DE4406073A1 - Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten, Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten und so erhaltene Fibroblasten - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten, Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten und so erhaltene FibroblastenInfo
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Description
Bei der Therapie verschiedenster Krankheiten ist es
wünschenswert, bestimmte biologisch aktive Moleküle, die auch
vom menschlichen Körper produziert werden können, in einer
gesteigerten, medizinisch wirksamen Dosierung dem Körper
zuzuführen. Die medikamentöse Zuführung von außerhalb des
Körpers hergestellten biologisch aktiven Molekülen hat jedoch
oft den Nachteil, daß derartige Wirkstoffe häufig, manchmal
sogar mehrmals täglich appliziert werden müssen, wobei eine
einfache subkutane Applikation oft nicht ausreicht, sondern
mehrmals täglich intravenöse Gaben erforderlich sind.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zur Verfügung zu stellen, mit dem solche Zellen zur Verfügung
gestellt werden, die derart verändert wurden, daß sie
biologisch aktive Moleküle produzieren können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten offenbart,
sowie ein Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden dem Spender
zunächst Gewebeproben von der Serosa und in bevorzugter Form
von der Haut entnommen, wobei diese Proben eine Größe von 0,5
bis etwa 2 cm² aufweisen können. Derartige Gewebeproben
können durch bekannte chirurgische Routineverfahren der
Biopsie entnommen werden.
Die im Rahmen der Biopsie erhaltenen Proben werden dann mit
einem Skalpell oder einem vergleichbaren Gerät in Teile von
weniger als 2 mm Durchmesser zerkleinert. Diese Teile können
dann auf Zellkulturplatten mit der Epidermisschicht nach oben
ausgelegt werden. Als Kulturmedium kann in bevorzugter Weise
Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM) mit 10% fötalem
Kälberserum und den üblichen Zusatzstoffen verwendet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich
herausgestellt, daß es vorteilhafter ist, wenn die
Gewebeproben zunächst nur auf eine Größe von etwa 0,5 cm²
zerkleinert werden und diese Teile dann in Kulturmedium
(DMEM) inkubiert werden, wobei das Medium die
Zellvereinzelung fördernde Enzyme enthält. Als derartige die
Zellvereinzelung fördernde Enzyme werden im Rahmen der
vorliegenden Erfindung bevorzugt Collagenase, Dispase (eine
neutrale Protease) oder Hyaluronidase eingesetzt, wobei die
Enzyme entweder einzeln oder in verschiedenen Kombinationen
verwendet werden können.
Die durch die enzymatische Behandlung freigesetzten Zellen
werden anschließend mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung
gewaschen und bei einer Dichte von etwa 2 × 10⁴/cm² in
Zellkulturflaschen ausgesät.
Die Fibroblastenkulturen werden üblicherweise zweimal pro
Woche mit frischen Wachstumsmedium versehen. Wenn die
Kulturen Konfluenz erreicht haben, können die Zellen durch
Behandlung mit Trypsin/EDTA geerntet werden. Nach Waschen,
Zählen, und wieder Aussäen bei 1 × 10⁴ Zellen/cm² beginnt ein
neuer Wachstumszyklus.
Es hat sich herausgestellt, daß im Rahmen der vorliegenden
Erfindung die Zugabe von sogenannten Feeder-Zellen
vorteilhaft ist. Hierbei werden etwa 5 × 10⁵ bestrahlte
Zellen zu etwa 10² klonogenen Fibroblastenzellen in Schalen
mit einem Durchmesser von 10 cm gegeben. Die Feeder-Zellen
werden mit einer Intensität von etwa 50 Gy bestrahlt. In
bevorzugter Weise werden hierzu menschliche embryonale WS-1
Fibroblasten verwendet, die von der American Type Culture
Collection erhältlich sind, oder auch Mäuse NIH3T3
Fibroblasten.
Bei einem besonders wirksamen Verfahren zur Herstellung von
humanen, klonogenen Fibroblasten werden die durch Biopsie
erhaltenen Gewebeproben zunächst zerkleinert in Stücke, die
nicht mehr als 0,5 cm² aufweisen. Diese Gewebestücke werden
dann mit dem Enzym Dispase bei einer Konzentration von 2,5
Einheiten/ml für 16 Stunden bei 4°C verdaut. Nach dem
Entfernen der Epidermis werden die Hautzellen in Stücke
zerkleinert, die nur wenige Millimeter groß sind. Das so
erhaltene Material wird weiter mit einer Mischung von
Collagenase (200 Einheiten/ml) und Hyaluronidase (300
Einheiten/ml) für 3 Stunden bei 37°C im Wasserschüttelbad
verdaut. Schließlich werden die Zellen durch ein Sieb mit
einer Maschengröße von 70 µm gesiebt, gewaschen und in die
Zellkultur überführt.
Es wurde festgestellt, daß von Spendern, die jünger als 60
Jahre waren, nach einer durchschnittlichen Zeit von 89 Tagen
(± 8 Tage) etwa 10¹¹ Zellen erhalten werden konnten.
Die anliegende Fig. 1 zeigt, daß die mittlere
Verdopplungszeit etwa 4,3 (± 0,6) Tage beträgt. Das weitere
Wachstum war deutlich langsamer in einigen Fällen und in
manchen Fällen wurde ein Plateau erreicht, was keine
Steigerung der Zellzahl mehr zuließ. Bei manchen Kulturen
konnte jedoch eine Zellzahl von mehr als 10¹⁵ Zellen erreicht
werden, ohne daß eine Abflachung der Kurve beobachtet werden
konnte. Es stellte sich heraus, daß die von älteren Spendern
stammenden Kulturen langsamere Wachstumsraten haben und eher
stagnieren.
Fig. 2 zeigt eine Gegenüberstellung von Fibroblasten in
Abhängigkeit von der Art der Herstellung der Zellen. Die
enzymatisch hergestellten Fibroblasten zeigten eindeutig eine
bessere Fähigkeit der Proliferation als diejenigen, die nur
durch mechanische Herstellung aus Hautbiopsien erhalten
wurden. Die von verschiedenen Spendern stammenden
Zellkulturen zeigten immer dann ein besseres Vermehrungs
verhalten, wenn die Zellen nach enzymatischer Behandlung
hergestellt wurden gegenüber denjenigen Zellen, die nur aus
den Biopsieproben herauswuchsen.
Fig. 3 zeigt, daß autologe Fibroblasten auch wirksam aus
Peritonealzellen mit Hilfe der enzymatischen Herstellungs
methode erhalten werden konnten. Zwar wuchsen Serosa- und
Hautkulturen anfänglich mit etwa gleichen Raten, jedoch
erreichten die diploiden Fibroblasten aus Serosa das Plateau
eher als gleich alte Kulturen von Haut.
Im Bezug auf permanent transfizierte Klone ist die
Platiereffizienz der diploiden Fibroblasten von großer
Bedeutung. Fig. 4 zeigt, daß diploide Fibroblasten ohne
"Feeder"-Zellen nur schlecht wuchsen. Durch die Zugabe von
bestrahlten menschlichen WS-1 Fibroblasten wurde die
Platierungseffizienz auf 9 bis 24% gesteigert. Es wurden von
nicht bestrahlten Zellen die Überstände ebenso geerntet wie
die von mit 20 und 100 Gy bestrahlten Zellen nach 3 und 8
Tagen. In den Überständen von nicht bestrahlten diploiden
Fibroblasten wurden 1,2 bis 1,4 ng Interleukin-6 pro 24
Stunden und 10⁶ Zellen gefunden. Die Bestrahlung änderte
nicht wesentlich die Interleukin-6 Sekretion. Nicht
bestrahlte diploide Fibroblasten produzierten dagegen nicht
nennenswerte Mengen von GM-CSF (colony stimulating factor)
oder TNFα (tumor necrose factor), wohingegen nach Bestrahlung
in den Überständen bis zu 90 pg GM-CSF und 50 pg TNFα pro 24
Stunden und 10⁶ Zellen gemessen wurden. Die Induktion dieser
Zytokine durch Bestrahlung war stark abhängig von den
jeweiligen individuellen Kulturen.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren herstellbaren
diploiden Fibroblasten können leicht beispielsweise von
Krebspatienten erhalten werden. Diese klonogenen Fibroblasten
dienen als geeignetes Ausgangsmaterial für die
Gentransfektion. Derartig transfizierte Fibroblasten können
dann als autologe Zellen den Spendern wieder zugeführt
werden.
Die nach dem oben näher beschriebenen Verfahren erhältlichen
Fibroblasten können durch Transfektion genetisch manipuliert
werden. Bei der Gentransfizierung werden in die klonogenen
Fibroblasten ein oder mehrere Gene eingeschleust, die für ein
Genprodukt kodieren, das therapeutisch wertvoll ist.
Derartige Genprodukte sind Wachstumsfaktoren, insbesondere
hämatopoetische Wachstumsfaktoren, aber auch Hormone, wie
beispielsweise Insulin, oder Enzyme, wie beispielsweise
lysosomale Enzyme oder Adenosindesaminase.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der
vorliegenden Erfindung werden durch die Transfektion
hämatopoetische Wachstumsfaktoren wie G-CSF oder
Erythropoetin in die Fibroblasten eingeschleust.
Zur Transfektion sind geeignete Vektoren erforderlich. Bei
einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
wird ein retroviraler Vektor verwendet. Dieser Vektor kann
neben den erforderlich essentiellen Genen aus dem
retroviralen System weiterhin ein sogenanntes Suizidgen, wie
das aus Herpes simplex Virus stammende Thymidinkinase-Gen,
enthalten. Dadurch wird eine selektive Abtötung der Zellen in
Gegenwart von Gancyclovir erlaubt. Außerdem können die
Vektoren induzierbare Promotoren enthalten, die eine
Regulation der Genexpression ermöglichen.
Ein Vektor, der bevorzugt verwendet werden kann, ist der
retrovirale Vektor N2, der von dem Genom des Moloney Murine
Leukemia Virus (MLV) abgeleitet ist und ein bakterielles
Neomyzinresistenzgen als selektiven Marker enthält. Die
Herkunft der Fragmente und die Restriktionsenzyme, die
verwendet wurden, um DNA-Fragmente zu erhalten, die für
menschliches Interleukin-2, Mäuseinterferon-γnd Herpex
simplex Virus Thymidinkinasepromotor und andere Gene
kodieren, wurden bereits beschrieben [Gansbacher et al., J.
Exp. Med., 172 (1990) S. 1217-1224; Gansbacher et al., Cancer
Res., 50 (1990) S. 7820-7825 und Gansbacher et al., Blood, 80
(1992) S. 2817-2825].
Ein weiterer Vektor, der im vorliegenden Verfahren bevorzugt
eingesetzt werden kann, wurde in Science, Vol. 256, April
1992, S. 445 beschrieben. Hierbei handelt es sich um die
äußere Hülle eines Adenovirus, bei dem die adenoviralen Gene
entweder deletiert oder anderweitig inaktiviert wurden. An
die virale Hülle ist ein Antikörper mit einem Lysinschwanz
gebunden, wobei der Lysinschwanz an die zu transfizierende
DNA bindet. Bei diesem Vektorsystem wird die DNA nicht
innerhalb der viralen Hülle verpackt, sondern außen an die
virale Hülle angehängt. Dieser Vektor ermöglicht die
Transfektion von größeren DNA-Fragmenten.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen humanen
klonogenen Fibroblasten können nach den oben beschriebenen
Methoden transfiziert werden. Da nur die klonogenen
Fibroblasten als Zielzellen für eine stabile Gentransfektion
in Frage kommen, sind die so erhaltenen Fibroblasten für die
Expression von Fremdgenen sehr geeignet.
Beispielsweise können Fibroblasten, die mit Zytokingenen
transfiziert wurden, als sogenannte "Bystander"-Zellen im
Rahmen von Vakzinationen gegen Tumoren oder auch zur
Prophylaxe von Infektionen eingesetzt werden. Mit anderen
Genen transfizierte Fibroblasten können in den Spender
zurückgebracht werden und der langfristigen Versorgung des
Organismus mit denjenigen Molekülen dienen, die bei der
entsprechenden Krankheit fehlen. Hierbei kann es sich
beispielsweise um den Blutgerinnungsfaktor VIII, das Protein
S, das Protein C, oder auch Insulin, Erythropoetin oder
andere hämatopoetische Wachstumsfaktoren handeln. Auch die
Bereitstellung von Enzymen wie Glucocerebrosidase oder
Adenosindesaminase ist möglich.
Die erfindungsgemäßen Fibroblasten können entweder im
autologen System verwendet werden oder auch im allologen
System, sofern dies in immunologischer Hinsicht möglich ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung werden die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhaltenen Fibroblasten mit Collagen beschichteten Polyvinyl
pyrrolidon Matrizes kokultiviert und in dieser Form als
Organoid intraperitoneal oder subkutan appliziert. Es ist
bekannt, daß derartige Objekte in vivo neovaskularisiert
werden. Die Menge des in vivo erforderlichen Genproduktes
wird über die Menge der transfizierten Zellen gesteuert und
gegebenenfalls zusätzlich durch den induzierbaren Promotor.
Anstelle der Polyvinylpyrrolidon Matrizes können auch andere
geeignete Trägerstoffe wie beispielsweise Polytetrafluor
ethylenfasern verwendet werden, die dann mit einem geeigneten
Beschichtungsmittel wie Collagen überzogen werden. Diese
Fasern können dann in eine extrazelluläre Gelmatrix einge
bettet werden und beispielsweise durch einen kleinen chirur
gischen Eingriff intraperitoneal appliziert werden.
Mit Hilfe von routinemäßigen chirurgischen Eingriffen wurden
Haut- und Serosaproben von etwa 0,5-2 cm² erhalten von 50
Spendern, die an Krebs erkrankt waren. Die Biopsieproben
wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM)
aufbewahrt und am Tag der Entnahme weiterbearbeitet.
Die Biopsieproben wurden mit einem Skalpell in Stücke von
weniger als 2 mm Durchmesser geschnitten. Diese Stücke wurden
dann auf Zellkulturplatten mit der Epidermis nach oben
ausplatiert. Als Wachstumsmedium wurde DMEM (Gibco BRL) mit
hohem Glucosegehalt, das 10% fötales Kälberserum (Boehringer
Mannheim) enthielt und mit L-Glutamin und Natriumpyruvat
angereichert wurde, verwendet.
Nachdem die Biopsieproben in Stücke von weniger als etwa 0,5 cm²
zerkleinert wurden, wurden diese Proben mit DMEM Medium,
das Collagenase (Biochrom, Berlin), Dispase (Boehringer
Mannheim) oder Hyaluronidase (Sigma, Deisenhofen) entweder
einzeln oder in verschiedenen Kombinationen enthielt,
inkubiert. Zellen, die durch diese Behandlung in die
Suspension freigesetzt wurden, wurden mit phosphatgepufferter
Kochsalzlösung gewaschen und in einer Dichte von 2 × 10⁴/cm²
in Zellkulturflaschen ausplatiert.
Die Fibroblastenkulturen wurden bei 37°C in feuchter
Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt, angezogen, wobei zweimal pro
Woche frisches Wachstumsmedium hinzugefügt wurde. Sobald die
Kulturen Konfluenz erreichten, wurden die Zellen durch
Behandlung mit Trypsin/EDTA geerntet, anschließend gewaschen,
gezählt und mit einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen/cm² erneut
ausgesät. Die Zellzahlen wurden ausgehend von der Anzahl der
Zellen und dem Verdünnungsfaktor bei jeder Passage
hochgerechnet.
10² Zellen wurden in Kulturplatten mit 10 cm Durchmesser
ausplatiert. Am folgenden Tag wurden 5 × 10⁵ menschliche
embryonale WS-1 Fibroblasten oder Mäusefibroblasten mit der
Bezeichnung NIH3T3 pro Kulturplatte hinzugefügt. Die beiden
von der ATCC, Rockville, MD erhältlichen Zellinien dienten
als sogenannte Feeder-Zellen nach Bestrahlung mit 100 Gy.
Nach 4 Wochen Kultur wurden die Kolonien mit 2% Methylenblau
in 50% Ethanol gefärbt und gezählt, wobei während der Kultur
dauer das Medium alle 2 Wochen gewechselt wurde.
Die Überstände von subkonfluenten Kulturen wurden 24 Stunden
nach einem vollständigen Wechsel des Nährmediums geerntet.
Die Zellen wurden gezählt und die Zytokinkonzentrationen in
den Überständen wurden bestimmt unter Verwendung von
kommerziell erhältlichen ELISA-Tests.
Die in Beispiel 1 angegebenen Versuchsbedingungen wurden
unter Verwendung von verschiedenen Enzymen (Beispiel 1c)
durchgeführt, um die Wirksamkeit für die Erstellung von
Langzeitkulturen von diploiden Fibroblasten zu ermitteln. Die
besten Ergebnisse wurden erhalten, wenn die in kleine Stücke
zerschnittenen Biopsieproben zunächst mit Dispase bei einer
Konzentration von etwa 2,5 U/ml für 16 Stunden bei 4°C
verdaut wurden. Nach dieser Behandlung konnte die Epidermis
leicht von den Zellfragmenten entfernt werden. Die Hautzellen
wurden dann weiter in Stücke von wenigen mm zerkleinert.
Dieses Zellmaterial wurde einer zweiten enzymatischen
Behandlung mit einer Mischung von Collagenase (200 U/ml) und
Hyaluronidase (300 U/ml) für 3 Stunden bei 37°C im
Wasserschüttelbad unterzogen. Schließlich wurden die Zellen
durch eine Passage durch ein 70 µm Sieb aufgetrennt,
gewaschen und in Zellkultur überführt.
Fig. 1 zeigt, daß diploide Fibroblastenkulturen, die mit
Hilfe dieses Verfahrens von Spendern erhalten wurden, die
jünger als 60 Jahre alt waren, im allgemeinen ähnliche
Wachstumscharakteristiken aufwiesen mit einer mittleren
Verdopplungszeit von 4,3 ± 0,6 Tagen.
Fig. 2 zeigt, daß die mit Hilfe des enzymatischen Verfahrens
hergestellten Fibroblastenkulturen eindeutig eine bessere
Vermehrungskapazität hatten als diejenigen Fibroblasten
kulturen, die lediglich durch eine mechanische Behandlung der
Hautbiopsieproben erhalten wurden.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können diploide
Fibroblastenkulturen nicht nur aus Hautzellen erhalten
werden, sondern auch von Peritonealzellen. Es zeigte sich,
daß die von der Serosa abgeleiteten Zellkulturen anfangs
ähnlich wuchsen wie die von der Haut abgeleiteten Zell
kulturen, wobei aber die von der Serosa abstammenden
diploiden Fibroblasten das Plateau bei einer deutlich
niedrigeren Zellzahl erreichten als die im Alter vergleich
baren diploiden Fibroblastenkulturen von Haut. Die Fig. 3
zeigt einen Vergleich der Zellzahlen von Fibroblasten
kulturen, die entweder von Haut oder von Serosa stammen.
Fig. 4 zeigt den Einfluß von sogenannten Feeder-Zellen auf
die Platierungseffizienz der diploiden Fibroblastenkulturen.
Es wurden diploide Fibroblastenkulturen von Hautzellen
hergestellt, die enzymatisch behandelt wurden. Ihre
Platierungseffizienz wurde bestimmt, indem die Zellen in
einer sehr geringen Dichte auf den Zellkulturflaschen ausge
sät wurden. Während die diploiden Fibroblasten ohne Feeder-
Zellen kaum irgendeine Koloniebildung unter diesen Bedin
gungen zeigten, konnte die Platierungseffizienz auf 9-24%
durch die Zugabe von bestrahlten menschlichen Fibroblasten
der Zellinie WS-1 erhöht werden.
Besonderes Augenmerk wurde der Produktion von Zytokinen in
den autologen diploiden Fibroblastenkulturen gewidmet. Hierzu
wurden Kulturüberstände von nicht bestrahlten diploiden
Fibroblasten entnommen und ebenso von diploiden Fibroblasten,
die mit 20 bzw. 100 Gy bestrahlt wurden. Die Kulturüberstände
der bestrahlten Zellen wurden am 3. und am 8. Tag nach
Bestrahlung entnommen.
In den Überständen von nicht bestrahlten diploiden
Fibroblasten wurden zwischen 1,2 und 1,4 ng Interleukin-6 pro
24 Stunden und 10⁶ Zellen gefunden. Die Bestrahlung
verursachte keine wesentlichen Änderungen bei der IL-6
Sekretion. Im Unterschied dazu produzierten die nicht
bestrahlten diploiden Fibroblasten keine meßbaren Mengen an
GM-CSF oder TNFα, wohingegen bis zu 90 pg GM-CSF und bis zu
50 pg TNFα pro 24 Stunden und 10⁶ Zellen in den Überständen
nach Bestrahlung gemessen werden konnten. Diese Ergebnisse
sind in der Fig. 5 dargestellt, wobei die Bezeichnungen HP-33,
KE-58 und KP-68 verschiedenen Zellinien angeben.
Um die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zur
Gentransfizierung von humanen Fibroblasten zu demonstrieren,
wurden Vorversuche im Mausmodell durchgeführt, die nach
folgend näher erläutert werden. Die Ergebnisse aus dem
Mausmodell können entsprechend auf menschliche Fibroblasten
angewendet werden.
Der retrovirale Basisvektor N2 leitet sich vom Genom des
Moloney-Murine-Leukemia-Virus (MLV) ab und enthält das
bakterielle Neomycin-Resistenzgen als Selektionsmarker. Es
wurden DNA-Fragmente kodierend für den Major Immediate Early
Human CMV-Promotor, den Promotor der Adenosine-Desaminase
(ADA-Promotor), das Poly-A-Signal und das Mäuse-GM-CSF in
verschiedene Stellen des N2-Vektors kloniert. Das Konstrukt
N2-Vektor/CMV-Promotor/Mäuse-GM-CSF wurde durch Klonieren des
CMV-GM-CSF-Fusionsprodukts in eine Xho I Restriktionsstelle
des Neomycinresistenzgens in dem N2-Vektor hergestellt.
Um den retroviralen Vektor DC/AD/R/GM-CSF herzustellen, wurde
der ADA-Promotor in umgekehrter Orientierung in eine mit dem
Klenow-Fragment aufgefüllte Restriktionsschnittstelle des
Enzyms Mlu I kloniert. Die Mäuse-GM-CSF cDNA wurde ebenfalls
in reverser Orientierung in eine durch das Restriktionsenzym
SnaB I erzeugte Schnittstelle kloniert und das Poly-A-Signal
in eine mit Klenow aufgefüllte Apa I Stelle in den 3′LTR
Polylinker. Durch Elektroporation der Vektor-DNA in eine
helferfreie echotrope Verpackungszellinie (GP + E-86) wurden
die retroviralen Vektoren in die korrespondierenden Viren
umgewandelt. Nach G418-Selektion (0,7 mg/ml Genticin, Gibco
Labor, Grand Island, NY) wurden Kolonien isoliert und zu
Producer-Zellinien expandiert. Zellfreier Überstand wurde zur
Titerbestimmung des Virus auf NIH3T3 Zellen getestet.
Fig. 6 zeigt die Struktur der verwendeten retroviralen
Vektoren.
CMS5 ist ein methylcholantreninduziertes, nicht meta
stasisches Fibrosarkom aus BALB/c-genetischem Hintergrund.
NIH3T3 ist eine kontaktinhibierte Fibroblastenzellinie, die
von NIH Swiss Maus-Embryonen etabliert wurde. BALB 3T3 Klon
A31 sind kontaktinhibierte, nicht tumorogene Fibroblasten
etabliert von BALB/c-Mäuseembryonen. Beide Fibroblastenzell
linien wurden von ATCC erworben. Die Zellen wurden in
Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium kultiviert,
supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml
Penicillin, 100 pg/ml Streptomycin und 2 mmol/l L-Glutamin.
Virus-Producer-Zellinien, die hohe Titer des Virus sezerniert
haben, wurden zur Infektion der CMS5-Zellen und der
Fibroblastenzellen eingesetzt. Klone oder auch bulk
infizierte Zellen wurden nach G418-Selektion zu Linien
expandiert und weiter analysiert.
Es wurde die Sekretion von GM-CSF in den Überstand von
retroviral infizierten CMS5-Zellen und Fibroblasten und die
GM-CSF-Serumkonzentration behandelter Mäuse durch einen
Bioassay bestimmt und mit Hilfe eines ELISA-Tests bestätigt.
Der Überstand von semikonfluenten parenteralen oder GM-CSF-
sezernierenden Zellen wurde nach 24 Stunden gesammelt, die
Zellzahl bestimmt und der Überstand hinsichtlich der
Produktion von Mäuse-GM-CSF untersucht.
Es wurden jeweils 106 mit 50 Gy bestrahlte CMS5-Zellen oder
mit dem Vektor N2/CMV/GM-CSF/CMS5 transfizierte Zellen
untersucht. Die Zellen wurden am Tag der Bestrahlung in
kleine Gewebekulturflaschen platiert und am 3., 6., 9. und
12. Tag nach der Bestrahlung wurde die GM-CSF Menge im 24
Stunden-Kulturüberstand bestimmt.
Die biologische Aktivität des zu untersuchenden GM-CSF wurde
bestimmt durch Ermittlung der Fähigkeit der GM-CSF enthal
tenden Überstände, eine ³H-Thymidininkorporation in die DNA
von GM-CSF abhängigen Mäuse 32DC13-Zellen zu induzieren.
Nachdem die Zellen ohne GM-CSF über Nacht inkubiert wurden,
wurden 10⁴ Zellen pro Loch einer Mikrotiterplatte mit 96
Löchern inkubiert mit Verdünnungen der Testflüssigkeiten und
die Zellen wurden 6 Stunden bei 37°C und 6% CO₂ kultiviert.
Hierauf wurde 1 µCi von ³H-Thymidin zugegeben und die
Inkubation wurde weitere 15 Stunden bei 37°C fortgeführt.
Nach Waschen wurden die Zellen mit Hilfe eines Flüssig-
Szintillationszählers ausgewertet. Die GM-CSF-Aktivität wurde
als counts per minute (cpm) ausgedrückt und es wurde die
Produktion in ng pro 24 Stunden von 10⁶ Zellen berechnet
durch Vergleich mit einer Standardkurve von rekombinantem
Mäuse-GM-CSF. Darüber hinaus wurde die GM-CSF-Produktion
mittels eines ELISA-Tests bestätigt.
Um eine weitere Proliferation wachstumsfaktorproduzierender
autologer oder allogener Zellen nach Injektion in vivo zu
verhindern, bietet sich die Bestrahlung dieser Zellen an. Es
wurden daher GM-CSF-sezernierende Zellen zunächst mit 50 Gy
bestrahlt und die GM-CSF-Sekretion bis zu 12 Tage nach
Bestrahlung bestimmt. In Abb. 7 ist zu sehen, daß
zunächst die GM-CSF-Produktion nach Bestrahlung erhöht wurde.
Während vor Bestrahlung etwa 40 ng/10⁶ Zellen/24 Stunden
gemessen wurden, liegen am 3. und 6. Tag nach Bestrahlung die
Werte bei etwa 130 ng/10⁶ Zellen/24 Stunden. Am 9. Tag fallen
die Werte auf die vor Bestrahlung erhaltenen Werte ab und am
12. Tag nach Bestrahlung ist die GM-CSF-Produktion/24 Stunden
bei etwa einem Drittel des Ausgangswerts. Da die Zahl der
überlebenden Zellen bereits am 6. Tag auf ein Zehntel des
Ausgangswerts abgefallen ist, wird deutlich, daß aus bereits
nicht mehr vitalen Zellen weiterhin GM-CSF freigesetzt wird.
Für die Experimente wurden weibliche BALB/c-Mäuse, die 7-10
Wochen alt waren, eingesetzt. Am Tag 0 und am Tag 2 erhielten
alle Mäuse 150 mg/kg Cyclophosphamid intraperitoneal
appliziert. Ein Teil der Mäuse erhielt keine weiteren
Injektionen, ein zweiter Teil wurde am Tag 3 zweimal täglich
mit 100 ng rekombinant hergestelltem Mäuse-GM-CSF subkutan
injiziert. Die letzte Gruppe erhielt am Tag 3 insgesamt 10⁷
mit 50 Gy bestrahlte N2/CMV/GM-CSF-CMS5-Zellen an 2 Stellen
subkutan injiziert. Ab dem viertem Tag wurde täglich Blut aus
den Schwanzvenen der Mäuse in heparinisierte Eppendorf-Gefäße
überführt. Die Anzahl der Leukozyten wurde nach Lysieren der
Erythrozyten in einer Neubauer-Zellkammer bestimmt. Alle zwei
Tage wurden Differentialblutbilder angefertigt und nach
Färbung mit May-Grünwald-Giemsa das Differentialblutbild
bestimmt. Serumwerte von Mäuse-GM-CSF wurden am Tag 1, 4 und
10 nach Injektion der bestrahlten GM-CSF-sezernierenden
Fibrosarkomzellen bestimmt.
Weibliche BALB/c-Mäuse wurden wie in Beispiel 4d beschrieben
behandelt. Ab dem 3. Tag wurden täglich die peripheren
Leukozytenzahlen ermittelt und alle 2 Tage wurde ein
Differentialblutbild angefertigt. Die Basisleukozytenzahlen
in diesen Mäusestämmen liegen bei etwa 9000 bis 10 000
Leukozyten/µl. Durch die Applikation von Cyclophosphamid sind
die Leukozyten am 3. Tag auf etwa 1000 bis 1500
Leukozyten/µl abgefallen. Bis zum 6. Tag nach der Injektion
von Cyclophosphamid zeigten sich keine großen Änderungen der
Leukozytenwerte. Alle Behandlungsgruppen liegen bei etwa
gleichen Werten. Ab dem 7. Tag zeigt sich ein Unterschied in
der absoluten Leukozytenzahl zwischen den GM-CSF-behandelten
Mäusen und den nur mit Cyclophosphamid injizierten
Kontrollmäusen. Die Werte in den mit Wachstumsfaktor
behandelten Tieren nach subkutaner Injektion oder einmaliger
Injektion von GM-CSF-sezernierenden autologen Zellen liegen
etwa doppelt so hoch wie bei den Kontrollmäusen am 7. und 8.
Tag nach Beginn der Behandlung. Die mit rekombinantem
Wachstumsfaktor behandelten Gruppen, wie die mit GM-CSF-
sezernierenden Fibrosarkomzellen behandelten Tiere erreichen
die normalen Leukozytenwerte am 8. Tag nach der Cyclo
phosphamidinjektion. Dagegen liegen die Kontrollmäuse noch
bei halb-normalen Werten. In Fig. 8 ist das Differential
blutbild der verschiedenen Behandlungsgruppen als absolute
Leukozytensubpopulationen (Monozyten, Granulozyten und
Lymphozyten) angegeben. Bei unbehandelten BALB/c-Mäusen sind
im Differentialblutbild etwa 1% Monozyten, 15-30%
Granulozyten und 70-85% Lymphozyten vorhanden. Am 5. Tag nach
Beginn der Cyclophosphamidbehandlung, also in der Phase der
absoluten Neutropenie, sind bei allen Behandlungsgruppen im
Differentialblutbild fast ausschließlich Lymphozyten zu
finden. Am 7. Tag, an dem die absoluten Leukozytenwerte der
mit rekombinatem GM-CSF und mit GM-CSF-sezernierenden Zellen
behandelten Mäuse etwa doppelt so hoch wie bei den nur mit
Cyclophosphamid behandelten Tieren liegt, ist auch ein
deutlicher Unterschied im Differentialblutbild festzustellen.
Die nicht mit Wachstumsfaktor behandelten Tiere haben nur
etwa 15% der Monozyten und 25% der Granulozyten der subkutan
mit GM-CSF oder mit GM-CSF-sezernierenden Fibroblasten
behandelten Mäuse, die bereits normale absolute Granulozyten
zahlen erreicht haben. Es sind keine Unterschiede bei den
absoluten Lymphozytenwerten zwischen den verschiedenen
Behandlungsgruppen festzustellen.
Fig. 8 zeigt also, daß bereits eine einmalige Injektion
bestrahlter gentransfizierter autologer Zellen biologische
Effekte auf das Blutbild von chemotherapiebehandelten Mäusen
zeigt.
In Fig. 9 wird die Anzahl der Leukozyten, die sich im
Verlauf der Zeit ändert, dargestellt. Die Mäuse wurden
jeweils mit Cyclophosphamid behandelt. Eine Kontrollgruppe
erhielt kein GM-CSF. Bei einer weiteren Kontrollgruppe wurde
rekombinant hergestelltes GM-CSF subkutan injiziert. Bei der
dritten Gruppe wurden gentransfizierte Zellen subkutan
appliziert, die GM-CSF produzierten.
Claims (14)
1. Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen
Fibroblasten, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Spender
Gewebe entnimmt und die Zellen aus dem Gewebe vereinzelt, die
so entstandene Zellsuspension siebt, die in der
Zellsuspension enthaltenen Zellen wäscht und die Zellen in
eine Gewebekultur überführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
das Gewebe dem Spender im Rahmen einer Biopsie aus der Haut
entnommen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß die Vereinzelung der Zellen durch eine mechanische und
eine enzymatische Behandlung erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei
der enzymatischen Behandlung Collagenase, Dispase und/oder
Hyaluronidase eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten in Gegenwart von
bestrahlten humanen oder murinen Fibroblasten als "Feeder"-
Zellen angezogen werden.
6. Humane, klonogene Fibroblasten, dadurch gekennzeichnet,
daß sie nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis
5 erhalten wurden.
7. Fibroblasten nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß
es diploide Fibroblasten sind.
8. Verfahren zur Transfektion von Fibroblasten, dadurch
gekennzeichnet, daß durch die Transfektion in die
Fibroblasten wenigstens ein Gen eingeschleust wird, das für
einen Wachstumsfaktor, ein Hormon oder ein Enzym kodiert.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es
sich bei dem Wachstumsfaktor um einen hämatopoetischen
Wachstumsfaktor handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch
gekennzeichnet, daß die Transfektion mit einem retroviralen
Vektor bewirkt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch
gekennzeichnet, daß die Transfektion mit einem Vektor bewirkt
wird, der auf Adenoviren oder Rezeptor mediierten Gen
transfer zurückzuführen ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß zur Transfektion Fibroblasten eingesetzt
werden, die nach einem der Verfahren 1 bis 5 erhalten wurden.
13. Gentransfizierte Fibroblasten, dadurch gekennzeichnet,
daß sie nach einem der Verfahren 8 bis 12 erhalten wurden.
14. Gentransfizierte Fibroblasten nach Anspruch 13, dadurch
gekennzeichnet, daß sie bestrahlt wurden.
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