JPH07503455A

JPH07503455A - 癌のリンホカイン遺伝子療法

Info

Publication number: JPH07503455A
Application number: JP5507903A
Authority: JP
Inventors: ソボル，ロバート　イー．; ゲイジ，フレッド　エイチ．; ロイストン，アイバー; フリードマン，シオドアー; ファクライ，ハビーブ
Original assignee: サン　ディエゴ　リージョナル　キャンサー　センター
Priority date: 1991-10-25
Filing date: 1992-10-23
Publication date: 1995-04-13
Anticipated expiration: 2019-05-10
Also published as: DE69230506T2; DK0668781T3; CA2121127A1; EP0668781B1; DE69230506D1; JP3524918B2; WO1993007906A1; EP0668781A4; EP0668781A1; GR3032660T3; ES2144426T3; ATE188125T1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】癌のリンホカイン遺伝子療法背景本出願は、１９９１年６月２５日に出願された米国特許出願第０７／７２０．８７２号の一部継続出願である１９９１年１０月２５日に出願された米国特許出願第０７／７８１．３５６号の一部継続出願である。両出願とも本明細書中に、全体が援用されている。

免疫系の生物学の我々の理解における近年の進歩は、サイトカイン（１−３）と呼ばれる免疫応答の重要なモジュレータ−を同定するに至った。リンパ球により産生される免疫系モジュレータ−が、リンホカインと名付けられており、サイトカインのサブセットのことである。これらの薬剤は、抗腫瘍性免疫に関与する多くの免疫応答を媒介する。数種のこれらのサイトカインが、組換えＤＮＡ法により生産され、それらの抗腫瘍効果について評価されてきた。リンホカインおよび関連する免疫モジュレータ−の投与は、種々の新生物を伴う被験体に、目的の腫瘍応答を引き起こす（４−７）。しかしながら、現在の様式でのサイトカイン投与は、これらの薬剤の治療上の価値を限定する毒性をしばしば伴う。

例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、抗腫瘍性免疫の獲得において重要なリンホカインである（４）。腫瘍性抗原に対する応答で、ヘルパーＴ細胞と名付けられるリンパ球のサブセットが、小量のＩし−２を分泌する。このＩＬ− ２は、腫瘍性抗原刺激部位で局所的に作用して、全身的な腫瘍細胞破壊を媒介する細胞障害性Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する。ＩＬ−２の静脈内、リンパ管内および病巣内投与は、数名の癌患者に臨床的に重大な応答を引き起こした（４−６）。しがしながら、激しい毒性（低血圧およびアデノーマ（ａｄｅａａ））により、静脈内およびリンパ管内ＩＬ−２投与の投与量および効能が制限される（Ｓ−７）。全身的に投与されたリンホカインの毒性は、これらの薬剤が局所的な細胞の相互作用を媒介し、そして通常非常に小量しか分泌されないので驚くべきものではない。

さらに、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、アルファインターフェロン（α− ＩＮＦ）　オよびガンマインターフェロン（γ−ＩＮＦ）のような他のサイトカインが、腫瘍細胞に対する免疫応答を刺激するために使用されてきた。ＩＬ−２と同様に、現在の様式での投与は、不利な副作用を有する。

全身的サイトカイン投与の毒性を回避するために、焼入かの研究者が、ＩＬ−２の病巣的注入を研究した。このアプローチは、全身的ＩＬ−２投与に関係する毒性を排除する（８．９．１０）。しかしながら、多数回の病巣的注入には、治療効能を最適化することが要求される（９．１０）。従って、多くの被験体に対して、特に、死亡する可能性を伴わずに注入が腫瘍部位に到達できない場合、これらの注入は実用的でない。

代替的なアプローチは、腫瘍細胞中へのサイトカイン遺伝子の転移を包含し、数種の動物腫瘍モデルで重大な抗腫瘍性免疫応答を引き起こした（１１−１４）。

これらの研究では、同系の宿主に移植された場合、サイトカイン遺伝子の腫瘍細胞中への転移に続（サイトカイン遺伝子産物の発現は、サイトカイン分泌腫瘍細胞の腫瘍形成性を停止させた。ＩＬ−２（１１，１２）、γ−ＩＮＦ（１３）またはインターロイキン−４（Ｉ　Ｌ−４＞　（１４）に対する遺伝子の転移は、いくつかの異なる組織学的タイプのネズミの腫瘍の成長を、顕著に減少させたかまたは排除した。ＩＬ−２遺伝子転移を用いる研究において、処置された動物はまた、全身的な抗腫瘍性免疫を獲得し、改変されていない親腫瘍による以後の腫瘍性の攻撃に対して保護された（１１．１２）。非改変親腫瘍細胞と、ＩＬ−２遺伝子を発現するように設計された遺伝的に改変された腫瘍細胞との混合を用いて、免疫処置を行い腫瘍成長の類似の阻害および防御免疫もまた証明された。これらの動物腫瘍の研究では、局所的なリンホカインの転移遺伝子の発現に関係する毒性は、全（報告されていない（１１−１４＞。

上記の遺伝子転移処理は、抗腫瘍性免疫を提供することが示されたが、未だ実用上の困難を宵している。はとんどの被験体の腫瘍がインビトロでの増殖のために樹立されておらず、ヒトのインビボでの遺伝子転移の方法も使用され得ないので、機能を有するサイトカイン遺伝子を、多数の被験体の腫瘍細胞中に転移できないことにより、このアプローチは制限される。

発明の要旨本発明は、新規で、より実用的なサイトカインの癌免疫治療の方法を示す。あるアプローチでは、例えば、日常的な皮膚バイオプシーから得られる線維芽細胞のような被験体由来の選択された細胞が、遺伝的に改変されて、１種またはそれ以上のサイトカインを発現する。または、マクロファージ、単球およびリンパ球のような、通常は免疫系において抗原提示細胞として働き得る被験体の細胞もまた、１種またはそれ以上のサイトカインを発現するように遺伝的に改変され得る。

以後、これらの改変細胞を、サイトカイン発現細胞、またはＣＥ細胞と呼ぶ。次いで、このＣＥ細胞を、例えば、照射腫瘍細胞の形態で、または精製された天然または組換え腫瘍性抗原の形態で、被験体の腫瘍性抗原と混合し、例えば皮下法のような、免疫処置において使用して、全身的な抗腫瘍性免疫を誘発する。

サイトカイノは、活性腫瘍部位以外の部位での局所的な免疫処置により、全身的な抗腫瘍性免疫応答を誘発しまたは高めるのに十分なレベルで、局所的に発現される。サイトヵイン投与に関係する全身的な毒性は、起こらない。なぜなら、ＣＥ細胞により分泌されるサイトカインのレベルは、全身的なサイトカインｆＡ度に太き（影響しないからである。

ＣＥ細胞により分泌されるサイトカインの量は、抗腫瘍性免疫を誘発するには十分であるが、実質的な全身的毒性を生じさせるよりもずっと少ないので、このアプローチは、局所的なサイトカイン投与という長所を提供する。さらに、この新規な方法は、死亡をまねき得る病巣的注入の必要性を除く。

さらに、免疫処置の部位でのサイトカインの連続的な局所的発現もまた、断続的なサイトカイン注入と比較して、抗腫瘍性免疫応答を高め得る。この方法はまた、わずられしい静脈内注入と対照的に、ＣＥ細胞を用いる局所的な免疫処置という長所を提供する。この方法はまた、インビトロで腫瘍細胞系を樹立する必要性、および遺伝子をこれらの腫瘍細胞に転移する必要性を排除する。

本発明はまた、サイトカインの局所的な発現の代替法をも提供し、サイトカインおよび腫瘍性抗原の両方の細胞発現の遺伝的改変を介して、被験体の腫瘍に対する免疫応答を誘発しおよび／または高める。本実施態様では、被験体由来の選択された細胞は、単離され、そして、サイトカイン遺伝子、および腫瘍性抗原をコードする遺伝子を用いて形質導入される。形質導入細胞を、「キャリアー細胞」と呼ぶ。キャリアー細胞は、線維芽細胞、および通常は、マクロファージ、単球およびリンパ球のような免疫系で抗原提示細胞として働く細胞を包含し得る。サイトカインおよび腫瘍性抗原の両方を活発に発現している形質導入細胞が、選択され、活性腫瘍部位以外の部位での局所的な免疫処置において使用されて、抗腫瘍性免疫応答を誘発する。ＣＥ細胞と共に用いた場合と同様に、キャリアー細胞により分泌されるサイトカインのレベルが、全身的なサイトカイン濃度に有意に影響を与えないので、これらのキャリアー細胞は実質上の全身的な毒性を生じない。

この代替法となる実施態様は、時に困難である腫瘍のサンプルの入手の必要を省くため有利である。しかしながら、キャリアー細胞は、局所的な免疫処置において、腫瘍細胞、腫瘍細胞ホモジェネート、精＆！腫瘍性抗原、または組換え膿瘍性抗原と共に使用され得、これによって抗腫瘍性免疫が高められる。

さらに、この第２の実施態様は、第１の実施態様と同じ長所を有し、その長所とは、キャリアー細胞により放出されたサイトカインのレベルが、抗腫瘍性免疫を誘発するには十分であるが、実質上の全身的な毒性を生じさせるよりはずっと低いことである。さらに、第１の実施態様と同様に、この方法は、病巣内注入の必要性を省き、サイトカインを連続的に発現させる。この方法はまた、腫瘍細胞のインビトロでの連続培養を樹立する必要性、およびこれらの腫瘍細胞中へ遺伝子を転移する必要性を排除し、そしてわずられしく長い静脈内注入とは対照的に、キャリアー細胞を用いる局所的な免疫処置という長所を提供する。

これらのアプローチはまた、医療業務の他の分野において、臨床的に重要な他の抗原に対する免疫応答を誘発しまたは高める用途を見出し得る。

図面の簡単な説明図１は、レトロウイルスヘク９−　ＤＣ／ＴＫ　ＩＬ２、ＬＸＳＮ−ＩＬ２、およびＬＮＣＸ−ＩＬ２の模式図を示す。

図２は、ＥＬＩＳＡで測定された３回上清す／プルのＩＬ−２平均濃度を示す。

上演は、約１．５Ｘ　１０’個の半集密的な線維芽細胞の１晩培養から採取した。

図３は、形質導入線維芽細胞により分泌されたＩＬ−２の生物学的活性を示す。

これは、上清の３回サンプルと共にインキユベートされたＩＬ−２依存Ｔ細胞系への’　トＴｄＲの平均取り込み量を測定することで実証された。上清は、約１．５Ｘ１０’個の半集密的な線維芽細胞の１晩培養から採取された。

図４は、以下の動物間の比較を示す２１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞のみを注入された動物（ロ）；１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞および２×１０６個の改変されていないＢＡＬＢ／Ｃ線維芽細胞を注入した動物（■）；１０５個のＣ７０１ｉ腫瘍細胞および２×１０６個のＩＬ−２形質導入ＢＡＬＢ／Ｃ線維芽細胞を注入した動物（・）；１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞および１×１０６個の形質導入ＢＡＬＢ／Ｃ線維芽細胞を注入した動物（Ｏ）。腫瘍の測定値は、各処置群における４匹の動物の腫瘍の横断直径の平均産物である。（＊）は、腫瘍の成長曲線の統計学的に有意な差異（Ｐ＜０．０５）を示す。

図５は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのＤＮＡ配列のＰＣＲ分析を示す。レーンｌ−陽性コントロールｐＬＸＳＮ−Ｒ１−ＩＬ２゜レーン２から４は、ゲノムＤＮＡをテストする：　レーン５および６、卵巣のゲノムＤＮＡ　；レーン７．１１４１．コントロール、ＤＮＡなし。肝臓、肺臓、および肺のゲノムＤＮＡを用いても同一の結果が得られた（データは示していない）。

図６は、腫瘍の定着および発達に対するＩＬ−２改変線維芽細胞の効果を示す。

ここでは、５Ｘ１０’個のＣＴ２６腫瘍細胞と２×１０５個の線維芽細胞とを混合して用い、腫瘍の成長速度に注目した。

図７は、腫瘍の定着および発達に対するＩＬ−２改変線維芽細胞の効果を示す。

ここでは、５Ｘ１０’個のＣＴ２６腫瘍細胞と２×１０６個の線維芽細胞とを混合して用い、各処置群での動物個体に対する腫瘍の発現時間に注目した。

図８は、腫瘍の定着および発達に対するＩＬ−２改変線維芽細胞の効果を示す。

ここでは、ｌＸ１０３個のＣＴ２６腫瘍細胞と２×１０６個の線維芽細胞とを混合して用い、腫瘍の成長速度に注目した。

図９は、腫瘍の定着および発達に対するＩＬ−２改変線維芽細胞の効果を示す。

ここでは、１×１０５個のＣＴ２６腫瘍細胞と２×１０６個の線維芽細胞とを混合して用い、各処置群での動物個体に対する腫瘍の発現時間に注目した。

図１Ｏは、腫瘍の定着および発達に対するＩＬ−２改変細胞の効果を示す。ここでは、ｌＸ１０５個の改変されていないＣＴ２６と２Ｘ１０’個のＤＣＴＫ−ＩＬ２改変ＣＴ−２６１１１瘍細胞とを混合して用い、１×１０５個のＣＴ２６と混合した２ＸｌＯ１３個のＤＣＴＫ−ＩＬ２改変線維芽細胞と比較し、腫瘍の成長速度に注目した。

図１１は、腫瘍の定着および発達に対するＩＬ−２改変細胞の効果を示す。ここでは、ｌＸ１０５個の改変されていないＣＴ２Ｂと２ＸＩＯ’個のＤＣＴＫ−ＩＬ２改変ＣＴ−２６腫瘍細胞とを混合して用い、ｌＸ１０５個のＣＴ２６とに混合した２×１０６個のＤＣＴＫ−ＩＬ−２改変線維芽細胞と比較し、各処置群での動物個体に対するｌＩｌ瘍の発現時間に注目した。

図１２は、全身的な抗腫瘍性免疫の誘発および腫瘍の成長速度に対するＩＬ−２改変線維芽細胞の効果を示す。マウスは、５Ｘ１０’個の新鮮な腫瘍細胞を投与する７日前に、２．５Ｘ　１０５個の照射ＣＴ２６腫瘍細胞と混合した２×１０６個の線維芽細胞を用いて免疫処置した。

図１３は、全身的な抗腫瘍性免疫の誘発および各処置群での、動物個体に対する腫瘍の発現時間に対するＩ　Ｌ−２改変線維芽細胞の効果を示す。マウスは、５Ｘ１０’個の新鮮な腫瘍細胞を投与する７日前に、２．５Ｘ　１０５個の照射ＣＴＣ６腫瘍細胞と混合した２Ｘ１０’個の線維芽細胞を用いて免疫処置した。

図１４は、全身的な抗腫瘍性免疫の誘発および腫瘍の成長速度に対するＩＬ−２改変線維芽細胞の効果を示す。マウスは、５ｘｔｏ’個の新鮮な腫瘍細胞を投与する１４日前に、２．５　Ｘ　１０５個の照射ＣＴ２６腫瘍細胞と混合した２× １０６個の線維芽細胞を用いて免疫処置した。

図１５は、全身的な抗腫瘍性免疫の誘発および各処置群での動物個体に対する腫瘍の発現時間に対するＩＬ−２改変線維芽細胞の効果を示す。マウスは、５ｘｔｏ’個の新鮮な腫瘍細胞を投与する１４日前に、２．５×１０５個の照射ＣＴＺ６１１１瘍細胞と混合した２ＸＩＯ６個の線維芽細胞を用いて免疫処置した。

１１望説旦腫瘍免疫療法の新規な方法は、サイトカイン遺伝子産物の分泌を引き起こし、腫瘍性抗原に対する被験体の免疫応答を刺激する細胞の遺伝的改変を包含すると記載される。本明細書中で、「遺伝子」は、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列であると定義される。ある実施態様では、少なくとも１種のサイトカイン遺伝子産物を分泌するように遺伝的に改変された自己の線維芽細胞を、活性腫瘍部位以外の部位において、被験体を免疫処置するために、腫瘍性抗原を含有する製剤形態で使用する。他の実施態様では、少なくとも１種の腫瘍性抗原遺伝子産物を発現し、そして少な（とも１種のサイトカイン遺伝子産物を分泌するように遺伝的に改変された細胞を、活性腫瘍部位以外の部位において、被験体を免疫処置するために製剤形態で使用する。好適には、サイトカインは、これらのタンパク質を周囲の環境に効果的に分泌する細胞において発現される。線維芽細胞は、このような細胞の例である。線維芽細胞および他の細胞は、本明細書中に後に記載のように、遺伝的に改変され得、１種またはそれ以上のサイトカインを発現し分泌する。

腫瘍性抗原は、以下を包含するいくつかの方法で提供され得るが、それらに限定されない：　１）ＣＥ細胞に、腫瘍性抗原をコードする遺伝子で、形質導入し得る。次いで、これらの「キャリアー細胞」を、被験体の免疫処置に使用する。２）適切な腫瘍性抗原をコードするクローン化遺伝子配列を、線維芽細胞または抗原提示細胞のような細胞中に、転移し得る。次いで、これらの細胞を、ＣＢ細胞またはキャリアー細胞と混合し、被験体を免疫処置する。３）腫瘍性抗原を、細菌または他のタイプの細胞中で、組換え処理によりクローン化し得る。

次いで、これらの抗原を精製し、ＣＥ細胞および／またはキャリアー細胞を用いる免疫処置に使用する。４）腫瘍性抗原を、腫瘍細胞から精製し得、ＣＥ細胞またはキャリアー細胞を用いて被験体を免疫処置するために使用し得る。５）腫瘍細胞を、被験体の免疫処置のために、照射し得、あるいは機械的に破砕し得、そしてＣＥ細胞および／′またはキャリアー細胞と混合し得る。

本発明は、以下の工程を包含する：　（Ａ）ＣＥ細胞またはキャリアー細胞の生産に適切な細胞を単離する工程；（Ｂ）サイトヵイン遺伝子を単離する工程、またはサイトカイン遺伝子および膿瘍性抗原遺伝子ならびに適切なマーカー遺伝子および／ま　゛たは自殺遺伝子を単離する工程；　（Ｃ）（Ｂ）から得た遺伝子を転移し、ＣＥ細胞またはキャリアー細胞を生産する工程；　（Ｄ）ＣＥ細胞またはキャリアー細胞を用いて免疫処置するために、被験体の腫瘍性抗原または他の適合する腫瘍性抗原の免疫学的サンプルを調製する工程；（Ｅ）免疫処置のために腫瘍細胞を腫瘍性抗原の供給源として用いる場合、その腫瘍細胞の悪性の潜在力を不活化する工程；および（Ｆ）免疫処置用のサンプルを調製する工程。以下は、発明者らにより考案されたい（っかの実施態様である。しかしながら、当業者に周知のいかなる手段も、これらの工程を達成するために、本発明において使用し得ることが理解される。

（Ａ）Ｃおよびキャリアー　を　るための　の限ＣＥ細胞およびキャリアー細胞として使用される細胞は、被験体の体の種々の位置から選択され得る。例えば、皮膚パンチバイオプシーは、被験体へ最小量で侵入させることにより、ＣＥ細胞の生産用の線維芽細胞が容易に入手され得る供給源を提供する。または、これらの線維芽細胞は、腫瘍サンプル自体から人手され得る。造血由来の細胞は、静脈穿刺、骨髄吸引、リンパ節バイオブンー、または腫瘍サンプルから得られる。ＣＥ細胞またはキャリアー細胞の生産用の他の適切な細胞は、当業者に周知の手段により単離され得る。同様に選択され、そして処理される非自己の細胞もまた、使用され得る。

（Ｂ）　ｉＬ云王立皇Ｉ非常に多くのサイトカイン遺伝子が、クローン化され、本プロトコルにおける使用に有効である。ＩＬ−２、γ−ＩＮＦおよび他のサイトカインの遺伝子が、容易に使用され得る（１−５．１ｌ−１４）。適切な腫瘍性抗原のクローン化遺伝子は、当該分野で周知の手段により単離される。

ネオマイノン抵抗性（Ｎｅｏ’）のような選択可能な、マーカー遺伝子か、容易に入手され得る。選択可能なマーカー遺伝子の組み込みにより、所望の遺伝子を首尾よ（受容し、発現した細胞の選択が可能になる。遺伝子転移技術の当業者に周知の池の選択可能なマーカー遺伝子もまた、所望の転移遺伝子を発現するＣＥ細胞またはキャリアー細胞の生産に使用され得る。

「自殺」遺伝子は、免疫応答の刺激後に、選択的に誘導可能な致死を生じさせるために、ＣＥ細胞またはキャリアー細胞中に組み込まれ得る。単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）のような遺伝子は、ＣＥ細胞またはキャリアー細胞の誘導可能な崩壊を引き起こすために使用され得る。ＣＥ　゛細胞またはキャリアー細胞が、もはや有効でなくなった場合、アシクロビルまたはガンシクロビルのような薬剤が投与され得る。これらの薬剤はいずれも、ＴＫを発現する細胞を選択的に殺し、それにより、移植され形質導入された細胞を除去する。さらに、自殺遺伝子は、誘導可能なプロモーターに結合した非分泌細胞障害性ポリペプチドをコードする遺伝子であり得る。ＣＥ細胞またはキャリアー細胞の崩壊が所望とされる場合、自殺遺伝子が細胞障害性ポリペプチドの生産を誘導し、その結果ＣＥ細胞またはキャリアー細胞を殺すように、プロモーターの適切な誘発物質を投与する。しかしながら、ＣＥ細胞またはキャリアー細胞の崩壊は、必ずしも必要とされるわけではない。

所望の腫瘍性抗原をコードする遺伝子は、組換え法によりクローン化され得る。

多数の腫瘍により発現される抗原のフード配列は、多数の被験体に使用され得る。

（Ｃ）ｌｉ五旦五並培養細胞中に遺伝子を転移するために、非常に多くの方法が、使用され得る（１５）。例えば、適切な遺伝子を、プラスミドまたはレトロウィルスのようなベクター中に挿入し得、そして細胞中に転移し得る。エレクトロポレーション、リボフェクションおよび種々の他の方法が、当該分野で知られており、用いられ得る。

遺伝子転移の１つの方法は、以前のヒト遺伝子転移の研究において用いられた方法と同様の方法であり、腫瘍浸潤リンパ球（ｔｕａｏｒ　ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）（ＴＩＬ）を、レトロウィルス遺伝子形質導入により改変し、癌被験体に投与した（１６）。

このレトロウィルス介在遺伝子転移の第１段階の安全性の研究において、ＴＩＬを遺伝的に改変して、ネオマイシン抵抗性（Ｎｅｏ”）遺伝子を発現させた。静脈内注入を行った後、ポリメラーゼ連鎖反応分析では、投与後２ケ月の間、−貫して循環中に遺伝的に改変された細胞が見出された。感染性レトロウィルスは、これらの被験体中には全く発見されず、そして、遺伝子転移による副作用は、どの被験体中にも見られなかった（１６）。これらのレトロウィルスベクターを改変し、ウィルスのｇａｇ、　ｐｏｔおよびｅｎｖ遺伝子の削除によりウィルスの複製を防止した。

レトロウィルスを遺伝子転移に使用する場合、複製受容能を有するレトロウィルスが、レトロウィルスベクターを生産するために使用されるパッケージング細胞系において、レトロウィルスベクターおよびウィルス遺伝子配列の間での組換えにより理論的に発生する。我々は、組換えによる復製受容能を有するウィルスの生産が減少したまたは排除されたパッケージング細胞系を使用する。このことから、被験体細胞を感染させるのに使用されるすべてのレトロウィルスベクターの上清を、ＰＣＲおよび逆転写酵素アッセイのような標準的なアッセイにより、複製受容能を有するウィルスに対しスクリーニングする（１６）。さらに、複製受容能を有するウィルスに曝すことが、必ずしも有害であるとは限らない。復製受容能を有するマウスレトロウィルスの多量の接種物を注入した霊長類の研究において、そのレトロウィルスは、霊長類の免疫系により排除された（１７）。復製受容能を有するウィルスに原因する疾病または後遺症は、曝した３年後にはまったく観察されなかった。要約すると、被験体が復製受容能を有するマウスレトロウィルスに曝されることは予期されず、そしてそのように曝されることが、必ずしも有害ではないと思われる（１７）。

（Ｄ）　の　、または　１　え　の８・サンプルの−１腫瘍の関係する抗原を有する腫瘍細胞が、被験体から単離される。これらの細胞は、固形癌または白血病性腫瘍の一方に由来する。固形癌については、単細胞懸濁液が、バイオプ／−組織の機械的分離および洗浄により作られ得る（１８）。

造血器腫瘍は、末梢血液または骨髄から、標準的な方法で単離され得る（１９）。

第二の変型は、腫瘍細胞のホモ／工不一トの使用である。

このようなホモジェネートは、本発明による刺激があった際に、被験体の免疫系により認識するのに有用な腫瘍性抗原を含有し得る。例えば、細胞を機械的に破壊することで、あるいは凍結し融解することで作られる非分画細胞ポモジェ不一ト、または、好ましくは濃縮レベルの腫瘍性抗原を伴うホモジェ不一トの画分が使用され得る。

同様に、例えば免疫沈降法またはＤＮＡ組換え法により得られた精製腫瘍抗原が使用され得る。次いで、精製抗原は、上記のＣＥ細胞および／またはキャリアー細胞と共に免疫処置に使用され、これらの抗原に対する被験体の免疫応答を誘発しまたは高める。

キャリアー細胞を使用する実施態様では、腫瘍性抗原は、キャリアー細胞による発現中ずっと使用され得る。これらのキャリアー細胞は、単独で、または、他の腫瘍性抗原調製物またはＣＥ細胞と共に注入され得る。同様に、ＣＥ細胞が用いられる場合は、当該分野で周知の方法で生成された精製組換え腫瘍性抗原が使用され得る。

自己の腫瘍細胞が容易に入手され得なければ、異種の腫瘍細胞、それらのホモジェ不一ト、それらの精製抗原、またはそのような抗原を発現しているキャリアー細胞が使用され得る。

（以下余白）（Ｅ）　の飄。

生存可能な腫瘍細胞を、腫瘍性抗原の供給源として免疫処置に使用する場合、腫瘍細胞は、被験体中で増殖しないように不活性化され得る。不活性化は、い（っがの方法で達成され得る。細胞は、免疫処置の前に照射され得る（１８）。この照射は、それらの複製を阻止するレベルであり得る。次いで、このような生存可能な細胞は、それらの腫瘍性抗原を、被験体の免疫系に提供し得るが、新しい腫瘍を形成するほどには増殖し得ない。

または、培養され得る腫瘍細胞は、自殺遺伝子を形質導入され得る。上記のように、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＴＫ）のような遺伝子を、腫瘍細胞に転移し、アシクロビルまたはガンンクロビルの投与により、それらの崩壊を誘導し得る。

免疫処置の後、ＴＫ発現腫瘍細胞は、それらの腫瘍性抗原を提供し得、増殖し得る。被験体の免疫応答が刺激される期間の後、この細胞は選択的に殺され得る。

おそらく、このアプローチは、免疫処置に使用される腫瘍細胞をより長く生存させる。そして、このことは、抗腫瘍性免疫を誘導しまたは高めることに有利である。

（Ｆ）　凡　のための　−の− ＣＥ細胞および／またはキャリアー細胞および腫瘍細胞、および／または腫瘍細胞のホモンエ不一トおよび／または精製腫瘍性抗原、を患者の免疫処置のために結合する。約１０７個の腫瘍細胞が必要とされる。腫瘍細胞のホモジェネート、または膿瘍性抗原の精製または非精製画分を用いるとき、腫瘍の用量を、１０７個の未処理の腫瘍細胞で通常存在する腫瘍性抗原の正常数に基づいて調整し得る。腫瘍の調製は、治療を妨げる実質的に全身的な毒性を生ずることなく、抗腫瘍免疫性（１１−１２＞を誘起するサイトカインのレベルを分泌するのに十分す数のＣＥまたはキャリアー細胞を混合すべきである。

サイトカインは、ＣＥ細胞または牛ヤリアー細胞により、免疫応答を誘起または増大するのに十分であるが、実質的に全身的な毒性を避けるのには十分ではないレベルで、生成されるべきである。これにより、サイトカインの生理学的レベルより大きい従来の方法の投与により生じる副作用を防ぐ。

これらの混合物、および単独で使用されるキャリアー細胞は、注入のために、当該分野で既知であって、免疫処置に受容可能な、どのような様式にも製剤され得る。少な（ともＣＢ細胞およびキャリアー細胞が、生存可能であることが重要なので、この製剤は細胞の生存に適合しなければならない。製剤は、皮下注射、箱内注射され得、または免疫処置に受容可能ないかなる様式の注入もなされ得る。

免疫応答を望ましくない抗原に集中させ得る調製物中の汚染物質は、免疫処置の前に除去しなければならない。

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施態様の説明のために提供するもので、本発明の範囲を限定するものと解すべきではない。

尖１１」− と　４した！−を　る　によるＩ　ＩＬ−２−ＣＥ　の　に　るの　の皮膚パンチパイオプンーを、滅菌条件下で各被験体から得る。そのバイオプシー組織を細断し、１０％のウシ胎児血清を含有する［ｌＰＭ＋１６４０培地（または類似の培地）中に入れ、培養において皮膚線維芽細胞の成長を樹立する。この培養線維芽細胞は、レトロウィルス介在ＩＬ−２遺伝子転移により［Ｌ−２分泌ＣＥ細胞を生産するために使用する。

２レトロウイルスベタ　−のおよびＩＬ−２゛・ＣＥ　の次いで、培養皮膚線維芽細胞を、ＩＬ−２およびネオマイシン抵抗性（ＮｅｏＲ）遺伝子を含有するレトロウィルスベクターに感染させる。Ｎｅｏ″遺伝子を含有するＮＺベクターを使用し、このベクターは、これまで多数の研究者により、ヒトを題材とする研究（１６）を含み、インビトロおよびインビボの研究に使用されてきた。このＩＬ−２ベクターは、Ｎ２由来のベクターである、Ｆｒｉｅｄｍａｎｎおよびその共同研究者により開発され記載されたＬＬＲＮＬから生産される（２０）。それは、ＬＬＲＮＬのルシフェラーゼ遺伝子を、ヒトＩＬ−２をコードする完全長のｃＤＮＡと置換することで作られる。汚染性で復製受容能を有するウィルスを含まないレトロウィルスベクターを、ベクタープラスミド構築物をヘルハーフリーパッケージング細胞系ＰＡ３１７中にトランスフェクトすることで生産する。被験体細胞の感染の前に、このベクターが、ヘルパーウィルスを含まないことが示される。ヘルパーウィルスが検出される場合、そのベクターを、ウィルスのｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子がｅｎｖから離れているＧＰ＋ｅｎｖＡＭ１２パッケージング細胞系中で生産し、ヘルパーウィルス生産の可能性をさらに減少させる。

３　≦　プロトコル培養始原線維芽細胞を、（２０）に記載のように、パッケージング細胞系由来の上清と共にインキュベートする。これらの細胞由来の上清を、外来性因子および複製受容能を有するウィルスについて、（１６）に記載のように試験し、表１に概要を示す。この線維芽細胞を、洗浄し、次いでＧ４１８（ネオマイシン類似物）を含有する培地中で増殖させ、Ｎｅｏ”遺伝子を発現している形質導入細胞を選別した。このＧ４１８抵抗性細胞を、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により培養の上清中のＩＬ−２の濃度を測定することで、ＩＬ−２遺伝子の発現について試験する（１２）。ＩＬ−２を発現しているＧ４１８抵抗性（ｒｅｓｉｌｉｅｎｔ）細胞は、−７０℃で、以後、免疫処置に使用するために必要になるまで貯蔵する。

表１および１、無菌度２、マイコプラズマ３、一般的安全性４、ウィルス試験ＬＣＭウィルス胸腺因子（Ｔｈｙ＋ｓｉｃ　ａｇｅｎｔ）！；十／Ｌ−ｅｃ。

Ｓ＋／Ｌ−ｘｅｎ。

Ｓ＋／Ｌ−ａｍｐｈ。

３Ｔ３増幅ＭＢＣ−５／Ｖｅｒ。

４　、・　の− 臨床的に示唆される外科的な切除から、または浅リンパ節または皮膚転移から得られた腫瘍を、２〜３■の細片に細断し、コラ−ゲナーゼおよびＤＮアーゼで処理し、単細胞懸濁液中への腫瘍の分離を容易にした。集めた細胞を、遠心分離し、ＲＰＭ１１６４０培ｊｔｔｌ中で洗浄し、次いで、１０％のジメチルスルホキシドおよび５０％のウシ胎児血清を、ＲＰＭ１１６４０培地中に含有する溶液中で凍結保存する。これらの細胞は、投与のときまで液体窒素中に貯蔵する。皮下免疫処置において使用する前に、これらの細胞を、解凍し、免疫原性汚染物質を含まない培地中で洗浄し、そして、セシウム照射装置中で、４，０００ラド／分、総線量２０．０００ラドの照射をした。

江皮蝮生立１訳被験体は、組織学的に確認された癌の診断を有する。治療の目的で切除する必要のある腫瘍、または、バイオブンーが容易に接近し得る腫瘍を有する被験体は、本発明の本実施態様に最も適切である。

Ｕ庭ｌ且圧呈以下の処置前評価を、実施した。

１）疾病の活動度の記載および定量化を包含する病歴および身体検査。

２）動作の状態の評価（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　５ｔａｔｕｓ　Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）０・正常、無症状１＝制限あり、しかし、通院可２・覚醒時の５０％以上、起床きている、自助能力あり３−覚醒時の５０％以上、ベッドまたは椅子から離れない限定された自助能力４；寝たきり３）処置前実験分画でのＣＢＣ（ＣＢＣｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｉａｌ）、血小板数、ＰＴ、　ＰＴＴｌ　グルコース、ＢＵＮ、　クレアチニン、電解質、５ＧＯＴ、　５ＧＰＴ。

ＬＤＨ，アルカリホスファターゼ、ビリルビン、尿酸、カルシウム、総タンパク質アルブミン。

４）他の分析：尿分析ＣＨｓｓＳＣｌおよびＣ４血清補体レベル、末梢血液Ｂ細胞およびＴ細胞サブセットの免疫表現型分析（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）末梢血液細胞における検出可能な複製受容能を有するウィルスに対するアッセイＮｅｏｌｌ、　ＩＬ−２およびウィルスｅｎｖについての、末梢血液白血球のＰＣＲアッセイ５）他の処置前評価：胸部Ｘ線および、フンビュータ一連動断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲ＋）または放射性核種スキャンを包含する他の診断的研究を、疾病の活動の程度を記録し、定量化するために実施し得る。

これらの評価に続いて、一定の間隔（約１〜３月毎）で、治療の過程中に行う評価が、治療および潜在的な毒性に対する応答を測定することに有用であり、その評価により、施される免疫処置の回数が調整される。

ｍ盪皮旦主且この処置の効果を最良にするために、被験体は、免疫系を抑制することが知られている並立療法を受けるべきではない。

ＩＬ１ツし江Δ 各被験体は、照射腫瘍細胞とＩＬ−２を分泌するように遺伝的に改変された自己の線維芽細胞ＣＢ細胞との混合物を用いる皮下免疫処置を受ける。約１０７個の腫瘍細胞を、組織培養において、半集密的な場合少なくとも２０単位／＋ｉｌのＩＬ−２を分泌することが知られている１０７個の線維芽細胞と混合する（１２）。この照射腫瘍細胞および遺伝的に改変された線維芽細胞を、免疫処置のために、最終容積が０．２１になるように通常生理食塩水に入れる。

江艮二ｌ旦且１２週間離して、照射腫瘍細胞、および、ＩＬ−２を分泌するように遺伝的に改変された自己の線維芽細胞を用いて、少なくとも２回の皮下免疫処置を施す。毒性がまったく観察されなければ、引続き、追加免疫処置を定期的（少なくとも１週間離して）に施し、抗腫瘍性免疫応答を最適化し得る。

ｊ　・　のルこれらの免疫処置から、有毒な副作用が起こることは予想されない。しかしながら、これらの免疫処置の潜在的な副作用は、以下の様式で処置可能である：大量の腫瘍細胞溶解が起これば、その結果起こる尿酸不フロパン−、成人呼吸促進症候群、汎発性血管向凝固症候群またはカリウム過剰血症は、標準的な方法により処置される。

免疫処置の部位の局所的毒性は、局所ステロイドおよび／または適切と思われる注入部位の外科的な切除で処置される。

悪寒、発熱および／または発疹のような過敏反応は、対症療法的に、解熱薬および抗ヒスタミン剤を用いて処置される。

被験体は、予防薬を用いて処置されるべきではない。関節痛、リンパ節症または腎機能不全が起こった場合、コルチコステロイドおよび／または抗ヒスタミン剤での処置を始める。アナフィラ牛シーは、エピネフリン、液体、およびステロイドの投与のような標準的手段により処置される。

（以下余白）実Ｊ！ＪＩＬＡ、　でのレトロウィルスＩＬ−２おＬ堕Ｘ旦マウスおよび初代ヒト線維芽細胞中でＩＬ−２およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を転移して発現するのに、レトロウィルスベクターを使用した。Ｇ１１ｂｏａおよび共同研究者らによって生成されたレトロウィルスベクターＤＣ／ＴＫ　ＩＬ２（Ｇａｎｓｂａｅｈｅｒら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、、１７２＋１２１７−１２２３．１９９０．　これは本明細書中に参考として援用されている）を利用して動物腫瘍モデルにおいて適用するためにマウス線維芽細胞に形質導入した（以下の８項を参照のこと）。ヒト線維芽細胞を、レトロウィルスベクターＬＸＳＮ−Ｒ１−ＩＬ２を用いて形質導入した。これらのレトロウィルスベクターの構造の概略図を図１に示す。

ＬＸＳＮ−Ｒ１−ＩＬ２ヘクターのより完全な記述を、そのヌクレオチド配列を含めて、実施例ＩＩ＋および表２．３および４に示す。

上記のベクターを用いた感染およびネオマイシン類似体６４１８を含有する増殖培地中での２〜３週間の選択に続いて、Ｂａ１ｂ／ｃおよびヒト線維芽胎児培養上清を採取し、モして固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、ＩＬ−２についてテストした。図２は、形質導入された線維芽細胞により分泌されたＩＬ− ２のレベルを表す。

これらの結果は、ルンフエラーゼまたはβ−ガラクトンダーゼのような不適切な遺伝子を発現するＮＺ由来レトロウィルスベクターで感染したネガティブコントロールの線維芽細胞、および成人ヒト線維芽細胞を用いた研究を用いて確認し得る。

形質導入したヒト線維芽細胞により発現したＩＬ−２の生物学的活性を、ＩＬ− ２依存性Ｔ細胞系を使用した細胞増殖パイオア。

セイによって確認した。このアッセイでは、形質導入した線維芽細胞およびコントロールの未改変の線維芽細胞からの上演を、ＩＬ−２依存性Ｔ細胞系ＣＴＬＬ −２と共にインキュベートした。

細胞増殖およびＩＬ−２活性の指標として１Ｈ−チミジンの取り込みを測定した（図３）。

Ｂ、　モデルにおＣる≦　した　のＩＬ−２を分泌するように遺伝学的に改変した線維芽細胞の効力を結腸癌の動物モデルでテストした。これらの研究において、Ｂａ１ｂ／ｃ　ＣＴ２６腫瘍細胞系を、形質導入してＩＬ−２を発現するＢａ１ｂ／ｃ線維芽細胞とともに皮下注射した。コントロール群は、１　）　ＣＴ２６腫瘍細胞および未改変線維芽細胞の混合物；２）線維芽細胞を含まないＣＴ２６腫瘍細胞；および３）形質導入された線維芽細胞単独を注射した動物を含有した。形質導入線維芽細胞およびＣＴ２６細胞で処理した動物の８分の３で腫瘍が検出されなかった。これとは対照的に、ＣＴ２６１１瘍細胞を注射された全てのコントロール動物（８／８）は、触診でわかるほどの腫瘍を発達させた。ＣＴ２６腫瘍細胞を含まない形質導入線維芽細胞を接種した動物では、腫瘍は検出されなかった。ＩＬ−２分泌線維芽細胞を注射したＢａ１ｂ／ｃマウスにおける平均ＣＴ２６腫瘍サイズは、コントロール群と比べてかなり小さかった（図４）。

多変量非母数統計手法（Ｋｏｚｉｏｌら、Ｂｉｏｍｅｔｒｉｅｓ　３７：３８３ −３９０．１９８１およびＫｏｚｉｏｌら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｐｒｏｇ、　Ｂｉｏ＋ｅｅｄ、　１９：６９−７４．１９８４、これらは本明細書中で参考として援用されている）を利用して、処理群中の腫瘍増殖の違いを評価した。図４に示す４つの処理群に対する腫瘍増殖曲線は、有意に異なっていた（ｐｉｌｏ、０４８）。続いて行った処理群間の比較は、腫瘍の増殖においてＣＴ２６腫瘍細胞だけを注射した動物と２Ｘ　１０’個の形質導入線維芽細胞およびＣＴ２６腫瘍細胞で処理した動物との間に有意な相違（ｐ＜０．０５）を示したく図４）。

爽施漕土■ Ａ、Ｌ五Ω見Ｉ癌のリンホカイン遺伝子治療は、通常の治療に失敗した癌患者において評価される。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有するＮ２由来レトロウィルスベクターを用いる。このベクターは、最近のヒト被験者を用いた定評ある研究を含むインビトロおよびインビボでの研究について、多くの研究者によって使用してきた（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、３２３：５７０−５７８．１９９０＞。本研究で用いられるリンホカインベクターは、Ｍｉ、ｌ１ｅｒらによって開発され記載されている、Ｎ２由来ベクター、ＬＸＳＮから生成される（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉ。

１６：２ｇ９５．１９８６およびＭｉｌｌｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７：９８０，１９８９＞これらの文献は本明細書中で参考として援用されている。バク９−ＬＸＳＮ−Ｒ１−ＩＬ２ハ、レトＯウイ／ｌ、ス５’ＬＴＲブａ− １−−９−（１）制御下でヒｌ−ＩＬ−２ｃＤＮＡを、そしてＳＶ４０プロモーター制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有する（図１を参照のこと）。正常のヒトＩＬ−２リーダー配列を、ラットインスリノおよびヒトＩＬ−２リーダー配列を含有するキメラ配列で置き換えた（表２．３、および４を参照のこと）。このキメラリーグ−配列は、ＩＬ−２遺伝子の発現を高める。

ＬＸＳＮ−Ｒ１−ＩＬ２ベクターを構築するために、完全長ＩＬ−２ｃＤＮＡおよびキメラリーダー配列を含有する細菌プラスミドｐＢｃ１２／ＣＭＶ／ＩＬ２（Ｃｕｌｌｅｎ、　Ｂ、　Ｒ，、ＤＮＡ　７　：６４５−６５０．１９８８１本明細書中で参考として援用されている）を、　ｉｌＬ！１ｄｌｌｌで切断し、そして末端をＫｌｅｎｏｖポリメラーゼを用いて平滑化した。ＩＬ−２ｃＤＮＡを、続いて石器を用いた切断によりプラスミドから切り離した。ＩＬ−２フラグメントを、１％アガロースゲル中で電気泳動により精製し、そして適切なバンドを、ガラスパウダー法を利用して抽出した。簡単にはゲルスライスを５５°で４Ｍ　Ｎａｌに溶解した。

室温にまで冷却した後、４μｌの酸化シリカ溶液（ＢＩＯ−１０１，ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ）を添加して、ＤＮＡを吸着した。次いで、シリカを、ＴＥ緩衝液中で０．１Ｍ　ＮａＣ１を含有する５０％エタノールの冷溶液で洗浄した。ＤＮＡを、蒸留水中で５５°で加熱することによりシリカから溶出した。次いで、精製ＩＬ−２ｃＤＮＡを、ｐＬＸＳＮベクターの石１−Ｂａｍ旧クローニング部位に順方向に連結した。１）ＬＸＳＮ−Ｒ１−ＩＬ２ベクターおよびその部分的ヌクレオチド配列のより完全な記載を、表２．３．４．５、および６に示す。

紅１位から６３６５位までのＬλ５Ｎ−Ｒ１−ＩＬ２の記載饗盈　１１−５８９　モロニーマウス肉腫ウィルス５’　ＬＴＲ６５９−１４５８延長したパフケージングシグナルの配列１４６９−２１５１　キメラリーグ−配列を有するＩＬ−２ｃＤＮＡ１４６９−１７１８　１Ｌ−２キメラリーダー配列１６４７−１７１８　シグナルベブチドのコード領域１７１９−２１５１　成熟ＩＬ− ２ニー２コード配２１５９−２５０３　サルウィルス４０初期プロモーター２５２１−２５２２　サルウィルスＤＮＡ末端／Ｔｎ５　ＤＮＡ開始２５５？−３３５１　ネオマイ／ノホスホトランスフェラーゼ３３７０−３３７１　Ｔｎ５　ＤＮＡ末端／′モロニーマウス白血病ウィルス開始３４１１−４００４　モロニーマウス白血病ウィルス３°ＬＴＲ４０７３−４０７４　モロニーマウス白血病ＤＮＡ末端／ｐＢＲ３２２ＤＮＡ開始４０７４−６３６５　プラスミド骨格（以下余白）」ＬＬｅｔ　素［参【ηＩＮ首唇シＪ　イヱＬＷＡａｆＪ　［　２］　１９６１．　２４８１Ａａｔ２　［　２］　８１１，　６２９５Ａｃｃｌ　［　ｌ］　４２５２Ａｃｙｌ　［　５］　８０８．　２６Ｂ５，　３８６０，　５９１０，　６２９２Ａｆ１２　［　４］　３４，　１０６４，　１９５５，　３４４６Ａｆ１３　［　２］　１５９２，　４４８０Ａｈａ２　［　５］　８０Ｂ，　２６８５，　３８６０，　５９１０，　６２９２Ａｈａ３　［　３］　５２３９，　５２５８，５９５０Ａ１ｗＮｌ　［　４］　２３１，　３５フ２，　３６４７，　４８９６Ａｏｃｌ　［　２］　８４７，　１０７６Ａｏｓｌ　［　２］　２７Ｂ７，　５５９５ＡｐａＬ１　［　４］　１７１７，　４２９６，　４７９４．　６０４０Ａｑｕｌ　（　６７　２４１，　４７２，　１９９８．　３８２１，　３８５４．　３８８７Ａｓａｌ　［　２］　１８０１．　５５４５Ａｓ＋ｐ７００　【ｌ］　５９７２Ａｓｐ７１Ｂ　［　２］　４フロ、　３Ｂ９１ＡｍｐＡＩ　Ｃ　ｌ］　１１４５Ａｖａｌ　［　６］　２４１，　４７２，　１９９８．　３８２１，　３８５４，　３８８７Ａｖａ３　［　２］　２２３２，　２３０４Ａｖｒ２　［　２］　１９６２，　２４Ｂ２Ｂａｌｌ　［　３３　６５８，　１１６９，　２７６７Ｂａ！ＩＬｌ！１　［　Ｌｌ　２１５２Ｂｂｅｌ　［　２］　２６ＢＢ，　３８６３Ｂｅｌｌ　（　１７　２５２６Ｂｑｌｌ　［　２］　２４３５．　５４９３ＢｓｐＨ１　［　３］　５２００，　６２０Ｂ，　６３１３ＢｓｐＭｌ　［　４］　１５０１，　２５００，　２５７２，　２９５３ＢｓｓＨ２　［　４］　３９２，　４４３．　３０Ｂ２，　３８０７ＢｓｔＥ２　［　１］　１１４５ＢｓｔＸｌ　［　１］　２０６０ＢｍｕコロＩ　［　２３　８４７，　１０７６Ｃｃｒｌ　［　１］　１９９８ＣｆｒｌＯ工　［　３］　３００４，　３１８５．　５４５３Ｃｖｎｌ　［　２３　８４７，　１０７６Ｄｒａｌ　［３］　５２３９．　５２５８．　５９５０Ｄｒａ２　［４］　３２Ｂ、１２７７、　３７４４．　６３４９Ｅａａｌ　［９］　６５６．　７９０．　１１６７、　１１８Ｂ、２５９１．　２７６５゜３１５６、　３１Ｂ３．　５７６１Ｅａｑｌ　［２］　７９０．　２５９１Ｅｃｏ５２ｍ　［２］　７９０．　２５９１Ｅｅｏ８１工　［２３Ｂ４７．　１０７６ＥｃｏＮｌ　［２］　８５０．　１４５０ＥｃｏＯ１０９工　［４］　３２Ｂ、１２７７、　３７４４．　６３４９ＥｃｏＲ１［１］　１４６０ＥｃｏＲ５［４］　１３７．　２１３．　３５５４．　３６２９Ｅｃｏ？２２工　［２］　２２３２．　２３０４Ｆｄｉ２　［２］　２７Ｂ７．　５５９５Ｆｓｐｌ　［２］　２７Ｂ７．　５５９５Ｈａｅ２　［４１２６８８，３８６３，４３５１１，４７２８Ｈｑａｌ　［８］　４５５．　７０７．　９６０．　１５８０．　４１７５．　４５９１゜５１６９、　５８９９ＨｑｉＡＬ　［９］　４１３．　１７２１．　２７９Ｂ、２９Ｂ８．　３８２Ｂ、４３００゜４７９８、　５９５９．　６０４４Ｈｉｎｃ２　［１］　５９１４Ｂｉｎｄ２　［１］　５９１４Ｂｉｎｄ３　（１］　２４９ＢＥｐｈｌ　［ＩＬＩ　１２１４．　１２４０．　１８１７．　２８６３．　４１０２．　４１１１゜５２１６、　５４４３．　５８５９．　６０６５，６１００Ｋｐｎｌ　［２３４Ｂ０．　３８９５Ｍ５ｔｌ　［２］　２７Ｂ７．　５５９５Ｍ５ｔ２　［２］　８４７．　１０７６Ｎａｅｌ　［１］　３１８７ＮａｒＬ　［２］　２６Ｂ５．　３８６ＯＮｃｏＬ　［２］　２１８９．　３１１７Ｎｄｅｌ　［１］　４３０３Ｎｈｅｌ　［３］　２９．　１６０５．　３４４１Ｎｓｉｌ　［２］　２２３２．　２３０４Ｎａｐ（７５２４１１［８］　１５９６．　１Ｂ３５．　１８５６．　２２３０．　２３０２．　３０９０゜４１１９、　４４８４Ｎｓｐｆｌｌ　［８］　１５９６．　１８３５．　１８５６．　２２３０．　２３０２．　３０９０゜４１１９、　４４Ｂ４ＰａｅＲ７エ　［１］　１９９８Ｐｌｅｌ　［７］　８６５．　１５４７．　３３５０．　３８８９．　４３７４．　４８５９゜ＰｐｕＭｌ　［３］　３２Ｂ、１２７７、：１７４４Ｐｓｓｌ　［４］　ＤＩ、　１２Ｂ０．　３７４フ、　６３５２Ｐｓｔｌ　（６３９Ｂ）、　１１６３．　１８８Ｂ、　２５１１．　２１３Ｂ、　５６１８Ｐｖｕｌ　［１］　５７４３Ｐｖｕ２　［６］　１１９．　１９０．　１７５１．　２７９１．　３５３２．　３６０７Ｒｓａｌ　［１０１３４７，４７８，７２５，１３４２，１５１９，１５９７゜２９９１、　３８９３．　４２８８．　５８５３Ｒｓｒ２　［１］　３２０１Ｓａｃｌ　［２］　４１３．　３８２ＢＳａｕｌ　［２］　８４フ、　１０７６Ｓｃａｌ　［１３５８５３Ｓｆｉｌ　［１］　２４３５Ｓｍａｌ　［２］　４７４．　３８８９Ｓｐｅｌ　［１］　７２６Ｓｐｈｌ　［４］　１Ｂ３５．　２２３０．　２３０２．　３０９０Ｓｓｐｌ　［ｌ］　６１フフ５ｓｔｌ　［２］　４１３．　３８２ＢＳｔｕｌ　［２］　１９６１．　２４８１Ｔｔｈｌｌｌ工　［６］　４６５．　８７７、１２フ５．　２８０３．　３８８０．　４２２７Ｘｂａｌ　［２］　１Ｂ９２．　３７０ＢＸｈｏｌ　［１３１９９ＢＸｍａｌ　〔２］　４７２．　３８８７Ｘｍａ３　［２］　７９０．　２５９１ＸｍｎＬ　［１］　５９７２Ｘｏｒ２　［１］　５７４３ −表−１ＬＸＳＮＲＩｌ、Ｌ２を切断しない酵素：Ｂａｎ３　ＢｓｔＢＩ　Ｅｇｐｌ　ＮｏｔＬ　Ｓａｉｌ１から６３６５まで　１位からの番号。

ｎｌ・ｌ　〉＾０１１＄０　１鋳　１９　１・６　１１ｇ１　２６６　ｆｆ１１６＞＊ｅａ６１Ｄｔ！＋１６（続き）表６　（ｉ！！１ｋＡＡζ？ＡＣＡＡＴ　ｋｃｃαｚｍ＾ＧＡＣ＆１℃＆？Ｃｍｔｃｃｉｒｒａａ　ＦＺｋＧｈＣＡＴｋ　Ｇ＆ａχ（Ｃに４−ぞ０シＣロｉり＾Ｃｊｘｊ（講＾ＣＡｅＢ×４α＝【工Ｔに４ａ＆５ウーマｉ（〜×４Ｔ’ＣＣＣ’Ｆｉｌ　ＡＪＡＯＯＣＣＣＩＸ　ロ１人υＣ試ｔ表６　（続き）表６　（続き）表６（続き）表６　（１！き）：Ｉｔ６　（続き））−−一表６（続き）！！６（続き）＞１−ａ厘２　＞＾ｖａｌ　＞１ａａｌコ９２０３ｇ３０３９４０コ９Ｓ６３１番０３９フ０３５＠６表６　（１！き）４００　４フＯＯ４フｔＯａフ！０　４フ３０　４７４＠　４フｓＯ表６（続き）＞Ｘｈｏ２＞１ｓｔＹｌ＞口ｒａ１ａｚｓｏ０４６ｕｔｏｓｕｅｓｈｏｓｓｏｅ＋ｓｓｓ。

表６（続き）ｓｉｔｅｓａｇｏｓｉｔｅｓフｏｏｓ１１６％７２（ＪＳｆｆ３０＞１ｅｓｃｌ　にｒｒｌｒＬ６　（続き）＠（１１ＯＮＣ１６４１１６Ｎコ０４１コＯ藝１４０Ｇｉｌｌ！１４１＠６６１）０４１・口＆１ｔＯ＆コＯ１ｌｉ）１０４２２０ＬＸＳＮＲＩＩ　Ｌ２を切断しない酵素−ＬＸＳＮ−Ｒ１−ＩＬ２レトロウィルスベクターを生成するために、１０マイクログラムのｐＬＸＳＮ−Ｒ１−ＩＬ２　ＤＮＡを、標準的なリン酸カルシウム沈澱法（Ｍｉ　１ｌｅｒら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、６：２１１９５．１９８６）によって外性の（ｅｃｏｔｒｏｐｉｃ）パッケージング細胞系ＰＥ５０１にトランスフェクトした。トランスフェクトしたＰＥ５０１細胞系を、１０％ＰＣ３を含むＤＭＥＭ培地中で増殖した。培地を２４時間後に交換し、そして２４時間後に上清を採取し、上記のように両性の（ａ■ｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）パッケージング細胞系ＰＡ３１７に感染させた（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、６：２８９５，１９８６およびＭｉｌｌｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ７：９ｇ０．１９８９）。感染ＰＡ３１’？細胞を、トリプシン処理２４時間後に採取し、そして１０％ＦＣＳおよびネオマイシン類似体Ｇ４１ｇ（４００μｇ／ｓ　ｌ　）を含有するＤＭＥＭ中に１＝２０で再プレートした。細胞を、７％ＣＯ２雰囲気下、３７°Ｃで増殖した。コロニーが現れるまで選択培地を５日毎に交換した。１４日目に、２０コロニーを選択し、展開し、そして標準的方法（Ｘｕら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７１：３３１−３４１．１９８９）によってウィルス産生物をテストした。簡単に言えば、上清を、集密（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）培養皿から採取し、０．４５μｍのフィルターを通し、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭで希釈し、そして８μｇ／＋ｅｌのポリブレン存在下でＮＩＨ３Ｔ３を感染させるのに利用した。２４時間後、ネオマイシン類似体０４１８を含有する培養培地中で感染ＮＩＨ３Ｔ３細胞を増殖した。１２〜１４日後、コロニーを染色して計数し、そしてウィルス力価を上記のようにして計算したＣＸｕら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７１：３３１−３４１．１９８９）。

ノーザンブロ・ノド分析によって、ＩＬ−２発現について、最も高いウィルス力価を有するコロニー（＞１０’感染単位／＋ｉｌ）をテストした。最も高いウィルス力価を有するコロニーおよび上記のＩＬ−２発現物を凍結保存した。そして、これらをＬＸＳＮ−Ｒ１−ＩＬ２レトロウィルスベクター試験を行うためのストック培養物として利用する。

支監匠■ Ｕ）ロウイルスベタ　−の　およびサイトカインの形質導入した細胞系によるＩＬ−２の生産を増加させるために、１シ一２発現を進める異なるプロモーターを含有するベクターを用い、そしてヒトＩＬ−２ｃＤＮＡを、インスリン分泌シグナルペプチド中に順方向にサブクローンした（１７）。ＩＬ−２ｃＤＮＡを、ＬＸＳＮ　（ＬＴＲブｏ−ｖ−一ター）およびＬＮＣＸ（ＣＭＶプＯモーター）ベクター（Ｄｒ、Ａ、Ｄ、Ｍｉｌｌｅｒより贈呈）の親プラスミド中に順方向にサブクローンした（１８）。ＬＸＳＮ−ＩＬ２およびＬＮＣＸ−ＩＬ２と命名した新たに構築したベクター（図１）を、レトロウィルスの上清の生産のためにＰＡ３１７細胞系にパッケージした。コントロールとして、高レベルの発現をする２重コピーベクター［）Ｃ／ＴＫ　ＩＬ−２ベクター（チミジンキナーゼプロモーター）　（Ｄｒ、Ｅ、Ｇ１１ｂｏａより贈呈）を比較に用いた。

これらのベクターを、多（のマウス、ヒト、初代および樹立細胞系に用いた。形質導入した細胞のプールを選択し、そして１０％０％ラン血清（ＦＢＳ）およびネオマイノン類似体である活性Ｇ−４１８（４００μｇ／ｌ）を含有するＤＭＥＭ培地に展開した。ＭＣＲ９およびＢａ１ｂ／ｃ　３Ｔ３細胞系における発現の研究の結果を表７に示す。

表７異なるＩＬ２ベクターで形質導入した繊維芽細胞による■Ｌ、２発現の比較４線維芽細胞　ベクター　／１０６細胞／日７１人　ＬＮＧＸ　（＝ｒｚ）ロー１１／）０．４　±５０％　＜１ＬＮＣＸ−工Ｌ２　３３．７　±１１％　６７ＬＸＳＮ−工Ｌ２　６．６　±６１　１３ＤＣ／ＴＫ工Ｌ−２１，９±５１　４ヒト　ＬＸＳＮ　（コントロール）０．７　±２９１　１ＬＮＣＸ−工Ｌ２　１５９．５　±１７％　３１９ＬＸＳＮ−工Ｌ２　２５．５　±１５％　５１ＤＣ／ＴＫ工Ｌ−２３，０±１０１６（以上ｑら）爽範」■ レトロウィルス≦　のための　および初代線維芽細胞レトロウィルス形質導入体の培養条件を最適化した。初代線維芽細胞を首尾よく培養した。最適条件は、約４〜６週間で、１２ｍｍ２の皮膚生検からの約３〜４Ｘ１０’個の初代線維芽細胞の増殖を可能にする。遺伝的に改変した線維芽細胞のレトロウィルス感染、０４１８選択、および展開は、さらに４〜６週間かかる。

初代線維芽細胞の遺伝的改変の条件の探索は、最適な形質導入が以下の手順で得られ得ることを示唆する二線維芽細胞を、血清飢餓により、続いて、形質導入の１５時間前に１５％のラン胎児血清を含有する培地を用いて刺激することにより、０１期に同期化する。次に細胞を、２サイクルのレトロウィルス感染させ、各サイクルを約３時間続けた。細胞を新鮮な培地で１晩再培養し、次いで翌日、０４１８中で選択を開始する。本方法は、感染多重度に依存して、培養物中の５〜１５％の線維芽細胞を形質導入し得る。

本手法を用いて、多くの初代および樹立線維芽細胞を形質導入した。例として、表８ではＬＸＳＮ−ＩＬ２を用いて形質導入した線維芽細胞系におけるＩＬ−２の発現レベルを比較する。

（以下余白）表８ＬＸＳＮ−ＩＬ２で形質４人しだ線維芽細胞にょるＩＬ−２の発現。

線維芽細胞系　種　起源　／１ｏ１胞／日Ｂａ１ｂ／ｃ　３Ｔ３　７ｑｌ　形質転換体　６．６±６１１３ＮＣＲ９ヒト　胚　２５．５±１５％　５１ＮＢＤＦ　３１３　ヒ）　皮膚　２５．０　”１０％　５０ＧＴＩ　ヒ）　皮膚　１５．０！５％　３０これらの結果は、樹立、胚、および初代線維芽細胞培養におけるＩＬ−２の発現レベルが類似していることを示している。

表７でのこれらのデータの比較は、ＩＬ−２の発現が、使用した線維芽細胞系よりも、異なるプロモーターのような要因によって、より影響されることを示唆− している。同様に、培養条件の変化は、ＩＬ−２の発現に重要な影響を及ぼし得る。表９は、形質導入したＧＴＩ細胞、すなわち初代ヒト線維芽細胞培養が、２５μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８選択下よりも、１００μｇ／Ｉｌｌ　Ｇ４１８選択下での方が１５倍多くのＩＬ−２を発現したことを示している。いくつかの他の初代線維芽細胞系もまた、本発明者らのベクターで形質導入され、そして０４１８選択下選択下増殖している。

ＬＸＳＮＩＬ２で形質４人したＧＴＩ細胞にょるＩＬ２発現におけるＣ４１８濃度の効果０４１８の選択用量　分泌ＩＬ−２ｎｇ／　ｔｏ’細胞／田２５　ｐｇ／ｍｌ　１．０　±　１０％５０　ｐｇ／Ｉｎ１　３．０　±　６１１００　μ ｇ／ｍｌ　１５．０　ｉ　５％’Ｇ４１８選択の３週間後。

尖Ｕ質リンパ　および　−μ　に　・された　によって　されるＩＬ−２レベルの遺伝学的に改変された線維芽細胞によるＩＬ−２の生産を、インビトロで正常ヒト末梢血液リンパ球（ｎＰＢＬ＞の刺激によって達成されたＩＬ−２生産と比較するために、ｎＰＢＬをＦｉｃｏｌ−Ｐａｑｕａ密度遠心分離によって単離し、同種異系ｎＰＢＬ　（混合リンノ（球培養、ＭＬＣ）、または、１７μＭのホルボール１２−ミリステート　１３−アセテート（ＰＭＡ）を加えた、２μＭのカルシウムイオノホア（（Ｃ１１（Ａ２３１８７）Ｊ離酸）存在下で培養した。表１０に示すように、本実験の結果は、ＰＭＡ／ＣＩ刺激正ｆＴ細胞集団におけるＩＬ−２発現レベルが２ｎｇ／ｉｏ’細胞７２４時間であったことを示してＬｌる。

これは、本発明者らの最小の生産力を有するベクターである、ＤＣ／ＴＫ　ＩＬ −２を用いて形質導入したＢａ１ｂ／ｃ　３Ｔ３線維芽細胞によるＩＬ−２発現レベルと等しい（表７）。ＭＬＣ中でのＩＬ−２発現レベルは１３０１１ｇ／１０’細胞７２４時間であった。これはＰＭＡ／ＣＩ刺激培養より低く、おそらくその理由はＰＭＡ／Ｃ１が非特異的な応答を誘起し、一方、ＭＬＣが特異的Ｔｈ刺激になるからである。ＭＬＣ刺激集団において、推測した抗原特異的Ｔｈの割合を考慮に入れると、刺激Ｔ細胞当たりのＩＬ−２発現レベルは、両方法で等しくなる。

表１０異なる細胞によるＩＬ２分泌レベル。

細胞　分泌ＩＬ−２ｐｇ／１０’細胞／日ＰＭＡ十　カルシウム　イオノホア　２，０００　”　６％混合リンパ球培養　１３０　±　９０％ＭＣＲ９−ＬＮＣＸ−工Ｌ２　１６２　、０００　±　２０％ＭＣＲ９−ＤＣ／ＴＫ工Ｌ−２１０，０００！　６％爽思１ユ■ マウス　モデルにおＣる　サイトカイン五血豊２つの実験のプロトコールを用いて、抗腫瘍免疫の誘導による線維芽細胞媒介すイト力イン遺伝子治療の効能を研究した。第一のプロトフールを、腫瘍移植に対する遺伝学的に改変した線維芽細胞をテストするように設計し、一方、第二のプロトコールを、全身的な抗腫瘍免疫を誘導するように設計した。各実験の結果は、２つの図および１つの表に示す。最初の図では、各処理群に対する腫瘍の増殖速度を、ある時間後での群中の平均腫瘍サイズとして示す。２番目の図では、カブランーメイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｊｅｒ＞曲線が、各処理群において個々の動物に対する腫瘍初期の時期を示す。各実験についての動物数、腫瘍のない動物の数および割合、および腫瘍サイズ分布パターンを表に示す。

支敷匠■且虹にお（る　サイトカイン　−　の肱来５Ｘ１０’個のＣ７０６細胞と２Ｘ　１０’個の異なるレトロウィルスベクターによってＩＬ−２を発現するように遺伝学的に改変された線維芽細胞との混合物を、マウスに皮下注射した。腫瘍細胞のみ、または腫瘍細胞と未改変線維芽細胞との混合物を注射したコントロールのアームでは、３３動物のうち３１動物（９４％）で４週目までに腫瘍が発達した（図６および７、表９）。これとは対照的に、線維芽細胞媒介すイト力イン遺伝子治療を受けた３４動物のうち２２動物（６５％）が、３週間まで膿瘍がなく、モして５動物（１８％）は１２週間後も腫瘍がなかった。これらの線維芽細胞媒介ＩＬ−２治療を受け、腫瘍が増殖した動物は、腫瘍増殖の開始および速度が遅れる特徴があった。

（以下余白）３週間後、マウスのコントロール群の平均腫瘍サイズ（最長および最大幅の腫瘍軸の積として測定した）は１２８＋ｏ＋ｍ２であり、これに比べて、ＤＣ／ＴＫＩＬ−２またはＬＮＧＸ−ＩＬ２で形質導入した線維芽細胞と混合した腫瘍細胞を注射したマウス群では、それぞれ６８および７■２であった。これは、ＣＴ２６のみまたは未改変線維芽細胞と混合したＣＴ２６で処理したマウスと比べて、ＩＬ−２処理した動物との間で高度に有意な差（補正χ２・１８．６９、ｐ・０．００１）が生じた。４週間後、同じ測定を行うと３７３．３００および７２１２であった（表１１）。最も発現性の高いベクター、ＬＮＣＸ−ＩＬ２は低発現性ベクターＤＣ／ＴＫＩＬ−２よりも実質的により大きな腫瘍発生の阻害を引き起こしたことに注目し得る。腫瘍増殖の差を評価するために利用した多変量非母数統計手法（１９゜２０）により、４週間後、図２に示される４群に対する増殖曲線間で違いが著しく有意である（ｐ＜０．　ｏｏｌ）ことが証明された。続いてコントロールのアームとＩＬ−２形質導入線維芽細胞を混合した腫瘍細胞を受けた動物との比較は、有意な差（Ｐ＜０．０５）を明らかにした。腫瘍細胞のみを注射した動物と未改変線維芽細胞を加えた腫瘍細胞を注射した動物との間の差は有意でないが、低ＩＬ−２発現線維芽細胞を受けた動物と高ＩＬ−２発現線維芽細胞を受けた動物との間の差（Ｐ・００５）は有意であった。

１×１０５個の生きている腫瘍細胞とａ合した２×１０６個の改変線維芽細胞をマウスに注射すると、結果はより著しいものとなった（図８および９、および表１２を参照のこと）。４週間後、全てのコントロール動物で腫瘍が発達したのに対し、ＤＣＴＫ−ＩＬ２またはＬＸＳＩＩ−ＩＬ２ベクターで改変した線維芽細胞で処理した動物のそれぞれ３３％および２７％では、７週間後も腫瘍がないままである（実験は継続中）。さらに劇的なことに、最高ＩＬ−２生産ベクターであるＬＮＧＸ−ＩＬ２ベクターで改変した線維芽細胞で処理した動物の７５％は、７週間後も腫瘍が発生しないままである。これらのデータは、明らかに腫瘍の定着を防ぐためのＩＬ−２の初期大量投与の重要性を証明する。

（以下余白）追加のコントロールとして、遺伝学的にＩＬ−２を発現するように改変したＣＴ２６細胞をマウスに注射した（結果は示していない）。１×１０′３個に達するまでのＩＬ−２発現腫瘍細胞のＢａ１ｂ／ｃマウスへの注射では、腫瘍を生産しなかった。しかしながら、さらに多くの注射では、数匹の動物が腫瘍開始の遅れを伴って腫瘍を発生した。これらのデータは、文献（１）に報告されている結果を確証する。ＩＬ−２生産線維芽細胞の効果と！Ｌ−２生産腫瘍細胞とを比較するために、本発明者らは、ＤＣＴＫ−ＩＬ２ベクターで改変した２ＸＩＯ６個のＣＴ２６腫瘍細胞と１×１０５個の未改変腫瘍細胞とを混合した。図１Ｏおよび１１、および表１３は、ＤＣＴＫ−ＩＬ２改変腫瘍細胞が、腫瘍発生を防ぐのにい（ぶん有効であることを示している。注射の４週間後、処理したアームの平均腫瘍サイズは３０３ｍｍ２であり、これに比べてコントロールのアームでは６２０ｍｍ’である。２２週間後、１匹の動ｍ（ｔｏ％）が腫瘍がないままであるが、これに比べてコントロールのアームでは腫瘍がないものはない。別々の実験において、同じ条件下でＤＣＴに−ＩＬ２改変腫瘍細胞で処理した動物に対するデータを、比較の目的で含宵する。この比較は、ＤＣＴＫ−ＩＬ２改変腫瘍細胞が、ＤＣＴＫ−ＩＬ２改変線維芽細胞と同様の腫瘍定着に対する効果を有することを示唆する。

（以下余白）実Ｊ【例−買１ｍ・　に・　る　サイトカイン玉血１立激１の単独で、あるいは２Ｘ１０６個の形質導入または未改変線維芽細胞と混合した腫瘍細胞で免疫し、１週間後、反対の横腹に５Ｘ１０’個の生きた腫瘍細胞で抗原投与した。これらの結果（図１２および１３、および表１４）は、放射線照射した腫瘍細胞および形質導入線維芽細胞を用いた免疫化は、動物を生きた腫瘍細胞の抗原投与に対して防御するが、その防御は、放射線照射した腫瘍細胞単独または未改変線維芽細胞と混合した放射線照射した腫瘍細胞での免疫化により達成した防御よりわずかによいのみであることを証明する。

（以下余白）上記のプロトコールと類似の第二のプロトコールにおいて、動物を、線維芽細胞と混合した放射線照射した腫瘍細胞で免疫化し、２週間後、新鮮な腫瘍細胞で抗原投与した。図１４および１５、および表１５に示すように、その結果は、放射線照射した腫瘍細胞と混合したＤＣＴＫ−ＩＬ２改変線維芽細胞が、放射線照射腫瘍細胞単独、未改変線維芽細胞と混合した放射線照射腫瘍細胞、またはＬＮＣＸ改変線維芽細胞と混合した放射線照射腫瘍細胞よりも、続いて起こる腫瘍の抗原投与に対して優れた防御をもたらすことを証明する。７週間後、コントロール動物の３分の１に比較して、ＤＣＴＫ−ＩＬ２改変線維芽細胞で処理したＩＯ動物のうち７匹（７０％）で腫瘍がないままである。４週間口、平均腫瘍サイズが、３つのコントロール群で１８０．１７０、および１４０１１１２であるのに比較して、この群では４１ｍ１であった。ＬＮＣＸ−１１２改変線維芽細胞で処理した動物もまた、次の腫瘍細胞の抗原投与に対して防御されたが、結果はそれほど著しいものではなかった。この群において、５４％の動物が腫瘍がないまま残っており、そして、４週間口のこの群の平均腫瘍サイズは８６ｍｍ２であった。

ＬＸＳＮ−ＩＬ２改変線維芽細胞で処理した群中の腫瘍がない動物数は、その腫瘍が、その開始において若干遅れたが、コントロール群と同様であった。腫瘍の開始における違いを評価するのに利用した多変量非母数統計手法（１９，２０）により、図１５に示す６匹のアームについての違いは有意（ｐ＝０．０１２）であることが証明された。それは、さらに生理食塩水で処理したコアトロールのアーム、および放射線照射腫瘍細胞単独、あるいは、未改変またはＬＮＣＸＮＣＸペクタ−維芽細胞と混合した放射線照射腫瘍細胞を受けたアームが、統計的な群を形成したことを示した。放射線照射腫瘍細胞と混合したＩＬ−２ベクター改変線維芽細胞を受けた３匹のアームにより、第二の異なる統計的な群を形成した。

生理食塩水を注射したフントロールアームとＩＬ２形質導入線維芽細胞を混合した腫瘍細胞を受けた動物との間の以下の比較は、全てのベクターについて有意な差を示した（ｐｒｏ、　０５）。

（以下余白）これらの結果は、サイトカイン遺伝子治療をする手段として、遺伝学的に改変した線維芽細胞を用いる可能性を証明する。全ての実験において、ＬＮＣＸ−ＩＬ２ベクターは、腫瘍定着を防ぐのに優れていることがわかったが、一方、次の腫瘍の抗原投与に対する全身的防衛の誘導においては、ＤＣＴＫ−ＩＬ２ベクターの方がよかった。これらの対照的な効果は、多少驚くべきものであるが、ＣＭＶプロモーターは、インビボでは移植後５日で消えるが、一方、ＴＫプロモーターはより長い期間活性を残すという観察により説明し得る。この発見の含む意味は、本願の遺伝子治療法を首尾よく適用するために、形質導入線維芽細胞中インビボで高レベルで持続的なＩＬ−２発現をもたらすプロモーターを用いなければならないということである。

本研究成果から得られたデータは、直接または間接的に抗腫瘍効果を有する全てのサイトカインについて重要な意味を包含している。さらには、本データは、抗腫瘍効力がＩＬ−２投与量に依存性であることを示唆する。したがって、より高レベルのサイトカイン分泌をもたらすベクターの構築は、本願の遺伝子治療法の適用に重要な進歩となる。

上記実施例中の括弧内の参考文献番号は、以下の参考文献リストと関連し、本明細書中に参考として援用されている。

（以下余白）参考す献１、　Ｇａｂｒｉｌｏｖｅ、　Ｊ、Ｌ、　’９　、　Ｍｏｎｏｇｒ、　Ｊ、　Ｎａｔｌ、　Ｃａｎｃｅｒｚｎｓｔ、■、７３−７　（１９９０１゜２、　Ｋｅｌｓｏ、　Ａ、、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　０ｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　ＩｍｍｕｎｏＬｏｇｙ、λ：２１５−２５　（１９８９１゜３、　Ｂｏｒｄｅｎ、　Ｅ、Ｃ−ｉ、、　、　Ｃａｎｃｅｒ、　６５：８００− １４　（１９９０１゜４、　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓ、Ａ、；　、Ａｎｎ、工ｎｔｅｒｎ−にａｄ−。

月狙：８５３−８６４　（１９８８１゜５、　Ｌｏｔｚｅ、Ｍ、Ｔ、　ら　、、ＴＡＭＡ、２５６：３１１７−３１２４　（１９Ｂ６）。

６、　Ｐｉｚｚａ、　Ｇ、　ら　、　Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ヱ：４５−８（１９８８１゜７、　５ａｒｎａ、　Ｇ、ら　、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ＲａｇｐｏｎｓｅＭｏｄｉｆｉｅｒｓ、　ｌ：８１−６　（１９９０１゜Ｂ・Ｇａｎｄｏｌｆｉ、Ｌ−う　、Ｈｅｐａｔｏ−Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ。

川＝３５２−６　４１９８９１゜９−　Ｂｕｂｅｎｉｋ、　Ｊ、！；、　Ｘ−ｕｎｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９：２７９−８２（１９８８１゜１０°　Ｂｕｂｅｎｉｋ　５　、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｌａｔｔｅｒｓ、２３：２８７−２９２（１９９０）。

１１、　Ｆｅａｒｏｎ、　Ｅ、Ｒ，Ｑ　、　Ｃｅ１ｌ、　６０：３Ｂ１−４０３　（１９９０１゜１２、　Ｇａｎ５ｂａｃｈａｒ、　Ｂ、ら　、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、、１７２：１２１７−１２２４　（１９９０１゜１１　Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｙ、’、　、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、。

Ｂ６：９４５６−９４６０　（１９８９１゜１４、　Ｔｅｐｐａｒ、　Ｒ，工、 ζ　、　Ｃａ１ｌ、　５７：５０３−５１２　（１９Ｂ９１゜１５、　Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、　Ｍ、、　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９０１゜１７、　Ｃｏｒｎｅｔｔａ、　Ｋ、Ｓ　、　Ｐｒｏｇ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉ口１．、並：３１１−２２　（１９８９１゜１Ｂ、　Ｂｏｏｖｅｒ、Ｈ，Ｃ，ら　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、４４：１６７１−７６（１９Ｂ４１゜１９、　５ｏｂｏｌ　！７Ｎｅｗ　Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ、３１６：１１１１−１１１７（１９８７）。

２０、　Ｌｉ　Ｘｕ、Ｓ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、　Ｙｕ：３３１−３４１　（１９８９）。

本発明を、現在の好ましい実施態様の参考として記載しているが、本発明の意図から離れることなく種々の改変をなし得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は次のクレームだけに限定される。

口＝コ　丑久ｌ田Ｒ’ｌ＞　＠＠　ＩＬ−２仔ンγ４入十〇月乞ＦＩＧ、　２ＦＩＧ、　３ＦＩＧ、　４ＦＩＧ、　５ＦＩＧ、　６ＦＩＧ、　８補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）諺迷ｍ匠１．被験体の癌を処置する方法であって、腫瘍性抗原、および、サイトカイン遺伝子産物を発現するように遺伝的に改変されたサイトカイン発現細胞を含有する製剤形態で、活動中の膿瘍部位以外の部位において、該被験体を免疫処置することにより、癌に対する該被験体の免疫応答を刺激する工程を包含し、ここで、該サイトカイン発現細胞が腫瘍細胞ではない、方法。

２、前記被験体からあらかじめ単離された腫瘍細胞が、前記腫瘍性抗原を特徴する請求項１に記載の方法。

３、前記サイトカイン遺伝子が、インターロイキン−１゜インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、およびガンマインターフェロンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

４、前記サイトカイン遺伝子が、インターロイキン−２である、請求項１に記載の方法。

５、サイトカイン発現細胞を生産するために、サイトカイン遺伝子が組換え法により細胞中に転移される、請求項１に記載の方法。

６、前記サイトカイン遺伝子が、発現ベクター中に存在する、請求項５に記載の方法。

７、前記発現ベクターが、自殺遺伝子をさらに含有する、請求項６に記載の方法。

８、前記サイトカイン発現細胞が、線維芽細胞および抗原提示細胞から生産される、請求項５に記載の方法。

９、癌に対する被験体の免疫応答を高める方法であって：ａ）該被験体から線維芽細胞を単離する工程；ｂ）　インビトロで、該線維芽細胞を培養する工程；Ｃ）　レトロウィルス発現ベクター中に、ＩＬ−２をコードする遺伝子および腫瘍性抗原をコードする遺伝子を含有するレトロウィルス発現ベクターを用いて、該線維芽細胞を形質導入して、該線維芽細胞により、該腫瘍性抗原を発現し、そして、該ＩＬ−２を発現および分泌する工程；およびｄ）　活性腫瘍部位以外の部位において、免疫応答を高めるのに十分であるが、実質的な全身的毒性を避けるのに十分に低いレベルでＩＬ−２を発現し、そして該腫瘍性抗原を発現する該線維芽細胞を用いて、該被験体を免疫処置する工程、を包含する、方法。

１０、前記線維芽細胞が、自殺遺伝子を発現するように、さらに改変される、請求項９に記載の方法。

１１、腫瘍性抗原に対する被験体の免疫応答を高める組成物であって、該組成物が、腫瘍性抗原、および、サイトカイン遺伝子産物を発現するように遺伝的に改変されたサイトカイン発現細胞を含有し、ここで、該サイトカイン発現細胞が腫瘍細胞ではない、組成物。

１２、前記サイトカイン遺伝子が、インターロイキン−１、インターロイキン− ２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、およびガンマインターフェロンからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。

１３、前記サイトカイン遺伝子が、インターロイキン−２である、請求項１１に記載の組成物。

１４、前記サイトカイン遺伝子が、免疫応答を刺激するのに十分であるが、実質的な全身的毒性を避けるのには十分に低いレベルで発現される、請求項１１に記載の組成物。

１５、前記形質導入の工程において、前記レトロウィルス発現ベクターが、ＩＬ −２の持続分泌を引き起こすプロモーターを有する、請求項９に記載の方法。

１６、前記レトロウィルス発現ベクターが、１日につき１０５個の細胞当たり約２ナノグラムから約１６０ナノグラムのＩＬ−２の分泌を引き起こす、請求項１５に記載の方法。

フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／　Ａ６１Ｋ　３８１００（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＣＡ、ＪＰ（７２）発明者　ロイストン、アイバーアメリカ合衆国　カリフォルニア　９２０３７゜ラ　ホヤ、エル　カミノ　デル　テアトロＩ（７２）発明者　フリートマン、ジオドアーアメリカ合衆国　カリフォルニア　９２０３７゜ラ　ホヤ、ラ　ホヤ　ショアーズ　ドライブ９４７０（７２）発明者　ファクライ、ハビーブアメリカ合衆国　カリフォルニア　９２０５６゜オーシャンサイド、アベニダ　アンダンテ

Claims

【特許請求の範囲】

１．被験体の癌を処置する方法であって、腫瘍性抗原、および、少なくとも１種のサイトカイン遺伝子産物を発現するように遺伝的に改変されたＣＥ細胞を含有する製剤形態で、活性腫瘍部位以外の部位において、該被験体を免疫処置することにより、癌に対する該被験体の免疫応答を刺激する工程を包含する、方法。
２．前記被験体からあらかじめ単離された腫瘍細胞が、前記腫瘍性抗原を提供する、請求項１に記載の方法。
３．前記サイトカイン遺伝子が、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インクーロイキン−５、インターロイキン−６、およびガンマインターフェロンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
４．１種のサイトカイン遺伝子が、インターロイキン−２である、請求項３に記載の方法。
５．ＣＥ細胞を生産するために、少なくとも１種のサイトカイン遺伝子が組換え法により細胞中に転移される、請求項１に記載の方法。
６．前記サイトカイン遺伝子が、発現ベクター中に存在する、請求項５に記載の方法。
７．前記発現ベクターが、自殺遺伝子をさらに含有する、請求項６に記載の方法。
８．前記ＣＥ細胞が、線維芽細胞および抗原提示細胞から生産される、請求項５に記載の方法。
９．癌に対する被験体の免疫応答を高める方法であって：ａ）該被験体から線維芽細胞を単離する工程；ｂ）インビトロで、該線維芽細胞を培養する工程；ｃ）レトロウイルス発現ベクター中に、１Ｌ−２をコードする遺伝子および腫瘍性抗原をコードする遺伝子を含有するレトロウイルス発現ベクターを用いて、該線維芽細胞を形質導入して、該線維芽細胞により、該腫瘍性抗原を発現し、そして、該１Ｌ−２を発現および分泌する工程；およびｄ）活性腫瘍部位以外の部位において、免疫応答を高めるのに十分であるが、実質的な全身的毒性を避けるのに十分に低いレベルで１Ｌ−２を発現し、そして該腫瘍性抗原を発現する該線維芽細胞を用いて、該被験体を免疫処置する工程、を包含する、方法。
１０．前記線維芽細胞が、自殺遺伝子を発現するように、さらに改変される、請求項９に記載の方法。
１１．腫瘍性抗原に対する被験体の免疫応答を高める組成物であって、該組成物が、腫瘍性抗原、および、少なくとも１種のサイトカイン遺伝子産物を発現するように遺伝的に改変されたＣＥ細胞を含有する、組成物。
１２．前記サイトカイン遺伝子が、インターロイキン−１、インターロイキン− ２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、およびガンマインターフェロンからなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
１３．１種のサイトカイン遺伝子が、インターロイキン−２である、請求項１２に記載の組成物。
１４．各サイトカイン遺伝子が、免疫応答を刺激するのに十分であるが、実質的な全身的毒性を避けるのには十分に低いレベルで発現される、請求項１１に記載の組成物。
１５．前記形質導入の工程において、前記レトロウイルス発現ベクターが、１Ｌ −２の持続分泌を引き起こすプロモーターを有する、請求項９に記載の方法。
１６．前記レトロウイルス発現ベクターが、１０日またはそれ以上の期間、少なくとも４単位／日の１Ｌ−２の分泌を引き起こす、請求項１５に記載の方法。