DE69233407T2

DE69233407T2 - Glial neurotrophe faktor

Info

Publication number: DE69233407T2
Application number: DE69233407T
Authority: DE
Inventors: H. Leu-Fen LIN; D. Franklin COLLINS; H. Daniel DOHERTY; Jack Lile; Susan Bektesh
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1991-09-20
Filing date: 1992-09-17
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2012-09-18
Also published as: IL103223A; IL103223A0; EP0610254A4; SG48145A1; PT100879B; US6093802A; US20020197675A1; US6015572A; US6362319B1; HUT66137A; EP0610254A1; NO321382B1; HU220795B1; KR940702505A; FI941285A; EP1243652A2; KR100242093B1; NO940922D0; HK1017816A1; CA2119463A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neurotrophe Faktoren und im Besonderen gliär abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF). Ebenfalls in dieser Erfindung enthalten sind Verfahren zur Aufreinigung von GDNF aus natürlichen Quellen und Verfahren zur Klonierung von für GDNF kodierenden Genen der Ratte und des Menschen, ebenso wie die Nukleinsäuresequenzen der Gene aus der Ratte und dem Mensch, die für GDNF kodieren. Das GDNF-Gen wurde in einen Expressionsvektor subkloniert und der Vektor verwendet, um biologisch aktives GDNF zu exprimieren. Zusätzlich beinhaltet diese Erfindung die Verwendung von GDNF zur Vorbeugung und Behandlung von Nervenschädigungen und mit Nerven zusammenhängenden Krankheiten wie die Parkinson-Krankheit.
Offenbart werden Antikörper gegen GDNF ebenso wie Verfahren zur Identifizierung von Mitgliedern der GDNF-Familie neurotropher Faktoren. Und letztlich werden Verfahren zur Vorbeugung oder Behandlung von Nervenschädigungen durch Implantieren von Zellen, die GDNF sekretieren, in Patienten beschrieben.
Hintergrund der Erfindung
Neurotrophe Faktoren sind natürliche Proteine, die im Nervensystem oder vom Nervensystem innervierten nicht-nervlichen Geweben gefunden werden, deren Funktion es ist, das Überleben von Nerven und/oder glialen Zellen zu fördern und deren phänotypische Differenzierung aufrechtzuerhalten (Varon und Bunge 1979 Ann. Rev. Neuroscience 1: 327; Thoenen und Edgar 1985 Sci ence 229: 238). Wegen dieser physiologischen Rolle können neurotrophe Faktoren nützlich bei der Behandlung der Degenerierung von Nervenzellen und dem Verlust differenzierter Funktion sein, die in einer Vielzahl von neurodegenerativen Krankheiten auftritt.
Damit ein bestimmter neurotropher Faktor potentiell nützlich sein kann bei der Behandlung von Nervenschädigungen, muss/müssen die Klasse oder die Klassen der geschädigten Nervenzellen auf den Faktor ansprechen. Verschiedene neurotrophe Faktoren beeinflussen typischerweise deutlich unterschiedliche Klassen von Nervenzellen. Daher ist es ratsam, eine Vielzahl verschiedener neurotropische Faktoren zur Hand zu haben, um jede der Klassen von geschädigten Neuronen zu behandeln, die bei verschiedenen Formen von Krankheiten oder Verletzungen auftreten können.
Neurotrophe Faktoren können empfängliche Neuronen vor einer Vielzahl von nicht miteinander in Beziehung stehenden Verletzungen ("unrelated insults") schützen. Beispielsweise wird der neurotrophe Faktor Nervenwachstumsfaktor (NGF) einen signifikanten Teil sensorischer Neuronen schützen vor dem durch Abschneiden ihrer axonalen Fortsätze verursachten Tod (Rich et al. 1987 J. Neurocytol 16: 261; Otto et al. 1987 J. Neurosci 83: 156), vor ontogenetischem Tod während embryonaler Entwicklung (Hamburger et al. 1984 J. Neurosci 4: 767) und vor durch Verabreichung von Taxol oder Cisplatin verursachtem Schaden (Apfel et al. 1991 Ann Neurol. 29: 87). Diese offensichtliche Allgemeingültigkeit eines Schutzes hat zu der Vorstellung geführt, dass, wenn ein neurotropher Faktor empfängliche Neuronen gegen experimentellen Schaden schützt, er in der Behandlung von Krankheiten nützlich sein könnte, die Schädigungen an diesen Neuronen in Patienten mit sich bringen, selbst wenn die Ätiologie unbekannt sein mag.
Zusätzlich dazu, dass er die richtige neuronale Spezifität haben muss, muss ein bestimmter neurotropher Faktor in ausreichender Menge erhältlich sein, um als pharmazeutische Behandlung verwendet zu werden. Da neurotrophe Faktoren typischerweise in verschwindend kleinen Mengen in Geweben vorhanden sind (z. B. Hofer und Barde 1988 Nature 331: 261; Lin et al. 1989 Science 246: 1023) wäre es mühsam, pharmazeutische Mengen von neurotrophen Faktoren direkt aus Tiergeweben zuzubereiten. Als eine Alternative wäre es wünschenswert, das Gen für einen neurotrophen Faktor zu lokalisieren und dieses Gen als Grundlage zum Aufbau eines rekombinanten Expressionssystems zu nutzen, um potentiell unbeschränkte Mengen des Proteins herzustellen.
Die Erfinder aus dieser Anmeldung beschreiben ein Verfahren zum Durchmustern biologischer Proben auf neurotrophe Aktivität in den embryonalen Vorläufern der dopaminergen Neuronen der Substantia nigra, die während der Parkinson-Krankheit degenerieren. Dieser Biotest zum Identifizieren neurotropher Faktoren, die nützlich bei der Behandlung von Parkinson-Krankheit sein können, beruht auf einem Test, der früher beschrieben (Friedman et al. 1987 Neuro. Sci. Lett. 79: 65–72, das ausdrücklich durch diese Bezugnahme hier drin aufgenommen wird) und mit Modifikationen in der vorliegenden Erfindung ausgeführt wird. Dieser Test wurde verwendet, um verschieden potentielle Quellen auf neurotrophe Aktivität, die auf dopaminerge Neuronen gerichtet ist, zu durchmustern. Die vorliegende Erfindung beschreibt die Charakterisierung eines neuen neurotrophen Faktors, der aus einer derartigen Quelle, dem konditionierten Kulturmedium einer Glioblastom-Zelllinie, B49 (Schubert et al. 1974 Nature 249: 224–27, das ausdrücklich durch diese Bezugnahme hier drin aufgenommen wird), aufgereinigt wurde. Von dem konditionierten Medium dieser Zelllinie wurde früher berichtet, dass es dopaminerge neurotrophe Aktivität enthält (Bohn et al. 1989 Soc. Neurosci. Abs. 15: 277). In diesem früheren Bericht wurde die Quelle der neurotrophen Aktivität nicht aufgereinigt, chemisch charakterisiert oder als Folge eines einzelnen Wirkstoffs in dem konditionierten Medium nachgewiesen. Nervenschädigung wird durch Bedingungen verursacht, die das Überleben und/oder richtige Funktionieren eines oder mehrerer Typen von Nervenzellen gefährden. Eine derartige Nervenschädigung kann sich aus einer großen Vielzahl von verschiedenen Gründen ergeben, von denen einige unten bezeichnet werden.
Nervenschädigung kann durch physische Verletzung auftreten, welche die Degenerierung der axonalen Fortsätze und/oder Nervenzellkörper nahe der Verletzungsstelle verursacht. Nervenschädigung kann auch durch temporären oder ständigen Stillstand des Blutflusses in Teile des Nervensystems wie beim Schlaganfall entstehen. Nervenschädigung kann auch wegen bewusster oder versehentlicher Exposition gegenüber Neurotoxinen, wie den chemotherapeutischen Wirkstoffen Cisplatin bzw. Dideoxycytidin (ddC) gegen Krebs und AIDS, auftreten. Nervenschädigung kann außerdem wegen chronischer metabolischer Krankheiten, wie beispielsweise Diabetes oder renaler Dysfunktion, auftreten. Nervenschädigung kann ferner wegen neurodegenerativer Krankheiten, wie Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und Amyotropher Lateralsklerose (ALS), auftreten, die aus der Degenerierung spezifischer neuronaler Populationen herrühren.
Diese Anmeldung beschreibt einen neuen neurotrophen Faktor. Neurotrophe Faktoren sind natürliche Proteine, welche die normalen Funktionen von spezifischen Nervenzellen fördern und/oder die gleichen Zellen gegen eine Vielzahl von verschiedenen Formen von Schädigungen schützen. Es sind diese Eigenschaften, die nahelegen, das GDNF nützlich sein könnte bei der Behandlung von verschiedenen Formen von Nervenschädigung, einschließlich der oben spezifisch angegebenen Formen.
Parkinson-Krankheit wird durch eine eindeutige Reihe von Symptomen identifiziert, die Starre, Bradykinesie, Seborrhö, schnellen und ungewollten Gang, gebeugte Körperhaltung, übermäßigen Speichelfluss und einen "Pillendreher"-Tremor beinhalten. Die Krankheit wird bei allen Rassen auf der Welt angetroffen und das durchschnittliche Alter des Krankheitsbeginns beträgt 60 Jahre.
Nach Jahren von widersprechenden Theorien und Kontroversen hat sich ein biochemischer Grund für die Parkinson-Krankheit als die Hauptursache herausgestellt. (Siehe z. B. Bergman, 1990 Drug Store News, 12: IP19.) Von besonderer Bedeutung für ein Verständnis der Parkinson-Krankheit sind die Bereiche des Gehirns, die bekannt sind als die Substantia nigra, die Basalganglien und insbesondere der Corpus striatum. Die Substantia nigra, eine bilateral gepaarte Schicht pigmentierter, grauer, Masse im Mittelhirn, ist an der Dopaminleitung beteiligt, während die normale Funktion der Basalganglien eine Reihe von Interaktionen und Rückkopplungssystemen ("feedback systems") beinhaltet, die mit der Substantia nigra assoziiert und teilweise durch Dopamin, Acetylcholin und andere Substanzen vermittelt ist.
Bei der Parkinson-Krankheit gibt es eine Fehlfunktion in der dopaminergen Aktivität der Substantia nigra, die durch neuronale Degenerierung verursacht wird. Dieses führt zu einem Zustand des Dopaminmangels und einer Verschiebung im Aktivitätsgleichgewicht hin zu einem cholinergen Übergewicht. Obwohl es keine Erhöhung in der Konzentration von Acetylcholin gibt, überwinden die anregenden Einflüsse dieses cholinergen Mediators auf das zentrale Nervensystem (d. h. Tremor) deshalb die inhibierenden Einflüsse des verminderten Dopamins.
Die bis heute effektivste Behandlung für Parkinson-Krankheit ist die orale Verabreichung von Levodopa. Levodopa penetriert das zentrale Nervensystem und wird enzymatisch in den basalen Ganglien in Dopamin umgewandelt. Es wird daher angenommen, dass die positiven Einflüsse von Levodopa in einer Erhöhung der Dopaminkonzentration im Gehirn liegen. Unglücklicherweise hält weder Levodopa noch irgendeines der weniger häufig verwendeten Medikationen tatsächlich das Fortschreiten der Krankheit auf, die durch Degenerierung der dopaminergen Neuronen verursacht wird.
Andere Forscher haben vom Auftreten dopaminerger Aktivität in verschiedenen biologischen Quellen berichtet. In der PCT-veröffentlichung WO 91/01739 von Springer et al. wurde eine dopaminerge neurotrophe Aktivität in einem Extrakt identifiziert, der aus Zellen des peripheren Nervensystems gewonnen wurde. Die identifizierte Aktivität wurde nicht auf gereinigt, wurde aber einem Faktor mit einem Molekulargewicht von weniger als 10000 Daltons zugerechnet. Der Faktor wurde aus Rattenischiasnerv isoliert, ist aber offensichtlich nicht CNTF, das ebenfalls in dem Nerven gefunden wird (Lin et al. 1989 Science 246: 1023).
Im US-Patent Nr. 5017735 von Appel et al. wurde dopaminerge Aktivität in einem Extrakt aus Caudate-Putamen-Gewebe identifiziert. Erneut wurden, keine Faktoren auf gereinigt, welche die Aktivität verursachen, und das scheinbare Molekulargewicht der die Aktivität enthaltenden Fraktionen war verhältnismäßig klein. Siehe auch Niijima et al. 1990 Brain Res. 528: 151–154 (chemisch deafferenziertes Striatum aus dem Gehirn erwachsener Ratten); Lo et al. 1990 Soc. Neurosci. Abstr., 16: 809 (aus dem Striatum stammender neurotropher Faktor). Zusätzlich wurde für andere bekannte neurotrophe Faktoren gezeigt, dass diese ebenfalls dopaminerge Aktivität aufweisen, z. B. aus dem Gehirn stammender neurotropher Faktor (BDNF) und azidische und basische Fibroblastenwachstumsfaktoren.
Das GNDF der vorliegenden Erfindung wurde basierend auf seiner Fähigkeit, die funktionelle Aktivität und das Überleben von dopaminergen Nervenzellen, die aus dem Mittelhirn von Rattenembryonen isoliert wurden, in Zellkultur zu fördern, isoliert. Diese dopaminergen Nervenzellen sind die embryonalen Vorläufer der dopaminergen Nervenzellen in der adulten Substantia nigra, die bei der Parkinson-Krankheit degenerieren. Daher könnte GDNF nützlich bei der Verringerung der neuronalen Degenerierung sein, welche die Symptome der Parkinson-Krankheit verursacht.
Weiterhin GDNF nützlich sein bei der Behandlung von anderen Formen von Schäden an oder fehlerhafter Funktion von dopaminergen Nervenzellen in menschlichen Patienten. Solche Schädigung oder Fehlfunktion kann bei Schizophrenie und anderen Formen von Psychosen auftreten. Momentane Behandlungen von solchen Zuständen verlangen häufig Wirkstoffe, die auf Dopaminrezeptoren wirken, was nahelegt, dass fehlerhafte Funktion der diese Rezeptor-tragenden neuronalen Populationen innervierenden dopaminergen Neuronen beim Fortschreiten der Krankheit beteiligt sein können.
Basierend auf früheren Erfahrungen mit anderen neurotrophen Faktoren werden neue Formen von Nervenschädigung, die mit GDNF behandelt werden können, hervortreten, wenn mehr über die verschiedenen Typen von Nervenzellen verstanden wird, die auf diesen neurotrophen Faktor ansprechen. Beispielsweise stellte sich der Nervenwachstumsfaktor (NGF) als eine potentiell nützliche Behandlung für Alzheimer-Krankheit nur heraus, als kürzlich entdeckt wurde, dass NGF als ein neurotropher Faktor für die basalen cholinergen Neuronen des Vorderhirns wirkt, die während Alzheimer-Krankheit degenerieren. (Williams, et al. 1986 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9231). In der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Verfügung gestellt, um andere Formen von Nervenschädigung zu bestimmen, die nützlicherweise mit GDNF behandelt werden können.
Patrick Aebischer und Mitarbeiter haben die Verwendung von semipermeablen, implantierbaren Membranvorrichtungen beschrieben, die nützlich als Mittel zur Verabreichung von Wirkstoffen oder Medikamenten unter bestimmten Bedingungen sind. Beispielsweise haben sie die Einkapselung von Zellen vorgeschlagen, die Neurotransmitterfaktoren sekretieren, und die Implantierung von solchen Vorrichtungen in das Gehirn von Patienten, die unter Parkinson-Krankheit leiden. Siehe US-Patent Nr. 4892538 von Aebischer et al.; US-Patent Nr. 5011472 von Aebischer et al.; US-Patent Nr. 5106627 von Aebischer et al.; PCT-Anmeldung WO 91/10425; PCT-Anmeldung WO 91/10470; Winn et al. 1991 Exper. Neurol. 113: 322–329; Aebischer et al. 1991 Exper. Neurol. 111: 269–275; und Tresco et al. 1992 ASAIO 38: 17–23.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft und beansprucht im Wesentlichen aufgereinigten, gliär abgeleiteten neurotrophen Faktor (GDNF). In einer Ausführungsform dieser Erfindung wird im Wesentlichen auf gereinigtes GDNF mit einer mindestens ungefähr 24000-fach höheren spezifischen Aktivität als die spezifische Aktivität von B49-konditionierten Medium erhalten. Das im Wesentlichen aufgereinigte GDNF hat eine spezifische Aktivität von mindestens ungefähr 12000 TU/μg.
Das im wesentlichen aufgereinigte GDNF der vorliegenden Erfindung hat bei nicht-reduzierender SDS-PAGE ein offensichtliches Molekulargewicht von ungefähr 31–42 kD, und ungefähr 20–23 kD bei reduzierender SDS-PAGE. Das im Wesentlichen auf gereinigte GDNF hat eine terminale Aminosequenz im Wesentlichen bestehend aus der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 1):
(Ser)-Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala-Leu-Pro-Arg-Arg-Glu-(Arg)-Asn-()-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-(Ser)-Pro-(Asp)-(Asn).
Die Aminosäuresequenz von reifen und "prä-pro"-Formen von GDNF aus der Ratte ist wie in 13 und 14 (SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4) dargestellt. Die Aminosäuresequenz von reifem menschlichem GDNF ist wie in dem unterstrichenen Teil der in 19 dargestellten Aminosäurereste 1–134 von SEQ ID NO: 5 und Aminosäurereste 1–134 SEQ ID NO: 6. Die Aminosäuresequenz der prä-pro-Form von menschlichem GDNF ist dargestellt in den 19 (SEQ ID NO: 5) und 22 (SEQ ID NO: 8).
Ein Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Erhalten von auf gereinigtem GDNF, das die Schritte umfasst: 1) Zubereiten eines serumfreien, konditionierten Wachstumsmediums von B49-Glioblastomzellen; 2) Konzentrieren des konditionierten Mediums; 3) Durchführen von Heparin-Sepharose-Chromatographie mit dem konzentrierten konditionierten Medium; 4) Durchführen von schneller Proteinflüssigchromatographie mit Fraktionen, die aus der Heparin-Sepharose-Chromatographie erhalten wurden; und 5) Durchführen von Reverse-Phase High-Performance Flüssigchromatographie mit Fraktionen, die aus der schnellen Proteinflüssigchromatographie erhalten wurden. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Erhalten von auf gereinigtem GDNF zusätzlich die Schritte: 6) Unterziehen der durch Reverse-Phase High-Performance Flüssigchromatographie erhaltenen Fraktionen einer präparativen SDS-PAGE; und 7) Durchführen einer Reverse-Phase High-Performance Flüssigchromatographie mit den durch präparative SDS-PAGE erhaltenen Fraktionen.
Ebenso beschrieben ist das Klonieren des GDNF-Gens der Ratte aus einer, aus der B49-Zelllinie hergestellten cDNA-Bibliothek. Die für das reife und das prä-pro-GDNF der Ratte kodierende Nukleinsäuresequenz ist in 13 (SEQ ID NO: 3) dargestellt. Das Verfahren zum Erhalten eines für GDNF kodierenden menschlichen Gens ist ebenfalls offenbart. Die für reifes menschliches GDNF kodierende Nukleinsäuresequenz ist wie in 19 (SEQ ID NO: 5) dargestellt. Die für die ersten 50 Aminosäuren des prä-pro-Abschnitts von menschlichen GDNF kodierenden Nukleinsäuresequenz ist wie in 22 (SEQ ID NO: 8) dargestellt.
Die Erfindung beinhaltet auch pharmazeutische Zusammensetzung, die eine effektive Menge an aufgereinigtem GDNF in einem pharmazeutisch verträglichem Träger umfasst. Ebenfalls beschrieben ist ein Verfahren zum Vorbeugen oder Behandeln von Nervenschädigung, welches Verabreichen einer therapeutisch effektiven Menge von GDNF an einem es benötigenden Patienten umfasst. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Nervenschädigung Parkinson-Krankheit oder beschädigte oder unvollständig funktionierende dopaminerge Nervenzellen.
In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird GDNF durch rekombinante DNA-Verfahren unter Verwendung der für GDNF kodierenden Gene wie hier beschrieben hergestellt. Die vorliegende Erfindung umfasst einen Vektor zur Verwendung beim Herstellen von biologisch aktivem GDNF, was die Expression von operativ an eine für reifes oder prä-pro-GDNF kodierende Sequenz verknüpfte regulatorische Elemente umfasst, und eine mit einem derartigen Vektor transformierte Wirtszelle. Auch umfasst ist ein rekombinantes DNA-Verfahren zum Herstellen von GDNF, das die Schritte umfasst: Subklonieren einer für GDNF kodierenden DNA-Sequenz in einen Expressionsvektor, welcher die zur Expression der DNA-Sequenz nötigen regulatorischen Elemente umfasst; Transformieren einer Wirtszelle mit dem Ex pressionsvektor; Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen zur Amplifikation des Vektors und Expression von GDNF; und Gewinnen des GDNF.
Ein rekombinantes DNA-Verfahren zur Produktion von GDNF wird beschrieben, das die Schritte umfasst: Kultivieren der Wirtszellen dieser Erfindung unter Bedingungen zur Amplifikation des Vektors und Expression von GDNF; und Gewinnen des GDNF.
Diese Erfindung beinhaltet im Wesentlichen aufgereinigte Antikörper, die GDNF erkennen. Ebenfalls beinhaltet sie ein Verfahren zum Vorbeugen oder Behandeln von Nervenschädigungen, das Implantieren von Zellen, die gliär abgeleiteten neurotrophen Faktor sekretieren, in den Körper von Patienten, die ihn benötigen, beinhaltet. Schließlich beinhaltet die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zum vorbeugen oder Behandeln von Nervenschädigung durch Implantieren in einen Patienten, die eine semipermeable Membran und eine innerhalb dieser Membran eingekapselte GDNF sekretierende Zelle umfasst, wobei die Membran permeabel für GDNF und impermeabel für Faktoren aus dem Patienten ist, die für diese Zellen schädlich sind.
Beschreibung der Figuren
1 stellt die Ergebnisse von Heparin-Sepharose-Chromatographie mit einer Lösung von konzentriertem B49-Glioblastomzellen, serumfreien, konditionierten Wachstumsmedium dar. Die Ergebnisse zeigen die O. D.₂₉₀ (–), Leitfähigkeit (-Δ-) und GDNF-Aktivität in TU (-O-) des Eluats. Mit einem Balken markierte Fraktionen wurden zur weiteren Aufreinigung vereint.
2 stellt die Ergebnisse von FPLC-Superose-Chromatographie der vereinten Fraktionen aus 1 dar. Die Ergebnisse sind gezeigt als O. D.₂₈₀ (–) und GDNF-Aktivität in TU (-o-).
3 stellt die Ergebnisse einer RP-HPLC von Fraktion 14 aus 2 dar. Die Ergebnisse sind gezeigt als (von) O. D.₂₁₄ mit der unten gezeigten GDNF-Aktivität in TU.
4 stellt die Ergebnisse der Analyse durch silbergefärbte SDS-PAGE von aus der 3 oben erhaltenen Fraktionen 3–10 dar. Spur S enthält Molekulargewichtstandards.
5 stellt die Ergebnisse von präparativer SDS-PAGE von Fraktionen 5 und 6 aus 4 dar. Gelabschnitte wurden auf GDNF-Aktivität in TU getestet. Die Gelabschnitte wurden durch Verwendung von Molekulargewichtsmarkern (Amersham) auch auf ihr Molekulargewicht korreliert.
6 stellt die Ergebnisse der RP-HPLC mit Fraktionen 16–23 aus 5 dar. Chromatogramm A enthält die Probe und Chromatogramm B ist eine Kontrolle (vereinigter Gelextrakt von entsprechenden Ausschnitten einer leeren Spur).
7 stellt die Ergebnisse einer Analyse durch silbergefärbte SDS-PAGE von Gipfel ("peak") 3 aus 6A (Spur 1) und einer Molekulargewichtskontrolle (Spur S) dar.
8 (SEQ ID NO: 1) beschreibt die aminoterminale Aminosäuresequenz, die aus aufgereinigtem GDNF erhalten wurde. Die leere Klammer gibt eine Position an, wo die Aminosäure bei Verwendung der eingesetzten Sequenzierungstechnik nicht bestimmt werden konnte. Wo Reste in Klammern angegeben sind, besteht etwas Unsicherheit hinsichtlich der Identifizierung die ses Restes. Die vollständige, richtige aminoterminale Aminosäuresequenz ist unten in 19 (SEQ ID NO: 5) gezeigt.
9 stellt das Ergebnis von RP-HPLC von mit Trypsin verdautem, aufgereinigtem GDNF dar. Chromatogramm A enthält die Probe und Chromatogramm B ist eine Kontrolle (nur Trypsin enthaltend).
10 stellt die Ergebnisse der RP-HPLC von Gipfel 37 aus 9 nach Behandlung mit Cyanogenbromid dar.
11 stellt die Ergebnisse von RP-HPLC des Reduktionsproduktes von Gipfel 1 aus 10 dar.
12 (SEQ ID NO: 2) beschreibt eine interne Aminosäuresequenz, die aus aufgereinigtem GDNF enthalten wurde.
13 (SEQ ID NO: 3) stellt die Aminosäuresequenz dar, die für GDNF der Ratte erhalten wurde, das aus einem B49-Zell-Bibliotheks-cDNA-Klon λZapII76.1 abgeleitet wurde. Auch dargestellt ist die gefolgerte Aminosäuresequenz für GDNF. Die für reifes GDNF kodierende Nukleinsäuresequenz ist unterstrichen. Die aminoterminale Sequenz der am meisten bevorzugten prä-pro-Form von GDNF ist mit einem * markiert.
14 (SEQ ID NO: 4) stellt die gefolgerte Aminosäuresequenz von reifem GDNF dar.
15 stellt die Ergebnisse der Förderung des Überlebens von parasympathischen Neuronen aus ciliären Hühnerembryo-Ganglien durch aufgereinigtes B49-Zell-GDNF und menschliches rekombinantes CNTF dar. Erhöhung der optischen Dichte auf der Y-Achse stellt erhöhtes neuronales Überleben dar. Die X-Achse stellt abnehmende Konzentrationen jedes neurotrophen Faktors dar. Die als Kontrolle bezeichnete Kurve ist gleichen Volumens inaktiver HPLC-Fraktionen, die benachbart sind zu solchen, die das zur Erzeugung der GDNF-bezeichneten Kurve verwendete GDNF enthalten.
16 stellt die Ergebnisse der Förderung des Überlebens von sympathischen Neuronen aus Grenzstrangganglien aus Hühnerembryo durch aufgereinigtes B49-Zell-GDNF und menschliches rekombinantes CNTF dar. Erhöhung der optischen Dichte auf der Y-Achse stellt erhöhtes neuronales Überleben dar. Die X-Achse stellt abnehmende Konzentrationen jedes neurotrophen Faktors dar. Die als Kontrolle bezeichnete Kurve ist gleichen Volumens inaktiver HPLC-Fraktionen, die benachbart sind zu solchen, die das zur Erzeugung der GDNF-bezeichneten Kurve verwendete GDNF enthalten.
17 stellt die Ergebnisse eines Biotests von COS-Zell-konditioniertem Medien hinsichtlich der Fähigkeit dar, die Dopaminaufnahme von mesenzephalischen dopaminergen Neuronen in Kultur zu erhöhen. Die Y-Achse stellt die aufgenommene Menge von radiomarkiertem Dopamin gegen ansteigende Mengen von konzentriertem COS-Zellkulturmedium auf der X-Achse dar. Die mit B-1 bezeichnete Kurve stellt das serumfreie konditionierte Medium von mit dem GDNF-Gen in der richtigen Orientierung zur Expression von GDNF transfizierten COS-Zellen dar. Die mit C-1 bezeichnete Kurve stellt das serumfreie konditionierte Medium von mit dem GDNF-Gen in der umgekehrten Orientierung, welche die Expression von GDNF verhindert, transfizierten COS-Zellen dar.
18 stellt die Ergebnisse eines Biotests von COS-Zell-konditioniertem Medium hinsichtlich der Eignung zur Steigerung des Überlebens von sympathischen Neuronen aus dem Grenzstrang in Hühnerembryos in Kultur dar. Die Y-Achse stellt die Menge von durch die Kulturen reduziertem MTT-Farbstoff dar und ist proportional mit neuronalem Überleben. Die X-Achse stellt ansteigende Verdünnung des konzentrierten COS-Zellkulturmediums dar. Die mit GDNF bezeichnete Kurve stellt das serumfreie konditionierte Medium von mit dem GDNF-Gen in der richtigen Orientierung zur Expression von GDNF transfizierten COS-Zellen dar. Die mit Kontrolle bezeichnete Kurve stellt das serumfreie konditionierte Medium von mit dem GDNF-Gen in der umgekehrten Orientierung, welche die Expression von GDNF verhindert, transfizierten COS-Zellen dar.
19 (SEQ ID NO: 5) stellt einen Teil der für menschliches GDNF wie unten in Beispiel 2C beschrieben erhaltenen Nukleinsäuresequenz dar, einschließlich des gesamten, für reifes menschliches GDNF kodierenden Genteils. Auch dargestellt ist die gefolgerte Aminosäuresequenz für reifes menschliches GDNF. Die Aminosäuresequenz für reifes menschliches GDNF ist unterstrichen.
20 stellt die Fähigkeit von GDNF dar, Dopaminaufnahme und Tyrosinhydroxylase(TH)-Immunofärbung in dopaminergen Neuronen zu stimulieren. Kulturen wurden wie in Beispiel 1B beschrieben geschaffen. GDNF wurde am Tag des Plattierens zugefügt und nach neun Tagen in vitro aufgefüllt. A. ³H-DA-Aufnahme wurde nach 15 Tagen in vitro gemessen. B. Kulturen wurden nach 16 Tagen in vitro mit 4% Paraformaldehyd fixiert, gründlich gewaschen, mit 0,2% Triton x-100 permeabilisiert und mit polyklonalem Antikörper gegen TH (Eugine Tech International, Allendale, NJ) gefärbt. Bindung des primären Antikörpers wurde durch Verwendung eines Vectastain ABC-Kits (Vector Labs, Burlingame, CA) sichtbar gemacht.
21 stellt die Spezifität von GDNF für dopaminerge Neuronen dar. Kulturen wurden wie in Beispiel 1B beschrieben geschaffen. GDNF wurde am Tag des Plattierens zugefügt. A. ³H-DA-Aufnahme wurde nach sieben Tagen in vitro gemessen. B. ¹⁴C-GABA-Aufnahme wurde nach acht Tagen in vitro gemessen. Zellen wurden inkubiert und wie für ³H-DA-Aufnahme behandelt, mit der Ausnahme, dass der Aufnahmepuffer aus Kreb-Ringers-Phosphatpuffer, pH 7,4, der 5,6 mM Glukose, 1,3 mM EDTA, 10 μM Aminooxyessigsäure (um GABA-Abbau zu verhindern), 2 mM β-Alanin (um Aufnahme von GABA in Glia zu inhibieren) und 0,1 μM ¹⁴C-GABA (150 mC/mmol, New England Nuclear, Boston, MA) enthielt, bestand. In Anwesenheit von 1 mM Diaminobuttersäure (DABA), einem potenten Inhibitor der ¹⁴C-GABA-Aufnahme in GABA-Neuronen, verringerte sich die ¹⁴C-Aufnahme auf 10%. Kontrollwerte in Anwesenheit von DABA wurden von experimentellen Daten abgezogen.
22 (SEQ ID NO: 8) stellt einen Teil der für menschliches GDNF, wie in Beispiel 2D unten beschrieben, erhaltenen Nukleinsäuresequenz dar, einschließlich der kodierenden Sequenz von Aminosäuren 1–50 des menschlichen prä-pro-GDNF. Auch dargestellt ist die gefolgerte Aminosäuresequenz für die ersten 50 Aminosäuren des menschlichen prä-pro-GDNF. Diese Information in Verbindung mit der in 19 angegebenen, kodierenden Sequenzinformation stellt die vollständige kodierende Sequenz für menschliches prä-pro-GDNF und die gefolgerte Aminosäuresequenz für das menschliche prä-pro-GDNF-Protein zur Verfügung.
23 stellt eine Karte von SacII- und PstI-Stellen innerhalb des Plasmids von pBSSK-λ3AluI, wie in Beispiel 2D unten beschrieben, dar.
24 stellt die Spezifität von GDNF für dopaminerge Neuronen dar. Kulturen wurden wie in Beispiel 1B beschrieben vorbereitet. GDNF wurde am Tag des Plattierens zugefügt und Aufnahme wurde nach sechs Tagen in vitro gemessen. A bezeichnet Dopaminaufnahme und B bezeichnet Serotoninaufnahme.
25 stellt Coomassie Blau-gefärbte, unter reduzierenden Bedingungen gelaufene SDS-PAGE von Fraktionen aus Chromatographie eines nicht erneut gefalteten GDNF auf einer S-Sepharosesäule vor erneutem Falten (siehe Beispiel 6C) enthaltendem bakteriellen Extraktes dar. Spuren 2–8 stellen aufeinanderfolgende Fraktionen des Säuleneluats dar. Fraktionen 3–5, die für GDNF angereichert waren, wurden für Rückfalten vereint. Spur 1 sind Molekulargewichtsstandards (SDS-70L, Sigma).
26 stellt Coomassie Blau-gefärbte SDS-PAGE der GDNF-Lösung dar; vor Rückfaltung (Spuren 6 & 13), nach Rückfaltung (Spur 2) und nach Rückfaltung und nachträglicher Rückreduktion mir 150 mM 2-Mercaptoethanol (Spur 5). Das Material vor der Rückfaltung und nach Rückreduktion läuft als ein Monomer bei ungefähr 16 kDa. Nach erfolgreicher Rückfaltung läuft GDNF (ohne Reduktion) als ein Dimer bei ungefähr 30 kDa (siehe Beispiel 6). Spur 15 sind Molekulargewichtsstandards (SDS-70L, Sigma).
27 stellt die Ergebnisse eines Biotests unter Verwendung von rückgefalteten GDNF dar; die Fähigkeit messend, das Überleben von sympathischen Neuronen aus Hühnerembryo in Kultur zu fördern. Das Biotestverfahren ist wie in Beispiel 4A beschrieben. Optische Dichte (proportional zur Anzahl der überlebenden Neuronen) auf der Y-Achse ist gegen GDNF-Konzentration auf der X-Achse (bestimmt durch Laserdichtebestimmung von Coomassie Blau-gefärbten SDS-PAGE-Gelen) aufgetragen. Die berechnete ED50 von rückgefaltetem GDNF für das Überleben von sympathischen Neuronen aus Hühnerembryo ist ungefähr 3 ng/ml.
28 stellt die Ergebnisse eines Biotests unter Verwendung von rückgefalteten GDNF dar; die Fähigkeit messend, Dopaminaufnahme durch nigrale dopaminerge Neuronen von embryonalem Mittelhirn von Ratten zu fördern. Das Biotestverfahren ist wie in Beispiel 1B beschrieben. Dopaminaufnahme auf der Y-Achse ist gegen GDNF-Konzentration auf der X-Achse aufgetragen. Die berechnete ED50 von rückgefaltetem GDNF zur Erhöhung der Dopaminaufnahme in diesen Kulturen ist ungefähr 3 pg/ml.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die momentan bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die zusammen mit den folgenden Beispielen dazu dienen, die Grundlagen der Erfindung zu erklären, werden nun im Detail erwähnt.
Vor dieser Erfindung war GDNF nicht als eine einzelne biologisch aktive Substanz identifiziert worden und hat nicht in einer im Wesentlichen reinen Form existiert. Wie hier beschrieben, wird eine detaillierte Beschreibung von GDNF zur Verfügung gestellt, zusammen mit einer Beschreibung seiner physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften; seiner Nützlichkeit; wie es herzustellen ist; nützliche, es enthaltende Zusammensetzungen; für es kodierende Nukleinsäuresequenzen; derartige Nukleinsäuresequenzen enthaltende Vektoren; mit solchen Vektoren transformierte Wirtszellen; rekombinante Techniken für seine Herstellung; und andere Aspekte der Erfindung.
GDNF ist ein Protein, das in gliären Zellen identifiziert werden kann in oder aus gliären Zellen erhalten werden kann und das neurotrophe Aktivität zeigt. Etwas genauer gesehen, ist GDNF ein dopaminerges neurotrophes Protein, das teilweise durch seine Fähigkeit, die Dopaminaufnahme in die embryonalen Vorläufer der dopaminergen Neuronen der Substantia nigra zu erhöhen charakterisiert ist, und zusätzlich durch seine Fähigkeit, das Überleben von parasympathischen und sympathischen Nervenzellen zu fördern. Im Wesentlichen auf gereinigtes GDNF ist weiterhin auf verschiedene Weisen charakterisiert:

1. Es hat eine spezifische Aktivität von mindestens ungefähr 12000 TU/μg.
2. Es hat auf reduzierenden SDS-PAGE ein Molekulargewicht von ungefähr 20–23 kD.
3. Es hat auf nicht-reduzierenden SDS-PAGE ein Molekulargewicht von ungefähr 31–42 kD.
4. Es hat eine spezifische Aktivität, die mindestens ungefähr 24000 mal größer ist als die spezifische Aktivität von B49-konditioniertem Medium.
5. Es hat die Fähigkeit, die Tyrosinhydroxylase-Immunreaktivität in mesenzephalischen Kulturen hochzuregulieren.
6. Es weist die wie in 8 (SEQ ID NO: 1) gezeigte aminoterminale Aminosäuresequenz auf.
7. Es weist die wie in 12 (SEQ ID NO: 2) gezeigte interne Aminosäuresequenz auf.

Das GDNF der vorliegenden Erfindung ist erheblich ausführlicher im Detail unten beschrieben. Dieser Aspekt der Erfindung ist so zu verstehen, dass er jegliches dopaminerges neurotrophes Protein abdeckt, das eine gleiche oder im Wesentlichen zu der in 8 (SEQ ID NO: 1) angegebenen homologe aminoterminale Aminosäuresequenz aufweist. Diese Erfindung umfasst auch jedes dopaminerges neurotrophes Protein, das eine gleiche oder im Wesentlichen zu der in 12 (SEQ ID NO: 2) angegebenen homologe interne Aminosäuresequenz aufweist.
Diese Erfindung schließt ein neues dopaminerges neurotrophes Protein ein, das hier als gliär abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF) definiert ist. GDNF wurde identifiziert in und in einer im Wesentlichen auf gereinigten Form isoliert aus ei nem serumfreien Wachstumskonditioniertem Medium von B49-Glioblastomzellen.
GDNF wurde aufgereinigt und charakterisiert und partielle Aminosäuresequenzen des auf gereinigten Materials wurden erhalten. Basierend auf der erhaltenen partiellen Aminosäuresequenz wurden DNA-Sonden entworfen, um einen cDNA-Klon aus der Ratte zu erhalten, der in der rekombinanten Herstellung von GDNF verwendet werden könnte. Die Nukleinsäuresequenz eines derartigen Klons und die gefolgerte Aminosäuresequenz von GDNF aus Ratte ist in den 13 (SEQ ID NO: 3) und 14 (SEQ ID NO: 4) angegeben.
Die aminoterminale Aminosäuresequenz von GDNF wurde bestimmt und ist in 8 (SEQ ID NO: 1) gezeigt. Ein Teil der internen Aminosäuresequenz von GDNF wurde ebenfalls bestimmt und ist in 12 (SEQ ID NO: 2) gezeigt. Das auf gereinigte GDNF hat ein scheinbares Molekulargewicht von ungefähr 31–42 kD auf SDS-PAGE unter nicht-reduzierenden Bedingungen und ungefähr 20–23 kD auf SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen. Obgleich ohne durch eine derartige Theorie eingeschränkt zu sein, wird postuliert, dass diese Information mit einem GDNF übereinstimmt, welches ein glykosyliertes, Disulfid-gebundenes Dimer in seinem natürlicherweise vorkommenden Zustand ist.
Wie in Beispiel 6C unten genauer beschrieben, führt eine Expression des menschlichen GDNF-Gens in einem bakteriellen Expressionssystem zur Bildung von rekombinantem menschlichen GDNF oder rhGDNF. Das nach Expression isolierte Material ist im Wesentlichen biologisch inaktiv und liegt als ein Monomer vor. Nach Rückfaltung liegt GDNF als ein biologisch aktives, Disulfid-gebundenes Dimer vor. GDNF ist daher in seiner natürlichen, biologisch aktiven Form ein Disulfid-gebundenes Dimer. Diese Erfindung schließt jedoch GDNF in sowohl seiner monome ren als auch dimeren, und sowohl seiner biologisch inaktiven als auch biologisch aktiven Formen ein.
Sonden wurden basierend auf der Nukleinsäuresequenz von GDNF der Ratte hergestellt, um das für menschliches GDNF kodierende genomische DNA-Gen zu klonieren. Das für reifes GDNF kodierende menschliche Gen und die Aminosäuresequenz von menschlichem reifem GDNF sind in 19 (SEQ ID NO: 5) angegeben.
GDNF kann auch durch seine Fähigkeit charakterisiert werden, die Dopaminaufnahme in die embryonalen Vorläufer von dopaminergen Neuronen der Substantia nigra, wie in Beispiel 1 unten beschrieben, zu erhöhen. GDNF kann weiterhin charakterisiert werden durch seine Fähigkeit, das Überleben von parasympathischen und sympathischen Nervenzellen, wie in Beispiel 4 unten beschrieben, zu fördern.
GDNF kann zusätzlich durch seine Fähigkeit charakterisiert werden, Tyrosinhydroxylase-Immunreaktivität in mesenzephalischen Kulturen heraufzuregulieren. Ein Beispiel dieser Eigenschaft ist in Beispiel 1E beschrieben und in 20 gezeigt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass GDNF einige Spezifität zu dopaminergen Neuronen im Vergleich zu Neuronen im allgemeinen hat. Beispielsweise wurde dies durch die begrenzten Wirkung auf die Aufnahme von γ-Aminobuttersäure (GABA) in GABA-enthaltenden Neuronen gezeigt. Dies ist auch in Beispiel 1E beschrieben und in 21 gezeigt. Es wurde auch gezeigt, dass GDNF, wenn überhaupt, eine begrenzte Wirkung auf die Serotoninaufnahme in serotonergen Neuronen hat. Dies wird in Beispiel 1E beschrieben und in 24 gezeigt.
Überall in dieser Beschreibung soll jeglicher Bezug auf gliär abgeleiteten neurotrophen Faktor als sich auf neurotrophe Faktoren jeglicher Herkunft beziehend aufgefasst werden, die im Wesentlichen homolog und biologisch gleichwertig zu dem hier charakterisierten und beschriebenen GDNF sind. Der Grad der Homologie zwischen dem Protein aus Ratte und Mensch ist ungefähr 93% und alle Säugetier-GDNF werden einen ähnlich hohen Grad von Homologie aufweisen. Derartige GDNFs können als Dimere in ihrer biologisch aktiven Form vorliegen.
Wie hier beschrieben umfasst die vorliegende Erfindung glykosylierte und nicht-glykosylierte Formen des GDNF ebenso wie trunkierte Formen des natürlicherweise vorkommenden und des rekombinanten GDNF. In einer weiteren Ausführungsform ist GDNF durch Anhängen eines oder mehrerer Polyethylenglykol(e) (PEG) oder anderer, sich wiederholender polymerer Reste modifiziert. Die vorliegende Erfindung umfasst auch rekombinant in bakteriellen Expressionssystemen hergestelltes GDNF, das einen aminoterminalen Methioninrest enthält.
Mit "biologisch gleichwertig", wie es durch die ganze Beschreibung und die Ansprüche benutzt wird, meinen wir Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die in der Lage sind, einige oder alle der gleichen neurotrophen Eigenschaften in einer ähnlichen Weise zu zeigen, aber nicht notwendigerweise im selben Ausmaß als das aus dem B49-konditionierten Medium isolierte GDNF. Mit "im Wesentlichen homolog", wie es durch die folgende Beschreibung und die Ansprüche benutzt wird, ist ein Grad an Homologie zum aus B49-konditioniertem Medium isolierte GDNF gemeint, der über den von jedem bisher berichteten GDNF gezeigten hinausgeht. Bevorzugt überschreitet der Homologiegrad 70%, besonders bevorzugt überschreitet er 80% und am meisten bevorzugt überschreitet er 90%, 95% oder 99%. Der Prozentsatz der Homologie, wie er hier beschrieben wird, wird berechnet als der Prozentsatz von Aminosäureresten, die in der kleineren der zwei Sequenzen gefunden werden, die sich mit identischen Aminosäureresten in der verglichenen Sequenz decken, wenn vier Lücken in einer Länge von 100 Aminosäuren ein gefügt werden können, um den Abgleich zu unterstützen, wie durch Dayhoff in Atlas of Protein Sequence and Structure Band 5, S. 124 (1972), National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., ausdrücklich durch Bezugnahme hier drin aufgenommen, beschrieben. Ebenfalls eingeschlossen als im Wesentlichen homolog ist jedes GDNF, das aufgrund von Kreuzreaktivität mit Antikörpern gegen das hier beschriebene GDNF isoliert werden kann, oder dessen Gene durch Hybridisierung mit dem Gen oder mit Teilen des Gens für das hier beschriebene GDNF isoliert werden können.
Ein bevorzugtes GDNF der vorliegenden Erfindung wurde aus B49-konditioniertem Medium isoliert und wurde in im Wesentlichen auf gereinigter Form isoliert. Ein weiterhin bevorzugtes GDNF wird durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt, um GDNF in im Wesentlichen reiner Form zu erzeugen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sollen "reine Form" oder "im Wesentlichen reine Form", wie sie verwendet werden, um sich auf das hier offenbarte GDNF zu beziehen, eine Zubereitung meinen, die im Wesentlichen frei von anderen Proteinen ist, die kein GDNF sind. Bevorzugt ist das GDNF der vorliegenden Erfindung mindestens 50% rein, bevorzugt 75% rein und besonders bevorzugt 80%, 95% oder 99% rein. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die GDNF-Proteinzubereitung von solch einer im Wesentlichen reinen Form, um es jemandem mit gewöhnlichen Fähigkeiten in diesem Fachbereich zu ermöglichen, zumindest Teile seiner Aminosäuresequenz zu bestimmen, ohne zuerst weitere Aufreinigungsschritte durchzuführen.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird GDNF aus B49-konditioniertem Medium wie in Beispiel 1 unten beschrieben aufgereinigt. Unter Berücksichtigung der hier dargestellten Informationen ist es natürlich für die Fachleute in diesem Bereich offensichtlich, das andere Quellen für GDNF identifiziert werden können, und dass die Aufreinigung von GDNF aus solchen Quellen im Allgemeinen entsprechend dem hier dargestellten Aufreinigungsverfahren durchgeführt werden kann.
Die dopaminerge Aktivität des GDNF wird verwendet, um den Aufreinigungsprozess zu vereinfachen. Der Biotest für dopaminerge neurotrophe Aktivitäten wird in Beispiel 1B unten beschrieben. In Kurzform werden Kulturen von dissoziierten mesenzephalischen Zellen präpariert, entweder in serumreichen oder serumfreien Umgebungen. Auf dopaminerge Aktivität zu testende Proben werden entsalzt und fortlaufend zu den Zellkulturen zugegeben, und die Schalen für sechs Tage bei 37°C in einer angefeuchteten Atmosphäre, die 6,5% CO₂ enthält, inkubiert. Die Kulturen werden dann bei 37°C in Anwesenheit des Testmaterials mit tritiiertem Dopamin (³H-DA) inkubiert Die Dopaminaufnahme wird angehalten, die Zellen gewaschen und die Dopaminaufnahme durch Scintillationszählung von zurückgehaltenem Tritium in den Kulturen untersucht.
Die Aufreinigung von GDNF wird im Detail in Beispiel 1C unten beschrieben. Das Verfahren der Aufreinigung ist in Tabelle I ausführlich dargestellt. Das Startmaterial konditioniertes Medium wird aus B49-Glioblastomzellen durch Platzieren der Zellen in serumfreiem Medium für zwei Tage hergestellt, wenn das konditionierte Medium gesammelt und erneuert wird. Dieser Zyklus wird wiederholt, um drei Ernten konditionierten Mediums von jedem Lot von B49-Zellen zu ergeben. Das konditionierte Medium wird zentrifugiert und vor weiterer Aufreinigung ungefähr 10-fach konzentriert.
Der erste Schritt des Herstellens dieser groben Mischung, die hier als serumfreies Wachstumskonditioniertes Medium aus B49-Glioblastom definiert wird, ist Aufbringen des konditionierten Mediums auf eine Heparin-Sepharosesäule, die mit 50 mM NaPi-Puffern, pH 8,0, die 0,15 N NaCl enthalten, äquilibriert ist. Eine Gradienten-Pufferlösung, hergestellt aus 50 mM NaPi, pH 8,0, die 1,5 N NaCl enthält, wird auf die Säule gegeben, nachdem die Elution stabilisiert ist. Fraktionen aus dieser Chromatographie werden auf GDNF-Aktivität abgeschätzt, und die Fraktionen, welche die GDNF-Aktivitäten enthalten, werden für weitere Aufreinigung vereinigt.
Die vereinigten Fraktionen werden einer Protein-Flüssigchromatographie (FPLC) auf einer Superose-Säule unterzogen, mit einem Laufmittelpuffer von 50 mM NaPi-Puffer, pH 7,4, der 0,5 N NaCl enthält. Wieder wird die GDNF-Aktivität der erhaltenen Fraktionen bestimmt. Eine einzelne Fraktion aus diesem Verfahren wird dann angesäuert und auf eine C-8 Reverse Phase High Performance Flüssigchromatographie(HPLC)-Säule geladen. Als GDNF-Aktivität-enthaltend identifizierte Fraktionen werden für weitere Aufreinigung und für Proteinsequenzierung verbunden. Wie in Tabelle 1 unten gezeigt, hat das zu diesem Zeitpunkt erhaltene GDNF eine ungefähr 24000-fach über die des konditionierten Mediums hinausgehende spezifische Aktivität. Aminoterminales Sequenzieren des an diesem Punkt erhaltenen Proteins ergibt die aminoterminale Sequenz wie in 8 (SEQ ID NO: 1) gezeigt.
Weitere Aufreinigung des aus der HPLC erhaltenen GDNF kann durch Durchführung präparativer SDS-PAGE mit den die GDNF-Aktivität-enthaltenden Fraktionen durchgeführt werden. Zu den Protein-enthaltenden Fraktionen wird Glycerin und SDS-enthaltender Puffer gegeben und die Lösung wird auf nicht-reduzierten 15% SDS-PAGE durch Elektrophorese getrennt, die bei 10°C bei 40 mA/Gel für zwei Stunden durchgeführt wird. Für den Teil des Gels, der einem Molekulargewicht von ungefähr 30–42 kD entspricht, wurde durch Biotests gezeigt, dass er die GDNF-Aktivität enthält. Eine zweite HPLC-Chromatographie des aus SDS-PAGE isolierten Materials ergab, wie in 6 gezeigt, einen einzelnen GDNF-Gipfel. TABELLE 1. AUFREINIGUNG VON GDMF AUS B49-ZELL-KM

n. b.: (nicht bestimmt)

Die aminoterminalen Sequenzen von GDNF für das Material aus der HPLC wurden vor und nach präparativer SDS-PAGE bestimmt. Die verwendeten Verfahren zum Erlangen von Aminosäuresequenzen von auf gereinigtem GDNF sind im Beispiel 1D angegeben. Die Aminoterminale Sequenz wurde mit einem Gasphasenproteinsequenzierer erhalten. Innere Sequenzen wurden aus dem durch HPLC erhaltenem Material, das nicht weiter durch präparative SDS-PAGE aufgereinigt wurde, erhalten. Die innere Aminosäuresequenz wurde durch Inkubieren des auf gereinigten GDNF mit Trypsin erhalten. Die erhaltenen Trypsinfragmente wurden durch HPLC aufgetrennt. Es zeigte sich, dass ein Fragment die ersten 13 Aminosäurereste der aminoterminalen Sequenz des unbehandelten Proteins enthielt. Ein zweites Fragment wur de mit CNBr behandelt, durch HPLC aufgereinigt, reduziert und erneut durch HPLC aufgereinigt. Die erhaltene Aminosäuresequenz ist in 12 (SEQ ID NO: 2) gezeigt. Solche in Klammern angegebenen Sequenzen wurden mit einem geringen Grad an Sicherheit bestimmt.
Diese Erfindung beinhaltet ein Verfahren zum Klonieren des Gens für GDNF, und des Gens, das identifiziert wurde, welches für GDNF kodiert. Ein detailliertes Verfahren für das Klonieren von Genen für GDNF aus Ratte und Mensch ist unten im Beispiel 2 angegeben. Erneut werden die Fachmänner anerkennen, dass andere verfahren zum Klonieren solch eines Gens im Lichte der hiesigen Offenbarung offensichtlich sind. Im Besonderen werden das Klonieren für GDNF kodierender Gene aus anderen Arten in Hinsicht auf die Offenbarung und die hier beschriebenen Verfahren offensichtlich sein.
Das hier beschriebene Ratten-GDNF-Gen wurde aus einer cDNA-Bibliothek erhalten, die aus polyA⁺-RNA, die aus B49-Zellen isoliert wurde, hergestellt wurde, die mit einer degenerierten Oligonukleotidsonde, die auf der aus dem aufgereinigten GDNF erhaltenden Aminosäuresequenz basierte, durchmustert wurde. Die cDNA wurde Standardverfahren entsprechend erhalten, behandelt, um EcoRI-verdaute Linker zu enthalten, und in den λZapII-Klonierungsvektor eingefügt. Die verwendete Hybridisierungssonde war ³²P-markiert, und bestand aus dem folgenden degenerierten Oligonukleotid (SEQ ID NO: 7):
Es wurden verschiedene positive Klone erhalten, und ein Klon (λZapII76.1) wurde durch DNA-Sequenzierung positiv als für ein Teil von GDNF, der beim Entwerfen der degenerierten Sonde nicht verwendet wurde, kodierend identifiziert.
Das Verfahren zum Erhalten der Nukleinsequenz des in λZapII76.1 enthaltenen cDNA-Klons ist in Beispiel 2B unten angegeben. Die Nukleotidsequenz der ersten 877 Basenpaare des 5'-Endes des cDNA-Klons wurde bestimmt und ist in 13 (SEQ ID NO: 3) angegeben. In 13 enthält der gezeigte Klon einen offenen Leserahmen (ORF) von 227 Aminosäuren, der den Amino-Terminus von aufgereinigtem GDNF enthält und mit der Sequenz für eines inneren Peptids übereinstimmt, das durch Spaltung des auf gereinigten GDNF erhalten wurde.
Die in 14 (SEQ ID NO: 4) angegebene innere Aminosäuresequenz zeigt die Aminosäuresequenz für das "reife GDNF". Mit "reifem GDNF" ist die Sequenz von aufgereinigtem GDNF gemeint, das aus dem B49-konditionierten Medium erhalten wurde. Selbstverständlich kann das aufgereinigte GDNF als ein Dimer oder anderes Multimer vorkommen und kann glykosyliert oder chemisch in anderen Weisen modifiziert sein. Reifes GDNF kann am Carboxy-Terminus trunkiert sein, besonders durch proteolytisches Bearbeiten der Lys-Arg-Reste 6 und 5 Reste vom carboxylterminalen Ende. Untersuchungen der Nukleinsäuresequenz des λZapII76.1-Klons aus der Ratte, wie er in 13 (SEQ ID NO: 3) gezeigt ist, legen nahe, dass GDNF anfänglich als ein prä-pro-GDNF-Polypeptid translatiert wird und das proteolytisches Prozessieren der Signalsequenz und des "pro"-Teils dieses Moleküls zu aufgereinigtem GDNF führt, das die gleiche reife Sequenz aufweist, als das aus B49 konditioniertem Medium erhaltene. Es wird postuliert, dass das prä-pro-GDNF-Polypeptid am ersten ATG- – für Methionin kodierenden – Codon am 5'-Ende des Klons (Position 50 in 13) beginnt. Die vorliegende Erfindung umfasst deshalb alle und jegliche prä-pro-GDNF-Polypeptide, die aus dem in 13 gezeigten Gen translatiert werden können, ebenso wie alle und jede prä-pro-GDNF-Polypeptide, die aus einem vollständigeren Klon translatiert werden können, die von einem Fachmann unter Verwendung von Standardlaborverfahren und dem hier beschriebenen Klon einfach erhalten werden können.
Prüfung der in 13 (SEQ ID NO: 2) angegebenen Ratten-Nukleinsäuresequenz zeigt, dass die vorhergesagte Aminosäuresequenz zwischen den Positionen 518 und 538 Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu ist, was mit der Aminosäuresequenz übereinstimmt, die für ein Peptid bestimmt wurde, das aus auf gereinigtem reifen GDNF durch das in dem Abschnitt zur inneren Sequenz in Beispiel 1 unten beschriebenen Verfahren abgeleitet wurde. Ein TGA-Stoppcodon an Position 683 beendet den ORF. Die vorhergesagte Länge des auf gereinigten GDNF ist daher 134 Aminosäurereste und das vorhergesagte Molekulargewicht dieses Polypeptids ist 14931. Zwei mögliche N-verknüpfte Glykosylierungsstellen treten an Positionen 425 und 533 auf. Glykosylierung an einer oder beiden dieser Stellen würde das Molekulargewicht des Moleküls erhöhen.
Der Serinrest an Position 281, der mit dem Start der Sequenz des auf gereinigten reifen GDNF übereinstimmt, wird von der Sequenz Lys-Arg vorangegangen, die eine mögliche proteolytische Spaltungsstelle zum Prozessieren einer mutmaßlichen Vorläuferform von GDNF zur Verfügung stellt, um die Molekülform zu ergeben, die aus B49-Zellen auf gereinigt wird. Ein mögliches translationelles Startkodon (ATG) tritt an Position 50 in der Sequenz auf und wird eng gefolgt von einer möglichen sekretorischen Signalsequenz. Die dieses ATG flankierenden Sequenzen zeigen genügend Ähnlichkeit zur Kozak-Konsensussequenz (Kozak 1987 Nucleic Acids Res. 15: 125–48), um anzudeuten, dass dieses ATG als eine translationelle Startstelle verwendet werden könnte. Weiterhin ist dieses ATG das am meisten 5'-wärts gelegene ATG in der Sequenz des cDNA-Klons. Diese Daten legen es als eine mögliche Startstelle für die Translation einer Vorläuferform von GDNF nahe.
Diese oben angegebenen Eigenschaften der Nukleotidsequenz des cDNA-Klons aus der Ratte legen die Möglichkeit nahe, das GDNF anfänglich als ein prä-pro-GDNF-Polypeptid translatiert wird und das proteolytisches Prozessieren der Signalsequenz und des "pro"-Teils dieses Moleküls zur Bildung der GDNF-Form führt, die aus B49-Zellkonditioniertem Medium auf gereinigt wird. Dennoch ist auch das Auftreten von anderen GDNF-Formen mit den Sequenzdaten vereinbar. Beispielsweise treten zwei weitere mögliche ATG-Translationsstarts innerhalb des 681-Bp-ORF auf: einer an Position 206 und einer an 242. Diese ATGs sind stromaufwärts vom Start der aminoterminalen Sequenz von auf gereinigtem GDNF lokalisiert. Obwohl in Eukaryonten translationelle Initiation im Allgemeinen an dem am meisten 5'-wärts gelegenen ATG der mRNA auftritt (Kozak, loc. cit.), gibt es Beispiele, bei denen ein Teil der translationellen Initiation an einem stromabwärts gelegenen ATG geschieht. Daher können alternative Vorläuferformen von GDNF vorstellbar durch translationelle Initiation an diesen ATG-Kodons entstehen. Proteolytisches Prozessieren dieser Polypeptide könnte zu der Bildung der gleichen Form auf gereinigtem GDNF führen, die in B49-Zellkonditioniertem Medium beobachtet wird. Zudem erstreckt sich der offene Leserahmen über das 5'-Ende der Sequenz des cDNA-Klons hinaus. Es ist daher möglich, dass die Initiation der Translation an einem stromaufwärts gelegenem ATG stattfindet, das in dem cDNA-Klon nicht vorhanden ist. In diesem Fall würde GDNF als ein noch größerer Vorläufer translatiert, der die hier beschriebene Aminosäuresequenz und zusätzliche Sequenz stromaufwärts enthält. Prozessierung einer solchen hypothetischen Vorläuferform kann auch zur Bildung der aufgereinigten Form des GDNF führen, von der hier berichtet wird. Es wäre möglich, potentielle stromaufwärtsgelegene ATG-Starts durch Sequenzierung des 5'-Endes der das GDNF-Gen enthaltenden mRNA über Primer-Verlängerung mit reverser Transkriptase zu detektieren (Maniatis et al., loc. cit.). Zusätzlich könnten andere cDNA-Klone aus B49-Bibliotheken erhalten und die 5'-Enden dieser Klone sequenziert werden. Die Größe der stromaufwärts vom ersten ATG lokalisierten 5'-mRNA können etwas grober durch die Techniken der "S1-Kartierung" (Maniatis et al., loc. cit.) und/oder einfache Größenbestimmung von Primerverlängerungsprodukten der reversen Transkriptase-Reaktion bestimmt werden. Während eine Vielzahl von mutmaßlichen Formen des primären translationellen Produktes, das die für aufgereinigtes GDNF kodierende Sequenz enthält, postuliert werden können, definiert die partielle, hier präsentierte DNA-Sequenz für den cDNA-Klon, der in dem rekombinanten Phagen λZapII76.1 enthalten ist, eindeutig die kodierende Sequenz, welche das auf gereinigte GDNF-Polypeptid, das aus dem B49-Zellkonditioniertem Medium isoliert wurde, ausmacht.
In Beispiel 2C unten wird das Klonieren des menschlichen, für GDNF kodierenden Gens beschrieben. Eine menschliche genomische Bibliothek wurde mit einer Sonde durchmustert, die von der Ratten-cDNA, die in Beispiel 2B beschrieben ist, abgeleitet war. Ein genomischer DNA-Klon des menschlichen GDNF-Gens wurde identifiziert und die Sequenz des für reifes menschliches GDNF kodierenden Gens ist in 19 dargestellt (SEQ ID NO: 5).
Die in 19 angegebene Sequenz für das Gen für menschliches GDNF gibt nicht die gesamte kodierende Sequenz für den prä-pro-Teil des GDNF wieder. Das Verfahren zur Erlangung der kodierenden Sequenz für die ersten 50 Aminosäuren des menschlichen prä-pro-GDNF ist unten in Beispiel 2D beschrieben. Die erhaltene Sequenz ist in 22 (SEQ ID NO: 8) angegeben. Die Karte des Plasmids pB55K-λ3Alu1, die verwendet wurde, um die Sequenz zu erhalten, ist als 23 gezeigt.
Diese Erfindung schließt für GDNF kodierende Nukleinsäuresequenzen ein. Relativ hochgradig homologe Sequenzen, die für Ratten-(13)(SEQ ID NO: 3) und Menschen-(19)(SEQ ID NO: 5)GDNF kodieren, werden hier angegeben. Ebenfalls vom Umfang dieser Erfindung umfasst sind im Wesentlichen gleiche Nukleinsäuresequenzen, die für das gleiche oder hochgradig homologe Aminosäuresequenzen kodieren. Beispielsweise können, wenn ein Konstrukt zur Expression von reifem GDNF in einem bakteriellen Expressionssystem, wie z. B. E. coli, vorbereitet wird, bestimmte Kodons in der in 19 angegebenen Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 5) durch Kodons, die in E. coli besser exprimiert werden, entsprechend gut bekannter und Standardverfahren ersetzt werden. Solche modifizierten Nukleinsäuresequenzen wären vom Umfang dieser Erfindung umfasst.
Spezifische Nukleinsäuresequenzen können durch Fachleute modifiziert werden. Daher umfasst diese Erfindung alle Nukleinsäuresequenzen, die für die Aminosäuresequenzen für reifes GDNF aus Ratte und Mensch, wie in den 14 (SEQ ID NO: 4) und 19 (SEQ ID NO: 5) dargestellt, und prä-pro-GDNF aus der Ratte, wie in 13 (SEQ ID NO: 3) dargestellt, und für prä-pro-GDNF aus dem Menschen, wie in den 19 (SEQ ID NO: 5) und 22 (SEQ ID NO: 8) dargestellt, kodieren. Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Nukleinsäuresequenzen, die mit allen derartigen Nukleinsäuresequenzen – oder, wo angebracht, den Komplementen der Nukleinsäuresequenzen – hybridisieren und für ein Polypeptid mit dopaminerger Aktivität kodieren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäuresequenzen, die für Polypeptide kodieren, die dopaminerge Aktivität aufweisen und die durch Antikörper, die an GDNF binden, erkannt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch Vektoren, die Expression-regulierende Elemente operativ geknüpft an jede der Nukleinsäuresequenzen, die vom Umfang der Erfindung umfasst sind, umfassen. Diese Erfindung beinhaltet auch Wirtszellen – jeglicher Art –, die mit Vektoren transformiert wurden, die Expression-regulierende Elemente operativ verknüpft an jede der vom Umfang dieser Erfindung umfassten Nukleinsäuren, umfassen.
Die Expression von GDNF in COS-Zellen ist unten in Beispiel 5 beschrieben. Das für GDNF kodierende, in 13 dargestellte Gen wurde in den Plasmidvektor pSG5, einem für die transiente Expression von klonierten Genzellen, wie z. B. COS-Zellen, entworfenem Vektor, subkloniert. Plasmide, die das GDNF-Gen in der richtigen oder falschen Orientierung enthielten, wurden selektiert und die DNA in COS-7-Zellen transfiziert. Nach Kultivierung wurden die transformierten Zellen geerntet. Das COS-7-konditionierte Medium wurde auf Bioaktivität sowohl im dopaminergen Test als auch dem sympathischen Ganglienneuronen-Test getestet. Es stellte sich heraus, dass das konditionierte Medium von den Zellen, die das Gen für GDNF in der richtigen Orientierung enthielten, biologische Aktivität in beiden Tests aufwies, was anzeigte, dass biologisch aktives GDNF über rekombinante DNA-Verfahren erfolgreich hergestellt wurde.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird menschliches reifes GDNF durch rekombinante DNA-Technologie in einem bakteriellen Expressionssystem hergestellt.
Die Expression von menschlichem GDNF in E. coli wird unten in Beispiel 6 beschrieben. Der Teil des menschlichen GDNF-Gens, der für reifes menschliches GDNF wie in 19 gezeigt kodiert, wurde verwendet, um ein menschliches GDNF-Konstrukt herzustellen. Ein solches Konstrukt wurde in einen Plasmidvektor ligiert, der in den E. coli-Stamm JM107 transformiert wurde. Nach Kultivieren der transformierten Wirtszellen wurde das gebildete GDNF geerntet. Ein Protein mit dem erwarteten Molekulargewicht für reifes menschliches GDNF (ungefähr 15000 Daltons) wurde erhalten, und aminoterminale Sequenzierung bestä tigte, dass das erhaltene Protein reifes menschliches GDNF war.
Das Rückfalten und die Naturierung von in E. coli exprimiertem menschlichen GDNF wird unten in Beispiel 6C beschrieben. In der beschriebenen Ausführungsform der Erfindung wurde der erhaltene, das exprimierte Protein enthaltende Extrakt vor der Rückfaltung durch Ionenaustauschchromatographie auf S-Sepharose Fast Flow-Harz partiell auf gereinigt. Rückfaltung wurde durchgeführt durch Zugeben zu dem GDNF-enthaltendem Extrakt von: zuerst Dithiothreitol, dann Glutathion-Dinatriumsalz, dann einem Rückfaltungspuffer. Das rückgefaltete rhGDNF war im Wesentlichen biologisch voll aktiv und lag als ein Disulfid-gebundener Dimer in seiner biologisch aktiven Form vor. Das GDNF vor der Rückfaltung – und nach Reduktion des rückgefalteten Materials – lag in einem monomeren Zustand vor und war im Wesentlichen biologisch inaktiv.
GDNF kann auch durch Expression in anderen Expressionssystemen hergestellt werden. Beispielsweise könnte mit der für reifes menschliches GDNF kodierenden Nukleinsäuresequenz, wie sie in 19 gezeigt ist, ein Fachmann GDNF in anderen Expressionssystemen herstellen. Vektoren, welche die für GDNF kodierende Nukleinsäuresequenz operativ geknüpft an Expression-regulatierende Elemente enthalten, können in andere Mikroorganismen transformiert werden, einschließlich Bacillus, Pseudomonas und Hefe. Baculovirus-Expressionssysteme können auch verwendet werden.
Wie oben angegeben betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Behandeln von Nervenschädigungen in Patienten, die darunter leiden. Diese Verfahren umfassen die Verabreichung einer therapeutisch aktiven Menge eines menschlichen Proteingliär abgeleiteten neurotrophen Faktors (GDNF) an einen Patienten, der unter Nervenschädigung leidet.
Eine Krankheit oder medizinische Indikation wird als Nervenschädigung betrachtet, wenn das Überleben oder die Funktion von Nervenzellen und/oder ihren axonalen Fortsätzen gefährdet ist. In einer bevorzugten Ausführungsform entsteht eine derartige Nervenschädigung als Folge einer der folgenden Zustände: 1) Physikalische Verletzung, welche die Degenerierung der axonalen Fortsätze und/oder Nervenzellkörper nahe der Stelle der Verletzung verursacht; 2) Ischämie, wie beim Schlaganfall; 3) Exponierung gegenüber Neurotoxinen, wie z. B. den Krebs- und AIDS-chemotherapeutischen Wirkstoffen Cisplatin bzw. Dideoxycytidin (ddC); 4) Chronische metabolische Krankheiten, wie z. B. Diabetes oder renale Dysfunktion; und 4) (5)) Neurodegenerative Krankheiten, wie z. B. Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit und amyotrophe Lateralsklerose (ALS), welche die Degenerierung von spezifischen neuronalen Populationen verursachen. Eine nicht-abschließende Liste von Nervenschädigung zur Folge habenden Krankheiten beinhaltet Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, amyotrophe Lateralsklerose, Schlaganfall, diabetische Polyneuropathie, toxische Neuropathie, verursacht durch die Krebs-chemotherapeutischen Wirkstoffe Taxol oder Cisplatin oder Vincristine, toxische Neuropathie, verursacht durch die AIDS-chemotherapeutischen Wirkstoffe ddI oder ddC und physikalischen Schaden am Nervensystem, wie z. B. der, welcher durch physikalische Verletzung des Gehirns und Rückenmarks oder Quetschungs- oder Schnittverletzungen an Arm und Hand verursacht wird.
Verfahren zum Herstellen von GDNF sind hier ebenfalls offenbart. Ein offenbartes Verfahren besteht aus Isolieren von GDNF aus verschiedenen Quellen, wie z. B. Gliazelllinien-konditioniertem Medium. Ein zweites Verfahren beinhaltet Isolieren des Gens, das für die Kodierung von GDNF verantwortlich ist, Klonieren des Gens in geeignete Vektoren und Zelltypen und Exprimieren des Gens, um das GDNF zu bilden. Das letztere Verfahren, das exemplarisch für rekombinante DNA-Verfahren im Allgemeinen ist, ist ein bevorzugtes Verfahren der vorliegenden Erfindung. Rekombinante DNA-Verfahren werden teilweise bevorzugt, weil sie in der Lage sind, vergleichsweise höhere Mengen Protein mit größerer Reinheit zu erlangen. Rekombinantes menschliches GDNF ist das am meisten bevorzugte Protein für die Herstellung von therapeutischen Zusammensetzungen und für die Behandlung von Nervenschädigung.
Diese Erfindung beinhaltet Verfahren zum Identifizieren und Klonieren von Genen, die für Proteine kodieren, die Aminosäuresequenzhomologie mit GDNF teilen, ebenso wie alle solche identifizierten Proteine.
Ein Genfamilie aus Säugetieren, die sich aus drei neurotrophen Faktoren zusammensetzt, wurde beschrieben (Leibrock et al. 1989 Nature 341: 149–152, Maisonpierre et al. 1990 Science 247: 1446–1451). Die reifen Formen der drei diese Familie bildenden Proteine [Nervenwachstumsfaktor (NGF), aus dem Gehirn abgeleiteter neurotropher Faktor (BDNF) und Neurotrophin-3 (NT-3)] haben ungefähr 50% Aminosäureidentität untereinander. Die Positionen von sechs in jedem von diesen Proteinen vorhandenen Cysteinresten sind genau konserviert. Obwohl strukturell gleich, zeigen diese drei Proteine verschiedene Gewebeverteilungen (Ernfors et al. 1990 Neuron 5: 511–526, Maisonpierre et al. 1990 Neuron 5: 501–509 und Phillips et al. 1990 Science 250: 290–294) und unterschiedliche in vitro-Aktivitäten (Rosenthal et al. 1990 Neuron 4: 767–773, Whittmore et al. 1987 Brain Res Rev 12: 439).
GDNF zeigt keine signifikante Homologie zu einem vorher beschriebenen Protein, aber es können unidentifizierte Gene existieren, die für Proteine kodieren, die erhebliche Aminosäuresequenzhomologie zu GDNF aufweisen und welche in vivo als neurotrophe Faktoren mit unterschiedlichen gewebespezifi schen Verteilungsmustern und/oder unterschiedlichen Aktivitätsspektren funktionieren könnten. Solche Proteine würden Mitglieder der GDNF-Familie von neurotrophen Faktoren bilden. Die DNA-Sequenzen für die GDNF-Gene der Ratte und des Menschen, jeweils dargestellt in den 13 (SEQ ID NO: 3) und 19 (SEQ ID NO: 5) und 22 (SEQ ID NO: 8), könnten verwendet werden, um neue Mitglieder einer derartigen vermuteten "GDNF-Genfamilie" zu identifizieren.
Als eine Folge der Konservierung der Aminosäuresequenz zwischen Proteinprodukten der Mitglieder einer Genfamilie wie der oben angeführten "NGF-Genfamilie" oder der "GDNF-Genfamilie" gibt es eine beträchtliche Sequenzkonservierung auf dem DNA-Niveau. Daher kann unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen Nukleinsäure-"Kreuzhybridisierung" zwischen Genen innerhalb der Familie auftreten, d. h. eine aus der Sequenz von einem der Familienmitglieder abgeleitete Nukleinsäuresonde wird ein stabiles Hybriddoppelmolekül mit Nukleinsäuremolekülen von anderen Mitgliedern der Familie bilden, die zur Sonde verwandte, aber nicht identische Sequenzen aufweisen (Beltz et al. 1983 Methods in Enzymology 100: 266–285). Daher kann man durch Herstellen einzigartiger oder degenerierter DNA-(oder RNA-)Sonden auf Grundlage der Sequenz von GDNF aus der Ratte, Mensch oder einer anderen Art und Durchführen von Hybridisierungsexperimenten mit einer Vielzahl von Ziel-DNAs (oder RNAs) unter Bedingungen, die eine stabile Bildung von nicht-perfekt gepaarten Nukleinsäure-Duplexen erlauben, nach verwandten Genen suchen.
Solche Hybridisierungsbedingungen, oft "verringerte Stringenz" genannt, sind in der Literatur gut beschrieben (Beltz et al. loc. cit., Sambrook et al. 1989 Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press) und beinhalten häufig eine Verringerung der Temperatur in der Hybridisierungsreaktion, wenn diese in wässriger Lösung ausgeführt wird, und/oder Ver ringerung der Formamidkonzentration in Hybridisierungssystemen, die normalerweise 50% Formamid-enthaltende Lösungen einsetzen. Andere Mittel zum Verringern der Hybridisierungsstringenz wurden ebenfalls beschrieben und können angewendet werden (Sambrook et al., loc. cit.). Die Nukleinsäureziele in diesen Hybridisierungsexperimenten können einschließen:

1) genomische DNA-Bibliotheken, die DNA aus Mensch, Ratte oder jeglicher Säugetierart oder jeder anderen Art kloniert in jedem geeignetem Vektor, einschließlich Bakteriophagen, Plasmide, Cosmide, künstliche Hefechromosomen oder jeden anderen Typ Vektor enthalten;
2) cDNA-Bibliotheken, die aus RNA aus jedem Gewebetyp erhalten wurde, der aus jedem der oben angegebenen Organismen oder aus Kulturen jeden Typs von primären Zellen, die aus jedem der oben genannten Organismen erhalten wurden, oder aus jedem Typ stabiler Zelllinien, die momentan existieren oder aus jeder primären Zellkultur gebildet werden, erzeugt wurden;
3) genomische DNA wie in Punkt 1 oben beschrieben, die mit Restriktionsenzymen verdaut und für Southern Blot-Analyse durch Gelelektrophorese und Transfer auf einen soliden Träger vorbereitet wurde;
4) RNAs wie oben unter Punkt 2 beschrieben, die Elektrophorese und Transfer auf einen festen Träger für Northern Blot-Analyse unterworfen wird. Solche RNA können zelluläre Gesamt-RNA oder aufgetrennte polyA⁺-RNA enthalten.
5) Produkte aus Polymerase-Kettenreaktionen (PCR), die auf in GDNF vorkommenden Sequenzen basierende Oligonukleotidprimer verwendet und als Templates jede der in Punkt 1 bis 4 beschriebenen Nukleinsäurequellen verwendet.

Jede Nukleinsäuresequenz, von der gezeigt wird, dass sie an eine GDNF-basierende Sonde unter einer Reihe empirisch bestimmter Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, kann klo niert und durch jede einer Vielzahl von dem Fachmann gut bekannten Techniken sequenziert werden und der Grad der Sequenzhomologie kann direkt bestimmt werden, um Mitglieder einer GDNF-Genfamilie zu identifizieren. Ein derartiger Hybridisierungsansatz wurde verwendet, um NT-3 durch Durchmustern mit einer auf der NGF-Sequenz basierenden Sonde zu klonieren (Kaisho et al. 1990 FEBS Letters 266: 187–191).
Ein alternatives Verfahren zum Identifizieren von GDNF-Familienmitgliedern beinhaltet die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um Sequenzen von GDNF-Familienmitgliedern zu amplifizieren, gefolgt von Klonieren und Analyse der amplifizierten Sequenzen. Degenerierte (oder nicht-degenerierte) Oligonukleotidprimer für PCR können basierend auf der Sequenz von GDNF synthetisiert werden. Angesichts der Konservierung der Lokalisierung von Cystein und der Konservierung von Aminosäuresequenzen in der unmittelbaren Umgebung von den Cysteinresten, die für die NGF-Familie beobachtet wird, stellen die Bereiche um die Cysteine in reifem GDNF offensichtliche Kandidaten für die Primersynthese dar, jedoch kann eine Vielzahl anderer Primer ebenfalls aus dem reifen Protein und den prä-pro-Bereichen des Proteins ausgewählt werden. PCR-Reaktionen können unter Bedingungen von verringerter Anlagerungstemperatur ("annealing temperature") durchgeführt werden, welche eine Amplifikation nicht nur der GDNF-Sequenz, sondern der Sequenzen jedes GDNF-Familienmitglieds erlauben würde. Siehe Innis et al. 1990 PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications, Academic Fress. Die Produkte derartiger PCR-Reaktionen können durch Gelelektrophorese nach Größe selektiert, in einen geeigneten Vektor kloniert und die klonierte DNA sequenziert werden, um GDNF-Familienmitglieder zu identifizieren. Alternativ können die Klone zuerst durch Hybridisierung an eine für GDNF spezifische Sonde unter Bedingungen hoher Stringenz durchmustert werden, um GDNF-Klone zu identifizieren. Jeder Klon, der nicht in der Lage ist, an GDNF bei ho her Stringenz zu hybridisieren, würden dann sequenziert werden, oder derartige Klone können an eine GDNF-Sonde unter Bedingungen verringerter Stringenz hybridisiert werden, und jeder Klon, der unter diesen Bedingungen an die GDNF-Sonde hybridisiert, würde dann sequenziert werden.
Ein zweiter, PCR zum Klonieren von GDNF-Familienmitgliedern verwendender Ansatz wäre, die Produkte der oben beschriebenen PCR-Reaktion zu markieren und solche Produkte als eine Sonde zum Durchmustern oben aufgelisteter Nukleintargets unter Bedingungen von hoher und/oder niedriger Stringenz zu verwenden. Hybridisierende Klone oder Nukleinsegmente könnten wie oben im einzelnen dargelegt untersucht werden, um GDNF-Klone und Familienmitglieder zu identifizieren. Ein derartiger Ansatz wurde verwendet, um NT-3 basierend auf den Sequenzen von NGF und BDNF zu klonieren (Maisonpierre et al. 1990 Science 247: 1446–1451).
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine GDNF-enthaltende therapeutische oder pharmazeutische Zusammensetzung in einer effektiven Menge Patienten verabreicht, die unter Nervenschädigung leiden. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird GDNF therapeutisch verwendet, um unter Parkinson-Krankheit leidende Patienten zu behandeln. Fachleute sind vertraut mit der Vielzahl von Tests, die verfügbar sind zur Indizierung, welche Neuronen empfänglich für Behandlung mit GDNF sind, und die Bestimmung von anderen empfänglichen Neuronen, die für GDNF empfänglich sind, könnte ohne unnötiges Experimentieren durchgeführt werden. Der Fachmann könnte leicht bestimmen, wo das Produkt von GDNF im Körper exprimiert wird und welches die Gehalte von GDNF-Protein in jeder dieser Regionen sind. Der Fachmann könnte auch die Lokalisierung von Bindungsstellen für GDNF im gesamten Nervensystem bestimmen. Diese Information würde es dem Fachmann erlauben, die neuronalen Typen zu be stimmen, die wahrscheinlich auf GDNF ansprechen, was wiederum die geeignete klinische Indikationen für dieses Protein nahelegen würde. Geeignete Zellkultur- und Tierexperimente könnten dann durchgeführt werden, um die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass GDNF beim Behandeln solcher Indikationen nützlich wäre.
Für aufgereinigtes, aus B49-konditioniertem Medium isoliertes GDNF wurde auch gezeigt, dass es das Überleben von parasympathischen und sympathischen Nervenzellen in Kultur fördert. Diese Ergebnisse sind im Detail in Beispiel 4 beschrieben.
Da es möglich ist, dass die neurotrophe Funktion von GDNF durch ein oder mehrere diskrete und getrennte Teile vermittelt wird, ist es auch vorgesehen, dass das Verfahren der vorliegenden Erfindung durch Verabreichen einer therapeutischen Zusammensetzung durchgeführt wird, deren aktive Bestandteile aus dem Teil (oder den Teilen) von GDNF besteht, der/die GDNF-neurotrophe Funktion kontrolliert/kontrollieren.
Die therapeutische oder pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt parenteral durch Injektion oder direkt in die zerebrale Spinalflüssigkeit (CSF) durch kontinuierliche Infusion aus einer implantierten Pumpe verabreicht. Andere effektive Verabreichungsformen, wie z. B. parenterale Formulierungen zur langsamen Freigabe, inhalierbare Nebel, oral aktive Formulierungen oder Suppositorien sind ebenfalls vorgesehen. Ferner ist die Verabreichung in Verbindung mit einem oder mehreren Wirkstoffen vorgesehen, die in der Lage sind, die Infiltration von GDNF über die Blut-Gehirn-Schranke zu fördern. Ein bevorzugter Träger ist physiologische Salzlösung, aber es wird in Erwägung gezogen, dass auch andere pharmazeutisch verträgliche Träger, wie z. B. künstliches CSF, verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Träger und das GDNF eine physiologisch verträgliche Formulierung zur langsamen Freisetzung bilden. Das primäre Lösungsmittel in solch einem Träger kann entweder wässriger oder nicht-wässriger Natur sein. Zusätzlich kann der Träger andere pharmakologisch verträgliche Hilfsstoffe zum Modifizieren oder Erhalten des pH, der Osmolarität, der Viskosität, der Klarheit, der Farbe, der Sterilität, der Stabilität, der Auflösungsrate oder des Geruchs der Formulierung enthalten. Ebenso kann der Träger weiterhin andere pharmakologisch-verträgliche Hilfsstoffe zum Modifizieren oder Erhalten der Stabilität, der Auflösungsrate, der Freisetzung oder der Absorption oder der Durchdringung der Blut-Gehirn-Schranke des GDNFs enthalten. Solche Hilfsstoffe sind solche Substanzen, die normalerweise und üblicherweise verwendet werden, um Dosierungen für parenterale Verabreichung in entweder Einzeldosierungs- oder Multidosierungsform oder für direkte Infusion in das CSF durch kontinuierliche oder periodische Infusion aus einer implantierten Pumpe zu formulieren.
Wenn die therapeutische Zusammensetzung formuliert worden ist, kann sie in sterilen Gefäßen als eine Lösung, Suspension, Gel, Emulsion, Feststoff oder dehydriertes oder lyophilisiertes Pulver gelagert werden. Derartige Formulierungen können entweder in einer gebrauchsfertigen Form gelagert werden oder benötigen Rekonstituierung unmittelbar vor der Verabreichung. Die bevorzugte Lagerung von derartigen Formulierungen erfolgt bei Temperaturen niedriger als mindestens 4°C und bevorzugt bei –70°C.
Bevorzugt ist die Art der parenteralen Verabreichungen der GDNF-enthaltenden Formulierungen über einen subkutanen, intramuskulären, intrathekalen oder intrazerebralen Weg. Um die gewünschte Dosis von GDNF zu erhalten, können wiederholte tägliche oder weniger häufige subkutane oder intramuskuläre Injektionen verabreicht werden, oder GDNF kann kontinuierlich oder periodisch aus einer implantierten Pumpe gegeben werden. Die Häufigkeit der Gabe wird von pharmakokinetischen Parametern des GDNF in der Formulierung und vom verwendeten Weg der Verabreichung abhängen.
Um die gewünschte Dosierung von GDNF in dopaminergen und anderen beschädigten Nervenzellen, deren Zellkörper innerhalb des Gehirns und dem Rückenmark liegen, zu erreichen, wird erwogen, dass das GDNF in das Gehirn oder den subarachnoidalen Raum des Rückenmarks oder intrazerebroventrikulär verabreicht wird. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch sein und mit einer implantierbaren Pumpe mit konstantem oder programmierbarem Fluss oder durch periodische Injektionen erreicht werden. Die Verabreichung kann auch in Verbindung mit Wirkstoffen geschehen, die es dem GDNF erlauben, die Blut-Gehirnschranke zu durchdringen.
Es wird ebenfalls erwogen, dass bestimmte GDNF-enthaltende Formulierungen oral verabreicht werden. Bevorzugt ist das GDNF, das in dieser Weise verabreicht wird, eingekapselt. Das eingekapselte GDNF kann mit oder ohne solchen Trägern formuliert werden, die üblicherweise beim Zusammensetzen von festen Dosierungsformen verwendet werden. Bevorzugt ist die Kapsel so gestaltet, dass der aktive Teil der Formulierung an dem Punkt im gastrointestinalen Trakt freigesetzt wird, an dem die Bioverfügbarkeit maximiert und der prä-systemische Abbau minimiert ist. Zusätzliche Hilfsstoffe können eingeschlossen sein, um Absorption von GDNF zu erleichtern. Verdünnungsmittel, Aromastoffe, Wachse mit niedrigem Schmelzpunkt, pflanzliche Öle, Gleitmittel, Suspensionsmittel, Tabletten-zersetzende Wirkstoffe und Bindemittel können ebenfalls eingesetzt werden.
Unabhängig von der Art der Verabreichung wird die spezifische Dosis entsprechend dem ungefähren Körpergewicht oder der ungefähren Fläche der Körperoberfläche des Patienten berech net. Weitere Verfeinerungen der Berechnungen, die notwendig sind, die geeignete Dosierung zur Behandlung, die jede der oben angeführten Formulierungen umfasst, zu bestimmen, werden routinemäßig durch die Fachmänner durchgeführt und liegen innerhalb des Aufgabenbereichs, der durch sie routinemäßig ohne unnötige Experimentieren durchgeführt wird, besonders im Hinblick auf die hier offenbarten Dosierungsinformationen und Tests. Diese Dosierungen können ermittelt werden durch Verwendung der etablierten Tests zum Bestimmen der Dosierung, die in Verbindung mit geeigneten Dose-Response-Daten verwendet werden.
In einer Ausführungsform dieser Erfindung kann GDNF durch Implantieren von Zellen, die in der Lage sind, eine biologisch aktive Form von GDNF zu synthetisieren und sekretieren, Patienten therapeutisch verabreicht werden. Solche GDNF-produzierenden Zellen können Zellen sein, die natürliche Produzenten von GDNF sind (analog zu B49-Zellen) oder sie können Zellen sein, deren Fähigkeit, GDNF zu bilden, durch Transformation mit dem GDNF-Gen in einer Form, die geeignet zur Förderung seiner Expression und Sekretion ist, vermehrt wurde. Um eine mögliche immunologische Reaktion in Patienten durch Gabe von GDNF einer fremden Art zu minimieren, wird bevorzugt, dass die natürlichen GDNF-produzierenden Zellen menschlichen Ursprungs sind und menschliches GDNF bilden. Üblicherweise würde man Zellen durch Verfahren analog zu den in Beispielen 5 und 6 unten benutzten, durch Verwendung eines für menschliches GDNF kodierenden Expressionskonstruktes transformieren, damit diese menschliches GDNF exprimieren.
Zellen, die natürlicherweise in der Lage sind, menschliches GDNF zu sekretieren, können durch Verwendung der folgenden Werkzeuge identifiziert werden: (1) Oligonukleotide, die einen Teil der Boten-RNA für menschliches GDNF repräsentieren oder komplementär zu einem Teil der Boten-RNA für menschliches GDNF sind, können verwendet werden, um das menschliche GDNF-Produkt produzierende Zellinien durch Northern Blot-Analyse, "RNase-Protection", in situ-Hybridisierung, die Polymerase-Kettenreaktion oder andere verwandte Verfahren zu entdecken; oder (2) polyklonale oder monoklonale Antikörper, die menschliches GDNF erkennen, können verwendet werden, um Zellinien, deren Extrakte oder konditionierte Kulturmedien GDNF-Protein enthalten, durch Western Blot-Analyse, ELISA-Test, radioimmunologischen Test oder andere verwandte Verfahren zu entdecken. Eine bevorzugte Strategie ist, dass konditionierte Kulturmedien aus einer Serie von Zellen menschlichen Ursprungs mit Antikörpern gegen menschliches GDNF durch das Verfahren nach (2) oben zu durchmustern, um Zellen zu entdecken, die GDNF in ihr Kulturmedium sekretieren. Bestätigung des so gebildeten GDNF würde aus Aufreinigung und Aminosäuresequenzanalysen herrühren, durchgeführt wie mit dem von B49-Zellen gebildetem und in ihr Kulturmedium sekretiertem GDNF. Beispiel 7 unten beschreibt die Produktion und Isolierung von Antikörpern gegen menschliches rekombinantes GDNF.
Zellen, die GDNF natürlicherweise sekretieren, oder Zellen, die transformiert wurden, um menschliches GDNF zu sekretieren, können verwendet werden, um Patienten zu behandeln. Menschliche oder nicht-menschliche tierische Zellen können in semipermeablen polymeren Einfassungen ("enclosure") in Patienten implantiert werden, um Freisetzung von GDNF zu ermöglichen, aber Zerstörung der Zellen durch das Patientenimmunsystem zu verhindern. Alternativ können die eigenen Zellen des Patienten, die ex vivo transformiert wurden, um GDNF zu bilden, direkt in den Patienten ohne eine derartige Einkapselung implantiert werden.
Die Methodik der Membraneinkapselung von lebenden Zellen ist dem Fachmann geläufig und das Vorbereiten der eingekapselten Zellen und ihre Implantierung in Patienten kann ohne unnö tiges Experimentieren durchgeführt werden. Siehe US-Patent-Nummern 4892538; 5011472 und 5106627, von denen jedes ausdrücklich durch Bezugnahme hier drin aufgenommen wird. Ein System zum Einkapseln lebender Zellen ist in der PCT-Anmeldung WO 91/10425 von Aebischer et al., das ausdrücklich durch Bezugnahme hier drin aufgenommen wird, beschrieben. Siehe auch PCT-Anmeldung WO 91/10470 von Aebischer et al.; Winn et al 1991 Exper. Neurol. 113: 322–329; Aebischer et al. 1991 Exper. Neurol. 111: 269–275; Tresco et al. 1992 ASAIO 38: 17–23, von denen jede ausdrücklich durch Bezugnahme hier drin aufgenommen wird.
Vor allem können GDNF-sekretierende Zellen in das Striatum von Patienten mit Parkinson-Krankheit implantiert werden, um den terminalen Feldern von nigralen dopaminergen Neuronen GDNF zur Verfügung zu stellen, und in die Nigra, um den dopaminergen Zellkörpern GDNF zur Verfügung zu stellen. Solches lokal appliziertes GDNF würde Sprossen und Reinnervation des Striatums durch dopaminerge Endstücke fördern und die weitere Degenerierung der dopaminergen Nervenzellen verhindern oder verlangsamen.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet deshalb ein Verfahren zum Verhindern oder Behandeln von Nervenschädigung durch Implantieren von Zellen in den Körper eines sie benötigenden Patienten; derartige Zellen entweder selektiert auf ihre natürliche Fähigkeit, GDNF zu bilden, oder verändert, um GDNF zu sekretieren. Bevorzugt ist das sekretierte GDNF menschliches reifes GDNF, wenn der Patient ein Mensch ist.
Es sollte beachtet werden, dass die hier beschriebenen GDNF-Formulierungen für tierärztliche ebenso wie für menschliche Anwendungen verwendet werden können und dass der Begriff "Patient" nicht in beschränkender Weise aufgefasst werden soll. Im Fall tierärztlicher Anwendungen sollten die Dosierungsbereiche die gleichen wie oben angegeben sein.
Es wird verstanden, dass die Anwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung auf ein spezifisches Problem oder Problemfeld innerhalb der Fähigkeiten einer Person mit gewöhnlichen Fähigkeiten in Anbetracht der hier enthaltenen Lehren sein wird. Beispiele für typische Verwendungen der vorliegenden Erfindung werden sich in den folgenden Beispielen zeigen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Aufreinigung und Sequenzierung von GDNF
Dieses Beispiel beschreibt Verfahren für den Biotest und das Auf reinigen von GDNF. Es beschreibt auch Verfahren zum Herstellen des B49-Zelllinien-konditionierten Mediums, welches das Startmaterial für die Aufreinigung ist. Verfahren zum Erhalten der Aminosäuresequenz von auf gereinigtem GDNF und partieller Aminosäuresequenzen, die von dem aufgereinigtem Protein erhalten werden, werden ebenfalls beschrieben.
A. Materialien
Zeitlich aufeinander abgestimmte, schwangere Ratten stammen aus dem Labor von Zivie Miller, Allison Park, PA. Soweit nicht anders angegeben, stammen alle Reagenzien von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.
B. Biotest auf dopaminerge neurotrophe Aktivitäten
Kulturbedingungen
Dissoziierte mesenzephalische Zellkulturen wurden wie bereits beschrieben (Friedman und Mytilineou 1987 Neurosci. Lett. 79: 65–72) mit geringfügigen Änderungen hergestellt. In Kurzform wurde das rostrale mesenzephalische Tegmentum aus dem Gehirn von Sprague-Dawley-Rattenembryos am 16. Tag der Schwangerschaft unter dem Mikroskop unter sterilen Bedingungen präpariert, in Ca²⁺- und Mg²⁺-freier Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (Gibco, Gaithersburg, MD) gesammelt und mechanisch durch milde Zerreibung getrennt. Die Zellen wurden mit 100 μl pro Vertiefung auf 16-mm Durchmesser-Gewebekulturvertiefungen (Falcon, Lincoln Park, NJ, 24-Lochplatte), die 400 μl Medium enthalten, ausplattiert, um eine Dichte von 2,5–3,5 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung zu erhalten. Die Kulturvertiefungen wurden vorher einer 0,1 mg/ml Lösung aus poly L-Ornithin in 10 mm Natriumborat, pH 8,4, für drei Stunden bei 37°C ausgesetzt, dreimal in milli-Q H₂O und einmal in Earles ausgewogener Salzlösung (Gibco) gewaschen. Das Nährmedium (10/10) bestand aus mit Glukose (33 mM), Natriumbikarbonat (24,5 mM), Glutamin (2 mM), HEPES (15 mM), Penicillin G (5 U/ml), Streptomycin (5 μg/ml), 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (Gibco) und 10% hitzeinaktiviertem Pferdeserum (Gibco) ergänztem minimalen essenziellen Medium (MEM, Gibco). Die Kulturen wurden bei 37°C in einer 6,5% CO₂ enthaltenden Wasser-gesättigten Atmosphäre gehalten. Nach drei Stunden, wenn die meisten der Zellen an den Grund der Vertiefung adhäriert hatten, wurde das Medium durch 500 μl frisches Medium ersetzt. Zu diesem Zeitpunkt wurde eine serielle Verdünnung der Probe, die auf GDNF-Aktivität getestet werden sollte, im Duplikat in jede Vertiefung gegeben und die Platten in dem 37°C-Inkubator inkubiert. Nach einer Woche wurden die Kulturen für 24 Stunden mit Fluordeoxyuridin (13 μg/ml) und Uridin (33 μg/ml) behandelt, um übermäßige gliäre Proliferierung zu verhindern, und nachfolgend mit dem obigen Medium ohne fötalem Kälberserum gefüttert. Das Nährmedium wurde wöchentlich gewechselt.
Alternativ wurde chemisch definiertes serumfreies Medium verwendet, in dem das Serum durch eine Mischung von Proteinen; Hormonen und Salzen ersetzt war. Das definierte Medium (DM) bestand aus einer Mischung von MEM und F12-Nährmischung (beide von Gibco, 1 : 1; vol/vol) mit Glukose (33 mM), Glutamin (2 mM), NaHCO₃ (24,5 mM), HEPES (15 mM), ergänzt mit Transferrin (100 μg/ml), Insulin (25 μg/ml), Putrescin (60 μM), Progesteron (20 nM), Natriumselenit (30 nM), Penicillin G (5 U/ml) und Streptomycin (5 μg/ml). Die Osmolarität des DM wurde durch Zugabe von milli-Q H₂O auf 325 eingestellt. (110–125 ml H₂O/l). Bei Verwendung von DM sind wenige nicht-neuronale Zellen erkennbar, durch Morphologie oder Färben aus gliäres fibriläres saures Protein (GFAP), welches ein Astrozyten-spezifisches cytoskeletäres Protein ist. GNDF ist beim Stimulieren der Dopaminaufnahme in sowohl serumenthaltenden und definierten Medien aktiv. Alle in den folgenden Beispielen erreichten Tests wurden in serumenthaltendem Medium durchgeführt.
Der funktionelle Status der dopaminergen Neuronen kann in diesen Kulturen durch Messen der Dopaminaufnahme durch spezifische "Radikalfänger"("scavenger")-Transporter in den dopaminergen Neuronen und durch Auszählen der Anzahl von Neuronen, die positiv für das Dopaminsyntheseprotein Tyrosinhydroxylase sind, durch Verwendung von Immunhistochemie, analysiert werden. Die Möglichkeit einer signifikanten Kontaminierung der Kulturen mit den noradrenergen Neuronen, die ebenfalls Dopamin transportieren und auch Tyrosinhydroxylase enthalten, wurde ausgeschlossen durch sorgfältiges Sektieren und durch Nachweisen, dass die Dopamintransporter das für dopaminerge eher als für noradrenerge Neuronen charakteristische pharmakologische Profil aufweisen. Dopaminaufnahme in diesen Kulturen wird durch GBR12909, eines Inhibitors des Monoamintransporter auf dopaminergen Neuronen, mit einer ED₅₀ von 20 nM inhibiert. Im Gegensatz dazu ist mindestens 300-fach mehr Desipramin, eines Inhibitors des Monoamintransporters von (oder) noradrenergen Neuronen, notwendig, um die Dopaminaufnahme in ihren Kulturen zu inhibieren. Diese Werte sind solche, die für die Monoamintransporter in dopaminergen Neuronen berichtet wurden.
Probenvorbereitung
Alle Proben, die in Schritt 1 bis 3 der Aufreinigung (siehe Abschnitt C unten) erzeugt wurden, wurden, bevor sie auf dopaminerge neurotrophe Aktivität in den mesenzephalischen Zellkulturen getestet werden, wie folgt entsalzt. Einhundert μl des Mediums 10/10 (als ein Träger) wurden in ein Centricon-10 (Amicon) gegeben und konnten sich für 10 Minuten setzen. Aliquots der zu testenden Probe wurden zu dem Centricon zugegeben, gefolgt von 1 ml von Dulbeccos Hoch-Glukose modifiziertem Eagle-Medium ohne Bikarbonat, aber 10 mM HEPES, pH 7,2, (Lösung A) enthaltend, und bei 5000 × g für 70 Minuten zentrifugiert. Das Retentat (ungefähr 0,1 ml) wurde mit frischer Lösung A zurück auf 1,1 ml gebracht und zweimal rekonzentriert. Die Probe wurde durch eine 0,11 μm Ultrafree-MC sterile Durapore-Einheit (Millipore, Bedford MA) gefiltert, bevor sie in die Kulturvertiefung zugegeben wurde.
³H-Dopaminaufnahme
Aufnahme von tritiiertem Dopamin (³H-DA) wurde in den Kulturen an Tag 6 oder Tag 7 wie früher beschrieben (Friedman und Mytilineou (1987) Neurosci. Lett. 79: 65–72) mit geringfügigen Veränderungen durchgeführt, und alle Lösungen wurden bei 37°C aufbewahrt. In Kurzform wurde das Kulturmedium entfernt, zweimal mit 0,25 ml des Aufnahmepuffers, der aus Krebs-Ringers Phosphatpuffer, pH 7,4, bestand, der 5,6 mM Glukose, 1,3 mM EDTA, 0,1 mM Ascorbinsäure und 0,5 mM Pargylin, eines Inhibitors der Monoaminoxidase, enthielt, gespült. Die Kulturen wurden mit 0,25 ml 50 nM ³H-DA (New England Nuclear, Boston, MA, spez. Akt. 36–37 Ci/mmol) für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. ³HDA-Aufnahme wurde durch Entfernen der Inkubationsmischung gestoppt und Zellen wurden dann zweimal mit 0,5 ml des Aufnahmepuffers gewaschen. Um das ³H-DA den Zellen freizusetzen, wurden die Zellen mit 0,5 ml 95% Ethanol für 30 Min bei 37°C inkubiert und dann zu 10 ml Ecolite (ICN, Irvine, CA) zugegeben und in einem Szintillationszähler gezählt. Leerwerte wurden erhalten durch Zugabe zum Aufnahmepuffer von 0,5 mM GBR-12909 (RBI), einem spezifischen Inhibitor der hochaffinen Aufnahmepumpe der Dopaminneuronen (Heikkila et al. 1984 Euro J. Pharmacol. 103: 241–48), und waren für gewöhnlich niedriger als 5% der ³H-DA-Aufnahme in unbehandelten Kontrollkulturen. Die Anzahl der trophischen Einheiten (TU) der GDNF-Aktivität wurde definiert als der Kehrwert der Lösung, die 50% der maximalen Stimulierung der ³H-DA-Aufnahme der Kultur ergibt. Spezifische Aktivität wurde bestimmt durch Teilen der Anzahl Tu's durch die Menge des in der Probe vorhandenen Proteins.
C. Aufreinigung von GDNF
Ausgangsmaterial
B49-Glioblastomzellen, die von D. Schubert, Salk Institute, La Jolla, CA (siehe Schubert et al. 1974 Nature 249: 224–27) erhalten wurden, wurden bis zur Konfluenz in DMEM-Medium, das 10% fötales Kälberserum, 4 mM Glutamin, 50 U/ml Penicillin-G und 50 μg/ml Streptomycin enthielt, in Kulturgefäßen (225 cm², Costar, Cambridge, MA) angezogen. Das serumfreie Wachstums-konditionierte Medium (CM) wurde hergestellt durch einmaliges Waschen der Kultur mit 10 ml serumfreien Medium und dann Umsetzen der Zellen für zwei Tage in Gefäße mit 50 ml serumfreien Medium pro Gefäß. CM wurde gesammelt, und die Zellen wurden alle zwei Tage danach bis Tag 6 mit frischem serumfreiem Medium wieder aufgefüllt. Das kombinierte CM von drei Ernten jedes Lots Zellen wurde bei 5000 × g für 20 min bei 4°C zentrifugiert, um Zellen und Bruchstücke zu entfernen. Der Überstand wurde ungefähr 10-fach über einen Amicon-Konzentrator (YM10-Membran) konzentriert und bei 40000 × g für 20 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde durch eine 0,2 μ Mikrokulturkapsel (Gelman Sciences) gefiltert und konnte bei 4°C bis zu einem Monat gelagert werden.
Schritt 1. Heparin-Sepharose-Chromatographie
Die obige Zubereitung (200 mg Protein) wurde auf eine Säule (1 × 25 cm) Heparin-Sepharose CL-6B (Pharmacia, Piscataway, NJ) geladen, die mit 50 mM NaPi-Puffer, pH 8,0, der 0,15 N NaCl enthielt, (Puffer A) äquilibriert war. Die Säule wurde dann mit dem gleichen Puffer gewaschen, bis die optische Dichte des Durchfluss bei 280 mm (O. D₂₈₀) zur Grundlinie zurückkehrte, und mit einem 100 ml-linearem Gradienten eluiert, der von Puffer A in 50 mM NaPi, pH 8,0, das 1,5 N NaCl enthielt, (Puffer B) überging. 2 ml-Fraktionen wurden gesammelt. Fraktionen wurden auf Leitfähigkeit und die GDNF-Aktivität untersucht. 1 zeigt ein derartiges Chromatogramm. Das Profil von eluierten Proteinen ist als O. D₂₈₀ aufgezeichnet. Darübergelegt sind Abbildungen der in jeder Fraktion gemessenen Leitfähigkeit und GDNF-Aktivität. Die mit einem Balken gekennzeichneten Fraktionen mit Gipfel("peak")-GDNF-Aktivität (ungefähr 0,6–0,8 N NaCl) wurden für weitere Analysen vereint.
Schritt 2. FPLC-Superose-Chromatographie
Die obige Vereinigung ("pool") wurde über einen Amicon-Konzentrator (Amicon, Beverly, MA, YM10-Membran) auf 0,4 ml aufkonzentriert und auf einem Fast Protein-Flüssigchromatographie(FPLC)-Superose-12-Säule (Pharmacia) in 50 mM NaPi-Puffer, pH 7,4, der 0,5 N NaCl enthielt, mit einer Flussrate von 0,5 ml/min chromatographiert. Nach 14 min Elution wurden Fraktionen von 0,5 ml in silikonisierten Microfuge-Röhrchen, die 5 μl 0,4% Tween 20 enthielten, gesammelt. Aliquots jeder Fraktion wurden auf GDNF-Aktivität untersucht. 2 zeigt ein derartiges Chromatogramm mit dem bei O. D₂₈₀ verfolgten Proteinprofil und dem darübergelegten GDNF-Aktivitätsmuster. 85% der auf die Säule geladenen GDNF-Aktivität wurde in den Fraktionen #12–15 zurückgewonnen.
Schritt 3. RP-HPLC
Die obige Fraktion #14 wurde mit 10 μl 25% Trifluoressigsäure (TFA) angesäuert. Die Hälfte des angesäuerten Materials wurde auf eine Aquapore RP-300 C-8-Reverse Phase HPLC-Säule (Brownlee-Säule, Applied Biosystems, San Jo se, CA), 2,1 × 220 mm, mit engem Durchmesser geladen und mit einem H₂O/0,1% TFA : 80% Acetonitril/0,085% TFA-Gradienten eluiert. Protein-enthaltende Fraktionen wurden manuell in silikonisierte Microfuge-Röhrchen basierend auf der UV-Absorption bei 214 nm gesammelt. Aliquots jeder Fraktion wurden auf GDNF-Aktivität untersucht. 3 zeigt ein derartiges Chromatogramm mit dem bei O. D₂₁₄ verfolgten Proteinprofil und mit dem Aktivitätsmuster in dem unteren Feld. Fraktionen 5 und 6 enthielten ungefähr 90% der in RP-HPLC zurückgewonnenen Aktivität, während Fraktion 7 für die verbleibenden 10% der Aktivität verantwortlich zeichnete. 4 zeigt einen silbergefärbten SDS-PAGE-Gellauf der Fraktionen rund um den in 3 gezeigten GDNF-Aktivitätsgipfel.
Schritt 4. Präparative SDS-PAGE
Die den Gipfel ("peak") der GDNF-Aktivität enthaltenden Fraktionen 5 und 6 wurden vereint und in der Gegenwart von 10 μl 0,4% Tween 20 in einer Speed-Vac auf 20 μl aufkonzentriert. 1 μl 1 M Tris-Base und 5 μl 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, die 40% Glycerin und 5% SDS enthielt, wurden zu der Probe zugegeben, und auf nicht-reduzierten 15% SDS-PAGE (Laemmli 1970 Nature 277: 680–684) (Block von 0,075 × 14 × 11,5 cm, 20 Zahn-Kamm, 0,075 × 0,4 × 2,8 cm/Probenvertiefung) aufgetrennt. Elektrophorese wurde bei 10°C mit 40 mA/Gel für zwei Stunden durchgeführt. Der Gelstreifen wurde in 1,14 mm-Schnitte zerschnitten. Jeder Schnitt wurde in zwei kleinere Stücke geschnitten und mit drei aufeinanderfolgenden Wechseln von 25 μl 5 mM NaPi, pH 6,7, das 0,001 Tween 20 enthielt, über einen Zeitraum von 20 Stunden mit durchgehendem Schütteln bei 4°C eluiert. Die drei Aliquots eluierten Materials wurden vereint, auf GDNF-Aktivität getestet (5) und das Eluat mit der höchsten Aktivität (aus dem 30–42 kD in 5 entsprechenden Gelabschnitt #16–23) wurde vereint. Ein leerer Gelstreifen (auf dessen Anfang vor der Elektrophorese nur der SDS-PAGE-Probenpuffer geladen wurde) wurde als Kontrolle gleich behandelt.
Schritt 5. RP-HPLC
Das vereinte Geleluat wurde in einer Speed-Vac auf ungefähr 150 μl konzentriert, mit 20 μl 25% TFA angesäuert und einer RP-HPLC wie in Schritt 3 beschrieben unterzogen. Protein-enthaltende Fraktionen wurden manuell in silikonisierte Microfuge-Röhrchen basierend auf der O. D₂₁₄ gesammelt und auf GDNF-Aktivität getestet. 6 zeigt die Ergebnisse einer derartigen Chromatographie. Das Eluat von gleich großen leeren Gelschnitten wurde als eine Kontrolle ebenfalls einer RP-HPLC unterzogen. Der einzige signifikante O. D₂₁₄-Gipfel über dem Kontrollprofil in der Probe (6, Feld A gegen B) ist Gipfel 3, der 70% der auf die HPLC-Säule geladenen GDNF-Aktivität enthält. 7 zeigt den auf einem silbergefärbten SDS-PAGE Gel gelaufenen Gipfel 3. Die einzige sichtbare Färbung ist ein sehr breites Band zwischen 30–42 kD, die mit dem GDNF-Aktivitätsprofil übereinstimmt, das in präparativer SDS-PAGE (5) beobachtet wurde. Die Zusammenfassung einer typischen Aufreinigung ist in Tabelle I angegeben.
D. Aminosäuresequenz von aufgereinigtem GDNF
Aminoterminale Sequenz
Gipfel 3 in 6 wurde mit einem Gasphasen-Proteinsequenzierer (Applied Biosystems) sequenziert. Die erhaltene Sequenz ist in 8 dargestellt. Sequenzieren von Fraktionen mit der Gipfel-GDNF-Aktivität nach Schritt 3 der Aufreinigung (Fraktionen 5 und 6 in 3) ergab auch eine einzelne Sequenz, die identisch ist mit der in 8, die mit der aufgereinigten Probe erhalten wurde. Das einzige Material, das diese unterschiedlichen Fraktionen gemeinsam haben, ist das Material, das als ein Schmier zwischen 30–42 kDa läuft. Daher könnten die kontaminierenden Banden außerhalb der 30–42 kD-Bereiche, die in dem silbergefärbten Gel von Fraktionen 5 und 6 in 4 gesehen werden, a) in der Menge (< 1 Pikomol) zu klein sein, um mit der gegenwärtigen Technik sequenziert zu werden; b) in der Sequenz mit der 30–42 kD-Schmierbande verwandt sein; oder c) einen blockierten Amino-Terminus haben.
Innere ("internal") Sequenz
Eine GDNF-Zubereitung nach Schritt 3 der oben beschriebenen Aufreinigung wurde als Ausgangsmaterial verwendet, um innere Sequenz zu erhalten. Fraktionen 5 und 6 in 3 wurden in ein 9 μl 0,4% Tween-enthaltendes silikonisiertes Microfuge-Röhrchen vereint und in einer Speed-Vac auf 40 μl konzentriert. Zu der Probe wurden 160 μl 1% NH₄HCO₃ zugegeben, das 2,5 M Guanidiniumhydrochlorid und 1 μg Trypsin enthielt, und die Probe wurde über Nacht bei 37° inkubiert. Die Mischung wurde mit 20 μl 25% TFA angesäuert, in einer Speed-Vac auf ungefähr 150 μl konzentriert und Peptide auf einer Aquapore RP-300 C8-Reverse Phase HPLC-Säule (Brownlee-Säule), 2,1 × 220 mm, mit engem Durchmesser aufgetrennt und mit einem H₂O/0,1% TFA : 80% Acetonitril/0,085% TFA-Gradienten eluiert. Peptid-enthaltende Fraktionen wurden basierend auf der Absorption bei 214 nm manuell in silikonisierte Microfuge-Röhrchen gesammelt. 9 zeigt die Ergebnisse von einer derartigen Chromatographie. Die Sequenz von Gipfel 10 in 9 wurde als identisch zu den ersten 13 Aminosäureresten von der aminoterminalen Sequenz des unbehandelten in 8 gezeigten Proteins (SEQ ID NO: 1) bestimmt. Gipfel 37 in 9 wurde weiterhin mit CNBr behandelt. Die Probe wurde in einer Speed-Vac auf 20 μl konzentriert. Zu der Probe wurden 70 μl 90% Ameisensäure und 5 mg CNBr zugegeben und die Probe im Dunkeln über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Mischung wurde in einer Speed-Vac auf 20 μl konzentriert, mit 100 μl 0,1% TFA verdünnt und durch Reverse Phase-HPLC wie oben beschrieben aufgetrennt. 10 zeigt die Ergebnisse einer derartigen Chromatographie. Gipfel 1 in 10 wurde in einer Speed-Vac in Gegenwart von 5 μl 0,4% Tween 20 auf 20 μl konzentriert. Zu der Probe wurden 100 μl 1% NH₄HCO₃ und 5 μl 50 mM Dithiothreitol zugegeben und die Probe wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde inkubiert. Die Mischung wurde mit 10 μl 25% TFA angesäuert, in einer Speed-Vac auf 100 μl konzentriert und durch Reverse Phase-HPLC wie oben aufgetrennt. 11 zeigt die Ergebnisse einer derartigen Chromatographie. Sowohl Gipfel 33 als auch Gipfel 34 in 11 ergaben eine identische Sequenz (12) (SEQ ID NO: 2).
E. Eigenschaften von GDNF
Beweglichkeit auf SDS-PAGE
Ohne jegliche Hitzebehandlung der Probe und unter nicht-reduzierenden Bedingungen läuft GDNF auf SDS-PAGE als eine Schmierbande zwischen 31–42 kD. Wenn die Probe in Anwesenheit eines reduzierenden Agens (4% β-Mercaptoethanol) für drei Minuten auf 100°C erhitzt wird, läuft GDNF als diskrete mehrfache Banden zwischen 20–23 kD. Da ungefähr 50% der auf das Gel geladenen Bioaktivität unter ersteren (nicht-reduzierenden), aber nicht unter Letzteren (reduzierenden) Bedingungen zurückgewonnen werden konnten, könnte GDNF ein Disulfid-gebundenes Dimer sein und nur als ein Dimer aktiv sein. Während ein einzelner Aminoterminus nahe legt, dass die GDNF-Zubereitung im Hinblick auf die primäre Kernstruktur homogen ist, deutet der Schmier oder das mehrfache Bandenmuster auf ein heterogen glykosiliertes Protein hin.
Spezifische Aktivität
Auf gereinigtes GDNF hat eine geschätzte spezifische Aktivität von ungefähr 17 trophischen Einheiten/ng, was anzeigt, das halb-maximale Stimulierung der Dopaminaufnahme bei der relativ niedrigen Konzentration von ungefähr 60 pg/ml stattfindet. Die für aufgereinigtes GDNF gemessene spezifische Aktivität könnte wegen partieller Inaktivierung von GDNF während der Aufreinigung durch Exposition gegenüber bei der RP-HPLC verwendeten angesäuerten organischen Lösungsmitteln, und wegen der denaturierenden Bedingungen bei der SDS-PAGE ein wenig unterschätzt sein.
Spezifität von GDNF
GDNF wurde mit Hilfe seiner Fähigkeit, die Aufnahme von Dopamin in Dopaminneuronen zu erhöhen, auf gereinigt (20A). Um zu bestimmen, ob GDNF auch andere Anzeiger für Überleben und/oder Reifung der Dopaminneuronen hochreguliert, wurde auch Tyrosinhydroxylase(TH)-Immunreaktivität in den mesenzephalischen Kulturen gemessen. TH ist in den Kulturen ein für Dopaminneuronen spezifischer Marker. Die Hochregulierung der Immunreaktivität durch GDNF könnte wegen des erhöhten Überlebens von Dopaminneuronen und/oder wegen einer Erhöhung der Bildung von TH pro Dopaminneuronen eintreten. Auf gereinigtes GDNF, das am Tag der Plattierung zugegeben wurde, und Kulturen, die acht Tage danach untersucht wurden, führten zu einer zehnfach höheren Anzahl von TH⁺-Neuronen gegenüber Kontrollen ohne GDNF. Wenn eine zweite Dosis GDNF am Tag 9 zugegeben wurde und Kulturen sieben Tage später (16 Tage in vitro) untersucht wurden, konnte ein ähnlicher Dosisabhängiger Anstieg gegenüber Kontrollen immer noch beobachtet werden (20B). Daher könnte GDNF das Überleben von Dopaminneuronen erhalten und/oder die Expression des TH-Gens in mesenzephalischen Dopaminneuronen erhöhen.
Um zu zeigen, dass GDNF eine spezifische stimulierende Wirkung auf die Reifung und/oder das Überleben von Dopaminneuronen und nicht eine allgemeine Wirkung auf alle Neuronen ausübt, wurde die Empfänglichkeit von Neuronen, die γ-Aminobuttersäure (GABA), die ebenfalls in den mesenzephalischen Kulturen anwesend ist, enthalten, gegenüber GDFN untersucht. H³-Dopamin(³H-DA)- und ¹⁴C-GABA-Aufnahme wurde in Schwesterkulturen mesenzephalischer Zellen gemessen, die jeweils mit unterschiedlichen Konzentrationen von GDNF für 15 bzw. 16 Tage angezogen wurden. Wie oben beschrieben, erhöht GDNF die ³H-DA-Aufnahmekapazität von mesenzephalischen Dopaminneuronen ~150% gegenüber Kontrollen ohne GDNF (21A). Jedoch hat GDNF keinen signifikanten Einfluss auf die Kapazität von GABA-Neuronen, ¹⁴C-GABA aufzunehmen, da die ¹⁴C-GABA-Aufnahme in Ge genwart von GDNF nur ~20% höher war als die der Kontrolle (21B). Dies wird auch veranschaulicht durch die Erhöhung in dem berechneten ³H-DA/¹⁴C-GABA-Aufnahmeverhältnis (21C). Diese Daten zeigen, dass Dopamin- und GABA-mesenzephalische Neuronen in Gegenwart von GDNF unterschiedlich reagieren, und dass der stimulierende Einfluss von GDNF auf die ³H-DA-Aufnahme in mesenzephalischen Kulturen spezifisch für Dopamin im Gegensatz zu GABA-Neuronen ist.
Diese Beobachtungen erläutern darüber hinaus, warum GDNF verwendet werden kann, um Parkinson-Krankheit oder andere, dopaminerge Neuronen einbeziehende Krankheiten, zu behandeln. Diese Ergebnisse zeigen, dass GDNF mindestens zwei wichtige Eigenschaften von dopaminergen Neuronen hochreguliert: Dopaminaufnahme und TH-Enzymgehalte. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die Einflüsse von GDNF zumindest teilweise spezifisch für dopaminerge Neuronen sind, da GABA-Neuronen nicht gleichermaßen betroffen sind.
Zusätzlich zu dopaminergen und GABAergen Neuronen gibt es in den mesenzephalischen Kulturen aus Rattenembryo eine weitere neuronale Population, serotonerge Neuronen. Einige Faktoren, wie z. B. epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), der Dopaminaufnahme durch dopaminerge Neuronen in mesenzephalischen Kulturen erhöht, erhöhen auch die Serotoninaufnahme durch die serotonergen Neuronen und die GABA-Aufnahme durch GABAerge Neuronen. Siehe, Casper et al. 1991 J. Neurosci. 30: 372. Dies deutet darauf hin, dass diese Faktoren nicht spezifisch für dopaminerge Neuronen sind.
Im Gegensatz dazu kann GDNF die Aufnahme von Serotonin durch die serotonergen Neuronen nicht erhöhen. ³H-Serotonin-Aufnahme wurde in der gleichen Weise wie die ³H-DA-Aufnahme, wie in Beispiel 1B beschrieben, gemessen, mit der Ausnahme, dass der Aufnahmepuffer 50 nM ³H-Serotonin (11 Ci/mol, Amersham, Arlington Heights, IL) anstelle von ³H-DA enthielt. In Gegenwart von 10 μM Citalpram (erhalten von Dr. C. Mytilineou, Mount Sinai School of Medicine), einem bekannten wirksamen Inhibitor der Serotoninaufnahme in Serotoninneuronen, war die ³H-Serotonin-Aufnahme auf 15% reduziert. Kontrollwerte in Gegenwart von Citalpram wurden von in 24 gezeigten experimentellen Daten abgezogen.
Im Gegensatz zu nicht-spezifischen Faktoren wie EGF, erhöht GDNF die GABA-Aufnahme (21) und Serotonin-Aufnahme (24) nicht unter Bedingungen, unter denen die Dopamin-Aufnahme signifikant erhöht ist. Diese und die oben beschriebenen Resultate deuten darauf hin, dass GDNF für dopaminerge Neuronen in den mesenzephalischen Kulturen beim Vergleich mit den GABAergen und serotonergen Neuronen, die in den gleichen Kulturen vorhanden sind, spezifisch ist. Eine derartige Spezifität erhöht die Nützlichkeit von GDNF zum Behandeln von Parkinson-Krankheit, die als Krankheit betrachtet wird, die spezifisch für die mesenzephalischen (nigralen) dopaminergen Neuronen ist.
Beispiel 2. Klonieren des Gens für GDNF
A. Klonieren einer für GDNF kodierenden cDNA-Kopie des Rattengens
Um das für GDNF kodierende Gen zu klonieren, wurde eine cDNA-Bibliothek aus poly A⁺-RNA, die aus B49-Zellen isoliert wurde, konstruiert, und diese Bibliothek wurde mit einer degenerierten Oligonukleotidsonde, die auf der aus aufgereinigtem GDNF erhaltenen Aminosäuresequenz basierte, durchmustert. Ein cDNA-Klon, der an diese Sonde hybridisierte, wurde durch DNA-Sequenzierung als DNA-Sequenzen enthaltend bestimmt, die 3' zu den Sequenzen lokalisiert sind, die in der degenerierten Oligonukleotidsonde verwendet wurden, die für eine in GDNF vor handene Aminosäuresequenz kodieren und carboxyterminal zur Aminosäuresequenz, auf der die Oligosonde für das Durchmustern basierte, lokalisiert sind.
Kulturbedingungen für die B49-Zelllinie sind im Detail in Beispiel 1 oben beschrieben. Für die RNA-Gewinnung wurden Zellen bis nahe der Konfluenz in serumenthaltendem Medium angezogen, einmal in serumfreiem Medium (DMEM) gewaschen und für vier Tage in DMEM mit einem Mediumwechsel nach zwei Tagen angezogen. Die Zellen wurden dann geerntet und Gesamt-RNA durch das Verfahren von Chomczynski und Sacchi 1987 Analytical Biochemistry 162: 156–159 extrahiert. Polyadenylierte RNA wurde aus dieser Gesamt-RNA durch Passieren über eine oligo dT-Zelluloseaffinitätssäule wie von Maniatis et al. 1989 Molecular Cloning 2. Auflage, CSH Press, beschrieben aufbereitet.
Synthese von cDNA wurde unter Verwendung von M-MLV RnaseH^– reverser Transkriptase (Bethesda Research Lab, Gaithersburg, MD) gemäss den vom Verkäufer beschriebenen Protokollen durchgeführt. Die Erststrangreaktion wurde mit einem oligo dT₁₅-Primer (Pharmacia) gestartet ("primed") und umfasste außerdem 8 Einheiten RNasin (Promega, Madison, WI) pro 5 μg poly A⁺-RNA. Zweitstrangsynthese wurde durch E. coli-DNA-PolymeraseI, E. coli-RNaseH und E. coli-DNA-Ligase (alle von BRL) entsprechend dem Protokoll des Verkäufers gesteuert. Um Klonieren zu vereinfachen, wurde die cDNA mit T4-DNA-Polymerase (BRL) behandelt, um bündige Enden zu erzeugen, und mit EcoRI-Methylase (BRL) methyliert. Diese Schritte wurden in Übereinstimmung mit den vom Enzymverkäufer herausgegebenen Protokollen durchgeführt. Die cDNA wurde dann zweimal mit einem Volumen einer 1 : 1-Mischung von Phenol und Chloroform extrahiert und die wässrige Fraktion mit 1/2 Volumen 7,5 M NH₄Ac und 3 Vol Ethanol bei Raumtemperatur ausgefällt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugation für 15 min bei Raumtemperatur mit 16000 × g gewonnen, mit 70% Ethanol gewaschen, vakuumgetrocknet und in 50 μl 50 mM Tris-HCl (7,6), 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% PEG8000, die 500 Pikomol phosphorylierten Linker (CCCGAATTCGGG, Pharmacia) (SEQ ID NO: 9) und 3 Einheiten T4-DNA-Ligase (BRL) enthielt, resuspendiert. Die Linkerligation wurde bei 16°C über Nacht (–16 h) durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert und wie oben ausgefällt. Das gewaschene Sediment wurde getrocknet und in 50 μl EcoRI-Verdaupuffer (100 mM Tris-HCl (7,5), 5 mM MgCl₂, 50 mM NaCl und 0,025% Triton X-100), zu dem 400 Einheiten EcoRI (New England Biolabs, Beverly, MA) zugegeben wurden, resuspendiert. Die Reaktion wurde bei 37°C für 2 h inkubiert. Nach Ausfällen (wie oben) wurde das Sediment in EcoRI-Verdaupuffer resuspendiert und eine zweite Runde EcoRI-Verdau wie oben beschrieben durchgeführt. Diese Reaktion wurde ausgefällt und in 40 μl 10 mM Tris-HCl (8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl resuspendiert. Diese cDNA, die jetzt EcoRI-verdaute Linker enthielt, wurde durch Zentrifugation über eine Sephacryl S300 (Pharmacia) Spin-Säule bei ungefähr 1100 g für 5 min größenfraktioniert. Der Durchfluss von dieser Säule wurde gesammelt, wie oben Ethanolgefällt und in 10 mM Tris-HCl (8,0), 1 mM EDTA bei einer Konzentration von ungefähr 0,1 μg/μl resuspendiert.
Eine cDNA-Bibliothek wurde in dem λZapII-(Stratagene, La Jolla, CA)Klonierungsvektor konstruiert. Typischerweise wurden 1 μg EcoRI-verdaute und phosphatierte Vektorarme (gekauft von Stratagene) an 0,1 μg mit EcoRI-Linkern versehene cDNA in einer 5 μl-Ligation durch Verwendung von ungefähr 3 Weiss-Einheiten T4-DNA-Ligase (NEB) in 50 mM Tris-HCl (7,6), 7 mM MgCl₂, 1 mM DTT, 5% PEG 8000 und 1 mM ATP ligiert. Ligationen wurden bei 16°C über Nacht durchgeführt. Ligationen wurden in GigapackII Gold-Verpackungsextrakten (gekauft von Stratagene) gemäss den vom Verkäufer zur Verfügung gestellten Protokollen verpackt. Bibliotheken wurden für das Titern und Durchmustern auf dem XL1-Blue-Wirt, der von Stratagene zur Verfügung gestellt wurde, ausplattiert.
Von einer derartigen Ligation und Verpackung wurden ungefähr 270000 Plaque-bildende Einheiten auf einer Gesamtheit von 12 Petrischalen mit 150 mm Durchmesser ausplattiert. Nitrozellulose-Filterabzüge wurden im Duplikat von diesen Platten nach dem von Maniatis et al. beschriebenen Verfahren angefertigt. Die Filter wurden an das folgende, ³²P-markierte degenerierte Oligonukleotid (SEQ ID NO: 7) (I = Inosin) hybridisiert:
Diese Sequenz basiert auf der Aminosäuresequenz (8) (SEQ ID NO: 1), die wie in Beispiel 1 oben beschrieben, um den Amino-Terminus von aufgereinigtem GDNF (SEQ ID NO: 10) herum erhalten wurde:
Pro-Asp-Lys-Gln-Ala-Ala-Ala
Das Oligonukleotid wurde mit aus ³²P-ATP (Amersham, Arlington Heights, IL) stammenden ³²P durch Verwendung von T4-Polynukleotidkinase (Pharmacia oder United States Biochemical, Cleveland, OH) markiert. Hybridisierungsreaktionen wurden in 6 × SSPE, 0,1% SDS, 0,1 mg/ml tRNA (SIGMA, St. Louis, MO) und 2 × Denhardts Reagenz (4 mg/ml von jeweils: Ficoll, Polyvinylpyrrolidin, BSA-Fraktion V) bei 50°C über Nacht (ungefähr 16 h) durchgeführt. Die Hybridisierungslösung enthielt 2–3 × 10⁶ cpm des markierten Oligo pro ml der Lösung. Auf die Hybridisierung folgend wurden die Filter zweimal bei Raumtemperatur in 2 × SSPE, 0,1% SDS und zweimal in der gleichen, auf 50°C vorgewärmten Lösung gewaschen. Die Filter durften an der Luft trocknen und wurden für sieben Tage bei –70°C unter Verwendung von Verstärkerfolien einem Film exponiert.
Die entwickelten Filme wurden untersucht, um Plaques zu identifizieren, die an das durchmusternde Oligonukleotid hybridisierten. In diesem primären Durchmustern wurden 24 vermutlich doppelte Positive identifiziert. Diesen positiven Signalen entsprechende Bereiche der Bibliotheksplatten wurden ausgeschnitten, resuspendiert und für eine zweite Runde des Durchmusterns mittels des oben beschriebenen Hybridisierungsverfahrens erneut plattiert. Acht der ursprünglich 24 wurden in diesem zweiten Durchmustern erneut als Positive getestet, während 16 negative Resultate ergaben. Diese acht Positiven wurden Plaque-aufgereinigt durch 1 oder 2 zusätzliche Runde(n) Hybridisierung und sechs von ihnen wurden anschließend durch DNA-Sequenzierung untersucht, um zu bestimmen, ob sie DNA-Sequenzen enthalten, die für GDNF kodieren könnten.
Der Phagemid-Teil des λZapII-Phagen, der die klonierten Inserts enthält, wird als pBluescript SK-bezeichnet. Das pBluescript SK-Phagemid wurde aus jedem der λZapII-Rekombinanten, die an die Oligonukleotidsonde hybridisierten, ausgeschnitten. Das Verfahren für in vivo-Exzision des rekombinanten pBluescript SK-Plasmids aus dem λZapII-Vektor wird im Detail durch die Protokolle des Verkäufers dargestellt. In Kurzform: Koinfektion von λZapII und einem M13-"Helfer"-Phagen führt zu Verpacken einer einzelsträngigen DNA-Kopie des rekombinanten pBluescript innerhalb eines infektiösen M13-Virions. Wenn ein derartiges Virion eine empfängliche Zelle infiziert, wird die einzelsträngige DNA in eine doppelsträngige DNA umgewandelt und vertikal als ein Plasmid propagiert. Selektion auf dieses Ereignis wird durch das auf pBluescript SK-kodierte Ampicillinresistenzgen geleistet. Daher wurden die E. coli XL1-Blue-Derivate, die das "gerettete" rekombinante pBluescript SK-Plasmid aus jedem der acht positiven λZapII-Klone enthielten, mit den von Stratagene beschriebenen Protokollen und durch Einsatz des "Helfer"-Phagen, der zusammen mit dem λZapII-Vektor zur Verfügung gestellt wurde, leicht erhalten.
Zur DNA-Sequenzierung wurde doppelsträngige Plasmid-DNA aus sechs dieser rekombinanten Plasmide durch ein auf Birnboim und Doily 1979 NAR 7: 1513–1523 basierendem "Mini-Präp"-Verfahren zubereitet. DNA-Sequenzierungsreaktionen, die das Dideoxy-Kettenterminierungsverfahren einsetzen, wurden unter Verwendung dieser Templates und des Durchmusterungsoligo als dem Primer durchgeführt. Reagenzien zum Sequenzieren wurden als ein Kit (Sequenase Version 2.0) von United States Biochemical erhalten und Sequenzierungsverfahren entsprechend den vom Verkäufer zur Verfügung gestellten Protokollen durchgeführt. Ein Klon, pBluescript SK-76.1, der aus dem Klon λZapII76,1 abstammte, lieferte die folgende Sequenz (SEQ ID NO: 11):
Diese Sequenz kann translatiert werden, um die folgende Aminosäuresequenz zu liefern (SEQ ID NO: 12):
Glu-Arg-Asn-Arg-Gln-Ala-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro,
welche der Aminosäuresequenz entspricht, die für einen, 5 Aminosäurereste carboxyterminal zum Ende der Aminosäuresequenz, die verwendet wurde, um das Oligo für die Durchmusterung/den Sequenzierungsprimer zu erzeugen, beginnenden Bereich bestimmt wurde. Dieses Ergebnis zeigt, dass der in λZapII76.1 enthaltende cDNA-Klon für einen Teil des, oder das gesamte aus dem B49-zellkonditioniertem Medium auf gereinigte GDNF-Protein kodieren muss.
B. Nukleotidsequenz des Bereichs des cDNA-Klons λZapII76.1, der die kodierende Sequenz für GDNF beinhaltet
Die Nukleotidsequenz der ersten 877 Basenpaare des 5'-Endes des cDNA-Klons wurde bestimmt. Es wurde gefunden, dass dieser Bereich einen offenen Leserahmen (ORF) von 227 Aminosäuren enthält, der die für den Amino-Terminus von aufgereinigten GDNF erhaltene Aminosäuresequenz und eine Sequenz enthält, die mit dem durch Spalten des aufgereinigten GDNF erhaltenen internen Peptid übereinstimmt. Die für dieses ORF vorhergesagten carboxyterminalen 134 Aminosäuren umfassen die vorhergesagte Aminosäuresequenz des aufgereinigten reifen GDNF-Proteins. Die vorangehenden 93 Aminosäuren enthalten ein potentielles Start-ATG-Codon gefolgt durch eine mutmaßliche Sekretions-Signalsequenz und enthält potentielle proteolytische Prozessierungsstellen zur Abspaltung eines Vorläufers oder einer "prä-pro"-Form des Proteins, um die oben in Beispiel 1 beschriebene reife, auf gereinigte Form des GDNF zu erzeugen.
Template-DNA für Sequenzierungsreaktionen beinhaltete einzelsträngige und doppelsträngige Versionen der pBluescript SK-76.1-Plasmid-DNA. Doppelsträngige DNA wurde aus Kulturen von XL1-Blue (pBluescript SK-76.1) durch ein "boiling prep"-Verfahren (Anal. Biochem 114: 193:97) zubereitet und in einem CsCl-Dichtegradienten als Bande gewonnen. Einzelsträngiges Template wurde durch Infektion von XL1-Blue (pBluescript SK-76.1) mit einem vom Verkäufer (Stratagene) herausgegebenen "Helfer"-M13-Phagen unter Verwendung der relevanten, zusammen mit dem Phagen herausgegebenen Protokolle hergestellt. Einzelsträngige Oligonukleotidprimer von 15 bis 23 Nukleotiden Länge wurden auf einem Applied Biosystems-(Foster City, CA)DNA-Synthetisierer, Modell 380A-Synthetisierer, synthetisiert und im Allgemeinen ohne Aufreinigung verwendet. Die Sequenzbestimmung wurde durch Verwendung des Dideoxy-Ketten terminierungsverfahren durchgeführt. Die verwendeten Reagenzien waren in dem Sequenase Version 2.0-Kit (United States Biochemical) enthalten und wurden in Übereinstimmung mit den durch den Verkäufer herausgegebenen Protokollen verwendet.
Die Nukleotidsequenz der ersten 877 Nukleotiden des 5'-Endes des cDNA-Klons λZapII76.1, welcher die kodierende Sequenz für das aufgereinigte reife GDNF-Protein enthält, ist in 13 (SEQ ID NO: 3) zusammen mit der gefolgerten Aminosäuresequenz eines offenen Leserahmens (ORF) von 681 Basenpaaren, der innerhalb dieser Sequenz zu finden ist, dargestellt. Die dem auf gereinigten reifen GDNF entsprechende Sequenz beginnt an Position 281 mit einem Serinrest und ist in 14 (SEQ ID NO: 4) gezeigt. Die für diesen Bereich erhaltene DNA-Sequenz sagt eine Aminosäuresequenz voraus, die vollständig mit den ersten 23 Resten der Aminosäuresequenz übereinstimmt, die am Amino-Terminus von aufgereinigtem GDNF beobachtet wurde (siehe Beispiel 1).
Basierend auf einer Untersuchung des Gens, wie es in 13 dargestellt ist, ist es wahrscheinlich, dass GDNF anfangs als ein prä-pro-GDNF-Polypeptid translatiert wird und das proteolytisches Bearbeiten der Signalsequenz und des "pro"-Teils dieses Moleküls zur Bildung der GDNF-Form führt, die aus B49-zellkonditioniertem Medium aufgereinigt wird. Die am meisten wahrscheinliche Stelle eines Translationsstarts für eine derartige prä-pro-Form ist das ATG-Kodon, das an Position 50 in der Sequenz aus 13 (SEQ ID NO: 3) vorkommt.
C. Klonieren des für GDNF kodierenden menschlichen Gens
Die Aminosäuresequenzen vieler neurotropher Faktoren sind in einer Auswahl von Säugetierarten hochgradig konserviert (Hallböok, et al. 1991 Neuron 6: 845–858; McDonald, et al. 1991 BBA (im Druck)). Als eine Folge der Konservierung der Ami nosäuresequenzen gibt es eine beträchtliche Konservierung der Nukleotidsequenzen der Gene, die für diese Proteine kodieren. Daher ist es im Allgemeinen wahr, dass das für einen neurotrophen Faktor in einer Säugetierart kodierende Gen unter geeigneten Anlagerungsbedingungen mit den für diesen Faktor in anderen Säugetierarten kodierenden Genen kreuzhybridisieren (d. h. einen stabilen doppelsträngigen DNA-Hybrid bilden) kann. Diese Eigenschaft wurde verwendet, um klonierte menschliche DNA-Segmente zu identifizieren, die das Gen für GDNF enthalten.
Eine in dem Vektor λFIXII konstruierte menschliche genomische Bibliothek wurde von Stratagene erworben (Katalog-Nr. 946203) und unter Verwendung einer aus dem Ratten-cDNA-Klon des oben in Beispiel 2B beschriebenen GDNF (pBluescript SK-76.1) abgeleiteten ³²P-markierten Sonde durchmustert. Die Sonde bestand aus ungefähr 250 Bp der kodierenden Sequenz aus dem reifen GDNF durch spezifische Amplifikation unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (Saiki et al. 1985 Science 230: 1350) und wurde wie folgt hergestellt. Eine 50 μl- oder 100 μl-PCR-Reaktion wurde unter Verwendung von < 1 ng λZapII76.1-DNA als Template und 10–20 pmol von jeweils zwei Oligonukleotidprimern, die auf der Sequenz von Ratten-GDNF basierten, durchgeführt. Ein Oligo war das "Durchmusterungsoligo" (auch als DHD-21 bezeichnet), das in Beispiel 2A oben beschrieben wurde, während das zweite Oligo (DHD-26) (SEQ ID NO: 13) die Sequenz:
auswies, die auf der von einem inneren Peptidprodukt aus Spaltung von GDNF (siehe Beispiel 1) erhaltene Aminosäuresequenz (Asp-Lys-Ile-Leu-Lys-Asn-Leu) (SEQ ID NO: 14) basiert. Die Reaktion wurde in 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 bei 25°C), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 10 μg/ml BSA (Promega R361), 0,2 mM von jedem dNTP (Pharmacia) unter Verwendung von 2,5–5 μ Polymerase (USB) durchgeführt. Die Reaktion bestand aus 30 Zyklen von: 39°C für eine Minute, 44°C für 1 1/2 Minuten und 72°C für 1 1/2 Minuten. Es wurde durch Agarosegelelektrophorese beobachtet, dass das Produkt dieses Bereichs ungefähr 250 Bp aufweist, was mit den Positionen der beiden Primer in der in 13 gezeigten cDNA-Sequenz übereinstimmt. Dieses unmarkierte Fragment wurde aus dem Gel durch Zentrifugation mit einer Ultrafree-MC Filtereinheit (Milipore, Bedford, MA) gemäss den Verkäuferprotokollen eluiert und als Template in nachfolgenden PCR-Markierungsreaktionen unter Anwendung der beiden gleichen Oligoprimer verwendet. Diese Reaktionen wurden unter identischen Bedingungen durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Konzentration von kaltem dCTP auf 12,5 μM reduziert wurde und 2,5 μM 3000–5000 Ci/mmol α-³²P-dCTP (Amersham) zu der Reaktion zugegeben wurden. Produkte der Markierungsreaktion wurden über eine BioSpin 6-Spinsäule (BioRad, Richmond, CA) gegeben. Der Durchfluss aus dieser Säule wurde als die Sonde verwendet, um die menschliche genomische Bibliothek zu durchmustern.
Die Bibliothek wurde unter Verwendung des von Stratagene zur Verfügung gestellten E. coli-Stamms PLK17 ausplattiert. 24 150 mm-Petrischalen, die jede ungefähr 50000 Plaques enthielten, wurden angefertigt. Nitrozellulosefilter-Abzüge im Duplikat wurden von jeder Platte entsprechend dem von Maniatis et al. loc. cit. beschriebenen Verfahren angefertigt. Diese 48 Filter wurden mit 250 × 10⁶ cpm der oben beschriebenen PCR-Sonde (durch Behandlung mit 0,5 N NaOH denaturiert) in 250 ml 6 × SSPE, 0,1% SDS, 2 × Denhardts Reagens, 0,1 mg/ml tRNA und 30% Formamid (USB) bei 42°C über Nacht (~16 h) beprobt. Die Filter wurden dann zweimal bei Raumtemperatur in 250 ml 2 × SSPE, 0,1% SDS bei Raumtemperatur und zweimal in 1,6 l (l) 0,1 × SSPE, 0,1% SDS, das auf 50°C vorgewärmt war, gewaschen. Die Filme konnten bei Raumtemperatur trocknen und wurden für sechs Tage bei –70°C mit Verstärkerfolien unter Film platziert. Die Filme wurden entwickelt und ausgewertet. Sechs starke, sich wiederholende Positive wurden beobachtet. Den positiven Signalen entsprechende Bereiche der Bibliotheksplatten wurden ausgeschnitten, resuspendiert und für eine zweite Runde des Durchmusterns mittels des oben beschriebenen Hybridisierungsverfahren erneut ausplattiert. Alle sechs wurden erneut als positiv getestet und Plaque-aufgereinigt mittels einer zusätzlichen Runde Plattieren und Hybridisieren.
Es ist für den Fachmann ein Routineverfahren, das DNA-Segment rund um den Bereich, der an die Sonde hybridisiert, subzuklonieren und zu sequenzieren, und so die gesamte oder Teile der Sequenz des menschlichen Gens für GDNF zu bestimmen. Wenn das gesamte menschliche GDNF-Gen in diesen Klonen nicht vorhanden ist, ist es ebenfalls eine Routinesache, entlang des Genoms und der mit dem Klon überlappenden Teile der DNA rund um diesen Bereich zu "wandern", um jedes verbleibende Teil dieses Gens zu erhalten und zu sequenzieren.
Die oben angeführten Verfahren und eine Vielzahl anderer, die für den Fachmann offensichtlich sein würden, könnten angewendet werden, um andere menschliche Genbibliotheken zu durchmustern. Zum Beispiel wurde unter Verwendung der oben beschriebenen Sonde und des oben beschriebenen Hybridisierungsverfahrens eine menschliche cDNA-Bibliothek durchmustert, die aus A⁺-RNA hergestellt wurde, die aus dem menschlichen Putamen extrahiert wurde. Diese, in dem Klonierungsvektor λgt10 enthaltene Bibliothek wurde von Clontech (Palo Alto, CA) erworben (Katalog-Nr. HL1092a, Posten-Nr. 1561). Die Bibliothek wurde auf E. coli LE392 (Maniatis et al. loc. cit.) mit einer Dichte von etwa 20000 Plaques pro Platte ausplattiert (Σ ungefähr 250000 Plaques) und durch Hybridisieren unter den oben beschriebenen Bedingungen durchmustert. Auf die Hybridisierung folgend wurden die Filter bei Raumtemperatur zweimal in 0,2 × SSPE, 0,1% SDS und zweimal in auf 50°C vorgeheiztem 0,1 × SSPE, 0,1% SDS gewaschen. Filter wurden bei Raumtemperatur luftgetrocknet und unter Film platziert. Nach drei Tagen Exponierung bei (–)70°C mit Verstärkerfolien wurden die Filme entwickelt und acht Positive im Duplikat identifiziert.
Sechs λFIXII-Klone aus einer menschlichen genomischen Bibliothek wurden durch Hybridisierung mit einer Ratten-GDNF-Sonde identifiziert und bis zur Homogenität Plaque-aufgereinigt (siehe oben). Lysate von jedem Phagen wurden durch das Verfahren von Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual; 1989) hergestellt. DNA wurde aus diesen Klonen durch das folgende Verfahren hergestellt: DNAase I (Pharmacia) und RNAase A (Sigma) wurden zu 5 ml jeder Kultur zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 μg/ml zu ergeben. Die Lösung wurde bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Dann wurden 5 ml 20% Polyethylenglykol (Sigma), 2 M NaCl zugegeben und die Lösung wurde bei 0°C für eine Stunde inkubiert. Die λ-Phagen wurden durch Zentrifugation bei 12000 × g für 10 min sedimentiert. Das Phagensediment wurde in 250 μl TE (10 mM THIS (Tris), pH 7,4, 1 mM EDTA) resuspendiert und der Reihe nach extrahiert mit einem gleichen Volumen von: a. Chloroform; b. Phenol; c. einer 1 : 1-Mischung von Chloroform und Phenol; und d. Chloroform. Ammoniumacetat wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,25 M zugegeben und die DNA durch Zugabe von 2 Volumen Ethanol und Zentrifugation bei 10000 × g ausgefällt. Das DNA-Sediment wurde in TE resuspendiert.
DNA aus jedem der sechs λ-Isolate wurde mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut und die Fragmente durch Elektrophorese auf einem Agarosegel (Sambrook et al.) aufgetrennt. Die DNA-Fragmente wurden auf zwei identische Nylonmembranen (Schleicher und Schuell) übertragen und mit radiomar kierten Sonden aus dem Ratten-GDNF hybridisiert. In Ratten-GDNF gibt es eine Eco R1-Stelle zwischen den Nukleotiden 356 und 357 (der Nummerierung von 13 folgend). Diese spaltet innerhalb der kodierenden Sequenz des reifen GDNF. Um zu bestimmen, ob menschliche genomische GDNF-Klone eine Stelle an einer homologen Position aufweisen, wurde Eco R1 als eine der Restriktionsendonukleasen zum Verdauen der menschlichen Klone verwendet. Spezifische radiomarkierte Sonden wurden für Bereiche des Gens entweder stromaufwärts (Sonde 1) oder stromabwärts (Sonde 2) der Eco R1-Stelle in Ratten-GDNF hergestellt. Sonde 1 war 268 Bp lang und bestand aus 14 Bp von 5'-untranslatierter Sequenz von Ratten-GDNF und 254 Bp von kodierender Sequenz (Aminosäuren 1 bis 85). Sie wurde durch Amplifizieren von λZapII76.1-DNA unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion und den Oligonukleotidprimern PD1 (GACGGGACTCTAAGATG) (SEQ ID NO: 15) und DHD23 (GCIGCIGC(C/T)TG(T/C)TT(A/G)TCIGG) (SEQ ID NO: 16) hergestellt. Die Reaktionsbedingungen zum Herstellen der Sonde waren wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Reaktion aus 30 Zyklen bestand von: 95°C für 1 Minute, 50°C für 1 1/2 Minuten und 72°C für 1 1/2 Minuten. Sonde 2 war 195 Bp lang und bestand aus 17 Nukleotiden von 3'-untranslatierter Sequenz des Ratten-GNDF und 178 Bp kodierender Sequenz (Aminosäuren 153 bis 211). Sie wurde unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion und der Oligonukleotidprimer LF2 (CGAGACAATGTACGACA) (SEQ ID NO: 17) und PD2 (CTCTGGAGCCAGGGTCA) (SEQ ID NO: 18) und λZAPII76.1 als dem DNA-Template hergestellt. Die Reaktionsbedingungen waren die selben wie für Sonde 1.
Fünf der sechs λ-Klone ergaben identische Hybridisierungsmuster. Sonde 1 hybridisierte an ein ungefähr 700 Bp-Eco R1-Fragment und Sonde 2 hybridisierte an ein ungefähr 2,8 kBp-Eco R1-Fragment. Die Tatsache, dass die zwei Sonden an verschiedene Eco-R1-DNA-Fragmente hybridisierten, legt deutlich nahe, dass das menschliche GDNF-Gen eine homologe Eco R1-Stelle besitzt. Das 700 Bp- und das 1,8 kBp-Eco R1-Fragment wurden getrennt in Bluescript SK-(Stratagene)subkloniert. Nukleotidsequenzen dieser beiden Fragmente wurden wie in Beispiel 2B beschrieben bestimmt. Die Sequenz von DNA-Fragmenten sind in 19 (SEQ ID NO: 5) gezeigt. Ausgehend von dieser Sequenz ist klar, dass es ein Intron gibt, dass der Aminosäure 52 des prä-pro-GDNF vorangeht. Es gibt kein Intron in dem Bereich des Gens, das für reifes menschliches GDNF kodiert. Die vorhergesagte Aminosäuresequenz von reifem menschlichem GDNF ist zu 93% homolog zu reifem GDNF der Ratte. Dies ist ungefähr der gleiche Grad an Aminosäuresequenzhomologie, der zwischen Proteinen für andere neurotrophe Faktoren von Mensch und Ratte gefunden wird (Aminosäuresequenzhomologie zwischen CNTF aus Ratte und Mensch ist 83%; McDonald et al. BBA (1991) (in Druck). Aminosäuresequenzhomologie zwischen NGF aus Ratte und Mensch ist 95%, für BDNF 100 und NT-3 100; Hallbook et al. 1991 Neuron 6: 845:855).
Um die vollständige menschliche prä-pro-GDNF-Sequenz zu erhalten, könnte eine radiomarkierte Hybridisierungssonde basierend auf der schon erhaltenen Sequenz von menschlichen GDNF hergestellt werden, und diese Sonde könnte verwendet werden, um menschliche cDNA-Bibliotheken zu durchmustern. Da cDNAs Kopien der prozessierten mRNA sind, sind die Introns nicht vorhanden und die Sequenz der vollständigen kodierenden Sequenz kann erhalten werden. Alternativ kann jetzt, wo die Position des Introns relativ zu der kodierenden Sequenz bekannt ist, eine Hybridisierungssonde, die spezifisch für Sequenzen stromaufwärts des Introns ist, aus dem Ratten-cDNA-Klon hergestellt werden, und diese Sonde kann verwendet werden, um eine genomische Bibliothek nach Klonen zu durchmustern, welche die 5'-Exon(s) enthalten.
D. Für die ersten 50 Aminosäuren von menschlichem prä-pro-GDNF kodierende Nukleotidsequenz
Wie in Beispiel 2C ausführlich dargestellt, gibt es ein Intron, das die der Aminosäure 51 des menschlichen prä-pro-GDNF entsprechende Nukleotidsequenz spaltet. Um die Sequenz dieses Teils des Moleküls zu erhalten, wurde eine menschliche genomische Bibliothek mit einer aus der aminoterminalen kodierenden Sequenz von prä-pro-GDNF der Ratte abgeleiteten Sonde durchmustert und ein hybridisierender Klon sequenziert und für diesen gezeigt, dass er die kodierende Sequenz der Aminosäuren 1 bis 50 des menschlichen prä-pro-GDNF, wie es in 22 (SEQ ID NO: 8) gezeigt ist, enthält.
Für diese Bibliotheks-Durchmusterung wurde eine PCR-Sonde wie in Beispiel 2C beschrieben synthetisiert. Die eingesetzten Oligonukleotidprimer waren:
PD1 = 5' > CCCGAATTCGACGGGACTCTAAGATG > 3' (SEQ ID NO: 19)
LFA = 5' > CGGTGGCCGAGGGAGTGGTCTTC > 3' (SEQ ID NO: 20)
Die Bedingungen für die (sowohl "kalte" als auch ³²P-Markierungs-)Reaktionen der PCR waren wie in Beispiel 2B beschrieben, mit der Ausnahme, dass die Reaktion aus 25 oder 30 Zyklen bestand von: 95°C für 1 min, 50°C für 1 1/2 min und 72°C für 1 min. Das Produkt dieser Reaktion enthält die ersten 122 Bp der kodierenden Sequenz für prä-pro-GDNF der Ratte und 14 Basenpaare 5' zum vermutlichen Start-ATG (siehe 13 und SEQ ID NO: 3). Bedingungen zum Durchmustern der menschlichen genomischen Bibliothek mit dieser Sonde waren wie in Beispiel 2C beschrieben. Dieselben Filterabzüge, die verwendet wurden, um Sequenzen für reifes menschliches GDNF tragende Klone zu identifizieren, wurden zweimal für 15 min in deioni siertem, destilliertem, bis zum Kochen erhitzten H₂O gewaschen, über Nacht beprobt, und entsprechend dem in Beispiel 2C beschriebenen Protokoll gewaschen. Die Filme wurden für drei Tage bei –70°C mit Verstärkerfolien einem Film ausgesetzt. Nach Entwicklung wurden zahlreiche doppelte Positive mit abweichenden Intensitäten beobachtet. Zwölf relativ starke Positive wurden gepickt und 10 von diesen wurden Plaque-aufgereinigt durch aufeinanderfolgende Hybridisierungsrunden unter den Durchmusterungsbedingungen.
Die klonierten DNAs dieser rekombinanten Phagen wurden durch Southern Blot-Hybridisierung untersucht. Für ein ungefähr 1000 Bp-AluI-Fragment wurde gefunden, dass es an die Durchmusterungssonde hybridisiert, und es wurde in SmaI-verdautes pBluescript SK-subkloniert, um pBSSK-λ3AluI zu erzeugen. Dieses klonierte AluI-Fragment wurde weiter subkloniert, um Sequenzieren des relevanten DNA-Segments zu erleichtern. Aufgereinigte pHSSK-λ3AluI-DNA wurde mit einer Reihe von Restriktionsenzymen, die den Vektor nur einmal (innerhalb der Polylinkerregion) schneiden, verdaut und die Verdauprodukte wurden durch Agarosegelelektrophorese untersucht. Zwei Restriktionsenzyme (PstI und SacII), die nur einmal innerhalb der klonierten DNA spalteten, wurden so bestimmt. 22 zeigt eine Karte von SacII- und PstI-Stellen. Southern Blots zeigten, dass der Bereich des klonierten Segments, das an die Durchmusterungssonde hybridisierte, zwischen den SacII- und PstI-Stellen des klonierten AluI-Segments lokalisiert war. Daher wurden zum Sequenzieren zwei Deletierungsderivate von pBBSK-λ3AluI konstruiert. In einem Beispiel wurde das kleine, ungefähr 300 Bp-PstI-Fragment wie folgt deletiert: Das Plasmid wurde mit PstI verdaut und der Verdau wurde ligiert und in E. coli transformiert. Transformanten wurden hinsichtlich solcher, denen das kleine PstI-Fragment fehlte, durchmustert. Parallel wurde das 300 Bp-SacII-Fragment auf gleiche Weise aus
pBSSK-λ3AluI deletiert, um ein zweites Deletierungsderivat zu bilden. Diese beiden Deletierungsplasmide wurden als Templates für Sequenzierungsreaktionen verwendet. Sequenzieren wurde wie in Beispiel 2B beschrieben durchgeführt.
22 (SEQ ID NO: 8) zeigt 233 Basenpaare der derartig erhaltenen Sequenz. Diese Sequenz enthält einen Bereich von 151 Bp, der einen sehr hohen Grad an Homologie mit den ersten 151 Bp der kodierenden Sequenz für prä-pro-GDNF der Ratte aufweist; 88% Identität auf dem Aminosäureniveau und 95% Identität auf dem DNA-Niveau. Daher wurde geschlossen, dass dieser Bereich Teil des Exons ist, der die kodierende Sequenz der aminoterminalen 50 Reste des menschlichen prä-pro-GDNF und das erste Nukleotid des Kodons für Rest 51 trägt. Die unmittelbar 3' zu dieser 151 Bp-Sequenz liegende Sequenz ist homolog zur Konsensussequenz für das 5'-Ende von Säugetierintrons [Shapiro und Senapathy 1987 Nucl. Acids. Res. 15: 7155–7174]. Die unmittelbar 5' zum mutmaßlichen Start-ATG liegende Sequenz zeigt für 28 Bp starke Homologie zur Rattensequenz; 27 von 28 Resten sind identisch. An diesem Punkt divergiert die Sequenz stromaufwärts stark. Die Sequenz rund um diesen Divergierungspunkt zeigt beträchtliche Homologie zur Konsensussequenz für das 3'-Ende von Säugetierintrons (Shapiro und Senapathy, loc. cit.). Daher erscheint es wahrscheinlich, dass dies eine Splice-Stelle ist, obwohl es dafür keinen direkten Beweis gibt. Der menschliche prä-pro-GDNF enthaltende offene Leserahmen dehnt sich mindestens 27 Basenpaare stromaufwärts von dem Start-ATG aus. Wie in der detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform oben diskutiert, ist es möglich, dass andere Formen eines prä-pro-GDNF produziert werden könnten, die zusätzliche Aminosäuren stromaufwärts enthalten würden. Diese Formen können auch prozessiert werden, um das reife GDNF-Molekül zu bilden, das auf gereinigt und sequenziert worden ist (siehe Beispiel 1).
Die hier und in Beispiel 2C dargestellten Nukleotidsequenzen enthalten die vollständige kodierende Sequenz für ein menschliches prä-pro-GDNF, das ausgedehnte Homologie zum prä-pro-GDNF der Ratte aufweist, welches erfolgreich in Säugetierzellen exprimiert wurde (siehe Beispiel 5), um aktives Ratten-GDNF zu bilden.
Beispiel 3: Verwendung von GDNF, um experimentelle Parkinson-Krankheit zu verhindern
Dieses Beispiel beschreibt Verfahren zum Erzeugen experimenteller Parkinson-Krankheit in Affen durch geeignete Verabreichung des Neurotoxins MPTP (1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6 tetrahydropyridin) an die Tiere. Es beschreibt auch Verfahren zum Verabreichen von GDNF an Tiere, die MPTP ausgesetzt sind, um die Entwicklung von Parkinson-Krankheit in solchen Tieren zu mildern.
A. Verabreichung von GDNF an Affen die mit MPTP behandelt wurden um experimentelle Parkinson-Krankheit zu erzeugen
Eine Kanüle aus rostfreiem Stahl kann in den rechten lateralen Ventrikel implantiert und an eine subkutan implantierte osmotische Minipumpe (Alzet 2002) angeschlossen werden. Die Minipumpe enthält GDNF in verschiedenen Konzentrationen oder sein Lösungsmittel als eine negative Kontrolle. Die Pumpe verabreicht 0,5 μl/h über 14 Tage. Zwei Tage nach der Kanülen-Pumpen-Implantierung erhalten Affen (Cebus apella) eine Injektion von 0,6 mg/kg MPTP in die rechte Karotisarterie. Sechs Wochen nach der anfänglichen Implantierung werden die Tiere mit Salzlösung perfundiert und das Gehirn schnell entfernt. Das Gehirn wird auf Eis zerlegt und Gewebsstanzungen aus dem Caudatenkern und dem Putamen entnommen. Die Substantia nigra wird in Fixiermittel gegeben. Das Caudate-Putamen-Gewebe wird durch HPLC-EC auf Dopamin untersucht, die Substantia nigra wird für Tyrosinhydroxylase(TH)-Immunreaktivität bearbeitet.
B. Wirksamkeit von GDNF
Degenerierung von nigralen dopaminergen Nervenzellen und ihren axonalen Fortsätzen in die Caudate/das Putamen verursachen experimentelle Parkinson-Krankheit in diesem Affenmodell. Es gibt verschiedene experimentelle Hinweise, dass GDNF die Schwere dieser neuronalen Degenerierung verhindern oder reduzieren kann. Beispielsweise kann GDNF den Verlust von TH-positiven Nervenzellkörpern in der Substantia nigra verhindern. Dies weist darauf hin, dass nigrale dopaminerge Nervenzellen durch GDNF von den toxischen Einflüssen des MPTP verschont bleiben. GDNF kann außerdem den Verlust von TH-positiven Fasern in der Caudate/dem Putamen verhindern. Dies weist darauf hin, dass die axonalen Fortsätze der nigralen dopaminergen Neuronen durch GDNF von den toxischen Einflüssen des MPTP verschont bleiben. GDNF kann auch den Verlust an Dopamingehalt in der Caudate/dem Putamen verhindern. Dies weist darauf hin, dass die sich von den nigralen dopaminergen Neuronen in die Caudate/das Putamen erstreckenden Axone durch GDNF von den toxischen Einflüssen des MPTP verschont bleiben.
Beispiel 4: Biologische Aktivitäten und mögliche klinische Indikationen für GDNF
Wie in Beispiel 1 gezeigt, erhöht aufgereinigtes GDNF die Dopaminaufnahme durch in den Kulturen von embryonalen mesenzephalen Nervenzellen vorhandene dopaminerge Neuronen sowohl in angereichertem als auch definiertem Kulturmedium. Dies deutet an, dass GDNF ein neurotropher Faktor in diesen dopaminergen Nervenzellen ist. Als solcher kann sich GDNF als nützlich erweisen beim Behandeln der Degenerierung dieser Neuronen, die bei der Parkinson-Krankheit auftritt. Zusätzlich kann sich GDNF beim Behandeln der unvollständigen Funktion von anderen dopaminergen Neuronen des Gehirns als nützlich erweisen. Ein derartiges unvollständiges Funktionieren kann bei Schizophrenie und anderen Krankheiten auftreten, die eine Behandlung mit Neuroleptika erfordern.
A. Aufgereinigtes GDNF fördert das Überleben von parasympathischen und sympathischen Nervenzellen in Kultur
1. Assay auf neuronales Überleben
Materialien
3-[4,5-Dimethyltiazol-2yl)-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) wurde von Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, erworben. Fötales Kälberserum wurde von Hyclone Laboratories, Logan, Utah, erworben. Kulturmedien und Salzlösungen wurden von Irvine Scientific, Santa Ana, California, erstanden. Kulturschalen wurden von Costar, Cambridge, Massachusetts, erstanden. Pathogen-freie Hühnereier mit fertilen Embryos in Gebrauchsgüte ("utility grade") wurden von Spafas, Roanoke, Illinois, erstanden.
Assay
Kulturen von primären Ziliarganglien und Grenzstrangganglien aus Hühnerembryos wurden wie bereits beschrieben hergestellt (Collins 1978 Develop. Biol. 65: 50; Manthorpe et al. 1986 Develop. Brain Res. 25: 191). In Kurzform wurden ziliäre oder sympathische Ganglien aus fertilen pathogen-freien Hühnerembryos entnommen, die für jeweils acht und zehn Tage bei 38°C in einer angefeuchteten Atmosphäre inkubiert wurden. Die Ganglien wurden chemischen getrennt durch Exponierung für 10 min bei 37°C mit erstens Hanks' ausgewogener Salzlösung ohne zweiwertige Kationen, die 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,2, enthielt, und dann Exponierung für 12 Minuten bei 37°C mit einer Lösung von 0,125% Bactotrypsin 1 : 250 (Difco, Detroit, Michigan) in Hanks' ausgewogener Salzlösung, die wie oben modifiziert war. Trypsinierung wurde durch Zugabe von fötalem Kälberserum bis zu einer Endkonzentration von 10% gestoppt.
Nach dieser Behandlung wurden die Ganglien in eine Lösung überführt, die aus Dulbeccos Hoch-Glukose modifiziertem Eagle-Medium ohne Bikarbonat, das 10% fötales Kälberserum und 10 mM HEPES, pH 7,2, enthielt, bestand, und wurden durch ungefähr 10-malige Zerreibung ("trituration") durch eine Glas-Pasteurpipette getrennt, deren Öffnung feuerpoliert wurde und deren Durchmesser so eingeengt war, dass es zwei Sekunden brauchte, um die Pipette zu füllen.
Die getrennten Ganglien wurden dann in Kulturmedium (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum, 4 mM Glutamin, 60 mg/l Penicillin-G, 25 mM HEPES, pH 7,2, ergänzt war) in Gewebekulturschalen mit 100 mm Durchmesser für drei Stunden ausplattiert (40 getrennte Ganglien pro Schale). Diese Vorplattierung wurde durchgeführt, um die nicht-neuronalen Zellen, die an die Platte adhärieren, von den Nervenzellen, welche nicht adhärieren, zu trennen. Nach drei Stunden wurden die nicht-adhärenten Nervenzellen durch Zentrifugation gesammelt, in Kulturmedium resuspendiert und mit einer Dichte von 1500 Nervenzellen pro Vertiefung in 50 μl pro Vertiefung auf Halbsbereich-96-Well-Mikrotiter-Gewebekulturschalen ausplattiert. Die Mikrotitervertiefungen wurden vorher einer 1 mg/ml Lösung von poly-L-Ornithin in 10 mM Natriumborat, pH 8,4, über Nacht bei 4°C ausgesetzt, in destilliertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet.
Zehn μl einer seriellen Verdünnung der auf neurotrophe Aktivität zu testenden Probe wurden in jede Vertiefung gegeben und die Schalen wurden für 20 Stunden bei 37°C in einer 7,5% CO₂ enthaltenden angefeuchteten Atmosphäre inkubiert. Nach 18 Stunden für ziliäre und 40 Stunden für sympathische Ganglien wurden 15 μl einer 1,5 mg/ml-Lösung des Tetrazoliumfarbstoffs MTT in Dulbeccos Hoch-Glukose modifiziertem Eagle-Medium ohne Bikarbonat, das 10 mM HEPES, pH 7,2, enthielt, pro Vertiefung zugegeben und die Kulturen für vier Stunden in den 37°C-Inkubator gestellt. Dann wurden 75 μl einer Lösung von 6,7 ml 12 M HCl pro Liter Isopropanol zugegeben und die Inhalte von jeder Vertiefung 30 mal zerrieben ("triturated"), um die Zellen aufzubrechen und den Farbstoff zu suspendieren. Die Absorbierung bei 570 nm wurde relativ zu einer 690 nm-Referenz für jede Vertiefung durch Verwendung eines automatischen Mikrotiterplattenlesers (Dynatech, Chantilly, Virginia) bestimmt. Die Absorbierung von Vertiefungen, die keinen neurotrophen Wirkstoff erhalten hatten (Negativkontrollen), wurde von der Absorbierung von proben-enthaltenden Vertiefungen abgezogen. Die resultierende Absorbierung ist proportional zu der Anzahl von lebenden Zellen in jeder Vertiefung, definiert als solche Nervenzellen, die in der Lage sind, den Farbstoff zu reduzieren. Die Anzahl von trophischen Einheiten der neurotrophen Aktivität wurde definiert als der Kehrwert der Verdünnung, die 50% maximales Überleben von Nervenzellen ergab. Spezifische Aktivität wurde durch Teilen der Anzahl der trophischen Einheiten durch die Menge des in der Probe enthaltenen Proteins bestimmt.
Ergebnisse
Wie in 15 dargestellt, fördert auf gereinigtes GDNF in Kultur das Überleben von parasympathischen Nervenzellen von Ziliarganglien aus dem Hühnerembryo. Wie in 16 dargestellt, fördert aufgereinigtes GDNF in Kultur auch das Überleben von sympathischen Nervenzellen aus Grenzstrangganglien aus dem Hühnerembryo.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass GDNF als e in Überlebensfaktor für parasympathische und sympathische Neuronen wirkt. Als solcher kann er nützlich sein beim Behandeln von verschiedenen Formen von Nervenschädigung am autonomen (d. h. parasympathischen und sympathischen) Nervensystem. Derartige Schädigung kann durch metabolische Erkrankungen, wie z. B. Diabetes oder renale Dysfunktion, auftreten. Derartige Schädigung kann auch sich durch Behandlung von Patienten mit verschiedenen chemotherapeutischen Wirkstoffen, wie z. B. den krebschemotherapeutischen Wirkstoffen Cisplatin und Vincristin, oder den AIDS-chemotherapeutischen Wirkstoffen ddI und ddC, ergeben. Derartige Schädigung kann auch durch genetische Erkrankungen, wie z. B. Dysautonomie, auftreten. Derartige Schädigung kann sich auch durch traumatische Verletzung ergeben.
Beispiel 5: Expression von rekombinantem GDNF in Tierzellen
A. Konstruktion von rekombinanten Plasmiden für COS-Zellexpression
Ein ungefähr 1,5 kBp-SmaI-Fragment von pBluescript SK-76.1, das die gesamte kodierende Sequenz für GDNF enthält, wurde in den Plasmidvektor pSG5 (Green et al. 1988 Nucl. Acids. Res. 16: 369), der für transiente Expression von klonierten Genen in das SV40-T-Antigen-exprimierenden Zellen, wie z. B. COS-Zellen, entworfen wurde, subkloniert.
Die DNA-Sequenz der GDNF-cDNA (13) (SEQ ID NO: 3) und Restriktionsendonukleasekartierung identifizierten ein SmaI-Fragment, das durch eine, in dem Polylinker des Vektors lokalisierte SmaI-Stelle (18 Bp 5' zum 5'-Ende des cDNA-Klons) und eine SmaI-Stelle (1500 Bp entfernt), die in dem cDNA-Klon ungefähr 800 Bp 3' zum Ende der kodierenden Sequenz für reifes GDNF lokalisiert ist, beschrieben ist. Dieses SmaI-Fragment wurde wie folgt in pSG5 kloniert. Auf gereinigte pSG5-Plasmid-DNA (Stratagene) wurde mit EcoRI verdaut und mit intestinaler alkaliner Kälberphosphatase (CIAP) (Promega) gemäss den Protokollen des Verkäufers behandelt. Anschließend wurde der Vektor elektrophoretisch aufgetrennt und aus einem Agarosegel eluiert. Aufgereinigte pBluescript SK-76.1-Plasmid-DNA wurde mit EcoRI-Methylase methyliert, mit SmaI verdaut und mit dem in Beispiel 2A beschriebenen EcoRI-Linkermolekül ligiert. Nach EcoRI-Verdau und Agarosegelelektrophorese wurde das ungefähr 1,5 kBp-SmaI-Fragment von Interesse (nun EcoRI-methyliert und gelinkert) eluiert und an den EcoRI-verdauten und phosphatierten pSG5-Vektor ligiert. Ligationsprodukte wurden verwendet, um kompetente E. coli XL1-Blue durch Verwendung des CaCl₂-Verfahrens (Maniatis et al. loc. cit.) zu transformieren. Ampicillin-resistente Transformanten wurden selektiert und auf rekombinante Plasmide durch Restriktionsendonukleaseverdau und Agarosegelelektrophorese untersucht. Verdau mit EcoRI zeigte an, dass die meisten Transformanten Plasmide enthielten, die das gewünschte Insert trugen. Verdau mit BamHI identifizierte die Orientierung des klonierten GDNF-Gens relativ zu dem in dem Vektor vorhandenen SV40-Promoter (beachte die BamHI-Stelle an Position 15 in der Sequenz in 13). Beide Orientierungen wurden erhalten.
Zwei Transformanten wurden für weitere Analysen ausgewählt; einer enthielt ein Plasmid, benannt als pSG5::rGDNF-7, welches das GDNF-Gen in der richtigen Orientierung trug, damit es beginnend an dem SV40-Promotor in RNA-Transkripte exprimiert wird, während der zweite ein Plasmid enthielt, bezeichnet als pSG5::rGDNF-4, welches das GDNF-Gen in umgekehrter Orientierung enthielt, in der an dem SV40-Promotor beginnende RNA-Transkripte GDNF nicht exprimieren werden. Auf gereinigte Zubereitungen von beiden dieser Plasmide wurden durch CsCl- Dichtegradientenzentrifugation zur Verwendung in COS-Zellexpressionsexperimenten vorbereitet.
B. Expression von GDNF in COS-7-Zellen
Plasmid-DNA aus diesen Konstrukten wurde durch das Verfahren der alkalischen Lyse gefolgt von CsCl-Dichtezentrifugation (Maniatis et al., loc. cit.) hergestellt. Diese DNA wurde in COS-7-Zellen durch das Verfahren von Sompayrac und Danna (1981 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7575–7578) transfiziert. Als eine Kontrolle wurden gleichwertige COS-Zellkulturen mit Plasmidvektor-DNA, die das GDNF-Insert in der entgegengesetzten Orientierung trägt, was keine Expression des GDNF-Proteins erlauben wird, transfiziert. Pro 100 mm-Kulturschale wurden 30 μg Lipofectin und 0,3–1 μg Plasmid-DNA verwendet.
Nach Transfizieren für 24 Stunden wurde das Medium abgesaugt und mit OptiMEM I ±3% FCS ersetzt. Kulturen wurden für 48 Stunden inkubiert und wie folgt geerntet:

a) das Medium (konditioniertes Medium oder CM) wurde abgezogen und bei –80°C gelagert;
b) 5 ml PBS +2,5 mM EDTA wurden zu der Zellwiese gegeben und bei 25°C für drei Minuten gehalten; und dann wurden die Zellen von der Platte pipettiert und bei 1000 × g für fünf Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Zellsedimente bei –80°C gelagert.

Das CM wurde 30-fach in Centricon 10-Konzentratoren konzentriert und auf Bioaktivität getestet. Die Zellsedimente wurden in 500 μl 10 mM EDTA, pH 7,0, plus 1 mM Benzamidin, 100 μM PMSF, 1 mM E-Amino-N-kaproinsäure mit Ultraschall behandelt. Die Zellysate wurden bei 14000 × g für fünf Minuten zentrifugiert und die Überstände auf Bioaktivität getestet.
C. Bioassay von exprimiertem GDNF
Das Zelllysat und Kulturmedien von COS-Zellen, die mit GDNF-exprimierenden und Kontrollplasmiden (mit der GDNF-kodierenden Sequenz in der nicht korrekten Orientierung) transfiziert waren, wurden auf sowohl die Fähigkeit, die Dopaminaufnahme in Kulturen von mesenzephalischen Neuronen zu erhöhen (siehe Beispiel 1), als auch auf die Fähigkeit, das Überleben von Neuronen der sympathischen Ganglien zu erhöhen (siehe Beispiel 4), getestet. Das COS-Zellkulturmedium (17) und das Zelllysat (Daten nicht gezeigt) erhöhten die Dopaminaufnahme, wie für GDNF erwartet. Wie in 18 gezeigt, erhöhten das COS-Zellkulturmedium und das Zelllysat das Überleben von Grenzstrangneuronen, wie für GDNF erwartet.
Diese Ergebnisse zeigen klar an, dass Expression des GDNF-Gens in einer Tierzelle zur Bildung eines Proteins mit der für auf gereinigtes GDNF gezeigten biologischen Aktivitäten führt.
Beispiel 6: Expression von menschlichem GDNF in E. coli
A. Konstruktion eines Plasmids das für menschliches GDNF kodiert
Die Sequenzinformation des menschlichen GDNF-Gens (Beispiel 2C) verwendend, wurden die synthetischen Oligonukleotide PD3 und PD4 als Primer für die Amplifikation des menschlichen GDNF-Gens und seiner Expression aus einem Plasmidexpressionsvektor in E. coli hergestellt. Die Sequenzen der Oligonukleotide PD3 (SEQ ID NO: 21) und PD4 (SEQ ID NO: 22) sind:
PD3: 5' CGCGGATCCAATAAGGAGGAAAAAAAATGTCACCAGATAAACAAAT 3'
PD4: 5' CGCGGTACCCAGTCTCTGGAGCCGGA 3'
Oligonukleotid PD3 ist 46 Nukleotide lang. Die 17 Nukleotide am 3'-Ende sind eine perfekte Übereinstimmung mit dem menschlichen GDNF-Gen in dem Bereich, der für den N-Terminus des reifen Proteins kodiert. Diese 17 Nukleotide werden von einem Translationsstartkodon, ATG, vorangegangen, so dass Synthese des reifen menschlichen GDNF mit der korrekten Aminosäure in E. coli beginnen wird. Die anderen Nukleotide sind so entworfen, dass sie andere, als notwenig für eine gute Expression in E. coli erachtete Signale ebenso wie eine BamH1 Endonukleaserestriktionsstelle, die notwendig zum Konstruieren des GDNF-Expressionsplasmids ist, zur Verfügung stellen.
Oligonukleotid-PD4 ist 26 Nukleotide lang. Die 17 Nukleotide am 3'-Ende sind eine perfekte Übereinstimmung mit 17 Nukleotiden des menschlichen GDNF-Gens 3'-wärts des Stoppkodons. Dieses Oligonukleotid stellt auch Sequenzen zur Verfügung, die notwendig sind, um eine KpnI-Restriktionsendonukleasestelle zum Konstruieren des GDNF-Expressionsplasmids zu rekonstruieren.
Die Reaktionsbedingungen für die Amplifikation des menschlichen GDNF sind wie folgt: das Reaktionsgesamtvolumen betrug 100 μl und enthielt 1 ng eines das menschliche GDNF-Gen enthaltenden λDNA-Klons, 20 pmol von jeweils PD3 und PD4, 20 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 mM KCl, 6 mM (NH₄)₂SO₄, 1,5 mM MgCl₂ und 0,1% Triton X-100. Die Reaktionsmischung wurde für 5 Minuten auf 95°C erhitzt, auf 44°C abgekühlt und 2 Einheiten Pfu DNA-Polymerase (Stratagene) wurden zugegeben. Die Reaktion bestand aus 13 Zyklen von: 72°C für 1 1/2 Minuten, 95°C für 1 Minute und 44°C für 1 1/2 Minuten. Am Ende der Reaktion wurde MgCl₂ bis zu einer Endkonzentration von 10 mM zugegeben. 5 Einheiten des großen Fragments der DNA-Polymerase I (Klenow) wurden zugegeben und die Reaktion bei 37°C für 10 Minuten inkubiert. Dann wurden 10 μl 3 M NaAc und 220 μl EtOH zugegeben und die Lösung bei 12000 × g für 15 Minuten zentrifugiert, um die DNA auszufällen. Die ausgefällte DNA wurde in 100 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 20 Einheiten BamH1 und 20 Einheiten KpnI resuspendiert und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Ein DNA-Fragment der richtigen Größe wurde nach Elektrophorese durch ein Agarosegel identifiziert und durch Verwendung einer Ultrafree-MC Filtereinheit (Millipore) aufgereinigt. Dieses Fragment wurde in einen E. coli-Expressionsvektor, pT3XI-2 (unten beschrieben), ligiert. Ligationsbedingungen waren wie folgt: Das Reaktionsgesamtvolumen betrug 5 μl und enthielt 10 ng pT3XI-2-DNA, die mit KpnI und BamHI linearisiert war, 5 ng des menschlichen GDNF-DNA-Fragments wie oben beschrieben, 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5% Polyethylenglykol-8000 und 1 Einheit T4-DNA-Ligase (Bethesda Research Laboratories). Die Reaktion wurde bei 14°C für 2 Stunden inkubiert.
Der Vektor pT3XI-2 wurde in der folgenden Weise hergestellt. Das Ausgangsplasmid für diese Herstellung war das Plasmid pKK223-3 (Brosius und Holy, 1984), das von Pharmacia erworben wurde. Das Plasmid pKK223-3 trägt ein partielles Gen für Tetrazyklinresistenz. Dieses nicht-funktionelle Gen wurde durch ein vollständiges, von dem Plasmid pBBR322 getragenem Tetrazyklinresistenzgen ersetzt. Das Plasmid pKK223-3 wurde vollständig mit SphI und partiell mit BamH1 verdaut. Ein 4,4 kBp-Fragment wurde gelaufgereinigt und verbunden mit einem synthetischen Adapter (SEQ ID NO: 23):
und einem 539-Basenpaar-Fragment aus DNA aus einem ClaI-, SphI-Verdau des Tetrazyklinresistenzgens aus pBR322 (PL Biochemicals, 27-4891-01). Das resultierende Plasmid wurde als pCJ1 bezeichnet.
Als nächstes wurde ein XhoI-Linker, der von New England Biolabs erworben wurde, in die PvuII-Stelle des pCJ1-Plasmids eingefügt, um das Plasmid pCJX-1 zu bilden. Diese Insertion unterbricht das rop-Gen, welches die Plasmidkopienzahl kontrolliert. Als nächstes wurde ein EcoRI-Fragment, welches das lacI-Gen enthält, aus Plasmid pMC9 (Calos et al., 1983) aufgereinigt und dann mit XhoI-zu-EcoRI-Adaptern in die XhoI-Stelle eingefügt. Die Polylinkerregion in Plasmid pKK223-3 wurde als nächstes durch Schneiden mit EcoRI und PstI durch einen zusätzliche Stellen enthaltenden Polylinker ersetzt (SEQ ID NO: 24):
5' AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA 3'
3' GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5'
Der so erhaltene Vektor wird als pCJXI-1 bezeichnet.
Letztlich wurde das Tetrazyklinresistenzgen durch ein ähnliches Gen ersetzt, bei dem die Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme HindIII, BamH1 und SalI durch Bisulfitmutagenese zerstört waren. Das folgende Verfahren wurde verwendet, um das Tetrazyklinresistenzgen von pBR322 zu mutieren. Das Plasmid pBR322 wurde mit HindIII geschnitten und dann mit Natriumbisulfit mutagenisiert (Shortle und Botstein, 1983). Die mutagenisierte DNA wurde ligiert, um zirkuläre DNA zu bilden, dann mit HindIII geschnitten, um jedes Plasmid, das der Mutagenese entronnen war, zu linearisieren. E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985). Tetrazyklin-resistente Plasmide wurden isoliert und auf Verlust der HindIII-Stelle in dem Tetrazyklinresistenzgen überprüft. Erfolgreich mutiertes Plasmid wurde als pT1 bezeichnet. Einem ähnlichen Verfahren wurde gefolgt, um die BamH1-Stelle in pT1 zu mutagenisieren, wodurch das Plasmid pT2 hervorgebracht wurde. Plasmid pT2 wiederum wurde mutagenisiert, um die SalI-Stelle zu entfernen, wodurch das Plasmid pT3 gebildet wurde. Ein ClaI-StyI-Fragment von pT3, welches das mutierte Tetrazyklinresistenzgen trägt, wurde isoliert und verwendet, um das homologe Fragment von pCJXI-1 zu ersetzen, um pT3XI-2 zu bilden. Das mutierte Tetrazyklinresistenzgen kodiert trotzdem für ein funktionelles Protein. Stromabwärts der tac-Promoterregion wurde ein Polylinker eingeführt, der zusätzlich zu anderen Stellen BamH1- und KpnI-Restriktionsstellen enthält, die zum Klonieren von Genen zur Expression in E. coli nützlich sind.
Nach der 2-stündigen Ligation des Vektors mit dem menschlichen reifen GDNF-Konstrukt wurden 2 μl des Reaktionsmix verwendet, um Epicurian Coli SURE^® superkompetente E. coli-Zellen (Stratagene) gemäss den Anweisungen des Herstellers zu transformieren. Die DNA-Sequenz von einem der rekombinanten Plasmide wurde wie in Beispiel 2B beschrieben bestimmt. Die Sequenz bestätigte, dass dieses Plasmid die komplette kodierende Sequenz des GDNF-Gen aus dem Mensch enthielt, die für reifes menschliches GDNF kodiert.
B. Expression von menschlichem GDNF in E. coli
Das rekombinante Plasmid, das für menschliches GDNF kodierende DNA-Sequenzen enthält, wurde in den E. coli-Stamm JM107ϕrMCB0005, einer T1-resistenten Variante von JM107 (Yanisch-Perron et al. (1985)) durch Verwendung des in Sambrook et al. (1989) beschriebenen CaCl₂-Verfahrens transformiert. Einer der Rekombinanten wurde in 50 ml LB-Medium (Sambrook et al.) mit 100 μg/ml Ampicillin (Sigma) mit Schütteln bei 37°C über Nacht angezogen. Am nächsten Tag wurde die Kultur 1 : 70 in LB-Medien mit 100 μg/ml Ampicillin verdünnt und für 5 Stunden mit Schütteln bei 37°C angezogen. 20 ml der Zellen wurden durch Zentrifugation bei 8000 × g für zehn Minuten gesammelt. Das Sediment wurde in 4 ml 10 mM EDTA pH 7,4 resuspendiert. Die Zellen wurden durch Verwendung einer French Press-Druckzelle (SLM Instruments) bei 18000 Pfund pro Quadratzoll ("psig") zerstört. Das Lysat wurde bei 12000 × g für 15 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Sediment wurde in 10 mM EDTA resuspendiert. Es wurde herausgefunden, das verhältnismäßig mehr GDNF akkumuliert, wenn Fermentation bei 42° anstatt bei 37°C oder 30°C stattfinden kann.
Das gegenwärtig bevorzugte Verfahren zum Erhalten hoher Niveaus von GDNF-Expression in E. coli durch Verwendung des in Beispiel 6A beschriebenen rekombinanten Plasmids (in dem die kodierende Sequenz für menschliches reifes GDNF in den Expressionsvektor pT3XI-2 kloniert ist) ist wie folgt. Für eine 10 l (l)-Fermentation wird ein 500 ml-Inokkulum in LB-Medium (pH 7), das 15 μg/ml Tetrazyklin enthält, bei 37°C in einer 2 l (l) Schüttelflasche mit Schikane bis zu einer optischen Dichte (A₆₆₀) von zwischen 2 und 3 angezogen. Diese Kultur wird verwendet, um 10 l (l) Wachstumsmedium zu inokulieren, das enthält: 12 g/l Trypton, 24 g/l Hefeextrakt, 25 g/l Glycerin, 1,3 g/l K₂HPO₄, 0,4 g/l KH₂PO₄, 0,1 ml/l einer 4 : 1-Mischung von Macoll9 : GE60 und 15 mg/l Tetrazyklin-HCl. Diese Kultur wird für ungefähr 12 bis 18 Stunden bei 42°C bis zu optischen Dichten von ungefähr 12 bis 20 (A₆₆₀) angezogen. Der pH der Fermentation wird bei 7,0 gehalten und der gelöste Sauerstoff bei einer Sättigung von 30% gehalten. Nach Fermentation wird die Kultur auf 4°C gekühlt und die Zellen durch Zentrifugation gesammelt.
Die Bildung von menschlichem GDNF aus diesem oben beschriebenen Plasmid ist nicht spezifisch für diesen E. coli-Stamm, sondern kann in jedem geeigneten Stamm erzeugt werden. Das Plasmid wurde in zwei andere E. coli-Stämme transformiert, JM108 (Yanisch-Perron et al., 1985) und SURE^® (Stratagene). In diesen beiden Stämmen wurde eine neue Proteinbande mit dem richtigen Molekulargewicht beobachtet, sichtbar gemacht durch Coomassie Blue-Färbung nach Elektrophorese durch ein Polyacrylamidgel.
Ein Aliquot des resuspendierten Materials wurde auf einem Polyacrylamidgel elektrophoretisch aufgetrennt. Das Gel wurde mit Coomassie Blue gefärbt. Ein Protein des erwarteten Molekulargewichts für GDNF (15000 Daltons) war nur in den Kulturen vorhanden, die das rekombinante menschliche GDNF enthielten, aber nicht in den Kulturen, die allein den Vektor pT3XI-2 enthielten. Das zurückgewonnene Protein wurde Standardverfahren zur aminoterminalen Sequenzierung unterworfen und die ersten 22 Aminosäuren dieses Proteins sind identisch mit der Aminosäuresequenz von menschlichem GDNF, wie sie in 19 gezeigt ist, was bestätigt, dass menschliches GDNF in E. coli korrekt exprimiert wird.
C. Rückfaltung und Bioaktivität von in Bakterien gebildetem rekombinanten menschlichen GDNF
Vorbereitung von Material für Rückfaltung
Der E. coli-Transformant JM107 (pT3X12::huGDNF) wurde bis zur stationären Phase bei 37°C in einem auf Hefeextrakt (#0127-01 Difco Laboratorien, Detroit, MI) und Trypton (#0123-05 Difco Laboratories, Detroit, MI) basierenden komplexen Medium (24 g/l Hefeextrakt, 12 g/l Trypton, 5 g/l Glycerin, 1,3 g/l K₂HPO₄, 0,4 g/l KH₂PO₄, 0,1 ml/l Macol 19/GE60 (4 : 1), 15 mg/l Tetrazyklin) ohne IPTG-Induzierung angezogen. Die Zellen wurden bei 16000 × g in einem JA10-Rotor bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert und der Zellbrei bei –20°C gelagert.
Die Zellen wurden wie folgt behandelt: 5 gm des Zellbreis wurden mit 40 ml 10 mM EDTA, pH 7,0, auf Eis durch Verwendung eines OCI Instruments-Homogenisators homogenisiert. Die Suspension wurde dreimal mit einer French-Press mit 20000 Pfund pro Quadratzoll ("psig") behandelt ("French-Press"), dann mit 30000 × g in einem JA20-Rotor für zehn Minuten bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Sediment wie oben homogenisiert und zentrifugiert. In einer Ausführungsform wurde das Sediment aus der Re-Extraktion mit 40 ml 25 mM Tris, pH 7,4, homogenisiert, wie oben zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wurde mit 20 ml 50 mM Tris, pH 8,0, das 8 M Harnstoff enthielt, mit oder ohne Zugabe von 30 mM 2-Mercaptoethanol homogenisiert, wie oben zentrifugiert und der Überstand behalten. Der Überstand wird als der TU-Extrakt bezeichnet. In der bevorzugten Ausführungsform wird das Sediment in 40 ml 10 mM Tris, pH 8,0, das 1 mM EDTA, 1% NP-40 enthielt, homogenisiert, wie oben zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Sediment wurde durch Sulfonylieren wie folgt solubilisiert: Das Sediment wurde in 25 ml 20 mM Natriumphosphat, pH 7,4, das 8 M Harnstoff, 100 mM Natriumsulfit und 10 mM Natriumtetrathionat enthielt, homogenisiert. Die Sulfonylierung konnte bei 4°C über Nacht mit Rühren fortschreiten und wurde dann mit 16000 × g, 4°C für 10 Minuten zentrifugiert, um die Lösung zu klären.
Partielle Aufreinigung von TU-Extrakt vor dem Rückfalten
Der TU-Extrakt wurde teilweise durch Ionenaustauschchromatographie auf S-Sepharose-Fast Flow-Harz (Pharmacia) aufgereinigt. Die Säule wurde äquilibriert und lief bei Raumtemperatur mit 25 mM Tris, pH 7,4, das 8 M Harnstoff und 30 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, (Puffer A). Nach Laden der Probe und Waschen mit Puffer A bis zur Grundlinie der optischen Dichte, wurde die Säule mit 10% Säulenvolumen pro Minute mit 5 Säulenvolumen von jeweils Puffer A und 100 mM Tris, pH 9,0, das 8 M Harnstoff, 500 mM NaCl und 30 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, (Puffer B) eluiert. Die Säulenfraktionen wurden bei 280 nm überwacht und durch SDS-PAGE untersucht. GDNF eluierte als der Hauptproteingipfel bei 60–70% des Gradienten. Mit GDNF angereicherte Fraktionen wurden für das Rückfalten vereint (25).
Partielle Aufreinigung von sulfonyliertem Extrakt vor dem Rückfalten
Der sulfonylierte Extrakt wurde partiell durch Ionenaustauschchromatographie auf Q-Sepharose Fast Flow-Harz (Pharmacia) aufgereinigt. Die Säule wurde äquilibriert und lief bei 4°C mit 10 mM Tris, pH 8,0, das 4 M Harnstoff enthielt, (Puffer A). Nach Laden der Probe und Waschen mit Puffer A bis zur Grundlinie der optischen Dichte wurde die Säule mit 5% Säulenvolumen pro Minute mit 5 Säulenvolumen von jeweils Puffer A und 10 mM Tris, pH 8,0, das 4 M Harnstoff und 500 mM NaCl enthielt, (Puffer B) eluiert. Säulenfraktionen wurden bei 280 nm überwacht und durch SDS-PAGE untersucht. GDNF eluierte als der Hauptproteingipfel bei 50% des Gradienten. Mit GDNF angereicherte Fraktionen wurden für das Rückfalten vereint.
Rückfalten von partiell aufgereinigtem TU-Extrakt
Partiell, wie oben beschrieben auf gereinigtes GDNF wurde wie folgt rückgefaltet: Zu 4 ml vereintem Säuleneluat, das GDNF mit ungefähr 1 mg/ml enthält, wurde Dithiothreitol bis 5 mM zugegeben. Das Röhrchen wurde verschlossen, um Luft auszuschließen, und für 15 Minuten bei 25°C aufbewahrt. Als nächstes wurde oxidiertes Glutathion-Dinatriumsalz bis 15 nM zugegeben, das Röhrchen erneut verschlossen, um Luft auszuschließen, und für 15 Minuten bei 25°C aufbewahrt. Diese Lösung wurde dann mit 14 Volumen Rückfaltungspuffer (100 mM Na₂HPO₄, 10 mM Ethanolamin, pH 8,3, das 4 M Harnstoff enthielt; 5% Polyethylenglykol 300 und 2 mM Cystein) verdünnt und unter Argon für drei Tage bei 5°C aufbewahrt.
Rückfalten von partiell auf gereinigtem sulfonyliertem Extrakt
Partiell, wie oben beschrieben auf gereinigtes GDNF wurde wie folgt rückgefaltet: Vereintes Säuleneluat, das GDNF mit ungefähr 3 mg/ml enthielt, wurde mit 19 Volumen Rückfaltungspuffer (100 mM Na₂HPO₄, Tris, pH 8,3, das 4 M Harnstoff ent hielt, 5% Polyethylenglykol 300 und 3 mM Cystein) verdünnt und unter Argon für drei Tage bei 5°C aufbewahrt.
Untersuchung von rückgefaltetem GDNF durch SDS-PAGE
GDNF, das aus Bakterien ohne vorherige Exposition mit reduzierenden Wirkstoffen extrahiert wurde, wandert auf SDS-PAGE als ein Monomer bei einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa verglichen mit der Wanderung von Molekulargewichtstandardproteinen. Es gibt kein detektierbares GDNF an der Position eines Dimers. GDNF, das einem reduzierenden Agens (30–150 mM 2-Mercaptoethanol) entweder während der Extraktion oder kurz vor der SDS-PAGE, jedoch vor dem Rückfalten ausgesetzt war, wandert an einer Position mit einem scheinbaren Molekulargewicht von ungefähr 16 kDa, die nicht unterscheidbar ist von dem nicht-reduzierten bakteriellen Protein (26, Spuren 6 & 13). Dies weist darauf hin, dass aus den bakteriellen Zellen hergestelltes GDNF vor dem Rückfalten nicht dimerisiert ist.
Nach dem wie oben beschriebenen Rückfalten wandert das meiste des bakteriell gebildeten rekombinanten GDNF auf nicht-reduzierenden SDS-PAGE als ein scheinbares Dimer bei ungefähr 30 kDa (26, Spur 2). Reduzierung des rückgefalteten GDNF mit 150 mM 2-Mercaptoethanol vor der SDS-PAGE veranlasst es, erneut an der Position des Monomers bei ungefähr 16 kDa zu wandern. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Rückfalten von GDNF das Protein veranlasst, ein Disulfid-gebundenes Dimer zu werden. SDS-PAGE von rückgefaltetem GDNF wurde ohne Reduzierung durchgeführt, und das Gen entlang seiner Länge zerschnitten und die Stücke auf Bioaktivität durch den Überlebensassay von sympathischen Ganglienneuronen getestet (siehe unten). Die einzige detektierbare Bioaktivität war an der Position des Dimers, was darauf hinweist, dass nur das Dimer biologisch aktiv ist.
Untersuchen des rückgefalteten GDNF in Reverse-Phase HPLC (RP-HPLC)
GDNF, das partiell durch S-Sepharose- oder Q-Sepharose-Chromatographie auf gereinigt war, jedoch vor der Rückfaltung, wandert in RP-HPLC, die wie unten angegeben durchgeführt wurde, mit einer Retentionszeit von ungefähr 21 Minuten. GDNF nach Rückfaltung wandert unter gleichen Bedingungen mit einer Retentionszeit von ungefähr 15 Minuten. Eine Verschiebung in der Retentionszeit wird für erfolgreiche Rückfaltung von GDNF erwartet. Es wird oft gesehen, dass eine Verschiebung in den Retentionszeiten bei RP-HPLC nach Rückfaltung von Proteinen beobachtet wird.
RP-HPLC von diesen Proben wurde wie folgt durchgeführt: mit einer Flussrate von 1 ml/Minute: eine 0,46 × 25 cm C-4-Säule (VyDac #214TP54) wurde wie folgt entwickelt: Lösungsmittel A = 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser; Lösungsmittel B = 0,1% TFA in Acetonitril; von 0,5 bis 1,5 Minuten wird B von 5% auf 25% erhöht; von 1,5 bis 31,5 Minuten wird B von 25% auf 55% erhöht.
Untersuchen des rückgefalteten GDNF durch Bioassays
Rückgefaltetes GDNF wurde in sowohl dem Überlebens-Bioassay sympathischer Ganglienneuronen aus Hühnerembryo (E10) (Beispiel 4A) als auch dem Dopaminaufnahme-Bioassay einer mesenzephalen Kultur aus Rattenembryo (E16) (Beispiel 1B) biogetestet. Vor der Rückfaltung zeigte GDNF, das 30 mM 2-Mercaptoethanol ausgesetzt und durch S-Sepharose- oder Q-Sepharose-Chromatographie wie oben aufgereinigt war, keine detektierbare Bioaktivität in dem Dopaminaufnahmeassay einer mesenzephalen Kultur und stark reduzierte Bioaktivität in dem Überlebens-Bioassay sympathischer Neuronen. Die scheinbare ED50 von S-Sepharose-chromatographierten Material in dem Überlebens-Bioassay sympathischer Neuronen betrug ungefähr 1 μg/ml, was ungefähr 333-fach niedriger ist als (bei) rückgefaltetem rhGDNF (siehe unten). Für Q-Sepharose-chromatographiertes Material betrug die scheinbare ED50 in dem Überlebens-Bioassay sympathischer Neuronen ungefähr 3 μg/ml, was ungefähr 100-fach niedriger ist als (bei) rückgefaltetem rhGDNF (siehe unten). Nach Rückfalten war GDNF, mit oder ohne vorherige Exponierung gegenüber 2-Mercaptoethanol, in beiden Bioassays scheinbar voll aktiv (27–28). Dieses Ergebnis weist darauf hin, dass GDNF durch Rückfalten signifikante Bioaktivität erwirbt, und auch darauf, dass die verringerte oder fehlende Bioaktivität vor dem Rückfalten nicht wegen der Exponierung gegenüber 2-Mercaptoethanol auftrat.
Die ED50 von rückgefaltetem, rekombinanten menschlichen GDNF (rhGDNF) in diesem Bioassay war gleich mit der davor für GDNF der Ratte, das aus B49-Zell-konditioniertem Medium aufgereinigt wurde, beobachteten. In dem Überlebens-Bioassay sympathischer Neuronen betrug die ED50 für rhGDNF ungefähr 3 ng/ml (27) und die ED50 für Ratten-GDNF ungefähr 5 ng/ml. In dem Dopaminaufnahmeassay einer mesenzephalischen Kultur betrug die ED50 für rhGDNF ungefähr 30 pg/ml (28) und für Ratten-GDNF ungefähr 50 pg/ml. Diese Ergebnisse deuten an, dass ein beträchtlicher Teil des rhGDNF erfolgreich rückgefaltet und biologisch voll aktiv war.
Beispiel 7: Herstellen und Isolieren von Antikörpern gegen GDNF
Antikörper gegen rhGDNF wurden durch das folgende Verfahren erzeugt. Dieses Verfahren wird in einer Weise gesehen, dass es das Adjuvans, das Immunisierungsprotokoll und die Tierart einschließt, aber nicht auf diese beschränkt ist. Auch können Antikörper gegen GDNF durch Verwendung des rückgefalteten, nativen Proteins oder des denaturierten, inaktiven Proteins, wie in dem unten angegebenen Verfahren oder mit aufeinanderfolgenden Peptiden der GDNF-Sequenz aus dem Mensch oder anderen Tierarten erzeugt werden.
Monoklonale Antikörper können durch eines der vielen Standardverfahren (siehe Antibodies a laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory 1988 ISBN 087969-314-2 Herausgeber Ed Harlow und David Lane) erzeugt werden. In Kurzform beinhaltet solch ein derartiges Verfahren zum Generieren monoklonaler Antikörper üblicherweise, aber nicht ausschließlich Immunisieren des geeigneten Tieres und Überwachen der Antikörperreaktion dieses Tieres gegenüber dem Immunisierungsprotokoll, Isolieren von Antikörper-bildenden Zellen, wie z. B. aus einem lymphatischen Organ eines oder mehrerer empfänglicher Tiere, Fusionieren dieser Zellen mit einer geeigneten Zelllinie, wie z. B. Myelomzellen, um Hybridome herzustellen, die Antikörpersekretierende unsterbliche Zellen darstellen, und Durchmustern, um fortschreitend Hybridome zu isolieren, bis Einzelzellklone erhalten werden, die den gewünschten monoklonalen Antikörper erzeugen.
Polyklonale Antikörper wurden wie folgt in Kaninchen erzeugt. Zwei Milliliter einer sterilen Salzlösung, die 0,005–0,25 mg rhGDNF enthält, wurden in ein Gefäß des RIBI-Adjuvans MPL-TDM-CWS-Emulsion (RIBI ImmunoChem Research, Inc.) injiziert und den Instruktionen des Herstellers entsprechend gevortext, um eine Emulsion zu bilden. Betäubte weibliche weiße Neuseeland-Kaninchen wurden dem von RIBI vorgeschlagenen Immunisierungsprotokoll folgend injiziert. Ein Milliliter der Adjuvans-Antigen-Emulsion wurde wie folgt verabreicht:
0,30 ml intradermal (0,05 ml in jede von sechs Stellen)
0,40 ml intramuskulär (0,20 ml in jedes Hinterbein)
0,10 ml subkutan (Nackenregion)
0,20 ml intraperitoneal
Die Tiere wurden alle 4–6 Wochen erneut mit dem gleichen Protokoll injiziert ("boosted"). Blut wurde den Tieren vor der ersten Injektion und 10–14 Tage nach jedem Boost entnommen, um es mit einem Neutralisierungstest oder einem Standard-ELISA auf Antikörper-Bildung zu testen.
Der Neutralisierungstest wurde wie folgt durch Verwendung des E16-Assays der mesenzephalen Kultur aus Ratten ausgeführt. Kaninchen-Testserum wurde in Dulbeccos minimal-essentiellem Medium, das mit 25 mM HEPES bei pH 7,4 gepuffert war, und 5 mg/ml bovines Serumalbumin (als BSAS bezeichnet) enthielt, verdünnt. Dieses wiederum wurde in die Testvertiefungen gegeben (25 μl des verdünnten Testserums in 500 μl Gewebekulturlösung) und konnte bei 37°C für 30 Minuten inkubieren. Als nächstes wurde rhGDNF als 25 μl einer aus einem Stamm verdünnten Lösung in BSA5, das rhGDNF mit 6,32 ngm/ml enthielt, bis zu einer Endkonzentration des rhGDNF in dem Test von 0,316 ngm/ml zugegeben. Dopaminaufnahme wurde nach acht Tagen in Kultur durch das vorangehend beschriebene Verfahren gemessen.
Ergebnisse mit Antiseren aus den zweiten Boosts sind für den Neutralisierungstest unten gezeigt (konsultiere Tabelle 2 unten).
Tabelle 2
Die Antiseren wurden außerdem auf GDNF-Antikörper in einem Standard-ELISA mit dem folgenden Verfahren getitert: Mikrotiterplatten (96 Vertiefungen, Nunc maxisorp) wurden mit 100 μl pro Vertiefung rhGDNF mit 1,0 μgm/ml in 50 mM Natriumbikarbonat-, pH 9,6, Bedeckungspuffer bei 4°C über Nacht bedeckt. Die Platten wurden viermal mit Plattenwaschpuffer (PWB; Phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung, pH 7,2, die 0,5% Tween 20 enthält) gewaschen und dann für zwei Stunden bei 25°C mit 200 μl pro Vertiefung 2% bovinem Serumalbumin in Phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung, pH 7,2, blockiert. Die Platten wurden erneut mit PWB gewaschen und zu titernde Proben (100 μl verdünnt in 20% normalem Ziegenserum und PWB) in die Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden für 1,5 Stunden bei 35°C inkubiert und erneut mit PWB gewaschen. Alkaline Phosphatase-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Jackson Immunochemicals) in einer 1 : 2500-Verdünnung in PWB wurde in jede Vertiefung gegeben (100 μl) und für 1,5 Stunden bei 35°C inkubiert. Die Platten wurden wie zuvor mit PWB gewaschen. Als nächstes wurde p-NPP-Substrat (Dinatrium-p-nitrophenylphosphat; Sigma Kat.-Nr. MP389) in jede Vertiefung gegeben (100 μl bei 1,0 mg/ml p-NPP in 10% Diethanolamin, pH 9,8) und die Platte bei 25°C inkubiert. Die Farbentwicklung wurde durch Auslesen der Platten bei 405–490 nm in einem Plattenleser (Molecular Devices Enax) verfolgt.
Antiseren wurden außerdem verwendet, um GDNF in Western Blots wie folgt zu detektieren und zu quantifizieren: Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde anhand des zuerst von U. K. Laemmli (Nature 227: 680–685 (1970)) beschriebenen Grundverfahrens unter Verwendung eines 12 1/2%igen Acrylamid-Trenngels und eines 4 ½-%igen Acrylamid-Sammelgels durchgeführt. Die Gele (16 × 14 × 0,15 cm) wurden bei 40 m amp konstanter Spannung für drei Stunden elektrophoretisiert. Zur Reduktion/Denaturierung wurden die Proben für zehn Minuten in Probenpuffer, der 1% SDS und 150 mM 2-Mercaptoethanol enthielt, auf 100°C erhitzt.
Zum Western-Blotten wurde das Gel dann auf Immobilon-P-Membran (Millipore Kat.-Nr. IPVH 151 50) mit 80 m amp konstanter Spannung für 16 Stunden in 25 mM Tris-Base (192 mM Glycin, 0,1% SDS und 20% Methanol geblottet ("transblotted") und wie folgt behandelt:

1) Die Membran wurde für eine Stunde bei 25°C in Blockierungspuffer (10 mM Tris, pH 7,4, das 150 mM NaCl enthielt, 0,05% Tween 20, 4% Magermilch und 0,02 Natriumazid) bei leichtem Schütteln blockiert.
2) Die Membran wurde als nächstes bei 25°C für zwei Stunden bei leichtem Schütteln in Blockierungspuffer inkubiert, der verdünntes primäres Antiserum gegen GDNF enthielt.
3) Die Membran wurde in Blockierungspuffer gewaschen (4 5-Minutenwaschungen).
4) Die Membran wurde als nächstes bei 25°C für zwei Stunden bei leichtem Schütteln in Blockierungspuffer inkubiert, der verdünnten sekundären Antikörper (alkaline Phosphatase-konjugiertes, affinitätsaufgereinigtes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG; Cappel Kat.-Nr. 59299) enthielt.
5) Die Membran wurde in Blockierungspuffer ohne die Magermilch gewaschen (4 5-Minutenwaschungen).
6) Die Membran wurde in 50 ml Entwicklungspuffer (100 mM Tris, pH 9,5, das 100 mM NaCl und 5 mM MgCl₂ enthielt) mit 165 μl NBT und 83 μl BCIP (Promega-Kit Kat.-Nr. P3771) bei 25°C und leichtem Schütteln entwickelt, bis die gewünschte Färbung erreicht ist.

Beispiel 8: Herstellen von membranumschlossenen Zellen, die GDNF sekretieren, und Implantieren in Patienten
Zellen, die GDNF sekretieren, können zum Implantieren in Patienten, die unter Nervenschädigung leiden, in semipermeablen Membranen eingekapselt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform leidet der Patient unter Parkinson-Krankheit, und die eingekapselten Zellen, die GDNF sekretieren, werden in das Striatum des Patienten implantiert, um den dopaminergen Zellkörpern GDNF zur Verfügung zu stellen.
In einer Ausführungsform der Erfindung werden Zellen, die verändert wurden, damit sie GDNF sekretieren – wie z. B. die in Beispiel 5 und 6 oben hergestellten und beschriebenen –, in biokompatible, implantierbare und wiedergewinnbare polymere Einlagen aufgenommen. Diese Einlagen können so ausgebildet sein, dass sie es dem sekretierten GDNF erlauben, in das die implantierten Zellen umgebende Gewebe einzudringen, während sie Faktoren aus dem umgebenden Gewebe, die schädlich für die Zellen wären, den Zugang zu den Zellen verwehren.
Die Zellen, die verändert wurden, um GDNF zu sekretieren, können in solche semipermeablen Membranen gemäss dem in der publizierten PCT-Anmeldung WO 91/10425, betitelt mit "Zellkapsel-Extrudierungssysteme" ("Cell Capsule Extrusion Systems"), beschriebenen Verfahren eingekapselt werden. Die membraneingekapselten Zellen können chirurgischen Standardverfahren folgend in das Striatum implantiert werden.

Claims

Gereinigtes und isoliertes neurotrophes Faktor Protein umfassend eine Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt ist oder ein Protein, das einen Homologiegrad von mehr als 70% zu den in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Sequenzen aufweist, wobei das Protein die Eigenschaft aufweist, die Dopaminaufnahme in dopaminerge Neuronen zu fördern.
Protein gemäß Anspruch 1, bei dem die Aminosäuresequenz zu mehr als 80% homolog zu den in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellten Sequenzen ist.
Protein gemäß Anspruch 1, umfassend die in SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz.
Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, das glykosyliert ist.
Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, das nicht glykolisiert ist.
Protein gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5, das eine Aminosäuresequenz mit einem Methioninrest an Aminoterminus aufweist.
Protein gemäß den Ansprüchen 1 bis 6, das mittels rekombinanter Verfahren erhältlich ist.
Protein gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, das durch Verknüpfung mit einer oder mehrerer polymerer Verbindungen modifiziert wurde.
Protein gemäß Anspruch 8, bei dem die polymere Verbindung Polyethylenglycol ist.
Nukleinsäuresequenz, die für ein neurotrophes Faktor Protein, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, kodiert.
Gereinigte und isolierte Nukleinsäuresequenz, die für ein neurotrophes Faktor Protein kodiert, wobei die Nukleinsäuresequenz: (a) die Nukleotide 304 bis 705 der SEQ ID NO: 3 oder die Nukleotide 105 bis 506 der SEQ ID NO: 5 umfasst; oder (b) für ein Protein kodiert, das eine in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst; oder (c) für ein Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz mit einem Homologiegrad von mehr als 70% zu einer in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 gezeigten Aminosäuresequenz umfasst; (d) mit einer Nukleinsäuresequenz hybridisiert, die komplementär zu einer Oligonukleotidsonde ist, welche für eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 kodiert; und wobei das Protein die Eigenschaft hat, die Dopaminaufnahme in dopaminerge Neuronen zu fördern.
Vektor, der die Expression regulierende Elemente umfasst, welche operativ mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 10 oder 11 verknüpft sind.
Transformierte oder transfizierte Wirtszelle, die aus ihrer natürlichen Umgebung isoliert wurde und den Vektor gemäß Anspruch 12 umfasst.
Wirtszelle gemäß Anspruch 13, die aus der Gruppe bestehend aus Säugetierzellen und Mikroorganismen ausgewählt wird.
Wirtszelle gemäß Anspruch 14, die eine COS-7 oder eine E. coli Zelle ist.
Wirtszelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die Wirtszelle zur humanen Implantation geeignet ist und wobei die Zelle einen neurotrophen Faktor exprimiert und sekretiert.
Wirtszelle gemäß Anspruch 16, wobei die Zelle ex vivo transformiert oder transfiziert wurde.
Wirtszelle gemäß Anspruch 16 oder 17, wobei die Zelle von einer semipermeablen Membran umgeben ist, welche für die menschliche Implantation geeignet ist.
Verfahren zur Herstellung eines neurotrophen Faktors, Schritte umfassend, bei denen man: (a) eine Wirtszelle gemäß irgendeinem der Ansprüche 13 bis 15 unter Bedingungen in einer Kultur zieht, welche für die Expression des neurotrophen Faktors durch die Wirtszelle geeignet sind; und (b) den neurotrophen Faktor, der von der Wirtszelle exprimiert wird gegebenenfalls isoliert.
Verfahren gemäß Anspruch 19, das ferner den Schritt der Rückfaltung des isolierten neurotrophen Faktors umfasst.
Gereinigter neurotropher Faktor erhältlich gemäß den Verfahren der Ansprüche 19 oder 20.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein neurotrophes Protein gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9 und 21 oder erhältlich gemäß den Ansprüchen 19 oder 20 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 22 zur Verwendung bei der Vermeidung oder Behandlung von Nervenzellschädigungen oder -störungen oder von unvollständig funktionierenden Nerverzellen.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 23 zur Verwendung bei der Vorbeugung oder Behandlung von Parkinson's Krankheit.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 23 zur Verwendung bei der Vorbeugung oder Behandlung von Alzheimer Krankheit.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 23 zur Verwendung bei der Vorbeugung oder Behanldung von amyotrophischer lateraler Sklerose.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 23 zur Verwendung bei der Vorbeugung oder Behandlung von Nervenzellschädigungen oder -erkrankungen auf Grund von physischem Schädigungen, Ischämie, Kontakt mit Neurotoxinen, chronischer metabolischer Erkrankungen oder neurodegenerativer Erkrankungen.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 27 zur Verwendung bei der Behandlung von Nervenzellschädigungen auf Grund von Hirnschlag, diabetischer Polyneuropathie oder toxischer Neuropathie, die durch Wirkstoffe verursacht wurde.
Antikörper erhältlich, indem man ein Tier mit einem neurotrophen Faktor Protein immunisiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellt ist.
Antikörper gemäß Anspruch 29, wobei der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.
Antikörper gemäß Anspruch 29, wobei der Antikörper ein polyklonaler Antikörper ist.
Vorrichtung zur Behandlung von Nervenschädigungen umfassend: (a) eine für die Implantation geeignete Membran; und (b) rekombinant veränderte Zellen gemäß Anspruch 13, die neurotrophes Faktor Protein exprimieren und sekretieren und innerhalb der Membran verkapselt sind; wobei die Membran für das neurotrophe Faktor Protein durchlässig und für Materialien, die schädlich für die Zellen sind, undurchlässig ist.
Vorrichtungen gemäß Anspruch 32, wobei der neurotrophe Faktor die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 6 umfasst.
Hybridom, erhältlich durch Fusion von Antikörperproduzierenden Zellen mit einer geeigneten Zelllinie, wobei das Hybridom einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der an einen neurotrophen Faktor bindet, welcher eine Aminosäuresequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 4 oder in SEQ ID NO: 6 dargestellt ist.
Verfahren zur Isolierung eines neurotrophen Faktors, bei dem man den Faktor mit einem Antikörper umsetzt, der spezifisch eine Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 bindet.
Verfahren zur Herstellung eines neurotrophen Faktors, Schritte umfassend, bei denen man: (a) eine transformierte oder transfizierte Wirtszelle in Kultur zieht, die eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche für ein neurotrophes Faktor Protein kodiert, unter Bedingungen die für die Expression des Proteins geeignet sind, (b) wobei die Nukleinsäure für ein Protein kodiert, das die in SEQ ID NO: 4 oder SEQ ID NO: 6 dargestellte Aminosäuresequenz umfasst; und das exprimierte Protein in einer im Wesentlichen reinen Form aus der Wirtszellkultur isoliert, wobei das Protein die Eigenschaft aufweist, die Dopaminaufnahme in dopaminerge Neuronen zu fördern.
Verfahren gemäß Anspruch 36, bei dem man ferner das exprimierte neurotrophe Faktor Protein zurückfaltet, um einen Disulfid-verbrückten Dimer zu bilden.