PT1267945E

PT1267945E - Células geneticamente modificadas que expressam um inibidor de ftc-beta, sendo essas células, células de cancro de pulmão

Info

Publication number: PT1267945E
Application number: PT01926498T
Authority: PT
Inventors: Habib Fakhrai
Original assignee: Novarx
Priority date: 2000-03-31
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2011-12-28
Also published as: ATE526990T1; JP5079962B2; EP1267945B8; EP2314322A1; EP1267945B1; WO2001074404A2; JP2012176994A; WO2001074404A3; JP2003528930A; DK1267945T3; EP1267945A2; ES2373431T3; AU2001253031A1

Description

DESCRIÇÃO

CÉLULAS GENETICAMENTE MODIFICADAS QUE EXPRESSAM UM INIBIDOR DE FTC-BETA, SENDO ESSAS CÉLULAS, CÉLULAS

DE CANCRO DE PULMÃO

Antecedentes da invenção

Domínio da invenção A presente invenção tem por objecto composições que compreendem uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de células geneticamente modificadas contendo uma estrutura genética expressando um inibidor de FTCP eficaz para reduzir a expressão de FTCP, em que as células geneticamente modificadas são células de cancro do pulmão de células não pequenas (CPCNP) ou células de cancro do pulmão de células pequenas (CPCP) e utilizações relacionadas.

Descrição da técnica relacionada 0 cancro de pulmão continua a ser o cancro mais prevalente no mundo ocidental, sendo responsável por 30 % de todas as mortes relacionadas com cancro (Ramanathan e Belani, 1997). O prognóstico actual para doentes com cancro do pulmão é mau. A taxa de cura total é estimada como sendo tão baixa quanto 13 %. Cerca de 180.000 novos casos de cancro de pulmão são esperados nos Estados Unidos Estados em 1999. A maioria destes doentes morrerá da doença, sendo esperadas 160.000 mortes por cancro de pulmão, a nível nacional, em 1999. 1

Existem duas subdivisões principais de cancro do pulmão: 1) cancro do pulmão de células não pequenas (CPCNP) e 2) cancro do pulmão de células pequenas (CPCP). As abordagens de tratamento e a história natural diferem para estas duas doenças. A maioria (80 %) dos casos de cancro do pulmão nos Estados Unidos são CPCNP. Embora se tenham feito, nos últimos 20 anos, avanços na compreensão de importantes factores clínicos e de prognóstico para os CPCNP e CPCP, tem havido apenas melhorias mínimas nos resultados terapêuticos. A única opção de cura para doentes com NSCLC é uma terapêutica local (excisão cirúrgica ou irradiação local) em doentes com a doença em estágio inicial (I & II) quando o tumor ainda está localizado. No momento do diagnóstico, no entanto, a maioria dos doentes com CPCNP apresentam a doença avançada, que não é curável apenas por cirurgia. Em estágios avançados da doença, a quimioterapia sistémica e/ou a irradiação podem produzir respostas objectivas e paliação dos sintomas, no entanto, oferecem apenas melhorias modestas em relação à sobrevivência. A sobrevivência média de doentes com doença irressecável é 6 a 12 meses. As taxas de sobrevivência de dois anos para os estágios IIIB e IV de CPCNP são de 10,8 e 5,4 por cento respectivamente. Da mesma forma, as taxas de sobrevivência de cinco anos são de 3,9 e 1,3 por cento. Recentemente, ficaram disponíveis vários fármacos novos para o tratamento de CPCNP, incluindo o paclitaxel (Taxol), docetaxel (Taxotere), topotecano, irinotecan, vinorelbina e gencitabina. Embora estes fármacos sejam melhorias em relação aos agentes quimioterapêuticos anteriores (etopósido, cisplatina e carboplatina), a taxa de cura global continua a ser baixa. 0 CPCP é um cancro muito agressivo, que metastiza cedo e muitas vezes e tem uma sobrevivência média desde o 2 diagnóstico de apenas dois a quatro meses. As formas localizadas de tratamento, como a ressecção cirúrgica ou a radioterapia, raramente produzem uma sobrevivência a longo prazo por causa da propensão deste cancro para metastizar à distância. Com a quimioterapia, a sobrevivência pode ser prolongada pelo menos quatro a cinco vezes em relação à taxa de sobrevivência dos doentes que são se submetem a uma terapêutica, no entanto, a sobrevivência global em cinco anos permanece somente em 5-10 %.

Como as actuais modalidades terapêuticas não aumentam significativamente a expectativa de vida em estágios de pacientes com CPCNP ou com CPCP, justifica-se a exploração de novas abordagens terapêuticas para estes doentes. A patente WO 96/002143 tem por objecto um processo de prevenção ou de redução da gravidade de um cancro num indivíduo, por meio da estimulação da resposta imunitária do indivíduo contra o cancro. A patente WO 96/25178 tem por objecto uma abordagem para o tratamento de fibroses do tecido resultantes da acumulação de matriz extracelular induzida por FTC-β.

Sumário da invenção

Doentes portadores de tumores de origem histológica diferente têm níveis elevados de factores β de transformação do crescimento (ΕΤΟβ). Os ΕΤΟβ são factores de crescimento que estão associados à imunossupressão. A supressão do sistema imunológico dos doentes, resulta na sua incapacidade de reconhecer e destruir tumores quando eles aparecem pela primeira vez. Além disso, a supressão da imunidade dos doentes torna-os susceptíveis a infecções frequentes. A injecção de células tumorais tratadas por 3 engenharia genética para bloquear a produção de ΠΌβ faz com que as células modificadas pelo gene sejam potentes vacinas que são reconhecidas e podem activar o sistema imunitário contra o tumor. A activação do sistema imunológico causa em seguida o reconhecimento e o controlo dos tumores parentais não modificados nos organismos hospedeiros. Este fenómeno aplica-se em modelos de tumores de animais e em ensaios clínicos humanos. Assim, os requerentes propõem a utilização desta abordagem em doentes com estágios de cancro do pulmão de células não pequenas e cancros do pulmão de células pequenas.

Descrição detalhada do enquadramento preferido

Os cancros do pulmão são responsáveis por 30 % de todos os óbitos por cancro nos Estados Unidos (Ramanathan e Belani, 1997) . A taxa geral de cura para o cancro do pulmão é de 13 % e o prognóstico actual para doentes com cancro do pulmão de células não pequenas (CPCNP) e o cancro do pulmão de células pequenas (CPCP) continua mau. Já foi documentado que doentes com um crescimento progressivo do tumor têm uma disfunção da função imunitária (Jakowlew et al. 1995, Ransohoff et al 1991/ Holladay et al. 1992a; Holladay et al. 1992b). Este comprometimento, normalmente caracterizado como uma hiporeactividade imunológica marcada, não se confina apenas à imunidade específica do tumor mas, em vez disso, é muitas vezes observada em todo o sistema imunológico. Esta disfunção é especialmente evidente no compartimento de células T ou mediado por células T e é caracterizada por linfopénia e reactividade das células T disfuncionais às células T, tanto para o estímulo específico do tumor como para o estímulo específico de não tumor (Ransohoff et al. 1991) . 4

Os tumores Às vezes o tumor pode escapar à vigilância imunitária expressando níveis mais baixos de moléculas de MHC da classe I e da classe II. Outros tumores podem escapar através do aumento da expressão de moléculas imunossupressoras, como os ΕΟΤβ. É comum observar tumores que utilizam uma combinação destes mecanismos. A terapêutica genética tem merecido uma atenção considerável nos últimos anos. A vacinação com células tumorais concebida para aumentar o aparecimento de antigénios tumorais e induzir a imunidade anti-tumoral específica tem mostrado resultados promissores, mas limitados (Holladay et al. 1992) . Os avanços na nossa compreensão da biologia do cancro e dos desenvolvimentos em tecnologias de vector estão a aumentar o potencial terapêutico das abordagens da vacina para o tumor. Agora é possível modificar geneticamente as células tumorais para a vacinação para expressar genes supressores específicos do tumor, imunomoduladores, genes sensíveis aos fármacos e fragmentos de genes anti-paralelos (Huber et al. 1991; Culver et al. 1992; Trojan et al. 1992; Dranoff et al. 1993; Ram et al. 1993; Trojan et al. 1993; Swisher et al. 1999). Em estudos pré-clínicos e estudos clínicos particulares demonstra-se o potencial das abordagens terapêuticas génicas no tratamento do cancro de pulmão. Modelos pré-clinicos de cancro de pulmão mostraram a regressão dos tumores estabelecidos e o aumento da imunogenicidade usando uma linha alogénica de cancro pulmonar geneticamente modificada para expressar a citocina FEC-GM e um gene sensível a fármacos, timidina-cinase do vírus do herpes simples misturada com células dendríticas derivadas de medula óssea singeneica (Miller et al. 1998). Os resultados preliminares dos ensaios clínicos da fase I, em doentes usando a terapia de genes retroviral mostra que 5 a terapia genética é bem tolerada e sem toxicidade (Swisher et al. 1998).

Os factores de transformação do crescimento beta (FTCP) são uma família de proteínas multi-funcionais que regulam o crescimento e a função de muitos tipos de células normais e neoplásicas (Sporn et al. 1986; Massague 1987; Border e Rouslahti 1992; Jachimczak et al. 1993) . Exercem uma vasta gama de efeitos numa variedade de tipos de células e verificou-se que estimulam ou inibem o crescimento celular, induzem a apoptose e aumentam a angiogénese (Merzak et al. 1994; et al. 1994; Ashley et al.1998a; Ashley et al.1998b; Jennings et al. 1998). Estes efeitos são mediados ao nível da transdução do sinal.

Constatou-se que a transdução do sinal de ΕΤΟβ afecta a expressão de mais de 20 genes diferentes (Baker e Harland 1997; Heldin et al. 1997; Stiles 1997; Yingling et al. 1997). Ο ΠΌβ existe em três isoformas, conhecidas como ΕΤΟβΙ, ΕΤ0β2 e ΕΤ0β3. As suas sequências de aminoácidos exibem homologias da ordem de 70-80 %. As proteínas ΕΤΟβ humanas e os genes que as codificam são conhecidos na técnica. Especificamente, têm sido documentados o ARNm de FTCPI (GenBank n°. de acesso XM_008912 e NM_000660) , ARNm de ΕΤ0β2 (GenBank n°. de acesso XM_001754 e NM_003238) e ARNm de ΕΤΟβ3 (GenBank n°. de acesso XM_007417) de fontes humanas.

As proteínas receptoras de ΕΤΟβ podem ser do tipo I (55 kDa) ou do tipo II (70 kDa). As proteínas receptoras de ΕΤΟβ e os genes que as codificam também são conhecidos na técnica. Estão descritos na técnica o ARNm do receptor do ΕΤΟβ humano do tipo I (GenBank n°. de acesso XM_005591) e o 6 ARNm do receptor do FTCP humano do tipo II (GenBank n° . de acesso XM_003094).

As citocinas da superfamília dos FTCP ligam-se a receptores específicos da serina/treonina cinase e transmitem sinais intracelulares através das proteínas Smad. Com a estimulação do ligando, as Smad movem-se para o núcleo e funcionam como componentes de complexos de transcrição. A sinalização dos FTCP é regulada positiva e negativamente através de vários mecanismos. A regulação positiva amplifica os sinais para um nível suficiente para a actividade biológica. A regulação negativa ocorre aos níveis citoplasmático e nuclear extracelular da membrana.

Muitos tumores, incluindo o CPCNP e o CPCP, produzem altos níveis de FTCP activo (Constam et al. 1992; Eastham et al. 1995; Friedman et al. 1995; Jakowlew et al. 1995; Kong et al. 1995; Yamada et al. 1995; Eder et al. 1996) . Níveis elevados de ΡΤΰβ também têm sido associados à imunossupressão (Sporn et al. 1986; Massague 1987; Bodmer et al. 1989; Border e Rouslahti 1992; Chen et al. 1997). 0 F1^ inibe a activação de células T em resposta à estimulação do antigénio. Além disso, os ΡΊΌβ têm efeitos antagonistas sobre nas células assassinas naturais (NA, em inglês NK), bem como a indução e a proliferação das células assassinas activadas por linfocina (AAL, em inglês LAK) (Rook et al. 1986; Kasid et al. 1988; Tsunawaki et al. 1988; Hirte et al. 1991; Ruffini et al. 1993; Naganuma et al. 1996) . Em apoio a isto, tem sido demonstrada uma relação entre os níveis de ΡΤΰβ e a sobrevivência em cancro do cólon (Friedman et al. 1995) . As taxas de recorrência foram 18 vezes maiores em doentes cujo tumor produziu altos níveis de ΡΤόβ em comparação com aqueles em que o tumor 7 produziu níveis baixos. Esta relação foi independente do estado nodal e do grau de diferenciação do tumor primário.

Dado o papel de ΠΟβ na supressão imunológica, os requerentes propuseram-se avaliar o efeito da inibição de FTCP por meio da vacinação do tumor CPCNP. Utilizando uma abordagem de um inibidor de FTCP os requerentes transfectaram um certo número de células de CPCNP com ΡΊΌβ anti-paralelo, seleccionado entre FTCpi, ΡΊΌβ2 e ΡΊΌβ3 e as suas misturas. Escolheu-se ΕΤ0β2 anti-paralelo porque demonstrou superioridade na regulação decrescente da expressão de FT^ comparado com ΓΤύβΙ ou com uma combinação de FT^l e FT^2. Estas células de CPCNP geneticamente modificadas foram então irradiadas para prevenir a proliferação e foram injectadas num certo número de indivíduos diferentes com tumor. Observou-se que as células de CPCNP, previamente ineficazes como componentes de uma vacina poderiam tornar-se eficazes através de uma modificação genética. 0 bloqueio da expressão de ΓΤόβ aumentou a imunogenicidade destes animais. Além disso, essas vacinações erradicaram tumores previamente implantados e protegeram os animais contra o reaparecimento do tumor.

Dado o papel de ΓΤόβ na supressão imunológica, os requerentes propuseram-se avaliar o efeito da inibição de ΓΤύβ por meio da vacinação contra o tumor de CPCNP. Utilizando uma abordagem com um inibidor de ΓΤύβ os requerentes transfectaram um certo número de células de CPCP com ΓΤύβ anti-paralelo, seleccionado entre ΕΤΟβΙ, ΕΤύβ2 e ΓΤύβ3 e as suas misturas. Estas células de CPCP geneticamente modificadas são então irradiadas para prevenir a proliferação e são injectadas num certo número de indivíduos diferentes com tumor. Os requerentes observaram que as células de CPCP, previamente ineficazes como componentes de uma vacina poderiam tornar-se eficazes através dessa modificação genética. Encara-se o bloqueio da expressão de ΠΟβ como um aumento a imunogenicidade destes animais. Além disso, consideram-se essas vacinações como formas de erradicação de tumores previamente implantados e de protecção dos animais contra o aparecimento de novos tumores.

Os requerentes demonstraram a eficácia desta abordagem num modelo de tumor de CPCNP. No modelo de tumor do CPCNP, KLN-205, vacinaram-se murganhos DB2 com duas injecções de 5 x 105 células autólogas de CPCNP, modificadas por genes anti-paralelos de FTC32 e irradiadas. Com isto conseguiu-se proteger os animais contra um subsequente aparecimento intraperitoneal (i.p.) do tumor com 106 células de CPCNP, KLN-205, sem modificações. Em experiências de erradicação neste modelo de tumor de cancro do pulmão, a vacinação de animais com tumores com uma semana de existência, com células modificadas do gene anti-paralelo de FTC32 resultou numa regressão acentuada do tumor e prolongou a sobrevivência sem tumor, comparada com a do grupo de controlo.

Fakhrai et al. 1996 demonstraram a eficácia desta abordagem num tumor glial de rato. No modelo de tumor de gliossarcoma 9L, a implantação intracraniana de um mínimo de 300 células do tumor em ratos Fisher-344 resultou em mais de 99 % de mortalidade após seis semanas. Fakhrai et al. 1996 implantaram 5 x 103 células do tumor no cérebro de ratos e administraram vacinas de tumor. Os animais imunizados com células 9L modificadas, anti-paralelas, de ΓΤΟβ2 ou com células 9L modificadas, anti-paralelas, de ΓΤΟβ2 para segregar IL-2 que permaneceu isenta de tumor 9 durante a duração do estudo (24 em 2 4 ou 100 % de sobrevivência sem tumor). Pelo contrário, a maioria do grupo de controlo (2 em 15) imunizado com células contendo os tumores que desenvolveram vectores vazios tiveram que ser sacrificados no prazo de cinco semanas (13 % de sobrevivência sem tumor, p < 0,01).

Liau et al. 1998 demonstraram uma eficácia comparável da terapia de genes anti-paralelos de ΕΤΟβ2 num modelo de tumor glioma C-6 de rato. Dorigo et al. 1998 mostraram a eficácia desta abordagem num modelo de tumor de teratoma de ovário de murino (TOM); no entanto, apenas o grupo inoculado com células modificadas do gene de UL2 e do gene anti-paralelo de FTCP resultou numa protecção significativa em relação ao aparecimento subsequente de um novo tumor, estabelecendo assim o empirismo da abordagem. Outros grupos têm demonstrado efeitos anti-tumorais semelhantes à terapia genética de ΠΟβ em células de cultura e modelos de tumores de animais (Kim et al. 1997). A terapêutica genética tem merecido uma atenção considerável nos últimos anos. A vacinação com células tumorais concebida para aumentar o aparecimento de antigénios tumorais e para induzir a imunidade anti-tumoral especifica tem mostrado resultados promissores, mas limitados. Avanços na nossa compreensão da biologia do cancro e dos desenvolvimentos em tecnologias de vector estão aumentando o potencial terapêutico das abordagens da vacina para o tumor. Agora é possível modificar geneticamente as células tumorais para a vacinação para expressar genes supressores específicos do tumor, imunomoduladores, genes sensíveis aos fármacos ou fragmentos de genes anti-paralelos (Huber et al. 1991; 10

Culver et al. 1992; Trojan et al. 1992; Dranoff et al. 1993; Ram et al. 1993; Trojan et al. 1993).

Um certo número de estudos clínicos têm avaliado células tumorais alogénicas geneticamente modificadas como componentes primários de tratamentos imunoterapêuticos para os cancros do cérebro, pele, cólon e mama. Os esquemas de vacinação têm mostrado ser seguros e geram respostas imunitárias anti-vacina humorais e celulares. Os resultados preliminares de vários ensaios clínicos da fase I, utilizando terapias genéticas em doentes com CPCNP, também demonstraram a segurança das abordagens das terapias de genes para esta população de doentes (Dubinett, 1998; Roth, 1998; Swisher et al. 1998) bem como uma população de doentes com CPCP. Há grupos que demonstraram experiência no campo da terapia genética, tanto numa série de modelos de tumores de animais como na clínica, (por exemplo, Fakhrai et al. 1995; Sobol et al. 1999) . A FDA já tinha aprovado antes, pelo menos quatro IND (fármaco aprovado para testes clínicos em seres humanos; do inglês investigational new drug) que tinham sido submetidos a investigação da vacinação modificada por genes em doentes com cancro: • Sobol et al., BB-IND # 5812: "Injection of colon carcinoma patients with autologous irradiated tumor cells and fibroblasts genetically modified to secrete interleukin-2 (IL-2). A Phase I study" • Sobol et al., BB-IND # 4840: "Active immunotherapy of glioblastoma with tumor cells or fibroblasts genetically modified to secrete interleukin-2 (IL-2)" • Sobol et al., BB-IND # 7483: "A Phase I Study of Allogeneic Tumor Cells Genetically Modified to Express 11 Β7.1 · (CD80) Mixed with Allogeneic Fibroblasts

Genetically Modified to Secrete IL-2 in Patients with Colorectal Carcinoma" • Fakhrai et al. BB-IND # 6658: "Proposal for a Phase I Clinicai Trial: A Phase I Study of the Safety of Injecting Malignant Glioma Patients with Irradiated FTC32 Antisense Gene-Modified Autologous Tumor Cells".

Na BB-IND # 6658, a FDA aprovou um IND da fase I avaliando a terapia génica anti-paralela de FTC32 em doentes com glioma de alto grau. Os doentes foram vacinados com células tumorais autólogas de glioma, geneticamente modificadas com o plasmido anti-paralelo de Π0β2 para bloquear a expressão de FTC32. A terapia consistiu em injecções intradérmicas com 5 x 108, 1 x 107 ou 2 x 107 células, de 3 em 3 semanas, durante os primeiros 4 meses e depois a cada 1-2 meses. Até o momento, trataram-se 5 doentes. Sob a mesma IND, a FDA aprovou o uso compassivo de uma parte correspondente de uma linha de células alogénica de glioma que emparelhavam parcialmente com o haplotipo que foi modificado pelo gene com o mesmo vector anti-paralelo de ΓΤ0β2 num doente com um glioma pediátrico. 0 tratamento global tem sido bem tolerado, têm sido relatadas apenas toxicidades transitórias de baixo grau. Não se observaram reacções adversas significativas nos locais de vacinação e não se observaram anomalias relacionadas com o tratamento, na monitorização do hemograma completo, da bioquímica do soro e das análises de urina. Nalguns casos transitórios, observou-se um eritema leve nos locais da injecção, após as segunda e terceira injecções subcutâneas com células tumorais autólogas modificadas por genes anti-paralelos de ΓΤ0β2. 12

Observou-se um aumento dos níveis de infiltrados das células efectoras CD3+, CD4+ e CD8+ no local da injecção e em biópsias de tumores secundários. A histologia imunitária das biópsias no local da injecção e do tumor obtidas numa operação subsequente demonstra um número significativamente maior de infiltrados imunológicos em comparação com as biópsias realizadas antes do início da terapia genética.

Dos 5 doentes tratados, 1 doente demonstrou uma resposta clínica, 2 demonstraram respostas imunes melhoradas, 1 mostrou uma progressão do tumor, enquanto o quinto doente ainda está em tratamento. No doente que teve uma resposta clínica, em geral, os exames de ressonância magnética realizados, aproximadamente com 6 semanas de intervalo, durante os primeiros três meses de tratamento, revelaram pequenas e modestas mudanças no tamanho do tumor em geral. Pode-se observar um aspecto encerado e um decréscimo do edema peri-tumoral associado a alterações nas doses de Decadron. No entanto, os exames de ressonância magnética mostraram regressão do tumor ao fim de sete meses com uma melhoria na resposta 3 meses mais tarde.

Os ensaios clínicos da fase I demonstraram assim a segurança da injecção dos doentes com 5 x 106, 1 x 107 ou 2 x 107 células tumorais autólogas anti-paralelas, modificadas com genes de Π0β2 ou de haplotipo emparelhado. Além disso, é encorajador ver a imunogenicidade aumentada e respostas clínicas preliminares observadas com este esquema de vacinação. Os requerentes contemplaram a aplicação desta abordagem de terapia genética em doentes com CPCNP ou CPCP. A presente invenção engloba composições e utilizações para prolongar a sobrevivência de um indivíduo com um cancro do pulmão de células não pequenas (CPCNP) ou um 13 cancro do pulmão de pequenas células (CPCP) compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade terapêutica eficaz de células geneticamente modificadas contendo uma estrutura genética que expressa um inibidor de ΕΤΟβ, eficaz para reduzir a expressão de ΠΟβ, em que as células que são geneticamente modificados são células de CPCNP ou de CPCP. Qualquer processo que neutralize ΕΤΟβ ou iniba a expressão do gene ΕΤΟβ (quer transcrição ou tradução) pode ser utilizado para conseguir a sobrevivência do indivíduo. Tais abordagens também podem ser úteis para aplicações de tratamento, ou seja, para o tratamento de CPCNP ou CPCP.

Numa modalidade, as modalidades de sobrevivência podem ser concebidas para reduzir o nível de expressão génica endógena de FTCP, por exemplo, usando abordagens anti-paralelas ou com ribozima para reduzir ou inibir a tradução dos transcritos do ARNm de FTCP; abordagens com a hélice tripla para inibir a transcrição do gene FTCP; ou recombinação homóloga dirigida ao alvo para inactivar ou fazer o nocaute do gene ΕΤΟβ ou do seu promotor endógeno.

As abordagens anti-paralelas envolvem o desenho de oligonucleótidos (quer ADN ou ARN), que são complementares do ARNm de ΕΤΟβ. Os oligonucleótidos anti-paralelos vão ligar-se aos transcritos complementares do ARNm de ΕΤΟβ e previnem a tradução. A complementaridade absoluta, embora preferida, não é necessária. Uma sequência "complementar" de uma parte de um ARN, tal como referido aqui, significa uma sequência com uma complementaridade suficiente para ser capaz de hibridar com o ARN, formando um duplex estável; no caso de ácidos nucleicos anti-paralelos de hélice dupla, pode-se assim ensaiar uma hélice simples do ADN de hélice dupla ou pode-se fazer o ensaio de uma formação de hélice tripla. A capacidade de hibridar dependerá tanto do grau de 14 complementaridade como do comprimento do ácido nucleico anti-paralelo. Geralmente, quanto mais longa for a hibridação dos ácidos nucleicos, mais desemparelhamentos de bases com um ARN podem conter e ainda formam um duplex estável (ou triplex, conforme o caso). Um especialista na matéria pode determinar um grau tolerável de desemparelhamento com o uso de procedimentos padrão para determinar o ponto de fusão do complexo hibridado.

Os oligonucleótidos que são complementares da extremidade 5' da mensagem, por exemplo, a sequência não traduzida de 5' até e incluindo o codão de iniciação de AUG, devem trabalhar mais eficientemente na inibição da tradução. No entanto, as sequências complementares das sequências não traduzidas de 3' dos ARNm também se têm mostrado eficazes na inibição da tradução dos ARNm. Ver, na generalidade, Wagner, R., 1994, Nature 372: 333-335. Assim, a complementaridade dos oligonucleótidos em relação a qualquer uma das regiões de não codificação e não

traduzidas de 5' ou de 3' de ΠΟβ poderia ser usada numa abordagem anti-paralela para inibir a tradução do ARNm endógeno de FTC3. A complementaridade dos oligonucleótidos em relação à região 5' não traduzida de ARNm deve incluir o complemento do codão de iniciação de AUG. A complementaridade dos oligonucleótidos anti-paralelos em relação às regiões de codificação de ARNm também poderia ser utilizada de acordo com a presente invenção. Quando concebido para hibridar as regiões 5', 3' ou a região de codificação de ARNm de ΡΤΟβ, os ácidos nucleicos anti-paralelos devem ter pelo menos seis nucleótidos de comprimento e são, de preferência, oligonucleótidos que variam de 6 a cerca de 50 nucleótidos de comprimento. Em aspectos específicos, o oligonucleótido tem pelo menos 17 15 nucleótidos, pelo menos 25 nucleótidos ou pelo menos 50 nucleótidos.

Independentemente da escolha da sequência-alvo, é preferível que os estudos in vitro sejam realizados primeiro para quantificar a capacidade do oliqonucleótido anti-paralelo para inibir a expressão do gene. É preferível que estes estudos utilizem controlos que distingam entre a inibição do gene anti-paralelo e os efeitos biológicos não específicos dos oligonucleótidos. Também é preferível que estes estudos comparam os níveis de ARN-alvo ou de proteínas com os de um ARN de controlo interno ou proteína. Além disso, prevê-se que os resultados obtidos usando o oligonucleótido anti-paralelo sejam comparáveis com os obtidos utilizando um oligonucleótido de controlo. É preferível que o oligonucleótido de controlo seja aproximadamente do mesmo comprimento que o oligonucleótido de ensaio e que a sequência de nucleótidos do oligonucleótido difira da sequência anti-paralela não mais do que o necessário para evitar a hibridação específica com a sequência-alvo.

Os oligonucleótidos podem ser ADN ou ARN ou misturas quiméricas ou derivados ou as suas versões modificadas, de hélice simples ou de hélice dupla. 0 oligonucleótido pode ser modificado na parte da base, na parte de açúcar ou na estrutura de fosfato, por exemplo, para melhorar a estabilidade da molécula, a hibridação, etc. 0 oligonucleótido pode incluir outros grupos anexados, tais como péptidos (por exemplo, para atingir os receptores da célula hospedeira) ou agentes facilitar o transporte através da membrana celular (ver, por exemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre et 16 al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. 84: 648-652; publicação da PCT No. W088/09810, publicada em 15 de Dez. de 1988) . 0 oligonucleótido anti-paralelo pode compreender pelo menos uma parte de base modificada que se selecciona no grupo que inclui, mas não se limita a 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxi-hidroxilmetil)-uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboxi-metilaminometiluracilo, di-hidrouracilo, beta-D-galactosil-queosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxi-carboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-iso-penteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v) , vibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metil-uracilo, éster metilico do ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo, (acp3)w e 2,6-diaminopurina. 0 oligonucleótido anti-paralelo também pode incluir pelo menos uma parte de açúcar modificada seleccionada no grupo incluindo mas não se limitando a arabinose, 2-fluoro-arabinose, xilulose e hexose.

Ainda noutra modalidade, o oligonucleótido anti-paralelo compreende pelo menos uma estrutura de fosfato modificada seleccionada no grupo que consiste em fosforo-tioato, fosforoditioato, fosforamidotioato, fosforamidato, fosfordiamidato, metilfosfonato, fosfotriéster de alquilo e formacetal ou um seu análogo. 17

Os oligonucleótidos da presente invenção podem ser sintetizados por processos padrão conhecidos na técnica, por exemplo, pelo uso de um sintetizador automático de ADN (como os que estão comercialmente disponíveis na Biosearch, Applied Biosystems, etc.). Como exemplos, podem sintetizar-se oligonucleótidos de fosforotioato pelo processo de Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209), os oligonucleótidos de metilfosfonato podem ser preparados utilizando suportes de polímeros de vidro de poros controlados (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85: 7448-7451), etc.

No entanto, é muitas vezes difícil alcançar as concentrações intracelulares do anti-paralelo suficientes para suprimir a tradução dos ARNm endógenos. Portanto, uma abordagem conveniente utiliza uma estrutura de ADN recombinante em que a sequência anti-paralela é colocada sob o controlo de um promotor forte. O uso dessa estrutura para transfectar as células-alvo irá resultar na transcrição de quantidades suficientes de ARN de hélice simples que formarão pares de bases complementares com os transcriptos endógenos de FTCP e, assim, prevenir a tradução do ARNm de FTCp. Por exemplo, pode-se introduzir um vector de tal ordem que seja incorporado por uma célula e direccionado para a transcrição de um ARN anti-paralelo. Esse vector pode permanecer epissómico ou tornar-se integrado sob o ponto de vista cromossómico, desde que possa ser transcrito para produzir o ARN anti-paralelo desejado. Esses vectores podem ser construídos por processos de tecnologia padrão na técnica de ADN recombinante. Os vectores podem ser plasmidos, virais ou outros conhecidos na técnica, utilizados para a replicação e a expressão em células de mamíferos. A expressão da sequência de codificação do ARN anti-paralelo pode ser 18 feita por qualquer promotor conhecido na técnica para actuar em células de mamíferos, preferencialmente células humanas. Esses promotores podem ser indutíveis ou constitutivos. Esses promotores incluem mas não se limitam a: reqião promotora precoce de SV40 (Bernoist e Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), promotor contido na repetição do terminal longo de 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), promotor do herpes de timidina cinase (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 78: 1441-1445), sequências reguladoras do gene da metalotioneína (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42), etc.

As moléculas de ribozima concebidas para clivarem cataliticamente os transcriptos do ARNm de FTCP também podem ser usadas para prevenir a tradução do ARN de FTCP e a expressão de FTCp. (Ver, por exemplo, a publicação da PCT internacional WO90/11364, publicada a 4 de Outubro de 1990; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222-1225). Embora as ribozimas que clivam o ARNm em sequências de reconhecimento específicas do sítio possam ser usados para destruir os ARNm de ΓΤΟβ, é preferível utilizar as ribozimas de cabeça de martelo. As ribozimas de cabeça de martelo clivam ARNm em locais ditados pelas regiões de flanqueio que formam pares de bases complementares com o ARNm alvo. 0 único requisito é que o ARNm alvo tenha a seguinte sequência de duas bases: 5'-UG-3'. A construção e a produção de ribozimas de cabeça de martelo são bem conhecidas na técnica e estão descritas com mais detalhes em Haseloff e Gerlach, 1988, Nature, 334: 585-591. Há centenas de potenciais sítios de clivagem da ribozima de cabeça de martelo dentro da sequência de nucleótidos de um ADNc de ΓΤύβ. De preferência, a ribozima é tratada por engenharia para que o sítio de reconhecimento de clivagem esteja 19 localizado perto da extremidade 5' do ARNm de FTCP; ou seja, para aumentar a eficiência e minimizar a acumulação intracelular dos transcritos não funcionais do ARNm.

As ribozimas da presente invenção incluem também endoribonucleases de ARN (doravante denominadas "ribozimas do tipo Cech") tal como as que ocorrem naturalmente em Tetrahymena Thermophila (conhecida como IVS ou ARN de L-19 IVS) e que tem sido amplamente descrita por Thomas Cech e colaboradores (Zaug, et al., 1984, Science, 224:5 74-578; Zaug e Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324: 429-433; pedido de patente internacional publicada No. WO 88/04300 da University Patents Inc.; Been e Cech, 1986, Cell, 47: 207-216). As ribozimas do tipo Cech têm um sitio activo de oito pares de bases que híbrida com uma sequência do ARN alvo onde se dá a clivagem do ARN alvo. A presente invenção abrange as ribozimas do tipo Cech que atingem as sequências do sítio activo de oito pares de bases que estão presentes em ΕΊΌβ.

Como na abordagem anti-paralela, as ribozimas podem compostas por oligonucleótidos modificados (por exemplo, para uma melhorar a estabilidade, a segmentação, etc.) e precisam de ser libertadas nas células-alvo que expressam FTCp. Um processo conveniente de libertação envolve a utilização de uma estrutura de ADN que codifica a ribozima sob o controlo de um promotor forte de modo que as células transfectadas irão produzir quantidades suficientes da ribozima para destruir mensagens endógenas de ΕΊΌβ e inibir a tradução. Porque as ribozimas, ao contrário das moléculas anti-paralelas, são catalíticas, é necessária uma menor concentração intracelular para haver eficiência. 20 A expressão endógena do gene ΕΤΟβ também pode ser reduzida pela inactivação ou "nocaute" do gene ΕΤΟβ ou o seu promotor usando recombinação homóloga dirigida ao alvo. (Ver, por exemplo, Smithies et al., 1985, Nature 317: 230-234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503-512; Thompson et al., 1989 Cell 5: 313-321) . Por exemplo, um ΕΤΟβ mutante, não funcional (ou uma sequência de ADN completamente alheia) flanqueado por ADN homólogo do gene ΕΤΟβ endógeno (tanto as regiões de codificação como as regiões reguladoras do gene ΕΤΟβ) pode ser usado, com ou sem um marcador seleccionável e/ou um marcador seleccionável negativo, para a transfecção das células-alvo que expressam ΕΤΟβ. A inserção da estrutura de ADN, através da recombinação homóloga dirigida, resulta na inactivação do gene ΕΤΟβ.

Alternativamente, a expressão endógena do gene FTC£ pode ser reduzida, visando a complementaridade das sequências de desoxirribonucleótido com a região reguladora do gene ΕΤΟβ (isto é, o promotor e/ou os melhoradores de ΕΤΟβ) para formar estruturas helicoidais triplas que impedem a transcrição do gene ΕΤΟβ em células-alvo. (Ver, de uma forma geral, Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6 (6) : 569-84; Helene, C., et al. , 1992, Ann, N.Y. Accad. Sei., 660: 27-36; e Maher, L. J., 1992, Bioassays 14 (12): 807-15) .

Ainda noutra modalidade da presente invenção, a actividade de ΕΤΟβ pode ser reduzida através de uma abordagem de "negativo dominante" para conseguir a sobrevivência do indivíduo. Com esta finalidade, podem utilizar-se estruturas genéticas que codificam ΕΤόβ com defeito para diminuir a actividade de ΕΤ3β em células vizinhas. Por exemplo, podem introduzir-se, nas células- 21 alvo, as sequências de nucleótidos que expressam directamente ΕΤΟβ cujos domínios estão excluídos ou mutados. Alternativamente, pode-se utilizar a recombinação homóloga direccionada para introduzir essas exclusões ou mutações no gene endógeno ΕΤΟβ das células-alvo. As células submetidas a engenharia irão expressar citocinas não funcionais (isto é, uma citocina que é capaz de se ligar ao seu receptor natural, mas incapaz de transdução do sinal). Essas células submetidas a engenharia deverão facilitar uma resposta diminuída das células vizinhas ao ligante endógeno de ΕΤΟβ, resultando na sobrevivência do indivíduo.

Numa modalidade alternativa, a administração de estruturas genéticas que codificam os péptidos solúveis, proteínas, proteínas de fusão ou anticorpos que se ligam a ΕΤΟβ e "neutralizam" ο ΕΤΟβ intracelular conseguem a sobrevivência do indivíduo. Com esta finalidade, podem utilizar-se estruturas genéticas que codificam péptidos correspondentes a domínios do receptor de ΕΤΟβ, eliminação de mutantes do receptor de ΕΤΟβ ou qualquer um destes domínios ou mutantes do receptor mutantes fundidos com outro polipéptido (por exemplo, um polipéptido de IgFc). Alternativamente, podem utilizar-se estruturas genéticas que codificam anticorpos anti-idiotípicos ou fragmentos de anticorpos anti-idiotípicos Fab que imitam o receptor de ΕΤΟβ e neutralizam ο ΕΤΟβ. Estes péptidos, proteínas, proteínas de fusão, anticorpos anti-idiotípicos dos receptores de ΕΤΟβ ou Fabs são administradas para neutralizar ΕΤΟβ e conseguir a sobrevivência do indivíduo.

As estruturas genéticas que codificam anticorpos que reconhecem especificamente um ou mais epítopos de FTCP ou epítopos de variantes conservadas de ΕΤΟβ ou fragmentos de péptido de ΕΤΟβ também estão abrangidas pela presente 22 invenção. Esses anticorpos incluem, mas não se limitam a anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (Acm), anticorpos humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab')2/ Dois fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab e fragmentos de ligação do epitopo de qualquer um dos anteriores. As estruturas genéticas que codificam esses anticorpos podem ser usadas como um processo para a inibição da actividade de ΓΤΟβ e para conseguir a sobrevivência do individuo.

Para a produção de anticorpos, podem imunizar-se vários animais hospedeiros por meio da injecção com ΠΌβ, um péptido de ΠΌβ, ΠΟβ truncado, equivalentes funcionais de ΓΤΟβ ou mutantes de ΕΤΟβ. Esses animais hospedeiros podem incluir, mas não se limitam a coelhos, murganhos e ratos, para citar apenas alguns. Os anticorpos policlonais são populações heterogéneas de moléculas de anticorpos derivadas do soro dos animais imunizados.

Os anticorpos monoclonais, que são populações homogéneas de anticorpos de um antigénio particular, podem ser obtidos por qualquer técnica que providencie a produção de moléculas de anticorpos por meio de linhas de células continuas em cultura. Incluem, mas não se limitam à técnica do hibridoma de Kohler eMilstein, (1975, Nature 256: 495-497/ e a patente norte-americana No. 4.376.110), à técnica do hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80: 2026-2030) e à técnica do hibridoma de EBV (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Esses anticorpos podem ser de qualquer uma das classes das imunoglobulinas, 23 incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer uma das suas subclasses.

Além disso, podem utilizar-se técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et al. 1984, Proc. Natl. Acad. Sei, 81: 6851-6855; Neuberger et. al. 1984, Nature, 312: 604-608; Takeda et al. 1985, Nature, 314: 452454) por excisão-união dos genes a partir de uma molécula de anticorpo de rato com uma especificidade do antigénio apropriada em conjunto com genes de uma molécula de anticorpo humano com a actividade biológica apropriada. Um anticorpo quimérico é uma molécula em que diferentes partes derivam de diferentes espécies de animais, tais como aquelas que têm uma região variável derivada de um Acm de murino e uma região constante de imunoglobulina humana.

Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (patente norte-americana No. 4.946.778; Bird, 1988, Science 242: 423.426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879.5883; e Ward et al., 1989, Nature 334: 544-546) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples contra os produtos dos genes ΕΤΟβ. Os anticorpos de cadeia simples são formados ligando os fragmentos de cadeia leve e pesada da região Fv, através de uma ponte de aminoácido, resultando numa única cadeia polipeptidica.

Os fragmentos de anticorpos que reconhecem epitopos específicos podem ser gerados por meio de técnicas conhecidas. Por exemplo, podem construir-se bibliotecas de expressão de Fab (Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281) para permitir uma identificação rápida e fácil de fragmentos monoclonais Fab com a especificidade desejada. 24

Além disso, as enzimas que clivam os precursores de ΠΌβ para as isoformas activas podem ser inibidas, a fim de bloquear a activação de FTC3. FTC3 deve ser activado para expor os seus efeitos biológicos e são necessárias enzimas para clivar a proteína precursora. Estas enzimas podem ser alteradas geneticamente para evitar a interacção com a proteína precursora, evitando a clivagem da proteína para a sua forma madura. A transcrição ou a tradução destas enzimas podem ser bloqueadas por um meio de uma técnica conhecida. Estas enzimas podem, em alternativa, ser inibidas por qualquer meio conhecido dos especialistas na matéria.

Os FTCP ligam-se a serina/treonina cinase e transmitir sinais intracelulares através de proteínas Smad. A transdução de sinal pode ser interrompida, a fim de reprimir a sinalização iniciada por ΡΤΟβ. A perturbação da transdução do sinal é possível para evitar o efeito imunossupressor de ΡΤΟβ. Isto pode ser feito por qualquer meio conhecido na técnica em que a interacção entre o receptor de ΓΤΟβ e a proteína Smad é antagonizada ou impedida, incluindo a administração de células geneticamente modificadas que expressam proteínas que bloqueiam ou competem com o receptor de ΡΤΟβ e interacções da proteína Smad. Alternativamente, a transcrição ou a tradução do receptor de ΓΤΟβ ou a proteína Smad podem ser alteradas por qualquer meio conhecido na técnica, a fim de prevenir a transmissão do sinal ao longo da via de sinalização.

As células-alvo modificadas por engenharia genética para expressar uma essa forma de inibidor de ΓΤΟβ são administradas como um imunogénio a doentes com CPCNP ou CPCP, quando vão servir para melhorar as respostas 25 imunitárias anti-tumor e, assim, prolongar a sobrevivência de indivíduos portadores de tumores. Essas células podem ser obtidas do doente (autólogo) ou de um dador (alogeneico ou xenogénico). Para um doente com CPCNP, as células geneticamente modificadas por engenharia constituem células cancro de pulmão de células não pequenas (CPCNP), que são células de CPCNP em virtude de serem derivadas de um ou CPCNP ou imitando um NCPCP (isto é, tendo partilhado antigénios tumorais comuns ou epítopos com um CPCNP primário) . Alternativamente, para um doente com CPCP, as células geneticamente modificadas por engenharia constituem células de cancro de pulmão de células pequenas (CPCP), que são células de CPCP em virtude de derivarem de um CPCP ou imitando um CPCP (isto é, tendo partilhado antigénios tumorais comuns ou epítopos com um CPCP primário).

As células autólogas são células que deriva de um mesmo indivíduo. Células alogénicas são as células que são derivam de um outro indivíduo da mesma espécie para que as células tenham variações genéticas intra-espécies. As células xenogeneicas são as células que são derivam de um outro indivíduo de uma espécie diferente ou individual, para que as células tenham variações antigénicas intra-espécies .

Numa modalidade, escolhe-se uma linha de células tumorais de CPCNP ou CPCP alogénica (ou xenogénica) como o imunogénio. As linhas de células tumorais de pulmão têm mostrado terem epítopos partilhados com tumores primários (Takenoyama et al. 1998). Estes investigadores mostraram que CTL restrito da classe I de MHC gerado contra uma linha de células de adenocarcinoma de pulmão humanas tinha citotoxicidade demonstrável contra outra linha de células tumorais de pulmão. A reactividade cruzada nestas 26 experiências foi bloqueada por anticorpos monoclonais anti-CD8 e da classe I anti-MHC, sugerindo que existem antigénios tumorais comuns partilhados entre as células de cancro do pulmão.

Noutra modalidade, utiliza-se uma mistura de células alogénicas (ou xenogénicas) como imunogénio em doentes com CPCNP ou CPCP. Pode-se utilizar mais de um, por exemplo, dois, três, quatro ou mais linhas celulares em vez de uma para aumentar o número total de antigénios tumorais presentes.

Além disso, as células-alvo terão baixos níveis de expressão de FTCP devido à transfecção com uma estrutura genética que codifica um inibidor de ΡΤ0β2. A supressão da expressão de FTCP pelas células do tumor vai remover uma das principais fontes de supressão imunológica operacional no local da injecção da vacina. A resposta imunitária local, dirigidas contra as células tumorais injectadas, vai induzir uma resposta imunológica sistémica contra o tumor original do doente.

As células-alvo são geneticamente modificadas por engenharia, in vitro, utilizando técnicas de ADN recombinante para introduzir as estruturas genéticas nas células, por exemplo, por transdução (usando vectores virais) ou procedimentos de transfecção, incluindo, mas não se limitando ao uso de plasmidos, cosmidos, YAC, electroporação, lipossomas, etc. As células tratadas por engenharia genética podem ser introduzidas no doente, por exemplo, na circulação, intraperitonealmente, intra-dermicamente, subcutaneamente nos lobos do pulmão. Alternativamente, as células podem ser incorporadas numa 27 matriz e implantadas no corpo como parte de um enxerto de tecido.

Noutra modalidade, as células-alvo são tratadas por engenharia para expressar uma sequência de codificação para uma ou mais citocinas. Numa alternativa, um vector de expressão simplesmente codifica uma ou mais citocinas é introduzido nas células-alvo. Noutra alternativa, um vector de expressão que codifica duplamente uma ou mais citocinas e introduz-se um inibidor de *FTC3 nas células-alvo. Ainda noutra alternativa, algumas células-alvo são tratadas por engenharia genética para expressar uma sequência de codificação para uma ou mais citocinas e outras células-alvo são geneticamente modificadas para expressar um inibidor de ΝΤΟβ. Pela co-administração do agente imunoestimulante, em conjunto com a inibição do FTCP imunossupressor, pode-se melhorar a resposta imunitária de um indivíduo às células tumorais. Exemplos de citocinas úteis para a prática da presente invenção incluem a interleucina-1, interleucina-2, interleucina-3, inter-leucina-4, interleucina-5, interleucina-6, interleucina-7, interleucina-8, interleucina-9, interleucina-10, inter-leucina-11, interleucina-12, interleucina-15, interferão-alfa, interferão-gama, factor alfa de necrose tumoral, factor beta de crescimento da transformação, factor estimulante de colónias de macrófagos granulócitos e factor estimulante de colónias de granulócitos. 0 nível de expressão das citocinas deve ser regulado de tal modo que a imunidade anti-tumor possa ser aumentada sem produzir toxicidade sistémica significativa no indivíduo.

Quando as células-alvo a serem administradas não são células autólogas, podem ser administradas através de técnicas bem conhecidas que impedem o desenvolvimento de 28 uma resposta imunitária do hospedeiro contra as células introduzidas. Por exemplo, as células podem ser introduzidas numa forma encapsulada que, embora permitindo a troca de componentes com o ambiente extracelular imediato, não permite que as células introduzidas reconheçam o sistema imunitário do hospedeiro. A toxicidade e a eficácia terapêutica das células de CPCNP ou de CPCP podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos normalizados em culturas de células ou em animais experimentais, por exemplo, para a determinação da DL50 (a dose letal para 50 % da população) e a DE50 (a dose terapêutica efectiva em 50 % da população). A proporção da dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão DL50/DE50. Preferem-se os números de células de CPCNP ou CPCP que apresentam grandes índices terapêuticos.

Os dados obtidos dos ensaios de cultura de células e de estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de doses para serem utilizadas em seres humanos. A dosagem para os seres humanos encontra-se, de preferência, numa gama de concentrações que incluem a DE50 com pouca ou nenhuma toxicidade. Para qualquer número de células de CPCNP ou CPCP utilizado nos processos da presente invenção, a dose eficaz sob o ponto de vista terapêutico pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de cultura de células. A dose pode ser formulada em modelos de animais para alcançar um intervalo de concentrações que inclui a CI50 (isto é, a concentração do material de ensaio que atinge uma inibição semi-máxima dos sintomas), conforme determinado na cultura de células. Essa informação pode ser utilizada para determinar com mais precisão, doses úteis em seres humanos. 29

As composições farmacêuticas para serem utilizadas de acordo com a presente invenção podem ser formuladas de uma maneira convencional usando um ou mais veículos ou excipientes aceitáveis sob o ponto de vista fisiológico.

Podem utilizar-se diferentes adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, incluindo QS-21, Detox-PC, MPL-SE, MoGM-CSF, TiterMax-G, CRL-1005, GERBU, TERamida, PSC97B, Adjumer, PG-026, GSK-1, GcMAF, B- aletina, MPC-026, Adjuvax,

CpG ODN, Betafectin, Alum e MF59 (ver Kim et al. Vaccine 2000, 18: 597 e referências aí contidas). As formulações para injecções podem apresentar-se em formas farmacêuticas unitárias, por exemplo, em ampolas ou em embalagens com várias doses. A presente invenção também providencia uma composição terapêutica compreendendo as células geneticamente modificadas que expressam um inibidor de FTC3 e um veículo aceitável sob o ponto de vista terapêutico. Tal como se utiliza aqui, um veículo aceitável sob o ponto de vista terapêutico inclui qualquer um dos dissolventes, incluindo água, meios de dispersão, meios de cultura de células, agentes isotónicos e similares que não são tóxicos para o hospedeiro. Convenientemente, é uma solução isotónica tamponada com pH próximo de 7,0. O uso desses meios e agentes em composições terapêuticas é bem conhecido na técnica. Excepto na medida em que qualquer meio convencional ou o agente é incompatível com as células geneticamente modificadas da presente invenção, considera-se o uso de tais meios ou agentes convencionais nas composições terapêuticas. Também podem ser incorporados, nas composições, ingredientes activos suplementares.

As composições terapêuticas da presente invenção podem ser administradas a um animal que delas necessite. De 30 acordo com isto, a presente invenção providencia utilização para induzir uma resposta imunológica num animal que necessite dessa resposta, que compreende a administração, a um animal, de uma quantidade imunologicamente eficaz, das células do indivíduo, geneticamente modificadas. A presente invenção também tem por objecto processos para prevenir ou tratar um tumor num animal, que compreende a administração a um animal uma quantidade anti-tumor eficaz, das células do indivíduo, geneticamente modificadas. 0 termo "animal" usado aqui engloba todos os mamíferos, incluindo seres humanos. De preferência, o animal da presente invenção é um ser humano. A resposta imunitária induzida no animal através da administração das células do indivíduo, geneticamente modificadas pode incluir respostas imunitárias celulares mediadas principalmente por células T citotóxicas, capazes de matar as células tumorais, bem como as respostas imunitárias humorais mediada principalmente por células T auxiliares, capazes de activar células B, levando à produção de anticorpos. Há uma variedade de técnicas que podem ser usadas para analisar o tipo de respostas imunitárias induzidas pelas células do indivíduo, geneticamente modificadas, que estão bem descritas na técnica; por exemplo, em Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994). A expressão "prevenção de um tumor" aqui utilizada significa que a ocorrência do tumor é impedido ou o aparecimento do tumor é significativamente atrasado. A expressão "tratamento de um tumor", aqui utilizada, significa que o crescimento do tumor é significativamente inibido, o que se reflecte, por exemplo, no volume do 31 tumor. 0 volume do tumor pode ser determinado por vários procedimentos conhecidos, por exemplo, pela obtenção de duas medições dimensionais com um paquímetro de mostrador.

Quando "uma quantidade eficaz sob o ponto de vista imunológico", "uma quantidade anti-tumor efectiva" ou "uma quantidade eficaz para inibir o tumor" é indicada, a quantidade precisa das células geneticamente modificadas a serem administradas pode ser determinada por um médico tendo em consideração as diferenças individuais de idade, peso, tamanho do tumor, extensão da infecção ou metástases e o estado clínico do doente. Geralmente pode-se afirmar que uma composição terapêutica que inclui as células do indivíduo, geneticamente modificadas é convenientemente administrada numa quantidade de pelo menos cerca de 1 vezes 103 a cerca de 5 vezes 109 células por dose. A administração das composições terapêuticas a um indivíduo pode ser realizada de qualquer maneira conveniente, inclusive por inalação de aerossóis, injecção, ingestão, transfusão, implantação ou transplante. Convenientemente, as células geneticamente modificadas da presente invenção são administradas a um doente por via subcutânea (s.c.), intraperitoneal (i.p.), intra-arterial (i.a.) ou injecção intravenosa (i.v.). 0 veículo aceitável sob o ponto de vista terapêutico deve ser esterilizado por meio de técnicas conhecidas pelos especialistas na matéria. A presente invenção é ainda ilustrada pelo exemplo específico que se segue, que não pretende, de forma alguma, limitar o âmbito da presente invenção. Os requerentes encaram a substituição de ΠΟβΙ e FTCp3 por FTCp2 no exemplo que se segue. Além disso, os requerentes encaram a 32 substituição das células CPCP pelas células de CPCNP no exemplo que se segue.

Exemplo

Num ensaio clinico os requerentes utilizaram quatro linhas de células de cancro do pulmão de células não pequenas que tinham sido previamente estabelecidas no laboratório em cultura de tecidos. Os requerentes modificaram estas células tumorais em laboratório, para bloquear sua secreção de ΠΟβ. Em seguida, utilizaram as células geneticamente modificadas como vacinas em doentes com cancro do pulmão de células não pequenas. Os doentes são injectados quatro vezes, a intervalos mensais, com os cocktails de vacina modificados pelos genes que constituem as quatro células tumorais modificadas pelo gene anti-paralelo de FTC3 (alogénico) não autónomas. 0 justificativo dos requerentes para a utilização de outras células de outras de tumor das pessoas é que as linhas de células do tumor do pulmão pertencentes a pessoas diferentes têm demonstrado que compartilham caracteristicas comuns que são reconhecidas pelos sistemas imunológicos não autónomos. Os doentes tratados são avaliados quatro meses depois de iniciarem a terapêutica. Os doentes que respondem à terapêutica recebem mais quatro a doze injecções para avaliar se a sua resposta ao tratamento pode ser ampliada.

Os doentes são distribuídos aleatoriamente num dos três grupos separados. A mistura da vacina é constituída por um número igual de cada uma das linhas de células de CPCNP modificadas por genes anti-paralelos de ΕΤύβ irradiados. 0 número de células injectadas nos três grupos é de 1,25 x 107, 2,5 x 107 e 5 x 107 células, respectivamente. 33 A resposta, o tempo até à progressão do tumor e a sobrevivência sem tumor são monitorizados nos doentes e comparados com controlos históricos e doentes que recebem outras formas de terapia. Os doentes são monitorizados e avaliados de acordo com critérios de avaliação padrão de nenhuma resposta, doença estável, resposta parcial e resposta completa. Os resultados deste estudo são utilizados para avaliar a viabilidade de ensaios clínicos adicionais com células tumorais modificadas pelo gene anti-paralelo de FTCp isoladamente e em combinação com a modificação genética de IL-2 (ou de outra citocina).

Principal objectivo 0 objectivo primário do ensaio clínico consiste em avaliar a capacidade de aumentar as doses de uma vacina de células tumorais modificadas por genes, para induzir resposta do tumor em doentes com CPCNP.

Concepção do estudo

Este estudo foi desenvolvido para avaliar a eficácia da imunização com doses crescentes de uma vacina de células tumorais alogénicas em doentes com CPCNP. Os doentes são acompanhados nos aspectos de respostas clínicas, imunogenicidade e segurança.

Os doentes elegíveis recebem 4 injecçóes intradérmicas mensais com uma mistura de células composta por um número igual de quatro linhas de células de CPCNP modificadas por genes anti-paralelos, alogénicas de FTCP2. Os doentes são distribuídos aleatoriamente por um dos três grupos de estudo. Os doentes recebem 1,25 x 107, 2,5 x 107 ou 5 x 107 células modificadas por genes, respectivamente. 34

Quando disponíveis, as amostras de tumor obtidas de doentes do estudo no momento da cirurgia clinicamente indicada são utilizadas para estabelecer uma linha de células para cada doente. As células de tumor dos doentes são então usadas em análises do precursor ou monitorizando o ensaio de citotoxicidade das respostas imunitárias dos doentes as inoculações da terapia genética.

Administração da vacina

Os doentes recebem injecções intradérmicas da vacina de células tumorais nos meses 0, 1, 2, 3 e 4. As vacinas são administradas em regime ambulatório. Os locais de injecção vão rodando entre as extremidades superior e inferior. Os doentes são observados na clínica durante 2 horas após a vacinação. Durante este período de observação, os sinais vitais são verificados de 30 em 30 minutos. Os doentes que não experimentam efeitos colaterais significativos do tratamento são excluídos duas horas após a vacinação.

Resumo dos procedimentos do estudo

Os doentes são vacinados de acordo com o cronograma descrito no quadro a seguir. Os doentes são tratados inicialmente uma vez por mês durante 4 meses, a menos que seja documentada toxicidade incontrolável ou progressão da doença clinicamente significativa que exijam intervenção com outras terapias anti-cancro. O estadiamento do tumor (por rastreios com TC (tomografia computorizada)/IRM (imagem por ressonância magnética)) é realizado no início e nas semanas 8, 16 e 28 e depois de 3 em 3 meses. Depois os doentes têm acompanhamento em série da resposta imunitária (respostas humorais e das células T) de 4 em 4 semanas até 35 à semana 28 e depois de 12 em 12 semanas. Os doentes são monitorizados rigorosamente quanto à toxicidade, ao longo do estudo. Nos doentes que demonstram ter benefícios do tratamento, dão-se vacinas adicionais, a cada 4-8 semanas, sendo dadas até 12 vacinas adicionais (num total de 16 vacinas) .

Regras para a paragem

Dado que as respostas do tumor à vacinação podem seguir-se a um período de progressão inicial do tumor, deixam-se os doentes continuarem em estudo em face da não progressão clinicamente significativa na semana 8. Na semana 16, os doentes devem mostrar que não há nenhuma progressão do tumor (não mais do que um aumento de 25 % na semana 16 em comparação com a semana 8) . Os doentes que exibem uma doença progressiva na semana 16 (em relação à semana 8) são retirados do estudo.

Visão geral do esquema de tratamento mensal

Procedimento Rastreio Dia 1 Dia 2 Dia 8 Dia 29/1 Consentimento informado X História, Exame X [2] X X Contacto telefónico X Sinais vitais, peso, PS X [2] X X X Eventos adversos X [2] X X X Medicações concomitantes X [2] X X X CBC com diferencial X [1] X X X Painel electrolítico X [1] X X Painel de metabolismo X [2] X X Estadiamento do tumor2 X [4] Biópsia do sítio da inoculação X Imunidade humoral3 X [2] X Imunidade celular3 X [2] X Administração de vacina4 X X [X]: X semanas antes do dia 1 2uma vez por mês durante o tratamento e uma vez de 3 em and 36

Procedimento Rastreio Dia 1 Dia 2 Dia 8 Dia 29/1 3 meses no seguimento 2repetido às 8, 16, 28 semanas e depois de 12 em 12 semanas 3repetido às 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 semanas e depois de 12 em 12 semanas 4administerado às 1, 4, 8, 12 semanas. Administração continuada possível para os pacientes que respondem_

Definição dos procedimentos

Contacto telefónico:

Hemograma com diferencial

Painel electrolitico

Painel do metabolismo

Estadiamento do tumor:

Biópsia do sitio da inoculação

Imunidade humoral: Imunidade celular:

Os doentes são contactados por telefone pela enfermeira do estudo para avaliar o grau de inflamação, a dor ou o prurido no local da injecção. FLS (fórmula leucocitária do sangue), HCT (hematócrito) , HGB (hemoglobina) , contagem de plaquetas, % de neutrófilos, % de linfócitos, % de monócitos Sódio, potássio, cloreto, dióxido de carbono, AUS (azoto da ureia do sangue), creatinina, glicose Cálcio, fósforo, AST (transaminase glutâmica oxaloacética sérica), ALT (alanina-transaminase) , fosfatase alcalina, bilirrubina, ácido úrico, albumina, proteína Exame físico, raios X, TC/IRM conforme o caso. Todos os estadiamentos devem usar o mesmo processo para avaliar o tumor, tal como se utilizou no início A biópsia realizada na pele por meio de uma punção na periferia de local inflamado da vacina ou, se não houver inflamação, para incluir o local da vacina. Títulos anti-tumorais no soro Imunofenotipagem dos subconjuntos das células B e das células T do sangue periférico (se estiverem disponíveis células suficientes), incluindo CD3, CD4, CD8, CD16, CD20 e CD68. Medição do perfil de citocinas do sangue periférico (CSP) por meio da actividade quantitativa (semi-quantitativa) das células assassinas naturais (NA) (morte não específica) e pela actividade de LAK (células assassinas activadas por linfocina) (Allo-killing) .

Critérios de inclusão

Assinatura do consentimento informado > 18 anos 37 • CPCNP confirmado histologicamente como não curável com uma doença mensurável e um volume estimado de 125 cc. • Estado de desempenho (ECOG) < 2 • Contagem absoluta dos granulócitos 1.500/mm3 • Contagem das plaquetas 100.000/mm3

• Bilirrubina total < 2 mg/dL • AST e ALT < 2x Limite superior do normal • Creatinina <1,5 mg/dL Critérios de exclusão

Esteróides sistémicos concorrentes > 20 mg prednisona/dia

Esplenectomia anterior

Cirurgia, quimioterapia, radioterapia, terapêutica com esteróides ou imunoterapia < 4 semanas antes da entrada no estudo

Metástases cerebrais ou linfomatose meningea a menos que tenham sido tratados e tenham estado estáveis durante 2 meses

Conhecido por ser positivo em relação ao VIH

Doenças graves não malignas (por exemplo, insuficiência cardíaca congestiva ou infecções bacterianas, virais ou fúngicas activas descontroladas) ou outros estados clínicos que, na 38 opinião do investigador, iriam comprometer os objectivos do protocolo. • Ocorrência maligna anterior (excluindo carcinomas da pele que não são melanomas) , a menos que tenha tido remissão durante > 2 anos • Tratamento com um fármaco em investigação nos 30 dias anteriores à entrada no estudo • História de distúrbio psiquiátrico que possa impedir a adesão ao protocolo • Mulheres grávidas ou a amamentar ou recusa para praticarem a contracepção se tiverem potencial reprodutivo

Realização do estudo O estudo é realizado de acordo com as Boas Práticas Clinicas, a Declaração de Helsínquia e a parte 50 do US 21 CFR - Protecção dos Seres Humanos e parte 56 - Conselhos Institucionais de Revisão. Obteve-se o consentimento escrito, informado e datado para o estudo, de todos os doentes, antes de se realizarem os procedimentos específicos do protocolo. Após a assinatura, é dada uma cópia aos do seu consentimento informado. A aprovação deste estudo foi obtida do Conselho de Revisão Institucional adequado antes de envolver os doentes no estudo. Os formulários do consentimento estão numa linguagem totalmente compreensível para o doente em perspectiva. O consentimento é documentado, quer através de assinatura datada do doente ou pela assinatura de uma testemunha independente que registe o consentimento do doente. 39

Resposta do tumor

Os doentes são avaliados por TC/IRM e exame físico. A resposta é relatada utilizando medidas de resultados padrão para ensaios clínicos (resposta completa (RC), resposta parcial (RP), doença estável (DE) e doença progressiva (DP). Qualquer resposta ao tratamento (quer RP ou RC) exige dois estadiamentos confirmatórios, pelo menos com 4 semanas de intervalo.

Resposta completa • Resolução de todas as doenças mensuráveis durante um período de pelo menos 4 semanas • Resolução de todas as doenças avaliáveis durante um período de pelo menos 4 semanas • Sem novas lesões (quer mensuráveis quer avaliáveis) Resposta parcial • Diminuição da soma do produto de todas as lesões mensuráveis de pelo menos 50 % durante um período de pelo menos 4 semanas • Melhoria subjectiva em todas as doenças avaliáveis durante um período de pelo menos 4 semanas • Sem novas lesões (quer mensuráveis quer avaliáveis) Doença estável • Diminuição de menos de 50 % E menos de 25 % de aumento na soma dos produtos de todas as lesões mensuráveis 40

Sem novas lesões (quer mensuráveis quer avaliáveis)

Doença progressiva • Aumento superior a 25 % na soma dos produtos de todas as lesões mensuráveis OU de novas lesões (quer mensuráveis quer avaliáveis)

Avaliação da resposta imunitária

Avaliação da resposta imunitária humoral

As respostas imunitárias humorais anti-tumor são avaliadas comparando o titulo de pré-tratamento e pós-tratamento nos soros para a reactividade contra as linhas de células de vacinação usando um ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA). Resumidamente, imobilizam-se 105 células-alvo em discos de papel de filtro numa câmara incubadora de 96 poços (V and P Enterprises, La Jolla, CA) e então são incubadas durante 30 minutos com os soros a ensaiar. As placas são lavadas e, em seguida, incubadas com uma Ig anti-humana conjugado com enzima. As placas são novamente lavadas, adiciona-se o substrato enzimático e a ligação é quantificada através da medição da absorvência de cada poço num leitor de ELISA.

Avaliação da resposta celular imunitária Imunofenotipagem 41

Os ensaios padrão de citometria de fluxo e imunofluorescência são realizados para avaliar os perfis dos doentes antes e após tratamento imunológico com células efectoras. As percentagens das subpopulações de células efectoras, que reagem com anticorpos monoclonais, em relação a células T (CD3, CD4, CD8), células assassinas naturais (CD16) e células B -(CD20) são medidas nas populações antes e após o tratamento com linfócitos de sangue periférico e são correlacionadas com as respostas dos doentes medidas por outros critérios. Resumidamente, as células mononucleares purificadas por Ficoll-Hypaque são incubadas com o anticorpo primário, durante 1 hora, à temperatura ambiente, lavam-se e, em seguida, são incubadas com anticorpo secundário conjugado com fluorocromo. Lavam-se as células, fixam-se e determina-se a percentagem de células positivas com um citómetro de fluxo. As incubações das células com um anticorpo de controlo emparelhado com um isotipo, em vez do anticorpo primário, servem como controlos negativos.

Actividade das células assassinas naturais (AN) A actividade das células AN é analisada através de um ensaio padrão de libertação de crómio usando como alvo a linha celular K562 sensível às células AN. Resumidamente, as células K562 são marcadas por incubação com 51Cr, durante 45 minutos, a 37 °C. As células-alvo são lavadas profundamente e, em seguida, faz-se a incubação de 5 x 103 K562 durante 4 horas, a 37 °C com pré e pós-tratamento com células mononucleares de sangue periférico (CMSP) com uma relação de células efectoras: célula-alvo que variam de 100:1 a 3:1. As células em seguida são centrifugadas e mede-se a quantidade libertada de 51Cr usando um contador de gama. Determina-se a percentagem específica da lise 42 utilizando a fórmula: (cpm experimental - cpm inicial)/(cpm total - cpm inicial) χ 100.

Actividade de AAL (LAK em inglês)

Determina-se a actividade de AAL por meio do ensaio de libertação de crómio, como descrito antes, usando como alvo a linha de células DAUDI, sensível a AAL.

Perfil dos linfócitos antes e depois do tratamento com citocinas O perfil de citocinas das CMSP dos doentes é determinado por meio de ensaios semi-quantitativos de RCP. O ARN é extraído de células mononucleares purificadas dos doentes pré e pós-tratamento de é usado para sintetizar a primeira hélice do ADNc por meio de um kit do ciclo do ADNc da Invitrogen (San Diego, CA) , de acordo com as recomendações do fabricante. A primeira hélice do ADNc é então usada como uma matriz nos ensaios de RCP utilizando diferentes conjuntos de iniciadores para a detecção de IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, FEC-GM (factor de estimulação de colónias de granulócitos e macrófagos), INF-γ, FNT-a, etc. Para se conseguir quantificar, as reacções de RCP limitam-se a 15-18 ciclos. Como um controlo interno e para auxiliar a quantificação adicionam-se concentrações conhecidas dos produtos de um ARN de controlo, a cada amostra, antes do início da síntese do ADNc. Iniciadores específicos para a sequência de controlo são então adicionados às reacções de RCP. Determinam-se os perfis de citocinas de amostras de doentes por meio da quantificação dos produtos de RCP e da sua comparação com os produtos de controlo da RCP. 43

Biópsia da pele do local de imunização A hematoxilina padrão e a coloração com eosina e os processos de imuno-histoquímica utilizando anticorpos monoclonais para os subconjuntos de células hematopoiéticas são utilizados para caracterizar os infiltrados imunológicos observados nas biópsias da pele nos locais de imunização. Os anticorpos monoclonais das células T (CD3, CD4, CD8), das células assassinas naturais (CD16) e das células B (CD20) são utilizados para estes estudos. Briefly, for the immunohistochemical studies, cryostat sections are fixed in cold acetone and then incubated with primary antibody for 1 hour at room temperature. As secções são lavadas e, em seguida, incubadas com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano-silvestre seguido de secções de coloração com um substrato cromagénico apropriado e foram examinadas por microscopia de luz. As incubações das secções com um anticorpo de controlo emparelhado com um isotipo, em vez do anticorpo primário, servem como controlos negativos.

Informação sobre o medicamento

Formulação clinica A vacina é fornecida em frascos congelados contendo pelo menos 20 x 106 células por frasco.

Instruções para os farmacêuticos

Material não diluído

Volume do frasco: 1 ml Aspecto Fluido turvo 44

Armazenagem -176 °C (azoto liquido). Riscos: Os frascos congelados não são considerados perigosos se não se partirem. Os frascos contêm células congeladas numa mistura contendo dimetil-sulfóxido a 10 % e soro bovino fetal a 50 %. Manuseamento Os frascos congelados não são considerados perigosos, sob o ponto de vista da segurança, se não se partirem. Os frascos partidos devem ser descartados de acordo com os procedimentos relativos aos riscos biológicos para medicamentos citotóxicos. Material diluido

Preparação: Antes da injecção nos doentes, descongela-se um frasco congelado numa campânula de biossegurança e lava-se duas vezes com meio contendo soro e quatro vezes com solução de Ringer lactada. Contam-se então as células e ajustam-se para o número adequado de células por injecção num volume de 250-400 μΐ. A suspensão de células é despejada numa seringa tapada de 1 ml.

Concentrado de 1,25 x 107, 2,5 x 107 ou 5 x 107 células fármaco: por injecção num volume de 250-400 μΐ. Diluente: Solução de Ringer lactada Via de Injecção intradérmica administração: 45

Armazenagem

Armazenam-se os frascos congelados, fechados, a -176 °C (azoto liquido).

Avaliação dos dados

Estatísticas e tamanho estimado da amostra

Inscreveram-se doentes numa quantidade de 27-75. Este é um estudo em duas fases. Cada um dos três ramos do tratamento acomoda inicialmente 9 doentes. Se não se vir nenhuma resposta nos primeiros 9 doentes, então não se acrescentam mais doentes a esse grupo de tratamento. Se se vir pelo menos 1 resposta nos primeiros 9 doentes, então acrescentam-se mais 16 doentes a esse grupo de tratamento para um total de 25 doentes por grupo de tratamento.

Definição dos doentes que se podem avaliar

Considera-se que se podem avaliar doentes quanto à resposta tumoral se tiverem completado pelo menos 2 vacinações e que sofreram um novo estadiamento do tumor na 8a semana.

Considera-se que se podem avaliar os doentes quanto à resposta imunitária se tiverem completado pelo menos 1 vacinação e que têm uma análise imune na 4a semana.

Os doentes são elegíveis para a toxicidade após uma única vacinação.

Relatórios dos resultados 46 de resposta são

As taxas de resposta são reportados utilizando estatísticas descritivas e relata-se as taxas de RC, RP, DE e DP e nos doentes determinados para serem avaliados. 0 tempo para a terapia inicial ter a sua progressão é determinado para os doentes que experimentam uma RC ou uma RP.

Os pontos finais secundários incluem a resposta imunitária, a duração da resposta e a segurança. Estas taxas são também relatadas utilizando estatísticas descritivas. A segurança é relatada como uma percentagem dos doentes que experimentam um determinado evento adverso. 0 tempo médio de progressão para a população responder é relatado usando as estatísticas de Kaplan-Meier.

Linhas de células de CPCNO sem modificações

Sete das oito linhas de CPCNP utilizadas na produção desta vacina são linhas de células estabelecidas que são compradas nas culturas americanas de células de tecidos (ATCC). A linha de células escamosas de CPCNP humano, Rh-2, foi estabelecida a partir de uma amostra de ressecção cirúrgica no laboratório do Dr. Steven Dubinett na UCLA, em 1994 e está disponível ao público em Lee et al., J. Immunology 152: 3222, 1994; Huang et al., Câncer Research 55: 3847, 1995; Huang et al., J. Immunology 157: 5512, 1996; Huang et al., Câncer Research 58: 1208, 1998.

Plasmido anti-paralelo de FTCg2: pCHEK/HBA2 O vector pCHEK utilizado para construir o plasmido contendo ΕΤΌβ2 anti-paralelo humano derivou do vector pCEP (Invitrogen, San Diego, CA) . Tem sido ligeiramente 47 modificado para facilitar a subclonagem genética. 0 vector transportador resultante é o pCHEK. Utilizou-se a subclonagem genética para inserir o fragmento do gene anti-paralelo de FTC32 (HbA2) em pCHEK. As aliquotas do plasmido pCHEKIHBA2 foram examinadas por meio de análises de enzimas de restrição para garantir 1) a identidade do vector portador no qual foi clonado o FTCp2 anti-paralelo e 2) a orientação correcta da inserção anti-paralela de FTC32.

Limites para o ensaio: A homologia completa com tamanhos esperados dos fragmentos de ADN, após uma série de dissoluções de restrição com 14 endonucleases: Apal, BamHI, BglII, Ciai, EcoRV, HindIII, Hpal, Notl, NruI, PstI, Sall, Sacll. Seal e Xbal.

Resultados: Os fragmentos de ADN observados obtidos por essas dissoluções restrição corresponderam às dimensões esperadas dos fragmentos esperado do plasmido pCHEK/HBA2. Em conclusão, o vector usado para a subclonagem está correcto e a inserção do fragmento do gene anti-paralelo de FTC32 está na orientação correcta.

Os fragmentos esperados destas dissoluções de restrição são:

Apal 4604 pb 3309 BamHI 10963 pb BglII 10210 pb 7 53 Ciai 10963 pb EcoRV 10963 pb HindIII 7540 pb 2787 Hpal 10251 pb 712 Notl 10963 pb NruI 5716 pb 5247 pb 1957 pb 874 pb 219 pb pb pb 636 pb pb pb 48

PstI 7573 pb 1494 pb 1277 pb 619 pb

Sall 8738 pb 2225 pb

Sacll 5347 pb 3340 pb 2276 pb

Seal 8021 pb 1915 pb 1027 pb

Xbal 9579 pb 1384 pb

Inserção anti-paralela de FTCp2

Para garantir ainda mais a sequência correcta e a orientação do fragmento anti-paralelo de FTC32, analisou-se a inserção por meio de análises da sequência usando um analisador genético ABI-310 (Perkin Elmer, Foster City, CA) .

Limites para o ensaio: homologia completa entre a inserção do plasmido e ο ΕΤΕβ2 anti-paralelo.

Resultados: Os resultados de sequenciação obtidos confirmaram a presença do fragmento de FTC32 humano no vector pCHEK. Estes resultados também confirmaram a orientação correcta da inserção. A sequência do fragmento de FTC 2 humano utilizado na construção do vector pCHEK/HBA2 e suas regiões flanqueadoras no vector são os seguintes. As letras minúsculas representam as duas sequências do vector que flanqueiam o fragmento do ΕΤ0β2 humano, tgtctggatc cggccttgcc ggcctcga (SEQ ID NO: 2) — sequência do vector de flanqueio da inserção -Par de bases 5 de FTC32 humano

ATTCAAGCAGGATACGTTTTTCTGTTGGGCATTGACTAGATTGTTTGCAAAAGTTTCGC ATCAAAAACAACAACAAC

AAAACAAACAACTCTCCTTGATCTATACTTTGAGAATTGTTGATTTCTTTTTTTTATTCTGACTTTTAAAAACA

ACTTTTTTTTCCACTTTTTTAAAAAATGCACTACTGTGTGCTGAGCGCTTTTCTGATCCTGCATCTGGTCACGGTC

GCGCTCAGCCTGTCTACCTGCAGCACACTCGATATGGACCAGTTCATGCGCAAGAGGATCGAGGCGATCCGCG

GGCAGATCCTGAGCAAGCTGAAGCTCACCAGTCCCCCAGAAGACTATCCTGAGCCCGAGGAAGTCCCCCCGG

AGGTGATTTCCATCTACAACAGCACCAGGGACTTGCTCCAGGAGAAGGCGAGCCGGAGGGCGGCCGCCTGCG

AGCGCGAGAGGAGCGACGAAGAGTACTACGCCAAGGAGGTTTACAAAATAGACATGCCGCCCTTCTTCCCCT 49

CCGAAACTGTCTGCCCAGTTGTTACAACACCCTCTGGCTCAGTGGGCAGCTTGTGCTCCAGACAGTCCCAGGT

GCTCTGTGGGTACCTTGATGCCATCCCGCCCACTTTCTACGACCCTACTTCAGAATTGTTCGATTTGACGTCTC

AGCAATGGAGAAGAATGCTTCCAATTTGGTGAAAGCAGAGTTCAGAGTCTTTCGTTTGCAGAACCCAAAAGCCA

GAGTGCCTGAACAACGGATTGAGCTATATCAGATTCTCAAGTCCAAAGATTTAACATCTCCAACCCAGCGCTAC

ATCGACAGCAAAGTTGTGAAAACAAGAGCAGAAGGCGAATGGCTCTCCTTCGATGTAACTGATGCTGTTCATGA ATGGCTTCACCATAAAGACAGGAACCTGGGATTTAAAATA (SEQ ID NO : 1 ) -- Par de

Bases 935 de FTC32 humano. - agcttgct agcagctggt acccagct (seq id no:3)-- sequência do vector de flanqueio da inserção

Linhas de células de CPCNP modificadas por genes

No seguimento da transfecção, os clones de cada linha celular modificada por genes foram ensaiados quanto à presença do vector pCHEK/HBA2 para RCP. Apenas os clones com teste positivo para pCHEK/HBA2 foram escolhidos para uma análise posterior.

Resultados: As colónias de sete das oito linhas de células ensaiadas foram positivas quanto à transfecção anti-paralela de FTC32. A linha celular NCI-H-292 foi negativa.

Regulação decrescente de FTCg2

No seguimento da transfecção, os clones de cada linha celular modificada por genes foram ensaiados quanto à regulação decrescente de ΓΤ0β2 por meio de um ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA) e comparou-se com linhas de células parentais não modificadas. Resumidamente, o sobrenadante isento de soro das culturas de células modificadas por genes anti-paralelos de FTCp2 foi colhido após 24 h e foi analisado em triplicado para determinar os niveis de secreção, utilizando um kit de ELISA (Genzyme, Cambridge, MASS). 0 ΓΤ0β2 humano foi capturado por um 50 anticorpo monoclonal de ΕΤ0β2 anti-humano e foi quantificado por meio da reacção com um anti-soro de FTCp2 anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rábano-silvestre, de acordo com a recomendação do fabricante. A quantificação foi feita através do desenvolvimento da reacção enzimática com um substrato de Chromagen e da leitura da densidade óptica num leitor de micro-placas de ELISA. Uma curva padrão de ΕΤ0β2 apresentando concentrações conhecidas de ΕΤ0β2 permitiu a quantificação da secreção de ΕΤ0β2 por meio das células modificadas com o gene anti-paralelo ΕΤ0β2.

Limites do ensaio para células tumorais sem modificações: Secreção de pelo menos200 pg de ΕΊΌβ2/106 células /24 h.

Limites do ensaio para as linhas de células tumorais modificadas por genes para a vacina: Redução da produção de Π0β2 de pelo menos 35 % em relação a células parentais sem modificações. Este limite do ensaio tem demonstrado que melhora a imunogenicidade das células tumorais em esquemas de vacinação, por Lee et al., J. Immunology 152: 3222, 1994 .

Aproximadamente 3-4 dias antes do inicio da terapia ensaiou-se novamente aliquotas de cada uma das linhas celulares modificadas por genes para a inibição de FTCP2. Aplicam-se os mesmos limites do ensaio.

Linha de células Carcinoma do pulmão Níveis de FTC$2 não modificados (ng/106 célula/24 h) Níveis de FTC$2 modi fi cadospor genes (ng/106 célula/24 h) % de regulação decrescente de FTCP2 NCI-H-2 92 Mucoepidermóide ND ND ND NCI-H-4 60 Célula grande 0, 67 0,12 82% 51 NCI-520 Escamosa 2,27 1,43 37% I-H-596 Adenoescamosa 1,5 2, 6 -73% NCI-H-661 Célula grande 13, 1 12,96 1 % SK-LU-1 Adenocarcinoma 3, 58 1,36 62% SK-MES-1 Escamosa 1,2 1,36 -13% Rh-2 Escamosa 1, 16 0,1 91%

As 4 linhas de células seleccionadas foram: NCI-H-460, NCI-H-520, SK-LU-1 e Rh-2. Nas mãos dos requerentes, as modificações do gene anti-paralelo de ΕΤ0β2 resultou em 37-91 % de bloqueio da expressão intrínseca de FTC32 nas células tumorais. A supressão da expressão de FTC32 nestas células tem-se mantido estável durante um período de seis a nove meses de cultura.

Densidade das células

Antes da vacinação do doente, avaliou-se a densidade das células para cada linha celular. Conta-se uma alíquota de cada linha de células a ser usada, através de um hemocitómetro para verificar a densidade das células. Mistura-se igual número de cada uma das linhas celulares modificadas pelo gene, para as três doses a serem investigadas neste estudo (1,25 x 106, 2,5 x 106 e 5 x 106 células no total, respectivamente).

Viabilidade celular

Antes de vacinação do doente, avaliou-se a viabilidade das células para cada linha celular. A viabilidade das células utilizadas para a imunização é avaliada por processos de exclusão com azul de tripano. 0 corante azul de tripano é uma medida da integridade da membrana plasmática. As células viáveis mantêm a integridade da membrana plasmática e, portanto, excluem o corante. As 52 células mortas perdem a integridade da membrana e permitem a absorção do corante aparecendo assim azuis. Faz-se o ensaio de uma alíquota de cada linha celular e contam-se as células num hemocitómetro. Determina-se a percentagem de células viáveis "não azuis".

Limites para o ensaio: a viabilidade das células tumorais modificadas pelo gene anti-paralelo FTC32, utilizadas para a terapia, deve ser superior a 50 %.

Clonogenicidade

Para garantir a segurança, todos as linhas de células de tumor modificadas pelos genes a serem usadas nas vacinas dos doentes devem ser irradiados antes da injecção. Isto é para evitar o crescimento e a replicação das células tumorais. As células são irradiadas antes da sua utilização com uma dose de 10.000 cGy. A escolha desta dose de radiação tem por base discussões com o Dr. Herman Suit, Chefe da Oncologia de radiação no Hospital Geral de Massachusetts. Esta foi a menor dose de radiação suficiente para tornar as células do tumor incapazes de proliferarem e de formarem tumores. É desejo dos requerentes utilizar a menor dose de radiação possível para as células transfectadas para optimizar o nível e a duração da transcrição anti-paralela de ΡΤΟβ2. Além disso, os requerentes ensaiaram esta dose de radiação no seu laboratório em células tumorais de cultura de diferentes origens histológicas, incluindo CPCNP humanos, gliomas, cancro do cólon e linhas de células do carcinoma do pâncreas e demonstraram que é capaz de travar completamente a formação de colónias de células de tumor de cultura de diferentes origens histológicas. 53

Irradiaram-se amostras de linhas de células humanas de CPCNP modificadas pelo gene com 10. 000 centi-Grays. As células irradiadas foram então postas em cultura em frascos T-225 e observaram-se quanto à formação de colónias. Definiu-se uma colónia como um conjunto de 16 células em crescimento. Conforme se apresenta no quadro a seguir, as colónias não se formaram nas culturas irradiadas durante um período de observação de quatro a seis semanas. Pelo contrário, todas as culturas de controlo não irradiadas controlo tornaram-se confluentes após 10-14 dias. A morte celular ocorreu cerca de duas semanas após o inicio das culturas irradiadas.

Efeito da radiação das culturas de células primárias de

CPCNP Células de tumor Dose de radiação (Gys) # Colónias às 5 semanas Culturas de controlo Nenhuma Confluente após 10-14 dias NC1-H-2 92 10.000 Nenhuma NC1-H-4 60 10.000 Nenhuma NC1-H-520 10.000 N enhuma NC1-H-596 10.000 N enhuma NC1-H-661 10.000 N enhuma SK-Lu 1 10.000 N enhuma SK-MES-1 10.000 N enhuma Rh-2 10.000 N enhuma

Antes da vacinação, descongela-se uma alíquota de cada linha de células modificada pelo gene e analisa-se quanto à formação de colónias durante um período de cultura de quatro a seis semanas antes de cada lote ser considerado seguro para dar a injecção ao doente.

Limites para o ensaio: Não há formação de colónias. Esterilidade das linhas celulares 54

Os ensaios de esterilidade foram realizados para cada linha de células não modificadas pela ATCC, o fabricante das células.

Além disso, enviaram-se alíquotas de cada linha para Molecular Diagnostics Associates para analisar a presença dos agentes virais que se seguem:

VIH 1 e 2 VHB CMV

HH-6 VHC VHTL VEB Virus adventícios

Resultados: verificou-se que as oito linhas de células de referência, sem modificações, eram negativas quanto à presença de bactérias, fungos e vírus.

Durante o crescimento in vitro e as manipulações cada linha de células foi analisada por rotina para pesquisa de infecções por bactérias, fungos e micoplasmas. Para evitar contaminação com outras células, as culturas foram tratadas individualmente em todos os pontos durante as manipulações de laboratório. Finalmente, no dia da terapêutica, faz-se uma nova análise de uma amostra do inoculo por meio da coloração de Gram. Apenas as células que passam todos os ensaios de esterilidade são usadas na terapêutica.

Os limites do ensaio são: sem infecções por bactérias, micoplasmas ou fungos.

Plasmido pCHEK/HBA2 de grau clínico

Após a caracterização preliminar do plasmido pCHEKIHBA2, prepararam-se concentrados de ADN a partir de culturas de bactérias pelo processo da lise alcalina de 55

Birnboim e Doly, optimizado pela Qiagen Corporation (Birnboim e Doly, 1979) e purificado em colunas prep. Qiagen EndoFree Giga. Todas as etapas foram realizadas em condições estéreis, utilizando pipetas de barreira de ART na campânula de fluxo de biossegurança. Retirou-se uma aliquota do ADN do plasmido e analisou-se quanto à sua esterilidade. Em resumo, utilizou-se 20 μΐ de ADN do plasmido foi utilizado para inocular quatro tubos de cultura, contendo de cada um 5 ml de calda LB isenta de antibióticos. As culturas foram incubadas durante cinco dias a 37 °C.

Limites para o ensaio: sem crescimento de bactérias.

Resultados: não se observaram colónias, confirmando a esterilidade do ADN de grau clinico preparado.

Breve descrição genérica dos procedimentos de fabrico e embalagem

Compraram-se oito linhas celulares de CPCNP estabelecidas na American Tissue Cell Culture (ATCC) ou noutra entidade e expandiram-se e congelaram-se em bancos de células de referência não modificadas (BCRnm). Cada linha foi ensaiada quanto à sua esterilidade (contaminantes de bactérias e virus), clonogenicidade e expressão de FTCP2. Descongelaram-se aliquotas de cada linha e transfectaram-se com pCHEKIHBA2, um vector contendo o transgene anti-paralelo de FTCP2, usando técnicas padrão. As linhas de células modificadas por genes foram expandidas em cultura, sob selecção de higromicina, para crescerem em número suficiente para aplicações terapêuticas e análises. As linhas de células expandidas foram então analisadas quanto à regulação decrescente da expressão e esterilidade 56 de ΕΤ0β2. Identificaram-se quatro linhas de células de CPCNP que demonstrou uma regulação decrescente bem sucedida da expressão e da esterilidade de FTCp2: NCI-H-460, NCI-H-520, SK-LU-1 e Rh-2. Estas linhas de células foram congeladas em aliquotas como (1) bancos de células de referência modificadas por genes (BCRmg) e (2) bancos de células de trabalho modificadas por genes (BCTmg) e armazenadas em azoto liquido. Antes da utilização, as aliquotas destas quatro linhas de células são descongeladas do BCTmg, irradiadss com 10.000 Gy e novamente analisadas quanto à esterilidade, clonogeneicidade e regulação decrescente de ΕΤΟβ2. Apenas os lotes de células que passaram todos os limites dos ensaios são aceitáveis para a preparação da vacina. No dia da injecção, descongelam-se então células suficientes de cada um dos lotes aceitáveis dos BCTmg, irradiam-se e misturam-se em número igual. Antes da vacinação do doente, analisa-se uma amostra do inoculo quanto à contaminação bacteriana. Se não for detectada contaminação, pode-se proceder à vacinação.

Obtenção de tecidos

As oito linhas de células estabelecidas de CPCNP que se seguem foram obtidos na American Type Culture Collection (ATCC) ou noutra entidade, expandiram-se em cultura e foram congeladas como bancos de células de referência não modificadas (total 8 BCTnm). As linhas de células foram cultivadas em meio IMDM complementado com SBF a 10 %, Hepes 25 mM, L-glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, 2,5 pg/ml de fungizone, 50 pg/ml de sulfato de gentamicina, a-tio-glicerol 10~4 M e aminoácidos não essenciais. Cada linha de 57 células foi congelada como um lote contendo 100 frascos com > 108 células/frasco. Cada linha foi ensaiada quanto à esterilidade e à expressão FTC 2. Utilizaram-se as linhas de células que se seguem: • NCI-H-292 • NCI-H-460 • NCI-H-520 • NCI-H-596 • NCI-H-661 • SK-LU-1 • SK-MES-1 • Rh-2

Preparação do plasmido de expressão anti-paralelo de FTCP2 humano

Descrição do plasmido PCHEK/HBA2 O vector pCHEK usado para produzir o plasmido de expressão anti-paralelo de FTC32 humano (PCHEK/HBA2) derivou do vector pCEP4 (Invitrogen, San Diego, CA) para facilitar a modificação genética das células cancerosas e para eliminar as preocupações de segurança. O vector pCHEK é idêntico ao vector pCEP4 em todas as regiões, excepto no seguinte: • A resistência à canamicina, em vez da resistência à ampicilina está incorporada no vector pCHEK. • No vector pCHEK, uma unidade de cassete de ADN, consistindo num promotor precoce de SV-40 seguido de um intrão, orienta a expressão do gene de resistência à higromicina. A incorporação do promotor de SV-40/unidade de intrão vai aumentar a expressão do gene 58 de resistência à higromicina para facilitar a selecção de células em cultura modificadas pelo gene. 0 plasmido pCHEK/HBA2 utiliza um promotor de CMV para dirigir a expressão de um fragmento de ΕΤ0β2 humano com 930 pares de bases numa orientação anti-paralela. O fragmento anti-paralelo de FTC32 consiste em 6-935 bases da extremidade 5' da molécula de ADNc de ΕΤ0β2 que foi ligado numa orientação inversa adjacente e sob o controlo do promotor do CMV. 0 vector pCHEK também contém o gene de resistência à higromicina orientado pelo promotor precoce de SV-40, a origem de replicação do virus de Epstein-Barr da replicação e o gene para a proteína 1 associada ao vírus nuclear de Epstein-Barr (EBNA-1). Além disso, o vector contém a origem de ColEl e genes de resistência à canamicina para a selecção de bactérias contendo vector durante a produção do ADN.

DOMÍNIOS DO VECTOR PCHEK

Domínio Fragmento contendo o domínio Sinal de poli A de SV-40 1-405 Sítio de clonagem múltipla 401-463 Promotor de CMV 467-1311 Sinal de poli A de TK 1312-1843 Higromicina 1844-2899 Intrão 2900-3233 Promotor precoce de SV-40 3234-3602 Origem de ColEl e resistência 3603-5188 59 à canamicina EBNA-1 5189-7789 Origem de replicação de Espstein Barr (OriP) 7790-1046

Subclonagem de ΕΤ0β2 anti-paralelo no vector pCHEK Isolamento de FTCP2

Para preparar o plasmido pCHEK/HBA2, os requerentes construíram pCEP4/HBA2, um vector transportador. Em resumo, plasmido o pPC21 (disponibilizado para o público pelo Dr. Purchio), contendo o gene humano ΕΤ0β2, foi digerido até à finalização com EcoRI. As extremidades de EcoRl tornaram-se extremidades cegas por ajustamento das condições de reacção para 250 μΜ de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP e adição de 3 unidades de enzima de Klenow para iniciar a reacção. Deixou-se a reacção prosseguir durante 30 minutos, a 37 °C. O volume de reacção foi então ajustado para 100 μΐ com TE e extraiu-se com fenol/clorofórmio. O ADN precipitou em isopropanol e lavou-se com etanol a 70 %. O fragmento de ΕΤ0β2 (HbA2), de 930 pares de bases foi libertado do vector por digestão de Hind III. No seguimento da electroforese em gel de agarose a 1 %, retirou-se uma lâmina de gel contendo o fragmento de ΕΤ0β2 de 930 pb e extraiu-se o fragmento de ADN extraído por um processo de rotina com sílica oxidada (pó de vidro). O ADN de ΕΤΟβ2 estava então pronto para ser ligado ao vector pCEP4.

Preparação do vector vaivém de pCEP4/HBA2 O vector pCEP4 foi preparado por digestão com a enzima de restrição Xhol e tornaram-se as extremidades cegas por meio de uma reacção de Klenow, como descrito antes. No 60 seguimento da extracção com fenol/clorofórmio e a precipitação em etanol, o vector foi digerido com Hind III e purificado pelo processo de electroforese em gel de agarose/de pó de vidro, como descrito antes. 0 fragmento humano de Π0β2 de 930 pares de foi subclonado direccionalmente no vector pCEP4 numa orientação anti-paralela. No seguimento da transformação de E. coli, preparou-se pCEP4/HBA2 ADN a partir de várias colónias de bactérias transformadas resistentes a ampicilina. 0 ADN isolado destas colónias foi caracterizado por análise de restrição enzimática e seleccionou-se um clone designado por pCEP4/HBA2 e utilizou-se para a preparação do plasmido clinico pCHEK/HBA2.

Preparação do plasmido de expressão pCHEK/HBA2

Em resumo, o ADN de pCEP4/HBA2 ADN foi digerido com as enzimas de restrição Κρη I e Bam Hl e o fragmento da inserção anti-paralela de FTC 2 de 930 pb foi purificado por electroforese em gel de agarose. A inserção foi então ligada ao Κρη I e Bam Hl digeridos pelo vector pCHEK e utilizou-se para transformar bactérias. Após a selecção de canamicina da cultura feita durante a noite, isolou-se o ADN de pCHEK/HBA2 de diversos clones e caracterizou-se por análises de enzima de restrição para garantir a identidade correcta. Para garantir ainda mais a sequência correcta e a orientação do fragmento anti-paralelo de FTCp2, analisou-se a inserção por meio de análises da sequência usando um analisador genético ABI-310 (Perkin Elmer, Foster City, CA) .

Produção do plasmido pCHEK/HBA2 de grau clinico 61

Após uma caracterização preliminar, fizeram-se riscas de uma colónia de bactérias contendo o plasmido pCHEK/HBA2 numa placa de agar de Luria-Bertani (LB) 100 pg/ml de canamicina. Após incubação, a 37 °C, utilizou-se uma única colónia bacteriana para inocular 5 ml de caldo de LB contendo 100 pg/mL de canamicina e deixou-se crescer durante a noite, a 37 °C, com agitação, numa incubadora de bactérias. Esta cultura feita durante a noite foi usada para inocular 50 ml da cultura de bactérias contendo plasmidos. A cultura de bactérias de 50 ml foi incubada durante a noite e usada para inocular frascos contendo 2 litros de LB mais 100 pg/ml de canamicina. A cultura cresceu durante a noite, a 37 °C.

Preparou-se o ADN a partir de culturas de bactérias pelo processo da lise alcalina de Birnboim e Doly, optimizado pela Qiagen Corporation (Birnboim e Doly, 1979) e purificado em colunas prep. Qiagen EndoFree Giga. Todas as etapas foram realizadas em condições estéreis, utilizando pipetas de barreira de ART na campânula de fluxo de biossegurança.

Retirou-se uma aliguota de ADN para a análise de restrição e a determinação da concentração do ADN. A concentração do ADN do plasmido foi ajustado para um mg/ml, foi dividido em aliguotas e armazenado, a -70°C para uso futuro. Retirou-se uma aliguota do ADN do plasmido e analisou-se quanto à sua esterilidade.

Modificação genética de linhas de células tumorais de CPCNP com o plasmido pCHEK/HBA2

Quatro alíquotas de cada linha de células de CPCNP foram retiradas dos BCRnm apropriados e cresceram em 62 cultura. As células foram alimentadas com meio fresco duas vezes por semana. No dia da modificação genética as células foram alimentadas com meio fresco. Quatro horas mais tarde as células foram tripsinizadas, lavadas com meio contendo soro e posteriormente SBF. Densidade celular foi ajustada para 1-2 x por 107células por ml num volume de 350 μΐ de SBF e incubadas em gelo durante 15-20 minutos. Adicionou-se 50 pg do plasmido pCHEK/HBA2. A mistura foi incubada em gelo durante mais 10-15 minutos. A suspensão celular foi então transferida para um cadinho pré-arrefecido e incubadas em gelo. Após de cinco minutos, os cadinhos foram colocados num electroporador de onda quadrada (Genetronics, San Diego, CA) e foram submetidos a três impulsos de electroporação de 3000 v/cm, durando cada impulso 75 psegundos. Adicionou-se 1 ml de meio fresco contendo Hepes 50 mM e incubou-se a mistura, à temperatura ambiente, durante 10 minutos. As células foram então colocadas em placas para 2 ciclos de divisão e, em seguida, começou a selecção (72 horas após transfecção). Adicionou-se às culturas meio fresco contendo 25 pg de higromicina/ml. As células modificadas por genes foram expandidas em cultura e congeladas como bancos de células de referência modificadas por genes (BCFmg) para um total de 4 BCFmg por linha de células. A presença do plasmido pCHEK/HBA2 em células modificadas por genes foi determinada por RCP. Além disso, cinco frascos (5 %) de cada BCFm foram submetidos e usados para ensaios de esterilidade consistindo em ensaios aeróbicos, anaeróbicos, de micoplasmas e de fungos.

Preparação e identificação de linhas de células para a vacinação de doentes

Após a modificação genética, as linhas de células tumorais foram expandidas em cultura para que crescessem 63 células suficientes para aplicações terapêuticas e ensaios. Os clones de cada linha de células que passaram os limites do ensaio de identidade, de resistência e de segurança foram preservados por criogenia em azoto liquido como aliquotas de bancos de células de referência modificadas por genes (BCRmg) e bancos de células de trabalho modificadas por genes (BCTmg). Antes da vacinação dos doentes, descongelam-se aliquotas de cada lote de BCTmg e irradiam-se com uma dose de 10.000 cGy, uma dose de radiação que demonstrou ser capaz de travar completamente a formação de colónias por células tumorais de cultura de diferentes origens histológicas, incluindo estas células de CPCNP. As aliqoutas de cada lote foram submetidas a ensaios de segurança, resistência e identidade para garantir que não ocorreu alteração ou contaminação durante a manipulação das células e a congelação. Fazem-se ensaios dos lotes para: clonogeneicidade, esterilidade e regulação decrescente de FTCp2.

Preparação de células e ensaios antes da vacinação do doente

Antes da imunização subcutânea, colocam-se aliquotas das quatro linhas celulares escolhidas em culturas de curto prazo. As células modificadas por genes são separadas placas dos pratos de cultura, lavadas e novamente suspensas num meio, irradiadas com 10.000 cGy, lavadas e novamente suspensas em solução de Ringer com lactato. São depois ensaiadas quanto à esterilidade e à viabilidade. Só as células que passam os limites do ensaio são utilizadas para a vacinação de doentes. 64

Literatura citada

Ashley DM, Kong FM, Bigner DD, Hale LP. Endogenous expression of transforming growth factor βΐ inhibits growth and tumorigenicity and enhances Fas-mediated apoptosis in a murine high-grade glioma model. Câncer Res 58(2): 302-309, 1998.

Ashley DM, Sampson JH, Archer GE, Hale LP, Bigner DD. Local production of FTC βΐ inhibits cerebral edema, enhances TNF-α induced apoptosis and improves survival in a murine glioma model. J Neuroimmunol 86(1): 46-52, 1998.

Baker JC and Harland RM. From receptor to nucleus: the Smad pathway. Curr. Opin. Gen. Devei. 7: 467-473, 1997.

Bodmer S, Podlisny MB, Selkoe DJ, Heid I, and Fontana A. Transforming growth factor-beta bound to soluble derivatives of the beta amyloid precursor protein of Alzheimer's disease. Biochem. Biophys. Res. Communications 171: 890-897, 1990.

Bodmer S, Strommer K, Frei K, Siepl C, de Tribolet N, Heid I, Fontana A. Immunosuppression and transforming growth factor-β in glioblastoma. Preferential production of transforming growth factor-β. J Immunol 143(10): 3222-3229, 1989.

Border, W.A., and Rouslahti E. Transforming growth factor-β in disease: the dark side of tissue repair. J.Clin. Invest. 90: 1, 1992.

Chen TC, Hinton DR, Yong VW, Hofman FM. FTC^2 and soluble p55 TNFR modulate VCAM-1 expression in glioma cells 65 and brain derived endothelial cells. J Neuroimmunol 73(1— 2): 155-161, 1997.

Constam DB, Phillipp J, Malipiero UV, ten Dijke P, Schachner M, and Fontana A. Differential expression of Transforming Growth Factor-βΐ, -β2, and -β3 by glioblastoma cells, astrocytes, and microglia. J. Inxmunol. 148: 1404-1410, 1992.

Culver KW, Ram Z, Wallbridge S, Ishii H, Oldfield EH, and Blaese RM. In vivo gene transfer with retroviral vector-producer cells for treatment of experimental brain tumors. Science 256: 1550-1552, 1992.

Dorigo O, Shawler DL, Royston I, Sobol RE, and Fakhrai H. Synnergy of Transforming Growth Factor beta (FTC-β) antisense and IL-2 gene therapy in the murine ovarian teratoma (MOT) model. Gynecol Oncol 71(2): 204-210, 1998.

Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A, Golumbek P, Levitsky H, Brose K, Jackson V, Hamada H, Pardoll D, and Mulligan R. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-macrophage colony-stimulating factor stimulates potent, specific, and long-lasting anti-tumor immunity. Proc. Natl. Acad. Sei. 90: 3539-3543, 1993. Dubinett SM; Miller PW; Sharma S; Batra RK Gene therapy for lung câncer. Hematol Oncol Clin North Am. 12(3): 569-94, 1998 .

Eastham JA, Truong LD, Rogers E, Kattan M, Flanders KC, Scardino PT, Thompson TC. Transforming growth factor-beta 1: comparative immunohistochemical localization in human primary and metastatic prostate câncer. Laboratory Investigation 73(5): 628-635, 1995. 66

Eder IE, Stenzl A, Hobisch A, Cronauer MV, Bartsch G, Klocker H. Transforming growth factors-beta 1 and beta 2 in serum and urine from patients with bladder carcinoma. J. Urology 156(3): 953-957, 1996.

Fakhrai H, Shawler DL, Gjerset R, Koziol J, Naviaux R, Royston I, and Sobol RE. Cytokine gene therapy with interleukin-2 transduced fibroblasts: effects of IL-2 on anti-tumor immunity. Human Gene Therapy 6: 591-601, 1995.

Fakhrai H, Dorigo 0, Shawler DL, Lin H, Mercola D, Black KL, Royston I, and Sobol RE. Eradication of established intracranial rat glioma by Transforming Growth Factor beta antisense gene therapy. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 2909-2914, 1996.

Friedman E, Gold LI, Klimstra D, Zeng ZS, Winawer S, Cohen A. High leveis of transforming growth factor beta 1 correlate with disease progression in human colon câncer. Câncer Epidemiology, Biomarkers and Prevention 4(5): 549-554, 1995.

Heldin CH, Miyazono K, and Dijke P. FTC-β signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins. Nature 390: 465-471, 1997.

Hirte, H., and Clark D.A. Generation of lymphokine-activated killer cells in human ovarian carcinoma ascitic fluid: identification of Transforming Growth Factor-beta as a suppressive factor. Câncer Immuno. Immunother. 32: 296-302, 1991. 67

Holladay FP, Heitz T, Chen YL, Chiga M, and Wood GW. Successful treatment of a malignant rat glioma with cytotoxic T lymphocytes. Neurosurgery 31: 528-533, 1992.

Holladay FP, Heitz T, and Wood GW. Antitumor activity against established intracerebral gliomas exhibited by cytotoxic T lymphocytes, but not by lymphokine-activated killer cells. J. of Neurosurgery 77: 757-762, 1992.

Holladay FP, Lopez G, De M, Morantz RA, and Wood GW. Generation of cytotoxic immune responses against a rat glioma by in vivo priming and secondary in vitro stimulation with tumor cells. Neurosurgery 30: 499-504, 1992 .

Huber BE, Richards CA, and krenitsky TA. Retroviral-mediated gene therapy for the treatment of hepatocellular carcinoma: An innovative approach for câncer therapy. Proc. Natl. Acad. Sei. 88: 8039-8043, 1991.

Jachimczak P, Bogdahn U, Schneider J, Behl C, Meixensberger J, Apfel R, Dorries R, Schlingensiepen KH, and Brysch W. The effect of Transforming Growth Factor^2-specific phosphorothioate-anti-sense oligodeoxynucleotides in reversing cellular immunosuppression in malignant glioma. J. Neurosurg. 78: 944-951, 1993.

Jakowlew SB, Mathias A, Chung P, Moody TW. Expression of transforming growth factor beta ligand and receptor messenger RNAs in lung câncer cell lines. Cell Growth and Differentiation 6(4): 465-476, 1995.

Jennings MT, Hart CE, Commers PA, Whitlock JA, Martincic D, Maciunas RJ, Moots PL, Shehab TM. Transforming 68 growth factor β as a potential tumor progression factor among hyperdiploid glioblastoma cultures: evidence for the role of platelet-derived growth factor. J Neurooncol 31(3): 233-254, 1997.

Jennings MT, Kaariainen IT, Gold L, Maciunas RJ, Coitimers PA. FTC-βΙ and ΕΤΟβ2 are potential growth regulators for medulloblastomas, primitive neuroectodermal tumors, and ependymomas: evidence in support of an autocrine hypothesis. Hum Pathol 25(5): 464-475, 1994.

Jennings MT, Pietenpol JA. The role of transforming growth factor β in glioma progression. J Neurooncol 36(2): 123-140, 1998.

Kasid A, Bell GI, and Director EP. Effects of transforming growth factor beta on human lymphokine activated killer cell precursors: Autocrine inhibition of cellular proliferation and differentiation to immune killer cells. J. Immunol. 141: 690, 1988.

Kim IY, Kim JH, Lang S, Kozlowski JM, Lee C. Successful treatment of established rat prostate câncer by transforming growth factor· 1 antisense transfected tumor vaccine. American Urological Association, Inc. Annual Meeting. 1997.

Kong FM, Anscher MS, Murase T, Abbott BD, Iglehart JD, Jirtle RL. Elevated plasma transforming growth factor-beta 1 leveis in breast câncer patients decrease after surgical removal of the tumor. Annals of Surgery 222(2): 155-162, 1995. 69

Liau LM, Fakhrai H, Black KL. Prolonged survival of rats with intracranial C6 gliomas by treatment with FTC-beta antisense gene. Neurol Res 20(8): 742-747, 1998.

Massague, J. The FTC-beta family of growth and differentiation factors. Cell 49: 437, 1987.

Merzak A, McCrea S, Koocheckpour S, Pilkington GJ. Control of human glioma cell growth, migration and invasion in vitro by transforming growth factor-β 1. Br J Câncer 70 (2): 199-203, 1994.

Miller PW; Sharma S; Stolina M; Chen K; Zhu L; Paul RW; Dubinett SM. Dendritic cells augment granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF)/herpes simplex vírus thymidine kinase-mediated gene therapy of lung câncer. Câncer Gene Ther. 5(6):380-9, 1998

Naganuma H, Sasaki A, Satoh E, Nagasaka M, Nakano S, Isoe S, Tasaka K, Nukui H. Transforming growth factor-β inhibits interferon-gamma secretion by lymphokine-activated killer cells stimulated with tumor cells. Neurol Med Chir (Tokyo) 36(11): 789-795, 1996.

Nandan D, Reiner NE. FTC-beta attenuates the class II transactivator and reveals an accessory pathway of IFN-gamma action. Journal of Immunology 158 (3) : 1095-1101, 1997.

Ram Z, Culver KW, Walbridge S, Blaese RM, and Oldfiel EH. In situ retroviral-mediated gene transfer for the treatment of Brain tumors in rats. Câncer Research 53: 83-88, 1993. 70

Ramanathan RK; Belani CP. Chemotherapy for advanced non-small cell lung câncer: past, present, and future. Semin Oncol. 24(4):440-54, 1997

Ransohoff J, Koslow M, and Cooper PR. Câncer of the central nervous system and pituitary. In: American Câncer Society Textbook of Clinicai Oncology. Holleb Al, Fink DJ, and Murphy GP, editors, pp 329-337, 1991.

Rook AM, Kerhl JH, Wakefield LM, Roberts AB, Sporn MB, Burlington DB, Lane HC, and Fauci AS. Effects of transforming growth factor-beta on the function of natural killer cells. Depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Iitimunol. 136 (10): 3916-3920, 1986.

Roth JA; Swisher SG; Merritt JA; Lawrence DD; Kemp BL; Carrasco CH; El-Naggar AK; Fossella FV; Glisson BS; Hong WK; Khurl FR; Kurie JM; Nesbitt JC; Pisters K; Putnam JB; Schrump DS; Shin DM; Walsh GL. Gene therapy for non-small cell lung câncer: a preliminary report of a phase I trial of adenoviral p53 gene replacement. Semin Oncol. 25(3 Supl 8) : 33-7, 1988.

Sobol RE; Shawler DL; Carson C; Van Beveren C; Mercola D; Fakhrai H; Garrett MA; Barone R; Goldfarb P; Bartholomew RM; Brostoff S; Cario DJ; Royston I; Gold DP. Interleukin 2 gene therapy of colorectal carcinoma with autologous irradiated tumor cells and genetically engineered fibroblasts: a Phase I study. Clin. Câncer Res. 5(9):2359-65, 1999.

Sporn M., Roberts, A.B., Wakefield L.M. e Asoian R.K. Transforming growth factor-beta: biological function and Chemical structure. Science 233: 532-534, 1986. 71

Stiles JD, Ostrow PT, Baios LL, Greenberg SJ, Plunkett R, Grand W, Heffner RR Jr. Correlation of endothelin-1 and transforming growth factor-βΐ with malignancy and vascularity in human gliomas. J Neuropathol Exp Neurol 56 (4) : 435-439, 1997.

Swisher SG; Roth JA; Nemunaitis J; Lawrence DD; Kemp BL; Carrasco CH; Connors DG; El-Naggar AK; Fossella F; Glisson BS; Hong WK; Khuri FR; Kurie JM; Lee JJ; Lee JS; Mack M; Merritt JA; Nguyen DM; Nesbitt JC; Perez-Soler R; Pisters KM; Putnam JB Jr; Richli WR; Savin M; Waugh MK; et al. Adenovirus-mediated p53 gene transfer in advanced non-small-cell lung câncer. J. Natl. Câncer Inst. 5; 91 (9) : 7 63-71, 1999

Takenoyama M; Yasumoto K; Harada M; Sugimachi K; Nomoto K. Antitumor response of regional lymph node lymphocytes in human lung câncer. Câncer Immunol Immunother. 47 (4): 213-20, 1998.

Trojan J, Blossey BK, Johnson TR, Rudin SD, Tykocinski ML, Ilan J e Ilan J. Loss of tumorigenicity of rat glioblastoma directed by episome-based antisense cADN transcription of insulin-like growth factor I. Proc. Natl. Acad. Sei., 89: 4874-4878, 1992.

Trojan J, Johnson TR, Rudin SD, Ilan J, Tykocinski ML, and Ilan J. Treatment and prevention of rat glioblastoma by immunogenic C6 cells expressing antisense insulin-like growth factor I RNA. Science 259: 94-96, 1993. 72

Tsunawaki S, Sporn M, Ding A. e Nathan C. Deactivation of macrophages by transforming growth factor-β. Nature 334: 260, 1988.

Yamada N, Kato M, Yamashita H, Nister M, Miyazono K, Heldin CH, Funa K. Enhanced expression of transforming growth factor-beta and its type-I and type-II receptors in human glioblastoma. International Journal of Câncer 62 (4): 386-392, 1995.

Yingling JM, Datto MB, Wong C, Frederick JP, Liberati NT e Wang XF. Tumor suppressor Smad4 is a transforming growth factor β-inducible ADN binding protein. Mol. Cell. Biol. 17 (12): 7019-7028, 1997.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Fakhrai, Habib

<120> Células geneticamente modificadas que expressam um inibidor de FCT-beta, sendo estas células, células de cancro do pulmão <130> ADBIO.003PCT <150> US 60/193,497 <151> 2000-05-31 <160> 3 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0 <210> 1 <211> 927 73 <212> ADN <213> Factor de transformação do crescimento beta-2 humano <400> 1 aattcaagca ggatacgfctt fctctgttggg cattgactag attgtttgca aaagtttcgc 60 atcaaaaaca acaacaacaa aacaaacaac tctccttgat ctatactttg agaafctgttg 120 atttcttttt tttattctga ctfcttaaaaa caactttttt tfcccactttt ttaaaaaatg ISO cactactgtg tgctgagcgc ttttctgatc ctgcatctgg tcacggfccgc gctcagcctg 240 tctacctgca geacactcga tatggaccag ttcatgcgca agaggaccga ggcgatccgc 300 gggeagatcc tgagcaagct gaagctcacc agtcccccag aagactatcc tgagccegag 360 gaagtccccc cggaggtgat ttccatctac aacagcacca gggacttgct ccaggagaag 420 gcgagccgga gggcggccgc ctgcgagcgc gagaggagcg acgaagagta ctacgccaag 480 gaggtttaca aaatagacat gecgeccttc ttcccctccg aaactgtctg cccagttgtt 540 acaacaccct ctggctcagt gggcagcttg tgctccagac agtcccaggt gctcfcgtggg 600 taccttgatg ccatcccgcc cactttctac agaccctact tcagaattgt tcgatttgac 660 gtctcagcaa tggagaagaa tgcttccaat ttggfcgaaag cagagtccag agtctttcgt 720 fctgeagaace caaaagccag agfcgcctgaa caacggattg agctatatca- gattctcaag 780 tccaaagafct taacatctcc aacccagcgc tacatcgaca gcaaagttgt gaaaacaaga 840 gcagaaggcg aatggctctc cttcgatgta actgatgctg ttcatgaatg gcttcaccat 300 aaagacagga acctgggatt taaaata 327

<210> 2 <211> 28 <212> ADN <213> Sequência do vector de flanqueio da inserção do FTC-beta2 <400> 2 tgtctggatc cggccttgcc ggcctcga 28

<210> 3 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência do vector de flanqueio da inserção do FTC-beta2 <400> 3 agcttgctag cagctggtac ccagct 26

Lisboa, 12 de Dezembro de 2011 74

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de células geneticamente modificadas contendo uma estrutura genética expressando um inibidor de FTCP eficaz para reduzir a expressão de FTCP, em que as referidas células geneticamente modificadas são células de cancro do pulmão.
2. Composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de células geneticamente modificadas contendo uma estrutura genética expressando um inibidor de ΠΌβ eficaz para reduzir a expressão de FTCP, em que as referidas células geneticamente modificadas são células de cancro do pulmão para serem utilizadas no prolongamento da sobrevivência de um indivíduo com cancro do pulmão.
3. Utilização de uma composição farmacêutica, caracterizada pelo facto de compreender uma quantidade eficaz, sob o ponto de vista terapêutico, de células geneticamente modificadas contendo uma estrutura genética expressando um inibidor de FTCP eficaz para reduzir a expressão de ΠΌβ, em que as referidas células geneticamente modificadas são células de cancro do pulmão, para a preparação de um medicamento para o prolongamento da sobrevivência de um indivíduo com cancro do pulmão.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, composição de acordo com a reivindicação 2 ou utilização de acordo com a reivindicação 3, caracterizadas pelo facto de as referidas células de 1 cancro do pulmão serem células de cancro do pulmão de células não pequenas (CPCNP) ou células de cancro do pulmão de células pequenas(CPCP).
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, composição de acordo com a reivindicação 2 ou 4 ou utilização de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizadas pelo facto de ΕΤΟβ ser ΕΤ0β-1 ou ΕΤ0β-2.
6. Composição farmacêutica, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1, 4 e 5, composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 2, 4 e 5 ou utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 5, caracterizadas pelo facto de as referidas células geneticamente modificadas serem células autólogas, células alogénicas ou misturas de células autólogas e alogénicas.
7. Composição farmacêutica, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 4 a 6, composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 e 4 a 6 ou utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 6, caracterizadas pelo facto de as referidas células geneticamente modificadas ainda expressarem uma ou mais citocinas com efeitos imuno-estimuladores.
8. Composição farmacêutica, composição ou utilização de acordo com a reivindicação 7, caracterizadas pelo facto de as referidas uma ou mais citocinas serem seleccionadas no grupo que consiste em interleucina-1, interleucina-2, interleucina-3, interleucina-4, inter-leucina-5, interleucina-6, interleucina-7, inter-leucina-8, interleucina-9, interleucina-10, inter-leucina-11, interleucina-12, interleucina-15, 2 factor-alfa de interferão alfa, interferão gama, necrose do tumor, factor-beta de transformação do crescimento, factor de estimulação de colónias de granulócitos e macrófagos e factor de estimulação de colónias de granulócitos.
9. Composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 4 a 8, composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 e 4 a 8 ou utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 8, caracterizadas pelo facto de o referido inibidor de ΕΤ0β ser um mutante anti-paralelo, uma ribozima, um mutante negativo dominante ou um anticorpo.
10. Composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 4 a 9, composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 e 4 a 9 ou utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 9, caracterizadas pelo facto de o referido inibidor de ΕΤ0β ser anti-paralelo e ter a sequência da SEQ ID NO: 1.
11. Composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 4 a 10, composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 e 4 a 10 ou utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 10, caracterizadas pelo facto de o referido inibidor de FTCP evitar a interacção do receptor de FTCP e da proteína Smad.
12. Composição farmacêutica de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 e 4 a 11, composição de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 e 4 a 11 ou utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 11, 3 ser caracterizadas pelo facto de a referida composição fornecida numa forma farmacêutica unitária. Lisboa, 12 de Dezembro de 2011. 4