於位置99之位置經S置換；在對應於位置120之位置經S置換；在對應於位置131之位置經L置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置138之位置經W置換；在對應於位置139之位置經R置換；在對應於位置139之位置經V置換；在對應於位置141之位置經M置換；在對應於位置141之位置經Y置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置146之位置經V置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置148之位置經K置換；在對應於位置150之位置經L置換；在對應於位置151之位置經Q置換；在對應於位置152之位置經I置換；在對應於位置152之位置經M置換；在對應於位置152之位置經T置換；在對應於位置154之位置經R置換；在對應於位置155之位置經A置換；在對應於位置155之位置經F置換；在對應於位置155之位置經L置換；在對應於位置155之位置經R置換；在對應於位置158之位置經H置換；在對應於位置159之位置經H置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置159之位置經Q置換；在對應於位置159之位置經S置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置163之位置經R置換；在對應於位置165之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置198之位置經L置換；在對應 於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置205之位置經L置換；在對應於位置205之位置經T置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置208之位置經Q置換；在對應於位置208之位置經R置換；在對應於位置213之位置經N置換；在對應於位置215之位置經E置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置237之位置經Q置換；在對應於位置240之位置經Q置換；在對應於位置251之位置經L置換；在對應於位置259之位置經K置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置271之位置經V置換；在對應於位置276之位置經E置換；在對應於位置277之位置經A置換；在對應於位置277之位置經C置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置292之位置經V置換；在對應於位置305之位置經N置換；在對應於位置306之位置經D置換；在對應於位置310之位置經R置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置328之位置經R置換；在對應於位置342之位置經A置換；在對應於位置368之位置經K置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置373之位置經S置換；在對應於位置379之位置經H置換；在對應於位置379之位置經S置換；在對應於位置379之位置經T置換；在對應於位置380之位置經I置換；在對應於位置380之位置經L置換；在對應於位置380之位置經P置換；在對 應於位置380之位置經T置換；在對應於位置388之位置經H置換；在對應於位置412之位置經G置換；在對應於位置412之位置經P置換；在對應於位置412之位置經S置換；在對應於位置413之位置經Q置換；在對應於位置433之位置經T置換；在對應於位置438之位置經A置換；在對應於位置441之位置經T置換；在對應於位置443之位置經M置換；在對應於位置445之位置經Y置換；在對應於位置446之位置經C置換；在對應於位置447之位置經E置換；及在對應於位置447之位置經G置換。
  10. 如申請專利範圍第1項之經修飾之PH20多肽，其中該/該等胺基酸置換選自如下置換：參考SEQ ID NO：3中之位置，在對應於位置15之位置經丙胺酸(A)置換；在對應於位置15之位置經V置換；在對應於位置26之位置經R置換；在對應於位置27之位置經E置換；在對應於位置29之位置經S置換；在對應於位置31之位置經G置換；在對應於位置33之位置經G置換；在對應於位置33之位置經M置換；在對應於位置33之位置經R置換；在對應於位置33之位置經W置換；在對應於位置34之位置經E置換；在對應於位置34之位置經H置換；在對應於位置38之位置經Y置換；在對應於位置39之位置經R置換；在對應於位置48之位置經G置換；在對應於位置86之位置經R置換；在對應於位置90之位置經W置換；在對應於位置93之位置經E置換；在對應於位置93之位置經S置換；在對應於位置97之位置經F置換；在對應於位置120之位置經S置換；在對應於位置131之位置經L置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置139之位置經R 置換；在對應於位置141之位置經M置換；在對應於位置141之位置經Y置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置148之位置經K置換；在對應於位置152之位置經M置換；在對應於位置152之位置經T置換；在對應於位置154之位置經R置換；在對應於位置155之位置經A置換；在對應於位置155之位置經F置換；在對應於位置155之位置經L置換；在對應於位置159之位置經N置換；在對應於位置159之位置經S置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置163之位置經R置換；在對應於位置165之位置經F置換；在對應於位置174之位置經W置換；在對應於位置198之位置經L置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置205之位置經L置換；在對應於位置205之位置經T置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置208之位置經R置換；在對應於位置213之位置經N置換；在對應於位置215之位置經E置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置240之位置經Q置換；在對應於位置251之位置經L置換；在對應於位置259之位置經K置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置271之位置經V置換；在對應於位置277之位置經A置換；在對應於位置277之位置經C置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置284 之位置經Q置換；在對應於位置284之位置經S置換；在對應於位置292之位置經V置換；在對應於位置315之位置經T置換；在對應於位置342之位置經A置換；在對應於位置369之位置經H置換；在對應於位置379之位置經H置換；在對應於位置379之位置經S置換；在對應於位置379之位置經T置換；在對應於位置380之位置經L置換；在對應於位置380之位置經P置換；在對應於位置380之位置經T置換；在對應於位置388之位置經H置換；在對應於位置412之位置經G置換；在對應於位置412之位置經P置換；在對應於位置412之位置經S置換；在對應於位置433之位置經T置換；在對應於位置438之位置經A置換；在對應於位置441之位置經T置換；在對應於位置443之位置經M置換；在對應於位置445之位置經Y置換；在對應於位置446之位置經C置換；在對應於位置447之位置經E置換；及在對應於位置447之位置經G置換。
  11. 如申請專利範圍第1項之經修飾之PH20多肽，其中該/該等胺基酸置換選自如下置換：參考SEQ ID NO：3中之位置，在對應於位置27之位置經麩胺酸(E)置換；在對應於位置132之位置經A置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置147之位置經M置換；在對應於位置148之位置經C置換；在對應於位置148之位置經H置換；在對應於位置160之位置經Y置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置205之位置經A置換；在對應於位置206之位置經I置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置260之位置經M置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置261之 位置經F置換；在對應於位置263之位置經T置換；在對應於位置284之位置經A置換；在對應於位置315之位置經T置換；及在對應於位置379之位置經S置換。
  12. 如申請專利範圍第1項之經修飾之PH20多肽，其中該/該等胺基酸置換選自如下置換：參考SEQ ID NO：3中之位置，在對應於位置30之位置經P置換；在對應於位置58之位置經R置換；在對應於位置60之位置經K置換；在對應於位置143之位置經K置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置204之位置經P置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置261之位置經A置換；在對應於位置311之位置經G置換；在對應於位置315之位置經T置換；及在對應於位置369之位置經H置換。
  13. 如申請專利範圍第12項之經修飾之PH20多肽，其中該/該等胺基酸置換選自如下置換：參考SEQ ID NO：3中之位置，在對應於位置30之位置經P置換；在對應於位置60之位置經K置換；在對應於位置147之位置經I置換；在對應於位置215之位置經T置換；在對應於位置235之位置經T置換；在對應於位置311之位置經G置換；在對應於位置315之位置經T置換；及在對應於位置369之位置經H置換。
  14. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽，其中該/該等胺基酸置換在具有SEQ ID NO：3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、388、390、392或400中之任一者中闡述之胺基酸序列的PH20多肽中。
  15. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽，其 中該/該等胺基酸置換在具有SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中闡述之胺基酸序列或顯示與SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者至少91%序列一致性之胺基酸序列的PH20多肽中。
  16. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽，其中該經修飾之PH20多肽顯示與SEQ ID NO：3中闡述之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%或99%胺基酸序列一致性。
  17. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽，其為缺乏信號序列之成熟PH20多肽。
  18. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽，其包含SEQ ID NO：73-386中之任一者中闡述之胺基酸序列或顯示與SEQ ID NO：73-386中之任一者中闡述之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性的胺基酸序列，且含有該胺基酸置換。
  19. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽，其由SEQ ID NO：73-386中之任一者中闡述之胺基酸序列或顯示與SEQ ID NO：73-386中之任一者中闡述之胺基酸序列至少95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性的胺基酸序列組成，且含有該胺基酸置換。
  20. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽，其實質上經純化或分離。
  21. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽，其包含糖基化、唾液酸化(sialation)、白蛋白化(albumination)、法尼基化(farnysylation)、羧化、羥基化及/或磷酸化中之一或多者。
  22. 如申請專利範圍第21項之經修飾之PH20多肽，其中該經修飾之PH20 多肽經糖基化，從而該多肽至少包含連接於至少三個天冬醯胺(N)殘基中之每一者的N-乙醯葡萄糖胺部分。
  23. 如申請專利範圍第22項之經修飾之PH20多肽，其中該三個天冬醯胺殘基對應於SEQ ID NO：3之胺基酸殘基200、333及358。
  24. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽，其結合於聚合物。
  25. 如申請專利範圍第24項之經修飾之PH20多肽，其中該聚合物為聚葡萄糖或PEG。
  26. 如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽，其中該經修飾之PH20多肽結合於選自多聚化結構域、毒素、可偵測標記及藥物之部分。
  27. 如申請專利範圍第26項之經修飾之PH20多肽，其中該經修飾之PH20多肽結合於Fc結構域。
  28. 一種結合物，其包含直接或經由連接子間接連接於靶向劑的如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽。
  29. 一種核酸分子，其編碼如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽。
  30. 一種載體，其包含如申請專利範圍第29項之核酸分子。
  31. 如申請專利範圍第30項之載體，其為真核或原核載體。
  32. 如申請專利範圍第30項之載體，其為哺乳動物載體。
  33. 如申請專利範圍第30項之載體，其為病毒載體。
  34. 如申請專利範圍第33項之載體，其為病毒載體，其中該病毒載體為腺 病毒載體、反轉錄病毒載體或牛痘病毒載體。
  35. 一種細胞，其包含如申請專利範圍第30項之載體。
  36. 如申請專利範圍第35項之細胞，其為哺乳動物細胞。
  37. 如申請專利範圍第36項之細胞，其中該哺乳動物細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
  38. 一種產生經修飾之PH20多肽的方法，其包含：將如申請專利範圍第29項之核酸引入能夠將N連接之糖部分併入該多肽中之細胞中；在使所編碼之經修飾之PH20多肽由該細胞產生及分泌的條件下培養該細胞；及回收該表現之PH20多肽。
  39. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該核酸可操作地連接於啟動子。
  40. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該細胞為真核細胞。
  41. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
  42. 如申請專利範圍第41項之方法，其中該細胞為中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。
  43. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽於醫藥學上可接受之賦形劑中。
  44. 如申請專利範圍第43項之醫藥組成物，其中該組成物中的經修飾之PH20多肽在無冷凍下儲存超過48小時時顯示其玻尿酸酶之超過75%、80%、85%、90%、95%或95%以上。
  45. 如申請專利範圍第43項之醫藥組成物，其經調配用於單劑投予。
  46. 如申請專利範圍第43項之醫藥組成物，其經調配用於多劑投予。
  47. 如申請專利範圍第43項之醫藥組成物，其中經修飾之PH20之濃度為或為約0.1μg/mL至100μg/mL、1μg/mL至50μg/mL或1μg/mL至20μg/mL。
  48. 如申請專利範圍第43項之醫藥組成物，其中經修飾之PH20之量在或約在10單位(U)/mL至5000U/mL、50U/mL至4000U/mL、100U/mL至2000U/mL、300U/mL至2000U/mL、600U/mL至2000U/mL或100U/mL至1000U/mL之間。
  49. 如申請專利範圍第43項之醫藥組成物，其中該組成物之體積為或為約0.5mL至50mL、1mL至10mL或1mL至5mL。
  50. 如申請專利範圍第43項之醫藥組成物，其中該組成物之體積為至少0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL或更大。
  51. 如申請專利範圍第43項之醫藥組成物，其包含另一種治療學上之活性劑。
  52. 如申請專利範圍第51項之醫藥組成物，其中該治療學上之活性劑是選自蛋白質、核酸、藥物、小分子或有機分子。
  53. 一種組合，其包含：第一組成物，其包含如申請專利範圍第43項之醫藥組成物；及第二組成物，其包含治療學上之活性劑。
  54. 如申請專利範圍第53項之組合，其中治療劑為蛋白質、核酸、藥物、 小分子或有機分子。
  55. 一種用於非冷凍儲存穩定PH20玻尿酸酶調配物之系統，其包含：a)如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽；及b)適合於無冷凍儲存之容器。
  56. 如申請專利範圍第55項之系統，其中該容器是選自小瓶、注射器、套管或袋子。
  57. 如申請專利範圍第55項之系統，其中該容器為玻璃或塑膠的。
  58. 一種製備包含PH20玻尿酸酶之醫藥組成物的方法，該醫藥組成物可在無冷凍下儲存以供直接投予，該方法包含a)提供如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之PH20多肽；及b)用醫藥學上可接受之緩衝劑將該多肽調配成液體以供非經腸投予。
  59. 如申請專利範圍第58項之方法，其中非經腸投予為靜脈內或皮下投予。
  60. 一種用於治療玻尿酸(hyaluronan)相關之疾病或病症或用於向個體傳遞治療劑之如申請專利範圍第43項之醫藥組成物。
  61. 如申請專利範圍第60項之醫藥組成物或組合，其中包含該PH20玻尿酸酶之組成物為非冷凍組成物。
  62. 如申請專利範圍第60項之醫藥組成物，其中該玻尿酸相關之疾病或病狀為發炎性疾病或腫瘤或癌症。
  63. 如申請專利範圍第62項之醫藥組成物，其中該腫瘤為實體腫瘤。
  64. 如申請專利範圍第60項之醫藥組成物，其中該治療劑為蛋白質、核酸、藥物、小分子或有機分子。
  65. 如申請專利範圍第60項之醫藥組成物，其中該治療劑是選自單株抗體、胰島素、細胞介素、免疫球蛋白、化學治療劑及凝血因子。
  66. 一種如申請專利範圍第1項至第13項中任一項之經修飾之PH20多肽的用途，其用於製造用以治療玻尿酸相關之疾病或病症或用以向個體傳遞治療劑的醫藥品。
  67. 如申請專利範圍第66項之用途，其中該玻尿酸相關之疾病或病狀為發炎性疾病或腫瘤或癌症。
  68. 如申請專利範圍第67項之用途，其中該腫瘤為實體腫瘤。
  69. 如申請專利範圍第66項之用途，其中該治療劑為蛋白質、核酸、藥物、小分子或有機分子。
  70. 如申請專利範圍第66項之用途，其中該治療劑是選自單株抗體、胰島素、細胞介素、免疫球蛋白、化學治療劑及凝血因子。
  71. 一種用於鑑別或選擇顯示熱穩定性的經修飾之降解玻尿酸之酶的方法，其包含：a)在一溫度下培育一段預定時間(該培育向不含修飾的未經修飾之降解玻尿酸之酶提供熱應力條件)之後，測試經修飾之降解玻尿酸之酶或一群經修飾之降解玻尿酸之酶的成員的活性；b)在2℃至8℃下培育之後測試該經修飾之降解玻尿酸之酶或一群經修飾之降解玻尿酸之酶的成員的活性，其中該活性在與a)相同之條件下測試，不同之處在於溫度差異；及c)選擇或鑑別顯示a)中之活性為b)中之活性的至少50%的經修飾之降解玻尿酸之酶。
  72. 如申請專利範圍第71項之方法，其中若a)中之活性為b)中之活性的至少55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或95%以上，則選擇或鑑別經修飾之降解玻尿酸之酶。
  73. 如申請專利範圍第71項之方法，進一步包含：d)將該所選擇或鑑別的經修飾之降解玻尿酸之酶在b)中之活性與在相同條件下測試的該未經修飾之降解玻尿酸之酶的活性比較；及e)鑑別或選擇與該未經修飾之降解玻尿酸之酶相比，顯示該活性之至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或100%以上的經修飾之降解玻尿酸之酶。
  74. 如申請專利範圍第71項至第73項中任一項之方法，其中該活性為玻尿酸酶活性。
  75. 如申請專利範圍第71項之方法，其中該熱應力條件如在熱攻擊分析中在該預定時間下測定，係為或係超過不含修飾的該未經修飾之降解玻尿酸之酶的T50之溫度。
  76. 如申請專利範圍第75項之方法，其中如在熱攻擊分析中在該預定時間下測定，a)中之活性在比該未經修飾之降解玻尿酸之酶的T50大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃或20℃以上之溫度下測試。
  77. 如申請專利範圍第75項之方法，其中在步驟a)之前，如在熱攻擊分析中在該預定時間下所測定，測定該未經修飾之降解玻尿酸之酶的T50。
  78. 如申請專利範圍第71項之方法，其中該熱應力條件係為或係超過不含 修飾的該未經修飾之降解玻尿酸之酶的熔融溫度(Tm)之溫度。
  79. 如申請專利範圍第78項之方法，其中a)中之活性在比該降解玻尿酸之酶之熔融溫度(Tm)大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃或20℃以上的溫度下測試。
  80. 如申請專利範圍第78項之方法，其中在步驟a)之前，測定該降解玻尿酸之酶的熔融溫度(Tm)。
  81. 如申請專利範圍第80項之方法，其中該熔融溫度(Tm)係藉由動態光散射、圓二色性(CD)光譜法、螢光發射光譜法或核磁共振(NMR)光譜法測定。
  82. 如申請專利範圍第71項至第73項中任一項之方法，其中a)中之活性在超過44℃之溫度下測試。
  83. 如申請專利範圍第82項之方法，其中a)中之活性在超過45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或60℃以上的溫度下測試。
  84. 如申請專利範圍第83項之方法，其中a)中之活性在超過或為或為約52℃之溫度下測試。
  85. 如申請專利範圍第71項至第73項中任一項之方法，其中該預定時間為至少5分鐘、10分鐘、20分鐘、30分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時或更長時間。
  86. 如申請專利範圍第71項至第73項中任一項之方法，其中該熱應力條件為在超過或為52℃之溫度下培育10分鐘。
  87. 如申請專利範圍第71項至第73項中任一項之方法，其中該經修飾之降解玻尿酸之酶與未經修飾之降解玻尿酸之酶相比包含胺基酸之胺基酸置換、插入或缺失。
  88. 如申請專利範圍第87項之方法，其中該經修飾之降解玻尿酸之酶包含胺基酸置換。
  89. 如申請專利範圍第88項之方法，其中該經修飾之降解玻尿酸之酶與該降解玻尿酸之酶的未經修飾之形式相比，含有單個胺基酸置換或兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或九個以上的胺基酸置換。
  90. 如申請專利範圍第71項至第73項中任一項之方法，其中：在a)及/或b)中測試一群經修飾之降解玻尿酸之酶的成員；及在a)及/或b)中分開測試複數個經修飾之降解玻尿酸之酶。
  91. 如申請專利範圍第90項之方法，其中：該複數個經修飾之降解玻尿酸之酶與相對應之未經修飾之降解玻尿酸之酶相比經修飾以產生一群經修飾之降解玻尿酸之酶，從而在a)及/或b)中之每一者中測試該群中之每一經修飾之蛋白質，其中：該群中之每一經修飾之降解玻尿酸之酶與該降解玻尿酸之酶的未經修飾之形式相比含有單個胺基酸置換；在該群中，在每一經修飾之位置的胺基酸經多達1-19種非該位置之原始胺基酸的其他胺基酸置換，從而每一經修飾之降解玻尿酸之酶含有不同胺基酸置換；及在該群中，沿該降解玻尿酸之酶之長度的每一胺基酸或其被選擇的部 分經置換。
  92. 如申請專利範圍第71項至第73項中任一項之方法，其中該未經修飾之降解玻尿酸之酶為軟骨素酶。
  93. 如申請專利範圍第71項至第73項中任一項之方法，其中該未經修飾之降解玻尿酸之酶為玻尿酸酶。
  94. 如申請專利範圍第93項之方法，其中未經修飾之玻尿酸酶為PH20玻尿酸酶或缺乏C端糖基磷脂醯肌醇(GPI)錨附接位點或該GPI錨附接位點的一部分之其截短形式，藉此該截短形式顯示玻尿酸酶活性。
  95. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該未經修飾之玻尿酸酶為選自人類、猴、牛類、綿羊、大鼠、狐狸、小鼠或天竺鼠PH20之PH20。
  96. 如申請專利範圍第94項之方法，其中該未經修飾之玻尿酸酶為人類PH20或其C端截短形式。
  97. 如申請專利範圍第96項之方法，其中該未經修飾之降解玻尿酸之酶具有SEQ ID NO：3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、388、390、392或400中之任一者中闡述的胺基酸序列或與SEQ ID NO：3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、388、390、392或400中之任一者至少80%序列一致的胺基酸序列。
  98. 如申請專利範圍第97項之方法，其中該未經修飾之降解玻尿酸之酶顯示與SEQ ID NO：3、7、10、12、14、24、32-66、69、72、388、390、392或400中之任一者至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列一致性。
  99. 如申請專利範圍第96項之方法，其中該未經修飾之降解玻尿酸之酶為 具有SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者中闡述之胺基酸序列或顯示與SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者至少85%序列一致性之胺基酸序列的PH20玻尿酸酶。
  100. 如申請專利範圍第99項之方法，其中該未經修飾之PH20玻尿酸酶具有顯示與SEQ ID NO：3、7、32-66、69或72中之任一者至少86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上序列一致性的胺基酸序列。
  101. 如申請專利範圍第71項至第73項中任一項之方法，其在試管內進行。
  102. 如申請專利範圍第71項至第73項中任一項之方法，其進一步包含重複該等步驟複數次，其中在每次重複中，產生所選擇的經修飾之降解玻尿酸之酶的進一步經修飾之降解玻尿酸之酶且進行測試，從而該經修飾之降解玻尿酸之酶進化而在變性條件下顯示增加之穩定性。
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