JP3784063B2 - 異種移植耐性の増強およびブタサイトカイン - Google Patents
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Description
この発明はブタ骨髄およびブタサイトカインを用いてブタ組織あるいは臓器の異種移植を増強する方法に関し、またブタサイトカインおよびそれらを含有する融合タンパク質発現のための組換えDNA分子に関する。ブタサイトカインは、異種移植において、組織とりわけ骨髄細胞の移植、安定化および増殖の改善に有用である。
発明の背景
臓器の調達は、移植を必要とする患者の数が利用できる臓器の数をはるかに上まわっているため、臓器移植で現在大きな問題の一つを提起している。異種移植はこの問題に解決を提供することが出来る。系統発生学的には、非ヒト霊長類はヒトにもっとも近接する種であり、従って供与体としての最初の選択を表わす。1969年、リーツマ他はチンパンジーからの最初の腎臓ヒト異種移植を成功裡に行った(リーツマ,ケイ.他1964年、「外科学年報」160巻、384ページ)。しかし霊長類供給者の潜在的利用は、不十分な数、法律および倫理的配慮および危険なウイルス疫病伝染の可能性により制約を受ける。ブタは数少ない大型動物種の一つでありその飼育特性が遺伝子実験を可能にすると共に、ミニチュアブタの主要組織適合遺伝子複合体(MHC)同型接合ラインを作ることが出来る。ミニチュアブタは200乃至300ポンドの最大成体重量に留めることが出来、解剖学的生理学的にもヒトに近い。従って、ミニチュアブタの臓器は、あらゆる年代のヒトに対する異種移植片として使用することが適切であるように見える。
自己主要組織適合遺伝子複合体(MHC)抗原に対する寛容は、胸腺においてT細胞成熟の間に発生する(マクダフィー他.「免疫学ジャーナル」141巻,1840ページ,1988年)。個体発生時にMHC抗原に対し免疫機構を曝すと、免疫機構のこれら抗原に対する反応性を失わせる原因となり、その結果動物が成体生命になっても特異的に寛容のままにしておく(ビリンガム他,1953「ネイチャー」172巻,603ページ)。移植免疫学者はリンパ球造血キメラの生産により、成体動物に寛容を誘導する手段を探究してきた。全身放射線照射(WBI)および骨髄移植(BMT)により成体マウスにMHCバリアを横断する寛容を誘導する研究が、マウスモデルで広範に行われた(ヘイフィールド他,1983,「移植」36巻、183ページ。真弓他、1989年、「実験医学ジャーナル」169巻、213ページ。サイクス他,1988年「今日の免疫学」9巻、23ページ)。
臓器移植に寛容を誘導する手段として、MHCミスマッチBMTを使用することは、いくつかの重要な不利益につながることがある。つまり予備養生は、その固有のリスクおよび毒性を持つ致死的照射を含む。また臨床適用の可能性はもっとも潜在的な受容体が適切なMHCマッチ供与体を持たず、更にBMT横断MHCバリアが重い移植片対宿主病(GVHD)の原因になるという事実により制約される。GVHDを予防するため、同種異系骨髄接種材料にあるTリンパ球を除去(ロット他、1971年「ヨーロッパ免疫学ジャーナル」、4巻、25ページ)すると、それが移植不全の割合増加に関連する(マーチン他、1988年「骨髄移植」3巻、445ページ。オライリー他.1985年「移植処置」17巻、455ページ。ソーダリング他.1985年「免疫学ジャーナル」135巻、941ページ)。これらの欠点が他の致死性悪性疾病の治療には一般に受け入れられてはいるが、それは臓器移植の予備養生としてはMHCミスマッチBMTの適用をきびしく制限することにより、そこでは非特異的免疫抑制薬が主な合併症があっても有効である。
骨髄移植および特異的な移植寛容のための相対的に非毒性非骨髄剥離予備養生の使用が、調和性ラットからマウス種までの組合せに適用された(シャラバイ,ワイ.他、1990年「実験医学ジャーナル」172巻、195−202ページ)。この治療は成熟T細胞サブセット(CD4およびCD8)ならびにナチュラルカラー(NK)細胞(NK1.1)を除去するためのモノクローナル抗体の投与を含んでいた。これらのモノクローナル抗体は、亜致死線量(300ラド)のWBI(全身放射線照射)および局所線量700ラドの胸腺照射のみを行った後、異種骨髄の移植を可能にした。生成したリンパ球再構成物は、致死性放射線照射で用意され前もって混合された異種キメラによるもの、およびT細胞放血同系および異種の骨髄と混合物による再構成物よりも優れており(シャラバイ,ワイ.他.1990年「実験医学ジャーナル」172巻、195−202ページ。イルドシュタッド他、1984年「ネイチャー」307巻、168−202ページ)、それは受容体が予備養生によって毒性作用をこうむる事がなかったためであった。加えて、ウマ抗ヒト抗胸腺細胞血清グロブリン(ATG)のポリクローナル製剤を静脈内に投与することにより、霊長類およびヒトの皮膚同種異系移植片の生存時間を延長する努力がなされた。ATGは移植と同時に、また移植の直後に注射された(コシミ,エイ.ビー.他、「外科学」68巻、54−61ページ)。
ブタ臓器をヒトに対し異種移植として使用することは、ブタ骨髄を使用するブタ組織に対し寛容を誘導(すなわち移植に対する何らかの免疫応答の発病度を減少、およびもしくは免疫応答を除去)することにより促進されることが認識されてきた。ブタ骨髄細胞(BMC)は受容体の骨髄に移植誘導され、そこで移植することが出来る。ここで使用される移植(engraftment)という用語は、ブタBMC(骨髄細胞)を異種受容体あるいは宿主に組織移植(implantation)あるいは移植(Transplantation)することを意味し、こうしてブタBMCは増殖し、分化し、かつ受容体内で骨髄として機能することを意味する。ブタ骨髄は、ブタ臓器の移植前、臓器移植と同時に、あるいはその両方の場合に誘導される。このような状況において、同じ手術処置の間もしくは術前準備の一部として、同時期あるいは事実上同時期に誘導が意図される。
この発明に従って、ブタ骨髄の移植を促進することがきわめて望ましく、また骨髄移植に効果的であるサイトカインがその効果にきわめて特異的な種であることが発明者により認識された。この発明に従って、ブタ骨髄移植を促進するのに有効なブタサイトカインが、組換え方法などのような方法によりおよび前記および他の用途で使用するのにきわめて望ましいような形で確認され、分離され、特性付けられ、あるいは生産されてはいなかったという欠乏の事実を発明者は認識した。
従って、この発明の他の主要な見地はブタサイトカインであり、これは他の種の骨髄細胞の存在の下でのブタ骨髄細胞、そのDNA配列およびこれらブタサイトカインの発現のためのDNA分子の増殖および移植を選択的に増強するものである。より詳細には、この発明はブタキメラ増強因子(「CHEFs」)を提供することであり、それはインターロイキン−1(以下「CHEF−1」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(以下「CHEF−2」)および幹細胞因子(以下「CHEF−3」)並びにこれら新規なブタサイトカイン相互の組合せ、およびそれとブタ白血病形成阻止因子(以下「ブタLIF」)などのような他のブタサイトカインとの組合せなどのブタ類似体である。この発明のブタサイトカインは、組換え法により発現される自然起点のものから精製されるかもしくは化学的に合成されるかを問わずタンパク質を包含するものと見做される。
以下でより詳細に説明されるように、受容体のブタサイトカインにより選択的に刺激されるブタ骨髄は、B細胞およびT細胞水準で寛容を誘導することにより、組織あるいは臓器移植を受容体に準備させる。望ましくは、骨髄細胞は未熟細胞(例えば未分化造血幹細胞。これらの細胞は投与に先立ち骨髄から分離される)、あるいはそのような細胞を使用出来ることを含む複合骨髄サンプルを含む。
望ましい実施例は、以下のようなものを含む:同一の免疫プロフィルを持つブタは移植される組織あるいは臓器および骨髄の供与体である;受容体哺乳類は霊長類であり、望ましくはヒトである;またブタは部分的あるいは完全に近交系、つまりミニチュアブタである;使用方法の望ましい実施例として、骨髄を誘導するのに先立ち低い線量で照射され、望ましくは100ラド以上および400ラド以下の線量で照射される。
図1は実施例1で報告された実験にもとづいて、植物性血球凝集素(PHA)で7日間連続して刺激された末梢血リンパ球を回転濾過した上澄みであるリンパ球馴化培地(LCM)を使って、サル、ブタ、およびサル/ブタ細胞の混合比の各種骨髄細胞個体群において、mLCM(サルLDM),pLCM(ブタLDM)およびその組合せの誘導体によって生じるコロニー形成の範囲をグラフで説明する。
図2は、ブタ骨髄細胞増殖の線量依存性および例外種特異性をグラフで説明する。トリチウム化チミジン取り込み試験(0−45,000cpm)が、実施例1で報告された実験において、IMDM培地(イスコーヴス修飾ダルベッコ培地)(%CM)内のLCMの一連の濃度(V/V)にわたり、ブタ、サルおよびヒトLCMを用いて測定された。
図3は、実施例2,3および4で記述されたCHEF−3コーディング領域の核酸配列および誘導アミノ酸配列を示す。哺乳類細胞の発現は、最初のメチオニンで開始するが、シグナル・ペプチド分割はアミノ酸26(太字で示されるグルタミン)で開始する哺乳類細胞から分泌されるタンパク質を生成することが予言されている。
図4は、実施例3に記述されたようにGST−CHEF−3融合をコードするプラスミドpMDR1069を保持する大腸菌溶菌液のSDS−PAGE分析を示す。IPTGの誘導前のサンプル(プレPRE)およびIPTG誘導5時間後のサンプル(ポストPOST)が(キロダルトンで)表示されたタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導GST−CHEF−3融合たんぱく質は矢印で示される。
図5は、実施例4で記述されるpCHEF−3構築物で形質移入されたコス(COS)細胞からの上澄みにより提供される刺激に対するブタBMCの増殖反応を示す。モック(偽)形質移入細胞からの材料は増殖を刺激しなかった。
図6は、実施例5で記述されるヒトGM−CSFクローンhuGM#23からのアンチセンスRNAプローブに対し、低い緊縮応答の下で雑種形成されたブタ末梢血単核細胞から得る全RNAのノーザンブロットを示す。
図7は、更に実施例5で記述されるブタ骨髄増殖活性に対し、図6で示されるRNA分析で使用される細胞から採取された馴化培地の検定結果を示す。
図8は、クローン1NC1−1AおよびサブクローンpCHEF−2.pcdのcDNA挿入断片を配列することで決定されるCHEF−2のヌクレオチド配列および誘導アミノ酸配列を示す。cDNAライブラリーの構築に使用されるリンカーから誘導される配列はアンダーラインを付してある。実施例5および6で記述されるように、哺乳類細胞の発現は最初のATG(位置23,太字)で出発し、典型的な哺乳類シグナル・ペプチド配列を開始し、TAA終結コドン(位置462,太字)まで続く。
図9は、実施例6で記述されるように、チオレドキシン−CHEF−2融合たんぱく質をコードするプラスミドpDA110を持つ太陽菌溶菌液のSDS−PAGE分析を示す。IPTG誘導前(プレPRE)およびIPTG誘導5時間後(ポストPOST 5h)あるいは誘導16時間後(ポストPOST 16h)の各サンプルが(キロダルトンで)示されたタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導されたチオレドキシン−CHEF−2融合タンパク質は矢印で示される。
図10は、実施例7で記述されるように、CHEF−2発現プラスミドpCHEF−2EXP.pcd(pGM−CSF)、あるいはpcDNAI/Ampのみ(モックCM)で形質移入されたコス細胞のコス細胞上澄み内でのGM−CSF増殖活性の検出を示す。
図11は、実施例8で記述されるように、CHEF−1のクローニングに対する段階を図式的に示す。分離されたゲノムDNAの制限地図はキロベースのスケールで以下に示される(S:SfiI;X:XbaI;Z:XhoI)。下部にある線図は、ブタゲノムライブラリーの2個のスクリーニングで分離されたファージを示す。
図12は、実施例8,9および10で記述されるように、pCHEF−1.pcd1のヌクレオチド配列および誘導アミノ酸配列を示す。最初のATG(太字)は位置24で出発し、典型的な哺乳類シグナル・ペプチドを開始し位置456で始まるTAA終止コドン(太字)まで続く。アンダーラインを付した配列は、PCRによりCHEF−1 cDNAで分離するのに使用するため、PCRプライマーILP−F(位置1−15,アンダーライン)およびILP−R(位置740−760,アンダーライン)を示す。
図13は、実施例9で記述されるように、GST−CHEF−1融合タンパク質をコードするプラスミドpEXIL−4を持つ大腸菌から準備された溶菌液のSDS−PAGE分析を示す。IPTG誘導前のサンプル(プレPRE)およびIPTG誘導3.5時間後のサンプル(ポストPOST)が(キロダルトンで)示されるタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導GST−CHEF−1融合タンパク質は矢印で示される。
実施例10から得られた結果を図示する図14は、3日間の生物学的検定でCHEF−1を含むコス細胞上澄みに対する増殖反応を示す。細胞活性の約10倍の増加が0.078%線量の馴化培地で検出されたが、CHEF−1を更に増量する線量の増加は観察されなかった。
実施例10から得られた結果を図示する図15は、7日間の生物学的検定でCHEF−1を含むコス細胞上澄みに対する増殖反応を示す。7日間の増殖から得られた結果は0.078%のみの馴化培地で同様の約10倍の増加を示しているが、CHEF−1,1.25%以上を含むコス細胞上澄みでCHEF−1の線量増加により、約40倍までの増加が検出された。
図16−23は、実施例11で記述される結果を示している。
図16は、骨髄細胞増殖検定の結果を図説する。LIF(n)あるいはCHEF−3およびLIFの組合せ(0)(CHEF,20%)によるpBMCの刺激がこの図で図示される。ブタ骨髄細胞の増殖はブタLIFのみの場合に比較して、CHEF−3およびブタLIFの刺激により2−3倍増加する。
図17は、コロニー形式検定において、CHEF−3およびLIFのユニークな組合せ活性を図示しており、ここでコロニー形成はLIF単独(n)あるいはCHEF−3,10%(0)もしくはCHEF−3,20%(u)のいずれかとの組合せの存在下で検定される。
図18および図19。1週間の培養の後細胞および始原細胞の発育についてのLIFおよび第一次同種異系(allo−)あるいは異種(xeno−)間質細胞の効果。ブタ間質細胞(n)あるいは霊長類間質細胞(o)もしくは間質細胞なし(=)のいずれかの場合で培養7日目の終りにブタ骨髄細胞充実度(図18)および始原細胞容量(図19)に対するLIFの効果。この結果は3個別個の実験の平均値である。
図20および図21。培養1週間後のLIF,CHEF−3および第一次異種あるいは同種異系間質細胞のいずれかの細胞充実度に対する効果(図20Aおよび図20B)、および始原細胞発育に対する効果(図21Aおよび図21B)。培養は株立ちされた。この変数はLIF[50ng/ml],CHEF−3[コス細胞上澄み20%]のいずれか、もしくはその双方を組合せたものを標準LTBMC培地に追加することである。7日を終えた後、2個のウエルのすべての細胞が採取され、細胞数が測定され、細胞の一部分(アリコット)がコロニー形成検定で平板培養された。
図22A−図22D。異種LTBMCにおける細胞および始原細胞発育に対する連続対2週間LIF追加の長期比較効果。第一次霊長類間質細胞が前記の通り用意され、またブタBMC500,000個を接種された。細胞は標準LTBMC培地あるいはLIF[50ng/ml]で補足された培地のいずれかで平板培養された。2個のウエルのすべての細胞は、培養の発育を実証付けるために週毎の間隔で採取された。パネルAおよびBにおいて、細胞充実度に対する連続LIF(0)の効果(図22A)および始原細胞発育に対する連続LIFの効果(図22B)が培地(n)単独のものと比較された。パネルCおよびDにおいては、LIF(0)は最初の2週間だけ培養が続けられた。2週間後、培地は標準LTBMC培地で代替された。これは全培養期間の培地のみ[n]のものと比較された。
図23。異種LTBMC内での細胞および始原細胞に対する連続CHEF−3あるいはCHEF−3+LIFの長期効果。LTBMCは株立ちされ、前記の通り設定された。これらの実験において、標準LTBMC培地の効果がCHEF−3(コス細胞上澄み20%;n)あるいはCHEF−3[20%]およびLIF[50ng/ml](0)と比較された。LTBMCの発育についての文献は前記の通りであった。
この発明の主要な見地は、寛容誘導量のブタ骨髄細胞および、そのブタ骨髄細胞の増殖および移植を増強するのに十分な量の少くとも1個のブタサイトカインを受容者に投与することによって、異種受容体、とりわけヒトにおけるブタ移植の寛容を増強することに関する。ブタ骨髄細胞およびサイトカインは、異種受容体にブタ移植を誘導する前、およびもしくはそれと同時に異種受容体に誘導することが出来る。ブタ骨髄細胞は、望ましくは全身に、例えば静脈内に投与される。
ブタサイトカインは、他のブタサイトカインの活性化、ブタ骨髄始原細胞の増殖、ブタ骨髄造血細胞の増殖、骨髄幹細胞(とりわけ造血幹細胞)の増殖、あるいはブタ顆粒球細胞およびマクロファージ細胞の増殖などを選択的に増強するものを選択することが出来る。
これは、受容体に投与する前に、生理的許容液に少なくとも1個のブタサイトカインを含む組成物にブタ骨髄細胞を浸漬することで達成される。更に、ブタサイトカインは例えば静脈内注射あるいは注入で、ブタ骨髄細胞と混合してもしくは別個の医薬製剤として受容体に全身投与することが出来る。別個の製剤として調合された場合には、サイトカインは(前記定義の通り)ブタ骨髄細胞の少し前もしくは殆ど同時に投与される。
も一つの主要な見地において、これはブタサイトカインに関し、このブタサイトカインは他のブタタンパク質が事実上存在せず、他の種の骨髄細胞の存在の下でブタ骨髄細胞の増殖および移植を選択的に増強する。この見地の実施例は、ブタ組織抽出物などのような天然のブタ組織源から分離されたサイトカイン、ブタを起源とする他のタンパク質あるいは高分子から事実上遊離しているような培養細胞および同等のものが含まれる。他の実施例としては、発現システムを形成する原核あるいは真核宿主細胞において発現ベクターを使用するものを含む組換え技術により調製されたサイトカインを含む。発現ベクターは、ブタ細胞あるいは組織抽出物から分離されたmRNAに相補性であるように調製されたcDNAの断片であるサイトカインのための構造コーディング配列を含有することが出来る。その他の実施例は、同様のブタサイトカイン骨髄増殖および移植活性を示すような発現システムの融合タンパク質製品を含む。更に別の実施例は、化学的に合成されるようなタンパク質、およびそれと事実上相同であるいずれかのタンパク質あるいその断片を含む。
核酸およびアミノ酸配列両方で引用される「事実上相同」という用語は、主題配列例えば突然変異体配列が1個もしくはそれ以上の置換、欠失あるいは付加により参照配列から変化するが、その正味の効果は参照および主題配列の間で逆作用の非類似性を生じることはないということを意味する。この発明の目的のために、90パーセント以上の相同性、同等の生物活性、および同等の発現特性を持つ配列は事実上相同であると見做される。相同を定義するために、成熟配列の截断は無視されねばならない。相同の度合の低いもので類似する生物活性、同等の発現特性を持つ配列は、等価物であると見做される。
ここで使用されるある種の追加用語の定義は、これらの用語の境界を考える手引きを提供する。ここで使用される「組換え体」は、タンパク質が組換え体(例えば微生物あるいは哺乳類)発現システムから誘導されることを意味する。「rCHEF」は、組換えブタサイトカイン・キメラ増強因子を意味する。「微生物」は、微生物あるいは菌類(例えば酵母菌)発現システムを意味する。生成物として、「組換え微生物」は、基本的に天然の内因性物質から遊離し、関連する天然糖鎖形成を伴わないブタタンパク質と定義される。大抵の微生物の培養、例えば大腸菌で発現されるタンパク質は、糖鎖形成修飾から遊離しており、また酵母菌で発現されるタンパク質は、哺乳類細胞で発現されるものとは異なる糖鎖形成パターンを持つであろう。
「DNA分接」(DNA segment)は分離断片の形態で、もしくはより大きなDNA構築物の一成分として、DNAポリマーに関し、それは事実上精製された形態、すなわち雑菌混入の内因性材質から遊離しており、標準の生化学方法、例えばクローニングベクターを使用する方法などにより断片およびその成分ヌクレオチドの確認、操作および回収を可能とする量および濃度で少なくとも一度は分離されたDNAから誘導されてきた。このような分接は真核遺伝子に典型的に存在するイントロンによって分断されない読み取り枠の形で提供される。非翻訳DNA配列は、それがコーディング領域の操作あるいは発現で干渉しない読み取り枠から下流で存在する。「ヌクレオチド配列」はデオキシリボヌクレオチドのヘテロポリマーを意味する。一般にこの発明により提供されるタンパク質をコード化するDNA分接は、cDNA断片および短オリゴヌクレオチドリンカー、あるいは一連のオリゴヌクレオチドから、微生物あるいはウイルスオペロンから誘導される調節要素を含む組換え「転写単位」に発現することのできる合成遺伝子を提供するために組立てられる。
「組換え発現ベクター」は、(1)遺伝子発現、例えばプロモーターあるいはエンハンサーで調節役割を持つ一つの遺伝子要素あるいは要素群、(2)mRNAに転写されおよびタンパク質に翻訳される構造あるいはコーディング配列、および(3)適切な転写開始および終結配列、の組立てを含む転写単位よりなるプラスミドあるいはファージを意味する。酵母菌あるいは真核発現システムに使用することを意図する構造単位は、望ましくは宿主細胞により翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。代替的に組換えタンパク質がリーダーあるは輸送配列なしで発現される場合には、それはN末端メチオニン残基を含む。この残基は最終製品を提供するために発現組換えタンパク質から分割されることもあるいは分割されない場合もある。
一般に組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製および選択マーカーの起点、例えば「大腸菌」のアンピシリン寛容遺伝子および「麦酒酵母菌」TRP1遺伝子、更に下流構造配列の転写を誘導するための高度発現遺伝子から誘導されるプロモーターを含む。このようなプロモーターは、3−ホスホグリセレートキナーゼ(PGK),a−因子,酸性ホスファターゼあるいは、その他のものの中でも熱ショックタンパク質などのような解糖酵素をコード化するオペロンから誘導することが出来る。異種構造配列は、翻訳開始および終結配列、および望ましくは翻訳タンパク質の分泌を周辺腔および細胞外培地に向けることの可能なリーダー配列を用いて、適切な相で組立てられる。オプションとしては、異種配列は、望ましい特性、例えば発現された組換え製品の安定化および単純精製を付与するN−末端確認ペプチドを含む融合タンパク質をコード化することが出来る。
微生物用途に有用な発現ベクターは、ブタサイトカインをコード化する構造DNA配列を、適切な翻訳開始および終結シグナルと共に、機能プロモーターを有する操作可能読み取り相に挿入することで構築される。このベクターは1個もしくはそれ以上の表現型選択マーカーおよび宿主内での増幅を確実にするための複製起点を含むであろう。形質転換のための適切な原核宿主は、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、およびシュードモナス属、ストレプトミセス属、ぶどう球菌属などの属にある核種の種を含むが、他のものも選択の問題として採用することが出来る。
代表的な例として必ずしもそれに限定されないが、微生物用途のための有用な発現ベクターは、既知のクローニングベクターpBR322(ATCC 37017)の遺伝子要素を含む商業的に利用できるプラスミドから誘導される選択マーカーおよび微生物複製起点を含むことが出来る。このような商業的に利用できるベクターは、例えばpKK223−3(スエーデン,ウプサラ、ファルマチア・ファイン・ケミカルズ)、およびpGEM1(アメリカ合衆国、ウイスコンシン州、マディスン,プロメガ)を含む。これらのpBR322「バックボーン」切片は適切なプロモーターおよび発現さえる構造配列と組合せられる。融合タンパク質の一部としての組換えCHEF−3タンパク質をグルタチオン−S−転移酵素と共に産出するための微生物発現システムの使用に関する追加的な詳細が後記実施例3で提供される。
適切な宿主菌株の形質転換および適切な細胞密度の成長に引き続き、選択されたプロモーターが適切な手段(例えば温度偏位あるいは化学誘導)により抑制解除され、細胞は更に一定期間培養される。細胞は遠心分離により典型的に採取され、物理的化学的方法により分断され、生成する粗抽出液は再に精製されるために保持された。
各種の哺乳類細胞培養システムも組換えタンパク質を発現するために使用することが出来る。哺乳類発現システムの例は、グラズマン「細胞」23巻、175ページ(1981年)に記載されたサル腎臓繊維芽細胞のコス−7ライン、および適合性ベクターを発現することのできる他の細胞ライン、例えばC127,3T3,CHO,HeLaおよびBHKなどの細胞ラインを含む。哺乳類発現ベクターは、複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、更にまた必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体および受容体部位、転写終結配列、および5′フランキング非転写配列を含むであろう。SV40ウィルスゲノム、例えばSV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、およびポリアデニル化部位などから誘導されたDNA各配列は、必要とされる非転写遺伝子要素を提供するのに使用される。組換えCHEFタンパク質を生産するための哺乳類高発現ベクターの使用に関し追加的な詳細が実施例で提供される。
微生物培養で生産される組換えタンパク質は通常細胞ペレットからの初期抽出により分離され、次いで1個もしくはそれ以上の塩析、水性イオン交換あるいはサイズ排除クロマトグラフィー段階へと続く。成熟タンパク質の立体配置を完成させるのに必要なため、タンパク質の再ひだ形成段階を使用することが出来る。最後に最終精製段階として、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)が使用される。CHEFタンパク質の発現に採用される微生物細胞は凍結溶解サイクリング、音波処理、機械的分断、あるいは細胞溶解剤の使用など何らかの便利な方法を使って分断することが出来る。分泌タンパク質としてCHEFタンパク質を発現する発現システムの使用は精製を大幅に単純化させる。
「組換え発現システム」は、適切な宿主微生物、例えば大腸菌のようなバクテリアあるいは麦酒酵母菌などの酵母菌の事実上相同単一栽培を意味する。これらの宿主微生物は組換え転写単位を染色体DNAにしっかりと組み込み、あるいはその組換え転写単位をレジデントプラスミドの一成分として保持する。一般にシステムを構成する細胞は、単一祖先型形質転換細胞の後代である。ここで定義される組換え発現システムは、発現されるDNA分接あるいは合成遺伝子に結合する調節要素の誘導に伴い異種タンパク質を発現する。
成熟ブタサイトカインは、適切なプロモーターの制御の下で哺乳類細胞、酵母菌、バクテリア、あるいはその他の細胞に発現することが出来る。無細胞翻訳システムもまた、この発明のDNA構築物から誘導されるRNAsを使用してブタサイトカインを生産するのに使用することが出来る。原核および真核宿主を使用する適切なクローニングおよび発現ベクターは、マニエイタス、「分子クローニング:実験マニュアル」(コールドスプリング・ハーバー社、ニューヨーク,1985年)に記述されており、その開示内容は参考文献としてここに統合されている。
この見地の望ましい1実施例は、現在確認され分離され、用意されているブタサイトカインキメラ現象強化因子3(CHEF−3)に関する。CHEF−3のタンパク質およびDNA配列、更にその1個のコーディング配列は添付の図面で示されており、またこれらが確認された方法は実施例で記述される。この見地のCHEF−3ブタサイトカインは、ブタ骨髄祖先細胞、より詳細にはブタ骨髄造血細胞、幹細胞および理想的にはブタ造血幹細胞の増殖を選択的に増強する。ここで「CHEF−3」として引用されるブタサイトカインは、配列識別番号4で示されるポリポプチド配列を持つ。
この見地のも一つの望ましい実施例は、ブタサイトカインキメラ現象増強因子(CHEFs)、とりわけ現在確認され、分離され用意されているCHEF−2に関する。CHEF−2のタンパク質およびDNA配列、更にその一つの可能なコーディング配列は添付図面で示されており、これらが確認された方法は実施例で記述される。この見地のブタサイトカインは、ブタ顆粒球細胞およびマクロファージ細胞の増殖を選択的に増強する。ここで「CHEF−2」として引用されるブタサイトカインは、配列識別番号11で示されるポリペプチド配列を持つ。
この見地のも一つの望ましい実施例は、ブタサイトカインキメラ現象増強因子(CHEFs)、とりわけ現在確認され、分離され用意されているCHEF−1に関する。CHEF−1のタンパク質およびDNA配列、更にその1個の可能なコーディング配列が添付図面で示され、それが確認される方法が実施例で記述される。この見地のブタサイトカインは、ブタ顆粒球細胞およびマクロファージ細胞の増殖を選択的に高める。ここで「CHEF−1」として引用されるブタサイトカインは配列識別番号21として示されるポリペプチド配列を持つ。
この発明のも一つの望ましい見地は、CHEF−3およびもしくはCHEF−2およびもしくはCHEF−1活性および少なくとも1個の追加タンパク質の活性、とりわけ造血ブタサイトカイン活性を含有する融合タンパク質に関するだけでなく、更に発現促進タンパク質、例えばCHEFタンパク質の分離のために例えばトロンビンなどにより分割出来る実施例2で示されるグルタチオンS転換酵素などのタンパク質に関する。
この発明のも一つの見地は、CHEF−3およびもしくはCHEF−2およびもしくCHEF−1と、この発明のCHEF−3およびもしくはCHEF−2およびもしくはCHEF−1を除く他のブタ始原タンパク質あるいはブタ天然源高分子から事実上遊離する他のブタサイトカインとの組合せに関する。
も一つの見地において、この発明は、この発明のCHEFの一つ、例えばCHEF−3,CHEF−2あるいはCHEF−1と、も一つのブタサイトカイン、望ましくはそれがとりわけ造血分化、および異種ブタ骨髄移植を増強するためそれが共力して相互作用するブタサイトカインの双方を発現することができる一つの発現ベクターを提供する。望ましい実施例はCHEF−3あるいはCHEF−1とブタ白血病阻止因子(LIF)との組合せを含む。
この発明のも一つの見地において、ブタ細胞、とりわけ骨髄および造血細胞の形質導入の効率は、この発明の1個もしくはそれ以上のブタサイトカインと共に誘導されるベクターを含む培地で形質導入が実行される時に著しく増強される。一般に骨髄細胞は、CHEF−1,20ng/mlおよびCHEF−3,100ng/ml,それに追加サイトカインと共にもしくはそれなしの存在の下で培養される。他の種で行われる形質導入実験から類推して、200倍までの細胞増殖の増加が期待され、受容体への転移に先立ち幹細胞形質導入および複製の効果が著しく向上した。
この発明のも一つの見地は、この発明のサイトカインの量の上昇を発現するよう修飾された形質移入ブタ細胞あるいは組織を提供する。例えば骨髄間質細胞は、ブタにとってユニークでありかつブタ骨髄の生存および成長に基本的であるタンパク質であるCHEF−1を発現するベクターで形質移入あるいは形質導入され得る。修飾された間質細胞は次いで他のブタ骨髄と共に共同移植され移植を改善する。
も一つの見地において、ブタサイトカインは始原生殖細胞および内細胞塊誘導細胞を含む全能性および多能性幹細胞の培養における生存力および維持量を増強する。これらの幹細胞は、必ずしもそれに限定されないが、移植抗原をコード化する遺伝子を含む対象となる遺伝子の発現のための培養で修飾されかつ選択され得る。このような幹細胞は、未分化細胞として培養内で成長するためのブタサイトカインを必要とするが、それは組織移植前段階で発育宿主胚芽と染色体再対合する際に、いずれかの体細胞あるいは胚芽細胞タイプに分化することが出来る。対象となる遺伝子を発現するため修飾された幹細胞からのルートによって創り出されるいくつかの動物は、修飾を保持する生殖体を生産し、修飾を適切に発現するラインを作り出すよう育種することができる。代替的に修飾幹細胞は核転移処理を用いて遺伝子導入動物を作り出すのに使用することが出来、この処理で幹細胞核が不受精除核卵母細胞に誘導され、修飾を保持する遺伝子的に均一な子孫のもとになる。マウス系から類推して、ブタにおいては少なくともいくつかのブタサイトカイン(例えばCHEF−3およびCHEF−3/LIFの組合せ)が生殖細胞発育を含む生理機能に役立つことが予測される。マウスでそうであるように、幹細胞因子CHEF−3のブタ相同体は、初期移植後胚胎(発情後期23−30日)の生殖隆起から誘導される胚胎生殖細胞の培養に決定的な成分であるかにみえる。CHEF−3は1ng/mlから1ug/mlまでの濃度の溶解因子として、あるいは支持細胞の膜結合成分としてこの目的のために提供される。最終結果は、形質あるいはタンパク質製品などのような一つの新規な表現形、すなわち相同受容体の臓器の免疫プロフィルに免疫的により近いものを与える異種移植供与を意図した特定の臓器の修飾免疫プロフィルである新規な表現形を発現するブタの遺伝子導入菌種を生産する能力である。
この発明のブタサイトカインは「誘導化合物」としても有用であり、これは修飾することが出来、あるいは受容体もしくは他の分子との構造/機能相互作用が低分子量の擬態あるいは拮抗質を合成あるいはスクリーンするために研究することが出来る。このような修飾はその標的細胞に対する化合物の活性を増加し、薬理学的半減期を増大し、種の特異性を増強し、あるいは化合物の抗原性を減少させるように設計されたものを含むことができる。
この発明のも一つの主要な見地は、ブタCHEFサイトカイン、その組合せあるいはそれと他のブタサイトカイン自身と組合せたもの、もしくは完全に分化しているかあるいは始原細胞の拡張された培養としてブタ骨髄あるいは造血細胞と組合せたサイトカインをブタ移植臓器の誘導の前に意図された受容体に誘導することによって、ヒト受容体のような異種移植宿主にブタ臓器の寛容を誘導する方法である。
組織あるいは臓器の異種移植の場合、移植の供与体および寛容誘導骨髄を供給する動物は、望ましくは同一の免疫プロフィルのものである。例えば非常に近交である供与体のコロニーから移植組織を得ることが望ましい。移植組織は肝臓,腎臓,心臓,骨あるいは骨格基質などの身体の部分、皮膚、腸、内分泌腺などの組織、あるいは各種の始原幹細胞などのような臓器よりなる。このような移植で最初に考えられたものは、肝臓、腎臓、心臓あるいは肺などのような固形で、形成され、より高度に機能分化した臓器である。
この発明のも一つの見地は、この発明の1個もしくはそれ以上のブタサイトカイン、あるいは1個もしくはそれ以上のブタサイトカインを含む組成物を、骨髄の回収の前に骨髄供与ブタに投与することによって、ブタ骨髄供与体における骨髄増殖により刺激を与えることである。例えば、移植および寛容の誘導にとっては、一つの改良された移植製品である特異な始原細胞個体群に富む骨髄を採取することが望ましい。この製品は移植および寛容の誘導を増強する。採取された骨髄は、一つの改良された移植製品である骨髄個体群を創り出すために各種のCHEFsの存在の下で生体外で培養することか出来る。この製品は移植および寛容の誘導を増強するであろう。
この発明のも一つの見地は、前記細胞をこの発明のブタサイトカインに曝すことを含む異種受容体にあるブタ骨髄細胞の増殖を増強する方法に関する。関連する一つの見地は、組織の移植に先立ちあるいはそれと同時にブタサイトカインあるいはこの発明に従って他の事実上純水なブタサイトカインとの混合物を受容者に誘導することによって、受容体哺乳類にあるブタ骨髄細胞の移植を増強する方法を提供する。投与量の幅および投与ルート、養生、担体、その他は以下で検討される。サイトカインは望ましくは静脈内注射で全身投与される。
受容体に注入された供与体の骨髄細胞(BMC)は受容体の適当な部位に向かい、宿主細胞を残しながら引き続き成長し、増殖してキメラリンパ球造血個体群を形成する。この過程により新しく形成されたB細胞(およびそれが生産する抗体)は供与体の抗原に曝され、かくして移植が自身として認識されるであろう。供与体に対する寛容もまたBMC(骨髄細胞)移植が行われた動物内でT細胞レベルで観察される。骨髄キメラ現象が誘導された後に臓器移植がそのような受容体に設定される時には、移植片は免疫機構の体液性および細胞性アームにより受容される。この発明に従ってブタサイトカインの使用はブタ骨髄細胞を選択的に刺激して受容体に移植を提供するものとなる。
骨髄細胞を誘導する方法は、とりわけ(1)骨髄の注入と組織の移植の間の時間を増大し、(2)注入するBMCの量を増加もしくは減少させ、(3)BMC注入の回数を変化させ、(4)BMCのデリバリ方法を変え、あるいは(5)BMCの源を変化させることにより変化する。組織供与体より誘導されるBMCは望ましくはあるが、BMCは他の個体あるいは種から、もしくは遺伝子工学同系繁殖供与体菌種から、あるいは試験管内細胞培養から得ることが出来る。
この発明のも一つの見地において、新規なブタサイトカインはブタ個体群が罹患しやすい各種の感染や病気の予防あるいは治療に役立つことが認識されている。このような疾患の例は、ブタが回復のための顆粒球活性を特に当てにするもの(アフリカブタ熱など)、あるいは一般化された免疫抑制に導くことの出来るもの(例えばブタコレラ、偽狂犬病、ブタインフルエンザ)などである。
この発明のも一つの主要な見地において、CHEFタンパク質、断片あるいは誘導体、もしくはその類似体、あるいはそれらを発現する細胞は、それに対する抗体を生産する免疫原として使用することが出来る。これらの抗体は、例えばポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単一連鎖、Fab断片、あるいはFab発現ライブラリーなどである。先行技術の各処理方法はポリクローナル抗体の生産に使用することが出来る。モノクローナル抗体の調製のために、連続細胞ライン培養により生産される抗体を提供する何らかの手法が使用されている。この例はハイブリドーマ(融合雑種腫瘍細胞)手法(ケーラーおよびミルシュタイン,1975年,「ネイチュア」256巻495−497ページ)、トリオーマ手法、ヒトB細胞ハイブリドーマ手法(コズボー他、1983年「今日の免疫学」4巻、72ページ)、およびヒトモノクローナル抗体を生産するEBVハイブリドーマ手法(コール他、1985年「モノクローナル抗体および癌治療」アラン.R.リス社,77−96ページ)である。単一連鎖抗体の生産で記載される手法(アメリカ合衆国特許番号4,946,778)は、CHEF特異的単一連鎖抗体を生産するのに適合することが出来る。これら抗体はこの発明のタンパク質配列の局在化および活性に関連する方法、例えばこれらタンパク質をイメージし、適切な生理的サンプルその他でそのレベルを測定するなどの方法に使用することが出来る。
この発明は、更に薬剤組成物を提供する。このような組成物は治療に有効量のブタサイトカイン、および薬理的に許容出来る担体あるいは賦形剤よりなる。この担体は必ずしもそれに限定されないが、食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、これらを組合せたものを含む。この処方は投与方法に適合すべきものである。
望ましい実施例において、この組成物は人間に対する静脈投与に適した薬理組成物として従来の方法に従って処方される。典型的には、静脈投与のための組成物は無菌等張性水性緩衝液の溶液である。必要な場合には、組成物は注入部位の苦痛を和らげるために更に溶解補助剤および局所麻酔剤を含むこともある。一般にこの成分は、別個に、あるいはユニット処方形態、例えば活性剤の量を示すアンプルあるいはサッシェ(1回袋)のような密封容器での連結乾燥剤あるいは無水濃縮物として供給される。組成物が点滴で投与される場合には、それは無菌薬理標準水あるいは食塩水を含有する点滴ビンで調剤することが出来る。組成物が注射で投与される場合には、注射用水あるいは食塩水のアンプルが用意され、成分は投与の前に混合される。
この発明の治療薬は、中性あるいは塩の形態で処方される。薬理的に許容できる塩は、塩酸、りん酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導される遊離アミノ基で形成される塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどで形成される遊離カルボキシル基で形成される塩を含む。
ブタサイトカインの投与方式は必ずしもそれに限定されないが静脈内、筋肉内および皮下のルートである。化合物はいずれかのルート、例えば点滴あるいはボーラス注射により投与され、他の生物学的活性剤と一緒に投与することが出来る。投与は望ましくは全身的であり、例えば個別に静脈内点滴により、あるいはブタ骨髄細胞との組合せ(望ましくは混和物)で全身投与される。
この発明は更にこの発明の薬剤組成物の1個もしくはそれ以上の成分で充填される1個もしくはそれ以上の容器よりなる薬剤パックあるいはキットを提供する。薬剤あるいは生物学的製品の製造、使用あるいは販売を管轄する政府機関により規定された形の通知がこのような容器に添付されており、この通知は人への投与に対し、政府機関による製造、使用あるいは販売に関する許可を表している。
ブタサイトカインは受容体にブタ骨髄の移植を促進するのに有効な量で使用される。一般にこの量は体重キログラム当たり少なくとも5μgであり、大抵は500μg/kg以上は必要としない。望ましくはそれは少なくとも20μg/Kgであり、通常は約100μg/Kgを必要としない。サイトカインは少なくとも7日間で投与されるが、一般に30日を越えることはなく、典型的な治療期間は7日から14日間である。サイトカインは望ましくは、1日1乃至3回静脈内もしくは皮下に投与され、最適な効力および薬理学的処方に合致するよう調節されることになろう。
以下の実施例は、その範囲に限定することなく、いくつかの見地においてこの発明を説明する。以下に設定される実施例は下記の通りである。
実施例1.ブタサイトカインの造血に特異的な種
実施例2.ブタCHEF−3cCDNA遺伝子の分離および配列化
実施例3.大腸菌から発現されるGST−CHEF−3融合タンパク質
実施例4.コス細胞内でのCHEF−3の発現およびブタ骨髄検定を使用する検出
実施例5.ブタCHEF−2cDNA遺伝子の分離および配列化
実施例6.大腸菌から発現されるチオレドキシン−CHEF−2融合タンパク質
実施例7.コス細胞内でのCHEF−2の発現およびブタ骨髄検定を使用する検出
実施例8.ブタCHEF−1cDNA遺伝子の分離および配列化
実施例9.大腸菌から発現されるGST−CHEF−1融合タンパク質
実施例10.コス細胞内でのCHEF−1の発現およびブタ骨髄検定を使用する検出
実施例11.CHEF−3とブタLIFの共働作用組合せ
実施例1.
ブタサイトカインの造血に特異的な種
末梢血末梢血の源:ヒトボランティアが研究の主旨を知らされ、血液提供のため告知同意書(インホームドコンセント)に署名した。動物供与体(ブタおよびマカクザル[マカカ・ファスキュラリス])より末梢血末梢血の調達は実験動物の取扱いおよび使用のための承認観察記録(プロトコール)にしたがって行われた。
末梢血末梢血単核細胞の分離:末梢血末梢血は静脈穿刺により供与体からヘパリン化ヴァキュテナー▲R▼管(ニュージャージー州、ラザフォード,ベクトン.ディキンソン)で得られた。末梢血末梢血は等量のリン酸塩緩衝食塩水で希釈され、ヒストパック(比重1.077gm/1,ミズリー州、セントルイス,シグマ)で層にされ、2000rpmで15分間遠心分離された。低密度単核細胞(RBMNC)が培地−ヒストパック・インターフェイスで分離され、イスコーヴス修飾ダルベッコ培地(IMDM,メリーランド州,ゲイザーズバーグ,GIBCO BRL)で2回洗浄された。IMDMは胎仔ウシ血清20%(FBS,メモリーランド州、ゲイザーズバーグ,GIBCO BRL)、L−グルタミン1%(メリーランド州、ゲイザーズバーク,GIBCO BRL),ペニシリン−ストレプトマイシン1%(10,000単位/mlの各抗生物質溶液、(メリーランド州、ゲイザーズバーグ,GIBCO BRL)および2−メルカプトエタノール1×10-4M(ミズリー州、セントルイス,シグマ)を含んでいる。
リンパ球馴化培地(LCM)の調製:分離PBMNCがイスコーヴス修飾ダルベッコ培地(IMDM,メリーランラド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL)で1×106/mlの濃度に調節された。IMDMは胎仔ウシ血清20%(FBS,メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL),1−グルタミン1%(メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBO BRL)、ペニシリン−ストレプトマイシン1%(10,000単位/mlの各抗生物質溶液、メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL)、および2−メルカプトエタノール1×10-4Mを含んでいた。植物性血球凝集素(PHA)(メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL)がPBMNCを含む1ml/100mlの濃度の培地で細胞に加えられた。PBMNC100mlが組織培養フラスコ(162cm2、マサチューセッツ州、ケンブリッジ、コスター)に置かれ、7日間37℃、雰囲気炭酸ガス5%の下で保温された。7日目の終わりに、遠心分離(2000rpm,10分間)により細胞をペレット化して上澄みが採取され、0.22mmフィルター(マサチューセッツ州、ケンブリッジ、コスター)を通して無菌濾過された。
骨髄細胞:骨髄はブタあるいはサルの骨から得られた。サルの大腿骨はテキサス霊長類センター(テキサス州、アリス、ヘーゼルトン・リサーチプロタクツ)から購入された。骨は供与体から採取され、一晩湿潤氷の上に置かれ、骨髄細胞は翌日分離された。ブタ骨髄細胞は同じ日に調達されたブタ腎臓供与体の肋骨(マサチューセッツ州、チャールズタウン,マサチューセッツ総合病院、移植生物学研究センター)から分離された。無菌状態の下で、骨はより小さな小片に切断され、骨髄は削られてダルベッコ・リン酸緩衝食塩水(メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL)の溶液を用いて洗浄された。この食塩水はクエン酸リン酸塩デキストロース溶液10%(ミズリー州、センルトイス,シグマ)およびゲンタマイシン100mg/ml(メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL)を含有する。骨髄細胞(BMC)はリン酸緩衝食塩水溶液(前記使用)で数回洗浄され、RPMI−1640培地(メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL)で再懸濁された。この培地はFBS10%および組織培養フラスコで2×106/mlの細胞濃度(75cm2フラスコ当り15ml)でのゲンタマイシンを含有する。BMCは一晩37℃,炭酸ガス5%の下で保温され、その後非粘着細胞はフラスコから採取され、RPMI−1640培地で洗浄された。これらの細胞はクローン原性検定に使用された。
クローン原性検定:サルBMC対ブタBMCの滴定が続行され、ここでブタおよびサルBMCの集合全体が検定培地の48,000−50,000細胞/mlの濃度で平板培養された。この研究では4個の組合せが用いられた。サル50×103:ブタ0×103,サル32×103:ブタ16×103,サル16×103:ブタ32×103,およびサル0×103:ブタ50×103がそれである。加えてコロニー形成の線形性を確実にするために、サルおよびブタBMCは16および32×103/mlの濃度で個別に平板培養された。これらの検定に使用された培地は、FBS30%、ブタLCM5%あるいはサルLCM5%のいずれかもしくは両方のLCM5%、およびメチルセルメロース1.15%のIMDMベースの培地(カナダ,ブリティッシュコロンビア州、バンクーバー,テリーフォックス研究所)であった。対照培養はいずれのLCM源も持たなかった。培養体は1ml量で35mmの平板内で二重に平板培養された(イリノイ州、ネイパービル、ナンク)。培養は7日間、37℃、炭酸ガス5%で保温され、(細胞数50個もしくはそれ以上で構成される)コロニーは1個のコロニーとして計数された。
増殖検定:ブタBMCの異なった種からのサイトカインに対する応答を比較するために、増殖検定が行われた。ブタBMC(2.5×104)は、培地200mlを含有する96個のウエル「u」底組織培養平板のそれぞれに平板培養された。培地ベースは無血清AIM−V培地(メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL)であり、これに対しブタ、サルあるいはヒトから得た0,1,3,5,7,あるいは10%のLCMが加えられた。各LCM濃度に対し3回の数値評価が求められたが。培養は6日間37℃、炭酸ガス5%で保温された。その後トリチウム標識チミジン1mCi[3H−Tdr,(イリノイ州、アーリントンハイツ,アマーシャム・コーポレーション)]が加えられ、培養は更に16時間保温された。培養平板はトムテック−ハーベスター(コネチカット州、オレンジ、トムテック インコーポレーテッド)を用いて7日目にガラス繊維フィルターの上で採取された。放射性サンプルは、ベータプレート・リーダー(メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL)を用いて決定され、結果は1分間当りの計数で表現された。
サルおよびブタ骨髄の混合物内で、ブタ骨髄細胞に特異な成長の有利性を提供するブタ特異的分子の結果が図1で示される。この培地システムにおいて、ブタ細胞はブタ特異的馴化培地にのみ応答し、サル馴化培地には応答しなかった。サル細胞はブタ馴化培地には応答しなかったが、サル馴化培地の存在の下でも10%のみの応答が観察された。従って、ブタ細胞の選択的成長がブタ特異的因子を使用して達成された。
ブタ骨髄細胞増殖の用量依存性および例外種特異性も更に図2で示される。ブタ骨髄細胞にトリチウム標識チミジン(T*)取込みは、IMDM培地(CM%)においてLCMの一連の濃度(V/V)にわたり、ブタ、サルおよびヒトLCMに曝された時に測定された。
実施例2.
ブタCHEF−3cDNA遺伝子の分離および配列化
内皮細胞の分離および培養:内皮細胞はライアン他(「組織と細胞」12巻、619−635ページ、1980年)が記述した通り、ミニチュアブタの大動脈から血管の管腔表面を削って取り出された。細胞は胎仔ウシ血清(メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL)20%およびゲンタマイシンを補足したM199培地で再懸濁され、フィブロネクチン(5μg/cm2)およびラミニン(1μg/cm2)でプリコートされた25cm2組織培養フラスコで平板培養された。150μg/mlの内皮細胞成長補足物(マサチューセッツ州、ベッドフォード、コラボレィティブ・リサーチ)が培養の最初の時点にのみ加えられた。培養は2−3日毎に半分が取り換え続けられた。継代培養は、単層が密集した時に2分間トリプシンEDTA(GIBCO BRL)0.25%で処理されることで進められた。培養は典型的な内皮細胞形態の相同細胞よりなっていた。この細胞はメッセンジャーRNA分離に使用される前に4回継代培養された。
オリゴタクレオチド:下記のオリゴヌクレオチドが、オリゴス・エトセトラ(オレゴン州ウイルソンビル)から購入された。
1.dL−1(配列識別番号1)5′−GCGCTGCCTT TCCTTATGAA G.
dL−1は5′未翻訳領域の15個のヌクレオチドおよびヒト幹細胞因子のためのシグナルペプチドの最初の2個のコドンを含む5′末端プライマーである(マーチン,F.H.他、「細胞」63巻、203−211ページ(1990年))。
2.FC−1(配列識別番号2):5′−TTAGGCTTTC CTATTACTGC TACT.
FC−1は最初の3個のヌクレオチドが人工の停止コドンよりなり、残る21個のヌクレオチドがマウスの幹細胞因子の分泌形態のアミノ酸173−179をコードする配列に相補性である3′末端プライマー(転写配列の逆転補体)である(アンダーソン,ディー.エッチ.他、「細胞」63巻,235−243ページ(1990年))。
RNA分離およびRNA PCR:RNAはブタ大動脈内皮細胞からグアニジン・イソチオシアネート4M内での溶解、および塩化セシウム5.7Mを経る超遠心分離により抽出された。RNA全体はパーキン−エルマー・シータス(コネチカット州、ノーウォーク)から購入されたRNA PCRキットを使用して逆転写された。アニーリングおよび逆転写酵素拡張条件は、25℃5分間、37℃5分間、42℃25分間であった。続く増幅はdL−1,5′オリゴヌクレオチドプライマーの追加および94℃1分間、50℃1分間、最終拡張72℃7分間のサイクル条件で行われた。断片はアガロース1%でゲル精製され、pBluscript KSII+(カリフォルニア州、ラホーラ,ストラータジーン)のEcoRV部位に直接サブクローンされ、pCHEF−3を生成した。
CHEF−3 cDNA遺伝子の配列は、シークエナーゼTMT7ポリメラーゼ・キット(オハイオ州、クリーブランド,ユーエス バイオケミカル)を使用してジデオキシ鎖成長終結法により、dL−1/FC−1 PCR製品の多重サブクローン配列化により決定された。すべての配列はpCHEF−3の挿入断片部で決定されたものと一致した。
DNAおよびタンパク質配列の比較がジーンワークス配列分析パッケージ(カリフォルニア州、マウンテンビュー,インテリジェネティクス)および下記の源から得た配列を使用して行われた。
1)ヒト幹細胞因子:マーチン,エフ.エッチ.他、「細胞」63巻、203−211ページ(1990年)
ジェンバンク・アクセス番号M59964
2)マウス幹細胞因子:アンダーソン,ディー.エッチ.他、「細胞う」63巻、253−243ページ(1990年)
ジェンバンク・アクセス番号M38436
3)ラット幹細胞因子:マーチン,エフ.エッチ.他、「細胞」63巻、203−211ページ(1990年)
ジェンバンク・アクセス番号M59966
図3はヌクレオチド(配列識別番号3)を示し、CHEF−3コード領域のアミノ酸(配列識別番号4)を予言した。pCHEF−3の挿入断片は、FC−1配列の逆補体(ヌクレオチド610−633)に結合する真正のブタ配列に(ヌクレオチド22−609)結合するdL−1(ヌクレオチド1−21)の配列よりなる。哺乳類細胞のタンパク質発現は、ヌクレオチド1−3によりコードされたメチオニンで開始し、ヌクレオチド613−615でコードされたアラニンで終結する。他の種で得られた幹細胞因子の研究に基づいて、哺乳類細胞は、シグナルポプチド切断による前記のものから誘導されるヌクレオチド76−78(太字)によりコードされるグルタミンでタンパク質開始を分泌することが予言される。比較出来る領域において、ヒト、マウスおよびラット種からの幹細胞で、CHEF−3 cDNA遺伝子はそれぞれ91%,87%および86%の核酸相同性を持つ。ブタCHEF−3遺伝子における3個のヌクレオチドの挿入断片を除けば、すべて単一ヌクレオチド置換である。アミノ酸レベルでCHEF−3はラットおよびヒト幹細胞で83%類似しており、一方CHEF−3とマウス幹細胞は80%類似している。
実施例3.
大腸菌から発現されるGST−CHEF−3融合タンパク質
この実施例はベクターpMDR1069(グルタチオン−S−転移酵素遺伝子融合タンパク質発現ベクター)を構築する方法を記述する。
CHEF−3配列の3′末端での翻訳終結コドンに続き、EcoRI部位挿入のためpCHEF−3は修飾された。pCHEF−3はHindIIIで切断され、末端はDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメント(インディアナ州、インディアナポリス,ベーリンガーマンハイム・バイオケミカルズ)を使用して「充填」された。EcoRIリンカー(pCGGAATTCCG[配列識別番号5]マサチューセッツ州、ビバリー,ニューイングランド・バイオラブス・インコーポレーテッド)はHindIII切断pCHEF−3に連結された。大腸菌JM101の形質転換の前に、HindIIIが再回送されるpCHEF−3を線状化するために結合反応に加えられた。アンピシリン寛容コロニーは650塩基対EcoRI断片の存在下でスクリーンされた。生成するベクターはpMDR1068として記載される。pMDR1068はPstIおよびEcoRIを用いて切断され、約650塩基対断片がLMA(低融点アガロース)により分離された。
pGEX−2Tが08854ニュージャージー州、ピスケータウェイ、ファーマシア・エルケイビー・バイオテクノロジーから購入された。このプラスミドpGEX−2Tは日本住血吸虫グルタチオン−S転移酵素(GST)との融合で遺伝子に高レベルの発現を誘導出来るものとして設計された。融合タンパク質からの26キロダルトンGST領域の切断は、多重クローニング部位からすぐ上流のトロンビンの認識配列の存在により促進される。pGEX−2TはEcoRIで切断され、脱リン酸化され、BamHIで切断された。4.9キロベースの断片がLMAにより分離された。
オレゴヌクレオチドCHEO2およびCHEO3が、アプライド・バオイシステムズ・インコーポレーテッド(カリフォルニア州、フォスター市)のオリゴヌクレオチド合成機で合成された。
CHEO2(配列識別番号6):5′−GATCACAAGG GATCTGCA
CHEO3(配列識別番号7):5′−GATCCCTTGT
DNA断片およびオリゴヌクレオチドは連結され、この連結ミックスは大腸菌JM101を形質転換するために使用された。アンピシリン寛容コロニーは、1500塩基対PstI断片の存在の下でスクリーンされた。生成プラスミドはpMDR1069として記載される。
GST−CHEF−3融合タンパク質のpMDR1069からの発現:
大腸菌JM101にあるpMDR1069の単一コロニーは50mg/mlのアンピシリンを含むテリフィック肉汁(TB)で一晩成育された(サンブルック他、「分子クローニング:ラボラトリーマニュアル」コールドスプリング・ハーバー出版)。一晩おいた0.5mlの培養は50mlのTB+50mg/mlのアンピシリンを加えられ、培養が600nmで測定される最適密度1に達するまで(350rpmで)37℃ではげしく震動させて成育された。アリコートが誘導前サンプルとして取り出され、次いでイソプロピル−b−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)が1mMの最終濃度のものに加えられた。誘導後1,3,5,および16時間にアリコートが取り出された。細胞は遠心分離され、タンパク質ゲルの還元緩衝剤で再懸濁され、10%のポリアクリルアミドSDSゲル電気泳動による分析の前に10分間煮沸された。ゲルはクーマシーブルーを使って染色された。プラスミドpGEX−2Tを含む細胞は負の対照として分析された。約46キロダルトンにあるタンパク質帯は、GST−CHEF−3融合タンパク質の誘導を示している。
図4は前記の通り用意された溶菌液のSDS−PAGE分析示す。IPTG(プレPRE)の導入に先立つサンプルおよび続くIPTG(ポストPOST)の5時間の誘導は(キロダルトンで)示されたタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導されたGST−CHEF−3融合タンパク質は矢印で示される。
実施例4.
コス細胞内でのCHEF−3の発現およびブタ骨髄検定を使用する検出
pCHEF−3EXP.pcd,CHEF−3タンパク質の分泌形態に対する真核発現ベクターの構築:
pCHEF−3はEcoRIおよびXhoIでのCHEF−3挿入断片に隣接するポリクローニング部位内で切断され、560個塩基対断片は低融点アガロース(LMA)から分離された。pcDNAI/Ampはインヴァイトロゲン・コーポレイション(カリフォルニア州、サンディエゴ)から購入された。pcDNAI/Ampは真核細胞内の組換えタンパク質の高次元の遷移性発現を促進する。プラスミドはEcoRIおよびXhoIで切断され、子ウシアルカリホスファターゼを用いて脱リンされた。ベクター断片はLMAから精製された。DNA断片は結合され、結合ミックスは大腸菌JM101を形質転換するため使用された。アンピシリン寛容コロニーは570個塩基対断片の存在下でスクリーンされた。生成プラスミドpCHEF−3EXP・pcdは図3で示されるpCHEF3(配列識別番号3)挿入断片の全配列を含む。
遷移形質移入コス細胞(COS cells)からのCHEF−3の発現:
コス7細胞はATCC(メリーランド州、ロックビル)から得られDMEM+胎仔ウシ血清10%(DMEM−10)で成育する。コス7細胞はOpti−MEM無血清培地(Gibco BRL)内でDNA2mg/mlおよびリポフェクチン試薬(Gibco BRL)15mg/mlを用いて5時間にわたり形質移入され、その後培地はDMEM−10で取り替えられた。細胞は72時間かけて成長し、上澄み培地は集められ、フィルターされ、CHEF−3の存在下で検定された。
形質移入コス細胞上澄み内でのCHEF−3の検出:
ブタBMCはウエル当り2.8×104細胞数の濃度で96個のウエル「u」底組織培養平板で平板培養された。培地基礎は修飾イーグル培地(MEM−199,メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL)で、FBS13%を含んでいた。この培地はモック形質移入コス細胞もしくはpCHEF−3EXP−pcd形質移入コス細胞のどちらかの(12倍)の上澄みの濃度で5%(V/V)に作られた。培養は5日間37℃で5%炭酸ガスの下で保温された。各ウエルは1マイクロキューリー3H−Tdrでパルスされ、更に16時間追加保温された。培養平板はトムテック・ハーベスター(コネチカット州、オレンジ、トムテック・インコーポレーテッド)を用いてガラス繊維フィルター上に採取された。サンプルの放射性容量はベータプレート・リーダー(メリーランド州、ゲイザーズバーク、ウォーレス・インコーポレーテッド)を用いて決定され、結果は1分当りの計数量で表された。
図5は追加試薬を入れないもの(対照)、pcDNAI/Ampで形質移入された細胞からコス上澄み(モック・コス)あるいは、pCHEF−3EXP.pcdで形質移入された細胞からの上澄み(CHEFコス)のブタ骨髄細胞の増殖反応が前記の通り検定されたことを示すものである。
実施例5.
ブタCHEF−2cDNA遺伝子の分離および配列化
末梢血末梢血リンパ球からのRNA分離:
ヒトボランティアおよびミニチュアブタから末梢血末梢血単核細胞が実施例1で記述された通り分離された。全RNAはチャーグウィンの方法(「バイオケミストリー」18巻、5294ページ,1979年)に従って分離された。ポリA+RNAは製造業者の指示に従ってポリUセファデックス・クロマトグラフィ(メリーランド州、ゲイザーズバーグ、GIBCO BRL)を用いて分離された。
ヒトGM−CSF cDNA分離:
ヒト末梢血末梢血単核細胞(PBMCs)からの全RNAは、植物性血球凝集素(PHA,GIBCO BRL)の1%の存在下で72時間保温され、逆転写され、実施例2で示されるようにポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に使用された。下記のプライマーが使用された。
1)リバース転写プライマー:XN−2(配列識別番号14)5′−TGGTTCCCAG CAGTCAAAGG G.XN−2はめん羊GM−CSF cDNA遺伝子のヌクレオチド416−436のリバース補体である(マッキネス,シー.ジェイ.およびヘイグ,ディー.エム.「遺伝子」105巻、275−279ページ(1991年)ジェンバンク・アクセス番号Z18291)。
2)フォワードPCRプライマー:XW3(配列識別番号8),5′−TTGGGCACTG TGGCCTGCAG C.XW3はヒトGM−CFS cDNA遺伝子のヌクレオチド57−77から誘導される(リー,エフ.他「全米科学アカデミー紀要」82巻、4360−4368(1985年)。ジェンバンク・アクセス番号M14743)。
3)リバースPCRプライマー:XW4(配列識別番号9)5′−ACAGGAAGTT TCCGGGGTTG G.XW4はヒトGM−CSF cDNA遺伝子のヌクレオチド351−371のリバース補体である(リー,エフ.他「全米科学アカデミー紀要」82巻、4360−4368ページ(1985年)。ジェンバンク・アクセス番号M14743)。
生成する315塩基対断片は標準の方法を用いてpBluescript KS+(カリフォルニア州、ラホーラ,ストラータジーン)のEcoRV部位にサブクローンされ、プラスミドphuGM#23を創出した。任意に感作されたプローブ(T7 クイックプライム。ニュージャージー州、ピスケイタウェイ、ファーマシア)が低融合点アガロースゲルから分離されたクローン挿入断片を用いて準備された。T7RNAポリメラーゼ、アンチセンス転写物はリボプローブ転写キット(ウィンスコンシン州、マジスン,プロメガ)を使って形成された。
ブタリンパ球馴化培地およびリンパ球RNA:
ブタ(ミニチュアブタ)PBMCは基本的に実施例1に記載されたように培養された。細胞は植物性血球凝集素(PHA)1%、PHAおよび12ミリスチン酸塩13アセテート・フォルボール(PHA+PMA;ミズリー州、セントルイス、シグマ)5ng/ml、あるいは試薬を加えないもの(対照)のいずれかで24時間処理された。第1日(処理の直後)に細胞は洗浄され追加の処理をせずに新しい培地の4個のアリコートに分割された。RNAは1アリコートの細胞から分離され、対応する馴化培地が第2日−第5日に集められた。
濾過された上澄みは下記に述べる増殖刺激活性の存在下で検定された。ウエル当り25,000個の細胞数のブタ骨髄細胞が96個のウエル組織培養平板に置かれた。各ウエルは培地(イスコーヴズ修飾ダルベッコ培地,胎仔ウシ血清10%および馴化培地10%(V/V))200μlを含んでいた。培養は3重に平板培養され、37℃7日間保温された。第6日に各ウエルは3H−Tdr(ウエル当り1マイクロキューリー)を含む培地20μlでパルスを与えられた。細胞はハーベスター(トムテック)を使って採取され、組み込まれた3H−Tdrはベータ平板リーダーを使って検出された。数値は三個のウエルの平均値である。
RNAは(ティー.マニエイティス編「分子クローニング:ラボラトリーマニュアル」に記載されているアガロース・ホルムアルデヒドゲル上で分画され、製造業者の指示通りナイロン膜質(ジーンスクリーン;デュポン エヌイーエヌ)に移された。RNAブロットは5×SSPE(1×SSPEは塩化ナトリウム0.15M,リン酸二水素ナトリウム0.01M,EDTA0.001M)のヒトGM−CSFアンチセンスRNA5×105cpm/ml、ホルムアルデビド緩衝液50%,42℃で雑種形成され、2×SSPE,ドデシル硫酸ナトリウム0.1%,62℃で洗浄された。
cDNAライブラリー構築およびスクリーニング:
ポリA+RNAは前記記載のPHAで16時間処理した後5日目にブタ末梢血単核細胞から分離された。EcoRIアダプターを持つ二本鎖cDNA(dscDNA)は、製造業者の指示に従って、タイムセイバーcDNA合成キット(ファーマシア)を使用して調製された。dscDNAはラムダ置換ベクター1gt−10(カリフォルニア州、ラホーラ,ストラータジーン)に結合され、パッケージーン・キット(プロメガ)を用いてパッケージングされた。生成ファージは大腸菌株NM514に増幅された。スクリーニングのために、増幅ファージ1×105が菌株c600Hfl(プロメガ)を用いて150mm平板で平板培養された。独立クローン3×105から増幅されたファージを含む6個の二層フィルターセットは、5×SSPE緩衝液内で50℃で任意に感作されたphuGM#23プラスミド挿入断片に雑種形成され、2×SSPE緩衝液で50℃で洗浄された。上述のように最初のスクリーンで推定上実在するものが第二ラウンドのスクリーンにかけられた。上記のものから選択されたクローン1NC1−1AからのDNAは、配列化のため液状溶菌液培養から調製された。
CHEF−2cDNAクローンの配列化:
クローン1NC1−1AからのDNAが1gt−10フォワードおよびリバース配列化プライマーおよびエフモル(fmol)配列化キット(プロメガ)を使って挿入断片のいずれかの末端から配列された。他の種からのGM−CSF配列に事実上相同であることを確認した後、挿入断片はNotIで1NC1−1Aから取り除かれ、プラスミドpcDNAI Amp(カリフォルニア州、サンディエゴ,インヴァイトロゲン)のNotI部位にサブクローンされた。ベクターCMVプロモーターに関して適切な5′−3′配向を持つ1個のクローンはpCHEF−2と呼ばれた。pCHEF−2・pcdからの挿入断片は実施例2で記載されるシークエナーゼ配列キット(オハイオ州、クリーブランド、ユーエス・バイオケミカル)を用いて両連鎖で完全に配列された。
DNAおよびタンパク質配列比較が、ジーンワーク配列分析パッケージ(カリフォルニア州,マウンテンヴュー,インテリジェネティクス)を使って行われ、配列は下記の源からのものが使われた。
1)ヒトGM−CSF:リー,エフ.他「全米科学アカデミー紀要」82巻、4360−4368(1985年)。ジェンバンク・アクセス番号M14743。
2)マウスGM−CSF:宮竹,エス.他。「EMBO J。」4巻,2561−2568頁(1985年)。ジェンバンク・アクセス番号K01850。
3)めん羊GM−CSF マッキネス,シー.ジェイ.およびヘイグ,ディー.エム.「遺伝子」105巻、275−279ページ(1991年)ジェンバンク・アクセス番号Z18291。
4)ウシGM−CSF:マリズースキー,シー.アール.他。「分子免疫学」25巻843−850ページ(1988年)。
図6で示されるように、ブタ末梢血単核細胞からの全RNAのノーザンブロットは、ヒトGM−CSF cDNAクローンphuGM#23からのアンチセンスRNAプローブに対し緊縮の低い状態で雑種形成された。細胞は16時間PHA,あるいはPHAおよびPMAで処理され、洗浄され、次いで処理の開始から2−5日に採取された。約800nt(矢印)の相同転写物は4−5日のPHA処理で誘導される。数多くの構成要素として発現された転写物は低い緊縮条件下でプローブに対し雑種形成する。
図7で示されるように、図6で示されたRNA分析に使用される細胞から採取された馴化培地は、ブタ骨髄増殖活性を検定された。ヒトGM−CSFに相同な転写物の誘導に続き、5日目のPHA処理細胞の培地には著しい活性の増加が見られた。
図8はヌクレオチド配列(配列識別番号10)およびクローン11NC1−1A並びにサブクローンpCHEF−2.pcdの配列化により決定されたCHEF−2 cDNA遺伝子の誘導アミノ酸配列(配列識別番号11)を示す。哺乳類細胞の発現は、典型的な哺乳類シグナルペプチドを開始する最初のATG(位置23,太字)で出発し、TAA終始コドン(位置455,太字)まで続く。ヌクレオチド1−7(アンダーライン部)および789−798(アンダーライン部)は、cDNAライブラリー構築で使用されたNotI/EcoRIアダプターから誘導される。コーディング領域内で、CHEF−2は、マウス、めん羊、ヒトおよびウシの各種からのGM−CSFでそれぞれ70%,88%,81%および81%の核酸相同性を持つ。シグナルペプチドを含めて、CHEF−2はマウスGM−CSFの54%,めん羊GM−CSFの80%,またヒトおよびウシGM−CSFの72%のアミノ酸同一性を有する。
実施例6.
大腸菌から発現されるチオレドキシン−CHEF−2融合タンパク質
この実施例はベクターpDA110(チオレドキシ遺伝子融合タンパク質発現ベクター)の構築方法を記述する。
成熟CHEF−2配列の分離:
成熟CHEF−2(図8,ヌクレオチド81−461)に対応する127アミノ酸をコードする381塩基対は、PCR技術を用いてクローンされた。2個のヌクレオチドが遺伝子増幅のために合成された。この配列は、以下に示される。
DA14(センスプライマー;配列識別番号12):
5′−CGACGGTACC GGCTCCCACC CGCCCACCC
DA15(アンチセンスプライマー;配列識別番号13);
5′−AGGATCTAGA GGATCCTCAT CACTTTTTGA CTGGCCCCCA
オリゴヌクレオチドは、増幅断片の5′末端が完全KpnI部位(GGTACC)を持ち、また3′末端がCHEF2遺伝子の停止コドンの下流に完全XbaI部位(TCTAGA)を持つように設計された。KpnI部位はCHEF−2断片のチオレドキシン配列に対し枠内連結反応するよう設計された。
クローン1NC1−AはCHEF−2 cDNAを含有する。このクローンから分離されたDNAは、各dNTP200μM,各プライマー0.5μM,塩化マグネシウム1.5mM,トリス(pH8.3)10mM,塩化カリウム50mM,ジメチルスルホキシド8%、およびアンプリタクDNAポリメラーゼ0.25ユニットを含む反応物50μlで増幅された(パーンエルマーDNAサーマルサイクラー・モデル480)。反応物は35サイクルで94℃で0.5分、55℃へ1分でランプ、55℃で0.5分、72℃へ0.5分でランプ、72℃で、0.5分、94℃へ1分でランプの形でサイクルされた。PCR製品はポリアクリルアミドゲル10%で分析された。主要製品帯は約400塩基対であり、これは414塩基対の予想サイズによく合致した。製造業者のプロトコールに続いて、DNAはマジックPCRプレップス(ウィスコンシン州,マジソン,プロメガ)を使って精製された。全サンプルはまずKpnIで消化され、次いでXbaIで消化された。CHEF−2を含有するKpnI/XbaI断片は再びマジックPCRプレップスの使用でより小さい断片(10塩基対以下)から精製された。
プラスミドpTRXFUS(ラヴァリー他「バイオ/テクノロジー」11巻、187−193ページ,1993年)はジェネティクス・インスティチュート(マサチューセッツ州、ケンブリッジ)から得られた。製造業者の指示に従って、pTRXFUS DNAはマジックマキシ・キット(ウィンスコンシン州、マジソン、プロメガ)を使って分離された。DNAの1アリコート(4μg)がまずKpnIで消化され、次いでXbaIで消化された。両制限酵素がうまく切断されれば20塩基対以下の断片だけがベクターから除去されるので、DNAは引き続きアルカリ性ホスファターゼ(子ウシの腸)で処理された。3580塩基対KpnI/XbaIベクター断片は次いでアガロースゲル0.8%で精製された。ベクター断片およびPCR断片は結合され、受容能大腸菌株GI698(ラヴァリー他,「バイオ/テクノロジー11巻、187−193ページ、1993年)に形質転換された。推定上のクローンはHincII制限消化分析によりスクリーンされた。チオレドキシン−GM−CSF融合タンパク質をコードする遺伝子を含む生成プラスミドはプラスミドpDA110として定義される。
チオレドキシン−CHEF−2の発現:
大腸菌GI698(pDA110)の単一コロニーはラヴァリー他により記述された通り、アンピシリン100μg/mlを含む修飾M9CAA2mlで一晩23℃で成長した。一晩置かれた培養はアンピシリン100μg/mlを含む新鮮な修飾M9CAA10mlに(1:50で)希釈され、また23℃で2時間成長した。1mlの培養が誘導前サンプルとして除去され、またトリプトファン(最終濃度0.49mM)がチオレドキシン−CHEF−2の発現を導入するために加えられた。18時間後に培養1mlは遠心分離された。誘導前(プレ)および誘導後(ポスト)細胞はSDS/還元緩衝液で再懸濁され、そのいずれもSDSポリアクリルアミド・ゲル12%で分析された。プラスミドpTRXFUSは発現のための正の対照として使用された。ゲルはクーマシーブルーで染色され、約27.3キロダルトンで新しいタンパク質帯が誘導後サンプルで観察されたが、誘導前サンプルでは見られなかった。この新しいタンパク質帯のサイズは、チオレドキシン−CHEF−2融合タンパク質の予測されたサイズと合致する。
図9は前記の通り用意された溶菌液のSDS−PAGE分析を示す。IPTG誘導前(プレPRE)およびIPTG誘導後5時間(ポストPOST 5h)あるいは誘導後16時間(ポストPOST 16h)の各サンプルは、(キロダルトン)で示されたタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導チオレドキシン−CHEF2融合タンパク質は矢印で示される。
実施例7.
コス細胞内でのCHEF−2の発現およびブタ骨髄検定を使用する検出
pCHEF−2EXP.pcd,真核発現ベクターの構築:
pCHEF−2.pcdはCHEF−2挿入領域(図8のヌクレオチド574)内のユニークXcmI部位で、またNotI挿入部位の下流にあるpcDNAI/Ampポリリンカー領域内のユニークXhoI部位で消化された。突出末端はクレノウフラグメントで平滑にされ、DNAはT4DNAリガーゼで再循環された。クローンpCHEF−2EXP.pcdは前記DNAの大腸菌形質転換細胞から分離され、図8のヌクレオチド574までのCHEF−2配列3′の欠失によりpCHEF−2とは異なるDNA配列化により示された。この領域がそれまでの真核mRNA分子の不安定性と関連する配列ATTTAの多くの繰り返しを含んでいるため、この欠失はコス細胞にCHEF−2RNAが高次元で累積することを可能にする。ヌクレオチド480はCHEF−2の翻訳停止コドンまでの3′であるので、図8に示される予期されるアミノ酸配列の変更はない。
遷移形質移入コス細胞からのCHEF−2の発現:
CHEF2は実施例4でCHEF−3に対し記述されたように、コス細胞の遷移発現により発現された。
コス細胞上澄み内でのGM−SCF増殖活性の検出:
ブタ供与体10758から得たブタ骨髄細胞(BMC)は大腿骨から無菌で採取され、リン酸緩衝食塩水溶液で洗浄され、骨粒子を除去するため傾瀉(デカンテーション)された。BMCは続いて2040rpmのローター速度を使い、密度およびサイズを増加して細胞を溶離させるためのフローレートを50および70ml/minに増大する連続フロー遠心水簸により分離された。これらのフローレートで集められた画分は番号1および2である。画分2が集められた後、ローターおよび液状フローが停止し、チャンバに残っている細胞がペレット化することになった。これがチャンバから採取され、増殖検定に使用される画分3細胞となった。
イスコーヴズ修飾ダルベッコ培地および胎仔ウシ血清10%内での分画されたブタ骨髄細胞(ウエル当り25,000個の細胞数)は96個のウエル・マイクロタイタ平板に加えられ、これに濃度を増大したコス細胞上澄みが加えられて最終容量が200μl/ウエルになるように調節された。細胞は37℃で3日間保温され、2日間に細胞は3H−Tdr(ウエル当り1マイクロキューリー)でパルスされ、ウエルはその24時間後に採取された。計数はベータプレート・リーダーに基づいて測定され、3個のウエルの平均値で表現された。
図10は、CHEF−2発現プラスミドpCHEF−2EXP.pcd(pGM−CSF)あるいはpcDNAI/Ampのみ(モック−CM)により形質移入されたコス細胞のコス細胞上澄みにおけるGM−CSF増殖活性の検出を示すものである。
実施例8.
ブタCHEF−1cDNA遺伝子の分離および配列化
ブタIL−1(CHEF−1)遺伝子を含むゲノムクローンの分離:
1個のゲノムライブラリーが、ミニチュアブタ(遺伝子型a/a)末梢血末梢血単核細胞DNAのSau 3AI部分消化を用いてベクター1gem−12(ウイスコンシン州、マジソン,プロメガ)に構築された。このライブラリーはGM−CSF(図11.クローン1S1−2,1S4−1および1S4−2)のブタゲノム配列の少なくとも一部を含む3オーバーラップクローンを分離するために、クローンpCHEF−2.pcd(実施例5)のcDNA挿入断片でスクリーンされた。CHEF−2遺伝子の転写の方向に関連するクローンの配向性は、CHEF−2遺伝子のエキソン1(XN1;(配列識別番号24):5′−AGGATGTGGC TGCAGAACCT G)あるいはエキソン4(C2X4;(配列識別番号15):ACATCTGCCA TTTCCCCTGC C)に特異的なオレゴヌクレオチドプローブでファージ制限消化物のサザンブロットを雑種形成することにより測定された。CHEF−2遺伝子の上流にある配列(ファージ|S4−2からの1.7キロベースXbaI断片。図11の座標23−25)はゲノムライブラリーを再スクリーンするために使用された。オーバーラップクローンが分離され、制限地図が描かれた。1個のクローン,|S1E−3はCHEF−2プロモーターの上流にある6−22キロベースの配列を含むことが発見された。このクローンはオリゴヌクレオチドプローブOL−2(配列識別番号16;5′−CTATGGAGGT TCCATGTCAG ATAAAG)を雑種形成し、この配列は、霊長類、めん羊およびげっ歯類のそれぞれの種のプロモーター領域の間で保存される。このクローンは更にオリゴヌクレオチドプローブILX5(配列識別番号17;5′−ATGTTCATTT GTACCTC)に雑種形成し、この発明は同じ種の3′未翻訳領域の間で保存される。ゲノムDNA配列は同じ2個のプライマーを用いて得られ、この配列は、オリゴヌクレオチドILP−F(配列識別番号18;5′−AGACAGGATCCATCGTACCG)およびILP−R(配列識別番号19;5′−CTCATTCAGA AGGAGCAGGC)を設計するために使用され、これらのオリゴヌクレオチドは他の種にあるIL−1遺伝子の転写出発およびポリアデニル化部位に関連するOL−2およびILX−5に相同な配列の位置に基づいて、CHEF−1遺伝子の推定上の5′および3′未翻訳領域からの配列を含んでた。
CHEF−1をコードするcDNAの分離:
プライマーILP−FおよびILP−Rは、実施例5で記述されたように調製されたPHAで4日間処理したブタ末梢血末梢血単核細胞からのポリA+RNAより誘導されるオリゴdT感作cDNAから約800塩基対のPCR製品を創出するために使用された。この製品は(ILP−F配列内で切断する)BamHIで消化され、pcDNAI/AmpのBamHI/Eco RV部位にクローンされた。1個のクローンはpCHEF−1.pcd1と名付けられ配列された。
CHEF−1遺伝子の配列化:
ジデオキシ配列化が、cDNAクローンpCHEF−1.pcd1から誘導されるPCRおよびCHEF−1ゲノム遺伝子(図11の座標29−35)を含む|S1E−3のEco RIサブクローンであるC1G−2のエキソン領域で実施された。ゲノム配列は、すべてのタンパク質コーディングエキソン領域で得られ、またcDNA配列はpCHEF−1.pcd1挿入断片の全長に沿つて得られた。同時に、この配列は全体としてCHEF−1タンパク質コーディング領域の両方の鎖よりなり立っていた。ゲノム配列およびcDNA配列はタンパク質コーディング領域を通じて完全に合致していた。
DNAおよびタンパク質配列比較がジーンワーク配列分析パパッケージ(カリフォルニア州、マウンテンヴュー,インテリジェネティクス)および下記の源からの配列を用いて行われていた。
1)ヒトIL−1:ヤン,ワイ.−シー.他「細胞」47巻、3−10ページ(1986年)。ジェンバンク.アクセス番号M14743。
2)マウスIL−1:ファン,エム.シー.他.「ネイチャー」307巻,233−237(1984年)。ジェンバンク−アクセス番号K01850。
3)めん羊IL−1:マッキネス,シー.ジェイ.他.未発刊。ジェンバンク・アクセス番号Z18291。
4)テナガザルIL−1:ヤン,ワイ.−シー.他「細胞」47巻、3−10ページ(1986年)。ジェンバンク.アクセス番号M14744。
図11はCHEF−1クローニング段階を図で表す。分離されたゲノムDNAの制限地図がキロベースの尺度で下記に示される(S:SfiI;X:XbaI;Z:XhoI)。底部の線の図形はブタゲノムライブラリーの2回のスクリーニングで分離されたファージを表わす。GM−CSF(CHEF−2)およびIL−1(CHEF−1)オリゴヌクレオチドプローブに雑種形成する領域が示される。
図12はpCHEF−1.pcd1のヌクレオチド配列(配列識別番号20)および誘導アミノ酸配列(配列識別番号21)を示す。最初のATG(太字)は、ヌクレオチド24で出発し、典型的な哺乳類シグナルペプチドで開始し、ヌクレオチド456(太字)で始まるTAA終結コドンまで続くオープンリーディングフレーム(読みとり枠)の先頭に立つ。アンダーラインの配列は、PCRプライマーILP−F(ヌクレオチド1−15,アンダーライン付き)から誘導され、またILP−Rのリバース補体(ヌクレオチド740−760,アンダーライン付き)は、CHEF−1cDNAをPCRにより分離するために使用される。遺伝子のコーディング領域の範囲内で、CHEF−1はめん羊、ヒト、マウスおよびテナガザル種のそれぞれの遺伝子に、66%,47%,47%および52%の核酸相同性を持つ。シグナルペプチドを含めて、CHEF−1はアミノ酸同一性をめん羊では46%,ヒトは34%,マウスは26%,テナガザルIL−1については33%を持つ。
実施例9.
大腸菌から発現されるGST−CHEF−1融合タンパク質
この実施例は大腸菌内の溶解性CHEF−1の発現のためのベクターpEXIL−4の構築方法を記述する。ホン.ハイイーネの方法(「核酸研究」14巻,4683−4690.1986年)を使用して、推定上のシグナルペプチド切断部位が図12のMet1に先行して決定された。成熟物(哺乳類分泌形態)をコードするCHEF−1cDNA遺伝子の一部は363ヌクレオチド(図12−ヌクレオチド93−455)であり、13.8キロダルトンのタンパク質をコードする。
成熟CHEF−1配列のPCRによる分類:
下記のオリゴヌクレオチドが成熟CHEF−1の363オリゴヌクレオチドを増幅するため合成された。
FE2Chf1:(配列識別番号22)5′GGGGAATTCA TATGCCTACC ACAACACTC.FE2Chf1は成熟CHEF−1の最初の18ヌクレオチド(アンダーライン部のヌクレオチド)を含むセンスPCRプライマーである。Met1(ATG)コドンはNdeI部位(CATATG)内に含まれる。加えてMet1の上流部はEcoRI部位(GAATTC)である。
REChf1:(配列識別番号23)5′CCCAAGCTTG GATCCTATTA GGGCTCTGTG ATCATGGG.REChf1は縦列停止コドン(TAA TGA)および成熟CHEF−1の最後の18ヌクレオチドを含むアンチセンスPCRプライマーである。停止コドンの下流はBamHI(GGATCC)およびHindIII(AAGCTT)部位である。
プライマーFE2Chf1およびREChf1は、pCHEF−1.pcd1 DNAから約390塩基対を持ちPCR製品を創り出し、この製品は真核発現ベクター,pCNDAI/AMPにクローンするCHEF−1 cDNAを含む。DNAは、各dNTP200μM,各プライマー0.5μM,塩化マグネシウム1.5mM,トリス(pH8.3)10mM,塩化カリウム50mM,ジメチルスルホキシド8%、およびアンプリタックDNAポリメラーゼ0.25ユニットを含む反応液50μl中で増幅(パーキンエルマーDNAサーマルシリンダーモデル480)された。この反応液は35サイクルに対し0.5分94℃,1分で55℃にランプ、0.5分55℃,0.5分で72℃にランプ、0.5分72℃,1分で94℃にランプしてサイクルされた。
大腸菌内でCHEF−1発現のためのpEXIL−4の構築:
PCR製品はアガロースゲル1%で分析された。主要帯は約390塩基対の予想されたサイズで観察された。反応混合物はフェノール/クロロホルムで注出され、次いでエタノール沈殿された。断片およびプラスミドpGEX−KG(ガンおよびディクソン「分析生化学」192巻,262−67ページ、1991年)はいずれもEcoRIおよびHindIIIで消化され、ついで結合された。受容能大腸菌JM109細胞は連結混合物で形質転換された。正のクローンはEcoRI/HindIIIで制限消化分析により確認された。GST−CHEF−1を含む生成プラスミドはpEXIL−4として表示される。
GST−CHEF−1の発現:
大腸菌JM109の単一コロニー(pEXIL−4)は、アンピシリン100μg/mlを含むルリア肉汁(LB)2mlで37℃一晩培養された。一晩の培養は、アンピシリンを含む新鮮なLB10mlで(1:50)に希釈され、次いで2時間37℃で成長した。培養物1mlが誘導前サンプルとして取り出され、1mMの最終濃度になるようにIPTGが加えられた。3.5時間後、培養液1mlが遠心分離された。誘導前、および誘導後細胞はSDS/還元緩衝液で再懸濁され両方ともSDSポリアクリルアミドゲル12%で分析された。プラスミドpGEX−KGは発現のための正の対照として使用された。ゲルはクーマシーブルーで染色され、約40キロダルトンで新しいタンパク質帯が誘導後サンプルで観察されたが誘導前サンプルでは見られなかった。この新しいタンパク質帯のサイズは、GST−CHEF−1融合タンパク質の予想サイズに一致する。
図13は前記の通り調製された溶菌液のSDS−PAGE分析を示す。IPTG誘導前のサンプル(プレPRE)およびIPTG誘導(ポストPOST)3.5時間後(ポストPOST)のサンプルが、(キロダルトンで)表示されるタンパク質分子量マーカーで分析された。誘導GST−CHEF−1融合タンパク質は矢印で示される。
実施例10.
コス細胞内でのCHEF−1の発現およびブタ骨髄検定を用いる検出
CHEF−1EXP.pcd,真核発現ベクターの構築:
pCHEF−1.pcd1はBamHI(図12のヌクレオチド2)およびHpaI(図12のヌクレオチド593)で完全に消化され、生成する592塩基対断片はpcDNAI/AmpのBamHI/EcoRV部位に再クローンされた。生成した構築物pCHEF−1EXP.pcdはCHEF−1に対するすべてのコーディング配列を含んでいたが、3′未翻訳領域に含まれる不安定配列ATTTAを欠失していた。適切な構築はDNA配列化により立証された。
遷移性形質移入コス細胞からのCHEF−1の発現:
CHEF−1は実施例4でCHEF−3について記述されたように、コス細胞の遷移性形質移入によりpCHEF−1EXP.pcdで発現された。
コス細胞上澄みにおけるCHEF−1増殖活性の検出:
pCHEF−1EXP.pcdあるいはpcDNAI/Ampで形質移入されたコス細胞上澄みからの生物活性の検出は次のように検定された。ブタ骨髄細胞は、熱不活性化胎仔ウシ血清10%を含むイスコーヴズ修飾ダルベッコ培地で、96ウエル「U」底培養平板のウエル当り10,000細胞数の濃度で平板培養された。コス細胞上澄みがこの培地に適切なパーセント(V/V)で加えられた。3日間の検定で、培養は2日間保温された3H−Tdr 1マイクロキューリーが加えられ、平板は3日目に採取された。7日間の検定では、培養は6日間保温され、3H−Tdr1マイクロキューリーが加えられ、平板は7日目に採取された。結果は分あたりの計数(cpm)であり、3個のウエルの平均値で表わされる。
図14は3日間の生物学的検定においてCHEF−1を含むコス細胞上澄みに対する増殖応答を示す。馴化培地0.078%の用量で細胞活性の約10倍の増加が検出されたが、CHEF−1を更に増量してもそれ以上の増加は見られなかった。
図15は7日間生物学的検定においてCHEF−1を含むコス細胞上澄みに対する増殖応答を示す。7日間増殖からの結果は馴化培地0.078%のみで同じような10倍までの増加を示したが、CHEF−1の用量を増加させると、1.25%以上のCHEF−1含有コス細胞上澄みは、約40倍までの細胞活性の更なる増加を検出させた。
実施例11.
CHEF−3とブタLIFとの共働作用組合わせ
ブタ白血病阻止因子(LIF)単独の場合と比較したCHEF−3とブタLIFとの組合せによる増殖の刺激およびコロニー形成が試験された。7日間の増殖検定におけるブタ骨髄細胞の増殖を刺激するLIFの能力が、0−100ng/mlの用量範囲にわたりテストされ、その結果は図16に示された。2−3倍の増殖が、50ng/mlで検出された最適刺激レベルで検出された。BMCがCHEF−3の一定のレベル[コス細胞上澄み20%]にしてLIF用量を増加させるように共培養された時には、100ng/mlのLIF用量が4倍以上の細胞増殖を刺激した。これらの結果は、LIFを単独で使用すると血清を含む増殖で軽い増殖の徴候が見られるが、それをCHEF−3と組合せると各因子を加えた効果以上の大きなレベルにまで応答が高められたことを示している。
この観察を更に支援し、実証すると、LIFおよびCHEF−3の組合せは増殖を刺激するだけでなく、コロニー形成検定においてコロニーの形成を刺激することになる。BMCはCHEF−3[コス細胞上澄み10%および20%]の存在の下でLIFの用量を増加して培養された。組合せてコロニーを形成するこれら2個の因子の潜在能力は図17で示される。これらの結果が示す所では、LIF単独では小さな刺激活性を有するだけであるが、CHEF−3と組合せると、CHEF−3,10%が使用されたLIF用量が100ng/mlに増量された場合コロニー数は11CFUから57CFUに増加した。最大のコロニー数はCHEF−3,20% LIF50ng/mlの存在する場合に形成された。これらの結果はLIFおよびCHEF−3の組合せがBMC増殖を相乗強化し、コロニー形成と相関するという増殖検定からの観察を支持するものである。
ブタ骨髄細胞(BMC)を霊長類骨髄間質細胞に移植することに関してLIFおよびLIFと組合せたCHEF−3の短期の効果もまた研究された。増殖およびコロニー形成研究の結果は、ブタ[同種異系allo]あるいは霊長類[異種xeno]骨髄より得た前成間質細胞の一次培養を用いて長期骨髄培養(LTBMC)で更に展開された。培養1週間後の細胞充実度に対するLIFの作用が図18で示される。ここでは培地単独で成長した細胞と比較すると、LIFが存在した場合異種間質細胞に成長するブタBMCの細胞充実度は50%以上増加した。同じようではあるが、それほど著しくない増加(24%)が同種異系LTBMCで検出された。前成間質細胞が存在しない培養では、LIFの存在の下でも細胞充実度は減少した。7日後始原細胞数のほんの少しの増加がLIFの存在下で同種異系LTBMCで検出された(図19)。対照的に、LIFで刺激された異種LTBMCは始原細胞数は少し減少した。前成間質細胞のない培養は、始原細胞の成長については明白な効果を示さなかった。
最初の研究は、LIFと組み合わせたCHEF−3が細胞増殖およびコロニー形成を増強したことを確認した。同種異系間質細胞について1週間後(図20B)、CHEF−3単独の場合と、LIFと組合せたCHEF−3の存在の下での培養を比較すると、それぞれ260,000細胞数対740,000細胞数と後者で著しい細胞充実度の増加が見られた。しかしBMCが異種間質細胞で成長する場合(図20A)では、CHEF−3刺激培養とCHEF−3+LIF刺激細胞の間の細胞充実度に大きな差異は見られなかった。対照的に、CHEF−3単独での培養で検出されたものと比べてCHEF−3プラスLIFで培養された同種異系LTBMC(図21B)および同種異系LTBMC(図21A)で検出される始原細胞数がより多かった。更に、同種異系LTBMCからの細胞充実度は同種異系LTBMCで検出されるものの約33%に過ぎなかった(図19)としても、CHEF−3プラスLIFの存在下で、異種LTBMCで検出される始原細胞数は同種異系LTBMCで検出される数と略々同じであった。これらの結果は、同種異系あるいは異種LTBMCのいずれかでCHEF−3およびLIFの組合せが始原細胞の発育を刺激し、異種骨髄間質細胞の成長を増強するための観察を拡張するというとを実証する。
異種間質細胞における原始骨髄細胞長期保存についてのLIFおよびCHEF−3プラスLIFの効果
異種LTBMCにおける始原細胞の細胞充実度および世代ならびに保存に関するLIFの長期の効果が図22A−22Dで示される。LIFを7週間異種LTBMCで培養すると、培地対照物で観察されたものより高いレベルの細胞数保存が見られた(図22A)。培地培養およびLIF処理培養(図22B)の間では始原細胞量に微妙な差異があり、LIF処理培養には5週間および7週間でより大きな始原細胞数がみられた。これはLIFが始原細胞の長期保存の持続を促進することを示していた。LIFの2週経過のものが7週経過のものと比較されたが、細胞充実度への著しい効果は観察されなかった(図22c)。代りに、培養培地からLIFを除去した後の培養における動態および始原細胞量に著しい変化が見られた(図22D)。始原細胞数はLIFによる連続処理(図22B)と比較して、3週間を通じて増加し、このレベルを5週間通じて維持した。これらの結果は原始細胞が始原細胞に成育あるいは応答することを制約する調節特性を持つことを示している。
CHEF−3およびLIFの組合せの下で成育する異種LTBMCは、CHEF−3単独で処理されるLTBMCで観察されたものよりも7週間の細胞および始原細胞生産量がより大きいものであった。これらの結果が示す著しい特徴は、CHEF−3+LIFで刺激された培養で2週間および3週間経た後に、細胞数および始原細胞数がより高い数を示したことであった。4週目の細胞充実度および始原細胞量は減少したが、続く7週には、細胞充実度は、着実に増加し始原細胞は劇的に反騰した。これらの結果は、このLIFプラスCHEF−3の組合せの2個の価値ある局面を確認することになる。第一のものは細胞および始原細胞を増強する能力であり、第二は異種間質環境における長期移植を有利にすることである。この後者の解釈は、培養7週後に細胞充実度および始原細胞量の顕著な回復で支持される。CHEF−3+LIF培養で7週で見出される細胞は顆粒細胞系列の芽細胞および未熟細胞であり、これは増殖活性を示すものであったが、一方他の培養情報から得られた細胞は末端培養に特徴的な主としてマクロファージであった。
図16.ブタBMCの増殖に対するLIFおよびLIFプラスCHEF−3の効果。ブタBMCは、ウエル当たり10,000細胞数の濃度で、(ウエル当たり全量200ulの)胎仔ウシ血清[FBS]10%を含むイスコーヴス培地を入れた96個のウエル円底組織培養平板で平板培養された。一組のウエルに対し、LIFが0−100ng/ml(n)の一連の希釈液に加えられた。第二組のウエルに対しては、培地はCHEF−3を含むコス細胞上澄み20%で作られ、LIF希釈液が加えられた(0)。培養は37℃,炭酸ガス5%で7日間成育された。培養の6日目に3H−Tdr,1mCiが加えられた。平板の細胞はトムテック・ハーベスターを用いて7日目に採取され、ベータプレート・リーダーを用いて放射能が計数された。各データは3個のウエルの平均値である。
図17.コロニー形成に対するLIFおよびCHEF−3の効果。ブタBMC(25,000細胞数/ml)が、FBS30%を含みメチメセルロースで1.1%に作られたイスコーヴス培地にCHEF−3(用量0(n),10(0),および20%(u)のコス細胞上澄み)およびLIF(0,25,50および100ng/ml)の用量滴定を含む培地におかれた。1mlの量が2個平板に置かれ、14日間37℃炭酸ガス5%で培養された。コロニーは50細胞数以上を有するものとして係数された。
図18および図19.培養1週間後の細胞充実度(図18)および始原細胞発育(図19)に対するLIFおよび原始同種異系あるいは異種間質細胞のいずれかの効果。原始間質細胞は、FBS10%,ウマ血清10%およびヒドロコルチゾン10-6Mを含む培地199[標準LTBMC培地]に細胞数2×106/mlの濃度で24個のウエル平板に播種された霊長類[異種SC]あるいはブタ[同種異系SC]BMCのずれかにより3週間培養された後に定着した。培地は各週に取り替えられ、非粘着細胞個体群は半分瀉出された。間質層の成育の後、原始細胞は10Gyで照射され、培地が取り替えられ、次いで各ウエルは500,000個のブタBMCで播種された。対照培養[SC無し]は前成間質要素を含まなかった。変数は培地あるいはLIF50ng/mlを含む培地であった。7日が終わった後、粘着および非粘着細胞は3個のウエルから採取され、ウエル当りの細胞個数が測定された。各ウエルからの細胞のアリコートが、コロニー形成ユニットを測定するために、イスコーヴズ培地でPHA−LCM10%,エリスロポイエティン2U/ml,FBS30%を含むメチルセルロース培養で平板培養された。コロニーは前記の通りの基準で14日間培養の後計数された。プロットされた結果は3個の個別の実験の平均値である。
図20および図21.1週間培養後の細胞充実度(図20Aおよび図20B)および始原細胞発育(図21Aおよび図21B)に対するLIF,CHEF−3,あるいはLIF+CHEF−3および原始同種異系もしくは異種間質細胞のいずれかの効果。培養は図18の凡例で詳細に記載されたように株立ちされた。変数は標準LTBMC培地に対してLIF[50ng/ml],CHEF−3[コス細胞上澄み20%]あるいはこの両者の組合せのいずれかを追加することである。7日後、2個のウエルのすべての細胞が採取され、細胞数が計測されまた細胞の1アリコートがコロニー形成検出で平板培養された。
図22A−22D.異種LTBMCにおける細胞あるいは始原細胞成育に対する外因性LIFの連続対2週間の長期比較効果。原始霊長類間質細胞が前記の通り準備され、500,000個のブタBMCで播種された。細胞は標準LTBMC、あるいはLIF50ng/mlを含む培地のいずれかで平板培養された。LTBMCは適切な培地を使って各週に培養の栄養補給で維持された。2個のウエルからのすべての細胞は細胞培地の成育を実証するために週間隔で採取された。パネルAおよびパネルBでは、連続LIF(o)の細胞充実度および始原細胞成育に対する効果が培地(n)単独のものと比較された。パネルCおよびパネルDでは、LIF(o)は最初の2週間のみ培養で維持された。2週間経過後、培地は標準LTBMC培地で取替えられた。これは全培養期間にわたり培地単独(o)のものと比較された。
図23.連続CHEF−3あるいはCHEF−3+LIFの異種LTBMCにおける細胞および始原細胞の発育に対する長期効果の比較。LTBMCは株立ちされ、前述の通り設置された。これらの実験において、標準LTBMC培地はCHEF−3[コス細胞上澄み20%]あるいはCHEF3[20%]およびLIF[50ng/ml]で補足された。LTBMC成育の参考文献は前記記載のとおりである。
配列リスト
(1)一般情報:
(i)出願人:ホーリー,ロバート ジェイ.ポーナス,ポール ディー.ローザ,マーガレット ディー.モンロイ,ロドニー エル.シャクター,バーニス ゼッド.
(ii)発明の名称:異種移植寛容の増強およびブタサイトカン
(iii)配列の数:24
(iv)連絡先:
(A)受信人:キャレラ,バーン,ベーン,ジルフィラン,セスキ,スチュワート アンド オルスタイン
(B)通:ベッカー ファーム ロード 6
(C)市:ローズランド
(D)州:ニュージャージー
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:07068
(v)コンピューター読取りフォーム:
(A)媒体型式:3.5インチ ディスク
(B)IBM PC コンパチブル
(C)操作システム:MS−DOS 5.0
(D)ソフトウエア:ウインドー 2.0言語
(viii)弁護士/代理人情報:
(A)氏名:ヘロン,チャールズ ジェイ.
(B)登録番号:28,019
(C)参照/ドケット番号:61750−79
(ix)通信情報:
(A)電話:201−994−1700
(B)テレファックス:201−994−1744
配列識別番号1に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 21個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号1
配列識別番号2に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 24個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号2
配列識別番号3に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基対 633個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:二本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号3
配列識別番号4に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:アミノ酸 180個
(B)タイプ:アミノ酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:有り
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号4
配列識別番号5に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 10個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号5
配列識別番号6に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 18個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号6
配列識別番号7に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 10個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号7
配列識別番号8に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 21個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号8
配列識別番号9に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 21個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号9
配列識別番号10に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基対 798個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:二本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号10
配列識別番号11に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:アミノ酸 127個
(B)タイプ:アミノ酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:有り
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号11
配列識別番号12に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 29個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号12
配列識別番号13に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 40個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号13
配列識別番号14に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 21個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号14
配列識別番号15に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 21個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号15
配列識別番号16に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 26個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号16
配列識別番号17に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 17個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号17
配列識別番号18に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 20個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号18
配列識別番号19に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 20個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号19
配列識別番号20に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基対760個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:二本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号20
配列識別番号21に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:アミノ酸 121個
(B)タイプ:アミノ酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:有り
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号21
配列識別番号22に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 29個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号22
配列識別番号23に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 28個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号23
配列識別番号24に関する情報
(i)配列特性:
(A)長さ:塩基 21個
(B)タイプ:核酸
(C)連鎖:一本鎖
(D)トポロジー:線型
(iii)仮説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号24
配列リスト
(1)一般情報
(i)出願人:ホーリー,ロバート ジェイ.ポナス,ポール ディー.ローザ,マーガレット ディー.モンロイ,ロドニー エル.シャクター,バーニス ゼィー.
(ii)発明の名称:異種移植耐性の増強およびブタサイトカイン
(iii)配列数:24個
(iv)通信アドレス:
(A)受信人:キャレラ,バーン,ベイン,ジルフィラン,セスキ,スチュワート アンド オルスタイン
(B)通り:ベッカー ファーム ロード 6
(C)市:ローズランド
(D)州:ニュー ジャージー
(E)国:アメリカ合衆国
(F)ジップコード:07068
(v)コンピューター読取りフォーム
(A)媒体の型:3.5インチ ディスク
(B)コンピューター:IBM PC コンパチブル
(C)作動システム:MS−DOS 5.0
(D)ソフトウェア:Word for Windows 2.0
(viii)弁護士/代理人情報
(A)氏名:ヘロン,チャールズ ジェイ.
(B)登録番号:28,019
(C)参照/ドケット番号:61750-79
(ix)遠距離通信情報:
(A)電話:201−994−1700
(B)テレファックス:201−994−1744
配列識別番号1に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:21塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号1
配列識別番号2に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:24塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:あり
(xi)配列の記述:配列識別番号2
配列識別番号3に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:633塩基対
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:2本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号3
配列識別番号4に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:180アミノ酸
(B)タ イ プ:アミノ酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:有り
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号4
配列識別番号5に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:10塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号5
配列識別番号6に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:18塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号6
配列識別番号7に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:10塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号7
配列識別番号8に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:21塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号8
配列識別番号9に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:21塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号9
配列識別番号10に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:798塩基対
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:2本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号10
配列識別番号11に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:127アミノ酸
(B)タ イ プ:アミノ酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:有り
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号11
配列識別番号12に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:29塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号12
配列識別番号13に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:40塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号13
配列識別番号14に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:21塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号14
配列識別番号15に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:21塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号15
配列識別番号16に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:26塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号16
配列識別番号17に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:17塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号17
配列識別番号18に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:20塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号18
配列識別番号19に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:20塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号19
配列識別番号20に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:760塩基対
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:2本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号20
配列識別番号21に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:121アミノ酸
(B)タ イ プ:アミノ酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:有り
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号21
配列識別番号22に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:29塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号22
配列識別番号23に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:28塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:有り
(xi)配列の記述:配列識別番号23
配列識別番号24に関する情報
(i)配列特性
(A)長 さ:21塩基
(B)タ イ プ:核酸
(C)連 鎖:1本
(D)トポロジー:線形
(iii)仮 説:無し
(iv)アンチセンス:無し
(xi)配列の記述:配列識別番号24
Claims (29)
- 一つの単離されたブタサイトカインであって、ブタ幹細胞因子活性と配列識別番号4のアミノ酸1乃至アミノ酸180を含むアミノ酸配列に少なくとも90%の同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とするブタサイトカイン。
- 天然源の一つの精製タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第1項記載のブタサイトカイン。
- 一つの組み換えタンパク質であることを特徴とする請求の範囲第1項記載のブタサイトカイン。
- 他のブタサイトカインの活性化を刺激することを特徴とする請求の範囲第1項記載のブタサイトカイン。
- ブタ骨髄前駆細胞の増殖を優先的に増強することを特徴とする請求の範囲第1項記載のブタサイトカイン。
- ブタ骨髄造血細胞の増殖を優先的に増強することを特徴とする請求の範囲第5項記載のブタサイトカイン。
- ブタ骨髄幹細胞の増殖を優先的に増強することを特徴とする請求の範囲第6項記載のブタサイトカイン。
- ブタ造血幹細胞の増殖を優先的に増強することを特徴とする請求の範囲第7項記載のブタサイトカイン。
- 配列識別番号4で示されるポリペプチド配列を持つことを特徴とする請求の範囲第1項記載のブタサイトカイン。
- 一つの単離されたブタサイトカインであって、配列識別番号11のポリペプチド配列に少なくとも90%の同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とするブタサイトカイン。
- ブタ顆粒細胞およびブタマクロファージを優先的に増強することを特徴とする請求の範囲第10項記載のブタサイトカイン。
- 一つの単離されたブタサイトカインであって、配列識別番号21のポリペプチド配列に少なくとも90%の同一性を持つアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことを特徴とするブタサイトカイン。
- 請求の範囲第1項記載のブタサイトカインをコードすることを特徴とする一つのDNA。
- 請求の範囲第5項記載のブタサイトカインをコードすることを特徴とする一つのDNA。
- 請求の範囲第9項記載のブタサイトカインをコードすることを特徴とする一つのDNA。
- 請求の範囲第9項記載のブタサイトカインをコードし、配列識別番号3で示されるDNA配列を持つことを特徴とする一つのDNA。
- 請求の範囲第10項記載のブタサイトカインをコードすることを特徴とする一つのDNA。
- 請求の範囲第11項記載のブタサイトカインをコードすることを特徴とする一つのDNA。
- 請求の範囲第11項記載のブタサイトカインをコードし、配列識別番号10で示されるDNA配列を持つことを特徴とする一つのDNA。
- 請求の範囲第12項記載のブタサイトカインをコードし、配列識別番号20で示されるDNA配列を持つことを特徴とする一つのDNA。
- 請求の範囲第15項記載のDNAおよびその転写を支援するのに有効な一つの調節配列を含むことを特徴とする一つの発現ベクター。
- 請求の範囲第16項記載のDNAおよびその転写を支援するのに有効な一つの調節配列を含むことを特徴とする一つの発現ベクター。
- 請求の範囲第17項記載のDNAおよびその転写を支援するのに有効な一つの調節配列を含むことを特徴とする一つの発現ベクター。
- 請求の範囲第19項記載のDNAおよびその転写を支援するのに有効な一つの調節配列を含むことを特徴とする一つの発現ベクター。
- 請求の範囲第20項記載のDNAおよびその転写を支援するのに有効な一つの調節配列を含むことを特徴とする一つの発現ベクター。
- 請求の範囲第23項記載の発現ベクターであって、更に少なくとも一つのブタサイトカインのコーディング配列およびその転写調節配列を含むことを特徴とする発現ベクター。
- 請求の範囲第1項記載の増量されたサイトカインを発現するために形質移入されることを特徴とするブタ骨髄細胞。
- 請求の範囲第5項記載の増量されたサイトカインを発現するために形質移入されることを特徴とするブタ骨髄細胞。
- 請求の範囲第10項記載の増量されたサイトカインを発現するために形質移入されることを特徴とするブタ骨髄細胞。
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