TW565568B - Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation - Google Patents

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Timothy D Bartley
Jakob M Bogenberger
Robert A Bosselman
Pamela Hunt
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i'發明説明（） 發明領娀 本發明係有關新穎蛋白質，於本文中同義地稱為M P 1 體或M G D F s ，其可剌激巨核细胞的生長並增加巨核細胞的 分化或成熟，最終效應為增加血小板的數目。此外，也_ 出從天然來源取得均質形式的蛋白質與經由重组遺傳工程 技術製備彼等之方法。 於另一部份中，本發明概括地有關新_的MGDF衍生物類 別，其中該MGDF分子係接著到水溶性聚合物者，及製備彼 等分子的方法。於又另一部份中，本發明係有關M G D F衍生 物，其中M G D F分子係接到一或多種聚乙二醇（” p e Q ”）者， 及其製餚方法。 發明背暑 本發明包含至少兩種廣闊的研究領域。第一種係有關巨 核細胞的發育及其隨後產生血小板，而第二種係有關生長 因子受體族的多狀成員，本文稱之為Μ p丨受p者，及其配 fi。下文即分別概述這些研究領域。 A .從巨核細朐產牛rfn小析 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 血小板為循環细胞，其對於流血的遏止和血液凝结具有 重要性。巨核細胞為血小板的細胞源且係源自共同的骨髓 前體綑胞一其可衍生成所有的造血細狍糸。該共同的前體 细胞稱為多種作用性幹細胞或PPSC。 巨核·細胞前身细胞的層糸（糸K在活體外（& vitro)對 應S 適當生長因子的培養糸统中所出現的巨核细胞（Μ K ) 群落之出現時間和尺寸為基礎的。釋故形成單位巨核細胞 (B F U - Μ Κ )為最原始的巨核细胞前身細胞：Β卩υ _ Μ κ被認為 -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） --- 565568 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 到最後會產生眾多群落形成性單位巨 其為更分化的Μ!(前身细胞。 隨著Μ Κ细胞進行後績的分化，其即 能力但取得核內再複製的能力。核内 分裂）為在沒有細胞分裂時，細胞内 核內再複製到最後會導致成為多倍體 熟化促成構成血小板特徵的细胞質小 取得。 血小板係經由未確定清楚的程序從 序經推測為Μ I(物理裂殖，或其他機制 大量膜搆造的觀察導致血小板形成模 统在细胞體内概括出新生悲血小板c 型係由下述觀察發展出者，亦即，巨 血小板尺寸間段的長細胞質突起，由 因骨II及/或肺内的血流壓力而分離 起即為B e c k e r和D e B r u y η所稱的前血 的在血小板形成中的前體角色。參看 DeBruyn, Anier. J. Anat. 145*183 圖1表出巨核細胞和血小板發展的 。圖中最左邊的细胞為P P S C，而圖中 胞為B F U - Μ K，接著為C F U - Μ K。圖中緊 核內再複製的細胞為成熟的巨核細胞 的结果，該細胞已變成多倍體。緊接 從成熟巨核细胞的多倍體核發出的長 最右邊為细胞質突起涇裂殖所產生的 核細胞（C F U - Μ Κ )， 失去進行有絲分裂的 再複製（或核内有絲 發生核分裂之現象。 的Μ Κ。進一步的Μ Κ成 器官和膜等組成物之 成熟Μ Κ產生的 之结果。巨核 型，其中一界 另一種血小板 核细胞會形成 該突起，血小 出來。這些细 小板Μ反映其 Becker and (1976)。 各種前體细胞 在P P S C右邊的 接在P P S C右邊 。由於核內有 其右邊的構造 細胞質突起。 許多血小板。 ，該程 細胞内 線膜系 形成模 限制在 板可能 咆質突 所假設 之總覽 其他細 正進行 絲分裂 體包含 於圖中 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 ¥ 頁 裝 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 下列有關上面對於巨核㈣胞成熟和血小板產生的說明之 某些先前文獻摘列： 1· · Williams, N. and Levine, R.F., British Journal of Haematology 52:.. 173-180 (1982). 2· Levin' J. t Molecular Biology and Differentiation of Megakaryocytes, pub. Wiley-Liss, Inc.: i-10 (1990). 3. Gewirtz, A.M., The Biology of Hematopoiesis, pub.. Wiley-Liss, Inc.: 123-132 (1990)· 4. Han, Z.C., et al., Int. J. Hematol. 54: 3-14 /1991). ’ r 5. Nieuwenhuis, H.K. and 5ixr：a, J., New Eng. J· of Med. 327: 1312-1813 (1992). 6. Long, M., Stem Cells 11: 33-40 (1993). 的 成 形 0 \ *皿 實 多 許 所 室 茔2 受 係 生 產 的 板 \ 血 示 顯 據 ，數 量 大 的 _|生 IL產 請 先 閲 讀 背 δ 之 注 意 事 項 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製 而 * % 解 了 「」 未力 尚能 先種 原這 性有 雜具 複都 的子 序因 程長 物生 生類 人 這多 。 許 節有 調示 所 顯 子 1刖 因目 液在 (生 素產 介的 識板 姐小 多血 許進 有增 ο 而 次池 層胞 胞细 細身 重前 多大 在擴 生由 發經 節可 -δ -)/ 胞 S 細ne 核ki 巨to 促生 K 的 胞立 细濁 的種 化兩 分有 為乎 更似 在， 用外 作此 為。 用子 係因程 子化些 因熟這 長成節 生之調 液製來 體複路 俎再迴 二内饋 第核回 :.進物 序 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7 經濟部智慧財產局M工消費合作社印製 五、發明説明（）. 有幾種譜糸的非特定性造血生長因子對MK成熟化施加重 要的影響。粒性细胞-巨噬細胞群落剌激因子（G Μ - C S F ) ，間白素-3 ( I L - 3 ) ，IL - 6，I L - 11 ，白血病抑制因子（ LIF ')，和促紅血球生長素（ΕΡΟ)等分別1別地依其對 Μ!(尺寸，數目或倍數性等之影響而在活體外顯示促進人類 Μ1(成熟化。L I F ，I L - 6，和I L - 1 1等的Μ Κ成熟化效應相對 於I L - 3有部份加成性者（L I F和I L - 6 )或完全加成性者（. I L - Π )。從這些先前文獻所得這類數據可推測在活體内 (i η ν i ν 〇 )可能需要組織介素組合以促進Μ Κ成熟化。 下列所列為一些關於巨核細胞調節和血小板產生的先前 文獻之摘述： 4 r 7. Hoffman, R. et al./ Blood Cells 13: 75-86 (1987). 8· Murphy, M.J., Hematology/Oncology Clinics of North ： America 3 (3) : 4 65-478 (1988). 4’. Hoffman, R· , Wood 7 4 (4) : 1196-1212 (1989) · / 10. Mazur, Ξ.Μ. and Cohen, J.L.,. Clin. Pharmacol. Ther.； 46 (3): 250-256 (1989). i 11. Gewirtz, A.M. and Calabretta, B., Int· J· Cell Cloning 8: 267-276 (1990). 12· Williams, N., Progress in Growth 厂ac亡or Research 2: 81-95 (1990). (請先閲讀背面之注意事項再 .裝- 頁) 訂 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 Α7 Β7 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 13· Gordon, M.S. and Hoffman, R., Blood 80 (2): 302-307 (1992) . 14. Hunt, P. et al., Exp. Hematol. 21: 372-281 (1993). 15· Hunt, P. et ai., Exp. Hematol. 21: 1295-1304 (1993) . 此外，也有報導（參看參考資料1 6 )提及在人類再生不 能性血清中含有異於I L - 3，粒性细胞群落刺激因子，和經 淋巴細胞調理過的培養基中所含因子等之巨核細胞群落刺 激活性。不過，促成該活性的分子並未被分離出或在先前 技藝中被鑑定過。 16· Mazur, E.M·， et al·, Blood 76:290-297 .(1 9 9 0 )。 C · Μ p Γ ^ f · f 骨髓增生性白血病病毒（MPLV )為一種老鼠複製缺陷性 逆轉錄酶病毒，其會引起被感染哺乳動物發生急性白血病 。據發現MPLV所表現的基因中有一部份編碼著融合到與組 ' 纈介素受體族，包含G Μ - C S F，G - C S F ，和E P 0等的受體相 IT連的序列之病毒所具逆轉錄酶病毒被膜（或外蛋白質殼 / 上述MPLV基因的表現具有一有趣的生物學性質，亦即會 ; 引起各種類型的老鼠前身細胞立即取得對增生與終端成熟 化的生長因子無關性：再者，有些被MPLV急性轉形的骨髓 細胞培養物中含有巨核細胞，顯示Μ P L V基因與巨核细胞生 長/分化之間有某種關聯。 目前已被公認者，Μ P L V病毒基因（稱為ν - Μ ρ 1 )在哺乳 動物细胞中有一同系物，其被稱為细胞Μ ρ 1基因（或 (請先閱讀背面之注意事項再 -裝· 頁) 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
c-MpI )。使用v-Mpl-衍生探頭，可選殖出對應於人類 c - Μ·ρ 1基因的c D N A。參看P C T公開申請W 0 9 2 / 0 7 0 7 4 ( 1 9 9 2年4月3 0日公開；於下文討論之）：序列分析證明被 c - M p 1基因產物所編碼的蛋白質，就像同系的v - M p丨基因 產物一般，屬於高度保守性姐織介質受體超族（ superfami ly ) c 這種細胞基因，c - Μ p 1 ，基於經由R N A s e探頭保護和 R T - P C R等實驗發琨在正常小鼠的骨髓，脾和胎肝等之中有 其表現，但在其他姐織内則沒有表現之结果被認為其在造 血中扮有機能性角色。特別者，c - M p 1係在巨核細胞上進 行表現。此外也證實人類細胞基因，人類c-Mp 1 ，係在 C D 3 4陽性细胞，包括經純化的巨核細胞和血小板等之内進 行表現。（:D 3 4為顯示早期造血前身细胞的抗原。此外，將 CD34陽性細胞接觸對c-Mpl mRNA或訊息圼反義（ a n t ί - s e n s e )的寡去氧核苷酸時會明顯地抑制C F U - Μ K巨核 细胞前身的群落形成能力，但對於紅血球與粒巨噬細胞等 的前身則沒有影響。 由上述數據和觀察结果推斷c - Μ ρ 1編碼-細胞表面分子 ，在本文稱之為Μ Ρ 1受體，其结合到一配體而活化該受體 ，可能導致巨核細胞的產生及/或發育。 PCT專利公開W0 9 2 / 07 0 7 4係有關從來自人類和老鼠兩 種來源的c-Mp 1產生之蛋白質序列。該基因產物如上面解 釋過者被認為是一受體，其係由至少三個共同區或域所搆 成，一细胞外域，一透膜域，及一细胞内（或細胞質）域 ◊連接在一起時，這三域即搆成完整的Mp 1受體。該PCT 一 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 裝 訂 線 565568 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 c A7 ‘ - B7 五、發明説明（） 公報也提出一種可溶性的受體形式，其實質地對應於成熟 .c - Μ p丨蛋白質的细胞外域。其細胞內域含有一疏水性區， 其在經由透膜區連接到該蛋白質的細胞外域時，即促使整 個蛋白質團聚而不溶。相反地’當c - Μ ρ 1 .基因產物的細胞 外域與該透膜域和细胞内域分開時’其即變成可溶，因此 ，該蛋白質的細胞外形式被稱為該受體的”可溶”形式。 下列為某些與上述ν - Μ Ρ丨和c _ Μ Ρ 1受體與基因相關聯的 說明之先前文獻： 17· Wendling, F·, et al·, Leukemia 3 (7): 475-480 .(1989).' ； d ! 18 . Wendling, F., et al. , Blood 73 (5) : 1161 — ]/ΐ67 I (1989). 19· Souyri, M., et al., Cell 63: 1137-1147 (1S90) . t % 20. Vigon, I·, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U^A 89: 广 5640-5644 (1992). I 21. Skocla, R.C., et al., The ΕΜΞΟ Journal 12 (7)： 2645-2653 (1993). I . . 22· Ogawa, M·, Blood 81 (11): 2844-2853 (1993). 23· Methia, Nw et al., Blood 82 (5): 1395-1401 (1993). 24· Wendling, F, et al., Blood 80: 246a (1993). (請先閱讀背面之注意事項再填頁) -裝_ 訂 線 -10* 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 D ·自书夠刺澈血小板產生的篯劑之需要 最近有報導提及在北美，西歐 正Μ逐漸的速率實施血小板灌輸 and Hoffman, R,, Blood 80(2) 種增加大半是因醫學技術的進步 ，例如，心臟手術及骨髓，心， 強作為癌症患者和Η I V - 1流行性 小板供給的過量需求。 血小板的使用伴隨著許多血液 的傳遞可能性。此外，純化血小 因而這種血小板的增加使用會增 故，對於製備供人類用的血小板 著緊急需要。 增加血小板製餚的範例先前作 美國專利第5 , 0 3 2 , 3 9 6號報導 激血小板產生1:間白素-7也稱為 種促淋巴细胞生成性生長因子， Τ -細胞前身之生長。公開的P C Τ 1 9 8 8年1 0月1 9日申請）和1 9 8 8年 申請第8 8 3 0 9 9 7 7 . 2號都揭示經由 動物I L - 7的D N A ，載體，和相關 提出的數據顯示I L - 7可增加正常 之循環血小板： 美國專利第5，087 , 448號揭示 動物可刺激巨核綑胞和血小板的 和日本等境内的醫療中心 。參看 G 〇 r d ο n , M , S， :302-307 (1992)。這 及下述技術的更大幅增加 和肝等的移植等。劑量加 的输送治療手段也肋長血 性感染病及同種異體免疫 板的製備為昂貴的努力， 高整體醫療費用。因此之 之新穎旦改良的方法存在 法分述如下： 間白素-7 ( I L - 7 )能夠刺 淋巴细朐生成素-丨且為一 能夠刺激骨髓内的B -和 申請序號8 8 / 0 3 7 4 7 ( 1 0月2 4日申請的歐洲專利 重組D N A ’ s技術製備哺乳 的方法。於該美國專利中 和半致死地照射過的小鼠 經由用間白素-6處治哺乳 增生。重組人類間白素為 11 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 請 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項
頁 訂 線 565568 經濟部智態財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 一種具有多重生物活性的2 6 , 0 0 0分子量_蛋白。該專利中 提出的數據顯示IL-6具有在活體外增加巨核細胞群落的效 應0 上述專利沒有提及任何有關本發明所提的Mp 1配體。 雖然有上述諸揭示，對於哺乳動物體内的巨核細胞及/ 或血小板之新剌激劑仍有強烈需求存在。 E ·有關彳h黑改g M G D F的背# 由於重組DNA技術的進展結果使得目前治療用蛋白質可 取得適當形式且充分的供應量。這些種蛋白質的化學衍生 物可Κ有效地阻斷蛋白水解酵素以免與蛋白質主鏈本身行 物理接觸，因而防止降解。其他的優點包括，在某些情況 下，增加治療性蛋白質的安定性和循環時間及減低抗原性 。不過，必須提及者特殊蛋白質的改質效應是無法預測的 。有一篇說明蛋白質改質和融合蛋白質的評論文章為 Francis, "Focus on Growth Factors，? 3:4-10 (May 1992) (為 Mediscript, Mountview Court, Friern B a r n e t L a n e , L ο n d ο η N 2 0 , 0 L D , U K 所出版）。 聚乙二醇（” P E G ”或” p e g ”）為已用於治療性蛋白質產物 的製備之一種這類化學品。例如，Adagen^，一種g聚乙 二醇化的腺苷脫胺酶方則即經許可用以治療嚴重的併S性 免疫缺乏疾病；聚乙二醇化的超氧物歧化_已在臨床實作 中用K治療頭部創傷；聚乙二醇化cx -甘擾素已被試用於 第I期肝炎臨床治療中；聚乙二醇化的葡楗腦脊脂酶和聚 乙醇化的血紅素都已報導處於臨床前試驗中。對於某些蛋 白質，接著聚乙二醇後經證明可對抗蛋白水解作用， -12 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再頁) -裝· 訂 線 565568 A7 B7 五、發明説明（ S a d a , e t a 1 . , J . Fermentation Bioengineering 71 ·· 1 3 7 - 1 3 9 ( 1 9 9 1)，且已有接著某些聚乙二醇部汾體之方法 可用。參看美國專利第4 , 1 7 9 , 3 3 7號，D a v i s e t a丨.， on-Immunogenic Polypeptides” ， （1979 年 12 月 18 日核 發）；和美國專利第 4，0 0 2，5 3 1 號，R o y e r , ” Μ o di f y i n g
Enzymes with Polyethylene Glycol and Product P r o d u c e d T h e r e b y ”，（ 1 9 7 7 年，1 月 1 1 日核發）。有關的 評論可看看 Abuchowski et al·,於”Enzymes as Drugs”中 (J . S . Holcerberg and J . Roberts, e d s . p p . 3 6 7 - 3 8 3 Π 9 8 1))。 別的水溶性聚合物也已被用來改質蛋白質，例如，乙二 醇/丙二醇共聚物，羧甲基纖維素，葡聚糖，聚乙烯醇， 聚乙烯基吡咯烷嗣，聚-1 , 3 -二噁茂烷，聚-1，3，6 氧 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 頁 裝 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 陸圍1，乙烯 或無規共聚 Μ聚乙二 接著到蛋白 二醇連接到 即為方便供 利第4 , 0 0 2 , 子接著到酵 5 3 9 1 6 7,，， Thereof”中 有機聚合物 2月2 7日核 /順丁烯二酸酐 物）等。 醇而言，已有多 質上。通常係經 蛋白質。胺基， 這種接著所用者 5 31號）提及使 素。1 9 9 3年4月 Peg Imidates 提及用P E G的臨 改質具有自由胺 發給S h a v的美國 共聚物，及聚胺基酸（均聚物 種手段被用來將聚乙二醇分子 由蛋白質上的反應性基將聚乙 和離胺酸殘基上或N -端上者， ϋ例如，R 〇 y e r (上列美國專 用還原性烷基化將聚乙二醇分 2 8日公開的W r U h t , E P 0 and Protein Derivates 亞胺酯衍生物或相關的水溶性 基的肽和有機化合物。1 9 9 0年 專利第4 , 9 0 4 , 5 8 4號係有關用 13 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ Μ經由反應性胺基接著聚乙二醇分 離胺酸殘基予以改質之方法。 一種經化學改質過的特殊治療性 刺激因子，”G-CSF” 。參看歐洲專 ΕΡ 0 473 268，和 ΕΡ 0 335 423等 另一例子為聚乙二醇化的IL-6 , 稱為”改質h I L - 6 ” （參看共同申請 0 7 / 6 3 2 , 0 7 0 )，其揭示加到I L - 6中 9月1 1日公開的E P 0 1 5 4 3 1 6提及 醇醛反應。 改質M G D F的能力在技藝中係未知 蛋白質對改質的感受性係決定於該 之故。再者，這種改質對各蛋白質 從技藝上是不可預測者。如本文所 臨床應用，因此需要有改變性質的 子可能具有在活體内增加的半生期 質等。 蛋白質分子經聚乙二醇化後通常 分子混合物：舉例而言，旯有5個 一個自由胺基U上述諸方法反應後 苎具有6個聚乙二醇部份體，有些 有些2個，有些1個而有些則無。 子中，其聚乙二醇部份體可能在不 的位置。常需要的是得到均質產物 種或少數種（如2 - 3 )改質蛋白質 子而將蛋白質所含許多 蛋白質為粒性细胞群落 利公報 Ε Ρ 0 4 0 1 3 8 4 , 0 ΕΡ 0 442 724 ，發明名 中的 U . S . S . Ν . 聚乙二醇分子：，1 9 8 5年 用淋巴細胞活與聚乙二 者’其原因在於各個別 蛋白質的特定搆造參數 所具生物學性質的影響 述者，由於MGDF的許多 衍化M G D F產物·。彼等分 及/或活性，及其❾性 會導穴化學改質蛋白質 離胺酸殘基和在^端的 可導致異質混合物，有 具有5個，有些3個， 此外，於具有幾個的分 同分子上不接著到相同 ，其中含有全部只有一 物種，其在化學物種， 14 565568 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 如PEG的數目及/或位置等有變異。話雖如此，對於某一 治療徵示而言，如單一，二一及或三一聚乙二醇化物種的 混合物可能為適當者或可容忍者。 每批潖合物的變異性在開發治療性聚乙二醇化蛋白質產 物時可能為不利者。於這種開發中，生钧活性的可預測性 是重要因素。例如，業經證明者，有超氧物歧化_與聚乙 二醇的非選擇性结合之情況中，有幾個部份的改質酶素係 完全無活性者（P. McGoff et al.， Chem. Pharm. Bull. 36：3079-3091 (1988))。亦參看，R o s e e t al·， Bioconjugate Chemistry 2:154-159 (1991)，其中 報導聯结劑基羰釀肼對蛋白質基質（胰島素）C-端羧基的 選擇性連接。若治療性蛋白質的組成每批不同時，就不能 具有這種預測性。有些聚乙二醇部份體在某些位置上可能 不像在其他位置结合得一樣安定，而這種情形可能導致妓 等部汾體從蛋白質上解離出來。當然，若這種部份體係無 規地接著且可能因而無規地解離時，則該治療性蛋白質的 藥物動力·學就不能正確地預測。 另外高度需要者為衍化MG D F產物中在聚合物部份體與 MGDF部份體之間沒有聯结部份體者。上文所述方法的一項 問題在於其典型地需要在蛋白質與聚乙二§?分子之間有一 聯结部份體。這些聯结部份體可能具抗原性，這點在開發 治療性蛋白質時也是不利者。 --種不含聯结基的方法載於F r a n c ί s e t a 1 ., ’.Stability of Protein Pharmaceuticals · in vivo pathways of degradation and strategies for (請先閱讀背面之注意事項再 -裝- 頁) 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ protein stabilization” （Eds· Ahern·， T· and
Manning, M.C. ) Plenum，New York， 1991)之中此外 ，在 Fisher et al·,編輯的”Separations Using Aqueous Phase Systems, Applications In Cell Biology and Biotechnology, Plenum Press, N . Y., Ν·Υ· 1989 pp· 211-213 中，Delgado et al.的 "Coupling of PEG to Protein By Activation with Tresyl Chloride, Applications In Immunoaffinity Cell Pr. eparation” 一文中提及使用 tresyl chloride ’ 其可導致聚乙二醇部份體與蛋白質部份體之間沒有聯结基 。由於t r e s y 1 c h 1 〇 r i d e的使用可能產生毒性副產物，因 此該方法可能難以用來製成治療性產物。
Chamov et al., Bioconjugate Chem . 5*133-140 (1 9 9 4 )報導到用一甲氧基一聚乙二醇（” M e P E G二醇）醛經由 這原性综基化改質C D 4免疫吸附素（C D 4 i m m u η o a d h e s i η )。作者提及有5 0 %的C D 4 - I g經由在卜端的a -胺基之選 擇性反應而被me PEG-改質（上引資料，第137頁）。此外 ，該作者也提及該改質C D 4 - I g (對蛋白質g p 1 2 0 )的活體 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項
訂 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 與Μ 會 力 tb 合 结 外 上 同 »ί\' 低 減 率 速 的 聯 相 度 程 化 特對 更著 ， 在 且存 , 也 求 ’ 需外 種此 1 ο 著求 在需 存所 物有 生DF £MG DF化 MG醇 於二 對乙 , 聚 述對 所’ 上之 綜丄一一 口 定
求 需 之 法 方 的 化 衍 CWE 種 這 行 進 "、、 S 沭 槪 明 發 巨 進 促 地 定 特 可 其 肽 多 CUE 種1 出 提 明 發 本 中 份 立口
Ns C /—\ 準 標 國 國 中 用一適 尺 紙 I本 格 6 11 讀 565568 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ ) 1 1 1 核 细 胞 生 長 及 / 或 發 育 ( ” Μ Pi 配 體 ” 或 ” M G D F s - > 且 其 1 1 1 實 質 地 不 含 ( 亦 即 分 離 出 者 ) 其 他 蛋 白 誓 ( 如 > 得 g 請 1 先 1 哺 乳 動 物 來 源 的 Μ ρ 1 配 體 之 情 況 中 > 哺 乳 動 物 蛋 白 質 ) 0 閱 讀 1 I 洹 種 蛋 白 質 可 從 經 由 天 妖 J\W 地 或 用 其 他 因 子 誘 導 下 產 生 因 子 背 面 1 I 之 1 的 細 胞 來 源 純 化 出 〇 其 亦 可 用 重 組 遺 傳 工 程 技 術 產 生 0 注 意 1 I Mp 1 配 體 更 可 經 由 化 學 技 術 或 上 述 技 術 的 組 合 合 成 而 得 項 1 | 1 1 0 b 1 裝 本 發 明 Mp 1 配 體 可 從 哺 乳 動 物 源 Μ 其 固 有 形 式 製 得 0 本 頁 1 發 明 實 施 例 節 段 中 述 及 從 犬 的 再 生 不 能 性 血 漿 中 分 離 出 m 1 I 例 Μ ρ 1 配 體 〇 不 過 在 本 發 明 其 他 實 施 例 中 也 證 明 從 人 類 1 1 和 豬 等 兩 來 源 的 再 生 不 能 性 血 漿 中 也 存 在 著 密 切 相 關 的 1 I Mp 1 配 體 〇 值 得 注 意 者 $ 人 1 豬 和 狗 等 的 Mp 1 配 體 的 個 別 1 訂 活 性 都 被 老 鼠 Mp 1 受 體 的 可 溶 形 式 所 特 定 地 抑 制 9 顯 示 1 I 所 有 垣 些 Μ ρ 1 配 體 ( 及 來 白 其 他 哺 乳 動 物 包 括 老 鼠 等 來 1 源 者 ) 在 構 造 和 活 性 水 平 上 都 密 切 相 關 著 0 1 1 人 > 豬 和 其 他 哺 乳 動 物 Mp 1 配 體 預 料 都 可 從 天 然 來 源 經 1 線 由 本 文 詳 述 之 程 序 分 離 而 得 0 參 看 實 5δ 例 10 ◦ 綜 上 所 述 1 • 1 本 發 明 概 括 地 包 含 哺 乳 動 物 Mp 1 配 體 9 例 如 得 白 狗 9 豬 ί 1 I 人 > 小 鼠 > 馬 > 羊 和 兔 子 等 者 0 特 別 較 佳 的 Η ρ 1 配 體 是 得 1 1 自 狗 9 豬 和 人 者 〇 1 1 此 外 > 也 從 人 胎 腎 和 肝 庫 選 殖 出 觸 碼 人 類 Μ ρ 1 配 fi 的 基 1 1 因 並 定 其 順 序 如 後 面 實 旋 m 中 所 說 明 者 0 定 出 在 細 跑 基 1 I 分 析 中 具 有 活 性 的 兩 種 人 類 多 呔 序 列 ( 參 看 實 例 4 ) 1 1 這 兩 序 列 的 長 度 彼 此 不 同 但 在 其 胺 基 酸 順 序 中 有 一 大 段 1 | 是 相 同 者 C> 該 相 同 的 部 份 對 紅 血 球 生 成 素 具 同 系 性 該 1 1 - 17 — 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210XM7公釐） 565568 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ ) 1 1 1 Mp 1 配 體 在 本 文 内 也 稱 為 巨 核 细 胞 生 長 和 發 育 因 子 ( 1 1 1 MGDF S ) 對 於 Μ ρ I 配 體 的 所 有 一 般 參 資 料 也 應 用 於 本 -s 請 1 I 文 所 稱 的 MGDF 且 反 之 亦 m 0 ” M G D F多呔” 詞 的 意 思 為 具 先 閲 1 I 讀 1 I 有 可 特 定 地 刺 激 或 抑 制 巨 核 细 胞 生 長 及 / 或 發 m 的 活 性 之 背 面 1 I 多 肽 本 文 要 揭 示 這 種 多 肽 的 範 例 C 之 注 1 | 意 I 本 發 明 Mp I 配 體 經 發 現 在 巨 核 细 胞 品 糸 中 具 特 定 活 性 ， 事 項 1 I 可 增 大 巨 核 細 胞 的 成 熟 作 用 及 / 或 增 殖 9 如 後 面 的 施 例 再 1 1 2 和 4 分 析 中 所 顯 示 者 ”特定地” 一 詞 意 為 相 對 於 許 多 其 ¥ 頁 裝 | 他 細 胞 類 型 而 言 該 多 肽 對 巨 核 細 胞 顯 示 出 相 對 較 大 程 度 1 I 的 生 物 活 性 0 對 於 巨 核 細 胞 具 有 刺 激 性 者 > 預 期 可 經 由 對 1 1 巨 核 细 胞 的 成 熟 化 和 分 化 等 之 刺 激 而 具 有 在 活 體 内 剌 激 血 1 I 小 板 產 生 之 活 性 0 1 訂 兩 種 得 白 犬 源 的 較 佳 Mp 1 配 體 具 有 經 十 —‘ 垸 基 硫 酸 納 聚 1 I 丙 :烯 Μ 胺 凝 膠 電 泳 法 ( SDS - PAGE) 在 非 m 原 性 條 件 下 測 得 1 1 約 2 5 k d 和 3 1 kd的 表 觀 分 子 量 0 於 後 面 實 施 例 中 詳 述 的 相 1 I 同 純 化 程 序 中 纯 化 出 兩 種 蛋 白 質 0 1 1 兩 種 較 佳 的 人 類 配 體 MGDF - 1和 MGDF -2 長 度 分 別 為 • 線 | 332 和 173 胺 基 酸 不 包 括 21 個 胺 基 1¾ 的 擬 定 信 號 肽 0 垣 1 I iib 序 列 ϊ 及 第 三 種 相 m 分 子 MGDF-3 皆 示 於 圖 1 1和 12 0 1 I 本 發 明 的 另 一 部 份 為 從 哺 乳 動 物 源 > 較 佳 者 全 血 液 $ 血 1 清 或 血 漿 分 離 和 純 化 本 發 明 Mp 1 配 體 或 其 片 段 的 方 法 0 再 1 1 生 不 能 性 血 液 > 血 清 或 血 漿 為 特 別 較 佳 的 起 始 物 .:1 再 生 不 1 能 性 血 ϊ伎 $ 血 清 或 血 漿 可 由 下 述 方 法 取 得 用 ΪΙ 射 源 例 1 1 如 鈷 — 6 0 1 Η 約 400 - 800 雷 得 (R ad) 的 $s 射 水 平 照 射 哺 乳 1 I 動 物 使 其 再 生 不 能 ri 垣 種 程 序 係 技 m 中 已 知 者 如 下 文 m 1 1 1 - 18 - 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（） 施例1中所引文獻中所說明者。於人類的情況中，經照射 的血液，血漿或血清可得自籍射治療，如治療癌症後的患 者。 之後，對該再生不能性血液，血清或血漿砲以純化程序 。本發明所提出的純化方法包括下列關鐽程序：外源擬集 素親和層析術和Mp 1受體親和層析術。這些程序都可導致 得自犬再生不能性血漿的2 5至3 1 k d兩蛋白質達到約 3 0 0 - 5 0 0倍的純化。其他的標準蛋白質純化程序也可與上 述程序一些包含在本發明方法中以進一步純化本發明的 M p 1配體，如下文詳细說明的程序。 本發明的另一部份包括編碼哺乳動物Μ ρ 1配體蛋白質的 表現之多核苷酸。這種DNA序列可能包括編本文所述哺 乳動物Μ ρ 1配體蛋白質表現的經離析D Ν Α序列：彼等DN A 序列也包括在該Μ ρ 1配體密碼序列兩測的和3 |哺乳動物 非密碼序列。彼等D Ν Α序列可更編碼胺基端信號肽。肢等 序列可經由已知方法製得，包括完全或部份的化學合成。 該等密碼子可經最適化以在經選擇用來表琨的宿主细胞内 進行表現〔如，大腸桿菌（EL. C ο i i )或C Η 0綑胞）。 此外，本發明也提出重姐D Ν Α分子，各包括載體D N A ( v e c t 〇 r D N A )和編碼一哺乳動物Μ ρ 1配體的D N A序列。該 D N A分子提供Μ ρ 1配體D N A與能夠導引Μ ρ 1配體在所選宿 主細胞内的複製與表現之調節性序列一起處於操縱締合状 態 '本發明也提出用Κ表琨重組Μ ρ 1配體蛋白質的經這種 D Ν Α分子轉形過的宿主细胞（如，细菌細咆，哺乳動物細 胞，昆蟲细胞，酵母细胞或植物細胞等）。 -19 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 裝· 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 565568 A7 B7 五、發明説明（） 本發明的D N A分子和經轉形细胞都用於另一部份中，一 種新穎的製備重姐哺乳動物Mp 1配體蛋白質，或其呔片段 之方法。於該方法中，用K編碼MpI蛋白質或其片段的表 現之D N A序列（或如上所述之重組D N A分子）與一能夠控 制蛋白質表現的適當調節性或表現控制性序列處於操縱締 合狀態而轉形所得細胞系於可使重組D N A進行表現的適當 條件下進行培養。該專利申請方法可以採用許多已知的細 胞作為蛋白質表現用之宿主細胞。本發明較適合於產生 M p 1配體的細胞系為哺乳動物細胞糸（如，C Η細跑）和細 菌細胞（如，大腸桿菌）。 用大腸桿菌生產Μ ρ 1配體時，較佳者為採用在要表現的 蛋白質Ν-端之Met和Lys殘基，因其所得表現產物的產率 典型地較高之故。特別較佳的表現產物為全部具有1 6 5個 胺基酸的Met-Lys人類MGDF (亦即，Met<-Lys 一1 [1-163] MGDF (從成熟蛋白質的第一個胺基酸開始绢號） 。將在細菌細胞，如大腸桿菌之内表琨所得產物予K純化 出之後，可用酵素，例如二肽酶（如，组缬蛋白酶C )等 處理而脫除掉鏈端Me t - L y s殘基。 I I--------裝-- (請先閱讀背面之注-ή拳項再本頁) 訂 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 培可漿 些本所 或基血 這。文 物養性。。質本 裂培能 > 質白種 溶的不 7 白蛋多 胞過生例蛋是或 細理再 _ 體其 一 , 調從實ici尤有 胞。如看1 ，含 細質，參MP質於 主白驟ί 姐物在 _ 宿蛋步理重物徵20 從體改處出動特 _ 段配修 Κ 提乳他 手 1 其予，哺其 统ΜΡ或者中他的 傳的驟用份其質 的出步所部含白 當現化!|一不蛋 適表純配另地體 Μ取的 1 明質配 , 收同HP發實1 後内相離本質MP 然基由分於白明 養經中 蛋發 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 565568 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ ) 1 1 1 述 的 物 理 生 化 學 藥 學 或 生 物 等 活 性 0 1 1 1 本 發 明 也 有 關 由 M G D F 蛋 白 部 份 體 連 接 到 至 少 一 種 水 溶 請 1 I 性 合 物 所 構 成 的 化 學 改 質 MGDF Κ 及 這 種 组 合 物 的 製 備 方 先 閱 1 1 讀 1 I 法 及 其 使 用 〇 特 別 者 本 發 明 包 括 化 學 改 質 MGDF > 其 中 該 背 1 I M G D F 物 種 係 與 反 應 性 聚 乙 二 醇 分 子 反 應 而 使 PEG 接 著 到 之 注 去 1 1 M G D F 〇 這 種 接 著 可 用 本 文 討 亡厶 過 的 聚 乙 二 化 反 應 予 以 完 思 事 項 1 I 成 例 如 用 基 化 或 烷 基 化 反 應 等 用 PEG 進 行 釀 基 化 再 填 1 1 裝 I 或 燒 基 化 反 應 可 在 主 要 產 物 為 一 聚 乙 二 醇 化 或 多 聚 乙 二 醇 修 頁 化 之 條 件 下 進 行 〇 多 聚 乙 二 醇 化 通 常 包 括 將 PEG 接 著 到 離 1 1 胺 酸 殘 基 的 ε - 胺 基 且 可 另 外 包 括 在 多 肽 的 N- 端 聚 乙 二 醇 1 1 化 0 一 聚 乙 二 醇 化 較 佳 者 包 括 將 PEG 接 著 在 蛋 白 質 Ν - :瑞 的 1 I a 雄 胺 基 〇 該 一 聚 乙 二 醇 化 反 應 的 產 率 和 均 一 性 可 經 由 一 1 訂 種 還 原 性 院 基 化 予 Μ 增 進 > 該 種 反 應 ί糸 將 MGDF 蛋 白 質 部 份 1 I 體N- 端 殘 基 的 α - 胺 基 予 Η 選 擇 性 地 改 質 藉 而 促 成 水 溶 1 1 性 聚 合 物 部 份 體 選 擇 性 接 著 到 蛋 白 質 的 Ν- 端 〇 如 此 可 得 實 1 I 均 一 的 聚 合 物 / MGDF 蛋 白 質 结 合 11 分 子 的 製 備 及 ( 若 使 1 1 用 聚 乙 二 醇 時 ) 使 聚 乙 二 醇 部 份 體 直 接 偶 合 到 蛋 白 質 部 份 • 線 I 體 的 聚 乙 二 m 化 MGDF 蛋 白 質 分 子 之 製 腾 〇 1 1 本 發 明 的 另 一 部 份 提 出 藥 姐 合 物 其 含 有 治 療 有 效 量 1 I 的 經 離 析 之 天 然 發 生 或 重 組 Μ ρ 1 配 體 ί 其 可 用 水 溶 性 聚 合 1 I 物 例 如 聚 乙 二 醇 予 以 衍 化 過 及 醫 藥 可 接 受 的 載 體 > 稀 1 1 釋 劑 > 或 賦 形 劑 0 這 種 醫 藥 組 合 物 可 用 於 丄、 <a 療 其 特 徵 為 巨 1 核 细 胞 及 / 或 血 小 板 缺 乏 及 活 體 內 ( in V 1 V ο ) Μ P 1 配 體 1 1 缺 乏 等 的 疾 病 狀 能 /匕、 或 疾 病 之 方 法 中 0 其 亦 可 預 防 性 地 用 來 1 I 改 善 預 測 的 巨 核 细 胞 或 血 小 板 缺 乏 ( 例 如 1 因 手 術 而 致 者 1 1 I - 21 一 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 砍此， 症，例如 ，A IDS患 用來治療 於骨髓移 乳動物。 所以， 致的這些 有效量的 體同時或 刺激因子 素，間白 本發明 組等型） 體片段者 部份中的 株抗體情 其在診斷 本發明 析可採用 辨識Μ P 1 要由外部 板缺乏或 ΡΙ性和陰 本發明的 ，增強血 者或正進 血液疾病 植患者的 得自一物 Μ ρ 1配體可Μ用來治療 小板產生受損患者的血 行癌症化學治療的患者 ，例如，血小板減少症 輔肋治療。這類患者可 種的Μρ 1配體也預期可 本發明的另一部份為一種治療用 和其他病 上述醫藥 順序地給 ，組織介 素，生長 的另一部 ，和抗體 (亦即， 一部份包 況中的雜 或治療程 的另一部 Μ單一抗 配體之抗 给用Μ Ρ 1 疾病。這 性的對照 理狀態 組合物 用有效 素（如 因子， 份提出 片段， 對彼等 括能夠 種瘤（ 序中的 份為體 體或”三 體。這 旨己體及 種分析 ，抗體 之方法，其包括 。這種治療方法 量的至少一種別 ΕΡΟ )，可溶性 或抗體等。 抗體（多株，單 其係對抗哺乳動 具反應性者）。 分泌這種抗體的 hybridomas) ， 用途等。 i夜含有Μ p 1配f i ί 明治 ”（s a n d w i 種分析可M用來 /或這種患者是 可能包含在配套 ，及其他標準配 再生不能 小板產生 )〇 Mpl 。Μ p 1 配 為人類或 用於另一 血小板缺 给患者服 可包括與 的巨核细 Μ ρ 1受體 株，人化 物Μ ρ 1配 所以，本 細胞（如 及其製備 之分析·' c h )格式 判定患者 否可能經 藥方式中 套藥劑成 性貧血 (例如 配體可 體可用 其他哺 物種。 乏所導 用治療 Μ ρ 1配 胞群落 *造血 ，和重 體或配 發明該 ，在單 方法與 這種分 持定地 是否需 歷血小 ，内含 份0 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 b 頁 裝 訂 線 -22 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 本發明的其他部份和優點可從後靣較佳實_冽的詳細說 明而獲得闡明。 4會圓之簡 5¾ 日月 本發明的許多特性和優點可從繪圏的閱覽而變得明顯， 其中： 圖1所示為巨核細胞和血小板的發育和成熟化之綜覽。 圖2所示為可溶性老鼠Mp 1受體實質地完全抑制受照射 狗血槳（”再生不能性犬血漿”或” A P K 9 ”）誘導巨核细胞發 育之能力。巨核细胞發育的分析述於實_例2中。 圖3所示為APK9經外源擬集素和Mp 1受體兩種親和層析 術程序增強的活性（” Mp 1配體”）剌激1A6 . 1细胞的生長 及可溶性老鼠M p 1受體阻斷該生長之情形。 圖4所示為從再生不能性犬血漿純化2 5和3 1 k d兩形式 的犬Mp 1受體所包含的純化步驟總覽。 圖5所示為用逆相Η P L C ( R P - Η P L C )純化M p 1配體。洗提 份2 1含有高度純化的3 1 k d Μ ρ丨配體；洗提份2 2含有3 1 k d和2 5 k d兩種Μ ρ 1配體的混合物；而洗提份2 3含有高 度純化的2 5 k d Μ ρ 1配體」 圖6所示為含有2 5及/或3 1 k d兩種Μ ρ 1配體蛋白質的 逆相Η P L C ( C 4管柱）洗提份中之Μ ρ 1配體活性的比較： 圖7所示為經C D 3 4 -選擇過的周圍血液細胞培養物用 A Ρ Κ 9，Hp 1配體和各種其他因子予以刺激所產生的巨核细 之數目。 圖8所示為羥C D 3 4 -選擇過的周圍血液细胞培養物用 A P K 9，M p 1配體和各種其他因子予以刺激而產生的總白血 -23 - (請先閱讀背面之注意事項再填頁) -裝· 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 球數目。 圖9所示為經C D 3 4 -選擇過的周圍血液妞胞培養物甩 APK9，Mp 1配體和各種其他因子予Μ刺激而產生的巨核细 胞百分比。 圖1 0所示為未參與在Μ ρ卜配體-誘導巨核细狍發育中的 人類I L - 3。 圖1 1所示為c D Ν Α和推演所得人類M G D F - 1和M G D F - 2的胺基 酸順序。 圖12所示為cDNA和推演所得人類MGDF-3的胺基酸順序。 圖1 3所示為MG D F - 1與得自犬源（A )和老鼠源（B )的 M G D F s ( M p 1配體）之間的比較。 圖1 4所示為用一甲氧基一聚乙二醇的Ν -羥基丁二薩亞胺 基（Ν H S )活性詣將MG D F隨化導到聚乙二醇化產物之實施例 0 圖1 5所示為用一甲氧基一聚乙二醇莛進行非特定性 MGDF遷原性烷基化得到多聚乙二醇化產物之例子。 圖1 6所示為用一甲氧基一聚乙二醇醛在Ν -端殘基的α -胺基進行部位特定性M G D F還原性烷基化導致實質的單聚乙 二醇化產物之實例。 圖1 7所示為用M W 2 0 k D a M e P E G活化衍生物製得的 MePEG-MGDF结合物之粒度排外（SEC) HPLC分析結果； A .用M e P E G ( P E G 1 1 )的N H S gg將M G D F醯化製成的多 -M e P E G - M G D F -结合物； Β.用MePEG醛（PEG 20)將MGDF垸基化製成的多 - M e P E G - M G D F -结合物； 一 2 4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再
訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印^ 565568 Α7 Β7 五、發明説明（ C.用MePEG醛（PEG 16)將MGDF烷基化製成的單 -M e P E G - M G D F -结合物。 圖1 8所示為用重組人類MGDF處理小鼠後的血小板計數之 空心菱形=C Η 0 -衍生2 2 - 3 5 3 M G D F ;空心圓=未聚乙二§享 化的大腸桿菌22 - 1 84 MGDF (亦即，卜1 6 3 M G D F .);及空 心圓=聚乙二醇化的大腸桿菌2 2 - 1 8 4 MG D F。 圖1 9所示為7 - H u M G D F的純化流程圖。 圖20所示為在老鼠Carboplatin模型中7 -HuMGDF (大 腸桿菌卜1 6 3 )對血小板計數的影響，於第0日時，用單 劑的CarbopUtin ( 1 . 2 5毫克/小鼠經腹膜内注射 B a 1 b / c小鼠。只有賦形劑的組則不加C a r b ο p 1 a t丨η 。於 2 4小時後，於研究的其餘天數內每天用賦形劑或1 0 0 ^ g / k g 7 - H u M G D F經皮下注射經C a r b ο ρ 1 a t i η -處理的動物 。（每一姐，η = 10 ;於每隔一時點，將5隻動物放血：）〇 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 頁 裝 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖2 1所示為7 - H u M G D F的（大腸桿菌卜1 6 3 射處理過的小鼠所具血小板計數的影響。在第 雷得7 -輻射（緦源）單劑量照射Ba 1 b/c小鼠 劑的組未受照射。於24小時後，在其餘的研究 用賦形劑或1 0 0 “ g / k g 7 - H u M G D F經皮下注射 (每一组，η = 8 ;於每隔一時點時將4隻動物 圖2 2所示為7 - H u M G D F的（大腸桿菌1 - 1 6 3 射和C a r b ο ρ 1 a t i η组合處理過的小鼠所具血小 響。於第0天時，用5 0 0雷得7 -輻射（緦源 B a 1 b / c 小鼠並给用 C a r b ο ρ U t ί η ( 1 · 2 5 毫克 / 24小時後，在其餘研究天數中每天用賦形劑或 )對於經照 0天用5 0 0 。只含賦形 天數内每天 受照射動物 放血）。 )對於經照 板計數之影 )照射 小鼠）於 10 0 u 線 -25 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ g / k g 7 - H u M G D F經皮下注射試驗動物 7 -Hu MG DF的支撐時，大部份的動物 存。於對照姐中，8隻動物中有1隻 δ隻動物中8隻都存活。 圖23所示為7 -HuMGDF的（大腸桿 猴照射誘導血小板減少症之影響。使 7 0 0 c G y C 〇 - 8 0 )。於照射後2 4小時 皮下給用7 - H u M G D F ( η = 3 )或人類血 為2 5徽克/公斤/天）。用電子血球 。每一符號代表平均值（+ / - s e m ) 圖2 4所示為經聚乙二醇化與糖苷化 C a「b 〇 p 1 a t i η和照射等處理過的小鼠 響。依圖2 2進行的研究所述對小鼠陁 射之組合處理。於處理後2 4小時開始 下注射所示7 -HuMGDF製劑（50微克 子血球計數器（S y s m e X，B a X t e r )於 (每组n = 8 )。沒有 在此研究中都不能殘 殘存。於處理組中， 菌卜1 6 3 )對於恆河 恆河猴接受照射（ 起的1 8連續天中，經 清白蛋白（n=9)(各 分析儀進行血球分析 Ο 的7 - H u M G D F對於經 所具血小板計數之影 M C a r b ο ρ 1 a t ί η 和照 的天數中，每天經皮 /公斤/天）。用電 所示天進行血球計數 請 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再
訂 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圖2 5所示為具有大腸桿菌最適化密碼子的重組人類 MGDF，胺基酸卜163之合成基因序列。 發明之詳綑說明 本發明的其他部份和®點可由諸於此技者從思考下列詳 述本發明操作的說明中明顯得知。 本發明所提出的新穎哺乳動物巨核細胞生長促進，及/ 或血小板產生因子，稱為ΜΡ 1配體者為實質地不與其他 3 1種含蛋白質物質締合之均一蛋白質。較佳者，該蛋白質 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ·· B7五、發明説明（） 中有約90¾不為其他蛋白質’特別較佳者，有約95¾不為 其他蛋白質，且最佳者約有έ 9 8 %不為其他蛋白質。這些 蛋白質可經由重組技術產生’ Κ大量製備供治療應用所用 的純活性Μ ρ 1配體。另外’這種蛋白質可從哺乳動物再生 不能性血液，血漿或血清’或從能分泌或表現Μ Ρ 1配體的 哺乳動物細胞糸等W均句形式取得。再者，也可經由化學 合成得到Μ ρ 1配體或其活性片段。 概括而言，本發明所用”Μρ1配體”之意為本發明所揭示 的，於下文較詳细說明的Μρ 1配體及其活性Η段和變化形 式。 得自犬源的兩種較佳Μ ρ 1配體具有用十二垸硫酸納聚丙 烯凝膠電泳（SDS-PAGE)在非還原條件下測声的表觀 分子量：約2 5 k d和3 1 k d。這兩種蛋白質都是用後面實施 例節段中詳述的相同純化程序予以純化°例如兩種M P 1 配體都结合麥穿外源凝集素並固定化Μ Ρ 1受體。該2 5 k d· ^ 形式包含下示胺基酸序列： 、 /· ^ Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lvs-Met-Leu- Arg—Asg-Ser一His一Val一Leu-His一Xaa—Arg一Leu一Xaa一Gin一Xaa_Pr〇— Asp-Ile-Tyr (SEQ ID NO: 1).·* ，. / 該3 1 k d形式包含下示胺基酸序列： Ala-Pro-Pro-Ala-Xaa-Asp-Pro-Arg-Leu-Leu-Asn-Lys-Met-Leu-Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SEQ ID NO: 2) · S E Q I D N 0 S ·· 1和2中的” X a a ”胺基酸為不能確定地得知者 -27 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（） ，不過預料其為半胱胺酸，絲胺酸，蘇胺酸，或（較不可 能者）色胺酸。 從上示兩序列可以看出該3 1 k d配體包含至少一部份的 25 kd形式。.特別者，該31 kd蛋白質的前面21個胺基酸 與2 5 k d蛋白質所含者完全相同。此證據，及特別者，兩 種蛋白質在本文所提Mp 1配體活性分析中都具有活性之事/ / 實，可Μ推斷兩種蛋白質在構造和活性上有非常密切的關 聯◦該3 1 k d形式的蛋白質與該2 5 k d形式在編碼妓等蛋 白質的基因之差示C -端順序，差示糖基化及/或差示接合 等方面可能有不同。 除了上述序列資料外，在最化純化步驟（用逆相Η P L C ) 之前/對2 5 k d分離帶的序列分析中測定出另一 _列。該 、 序列經發現係在非還原條件下而不是在遷原性條件下與 25 kd帶締合，顯示其為該25 kd蛋白質被切斷成兩部份 (如，經由蛋白_作用者.）的结果*該兩部份係由二硫鐽 ； ^ 維繫在一起的。該序列為： 、 ； /，· y Thr-Gln-Lys-Glu-Gln-Thr-Lyis-Ala-Gin-Asp-Val-Leu~Gly-Ala-Val-Ala-Leu (SEQ ID NO: 3) . ， ， ； 雖然S E (T I D N 0 : 3在2 5 k d蛋白質序列中的正確位置尚 不清礎，不過，類似於其他细胞活素，例如促紅血球生成 素等者，該序列可能發生於25 kd蛋白質中胺基酸1 1 4之 附近。必須提及者，有可能，雖則尚未證明者，S E Q I D ; N 0 : 3也發生於該3 1 k d蛋白質内，也許同樣地從胺基酸 1 1 4附近起始。該序列資枓在實施例7中會另外予K詳细 ~ 2 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再 -裝· 頁) 線 565568 A7 B7 五、發明説明（ 討論。 自從 已選殖 所示的 可預測 的C-端 圖1 3 B 彼等 予K鑑 /毫克 A P K 9 標 胞之物 這種 细胞生 位/毫 致200 下面 其他特 如上文概述者，犬配體 出編碼該犬配體的基因 該犬配體的全長度胺基 該2 5 k d和3 1 k d犬配 處理形式。另外也得到 所示之順序。 純化配體也可Μ用實施 定其比活性，而為至少 $初始純化實驗之後，至今 。其结果為已定出如圖1 3 A 酸順序。基於分子量計算， 體為圖1 3 A所示全長度配體 一種老鼠MpI配體*其具有 例2所述人類巨核细胞分析 約5 . 7 X 1 0 9巨核細胞單位 一個巨核细胞單位的定義為導致產生與1微升 準對照用實施例2所述 質量。 純化配體的其他特徵為 長分析中所得比活性至 克。”細胞生長單位”的 1 A 6 . 1细胞生長所需配 的表1列出根據本發明 殊活性計算： 分析法所得一樣多的巨核细 其在實施冽4的M p卜依賴性 少約6 . 9 X 1 0 9细胞生長單 定義為在實施例4分析中導 體量。 實際純化所得犬Μρ 1配體的 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項
訂 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Μρ 1配體 31 kd 2 5 kd 表 1 1 .A 6 . 1分析 (鼠位/毫克） 6.52xl09 10.5 X 109 人類M e g分析 (II位/毫克) 5.7 X 109 14 X 109 29 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（） 總括上述資料，本發明的一些範例Mp 1配體具有下列一 或多項生化和生物性質： U )彼等Mp 1配體係從犬的再生不能性血槳分離出來的 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (b) 彼等MpI配體具有依 胺凝膠電泳法（SDS-PAGE) 2 5 k d或3 1 k d的表觀分子 (c) 彼等Mp 1配體包含下 於2 5 k d蛋白質的情況中 於3 1 k d蛋白質的情況中 (d) 彼等MpI配體另包含 別較佳者為在2 5 k d蛋白質 ie)彼等MpI配體會结合 (Γ)彼等MpI配體會结合 受體； (g) 妓等MpI配體的活性 溶性M p 1受體所抑制；及 (h) 彼等MpI配體在約8-換管柱上。 本發明較佳MpI配體的生 核細胞生長促進分析中特定 能力而展現的。於該分析中 刺激人類周圍血液C D 3 4 +細 的C D - 3 4細胞）的分化。巨 抗原抗體予Μ染色鑑定並以 12-14¾十二烷硫酸納聚丙烯_ 在非遷原性條件下測得之約 量； 列胺基酸序列： ，S E Q I D N 0 : 1 ; $ ，S E Q I D N 0 ·· 2 ； 胺基酸序列S E Q I D N 0 : 3 (特 內者）； 到麥穿外源凝集素；. 到經固定化的可溶型老鼠MpI 在活體外（i n v i t r 〇 )會被可 9的pH值下會结合到陰離子交 物活性係K其在實施例2的巨 地剌激巨核細胞生長和發育之 ，在8天培養期間，MpI配體 胞（亦即，經免疫吸附所選出 核細胞係用特定的抗一血小板 顯微術計數者。M p 1配體也剌 -30 -
訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 激因子一依賴性细胞系，1 A6 . 1 ，之生長。於沒有Mp 1配 體之情況中，細胞會死亡。在用Mp 1配體培養2天後，估 算1 A6 . 1細胞數。 上述Μ P 1配體具有如上面表1所列之比活性。 Μ ρ 1配體源已被測定過為再生不能性哺乳動物血液，血 漿，或血清。不過，彼等配體的來源並不預期受限於這些 已知來源而可能包括其他的哺乳動物體液，從彼等所得細 胞等ϋ 從哺乳動物源純化天然Μ Ρ 1配體的程序係根據下列兩種 關鐽性純化步驟： (a )外源凝集素親和層析術，較佳者係用麥芽凝集素； 及 (b )經固定化的MP 1受體親和層析術。 此外，可以包括其他步驟Μ進一步纯化蛋白質，例如離 子交換層析術，膠濾層析術，和逆相1析術等。 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再
頁 訂 得 : 取} 漿 7 血例 性施 能實 不， 生看 再參 犬ί 從驟 Μ步 用列 上下 際含 實包 術 技 ib 純 勺 β iBH 骨 Jb § 特 為 術 析 層 素 集 凝 ί牙 麥 術 析 層 和 親 素 集 凝 源 外 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 者 佳 較 II1- 受ΜΡ 1 鼠 ΜΡ老 性的 溶化 可定 ) 固 (b經 用 術 析 層 和 親 者 佳 較. 合*' 用
用 者 ； 佳 > 較柱 ( 管 術Q 析no 層 Μ 換用 交 ， )者 子佳 離較 陽別 或特 子 ； 離術 陰析 丨層 子換 離六乂 .) 子 C 術 析 層 滹 翏 αΗ^ 使 者 佳 較 的 行 進 下 況 狀 離及 解 在丨 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 565568 A7 B7 經濟部智¾財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ ) 1 1 1 (e } 逆 相 層 析 術 ( 較 佳 者 使 用 C - 4 管 柱 ) 〇 1 1 1 對 再 生 不 能 性 血 液 血 清 或 血 漿 $ 或 其 他 哺 乳 動 物 Μ ρ 1 X—ν 請 1 I 配 體 源 例 如 細 胞 或 組 織 等 來 源 施 Μ 上 面 的 純 化 程 序 即 先 閱 1 I 讀 1 I 可 得 到 均 的 哺 乳 動 物 Mp 1 配 體 ， 包 括 人 類 配 體 0 這 些 步 背 面 1 I 驟 並 不 要 求 以 特 殊 順 序 進 行 9 不 過 仍 上 面 所 列 順 序 較 為 之 注 1 | 意 I 適 當 0 培 養 可 用 來 產 生 Mp 1 配 體 的 細 胞 ( 或 組 織 源 ) 之 程 項 1 I 序 係 諸 於 此 技 者 所 已 知 且 可 用 來 例 如 t 擴 大 起 始 物 的 供 再 ά 1 1 給 者 〇 麵 裝 頁 1 Mp 1 配 體 或 其 一 或 多 種 肽 片 段 也 可 Μ 經 由 重 組 技 術 來 產 1 I 生 0 為 了 得 到 特 別 Η ρ 1 配 體 的 DN A 序 列 9 要 將 純 化 Mp 1 配 1 1 體 物 予 遷 原 並 視 需 要 蛋 白 酶 > 如 胰 蛋 白 m 予 消 化 用 1 I 傳 統 技 術 分 離 出 酵 素 分 解 片 段 並 定 其 順 序 〇 另 外 > 如 本 發 1 訂 明 實 砲 例 所 舉 例 說 明 者 可 將 整 個 純 化 蛋 白 貝 根 據 可 得 蛋 1 I 白 質 的 量 直 接 定 其 序 列 到 可 能 的 程 度 1 妖 ^ \ w 後 類 似 於 下 述 1 1 程 序 中 的 已 定 順 序 之 胰 蛋 白 酶 分 解 Η 段 使 用 該 已 定 順 序 的 1 I 區 段 〇 用 遺 傳 密 碼 合 成 寡 核 酸 探 頭 Μ 預 測 觸 碼 已 定 順 序 1 1 線 I 的 片 段 所 具 胺 基 酸 順 序 之 所 有 可 能 順 序 較 佳 者 產 生 幾 • 種 簡 併 性 序 列 以 作 為 探 頭 〇 用 這 lit 探 頭 篩 選 哺 乳 動 物 基 因 1 1 I 姐 庫 或 其 他 來 源 而 鑑 別 出 Mp 1 配 體 基 因 此 外 i 也 可 Μ 用 1 I 取 白 Mp 1 配 體 細 胞 源 的 mRN A 製 備 c D N A 庫 m 後 用 探 頭 對 其 1 進 行 篩 選 Μ 鑑 別 編 碼 Mp 1 配 體 多 肽 的 cDN A : 再 者 可 以 用 1 1 適 當 的 引 物 PCR 技 術 來 擴 充 cDN A序 列 0 1 I 使 用 這 探 頭 誦 選 基 因 组 庫 後 1 即 可 得 到 DN A 糸 ( 1 1 cl on e ) 〇 為 了 得 到 全 長 度 系 * 可 用 根 據 所 得 DN A 序 列 之 1 1 探 頭 再 蒒 選 該 庫 並 雜 交 到 全 長 度 Mp I 配 體 DN A 序 列 :’ 1 1 1 - 32 - 1 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210XM7公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 b 頁
Mp 1配體的人類cDN A也可以經由將全長度人類基因組系 分殖到表現媒體内，將其轉移感染到COS細胞中，用這些 轉移感染C 0 S细胞製備c D N A庫並經由雜交M p丨配體c D N A進 行篩選等程序製得。在完整cDN A經鐘定出後，可將該 c D N A或其編碼M p 1配體活性片段的任何部份導到多種表現 媒體中的任何一種之内而製備成該Μρ 1配體或其一或多種 片段之表現系统。 訂 經由重組技術的這種使用，可得到編碼Μ ρ 1配體多肽的 較佳D Ν Α序列。本發明也包括這些D Ν Α序列，其不和編碼 其他蛋白質的D N A序列相締合（亦即，其為隔離者），且 其编碼具有Μρ 1配體活性（亦即，巨核細胞生長及/或發 展）的Μρ 1配體多狀之表現。這些D Ν Α序列包括編碼整個 Μρ 1配體或其片段的序列及雜交，較佳者在嚴緊雜交狀態 下雜交到cDNA序列之序列〔參看，T. Maniatis et al ., Molecular Cloning ( A Laboratory Manual) ； Cold Spring Harbor Laboratory )1982.), 387 至 389 頁〕° 線 範例嚴·緊雜交條件為在62-67 °C下，於4 X SSC中雑交 ，接著在6 2 - 6 7 °C下，於0 . 1 X S S C中洗約1小時。另外 ，範例嚴緊雜交條件為在4 0 - 4 5 °C下，於4 5 _ 5 5 %甲醯胺， 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 4 X S S C中雜交。 於鬆弛雜交條件下雜交到Μρ 1配體的序列且编碼具有 Μ ρ 1配體生物性質的Μ Ρ 1配體肽之D Ν Α序列也編碼本發明 新穎Μ ρ 1配體。這種經鬆弛嚴緊雜交條件的例子為在 4 5 - 5 5 t 下，4 X S S C ，或用 3 0 _ 4 0 % 甲藤胺在 4 0 - 4 5 :C 下 雑交。例如，與Μ ρ丨配體序列共有明顯同系性區域，例如 一 33 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ，糖基化或二硫鐽结等部位且編碼具有一或多種Mp 1配體 生物性質的蛋白質等之DNA序列顯然地編碼Mp 1配體多呔 ，即使這種DN A序列不會嚴緊地雜交到該Mp丨配體序列亦 妖0 此外，本發明也包括掲碼M p 1配體肽序列的D N A序列之 對偶基本變異體（在物種群中自然發生的可能會或不會導 致胺基酸變化的鹼變化：），及其類似物或衍生物。類似地 ，本發明也包含編碼Μ P 1配體多肽但因遺傳密碼簡併性促 成密碼子使用的不同之D Ν Α序列，或因點突變或誘導改質 藉以增進所編碼多肽的活性，半生期或產生等所引起的 M p 1配體D Ν A序列之變異體。 遵從後面實施例1 1所述選殖程序而導致本文所揭示的人 類蛋白質M G D F - 1，M G D F - 2，和M G D F - 3的胺基酸序列和 c D Ν Α序列。M G D F - 1為圖1 1所示的胺基酸2 2 - 3 5 3且含有3 3 2 個胺基酸。M G D F - 2和M G D F - 1的截取部份，而為在圖1 1中所 列的胺基酸2 2 - 1 9 5。所Μ，M G D F - 2含有1 7 4個胺基酸。 M G D F - 3為圖1 2中所列的胺基酸2 2 - 2 8 9而含有2 6 8個胺基酸 。於本發明所揭示的每一 MGDF中，包含信號肽的分子，例 如圖1 1和1 2兩者之中的胺基酸卜2 1也為本發明多肽的一部 份，不過，對於要展現的巨核细胞生長和發育活性而言， 最好將其脫除掉。摘要而言，MG D F 1 - 3的定義如下： M G D F - 1 胺基酸 2 2 - 3 5 3 圖 1 1 M G D F - 2 胺基酸 2 2 - 1 9 5 圖 1 1 M G D F - 3 胺基酸 2 2 - 2 8 9 圖 1 2 .於本發明所提諸分析中，MGDF-1和MGDF-2皆具活性而 -34 - 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項
頁 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 565568 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（） M G D F - 3 則否。 基於本發明所提活性數據，假設人類MG D F ί糸在活體内( i η ν i ν 〇 )表現成實質地非活性或較低活性的前體多肽， 其含有可變的C-端胺基酸。於切去C-端胺基酸（及信號肽 )之後，該經處理形式的分子即持有活性或變得更具活性 。從上述假說看來，相信MGDF-1為展現其活性可能需要處 理（如，用蛋白酶切斷）。截取形式的MG D F - 1 (即， MGDF-2 )具有活性之事實即可支持此假說： 用MGDF-1基因轉染過的人類腎293細胞：：經調理過培養 基（活體外原）在後面實施Μ 4的细胞分析中確實展現出 活性。另一方面，在其他細胞糸，如3 2 D细狍之中，則未 看到該分子的活性。據信，這種结果可能代表2 9 3细胞能 夠處理MGDF-1分子，也許是經由截取，使得基本上促成該 活性的分子為經截取之形式，而3 2 D細胞則不能處理該分 子。 自上述假說來看，從M G D F - 1序列（圖1 1 )經截取後可能 導致多種活性分子。在綑胞活素族，如，促紅血球生成素 (Ε Ρ 0 )内保守注的構造特點包括四條cx - _旋束和四個半 胱胺酸。參看MG D F - 1序列，C y s 1 7 2為這些演化性地保守 且機能性必要的構造之最C -端元件。所以，較佳的 MG D F - 1截取變形體為具有胺基酸1 7 3至3 5 3的C -端截取段 (伴隨著信號肽之切斷）之任何者。較佳者，M G D F - 1序列 要從C -端除去5 0至1 δ 5個胺基酸，特別較佳者，從C端除 去90至172個胺基酸。如本發明所揭示者，信號肽的長度 被認為是2 1個駿基酸；不過，根據M G D F - 1的頌序，該信號 -35 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填.
訂 線 565568 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 呔 可能 具 有 23 個 胺 基 酸 〇 綜 上所 述 ，本 發 明 也 特 別 包 括 對 應 於本 文 所 提 但 従 圖 11或 1 2的位 置 24起 始 之 多 肽 : 下面 所 列 為 可 能 具 有 活 性 (亦 即 ，促 成 巨 核 细 胞 及 / 或 血 小板 生 長 的 能 力 > 或 對 白 妖受 ^\\\ 體 的抑 制 / 剌 激 活 性 等 ) 的 某些 特 別 較 佳 之 MGDF -1 交 體： MGDF -4 胺 基 酸 22 -172 圖1 1 M G D F -5 胺 基 酸 22-177 圖1 1 M G D F - Γ) 胺 基 酸 22 -191 圖1 1 MGDF _ 7 胺 基 酸 22 - 198 圖1 1 MGDF - 8 胺 基 酸 22 -265 圖1 1 MGDF -1 1 胺 基 酸 22 -184 圖1 1 於某 些 純 系 中 1 不 含 MGDF -1序 列 中的 胺 基 酸 133- 136 > 因 此， 對 應 於 上 面 所 列 y 但 不含 這 些胺 基 酸 ( 而 其 〇 端 胺 基 酸編 號 向 下 減 4 調 整 ) 之 序列 也 可能 具 有 活 性 CJ 於一 純 系 中 1 在 位 虽 192 具有 — 终止 密 碼 子 ) 因 此 在 圖 11 中的 位 置 19 1 處 係 以 A 1 a 殘基 取 代Th r 殘 基 所 以 > 本 發 明包 括 M G D F 分 子 中 > 位 PS 且 191 係 Μ A1 a 取 代 Th r 之 交 體 MGDF -3 係 因 脫 除 掉 本 文 稱 之為 I VS-5 ( 間 插 序 列 -5 ) 的 序 列後 所 得 者 % 該 序 列 是 接合 在 原序 列 的 五 外 顯 子 内 之 故：: 由 於 I VS - 5 的 5 . 端 發生 在 一密 碼 子 之 内 其 脫 除 會 導致 刺 餘 M G D F 序 列 的 移 碼 ，其 可 看出 是 從 MGDF -3的 位 Μ 160開 始 發 生 到 該 分 子 的 末 赖為 止 〇 至今 為 止 > 將 MGDF -3本 身 轉染 到 293 細 胞 内 並 用 實 施 例 4 的细 胞 基 分 析 檢 驗 所 得 涇 調理 培 養基 的 活 性 時 1 皆 未 發 -36 - 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 P 頁 裝 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 現有活性。顯然地，不像M G D F - 1者，2 9 3细胞不能夠將 MGDF-3處理成活性形式。雖然如此，根據上文與MGDF-1相 關的截取假說，從M G D F - 3截取掉C -端胺基酸也可能導致活 性。例如，將MGDF-3截取掉C-端40至102個胺基酸即可導 致活性。較佳者，除掉5 0至9 0個胺基酸。兩種特別較佳的 MGDF-2變體為： M G D F - 9 胺基酸 22-179 圖 1 2 MGDF-10 胺基酸 22-190 圖 12 於本文所揭示的所有Μ ρ 1配體，包括上列範例M G D F s在 内，Ν -端可能含甲硫胺釀殘基，尤其是在彼等多肽係在细 菌宿主細胞内表現者之時。 Μρ 1配體多呔也可能經由已知的傳统化學合成予以製成 。Μ合成手段搆成本發明多肽的方法係諳S彳此技者所知悉 者。羥由合成方法構成的Μ ρ 1配體多肽序列，藉著與Μ ρ 1 配體多狀共有的一級，二級或三级構造與構像特性，也可 能具有與彼等相同的Μρ 1配體生物性質。因此，其可敝為 天然羥純·化Μρ 1配體多肽的生物活性或免疫學替代物以用 於治療和免疫等程序中。 肽或編碼Μ ρ 1配體的D Ν Α序列等之中的改質可由諸於此 技者用已知技術完成。Μ p 1配體序列中的標的改質可包括 密碼序列中所選胺基酸殘基的替換，嵌入或剛除。妓等替 換，嵌入或刪除所用突變形成技術皆為諸於此技者所熟知 者：參看，例如，美國專利第4,5 1 8,5 8 4號：。最好是在 1至2 0胺基酸之保守性變化。較佳的肽可羥由蛋白分解酵 素，或經由直接化學合成而產生。這些種變體也包括在本 -37 - (請先閲讀背面之注意事項再 -裝-^^4 頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 發明Mp I配體多肽和 1配體多肽序列 ’絲胺酸，蘇胺酸， .瞭胺一聯结楗基化 _而改質的任何部位 糖基化的不存在或只 基化辨識部位包括被 之二狀序列。這些二 Asr-Xaa-Ser ，其中 。在糖基化辨識部位 生的多種胺基酸替換 刪除）會導致該經改 苷酸序列的表現會產 其他的MGDF$i似物/ 多核脊酸之意義内。 的特殊突變可能包括糖基化 或天冬胺_胺）之改質。在 辨識部位或在分子上經由添 等所發生的胺基酸替換或刪 部份糖基化。天冬胺藤胺-適當的細胞糖基化酵素所特 狀序列可為Asn-Xaa-Thr或 X a a可為p r 〇以外的任何其 的第一或第三或兩者的胺基 (及/或在第二位置 序列的非糖基化。彼 等位置未發生楗基化 或_除 質三肽 生在該 衍牛物 部位（如 任何天冬 加0 -聯结 除可導致 聯结的糖 定地辨識 他胺基酸 酸位置發 的胺基酸 等變質核 之變體：
訂 經濟部智总財產局員工消費合作社印製 M G D F序列（ 留全部或部份 此技者從本發 之内。 更特別者， 製餚和使用彼 進其性質。 Μ ρ 1配體）的 0勺 MG D F ( Mp 1 明揭示而製備 本發明也概括 等之方法。本 其他類似物和衍生物，其可保 配體）活性者，也可以由諸於 成。彼等改質也包括在本發明 地包括化學改質MGDF^成物及 揭示顯露出可以改質M G D F並增 關M G D F產物，其係由M G D F蛋白 合物部份體所構成者 有關MGDF產物，其中該MGDFg 白質係聯结到至少一個聚乙二醇分子。 於一部份中，本發明係有 質聯结到至少一種水溶性聚 於另一部份中，本發明係 -38 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 Α7 Β7 五、發明説明（ 於另一部份中，本發明係有關經由釀基或烷基鐽结接著 到至少一個聚乙二31分子的M G D F分子： MG D F的聚乙二醇化可用技藝中已知的任何聚乙二醇化反 應進行。參看，例如：” F 〇 c u s ο n G r 〇 w t h F a c t 〇 r s 3 ( 2 ) :4-10 (1992) EP 0 154 316; EP 0 401 384;及本文所 引與聚乙二醇化相關的其他文獻。較佳者，該聚乙二§|化 係用反應性聚乙二醇分子（或類似的反應性水溶性聚合物 )經由藤基化反應或垸基化反應進行的。至此於下文要更 詳細地討論聚乙二醇衍化的這些較佳手段。 _基化 經由_基化的聚乙二醇化通常包括用聚乙二醇（:P E G )的 活性g旨衍生物與M G D F蛋白質之反應。任何種已知的或Μ後 發現的反應性PEG分子都可用來進行MGDF的聚乙二醇化。 較佳的活化P E G酯為詣化到N -羥基丁二釀亞胺（” N H S ”）之 PEG 。如本文所用者，” _基化”意歆包括但不侷限於下述 類似的M G D F與水溶性聚合物，如P E G之間的_结：廳胺， 胺甲酸醋·，胺等。參看Β ί 〇 c ο n j u g a t e C h e m . 5 : 1 3 3 - 1 4 0 ( 1 9 9 4 )。其反應條件可選自聚乙二醇化技藝中 已知者或Μ後開發出者，不過必須避開會使要改質的 MGDF物種抑活化之條件：如溫度，溶劑和pH等。下文要說 明一般用於MGDFs的聚乙二醇化之反應條件。圖14示出用 一甲氧基-P E G的N H S §旨進行的範例反應： 經由釀基化進行的聚乙二醇化通常會導致多聚乙二醇化 M G D F產物，其中離胺酸的ε -胺基係經由_基聯结基被聚 乙二醇化者。較佳者，該連接鍵结為釀胺。另外較佳者， -39 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項
頁 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 565568 經濟部智总財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 所得產物實質地僅為（如，2 9 5 $ )——，二一或三-聚 乙二醇化。不過，通常會以與所用的特殊反應條件有關之 量形成某些具有較高聚乙二醇化程度之物種（最高達到 MGDF所含離胺基ε -胺基的最大數目加上MGDF胺基端的一 個α -胺基）。必要時，可用標準純化技術，包括，例如 ，透析，鹽析，超濾，離子交換層析術，膠滹層析術和電 泳等從混合物，特別者未反應物種之中分離出更純化的聚 乙二醇化物種。 :院基化 經由烷基化的聚乙二醇化通常包括用P E G的末端醛衍生 物與蛋白質，如MGDF，在遷原劑存在中反應。如上文討論 的_基化一般，要在下文說明其反應條件： 經由烷基化的聚乙二醇化也可能導致多一聚乙二醇化 M G D F。圖1 5示出M G D F的範例還原性烷基化反應，其產生多 聚乙二醇化產物。此外，可Μ經由操縱本文所述反應條件 Μ使聚乙二醇化有利於實質地只發生於M G D F物種Ν -端的《 -胺基（亦即*單一聚乙二醇化物種）。圖1 6示出M G D F的 一個範例還原性烷基化反應，其產生單一聚乙二醇化產物 。於單一聚乙二醇化或多一聚乙二醇化任一情況中，該 PEG基最好是經由- CH2-NH-基接著到蛋白質上。特別指 -C Η 2 -基時，這類鍵结在本文中稱之為”烷基”鍵结。 經由遷原性烷基化Μ產生單一聚乙二醇化產物之衍化反 應係利用MG D F中可供衍化的不同類型一級胺基所具差別反 應性(離胺酸相對於Ν -端）。該反應係在可利用離胺酸殘 基的ε -胺基與蛋白質Ν-端殘基的σ -胺基之間的pKa差 - 4 0 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) -裝· 訂 線 565568 A7 B7 五、發明説明（ 異之P Η值下進行的（參看下 即可控制具反應性基，如醛 接著：與該聚合物的接合主 其他反應性基，如離胺酸的 質。於一重要部份中，本發 (意即MGDF蛋白質 接合分子 ^95¾ ) 之，若使 MGDF蛋白 二§?分子 綜上所 MGDF ，其 討論過者 化者（亦 P E G通常 ，也包括 基可在適 接著一聚合物分子 用聚乙二醇時，本 質，其不具可能的 直接偶合到M G D F蛋 較佳部份 述，於一 中該P E G ，這種產 即，含有 是接著到 P E G接著 當反應條 文）。 基的水 要係在 側鏈胺 明提出 上實質 )之實 發明也 抗原性 白質上 中，本 經由這種 溶性聚合 蛋白質的 基，則未 一聚合物 選擇性衍化， 物對蛋白質之 Ν-端進行而對 發生明顯的改 / MGDF蛋白質 地只在單一位置（如 基係經由_基或 物可為一 2 - 6 個， 蛋白質所 到蛋白質 件下具有 一聚乙 較佳者 含胺基 所含任 足夠反 質均一製 提出一種 聯结劑， 而形成者 發明係有 烷基而接 二醇化或 ，2-5 個 酸的c(或 何胺基之 應性而接 備。更特定言 聚乙二醇化 且其Μ聚乙 〇 關聚乙二醇化 著的。如上文 多一聚乙二醇 P E G者）。該 ε胺基，不過 上者；肢等胺 著到P E G基。 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 相物 化可胺的乙 0. 生 純應 _ 能聚 合衍 易反 α 可多 狙化 容化的及， 子醇 較醇酸 ，Μ 分二 物二基個所 的乙 生乙胺一 。 佳聚 衍聚端何著 較一 化一 i 任接 別， 醇，到的醇 特言 二者著中二 _ 一而。乙述接基乙41 為物者聚所只殘聚 I DF生利多上體酸的 MG衍有比如份胺外 化DF較物。部離額 SIMG是生一醇個生 二化都衍均二幾發 乙醇來化為乙含能 聚二看醇更聚所可 一 乙由二常使DF都 明聚理乙通得MG位 發多種聚而行於部 本於多一因進。他 對就 ，K 基其 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 經濟部智惡財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 二醇化MGDF衍生物傾向於為更非均一混合物。一聚乙二醇 化衍生物的產率通常也高於多聚乙二醇化衍生物的產率。 於薩基化和烷基化兩者之中所用的聚合物分子可選自水 溶性聚合物或其混合物之中。所選聚合物必須是水溶性者 ，使其所接著的蛋白質不會在水環境，例如在生理環境中 沉澱。所選聚合物最好必須經過改質Μ具有單一反應性基 ，例如供醯基化的活性酯，或供烷基化的醛，使得如本發 明方法所提出者，可Μ控制聚合度。較佳的反應性P E G醛 為聚二醇丙醛，其具有水安定性，或其-CrCi。烷氧基或 芳氧基衍生物（參看，美國專利第5 , 2 5 2 , 7 1 4號）。該聚 合物可為分支或不分支者。較佳者，對於末端產物製劑的 治療用途而言，該聚合物須為醫藥可接受者。該水溶性聚 合物可選自下列所成組合之中：聚乙二醇，一甲氧基一聚 乙二醇，葡聚糖，聚（N -乙烯基吡咯烷_)聚乙二醇，丙 二醇均聚物，聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物，多氧乙基化 多元醇（如，丙三醇）和聚乙烯醇等·、對於釀基化反應， 所選聚合物必須具有單一反應性酯基：而對於本發明S原 性烷基化而言，所選聚合物必須具有單一反應性醛基。通 常，該水溶性聚合物不會選自天然發生的糖基殘基，以其 一般而言，可用哺乳動物重姐表現系统更方便地製得之故 。該聚合物可具任何分子量，且可為分支或未分支者。 可供本發明所用的一特別較佳之水溶性聚合物為聚乙二 醇，縮寫為PEG 。如本發明所用者，聚乙二醇意欲包括已 被闬來衍化其他蛋白質之任何形式的P E G ，例如，一 -(C α - C i 〇 )烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。 -42 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) •裝· 訂 線 565568 A7 B7 五、發明説明（ 如本發明所用者，MGDF係定義為包括本發明所述MGDF的 各種形式。例如，全長度或經截取者，糖基化或未糖基化 等形式的M G D F都包括在内。下面所列為要衍化的較佳 MG D F分子（於各例中，其編號都是根據圖Η的胺基酸編號 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 MGDF -1 胺 基 酸 22 -353 圖 11 MGDF-2 胺 基 酸 22 -195 圖 11 MGDF -4 胺 基 酸 22 -172 圖 11 MGDF -11 胺 基 酸 22 -184 圖 11 MGDF -12 胺 基 酸 22 -353 圖 11 MGDF -13 胺 基 酸 27 -195 圖 11 MGDF -14 胺 基 酸 27 -172 圖 11 MGDF -15 胺 基 酸 27 -184 圖 11 上 述 較佳 物 種 可 為 經 糖 基 化， 未 羥 糖 基 化 1 或 去 糖 基 化 等 者 > 最好 是 未 經 糖 基 化 它 。其 可 用 細 菌 ί 如 大 腸 捍 菌 ) 或 哺 乳動 物 ( 如 ί CH0 ) 細胞 等 經 重 姐 方 式 製 成 +D 下 面 所列 為 本 發 明 特 別 較 佳的 化 學 衍 化 分 子 小 組 ( 於 各 例 中 t 其為 有 經 由 Μ 基 或 基而 接 著 的 一 一 或 多 一 9 如 2- 4 個 PEG 部 份 體 ) 聚 乙 二醇 化 MGDF -1 1 聚 乙 二醇 化 MGDF -4 聚 乙 二醇 化 MGDF -2 一 般 ΙΤΠ a ί 化 學 衍 化 可 在 用以 使 生 物 活 性 物 質 與 活 化 聚 合 物 分 子進 行 反 應 之 任 何 適 當條 件 下 進 行 0 製 餚 聚 乙 二 §1 化 M G D F的方 法 概 括 地 包 含 下 列步 驟 ： (a ) 用 MGDF 多 呔 與 聚 -43 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 頁 裝 訂 565568
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 i'發明説明（） 乙二醇（例如P E G的反應性g旨或醛衍生物）在可使MG D F接 到〜或多個PEG基之條件下反應，及（b )取得該反應產物 °通常，醯基化反應所用的最佳反應條件係依個察根據已 知參數和所欲结果而定者。例如，P E G :蛋白質比例越大 ’則多一聚乙二醇化產物的百分比越大。 製備實質均一群的--聚合物/ M G D F蛋白質接合分子所 用之還原性烷基化通常包括下列步驟：（a)用MGDF蛋白質 與反應性PEG分子在還原性烷基化條件下反應，其中所用 pH值係適合於使該MGDF蛋白質胺基端的α —胺基發生選擇 性改質者；及（b)取得反應產物。 為了得到實質均一群的——聚合物/ M G D F蛋白質接合分 子，該還原性烷基化反應條件為可使水溶性聚合物部份體 選擇性地接著到M G D F Ν -端者。這種反應條件通常可提供 離胺酸胺基與Ν-端cx -胺基之間的pKa差異（PKa為50¾ 的胺基被質子化而另外50¾為否之pH值）。pH (直也會影響 '所用的聚合物/蛋白質比例。概括而言，若p Η愈低，則需 要用到較大超量的聚合物/蛋白質比冽（亦即，卜端α _ •胺基的反應性愈低*就需要愈多的聚合物Κ達到最適條件 )。若pH越高，就不需要這種大的聚合物：蛋白質比例（ 亦即，可得愈多反應性基時，就需要較少的聚合物分子） 。對本發明目的而言，該p Η通常係在3 - 9 ，較佳者3 - 6範 圍之内。 另一項重要的考慮為聚合物的分子量。通常，聚合物分 子量越高，可接到蛋白質的聚合物分子數目愈少3同樣地 ’在最適化彼等參數之時，也必須考慮聚合物的分支。.槪 -4 4 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填· 頁 -裝- 訂 線 565568 A 7 B7 五、發明説明（） 括而言，分子量越高（或分支越多），則聚合物：蛋白質 比例越高。一般而言，對於本發明所涵蓋的聚乙二醇化反 應，較適當的平均分子量為約2 k D a至約1 0 0 k D a ( ”約 ”一字代表土 1 kDa )。較佳的平均分子量為約5 kDa至 約5 0 k D a，特別較佳者為約1 2 k D a至約2 5 k D a。水溶性聚 合物對MG D F蛋白質的比例通常為1 : 1至1 0 0 : 1 ，較佳者（ 對於多一聚乙二醇化而言）為1 : 1至2 0 : 1及（：對於——聚 乙二醇化而言）1 : 1至5 ·· 1 。 使用上述條件時，還原性烷基化可使聚合物選擇性地接 著到N端具有〇(-胺基的任何MGDF蛋白質，且提供實質均 一的一聚合物/ MG D F蛋白質接合物之製備。”一聚合物/ MG D F蛋白質接合物”一詞在此係用以指含有單一個聚合物 分子接著到一個MG D F蛋白質分子之組成物。該一聚合物/ MG D F蛋白質接合物較佳者具有一個接到N -端而非離胺酸所 具胺基側基上之聚合物分子。該製備較佳者有大於90¾的 —聚合物/ MG D F蛋白質接合物，且更佳者有大於9 5 %的一 聚合物/ MG D F蛋白質接合物，其餘可觀測到的分子為未反 應者（亦即，沒有聚合物部份體的蛋白質）。下面的實施 例提供含有至少約9 0 % —聚合物/蛋白質接合物，和含 1 0 %未反應蛋白質之製備物。該一聚合物/蛋白質接合物 具有生物活性。 對於本發明還原性烷基化而言，該遷原劑必須是在水溶 液中具安定性者且較佳者為只能夠遷原在該遷原性烷基化 初始程序中形成的希夫（S c h i f f )酸。較佳的遷原劑為選 自硼氫化納，氡硼氫化納*二甲烷基硼烷，三甲胺基硼烷 -45 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 裝· 訂 經濟部智惡財產局員工消費合作社印製 565568 A7 __B7__ 五、發明説明（） 和吡啶硼烷等之中者。特别較佳的還原劑為氰硼氫化鈉。 其他反應參數，例如溶剤，反應時間，溫度等，及產物 純化手段，都可根據公開的有關用水溶性聚合物衍化蛋白 質之資料依個察分別決定（參看本文所引文獻）。範例細 節將在下面的實施例節段中說明。 可以選擇經由_基化及/或烷基化方法來製備聚合物/ 蛋白質接合分子，且本發明所提供的優點可以選擇混合物 所含一聚合物/蛋白質接合物比例。因此，必要時，可以 製備接著不同數目的聚合物分子之各種蛋白質的混合物（ 如，二一，三一，四一，等）並與用本發明方法製成的一 聚合物/蛋白質接合物組合在一起，而得具有預定比冽的 ——聚合物/蛋白質接合物。 下面的操作實施例演示化學改質MGDF之製備和經由_基 化與烷基化予以聚乙二醇化的M G D F之製備。因此，本發明 的其他部份係有關這些製備。 概括而言，經由給用本發明聚合物/ MG D F可以減緩或舒 解的病況包括上文有卩J MGDF分子通盤說明中提及者。不過 ，本發明揭示的聚合物/ MGDF分子比未衍化分子而言可具 有其他的活性，增加或減低的活性，或其他持性。 於本發明另一部份中，提出含有上述化學改質MGDF分子 的醫藥組合物。這種醫藥姐合物可含有本文所載有關未衍 化MGDF分子的任何成份。 隨著後續研究的進行，有關治療不同病人的不同病況所 需適當劑量水平之資料會陸續出現，且一般熟練工作者於 考慮接受者的治療情況，年齡和一般健康情形等，即可確 -4 6 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) -裝- 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 565568 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 定適當的劑量。概括而言，其劑量為0 . 0 1徹克/公斤體重 (只計算蛋白質的質量，未包括化學改質）至3 0 0徽克/ 公斤（同上）之間。較適當的劑量通常為5徵克/公斤體 重至100微克/公斤體重，特別較佳者為丨0徽克/公斤體 重至7 5微克/公斤體重。 本發明也提出製備MGDF (亦即，Mp 1配體）多肽或其活 性片段之方法。本發明的一種方法包括將㈣碼Mp 1配體多 肽的c D N A導到表現媒體中Μ製備成M p 1配體表現系统。用 該媒體轉染所選宿主細胞並予以培養。因此，本發明方法 包括培養適當的细胞或細胞系，其係用對於在已知調節序 列的控制下進行Μ ρ 1配體多肽的表現有編碼之D Ν Α序列轉 染過者。該等調節序列包括啟動區序列，终止區Η段及導 引/控制蛋白質在適當宿主細胞内的表現之其他適當序列 。然後從培養基（或若係在細胞内表現時，從細胞）Μ諸 於此技者所熟知的恰當手段收取，分離和純化表現出來的 因子。此外，美國專利第5，2 7 2 , 0 7 1號中揭示的方法也預 期可甩於本發明多核答酸/多肽。 適當的細胞或细胞系可為哺乳動物细胞，冽如田鼠卵巢 細胞（CH0 )或3Τ3細胞。適用哺乳動物宿主细胞的選擇及 轉化，培養，擴大，篩選和產物生產與纯化等方法都是技 藝中已知者ϋ參看，例如，G e t h丨n g a n d S a m b r ο 〇 k , Nature 293 : (320 - 62 5 (1981);或另外，Kaufman et a i ·，Μ o 1 · C e 1 1 B ί o 1 .，5 ( 7 ) : 1 7 Γ) 0 - 1 7 5 9 ( 1 9 8 5 )或 Η o w丨e y e t a 1 .,美國專利第4，4 1 9 , 4 4 6號。其他適用的哺 乳動物细胞糸為猴子C 0 S - 1和C 0 S - 7細胞系，及C V - 1細胞 -4 7 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) -裝· 訂 線 565568 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（） 条。其他典型哺乳動物宿主细胞包括靈長類細胞糸和齧齒 類細胞糸，包括經轉化細胞系在内。正常二倍體細胞，初 级姐織活體化（i π v丨t r 〇 )培養所ίίΐ生的细胞品糸^以及 原植物等也都適合所闬。候選细胞可為在選擇基因中有基 因型地缺乏者，或可含有顯性作用選擇基因者。其他適當 的哺乳動物細胞系包括但不限於H e L a，小鼠L - 9 2 9細胞， 衍生自瑞士 Balb-c或NIH小鼠的3T3系，BHK或HaK倉鼠 细胞糸等。 類似地可用為適合於本發明的宿主細胞者為細菌細胞。 例如，各種大腸桿菌品系（如，Η B 1 0 1 ，D Η 5 « ，D Η 1 Ο， 和MC 1 061等）皆為生物技術領域中所熟知的宿主细胞。另 夕卜，祜草桿菌d s u b t i 1 i s )，假單胞菌羈（ Pseudomonas s p p.) ，其他的桿菌屬(Bacillus s ρ ο ·) ，鏈M菌屬 （Strep t.om.vc^es s p p .) 等的各種品糸也可M 用於本發明方法中。 諸於此技者所知悉的多種酵母綑胞品系也可用為宿主细 胞以表現本發明的多肽。另外，於必要時，也可Μ用昆蟲 細胞作為本發明方法中的宿主細胞。參看，例如， Miller e t a 1 . , Genetic Engineering 8: 2 7 7 - 2 9 8 (1 9 8 6 )及其中所引參考文獻。 本發明也提出重姐分子或媒體以用於新類M p 1配體多呔 的表現方法中。這些媒體含有M p 1配體D N A序列且其單濁 地或與其他序列姐合地獨碼本發明M p 1配體多肽（有或無 信號肽者）或其活性片段。另外，摻合上述改質序列的媒 體也為本發明的實施例且可用於‘產生ΜΡ 1配體多肽：本發 ~ 4 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) .裝· 、1Τ 線 565568 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（） 明方法所用的媒體也含有經選擇的調節序列，其與編碼本 發明序列的D N A處於搡作締合狀態且能夠在所選宿主細胞 中導引其複製和表現。 有一媒體為P X Μ ，其特別適合於在C 0 S細胞中的表現〔 Y,C. Yang et al·, Cell 47:3-10 (1986)〕。另一種適 合於在哺乳動物細胞，如，CH0細胞之中的表現之媒體為 PEMC2B1 。本發明所述哺乳動物细胞表現媒體可用諸於此 技者所熟知的技術予Μ合成。諸媒體所含諸成份，洌如， 複製子，選擇基因，強化因子，啟動區等，都可得自天然 來源或用已知程序合成。參看，K a u f m a n e t a 1 . , J . Mol. B i ο 1 · 1 5 9 : 5 1 卜 5 2 1 ( 1 9 8 2 );和 K a u f m a η , P r o c· N a t 1 . A c a d . S c i . ϋ S A 8 2 : 6 8 9 - 6 9 3 ( 1 9 8 5 )。此外，媒體 DNA可包含全部或部份的牛乳頭狀瘤病毒基因組.〔U sky e t a 1 ·，C e 1丨3 6 : 3 9卜4 0 1 (1 9 8 4 )〕且可在细胞糸，如 C 1 2 7小鼠細胞等之内複製成穩定的附加體元素。這些媒體 轉染到適當的宿主細胞後可導致M p 1配體多肽的表現。 有眾多類型係技藝中已知用於哺乳動物，昆蟲，酵母， 真菌和细菌等的表現者之其他適當表現媒體也可Μ用於該 目的。 本發明方法和組合物所要治療的病況通常為包含既存的 巨核細胞/血小板缺乏或預期未來有巨核細胞/血小板缺 乏者（例如，因為已計畫的手術者）。彼等病況通常具活 體内活性Μ ρ 1配體缺乏（暫時性或永久性）的结果。血小 板缺乏的一般術語為血小板減少症，因此，本發明方法和 組合物概括地可用以治療血小板減少症。 -4 9 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁) •裝. 、1Τ 線 8 6 5 5 6 5 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五 A7 —__B7 發明説明（） 血小板減少症（：血小板缺乏）可因幾種原因而發生，包 括用各種藥物進行的化學治療和其他治療，放射治療，手 術’意外事故血液損失，與其他特殊的疾病情況等。包含 血小板減少症且可根據本發明予以治療的代表性特殊病況 有：再生不能性貧血，自發性血小板減少症，會導致血小 板減少症的轉移性腫瘤，糸統性紅斑狼瘡，脾腫大，方康 尼氏徵候群（F a n c ο n i S y n d r 〇 m e )，維生素B 1 2缺乏，葉 缺乏’梅—黑格林琦型（M a y - η e g g 1 ί n a η o m a 1 y )， W ί s k o 11 - A 1 d iM c h徵候群，和陣發性睡眠性血紅蛋白尿症 等。此外，對於A I D S的某些治療也會導致血小板減少症（ 如’ A Z T )。某些創傷癒合症也可能從血小板數目的增加 受益。 有關預期的血小板缺乏，例如，因未來的手術所致，可 K在需要血小板之前的幾天到幾小時，先服用本發明的 M p 1配體。對於緊急情況，如，意外事故和大量流血，可 Μ將該Μ ρ 1配體與血液或純化血小板一起给用。 本發明Μ ρ 1配體也可Μ用來刺激巨核细胞以外的某些细 胞類別，只要這種细胞係可表現Μ ρ 1受體者。與這種表現 Μρ 1受體的細胞相關聯，且其對ΜΡ丨配體的剌激有反應之 病況也在本發明範圍之内。 在本發明所提活性分析中本身不具活性的分子可在 活體外或活體内用為Μ ρ 1受體的調整劑（如，抑制劑或刺 激劑）。 本發明多狀可單獨使闬，或與其他細胞活性，可溶性 Μ ρ 1受體，造血因子，間白素，生長因子或抗體等狙合使 一 50 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用於上 綜上 療組合 其具治 為注射 用物質 一或多 組合物 的鹽水 適當賦 劑，稀 合物有 於各例 本發 組合物 所用治 式。這 性，安 治療 考慮可 括，例 染的嚴 曰劑量 體重。 本發 述病況 所述， 物。這 療效用 水，較 。典型 種生理 形式進 皆為代 形劑( 釋劑， T「i s 緩 中，可 明組合 可經靜 療姐合 種醫藥 定性等 上述病 能改變 如，病 重性* 要在0 . 的治療之中。 本發明的另一部 種組合物包含治 的片段，與醫藥 佳者，補充其他 者，MpI配體治 可接受的載劑， 行給藥。中性緩 表性適當載劑。 蔗糖） 起 和賦形劑等也可 衝劑，P Η 8 . 0和 更包含山梨糖醇 物可以非經腸地 脈内或皮下給藥 物可為無熱原， 可接受的蛋白質 而言，都是技藝 況的方法中所用 藥物作用的各種 人年齡，病況， 給藥時間和其他 1 - 1 0 0 0 徹克 Μ ρ 1 份為用 療有效 可接受 常給哺 療劑可 賦形劑 衝鹽水 較佳者 的冷凍 視需要 乙酸鹽 Μ治療上 量的Μρ 1 載劑。該 乳動物施 用由純化 ，或稀釋 或混合著 ，該產品 乾燥物。 加入。別 緩衝劑， 述病況的治 配體多狀或 載劑物質可 用的溶液所 蛋白質配合 劑所搆成的 血清白蛋白 係調配成與 其他標準載 的代表性組 pH 5.0 ，其 系统性给藥。另外，本發明 。以系统性給藥時，本發明 非經腸地可接受之水溶液形 溶液之製備，就其P Η，等滲 所及者。 劑量之道決定於主治醫師， 因素後決定之，彼等因素包 體重，性別和食物，任何感 臨床因素等 般而言，每 配體蛋白質或其片段/公斤 明治療方法，組合物和多肽等也可以用來，單獨地 51 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再
訂 565568 A7 _B7_ 1、發明説明（) 或與其他细胞活素，可溶性Μ p 1受體，造血因子，間白素 ，生長因子或抗體等配合而用於治療具有其他徵候及血小 板缺乏等特徵之病況。據預期者，Mp i配體分子經證明可 與一般造血性剌激劑，如I L - 3或G Μ - C D F等姐合而用以治療 某些形式的血小板減少症。其他巨核细胞剌激因子，如， m e g - C S F ，幹細胞因子（S C F )，白血症抑制因子（L I F )， 制瘤素Μ ( 0 S Μ )，或其他具有巨核細胞刺激活性的分子等 也可以與ΜΡ 1配體一起使用。可用於這種共同施藥的其他 代表性細胞活素或造血因子包括I L - 1 cx , I L - 1 /3 , IL - 2， IL-3， IL-4， IL-5， IL-6， IL-11 ，群落刺激因子-1 (CSF-1 )，CM-CSF，粒狀細胞群落刺激因子（G-CSF)， ΕΡΟ，千擾素-α ( IFN-α) ，IFN-θ ，或 IFN-7 等0 另 外，可Μ同時地或依次地陁用有效量的可溶性哺乳動物 Μ Ρ 1受體，其似乎具有使到達成熟形式的巨核细胞片斷成 血小板之效應。依此，施用Μ ρ 1配體（以增進成熟巨核细 胞的數目），接著施用可溶性Μ ρ 1受體（將配體抑活化並 使成熟巨核细胞產生血小板）預期可為特別有效的剌激血 小板產生之手段。上述劑量可經調整以補償治療姐合物中 的這種附加成份。被治療病人的進展可用傳统方法來監測 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填®^頁) 線 0 這些新穎多肽的其他用途在於開發用標準方法產生的抗 體。例如，包括可與本發明Μ Ρ 1配體反應的抗體及彼等抗 體的反應性Η段。彼等抗體可為多株，單株，重組，嵌合 型，單鏈及/或雙特定性等者。彼等抗體月段可為對本發 明Μ ρ 1配體具有反應性的任何Η段，例如，F a b · F a b .，等 -52 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 565568 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 。此外，本發明也提出雜交瘤，其係用Mp 1配體或其片段 作為抗原給所選哺乳動物，接著用已知技術將該動物的细 胞（如，脾細胞）與某些種癌細胞融合而產生永生化的細 胞系。本發明也包括產生這種細胞系所用的方法及對抗本 發明人類Mp 1配體多呔的全部或部份之抗體。 該抗，體可具有治療用途，例如抑制Mp丨§卩體與其受體的 結合等。該抗體更可用於活體内（i η ν i ν 〇 )和活體外（ ί n v i t r 〇 )診斷用途，例如，以標示形式偵檢體液中 M p 1配體之存在。 本發明提出下面的實施例Μ更完整地闡釋本發明。另外 ，這些實施例也提出本發明的較佳實施例，但除非另外指 示，否則，這些實施例並不意欲用以限制本發明的範圍。 下面實施例述及的許多程序所用標準方法，或適當的取代 程序，皆在廣被公認的分子生物學手冊中有所提及，例如 ，Sambrook et al·, ” Molecular Cloning.’，第 2 版， Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987)和 ίη Ausubel et al.,(編輯）"Current Protocols in Molecular Biology”， Greene associates/Wiley Interscience， New York (1990)等〕 實施例1 再牛不能件犬rfn骑 依下面文獻中所述，但以45 0雷得的全身照射施加於接 受者以製備經肝燐脂處理的犬再生不能性血漿（” A P K 9 ”） 或正常犬血漿（” H K 9 ” ）： -53 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 頁 裝 訂 線 565568 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 1· Mazur, Ε· and South, K. Σχρ. Hematol. 13:1164—1172 (1985) · 2· Arriaga, M., South, K., Cohen, J.L., and Mazur, E.M. Blood 69: 486-492 (1987) ·· 3. Mazur, Ew Basilico, D., Nevton,. J. L., Cohen, J.L., Charland, C., Sohl, P.A., and Narendran, A. BloodlS: 1771-1782 (1990). · . ’ 實施例2 人類巨核細贿！分析 分析A P K 9和分段A P K 9剌激從C D 3 4 ♦前身細胞的人類巨核 細胞i發展。經C D 3 4 -選過的細胞係依所述得自p圍血液、 細胞（Hokom, M.H·， Choi, E·, Nichol, J.L,， Hornkohl，A. , Arakawa, T. , and Hunt, P. Molecular Biology of Haematopoiesis 3:15-31, 1994 )並接注在 T®的培養基中·· Iscove's改質Dulbecco’s培養基、（ M+DM; GIBCO ，Grand Island, NY)，其中補充著 1¾榖胺 ϋ 胺 Pen-Strep (Irvine Scientific, Santa Ana, CA ) 和1 0 %肝燐素處理過，血小板貧乏性人類A B血漿。另外也 i 包含2 -氫硫基乙醇（1 0 - 4 Μ )，丙酮酸（1 1 0徽克/毫升 )，膽固醇（7 . 8微克/毫升），腺苷，鳥嘌呤，胞嘧啶 核苷，尿嘧啶核苷，胸腺嘧啶核苷，2 -去氧胞嘧啶，2 -去 氧腺0票呤，2 -去氧鳥ϋ票呤（各1 〇微克/毫升，S丨g m a )； 人類重組胰島素（1 0徽克/毫升），人類鐡傳遞蛋白( 3 0 0微克/毫升），大豆脂質（1 %，B 〇 e h · i n g e r -54 - ----------參-- (請先閱讀背面之注意事項再填H頁) 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ M a η n h e i m , I n d i a n a ρ ο 1 i s，I N ;人類重組驗性纖維母細 朐生長因子（2奈克（：n g ) /毫克，G e n z y m e， Cambr idge，MA);人類重組上皮细胞生長因子（15奈克 /毫升），血小板（衍生）生長因子（10奈克/毫升， Amgen， Inc·, Thousand Oaks, CA)。將 CD34-選擇細胞 置於2 X 105毫升培養基，15微升最後體積，的 Terasaki-型徽滴板（Vanguard, Inc·, Neptune, NJ ) 。將细胞置於3 7 °C，5 % C 0 2 /空氣的溼氣箱內，直接用 1 %戊二醛固定到培養洞，並接注單株抗體調合物（抗 請 先 閲 背 之 注 意 事 項 再
經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 - G Ρ I b ，抗-G Ρ I I b，( Carpinteria, C A )後 -/3 -半乳糖苷酶偵檢系 and Perry )展開免疫 率計數以藍色鑑別出來 細胞數/洞土平均值標 數據表成”巨核細胞單 的巨核細胞發育程度相 一化。一單位係定義成 核细胞數目所需物質量 (克溶性丨〇1受體）阻 配體者。 APK9係已被證明在該 菏的因子。CD34選擇细 略數目的藍色染色巨核 A Ρ K 9溫菏8天後，顯示
Biodesign )和抗-GPIb (Dako， 一起溫育8天。用鏈抗生物素蛋白 統(HistoMark ， Kirkegaard 反應。在逆相顯微鏡下以1 0 0 :<政大 的巨核细胞其结果表成平均巨核 準誤差（S E Μ )。於某些例子中，將 位/毫升”，其中係將某樣品誘導 對於該實驗的陽性ΑΡΚ9標準樣而歸 可導致與1微升A Ρ Κ 9標準樣相同巨 。若其可被5 - 1 0徽克/毫升Μ P L - X 斷時，其活性即被認可係來自Μ P L 系统中含有可刺激人類巨核细胞發 胞與1 0 % Ν Κ 9培育8天後，顯示可忽 細胞，而C D 3 4 -選擇細胞與1 0 % 非常大數目的藍色染色巨核细胞： -55 - 訂 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 圖2 顯示出 系統時可逐增 徽克/毫升時 刺激C D 3 4 -選 配體）交互作 且顯示A P K 9本 另外在此也 體活性存在於 IScove培養基 流出物）經收 物洗提到1 0毫 4-倍後，進行 之中時不發育 加到管柱的相 將逐增濃度的Mp 1 - X加到人類巨 地阻斷巨核細胞發育。於M p 1 - X ，即完全抑制。於該實驗中，係 擇細胞。其结果證明與Μρ卜X ( 用的活性對於人類巨核細胞發育 身含有Μ ρ 1配體。 證明對於人類巨核细胞發菏為必 A Ρ Κ 9中。將A Ρ Κ 9 ( 1 3 5毫升）稀 中，砲加到Μ ρ 1 - X親和管柱上。 集並濃縮到原體積後，才進行分 升的1 M Na C 1中，取2 0 %集液經 分析。C D 3 4 -選擇细胞單獨培育 成巨核細胞。與5 % A Ρ K 9 —起培 同集液）則發育成48 ± 8個巨核 核细胞培養 濃度大於5 用 5 % A Ρ K 9 假定的Μ ρ 1 係必需者， 需的Μ ρ丨配 釋6 -倍到 未結合物（ 析。將结合 透析並濃縮 在該培養基 育的細胞（ 细胞/洞。 請 先 閱 讀 背 ιέ 之 注 意 事 項 再 在10洞升 在胞 ο 細 胞核 細巨 核個 巨44 成土 育20 發1 會成 不展 胞發 細胞 的細 育的 培育 中培 物中 合液 结集 未提 % 洗 毫 \ 克 微 5 被 會 -ΚΗ 性 Ο 活制 的抑 者地 兩全 液完 集質 提簧 洗中 與析 物分 加該 施在 柱X 管1- 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 ή 苜； 人 鼠 老 將 m 鼠 老 度 長 全 將 例 施 實 內 -¾ 胞 細 鼠 老 到 染 轉 由« 1- 受 自 生 衍 有 含 到 殖 分 中tr中 體(S之 載 ◦系 現He胞 表VL细 之Ipa 關Kf^ — 己丨 兰口 員 g票f 錄ilfm ®ir-3 M SL- ι 可IJI R ^ 5 ^ ^ « 毒w培 病與洞 瘤物孔 肉成電 鼠構一 老該共 氏克丨 微 5 取 δ 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（） 純糸 23; Greenberger et al·， PNAS 80:2931-2936 (1 98 3 ))。將細胞培養五天後，從程序中回收，再置於含 有8〇〇微克/毫升〇0!10 1:丨(：丨1^(〇418,$丨811]3)和1奈克/ 毫升老鼠IL-3的選擇培養基中溫育。接著將存活細胞分成 2 X 1 0 5细胞庫並培養到長出可供進一步分析的群落為止 。取六份群落用多株兔子抗肽血清以FACS分析進行MpI受 體表面表現檢驗。選出一份群落用上述相同抗肽血清進行 F A C S揀選。經由在1 0 % A P K 9和G e n e t i c丨η中生長而選擇出 母細胞系的單细胞純系。在ΑΡΚ9中選擇35天後，將细胞保 持在1奈克/毫升老鼠I L - 3之中。用其中的一分殖：系， U6. 1 ，於該研究體中。 Β · 人類Μ d 1等鵲 將全長度人類Μ ρ 1受體序列（V丨g ο η , I . e t a 1 .， P N A S 8 9 : 5 6 4 0 - 5 6 4 4 ( 1 9 9 2 ))分殖到含有卜1 o 1 ο n e y 氏老鼠 肉瘤病毒轉錄啟動區的表現載體内（與老鼠受體相同的載 體）。取6微克該構成物和6微克的兼性營養逆轉錄酶病 毒包裝構成物（L a n d a u , N · R . , L i 11 m a n , D . R . , J . V i r o 1 o g y 6 6 : 5 1 1 0 - 5 1 1 3 ( 1 9 9 2 ))用 C a P 0 4 哺乳動物轉染 配套藥劑（S t「a t a g e n e )轉染到3 >: 1 0 Q 2 9 3细胞中。於 2天後及再度於4天後對相同的细胞重轉染。於最後轉染 後的當天，將該2 9 3細胞與I L - 3依賴性老鼠細胞糸（3 2 D ，纯系 23; Greenberger e t a 1 . , P H A S 80*2931-2936 (1 9 8 3 ))共同培養。於2 4小時後，在B S A梯度中分離出 3 2 D 細胞帶（P a t h - ο - c y t e ; M i 1 e s I n c .)。將該细胞於 1奈克/毫升老鼠IL-3中擴大，然後在20¾ APK9中選擇生 一 57 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再 -裝-
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 565568 A7 B7 五、發明説明（ 長。用多株兔子抗肽血清M F A C S進行該細胞的受體細胞表 面表現之揀選。所得細胞所隨後即用於分析中。 實施例4 1 A 6 . 1 M 1配鵂分析 將1A6.1细胞洗除IL-3培養物並在Terasaki-型微滴板 中於補充1 0 %胎牛血清（F C S ) ，G e n e t丨c丨η ( 8 0 0徽克/毫
升），和 11¾ p e n / s t「e p ( G i b c ο .)的 α Μ E Μ ( G i b c ο .)中以 1 : 1糸列試樣稀釋進行再平板培養（1 000細胞/ 1 5徽升總 體積/洞：）。於48小時後，用顯微術測定每洞的活细胞數 。一活性單位的定義於分析中加入5 - 1 0微克/毫升M p 1 - X 請 先 閱 背 面 之 注 意 事 項 再
即可完全阻斷時， Μ Ρ 1配體活性平均 漿。除非另外指出 析中定義者。 用人類Μ ρ 1受體 3 Β )基本上係以與 即視為係來自Μ ρ 1配體者。在A Ρ Κ 9中的 為4 4 0 0 ± 5 3 9單位/毫升再生不能性血 ，否則Mp 1配體活性單位係在1 A6 . 1分 基因感染過的細胞進行的分析（實施例 用1 A 6 . 1細胞者相同的方式進行。 實拖例5 鼠，狗，豬和人類莕夾源的再牛不能件血賠或命清中含 訂 Μ 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 有Μ P卜5卩騁之證明 Μ ρ 1配體存在於 血駿或血清中（表 雷得：）後之B D F 1小 證實有2 0 0 0單位/ 毫升）實質完全地 细胞分析中圼陽性 小鼠，犬，豬和人類來源的再生不能性 2 )。從預照射及12天的後照射（500 鼠採集血漿。以U6.1分析檢驗該血漿 毫升的活性，其可被Μ ρ 1 - X ( 1 0徹克/ 抑制。經照射小鼠的血漿也在人類巨核 ，顯示出有1 8 3 3單位/毫升之活性：從 ~ 5 8 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（） 預照射和1 0天後照射（450雷得）處理過的狗採取血槳。 於1 A6 . 1分析和人類巨核細胞分析中檢驗該血漿。兩分析 中都偵撿出活性且會被Mp 1 -X ( 10微克/毫升）完全抑制 。從預照射及10天後照射（650雷得）處理過的豬收集血 漿。於1 A6 . 1分析和人類巨核細胞分析中檢驗該血漿。於 兩分析中，都顯示出相當於犬再生不能性血漿中所發現的 Mp 1配體活性（可被1 0微克/毫升的Mp卜X所抑制）。取 得人類再生不能性血清。該物係從骨髓移植病人身上取得 者。將取自6個病人的血清K 1 A 6 . 1分析檢驗，顯不出 9 0 3單位/毫升之活性，其中有88¾係來自Mp 1配體（可 用10微克/毫升的Mp 1 -X予以抑制）。此外，也用取自 1 4個再生不能性病人的血清Μ人類巨核細胞分析檢驗之。 整體地，其顯示出實質的活性，9 1 4巨核細胞單位/毫升 ，其可被10微克/毫升的Mpl-Χ予以完全抑制。另外加入 小鼠I L - 3數據Μ顯示出1 A 6 . 1分析的特定性。雖然這種重 組細胞活性可誘導該细胞系的生長，但其不被1 0徹克/毫 升的Mp 1 - X所阻斷。 (請先閱讀背面之注意事項再本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 9 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 Α7 Β7 五、發明説明（ 物種 正常小鼠 再生不能性小鼠 1A6.1细胞分析 (层份/豪羿） 培巻基 + Md卜X 0+/-0 〇+/-〇 2000 〇 正常犬 0+/**0 〇+/-〇 再生不能性犬 4400+/-539 0+/-0 人類巨核妞胞分析 (巨楛钿朐Μ份/亳畀） 培巻基 ^Md 1 ~χ 〇+/-〇 〇+/-ο 1833 未實施 0+/-0 0+/-0 792+/- 12δ 0+"0 請 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再
頁 正常豬· 再生不能性豬 4 再生不能性人 nurIL3 0+/-0 / 0+/-0 903+/-64 0+/-0 0 0 0+/-0 114+/-33 0+/-0 0+/-1 18 + - 8 0/1 0+/-0 . 0+/-0 f 94W -178 0+Λ0 6000+/-565 6000+/-565 未實施 未實施 經濟部智惡財產局員工消費合作社印製 广 ^ 實施例6 Μ p 1 SP㈣刺澈1 Α β . 1湘_牛#及λ類巨柊Μ朐發裔 · ΜρΙ配體（於外源凝集素與親和層析術等程序後增濃至 少約1 0 0，0 0 0 -倍，參看實陁例7 )可剌激1 A 6 . 1細胞系的 生長和來自C D 3 4 -選擇過的周圍血球之人類巨核细胞發展 ，其涤劑量相關性方式者。圖2和3顯示出來自M p丨配體 的可反應出活性*因在雨分析中，其活性皆可被Μ Ρ卜X所 完全阻斷之故。 6 0 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印¾ 五、發明説明（ 此外，本案發明人也證明F A C S純化過的周圍血液C D 3 4 + 细胞在與M p 1配體一起培育（於此例中為1 0 0單位/毫升 ，9天）時，會發育成基因型地正常成熟巨核细胞。此即 確定純化Μ Ρ 1配體具有與粗A Ρ Κ 9相同的對巨核細胞之效應 。此外，本實驗使用的是經純化的C D 3 4 +细胞（1 0 0 % C D 3 4 + )，而非通常只含3 0 - 5 0 % C D 3 4 +的經C D 3 4 -選擇之 綑胞。 實施例7 犬Μ p丨SR騁之純仆 1 .槪沭 純化出對Μρ 1受體顯示出配體預期的活性之蛋白質（ 2 5 k d和3 1 k d )。從受照射犬的血漿以採用麥芽凝集素 ㈧G A )親和層析術，M p 1受體親和層析術，陰離子交換層 析術，膠濾層析術，和C4逆相層析術等的程序純化出蛋白 質：參看圖4有關該純化程序的綜覽。該2 5 k d和3 1 k d Μρ 1配體係經高度純化到表觀均一性且經測定為含有本文 所揭示的胺基酸序列者。 Ε .方法 A ·血發的澄清化 將得自被照射狗的冷凍血漿（總共2 0升）（參看實砲例 1 )在4 °C解凍隔夜；較大瓶子的解凍係在室溫起始數小 時後，才放在冷房内。以1 1 , Ο Ο Ο X g離心6小時脫除不溶 杓：用含有0 . 0 1 %疊氮化納的磷酸鹽緩衝鹽水，p Η 7 . 3 ( P B S /疊氮鹽）稀釋該血漿並以1 . 2微米濾器過滹。該澄 清化程序典型地導致起始物約2 -倍的稀釋。 61 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再
頁 訂 565568 A7 B7 五、發明説明（ B . 麥穿凝集素親和曆析衞 所有搡作都在4它下進行。將經澄清化的血漿（分成兩 批）加到已在P B S /疊氮鹽中平衡過的固定化麥芽凝集素 管柱（1升，10 X 12公分，E Y霣驗室）。於加上樣品後 ，用P B S /疊氮鹽從管柱洗出未结合物，接著用0 . 5 Μ N a C 1 / 2 0 m Μ T r i s - H C 1，ρ Η 8 洗提。然後，用 0 . 3 5 Μ Ν -乙 _ 基葡糖胺（G 1 c N A c ) ，0 . 5 Μ N a C 1，2 0 m Μ T r ί s - H C 1 ，pH 8洗提出被VGA管柱结合注的Mp 1配體活性。在預流 過或洗出液份中都不能偵檢出Mp 1配體活性。 C · Μ p 1 - X夸體親和層析衞 所用的可溶性老鼠Μ ρ 1受體（Μ ρ 1 - X ) ί糸對應於該Μ ρ 1 受體的整個細咆外域減去位置48 3的Τ>ρ (參看，V : go η， et al., 8：2607-2615 (1993))。為 了使 Μ p1 配體對
Mp 1 -X受體親和管柱的结合最適化，將WG A洗提集液用薄 膜超滹器（1 0 , 0 0 0分+量截止值，Y Μ - 1 0 ，A m丨c ο η )及砍 序稀釋調整到0 . 2 Μ的N a C 1予Μ濃縮。將_縮後的W G Α集 液以0 . 9毫升/分的流速拖加到2 0毫升m - M p 1 - X (老鼠 M p 1可溶性受體.）/ C N B r活化S e p h a r o s e管柱上（2 . 6 :< 4 . 2公分，1 . 5毫克m - M p卜X /毫升樹脂）。用4 0毫升 P B S /疊氮鹽Μ 1 . 5毫升/分洗該管柱，接著用1 0 m Μ T r i s - H C 1，1 Μ N a C 1，1 m M C H A P S，ρ Η 8 . 0 進行高 13 洗；ίΙ (4 0 5 毫升）。然後用 2 0 m M C A P S，1 Μ N a C 1，5 m Μ C H A P S，p Η 1 0 . 5洗提該管柱。收集適當的液份。於每一 液份加入T r i s Μ中和其p Η : ΜΡ1-Χ受體親和管柱的洗提曲線gSDS-PAGE和280nm 6 2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再 頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 565568 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 吸光度分析都顯示在1 -4液份有早期蛋白質尖峰，而主要 的Mp 1配體活性係在第5液份後洗提出者。 D · Μ ο η 〇 - Q陰雛子交換靥析術 將幾隻Μρ卜X受體親和管柱的最高純度洗提份合併，濃 縮並相對於2〇11^1>丨51(：卜5〇^(：[{計$，9^18.7透濾到 5 8. 5毫升的最後體積。Μ 280 n m吸光度估測集液的蛋白質 濃度為0 . 1 2毫克/毫升（約7毫克總蛋白質）。將該集液 以0 . 5毫升/分施加到已平衡在2 0 m Μ T r ί s - H C 1，5 m Μ CHAPS， pH 8·7之中的 Mono Q HR 5/5 管柱（Pharmacia )。於2 7分鐘期間，用在相同緩衝液中達到0 . 3 6 Μ N a C 1 的線形梯度洗提該管柱。然後用到0 . 54 M Na 1的（5分鐘梯 度洗該管柱，旦最後K 0 . 9 Μ N a C 1進行一步驟冼_。Μ 1 毫升洗提液份進行收集。 Mono Q管柱的洗提分佈顯示於預流液和洗滌液份中未偵 檢到Mp 1配體，而只偵險到可忽略的蛋白質。大部份的 Mp 1配體活性是在起始NaC 1梯度階段中的洗提液份5-7中 洗提出。在洗提份8 - 1 0覲察到活性”扃”，接著在洗提份 11 - 1 5出現第二個主要尖峰。 於活性洗提份中W SDS-PAGE (非還原性）觀察到一明顯 的25 kd帶。該帶的強度直接對應於洗提份中的Mp 1配體 活性。於洗提液份3和4中不含該帶（無活性）。於洗提 份5和6中有明顯活性（U 6 . 1活性峰）且在洗提份 1 1 - 1 4中有類似的強染色帶（1 A 6 . 1活性峰）。於洗提份 1 5和1 6的集液中有弱帶，其對應於洗提份1 6中的明顯較低 活性。 -63 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0>< 297公釐） 請 kj 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 看· 本 頁 565568 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） E · 凝穋洗提富驗 用Mono Q洗提份5和6或Mono G洗提份13和14的液份進 行凝膠洗提實驗。為這些實驗，製備洗提份5和6 (各6徽 升）或13和14 (各7.5微升）的集液，與SDS-PAGE樣品緩 衝液（非逼原性）混合後，加到12¾ SDS凝膠上。於電泳 完畢後，切出標的電泳道（1毫米）並用刮髮刀將該切條 切成小片。將該切片轉移到1 . 5毫升微離心管内，其内已 先裝著0 . 5毫升P B S / 5 m M C H A P S ，再於4 t下溫和ί«拌 隔夜。於第二天，稍微旋轉彼等管後，取出液份，再將該 樣品相對於補充BSA作為載體蛋白質的Iscove氏培養基進 行透滤。經透濾後的樣品即用於分析中。 其结果顯示出有兩個M p 1配體活性尖峰。一尖峰對應於 凝膠的25 kd區，而第二個Μρ 1配體活性尖峰則出現在 31 k d區内： F . Suoerdex 2 0 0 3絜；慮 將Mono Q陰離子交換管柱所得13M6洗提液份，及第二 Μ ο η 〇 Q分離所得雨個相同洗提液份等合併並用薄瞑超滹器 (C e n t「i c ο η - 1 0，A m i c ο η )予 Μ 濃縮。加入 S D S 到 0 . 1 % 的 最後濃度，並將該樣品注射到S υ ρ e「d e X 2 0 0 H R 1 0 / 3 0 (Ρ h a r m a c i a )管柱上。用0 . 3毫升/分流速將該管柱平衡 到 5 0 m Μ T「i s - H C 1，0 . 1 % S D S，p Η 7 . 5 之中，並在室溫下 操作。收集丨分鐘洗提液。其结果為樣品中的大部份蛋白 質係在洗提份3 2 - 40中洗提出，而在冼提份42 - 4 6偵檢到 Μ ρ 1配體活性。S D S - P A G Ε洗提份分析顯示在活性洗提份中 有明顯的25 kd帶。 -6 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 先 閲 讀 背 δ 之 注 意 事 項 再 %% 本 頁 565568 A7 B7 五、發明説明（） 提份4 3 - 4 6 crocon-10 1 X 100 毫 上。將該管 衝液B為0 . 分鐘期間實 施Μ到7 5 % 4 2的純化结 顯的Μ ρ 1配 凝膠上，於 單一 3 1 k d 合併液或單 ，A m i c ο η .) 米C 4逆相徵 柱平衡在0 . 0 3 5 ¾ TFA/ _ 到 4 5 % B B的線形梯 果表Si圖5 體活性尖峰 非這原與遷 帶；洗提份 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再
G . C4逆向 HPLC 將 Superdex 200洗 42用薄膜超瀘器（Mi 濃縮集液分別施加到 SynChropak RP-4 ) 中（緩衝液A );緩 注射樣品之後* 4 接著，於40分鐘期間 75徽升/分。洗提份 份2 1 _ 2 3中觀察到明 份在14¾聚丙烯醯胺 分析。洗提份2 1含有 寬2 5 k d帶；而洗提份2 2同時含2 5 k d和3 1 。未看到其他明顯的帶。要提及者，早期凝 認為兩區都有Mp 1配體活性。於非遷原性凝 份都觀察到小的高分子量帶，但在選原性凝 到。 Η · 2 5 k d和：Π k d Μ ρ 1配㈣的Ν -端序 獨的洗提份 予Μ濃縮。將 孔洞管柱（ 04¾ TFA / 水 80名乙睛。於 的線形梯度， 度ρ其流速為 中。在其洗提 。用這些洗提 原兩種條件下 2 3含有一單一 k d兩區的帶 膠洗提實驗已 膠的所有洗提 膠中則未能看 列分析 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 。d 析相犬，低 祈 k 分帶的如減 分25列質列冽步 列於序雜序，一 序應，小量驟進 端對丨述少步量 N-了 X 所兩化的 行除90中該純質 進。少 G 出一雑 上文至面示另量 份前的上顯用少 _ 提於量與後陁此二65 洗列總係之以這 · LC已品其對可使 HP都樣 ί 比 ，， Ρ-列加列列時驟 卩序所序序要步 C4的為量知必濾 的出 ί 少已。膠 性測列個與鏈 一 活質序兩 。k 另 有白要到和 ， 含蛋主檢者鏈者 在些的偵含重佳 這帶另结 U 較 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 Α7 Β7 五、發明説明（ 圖6數據 的活性係實 帶的混合物 液份予K稀 激1 A 6 . 1細 23 ， 6000细
Mp 1 -X 起 的敏感性， 種结果顯示 性的M p 1配 Η ρ 1 id C 4純彳h洗提份中M d 1配髑活件之bh較 顯示C 4 R Ρ - Η P L C層析步驟所得i先提汾2 2和2 3中 質地相等的。洗提份2 2含有2 5 k d和3 1 k d兩 ，而洗提份2 3只含有2 5 k d帶。取各洗提份的 釋1 : 45 00 0 。稀釋後的洗提份實質地同樣可剌 胞生長（洗提份22，5 40 0细胞/洞；洗提份 胞/洞）。將稀釋後的洗提份與逐增濃度的 溫育。該等洗提份對Mp 1-X的抑制作用有同等 兩者都含被7 -1 . 4微克/毫升所完全阻斷。這 每一洗提份中的活性蛋白質為具有同等生物活 體物種。 實施例8 晉霉相對於其他闵孑對巨核湘朐發裔之hh較 請 先 閱 讀 背 ί 事 項 再 頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 有許多重組因子或有機化合物，例如大 酸乙酸酯（PMA)等據報導會影響巨核细朐 此，乃研究這些因子對於C D 3 4 -選擇周圍 培養物中依所示加入人類重姐間白素3 ( /毫升），幹细胞因子（S C F ，5 0奈克/ 6 ( IL - 6，2 5奈克/毫升），促紅血球生 單位/毫升），白血病抑制因子（L I F ， ，和粒狀細胞-巨噬細胞群落-剌激因子 克/毫升，Amgen, Inc.);間白素11 ( / 毫升，R + D 系統，M i η n e a ρ ο 1 i s , Μ N ) 豆蔻酸乙酸酯（Ρ M A ，1 0 — 1。Μ，S i g m a ) 6 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 戟二萜醇肉豆蔻 生長或發育。因 血球的影響。於 IL-3 ， 1-2 奈克 毫升），間白素 成素（ΕΡ0 ， 1 1 0奈克/毫升） (GM-CSF ， 25奈 IL-11 ， 25奈克 ，大戟二萜醇肉 等。Μ ρ丨配體的 565568 A7 B7 五、發明説明（ 毫升，APK9的用量 試驗的因子係以個 後，將细胞直接固 況）或計數總細胞 均值土 SEM 。 M p 1配體都可導致 巨核细胞發展，尤 ，或Ε Ρ 0等，於單 都很少影響。Ρ Μ A 自相同實驗的數據 (C e 1 1 υ 1 a r i t y )) 而I L - 3和S C F具有 大影響。用圖7和 比，如圖9中所示 細胞百分比的因子 用量為275單位/ 位/毫升）。組合 使用。於培養8天 細胞（η = 6洞每狀 )。數據係表為平 圖7顯示i\ Ρ Κ 9和 /洞。I L - 3也導致 時。IL-6，IL- 1 1 ，對巨核細胞數目 少影響。圖8為來 细胞數（”细胞率” 細胞率影響很少， I L - 3組合時具有最 洞的巨核細胞百分 每培養洞最大巨核 為5太（相當於2 2 0單 別試驗時的相同濃度 定在洞中並染色巨核 數目（η = 3洞每狀況 最大數目的巨核细胞 其是與S C F組合使用 獨時或與I L - 3姐合時 ，L I F 和 G Μ - C S F 都很 ，顯示出每洞所得總 。A Ρ Κ 9和Μ ρ 1配體對 中等影響。S C F與 8所示數據來計算每 者。顯然地，可導致 為Μρ 1配體一 ΑΡΚ9中 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再
頁 1 丁 出 示 顯 果 结 ·· 種 這 ο 份 成 性 活 。 的性 定 特 的 胞 细 核 巨 對 體 配 類 人 ¾ 件 9 活 传谁 施促 實咆 細 核 巨 的 S,. 配 狃 .齡| 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 .激但 刺， 可份 時成 物的 充基 補養 的培 基該 養是 培不 述？ 所IL 2 然 例雖 實 0 為發 用的 在胞 由1.3田 έ··· 配核 1巨 ΜΡ類 人 平誘 水| 低體 之¾ 得 1 溯MP 能及 不涉 K 不 仍亦 中？ 漿IL 血 ’ 類在 人存 常其 正在 含使 所即 基， 養過 培不 該 ： 在在 其存 升位 毫單 \ 胞 克細 奈核 2 巨 ο ') ο 中,9 之14 10致 圖導 於可 示中 點析 此分 ο 胞 中细 之核 成巨 生類 朐人 细在 核？ 巨IL 導的 7 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ /毫升之活性。此活性會被抗-I L - 3 ( 3 . 3微克/毫升； G e n z y m e，C a m b rM d g e，Μ A )抑制 9 7 :¾ : 8 2 0 3 巨核細胞單位 /毫升的Mp 1配體不會被抗-I L - 3所沛制。 實施例1 0 Μ Η ρ 1 5己f暮：^ 0丰斤 I · ‘槪沭 具有Mp 1配體活性的受照射豬血漿所得蛋白質經VG A親 和層析術，Mp 1受體親和層析術，離子交換層析術和C4.逆 相HPLC等予Μ鑑定。該活性也經由從SDS-聚丙烯_胺凝膠 的切條洗提出來進行鑑定。 註釋 加4 . 4 X 1 0 6單位 回收3 . 4 X 1 0 s單位 5担加2 . 7 X 1 0 6單位 回收2 , 4 X 1 0 6單位 _加2.4 X 10s單位 回收4 . 4 X 1 0 s單位 於洗提份2 3 - 2 5回收到活性 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再
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層析術 W G Α親和管柱 Μ ρ 1受體管柱 Μ ο η 〇 Q離子交換 pH 6.0 C 4逆相Η P L C 驗 實 提 洗 膠 在 現 出 1 其 性 活 兩 出 別 區 顯 明 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 8 --! ϋ 幺||> 另 8 2 約 在 11類 例人 實體 配 猜 巽 之 法 ·· 作 法萌 作潠 種件 兩表 出代 述種 概 面Μ 下
自」AJ A 生 產 之 頭 8 6 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 . A7 B7 五、發明説明（ 根據犬蛋白質的胺基端序列設計許多簡併性PCR引物。 用不同的引物配對從人類基因體DNA擴大該MGDF基因。在 用有義引物 5· GCN CCN CCN GCN TGY GA 3· (SEQ ID N0:4)，其編碼犬蛋白質的前五個胺基酸（SEQID N0:1 ) & 反義引物：5· GCA RTG YAA CAC· RTG NGA RTC 3 1 ( S E Q ID N 0：5)，其編碼 S E Q ID N 0:1 的胺基酸 1 6 至 2 1，進行4 0涸擴大循環之後，將P C R產物於2 . 0 %瓊脂糖凝 膠上於TBE緩衝液中洗提。 從瓊脂糖凝膠切出6 3 b p帶並用相同的引物組再擴大。 將該P C R產物選殖在P C R I I載體中（：I n v i t r 〇 g e n , S a η Diego)。經由DNA序列分析篩選出眾多純系：使用編碼類 似於4 M G D F蛋白質的呔之質體D N A作為起源以產#用以蒒 選c D N A庫的放射性探頭。該基因所編碼的胺基酸序列如下 所示：
Ala-Pro-Pro-Ala-Cys-Asp-Leu-Arg-Val-Leu-Ser-Lys-Leu-Leu- Arg-Asp-Ser-His-Val-Leu-His (SEQ ID NO: 6)‘、 广 ‘用含有人類MGDF的瓊脂糖帶M熱PCR產生該探頭。典型 的1 0 0微升P C R反應含有下列成份。 請 kj 閲ik 背 面 之 注
I %% 本 頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
模板D N A 5·引物（SEQ ID NO : 4) 3 ’ 引物（SEQ ID NO : 5 ) 10 X緩衝液 d A T P ( 0 · 1 m Μ ) 2-3 ,α 1 1 u 1 , 20 p m ο 1 e s
1 u 1 1 20 p m ο I e s 10 u I 2 “1 -69 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ dTTP (10 in M ) 2 u dGTP (10 m M ) 2 “ dCTP (0 · 1 mM) 2 u dCTP ,p3 2 (1 0 u C / u 1 ) 5 a dATP ,P3 2 (1 0 u C / u 1 ) 5 u T a q DNA 聚合酶 0 . 5 y丨，2 . 5單位 7[<_ 77 u 總體積 擴大反應條件如下所列： 起始加熱 冷卻配對 擴展 變性 100 u
9 4 °0 5 3 °C 7 2 T； 9 4〇C 2分鐘 30秒 3 0秒 30秒 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 經濟部智慧財產局p貝工消費合作社印製 在 P e r k i η Ε 1 m e r G e n e A m p S y s t e m 9 6 0 0 中進行 4 0 個擴大循 ταχι m ° · 將產物通過一推進管柱（S t r a t a g e η e , S a η D i e g ο ): 取1微升的探頭置於閃爍計數器内計數。於雜交混合物中 加入含有1至3百萬計數/毫升之探頭。 Β · 胎肝庫之檨成 人類胎肝聚Α+ RN Α係購自Cion tech實驗室。用約4微克 的R N A進行c D N A合成，其中係用接著到含有X b a I部位的 寡核苷酸之無規六體物，5 ’ G A T C G C G T T C T A G A N N N N NNT 3 ’， （SEQ ID NO : 7 )進行引發。 70 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 使用G i b c 〇 - B R L程序來產生雙股c D N A :，將E c 〇 R I - B s t X I轉ί安子（Invitrogen, San Diego )連接到雙股 cDN A，接著用限制酵素，xba I .，消化。在S500 Sephacryl 管柱（Life Technologies, Inc.)上進行 c D N A的尺寸選擇。將大於4 0 0 b p的c D N A連接到已用E c ο RI和Xba I消化過的哺乳動物表現載體vl9.8 ( Martin, F · , C e 1 1 6 3 : 2 0 3 - 2 1 1 ( 1 9 9 0 ))。將勝任的大腸桿菌 D Η 1 0細胞轉化並將所得c D H A庫分派成各為1 〇 〇，〇 〇 〇 c D N A的 7個庫。 C · 舖撰人產 從Cion tech購得在人gtll中的人類胎腎庫，效價為650 百萬P f u /毫升。用p c R產生的探頭（參看上文）篩選約 2百萬個菌斑。於5 6 °C下，在6 X S S C , 5 X D e n h a r d t， 〇· 1¾ SDS，100徽克/毫升，單股鮭精DNA之中進行雜交 1 5小時。 進行多次篩選。從單一菌斑擴大D N /\並用編碼S E Q I D N 0 : 6中胺基酸7至1 3的内引物5 ’ A G T T T A C T G A G G A C T 000&003’（5£(310丨丨0:8)進行雑交以鑑定真正的正樣。 D · cD ΝΑ端的3 ’快涑墉十（RACE ) 人類胎fe·和胎肝的聚腺甘酸化R N A係購自C 1 ο n t e c h 取 1 微克的 RNA 用寡5’ TTC GGC CGG ΑΤΑ GGC CTT TTT TTT TTT TTT 3· (DEQ ID N0:9)作為引物進行逆轉錄3 用 Gibco-BRL cDNA合成配套藥劑（Life Technologies I n c ·，C a t · it 1 8 2 6 7 - 0 1 3 )產生第一股c ο N A。最後體積為 3 0緻升。添加5 0 0 m Μ E D T A到1 0 m M最後濃度以停止該反 71 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 請 先 閲 讀 背 5
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頁 訂 565568 A7 _B7 五、發明説明（） 應並保持在-2 Ο Ό。 對於初始P C R ，每反應係用Ο . 5微升的c D N Μ乍為模板。 用引體SEQ ID Ν0:9和競爭物寡5’ TTC GGC CGG ΑΤΑ 引物，而用編碼S E Q I D〖1 0 : 6所含胺基酸5到11的寡核苷 酸 5， TGC GAC CTC CGA GTC CTC AG 3， （SEQ ID ΝΟ:11) 作為有義引物。用前述程序：9 4't起始培育2分鐘後，在 94 °0，30秒；65t ，30秒；7 2°C ，30秒；進行40個擴大循 環。使用 Perkin Elmer GeneAmp System 9600進行該擴大 Ο 用有義引物，編碼S E Q I D Ν 0 : 6所含胺基酸8到1 4的 5* GAG TCC TCA GTA AAC TGC TTC GT 3' (SEQ ID N 0 : 1 2 )，而用S E Q I D N 0 : 9和S E Q I D N 0 : 1 0作為反義引物 進行重疊。進行4 0個擴大循環，其中冷卻配對係在6 5它下 實施。在0 · 8 %瓊脂糖凝膠上進行該P C R產物的分離，並在 U V光下照相。可看到在0 . 8至1 . 2 k b附近有分離帶：、 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 然後將PCR產物選殖到載體PCR II (Invitrogen)之中 。挑選出個別群落並用Q ί a g e η配套藥劑c a t til 2 1 4 3和 1 2 1 45分離質體。用載體引物完成雙股染料引發的序列分 析。使用各種類型的G C G $欠體分析該序列。 E · 5 _和3 ’弓丨物伸展 為了分離出全長度MG D F基因的序列，乃用不同的胎肝庫 姐合作為模板進行3 ’和5 ·引物伸展。對於c D NA 5 ·引物的 擴大，係從每一组合各取約20奈克的cDNA作為模板：使用 對MGDF具特定性，編碼SEQ ID N0 :6所含胺基酸12至17的 -72 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 一 565568 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ____B7_五、發明説明（） 反義引物5’ GGA GTC ACG AAG CAG TTT AC 3· (SEQ ID N0:13 )與 5’載體 vl9.8 有義引物 5· CCT TTA CTT CTA GGC CTG 3· (SEQ ID N0:14)。進行30個擴大循環，其中 冷卻配對係在5 3 °C實施。用編碼S E Q I D N 0 : 6所含胺基酸 1 至 6 的反義引物 5’ GAG GTC i\C/\ AGC AGG AGG A 3’ (S E Q I D N 0 : 1 5 )和載體引物S E Q I D N 0 : 1 4進行3 0個重疊 循環。 對於M G D F c D N/\ s 3 ’端的引物伸展，係使用反義載體引 物 5’ GGC ΑΤΑ GTC CGG GAC GTC 3· (SEQ ID N0:16 )與 對M G D F具特定性，編碼S E Q I D N 0 : (5所含胺基酸1至6的 引物 5’ TCC TCC TGC TTG TGA CCT C 3’ （SEQ ID N0:17 )。進行3 0個擴大循環，其中冷卻配對係在5 8 °C實施。 用丨彳00「引物$£(310川：12和載體引物$£010卜丨0:16進行 30個循環的重璧擴大。特定性帶出現於組合編號1 ，7和 8中，將其選殖於P C R I I載體内。從單一群落純化所得質 體D N A再經純化並分析出序列。 F · 伞#庠人類M G D F純系之_ iL離 有許多起始純系缺乏M fi D F胺基端的一部份，係因使用部 份的MGDF序列進行引發和重疊之故。用依上述5 ·引物伸展 實驗得到的序列一引物5’ CCA GGA AGG ATT CAG GGG A 3 · ( S E Q I D N 0 : 1 8 )作為有義引物用載體引物S E Q I D N 0 : 1 6作為反義引物。進行3 5個循環的擴大，其中冷卻配 對係在58它下進行。接著，使用對MGDF具特定性，含有 Sal I 部位的引物 5· CAA CAA GTC GAC CGC CAG CCA GAC ACC CCG 3， （SEQ ID H0:19)與載體引物（SEQ ID -73 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再本頁)
、1T 線 565568 Α7 Β7 五、發明説明（ Η 0 : 1 5 )進行3 5個循環的重疊。將所得P C R產物選殖於 PCR I I載體中並定其序列。 1 .第二個代弄袢撰硝作用 ή . 女M G f) F Ν -端c D Ν Α之撰猜 根據前面節段中所述犬MGDF N-端胺基酸序列設計簡併 性寡核苷酸引物並用於聚合酶鏈型反應（P C R s )中作為引物 Μ擴大編碼MGDF的cDNA序列。用犬品M Chomzynsk ί和 S a c c h 丨的異硫氰酸胍法（Β 丨 o c h e m · 1 6 2 : 1 5 Γ) - 1 5 9 ( 1 9 8 7 ) )製備總R N A 。用隨機引物一轉接子5 ’ G G C C G G A T A G G C C A C T C N N N N N hT T 3 ’ （ S E Q I D N 0 : 2 0 ) Μ Μ ο M U L V 逆轉 錄酶製餚第一股cDNA並作為模版用於後續PCRs中。 P C R係在0 . 5徽升，約5 0奈克的c D N A上進行，其中使用 編碼S E Q I D N 0 : 1所含胺基酸卜6的有義股引物—引物A 5· GCN CCN CCN GCN TGY GA 3’ （SEQ ID N0:4)，及引物 B 5 * GCA R T G HAG N A C R T G N G A R T C 3 f (S E Q ID N 0：5) 或引物C 5’ GCA RTG YAA NAC RTG NGA RTC 3’ （SEQ ID N 0 : 2 1 ).，其為編碼S E Q I D N 0 : 1所含胺基酸1 6 - 2 1的反 義股引物，其在5 ’端有加上三個額外的核¥酸以增加冷卻 配對安定性。用Taq聚合酶的PCR係進行35至45個循環， 直到在瓊脂糖凝膠電泳分析上有明顯產物帶為止。對於前 面兩個P C R循環，其冷卻配對步驟係在3 7 t下進行2分鐘 ;對於其餘的循環，係在50 t下冷卻配對1分鐘。於每次 反應中都觀察到多重產物帶。用巴斯德氐吸管尖端收集包 含具有大硌預期尺寸（.6 15 b p )的帶之凝膠部份竝用相同的 引物配對再擴大。根據製造商的說明將D N A產物選殖到載 -7 4 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再
頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 565568 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 體P C R I I ( I η V ί t r 〇 g e η )之内。定出三純糸序列並發現其 係在一讀碼内，編碼預期的犬M G D F c D N A ，殘基1 - 2 1。於 這種方式得到獨特的犬M G D F c D N A序列，其跨越密碼子6 的第三核苷酸到密碼子1 5的第三個核苷酸。用這些純系之 一作為模板以製備經標示的犬MGDF cDN/\探頭。 B · 人類眙肝c D N A廑之構成 用人胎肝（International Instif」te for the A d v a n c e m e n t o f M e d i c i 〜」·，E x t ο η , P A )經由將姐纈溶裂 於5 . 5 M硫氮酸胍中並以C s T F A ( P h a r m a c i a )離心純化而 分離出R N A 。用寡（d T ) 2 5 d y n a b e a d s選擇出聚腺脊酸化 R N A ( D y n a 1，根據製造商的說明）。用該R N A Μ供c D N A合 成用的S u p e r s c r丨p t質體系統（L i f e T e c h η o 1 o g丨e s , I n c .)製備雙股c D N A，但不同處在於使用不同的聯结子轉 接子：5 ’ T T G G T G T G C A C T T G T G 3 ’ （ S E Q I D N 0 ·· 2 2 )和 5 * C A C A A G T G C A C A CCA ACC C C 31 (S E Q ID H 0 ： 2 3 )- 於尺寸選擇之後，將該cDNA取向地嵌到哺乳動物表琨載體 P B C B的B s t X I和N 〇 t I部位（p B C B (系衍生自質體R c / C Μ V ， I n v i t r o g e η，其含有p u c 1 9主鏈，C Μ V啟動區和B G Η聚腺 ΐί酸化部位）。將連接後的D Ν Α電嵌入到電勝任性细菌株 10 B ( Life Technologies, Inc.)之中 c' C · 人眙肝c D N A篩潠M G D F 將人胎肝庫的濾器複製體於64t_下與故射標示犬MGDF N-端cDNA PCR產物雜交18小時（5 X SSPE，2 X D e n h a r d t. · s，0 . 0 5 % 焦磷酸納，0 . 5 % S D S，1 0 0 微克 / 毫 升酵母t R N A溶解產物和1 0 0微克/毫升的變性鞋精D N A ) -75 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再
填·ιί響裝 頁I 訂 565568 A7 B7 經濟部智惡財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 。將濾器置於e4°C下，5 X SSPE，0 , 5¾ SDS之中洗P並靜 置隔夜。分離出雜交到該探頭的兩種不同純糸並分析之。 D · 人類M G D F c D N A純集之羌琨 將從M G D F c D N A純系所純化出的D N A轉染到2 9 3 E B N A細 胞（I n v it r 〇 g e η )內。用1 · 5微克的D N A與7 · 5微升的 Lipofectamine ( Life Technologies, Inc.)在 100 徽 升無血清DMEM中混合。在室溫下溫育20分鐘後，將該 D N A - L i p 〇 f e c t a m i n e 混合物加到 4 0 0 徽升 D Μ E Μ，1 % 血清（ F e t a 1 C 1 ο η e I I )中達5 χ 1 0 5细胞/洞（2 4洞正方形 G「e丨n e r培養板）並在3 7 培育6小時。將5 0 0徽升的 D Μ E Μ，2 0 :¾血清（F e t a 1 C 1 ο n e I I )加到細胞上。1 6小時 之後，吸取出培養基並加入5 0 0徽升的D Μ E Μ，1 S血清（ Fetal Clone Π) 。7 2小時後，收集調理過的培養基並離 心通過0 . 22徽米旋轉蒸發：·分析該調理培養基所含MGDF生 物活性。 I .人類M G [) F純系的榀i朮和活件 根據上·述選殖程序，得到圖1 1 ( MGDF-1和MGDF-2 ; SEQ I D N 0 : 2 4，2 5 ;和 2 6，2 7 )與圖 1 2 ( M G D F - 3 ; S E Q I D Ν 0 : 2 8 ，2 9 )所示的人類c D Ν Α純糸。圖中所示這些序列各含一胺基酸卜2 1的推定信號序列，所Μ，各情況中，成熟 蛋白質係從胺基酸2 2開始的。 用上面實施例4 Α所述細胞基分析以M G D F 1 - 3進行活性分 祈之结果列於下面的表3和4中。於表3中，用各搆成物 轉染過的2 9 3 Ε Β Ν Α細胞，在2天培養後收集其調理培養基 ，並在 1 A (3 . 1 細胞（3 2 D / m ii r - Μ P L + ) + / - 1 0 徹克 / 毫升 -76 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 之 注 意 項 再 訂 565568 A7 B7 五、發明説明（ mur-MPL-X之上進行試驗。於表4中，用各搆成物轉染過 的2 9 3 EBN A細胞，在4天培養後，收集其調理培養基並在 3 2 D / m u「- Μ P L '细胞（實施例 3 A )和 3 2 D / h u - Μ P L + 细胞（：實 砲例3Β)之上試驗，可Μ看出，人類MGDF-1和MGDF-2對於 表現老鼠和人類兩種形式的Μ ρ 1之細胞：系都有活性，而 MGDF-3則無。表現人類ΜΡ丨受體的細胞糸對S:丨人類 M G D F - 1和M G D F - 2的反應性大於表現老鼠Μ ρ 1受體的细胞系 之反應性。 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 表3 U/m 1 (-m u r - Μ P L - X ) U/m 1 (tniu r - Η Ρ L X ) 經濟部智^財產局員工消費合作社印製 培養基 0 0 PBC0 (對 照 質 體） 0 0 M G D F - 1 12,800 800 MGDF-1 ( 重 複 ) 12,800 5 6 6 M G D F - 2 4 5 2 5 400 MGDF-2 f 重 複 ) 1 2 8 0 0 1131 M G D F - 3 0 0 MGDF-3 ( 重 複 .) 0 0 APK9對照 4400+/-400 0 表 4 U / m 1 3 2 D / m u r - Μ Ρ I, + -7 7 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 Α7 Β7 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 、發明説明（） M G D F - 1 1600 25,600 M G D F - 2 6400 50,000 MG DF-2 (重複） 6 40 0 50,000-100,000 下面的表5顯示出人類MGDF-1和MGDF-2對32D/hu-MPL + 细胞（實施例38)的活性會被可溶性人類丨仆1受體（ h u - Μ P L - X )所實質完全地抑制。H u - Μ P L - X係存在於從產生 該蛋白質的CHO細胞收集到的調理培養基內。該CHO h u - Μ P L - X調理培養基係經濃縮1 2 0 -倍後，再加到培養物内 ，濃度為6 . 6 %。從對照組C Η 0培養物收集到的調理培養基 對分析沒有影響。該分析係依簧施例4Β所示進行，不同處 在於係在3天後才評估存活细胞。 Η G D F - 1 M G D F - 2 表 5 U /毫升 H u - Η P L - X ) 530 270 U /毫升 + H - Μ P 丨，X ) 0 人頷巨核钿朐分析 M G D F - 1和M G D F - 2都可誘導周圍血液C D 3 4 -選擇细朐形成 巨核細胞，但M G D F - 3則否：表6中所述賞驗基本上是依實 陁冽2中所述者進行，不同處在於該周圍血球係羥C D 3 4 -選擇過但未洗淨者且該培養物係在7天後收取者。從每種 2 9 3 E B N A M G D F構成物所得調理培養基係以2 0 %最後體積 78 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 頁 565568 Α7 Β7 五、發明説明（ + / - 3 0徽克/毫升m II r - Μ P L - X之條件使用 Μ 6 $最後體積使用。 A Ρ Κ 9對照樣係 表 6 巨核细 胞/洞 巨核 細胞/洞 純条 (-m υ r - MPL-X) (+ m u r - Μ P L - X ) 載體對照樣 0 0 A P K 9對照樣 100 +/- 3 0 MGDF- 1 142+/- 48 17 2 HGDF-2 100+/- 3 6 2 M G D F - 2重複 86 +/- 10 0 M G D F - 3 2七卜 2 0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 實陁例1 2 下面的實施例說明1 2種不同的聚乙二§f化M G D F分子， P E G 9 - P E G 1 2和P E G 1 4 - P E G 2 1 ，之合成。於各例中，被聚乙 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 二醇化的M G D F分子為大腸桿菌衍生的M G D F - 1 1 (從信號肽 開始編號時為胺基酸2 2 - 1 8 4 ;從成熟蛋白質開始編號時為 胺基酸卜1 6 3 )。下面的表7 - 1 0摘要出有關全部這些聚乙 二_化物.種的細節。 12.1 用活化M e P E G衍牛物_化M G D F而製ig多-M e P E G -M G D F接合物 *huh ”ί··: 多- M e P E G ( 2 0 k D a ) - M G D F 接合物（P E G 1 1 )之製爆 將冷卻過（4 t )的M G D F ( 2 · 5毫克/毫升）/ Ο . 1 Μ Β I C I Ν Ε緩衝液，ρ Η 8之溶液加到1 Ο -倍莫耳超量的固體 79 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 565568 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7B7_五、發明説明（） MePEG 丁二隨亞胺基丙酸 _ (MW 20 kDa) (Shearwater Polymers, Inc.)之中。溫和攪拌M溶解該聚合物並在室 溫下繼續進行反應。 於反應過程中的蛋白質改質程度係用粒度排斥（s E c ) Η P L C予以監測’其係te用S u p e r d e x 2 0 0 H R 1 0 / 3 0管柱（ Pharmacia Biotech ) ， Μ〇·ι M 磷酸納緩衝液pH 6.9, 流速0 . 7毫升/分進行的。 在3 0分鐘時點進行反應混合物的s E c η p l c分析時顯示反 應混合物中未留下自由蛋白質。於該時點，加入無菌水使 反應混合物中的蛋白質濃度減低到1毫克/毫升並用數滴 0 · 5 Μ乙酸將混合物的ρ Η值調整到4 。 然後用 S P S e p h a r 〇 s e Η P ( p h a r m a c i a B i 〇 t e c h )離子交 換樹脂丨y、離子交換層析術從過刺的Me PEG和其他反應副產 物中分離出MePEG-MGDF接合物。 將反應混合物加到（2 · 5毫克/毫升樹脂）管柱上，用 3個管柱體積的起始緩衝液A (: 2 0 m M 5¾酸納，p Η 7 . 2 , 1 5 %甘油·）洗提出未反應的M e P E G 。之後，用1 〇個管柱體 積，0¾至30¾终端緩衝液B (1 M NaCl/緩衝液A)的線形 梯度洗提出M e P E G - M G D F接合物。於2 8 0 n m監測洗提液。將 含有多-MePEG-MGDF接合物的洗提液合併，濃縮並無濾過 灌° 將該純化過的多-MePEG-MGDF接合物用TSK-GEL G4000SWXL和G2000SWXL兩串接在一起的膠滹管柱進行 S E C Η P L C分析。Μ 2 8 0 n m的U V吸光度偵檢蛋白質。甩 BI0-RAD膠濾標準品作為球形蛋白質分子量標誌物。 -8 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 從圖1 7 A可Μ看出，S E C Η P L C顯露出製備物中有兩個主 要成份（約呈2比1比例），其洗提位置分別對應於 3 7 0 . 9 k D a和1 5 5 . 0 k D a球形蛋白質-I亦參看下面的表8 0 用Μ W = 6 - 5 0 k D a的M e P E G S之丁二_亞胺基醋進行M G D F藤 化製備成的接合物P E G 9 ，P E G 1 0和P E G 1 2也是Μ類似方 式進行。表7摘列出這些製備所用的主要反應參數。 表8列出這些接合物的S E C Η P L C分析结果： 12.2 用M e P F： G薛將M G D F澴原件烷基化製備多-Μ e P F： G -M G D F接合物 多-M e P R G ( 2 0 k D a 卜 M G D F 接合物（P F G 2 0 )之製 ί§ 於經冷卻（4 °C )，撥拌中的MG D F ( 2毫升，2 · 5毫克 / 毫升）/ 1 0 0 in Μ 磷酸納，p Η 5 / 2 0 m Μ N a C N B Η 3 溶液中 加入10-倍莫耳過量的一甲氧基一聚乙二醇醛（Me PEG ) (平均分子量20 kDa )並將反應混合物置於相同溫度下繼 績撥拌。 於反應過程中的蛋白質改質程度係用S E C Η P L C監測者， 其中使用Superdex 200 HR 10/30 管柱（Pharmacia B i o t e c h ) ，Μ 0 . 1 Μ _ 酸納緩衝液 p H R · 9，0 . 7 毫升 / 分流速進行洗提。 於1 6小時後，S E C Η P L C分析顯示有起始量9 0 % Μ上的蛋 白質被改質。此時，用無菌水稀釋反應潖合物使反應混合 物中的蛋白質濃度成為1毫克/毫升並將其pH值調整到4 (0 · 5 Μ 乙酸）。 用 S P S e p h a r 〇 s e Η P ( P h a r m a c i a B i 〇 t e c h )離子交換樹 8 1 一 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐） 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 業· 頁 565568 A7 B7 五、發明説明（ 脂Μ離子交換層析術從刺餘的MePEG和其他反應副產物ψ 分離出M e P E G - M G D F接合物。 將反應混合物施加到管柱上（2 · 5毫克/毫升樹脂} @ 用3個管柱體積的起始緩衝液A (20 m Μ磷酸納，pH 7· ^ ’ 1 5 %甘油·）洗提出未反應Me P E G 。之後，用1 0個管柱 ,0$至30¾終端緩衝液B (1 M KaCl /緩衝液A)的線形# 度洗提出M e P E G - M G D F接合物。於2 8 0 η οι監測洗提液。.將$ 有多-Me PEG-MGDF接合物的洗提液合併，濃縮及無菌過_ T S Κ - G E L G 4 0 0 0 S W X L 和 G 2 0 0 0 S W X L 膠濾 -MePEG-MGDF接合物進行SEC HPLC分析 光度偵檢蛋白質。用B I 0 - R A D膠濾標準 分子量標誌物。 出，SEC HP L.C揭露出該製備物中有兩種 全量的5 2 %和4 7 % )，其洗提位置分別對 1 5 9 · 3 k D a球形蛋白質。亦參看表8 。 M W = 6 - 2 5 k D a 的 M e P E G 醛進行 M G D F 的還 得接合物Ρ Ε G 1 δ，Ρ Ε G 1 9和Ρ Ε G 2 1。表 所用的主要反應參數。 合物的S E C Η P L C分析结果。 12.3 接著部位存Ν -端σ -胺基8$的一甲氯某一聚7.二醇 -M G I) F榇合物之製儲 一 -Μ e P F： G ( 2 0 k [) a ) - M G D F 接合物（P E G 1 Γ))之製潜 於經冷卻（4 ，提拌中的MGDF ( 2毫升，2 · 5毫克 /毫升）/ 1 0 0 m Μ磷酸納，P Η 5 / 2 0 m Μ丨丨a C hT B Η 3溶液中 -82 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 請 先 閱 % 背 Sr 之 注 意 事 存
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用串接在一起的 管柱對經純化的多 。Μ 2 8 0 n m U V 吸 品作為球形蛋白質 從圖1 7 B可以看 主要成份（分別佔 應於3 5 9 . 4 k D a和 Μ類似·方式，用 原性烷基化而製備 7摘列出這些製餚 表8列出這些接 565568 A7 B7 五、發明説明（） 加入5 -倍莫耳超量的一甲氧基—聚乙醇醛（M e P E G )(平 均分子量20 kDa)並於相同溫度下繼續攪拌反應混合物。 於反應過程中的蛋白質改質程度係用SEC HP LC監測者， 其中使用 Superdex 200 HR 10/30 管柱（Pharmacia Β ί o t e c h )，以0 · 1 Μ碟酸納緩衝液p Η 6 . 9，0 . 7毫升/ 分流速進行洗提。 於1 6小時後，S E C Η P L C分析顯示有起始量9 0 %以上的蛋 白質被改質。此時，用無菌水稀釋反應混合物使反應混合 物中的蛋白質濃度減低到1毫克/毫升並將反應混合物的 Ρ Η值調整到4 (: 0 · 5 Μ乙酸）。 用 SP Sepharose HP (Pharmacia Biotech)離子交換樹 脂Μ離子交換層析術從刺餘的“PEG和其他反應副產物中 分離出M e P E G - M G D F接合物。 將反應混合物砲加到管柱上（2 , 5毫克/毫升樹脂）並 用3個管柱體積的起始猨衝液A ( 2 0 in Μ 酸納，ρ Η 7 . 2， 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 5 %甘油）洗提出未反應的M e P E G 。之後，用2 0個管柱體 積，0 %至2 5 %的終端緩衝液B ( 1 Μ N a C 1 /緩衝液A )線形 梯度洗提出M e P E G - M G D F接合物。於2 8 0 n m監測洗提液。將 含有多-M e P E G - M G D F接合物的洗提液合ί并，濃縮及無濾過 濾° 用4 - 2 0 %預澆鑄梯度凝膠（Ν 0 V Ε X ) Μ十二烷基硫酸鈉聚 丙烯磕胺凝膠電泳法測定一 -MePEG-MGDF接合物之均一性 :顯示出一個對應於46.9 k Da蛋白質位置的主要帶。 用串接在一起的TSK-GEL G4000SVXL和G2000SWXL膠滹 -83 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 管柱對經純化的多-MePEG-MGDF接合物進行SEC HPLC分析 。以280 nm UV吸光度偵檢蛋白質。用BIO-RAD膠濾標準 品作為球形蛋白質分子量標誌物。 從圖17C可Μ看出，SEC HPLC揭露出該製《物中有一個 主要成份，其洗提位置對應於181.1 kDa球形蛋白質。亦 參看表9 c
K類似方式，用MW = 6-25 kDa的MePEG醛進行MGDF的還 原性烷基化而製備得一 -MePEG-MGDF接合物PEG 14，PEG 1 5和P E G 1 7 :、表7摘列出這些製備所用主要反應參數。 表9列出這些接合物的S E C Η P L C分析结果。 訂 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 4 8 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製
565568 A7 B7 五、發明説明（） 表 8 S E C Η P L C鑑定多- M e P E G - M G D F特性摘要 編碼 反應性 M e P E G 表觀M W b y 成 份量， SEC, k D a :¾ PEG 9 NHS 6k Da 87 . 9 7 5 52.7 25 ( s h o u 1 d e r ) PEG 10 NHS 6k Da 69.2 1 4 ( s h o u 1 d e r ) 西§ 42，9 8 6 PEG 11 NHS 20kDa 3 7 0.9 6 8 15 5.0 32 PEG 12 NHS 5 0 k D a 8 6 5.6 53 3 R 8 . 0 4 7 PEG 18 醛 6k Da 8 4.6 6 0 4 1.5 40 PEG 19 11 12kDa 218.4 5 9 10R . 7 41 ί全 i ο 2 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 :全 i 1—_ 2 2 0 k D a 3 5 9.4 52 1 5 9 · 3 47 2 5 k D a 450 . 5 54 218.4 4 6 _ 8 6 一
本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 表 M e P E G - M G D F接合物的表觀分子 _碼 反應性 M e P E G 表觀MW b y SEC , kDa 表觀MW by SDS PAGE.kDa 類別 MU PEG 14 6 kDa 4 4.5 27 . 7 PEG 1 5 12kDa 104.7 38 . 3 巳E G」—6 20kDa 181.1 4R . 9 PUL 2 5 k D a 2 2 6.4 5 5 . 5 12.4 用 甲氢某聚 (乙二醇 )H# M G D F il 原件烷 基ih而： 二 MePRG(12 kDa)- M G D F接合物 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 馬 本 頁 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 子‘:： ;亦即， 複數使其分子 加到保持在5 衍生物， 混合1 0分鐘後 在反應混合物 下述程序導致本文稱之為PEG 22的純化分 將5 -倍過量的甲氧基聚乙二醇醛（M e P E G Ο Η Ο ( C Η 2 ) 2 Ο - ( C Η 2 - C Η 2 Ο ) n - C Η 3 ;式中 η :重 量約為 12 kDa.) (Shearwater Polymers ) t下的2 . 5毫克/毫升MG D F溶液（大腸桿菌 1-163) /100 mM 乙酸納，pH 5.0 之中。方 $ ，加入足量的氰硼氫化納（A 1 d r ί c h )使其 內達到2 0 m Μ濃度。 將該混合物置於約5 t下撥拌1 6小時。於該時間结束時 ，加入足量的純化水，U S P ，使M G D F濃度成為1毫克/毫 升。將其濾過0.2微米真空濾器。以這種方式製得90毫克 -87 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 565568 Α7 Β7 五、發明説明（） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 的反應產物3於該反應產物混合物中加入少量的1 . Ο Μ -鹼 價磷酸鹽和1 Ν氫氧化鈉等溶液使其達到1 0 m Μ磷酸馥， Ρ Η 6 . 8溶液。 將該接合物在陽離子交換管柱上純化。製備具有7 . 5公 分床高的40毫升S Ρ - S e ρ h a「〇 s e高性能管柱。用平衡緩衝液 (1 0 m Μ隣酸鹽，p Η 6 . 9，含1 5 %甘油）平衡該管柱。Μ 0 . 1 5管柱體積（C V )/分鐘的速率裝填管柱到2 . 2毫克/ 毫升樹脂。接著用平衡緩衝液洗到基線。用1 0個管柱體積 的緩衝液A ( 2 0 in Μ δ舜酸ϋ，ρ Η 7 . 2，含1 5 %甘油）到緩衝 液Β (緩衝液Α加0.3 M NaCl)線形梯度洗提該管柱。流 速都保持在前後皆為0 . 1 5 C V /分。於2 8 0 η πι監測洗提液 0 KSDS-PAGE凝膠分析洗提份，將含[HPEG接合物的洗提 份合併再濾過0 . 2微米單元。 賞施例1 3 聚乙二醇ih M G D F分孑的牛物活件 A . P E G「9 - P E G 1 2 和 P E G - 1 4 - P E G _ 2 1 經濟部智¾財產局員工消費合作社印製 測量用重組人類MG D F處理過的小鼠之血小板計數，其结 果列於圖1 δ中。將上圖說明所示濃度的未聚乙二醇化C Η 0 —衍生2 2 - 3 5 3 (空心菱形），未聚乙二醇化的大腸桿菌 2 2 - 1 8 4 (空心圓）和——聚乙二醇化的大腸桿菌2 2 - 1 8 4 ( 實心圓）等經皮下注射到正常Balb/c小鼠内，每天一次， 注射5天。本實驗所用的聚乙二醇化M G D F為P E G 1 6 (亦即 ，2 0 k d的——聚乙二醇化M G D F 2 2 - 1 8 4 (画1 )，係產生 自大腸捍菌者）。於最後一次注射的2 4小時後，從尾部靜 _ 8 8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 565568 . A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 脈的小側切口採集試驗血液°用S y s in e X霄子血球分析儀（ Baxter Diagnostics, Inc. Irvine, CA )進行血知分析 。數據係表成4隻動物的測定平均值+ / -平均值的標準偏 差。其他血球參數，例如，總白血球計數或紅血球計數等 不受這種處理所影響。 其他形式的重組人類M G D F亦如上述進行檢驗。下面的表 1 0列出用5 0歡克/公斤/天或1 〇微克/公斤/天的所示形 式之7 - H u M G D F處理過的小鼠之血小板計數：數據4隻動 物的平均值，其標準誤差Μ斜體表示。 表 10 50舒克/公斤/妥 舒克/公斤/夭 形弍 *. 孚均倌 孚诌信 CH〇 22-353 4343 309 . 2571 80 E. coli 22-184 2021 29 1439 18 PEG 9 2728 56 2369 P，£G10 2431 291 1556 126 REG 11 3778 59 1861 73 PEG 12 3885 155 1740 88' PEG 14 3567 80 2020 63 PEG 15 4 402 57 2834 99 PEG 16 4511 239 3215 11 PEG 17 4140 188 3113 2 61 PEG 18 4586 59 2931 129 PEG 19 3980 • 330 4189 80 PEG 20 3942 285 3054 33S PEG 21 4195 145 4002 91 -^ 1 939 25 -89 一
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（） 表1 0言宇角军 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於下面所列中，被聚乙二醇化的MG D F分子為大腸桿菌衍 生的MGDF-11 (從信號肽開始編碼時的胺基酸2 2 - 1 8 4，或 為従成熟蛋白質開始編號的胺基酸卜163 )，如前面實砲 洌1 2中所述者。
名稱 聚 乙二醇化 P E G平均 合成用的反® P E G分孑 PEG 9 多 聚乙二醇化 6 kDa M e P E Γ;的 N H S 詣 PEG 10 多 聚乙二醇化 6 kDa M e P E G 的 N H S 詣 PEG 11 多 聚乙二§1化 2 0 k D a M e P E G 的 N H S 詣 PEG 12 多 聚乙二醇化 50kDa M e P E G 的 N H S 詣 PEG 14 一 -聚乙 二醇化 6 kDa MePEGsl PEG 15 一 -聚乙 二醇化 12kDa M e P E G 11 PEG 16 一 -聚乙 二醇化 2 0 k D a M e P E G PEG 17 — -聚乙 二醇化 25kDa M e P E G 5i PEG 18 多 -聚乙 二醇化 6 kDa M e P E G m PEG 19 多 -聚乙 二醇化 12kDa MePEGsl PEG 20 -聚乙 二醇化 20kDa M e P E G 證 P E G 2 1 多 -聚乙 二醇化 25kDa M e P E G 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 基線計數為沒有狍用任何物質的正常動物所得值。 顯然地，重組人類MG D F的聚乙二醇化對於該分子增加接 -90 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 Α7 Β7 五、發明説明（ 受動物的血小板計數之能力沒有不良 使大腸桿菌產物2 2 - 1 8 4的活性增高到 子的活性同大或較大。 Β · PEG-22 圖24列出PEG-22所得结果。值得注 小板計數的正常化對全長度C Η 0衍生 P E G - 1 7等都較早數天即發生。 實陁例1 4 重钼人類MG 1) F 「1 - 1 β 3 1 #大腸桿Μ中的表琨 影響，且事實上可能 與C Η 0 -衍生2 2 - 3 5 3分 意者，P E G - 2 2所得血 MGDF，PEG-16或 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 填 本 頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 要在大腸桿菌内表現7 -HuMGDF時，要將編 質前1 6 3個胺基酸的序列用最佳的大腸桿菌密 學合成。此外，在基因的5 ’端加入編碼胺基酸 和離胺基-的D N A序列。如此，該序列所編碼 -H u M G D F蛋白質長度為從M e t - L y s開始的1 6 5 7 - H u M G D F ( 1 - 1 6 3 )基因的合成分幾個步驟 ，甩最佳的大腸桿菌密碼子化學合成表出基因 互補寡核苷酸（長度6 0 - 7 0 b p )。於該合成期 基因的5 ’端加上甲硫胺酸和離胺酸兩胺基酸的 基因的厂端放置一停止密碼子。此外，分別在 5 3 ’端加上供限制酵素X b a I和H i n d I I I用的 且在起始甲硫胺酸上游適當距離處加上一合成 部位。第二，將各基因Η段的互補寡核苷酸予 第三，用聚合酶鏈型反應擴大這些個別合成 第四，然後將經擴大的Η段分殖到適當載體内 定分殖片段的序列。第六，將個別Η段連接在 9 1 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 碼成熟蛋白 碼子予Μ化 一甲硫胺酸 的7 個胺基酸。 完成。第一 接合片段的 間，在成熟 密碼子而在 基因的極 切斷部位， 核楗體结合 以冷卻配對 基因片段。 :第五，確 一起並再分 565568 A7 B7 五、發明説明（） 殖到適當載體內，重新搆成全長度7 - H u M G D F ( 1 - 1 6 3 )基 因。最後，確認重搆成基因的序列。 在！Γ和3 '兩端分別側接Xb a I和Η ί η (Γ I I I限制部位的合 成7 - H u M G D F基因Η段含有核糖體结合部位，A T G起始密 碼子，編碼成熟M e t L y s 7 - H u M G D F蛋白質的序列，及停 止密碼子。 將上述片段選殖到乳糖誘導性表現載體PAMG11的Xba I 和H i n d I I I兩部位。該p A M G 1 1載體為具有p R 1 0 0 -衍生複製 源的低複本數質體。表現質體PAMG 11可Κ從質體 PCFM1656 (ATCC ft 69576，1994年 2 月 24 日登錄）經由 PCR重疊寡突變形成製造一系列部位導向鹼基變化而衍生 成。從緊接到質體複製啟動區PcopB的：Γ之Bg I I I部位（ 質體bp 180 )開始且向質體複製基因進展，其鹼對變動 如下： 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再
頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 565568 • A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
五、發明説明（） oAMGII bo # # 204 # 428 # 509 # 617 # 679 ? 980 # 994 # 1004 # 1007 # 1028 # 1047 *#117 8 # 1466 # 2028 ? 2187 # 2480 ? 2499-2502 A 2642 I t 3435 '· i 3446 i 3643 ? 4489-4512
pCFHlp56 中的 bp T/A A/T G/C G/C T/A G/C A/T C/G A/T C/G G/C G/C G/C C/G A/T
改變成pAHGll中的bp C/G * G/C A/T 嵌入兩倨G/C bp T/A C/G A/T C/G T/A T/A T/A T/A T/A bp酹除 T/A r T/A
AGTG TCAC
GTCA CAGT
TCCGAGC AGGCTCG bp削除
G/C G/C A/T
A/T A/T T/A
嵌入 ·. bps GAGCTCACTAGTGTCGACCTGCAG CTCGAGTGATCACAGCTGGACGTC (SEQ ID NOS: 30 和 31 -93 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 . A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ 且將獨特的Aatll和CUI兩限制部位之間的DNA序列用下 示寡核苷酸予以取代：
Aatll (#4358) 51 CTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAAATTCTT- 3 1 TGCAGAGTATTAAA^JiTTTTTTAAGTAAACTGTTTACGATTTTAAGAA- -GATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTAT 3 ^ -CTAATTATAAGAGTTAACACTCGCGAGTGTTAAATAGC 5' Clal (·#4438) (SEQ ID N〇S: 32 和 33) 選殖到p A M G 1 1内的7 - H u M G D F之表現係由具有下示序列 的合S乳糖誘導性啟動區，如，P s 4 ，所驅動者/ 5 1 GACGTCTCATAATTTTTAAAAAATTCATTTGACAAATGCTAAA-- -ATTCTTGATTAATATTCTCAATTGTGAGCGCTCACAATTTATCGAT 3 '. (SEQ ID NO: 34 ) ‘、 广 該P S 4敗動區會被大腸桿菌1 a c I基因的產物，乳糖阻遏物 (L a c I )所阻遏。 · 接著將P A M G 1卜7 - Η u M G D F質體轉形到含有1 a c I "等位基 因的大腸桿菌K - 1 2品系中。U c I q等位基因為1 a c I啟動區 内的一突變，其可增加La c I的表現，且導致P s 4啟動區的 蛋白質表現之更嚴緊控制。所Μ，在該品系中，於沒有乳 糖之情況中，7 - H u M G D F的表現會被L a c I所阻遏。S)添加 乳糖後，L a c I蛋白質對P s 4啟動區上的操縱基因（ 94 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再
填赢I 粟 頁I 訂 565568 A7 B7 五、發明説明（） ο P e r a t 〇 r )部位之结合會減低，因而起始從P s 4的7 - HuMGDF之轉錄。本實_例所用大腸桿菌宿主细胞係在 1994年11月30日登錄為ATCC ti 69717者。 用PAMG1卜7 -HitMGDF質體轉形該大腸桿菌宿主ATCC tf 6 97 1 7並根據下列醱酵說明予以生長。將大腸桿菌品系接 種到U r i a肉湯中，然後在3 0°C下培育約1 2小時：接著將 該細胞無菌地轉移到裝著批料培養基（20克/升酵母萃取 物；3 . 4克/升檸檬；1 5克/升Κ 2 Η P 0 4 ; 1 5毫升D 〇 w Ρ2000 ; 5 克 / 升葡萄糖；1 克 / 升 MgS〇4.7H2〇; 5.5 毫 升/升微量金屬，5 . 5毫升/升的維生素）的醱酵器内。 該程序的批次相繼續到培養物在6 0 0 n m的光密度為5 . 0 士 1 . 0為止。然後用第一進料培養基（7 0 0克/升葡萄糖； 6 . 7 5克/升卜U S 0 4 . 7 Η 2 0 )起始而開始進料一批次相：於每 —確定時程中每隔2小時調整進料速率。當培養物在6 0 0 n m的光密度到達2 0 — 2 5時，即開始第二進料培養基（1 2 9 克/升胰蛋白誨脾；2 5 8克/升酵母萃取物）的起始。將 第二進料培養基保持在固定流速，而第一進料培養基則要 繼續調整。於整個醱酵過程中的溫度都保持在約3 0 t下。 該培養物於需要時，添加酸或鹼以維持在約P Η 7。經由調 整醱酵器内的提動及空氣輸入速率和氧氣輸入速率以維持 所需的溶氧水平。當培養物在6 0 0 n m的光密度到達5 7 - (5 3 時，起始第三進料培養基的添加。K固定流速將第三進料 培養基（3 0 0克/升乳糖）導到醱酵器内；中斷第一進料 培養基的添加並將第二進料培養基的流速改成新的固定速 率。於第三進料培養基起始添加後，持續醱酵1 0小時。於 -95 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 565568 Α7 Β7 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 醱酵结束時，將培養物冷卻到1 5 ± 5 °C。離心收取细胞。 將所得細胞糊包裝後，貯存在< -60 t。 依上文所述在大腸桿菌中生產的重组MGDF，其純化係依 下文所述進行。將1 8 0 0克的細胞糊懸浮在約1 8升的1 0 m Μ EDTA中，並Μ 1 5 , 0 00 ps ί通過高壓勻化器。將破裂的細胞 懸浮液離心並將沉著九再懸浮於1 0升的1 0 tn Μ E D Τ Α中。離 心該懸浮液並將2 0 0克的沉著丸溶解在2升的1 0 m Μ Τ「i s，8 Μ 脈氫氯化物，1 0 m M D Τ Τ ，5 m Μ E D T A ，ρ Η 8 . 7之中。將該溶液慢慢地稀釋到2 0 0升的1 0 m Μ C A Ρ S， 3 Μ腺，3 0 %甘油，3 m Μ胱胺，1 m Μ光胱胺酸，ρ Η 1 0 · 5 之中。 在室溫下，將稀釋溶液慢慢攪拌1 6小時後，將ρ Η值調整 到6 . 8 。將已調整ρ Η的溶液澄清化後，加到已用1 0 m Μ磷 酸納，1 . 5 Μ腺，1 . 5 %甘油，ρ Η 6 . 8平衡過的2升C Μ S e p h a r 〇 s e管柱上。於加完後，用1 0 m Μ碟酸納，1 5 %甘 油，Ρ Η 7 . 2洗該管柱。然後，用0至0 . 5 Μ氯化納梯度， 1 0 m Μ磷酸納，ρ Η 7 . 2洗提M G D F。 經濟部智慧財產局3(工消費合作社印製 將C Μ洗提液濃縮後，用1 0 , 0 0 0分子量截止率的薄膜與 1 0 m Μ磷酸納，ρ Η 6 . 5進行緩衝液交換。對所得濃度約2 毫克/毫升的濃縮溶液用组織蛋白_C在周溫下處理90分 鐘（5 0 0比1莫耳比）： 然後將該溶液加到已用1 0 mM隣酸納，1 5 %甘油，p Η 7 . 2平衡過的1 . 2升S Ρ高性能S e p h a r u s e管柱上。加完後 ，用0 . 1至0 . 2 5 Μ氯化鈉梯度，1 0 m Μ磷酸納，p Η 7 . 2洗 提出M G D F。 _ 96 -· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 於S P高性能管柱的洗提液中加入硫酸銨至0 . 6 Μ 。將洗 提液加到已用1 0 m Μ磷酸納，0 . 6 Μ硫酸銨，ρ Η 7 . 2平衞 過的1 . 6升P h e n y 1 Τ 〇 y ο p e a r 1管柱上。用0 . 6至Ο Μ硫酸 鞍梯度，1 Ο m Μ磷酸納，ρ Η 7 . 2洗提出Μ G D F尖峰。 將該P h e n y 1 T o y o p e a r 1洗提液濃縮並用1 Ο , Ο Ο 0分子量截 止薄膜進行緩衝液交換至10 mM T>is，5%山梨楗醇，pH 7 . 5之中。 實陁例1 5 7 - H u M G D F ( t腸稈Μ )的活驛内牛物件質 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再
頁 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用依上面實砲例14所述製 -1 6 3 )進行老鼠體内的生 量的7 -HuMGDF皮 得的7 物效能 下注射 克/公 時，用 計數。 板計數 /公斤 白血球 影響。 斤/夭 小板並 處理動 區別者 的敏感 消除與 -97 - -HuMGDF (大腸桿菌 評估。於五個連續天内 到正常的雄B a 1 b / c小鼠 斤/天到1500徽克/公 電子血球4數器（ 结果觀察到隨著细胞活< 有線型增加3在該糸统 /天時增加到基線值的 或紅血球等的計數，或 7 -Hu M G D F (大腸捍菌 評估其對應於ADP的凝 物的血小板與取自對照 ，其中兩组群對於血小 性： 化學治療a /或辐射相 K逐增劑 體内。所 斤/天ϋ S y s m e X , 素濃度對 中，血小 300% 。其 血球容積 從皮下 1-163 ) 集能力。 動拘的血 板激動劏 此外， 用劑量範 於最後注 Baxter) 數地遞增 板計數在 他血球參 等都不受 注射3 0 0 六天的老 其數據顯 小板實際 ，ADP ， 也評估7
圍為1 5微 射後2 4小 測量血球 ，其血小 1 5 0 0微克 數，例如 此處理所 徽克/公 鼠收取血 示取自被 上是不能 都有同等 -HuMGDF 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 關的血小板減少症之能力。於這些研究中使用會引起人類 明顯血小板減少症的化學治療劑，c a r b 〇 p 1 a t i η 。於研究 開始時，用1 . 2 5毫克c a r b ο p 1 a t i n皮下注射B a 1 b / c小鼠ϋ 於2 4小時後，在研究的刺餘天數，每天用100微克/公斤 /天7 - H u M G D F (大腸桿菌1 - 1 6 3 )，或賦形劑，注射小 鼠。到第9天時，賦形劑處理的小鼠之血小板計數降到正 常值的約15¾ ，但用7 -Hu M GDF處理的小鼠，則仍保留在 基線水平（圖2 0 )。對於照射研究，對小鼠_ Μ 5 0 0雷得 7 - $畐射（緦源）之單一劏量。其為次致死劑量，可在第 11天時，導致9 0 %血小板計數減低程度。到第2 1天為止， 血小板計數仍未回復到正常值。在第1天到第2 0天中，每 天给被照射小鼠給用7 - Η I】M G D F (大腸桿菌1 - 1 6 3 ) ( 1 0 0 徹克/公斤/天）時，血小板計數降低情況比用賦形劑處 理的小鼠較不嚴重且更快速回復到基線水平（圖2 1 )。為 了在極端且長期血小板減少模式中試驗7-HuMGDF ，乃组 合_用C a r b ο p丨a t i η和福射（圖2 2 )在這種情況中，血 小板計數降低到極低水平，（正常值的3 - 5 Ϊ )，且大部份 的動物（7 / δ )在此處理中都不能存活。不過，當研究期 間，每天Μ皮下注射1 0 0微克/公斤/天的7 ϋ G D F處 埋這些動物時，血小板減少症有明閑地消除，更快速地回 復到基線計數，且所有^ 7 - H u M G D F - ®理的動物（8 / 8 )都 存活。 另外，也在恆河猴體內評估7 -HuMGDF 於10天（第0 天至第9天）期間，對正常恆河猴施K皮下注射2 . 5或 25微克/公斤/天。於較低劑量組中，血小板計數在第 -98 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29?公釐） 565568 Α7 Β7 五、發明説明（ 12天增加400¾，而 7 0 0 % 〇 方§ & $ 身寸 正常值。白血球計 其外，也在嚴重 -HuMGDF (大腸桿 70 0雷得，鈷源） 常值的1-2¾。到第 ◊相反地，每天用 的經照射動物，其 均不低於2 0，0 0 0 / 输的制動點。於經 復到基線計數值； 齧齒類和靈長類 支持下述概念，亦 強力治療劑，具有 能力。 在較高劑量組中， 後，在第2 5 - 3 0天 數和紅血球計數都 血小板減少症的靈 Μ 1-16 3)(圖 2 3) 後，在第1 5天導致 3 5 - 40天時，血小 7 -HuMGDF ( 25(¾ 血小板計數只降低 微升-血小板減少 7 - H u M G D F —處理 其亦在第12天增加 ，血小板計數回復到 不受此處理所影響。 長類模型中試驗7 。動物接受照射（ 血小板計數減低到正 板計數回復到正常值 克/公斤/天）處理 到正常值的1 0 S且平 症病人進行血小板注 動物中，也更快速回 在第2 0天即發生。 兩種研究所得這些活體内數據可完全地 即7 - H u M G D F (大腸桿菌1 - 1 6 3 )為一種 明顯地影響臨床相關性血小板減少症之 請 先 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再
頁 實施例1 6 C Η 0 細朐掊養姦牛 H u M G 0 F 1 - 2 之方法 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 用可表現編碼M G D F卜3 3 2的c D Ν Α之涇轉染田鼠卵巢細胞 在適當故動區並聯结到编碼可擴大選擇標誌，D H F R，的基 因等之下產生糖基化7 - H u M G D F 1 - 3 3 2 。可供C Η 0細胞内 表現出M G D F的適當故動區為S R α。參看Μ ο 1 . C e 1 1 . B i ο i , 8 : 4 6 6 - 4 7 2 Π 9 8 8 )和 V 0 9 1 / 1 3 1 6 0 ( 1 9 9 1 ) -·可供 CH0细胞内表現出MGDF的適當載體為pDSR«2 。參看WO 9 0 / 1 4 3 6 3 ( 1 9 9 0 )。代表性C Η 0细胞：系可在標準细胞培養 99 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 565568 Α7 Β7 五、發明説明（） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 基内產生分泌出的MGDF，其產量可為10-20毫克/升，不 過可增加到2 5至2 1 0 0毫克/升。要用典型细胞：系來產生 MGDF時，可將培養液擴大，其方式為將其以黏附生長方式 通入具有下列組成的培養基之懸浮液或組織培養容器内： 等比例的Dulbecco氏改質Eagle氏培養基（DMEM)和 H a m 1 s F 1 2 ( D Μ E Μ / F 1 2 , G i b c o )，加上 5 到 1 0 % 胎牛血清 (F B S )或經透析胎牛血清和in e t h o t r e x a t e ( Μ T X )(必要時 :MTX的典型濃度為2 0 0 - 6 0 0 n Μ) M維持選擇壓力：該培 養基必須補充額外的非必需胺基酸（N E A /Γ s )和穀胺醯胺 。懸浮培養物可以容易地從接種（分配）密度卜4 X 1 0 5 細胞/毫升繁殖到最大密度〜1 X 1 0 0细胞/毫升，於該 點將培養液經由稀釋到較大體積，使起始細胞濃度為所指 定的分配密度而擴大培養。 經濟部智慧財產局員工消费合作社印製 要在滾瓶中產生MGDF時，必須用磁攪拌旋轉容器置到 溫控環境（37± 1 °C )，或有儀器設備，經控制的授拌槽 生物反應器系統中以產生適當的懸浮液體積和细胞密度。 滾動瓶（例如，8 5 0立方公分F a 1 c ο η滾動瓶）必須K每瓶 1 . 5至3 X 1 0 7細胞的起始密度接種並補充添加生長培養 基（D Μ E M / F 1 2 ，加 5 - 1 0 % F B S ，1 X N E A A 和 1 X L -穀胺 廳胺），其量要適合於在3-4夭内產生匯集單層（ 1 5 0 - 3 0 0毫升/瓶）。該生長培養基必須用碳酸氫納適當 地緩衝到P Η 6 . 7至7 . 2 Μ與6 0 - 9 0 m m H g分壓的二氧化碳平 衡。瓶子必須通入1 0 % C 0 2 /空氣並置於滾動架（〜1 r〇m )上，於3 7 ± 1 ΐ、下培養3 - 4天：於匯集後，須將滾 動瓶經由傾注或抽吸生長培養基而轉換成無血清的生產培 -100 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 565568 Α7 Β7 五、發明説明（） 養基；用等滲緩衝液，例如D ιΠ b e c c 〇 ’ s磷酸鹽緩衝鹽水（ D-PBS)，洗滌該瓶，5 0 - 1 00毫升/瓶；然後加入適當體積 的碳酸氫鹽緩衝，無血清DMEM/F 1 2 (1:1) ( 2 0 0 - 3 0 0毫升 /瓶），其中補充著NEAA’s和6-縠胺藤胺及硫酸銅以減少 共價聚集（1 - 2 0 ,u Μ )。瓶子必須通入1 0 % C 0 2 /空氣並 在滾動架（〜1 r ρ m )上，3 7 土 1 t：下培育6 ± 1天，或直 到代謝活性1使葡萄糖水平到低於0 . 5克/升及/或p Η水 平低於6 . δ為止。從瓶內倒出或抽出Μ收集調理培養基並 補充如上所述的新鮮無血清生產培養基以供其他的收集之 用。這種程序可進行到該细胞不再持續無血清生產a滾動 瓶泥廢為止。 收集到的調理培養基可經由通過0 . 45徽米及/或0 . 2徽 米滅器（S a r t 〇「i u s S a r t 〇 b r a η ρ Η 〇 r Ρ ο 1 1 .)進行間端微 滹純化處理。濾後的調理培養基必須冷卻到4 °C，然後， 暫時貯存在4 C，或立即用交叉流動超濾系统（如， F ί 1 t r ο η Υ Μ - 5 0 )予以濃縮和透析到低離子強度。超濾和 透滹必須在4 t：下進行以減少蛋白質降解。調理培養基必 須用緩衝水溶液（如，1 0 in Μ磷酸鉀，ρ Η 6 . δ )透析後才 進行層析術純化步驟。 調理培養基中的產物品質可用非遷原性SDS-PAGE西方點 染法予以監測；該法可顯露出樣品中的含聚集，單體，和 蛋白分解降解MGDF的相對量。 另一種用C Η 0細胞產生M G D F的方法為將表現M G D F的細胞 系調適到無血清培養基；如G i b c 〇 S - S F Μ I I之中。可Μ經 由糸列地通到含有最低或無血清補充的培養基内而調適细 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) —裝· 太 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 565568 A7 B7 五、發明説明（） 胞。若該細胞系可在這種培養基內持續生長同時產生充分 量的分泌MGDF時，即可經由系列地通入遞增地較大培養體 積内擴大接種培養，然後接注到適當生產容器内（儀控攪 拌槽生物反應器）並在最佳生長條件（P Η，養份，溫度， 氧氣，剪切速率）之下增生到其最大存活密度而進行生產 。於最佳生產點（經由測量產物量和品質而實驗地決定） ，即從該生物反應器收集培養物，並利用微米一尺寸深度 過滹或次微米交叉流動微濾而從調理培養基脫除掉细胞。 若將用深度過濾時，必須用次微米間端過滤將培養基進一 步澄清後，才依上文所述予Μ濃縮和透析。 … 雖然本發明已在上文羥概括地及以其較佳實砲例而說明 過，不過，要了解者，諳於此技藝者可從上述說明而加以 變巽和修改。所以，後附申請專利範圍意肷將所有這些變 異涵蓋在本發明所申請的專利範圍之內。 此外，為了闡明有關本發明的背景及於特別情況中，提 供有關其操作的其他細節等所引述的文獻和其他資料都併 於本文中Μ為參考。 撤半物於台灣之寄存 質體P B C B ( M G D F 2 )(於大腸桿菌A b 1 e C中）已於8 4年3月2 8 日寄存於食品工業發展研究所（F I R D I )，寄存編號：C C R C 940086 a 質體P B C B ( M G D F 1)(於大腸桿菌A b 1 e C中）已於8 4年3月2 8 日寄存於F I R D I，寄存.頃號：C C R C 9 4 0 0 8 7。 表現質體p A M G 1 1 R - H u M e t L y s M G D F (於大腸桿菌F Μ 1 5 -102 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
565568 Α7 Β7 五、發明説明（） 中）已於84年3月28日寄存於FIRDI，寄存绢號：CCRC 940088 。 大腸桿菌K 1 2 F Μ 1 5已於8 4年3月2 8日寄存於F I R D I，寄存 編號：CCRC 950002 。 中國倉鼠卵巢细胞株Ρ 〇 〇 1 2 6 0 η Μ已於8 4年3月2 8日寄存 方令FIRDI，寄存編號：CCRC 960025。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -103 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 565568 . A7 B7 經濟部智慈財產局員工消费合作社印製
五、發明説明（） 序列表 (1) 一般資訊： I - (i )申請人：AMGEH IHC. (π)發明名稱：剌激巨核细胞生長與分化之组合物與方法 (iii) 序列數：34 (iv) 通訊地址： (A) 收信人：Amgen Inc. (B) 街名：1840 Dehavilland Drive (C) 市名：Thousand Oaks (D) 州名：加利佛尼亞 (E) 國名：美國 (F) #'郵遞區號：91320-1789 (v) 計算機可謓形式 (A) 媒體類型：軟碟 (B) 計算機：IBM PC可相容 (C) 搡作糸統：PC-D0S/MS-D0S . 广（D)軟體：Patentln Release #1,0, Version tfl.25 (vi) 現有申請數據： (A) 申請號： (B) 申請日.期： 1 (C)分類： (viu)代理人/事務所資訊： (A)名構：Cook, Robert R. (C) 參考/檔號：A-290-C -104- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 565568 . A7 B7五、發明説明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (2) SEQ ID H0:1 的資料： (i) 序列特性：. (A) 長度：31胺基酸 (B) 類型.：胺基酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學··線型 ’ (ii) 分子類別：蛋白質 (xi)序列說明·· SEQ ID Η0··1: Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 1 5 10 15 Ser His Val Leu His Xaa Arg Leu Xaa Gin Xaa Pro Asp lie Tyr i 20 25 30 r (2) SEQ ID N0:2 的資料： (i)序列特性： (A)長度·· 21胺基酸 、 广（B)類型：胺基酸 • (C)股型：單股 (D)拓撲學：線型 1 (ii)分子類別：蛋白質 (xi)序列說明·· SEQ ID H0:2: -105 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
B7五、發明説明（） Ala Pro Pro Ala Xaa Asp Pro Arg Leu Leu Asn Lys Met Leu Arg Asp 1 5 10 15 Ser His Val Leu His20 (2) SEQ ID N0:3 的資料： (i) 序列特性： ./ (A) 長度：17胺基酸 (B) 類型：胺基酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線型 (ii) 分子類別：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID H0:3: f Thr Gin Lys Glu Gin Thr Lys Ala Gin Asp Val Leu Gly Ala Val Ala 1 5 Leu > (2/sEQ ID N0:4 的資料·· I (i)序列特性： .(A)長度·· 17鹸對 (B) 類型％核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線型 (ii)分子類別：cDNA 15 -106- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） 565568 A7 B7 ^___ ,_^_ 經濟部智慧財產局員工消·費合作社印製 發明説明（
(xi)序列說明：SEQ ID H0:4: GCNCCHCCHG CHTGYGA 17 (2) SEQ ID H0:5 的資料： (i)序列特性： (A) 長度·· 21鹼對 (B) 類型：核酸 ' (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (Π ) ·分子類別：CDNA (xi)序列說明：SEQ ID H0:5: GCARTGYAAC ACRTGNGART C 21 (2) SEQ ID N0:6 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：21胺基酸 (B) 類型：胺基酸 广(C)'股型：單股 ' (D)拓樸學··線形 * (ii) 分子類別：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID H0:6: Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg 1 5 Se「 His Val Leu His 20 -107 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 15
Asp
565568 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 A7 " B7五、發明説明（) (2) SEQ ID H0:7 的資料： (i) 序列特性： | (A)長度：21鹼對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線形 (ii) 分子類別：cDNA (xi)序列說明·· SEQ ID K0:7: GTACGCGTTC TAGANHNHKH T i (2) SEQ ID N0:8 的資料： (i广序列特性： (A)長度：21鹼對 1 (B)類型：核酸 (C)股型：單股 • (D)拓樸學：線形 ,(ii)分子類別：cDNA ' r ，（xi)序列說明·· SEQ ID H0:8: I AGTTTACTGA GGACTCGGAG G ; (2) SEQ ID N0:9 的資料： 1 (i )序列特性： (A) 長度：30鹼對 (B) 類型：核酸 -108- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 29*7公釐） 565568 . A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID H0:9: TTCGGCCGGA TAGGCCTTTT TTTTTTTTTT 30 (2) SEQ ID H0:10 的資料·· (i) 序列特性： (A) 長度：29鹼對 (B) 類型：核酸 I '· (C)股型：單股 (D)拓撲學：線彤 , (ii) 分子類別：cDHA ' (xi)序列說明：SEQ ID N0:10: TTCGGCCGGA TAGGCCTTT TTTTTTTTT 29 广(2) SEQ ID Ν0:Π 的資料： (i )序列特性： (A)長度：20鹼對 ! . ! (B)類型：核酸 1 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID N0:11: -109- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —mi 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 TGCGACCTCC GAGTCCTCAG (2). SEQ ID N0:12 的資料： (i )序列特性： (A) 長度·· 23鹼對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線彤 (ii)分子類別：cDNA (xi) ·序列說明：SEQ ID N0:12: GAGTCCTCAG TAAACTGCTT CGT (2) SEQ ID N0:13 的資料： (i)序列特性： (A) 長度：20鹼對 (B) 類型：核酸 广 (C)股型：單股 (D)拓撲學：線形 (Π)分子頚別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID H0:13: GGAGTCACGA AGCAGTTTAC (2) SEQ ID H0:14 的資料： (i )序列特性： 23 20 -110- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 • A7 B7 經濟部智惡財產局員工消費合作社印发 五、發明説明（） (A) 長度：18鹼對 (B) 類型··核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ϋ)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID NO:U: CCTTTACTTC TAGGCCTG 1δ U2) SEQ ID H0:15 的資料： (i )序列特性： /A)長度：19鹼對 ! (B)類型：核酸 I (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii)分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID N0:15: (fAGGTCACAA GCAGGAGGA 19 i (2) SEQ ID N0:16 的資料： 1 * * I ( i )序列特性： I (A)長度：19鹼對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線形 -Ill - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7五、發明説明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID N0:16: I GGCATAGTCC GGGACGTCG 19 (2) SEQ ID N0:17 的資料： (i) 序列特性： (A) 長度：19鹸對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii )分子類別：cDHA i (xi)序列說明：SEQ ID K0:17: f I I TCCTCCTGCT TGTGACCTC 19 (2) SEQ ID N0:18 的資料： (i )序列特性： 广 (A)長度：19鹼對 (B)類型：核酸 ! (C)股型：單股 ' (D)拓撲學：線形 (ii) 分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID Ν0··18: CCAGGAAGGA TTCAGGGGA iq -112- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再本頁) 裝· 線 565568 • · A7 B7五、發明説明（）
ΐ (2) SEQ ID H0:19 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：30鹼對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線彤 (η)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID H0:19: I CAACAAGTCG ACCGCCAGCC AGACACCCCG 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 30 (2) ,SEQ ID H0:20 的資料： (i )序列特性： ' (A) 長度：24鹼對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓摈學：線形 < («)分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID H0:20: GGCCGGATAG GCCACTCHNH NNNT 24 (2) SEQ ID H0:21 的資枓： (i)序列特性： (A) 長度：21鹼對 (B) 類型··核酸 -113 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 A7 *' B7五、發明説明（) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學線形 (ii)分子類別：cDHA (xi)序列說明：SEQ ID H0:21: GCARTGYAAH ACRTGNGART C (2) SEQ ID H0:22 的資料： (i) 序列特性： (A)長度：16鹼對 I (B)類型：核酸 ' (C)股型：單股 4 (D)拓撲學：線形 ! (ϋ)分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID H0:22: TTGGTGTGCA CTTGTG 沒）SEQ ID N0:23的資料： ,(i)序列特性： (A) 長度：20鹼對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii) 分子類別：cDNA (xi)序列說明：SEQ ID H0:23: -114- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 . A7 B7五、發明説明（） 經濟部智慧財產局資工消費合作社印製 CACAAGTGCA CACCAACCCC 2〇 * · . ·_ * (2) SEQ ID Η0··24 的資料： (i )序列特性： (A) 長度：1342鹼對 / (B) 類型··核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓樸學：線形 (ϋ)分子類別：cDHA (ix)'特點： (A) #名稱/關鐽詞：CDS . /， • (B)位置·· 99-1094 (xi)序列說明：SEQ ID N0:24: 一 C^C^GCC.-^ G^CACCCl-G^ CGAG^.TGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG 60 TGGTCATGCT TCTCCTAACT GC^GGCT^ CGCTG7CC AGC CCG GC7 CCT CCT ^ U3 广 Ser Pro Ala Pro Pro (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（） 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 GCT TGT GAC CTC CGA GTC C7C AGT CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lvs Leu Leu Arg Asp Ser His Val 10 15 20 CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA Leu Kis Ser Arg Leu Ser Gin Cys Pro GIu Val His Pro Leu "Pro Thr 25 30 35 CCT GTC CTG CTG CCT GCT GIG GAC TTT AGC TTG GGA GAA' TGG AAA ACC •Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lvs Thr 40 4*5 5〇 * ** CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT Gin Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Lea Gly Ala Val Thr Leu 55 60 65 . ^ CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin Leu GIv Pro Thr Cvs 7 0 75. 80 ^ 85 CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT Leu Ser Ser Lea Leu Gly Gin Leu Ser Glv Gin Val Arg Leu Leu Leu 90 95 loo GGG GCC CTG. CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG Gly A丄a Leu Gin Ser Leu Leu GIv Thr Gin Leu Pro Pro Gin Glv krg 105 110 - ^ j ACC ACA GCT CAC GAT CCC ΑΛΤ GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC j Thr Thr Ala His Lvs Asp Pro Asn Ala lie Phe Leu Ser Phe Gin His ； 120 · · 125 130 一一 cro CTC CGA GGA .^G GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC Lsu Leu Arg Gly Lvs Val Arg ?he Leu y.ez Leu Val Glv Gly Ser Thr 135 ** 140 145 * ~ > CTC T2C GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro T.^.r Thr Ala Val Pr〇 Ser Arg Thr 150 155 150 155 TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AGG ACT TCT GGA TTG Ser Leu Vai Leu Thr Leu Asn Glu Leu ?rc Asn Arg Thr Ser Giv Leu ； 170 :T3 130 161 209 257 305 353 401 449 497 545 593 641 TTC，GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC Λ; Leu Glu Thr ASn ?h〇 Thr Ala Ser Ai= Λ 195 190 CrG Λ-^G TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC Λ. :-C- .'Ci GoC TCT GGG CTT •nr Giv Ser Glv Leu 639
Leu -vs
〔T CCT GGT C:G CTG AAC
Gin Gin Gly ?he Arg 三 lys :ie ?:〇 Giy Leu Leu Asn 737 200 205 c.mcc Glr. T 卜· r 215 :CC AGG TCC CTG GAC Arg Ser Leu Asp Gin 220 210 -*'C CTG AAC AGG 乙eu Asn Arc 225 * 735 -116- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） * o (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
565568 A7 B7 五、發明説明（） 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 CAC GAA CTC TTG ΛΑΤ GGA ACT CGT GGA CZZ 7TT CCT GGA CCC TCA CGC His Giu Leu Leu Asn Glv Thr Arg Giv Lev: ?he Pro Glv Pro Ser Arg 230 235 240 245 AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC Arg Thr Leu Gly Ala Pro As? lie Ser Ser Giy Thr Ser Asp Thr Giv 250 · 255 . 2.S0 * TCC CTG CCA CCC CTC CAG CCT GGA ΤΛΤ TCT CCT TCC CCA ACC CA? Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gin Pro Gly Tvr Ser Pro Ser Pro Thr Hi3 265 . 270 275 CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC 7TC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC Pro Pro Thr Gly Gin Tyr Thr Leu Phe'Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro 280 ^ .285.290 ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC'CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA . Thr Pro Val Val Gin Leu His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro 295 300 305 ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu A^n Thr Ser Tyr Thr His Ser 210 · 315 220 325 CAG AAT_ CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC GACATCAGCA Gin Asn Leu Ser Gin Giu Gly .‘ 330 • f TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT GGAC.^.GATT TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT ATCAGCAATA ! CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCA 1(2) SEQ ID H0:25 的資料： 、I · "(i) /'序列特性： ”(A)長度·· 332胺基酸 (B)類型：胺基酸 (D)拓撲學：線形 (ii) 分子類別：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID H0:25: ier Pro Ala Pro ?二〇 Ala Cys Aso Leu I 5 · :g Val Leu Ser Lvs Leu Leu :0 - 15 833 381 929 977 1025 1073 1124 1184 1244 1304 1342 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 •-•rg Asp Ser o 2
a V r e s c--o Γ2 u e e s
s V- c n 1 G
Pro Giu VaI 20
His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Le- Pro Ala Val Asp ?he Ser leu 35 40 45 -117- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 A7 B7 五、發明説明（） 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 GIv GIu Trp Lys Thr Gin Met Glu Glu Thr Lvs Ala Gin Asp lie Leu 50 * 55 60 ' GIv Ala Val Thr Leu Leu Leu G丄u Giy Val Met Ala A丄a Arg Giy Gin ; 65 70 75 80 Leu GIv Pro Thr Cvs Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser G_y Gin 85 90 55 Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu 100 105 '110 Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala lie ?he 115 120 * 125 Leu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Giv Lys Val Arg Phe Leu Met Leu 130 - 135. "* 140 Val Gly Gly Ser Thr Leu Cy3 Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala 145 150 155 160 Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn ! 165 170 175 I » . ' Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr j 180 . 135 190 ( I I ! Thr Giv Ser Gly Leu Leu Lys· Jrp Gin Gin Gly Phe Arg Ala Lys He 195 ，. 200 205 ** Pro Gly Leu Leu Asn Gin Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gin lie Pro Gly 210 215 220 - Tyr Leu Asn Arg lie H13 Glu Leu Lev: r-sn Giv Thr Arg Gly Leu Phe 225 · 230 235. " 240 Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Giv Ala Pro Asp He Ser Ser Gly . 245 250 255 ' Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Leu Gin Pro Gly Tvr Ser 260 255 270 * Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Giv Gin Tyr Thr Leu Phe Pro Leu 275 280 285 Pro Pro Thr Leu ?^o Thr Pro Val Val Gin leu His Pro Leu Leu Pro 250 295 300 Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr :305 310 315 320' Ser Tyr rhr His Ser Gin Asn Leu Ser Gin Glu Giv 325 330 ·_ ^ -118- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） (2) SEQ ID H0:26 的資料·· (i) 序列特性： (A) 長度：1342 _對 (B) 類型：核酸· .(C)股型：單股 (D)拓樸學··線型 (ii) 分子類別·· cDHA (ix)特點：
(A) 名稱/翮鍵詞：CDS (B) 位置：99· .621 (xi)序列說明：SEQ ID H0:26: •CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGAATGGA GCTGACTGAA TTGCTCCTCG 60 4 TGGTCATGCT TCTCCT^CT C-CAAGGCTA.\ C3CTGTCC AGC CCG GCT CCT CCT f 113 , Ser Pro Ala Pro Pro . 1 5 GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT ΛΛΛ CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC 151
Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lvs Leu Leu Arg Asp Ser His Val · 10 15 20 · CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA ' 209
Leu His Ser Arg Leu Ser Gin Cys ?ro Glu Val His Pro Leu Pro Thr" 25. 30 35 CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC 7TT AGC ™G GGA GAA TGG ACC 257 ! Val」eu Leu Pro Ala Val Asd ?he Ser Leu Glv Glu Tro. Lvs Thr I -0 45 -50·- CAG ATG GAG GAG ACC Ai^.G GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT 305 ；GIn Met Glu Glu Thr Lvs Ala Gin Asp lie Leu Glv Ala Val Thr Leu ! 55 60 65 i :CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CJ-Λ CTG GGA CCC ACT TGC 353
Leu Leu Glu Glv Val Met Ala Ala Arg Glv Gin Leu Glv Pro Thr Cvs 70 75 80 35 fTC TCA rcc CTC CTG GG3 CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT 401
Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Glv Gin Val Arg Leu Leu Leu 90 95 100 -119- _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
565568 A7 B7 五、發明説明（） GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG 449 GIv Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu Pro Pro Gin GIv Arg ** 105 110 115 ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAC 497 Thr Thr Ala His Lys Aso Pro Asn Ala lie ?he Leu Ser Phe Gin ：-：is 120 ^ ' 125 130 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 TG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG *ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC 5 45 Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Vai Gly Gly. Ser Thr / 135 * 140 145 、 CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC 593 Leu Cy3 Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser- Arg Thr 150 155 1d0 165 TCT CTA GTC CTC AC\ CTG AAC GAG CTC C CAAACAGGAC TTCTGGATTG 641 Ser Leu Val Leu Thr Leu Aan Glu Leu 170 TTGGAGACAA^ACTTCACTGC CTCAGCCAGA ACTACTGGCT CTGGGCTTCT GAAGTGGCAG 701 CAGGGATTCA GAGCCAAGAT TCCTGGTCTG CTGAACCAAA CCTCCAGGTC CCTGGACCAA 761 ATCCCCGGAT AgCTGAACAG GATACACGA.^ CTCTrGJL\TG GAACTCGTGG ACTCTTTCCT 821 GGACCCTCAC GCAGGACCCT AGGAGCCCCG GACATTTCCT CAGGAACATC AGACACAGGC 881 TCCCTGCCAC CCAACCTCCA GCCTGGATAT TCTCCTTCCC CAACCCATCC TCCTACTGGA 941 CAGTATACC-C TCTTCCCTCT TCCACCCACC TTC-CCC^.CCC CTGTGGTCCA GCTCCACCCC 1001 CTGCT/CCTG ACCCTTCTGC TCCAACGCCC ACCCCTACCA GCCCTCTTCT AAACACATCC 1061 j TACACCCACT CCCAGAATCT GTCTCAGGAA GGGTAAGGTT CTCAGACACT GCCGACATCA 1121 GCATTGTCTC GTGTACAGCT CCCTTCCCTG CAGGGCC-CCC CTGGGAGACA ACTGGACAAG 1131 .ATTTCCTACT TTCTCCTGAA ACCCAAAGCC GGATACACAG GACTGJ^^---G 12 41 \i · GGAATCATTT -TTCACTGTAC ATTATAA.^.CC TTCAGAAGCT ΑΤΤΤΤΤΤΤΛΑ GCTATCAGCA 1301 Λ Α ^ Λία L 1 -: *w 丄· ·一 i J H i： -120- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2!〇X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 565568 A7 B7 五、發明説明（） (2) SEQ ID N0:27 的資料： (i)序列特性： ! (a)長度：rA胺基酸 (B)類型：胺基酸 (D)拓樸學：線形 (ϋ)分子類別：蛋白質 (xi)序列說明：SEQ ID H0:27:
Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cvs Asd
Leu Arc- Val Leu Ser Lvs Leu Leu ：2 ' 15
Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg leu Ser Gin Cvs Pro GIu Val 20 25 一 30
His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu ?rc Ala Val Asd Phe Ser Leu • ·. 40 45 ,
Gly Glu Trp Lvs Thr Gin Met' 50 55
Glu Glu Thr Lvs Ala Gin Asp lie Leu 50
Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Glv 70 75 **
Gin 80
Leu Gly Pr。丁hr Cy3 Leu Ser Ser ⑻⑻ Giv 85 90 y Gin Leu Ser dy Gin 95
Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gin Ser 100 105
Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala Kis Lvs 115 120 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Leii Leu Glv Thr Gin Leu 110 Pro Asn Ala lie Phe 125
Leu Ser Phe Gin Hi3 Leu Leu Arg Gly Lvs Val Arg Phe Leu Met Leu 135 140
Val Gly Gly Ser Thr Leu Cy3 Val Arg Arg Ala Pro :145 150
Pro Thr Thr Ala 160
Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu 165 170 -121 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210X297公釐）
、發明説明（） (2) SEQ ID H0:28 的資料·· (i )序列特性： (A) 長度：1164鹸對 (B) 類型：核酸 (C) 股型：單股 (D) 拓撲學：線形 (ii)分子類別：cDHA (ix)特點： (A)名稱/W鍵詞：CDS ⑻位·置·· 97..894 .(xi)序列說明·· SEQ ID Η0··28:
AGGGAGCCAC GCCAGCCAGA CACCCCGGCC AGAATC-GAGC TGACTGAATT GCTCCTCGTG
GTCATGCTTC TCCTAACTGC AAGGCTAACG C7GTCC A-SC CCG GCT CCT CCT GCT
Ser Pro Ala Pro.Pro Ala 4 · 1 5
TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA C7G CT7 C3T GAC 7CC CAT GTC CTT
Cy3 Asp Leu Arg Val Leu Ser Lvs Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu 10 15 20 CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT^
His Ser Arg Leu Ser Gin Cvs Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro 广 25 30 35
GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG C-GA GAA TGG AAA ACC CAG
Val Leu Leu Pro Ala Val Asp ?he Ser Leu Glv Glu Trp Lys Thr Gin S 40 50 *
;^TG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG ;Met Glu Glu Thr Lys Ala Gin Asp lie Leu Glv Ala Val Thr Leu Leu 55 60 65 70
CTG G^G GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC
Leu Glu Glv Val Met Ala Ala Arg Glv Gin Leu Gly Pro Thr Cvs Leu 75 80 85
TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG
Ser Ser Leu Leu Glv Gin Leu Ser Gly Gin Val Arg Leu Leu Leu Gly 90 95 100 -122- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) M規格（210X297公t ) 60 114 162 210 258 306 354 402 565568 A7 B7 五、發明説明（ GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC 450 Ala Leu Gin Ser Leu Leu GIv Thr Gin Leu Pro Pro Gin Glv Arg Thr 105 110 115 " ACA GCT CAC AAG GAT CCC ΛΑΤ GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG 4S3 Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala lie ?he Leu Ser Phe Gin His Leu [ 120 125 130 I . I CTC CGA GGA AAG GAC TTC TGG ATT GTT GGA GAC AAA CTT CAC TC-C CTC 546 Leu Arg GIv Lys Asp Phe Trp lie Val Gly A_sp Lys Leu His Cys Leu 135 · 140 145 "* ^ 150 AGC CAG AAC TAC TGG CTC TGG GCT TCT GAA G7G GCA GCA GGG ΆΤΤ CAG 5 9<’ Ser Gin Aan Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu Val Ala Ala Glv He Gin 155 ISO 165 :AGC CAA GAT TCC TGG TCT GCT GAA CCA .^C CTC CAG GTC CCT GGA CCA 642 :Ser Gin Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro ksn Leu Gin Val Pro Glv Pro ； · ' 170 175 130 ' I ΑΛΤ CCC CGG ATA CCT GAA CAG GAT ACA CGA ACT CTT GAA TGG AAC TC3 650 i Asn Pro Arg lie Pro Glu Gin Asp Thr Arg *Thr Leu Glu Trp Asn Ser I 185 ' 190 195 * I * 'TGG ACT CTT TCC TGG ACC CTC ACG CAG GAC CCT AGG AGC CCC GGA 7 33 Trp Thr Leu Ser 丁二;d Thr Leu Thr Gin p Pro Arg Ser Pro Giy His 200 205 ’ 210 * TTC CTC AGG AAC ATC AGA CAC AGG CTC C二二 GCC ACC CAA CCT CCA GCC 7SS Phe Leu Arg Asn lie Arg His Arg Leu ?二二 Ala Thr Gin Pro Pro ΛΙξ 215 220 ：25 220 t •TGG- ATA TTC TCC TTC CCC CCA TCC TCC TAC TGG ACA GTA TAC GCT 334 Trp lie Phe Ser Phe Pro Asn Pro Ser Ser Tyr Trp Thr Val Tyr ' 广 235 2；C ·. ' 245 CTT CCC TCT TCC ACC CAC CTT GCC CAC CCC TC-T GGT CCA GCT CCA CCC 3S2 Leu ?二3 Ser Ser Thr His Leu A丄a His ?rc Cys Glv Pro Ala ?ro Pro Z50 255 * " 260 ， 931 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 #f 經濟部智慧財產局資工消費合作社印製 广^ 广广广广产，一《"T广…广乙广< Cw - 丄 -^w ▲ c ▲丄 L 丄 丄 ;?二。Ala Ser Λ ' 265 CT.-^-ACACAT CCTACACCCA CTCCCAG.-AT CTGTCTCAGG .^GGGTAAGG TTCTCAGACA 391 CTGCCGACAT CAGCATTGTC TCGTGTACAG CTCCCTTCCC TGCAGGGCGC CCCTGGGAGA 1051 C.^CTC-GACA AGATTTCCTA CTTTCTCCTG CCCTGG7^\A AGGGATACAC iLii ASSACTG.^ AGGG^.TCAT TTTTCACTGT ΛΟΛΤΓλΓ.-_^ CCTTCAG.^G CTA ；L1S4 -123 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 . A7 ^_B7_ 五、發明説明（） (2) SEU ID Κ0:29 的資料： (i) 序列特性： _ (A) 長度：265肢基酸 (B) 類型··胺基酸 … (D)拓樸學：線形 ί . (ii) 分子類別··蛋白質 (xi)序列說明·· SEQ ID Η0··29: Pro Ala Pro Pro Aj.a Cys Asp Leu Axg Val Leu Ser Lvs Leu Leu 1 - 5 10 15 Ser Hj_s Val Leu Hi.s Ser Arg Leu Ser Gin Cvs Pro Glu Val 20 25 30 His Pr© Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala.Val Aso Phe Ser Leu 35 40 45 f ! Gly Glu Trp Lys Thr Gin M〇t Glu Glu Thr Lvs Ala Gin Aso lie Leu 50 55 60 * Glv Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gin 65 "70 75 SO ， Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gin Leu Ser Gly .Gin 85 90 95 5 Val Arg Leu Leu Leu Glv Ala Leu Gin Ser Leu Leu Gly Thr Gin Leu 100 105 no Pro Pro Gin Gly Arg Thr Thr Ala His Lvs Aso Pro Asa Ala lie Phe' ! 115 120 125 · ! · i I i^eu Ser Phe Gin His Leu Leu Arg Glv Lvs Asd Phe Tro lie Val Glv 130 135 * 140 * · Asp Lys Leu His Cys Leu Ser Gin Tyr Trp Leu Trp Ala Ser Glu 145 150 15*5 ‘ 160 Val Ala nla Gly ile Gin Ser Gin Asp Ser Trp Ser Ala Glu Pro Asn ⑹ 170 * 175 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · 訂 -124- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 .· A7 B7 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） Leu Gin Val Pro Gly Pro Asn Pro Arg lie Pro Giu Gin A50 Thr Arg 180 185 190 Thr Leu Glu Trp Asn Ser Trp Thr Leu Ser Tm Thr Leu Thr Gin Asd 195 , 200 ' 205 * Pro Arg Ser Pro Gly His Phe Leu Arg Asn lie Arg His Arg Leu Pro •210 215 220 j -! Ala Thr Gin Pro Pro Ala Trp lie Phe Ser Phe Pro A^n Pro Ser Ser 225 230 235 240 Tvr Trp Thr Val Tyr Ala Leu Pro Ser Ser Thr Hia Leu Ala His Pro 245 250 ·-; 255 Cys Gly Pro Ala Pro Pro Pro .Ala Ser 260 . 265 ! - 1(2) SECTID H0:30 的資料： 丨（i)序列特性： (A,長度：24鹼對 ； (B)類型：核酸 I (C)股型··單股 i (D)拓樸學：線形 (ii)分子類別·· cDNA 、 (5ή) 序列說明：SEQIDH0:30: GAGCTCACTA GTGTCGACCT GCAG 24 (2) SEQ ID N0:31 的資料： i (i )序列特性： I (A)長度：24驗對 i ' (B)類型：核酸 .(C)股型：單股 * - 125 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 丨0 、訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 565568 • A7 B7 經濟部智丛財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（） (D)拓撲學：線型 (ii )分子類別：cDNA (xi)序列說明·· SEQ ID K0:31: CTGCAGGTCG ACACTAGTGA GCTC 24 (2) SEQ ID H0:32 的資料： ' (i )序列特性： ·、:’ (A)長度：80鹼對 I (B)類型：核酸 j (C)股型：單股 (D)拓撲學：線形 (ϋ)分字類別·· CDNA ； (xi)序列說明：SEQ ID H0:32: ί CTCATAATTT TTAAAAAATT CATTTGACAA ATGCTAAAAT TCTTGATTAA TATTCTCAAT 60 TGTGAGCGCT CACAATTTAT g〇 (2) SJQ ID H0:33 的資料： i ( i )序列特性： ! . (A) 長度：86鹼對 (B) 類型：核酸 i I (c)股型：單股 ! (D)拓揆學：線形 (ii)分子頚別：cDHA (xi)序列說明·· SEQ ID H0:33: -126- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 565568 . A7 B7 經濟部智尨財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（ CGATAAATTG TGAGCGCTCA CAATTGAGAA TATTAATCAA GAATTTTAGC ATTTGTCAAA 60 TGAATTTTTT AAAAATTATG AGACGT 86 (2) SEQ ID H0:34 的資料： “）序列特性： (A) 長度：89鍮對 (B) 類型：核酸 / · (C) 股型··單股 (D) 拓樸學：線形 (ii)分子頚別：cDHA (xi)序列說明：SEC1 ID Η0··34: GACGTCTCAT AATTTTTAAA AAATTCATTT GACAAATGCT AAAATTCTTG ATTAATATTC 60 TCAATTGTGA GCGCTCACAA TTTATCGAT 89 广 127- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims (2)

  1. 565568 第088113115號專利申請案 ί 中文申請專利範圍替換本(92年9月） Β8 ：8 — 六、申請專利範圍 午用曰^ 士 说9· 26補！ 公告本 1. 一種製備單聚乙二醇化巨核細胞生長發育因子 (MGDF)之方法，該單聚乙二醇化巨核細胞生長發育 因子包含與一個具有單反應醛基之聚乙二醇連結 之可專一促進人類巨核細胞生長及發育之MGDF多 肽，其中該方法包含： (a) 將該MGDF多肽與聚乙二醇於還原性烷基化條 件下接觸，於pH 3至pH 9下，容許該MGDF 多肽一端之〇：-胺基呈反應性；及 (b) 獲得該單聚乙二醇化MGDF。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該單聚乙二 醇化MGDF係實質上均質。 3. 根據申請專利範圍第2項之方法，其中該pH值係 為 pH 3 至 pH 6。 4. 根據申請專利範圍第3項之方法，其中該還原性烷 基化條件中使用選自.由硼氫化鈉、氰硼氫化鈉、二 甲烷基硼烷、三甲烷基硼烷及吡啶硼所組成之群之 還原劑。 5. 根據申請專利範圍第4項之方法，其中該還原劑係 為氰硼氫化鈉。 6. 根據申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其 中該 MGDF具有選自由 MGDF-1、MGDF-2、 MGDF-4、MGDF-5、MGDF-6、MGDF-7、MGDF-8、 MGDF-11、MGDF-12、MGDF-13、MGDF-14 及 MGDF-15所組成之群中之任一個胺基酸序列，其胺 O:\59\59701-920926.DOC\TP - 1 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) ^ 一 565568 ABCD -2 - 申請專利釭圍 基酸序列分別對應於下示胺基酸序列中’第 22-35 3、22-195、22-172、22-177、22-191、22-198、 22-265、22-184、27-353、27-195、27-172 及 27-184 之序列 1 CAGGGAGCCACGCCAGCCAAGACACCCCGGCC AGAATGGAGCTG ACTGAATTGCTCCTC 59. 1 MetGluLeuThrGluLeuLeuLeu · 8 60 GTGGTCATGCTTCTCCTAACTGCAAGGCTAACGCTGTCCAGCCCGGCTCCTCCTGCTTGT 119 9 ValValMetLeuLeuLeuThrAlaArgLeuThrLeuSerSerProAlaProProAlaCys 28 12 0 GACCTCCG AGTCCTCAGTMACTGCTTCGTG ACTCCCATGTCCTTCACAGCAGACTGAGC 179 29 AspLeuArgValLeuSerLysLeuLeuArgAspSerHisValLeuHisSerArgLeuSer 48 180 CAGTGCCCAGAGGTTCACCCTTTGCCTACACCTGTCCTGCTGCCTGCTGTGGACTTTAGC 239 49 GlnCysProGluValHisProLeuProThrProValLeuLeuProAlaValAspPheSer 68 2 4 0 TTGGGAGAATGGAAAACCCAGATGGAGGAGACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAGCAGTG 299 69 LeuGlyGluT^LysThrGlnMetGluGluThrLysAlaGlnAspIleLeuGlyAlaVal 88 % ••參 300 ACCCTTCTGCTGGAGGGAGTGATGGCAGCACGGGGAC AACTGGGACCCACTTGCCTCTCA 359 89 ThrLeuLeuLeuGluGlyValMetAlaAlaArgGlyGlnLeuGlyProThrCysLeuSer 108 360 TCCCTCCTGGGGCAGCTTTCTGGACAGGTCCGTCTCCTCCTTGGGGCCCTGCAGAGCCTC 419 109 SerLeuLeuGlyGlnLeuSerGlyGlnValArgLeuLeuLeuGlyAlaLeuGlnSerLeu 128 420 CTTGGAACCCAGCTTCCTCCACAGGGCAGGACCACAGCTCAC AAGGATCCCAATGCCATC 479 129 LeuGlyThrGlnLeuProProGlnGlyArgThrThrAlaHisLysAspProAsnAlalle 148 480 TTCCTGAGCTTCCAACACCTGCTCCGAGGAMGGTGCGTTTCCTGATGCTTGTAGGAGGG 539 149 168 540 TCCACCCTCTGCGTCAGGCGGGCCCCACCCACCACAGCTGTCCCCAGCAGAACCTCTCTA 599 169 SerThrLeuCysValArgArgAlaProProThrThrAlaValProSerArgThrSerLeu 188 6 0 0 GTCCTCACACTGAACGAGCTCCCAAACAGGACTTCTGGATTGTTGGAGACAMCTTCACT 659 189 ValLeuThrLeuAsnGluLeuProAsnArgThrSerGlyLeuLeuGluThrAsnPheThr 208 660 GCCTCAGCCAGAACTACTGGCTCTGGGCTTCTGAAGTGGCAGCAGGGATTCAGAGCC AAG 719 209 AlaSerAlaArgThrThrGlySerGlyLeuLeuLysTrpGlnGlnGlyPheArgAlaLys 228 O:\59\59701 -920926. DOC\TP 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公爱） 裝 訂 8 8 8 8 A BCD 565568 六、申請專利範圍 720 ATTCCTGGTCTGCTGAACCAAACCTCCAGGTCCCTGGACCAAATCCCCGGATACCTGAAC 779 229 IleProGlyLeuLeuAsnGlnThrSerArgSerLeuAspGlnlleProGlyTyrLeuAsn 248 780 AGGATACACGAACTCTTGAATGGMCTCGTGGACTCTTTCCTGGACCCTCACGCAGGACC 839 249 ArglleHisGluLeuLeuAsnGlyThrArgGlyLeuPheProGlyProSerArgArgThr 268 840 CTAGGAGCCCCGGACATTTCCTCAGGAACATCAGACACAGGCTCCCTGCCACCCAACCTC 899 269 LeuGlyAlaProAspIleSerSerGlyThrSerAspThrGlySeirLeuPro ProAsnLeu 288 900 CAGCCTGGATATTCTCCTTCCCCAACCCATCCTCCTACTGGACAGTATACGCTCTTCCCT 959 2 8 9 GlnProGlyTyrSerProSerProThrHi s ProProThrGlyGlnTyrThrLeuPhePro 308 960 CTTCCACCCACCTTGCCCACCCCTGTGGTCCAGCTCCACCCCCTGCTTCCTGACCCTTCT 1019 309 LeuProProThrLeuProThrProValValGlnLeuHisProLeuLeuProAspProSer^. /. 328 1020 * GCTCCAACGCCCACCCCTACCAGCCCTCTTCTAAACACATCCTACACCCACTCCCAGAAT 1079 329 AlaProThrProThrProThrSerProLeuLeuAsnThrSerTyrThrHisSerGlnAsn i 348 1080 CTGTCTCAGGAAGGGTAAGGTTCTCAGACACTGCCGACATCAGCATTGTCTCGTGTACAG 1139
  2. 349 . LeuSerGlnGluGlyEnd 353 1140 CTCCCTTCCCTGCAGGGCGCCCCTGGGAGACAACTGGACAAGATTTCCTACTTTCTCCTG 1199 1200 AAACCC AAAGCCCTGGTAAAAGGG ATAC AC AGGACTG AAAAGGGAATC ATTTTTC ACTGT 1259 1260 AC ATTATAAACCTTC AGAAGCTATTTTTTTAAGCTATC AGC AATACTCATCAG AGC AGCT 1319 1320 AGCTCTTTGGTCTATTTTCTGCA 1342 . o 7.根據申請專利範圍第.6項之方法，其中該MGDF多 肽係將由大腸菌細胞表現之MGDF多肽，切除 MedLys·1 製得。 8·根據申請專利範圍第1至5項中任一項之方法，其 中該聚乙二醇分子具有2至100千道耳頓的分子 量。 9·根據申請專利範圍第8項之方法，其中該聚乙二醇 分子具有5至50千道耳頓的分子量。 10·根據申請專利範圍第9項之方法，其中該聚乙二醇 分子具有12至25千道耳頓的分子量。 O:\59\59701-920926.DOC\TP - 3 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公釐）
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