DE4406073A1 - Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten, Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten und so erhaltene Fibroblasten - Google Patents

Description

Bei der Therapie verschiedenster Krankheiten ist es wünschenswert, bestimmte biologisch aktive Moleküle, die auch vom menschlichen Körper produziert werden können, in einer gesteigerten, medizinisch wirksamen Dosierung dem Körper zuzuführen. Die medikamentöse Zuführung von außerhalb des Körpers hergestellten biologisch aktiven Molekülen hat jedoch oft den Nachteil, daß derartige Wirkstoffe häufig, manchmal sogar mehrmals täglich appliziert werden müssen, wobei eine einfache subkutane Applikation oft nicht ausreicht, sondern mehrmals täglich intravenöse Gaben erforderlich sind.

Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem solche Zellen zur Verfügung gestellt werden, die derart verändert wurden, daß sie biologisch aktive Moleküle produzieren können.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten offenbart, sowie ein Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten.

Bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden dem Spender zunächst Gewebeproben von der Serosa und in bevorzugter Form von der Haut entnommen, wobei diese Proben eine Größe von 0,5 bis etwa 2 cm² aufweisen können. Derartige Gewebeproben können durch bekannte chirurgische Routineverfahren der Biopsie entnommen werden.

Die im Rahmen der Biopsie erhaltenen Proben werden dann mit einem Skalpell oder einem vergleichbaren Gerät in Teile von weniger als 2 mm Durchmesser zerkleinert. Diese Teile können dann auf Zellkulturplatten mit der Epidermisschicht nach oben ausgelegt werden. Als Kulturmedium kann in bevorzugter Weise Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum und den üblichen Zusatzstoffen verwendet werden.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich herausgestellt, daß es vorteilhafter ist, wenn die Gewebeproben zunächst nur auf eine Größe von etwa 0,5 cm² zerkleinert werden und diese Teile dann in Kulturmedium (DMEM) inkubiert werden, wobei das Medium die Zellvereinzelung fördernde Enzyme enthält. Als derartige die Zellvereinzelung fördernde Enzyme werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt Collagenase, Dispase (eine neutrale Protease) oder Hyaluronidase eingesetzt, wobei die Enzyme entweder einzeln oder in verschiedenen Kombinationen verwendet werden können.

Die durch die enzymatische Behandlung freigesetzten Zellen werden anschließend mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und bei einer Dichte von etwa 2 × 10⁴/cm² in Zellkulturflaschen ausgesät.

Die Fibroblastenkulturen werden üblicherweise zweimal pro Woche mit frischen Wachstumsmedium versehen. Wenn die Kulturen Konfluenz erreicht haben, können die Zellen durch Behandlung mit Trypsin/EDTA geerntet werden. Nach Waschen, Zählen, und wieder Aussäen bei 1 × 10⁴ Zellen/cm² beginnt ein neuer Wachstumszyklus.

Es hat sich herausgestellt, daß im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Zugabe von sogenannten Feeder-Zellen vorteilhaft ist. Hierbei werden etwa 5 × 10⁵ bestrahlte Zellen zu etwa 10² klonogenen Fibroblastenzellen in Schalen mit einem Durchmesser von 10 cm gegeben. Die Feeder-Zellen werden mit einer Intensität von etwa 50 Gy bestrahlt. In bevorzugter Weise werden hierzu menschliche embryonale WS-1 Fibroblasten verwendet, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind, oder auch Mäuse NIH3T3 Fibroblasten.

Bei einem besonders wirksamen Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten werden die durch Biopsie erhaltenen Gewebeproben zunächst zerkleinert in Stücke, die nicht mehr als 0,5 cm² aufweisen. Diese Gewebestücke werden dann mit dem Enzym Dispase bei einer Konzentration von 2,5 Einheiten/ml für 16 Stunden bei 4°C verdaut. Nach dem Entfernen der Epidermis werden die Hautzellen in Stücke zerkleinert, die nur wenige Millimeter groß sind. Das so erhaltene Material wird weiter mit einer Mischung von Collagenase (200 Einheiten/ml) und Hyaluronidase (300 Einheiten/ml) für 3 Stunden bei 37^°C im Wasserschüttelbad verdaut. Schließlich werden die Zellen durch ein Sieb mit einer Maschengröße von 70 µm gesiebt, gewaschen und in die Zellkultur überführt.

Es wurde festgestellt, daß von Spendern, die jünger als 60 Jahre waren, nach einer durchschnittlichen Zeit von 89 Tagen (± 8 Tage) etwa 10¹¹ Zellen erhalten werden konnten.

Die anliegende Fig. 1 zeigt, daß die mittlere Verdopplungszeit etwa 4,3 (± 0,6) Tage beträgt. Das weitere Wachstum war deutlich langsamer in einigen Fällen und in manchen Fällen wurde ein Plateau erreicht, was keine Steigerung der Zellzahl mehr zuließ. Bei manchen Kulturen konnte jedoch eine Zellzahl von mehr als 10¹⁵ Zellen erreicht werden, ohne daß eine Abflachung der Kurve beobachtet werden konnte. Es stellte sich heraus, daß die von älteren Spendern stammenden Kulturen langsamere Wachstumsraten haben und eher stagnieren.

Fig. 2 zeigt eine Gegenüberstellung von Fibroblasten in Abhängigkeit von der Art der Herstellung der Zellen. Die enzymatisch hergestellten Fibroblasten zeigten eindeutig eine bessere Fähigkeit der Proliferation als diejenigen, die nur durch mechanische Herstellung aus Hautbiopsien erhalten wurden. Die von verschiedenen Spendern stammenden Zellkulturen zeigten immer dann ein besseres Vermehrungs­ verhalten, wenn die Zellen nach enzymatischer Behandlung hergestellt wurden gegenüber denjenigen Zellen, die nur aus den Biopsieproben herauswuchsen.

Fig. 3 zeigt, daß autologe Fibroblasten auch wirksam aus Peritonealzellen mit Hilfe der enzymatischen Herstellungs­ methode erhalten werden konnten. Zwar wuchsen Serosa- und Hautkulturen anfänglich mit etwa gleichen Raten, jedoch erreichten die diploiden Fibroblasten aus Serosa das Plateau eher als gleich alte Kulturen von Haut.

Im Bezug auf permanent transfizierte Klone ist die Platiereffizienz der diploiden Fibroblasten von großer Bedeutung. Fig. 4 zeigt, daß diploide Fibroblasten ohne "Feeder"-Zellen nur schlecht wuchsen. Durch die Zugabe von bestrahlten menschlichen WS-1 Fibroblasten wurde die Platierungseffizienz auf 9 bis 24% gesteigert. Es wurden von nicht bestrahlten Zellen die Überstände ebenso geerntet wie die von mit 20 und 100 Gy bestrahlten Zellen nach 3 und 8 Tagen. In den Überständen von nicht bestrahlten diploiden Fibroblasten wurden 1,2 bis 1,4 ng Interleukin-6 pro 24 Stunden und 10⁶ Zellen gefunden. Die Bestrahlung änderte nicht wesentlich die Interleukin-6 Sekretion. Nicht bestrahlte diploide Fibroblasten produzierten dagegen nicht nennenswerte Mengen von GM-CSF (colony stimulating factor) oder TNFα (tumor necrose factor), wohingegen nach Bestrahlung in den Überständen bis zu 90 pg GM-CSF und 50 pg TNFα pro 24 Stunden und 10⁶ Zellen gemessen wurden. Die Induktion dieser Zytokine durch Bestrahlung war stark abhängig von den jeweiligen individuellen Kulturen.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren herstellbaren diploiden Fibroblasten können leicht beispielsweise von Krebspatienten erhalten werden. Diese klonogenen Fibroblasten dienen als geeignetes Ausgangsmaterial für die Gentransfektion. Derartig transfizierte Fibroblasten können dann als autologe Zellen den Spendern wieder zugeführt werden.

Die nach dem oben näher beschriebenen Verfahren erhältlichen Fibroblasten können durch Transfektion genetisch manipuliert werden. Bei der Gentransfizierung werden in die klonogenen Fibroblasten ein oder mehrere Gene eingeschleust, die für ein Genprodukt kodieren, das therapeutisch wertvoll ist. Derartige Genprodukte sind Wachstumsfaktoren, insbesondere hämatopoetische Wachstumsfaktoren, aber auch Hormone, wie beispielsweise Insulin, oder Enzyme, wie beispielsweise lysosomale Enzyme oder Adenosindesaminase.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden durch die Transfektion hämatopoetische Wachstumsfaktoren wie G-CSF oder Erythropoetin in die Fibroblasten eingeschleust.

Zur Transfektion sind geeignete Vektoren erforderlich. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein retroviraler Vektor verwendet. Dieser Vektor kann neben den erforderlich essentiellen Genen aus dem retroviralen System weiterhin ein sogenanntes Suizidgen, wie das aus Herpes simplex Virus stammende Thymidinkinase-Gen, enthalten. Dadurch wird eine selektive Abtötung der Zellen in Gegenwart von Gancyclovir erlaubt. Außerdem können die Vektoren induzierbare Promotoren enthalten, die eine Regulation der Genexpression ermöglichen.

Ein Vektor, der bevorzugt verwendet werden kann, ist der retrovirale Vektor N2, der von dem Genom des Moloney Murine Leukemia Virus (MLV) abgeleitet ist und ein bakterielles Neomyzinresistenzgen als selektiven Marker enthält. Die Herkunft der Fragmente und die Restriktionsenzyme, die verwendet wurden, um DNA-Fragmente zu erhalten, die für menschliches Interleukin-2, Mäuseinterferon-γnd Herpex simplex Virus Thymidinkinasepromotor und andere Gene kodieren, wurden bereits beschrieben [Gansbacher et al., J. Exp. Med., 172 (1990) S. 1217-1224; Gansbacher et al., Cancer Res., 50 (1990) S. 7820-7825 und Gansbacher et al., Blood, 80 (1992) S. 2817-2825].

Ein weiterer Vektor, der im vorliegenden Verfahren bevorzugt eingesetzt werden kann, wurde in Science, Vol. 256, April 1992, S. 445 beschrieben. Hierbei handelt es sich um die äußere Hülle eines Adenovirus, bei dem die adenoviralen Gene entweder deletiert oder anderweitig inaktiviert wurden. An die virale Hülle ist ein Antikörper mit einem Lysinschwanz gebunden, wobei der Lysinschwanz an die zu transfizierende DNA bindet. Bei diesem Vektorsystem wird die DNA nicht innerhalb der viralen Hülle verpackt, sondern außen an die virale Hülle angehängt. Dieser Vektor ermöglicht die Transfektion von größeren DNA-Fragmenten.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen humanen klonogenen Fibroblasten können nach den oben beschriebenen Methoden transfiziert werden. Da nur die klonogenen Fibroblasten als Zielzellen für eine stabile Gentransfektion in Frage kommen, sind die so erhaltenen Fibroblasten für die Expression von Fremdgenen sehr geeignet.

Beispielsweise können Fibroblasten, die mit Zytokingenen transfiziert wurden, als sogenannte "Bystander"-Zellen im Rahmen von Vakzinationen gegen Tumoren oder auch zur Prophylaxe von Infektionen eingesetzt werden. Mit anderen Genen transfizierte Fibroblasten können in den Spender zurückgebracht werden und der langfristigen Versorgung des Organismus mit denjenigen Molekülen dienen, die bei der entsprechenden Krankheit fehlen. Hierbei kann es sich beispielsweise um den Blutgerinnungsfaktor VIII, das Protein S, das Protein C, oder auch Insulin, Erythropoetin oder andere hämatopoetische Wachstumsfaktoren handeln. Auch die Bereitstellung von Enzymen wie Glucocerebrosidase oder Adenosindesaminase ist möglich.

Die erfindungsgemäßen Fibroblasten können entweder im autologen System verwendet werden oder auch im allologen System, sofern dies in immunologischer Hinsicht möglich ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Fibroblasten mit Collagen beschichteten Polyvinyl­ pyrrolidon Matrizes kokultiviert und in dieser Form als Organoid intraperitoneal oder subkutan appliziert. Es ist bekannt, daß derartige Objekte in vivo neovaskularisiert werden. Die Menge des in vivo erforderlichen Genproduktes wird über die Menge der transfizierten Zellen gesteuert und gegebenenfalls zusätzlich durch den induzierbaren Promotor. Anstelle der Polyvinylpyrrolidon Matrizes können auch andere geeignete Trägerstoffe wie beispielsweise Polytetrafluor­ ethylenfasern verwendet werden, die dann mit einem geeigneten Beschichtungsmittel wie Collagen überzogen werden. Diese Fasern können dann in eine extrazelluläre Gelmatrix einge­ bettet werden und beispielsweise durch einen kleinen chirur­ gischen Eingriff intraperitoneal appliziert werden.

Beispiel 1 a) Biopsien

Mit Hilfe von routinemäßigen chirurgischen Eingriffen wurden Haut- und Serosaproben von etwa 0,5-2 cm² erhalten von 50 Spendern, die an Krebs erkrankt waren. Die Biopsieproben wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) aufbewahrt und am Tag der Entnahme weiterbearbeitet.

b) Mechanische Behandlung

Die Biopsieproben wurden mit einem Skalpell in Stücke von weniger als 2 mm Durchmesser geschnitten. Diese Stücke wurden dann auf Zellkulturplatten mit der Epidermis nach oben ausplatiert. Als Wachstumsmedium wurde DMEM (Gibco BRL) mit hohem Glucosegehalt, das 10% fötales Kälberserum (Boehringer Mannheim) enthielt und mit L-Glutamin und Natriumpyruvat angereichert wurde, verwendet.

c) Enzymatische Behandlung

Nachdem die Biopsieproben in Stücke von weniger als etwa 0,5 cm² zerkleinert wurden, wurden diese Proben mit DMEM Medium, das Collagenase (Biochrom, Berlin), Dispase (Boehringer Mannheim) oder Hyaluronidase (Sigma, Deisenhofen) entweder einzeln oder in verschiedenen Kombinationen enthielt, inkubiert. Zellen, die durch diese Behandlung in die Suspension freigesetzt wurden, wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in einer Dichte von 2 × 10⁴/cm² in Zellkulturflaschen ausplatiert.

d) Langzeitkultur

Die Fibroblastenkulturen wurden bei 37°C in feuchter Atmosphäre, die 5% CO₂ enthielt, angezogen, wobei zweimal pro Woche frisches Wachstumsmedium hinzugefügt wurde. Sobald die Kulturen Konfluenz erreichten, wurden die Zellen durch Behandlung mit Trypsin/EDTA geerntet, anschließend gewaschen, gezählt und mit einer Dichte von 1 × 10⁴ Zellen/cm² erneut ausgesät. Die Zellzahlen wurden ausgehend von der Anzahl der Zellen und dem Verdünnungsfaktor bei jeder Passage hochgerechnet.

e) Platierungseffizienz

10² Zellen wurden in Kulturplatten mit 10 cm Durchmesser ausplatiert. Am folgenden Tag wurden 5 × 10⁵ menschliche embryonale WS-1 Fibroblasten oder Mäusefibroblasten mit der Bezeichnung NIH3T3 pro Kulturplatte hinzugefügt. Die beiden von der ATCC, Rockville, MD erhältlichen Zellinien dienten als sogenannte Feeder-Zellen nach Bestrahlung mit 100 Gy. Nach 4 Wochen Kultur wurden die Kolonien mit 2% Methylenblau in 50% Ethanol gefärbt und gezählt, wobei während der Kultur­ dauer das Medium alle 2 Wochen gewechselt wurde.

f) Bestimmung der Zytokine

Die Überstände von subkonfluenten Kulturen wurden 24 Stunden nach einem vollständigen Wechsel des Nährmediums geerntet. Die Zellen wurden gezählt und die Zytokinkonzentrationen in den Überständen wurden bestimmt unter Verwendung von kommerziell erhältlichen ELISA-Tests.

Beispiel 2

Die in Beispiel 1 angegebenen Versuchsbedingungen wurden unter Verwendung von verschiedenen Enzymen (Beispiel 1c) durchgeführt, um die Wirksamkeit für die Erstellung von Langzeitkulturen von diploiden Fibroblasten zu ermitteln. Die besten Ergebnisse wurden erhalten, wenn die in kleine Stücke zerschnittenen Biopsieproben zunächst mit Dispase bei einer Konzentration von etwa 2,5 U/ml für 16 Stunden bei 4°C verdaut wurden. Nach dieser Behandlung konnte die Epidermis leicht von den Zellfragmenten entfernt werden. Die Hautzellen wurden dann weiter in Stücke von wenigen mm zerkleinert. Dieses Zellmaterial wurde einer zweiten enzymatischen Behandlung mit einer Mischung von Collagenase (200 U/ml) und Hyaluronidase (300 U/ml) für 3 Stunden bei 37°C im Wasserschüttelbad unterzogen. Schließlich wurden die Zellen durch eine Passage durch ein 70 µm Sieb aufgetrennt, gewaschen und in Zellkultur überführt.

Fig. 1 zeigt, daß diploide Fibroblastenkulturen, die mit Hilfe dieses Verfahrens von Spendern erhalten wurden, die jünger als 60 Jahre alt waren, im allgemeinen ähnliche Wachstumscharakteristiken aufwiesen mit einer mittleren Verdopplungszeit von 4,3 ± 0,6 Tagen.

Fig. 2 zeigt, daß die mit Hilfe des enzymatischen Verfahrens hergestellten Fibroblastenkulturen eindeutig eine bessere Vermehrungskapazität hatten als diejenigen Fibroblasten­ kulturen, die lediglich durch eine mechanische Behandlung der Hautbiopsieproben erhalten wurden.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können diploide Fibroblastenkulturen nicht nur aus Hautzellen erhalten werden, sondern auch von Peritonealzellen. Es zeigte sich, daß die von der Serosa abgeleiteten Zellkulturen anfangs ähnlich wuchsen wie die von der Haut abgeleiteten Zell­ kulturen, wobei aber die von der Serosa abstammenden diploiden Fibroblasten das Plateau bei einer deutlich niedrigeren Zellzahl erreichten als die im Alter vergleich­ baren diploiden Fibroblastenkulturen von Haut. Die Fig. 3 zeigt einen Vergleich der Zellzahlen von Fibroblasten­ kulturen, die entweder von Haut oder von Serosa stammen.

Fig. 4 zeigt den Einfluß von sogenannten Feeder-Zellen auf die Platierungseffizienz der diploiden Fibroblastenkulturen. Es wurden diploide Fibroblastenkulturen von Hautzellen hergestellt, die enzymatisch behandelt wurden. Ihre Platierungseffizienz wurde bestimmt, indem die Zellen in einer sehr geringen Dichte auf den Zellkulturflaschen ausge­ sät wurden. Während die diploiden Fibroblasten ohne Feeder- Zellen kaum irgendeine Koloniebildung unter diesen Bedin­ gungen zeigten, konnte die Platierungseffizienz auf 9-24% durch die Zugabe von bestrahlten menschlichen Fibroblasten der Zellinie WS-1 erhöht werden.

Beispiel 3

Besonderes Augenmerk wurde der Produktion von Zytokinen in den autologen diploiden Fibroblastenkulturen gewidmet. Hierzu wurden Kulturüberstände von nicht bestrahlten diploiden Fibroblasten entnommen und ebenso von diploiden Fibroblasten, die mit 20 bzw. 100 Gy bestrahlt wurden. Die Kulturüberstände der bestrahlten Zellen wurden am 3. und am 8. Tag nach Bestrahlung entnommen.

In den Überständen von nicht bestrahlten diploiden Fibroblasten wurden zwischen 1,2 und 1,4 ng Interleukin-6 pro 24 Stunden und 10⁶ Zellen gefunden. Die Bestrahlung verursachte keine wesentlichen Änderungen bei der IL-6 Sekretion. Im Unterschied dazu produzierten die nicht bestrahlten diploiden Fibroblasten keine meßbaren Mengen an GM-CSF oder TNFα, wohingegen bis zu 90 pg GM-CSF und bis zu 50 pg TNFα pro 24 Stunden und 10⁶ Zellen in den Überständen nach Bestrahlung gemessen werden konnten. Diese Ergebnisse sind in der Fig. 5 dargestellt, wobei die Bezeichnungen HP-33, KE-58 und KP-68 verschiedenen Zellinien angeben.

Beispiel 4

Um die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gentransfizierung von humanen Fibroblasten zu demonstrieren, wurden Vorversuche im Mausmodell durchgeführt, die nach­ folgend näher erläutert werden. Die Ergebnisse aus dem Mausmodell können entsprechend auf menschliche Fibroblasten angewendet werden.

a) Vektor

Der retrovirale Basisvektor N2 leitet sich vom Genom des Moloney-Murine-Leukemia-Virus (MLV) ab und enthält das bakterielle Neomycin-Resistenzgen als Selektionsmarker. Es wurden DNA-Fragmente kodierend für den Major Immediate Early Human CMV-Promotor, den Promotor der Adenosine-Desaminase (ADA-Promotor), das Poly-A-Signal und das Mäuse-GM-CSF in verschiedene Stellen des N2-Vektors kloniert. Das Konstrukt N2-Vektor/CMV-Promotor/Mäuse-GM-CSF wurde durch Klonieren des CMV-GM-CSF-Fusionsprodukts in eine Xho I Restriktionsstelle des Neomycinresistenzgens in dem N2-Vektor hergestellt.

Um den retroviralen Vektor DC/AD/R/GM-CSF herzustellen, wurde der ADA-Promotor in umgekehrter Orientierung in eine mit dem Klenow-Fragment aufgefüllte Restriktionsschnittstelle des Enzyms Mlu I kloniert. Die Mäuse-GM-CSF cDNA wurde ebenfalls in reverser Orientierung in eine durch das Restriktionsenzym SnaB I erzeugte Schnittstelle kloniert und das Poly-A-Signal in eine mit Klenow aufgefüllte Apa I Stelle in den 3′LTR Polylinker. Durch Elektroporation der Vektor-DNA in eine helferfreie echotrope Verpackungszellinie (GP + E-86) wurden die retroviralen Vektoren in die korrespondierenden Viren umgewandelt. Nach G418-Selektion (0,7 mg/ml Genticin, Gibco Labor, Grand Island, NY) wurden Kolonien isoliert und zu Producer-Zellinien expandiert. Zellfreier Überstand wurde zur Titerbestimmung des Virus auf NIH3T3 Zellen getestet.

Fig. 6 zeigt die Struktur der verwendeten retroviralen Vektoren.

b) Zellinien und Infektion der Tumorzellen und Fibroblasten

CMS5 ist ein methylcholantreninduziertes, nicht meta­ stasisches Fibrosarkom aus BALB/c-genetischem Hintergrund. NIH3T3 ist eine kontaktinhibierte Fibroblastenzellinie, die von NIH Swiss Maus-Embryonen etabliert wurde. BALB 3T3 Klon A31 sind kontaktinhibierte, nicht tumorogene Fibroblasten etabliert von BALB/c-Mäuseembryonen. Beide Fibroblastenzell­ linien wurden von ATCC erworben. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium kultiviert, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 pg/ml Streptomycin und 2 mmol/l L-Glutamin. Virus-Producer-Zellinien, die hohe Titer des Virus sezerniert haben, wurden zur Infektion der CMS5-Zellen und der Fibroblastenzellen eingesetzt. Klone oder auch bulk­ infizierte Zellen wurden nach G418-Selektion zu Linien expandiert und weiter analysiert.

c) Zytokinbestimmung

Es wurde die Sekretion von GM-CSF in den Überstand von retroviral infizierten CMS5-Zellen und Fibroblasten und die GM-CSF-Serumkonzentration behandelter Mäuse durch einen Bioassay bestimmt und mit Hilfe eines ELISA-Tests bestätigt. Der Überstand von semikonfluenten parenteralen oder GM-CSF- sezernierenden Zellen wurde nach 24 Stunden gesammelt, die Zellzahl bestimmt und der Überstand hinsichtlich der Produktion von Mäuse-GM-CSF untersucht.

Es wurden jeweils 106 mit 50 Gy bestrahlte CMS5-Zellen oder mit dem Vektor N2/CMV/GM-CSF/CMS5 transfizierte Zellen untersucht. Die Zellen wurden am Tag der Bestrahlung in kleine Gewebekulturflaschen platiert und am 3., 6., 9. und 12. Tag nach der Bestrahlung wurde die GM-CSF Menge im 24 Stunden-Kulturüberstand bestimmt.

Die biologische Aktivität des zu untersuchenden GM-CSF wurde bestimmt durch Ermittlung der Fähigkeit der GM-CSF enthal­ tenden Überstände, eine ³H-Thymidininkorporation in die DNA von GM-CSF abhängigen Mäuse 32DC13-Zellen zu induzieren. Nachdem die Zellen ohne GM-CSF über Nacht inkubiert wurden, wurden 10⁴ Zellen pro Loch einer Mikrotiterplatte mit 96 Löchern inkubiert mit Verdünnungen der Testflüssigkeiten und die Zellen wurden 6 Stunden bei 37°C und 6% CO₂ kultiviert. Hierauf wurde 1 µCi von ³H-Thymidin zugegeben und die Inkubation wurde weitere 15 Stunden bei 37°C fortgeführt. Nach Waschen wurden die Zellen mit Hilfe eines Flüssig- Szintillationszählers ausgewertet. Die GM-CSF-Aktivität wurde als counts per minute (cpm) ausgedrückt und es wurde die Produktion in ng pro 24 Stunden von 10⁶ Zellen berechnet durch Vergleich mit einer Standardkurve von rekombinantem Mäuse-GM-CSF. Darüber hinaus wurde die GM-CSF-Produktion mittels eines ELISA-Tests bestätigt.

Um eine weitere Proliferation wachstumsfaktorproduzierender autologer oder allogener Zellen nach Injektion in vivo zu verhindern, bietet sich die Bestrahlung dieser Zellen an. Es wurden daher GM-CSF-sezernierende Zellen zunächst mit 50 Gy bestrahlt und die GM-CSF-Sekretion bis zu 12 Tage nach Bestrahlung bestimmt. In Abb. 7 ist zu sehen, daß zunächst die GM-CSF-Produktion nach Bestrahlung erhöht wurde. Während vor Bestrahlung etwa 40 ng/10⁶ Zellen/24 Stunden gemessen wurden, liegen am 3. und 6. Tag nach Bestrahlung die Werte bei etwa 130 ng/10⁶ Zellen/24 Stunden. Am 9. Tag fallen die Werte auf die vor Bestrahlung erhaltenen Werte ab und am 12. Tag nach Bestrahlung ist die GM-CSF-Produktion/24 Stunden bei etwa einem Drittel des Ausgangswerts. Da die Zahl der überlebenden Zellen bereits am 6. Tag auf ein Zehntel des Ausgangswerts abgefallen ist, wird deutlich, daß aus bereits nicht mehr vitalen Zellen weiterhin GM-CSF freigesetzt wird.

d) Übertragung der gentransfizierten Zellen in Mäuse

Für die Experimente wurden weibliche BALB/c-Mäuse, die 7-10 Wochen alt waren, eingesetzt. Am Tag 0 und am Tag 2 erhielten alle Mäuse 150 mg/kg Cyclophosphamid intraperitoneal appliziert. Ein Teil der Mäuse erhielt keine weiteren Injektionen, ein zweiter Teil wurde am Tag 3 zweimal täglich mit 100 ng rekombinant hergestelltem Mäuse-GM-CSF subkutan injiziert. Die letzte Gruppe erhielt am Tag 3 insgesamt 10⁷ mit 50 Gy bestrahlte N2/CMV/GM-CSF-CMS5-Zellen an 2 Stellen subkutan injiziert. Ab dem viertem Tag wurde täglich Blut aus den Schwanzvenen der Mäuse in heparinisierte Eppendorf-Gefäße überführt. Die Anzahl der Leukozyten wurde nach Lysieren der Erythrozyten in einer Neubauer-Zellkammer bestimmt. Alle zwei Tage wurden Differentialblutbilder angefertigt und nach Färbung mit May-Grünwald-Giemsa das Differentialblutbild bestimmt. Serumwerte von Mäuse-GM-CSF wurden am Tag 1, 4 und 10 nach Injektion der bestrahlten GM-CSF-sezernierenden Fibrosarkomzellen bestimmt.

Beispiel 5

Weibliche BALB/c-Mäuse wurden wie in Beispiel 4d beschrieben behandelt. Ab dem 3. Tag wurden täglich die peripheren Leukozytenzahlen ermittelt und alle 2 Tage wurde ein Differentialblutbild angefertigt. Die Basisleukozytenzahlen in diesen Mäusestämmen liegen bei etwa 9000 bis 10 000 Leukozyten/µl. Durch die Applikation von Cyclophosphamid sind die Leukozyten am 3. Tag auf etwa 1000 bis 1500 Leukozyten/µl abgefallen. Bis zum 6. Tag nach der Injektion von Cyclophosphamid zeigten sich keine großen Änderungen der Leukozytenwerte. Alle Behandlungsgruppen liegen bei etwa gleichen Werten. Ab dem 7. Tag zeigt sich ein Unterschied in der absoluten Leukozytenzahl zwischen den GM-CSF-behandelten Mäusen und den nur mit Cyclophosphamid injizierten Kontrollmäusen. Die Werte in den mit Wachstumsfaktor behandelten Tieren nach subkutaner Injektion oder einmaliger Injektion von GM-CSF-sezernierenden autologen Zellen liegen etwa doppelt so hoch wie bei den Kontrollmäusen am 7. und 8. Tag nach Beginn der Behandlung. Die mit rekombinantem Wachstumsfaktor behandelten Gruppen, wie die mit GM-CSF- sezernierenden Fibrosarkomzellen behandelten Tiere erreichen die normalen Leukozytenwerte am 8. Tag nach der Cyclo­ phosphamidinjektion. Dagegen liegen die Kontrollmäuse noch bei halb-normalen Werten. In Fig. 8 ist das Differential­ blutbild der verschiedenen Behandlungsgruppen als absolute Leukozytensubpopulationen (Monozyten, Granulozyten und Lymphozyten) angegeben. Bei unbehandelten BALB/c-Mäusen sind im Differentialblutbild etwa 1% Monozyten, 15-30% Granulozyten und 70-85% Lymphozyten vorhanden. Am 5. Tag nach Beginn der Cyclophosphamidbehandlung, also in der Phase der absoluten Neutropenie, sind bei allen Behandlungsgruppen im Differentialblutbild fast ausschließlich Lymphozyten zu finden. Am 7. Tag, an dem die absoluten Leukozytenwerte der mit rekombinatem GM-CSF und mit GM-CSF-sezernierenden Zellen behandelten Mäuse etwa doppelt so hoch wie bei den nur mit Cyclophosphamid behandelten Tieren liegt, ist auch ein deutlicher Unterschied im Differentialblutbild festzustellen. Die nicht mit Wachstumsfaktor behandelten Tiere haben nur etwa 15% der Monozyten und 25% der Granulozyten der subkutan mit GM-CSF oder mit GM-CSF-sezernierenden Fibroblasten behandelten Mäuse, die bereits normale absolute Granulozyten­ zahlen erreicht haben. Es sind keine Unterschiede bei den absoluten Lymphozytenwerten zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen festzustellen.

Fig. 8 zeigt also, daß bereits eine einmalige Injektion bestrahlter gentransfizierter autologer Zellen biologische Effekte auf das Blutbild von chemotherapiebehandelten Mäusen zeigt.

Beispiel 6

In Fig. 9 wird die Anzahl der Leukozyten, die sich im Verlauf der Zeit ändert, dargestellt. Die Mäuse wurden jeweils mit Cyclophosphamid behandelt. Eine Kontrollgruppe erhielt kein GM-CSF. Bei einer weiteren Kontrollgruppe wurde rekombinant hergestelltes GM-CSF subkutan injiziert. Bei der dritten Gruppe wurden gentransfizierte Zellen subkutan appliziert, die GM-CSF produzierten.

Claims (14)

1. Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Spender Gewebe entnimmt und die Zellen aus dem Gewebe vereinzelt, die so entstandene Zellsuspension siebt, die in der Zellsuspension enthaltenen Zellen wäscht und die Zellen in eine Gewebekultur überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe dem Spender im Rahmen einer Biopsie aus der Haut entnommen wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vereinzelung der Zellen durch eine mechanische und eine enzymatische Behandlung erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei der enzymatischen Behandlung Collagenase, Dispase und/oder Hyaluronidase eingesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten in Gegenwart von bestrahlten humanen oder murinen Fibroblasten als "Feeder"- Zellen angezogen werden.

6. Humane, klonogene Fibroblasten, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 erhalten wurden.

7. Fibroblasten nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es diploide Fibroblasten sind.

8. Verfahren zur Transfektion von Fibroblasten, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Transfektion in die Fibroblasten wenigstens ein Gen eingeschleust wird, das für einen Wachstumsfaktor, ein Hormon oder ein Enzym kodiert.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Wachstumsfaktor um einen hämatopoetischen Wachstumsfaktor handelt.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion mit einem retroviralen Vektor bewirkt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion mit einem Vektor bewirkt wird, der auf Adenoviren oder Rezeptor mediierten Gen­ transfer zurückzuführen ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß zur Transfektion Fibroblasten eingesetzt werden, die nach einem der Verfahren 1 bis 5 erhalten wurden.

13. Gentransfizierte Fibroblasten, dadurch gekennzeichnet, daß sie nach einem der Verfahren 8 bis 12 erhalten wurden.

14. Gentransfizierte Fibroblasten nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie bestrahlt wurden.