CZ288890B6 - MGDF polypeptid pro stimulaci růstu a diferenciaci megakaryocytů - Google Patents

Abstract

MGDF polypeptid maj c aminokyselinovou sekvenci l tky zvolen ze souboru zahrnuj c ho MGDF-2, MGDF-4, MGDF-5, MGDF-6, MGDF-7 a MGDF-8; izolovan² polynukleotid k duj c tento MGDF polypeptid; DNA vektor obsahuj c cDNA sekvenci odpov daj c tomuto polynukleotidu; hostitelsk bu ka stabiln transformovan nebo transfekovan touto sekvenc DNA; zp sob produkce uveden ho MGDF polypeptidu kultivac uveden hostitelsk bu ky; a protil tka reaktivn v i MGDF polypeptidu.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových proteinů, které jsou v tomto popisu označovány dvěma synonymními názvy, a to Mpl ligandy nebo MGDF. MGDF znamená „faktor růstu a vývoje megakaryocytů“ (Megakaryocyte Growth and Development Factor). Tyto proteiny stimulují růst megakaryocytů a zvyšují diferenciaci nebo muturaci megakaryocytů, což se v konečném úhrnu projevuje zvýšením počtu krevních destiček. Vynález se také týká způsobů získávání těchto proteinů v homogenní formě z různých zdrojů a způsobu jejich přípravy rekombinantní technikami genového inženýrství.

Dosavadní stav techniky

Vynález zahrnuje přinejmenším dvě oblasti výzkumu. První z nich se týká vývoje megakaryocytů a následující produkce krevních destiček a druhý se týká polypeptidového členu třídy receptorů růstového faktoru (zde označovaného názvem Mpl receptory) a jejich ligandů. Obě tyto oblasti výzkumu budou podrobněji charakterizovány v následujícím popisu.

A. Produkce krevních destiček z megakaryocytů

Krevní destičky jsou cirkulující buňky, které hrají rozhodující úlohu při prevenci krvácení a při koagulaci krve. Megakaryocyty jsou buněčným zdrojem krevních destiček a vznikají ze společných prekurzorových buněk v kostní dřeni, z nichž vznikají všechny hematopoietické buňky. Tyto společné prekurzorové buňky jsou známy jako pluripotentní kmenové buňky nebo PPCS.

Hierarchie megakaryocytových progenitorových buněk byla definována na základě doby vzniku a velikosti megakaryocytových (MK) kolonií objevujících se v systémech in vitro kultur v odpovědi na příslušné růstové faktory. Tzv. megakaryocyty „burst-forming unit megakaryocyte“ (BFU-MK) jsou nejprimitivnějšími megakaryocytovými progenitorovými buňkami. O BFU-MK se předpokládá, že nakonec vytvoří početné megakaryocytové jednotky vytvářející kolonie (CFU-MK), které jsou diferencovanějšími progenitorovými buňkami megakaryocytů.

Při následné diferenciaci megakaryocytových buněk ztrácejí tyto buňky schopnost mitozy, ale získávají schopnost endoreduplikace. Endoreduplikace (nebo endomitoza) je buněčný jev jaderného dělení za nepřítomnosti dělení buněk. Endoreduplikací vznikají nakonec polyploidní megakaryocyty. Další maturace megakaryocytů vede k získání cytoplazmatických organel a membránových složek, které jsou charakteristické pro krevní destičky.

Krevní destičky vznikají z maturovaných megakaryocytů špatně definovaným procesem, o němž se předpokládá, že je důsledkem fyzikální fragmentace megakaryocytů nebo jiného mechanismu. Pozorování rozsáhlých membránových struktur v megakaryocytech vedlo k vytvoření modelu tvorby krevních destiček, v němž demarkační membránový systém v hlavních rysech ohraničuje nascentní krevní destičky v těle buňky. Jiný model tvorby krevních destiček byl vyvinut na základě pozorování, že magakaryocyty tvoří dlouhé cytoplazmatické výčnělky omezené v intervalech odpovídajících velikosti krevních destiček, z nichž se krevní destičky pravděpodobně odtrhují díky tlakům vyvolaným krevním tokem v kostní dřeni a/nebo plicích. Tyto cytoplazmatické výčnělky byly nazvány Beckerem a DeBruynem (Becker a DeBruyn, Amer. J. Anat. 145: 183 (1976)) prodestičkami, aby tak byl naznačen jejich předpokládaný prekurzorový charakter při tvorbě destiček.

-1 CZ 288890 B6

Přehled různých prekurzorových buněk, které se podílejí na vývoji megakaryocytů a krevních destiček je uveden na obr. 1. Krajní buňka na levé straně obrázku představuje pluripotentní kmenovou buňku (buňku PPSC) a od nich směrem vpravo jsou umístěny buňky BFU-MK a dále pak CFU-MK. Buňka podléhající endoreduplikaci, která je umístěna v obr. 1 bezprostředně napravo od PPSC, představuje maturovanou megakaryocytovou buňku. V důsledku endomitosy se tato buňka stala polyploidní. Další struktura, směrem vpravo, zahrnuje dlouhé cytoplazmatické výčnělky vycházející z polyploidního jádra maturované megakaryocytové buňky. Na pravém okraji obr. 1 je znázorněna řada krevních destiček, které vznikly fragmentací cytoplazmatických výčnělků.

Dále je uveden přehled některých dosavadních publikací, které se vztahují k výše uvedenému popisu maturace megakaryocytů a produkce krevních destiček.

1. Williams, N. a Levine, R. F., British Joumal of Haematology 52: 173-180 (1982);

2. Levin, J., Molecular Biology and Differentiation of Megakaryocytes, vyd. Wiley-Liss, lne.: 1-10(1990);

3. Gewirtz, A. M., The Biology of Hematopoiesis, vyd. Wiley-Liss, lne.: 123-132 (1990);

4. Han, Z. C„ et al., Int. J. Hematol. 5: 3-14 (1991);

5. Hiewenhuis, Η. K. a Sixma, J. New Eng. J. of Med. 327: 1812-1813 (1992);

6. Long, M., Stem Cells 11: 33-40 (1993).

Dále je uveden přehled některých dosavadních publikací, které se vztahují k regulaci produkce megakaryocytů a krevních destiček:

7. Hoffman, R. et al., Blood Cells 13: 75-86 (1987);

8. Hurphy, M. J., Hematology/Oncology Clinics of North America 3 (3): 465-478 (1988);

9. Hoffman, R., Blood 74 (4): 1196-1212 (1989);

10. Mazur, E. M. a Cohen, J. L., Clin. Pharmacol. Ther., 46 (3): 250-256 (1989);

11. Gewirtz, A. M. a Calabretta, B., Int. J. Cell Cloning 8: 267-276 (1990);

12. Williams, N., Progress in Growth Factor Research 2: 81-95 (1990);

13. Gordon, M. S. a Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992);

14. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 372-281 (1993):

15. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 1295-1304 (1993);

Také bylo oznámeno (viz Mazur E. M. et al., Blood 76: 290 až 297 (1990)), že humánní aplastické sérum obsahuje kolonii megakaryocytů stimulující účinnost faktoru stimulujícího granulocytovou kolonii a faktorů přítomných v médiu kondicionovaném lymfocyty, odlišnou od IL-3. Molekula zodpovědná za tuto účinnost však za dosavadního stavu techniky nebyla izolována ani charakterizována.

-2CZ 288890 B6

C. Receptoiy Mpl

Virus myeloproliferativní leukémie (MPLV) je myší replikačně defektní retrovirus vyvolávající akutní leukémii u infikovaných savců. Zjistilo se, že gen exprimující MPLV se skládá zčásti genu kódujícího obal retroviru (nebo vnější proteinový plášť) viru fúzovaného k sekvenci, která je příbuzná třídě receptorů cytokinu zahrnující receptory GM-CSF, G-CSF a EPO.

Exprese genu MPLV popsaná výše má zajímavou biologickou vlastnost způsobující, že myší progenitorové buňky různých typů ihned nabývají závislost na růstovém faktoru při proliferaci a terminální maturaci. Kromě toho některé kultury buněk kostní dřeně akutně transformované MPLV obsahují megakaryocyty, což naznačuje, že existuje spojení mezi genem MPLV a růstem a diferenciací megakaryocytů.

V současné době je známo, že gen viru MPLV (označovaný zkratkou v-Mpl) má v savčích buňkách homolog označovaný názvem buněčný gen Mpl (c-Mpl). Za použití prób získaných zv-Mpl byla klonována cDNA odpovídající humánnímu genu c-Mpl (viz přihláška PCT s číslem WO 92/07074, publikovaná 30. dubna 1992, která je blíže charakterizována dále). Sekvenční analýza ukázala, že protein kódovaný produktem genu c-Mpl patří k vysoce konzervované supertřídě receptorů cytokinu podobně jako homologický produkt v genu v-Mpl.

O tomto buněčném genu, c-Mpl, se předpokládá, že má svou funkční úlohu při hematopoiesi. Tento předpoklad je založen na pozorování, že jeho exprese byla zjištěna pomocí ochrany RNAsovou próbou a experimenty RT-PCR v kostní dřeni, slezině a fetálních játrech normálních myší, ale nikoliv v jiných tkáních. c-Mpl je zejména exprimován na megakaryocytech. Také bylo ukázáno, že humánní buněčný gen, humánní c-Mpl, je exprimován v CD34 pozitivních buňkách obsahujících purifikované megakaryocyty a krevní destičky. CD34 je antigen, který je indikativní pro časné hematopoietické progenitorové buňky. Kromě toho expozice CD34 pozitivních buněk syntetickým oligodeoxynukleotidům, které jsou pozitivní vzhledem k c-Mpl mRNA nebo informaci, významně inhibují schopnost vytvářet kolonie u megakaryocytových progenitorů CFU-MK, ale nemají žádný účinek na erythroidní nebo granulomakrofágové protenitoiy.

Výše uvedené údaje a pozorování naznačují, že c-Mpl kóduje molekulu povrchu buňky, která je zde označována názvem receptor Mpl. Tato molekula se váže k ligandu aktivujícímu receptor, přičemž možná dochází k produkci a/nebo vývoji megakaryocytů.

Patentová přihláška PCT s číslem WO 92/07074 je zaměřena na sekvenci proteinu produkovaného genem c-Mpl, a to jak z humánního, tak z myšího zdroje. Tento genový produkt, o němž se předpokládá, že je receptorem, jak to bylo vysvětleno výše, je sestaven z alespoň tří obecných oblastí nebo domén: extracelulámí domény, transmembránové domény a intracelulámí (nebo cytoplazmatické domény). Spolu spojeny vytvářejí tyto domény intaktní receptor Mpl. Citovaná publikace PCT se také týká rozpustné formy tohoto receptoru, která v podstatě odpovídá extracelulámí doméně maturovaného proteinu c-Mpl. Tato intracelulámí doména obsahuje hydrofobní oblast, která, je-li připojena prostřednictvím transmembránové oblasti k extracelulámí doméně proteinu, dodává celému proteinu agregovatelnost a nerozpustnost. Když se na druhé straně extracelulámí doména produktu genu c-Mpl oddělí od transmembránové domény a intracelulámí domény, stane se rozpustnou. Proto je extracelulámí forma proteinu označovaná názvem „rozpustná“ forma tohoto receptoru.

Následuje přehled několika dosavadních publikací vztahujících se kvýše uvedenému popisu receptorů a genů v-Mpl a c-Mpl.

17. Wendling, R., et al., Leukemia 3 (7): 475^180 (1989);

18. Wendling, R., et al., Blood 73 (5): 1161-1167 (1989);

-3CZ 288890 B6

19. Souyri, M., et al., Cell 63: 1137-1147 (1990);

20. Vigon, I., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 5640-5644 (1992);

21. Škoda, R. C., et al., The EMBO Joumal 12 (7): 2645-2653 (1993);

22. Ogawa, M., Blood 81 (11): 2844-2853 (1993);

23. Methia, N., et al., Blood 82 (5): 1395-1401 (1993);

24. Wendling F., et al., Blood 80: 246A (1993).

D. Potřeba činidla schopného stimulovat produkci krevních destiček

Nedávno bylo oznámeno, že v lékařských centrech v Severní Americe, západní Evropě a Japonsku stále stoupá počet provedených transfusí krevních destiček (viz Gordon, M. S. aHoffman, R., Blood 80 (2): 302 až 307 (1992). Tento nárůst se zdá být do značné míry zapříčiněn pokrokem v lékařské technice a větším přístupem k takovým technikám, jako jsou srdeční chirurgie a transplantace kostní dřeně, srdce a jater. K velké poptávce po zásobách krevních destiček přispěla také intenzifikace dávek podávaných při léčbě pacientů postižených rakovinou a epidemie HTV-1.

Používání krevních destiček nese s sebou možnost přenosu různých infekčních chorob přenosných krví, jakož i alloimunizace. Kromě toho, produkce krevních destiček je nákladná záležitost, a proto zvyšující se použití krevních destiček významně zvyšuje celkové náklady na léčení. V důsledku toho existuje akutní potřeba vyvinout nové a zlepšené metody produkce krevních destiček pro humánní aplikace.

Jako příklady až dosud známých pokusů o zvýšení produkce krevních destiček je možno uvést následující prameny.

V US patentu č. 5 032 396 bylo oznámeno, že interleukin-7 (IL-7) je schopen stimulovat produkci krevních destiček. Interleukin-7 je také znám pod označením lymfopoietin-1- a jedná se o lymfopoietický růstový faktor, který je schopný stimulovat růst B- a T-buněčných progenitorů v kostní dřeni. Publikovaná přihláška PCT WO 89/03 884 a patent EP 314 415 popisuje DNA, vektory a způsoby produkce savčích IL-7 proteinů technikou rekombinace DNA. Data uvedená v tomto US patentu ukazují, že IL-7 může zvýšit množství cirkulujících krevních destiček v normálních a sublethálně ozářených myších.

V US patentu č. 5 087 448 se uvádí, že megakaryocyty a krevní destičky je možno stimulovat k proliferaci v savcích tím, že se na ně působí interleukinem-6. Rekombinantní humánní interleukin-6 je glykoprotein o molekulové hmotnosti 26 000, který má několik biologických účinností. Data uvedená v tomto patentu ukazují, že IL-6 nemá žádný účinek na zvětšování kolonií megakaryocytů in vitro.

Žádný z výše uvedených patentů neuvádí informace vztahující se k ligandům Mpl, které se podílejí na předloženém vynálezu.

Přes existenci výše uvedených publikací existuje nadále silná potřeba vyvinout nové stimulátory megakaryocytů a/nebo krevních destiček v savcích.

-4CZ 288890 B6

Podstata vynálezu

Jedním aspektem tohoto vynálezu jsou nové polypeptidy, které jsou specifickými promotory růstu a/nebo vývoje megakaryocytů („Mpl ligandy“, nebo MGDF“), které v podstatě neobsahují (tj. které jsou izolovány) jiné proteiny (tj- savčí proteiny v případě Mpl ligandu získaného ze savčího zdroje). Takové proteiny je možno purifikovat z buněčných zdrojů produkujících tyto faktory přirozeně nebo po indukci jinými faktory. Také je možno je připravovat rekombinantními technikami genového inženýrství. Mpl ligandy je možno dále syntetizovat chemickými technologiemi nebo kombinací výše uvedených technologií.

Mpl ligandy podle vynálezu je možno získat v nativní formě ze savčích zdrojů. Dva příkladné Mpl ligandy izolované ze psí aplastické plazmy jsou popsány v příkladové části tohoto popisu. V jiných příkladech uvedených v tomto popisu je však ukázáno, že blízce příbuzné Mpl ligandy jsou přítomny v aplastické plazmě člověka a také vepře. Je pozoruhodné, že účinnost každého z Mpl ligandů (člověka, vepře i psa) je možno specificky inhibovat rozpustnou formou myšího Mpl receptoru, což ukazuje, že všechny tyto Mpl ligandy (jakož i ligandy z jiných savčích zdrojů, včetně z myši) jsou blízce příbuzné, jak pokud se týče struktury, tak pokud se týče úrovně účinnosti.

Očekává se, že savčí Mpl ligandy z člověka, vepře i jiných savců bude možno z přírodních zdrojů izolovat postupy, které jsou podrobně popsány v příkladu 10. Předmětem vynálezu jsou tedy obecně savčí Mpl ligandy, jako jsou Mpl ligandy pocházející z psa, vepře, člověka, myši, koně, ovce a králíka. Obzvláštní přednost se dává Mpl ligandům, které pocházejí z psa, vepře a člověka.

Kromě toho byly geny kódující humánní Mpl ligandy klonovány z knihovny humánních fetálních ledvin a jater a sekvenovány, jak je to popsáno v příkladové části uvedené dále. Byly nalezeny dvě humánní polypeptidové sekvence vykazující účinnost při buněčné zkoušce (viz příklad 4). Tyto sekvence se liší v délce, ale vykazují identitu ve velkém úseku svých aminokyselinových sekvencí. Totožné části jsou homologické s erythropoietinem. Mpl ligandy jsou zde také označovány jako faktory růstu a vývoje megakaryocytů (MGDF). Hovoří-li se kdekoliv v tomto popisu o Mpl ligandech, je toto označení vždy zaměnitelné za označení MGDF a naopak. Pod označením „MGDF polypeptid“ se rozumí polypeptid vykazující účinnost spočívající ve specifické stimulaci nebo inhibici růstu a/nebo vývoje megakaryocytů. Příklady takových polypeptidů jsou uvedeny v tomto popisu.

Bylo zjištěno, že Mpl ligandy podle vynálezu jsou specificky účinné v třídě megakaryocytů, přičemž zvyšují maturaci a/nebo proliferaci megakaryocytů, jak to ukazují pokusy v příkladech 2 a 4 popsané dále. Pod označením „specificky“ se rozumí, že tyto polypeptidy vykazují biologickou účinnost relativně vyššího stupně vůči megakaryocytům ve srovnání s mnoha jinými typy buněk. Od Mpl ligandů se stimulačním účinkem vůči megakaryocytům očekává, že budou vykazovat in vivo účinnost stimulující produkci krevních destiček prostřednictvím stimulace, maturace a diferenciace megakaiyocytů.

Dva přednostní Mpl ligandy z psího zdroje vykazují relativní molekulovou hmotnost přibližně 25 000 a 31 000 podle stanovení elektroforézou na polyakrylamidovém gelu za použití natriumdodecylsulfátu (SDS-PAGE) za neredukčních podmínek. Oba tyto proteiny se purifikují v průběhu téhož purifikačního protokolu, který je podrobně popsán v příkladové části uvedené dále.

Dva přednostní humánní ligandy, MGDF-1 a MGDF-2, mají délku 332 a 174 aminokyselin, nepočítaje v to 21 aminokyselin předpokládaného signálního peptidu. Tyto sekvence a sekvence třetí příbuzné molekuly, MGDF-3 jsou znázorněny na obr. 11 a 12.

-5CZ 288890 B6

Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu jsou způsoby izolace a purifikace Mpl ligandů podle vynálezu nebo jejich fragmentů ze savčích zdrojů, přednostně z úplné krve, séra nebo plazmy. Přednostním výchozím materiálem je zejména aplastická krev, sérum nebo plazma. Aplastickou krev, sérum nebo plazmu je možno získat způsobem, při němž se savec ozařuje radiačním zdrojem, jako je kobalt-60, při úrovni radiace přibližně 400 až 800 rad, aby se dosáhlo aplasticity. Takový postup je známý v tomto oboru, jak je to například zřejmé z publikací citovaných jako příklady v příkladu 1. V případě člověka je možno ozářenou krev, plazmu nebo sérum získat od pacientů po radiační terapii, například při léčení rakoviny.

Aplastická krev, sérum nebo plazma se potom podrobí purifikačnímu postupu. Purifíkační postup podle vynálezu zahrnuje následující klíčové stupně: lektinovou afinitní chromatografii a Mpl receptor-afmitní chromatografii. Každý z těchto stupňů má za následek přibližně 300 až 500-násobnou purifikaci proteinu o relativní molekulové hmotnosti 25000 a 31000 z psí aplastické plazmy. Výše uvedené purifíkační stupně je možno kombinovat s jinými standardními postupy purifikace proteinů za účelem zvýšení čistoty Mpl ligandů podle vynálezu. Takové přídavné purifíkační postupy jsou také podrobně popsány dále.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou polynukleotidy kódující expresi savčího proteinu Mpl ligandů. Takové sekvence DNA mohou zahrnovat izolovanou sekvenci DNA kódující expresi savčích proteinů Mpl ligandů, která je popsána dále. Sekvence DNA mohou také zahrnovat 5' a 3' savčí nekódující sekvence lemující sekvenci kódující Mpl ligand. Sekvence DNA mohou dále kódovat aminoterminální signální peptid. Takové sekvence je možno připravit jakýmikoliv známými metodami, včetně úplné nebo částečné chemické syntézy. Kodony je možno optimalizovat pro expresi v hostitelských buňkách, které byly zvoleny pro expresi (například

E. coli nebo buňkách CHO).

Předmětem vynálezu jsou dále také molekuly rekombinantní DNA, z nichž každá obsahuje DNA vektoru a sekvenci DNA kódující savčí Mpl ligand. Molekula DNA obsahuje DNA Mpl ligandů v operativním spojení s regulační sekvencí schopnou řídit replikaci a expresi Mpl ligandů ve zvolené hostitelské buňce. Předmětem vynálezu jsou i hostitelské buňky (například bakteriální, savčí, hmyzí, kvasinkové nebo rostlinné), které jsou transformovány takovými molekulami DNA pro použití při expresi proteinu Mpl ligandů.

Molekul DNA a transformovaných buněk podle vynálezu se používá při dalším aspektu tohoto vynálezu, tj. novém způsobu výroby rekombinantního savčího proteinu Mpl ligandů nebo jeho peptidových fragmentů. Při tomto způsobu se buněčná linie transformovaná sekvencí DNA kódující expresi proteinu Mpl ligandů nebo jeho fragmentu (nebo rekombinantní molekula DNA popsaná výše) v operativním spojení s vhodnou regulační sekvencí nebo sekvencí kontrolující expresi tohoto proteinu kultivuje za vhodných podmínek umožňujících expresi rekombinantní DNA. Při tomto nárokovaném způsobu se může používat řady známých buněk jako hostitelských buněk pro expresi proteinu. V současné době jsou přednostními buněčnými liniemi pro produkci Mpl ligandů savčí buněčné linie (například buňky CHO) a bakteriální buňky (například buňky E. coli).

V případě produkce Mpl ligandů v E. coli se přednostně používá u N-konce exprimovaného proteinu zbytku Met a Lys, poněvadž výtěžek produktu exprese je v tomto případě obvykle vyšší. Obzvláště přednostním produktem exprese je Met-Lys-humánní MGDF s celkem 165 aminokyselinami (tj. Mef²-Lys-^-I[l-163]MGDF (číslování se provádí od první aminokyseliny maturovaného proteinu). Po purifikaci produktu exprimovaného v bakteriální buňce, jako je E. coli se mohou terminální zbytky Met-Lys odstranit enzymatickým zpracováním, jako například působením dipeptidázy (například kathepsinu C).

Exprimovaný protein Mpl ligandů se potom izoluje z hostitelských buněk, buněčného lyzátu nebo kultivačního média vhodnými konvenčními metodami. Produkční médium je možno

-6CZ 288890 B6 zpracovat stejnými purifikačními stupni nebo jejich modifikacemi, jakých se používá při izolaci Mpl ligandu z aplastické plazmy (viz příklad 7).

Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu jsou rekombinantní proteiny Mpl ligandu. Tyto proteiny v podstatě neobsahují žádné jiné savčí látky, zejména proteiny. Proteiny Mpl ligandu podle tohoto vynálezu jsou také charakteristické tím, že vykazují jednu nebo více fyzikálních, biochemických, farmakologických nebo biologických účinností charakterizovaných v tomto popisu.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou farmaceutické prostředky obsahující terapeuticky účinné množství izolovaného přírodního nebo rekombinantního Mpl ligandu, v kombinaci s farmaceuticky vhodným nosičem, ředidlem nebo excipientem. Takových farmaceutických prostředků se může používat při léčení chorobných stavů nebo poruch, které jsou charakteristické nedostatkem megakaryocytů a/nebo krevních destiček, jakož i in vivo deficiencí Mpl ligandu. Také se jich může používat profylakticky pro zlepšení očekávané deficience megakaryocytů nebo krevních destiček (například v důsledku chirurgického zásahu).

Mpl ligandů podle vynálezu se může používat při léčení aplastických anemií, například pro zvýšení produkce krevních destiček u pacientů se zhoršenou produkcí krevních destiček (jako jsou pacienti postižení AIDS nebo pacienti, u kterých je aplikována chemoterapie rakoviny). Mpl ligandu se může použít pro léčení krevních poruch, jako je thrombocytopenie. Mpl ligandu se také může použít jako adjunktivní terapie u pacientů, kterým byla transplantována kostní dřeň. Těmito pacienty mohou být lidé nebo jiní savci. Očekává se, že Mpl ligand z jednoho druhu bude užitečný i u jiného druhu.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je tedy způsob léčení těchto a jiných patologických stavů, k nimž dochází v důsledku nedostatku krevních destiček, při němž se pacientům podává terapeuticky účinné množství farmaceutického prostředku popsaného výše. Takové terapeutické metody mohou zahrnovat podávání (simultánní nebo postupné) Mpl ligandu, účinného množství alespoň jednoho jiného faktoru stimulujícího megakaryocytovou kolonii, cytokinu (například EPO), rozpustného Mpl receptorů, hematopoietinu, interleukinu, růstového faktoru nebo protilátky.

Ještě dalším aspektem tohoto vynálezu jsou protilátky (například polyklonální, monoklonálni, humanizované a rekombinantní) a fragmenty protilátek, které jsou zaměřeny proti savčímu Mpl ligandu nebo jeho fragmentu, tj. které jsou vůči savčímu Mpl ligandu nebo jeho fragmentu, tj. které jsou vůči savčímu Mpl ligandu nebo jeho fragmentu, tj. které jsou vůči savčímu Mpl ligandu nebo jeho fragmentu reaktivní. Součástí tohoto aspektu vynálezu jsou tedy buňky, které jsou schopny vylučovat takové protilátky (například hybridomy, v případě monoklonálních protilátek) a způsoby jejich produkce, jakož i jejich použití při diagnostických nebo léčebných postupech.

Dalším aspektem tohoto vynálezu je zkoušení tělesných tekutin na přítomnosti Mpl ligandu. Při takovém zkoušení je možno používat protilátek, které specificky rozeznávají Mpl ligand. Při tom se může použít přístupu s jedinou protilátkou nebo s tzv. sandwichem. Takové zkoušky se může použít pro stanovení, zda pacient potřebuje externí podávání Mpl ligandu a/nebo zda pacient nevykazuje deficienci krevních destiček nebo jejich poruchu. Stanovení je možno provádět definovaným způsobem za použití soupravy obsahující vzorky pro pozitivní a negativní kontrolu, protilátku nebo protilátky a jiné standardní složky soupravy.

Jiné aspekty a výhody tohoto vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu přednostních provedení tohoto vynálezu.

Rada charakteristických znaků a výhod tohoto vynálezu je zřejmá z popisu, v němž se používá odkazů na připojené obrázky.

-7CZ 288890 B6

Přehled obr, na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn přehled vývoje a maturace megakaryocytů a krevních destiček.

Obr. 2 ukazuje, že rozpustný myší Mpl receptor v podstatě úplně inhibuje schopnost plazmy ozářených psů („aplastické psí plazmy“ či „APK9“) indukovat vývoj megakaryocytů. Přitom je použito stanovení vývoje megakaryocytů popsané v příkladu 2.

Obr. 3 ukazuje, že aktivita získaná obohacováním z APK.9 lektinovou afinitní chromatografií a Mpl receptorafinitní chromatografii (za použití Mpl ligandu) stimuluje růst buněk 1-A6.1 a že rozpustný myší Mpl receptor blokuje tento růst.

Na obr. 4 je uveden přehled purifikačních stupňů při purifikaci formy psího Mpl receptoru z aplaetické psí plazmy o relativní molekulové hmotnosti 25000 a 31000.

Obr. 5 ukazuje purifikaci Mpl ligandu pomocí HPLC s obrácenými fázemi (RP-HPLC). Frakce 21 obsahuje vysoce purifikovaný Mpl ligand o relativní molekulové hmotnosti 31000, frakce 22 obsahuje směs ligandů o relativní molekulové hmotnosti 31000 a 25000 a frakce 23 obsahuje vysoce purifikovaný Mpl ligand o relativní molekulové hmotnosti 25000.

Na obr. 6 je znázorněno porovnání aktivity Mpl ligandu frakce obsahující protein Mpl ligandu o relativní molekulové hmotnosti 25000 a/nebo 31000 při HPLC s obrácenými fázemi (sloupec C4).

Obr. 7 ukazuje počet megakaryocytů produkovaných v kulturách CD34-selektovaných buněk periferní krve stimulovaných APK9, Mpl ligandem a různými jinými faktory.

Obr. 8 ukazuje počet všech leukocytů produkovaných v kulturách CD34-selektovaných buněk periferní krve stimulovaných APK9, Mpl ligandem a různými jinými faktory.

Obr. 9 ukazuje procentický podíl megakaryocytů produkovaných v kulturách CD34-selektovaných buněk periferní krve stimulovaných APK9, Mpl ligandem a různými jinými faktory.

Obr. 10 ukazuje, že humánní IL-3 se nepodílí na vývoji megakaiyocytů indukovaném Mpl ligandem.

Obr. 11 ukazuje cDNA a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci humánního MGDF-1 a MGDF-2.

Obr. 12 ukazuje cDNA a dedukovanou aminokyselinovou sekvenci humánního MGDF-3.

Obr. 13 ukazuje porovnání mezi MGDF-1 a dalšími MGDF (Mpl ligandy) z psího zdroje (A) a myšího zdroje (B).

Na obr. 14 je znázorněno purifikační schéma r-HuMGDF.

Na obr. 15 je znázorněn účinek r-HuMGDF (E. coli 1-163 na počet destiček u myšího karboplatinového modelu. Myším Balb/c se intraperitoneálně injekčně podá jediná dávka karboplatinu (1,25 mg/myš) v den 0. Skupina, jíž se podává pouze excipient, neobdrží karboplatin. Po 24 hodinách se zvířatům ošetřeným karbopíatinem subkutánně injekčně podává buď excipient, nebo 100 pg/kg r-HuMGDF denně až do konce studie (počet zvířat ve skupině (n) je 10, střídavě se odebírá krev vždy 5 zvířatům).

-8CZ 288890 B6

Na obr. 16 je znázorněn účinek rHuMGDF (E. coli 1-163) na počet krevních destiček u myší ošetřených ozářením. Myši Balb/c se ozáří jednou dávkou gamma záření 500 rad z cesiového zdroje v den 0. Skupina, jíž se podává pouze excipient není ozařována. Po 24 hodinách se ozářeným zvířatům podává subkutánní injekcí buď excipient, nebo 100 pg/kg rHuMGDF každý den, až do konce studie (počet zvířat ve skupině (n) = 8, střídavě se odebírá krev vždy čtyřem zvířatům).

Na obr. 17 je znázorněn účinek rHuMGDF (E. coli 1-163) na počet krevních destiček u myší ošetřených kombinací ozařování a karboplatinu. Myši Balb/c se ozáří jednou dávkou gamma záření 500 rad z cesiového zdroje a podá se jim karboplatin (1,25 mg/myš) v den 0. Po 24 hodinách se exponovaným zvířatům podává subkutánní injekcí buď excipient nebo 100 pg/kg rHuMGDF každý den, až do konce studie (počet zvířat ve skupině (n) = 8). Bez podpory r-HuMGDF většina zvířat studii nepřežije. V kontrolní skupině přežije 1 zvíře z 8, zatímco v ošetřené skupině přežije 8 zvířat z 8.

Na obr. 18 je znázorněn účinek r-HuMGDF (E. coli 1-163) na thrombocytopenii indukovanou ozářením u opic rhesus. Opice rhesus se ozáří 700 cGy ze zdroje Co-80. Počínaje 24 hodinami po ozáření se opicím po dobu dalších 18 dnů subkutánně podává r-HuMGDF (n = 3) nebo humánní sérový albumin (n = 9) (vždy v dávce 25 pg/kg/den). Analýzy krevních buněk se provádějí pomocí elektronického analyzátoru krevních buněk. Každý symbol představuje průměrnou hodnotu (± směrodatná odchylka).

Obr. 19 ukazuje syntetickou genovou sekvenci rekombinantního humánního MGDF, aminokyseliny 1 až 163, mající E. coli optimalizované kodony.

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Nové faktory povzbuzující růst savčích megakaryocytů a/nebo produkující krevní destičky, přičemž tyto faktory jsou označovány názvem Mpl ligandy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou homogenní proteiny, které v podstatě nejsou spojeny s jinými proteinovými látkami. Přednostně jsou tyto proteiny z asi 90 %, výhodněji z asi 95 % a nejvýhodněji více než 98 % prosté jiných proteinů. Je možno je produkovat rekombinantními technikami, kterými je možno zajistit produkci velkých množství čistého aktivního Mpl ligandu užitečného pro terapeutické aplikace. Alternativně lze tyto proteiny získat v homogenní formě ze savčí aplastické krve, plazmy nebo séra, nebo ze savčí buněčné linie vylučující nebo exprimující Mpl ligand. Mpl ligand nebo jeho účinné fragmenty je dále také možno syntetizovat chemicky.

Pod obecným označením „Mpl ligandy“, jak se ho používá v popisu tohoto vynálezu, se rozumějí Mpl ligandy popsané v tomto popisu, jakož i jejich účinné fragmenty a varianty, které jsou podrobněji popsány dále.

Přednostní Mpl ligandy z psího zdroje mají relativní molekulovou hmotnost přibližně 25000 a 31 000 podle stanovení elektroforézou na polyakrylamidovém gelu za použití dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) za neredukčních podmínek. Oba proteiny se purifikují podle stejného purifikačního protokolu, který je podrobně popsán v příkladové části uvedené dále. Tak například oba tyto Mpl ligandy vážou lektin z pšeničných klíčků a imobilizovaný Mpl receptor. Forma o relativní molekulové hmotnosti 25000 zahrnuje následující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1:

Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-ValLeu-His-Xaa-Arg-Leu-Xaa-Gln-Xaa-Pro-Asp-Ile-Tyr

-9CZ 288890 B6

Forma o relativní molekulové hmotnosti 31000 zahrnuje následující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2:

Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-ValLeu-His

Aminokyseliny označené zkratkou „Xaa“ v SEQ ID NO: 1 a 2 nejsou s určitostí známy, ale předpokládá se, že se jedná o cystein, serin, threonin nebo (méně pravděpodobně) tryptofan.

Zvýše uvedených sekvencí je zřejmé, že ligand o relativní molekulové hmotnosti 31000 obsahuje přinejmenším část formy o relativní molekulové hmotnosti 25000. Zejména prvních 21 aminokyselin 31000 proteinu se přesně shoduje s aminokyselinami ve 25000 proteinu. Tento důkaz, a zejména skutečnost, že oba tyto proteiny vykazují účinnost při stanovení aktivity Mpl ligandu charakterizovaném v tomto popisu, vede k závěru, že oba tyto proteiny jsou velmi příbuzné, jak pokud se týče struktury, tak pokud se týče účinnosti. Je pravděpodobné, že 31000 forma tohoto proteinu se od 25000 formy liší v odlišné C-terminální sekvenci, odlišné glykosylaci a/nebo odlišném sestřihu genu kódujícího tyto proteiny.

Kromě informací, vztahujících se ke složení sekvence, uvedených výše, během sekvenování 25000 pásu před závěrečným purifikačním stupněm (za použití HPLC s obrácenými fázemi) byla stanovena další sekvence. Tato sekvence je připojena k 2500 pásu za neredukčních podmínek, ale nikoliv za redukčních podmínek, což ukazuje, že se jedná o výsledek štěpení 25000 proteinu na dvě části (například proteázou), přičemž tyto části jsou spojeny disulfídovou vazbou. Tato sekvence (SEQ ID NO: 3) má následující složení:

Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lys-Ala-Gln-Asp-Val-Leu-Gly-Ala-Val-Ala-Leu

Přestože přesné umístění SEQ ID NO: 3 v sekvence 25000 proteinu není jasné, soudí se na základě analogie s jinými cytokiny, jako je erythropoietin, že by tato sekvence mohla být umístěna v 2500 proteinu v blízkosti aminokyseliny s číslem 114. Je pravděpodobné, ačkoliv to nebylo dosud prokázáno, že sekvence SEQ ID NO: 3 se také vyskytuje v 31kD proteinu, pravděpodobně opět v blízkosti aminokyseliny s číslem 114. Výše uvedené informace jsou podrobněji prodiskutovány v příkladu 7.

Po počátečních purifikačních experimentech s psími ligandy, jejichž souhrn je uveden výše, byl nyní klonován gen kódující psí ligand. V důsledku toho byla stanovena celá délka aminokyselinové sekvence psího ligandu (viz obr. 13A). Na základě výpočtů molekulové hmotnosti se předpokládá, že 25000 a 31000 psí ligandy jsou C-terminálními upravenými formami ligandu o úplné délce znázorněného na obr. 13A. Dále byl získán také myší Mpl ligand, jehož sekvence je uvedena na obr. 13B.

Tyto purifíkované ligandy je také možno charakterizovat specifickou aktivitou při zkoušce s humánními megakaryocyty (podle příkladu 2), která dosahuje hodnoty alespoň asi 5,7 x 10⁹ megaryocytových (meg) jednotek/mg. Megakaryocytová jednotka je definována jako množství látky, které vede k produkci stejného množství megakaryocytů jako 1 μΐ standardního kontrolního vzorku APK9 za použití zkoušky popsané v příkladu 2.

Takové purifíkované ligandy jsou rovněž charakterizovány specifickou aktivitou při Mpl-dependentním růstu buněk, tj. zkoušce popsané v příkladu 4, přičemž tato aktivita dosahuje přinejmenším hodnoty asi 6,9 x 10⁹ jednotek buněčného růstu/mg. „Jednotka buněčného růstu“ je definována jako množství ligandu, které vede k růstu 200 1A6.1 buněk při zkoušce podle příkladu 4.

Následující tabulka 1 ukazuje přídavné specifické výpočty aktivity pro skutečné purifíkované psí Mpl ligandy vyrobené způsobem podle tohoto vynálezu.

-10CZ 288890 B6

Tabulka 1

Mpl Ligand	1A6.1 zkouška (jednotky/mg)	Zkouška s humánními megakaryocyty (jednotky/mg)
31 000	6,52 x 109	5,7 x 109
25 000	10,5 xlO9	14xl09

Výše uvedené informace jsou sumarizovány v následujícím přehledu, v němž uvedeno několik příkladů Mpl ligandů podle vynálezu, které jsou charakterizovány jednou nebo více biochemickými a biologickými vlastnostmi:

(a) Mpl ligandy jsou izolovány z psí aplastické plazmy;

(b) Mpl ligandy mají relativní molekulovou hmotnost přibližně 25 000 nebo 31 000 podle stanovení elektroforézou na polyakrylamidovém gelu za použití dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) za neredukčních podmínek;

(c) Mpl ligandy zahrnují následující aminokyselinové sekvence:

SEQ ID NO: 1, v případě 25000 proteinu nebo SEQ ID NO: 2, v případě 31000 proteinu;

(d) Mpl ligandy přídavně obsahují aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 3 (zvláště pak 25000 protein);

(e) Mpl ligandy se vážou k lektinu z pšeničných klíčků;

(f) Mpl ligandy se vážou k imobilizovanému rozpustnému myšímu Mpl receptoru;

(g) aktivitu Mpl ligandu je možno inhibovat in vitro rozpustný Mpl receptorem; a (h) Mpl ligandy se vážou k anexovému sloupci při pH od asi 8 do asi 9.

Biologické účinnosti přednostních Mpl ligandů podle vynálezu jsou demonstrovány jejich schopností specificky stimulovat růst a vývoj megakaryocytů při zkoušce povzbuzování růstu megakaryocytů podle příkladu 2. Při této zkoušce Mpl ligand stimuluje diferenciaci humánních buněk CD34⁺ periferní krve (tj. buněk CD-34 získaných imunoadsorpční selekcí) v průběhu 8-denního období kultivace. Megakaryocyty se identifikují barvením za použití specifických protidestičkových antigenových protilátek a spočítají se pod mikroskopem. Mpl ligand také stimuluje růst faktordependentní buněčné linie 1A6.1. Za nepřítomnosti Mpl ligandu buňky hynou. Počet 1A6.1 buněk se stanoví po 2 dnech kultivace s Mpl ligandem.

Mpl ligandy popsané výše vykazují specifické aktivity popsané v tabulce 1.

Jako zdroje Mpl ligandů byly zjištěny aplastická savčí krev, plazma nebo sérum. Neočekává se však, že by byly zdroje těchto ligandů omezeny na tyto známé látky. Zdroje tedy budou zahrnovat také jiné savčí tělesné tekutiny, buňky z nich získané atd.

Purifikace nativních Mpl ligandů ze savčích zdrojů je založena na dvou klíčových purifikačních stupních:

(a) lektinová afinitní chromatografie, přednostně za použití aglutininu z pšeničných klíčků a (b) afinitní chromatografie s imobilizovaným Mpl receptorem.

-11CZ 288890 B6

Mohou být též zařazeny přídavné stupně za účelem další purifíkace proteinu. Takové stupně zahrnují například ionexovou chromatografií, gelovou filtrační chromatografii a chromatografii s obrácenými fázemi.

Purifikační techniky skutečné použité pro získání Mpl ligandu z psí aplastické plazmy zahrnují následující stupně (viz příklad 7):

(a) lektinovou afinitní chromatografii (obzvláštní přednost se dává chromatografii za použití aglutininu z pšeničných klíčků);

(b) afinitní chromatografii s rozpustným Mpl receptorem (Mpl-X) (přednostně za použití imobilizovaného myšího Mpl-X);

(c) chromatografii s výměnou iontů (tj. aniontů nebo kationtů), přednostně za použití sloupce Mono Q;

(d) gelovou filtrační chromatografii za použití disociačních podmínek (přednostně za použití Superdex 200 plus SDS); a (e) chromatografii s obrácenými fázemi (přednostně za použití sloupce C-4).

Homogenní savčí Mpl ligand, včetně humánního ligandu, je možno získat aplikací výše uvedených purifikačních postupů na aplastickou krev, sérum nebo plazmu nebo na jiné zdroje savčího Mpl ligandu, například buněčné nebo tkáňové zdroje. Použité purifikační stupně není nutno provádět v nějakém určitém pořadí, ale pořadí, které je uvedeno výše se dává přednost. Procedury, kterých je možno použít při kultivaci buněk (nebo tkání) za účelem produkce Mpl ligandu, jsou známé odborníkům v tomto oboru a může se jich například použít pro rozšíření nabídky výchozích látek.

Mpl ligand nebo jeden nebo více jeho peptidových fragmentů je také možno získat rekombinantními technikami. Pro získání sekvence DNA určitého Mpl ligandu se purifikovaný Mpl ligand redukuje a popřípadě štěpí proteázou, jako je trypsin. Enzymatické fragmenty se izolují a sekvenují konvenčními technikami. Alternativně, jak je to příkladně uvedeno v části popisu zabývající se příklady provedení, se intaktní purifikovaný protein může přímo sekvenovat v možném rozsahu, který je závislý na množství dostupného proteinu a potom se může sekvenované oblasti použít analogicky jako sekvenovaných, trypsinem vyštěpených, fragmentů při následujícím postupu. Oligonukleotidové próby se syntetizují za použití genetického kódu, aby byly předvídány všechny možné sekvence kódující aminokyselinové sekvence sekvenovaného fragmentu nebo fragmentů. Přednostně se jako próby vytvoří několik degenerovaných sekvencí. Gen Mpl ligandu se identifikuje za použití těchto prób při screeningu savčí genomové knihovny nebo jiného zdroje. Alternativně se může mRNA z buněčného zdroje Mpl ligandu použít pro vytvoření cDNA knihovny, již lze podrobit screeningu s próbami za účelem identifikace cDNA kódující Mpl ligandový polypeptid. Dále lze použít také PCR techniky pro prodloužení cDNA sekvence. Při tom se používá vhodných primerů.

Za použití těchto prób pro screening genomové knihovny se získá DNA klon. Pro získání klonu o plné délce se může prób založených na získané sekvenci DNA použít pro nový screening knihovny a hybridizaci k úplné sekvenci DNA Mpl ligandu.

Humánní cDNA pro Mpl ligand je také možno získat subkionováním humánního genomového klonu o plné délce do expresního vektoru, jeho transfekcí do buněk COS, přípravou cDNA knihovny z takto transfekovaných buněk COS a hybridizačním screeningem na cDNA Mpli ligandu. Po identifikaci celé cDNA je možno celou cDNA nebo její část kódující aktivní

-12CZ 288890 B6 fragment Mpl ligand zavést do kteréhokoliv z různých expresních vektorů za účelem vytvoření expresního systému pro Mpl ligand nebo jeden nebo více jeho fragmentů.

Při takovém použití rekombinantních technik se získají přednostní sekvence DNA kódující Mpl ligandový polypeptid. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také tyto sekvence DNA, které nejsou asociovány se sekvenování DNA kódujícími jiné proteiny (tj. jsou izolované). Takové sekvence kódují expresi Mpl ligandových polypeptidů s aktivitou Mpl ligandu (jako je například růst a/nebo vývoj megakaryocytů). Tyto sekvence DNA zahrnují sekvence kódující celý Mpl ligand nebo jeho fragment a sekvence, které hybridizují, přednostně za stringentních hybridizačních podmínek k sekvencím cDNA [viz T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387 až 389],

Jako příklady stringentních hybridizačních podmínek je možno uvést hybridizaci v 4 X SSC při 62 až 67 °C s následným promýváním 0,1 X SSC při 62 až 67 °C po dobu asi 1 hodiny. Jako alternativní příklad stringentních hybridizačních podmínek je možno uvést hybridizaci v 45 až 55% formamidu, 4 X SSC při 40 až 45 °C.

Sekvence DNA hybridizující k sekvencím Mpl ligandu za relaxovaných hybridizačních podmínek a kódující Mpl ligandové peptidy s biologickými vlastnostmi Mpl ligandu také kódují nové Mpl ligandové polypeptidy podle tohoto vynálezu. Jako příklady takových hybridizačních podmínek s relaxovanou stringencí je možno uvést 4 X SSC při 45 až 55 °C nebo hybridizaci s 30 až 40% formamidem při 40 až 45 °C. Tak například sekvence DNA, která sdílí oblasti signifikantní homologie, například místa glykosylace nebo místa disulfidových vazeb, se sekvencemi Mpl ligandu a která kóduje protein vykazující jednu nebo více biologických vlastností Mpl ligandu, jasně kóduje Mpl ligandový polypeptid, i když se taková sekvence DNA stringentně nehybridizuje k sekvenci nebo sekvencím Mpl ligandu.

Alelové variace (změny bází v populaci určitého druhu, nimž dochází v přírodě a které mohou, nebo nemusí mít za následek změnu aminokyseliny) sekvencí DNA kódujících sekvence peptidů Mpl ligandu také spadají do rozsahu tohoto vynálezu, podobně jako příslušné analogy nebo deriváty. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají podobně také sekvence DNA kódující polypeptidy Mpl ligandu, které se však odlišují využitím v kodonu v důsledku degenerací genetického kódu nebo variací sekvence DNA Mpl ligandu způsobených bodovými mutacemi nebo indukovaných modifikacemi za účelem zvýšení aktivity, poločasu rozpadu nebo produkce polypeptidů, které jsou jimi kódovány.

Za použití klonovacího postupu uvedeného v příkladu 11 (dále) byly získány aminokyselinové a cDNA sekvence humánních proteinů MGDF-1, MGDF-2 a MGDF-3, které jsou publikovány v tomto popisu. MGDF-1 zahrnuje aminokyseliny 22 až 353 v obr. 11, tedy celkem 332 aminokyselin. MGDF-2 představuje omezenou část MGDG-1, tedy aminokyseliny 22 až 195 z obr. 11. MGDF-2 tedy obsahuje 174 aminokyselin. MGDF-3 zahrnuje aminokyseliny 22 až 286 z obr. 12, takže obsahuje 265 aminokyselin. V každém z publikovaných MGDF je součástí molekuly polypeptidů podle tohoto vynálezu také signální peptid (aminokyseliny 1 až 21 v obr. 11 a 12). Tento signální peptid se přednostně odstraňuje, aby došlo k růstu megakaryocytů a vývoji jejich aktivity. Přehledně lze MGDF 1 až 3 definovat takto:

MGDF-1 aminokyseliny 22 až 353 obr. 11

MGDF-2 aminokyseliny 22 až 195 obr. 11

MGDF-3 aminokyseliny 22 až ě86 obr. 12

Při zkouškách uvedených v tomto popisu jsou MGDF-1 a MGDF-2 účinné, zatímco MGDF-3 je neúčinný.

Na základě dat vztahujících se k aktivitě, která jsou uvedena v tomto popisu, byla vytvořena hypotéza, že humánní MGDF je exprimován in vivo, jako v podstatě inaktivní nebo méně aktivní

-13CZ 288890 B6 polypeptidový prekurzor obsahující proměnlivé C-terminální aminokyseliny. Po odštěpení C-terminálních aminokyselin (jakož i signálního peptidu) si upravená forma molekuly zachovává aktivitu nebo se stává aktivnější. Na základě této hypotézy se předpokládá, že MGDF-1 může vyžadovat úpravu (například štěpení proteázou), aby vykazoval aktivitu. Tuto hypotézu potvrzuje skutečnost, že omezená forma MGDF-1 (tj. MGDF-2) je účinná.

Kondicionované médium z buněk 293 humánní ledviny (Invitrogen) transfekovaných MGDF-1 genem vykazuje aktivitu při zkoušce s buňkami podle příkladu 4. Na druhé straně, v jiných buněčných liniích, například buňkách 32-D, nebyla u této molekuly pozorována žádná aktivita. Předpokládá se, že to může znamenat, že buňky 293 jsou schopny zpracovat (upravit) molekulu MGDF-1, pravděpodobně jejím omezením, takže molekula, která je převážně zodpovědná za aktivitu má omezenou formu. Buňky 32-D nejsou schopny molekulu takto upravovat.

S ohledem na tuto hypotézu se mohou různé aktivní molekuly získat omezením sekvence uvedené pro MGDF-1 (obr. 11). Strukturní znaky konzervované ve skupině cytokinů, jako je erythropoietin (EPO) zahrnují čtyři α-helikální svazky a čtyři cysteiny. Pokud se týče sekvence MGDF-1, je Cys 172 nejvíce C-terminálním prvkem z těchto evolučně konzervovaných funkčně esenciálních struktur. Přednostními omezenými variantami MGDF-1 jsou tedy kterékoliv z variant, které obsahují C-terminálni omezeni od aminokyseliny 173 do aminokyseliny 353 (současně s odštěpením signálního peptidu). Přednostně bude ze sekvence MGDF-1 odstraněno 50 až 185, zvláště pak 90 až 172, aminokyselin od C-konce. Jak je uvedeno v tomto popisu, za signální peptid je považován peptid o délce 21 aminokyselin. Signální peptid však může obsahovat 23 aminokyselin vztaženo na sekvenci MGDF-1. V důsledku toho spadají do rozsahu tohoto vynálezu také polypeptidy odpovídající zde popsaným polypeptidům, které však začínají v poloze 24 na obr. 11 nebo 12.

Dále jsou uvedeny některé specifické přednostní varianty MGDF-1, které by mohly vykazovat účinnost (tj. schopnost vyvolávat růst megakaryocytů a/nebo krevních destiček nebo vykazovat inhibiční/stimulační účinnost na přírodní receptor):

MGDF-4 aminokyseliny	22 až	172	obr. 11
MGDF-5 aminokyseliny	22 až	177	obr. 11
MGDF-6 aminokyseliny	22 až	191	obr. 11
MGDF-7 aminokyseliny	22 až	198	obr. 11
MGDF-8 aminokyseliny	22 až	265	obr. 11
MGDF-11 aminokyseliny	22 až	184	obr. 11
V některých klonech aminokyi	seliny	133 až	136 v sekvence MGDF-1 chybí, takže sekvence,

které odpovídají výše uvedeným sekvencím, přičemž v nich však některé aminokyseliny chybí (a počet aminokyselin u C-konce je snížen o 4) mohou být také účinné.

V jednom klonu, který má terminaČní kodon v poloze 192, byl nalezen zbytek Ala místo zbytku Thr, jak je to znázorněno v poloze 191 na obr. 11. Do rozsahu vynálezu tedy spadají také varianty molekul MGDF, v nichž se v poloze 191 nachází Ala místo Thr.

MGDF-3 vzniká odstraněním sekvence, která je zde označována zkratkou IVS-5 (intervenční sekvence-5), poněvadž tato sekvence je upravena sestřihem v pátém exonu této sekvence. Poněvadž se 5' konec IVS-5 sekvence nalézá v kodonu, její odstranění má za následek rámcový posun ve zbývající sekvenci MGDF, který lze pozorovat od výchozí polohy 160 MGDF-3 do konce této molekuly.

U samotného MGDF-3 nebyla po transfekci do buněk 293 a zkoušení kondiciovaného média na aktivitu buněčnou zkouškou popsanou v příkladu 4 zjištěna až dosud žádná aktivita. Zjevně jsou buňky 293 na rozdíl od MGDF-1 neschopné převést MGDF-3 na účinnou formu. Nicméně však vypuštěním C-terminálních aminokyselin z MGDF-3 by se snad také mohlo dospět k účinné

-14CZ 288890 B6 formě (tento předpoklad se zakládá na výše uvedené hypotéze o C-terminálním omezení. Tak například C-terminální omezení MGDF-3 od aminokyseliny 40 do aminokyseliny 102 může mít za následek dosažení účinnosti. Přednostně se odštěpují aminokyseliny 50 až 90. Jako dvě specifické varianty MGDF-2 je možno uvést

MGDF-9 aminokyseliny 22 až 179 obr. 12

MGDF-10 aminokyselin 22 až 190 obr. 12

Ve všech Mpl ligandech uvedených v tomto popisu, včetně příkladných MGDF uvedených výše, může být u N-konce přítomen methionylový zbytek, zejména když se tyto polypeptidy exprimují v bakteriálních hostitelských buňkách.

Polypeptidy Mpl ligandu je také možno získat známou konvenční chemickou syntézou. Způsoby konstrukce polypeptidů podle vynálezu syntetickými postupy jsou známé odborníkům v tomto oboru. Synteticky zkonstruovaná sekvence polypeptidů Mpl ligandu může vykazovat biologické vlastnosti shodné s vlastnostmi Mpl ligandu díky tomu, že vykazuje stejné primární, sekundární nebo terciární strukturní a konformační charakteristiky. Takových polypeptidů je tedy možno použít jako biologicky aktivních nebo imunologických náhražek za přírodní purifikované polypeptidy Mpl ligandu při terapeutických a imunologických procesech.

Modifikace polypeptidů nebo sekvencí DNA kódujících Mpl ligand může odborník v tomto oboru provést známými technikami. Modifikace sekvencí Mpl ligandu, které jsou předmětem zájmu, mohou zahrnovat náhradu, vsunutí nebo vypuštění zvoleného aminokyselinového zbytku z kódujících sekvencí. Techniky mutagenese, které jsou vhodné pro takové nahrazení, vsunutí nebo vypuštění aminokyselinového zbytku jsou odborníkům v tomto oboru dobře známy [viz například US patent č. 4 518 584]. Přednost se dává konzervativním změnám v rozmezí od 1. do 20. aminokyseliny. Přednostní peptidy je možno vytvářet za použití proteolytických enzymů nebo přímou chemickou syntézou. Takto získané varianty spadají do rozsahu významu „polypeptidy Mpl ligandu“ (či „Mpl ligandové polypeptidy“) a „polynukleotidy Mpl ligandu“ podle vynálezu.

Specifické mutace sekvencí Mpl ligandového polypeptidů mohou zahrnovat modifikace glykosylačního místa (například šeřinu, threoninu nebo asparaginu). K absenci glykosylace nebo jen k částečné glykosylaci dochází substitucí nebo delecí aminokyseliny v jakémkoliv glykosylačním rozpoznávacím místě připojené k asparaginu nebo v jakémkoliv místě molekuly, které je modifikováno adicí O-připojeného sacharidu. Glykosylační rozpoznávací místo připojené k asparaginu zahrnuje tripeptidovou sekvenci, která je specificky rozpoznávána příslušnými buněčnými glykosylačními enzymy. Tyto tripeptidové sekvence mají složení buď Asn-Xaa-Thr, nebo Asn-Xaa-Ser, kde Xaa může být jakákoliv aminokyseliny odlišná od Pro. Různé aminokyselinové substituce nebo delece v jedné nebo dvou z poloh 1 a 3 glykosylačního rozpoznávacího místa (a/nebo delece aminokyseliny v poloze 2) má za následek absenci glykosylace v modifikované tripeptidové sekvenci. Exprese takto pozměněných nukleotidových sekvencí má za následek vznik variant, které v tomto místě nejsou glykosylovány.

Pod označením MGDF se v tomto popisu rozumí kterákoliv z různých forem MGDF uvedených v tomto popisu. Do rozsahu tohoto pojmu tedy spadá například MGDF s plnou nebo omezenou délkou, a to jak glykosylované, tak neglykosylované formy. Přednostní molekuly MGDF pro derivatizaci jsou uvedeny dále.

MGDF-1 aminokyseliny MGDF-2 aminokyseliny MGDF-4 aminokyseliny MGDF-11 aminokyseliny MGDF-12 aminokyseliny MGDF-13 aminokyseliny

22 až 353	obr. 11
22 až 195	obr. 11
22 až 172	obr. 11
22 až 184	obr. 11
27 až 353	obr. 11
27 až 195	obr. 11

-15CZ 288890 B6

MGDF-14 aminokyseliny 27 až 172 obr. 11

MGDF-15 aminokyseliny 27 až 184 obr. 11

Číslování se ve všech případech vztahuje k číslování aminokyselin podle obr. 11.

Výše uvedené přednostní druhy MGDF mohou být glykosylovány, neglykosylovány nebo deglykosylovány a přednostně jsou neglykosylovány. Je možno je připravovat rekombinantní postupy jak v bakteriálních (například E. coli), tak savčích (například CHO) buňkách.

Předmětem vynálezu je dále také způsob výroby polypeptidů MGDF (tj. Mpl ligandu) nebo jejich aktivních fragmentů. Jeden z těchto způsobů podle vynálezu zahrnuje zavedení cDNA kódující polypeptid Mpl ligandu do expresního vektoru pro vytvoření expresního systému pro Mpl ligand. Tímto vektorem se transfekuje zvolená hostitelská buňka a transfekovaná buňka se kultivuje. Předmětem vynálezu je tedy také způsob kultivace vhodné buňky nebo buněčné linie transfekované sekvencí DNA kódující expresi polypeptidů Mpl ligandu pod kontrolou známých regulačních sekvencí. Regulační sekvence zahrnují fragmenty promotoru, fragmenty terminátoru a jiné vhodné sekvence, které řídí a kontrolují expresi proteinu ve vhodné hostitelské buňce. Exprimovaný faktor se potom izoluje a purifikuje z kultivačního média (nebo z buňky, je-li exprimován intracelulámě) vhodnými způsoby, které jsou známé odborníkům v tomto oboru. V souvislosti s polynukleotidy/polypeptidy podle tohoto vynálezu je také možno použít metod popsaných v US patentu číslo 5 272 071.

Jako vhodné buňky nebo buněčné linie přicházejí v úvahu savčí buňky, jako jsou buňky ovárií čínského křečka (CHO) nebo buňky 3T3. Selekce vhodných savčích hostitelských buněk a způsoby transformace, kultivace, amplifikace, screeningu a přípravy produktu, včetně jeho purifikace, jsou známé v tomto oboru, viz například publikace Gething a Sambrook, Nátuře 293: 620 až 625 (1981); Kaufman et al., Moll. Cell. Biol. 5 (7): 1750 až 1759 (1985) nebo Howley et al., US 4 419 446. Jako jiné vhodné savčí buněčné linie je možno uvést opičí buněčné linie COS-1 a COS-7 a buněčnou linii CV-1. Jako další příklady savčích hostitelských buněk je možno uvést buněčné linie z primátů a buněčné linie z hlodavců, včetně transformovaných buněčných linií. Vhodné jsou také normální diploidní buňky, kmeny buněk získané z in vitro kultivace primárních tkání a také primární explantáty. Vhodné buňky mohou být genotypicky deficientní, pokud se týče selekčního genu nebo mohou obsahovat dominantně působící selekční gen. Jako jiné vhodné savčí buněčné linie (na něž se však vynález neomezuje) je možno uvést buňky HeLa, myší buňky L929, linie 3T3 pocházející ze švýcarských myší Balb-c nebo NIH a buněčné linie BHK nebo HaK pocházející z křečka.

Podobně jsou jako hostitelské buňky užitečné pro provádění vynálezu také bakteriální buňky. Jako hostitelské buňky v oblasti biotechnologií jsou například dobře známy různé kmeny E. coli (například HB101, DH5a, DH10 a MC1061). Také se při tomto způsobu může použít různých kmenů Bacillus subtilis, Pseudomonas spp., jiných kmenů Bacillus, Streptomyces spp. apod.

Jako hostitelské buňky pro expresi polypeptidů podle vynálezu přicházejí v úvahu také mnohé kmeny kvasinkových buněk, které jsou známy odborníkům v tomto oboru. Pokud je to žádoucí, může se dále podle vynálezu použít jako hostitelských buněk také hmyzích buněk (viz například Miller et al., Genetic Engineering 8: 277 až 298 (1986) a citace uvedené v této publikaci).

Předmětem vynálezu jsou také rekombinantní molekuly nebo vektory pro použití při způsobu exprese nových polypeptidů Mpl ligandu. Tyto vektory obsahují sekvence DNA Mpl ligandu, které samotné nebo v kombinaci s jinými sekvencemi kódují polypeptidy Mpl ligandu podle vynálezu (se signálními peptidy, nebo bez nich) nebo jejich účinné fragmenty. Vektor použitý při této metodě obsahuje také zvolené regulační sekvence v operativním spojení škodujícími sekvencemi DNA podle vynálezu, které jsou schopny řídit jejich replikaci a expresi ve zvolených hostitelských buňkách.

-16CZ 288890 B6

Jedním vhodným vektorem je pXm, který je obzvláště žádoucí pro expresi v buňkách COS (Y. C. Yang et al., Cell. 47: 3 až 10 (1986)). Jiným vhodným vektorem, který je žádoucí pro expresi v savčích buňkách, například v buňkách CHO je pEMC2Bl. Expresní faktory v savčích buňkách, které jsou zde popsány, je možno syntetizovat technikami známými v tomto oboru. Složky těchto vektorů, například replikony, selekční geny, enhancery, promotory apod. Je možno získat z přírodních zdrojů nebo syntetizovat známými postupy (viz Kaufman et al., J. Mol. Biol. 159: 511 až 521 (1982); Kaufman Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 689 až 693 (1985). Alternativně může DNA vektoru zahrnovat celý genom hovězího papillomaviru nebo jeho část (Lusky et al., Cell. 36: 391 až 401 (1984)) a je možno ho replikovat v buněčných liniích, jako jsou myší buňky Cl27 v podobě stabilního episomálního prvku. Transfekce těchto vektorů do vhodných hostitelských buněk může mít za následek expresi polypeptidů Mpl ligandu.

K tomuto účelu je také možno použít jiných vhodných expresních vektorů, z nichž četné typy jsou známy v oboru savčí, hmyzí, kvasinkové, fungální a bakteriální exprese.

Z chorob nebo stavů, které lze léčit za použití látek a prostředků podle tohoto vynálezu, je možno uvést choroby zahrnující již existující nebo očekávanou (například v případě plánovaného chirurgického zásahu) deficienci megakaryocytů/krevních destiček. Takové stavy budou obvykle důsledkem defícience (dočasné nebo stálé) aktivních Mpl ligandů in vivo. Generickým označením pro deficienci krevních destiček je thrombocytopenie, a proto způsoby a prostředky podle tohoto vynálezu jsou obecně vhodné pro léčení thrombocytopenie.

K thrombocytopenii (deficienci krevních destiček) může docházet z různých důvodů, například v důsledku chemoterapie nebo jiných způsobů léčení za použití různých léčiv, radiačního léčení nebo chirurgických zásahů, ztráty krve při nehodách. Thrombocytopenie může být také způsobena specifickými chorobnými stavy, jako je například aplastická anémie, idiopatická thrombocytopenie, metastáza nádorů, která vede k vývinu thrombocytopenie, systemický lupus erythematosus, splenomegalie, Fanconiho syndrom, defícience vitaminu B12, defícience kyseliny listové, May-Hegglinova anomálie, Wiskott-Aldrichův syndrom a paroxysmální nokturální hemoglobinurie. Ve všech těchto případech je možno použít sloučenin a prostředků podle vynálezu. Thrombocytopenie může být také důsledkem určitých způsobů léčení AIDS (například za použití AZT). Zvýšení počtu krevních destiček může být také důležité při určitých poruchách hojení ran.

S ohledem na předvídanou deficienci krevních destiček, například v důsledku plánovaného chirurgického zásahu, je možno Mpl ligand podle vynálezu podávat několik dnů až několik hodin před tím, než je krevních destiček zapotřebí. V akutních situacích, například v případě nehody nebo masivní ztráty krve, může být Mpl ligand podáván spolu s krví nebo purifíkovanými destičkami.

Mpl ligandy podle tohoto vynálezu mohou být také užitečné při stimulaci určitých typů buněk odlišných od megakaryocytů, pokud se zjistí, že tyto buňky exprimují Mpl receptor. Do rozsahu tohoto vynálezu spadá také určení podmínek, za nichž jsou tyto buňky, které exprimují Mpl receptor, responsivní vůči stimulaci Mpl ligandem.

Molekuly MGDF, které samy o sobě nejsou účinné při zkouškách aktivity uvedených v tomto popisu, mohou být užitečné jako modulátory (například inhibitory nebo stimulanty) Mpl receptorů in vitro nebo in vivo.

Při léčení výše uvedených chorob nebo stavů se polypeptidů podle tohoto vynálezu může používat samotných nebo v kombinaci s jinými cytokiny, rozpustnými Mpl receptory, hematopoietickými faktory, interleukiny, růstovými faktory nebo protilátkami.

Dalším aspektem tohoto vynálezu jsou proto terapeutické prostředky pro léčení výše uvedených chorob nebo stavů. Tyto prostředky obsahují terapeuticky účinné množství polypeptidů Mpl

-17CZ 288890 B6 ligandu nebo jeho terapeuticky účinného fragmentu ve směsi s farmaceuticky vhodným nosičem. Jako nosič přichází v úvahu voda (v případě injekčních prostředků), která je přednostně doplněna jinými látkami obvyklými při výrobě roztoků určených pro podávání savcům. Obvykle se Mpl ligand k terapeutickým účelům podává ve formě prostředku obsahujícího purifikovaný protein ve 5 spojení s jedním nebo více fyziologicky vhodných nosičů, excipientů nebo ředidel. Jako příklady vhodných nosičů je možno uvést neutrální pufrovaný roztok chloridu sodného nebo roztok chloridu sodného smíchaný se sérovým albuminem. Přednostně se produkt zpracovává na prostředek ve formě lyofílizátu za spolupoužití vhodných excipientů (například sacharosy). Podle potřeby je možno přidávat i jiné standardní nosiče, ředidla a excipienty. Jako příklady je možno 10 uvést Tris pufr o pH 8,0 a acetátový pufr o pH 5,0, přičemž posledně uvedené pufry mohou dále obsahovat sorbitol.

Prostředky podle vynálezu je možno systematicky podávat parenterální cestou. Alternativně je možno je podávat intravenosně nebo subkutánně. Pokud se používá systematického podávání, 15 mohou být terapeutické prostředky podle vynálezu ve formě apyrogenních parenterálně vhodných vodných roztoků. Příprava takových farmaceuticky vhodných proteinových roztoků s řízenou hodnotou pH, isotonicitou, stabilitou apod. je v rozsahu zkušeností běžného odborníka v tomto oboru.

Dávkovači režim při léčení výše uvedených chorob a stavů bude určovat ošetřující lékař, který bude brát v úvahu různé faktory modifikující působení léčiv podle vynálezu, jako je například věk, stav, tělesná hmotnost, pohlaví a strava pacienta, závažnost případné infekce, doba podávání a jiné klinické faktory. Obvyklý denní režim by měl zahrnovat podávání 0,1 až 1000 pg proteinu Mpl ligandu nebo jeho fragmentu, vztaženo na kg tělesné hmotnosti.

Terapeutických metod, prostředků a polypeptidů podle tohoto vynálezu se může používat ' samotných nebo v kombinaci s jinými cytokiny, rozpustnými Mpl receptory, hematopoietickými faktory, interleukiny, růstovými faktory nebo protilátkami při léčení chorobných stavů, které jsou charakterizovány i jinými symptomy kromě deficience krevních destiček. Předpokládá se, že 30 molekula Mpl ligandu bude užitečná při léčení určitých forem thrombocytopenie v kombinaci s obecnými stimulátory hematopoiese, jako je IL-3 nebo GM-CSF. Spolu s Mpl ligandem se také může používat jiných megakaryocytických stimulačních faktorů, tj. meg-CSF, faktorů kmenových buněk (SCF), faktoru inhibitujícího leukémii (LIF), onkostatinu M (OSM) nebo jiných molekul se stimulační účinnosti na megakaryocyty. Jako přídavné cytokiny nebo 35 hematopoietické faktory pro takové společné podávání je možno uvést IL-1 a, IL-1 β, IL-2,

IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6, IL-11, faktor stimulující kolonie-1 (CSF-1), GM-CSF, faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF), EPO, interferon-α (IFN-a), IFN-β nebo IFN-gamma. Dále může být užitečné podávat, buď současně, nebo postupně, účinné množství rozpustného savčího receptoru Mpl, který vykazuje pravděpodobný účinek na fragmentaci megakaryocytů na 40 krevní destičky, když megakaryocyty dosáhly maturované formy. Podávání Mpl ligandu (za účelem zvýšení počtu maturovaných megakaryocytů) s následným podáváním rozpustného Mpl receptoru (za účelem inaktivace ligandu a umožnění produkce krevních destiček z maturovaných megakaryocytů) se považuje za obzvláště účinný prostředek stimulace tvorby krevních destiček. Výše uvedené dávkování je pak třeba přizpůsobit za účelem kompenzace výše 45 uvedených přídavných složek terapeutického prostředku. Pokrok dosažený u léčeného pacienta je možno monitorovat obvyklými metodami.

Jiná použití nových polypeptidů podle vynálezu zahrnují vývoj protilátek, které se vytvářejí standardními postupy. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají i protilátky reagující sMpl ligandy 50 podle tohoto vynálezu, jakož i reaktivní fragmenty takových protilátek. Tyto protilátky mohou být polyklonální, monoklonální, rekombinantní, chimérické, jednořetězcové a/nebo bispecifické atd. Jako fragmenty těchto protilátek přicházejí v úvahu jakékoliv protilátky, které jsou reaktivní vůči Mpl ligandu podle tohoto vynálezu, jako je F_ab, F_ab, atd. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také hybridomy vytvořené tak, že se Mpl ligand nebo jeho fragment padá jako antigen zvolenému 55 savci a potom se známým způsobem provede fúze buněk (například buněk sleziny) zvířete

-18CZ 288890 B6 s určitými rakovinnými buňkami za účelem vytvoření imortalizovaných buněčných linií. Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také způsoby používané pro vytvoření takových buněčných linií a protilátky zaměřené proti celému humánnímu polypeptidu Mpl ligandů nebo jeho částem podle tohoto vynálezu.

Těchto protilátek se může používat k terapeutickým účelům, jako například pro inhibici vazby Mpl ligandů a jeho receptoru. Těchto protilátek se dále může používat pro in vivo a in vitro diagnostické účely, jako například (ve značené formě) pro detekci přítomnosti Mpl ligandů v tělesné tekutině.

Dále uvedené příklady slouží k dalšímu objasnění předloženého vynálezu. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. V příkladech jsou zejména popsána přednostní provedení tohoto vynálezu. Standardní metody provádění mnoha postupů popsaných v těchto příkladech, jakož i vhodné alternativní postupy jsou uvedeny v uznávaných příručkách molekulární biologie, jako je například Sambrook et al., Molecular Cloning, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987) a Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols In Molecular Biology, Greene associates/Wiley Interscience, New York (1990).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Aplastická psí plazma

Heparinizovaná aplastická psí plazma („APK9“) nebo normální psí plazma („NK9“) byla připravena způsobem popsaným v následující publikacích, stou výjimkou, že bylo recipientům dodáno, vztaženo na jednotlivce, ozáření v dávce 450 rad:

1. Mazut, E. a South, K., Exp. Hematol. 13: 1164-1172 (1985),

2. Arriaga, M., South, K., Cohen, J. L., a Mazur, Ε. M. Blood 69: 486-492 (1987) a

3. Mazur, E., Basilico, D., Newton, J. L., Cohen, J. L., Charland, C., Sohl, P. A., a Narendran,

A., Blood 76: 1771-1782(1990).

Příklad 2

Zkouška s humánními megakaryocyty

APK9 a frakcionovaná APK9 byla zkoušena na schopnost stimulovat vývoj humánních megakaryocytů z progenitorových buněk CD34⁺. CD34-selektované buňky byly získány z buněk periferní krve způsobem popsaným v Hokom Μ. H., Choi E., Nichol J. L., Homkohl A., Arakawa T. a Hunt P., Molecular Biology of Haematopoiesis 3: 15 až 31, 1994 a byly inkubovány v Dulbeccově médiu modifikovaném podle Iscova (IMDM, GIBCO, Grand Island, N.Y. USA) doplněném 1 % Glutamine Pen-strep (Irwine, Sciencific, Santa Anna, Kalifornie, USA) a 10 % heparinizované, na destičky chudé, humánní AB plazmy. Toto médium obsahovalo také 2-merkaptoethanol (10^M), kyselinu pyrohroznovou (110 pg/ml), cholesterol (7,8 pg/ml), adenosin, guanin, cytidin, uridin, thymidin, 2-deoxycytosin, 2-deoxyadenosin a 2-deoxyguanosin (vždy 10pg/ml, Sigma), humánní rekombinantní inzulín (10pg/ml), humánní transferin (300 pg/ml), sojové lipidy (1 %, Boehringer Mannheim), Indianapolis, IN, USA), základní humánní rekombinantní růstový faktor fibroblastů (2 ng/ml, Genzyme, Cambridge, MA, USA), humánní rekombinantní epidermální růstový faktor (15 ng/ml), růstový faktor pocházející

-19CZ 288890 B6 z krevních destiček (lOng/ml, Amgen, lne., Thousand Oaks, Kalifornie, USA. CD34selektované buňky byly přeneseny do jamek mikrotitrové misky typu Terasaki (Vanguard, lne., Neptune, NJ, USA) v koncentraci 2 x 10⁵/ml kultivačního média (konečný objem 15 pl). Buňky byly inkubovány 8 dnů při 37 °C komoře s řízenou vlhkostí a atmosférou obsahující 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu za přítomnosti 1 % glutaraldehydu s koktejlem monoklonálních protilátek (anti-GPIb, anti-GPIIb (Biodesigne) a anti-GP-Ib (Dako, Carpinteria, Kalifornie, USA). Imunitní reakce byla vyvinuta za použití detekčního systému streptavidin-|3-galaktosidasa (HistoMark, Kirkegaard a Perry). Megakaryocyty identifikované na základě modrého zbarvení byly spočítány v mikroskopu s invertní fází při 100-násobném zvětšení. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměrný počet megakaryocytů, vztažený na jamku, ± směrodatná odchylka (SEM) od střední hodnoty. V některých případech (když se stupeň, v jakém daný vzorek indukuje vývoj megakaryocytů normalizuje vzhledem k pozitivní kontrolní APK9 pro tento pokus) se data uvádějí vjednotkách „megakaryocytové (meg) jednotky/ml“. Jedna taková jednotka je definována jako množství látky, které poskytne stejný počet megakaryocytů jako 1 μΐ APK9 standardu. Aktivita se považuje za aktivitu Mpl ligandu, pokud je možno ji blokovat MPU-X (rozpustný receptor Mpl) v koncentraci 5 až 10 pg/ml.

Ukazuje se, že APK9 obsahuje faktor nebo faktoiy, které v daném systému stimulují vývoj humánních megakaryocytů. CD34-selektované buňky inkubované s 10% NK9 po dobu 8 dnů vykazují zanedbatelný počet modře vybarvených megakaryocytů, zatímco v případě CD34selektovaných buněk inkubovaných s 10% APK9 po dobu 8 dnů je počet modře vybarvených megakaryocytů velmi vysoký.

Obr. 2 ukazuje, že zvyšující se koncentrace Mpl-X přidané ke kultuře humánních megakaryocytů mají za následek zvyšující se inhibici vývoje megakaryocytů. Při koncentraci Mpl-X vyšší než 5 pg/ml je inhibice úplná. Při tomto pokusu jsou CD34-selektované buňky stimulovány 5 % APK9. To ukazuje, že pro vývoj humánních megakaiyocytů je zapotřebí aktivity, která interaguje s Mpl-X (předpokládaným Mpl ligandem. Dále z tohoto výsledku vyplývá, že v samotné APK9 je přítomen Mpl ligand.

Pokusy prováděné v souvislosti s vynálezem dále ukázaly, že aktivita Mpl ligandu, která je potřebná pro vývoj humánních megakaryocytů, je obsažena v APK9. APK9 (135 ml) byla zředěna šestinásobně Iscoveho médiem a nanesena na afinitní sloupec Mpl-X. Nenavázaná látka (látka proteklá sloupcem) byla shromážděna a před zkoušením zkoncentrována na původní objem. Navázaná látka byla eluována do 10 ml 1M roztoku chloridu sodného a 20 % shromážděného eluátu bylo podrobeno diafiltraci a před zkoušením čtyřnásobně zkoncentrováno. CD34-selektované buňky inkubované v samotném médiu neposkytly megakaryocyty. Buňky inkubované v 5% APK9 (stejná várka, jaká byla nanesena na sloupec) vedly k vývinu megakaryocytů v počtu 48 ± 8, vztaženo na jamku. Buňky inkubované v 10% nenavázané látce se nevyvinuly v megakaryocyty. Buňky inkubované v 10% eluátu poskytly megakaryocyty v počtu 120 ± 44, vztaženo na jamku. Aktivita jak látky navázané na sloupci, tak eluátu, byla při zkoušení v podstatě úplně inhibována Mpl-X o koncentraci 5 pg/ml.

Příklad 3

Transfekce myšího nebo humánního Mpl receptoru do myší buněčné linie

A. Myší Mpl receptor cDNA Mpl receptoru o úplné délce byla subklonována do expresního vektoru obsahujícího promotor transkripce pocházející z ltr viru myšího sarkomu Moloney Y. 5 pg tohoto konstrukci a 1 pg selektovatelného markerového plazmidu pWLNeo (Stratagene) bylo zavedeno současnou elektroporací do IL-3 dependentní myší buněčné linie (32D, klon 23; Greenberger et al., PNAS

-20CZ 288890 B6

80: 2931 až 2936 (1983)). Buňky byly 5 dnů kultivovány, potom byly izolovány a inkubovány v selekčním médiu s obsahem Geneticinu (800 pg/ml, G418, Sigma) a myšího IL-3 (1 ng/ml). Přeživší buňky byly potom rozděleny na části s obsahem vždy 2 x 10⁵ buněk a kultivovány až do nárůstu populace, kterou bylo možno dále analyzovat. Šest populací bylo zkoušeno na povrchovou expresi Mpl receptoru pomocí analýzy FACS za použití polyklonálního králičího antipeptidového séra. Jedna populace byla vybrána pro třídění za použití stejného antipeptidového séra, jaké je zmíněno výše. Jednobuňkové klony rodičovské buněčné linie byly podrobeny selekci za použití růstu na 10% APK9 s Geneticinem. Po selekci v APK9 (35 dnů) byly buňky uchovávány v myším IL-3 o koncentraci 1 ng/ml. Pro tuto část práce byl zvolen jeden ze subklonů, 1A6.1.

B. Humánní Mpl receptor

Sekvence humánního Mpl receptoru o úplné délce (Vigon I. et al., PNAS 89: 5640 až 5644 (1992)) byla subklonována do expresního vektoru obsahujícího promotor transkripce pocházející z viru myšího sarkomu Moloney (stejný vektor, jakého bylo použito v případě myšího receptoru). 6 pg tohoto kbnstruktu a 6 pg amfotrofíckého retrovirového obalového konstruktu (Landau N. R., Littman D. R., J. Virology 66: 5110 až 5113 (1992)) bylo transfekováno do 3 x 10⁶ buněk 293 za použití soupravy pro transfekci „CaPO₄ mammalian transfection kit“ (Stratagene). Stejné buňky byly podrobeny retransfekci po dvou a poté znovu po čtyřech dnech. Den následující po poslední transfekci byly buňky 293 kultivovány společně s IL-3 dependentní myší buněčnou linií (32D, klon 23; Greenberger et al., PNAS 80: 2931 až 2936 (1983)). Po 24 hodinách byly buňky izolovány a umístěny na pás BSA gradientu (Path-o-cyte; Miles lne.). Buňky byly expandovány v myším IL-3 (1 ng/ml) a potom podrobeny selekci na růst ve 20% APK9. Potom byly buňky vytříděny na povrchovou expresi receptoru za pomocí FACS za použití polyklonálního králičího antipeptidového séra. Těchto buněk bylo posléze použito na zkoušení.

Příklad 4

Stanovení Mpl ligandu v 1A6.1

Buňky 1A6.1 byly promytím zbaveny kultury IL-3 a přeneseny (1000 buněk/celkový objem 15 pl, vztaženo na jamku) do mikrotitrových misek typu Terasaki s médiem alfa MEM (Gibco) doplněném 10 % fetálního telecího séra (FCS), Geneticinem (800 pg/ml) a směsí penicilinu a streptomycinu (pen/strep, 1 %, Gibco). Zkoušené vzorky byly přitom podrobeny sériovému ředění v poměru 1 : 1. Po 48 hodinách byl pod mikroskopem stanoven počet životaschopných buněk vjamce. Jedna jednotka aktivity byla definována jako aktivita, jíž se dosáhne za přítomnosti 200 životaschopných buněk vjamce. Aktivita byla definována jako aktivita Mpl ligandu, pokud bylo možno ji úplně inhibovat přídavkem Mpl-X v koncentraci 5 až lOmg/ml. Aktivita Mpl ligandu v APK9 dosahovala v průměru hodnoty 4400 ± 539 jednotek/mililitr aplastické plazmy. Pokud není uvedeno jinak, jsou jednotky aktivity Mpl ligandu definovány ve stanovení 1 A6.1.

Zkoušky s buňkami transfekovanými genem humánního Mpl receptoru (příklad 3B) byly prováděny v podstatě stejným způsobem, jako zkoušky s buňkami 1A6.1.

Příklad 5

Potvrzení přítomnosti Mpl ligandu v aplastické plazmě nebo séru z myšího, psího, vepřového a humánního zdroje

Mpl ligand je přítomen v aplastické plazmě nebo séru z myšího, psího, vepřového a humánního zdroje (viz tabulka 2). Myším BDF1 byla plazma odebrána před ozářením a 12 dnů po ozáření

-21CZ 288890 B6 (500 rad). Plazma byla podrobena zkoušení za použití buněk 1A6.1, přičemž byla zjištěna aktivita 2000 jednotek/ml. Tuto aktivitu bylo možno v podstatě úplně inhibovat Mpl-X (10 pg/ml). Ozářená myší plazma byla také pozitivní při zkoušce s humánními megakaryocyty, kde vykázala aktivitu 1833 jednotek/mililitr. Psům byla plazma odebrána před ozářením a 10 dnů 5 po ozáření (450 rad). Plazma byla zkoušena jak za použití buněk 1A6.1, tak za použití humánních megakaryocytů. Zjištěná aktivita byla při obou zkouškách úplně inhibovatelná Mpl-X (10 pg/ml). Vepřům byla plazma odebrána před ozářením a 10 dnů po ozáření (650 rad). Plazma byla zkoušena jak za použití buněk 1A6.1, tak za použití humánních megakaryocytů. Zjištěná aktivita Mpl ligandu byla při obou zkouškách úplně inhibovatelná Mpl-X (10pg/ml), což je io výsledek srovnatelný s výsledkem zjištěným u aplastické psí plazmy. Dále byla získána séra od aplastických humánních pacientů. Tato látka byla odebrána z kostní dřeně pacientů podrobených transplantaci. Séra od 6 pacientů byla zkoušena za použití buněk 1A6.1, kde byla zjištěna aktivita 903 jednotek/mililitr). 88 % této aktivity pocházelo z Mpl ligandu (na základě inhibice Mpl-X o koncentraci 10pg/ml). Séra od 14 aplastických pacientů byla také podrobena zkoušce 15 s humánními megakaryocyty. Jako celá skupina vykazovala tato séra podstatnou aktivitou,

941 jednotek meg/ml. Tuto aktivitu bylo možno úplně inhibovat Mpl-X o koncentraci 10 pg/ml. Data za použití myšího IL-3 jsou zde zahrnuta pro potvrzení specifičnosti zkoušky 1A6.1. Přestože tento rekombinantní cytokin indukuje růst této buněčné linie, není inhibován Mpl-X o koncentraci 10 pg/ml.

Tabulka 2

Druh	Zkouška s buňkami 1A6.1 (jednotky/ml)	Zkouška s humánními megakaryocyty (jednotky meg/ml)
	médium	+ Mpl-x	médium	+ Mpl-X
Normální myš	0±0	0±0	0±0	0±0
Aplastická myš	2000	0	1833	neprovedena
Normální pes	0±0	0±0	0±0	0±0
Aplastický pes	4400 ±539	0±0	792 ± 128	0±0

Tabulka 2 - pokračování

Druh	Zkouška s buňkami 1A6.1 (jednotky/ml)	Zkouška s humánními megakaryocyty (jednotky meg/ml)
	médium	+ Mpl-X	médium	+ Mpl-X
Normální vepř	0±0	0±0	0±0	0± 1
Aplastický vepř	3866± 1136	0±0	1284± 182	10± 10
Normální člověk	0±0	0±0	0±0	0±0
Aplastický člověk	903 ± 64	114 ±33	941±178	0±0
myší IL3	6000 ± 565	6000 ± 565	neprovedena	neprovedena

Příklad 6

Stimulace růstu buněk 1 A6.1 Mpl ligandem a vývoj humánních megakaryocytů

Mpl ligand přinejmenším asi 100 000 x obohacený lektinovou a afinitní chromatografií, viz příklad 7, stimuluje růst buněčné linie 1A6.1 a vývoj humánních megakaryocytů zCD34selektovaných buněk periferní krve způsobem, který je závislý na dávce. Za tuto aktivitu je

-22CZ 288890 B6 zodpovědný Mpl ligand, jak to vyplývá z obr. 2 a 3, poněvadž aktivity při obou těchto zkouškách lze úplně inhibovat působením Mpl-X.

Původci tohoto vynálezu také ukázali, že buňky periferní krve CD34⁺ purifikované FACS se po inkubaci s Mpl ligandem (v tomto případě 100 jednotek/ml po dobu 9 dnů) vyvinou v fenotypové normální maturované megakaryocyty. To potvrzuje, že purifikovaný Mpl ligand vykazuje stejný účinek na megakaryocyty, jako surová APK9. Kromě toho bylo při tomto pokusu použito purifíkovaných buněk CD34⁺ (100% CD34⁺) na rozdíl od CD34~selektovaných buněk, které představují pouze 30 až 50% CD34⁺.

Příklad 7

Purifíkace psího Mpl ligandu

I. Shrnutí

Proteiny (25 000 32 000) vykazující aktivity předvídané pro ligand Mpl receptoru byly podrobeny purifikaci. Proteiny byly purifikovány z plazmy ozářených psů postupem zahrnujícím afmitní chromatografií s aglutininem z pšeničných klíčků (WGA), afinitní chromatografií s Mpl receptorem, anexovou chromatografií, gelovou filtrační chromatografií a HPLC s obrácenými fázemi C44 (přehled tohoto purifikačního postupu je uveden na obr. 4). 25000 a 31000 Mpl ligandy byly vysoce purifikovány, až do dosažení zřejmé homogenity a bylo zjištěno, že mají aminokyselinové sekvence uvedené v tomto popisu.

II. Metody

A. Vyčiření plazmy

Zmrazená plazma (celkem 20 litrů) ozářených psů (viz příklad 1) byla ponechána roztát přes noc při 4 °C. Velké láhve se nechaly tát nejprve několik hodin při teplotě místnosti a teprve poté byly přemístěny do chladného prostoru. Nerozpustná látka byla odstraněna šestihodinovou centrifugám při 11 000 x g. Plazma byla zředěna fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem chloridu sodného o pH 7,3 s obsahem 0,01 % azidu sodného (PBS/azid) a přefiltrována přes filtr s póry o průměru 1,2 pm. Po čeřícím postupu bylo obvykle dosaženo přibližně dvojnásobného zředění výchozí látky.

B. Afinitní chromatografie s aglutininem z pšeničných klíčků

Všechny operace byly prováděny při 4 °C. Vyčiřená plazma (2 várky) byla nanesena na sloupec s mobilizovaným aglutininem z pšeničných klíčků (1 litr, 10x10 cm, E y Laboratories), který byl ekvilibrován vPBS/azidu. Po nanesení vzorku byla nenavázaná látka ze sloupce vymyta PBS/azidem. Po promytí sloupce 0,5M roztokem chloridu sodného ve 20mM Tris-HCl o pH 8 byla aktivita Mpl ligandu navázaná na sloupec WGA eluována roztokem N-acetylglukózaminu (0,3 5M) (GlcNAc), chloridu sodného (0,5M), Tris-HCl (25mM) o pH 8. Aktivitu ligandu nebylo možno stanovit ve přefiltrovaném výtoku ani ve frakcích promývacího louhu.

C. Afinitní chromatografie s receptorem Mpl-X

Použitý rozpustný myší receptor Mpl (Mpl-X) odpovídá celé extracelulámí doméně Mpl receptoru bez Trp v poloze 483 (viz Vigon et al., 8: 2607 až 2615 (1993)). Pro optimalizaci vazby Mpl ligandu k afinitnímu sloupci s Mpl-X receptorem byl WGA eluát zkoncentrován membránovou ultrafiltrací (vylučovací mez molekulové hmotnosti 10 000, YM-10, Amicon) a následným zředěním byla koncentrace chloridu sodného nastavena na 0,2M. Zkoncentrovaný vzorek WGA byl nanesen na 20ml sloupec m-Mpl-X [myší rozpustný Mpl receptor/CNBr

-23CZ 288890 B6 aktivovaná pryskyřice Sepharose (2,6 x 4,2 cm, 1,5 mg mMpl-X pryskyřice)] při průtokové rychlosti 0,9 ml/min. Sloupec byl promýván PBS/azidem (40 ml, 1,5 ml/min), promývací kapalinou s vysokým obsahem soli (405 ml; lOmM Tris-HCl, 1M chlorid sodný, lmM CHAPS, pH 8,0). Sloupec byl eluován 20mM CAPS, 1M NaCl, 5mM CHAPS o pH 10,5. Vhodné frakce byly zachyceny a hodnota pH každé z nich byla upravena Tris pufrem.

Jak SDS-page, tak absorbance při 280 nm elučního profilu afinitního sloupce s Mpl-X receptorem vykazovala časný proteinový pík ve frakcích 1 až 4, zatímco hlavní podíl aktivity Mpl ligandu byl eluován po frakci 5.

D. Anexová chromatografie na sloupci Mono-Q

Frakce o nejvyšší čistotě z několika afinitních sloupců z Mpl-X receptorem byly spojeny, zkoncentrovány a diafiltrovány proti 20mM Tris-HCl, 5mM CHAPS o pH 8,7 do konečného objemu 58,5 ml. Koncentrace proteinu v produktu byla stanovena na základě absorbance při 280 nm (0,12 pg/ml, což odpovídá celkem asi 7 mg proteinu). Produkt byl nanesen průtokovou rychlostí 0,5 ml/min na sloupec Mono Q HR 5/5 (Pharmacia), který byl ekvilibrován ve 20mM Tris-HCl a 5mM CHABS o pH 8,7. Sloupec byl eluován lineárním gradientem až do 0,36M chloridu sodného ve stejném pufru v průběhu 27 minut. Potom byl sloupec promyt během 6 minut gradientem až do 0,54M chloridu sodného a nakonec následovalo promytí 0,9M chloridem sodným. Byly zachycovány frakce o objemu 1 ml.

Eluční profil sloupce Mono-Q ukazuje, že žádný Mpl ligand nelze detegovat a jen nepatrné množství proteinu lze detekovat v proteklé kapalině a promývacích frakcích. Značná aktivita Mpl ligandu byla eluována ve frakcích 5 až 7 v průběhu počátečních stádií gradientu chloridu sodného. Inflexe aktivity byla pozorována ve frakcích 8 až 10 a poté následoval druhý hlavní pík zahrnující frakce 11 až 15.

Za použití SDS-PAGE (neredukční podmínky) byl v aktivních frakcích pozorován výrazný 25000 pás. Intenzita tohoto pásu je přímo úměrná aktivitě Mpl ligandu v těchto frakcích. Tento pás chyběl ve frakcích 3 a 4 (nulová aktivita), byl významný ve frakcích 5 a 6 (pík aktivity 1A6.1) a podobně intenzivně vybarvený pás byl také přítomen ve frakcích 11 až 14 (pík aktivity 1A6.1). Výše uvedený pás byl slabý ve spojených frakcích 15 a 16, což odpovídá významně nižší aktivitě ve frakci 16.

E. Experimenty za použití gelové eluce

Experimenty s gelovou elucí byly prováděny za použití alikvotů Mono Q frakcí 5 a 6 nebo Mono Q frakcí 13 a 14. Při těchto experimentech byly frakce 5 a 6 (vždy 6 μΐ) spojeny, podobně jako frakce 13 a 14 (vždy 7,5 μΐ). Spojené frakce byly smíchány se vzorkem pufru SDS-PAGE (neredukčního) a naneseny na 12% SDS-gely. Po skončení elektroforézy byly vyříznuty dráhy, které jsou předmětem zájmu (1 mm) a vyříznuté proužky byly nařezány na malé kousky holicí čepelkou. Kousky byly přeneseny do l,5ml mikrocentrifugačních zkumavek obsahujících 0,5 ml PBS/5mM CHAPS, kde byly mírně promíchávány přes noc při teplotě 4 °C. Následujícího dne byly zkumavky krátce odstředěny, byly odebrány alikvotní vzorky a ty byly diafiltrovány proti Iscoveho médiu doplněnému BSA, jako nosným proteinem. Diafiltrovaných vzorků bylo použito pro zkoušení.

Výsledky ukazují, že bylo možno pozorovat dva píky aktivity Mpl ligandu. Jeden pík odpovídal 25000 oblasti gelu, zatímco druhý pík aktivity Mpl ligandu byl pozorován v 3 lkD oblasti.

F. Filtrace na gelu Sephadex 200

Frakce 13 až 16 ze sloupce pro iontovou výměnu na anexu Mono Q, jakož i dvě ekvivalentní frakce z druhé frakcionace na sloupci Mono Q byly spojeny a zkoncentrovány v membránovém

-24CZ 288890 B6 ultrafiltračním zařízení (Centricon-10, Amicon). Byl přidán SDS do konečné koncentrace 0,1% a vzorek byl nastříknut na sloupec Superdex 200 HR 10/30 (Pharmacia). Sloupec byl ekvilibrován v 50mM Tris-HCl, 0,1% SDS o pH 7,5 při průtokové rychlosti 0,3 ml/min, při teplotě místnosti. Byly zachycovány frakce vždy po 1 minutě. Zjistilo se, že většina proteinu ze vzorku se eluuje ve frakcích 32 až 40, zatímco aktivita Mpl ligandů byla detegována ve frakcích 42 až 46. Analýza frakcí pomocí SDS-PAGE ukázala, významný 25000 pás v aktivních frakcích.

G. HPLC s obrácenými fázemi (C4)

Frakce 43 až 46 (spojené) a frakce 42 (samotná) z filtrace na Superdex 200 byly zkoncentrovány v membránovém ultrafiltračním zařízení (Microcon-10, Amicon). Koncentrované vzorky byly odděleně naneseny na 1 x 100 mm sloupec s obrácenými fázemi (vrtaná mikrokolena s náplní SynChropak RP—4). Sloupec byl ekvilibrován v 0,04% kyselině trifluoroctové (TFA) ve vodě (pufr A;). Jako pufru B bylo použito 0,035% TFA v 80% acetonitrilu. Po nastříknutí vzorku následoval lineární gradient až do 45% B během 4 minut a poté lineární gradient až do 75% B během 40 minut. Průtoková rychlost byla 75 μΐ/min. Výsledky purifikace frakce 42 jsou uvedeny na obr. 5. Významné píky aktivity Mpl ligandů byly pozorovány ve frakcích 21 až 23. Tyto frakce byly analyzovány na 14% polyakrylamidovém gelu za neredukčních a redukčních podmínek. Frakce 21 se skládala z jediného 31000 pásu, zatímco frakce 23 zahrnovala jediný široký 25000 pás a frakce 22 obsahovala pásy jak v oblasti 25000, tak v oblasti 31000. Žádné jiné významné pásy nebyly pozorovány. Je třeba si povšimnout, že na základě dřívějších experimentů s gelovou elucí byla aktivita Mpl ligandů připisována oběma těmto oblastem. Jeden menší pás o vysoké molekulové hmotnosti byl pozorován ve všech frakcích neredukujícího gelu. Tento pás však nebylo možno zjistit v redukujícím gelu.

H. Analýza N-terminální sekvence 25000 a 31000 Mpl ligandů

Analýza N-terminální sekvence byla prováděna na frakcích C4 RP-HPLC vykazujících aktivitu. Sekvence zjištěné u těchto proteinů jsou uvedeny výše. Kromě hlavní sekvence odpovídající 25000 pásu (přinejmenším 90 % z celkem naneseného vzorku) byly při sekvenování zjištěny dvě menší sekvence (které jsou připisovány menšímu kontaminujícímu pásu popsaného v části G výše). Porovnání se známými sekvencemi ukázalo, že menší sekvence odpovídají těžkému řetězci a kappa řetězci psího Ig. Pokud by to bylo žádoucí, bylo by možno množství těchto menších nečistot dále snížit zařazením přídavného purifikačního stupně, přednostně dalšího stupně gelové filtrace.

I. Porovnání aktivit Mpl ligandů v C4 purifikovaných frakcích

Obr. 6 ukazuje data potvrzující, že aktivity přítomné ve frakcích 22 a 23 zC4 RP-HPLC chromatografického stupně jsou v podstatě ekvivalentní. Frakce 22 obsahuje směs 25000 a 31000 pásu, zatímco frakce 23 obsahuje pouze 25000 pás. Alikvoty každé frakce byly zředěny v poměru 1 : 45 000. Zředěné frakce stimulovaly růst buněk 1A6.1 v podstatě stejně (frakce 22, 5 400 buněk na jamku; frakce 23, 6 000 buněk na jamku). Zředěné frakce byly inkubovány se vzrůstajícími koncentracemi Mpl-X. Tyto frakce byly stejně citlivé k inhibici působením Mpl-X, tj. u obou došlo k úplné inhibici za použití koncentrace 7-1,4 pg/ml. To ukazuje, že účinný protein nebo proteiny ve všech frakcích jsou představovány Mpl ligandy s ekvivalentní biologickou aktivitou.

Příklad 8

Porovnání Mpl ligandů s jinými faktory při vývoji megakaryocytů

Bylo oznámeno, že na růst megakaryocytů nebo jejich vývoj má vliv řada rekombinantních faktorů nebo organických sloučenin, jako je forbolmyristoacetát (PMA). Z toho důvodu byly

-25CZ 288890 B6 zkoumány účinky těchto faktorů na CD34-selektované buňky periferní krve. Ke kultuře byl, podle toho jak je to uvedeno, přidán humánní rekombinantní interleukin 3 (IL-3, 1 až 2 ng/ml), faktor kmenových buněk (SCF, 50 ng/ml), interleukin 6 (IL-6, 25 ng/ml), erythropoietin (EPO, 1 jednotka/ml), faktor inhibující leukémii (LIF, 10 ng/ml) a faktor stimulující kolonie granulocytů a makrofágů (GM-CSF, 25 ng/ml, Amgen, lne.); interleukin 11 (IL—11, 25 ng/ml, R+D Systems, Minneapolis, MN, USA); nebo forbolmyristoacetát (PMA, 10”^l0M, Sigma). Mpl ligandu bylo použito v koncentraci 275 jednotek/ml a APK9 v 5% koncentraci (což odpovídá 220 jednotkám/ml). Faktorů zkoušených v kombinaci bylo použito ve stejné koncentraci jako při individuálním zkoušení. Po 8 dnech kultivace byly buňky fixovány v jamkách a bylo provedeno barvení megakaryocytů (n = 6 jamek pro každou podmínku) nebo byl stanoven celkový počet buněk (n = 3 jamky pro každou podmínku). Data jsou uvedeny jako střední hodnota ± směrodatná odchylka.

Obr. 7 ukazuje, že APK9 a Mpl ligand vede k nejvyššímu počtu megakaryocytů, vztaženo na jamku. Jaké IL-3 má za následek vývoj megakaryocytů, zejména v kombinaci s CSF. IL-6, IL—11, ani EPO nemá velký vliv na počet megakaryocytů, ať již se jich použije samotných nebo v kombinaci s IL-3. Také PMA, ILF a GM-CSF vykazuje jen malý účinek. Na obr. 8 jsou uvedena data ze stejného experimentu, která ukazují celkový počet buněk zjištěných vjamce („celularita“). APK9 a Mpl ligand mají na celularitu malý vliv, zatímco IL-3 a SCF mají střední vliv. Nejvyšší účinek má kombinace SCF a IL-3. Dat uvedených na obr. 7 a 8 bylo použito pro výpočet procentických podílů megakaryocytů na jamku, což je uvedeno na obr. 9. Je jasné, že faktorem, který vyvolá nejvyšší procentický podíl megakaryocytů vjamce s kulturou, je Mpl ligand, účinná složka APK9. Tento výsledek ukazuje na specifičnost Mpl ligandu vzhledem k megakaryocytům.

Příklad 9

Aktivita Mpl ligandu spočívající v povzbuzení megakaryocytů není závislá na humánním IL-3

Mpl ligand stimuluje vývoj humánních megakaryocytů, když se ho použije jako přísady ke kultivačnímu médiu popsaného v příkladu 2. Přestože IL-3 se k tomuto médiu nepřidá, mohl by být přítomen v nedetegovatelně nízkých koncentracích v normální humánní plazmě, která je v tomto médiu obsažena. I když by však byl IL-3 přítomen, nepodílí se na Mpl ligandem indukované megakaryopoiesi. To je zřejmé z obr. 10. IL-3 v koncentraci 2 ng/ml vykazuje při zkoušce s humánními megakaryocyty aktivitu 14 900 megakaryocytových jednotek/ml. Tato aktivita je z 97 % inhibována pomocí anti-IL-3 (3,3 pg/ml, Genzyme, Cambridge, MA, USA). Mpl ligand v koncentraci 8 203 meg jednotek/ml není inhibován anti-IL-3.

Příklad 10

Analýza Mpl ligandu z vepře

I. Shrnutí

Proteiny z plazmy ozářeného vepře s aktivitou Mpl ligandu byly charakterizovány afinita í chromatografií WGA, afinitní chromatografií s Mpl receptorem, ionexovou chromatografií a HPLC s reversními fázemi C4. Tato aktivita byla také charakterizována elucí z proužků SDS-polyakrylamidových gelů.

-26CZ 288890 B6

Chromatografie	Poznámka
WGA afinitní sloupec	4.4 x 106 jednotek naneseno 3.4 x 106 jednotek získáno
sloupec s receptorem Mpl	2,7 x 106 jednotek naneseno 2,4 x 106 jednotek získáno
iontová výměna, sloupec Mono S, pH 6,0	2,4 x 10b jednotek naneseno 2,4 x 106 jednotek získáno
HPLC s obrácenými fázemi C4	aktivita získána ve frakcích 23 až 25
experimenty s gelovou elucí	byly jasně rozlišeny dvě aktivity; jedna při asi 18 000 a druhá při asi 28 000

Příklad 11

Klonování humánního Mpl ligandu, humánního MGDF

Dále jsou popsány dva přístupy:

I. Příklad prvního přístupu ke klonování

A. Vytvoření humánní MGDF próby

Byla vytvořena řada degenerovaných PCR primerů založených na aminoterminální sekvenci psího proteinu. Pro amplifikaci MGDF genu z humánní genomové DNA bylo použito různých dvojic primerů. Po 40 cyklech amplifikace za použití negativního primeru 5' GCN CCN CCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID NO:4) kódujícího prvních 5 aminokyselin psího proteinu (SEQ ID NO:1) a pozitivního primeru 5'GCA RTG YAA CAC RTGNGARTC 3' (SEQ ID NO:5) kódujícího aminokyseliny 16 až 21 sekvence SEQ ID NO: 1 se PCR produkt analyzuje na 2,0% agarózovém gelu v pufru TBE.

Z agarózového gelu byl vyříznut 63bp pás, který byl reamplifikován za použití stejné kombinace primerů. PCR produkt byl klonován do PCR II vektoru (firma Invitrogen, San Diego, Kalifornie, USA). Řada kolonií byla podrobena screeningu sekvenováním DNA. Plazmidové DNA kódující peptid, který se podobá psímu MGDF proteinu, byl použit jako zdroj pro vytvoření radioaktivní próby určené pro screening cDNA knihoven. Genový fragment kóduje následující aminokyselinovou sekvenci.

Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu-Arg-Asp-Ser-His-ValLeu-His (SEQIDNO:6)

Agarózového pásu obsahujícího humánní HGDF bylo použito pro vytvoření próby horkou PCR. Při typické PCR reakci obsahuje celkový objem 100 μΐ vzorku následující přísady:

templátová DNA

5' primer (SEQ IDNO:4) 3' primer (SEQ IDNO:5)

X pufr dATP (0,1 mM) dTTP(lOmM) dGTP(lOmM) dCTP (0,1 mM) dCTP, P³² (10 pCu/pl) dATP, P³² (10 pCu/pl) Taq DNA polymeráza voda

Celkový objem 100 μΐ az 3 μΐ μΐ, 20 pmol μΐ, 20 pmol μΐ

2μ1 μΐ μΐ μΐ

5μ1 μΐ

0,5 μΐ, 2,5 jednotky

-27CZ 288890 B6

Bylo použito následujících amplifikačních podmínek:

počáteční zahřívání teplotní hybridizace prodlužování denaturace °C, 2 minuty °C, 30 sekund °C, 30 sekund °C, 30 sekund

Bylo provedeno 40 amplifikačních cyklů za použití zařízení Perkin Elmer GeneAmp Systém 9600.

Produkt byl purifikován průchodem přes sloupec „push“ (Stratagene, San Diego, Kalifornie, USA). Ιμΐ próba byla spočítána ve scintilačním počítači. K hybridizační směsi byly přidány próby obsahující 1 a 3 miliony rozpadů/ml.

B. Konstrukce knihovny z fetálních jater

Humánní polyA⁺ RNA z fetálních jater byla zakoupena od Clontech Laboratories. Pro syntézu cDNA bylo použito asi 4 pg RNA, přičemž primování bylo provedeno za použití statistického hexameru, 5'GTA CGC GTT CTA GAN NNN NNT 3' (SEQ ID NO:7), připojeného koligomeru obsahujícímu místo Xbal.

Pro vytvoření dvouřetězcové cDNA bylo použito protokolu Gibco-BRL. Adaptor Eco R I-Bst XI (Invitrogen, San Diego, Kalifornie, USA) byl ligován k dvouřetězcové cDNA, načež následovalo štěpení restrikčním enzymem Xbal. Selekce cDNA podle velikosti byla provedena na sloupci S500 Sephacryl (Life Technologies, lne.). cDNA větší než 400 bp byly ligovány k savčímu expresnímu vektoru vl9.8 (Martin F., Cell 63: 203 až 211 (1990)), který již byl rozštěpen EcoRI a Xbal. Kompetentní buňky E. coli DH10 byly transformovány a výsledná cDNA knihovna byla rozdělena na 7 částí, z nichž každá obsahovala 100 000 cDNA.

C. Screening lambda knihovny

Knihovna z humánních fetálních ledvin v lambda gtll byla zakoupena od firmy Clontech (titr 650 x 10⁶ pfu/ml). Asi 2 miliony plaků bylo podrobeno screeningu pomocí próby vytvořené PCR (viz výše). Hybridizace byla prováděna v 6 X SSC, 5 X Denhardt, 0,1% SDS a jednořetězcové DNA z lososího spermatu (100 pg/ml) po dobu 15 hodin při 56 °C.

Bylo provedeno několik cyklů screeningu. DNA byla amplifikována z jednotlivých plaků a hybridizována s vnitřním primerem, 5' AGT TTA CTG AGG ACT CGG AGG 3’ (SEQ ID NO:8) kódujícím aminokyseliny 7 až 13 ze SEQ ID NO: 6, za účelem identifikace pozitivních výsledků.

D. 3. Prime rychlá amplifikace konců cDNA (RACE)

Polyadenylovaná RNA z humánních fetálních ledvin a fetálních jater byla zakoupena od firmy Clontech. 1 pg RNA byl reversně transkribován za použití oligo 5' TTC GGC CGGATA GGC CTT TTT TTT TTT TTT 3' (SEQ ID NO: 9), jako primeru.

Pro vytvoření prvního řetězce cDNA bylo použito soupravy pro syntézu cDNA Gibco-BRL (Life Technologies lne., katalogové číslo 18267-013). Konečný objem byl 30 pl. Reakce byla zastavena přídavkem 500mM EDTA do konečné koncentrace lOmM a reakční směs byla uchovávána při teplotě -20 °C.

-28CZ 288890 B6

Při počáteční PCR bylo jako templátu pro reakci použito 0,5μ1 cDNA. Jako pozitivních primerů bylo použito primeru (SEQ ID NO: 9) a kompetitoru, oligo 5' TTC GGC CGGATA GGC CTT TTT TTT TTT TT-P 3' (SEQ ID NO: 10), zatímco oligonukleotidu 5'TGC GAC CTC CGA GTC CTCAG 3' (SEQ ID NO: 11) kódujícího aminokyseliny 5 až 11 ze SEQ ID NO:6 bylo použito jako negativního primeru. Bylo provedeno 40 amplifikačních cyklů za použití následujícího protokolu: 94 °C - 30 sekund, 65 °C - 30 sekund a 72 °C - 30 sekund. Předtím byla provedena počáteční inkubace při 94 °C po dobu 2 minut. Amplifikace byla prováděna v zařízení Perkin Elmer GeneAmp Systém 9600.

Nesting byl proveden za použití negativního primeru 5' GAG TCC TCA GTA AACTGC TTC GT 3' (SEQ ID NO: 12) kódujícího aminokyseliny 8 až 14 ze SEQ ID NO: 6. Jako pozitivních primerů bylo použito primerů SEQ ID NO: 9 a SEQ ID NO: 10. Bylo provedeno 40 amplifikačních cyklů s teplotní hybridizací při 65 °C. PCR produkty byly analyzovány na 0,8% agarózovém gelu a potom fotografovány pod UV světlem. Přitom byly viditelné pásy okolo 0,8 až 1,2 kb.

Produkty PCR byly potom klonovány do vektoru PCR II (Invitrogen). Jednotlivé kolonie byly sesbírány a plazmidy byly izolovány za použití souprav Qiagen (katalogová čísla 12143 a 12145). Za použití vektorových primerů bylo potom provedeno dvouřetězcové, barvivém primované, sekvenování. Sekvence byly analyzovány za použití různých typů software GCG.

E. Prodloužení 5' a 3' primery

Pro izolaci sekvence MGDF genu s úplnou délkou bylo prováděno prodlužování 3' a 5' primerem za použití různých částí knihovny z fetálních jater, jako templátu. Pro amplifikaci 5 primeru cDNA bylo použito asi 20 ng cDNA z každé části, jako templátu. Byl použit MGDF specifický pozitivní primer 5'GGA GTC ACG AAG CAG TTG AC 3' (SEQ ID NO: 13) kódující aminokyseliny 12 až 17 ze SEQ ID NO: 6 a 5' vektor vl9.8 negativní primer 5'CCTTTACTT CTA GGC CTG 3' (SEQ ID NO: 14. Amplifikace byla prováděna ve 30 cyklech s teplotní hybridizací při 53 °C. Nesting byl prováděn 30 cyklů s pozitivním primerem 5' GAG GTC ACA AGC AGG AGG A 3' (SEQ ID NO: 15) kódujícím aminokyseliny 1 až 6 ze SEQ ID NO: 6 a vektorovým primerem SEQ ID NO: 14.

Pro příměrovou extensi 3' konců MGDF cDNA bylo použito pozitivního vektorového primeru 5'GGC ATA GTC CGG GAC GTC G 3' (SEQ ID NO: 16) a MGDF specifického primeru 5'TCC TCC TGC TTG TGA CCT C 3' (SEQ ID NO: 17) kódujícího aminokyseliny 1 až 6 SEQ ID NO: 6. Amplifikace byla prováděna ve 30 cyklech s teplotní hybridizací při 58 °C.

Nestingová amplifikace byla prováděna 30 cyklů za použití MGDF primeru SEQ ID NO: 12 a vektorového primeru SEQ ID NO: 16. Specifické pásy byly patrné v částech 1, 7 a 8, které byly klonovány do PCR II vektoru. Purifikované plazmidové DNA z jednotlivých kolonií byly dále purifikovány a sekvenovány.

F. Izolace klonů humánního MGDF o plné délce

Mnoho počátečních klonů neobsahovalo část u aminokonce MGDF, poněvadž části MGDF sekvence bylo použito pro priming a nesting. Primeru 5' CCA GGA AGG ATT CAG GGG A 3' (SEQ ID NO: 18), jehož sekvence byla získána z pěti experimentů s příměrovou extenzí popsaných výše bylo použito jako negativního primeru. Jako pozitivní primer přitom posloužil vektorový primer SEQ ID NO: 16. Bylo provedeno 35 cyklů amplifikace s teplotní hybridizací při 58 °C. Pro nesting v 35 cyklech bylo použito MGDF specifického primeru 5' CAA CAAGTC GAC CTC CAG CCA GAC ACC CCG 3' (SEQ ID NO: 19) s místem Sáli a pro nesting v 35 cyklech bylo použito vektorového primeru SEQ ID NO: 15. PCR produkt byl klonován do PCR II vektoru a sekvenován.

-29CZ 288890 B6

II. Přívod druhého přístupu ke klonování

A. Klonování N-terminální cDNA psího MGDF

Degenerované oligonukleotidové příměry byly zhotoveny na psí MGDF N-terminální aminokyselinové sekvenci popsané v předchozí části a bylo jich použito jako primeru při řetězových reakcích iniciovaných polymerázou (PCR pro amplifikaci MGDF-kódujících cDNA sekvencí). Úplná RNA byla připravena ze vzorku psích ledvin metodou s guanidiniumisokyanátem (Comzynski a Sacchi, Biochem 162: 156 až 159 (1987)). První řetězec cDNA byl připraven se statistickým primerem - adapterem 5' GGC CGG ATA GGC CAC TCN NNNNNT 3' (SEQ ID NO: 20) za použití reversní transkriptasy MoMULV a bylo ho použito jako templátu při následujících reakcích PCR.

PCR byla prováděna za použití 0,5 μΐ (asi 50 ng) cDNA za použití primeru A 5' GCN CCNCCN GCN TGY GA 3' (SEQ ID NO: 4) a primeru s negativním řetězcem kódujícího aminokyseliny 1 až 6 ze SEQ ID NO: 1 a buď primeru B 5' GCA RTG NAG NAC RTGNGARTC3' (SEQ ID NO: 5), nebo primeru C 5'GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3' (SEQ ID NO: 21), což jsou primery pozitivního řetězce kódující aminokyseliny 16 až 21 ze SEQ ID NO: 1 se 3 nukleotidy navíc u 5' konce pro zvýšení stability při teplotní hybridizaci. PCR s Taq polymerázou byla prováděna 35 až 45 cyklů do té doby, dokud nebyly na agarózovém gelu pro elektroforetickou analýzu patmé pásy produktu. V prvních dvou cyklech PCR byl prováděn rehybridizační (teplotní hybridizace) stupeň (37 °C, 2 minuty) a rehybridizace ve zbývajících cyklech byla prováděna 1 minutu při 50 °C. V každém reakčním produktu bylo pozorováno více pásů produktů. Pomocí špičky Pasteurovy pipety byly odebrány části gelu obsahující pásy o přibližně očekávané velikosti (66 bp) a byla provedena jejich reamplifíkace se stejnou dvojicí primerů. DNA produkty byly klonovány do vektoru PCR II (Invitrogen) podle instrukcí výrobce. Tři klony byly sekvenovány a bylo zjištěno, že kódují vjednom čtecím rámci očekávanou psí MGDF sekvenci, zbytky 1 až 21. Tímto způsobem byla získána jedinečná psí MGDF cDNA sekvence pokrývající oblast od třetího nukleotidu kodonu 6 do třetího nukleotidu kodonu 15. Jednoho z těchto klonů bylo použito jako templátu pro přípravu značené psí MGDF cDNA próby.

B. Konstrukce cDNA knihovny z humánních fetálních jater

RNA byla izolována z humánních fetálních jater (Intemational Institute for the Advancement of Medicine, Exton, PA, USA) lyží tkáně v 5,5M guanidiniumthiokyanátu a purifikací CsTFA (Pharmacia) centrifugách Polyadenylovaná RNA byla selektována za použití perlového produktu oligo (dT)₂5 dynabeads (Dynal, podle instrukcí výrobce). Z této RNA byla vyrobena dvouřetězcová DNA za použití plazmidového systému Superscript pro syntézu cDNA (Life Technologies lne.) s výjimkou použití odlišného linkerového adaptéru: 5' TTG GTG TGC ACTTGT G 3' (SEQ ID NO: 22) a 5' CAC AAG TGC ACA CCA ACC CC 3' (SEQ ID NO: 23). Po selekci podle velikosti byla tato cDNA směrované vložena do míst BstXI a Notl savčího expresního vektoru pBCB (pBCB byl získán zplazmidu Rc/CMV, Invitrogen obsahujícího hlavní řetězec pucl9, CMV promotor a BGH polyadenylační místo). Ligovaná DNA byla elektroporací zavedena do elektro-komptetentního bakteriálního kmene 10 B (Life Technologies lne.).

C. Screening knihovny cDNA z humánních fetálních jater na MGDF

Filtrové repliky humánní fetální jatemí knihovny byly hybridizovány k radioaktivně značenému psímu MGDF N-konec cDNA PCR produktu (5x SSPE, 2x Denhardt, 0,05% difosforečnan sodný, 0,5% SDS, kvasinkový tRNA lyzát (100 μΐ/litr) a denaturovaná lososí spermatová DNA (100pg/ml)) 18 hodin při 64 °C. Filtry byly promyty při 64 °C v 5x SSPE, 0,5% SDS

-30CZ 288890 B6 a exponovány přes noc. Byly izolovány a analyzovány dva různé klony hybridizované ktéto próbě.

D. Exprese humánních MGDF cDNA klonů

Purifíkovaná DNA z MGDF cDNA klonů byla transfekována do buněk 293 EBNA (Invitrogen). 1,5 pg DNA bylo smícháno se 7,5 pl Lipofectaminu (Life Technologies Inc.) ve 100 pl séraprostého DMEM. Po 20minutové inkubaci při teplotě místnosti byla směs DNA-Lipofectamine přidána k 5 x 10⁵ buňkám/jamka (24-jamková čtvercová miska Greiner) v 400 pl DMEM s 1 % séra (Fetal Cloně II) a inkubována 6 hodin při 37 °C. K buňkám bylo přidáno 500 pl DMEM s 20 % séra (Fetal Cloně II). Po 16 hodinách bylo médium odtaženo a bylo přidáno 500 pl DMEM s 1 % séra (Fetal Cloně II). Po dalších 72 hodinách byla zpracované médium shromážděno a odstraněno za použití rotačního filtru s průměrem pórů 0,22 pm. Zpracované médium bylo podrobeno zkoušce na biologickou aktivitu MGDF.

III. Popis humánních MGDF klonů a jejich aktivita

Za použití výše popsaných strategií klonování byly získány humánní cDNA klony znázorněné na obr. 11 (MGDF-1 a MGDF-2; SEQ ID NO: 24, 25 a 26, 27) a obr. 12 (MGDF-3; SEQ ID NO: 28, 29). Každá z těchto sekvencí uvedených na obrázcích obsahuje předpokládanou signální sekvenci aminokyselin 1 až 21, takže maturovaný protein začíná vždy aminokyselinou 22.

Výsledky zkoušek aktivity za použití zkoušky s buňkami popsané v příkladu 4A (MGDF 1 až 3) jsou uvedeny v tabulkách 3 a 4. Podle tabulky 3 bylo médium zpracované buňkami 293 EBNA transfekovanými jednotlivými konstrukty shromážděno po dvou dnech kultivace a potom zkoušeno na buňkách 1A6.1 (32D/mur-MPL+) ± 10 pg/ml mur-MPL-X. Podle tabulky 4 bylo médium zpracované buňkami 293 EBNA transfekovanými jednotlivými konstrukty shromážděno po čtyřech dnech kultivace a potom zkoušeno na buňkách 32D/mur-MPL+ (příklad 3A) a 32D-Hu-MPL+ (příklad 3B). Jak je zřejmé, humánní MGDF-1 a MGDF-2, ale nikoliv MGDF-3, je aktivní u buněčných linií exprimujících jak myší, tak humánní formu Mpl. Buněčná linie exprimující humánní Mpl receptor je responsivnější vzhledem k MGDF-1 a MGDF-2 než buněčná linie exprimující myší Mpl receptor.

Tabulka 3

Klon	- mur-MPL-X (jednotky/ml)	+ mur-MPL-X (jednotky/ml)
Médium	0	0
PBCO (kontrolní plazmid)	0	0
MGDF-1	12 800	800
MGDF-1 (opakování)	12 800	566
MGDF-2	4525	400
MGDF-2 (opakování)	12 800	1131
MGDF-3	0	0
MGDF-3 (opakování)	0	0
APK9 kontrolní	4400 ± 400	0

-31CZ 288890 B6

Tabulka 4

Klon	32D/mur-MPL+ (jednotky/ml)	32D/hu-MPL+ (jednotky/ml)
MGDF-1	1600	25 600
MGDF-2	6400	50 000
MGDF-2 (opakování)	6400	50 000 až 100 000

Následující tabulka 5 ukazuje, že aktivity humánního MGDF-1 a MGDF-2 na buňky 32D/Hu-MPL+ (příklad 3B) jsou v podstatě úplné inhibovány rozpustným humánním Mpl receptorem (hu-MPL-X). hu-MPL-X byl obsažen ve zpracovaném médiu odděleném od buněk CHO produkujících tento protein. Médium zpracované buňkami CHO s hu-MPL-X bylo 120x zkoncentrováno a potom přidáno ke kulturám do obsahu 6,6 %. Zpracované médium z kontrolních CHO kultur nevykazovalo žádný účinek při této zkoušce. Zkouška byla prováděna způsobem popsaným v příkladu 4B, pouze s tím rozdílem, že životaschopné buňky byly zjišťovány po 3 dnech.

Tabulka 5

Klon	-Hu-MPL-X (jednotky/ml)	+ Hu-MPL-X Gednotky/ml)
MGDF-1	530	0
MGDF-2	270	0

Zkouška s humánními megakaryocyty

MGDF-1 a MGDF-2, ale nikoliv MGDF-3, indukuje tvorbu megakaryocytů z CD34-selektovaných buněk z periferní krve. Experiment popsaný v tabulce 6 byl proveden v podstatě způsobem popsaným v příkladu 2, pouze s tím rozdílem, že buňky periferní krve byly CD34selektovány bez elutriace a kultura byla sklizena po 7 dnech. Zpracovaného média z 293 EBNAMGDF konstruktu bylo použito při 20 % finálního objemu ±30 μg/ml mur-MPL-X. APK9 kontroly bylo použito při 6 % konečného objemu.

Tabulka 6

Klon	Megakaryocyty na jamku (-mur-MPL-X)	Megakaryocyty na jamku (+mur-MPL-X)
vektorová	0	0
kontrola
APK9	100 ±3	0
kontrola
MGDF-1	142 ± 48	17 ±2
MGDF-2	100 ±3	6±2
MGDF-2
(opakování)	86 ± 10	0
MGDF-3	2±2	0

Příklad 12

Exprese rekombinantního humánního MGDF (1 až 163) v E. coli

-32CZ 288890 B6

Pro expresi r-HuMGDF v E. coli byla chemicky syntetizována sekvence kódující prvních 163 aminokyselin maturovaného proteinu za použití optimálních kodonů E. coli. K 5' konci genu byly přidány sekvence DNA kódující aminokyseliny methionin a lysin. Protein r-HuMGDF kódovaný touto sekvencí obsahuje proto 165 aminokyselin, počínaje s řetězcem Met-Lys. Sekvence tohoto genu je uvedena na obr. 19.

Syntéza rHuMGDF (1-163) genu byla provedena v několika stupních. Nejprve byly za použití optimálních kodonů E. coli chemicky syntetizovány první komplementární oligonukleotidy (o délce 60 až 70 bp) představující sousední fragmenty genu. Během této syntézy byly k 5’ konci maturovaného genu připojeny kodony pro aminokyselinu methionin a lysin a k 3' konci genu byl připojen stop kodon. Kromě toho byla na nejzazší konce 5' a 3' připojena štěpná místa pro restrikční enzymy Xbal (5' konec) a HindlII (3' konec) a ve vhodné vzdálenosti před počátečním methioninovým zbytkem bylo umístěno syntetické ribosomální vazebné místo. Potom byla provedena teplotní hybridizace komplementárních oligonukleotidů pro každý fragment genu. Ve třetím stupni byly jednotlivé syntetické fragmenty genu amplifikovány za použití PCR reakce. Ve čtvrtém stupni byly amplifíkované fragmenty subklonovány do vhodného vektoru. V pátém stupni byla provedena verifikace sekvencí subklonovaných fragmentů. V šestém stupni byly jednotlivé fragmenty vzájemně ligovány a subklonovány do vhodného vektoru, přičemž byl rekonstruován r-HuMGDF (1-163) gen o plné délce. Nakonec byla provedena verifikace rekonstruovaného genu.

Syntetický r-HuMGDF genový fragment lemovaný restrikčními místy Xbal (u 5' konce) a HindlII (u 3' konce) obsahuje ribosomální vazebné místo, ATG start kodon, sekvenci kódující maturovaný Met-Lys r-HuMGDF protein a stop kodon.

Výše uvedený fragment byl klonován do míst Xbal a HindlII laktosou indukovatelného expresního vektoru pAMGl 1. Vektor pAMGl 1 je plazmid s nízkým počtem kopií, jehož počátek replikace je odvozen zpRlOO. Expresní plazmid pAMGll může být získán zplazmidu pCFM1656 (přírůstkové číslo sbírky ATCC 69576, datum uložení: 24. února 1994) sérií místně orientovaných změn bází PCR překrývající oligomutagenesí. Začne se místem BglII (plazmid bp# 180) bezprostředně ve směru 5' od promotoru replikace plazmidu P_copB a pokračuje se směrem ke genům replikace plazmidu, přičemž se provedou následující změny bázových párů:

-33CZ 288890 B6

dAMGII bo 4 bp v pCFM1656	změněný bp v pAMGll
♦ 204	T/A	C/G
4 428	A/T	G/C
* 509	G/C	A/T
4 617	- -	insert dvou G/C bp
♦ 679	G/C	T/A
4 980	T/A	C/G
4 994	G/C	A/T
4 1004	A/T	C/G
4 1007	C/G	T/A
4 1028	A/T	T/A
4 1047	C/G	T/A
4 1178	G/C	T/A
4 1466	G/C	T/A
4 2028	G/C	bp delece
4 2187	C/G	T/A
4 2480	A/T	T/A
4 2499-	2502 AGTG TCAC	GTCA CAGT
4 2642	TGCGAGC AGGCTCG	bp delece
4 3435	G/C	A/T
4 3446	G/C	A/T
4 3643	A/T	T/A
4 4489-	-4512 --	insert bps

SAGCTCACTAGTGTCGACCTGGAG

CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC (SEQ ID NOS: 30,31) a sekvence DNA mezi jedinečnými restrikčními místy AatlI a Clal se nahradí následujícím oligonukleotidem:

-34CZ 288890 B6

AatlI (#4358) ’ CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT- * TGCAGAGTATTAAAAATTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA-

-GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3 · -CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5 ·

Clal (#4438) (SEQ ID NOS: 32,33)

Exprese r-HuMGDF klonovaného do pAMGll je poháněna syntetickým promotorem, který je indukovatelný iaktosou, jako je Ps4, jehož sekvence je:

5' GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3 ’.

(SEQ ID NO: 34)

Promotor Ps4 je potlačován represorem laktosy (Láci), což je produkt genu láci z E. coli.

Plazmid pAMGl 1 -r-HuMGDF se potom transformuje do E. coli kmene K-12, který obsahuje allelu lacl^q. Allela představuje mutací v promotoru láci zvyšující expresi Láci, což má za následek přísnější kontrolu exprese proteinu poháněnou promotorem PS4. V tomto kmen je tedy za nepřítomnosti laktosy exprese r-HuMGDF potlačena Láci. Po přídavku laktosy se protein Láci, který se naváže na místo operátoru promotoru PS4, redukuje a začne transkripce r-HuMGDF prostřednictvím PS4. Hostitelská buňka E. coli použitá v tomto příkladu je uložena ve sbírce ATCC pod přírůstkovým číslem 69717 (datum uložení: 30.11. 1994).

Hostitel, E. coli ATCC č. 69717, byl transformován plazmidem pAMG 11-r-HuMGDF a buňky byly pěstovány podle následujícího fermentačního předpisu: Kmen E. coli se inokuluje do půdy Luria a potom se směs asi 12 hodin inkubuje při 30 °C. Buňky se za aseptických podmínek přenesou do fermentoru, který obsahuje vsázku média (kvasinkový extrakt - 20 g/litr, kyselina citrónová - 3,4 g/litr, hydrogenfosforečnan draselný - 15 g/litr, Dow P2000- 15 ml, glukóza

- 5 g/litr, heptahydrát síranu hořečnatého - 1 g/litr, stopové kovy - 5,5 ml/litr a vitaminy

- 5,5 ml/litr). Ve vsázkové kultivaci se pokračuje tak dlouho, dokud jednorázová kultura nedosáhne optické density 5,0 ±1,0 při 600 nm. Potom se zahájí fermentační fáze „fed-batch“, přičemž se nejprve přivádí první dodávané médium obsahující glukosu (70 g/litr) a heptahydrát síranu hořečnatého (6,75 g/litr). Rychlost dávkování se přizpůsobuje každé 2 hodiny podle předem stanoveného rozvrhu. Druhé dodávané médium obsahující tryptikasový pepton (129 g/litr) a kvasinkový extrakt (258 g/litr) se začne dávkovat, když kultura dosáhne optické density 20 až 25 při 600 nm. Průtoková rychlost druhého dodávaného média se udržuje na konstantní hodnotě a pokračuje se v přizpůsobování prvního dodávaného média. Teplota během celé fermentace se udržuje přibližně na hodnotě 30 °C a její hodnota pH se udržuje na asi 7 přidáváním kyseliny nebo báze podle potřeby. Požadovaná hladina rozpuštěného kyslíku se udržuje úpravou rychlosti míchání, přívodu vzduchu a přívodu kyslíku do fermentoru. Když optická densita kultury dosáhne 57 až 63 při 600 nm, zahájí se přidávání třetího dodávaného média. Třetí dodávané médium (laktosa - 300 g/litr) se do fermentoru uvádí konstantní průtokovou rychlostí; uvádění prvního dodávaného média se přeruší a rychlost přivádění druhého dodávaného média se upraví na novou konstantní hodnotu. Fermentace trvá přibližně 10 hodin od

-35CZ 288890 B6 zahájení přívodu třetího dodávaného média. Na konci fermentace se kultura ochladí na 15 ± 5 °C a buňky se sklidí centrifugací. Výsledná pasta se shromáždí a uloží při teplotě nižší než 60 °C.

Purifikace rekombinantního MGDF produkovaného v E. coli, popsaného výše, byla provedena takto: buněčná pasta (1800 g) byla suspendována přibližně v 18 litrech lOmM EDTA a suspenze byla zpracována ve vysokotlakém homogenizéru za tlaku 103 MPa. Suspenze rozbitých buněk byla odstředěna a peleta byla resuspendována v 10 litrech lOmM EDTA. Následovala nová centrifugace suspenze a získaná 200g peleta byla solubilizována ve 2 litrech lOmM Tris, 8M hydrochloridu guanidinu, lOmM DTT, 5mM EDTA o pH 8,7. Tento roztok byl pomalu zředěn převedením do 200 litrů lOmM CAPS, 3M močoviny, 30% glycerolu, 3mM cystaminu a lmM cysteinu o pH 10,5.

Zředěný roztok byl 16 hodin pomalu míchán při teplotě místnosti a poté bylo pH upraveno na hodnotu 6,8. Roztok s upravenou hodnotou pH byl vyčiřen a nanesen na dvoulitrový sloupec CM Sepharose ekvilibrovaný s lOmM fosforečnanem sodným, 1,5M močovinou a 15% glycerolem o pH 6,8. Po nanesení byl sloupec promyt lOmM fosforečnanem sodným a 15% glycerolem o pH 7,2. MGDF byl eluován gradientem chloridu sodného od 0 do 0,5M a lOmM fosforečnanem sodným o pH 7,2.

CM eluát byl zkoncentrován a pufr byl vyměněn za lOmM fosforečnan sodný o pH 6,5 za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000. Na koncentrovaný roztok (asi 2 mg/ml) bylo působeno cathepsinem C (500 až 1M) po dobu 90 minut při teplotě okolí.

Potom byl roztok nanesen na l,21itrový sloupec pro HPLC (SP High Performance Sepharose) ekvilibrovaný s lOmM fosforečnanem sodný, 15% glycerolem o pH 7,2. Po nanesení byl MGDF eluován za použití gradientu chloridu sodného (0,1 až O,25M) a lOmM fosforečnanu sodného o pH 7,2.

K eluátu ze sloupce SP High Performance byl přidán síran amonný až do 0,6M koncentrace. Eluát byl nanesen na l,61itrový sloupec Phenyl Toyopearl ekvilibrovaný s lOmM sodným, 0,6M síranem amonným, pH 7,2. Pík MGDF byl eluován síranem amonným (gradient od 0,6 do 0M), fosforečnanem sodným (lOmM), pH 7,2.

Eluát ze sloupce Phenyl Toyopearl byl zkoncentrován a pufr byl vyměněn za lOmM Tris, 5% sorbitol, pH 7,5 za použití membrány s vylučovací mezí molekulové hmotnosti 10 000.

Příklad 13

In vivo biologické vlastnosti r-HuMGDF (E. coli 1-163)

Byla zjišťována biologická účinnost r-HuMGDF (E. coli 1-163) připraveného způsobem popsaným v příkladu 12 na hlodavce. Normálním samicím myší Balb/c se po dobu 5 po době jdoucích dnů subkutánně podávají injekce se zvyšující se dávkou r-HuMGDF. Rozmezí dávkování bylo od 15 do 1500 pg/kg/den. 24 hodin po poslední injekci byly zvířatům odebrány krevní vzorky. Analýza krevních buněk byla provedena pomocí elektronického počítače buněk Sysmex (Baxter). Při logaritmicky se zvyšující koncentraci cytokinu byl pozorován lineární nárůst počtu krevních destiček. Při dávkování 1 500 pg/kg/den se v tomto systému počet krevních destiček zvýšil na 300 % počáteční hodnoty (základní linie). Jiné parametry krevních buněk, jako je počet bílých nebo červených buněk nebo hematokrit, nebyly při tomto ošetření ovlivněny.

Krysám, kterým byla po dobu 6 dnů podávána dávka r-HuMGDF (E. coli 1-163) 30 pg/kg/den byly odebrány krevní destičky a tyto krevní destičky byly podrobeny zkoušce na schopnost agregace v odpovědi na ADP. Zjištěná data ukazují, že destičky od ošetřených zvířat v podstatě

-36CZ 288890 B6 nelze odlišit od destiček kontrolních zvířat, poněvadž obě populace jsou stejně citlivé vůči agonistovi krevních destiček, ADP.

r-HuMGDF byl také hodnocen na schopnost odstranit thrombocytopenii spojenou s chemoterapií a/nebo ozařováním. Při této studii bylo použito carboplatinu, což je chemoterapeutikum vyvolávající hlubokou thrombocytopenii u člověka. Na počátku studie byla myším Balb/c subkutánní injekcí podána dávka 1,25 mg carboplatinu. Po 24hodinách začaly být myši léčeny r-HuMGDF (E. coli 1-163) nebo excipientem v denní dávce 100 pg/kg/den, až do dokončení studie. Devátý den poklesl počet krevních destiček u myší léčených excipientem přibližně na 15 % normální hodnoty, zatímco u myší léčených r-HuMGDF zůstal počet krevních destiček na úrovni základní linie (viz obr. 15).

Při studiích s ozařováním byly myši podrobeny jedné dávce gamma záření (z cesiového zdroje, 500 rad). Jedná se o sublethální dávku, která má za následek 90% snížení počtu krevních destiček do 11. dne. Počet krevních destiček se do 21. dne nevrátil na normální hodnotu. Když byl ozařovaným myším od prvního do 20. dne podáván r-HuMGDF (E. coli 1-163) jednou denně v dávce 100 pg/kg/den, nebyl pokles počtu krevních destiček tak dramatický a návrat na hodnotu odpovídající základní linii byl rychlejší než u myší léčených excipientem (viz obr. 15).

Pro vyzkoušení aktivity r-HuMGDF za použití modelu extrémní a dlouhodobé thrombocytové cytopenie, bylo podání carboplatinu a ozařování aplikováno v kombinaci (obr. 16). Za těchto okolností poklesl počet krevních destiček na extrémně nízkou hodnotu (3 až 5 % normální hodnoty) a většina zvířat (7 z 8) toto ošetření nepřežila. Když se však byla těmto zvířatům každý den po celou dobu studie podávána subkutánní injekce r-HuMGDF v dávce 100 pg/kg/den, thrombocytopenie byla významně potlačena, návrat na hodnotu odpovídající základní linii byl rychlejší a všechny zvířata léčená r-HuMGDF (8/8) přežila.

r-HuMGDF byl také zkoušen na opicích rhesus. Normálním opicím rhesus byl subkutánní injekcí podáván r-HuMGDF v dávce 2,5 nebo 25 pg/kg/den, celkem po dobu 10 dnů (den 0 až 9). U skupiny s nižší podávanou dávkou se počet krevních destiček v den 12 zvýšil o 400 % a u skupiny s vyšší podávanou dávkou činilo toto zvýšení 700 %, také v den 12. Po ukončení injekčního podávání se počty krevních destiček vrátily na normální hodnotu do dne 25 až 30. Výše popsaným ošetřením nebyl ovlivněn počet bílých a červených krvinek.

r-HuMGDF (E. coli 1-163) byl také zkoušen na primátech s prudkou thrombocytopenii (obr. 18). Modelová zvířata byla ozářena (dávkou 700 rad z kobaltového zdroje), což mělo za následek pokles počtu krevních destiček v den 15 na 1 až 2 % normální hodnoty. Do dne 35 až 40 se počet krevních destiček vrátil na normální hodnotu. Naproti tomu počet krevních destiček u ozařovaných zvířat léčených každý den rHu-MGDF v dávce 25 pg/kg/den klesl jen na 10 % normální hodnoty a v průměru nebyl nižší než 20 000/pl, což je mezní hodnota, při níž se u humánních pacientů postižených thrombocytopenii zahajuje transfuze krevních destiček. U zvířat léčených r-HuMGDF byl také návrat na základní hodnotu rychlejší; této hodnoty bylo dosaženo v den 20.

Výše uvedená in vivo data ze studií na hlodavcích a primátech plně podporují předpoklad, že rHuMGDF (E. coli 1-163) je účinným terapeutickým činidlem se schopností významně ovlivnit klinicky relevantní thrombocytopenie.

-37CZ 288890 B6

Příklad 14

Způsob produkce r-HuMGDF 1-332 v kultuře buněk CHO

Glykosylovaný r-HuMGDF 1-332 je produkován transfekovanými buňkami ovárií čínského křečka exprimujícími cDNA pro MGDF 1-332 pod kontrolou vhodného promotoru as připojením ke genu kódujícímu amplifikovatelný selekční markér DHFR. Vhodným promotorem pro expresi MGDF v buňkách CHO je SRa (viz Mol. Cell. Biol. 8: 466 až 472 (1988) a WO 91/13160 (1991)). Vhodným vektorem pro expresi MGDF v buňkách CHO je pDSRa2 (viz WO 90/14363 (1990)). Příkladné buněčné linie CHO jsou schopny produkovat sekretovaný MGDF ve standardním médiu pro buněčné kultury v množství v rozmezí od 10 do 20 mg/litr. Toto množství je však možno zvýšit na 25 až 100 či více mg/litr. Pro produkci MGDF za použití typické buněčné linie je možno kulturu expandovat pasážováním v suspenzi nebo v nádobách pro tkáňové kultury způsobem adherentního růstu za použití média, které zahrnuje stejná množství Dulbeccem modifikovaného Eaglova média (DMEM) a Hamova média F12 (DMEM/F12, Gibco). Použité médium může být doplněno 5 až 10 % fetálního hovězího séra (FBS) nebo dialyzovaného fetálního hovězího séra a methotrexatem (MTX) (pokud je ho zapotřebí, bývá typická koncentrace MTX 200 až 600nM) za účelem udržení selekčního tlaku. Toto médium by mělo být doplněno přídavnými neesenciálními aminokyselinami (NEAA) a glutaminem. Suspenzní kultury snadno propagují v rozmezí od inokulačních denzit 1 až 4 x 10⁵ buněk/ml. Při maximální densitě asi 1 x 10⁶ buněk/ml se kultury expandují zředěním do většího objemu s počáteční hodnotou density krevních destiček při specifikované hodnotě inokulační density.

Má-li se MGDF produkovat v převalovaných láhvích, musí se vhodný objem suspenzí kultury o vhodné densitě buněk vytvořit za použití buď magneticky míchaných rotačních nádob umístěných v prostředí s regulovanou teplotou (37 ± 1 °C), nebo bioreaktoru typu míchané nádrže opatřené příslušnými měřicími a regulačními prvky. Převalované láhve (jako například láhve typu Falcon o objemu 850 cm³) je třeba zaočkovat na počáteční hustotu 1,5 až 3 x 10⁷ buněk, počítáno na láhev a doplnit přídavným růstovým médiem (DMEM/F12 s 5 až 10 % FBS, IX NEAA a IX L-glutaminem) v množství vhodném pro vytvoření konfluentní monovrstvy během 3 až 4 dnů (150 až 300 ml/láhev). Růstové médium by mělo být zpočátku pufrováno hydrogenuhličitanem sodným na pH 6,9 až 7,2 v rovnováze s oxidem uhličitým o parciálním tlaku 8 kPa až 12 kPa. Láhve by měly být zaplyněny směsí 10% oxidu uhličitého ve vzduchu a po upevnění v převalovacím zařízení 3 až 4 dny převalovány při teplotě 37 ± 1 °C a frekvenci otáčení asi 1 min¹. Po dosažení konfluence by mělo být v lahvích médium vyměněno za produkční médium neobsahující sérum. To lze provést vylitím nebo odsátím růstového média, promytím lahví isotonickým pufrem, jako je Dulbeccův fosfátem pufrovaný roztok chloridu sodného (D-PBS), v množství 50 až 100 ml/láhev a potom přidáním vhodného objemu hydrogenuhličitanem pufrovaného, séraprostého média DMEM/F12 (1:1) (200 až 300 ml/láhev) doplněného NEAA a L-glutaminem, jakož i síranem měďnatým, za účelem minimalizace kovalentní agregace (1 až 20μΜ). Láhve by měly být zaplyněna 10% oxidem uhličitým ve vzduchu a inkubovány při 37 ± 1 °C v převalovacím zařízení otáčejícím se s frekvencí 1 min¹ po dobu 6 ± 1 dnů nebo tak dlouho, dokud metabolická aktivita nesníží koncentraci glukosy na hodnotu nižší než 0,5 mg/litr a/nebo hodnotu pH pod 6,6. Zpracované médium se může sklidit vylitím nebo aspirací z lahví a nahradit čerstvým séraprostým produkčním médiem popsaným výše, za účelem dalších sklizní. Tento postup se může provádět tak dlouho, až již buňky nejsou schopny pokračovat v produkci v séruprostém prostředí a vytékají z převalovaných láhví.

Sklizené zpracované médium je možno purifíkovat mikrofiltrací se slepým koncem za použití filtrů o rozměru póru 0,45 pm a/nebo 0,2 pm (Sartorius Sartobran pH nebo Pall). Přefiltrované zpracované médium je třeba zchladit na 4 °C a potom buď dočasně uložit při teplotě 4 °C, nebo ihned zkoncentrovat a dialyzovat na nízkou iontovou sílu za použití ultrafiltračního systému s příčným tokem (například Filtron YM-50). Ultrafiltrace a diafiltrace by se měla provádět při 4 °C za účelem minimalizace rozkladu proteinu. Před stupni chromatografické purifikace by

-38CZ 288890 B6 zpracované médium mělo být dialyzováno proti pufrovanému vodnému roztoku (například lOmM fosforečnanu draselnému o pH 6,8).

Kvalitu produktu ve zpracovaném médiu je možno nejlépe monitorovat za použití analýzy neredukující SDS-PAGE Western Blot. Touto analýzou se mohou zjistit relativní množství agregovaných, monomemích a proteolyticky degradovaných MGDF ve vzorcích.

Další způsob produkce MGDF z buněk CHO spočívá v adaptaci buněčné linie exprimující MGDF na séraprosté médium, jako je Gibco S-SFM II. Buňky je možno adaptovat sériovým pasážováním v médiu, které obsahuje malé přídavky séra nebo sérum vůbec neobsahuje. Když se zjistí, že buněčné linie dobře roste v takovém médiu a produkuje vhodná množství vyloučeného MGDF, může se v produkci pokračovat tak, že se sériovým pasážováním inokulační kultura převede do většího měřítka s větším objemem kultury a vzniknou kulturou se zaočkuje vhodná produkční nádoba (například míchaný nádržový bioreaktor opatřený měřicími a regulačními prvky). Kultura se může nechat růst až do maximální density zajišťující životaschopnost za optimálních růstových podmínek (pH, živiny, teplota, kyslík, smykové míchání). V optimální fázi produkce (kterou lze zjistit experimentálně na základě stanovení kvantity a kvality produktu) je možno kulturu z bioreaktoru sklidit a buňky lze odstranit ze zpracovaného média hloubkovou filtrací (řádově mikronovou) nebo submikronovou mikrofíltrací s příčným tokem. Pokud se použije hloubkové filtrace, mělo by být médium dále vyčiřeno submikronovou filtrací se slepým koncem a teprve potom podrobeno koncentraci a dialýze, jak je to popsáno výše.

Vynález byl popsán jak obecně, tak na svých přednostních provedeních. Do rozsahu vynálezu však spadají i nejrůznější obměny a modifikace, které jsou odborníci v tomto oboru schopni provést na základě výše uvedeného popisu. Následující patentové nároky pokrývají také všechny výše uvedené modifikace.

Všechny výše uvedené citace osvětlující oblast vynálezu a dosavadní stav techniky jsou zde citovány náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu jejich celého vynálezu.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Bartley, Timothy D.

Bogenberger, Jakob M. Bosselman, Robert A. Hunt, Pamela Kinstler, Olaf, B. Samal, Babru B.

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Composition and Methods for Stimulating

Megakaryocyte Growth and Differentiation (Látky a způsoby pro stimulaci růstu a diferenciace megakaryocytů) (iii) POČET SEKVENCÍ: 34 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A) ADRESÁT: Amgen lne., (B) ULICE: 1840 Dehavilland Drive (C) MĚSTO: Thousand Oaks (D) STÁT: Kalifornie (E) ZEMĚ: USA

-39CZ 288890 B6 (F)PSČ: 91320-1789 (ZIP) (v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP MEDIA: Disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, verze #1.25 (vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K TÉTO PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNÍ:

(C) ZATŘÍDĚNÍ:

(viii)INFORMACE O PATENTOVÉM ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Cook, Robert R.

(C) SPISOVÁ ZNAČKA: A-290-C (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 31 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi)POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Het Leu Arg Asp

5 10 15

Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gin Xaa Pro Asp Ile Tyr

25 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein

-40CZ 288890 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

Ala Pro pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 15 10 15

Ser His Val Leu His (2) INFORMACE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp Val Leu Gly Ala Val Ala 15 10 15

Leu (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

GCNCCNCCNG CNTGYGA 17 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

-41CZ 288890 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

GCARTGYAAC ACRTGNGART C 21 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:6:

Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp 15 10 15

Ser His Val Leu His (2) INFORMACE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

GTACGCGTTC TAGANNNNN T (2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

AGTTTACTGA GGACTCGGAG G

-42CZ 288890 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTTT 30 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTT 29 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

TGCGACCTCC GAGTCCTCAG 20 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 23 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

-43CZ 288890 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

GGAGTCACGA AGCAGTTTAC (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

CCTTTACTTC TAGGCCTG (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETÉZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

GAGGTCACAA GCAGGAGGA 19 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: (A) DÉLKA: 19 bázových párů

-44CZ 288890 B6 (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 16:

GGCATAGTCC GGGACGTCG 19 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 17:

TCCTCCTGCT TGTGACCTC 19 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 19 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:18:

CCAGGAAGGA TTCAGGGGA 19 (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 19:

CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 30

-45CZ 288890 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:20:

GGCCGGATAG GCCACTCNNN NNNT (2) INFORMACE O SEQ ID NO:21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 21 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:21:

GCARTGYAAN ACRTGNGART C (2) INFORMACE O SEQ ID NO:22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 16 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:22:

TTGGTGTGCA CTTGTG (2) INFORMACE O SEQ ID NO:23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 20 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA

-46CZ 288890 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:23:

CACAAGTGCA CACCAACCCC (2) INFORMACE O SEQ ID NO:24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1342 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTIKA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 99.1094 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:24:

-47CZ 288890 B6

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG

TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT

Sec Pro Ala Pro Pxo

5

GCT TGT GAC CTC

CGA Arg 10

GTC CTC AGT

AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC

Ala Cys Asp

Leu

Val

Leu Ser

Lys

Leu Leu 15

Arg Asp

Sex

His Val 20

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

ACA

Leu

His

Sex

Arg 25

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pxo

Leu 35

Pxo

Thr

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA

ACC

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro

Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

Gin

Met 55

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr

Leu

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

95 100

GGG Gly

GCC CTG Ala Leu

CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG

Gin Ser 105

Leu

Leu Gly

Thr 110

Gin

Leu pro

Pro

Gin Gly Arg 115

ACC

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

CTG

CTC

CGA

GGA

AAG

GTG

CGT

TTC

CTG

ATG

CTT

GTA

GGA

GGG

TCC

ACC

Leu

Leu 135

Arg

Gly Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Met

Leu

Val 145

Gly

Gly

Ser

Thr

CTC

TGC

GTC

AGG

CGG

GCC

CCA

CCC

ACC

ACA

GCT

GTC

CCC

AGC

AGA ACC

Leu 150

Cys

Val

Arg

Arg

Ala 155

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala 160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr 165

TCT

CTA

GTC

CTC

ACA

CTG

AAC

GAG

CTC

CCA

AAC

AGG

ACT

TCT

GGA

TTG

Ser

Leu

Val

Leu

Thr 170

Leu

Asn

Glu

Leu

Pro 175

Asn

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

TTG

GAG

ACA

AAC

TTC

ACT

GCC

TCA

GCC

AGA

ACT

ACT

GGC

TCT

GGG

CTT

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser 195

Gly

Leu

CTG

AAG

TGG

CAG

CAG

GGA

TTC

AGA

GCC

AAG

ATT

CCT

GGT

CTG

CTG

AAC

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Leu

Asn

CAA

ACC

TCC

AGG

TCC

CTG

GAC CAA

ATC

CCC

GGA

TAC

CTG

AAC

AGG

ATA

Gin

Thr

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp Gin

Ile

Pro

Gly Tyr

Leu

Asn

Arg

Ile

215 220 225

113

161

209

257

305

353

401

449

497

545

593

641

689

737

785

-48CZ 288890 B6

CAC GAA His Glu 230

CTC Leu

TTG AAT Leu Asn

GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC

833

Gly 235

Thr Arg Gly

Leu

Phe Pro 240

Gly

Pro Ser Arg 245

AGG

ACC

CTA

GGA

GCC

CCG

GAC

ATT

TCC

TCA

GGA

ACA

TCA

GAC

ACA

GGC

881

Arg

Thr

Leu

Gly

Ala

Pro

Asp

Xle

Ser

Ser

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr

Gly

250

255

260

TCC

CTG

CCA

CCC

AAC

CTC

CAG

CCT

GGA

TAT

TCT

CCT

TCC

CCA

ACC

CAT

929

Ser

Leu

Pro

Pro

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro

Thr

His

265

270

275

CCT

CCT

ACT

GGA

CAG

TAT

ACG

CTC

TTC

CCT

CTT

CCA

CCC

ACC

TTG

CCC

977

Pro

Pro

Thr

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro

Thr

Leu

Pro

280

285

290

ACC

CCT

GTG

GTC

CAG

CTC

CAC

CCC

CTG

CTT

CCT

GAC

CCT

TCT

GCT

CCA

1025

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Leu

His

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

295

300

305

ACG

CCC

ACC

CCT

ACC

AGC

CCT

CTT

CTA

AAC

ACA

TCC

TAC

ACC

CAC

TCC

1073

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

Ser

Tyr

Thr

His

Ser

310

315

320

325

CAG

AAT

CTG

TCT

CAG

GAA

GGG

TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA

1124

Gin

Asn

Leu

Ser

Gin

Glu

Gly

330

TTGTCTCGTG

TACAGCTCCC

TTCCCTGCAG

GGCGCCCCTG

GGAGACAACT

GGACAAGATT

1184

TCCTACTTTC

TCCTGAAACC

CAAAGCCCTG

GTAAAAGGGA

TACACAGGAC

TGAAAAGGGA

1244

ATCATTTTTC

ACTGTACATT

ATAAACCTTC

TTTTTAAGCT

ATCAGCAATA

1304

CTCATCAGAG

CAGCTAGCTC

TTTGGTCTAT

AGAAGCTATT

1342 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 332 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:25:

Ser

Pro

Ala

Pro

Pro

Ala

Cys Asp

Leu

Arg

Val

Leu

Ser

Lys

Leu

Leu

1

5

10

15

Arg

Asp

Ser

His

Val

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

20

25

30

His

Pro

Leu

Pro

Thr

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

35

40

45

-49CZ 288890 B6

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

Met 55

G1U

Glu

Thr

Lys

Ala 60

Gin

Asp Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr

Leu

Leu 70

Leu

G1U

Gly

Val

Met 75

Ala

Ala

Arg Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly Arg

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Val

Arg 140

Phe

Leu

Met

Leu

Val 145

Gly Gly

Ser

Thr

Leu 150

Cys

Val

Arg

Arg

Ala 155

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala 160

Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn

165

170

175

Arg

Thr

Ser

Gly 180

Leu

Leu

Glu

Thr

Asn 185

Phe

Thr

Ala

Ser

Ala 190

Arg

Thr

Thr

Gly

Ser 195

Gly

Leu

Leu

Lys

Trp 200

Gin

Gin

Gly

Phe

Arg 205

Ala

Lys

Ile

Pro

Gly 210

Leu

Leu

Asn

Gin

Thr 215

Ser

Arg

Ser

Leu

Asp 220

Gin

Ile

Pro

Gly

Tyr 225

Leu

Asn

Arg

Ile

His 230

Glu

Leu

Leu

Asn

Gly 235

Thr

Arg Gly

Leu

Phe 240

Pro

Gly

Pro

Ser

Arg Arg 245

Thr

Leu

Gly

Ala 250

Pro

Asp

Ile

Ser

Ser 255

Gly

Thr

Ser

Asp

Thr 260

Gly

Ser

Leu

Pro

Pro 265

Asn

Leu

Gin

Pro

Gly 270

Tyr

Ser

Pro

Ser

Pro 275

Thr

His

Pro

Pro

Thr 280

Gly

Gin

Tyr

Thr

Leu 285

Phe

Pro

Leu

Pro

Pro 290

Thr

Leu

Pro

Thr

Pro 295

Val

Val

Gin

Leu

His 300

Pro

Leu

Leu

Pro

Asp

Pro

Ser

Ala

Pro

Thr

Pro

Thr

Pro

Thr

Ser

Pro

Leu

Leu

Asn

Thr

305 310 315 320

Sec Tyr Thr His Ser Gin Asn Leu Ser

325

Gin Glu Gly

330

-50CZ 288890 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1342 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTIKA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 99..621 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:26:

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG60

TGGTCATGCT TCTCCTAACT GCAAGGCTAA CGCTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT113

Ser Pro Ala Pro Pro

GCT Ala

TGT GAC

CTC CGA Leu Arg 10

GTC Val

CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC

161

Cys

Asp

Leu

Ser

Lys

Leu Leu 15

Arg Asp

Ser His Val 20

CTT

CAC

AGC

AGA

CTG

AGC

CAG

TGC

CCA

GAG

GTT

CAC

CCT

TTG

CCT

ACA

209

Leu

His

Ser

Arg

Leu

Ser

Gin

Cys

Pro

Glu

Val

His

Pro

Leu

Pro

Thr

25

30

35

CCT

GTC

CTG

CTG

CCT

GCT

GTG

GAC

TTT

AGC

TTG

GGA

GAA

TGG

AAA ACC

257

Pro

Val

Leu

Leu

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu

Trp Lys

Thr

40

45

50

CAG

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT

305

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly Ala

Val

Thr

Leu

55

60

65

CTG

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC

353

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

70

75

80

85

CTC

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT

401

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

90

95

100

GGG

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG

449

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin

Gly Arg

105

110

115

ACC

ACA

GCT

CAC AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA CAC

497

Thr

Thr

Ala

His Lys Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser

Phe

Gin His

120

125

130

-51CZ 288890 B6

TG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC545

Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr

135 140145

CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC593

Leu Cya Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser ArgThr

150 155 160165

TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG641

Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu

170

TTGGAGACAA ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG701

CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA761

ATCCCCGGAT ACCTGAACAG GATACACGAA CTCTTGAATG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT821

GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC881

TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TCCTACTGGA941

CAGTATACGC TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTGCCCACCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC1001

CTGCTTCCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC1061

TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTAAGGTT CTCAGACACT GCCGACATCA1121

GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCGCCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG1181

ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC CTGGTAAAAG GGATACACAG GACTGAAAAG1241

GGAATCATTT TTCACTGTAC ATTATAAACC TTCAGAAGCT ATTTTTTTAA GCTATCAGCA1301

ATACTCATCA GAGCAGCTAG CTCTTTGGTC TATTTTCTGC A1342 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 174 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:27:

Sex Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu 15 1015

Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro Glu Val 20 2530

His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu 35 40<5

-52CZ 288890 B6

Gly

Glu

Trp

Lys

Thr

Gin

Met

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala

Gin

ASp

Ile

Leu

50

55

60

Gly

Ala

Val

Thr

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

Val

Met

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin

65

70

75

80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly

Gin

85

90

95

Val

Arg

Leu

Leu

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr

Gin

Leu

100

105

110

Pro

Pxo

Gin

Gly Arg

Thr

Thr

Ala

His

Lys

Asp

Pro

Asn

Ala

Ile

Phe

115

120

125

Leu

Ser

Phe

Gin

His

Leu

Leu

Arg

Gly

Lys

Val

Arg

Phe

Leu

Met

Leu

130

135

140

Val

Gly

Gly

Ser

Thr

Leu

Cys

Val

Arg

Arg

Ala

Pro

Pro

Thr

Thr

Ala

145

150

155

160

Val

Pro

Ser

Arg

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Thr

Leu

Asn

Glu

Leu

165

170

(2) INFORMACE O SEQ ID NO:28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1164 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) CHARAKTERISTIKA:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 97..894 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:28:

AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC ASAATGGAGC TGACTGAATT GCTCCTCGTG(0

GTCATGCTTC TCCTAACTGC AAGGCTAACG CTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT114

Sec Pro Ala Pro Pro Ala

TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT1(2

Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Sex His ValLeu

1520

CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT210

His Ser Arg Leu Sex Gin Cys Pro Glu Val His Pxo Leu Pro ThrPro

3035

-53CZ 288890 B6

GTC CTG CTG

CCT Pro

GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG

25B

Val Leu 40

Leu

Ala Val Asp Phe Ser 45

Leu

Gly Glu 50

Trp

Lys

Thr Gin

ATG

GAG

GAG

ACC

AAG

GCA

CAG

GAC

ATT

CTG

GGA

GCA

GTG

ACC

CTT CTG

306

Met 55

Glu

Glu

Thr

Lys

Ala 80

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

Val

Thr

Leu Leu 70

CTG

GAG

GGA

GTG

ATG

GCA

GCA

CGG

GGA

CAA

CTG

GGA

CCC

ACT

TGC CTC

354

Leu

Glu

Gly

Val

Met 75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys Leu 85

TCA

TCC

CTC

CTG

GGG

CAG

CTT

TCT

GGA

CAG

GTC

CGT

CTC

CTC

CTT GGG

402

Ser

Ser

Leu

Leu 90

Gly

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

val

Arg

Leu

Leu 100

Leu Gly

GCC

CTG

CAG

AGC

CTC

CTT

GGA

ACC

CAG

CTT

CCT

CCA

CAG

GGC

AGG ACC

450

Ala

Leu

Gin 105

Ser

Leu

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly

Arg Thr

ACA

GCT

CAC

AAG

GAT

CCC

AAT

GCC

ATC

TTC

CTG

AGC

TTC

CAA

CAC CTG

498

Thr

Ala 120

His

Lys

Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His Leu

CTC

CGA

GGA

AAG

GAC

TTC

TGG

ATT

GTT

GGA

GAC

AAA

CTT

CAC

TGC CTC

546

Leu 135

Arg

Gly

Lys

Asp

Phe 140

Trp

Ile

Val

Gly

Asp 145

Lys

Leu

His

Cys Leu 150

AGC

CAG

AAC

TAC

TGG

CTC

TGG

GCT

TCT

GAA

GTG

GCA

GCA

GGG

ATT CAG

594

Ser

Gin

Asn

Tyr

Trp 155

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu 160

Val

Ala

Ala

Gly

Ile Gin 165

AGC

CAA

GAT

TCC

TGG

TCT

GCT

GAA

CCA

AAC

CTC

CAG

GTC

CCT

GGA CCA

642

Ser

Gin

Asp

Ser 170

Trp

Ser

Ala

Glu

Pro 175

Asn

Leu

Gin

Val

Pro 180

Gly Pro

AAT

CCC

CGG

ATA CCT

GAA

CAG

GAT

ACA

CGA ACT

CTT

GAA

TGG

AAC TCG

690

Asn

Pro

Arg 185

Ile

Pro

Glu

Gin

Asp 190

Thr

Arg

Thr

Leu

Glu 195

Trp

Asn Ser

TGG

ACT

CTT

TCC

TGG ACC

CTC

ACG

CAG

GAC

CCT

AGG

AGC

CCC

GGA CAT

738

Trp

Thr 200

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu 205

Thr

Gin

Asp

Pro

Arg 210

Ser

Pro

Gly His

TTC

CTC

AGG

AAC

ATC

AGA

CAC

AGG

CTC

CCT

GCC

ACC

CAA

CCT

CCA GCC

786

Phe 215

Leu

Arg

Asn

Ile

Arg 220

His

Arg

Leu

Pro

Ala 225

Thr

Gin

Pro

Pro Ala 230

TGG

ATA

TTC

TCC

TTC

CCC AAC

CCA

TCC

TCC

TAC

TGG

ACA

GTA

TAC GCT

834

Trp

Ile

Phe

Ser

Phe 235

Pro

Asn

Pro

Ser

Ser 240

Tyr Trp

Thr

Val

Tyr Ala 245

CTT

CCC

TCT

TCC ACC

CAC

CTT

GCC

CAC

CCC

TGT GGT

CCA

GCT

CCA CCC

882

Leu

Pro

Ser

Ser Thr

His

Leu

Ala

His

Pro

Cys Gly

Pro Ala

Pro Pro

250 255 260

-54CZ 288890 B6

CCT GCT TCC TGACCCTTCT GCTCCAACGC CCACCCCTAC CAGCCCTCTT931

Pro Ala Ser

265

CTAAACACAT CCTACACCCA CTCCCAGAAT CTGTCTCAGG AAGGGTAAGG TTCTCAGACA991

CTGCCGACAT CAGCATTGTC TCGTGTACAG CTCCCTTCCC TGCAGGGCGC CCCTGGGAGA1051

CAACTGGACA AGATTTCCTA CTTTCTCCTG AAACCCAAAG CCCTGGTAAA AGGGATACAC1111

AGGACTGAAA AGGGAATCAT TTTTCACTGT ACATTATAAA CCTTCAGAAG CTA1164 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:29:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 265 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:29:

Ser 1

Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu

5

10

15

Arg

Asp

Ser

His 20

Val

Leu

His

Ser

Arg 25

Leu Ser

Gin

Cys

Pro 30

Glu

Val

His

Pro

Leu 35

Pro

Thr

Pro

Val

Leu 40

Leu

Pro Ala

Val

Asp 45

Phe

Ser

Leu

Gly

Glu 50

Trp

Lys

Thr

Gin

Met 55

Glu

Glu

Thr Lys

Ala 60

Gin

Asp

Ile

Leu

Gly 65

Ala

val

Thr

Leu

Leu 70

Leu

Glu

Gly

Val Met 75

Ala

Ala

Arg

Gly

Gin 80

Leu

Gly

Pro

Thr

Cys 85

Leu

Ser

Ser

Leu

Leu Gly 90

Gin

Leu

Ser

Gly 95

Gin

Val

Arg

Leu

Leu 100

Leu

Gly

Ala

Leu

Gin 105

Ser Leu

Leu

Gly

Thr 110

Gin

Leu

Pro

Pro

Gin 115

Gly Arg

Thr

Thr

Ala 120

His

Lys Asp

Pro

Asn 125

Ala

Ile

Phe

Leu

Ser 130

Phe

Gin

His

Leu

Leu 135

Arg

Gly

Lys Asp

Phe 140

Trp

Xle

Val

Gly

Asp Lys 145

Leu

His

Cys

Leu 150

Ser

Gin

Asn

Tyr Trp 155

Leu

Trp

Ala

Ser

Glu 160

Val Ala

Ala

Gly

Zle

Gin

Ser

Gin

Asp

Ser Trp

Ser

Ala

Glu

Pro Asn

165 170 175

-55CZ 288890 B6

Leu

Gin

Val

Pro 180

Gly

Pro

Asn

Pro

185

Ile

Pro

Glu

Gin

Asp 190

Thr

Arg

Thr

Leu

Glu 195

Trp

Asn

Ser

Trp

Thr 200

Leu

Ser

Trp

Thr

Leu 205

Thr

Gin

Asp

Pro

Arg 210

Ser

Pro

Gly

His

Phe 215

Leu

Arg

Asn

Ile

Arg 220

His

Arg

Leu

Pro

Ala 225

Thr

Gin

Pro

Pro

Ala 230

Trp

Zle

Phe

Ser

Phe 235

Pro

Asn

Pro

Ser

Ser 240

Tyr

Trp

Thr

Val

Tyr 245

Ala

Leu

Pro

Ser

Ser 250

Thr

His

Leu

Ala

His 255

Pro

Cys

Gly

Pro

Ala 260

Pro

Pro

Pro

Ala

Ser 265

(2) INFORMACE O SEQ ID ΝΘ:30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:30:

GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG 24 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:31:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 24 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:31:

CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24

-56CZ 288890 B6 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 80 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:32:

CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT 60

TGTGAGCGCT CACAATTTAT 80 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 86 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:33:

CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA 60

TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT 8⁶ (2) INFORMACE O SEQ ID NO:34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 89 bázových párů (B) TYP: nukleová kyselina (C) ŘETĚZCOVOST: jeden řetězec (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:34:

GACGTCTCAT ΑΑΤΓΓΤΤΆΑΑ AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATIAATATTC 60

TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT 89

Claims (15)

1. MGDF polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci látky zvolené ze souboru zahrnujícího

MGDF-2, aminokyseliny 22 až 195 z obr. 11,

MGDF-4, aminokyseliny 22 až 172 z obr. 11,

MGDF-5, aminokyseliny 22 až 177 z obr. 11,

MGDF-6, aminokyseliny 22 až 191 z obr. 11,

MGDF-7, aminokyseliny 22 až 198 z obr. 11 a

MGDF-8, aminokyseliny 22 až 265 z obr. 11.

2. Izolovaný polynukleotid kódující MGDF polypeptid podle nároku 1.

3. Izolovaný polynukleotid podle nároku 2, kterým je sekvence DNA.

4. Sekvence DNA podle nároku 3, kterou je sekvence cDNA.

5. Sekvence cDNA podle nároku 4 vykazující odpovídající sekvenci, jak je znázorněna na obr. 11.

6. DNA vektor obsahující DNA sekvenci podle nároku 4.

7. Vektor podle nároku 6, v němž je sekvence DNA operativně připojena k sekvenci DNA řídící expresi.

8. Hostitelská buňka stabilně transformovaný nebo transfekovaná sekvencí DNA podle nároku 4.

9. Hostitelská buňka podle nároku 8 exprimující MGDF polypeptid kódovaný sekvencí DNA podle nároku 3 až 5.

10. Způsob produkce MGDF polypeptidu podle nároku 1, vyznačující se tím, že se hostitelská buňka podle nároku 9 pěstuje ve vhodném živném médiu a z buněk nebo z živného média se izoluje MGDF polypeptid.

11. Způsob produkce MGDF polypeptidu podle nároku 10, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je buňka E. coli.

12. Způsob produkce MGDF polypeptidu podle nároku 10, vyznačující se tím, že hostitelskou buňkou je buňka CHO.

13. Protilátka reaktivní vůči MGDF polypeptidu podle nároku 1.

14. Monoklonální protilátka podle nároku 13.

15. Rekombinantní protilátka podle nároku 13.