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Hintergrund
der Erfindung
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Die
maligne Transformation ist durch die Entkopplung der Proliferation
und Differenzierung gekennzeichnet, was zu einer andauernden Amplifikation
der Zellen einhergehend mit dem Verlust ihrer Fähigkeit führt, zur Differenzierung überzugehen.
Mittel, die in der Lage sind die Differenzierungsfähigkeit
von Krebszellen wiederherzustellen, sind demnach in der Krebstherapie
potentiell nützlich.
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Es
wurde von verschiedenen Extrakten, Proteinen und Chemikalien gezeigt,
dass sie die Differenzierung von bestimmten Krebszellen in vitro
und in vivo induzieren. Zum Beispiel stellt Sachs et al. (1987),
Cancer Research 47: 1981 einen Review über die Induktion und Differenzierung
von myeloiden hämatopoetischen Leukämiezellen
bereit, einschließlich
von Beobachtungen, dass myeloide Leukämiezellen durch ein normales Differenzierungsprotein
in vitro und in vivo induziert werden können zu differenzieren. Tallman
et al. (1992) J. Clin. Pharmacol, 32: 868 besprechen die Rolle von
Retinoiden bei der Krebsbehandlung. Retinoide wurden als Differenzierungsmittel
zur Prävention
und Therapie von Blasen- und Brustkrebs und Leukämien untersucht. Platica et
al. (1992) Endocrinology 131: 2573 berichten, dass Extrakte aus
einer bovinen Hypophyse und einem mammosomatotropen Tumor in Ratten
die Differenzierung von Rattenbrusttumorzellen induzieren.
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Die
Differenzierungsmittel, die durch in vitro-Studien und in vivo-Studien in Nagern
identifiziert wurden, sind auch klinisch beurteilt worden. Zum Beispiel
haben Differenzierungsmittel, einschließlich von Hexamethylenbisacetamid
und Retinolsäure,
die klinischen Versuche für
die Krebsbehandlung und -prävention
erreicht und wurden von Linskey et al. (1995) Neurosurgery 36: 1
besprochen. Von der erfolgreichen Verwendung von Differenzierungsmitteln
zur Behandlung von akuter promyelotischer Leukämie ist durch Warrell et al.
(1993) New Engl. J. Med. 329: 177 berichtet worden. Von Retinoiden
wurde durch Lippmann et al. (1993) J. Natl. Cancer Inst. 85: 499
gezeigt, dass sie therapeutisch in der Behandlung von Gebärmutterhalskrebs
nützlich
sind.
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Die
klinische Verwendung von Differenzierungsmitteln um Krebszellen
zu induzieren zu differenzieren und folglich normalere Merkmale
anzunehmen, wurde Differenzierungstherapie (Englisch: Differentiation
Therapy) genannt. Die Differenzierungstherapie stellt einen alternativen
Ansatz zur konventionellen Krebstherapie wie der zytotoxischen Chemotherapie
bereit. Dementsprechend gibt es einen Bedarf auf diesem Gebiet zur Identifikation
und Isolation oder Synthese von neuen Mitteln, die in der Lage sind
die Differenzierung von Krebszellen zu fördern.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen hypophysären Differenzierungsfaktor
(PDF), einen Faktor der Hypophyse, der in der Lage ist Zellen zu
differenzieren, einschließlich
von Brustkrebs- und Prostatakrebzellen.
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In
einer Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung isolierte Nukleinsäuren bereit,
die für
den PDF kodieren. Es werden ferner Vektoren und Wirtszellen bereitgestellt,
die die isolierten Nukleinsäuren,
welche den PDF kodieren, enthalten.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt den isolierten und aufgereinigten
PDF und biologisch aktive Analogons und Fragmente davon bereit,
und sie stellt ein Verfahren zur Herstellung des PDF's und der biologisch
aktiven Analogons und Fragmente davon bereit.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ferner eine Verfahren zur Förderung
der Differenzierung von Brustkrebs- und Prostatakrebszellen bereit,
umfassend die Kontaktierung der Brust- und Prostatakrebszellen mit
einer Differenzierungs-fördernden
Menge eines PDF's.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von Brust-
oder Prostatakrebs bereit, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch
wirksamen Menge des PDF's
an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf.
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In
einer weiteren Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen
bereitgestellt, die den PDF oder biologisch aktive Analogons oder
Fragmente davon umfassen, vermischt mit einem pharmazeutisch akzeptablen
Träger.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 stellt
humane MCF-7-Brustkrebszellen in konditioniertem Medium in Abwesenheit
des PDF's dar.
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2 stellt
humane MCF-7-Brustkrebszellen dar, die mit dem Lysat von Oocyten
behandelt wurden, welchen cDNA injeziert wurde, die für den PDF
kodiert, und illustriert die Aggregation, die durch den PDF induziert
wird.
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3 stellt
DU145 Prostatakrebszellen dar, die in Abwesenheit des PDF's kultiviert wurden.
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4 illustriert
die morphologischen Veränderungen,
einschließlich
der Aggregation und der Sphäroidformation,
die durch den PDF bei den DU145-Zellen induziert werden.
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5 zeigt
die Nukleinsäuresequenz
von SEQ:ID:NO 1.
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6 ist
ein Graph, der die Wirkung des Oocytenlysats, welches den PDF enthält, auf
die Sphäroidformation
von MCF-7-Zellen demonstriert.
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7 ist
ein Graph, der die Wirkung des PDF's auf die Sphäroidformation von Du-145-Zellen
demonstriert.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen hypophysären Differenzierungsfaktor
(PDF). Der PDF ist ein Polypeptid, das aus einer Säugetierhypophyse
und hypophysären
Tumoren, einschließlich MtTW10,
erhalten werden kann. Der PDF fördert
die Differenzierung von Zellen, einschließlich von Brustkrebs- und Prostatakrebszellen.
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In
einer Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung eine isolierte Nukleinsäure bereit,
die für
den PDF kodiert. Es wurde eine Plasmid, bezeichnet mit pBS-PDF1,
welches eine 2,2 kb cDNA enthält,
die für
den PDF kodiert, bei der American Type Culture Collection (ATCC),
21301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 hinterlegt und ihm
die Accession Number ATCC 97648 erteilt.
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In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung kann eine isolierte Nukleinsäure, die
für den
PDF kodiert, aus einer Säugetierhypophyse
mittels Expressionsklonierung erhalten werden. Eine Säugetierhypophysen- cDNA-Bibliothek kann
durch Verfahren hergestellt werden, die Fachleuten mit gewöhnlichen
Kenntnissen auf dem Gebiet bekannt sind, wie von Sambrook et al.
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY beschrieben.
Außerdem
sind Säugetierhypophysen-cDNA-Bibliotheken
kommerziell erhältlich,
zum Beispiel von Clontech, Palo Alto, CA. Eine humane Hypophysenbibliothek
wird bevorzugt.
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Eine
isolierte Nukleinsäure,
die für
den PDF kodiert, wurde aus einer Säugetier-cDNA-Bibliothek durch die
Expression der cDNA-Klone der Bibliothek und durch die Beurteilung
des exprimierten Produkts hinsichtlich der PDF-Aktivität in einem
funtionalem Nachweis erhalten. Fachleuten mit gewöhnlichen
Kenntnissen auf dem Gebiet sind verschiedene Expressionssysteme
bekannt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden
Xenopus-Oocyten als Wirt für
die Expression der hypophysären
cDNA verwendet. Die Verwendung von Xenopus-Oocyten für die Expression
von exogenen Nukleinsäuren
ist im Stand der Technik bekannt und beschrieben, zum Beispiel von
Gurdon et al. (1983) Methods in Enzymology 101: 370. Expressionsvektoren,
die die hypophysäre
cDNA unter der Kontrolle eines starken Promotors enthalten, können in
die Nuclei der Oocyten injeziert werden und die Oocyten danach für ein bis
mehrere Tage inkubiert werden, gefolgt von der Beurteilung des Oocytenlysats
oder konditioniertem Mediums (CM) hinsichtlich der PDF-Aktivität. Alternativ
kann die mRNA in vitro von der hypophysären cDNA synthetisiert werden
und in die Oocyten injeziert werden, gefolgt von der Beureilung
des Oocytenlysats oder des CM hinsichtlich einer PDF-Aktivität wie unten
beschrieben. Die hypophysäre
cDNA kann in Pools aufgeteilt werden, von welchen die RNA synthetisiert,
in Oocyten injeziert und auf die funktionale Aktivität getestet
wird. Positive Pools werden in Unterpools unterteilt und das Protokoll
wird wiederholt bis eine einzige cDNA identifiziert wird, die für den PDF
kodiert.
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Die
Bionachweise, die für
die Identifikation des PDF's
nützlich
sind, basieren auf der Fähigkeit
des PDF's die Differenzierung
von Brust- und Prostatakrebszellen zu fördern. Alle beliebigen Brust-
oder Prostatakrebszellen, die auf die Differenzierungs-induzierende
Aktivität
des PDF's wie hierin
beschrieben reagieren, sind für
die Verwendung in dem Bionachweis der vorliegenden Erfindung geeignet.
Es sind verschiedene kultivierte Brust- und Prostatakrebszellen
von der ATCC erhältlich.
In einer bevorzugten, nicht einschränkenden Ausführungsform
der Erfindung sind die Brustkrebszellen, die für den Bionachweis verwendet
werden, Brustkrebszellen aus Ratten der Linie MTW9/P1, erhältich von
D. Sirbascu, University of Texas Medical School, Houston, TX, oder
humane MCF-7-Brustkrebszellen,
erhältlich
von der ATCC. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammen die Prostatakrebszellen
von der humanen Prostatazelllinie DU145, erhältlich von der ATCC.
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Die
Behandlung von Brust- oder Prostatakrebszellen mit dem PDF veranlasst
die undifferenzierten Krebszellen sich zu differenzieren. Die Differenzierung
kann mittels morphologischen und biochemischen Parametern gemessen
werden, die im Einklang mit der Differenzierung zu der Struktur
normaler Brust- oder Prostatadrüsen
stehen. Die Krebszellen, die normalerweise in Kultur als Einzelzellsuspensionen
wachsen, aggregieren und bilden innerhalb einer 24-stündigen Behandlung
mit dem PDF Sphäroide.
Die Aggregation kann gemessen werden, indem die suspendierten Einzelzellen
entfernt und gezählt
werden, dann die verbleibenden aggregierten und adhärenten Zellen
abgelöst
und gezählt
werden und dann der Prozentsatz der Gesamtzellzahl, die aggregiert
haben, bestimmt wird. Eine statistisch signifikante Zunahme der
Aggregation der behandelten Zellen verglichen mit den unbehandelten
Zellen ist eine Beweis für
eine PDF-Aktivität.
Die Messung der Aggregation stellt folglich einen einfachen und
zweckmäßigen Bionachweis
für die
PDF-Aktivität
bereit.
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Der
Aggregationsbionachweis kann wie folgt durchgeführt werden. Es werden etwa
1 × 105 Brustkrebszellen, zum Beispiel MTW9/P1-Zellen
in 1 ml serumfreien Dulbecco's
modified Eagles's
Medium (DMEM) in An- oder Abwensenheit des Expressionsprodukts der
hypophysären
cDNA mit einer Konzentration von etwa 10 ng/ml bis etwa 10 μg/ml gewachsen.
Die Kulturen werden bei 37°C
in einer 5% CO2-Atmosphäre für etwa 72 Stunden kultiviert.
Die suspendierten Einzelzellen werden entfernt, indem sie mit serumfreiem
DMEM gespühlt
und dann gezählt
werden. Die verbleibenden aggregierten und adhärenten Zellen werden durch
Trypsinisierung mit Trypsin-EDTA für 5 Minuten abgelöst und dann
gezählt.
Die Zellen werden zweckmäßig gezählt, indem
sie unter dem Lichtmikroskop auf mit Gittern versehenen Kulturplatten
betrachtet werden. Eine Dosis-Response-Zunahme der Aggregation als
Antwort auf die Behandlung mit dem Expressionsprodukt der hypophysären cDNA
zeigt an, dass die cDNA für
einen PDF kodiert.
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Ein
Nachweis für
die Sphäroidformation
kann wie folgt durchgeführt
werden. Es werden etwa 1 × 105 Prostatakrebszellen, zum Beispiel DU145-Zellen, in RPMI 1640-Medium
(Sigma), versetzt mit 10% fötalem Rinderserum
(FBS) (Bio Whittacker, Walkersville, MD) und 10 IU Penicillin/ml
und 50 mg Streptomycin/ml, bei 37°C
in einer 5% CO2-Athmosphäre wachsen gelassen. Die Kulturen
werden mit verschiedenen Konzentrationen des PDF's, zum Beispiel mit 50–300 μg/ml Kultur
behandelt. Nach 72 Stunden werden die Kulturen auf die Bildung von
Sphäroiden
gezählt.
Sphäroide
sind als multizelluläre
Aggregate ohne eine individuell unterscheidbare Zellmorphologie
definiert. Die Kulturen werden zweckmäßig gezählt, indem sie unter dem Lichtmikroskop
auf mit Gittern versehenen Kulturplatten betrachtet werden und die
Sphäroide
gezählt
werden. Eine Dosis-Response-Zunahme der Sphäroidformation zeigt eine PDF-Bioaktivität an.
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In
einer Modifikation des vorhergegangenen Aggregationsbionachweises
können
die Aggregation und die Sphäroidformation
mittels Licht- oder Elektronenmikroskopie von fixierten Schnitten
detektiert werden. Nach der Kultivierung und Behandlung der Zellen
wie oben beschrieben werden die kultivierten Zellen fixiert und
für die
Mikroskopie durch Verfahren geschnitten, die im Stand der Technik
bekannt sind. Zum Beispiel werden die kultivierten Zellen in 1,5%
Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylatpuffer für eine Stunde fixiert. Die
Pellets, welche durch eine Niedriggeschwindigkeitszentrifugation
erhalten wurden, werden in 1,5% Osmiumtetroxid in Collidinpuffer
für 30
Minuten und gefolgt von 30 Minuten in Uranylacetat in Maleatpuffer
nachfixiert und dann dehydriert und in Epon 812 eingebettet. Für die Lichtmikroskopie
werden 1 μm
Schnitte mit Methylenblau, Azure-II und basischem Fuchsin gefärbt. Für die Elektronenmikroskopie
werden 60 bis 90 nm Schnitte geschnitten und mit Uranylacetat-Bleicitrat
gefärbt.
Die Aggregation und Sphäroidformation
kann dann unter dem Licht- oder Elektronenmikroskop sichtbar gemacht
werden. Eine statistisch signifikante Zunahme in der Aggregation und
Sphäroidformation
der behandelten Zellen verglichen mit unbehandelten Zellen ist ein
Beweis für
eine PDF-Bioaktivität.
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Die
Behandlung von Brustkrebszellen mit dem PDF bewirkt andere Effekte,
die mittels Mikroskopie beobachtet werden können, was folglich weitere
PDF-Nachweise bereitstellen. Durch Lichtmikroskopie kann beobachtet
werden, dass PDF-behandelte Zellen eine kleinere Größe haben
als unbehandelte Zellen und dass sie übereinstimmtend mit der Drüsenformation
in Organoidstrukturen geklustert sind. Mittels Elektronenmikroskopie
kann beobachtet werden, dass die behandelten Zellen kleiner sind
und kleinere Nuklei haben als die unbehandelten Zellen. Ferner ist
das Cytoplasma reich an polarisierten Organellen wie Lysosomen und
endoplasmatisches Retikulum im Gegensatz zu unbehandelten Zellen,
die ein vakuolisiertes Cytoplasma mit wenig Organellen mit Ausnahme
der Mitochondrien haben.
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Die
Brustkrebszellen, die mit dem PDF behandelt wurden, machen biochemische
Veränderungen durch,
die zusätzliche
Bionachweise für
den PDF bereitstellen. Speziell wird Lactalbumin, das nur von differenzierten
Brustzellen sekretiert wird, von den PDF-behandelten MTW9/P1-Zellen
aber nicht von den unbehandelten Zellen produziert. Demnach stellt
die Synthese von Lactalbumin, wie sie zum Beispiel durch konventionelle
Northern- oder Westernblots, histochemische Techniken oder Immunassays
nachgewiesen wird, einen weiteren Bionachweis für den PDF bereit.
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Durch
die vorhergegangenen Klonierungsverfahren und Bionachweise wurde
eine isolierte cDNA identifiziert, die für den PDF kodiert. Es wurde
folglich in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass eine einzige
Nukleinsäure,
die für
ein einziges Polypeptid kodiert, die hypophysäre Differenzierungaktivität regelt.
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Die
isolierte Nukleinsäure,
die für
den PDF kodiert, kann zusätzlich
durch ihre Nukleotidsequenz charakterisiert werden. Die Nukleotidsequenzierung
kann von Fachleuten auf dem Gebiet durch bekannte Verfahren durchgeführt werden,
einschließlich
von zum Beispiel dem Dideoxy-Kettenterminationverfahren von Sanger
et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463. Eine isolierte Nukleinsäure, die
in Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung für
den PDF kodiert, enthält
die Sequenz, dargelegt in SEQ ID NO: 1 in 5.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst isolierte Nukleinsäuren, die aus einer Säugetierhypophse
und hypophysären
Tumoren erhalten werden können
und für
den PDF kodieren, ein Polypeptid, dass die Fähigkeit hat die Differenzierung
von Brustkrebszellen zu fördern,
wie durch igendeinen der oben beschriebenen Bionachweise festgestellt
werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist
die Nukleinsäure die
2,2 kb Nukleinsäure,
die in dem PLasmid pBS-PDF1 enthalten ist. In einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform
ist die isolierten Nukleinsäure
ein zusammenhängendes
Fragment des 2,2 kb-Inserts, worin das Fragment für den biologisch
aktiven PDF kodiert. Fachleute auf dem Gebiet können Fragmente des 2,2 kb-Inserts
durch konventionelle molekularbiologische Techniken erhalten, Expressionsvektoren
herstellen, die die Fragmente enthalten, die Nukleinsäure exprimieren
und das resultierende Produkt für
die PDF-Aktivität
wie oben beschrieben nachweisen, um die Fragmente, die für den PDF
kodieren, zu identifizieren.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, ist die isolierte Nukleinsäure, die für den PDF
kodiert, in dem 2,2 kb-Fragment
des Plasmids pBS-PDF1 enthalten. Die vorliegende Erfindung umfasst
ferner Analogons der Nukleinsäure,
die in dem 2,2 kb-Fragment des Plasmids pBS-PDF1 enthalten ist,
worin die besagten Analogons für
den PDF kodieren. Zum Beispiel kann ein Fachmann auf dem Gebiet, der über das
Wissen der Degeneration des genetisches Codes verfügt, die
Nukleinsäuresequenz
bestimmen, die für
die Aminosäuresequenz
kodiert, die von dem Insert des Plasmids pBS-PDF1 kodiert wird.
Ferner kann die Sequenz ausgewählt
werden, um die Expression in einem bestimmten Wirtsorganismus durch
die Verwendung von Codons zu optimieren, von denen bekannt ist,
dass sie von dem Wirtsorganismus der Wahl bevorzugt verwendet werden.
Zusätzlich
können
Analogons hergestellt werden, indem Reste substituiert oder deletiert
werden, die nicht für
die biologische Aktivität
nötig sind.
Solche Analogons können
mittels den Bionachweisen, die oben beschrieben werden, identifiziert
werden.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst ferner Nukleinsäuren, die aus einer Säugetierhypophyse
oder hypophysären
Tumoren isolierbar sind und in der Lage sind unter hochstringenten
Bedingungen an das 2,2 kb-Insert des Plasmids pBS-PDF1 zu hybridisieren
und ferner in der Lage sind für
den biologisch aktiven PDF zu kodieren. Hochstringente Hybridisierungsbedingungen
sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und werden zum Beispiel in
Sambrook et al. und Beltz et al. (1983) Methods Enzym. 100: 266
beschrieben. Hochstringente Bedingungen schließen zum Beispiel eine Hybridisierung
bei 68°C
in einer wässerigen
gepufferten Lösung oder
bei 42°C
in 50% Formamid ein. Die Fähigkeit
der isolierten Nukleinsäure
der vorliegenden Erfindung für den
biologisch aktiven PDF zu kodieren, kann durch die funktionalen
Nachweise, die oben beschrieben sind, bestimmt werden.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf Vektoren, die die
isolierten Nukleinsäuren
der vorliegenden Erfindung umfassen. Die Vektoren sind für die Amplifikation
und/oder Expression der Nukleinsäuren, die
für den
PDF kodieren, nützlich.
In einer Ausführungsform
umfassen die Vektoren der Erfindung die Nukleinsäure, die für den PDF kodiert, wirksam
verbunden mit geeigneten transkriptionalen und/oder translationalen regulatorischen
Elementen, um die Expression des PDF's in einer geeigneten Wirtszelle zu
bewirken. Die regulatorischen Elemente können von Säugetiergenen, mikrobiellen,
viralen oder Insektengenen stammen und zum Beispiel Promotoren,
Enhancer, Transkriptions- und Translationsinitiationssequenzen,
Terminationssequenzen, Replikationsursprünge und Sequenzen einschließen, die
für Leader-
oder Transportsequenzen kodieren. Geeignete regulatorische Elemente
werden nach der optimalen Expression in einer gewünschten Wirtszelle
ausgewählt.
Brauchbare Expressionsvektoren können
durch Verfahren konstruiert werden, die einem Fachmann auf dem Gebiet
bekannt sind, und sind auch kommerziell erhältlich. Rekombinante virale
Vektoren, einschließlich
retroviraler, parvoviraler, densoviraler und baculoviraler Vektoren,
werden besonders bevorzugt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung umfasst der Expressionsvektor einen starken konstitutiven
oder induzierbaren Promotor, der wirksam mit einer Nukleinsäure, die
für den
PDF kodiert, verbunden ist. Geeignete Promotoren sind gut bekannt
und für
Fachleute auf dem Gebiet fertig erhältlich und schließen zum
Beispiel baktrielle, Hefe-, virale, Säugetier- und Insektenpromotoren
ein. Expressionsvektoren, die mit Insekten- und Säugetierzellen
kompatibel sind, werden besonders bevorzugt.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt Wirtszellen bereit, die eine Nukleinsäure umfassen,
die für
den PDF kodiert. Die Wirtszellen, die die Nukleinsäure umfassen,
sind für
die Replikation und Expression der Nukleinsäure, die für den PDF kodiert, brauchbar.
Die Wirtszelle kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein, einschließlich von
bakteriellen, Hefe-, Insekten- oder Säugetierzellen. Insekten- und Säugetierzellen
werden bevorzugt. Besonders bevorzugte Wirtszellen sind Insektenzelllinien,
die zum Beispiel Spodoptera frugiperda- und Trichoplusiani-Zellen
einschließen.
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Die
isolierten Nukleinsäuren
oder Expressionsvektoren können
in die Wirtszellen durch Verfahren eingeführt werden, die einem Fachmann
auf dem Gebiet bekannt sind, einschließlich von Transformation, Transfektion
und Infektion. Zum Beispiel kann eine Transfektion durch bekannte
Verfahren wie einer Liposomen-vermittelte Transfektion, einer Calciumphosphat-vermittelte Transfektion,
einer Transfektion mit nackter DNA, einer Mikroinjektion und einer
Elektroporation durchgeführt
werden. Transformationsverfahren für prokaryotische Zellen werden
zum Beispiel von Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
69: 2110 beschrieben. Die Transformation von eukaryotischen Wirtszellen
wird zum Beispiel von Sambrook et al. beschrieben.
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Es
werden auch Expressionssysteme, die baculovirale Vektoren und Insektenwirtszellen
verwenden, bevorzugt. Die Verwendung von Baculoviren als rekombinante
Expressionsvektoren, um Lepidoptera-Insektenzellen zu infizieren
sind im Stand der Technik bekannt und werden zum Beispiel von Luckow
et al. (1988) BioTechnology 6: 47 beschrieben.
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf den isolierten und
aufgereinigten PDF und die biologisch aktiven Analogons und Fragmente
davon. In einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung hat der isolierte und aufgereinigte PDF
eine Aminosäuresequenz,
die von der DNA in dem Plasmid pBS-PDF1 kodiert wird.
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Der
isolierte und aufgereinigte PDF kann durch die Einführung einer
Nukleinsäure,
die für
den PDF kodiert, zum Beispiel durch Transformation, Transfektion
oder Injektion, die Kultivierung der Wirtszelle unter Bedingungen,
die für
die Expression geeignet sind, und die Rückgewinnung des rekombinanten
PDF's hergestellt
werden. Der rekombinante PDF kann aus den Zellen oder dem Kulturmedium
mittels Proteinaufreinigungsverfahren, die im Stand der Technik
bekannt sind, zurückgewonnen
werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird
ein Expressionsvektor in Insekten- oder Säugetierwirtszellen eingeführt, der eine
Nukleinsäure
unter der Kontrolle eines geeigneten Promotors umfasst, die für den PDF
kodiert.
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Biologisch
aktive Analogons oder Fragmente des PDF's werden auf ähnliche Weise hergestellt,
wobei eine Nukleinsäure,
die für
ein biologisch aktives Analogon oder Fragment des PDF's kodiert, verwendet
wird. Das isolierte rekombinante Analogon oder Fragment kann mit
dem oben beschriebenen Bionachweis identifiziert werden. Der Begriff "Analogons" schließt Substitutionen
und Alterationen der Aminosäuresequenz
des PDF's ein, wobei
die Substitutionen und Alterationen die biologische Aktivität des PDF's aufrechterhalten.
Aminosäureinsertionsderivate
schließen
amino- und carboxyterminale Fusionen und einzelne oder vielfache
Intrasequenzinsertionen ein. Deletionsvarianten haben eine oder
mehrere Aminosäuren
aus der Sequenz entfernt. Bei Substitutionsaminosäurevarianten
wurde wenigstens ein Rest entfernt oder durch einen anderen Rest
ersetzt. Biologisch aktive Fragmente sind Fragmente des PDF's oder der PDF-Analogons, die nicht
die volle Länge
des PDF-Polypeptids umfassen, die aber die biologische Aktivität des PDF's aufrechterhalten.
Die biologisch aktiven Analogons und Fragmente können durch rekombinante Verfahren,
wie zum Beispiel von Sambrook et al. beschrieben, hergestellt werden
oder durch Peptidsynthesetechniken, die im Stand der Technik gut bekannt
sind wie der Festphasenpeptidsynthese.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Förderung der Differenzierung
von Brustkrebs- oder Prostatakrebszellen bereit, das die Kontaktierung
der Brust- oder Prostatakrebszellen mit einer Menge des PDF's oder eines Analogons
oder Fragments davon umfasst, die wirksam die Differenzierung fördert. Eine Menge
des PDF's, die wirksam
die Differenzierung fördert,
ist die Menge, die die Differenzierung von Krebszellen durch irgendeinen
der oben beschriebenen Differenzierungsbionachweise fördert.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von Brustkrebs
bereit, umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen
Menge des PDF's
oder eines Analogons oder Fragments davon an einen Patienten, der
einer solchen Behandlung bedarf. Eine therapeutisch wirksame Menge
des PDF's für die Brustkrebsbehandlung
ist eine Menge, die zu einer Veränderung
im Verhalten der bewachten (Englisch: sentinel) Tumormassen führt wie
der morphologischen oder biochemischen Differenzierung, Reduktion
der Tumormarker, Tumorregression, Apoptose oder partiellen Einstellung des
Tumorwachstums oder der Tumorinvasion. Der PDF wird als pharmazeutische
Zusammensetzung verabreicht, die den PDF oder ein biologisch aktives
Analogon oder Fragment davon und einen pharmazeutisch akzeptablen
Träger
enthält.
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Eine
weitere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Behandlung von Prostatakrebs
bereit, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen des
PDF's oder eines
Analogons oder Fragments davon an einen Patienten umfasst, der einer
solchen Behandlung bedarf. Eine therapeutisch wirksame Menge des
PDF's für die Prostatakrebsbehandlung
ist eine Menge, die zu einer Veränderung
im Verhalten der bewachten Tumormassen wie oben beschrieben führt. Der
PDF wird als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, die den
PDF oder ein biologisch aktives Analogon oder Fragment davon und
einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthält.
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Die
Formulierung der pharmazeutischen Zusammensetzungen ist im Allgemeinen
im Stand der Technik bekannt und es kann zweckmäßig auf Remington's Pharmaceutical
Sciences, 17. Auflage, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania
verwiesen werden. Die Formulierung des PDF's oder biologisch aktiver Analogons und
Fragmente davon für
die Verwendung in der vorliegenden Erfindung muß unter den Herstellungs- und
Lagerbedingungen stabil sein und muß auch vor der kontaminierenden
Wirkung von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen bewahrt werden.
Die Bewahrung vor der Kontamination mit Mikroorganismen kann durch
die Zugabe von verschiedenen antibakteriellen und antifungalen Mittel
erreicht werden.
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Die
pharmazeutischen Formen des PDF's,
die zur Verabreichung geeignet sind, schließen sterile wässerige
Lösungen
oder Dispersionen und steriel Pulver für die extemporane Herstellung
von sterilen injezierbaren Lösungen
oder Dispersionen ein. In allen Fällen muss die Form steril und
zu einem Ausmaß flüssig sein, dass
eine leichte Spritzbarkeit besteht. Typische Träger schließen ein Lösungs- oder Dispersionsmedium
ein, das zum Beispiel Wasser, gepufferte wässerige Lösungen (dass heißt biokompatible
Puffer), Ethanol, Polyole wie Glycerol, Propylenglycol, Polyethylenglycol,
geeignete Mischungen davon, oberflächenaktive Stoffe oder pflanzliche Öle umfasst.
Die Sterilisation kann durch eine im Fach anerkannte Technik durchgeführt werden, einschließlich, aber
nicht darauf beschränkt,
der Filtration oder der Zugabe von antibakteriellen oder antifungalen
Mitteln, zum Beispiel von Paraben, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure oder
Thimerosal. Ferner können isotonische
Mittel wie Zucker oder Natriumchlorid in die Zusammensetzungen,
die Gegenstand der Erfindung sind, inkorporiert werden.
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Die
Herstellung von sterilen injezierbaren Lösungen, die den PDF, der Gegenstand
der Erfindung ist, enthalten, wird durch die Inkorporation dieser
Verbindungen in der benötigten
Menge in das geeignete Lösungesmittel
mit verschiedenen Ingredienzien, die oben aufgelistet sind, bewerkstelligt,
gefolgt, wenn erforderlich, von einer Sterilisation, vorzugsweise
einer Filtersterilisation. Um ein steriles Pulver zu erhalten werden
die oben genannten Lösungen
gegebenenfalls vakuumgetrocknet oder gefriergetrocknet.
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Der
PDF, der Gegenstand der Erfindung ist, oder die Analogons oder Fragmente
davon werden folglich für
eine zweckmäßige und
wirksame Verabreichung in pharmazeutisch wirksamen Mengen mit einem
geeigneten pharmazeutisch akzeptablen Träger und/oder pharmazeutisch
akzeptablen Verdünnungsmittel
in einer therapeutisch wirksamen Dosis entrichtet.
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Wie
hierin verwendet schließt
der Begriff „pharmazeutisch
akzeptabler Träger
und/oder pharmazeutisch akzeptables Verdünnungsmittel" irgendeines und
alle Lösungsmittel,
Dispersionsmedien, antibakterielle und antifungale Mittel, Mikrokapseln,
Liposomen, kationische Lipidträger,
isotonische und absorptionsverzögernde
Mittel und dergleichen ein, die nicht mit den aktiven Ingredienzien
inkompatibel sind. Die Verwendung solcher Medien und Mittel für pharmazeutisch
aktive Substanzen sind im Stand der Technik gut bekannt. Es können auch
zusätzliche
aktive Ingredienzien in die Zusammensetzungen inkorporiert werden
und in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Die
genaue therapeutisch wirksame Menge des PDF's, Analogons oder Fragments davon, welche
in den Verfahren der Erfindung angewendet auf den Menschen verwendet
werden soll, kann durch einen Fachmann mit gewöhnlichen Kenntnissen auf dem
Gebiet unter Berücksichtigung
der indivuellen Unterschiede im Alter, Gewicht, Erkrankungsausmaß und Verfassung
des Patienten bestimmt werden. Allgemein kann festgehalten werden,
dass die pharmazeutische PDF-Präparation
der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in einer Menge von wenigstens
etwa 1 mg pro Infusionsdosis, vorzugsweise in einer Menge von bis
zu 10 mg pro Dosis oder mit einer Dosis verabreicht werden, die
eine lokale Brust- oder Prostatagewebekonzentration von etwa 10–9 M
bis 10–6 M
erreicht.
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Es
ist besonders vorteilhaft paranterale Zusammensetzungen in Form
von Dosierungseinheiten für eine
einfache Verabreichung und die Einheitlichkeit der Dosierung zu
formulieren. Die Dosierungseinheitform, wie sie hierin verwendet
wird, bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die für die zu
behandelnden Säugetiere
als einheitliche Dosierungen geeignet sind, wobei jede eine vorbestimmte
Menge des aktiven Materials enthält,
welche berechnet ist, um die gewünschte
therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem benötigten pharmazeutischen Träger zu verursachen.
Die Spezifikation der neuartigen Dosierungseinheitsformen der Erfindung
sind vorgegeben durch und hängen
direkt von den einzigartigen Merkmalen des aktiven Materials (das
heißt
dem PDF, den Analogons oder den Fragmenten davon) und den Einschränkungen
ab, die der Entrichtungsweise einer solchen aktiven Verbindung zur
Behandlung von Brust- oder Prostatakrebs inhärent sind.
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Die
aktive Hauptingredienz wird für
eine zweckmäßige und
wirksame Verabreichung in wirksamen Mengen mit einem geeigneten
pharmazeutisch akzeptablen Träger
in Dosierungseinheitsformen wie oben offenbart entrichtet. Im Fall
von Zusammensetzungen, die zusätzliche
aktive Ingredienzien enthalten, werden die Dosierungen in Bezug
auf die gewöhnliche
Dosis und Verabreichungsweise der Ingredienzien bestimmt.
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In
dem Behandlungsverfahren gemäß der vorliegenden
Erfindung können
der PDF, die Analogons oder Fragmente davon auf eine Weise, die
mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist, in solchen Mengen verabreicht
werden, wie sie therapeutisch wirksam sind, und auf irgendeinem
Weg, der medizinisch akzeptabel für die Behandlung von Brust-
und Prostatazellkrebs ist. Mögliche
Verabreichungswege schließen
Injektionen auf paranteralen Wegen wie intravaskulär, intravenös, intraarteriell,
subkutan, intramuskulär,
intratumoral, intraperitoneal, intraventrikulär oder intraepidural ein. Die
Zusammensetzungen können
auch direkt auf Gewebeoberflächen,
zum Beispiel während
einer Operation angewendet werden. Eine Verabreichung mit einer
anhaltenden Freisetzung (Englisch: sustained release) ist auch spezifisch
in der Erfindung durch Vorrichtungen wie Depotinjektionen oder erodierbaren
Implantaten mit eingeschlossen.
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Die
Erfindung wird ferner durch die folgenden spezifischen Beispiele
illustriert, welche nicht dazu gedacht sind den Bereich der Erfindung
auf irgendeine Weise einzuschränken.
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Beispiel 1
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Hypophyseextrakte
induzieren die Differenzierung von Brustkrebszellen und Prostatakrebszellen
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Extrakte,
die aus boviner Hypophyse und aus einem mammosomatischen Hypophysetumor
hergestellt wurden, wurden hinsichtlich der Fähigkeit, die Differenzierung
von Brustkrebszellen zu induzieren, bewertet.
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Es
wurden alkalische Hypophyseextrakte von dem mammosomatotropen Tumor
MtTW10 und dem hypophysären
Tumor MTW9-0M, erhalten von Dr. Untae Kim, Roswell Park Memorial
Institute, Bufallo, NY, wie durch Platica et al. (1992) Endocrinology
131: 2573, hergestellt. Der bovine Hypophyseextrakt wurde kommerziell
von Collaborative Research, Bedford, MA, erhalten.
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Die
Hypophyseextrakte wurden zu serumfreien Kulturen von MTW9/P1 Rattenbrusttumorzellen, MCF-7
humanen Brustkrebszellen, normalen ephithelialen Brustzellen und
myelocytischen und lymphocytischen Leukämiezellen zugegeben. Nach 24
Stunden aggregierten die Brustkrebszellen, welche normalerweise
als Einzelzellsuspensionen wachsen, und formten Sphäroide. Eine
Elektronenmikroskopie zeigte Veränderungen,
welche die Differenzierung in Richtung der normalen Brustdrüsenstruktur
anzeigen, einschließlich
der Polarisierung der Organellen, der Bildung einer lumenartigen
Struktur, Junctionbildung und dem Auftauchen von intrazellulären sekretorischen
Granulas. Nothern- und Westernblots, die mittels Standardverfahren
durchgeführt
wurden, zeigten, dass der Hypophyseextrakt die Expression von Laminin,
Casein und Lactalbumin und die Überexpression
von E-Cadherin in Brustkrebszellen induzierte. Normale epitheliale
Zelle und myelocytische und lymphocytische leukämische Zellen wurden von der
Behandlung mit dem Hypophyseextrakt nicht beeinflußt.
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Prostatakrebszellen
wurden von der ATCC erhalten. Es wurden serumfreie Kulturen der
Postatakrebszellen mit dem Hypophysextrakt, hergestellt von Platica
et al. wie oben beschrieben, behandelt und morphologisch und biologisch
auf Differenzierungsanzeichen beurteilt. Der Hypophyseextrakt induzierte
die Differenzierung der Postatakrebszellen, wie es mittels eines
Bionachweises gemessen wurde.
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Es
wurden gleichermaßen
aus Rattenleber uns Rattennieren Extrakte hergestellt und zu den
Zellkulturen wie oben beschrieben zugegeben. Die Rattenleber- und
Rattennierenextrakte hatten keine Wirkung auf die Differenzierung
der Brustkrebs- und Prostatakrebszellen.
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Es
wurden verschiedene Hormone und Wachstumsfaktoren, einschließlich dem
epidermalen Wachstumsfaktor (EGF für Englisch: epidermal growth
factor), transformierenden Wachstumsfaktor (TGF für Englisch transforming
growth factor), thrombozytäre
Wachstumsfaktor (PDGF für
Englisch: platelet-derived growth factor), fibroblasten Wachstumsfaktor
(FGF für
Englisch: fibroblast growth factor), insulinähnlichen Wachstumsfaktor (IGF
für Englisch:
insulin-like growth factor) -I und II, Estradiol, Wachstumshormon
und Prolactin, zu den Brustkrebszellkulturen zugegeben und hinsichtlich
der Differenzierungsaktivität
wie oben beschrieben bewertet. Keines der Hormone und keiner der
Wachstumsfaktoren wies die Fähigkeit
auf eine Differenzierung zu induzieren.
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Beispiel 2
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Identifikation
eines Klonierungssystems für
eine hypophysäre
Differenzierungsaktivität
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Es
wurde ein Expressionsklonierungsverfahren entwickelt, um die hypophysäre Differenzierungsaktivität weiter
zu charakterisieren. Um festzulegen, ob Xenopus-Oocyten ein geeignetes
Expressionsystem sind, wurden die Xenopus-Oocyten auf die Abwesenheit
einer hypophysären
Differenzierungs-ähnlichen
Aktivität, einer
Toxizität
für Brustkrebzellen
in dem ausgewähltem
funktionalem Nachweis und der Anwesenheit von Faktoren beurteilt,
die eine hypophysäre
Differenzierungsaktivität
zerstören
oder mit dieser interferieren können.
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Der
Aggregationsbionachweis für
eine hypophysäre
Differenzierungsaktivität
hat die Sphäroidbildung von
MCF-7-Brustkrebszellen
gemessen. MCF-7-Zellen aggregieren und bilden Sphäroide als
Antwort auf die hypophysäre
Differenzierungsaktivität
eines Hypophysenextrakts. Die Sphäroide wurden mittel Lichtmikroskopie
sichtbar gemacht.
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Das
Oocytenlysat wurde durch die Homogenisierung der Oocyten in 0,15
M NaCl2 erhalten, gefolgt von einer Zentrifugation
für 30
Minuten bei 15000 × g
und 4°C
und der Sammlung des Überstands.
Es wurden verschiedene Mengen des Oocytenlysats, welches 50–400 μg Protein
enthielt, und konditioniertes Medium, in welchem die Oocyten für 24 Stunden
gehalten wurden, zu 1 ml-Kukturen zugegeben, die 1 × 105 MCF-7-Zellen enthielten, gefolgt von einer
Inkubation bei 37°C
für 72
Std. Es wurden keine keine morphologischen Veränderungen oder toxischen Wirkungen
auf die MCF-7-Zellen
bei jeder Konzentration des Lysats oder Mediums beobachtet, was
anzeigt, dass die Xenopus-Oocyten keine hypophysäre Differenzierungs-ähnliche Aktivität enthalten
und dass das Oocytenlysat für
Brustkrebszellen nicht toxisch ist.
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Um
zu bestimmen, ob die hypophysäre
Differenzierungsaktivität
in der Anwesenheit des Xenopus-Oocytenlysats aktiv bleibt, wurden
Kulturen, die 1 × 105 MCF-7-Zellen enthielten, mit 150 μg/ml Hypophyseextrakt bei
37°C für 72 Std.
in der An- oder Abwesenheit von verschiedenen Mengen des Oocytenlysats
(50–400 μg/ml) inkubiert.
Die Aggregationswirkung, welche durch den Hypophyseextrakt induziert
wurde, wurde von der Anwesenheit des Oocytenlysats nicht beeinflusst.
Die Ergebnisse zeigen an, dass die hypophysäre Differenzierungsaktivität in der
Anwesenheit des Xenopus-Oocytenlysat
aktiv bleibt.
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Es
wurde die Fähigkeit
der Xenopus-Oocyten bestimmt eine hypophysäre Differenzierungsaktivität in Mengen
zu exprimieren, die ausreichend für die Detektion mit den Aggregationsbionachweis
sind. Es wurde Poly (A)+-RNA von dem hypophysären Rattentumor
MtTW10 mittels dem Guanidinium/Cäsiumchlorid
(CsCl)-Zentrifugationsverfahren wie von Sambrook et al. in einer
RNAse-freien Umgebung hergestellt. Kurz, es wurde 1 g Gewebe in
5 ml 4M Guanidiniumthiocyanat, 0,1 Tris-HCl (pH 7,5) und 1% 2-ME
bei Raumtemperatur homogenisiert. Dann wurden 9,7 ml Homogenat auf
ein 3,3 ml Pad aus 5,7M CsCl und 4 mM EDTA, pH 7,5, geschichtet
und bei 30000 rpm für
24 Stunden bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die RNA, welche auf
dem Boden des Tubes pelletiert wurden, wurde in 10 mM Tris pH 7,4,
1 mM EDTA und 0,1% SDS gelöst
und dann mit Ethanol präzipitiert.
Die Poly (A)+-RNA wurde durch das zweimalige
Passieren der Gesamt-RNA über
eine Oligo-dT-Cellulosesäule
erhalten. Es wurden 17 μg
der Poly (A)+-RNA aus 900 μg Gesamt-RNA
erhalten. Dann wurden 20 ausgewachsene Oocyten (Stadium V und VI),
welche in steriler MBS-Lösung
bei 19°C
gehalten wurden, mit 5 ml injeziert, die 50 ng mRNA pro Oocyte erhielten,
wobei eine automatische Spritze verwendet wurde. Die Oocyten wurden
dann in eine MBS-Lösung
gegeben, die Penicillin und Streptomycin enthielt, und bei 19°C inkubiert.
Nach drei Tagen wurden die Überstände des
Oocytenlysats (hergestellt wie oben beschrieben) und konditioniertes
Medium (CM) der RNA-injezierten Oocyten auf die hypophysäre Differenzierungsaktivität getestet.
Die Kulturen, welche 1 × 105 MCF-7-Zellen in 1 ml serumfreinen RPMI
enthielten, wurden in der Anwesenheit von verschiedenen Proteinkonzentrationen
des Oocytenlysats (10–300 μg) oder CM (50–200 μl/Kultur)
bei 37°C
in einer 5% CO2-Atmosphäre inkubiert. Nach 72 Stunden
wurde in den MCF-7-Kulturen, die mit dem Oocytenlysat behandelt
wurden, eine Aggregation beobachtet, nicht jedoch in den CM-behandelten
MCF-7-Zellen. Es wurde eine lineare Beziehung zwischen der Anzahl
der erhaltenen Aggregate und der Lysatproteinkonzentration wie in 6 gezeigt
beobachtet.
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Es
wurden ähnliche
Experimente unter Verwendung von Poly (A)+-RNA aus Rattenleber
durchgeführt. Weder
das konditionierte Medium noch die Lysate von Oocyten, die mit der
Leber-mRNA injeziert worden waren, hatten einen Effekt auf die MCF-7-Zellen.
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Diese
Ergebnisse zeigen an, dass eine hypophysäre Differenzierungsaktivität durch
den Aggragationsbionachweis sogar detektiert werden kann, wenn die
gesamte Population der hypophysären
mRNA in Xenopus-Oocyten exprimiert wurde.
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Die
vorangehenden Ergebnisse demonstrieren, dass die Xenopus-Oocyten keine hypophysäre Differenzierungs-ähnliche
Aktivität
enthalten, für
MCF-7-Zellen nicht toxisch sind und die hypophysäre Differenzierungsaktivität nicht
zerstören.
Ferner exprimierten Xenopus-Oocyten,
die mit hypophysärer
mRNA injeziert worden waren, eine hypophysäre Differenzierungsaktivität auf einem
Level, der durch den Aggregationsbionachweis detektierbar ist.
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Beispiel 3
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Charakterisierung der
hypophysären
Differenzierungsktivität
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Es
wurde eine humane cDNA-Bibliothek von Clontech, Palo Alto, CA erhalten
und auf die Anwesenheit einer cDNA getestet, die für eine hypophysäre Differenzierungsktivität kodiert.
Die cDNA-Bibliothek wurde direktional in die EcoRI-HindIII-Stelle
des Lambda-Bluemid-Phagen kloniert, welcher eine Transkription von
beiden Strängen
des DNA-Inserts mit entweder der T7- oder T3-RNA-Polymerase ermöglicht.
Es wurden 5 μl
einer seriellen Verdünnung
der Phagenbibliothek mit 200 μl
K802 E. coli (OD600 = 0,25) gemischt und
bei 37°C 20
Minuten inkubiert. Dann wurden 3 ml geschmolzener 0,7% Agar mit
48°C zugegeben
und die Mischung wurde oben auf einer 100 mm Platte, die 1,5% LB-Agar
enthielt, verteilt. Nach einer Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die Plaques
für jede
Phagenverdünnung
gezählt
und der Bibliothekstiter mit 1 × 1010 pfu/ml bestimmt. Dann wurde ein Pool von
400000 pfu von jeder Bibliothek auf 20 Platten (20000 pfu pro Platte)
ausplattiert und bei 37°C
inkubiert, bis die Plaques etwa 1 mm Durchmesser erreicht hatten.
Der obere Agar wurde dann in SM-Puffer (0,1 M NaCl, 10 mM MgSO4·7H2O, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2% Gelatine)
geerntet und die Bakterienzellen mit Chloroform lysiert. Der Agar
und die bakterielle Debris wurden durch eine Zentrifugation bei
8000 × g
für 20
Minuten pelletiert. Der Überstand
wurde mit 1 μg/ml
DNase I und 5 μg/ml
RNase A für
1 Stunde bei 37°C
behandelt und dann nochmals bei 8000 rpm für 20 Minuten zentrifugiert.
Der Überstand,
welcher die Phagenpartikel enthielt, wurde bei 25000 rpm (Beckman,
SW27 ROTOR) für
2 Stunden bei 20°C
zentrifugiert. Die pelletierten Phagen wurden dann in 0,5 M Tris-Puffer,
pH 8, resuspendiert und mit 100 μg/ml
Proteinase K für
30 Minuten bei 37°C
inkubiert, gefolgt von drei Phenol-, einer Pheno/Chloroform- und
einer Chloroformextraktion und einer Ethanolpräzipitation.
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Da
in dieser Bibliothek die T3-RNA-Polymerase den (+)-Strang des klonierten
Inserts synthetisiert, wurde die Phagen-DNA durch einen Verdau mit
SalI linearisiert, das in der in multiplen Klonierungsregion auf der
Seite des Inserts, die dem T3-RNA-Polymerasepromotor entgegengesetzt
ist, schneidet. Für
eine effiziente Translation wurde eine CAP-Stelle an das 5'-Ende des Transkripts hinzugefügt. Die
Transkription erfolgte, mit geringeren Modifikationen, nach dem
Protokoll nach Melton (Kroeg et al., 1987, Methods Enzymol. 155: 397),
wie von Regec et al. (1995) Blood 85: 2711 beschrieben, wobei ein
mMessage-mMachine-Kit von Ambion verwendet wurde, der 30–50 μg gecapte
RNA pro μg
Plasmid-DNA herstellen kann. Die Reaktion wurde in einem 20 μl Volumen
unter Verwendung von 5 μg
linearisierter Phagen-DNA durchgeführt und das Protokoll und die
Reagenzien wurden von dem Hersteller bereitgestellt. Nach 1 Stunde
Inkubation bei 37°C
wurde 1U RNase-freie DNase I pro μg
DNA zugegeben und die Inkubation für 15 Minuten fortgesetzt. Dann
wurde die Reaktionsmischung mit Phenol/Chloroform extrahiert, gefolgt
von einer Präzipitation
mit einem halben Volumen 7,5 M NH4-Acetat
und drei Volumina Ethanol. Mit drei solcher Ehtanolpräzipitationen
in Folge wurden 99% der nichteingebauten Nukleotide entfernt.
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Es
wurden 20 Oocyten mit 50 ng RNA pro Oocyte wie oben beschrieben
injeziert, in MBS-Lösung,
die Penicilin und Streptopmycin enthielt, gegeben und bei 19°C für 3 Tage
inkubiert. Das Oocytenlysat, das wie oben beschrieben hergestellt
wurde, wurde dann an MCF-7-Zellen unter Verwendung des oben beschriebenen Bionachweises
auf eine Differenzierungsktivität
getestet. Die behandelten Zellen bildeten Sphäroide ähnlich zu jenen, die von diesen
humanen Brusttumorzellen in Anwesenheit des Hypophysextrakts gebildet
wurden. Es wurde eine lineare Beziehung zwischen der Anzahl an gebildeten
Sphäroiden
und dem Proteinlysat, das in dem Bionachweis verwendet wurde, beobachtet.
(Bitte Daten bereitstellen). Diese Daten zeigen, dass die humane
hypophysäre
cDNA-Bibliothek von Clontech ein oder mehrere Klone enthält, die
für eine
hypophysäre Differenzierungsktivität kodieren.
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Der
oben beschriebene Pool von 400000 pfu der hypophysären cDNA-Bibliothek
wurde für
eine Sib-Selektion verwendet. Von dem 400000 pfu-Pool wurden jeweils
10 Unterpools von etwa 40000 Plaques separat ausplattiert und bis
sie eine Größe von etwa
1 mm erreicht hatten wachsen gelassen. Die Phagen-DNA von jedem
Pool wurde hergestellt und mit der T3-RNA-Polymerase wie beschrieben gecapte
Transkripte synthetisiert. Die RNA von jedem Unterpool wurde in
20 Froschoocyten injeziert (50 ng/Oocyte) und die Lysate an MCF-7-Zellen
auf eine Differenzierungsaktivität
getestet. Für
jeden Bionachweis wurden Kontrollen mit mRNA von hypophysären Tumoren,
mit Lysat von nichtinjezierten Oocyten und mit Hypophyseextrakten
angefertigt. Von den 10 analysierten Unterpools zeigten drei in
dem Bionachweis eine aggregierende Aktivität. Der Unterpool Nr. 2 wies
die stärkste
biologische Aktivität
auf und wurde für
eine weitere Sib- Selektion
ausgewählt.
Dieser Unterpool wurde in 10 Unterpools von jeweils etwa 4000 pfu
aufgeteilt, mit denen wie oben beschrieben verfahren wurde. Von
diesen Unterpools wies der Unterpool Nr. 6 die stärkste Differenzierungsaktivität auf und wurde
weiter in 10 Unterpools aufgeteilt (jeder enthielt mehr als 400
pfu), mit welchen ähnlich
verfahren wurde. Dieses Verfahren wurde weiter fortgesetzt, indem
weitere positive Pools aufgeteilt und auf eine Differenzierungsaktivität gescreened
wurden, bis ein einzelner positiver Klon, der für den hypophysären Differenzierungsfaktor
kodiert, identifiziert war.
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Der
identifizierte PDF-cDNA-Phagenklon wurde in eine Plasmidklon konvertiert,
wobei dam Verfahren von Clontech gefolgt wurde. Die Phage-DNA wurde mit NotI
verdaut, um die pBLUESCRIPT-Plasmid-DNA, die das cDNA-Insert enthält, freizusetzen.
Nach einer Phenol/Chloroformextraktion und einer Ethanolpräzipitation wurde
die verdaute Plasmid-DNA ligiert und verwendet, um kompetente DM5
alpha E. coli (Gibco, BRL) zu transformieren. Die Kolonien wurden
auf Agarplatten mit 50 μg/ml
Ampicillin wachsen gelassen und enthielten das Blueskript-Plasmid
mit der klonierten PDF-cDNA.
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Um
zu versichern, dass der Plasmidklon eine cDNA erhielt, die für einen
PDF kodiert, wurde das Transkript von der cDNA mit der T3-RNA-Polymerase synthetisiert
und in Xenopus-Oocyten translatiert. Das Oocytenlysat wurde wie
oben beschrieben auf eine PDF-Aktivität getestet. 1 zeigt
MCF-7-Zellen, die mit dem Kontroll-CM inkubiert wurden. 2 zeigt
MCF-7-Zellen, die mit dem Oocytenlysat behandelt wurden, welches das
cDNA-Transkript enthielt. Die behandelten Zellen aggregierten und
bildeten Sphäroide
und somit wurde bestätigt,
dass der cDNA-Klon für
den PDF kodierte. Die Plasmid-DNA wurde dann für eine Sequenzierung vorbereitet.
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Es
wurden 500 ml Ampicillin/LB-Medium mit 0,5 ml einer Stocksuspension
von E. coli inokuliert, welche das Plasmid, das die PDF-cDNA enthielt, trugen,
unter Schütteln
bei 37°C über Nacht
inkubiert. Am nächsten
Tag wurden die Zellen mit 8000 × g
für 20
Minuten bei 4°C
pelletiert und die Plasmid-DNA mittels dem Verfahren der alkalischen
Lyse von Birnboim und Dolly (1979) Nucleic Acid Res, 7: 1573 hergestellt.
Das bakterielle Pellet wurde in 10 ml 50 mM Glukose, 25 mM Tris-HCl
(pH 8,0) und 10 mM EDTA (pH 8,0) resuspendiert. Nach einer Behandlung
mit Lysozym wurden die bakteriellen Zellen mit 0,2 N NaOH und 1%
SDS für
10 Minuten bei Raumtemperatur lysiert. Dann wurden 15 ml 3 M kaltes
Natriumacetat zugegeben. Die Mischung wurde für 10 Minuten auf Eis gestellt
und mit 4000 × g
für 15
Minuten bei 4°C
zentrifugiert. Der Überstand,
der vornehmlich die Plasmid-DNA enthielt, wurde gefiltert und mit
0,6 Volumina Isopropanol präzipitiert.
Die Nukleinsäure
wurde durch eine Zentrifugation mit 5000 rpm für 15 Minuten sedimentiert,
mit 70% Ethanol gewaschen und in TE-Puffer gelöst.
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Es
wurden CsCl/Ethidiumbromidgradienten nach Sambrook et al. (1989)
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, hergestellt. Es
wurde 1 g CsCl in jeweils 1 ml der Plasmidpräparation gelöst und 80 μl Ethidiumbromid
(10 mg/ml) pro ml CsCl-DNA-Lösung
zugegeben. Nach einer Zentrifugation mit 60000 rpm für 24 Stunden
bei 20°C
in einem Ti 65-Rotor war die bakterielle DNA in zwei Banden aufgetrennt:
obere Bande enthielt die lineare, chromosomale und genickte zirkuläre Plasmid-DNA
und die untere Bande bestand aus der geschlossenen zirkulären superhelikalen
Plasmid-DNA. Die Plasmid-DNA wurde wiedergewonnen, das Ethidiumbromid
mit 1-Butanol extrahiert und nach der Entfernung des CsCl mittels
Dialyse wurde die DNA mit Ethanol präzipitiert.
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Die
Sequenzierung der PDF-cDNA wurde in der Core Facility of Mount Sinai
Medical School, New York, durchgeführt, wobei das Verfahren der
Dideoxykettentermination von Sanger et al. (1997) Proc. Natl. Acad.
Sci. 74: 5463, verwendet wurde. Es wurde jeder Teil des Klons von
sowohl der Vorwärts-
als auch reversen Orientierung sequenziert. Es wurden 530 Nukleotide
des 2,2 kb-Inserts unter Verwendung von M13-20 und den reversen
Primer von der Bluescript-Plasmidsequenz sequenziert. Die 530 Basenpaare
der PDF-cDNA haben die Nukleotidsequenz, dargelegt in SEQ ID NO:
1. Die Sequenz wurde mit dem DNASIS-Programm (Hitachi Software Engineering
Co.) auf eine Homologie mit anderen Sequenzen der GENBANK und des
EMBL analysiert. Es wurde keine einfache Homologie dieser Sequenz
mit irgendeiner Sequenz aus der GENBANK-Datenbank gefunden. Die
größte gefundene
Maximalübereinstimmung
war 72,5% über
einen Bereich von 98 Basenpaaren, was anzeigt, dass der PDF ein
neuartiges Polypeptid ist.
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Beispiel 4
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Wirkung des PDF's auf prostatische
Krebszellen
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Die
humane prostatische Zelllinie DU145 wurde von der American Type
Culture Collection erhalten und in RPMI 1640 Medium, versetzt mit
10% fötalem
Rinderserum (FBS) (BioWhittacker, Walkersville, MC), 10 IU Penicillin/ml
50 mg Streptomycin/ml, bei 37°C
in einer humidifizierten Atmosphäre
wachsen gelassen, die 5% CO2 enthielt.
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Um
die Wirkung des PDF's
auf diese Zellen zu beobachten, wurden Kulturen, die 1 × 105 DU-145-Zellen in serumfreiem RPMI 1640-Medium
enthielten, mit verschiedenen Konzentrationen des PDF's (50–300 μg/ml Kultur)
behandelt. Drei Tage später
wurden die Kulturen auf die Bildung von Sphäroiden ausgewertet. Es wurde
eine Korrelation zwischen der PDF- Konzentration und der Anzahl an gebildeten
Sphäroiden
gefunden, wie in dem Graph in der 7 dargestellt.
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3 zeigt
DU145-Zellen, die in Abwesenheit des PDF's kultiviert wurden. 4 illustriert
die morphologischen Veränderungen,
die durch 150 μg
PDF/ml in den DU145 prostatischen Krebszellen nach 72 Stunden induziert
wurden. Die PDF-behandelten Zellen aggregierten und bildeten Sphäroide ähnlich zu
jenen, die von den Brustkrebszellen, die mit dem PDF behandelt wurden,
erzeugt wurden.
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Beispiel 5
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Sequenzierung und Expression
des PDF's
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Es
wurde die vollständige
Sequenz der PDF-cDNA, beschrieben in Beispiel 3, mittels einer Primerextensionsstrategie
wie zum Beispiel von Sambrook et al. beschrieben bestimmt. Von der
vollständigen
Sequenz wurden die Start- und Stopcodons, der offene Leserahmen
und die abgeleitete Aminosäuresequenz
bestimmt.
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Es
wurden baculovirale Expressionsvektoren, die die für den PDF
kodierende cDNA enthielten, hergestellt. Die PDF-cDNA wurde in den
baculoviralen Vektor AcNPv kloniert und der rekombinante baculovirale Vektor
verwendet, um Zellen der Insektenzelllinie Sf21 zu transformieren.
Das Baculovirus/Insektensystem wird kultiviert, um den rekombinanten
PDF zu exprimieren, welcher dann aus dem Kulturmedium oder den Zellextrakten
aufgereinigt wird. Die biologische Aktivität des rekombinaten PDF's wurde durch den
in vitro Aggregationsnachweis bestätigt.
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Beispiel 6
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Wirkung des rekombinanten
PDF's auf das Tumorwachstum
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Es
wurden nackte Mäuse,
die den Brusttumor MTW9 trugen, mittels Transplantation, wie von
Diamond et al. (1976) Cancer Research 36: 77 beschrieben, erhalten.
Mittels einer intraperitonealen Injektion wurde der rekombinante
PDF an die tumortragenden Mäuse
für 21
Tage mit einer Dosierung von 50 μg/kg
pro Tag verabreicht. Die Reduktion der Tumorgröße in Reaktion auf die Behandlung
mit dem PDF wurde in regelmäßigen Abständen durch
die Messung der Tumorlänge,
-breite und -höhe
mit Messschiebern (Englisch: calipers) bewertet und das Tumorvolumen
berechnet.
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Es
sind verschiedene Publikationen hierin zitiert und die Inhalte davon
sind hiermit durch Referenz in ihrer Gesamtheit enthalten.
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