DE69736712T2

DE69736712T2 - Verfahren zur milderung von neuropatischen schmerz mit prosaposin verwandten peptiden

Info

Publication number: DE69736712T2
Application number: DE69736712T
Authority: DE
Inventors: S. John San Diego O'BRIEN
Original assignee: University of California; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Current assignee: University of California; University of California Berkeley; University of California San Diego UCSD
Priority date: 1996-03-05
Filing date: 1997-03-05
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2017-03-06
Also published as: IL126082A0; CA2248139A1; KR19990087686A; NZ331757A; EP0929569B1; NO984093D0; JP2000506853A; PL187917B1; PL328701A1; SK122898A3; RU2223969C2; ATE340187T1; DE69736712D1; CA2248139C; CZ297384B6; AU2328697A; US6271196B1; US6268347B1; CZ283998A3; KR100507715B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Schmerztherapie und insbesondere auf die Verwendung von von Prosaposin abgeleiteten Peptiden für die Behandlung von neuropatischen Beschwerden.
Hintergrundinformation
Neuropatische Beschwerden resultieren aus einer Verletzung eines Nervs. Im Gegensatz zu dem sofortigen Schmerz, der durch eine Gewebeverletzung verursacht wird, können sich neuropatische Beschwerden Tage oder Monate nach einer traumatischen Verletzung entwickeln. Während die Schmerzen, die durch Gewebeverletzung verursacht werden, normalerweise auf die Dauer der Gewebereparatur begrenzt sind, sind die neuropatischen Schmerzen außerdem häufig langlebig oder chronisch. Darüber hinaus können neuropatische Schmerzen spontan oder als Ergebnis einer Stimulation auftreten, die normalerweise nicht schmerzhaft ist.
Klinische Ursachen von neuropatischen Schmerzen sind weit verbreitet und schließen sowohl Trauma als auch Krankheit ein. Z.B. sind traumatische Nerven-Kompression oder -Quetschung und eine traumatische Verletzung des Gehirns oder des Rückenmarks allgemeine Ursachen von neuropatischen Schmerzen. Außerdem verursachen die meisten traumatischen Nervenverletzungen auch die Bildung von Neuromas, in denen der Schmerz als Ergebnis einer anomalen Nervenregeneration auftritt. Zusätzlich werden Krebs-verwandte neuropatische Schmerzen verursacht, wenn ein Tumorwachstum angrenzende Nerven, das Gehirn oder das Rückenmark schmerzhaft zusammendrückt. Die neuropatischen Schmerzen werden auch mit Krankheiten, wie Diabetes oder Alkoholismus, in Verbindung gebracht.
Leider sind die neuropatischen Schmerzen häufig gegenüber verfügbaren Arzneimitteltherapien resistent. Zusätzlich haben aktuelle Therapien ernsthafte Nebenwirkungen, einschließlich z.B. kognitiver Veränderungen, Beruhigung, Übelkeit und, im Falle von narkotischen Arzneimitteln, Suchtgefahr. Viele Patienten, die unter neuropatischen Beschwerden leiden, sind älter oder haben eine andere medizinische Vorgeschichte, die ihre Toleranz gegenüber Nebenwirkungen, die mit bestehenden Arzneimitteltherapien zusammenhängen, besonders einschränken. Die Unzulänglichkeit einer aktuellen Therapie bei der Minderung neuropatischen Schmerzen, ohne unerträgliche Nebenwirkungen hervorzurufen, wird häufig bei unter Depression und suizidaler Tendenz bei unter chronischen Schmerzen Leidenden gefunden.
Die Verfahren zur Linderung von neuropatischen Schmerzen würden die Lebensqualität vieler Menschen verbessern, die unter Beschwerden auf Grund eines Traumas oder einer Krankheit leiden. Jedoch gibt es aktuell keine wirksamen Arzneimittel, die neuropatische Schmerzen ohne unerwünschte Nebenwirkungen, wie Beruhigung und Suchtgefahr, mindern. Daher gibt es einen Bedarf an Verfahren zur Linderung von neuropatischen Schmerzen, ohne unerwünschte Nebenwirkungen hervorzurufen. Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf und liefert außerdem diesbezügliche Vorteile.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Milderung bzw. Linderung von neuropatischen Schmerzen bzw. Beschwerden durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines aktiven Prosaposin-Fragments an ein Subjekt zur Verfügung. Z.B. liefert die Erfindung ein Verfahren zur Minderung von neuropatischen Schmerzen, resultierend aus einer Störung eines periphereren Nervs, der Spinalganglia, des Rückenmarks, des Hirnstammes, des Thalamus' oder des Cortex', durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines aktiven Prosaposin-Frag ments an ein Subjekt, das die Aminosäuresequenz von Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO. 1) oder Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr (SEQ ID NO. 2) aufweist. Zusätzlich stellt die Erfindung ein Verfahren zur Vermeidung von neuropatischen Schmerzen bei einem Subjekt unter Verabreichung einer wirksamen Menge eines aktiven Prosaposin-Fragments an das Subjekt zur Verfügung. Die vorliegende Erfindung stellt auch von Prosaposin abgeleitete Peptide und die Verwendung dieser Peptide zur Stimulation des Neurit-Wachstums, welches neuralen Zelltod inhibiert, zur Verfügung, so dass Myelinisierung gefördert und neurale Demyelinisierung inhibiert wird. Zusätzlich wird ein Verfahren zur Inhibierung sensorischer oder motorischer Neuropathie durch In-Kontakt-Bringen neuronaler Zellen mit einer Zusammensetzung, die eine wirksame inhibierende Menge eines aktiven Prosaposin-Fragments enthält, zur Verfügung gestellt.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt den Schwellenwert einer tastbaren Allodynie vor (Zeit 0) und zu verschiedenen Zeiten nach einer Bolus-Injektion des von Prosaposin abgeleiteten 22-mer-Peptids (SEQ ID No. 1) in Chung-Modellratten.
2 zeigt den Schwellenwert einer tastbaren Allodynie vor (Zeit 0) und zu verschiedenen Zeiten nach einer Bolus-Injektion des von Prosaposin abgeleiteten 14-mer-Peptids (SEQ ID No. 2) in Chung-Modellratten.
3 zeigt das gesamte Zurückzucken als Antwort auf 0,5 %iges Formalin nach einer intraperitonealen Verabreichung des von Prosaposin abgeleiteten 14-mer-Peptids (SEQ ID No. 2) oder einer Kochsalzlösung an Ratten.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Minderung von neuropatischen Schmerzen bei einem Subjekt durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines aktiven Prosaposin-Fragments an ein Subjekt zur Verfügung. Wie hierin offenbart, kann das erfindungsgemäße Verfahren neuropatische Schmerzen bei einem Sub jekt innerhalb von 30 Minuten nach der Verabreichung mindern. Solch ein Verfahren ist für die Linderung von neuropatischen Schmerzen verwendbar, welche aus einer Störung bzw. Erkrankung eines peripheren Nervs, der Spinalganglia, des Rückenmarks, des Hirnstammes, des Thalamus' oder des Cortex' resultieren.
Ein Peptid, das erfindungsgemäß geeignet ist, wird vom Prosaposin abgeleitet, das ein Protein mit 517 Aminosäuren ist, welches ursprünglich als Vorläufer von vier Sphingolipid-Aktivatorproteinen identifiziert wurde (Kishimoto et al., J. Lipid Res., 33:1255-1267 (1992)). Im Prosaposin werden vier benachbarte Tandemdomänen proteolytisch in den Lysosomen prozessiert, um die Saposine A, B, C und D zu generieren, welche die Hydrolyse der Glycospingolipide durch lysosomale Hydrolasen aktivieren (O'Brien und Kishimoto, FASEB J., 5:301-308 (1991)).
Die unprozessierte Form des Prosaposin wird in hohen Konzentrationen im Menschen- und Rattengehirn gefunden, wo sie innerhalb der neuronalen Oberflächenmembranen lokalisiert ist. Während der embryonalen Entwicklung ist die Prosaposin-mRNA im Gehirn und im Spinalganglion reichlich vorhanden. Außerdem bindet Prosaposin mit hoher Affinität an Ganglioside, die das Neurit-Wachstum anregen und den Übergang der Ganglioside von Mizellen zu Membranen fördert.
Die WO 95/03821 offenbart, dass Prosaposin, Saposin C und deren Fragmente die neuronale Zellmyelinisierung stimulieren und die Myelinisierung erhöhen.
Die neurotrope Aktivität von Prosaposin stimmt mit seiner Lokalisierung in den neuronalen Zellpopulationen überein (O'Brien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9593-9596 (1994); Sano et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 204:994-1000 (1994)). Prosaposin stimuliert das motorische Neurit-Wachstum in vitro und in vivo und erhöht die Cholinacetyltransferase-Aktivität, welche ein Marker für die neuronale Differenzierung ist. Zusätzlich verhindert Prosaposin den Zelltod in den Neuroblastom-Zellen (O'Brien et al., ibid., 1994; O'Brien et al., FASEB J. 9: 681-685 (1995)).
Die neurotrope Tätigkeit von Prosaposin ist am Saposin C, einer Domäne von 80 Aminosäuren, lokalisiert. Ein 22-mer-Peptid, das mit den Aminosäuren 8 bis 29 der Saposin C-Domäne entspricht (SEQ ID NO. 1), stimuliert das Neurit-Wachstum und die Cholinacetyltransferase-Aktivität und verhindert den Zelltod in den Neuroblastom-Zellen (O'Brien et al., ibid., 1995).
Das Prosaposin oder das von Prosaposin abgeleitete 22-mer-Peptid (SEQ ID NO. 1) kann zum Beispiel die motorische Neuronfunktion modulieren, indem es das Neurit-Wachstum fördert. Vor der vorliegenden Erfindung war es jedoch nicht bekannt, ob Prosaposin oder ein Peptidfragment des Prosaposin die sensorische Neuronfunktion beeinflussen könnte. Darüber hinaus ist die neurotrope Aktivität von Prosaposin oder von einem von Prosaposin abgeleiteten Peptid zur Stimulation des motorischen Neurit-Wachstums nur nach einer Dauer von 24 bis 48 Stunden offensichtlich (siehe z.B. O'Brien et al., ibid., 1994). Es ist nicht nachgewiesen worden, dass die neurotrope Aktivität von Prosaposin oder von einem von Prosaposin abgeleiteten Peptid nach einer kürzeren Zeit stattfindet.
Demgegenüber liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Minderung neuropatischer Schmerzen, die sowohl sensorische als auch motorische Neuron-Komponenten mit einbezieht. Außerdem ist das erfindungsgemäße Verfahren bei der Minderung neuropatischer Schmerzen innerhalb von Minuten wirksam, im Gegensatz zu den zuvor gezeigten Stunden oder Tagen, die für die neurotrope Aktivität von Prosaposin oder von einem von Prosaposin abgeleiteten Peptid erforderlich waren.
Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Minderung neuropatischer Schmerzen wurde mit dem anerkannten Chung-Rattenmodell für periphere Neuropathie nachgewiesen. In dem Chung-Rattenmodell erzeugt eine spinale Nerven-Teilverbindung der linken spinalen Nerven L-5 und L-6 eine lang andauernde Überempfindlichkeit gegenüber leichtem Druck auf den betroffenen linken Fuß. Die Überempfindlichkeit ist ähnlich zu dem Schmerz, den Menschen in einem neuropatischen Zustand der Causalgia wahrnehmen, wie von Kim und Chung in, Pain 50:355-363 (1992) beschrieben ist.
Vor der Verabreichung eines aktiven Prosaposin-Fragments wiesen Chung-Modellratten einen Schwellenwert von 3,0 bis 4,0 g auf, bevor der betroffene Fuß in Erwiderung (Response) auf den Druck zurückgezogen wurde (Von Frey Hairs) (siehe 1). Nach der Verabreichung eines aktiven Prosaposin-Fragments (von Prosaposin abgeleitetes 22-mer, SEQ ID NO. 1) wurden die neuropatischen Schmerzen gemindert, was durch eine größere Toleranz gegenüber dem Druck bewiesen wurde, bevor der betroffene Fuß zurückgenommen wurde. Die Wirkung des aktiven Prosaposin-Fragments trat innerhalb von 15 Minuten auf und wurde, wie in 1 gezeigt, während 3 auf die Verabreichung folgenden Stunden aufrecht erhalten. Diese schnelle Linderung der neuropatischen Schmerzen steht in starkem Kontrast zu den verzögerten neurotropen Effekten, die zuvor für das Prosaposin und von Prosaposin abgeleitete Peptide berichtet wurden.
Ein aktives Fragment von Prosaposin, wie das von Prosaposin abgeleitete Peptid SEQ ID NO. 2, minderte auch den Schmerz in einem Rattenmodell für schmerzhafte diabetische Neuropathie. Wie in Beispiel III beschrieben, verringerte das Peptid SEQ ID NO. 2 die Allodynie bei Ratten mit kurzzeitiger Insulin-defizienter Diabetes, die durch das selektive β-Zell-Toxin, Streptozotocin, verursacht wurde. Somit kann ein erfindungsgemäßes aktives Fragment von Prosaposin oder ein von Prosaposin abgeleitetes Peptid verwendet werden, um eine Vielzahl von Typen von neuropatischen Schmerzen, einschließlich mechanischen Schmerzen, wie durch das Chung-Rattenmodell gezeigt, und metabolischen Schmerzen, wie durch die Verwendung dieser Peptide zur Minderung von Schmerzen in diabetischen Ratten exemplarisch gezeigt, zu verringern.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "neuropatische Schmerzen bzw. Schmerz" einen Schmerz, resultierend aus einer Verletzung eines Nervs. Die neuropatischen Schmerzen sind von den nozizeptiven Schmerzen zu unterscheiden, welche die Schmerzen sind, die durch eine akute Gewebeverletzung verursacht werden, worin kleine Hautnerven oder kleine Nerven in Muskeln oder im Bindegewebe involviert sind. Der Schmerz, bei dem ein nozizeptiver Mechanismus eine Rolle spielt, ist normalerweise auf die Dauer der Gewebereparatur beschränkt und ist im Allgemeinen durch verfügbare schmerzlindernde Mittel oder Opioide zu lindern, wie beschrieben in Myers, Regional Anesthesia 20:173-184 (1995).
Die neuropatischen Schmerzen sind gewöhnlich lang andauernd oder chronisch und entwickeln sich häufig Tage oder Monate nach einer anfänglich akuten Gewebeverletzung. Die neuropatischen Schmerzen können hartnäckigen, spontanen Schmerz sowie Allodynie mit sich bringen, welche eine schmerzhafte Erwiderung auf einen Reiz ist, der normalerweise nicht schmerzhaft ist. Die neuropatischen Schmerzen können auch durch Hyperalgesie charakterisiert werden, in welcher eine verschärfte Erwiderung auf einen schmerzhaften Reiz auftritt, der normalerweise, wie bei einem Nadelstich, geringfügig ist. Anders als der nozizeptive Schmerz sind die neuropatischen Schmerzen im Allgemeinen gegenüber einer Opioid-Therapie resistent (Myers, ibid., 1995).
Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Linderung neuropatischer Schmerzen, resultierend aus einer Störung eines peripheren Nervs, des Spinalganglions, des Rückenmarks, des Hirnstammes, des Thalamus' oder des Cortex', anwendbar. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Störung" jedes mögliche Trauma, jede mögliche Verletzung, Erkrankung oder jeden möglichen Zustand, aus dem neuropatische Schmerzen entstehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist unabhängig von der Ätiologie des Schmerzes zur Linderung neuropatischer Schmerzen anwendbar. Z.B. kann ein erfindungsgemäßes Verfahren angewendet werden, um die neuropatischen Schmerzen zu mindern, welche aus einer peripheren Nervenstörung, wie Neurom, Nervenkompression, Nervenquetschung, Nervendehnung oder unvollständiger Nervendurchtrennung, Mononeuropathie oder Polyneuropathie, resultieren. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann auch angewendet werden, um die neuropatischen Schmerzen zu mindern, die sich aus einer Störung, wie einer Hinterwurzelganglion- bzw. Spinalganglionkompression, Entzündung des Rückenmarks, Prellung, Tumor- oder Hemisektion des Rückenmarks, Tumoren des Hirnstamms, des Thalamus' oder des Cortex', oder Trauma des Hirnstamms, des Thalamus' oder des Cortex' ergeben (siehe z.B. Tab. 1).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann z.B. nützlich sein, neuropatische Schmerzen zu lindern, welche aus einem Neurom resultieren, das sich einfach nach einer traumatischen Verletzung eines Nervs entwickeln kann, insbesondere wenn ein ganzer Nerv ernsthaft gequetscht oder durchtrennt wird. Bei einem Neurom ist das Neurit-Wachstum, das normalerweise einen peripheren Nerv regeneriert, anomal oder fehlgeleitet, z.B. zu einer körperlichen Obstruktion, wie einem Narbengewebe. So wird eine regenerierte Nervenfaser in eine Umgebung eingebracht, in der mechanische und physische Faktoren eine anormale elektrophysiologische Aktivität und Schmerzen erzeugen (Myers, ibid., 1995). Ein Amputationsneurom kann z.B. Phantomschmerzen verursachen oder Schmerzen, die durch den Gebrauch einer Gliedprothese ausgelöst werden. Wie hierin offenbart, können solche neuropatischen Schmerzen durch die Verabreichung eines aktiven Prosaposin-Fragments gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gelindert werden.
Eine Nervenkompression führt ebenfalls zu neuropatischen Schmerzen, die unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens behandelt werden können. Eine Nervenkompression kann, wie im Fall traumatischer Nervenquetschung, abrupt stattfinden oder infolge eines Tumorwachstums oder einer Narbenbildung in der Nähe eines Hauptnervenstrangs verlängert und moderat verlaufen. Eine Kompressionsneuropathie kann als Ergebnis von Veränderungen im Blutstrom zu einem Nerv auftreten, wodurch eine heftige Ischämie und folglich eine Nervenverletzung verursacht wird (Myers, ibid., 1995).
Die Verabreichung eines aktiven Prosaposin-Fragments gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren kann die neuropatischen Schmerzen ebenfalls lindern, die aus einer Mononeuropathie oder einer Polyneuropathie resultieren. Wie hierin verwendet, ist eine Neuropathie eine Funktionsstörung oder eine pathologische Veränderung im peripheren Nervensystem und klinisch durch sensorische oder motorische Neuronmissbildungen gekennzeichnet. Der Begriff Mononeuropathie zeigt an, dass ein einziger peripherer Nerv betroffen ist, während der Begriff Polyneuropathie anzeigt, dass mehrere periphere Nerven betroffen sind.
Die Ätiologie einer Neuropathie kann bekannt oder unbekannt sein (siehe z.B. Myers, ibid., 1995; Galer, Neurology 45 (suppl. 9):S. 17-25 (1995); Stevens und Lowe, Pathology, Times Mirror International Publishers Limited, London (1995)). Bekannte Ätiologien schließen Komplikationen bei einer Krankheit oder einem toxischen Zustand ein; z.B. ist Diabetes die am häufigsten vorkommende metabolische Störung, die Neuropathie verursacht. Das erfindungsgemäße Verfahren lindert die neuropatischen Schmerzen einer Mononeuropathie, welche z.B. aus Diabetes, Bestrahlung, Ischämie oder Vasculitis resultiert. Das erfindungsgemäße Verfahren lindert auch die neuropatischen Schmerzen einer Polyneuropathie, welche z.B. aus einem Post-Polio-Syndrom, Diabetes, Alkohol, Amyloid, Toxinen, HIV, Hypothyreose, Urämie, Vitaminmangel, Chemotherapie, ddC oder der Fabry-Krankheit resultieren (siehe Tab. 1). Das erfindungsgemäße Verfahren ist beson ders nützlich zur Linderung der Post-Polio-Myalgie. Das erfindungsgemäße Verfahren kann ebenfalls die neuropatischen Schmerzen einer unbekannten Ätiologie mindern.
Wie hierin offenbart, kann ein aktives Prosaposin-Fragment auch bei der Linderung von neuropatischen Schmerzen oder bei der Stimulation des Neurit-Wachstums, der Inhibierung des neuralen Zelltodes, der Förderung der Myelinisierung oder Inhibierung der Demyelinisierung oder der Inhibierung der sensorischen Neuropathie nützlich sein. Der Begriff "aktives Prosaposin-Fragment", wie hierin verwendet, bedeutet ein Peptid, das eine Aminosäuresequenz hat, welche der Aminosäuresequenz von Prosaposin entspricht und eine Aktivität zur Linderung neuropatischer Schmerzen aufweist oder das Neurit-Wachstum stimuliert, den neuralen Zelltod inhibiert, Myelinisierung fördert oder Demyelinisierung inhibiert oder sensorische oder motorische Neuropathie inhibiert.
Wie hierin verwendet, bedeutet die Linderung der neuropatischen Schmerzen das Verringern der Heftigkeit der neuropatischen Schmerzen. In einer menschlichen Person verringert ein aktives Prosaposin-Fragment die Heftigkeit der neuropatischen Schmerzen, so dass das Leiden der Person gemindert und die Lebensqualität verbessert wird. Ein aktives Prosaposin-Fragment kann auch die neuropatischen Schmerzen in einem beliebigen gut etablierten Tiermodell für neuropatische Schmerzen mindern, wie weiter unten beschrieben ist (siehe auch Bennett, Muscle & Nerve 16:1040-1048 (1993)). Wie hierin verwendet, ist der Begriff "aktives Prosaposin-Fragment" mit "von Prosaposin abgeleitetem Peptid" synonym.
Das aktive Prosaposin-Fragment enthält vorzugsweise die Aminosäuresequenz Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO. 3), das den Aminosäuren 18 bis 29 von Saposin C entspricht. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform hat ein aktives Prosaposin-Fragment die Aminosäuresequenz Cys-Glu-Phe-Leu-Val-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO. 1), das den Aminosäuren 8 bis 29 von Saposin C entspricht, oder die Aminosäuresequenz Thr-D-Ala-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Ala-Thr-Glu-Glu-Ile-Leu-Tyr (SEQ ID NO. 2), das den Aminosäuren 16 bis 29 von Saposin C entspricht, welches aber durch Ersatz von Lysin durch D-Alanin an Position 2, Ersatz von Lysin durch Alanin an Position 8, Deletion von Lysin an Position 11 und Hinzufügung eines C-terminalen Tyrosinrests geändert worden ist (siehe Tab. 2). Solche Modifikationen können wie unten beschrieben für die Erhöhung der Peptidstabilität oder -aufnahme über der Blut-Hirn-Schranke nützlich sein. Wie hierin verwendet, kann D-Alanin durch D-Ala oder X dargestellt werden.
Ein aktives Prosaposin-Fragment kann ungefähr 12 Aminosäuren bis ungefähr 80 Aminosäuren aufweisen, was der vollen Länge des Saposin C entspricht. Vorzugsweise hat ein aktives Prosaposin-Fragment ungefähr 12 Aminosäuren bis ungefähr 40 Aminosäuren und vorzugsweise ungefähr 14 Aminosäuren bis ungefähr 22 Aminosäuren.
Zur Anwendung bei der Linderung neuropatischer Schmerzen in einer menschlichen Person wird ein aktives Fragment des menschlichen Prosaposin, wie SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2, bevorzugt. SEQ ID NO. 3 ist in Tab. 2 und in der gesamten Beschreibung für Vergleichszwecke gezeigt. Jedoch ist auch ein aktives Fragment, das von einem anderen Säugetier- Prosaposin abgeleitet ist, bei der Linderung neuropatischer Schmerzen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren nützlich. So kann z.B. auch ein aktives Fragment eines Maus-Prosaposin, eines Ratten-Prosaposin, eines Meerschweinchen-Prosaposin oder eines Rinder-Prosaposin, wie SEQ ID NOS. 4 bis 7, bei der Linderung neuropatischer Schmerzen in einem Subjekt nützlich sein.
Die Aminosäuresequenz eines aktiven Fragments des menschlichen Prosaposin (SEQ ID NO. 1), das den Aminosäuren 8 bis 29 des Saposin C entspricht, ist in nerhalb der anderen Spezies gut erhalten, wie in Tab. 3 gezeigt ist. Insbesondere sind die benachbarten Asparagin (N)-Reste bei Mensch-, Maus-, Ratte-, Meerschweinchen- und Rinder-Prosaposinen erhalten. Außerdem ist ein Leucin (L)-Rest mit 3 bis 4 Resten zum N-Terminus der zwei Asparagin-Reste erhalten, und ein oder mehrere geladene Reste (Asparaginsäure (D), Lysin (K), Glutaminsäure (E) oder Arginin (R)) sind mit 2 bis 8 Resten zum C-Terminus der zwei Asparagin-Reste erhalten. Jeder dieser gut erhaltenen Reste ist in Tab. 3 unterstrichen.
Die oben beschriebenen gut erhaltenen benachbarten Asparagin-Reste, der Leucin-Rest und die geladenen Reste können für die Aktivität eines aktiven Prosaposin-Fragments für die Linderung von neuropatischen Schmerzen oder bei der Stimulierung des Neurit-Wachstums, der Inhibierung des neuralen Zelltodes, der Förderung der Myelinisierung oder Inhibierung der Demyelinisierung oder bei der Inhibierung der motorischen Neuropathie wichtig sein. Z.B. ist das von Prosaposin abgeleitete 22-mer (SEQ ID NO. 1) oder das von Prosaposin abgeleitete 14-mer (SEQ ID NO. 2) ein aktives Prosaposin-Fragment, das die schmerzhafte Allodynie verringert, zu sehen im Chung-Rattenmodell für periphere Neuropathie, wie im Beispiel I offenbart (siehe 1 und 2). Demgegenüber mangelt es einer 22-mer-Mutante (SEQ ID NO. 8), welche sich von SEQ ID NO. 1 darin unterscheidet, das sie einen Asparaginsäure-Rest (D) an Stelle des ersten konservierten Asparagins aufweist (siehe Tab. 4), an Aktivität bei der Linderung neuropatischer Schmerzen, wie unter Verwendung von Chung-Ratten (siehe Beispiel I) geprüft.
Die Aktivität eines Peptids zur Linderung neuropatischer Schmerzen kann auch mit der neurotropen Aktivität korreliert werden. Zum Beispiel lindern das von Prosaposin abgeleitete 22-mer (SEQ ID NO. 1) und das von Prosaposin abgeleitete 14-mer (SEQ ID NO. 2) die neuropatischen Schmerzen und weisen eine neurotrope Aktivität auf. Außerdem ist die 22-mer-Mutante (SEQ ID NO. 8), wie oben beschrieben, bezüglich der Linderung neuropatischer Schmerzen inaktiv, und es fehlt die neurotrope Aktivität, was weiterhin anzeigt, dass die Aktivität zur Linderung neuropatischer Schmerzen mit neurotroper Aktivität korrelieren kann. Die 14-mer-Peptid-M-1-Mutante (SEQ ID NO. 9), welche eine Substitution am zweiten konservierten Asparagin-Rest aufweist, fehlt die neurotrope Aktivität, was anzeigt, dass die Peptid-SEQ ID NO. 9 bezüglich der Linderung neuropatischer Schmerzen ebenfalls inaktiv ist. Der 14-mer-Peptid-M-2-Mutante (SEQ ID NO. 10), welche eine Substitution am konservierten Leucin-Rest aufweist, fehlt die neurotrope Aktivität, was anzeigt, dass die Peptid-SEQ ID NO. 10 bezüglich der Linderung neuropatischer Schmerzen ebenfalls inaktiv ist. Demgegenüber ist das von Prosaposin abgeleitete 12-mer-Peptid (SEQ ID NO. 3), das die oben beschriebenen konservierten benachbarten Asparagine, das Leucin und die geladenen Reste hat, als neurotroper Faktor aktiv.
Von Prosaposin abgeleitete Peptide und deren neurotrope Analoga haben bedeutende therapeutische Anwendungen bei der Förderung einer funktionalen Wiederherstellung nach toxischen, traumatischen, ischämischen, degenerativen oder ererbten Verletzungen des peripheren oder zentralen Nervensystems. Außerdem können diese Peptide die Myelinisierung fördern oder die Demyelinisierung inhibieren, was dem Effekt von Demyelinisierungskrankheiten entgegenwirkt. Weiterhin stimulieren solche Peptide das Wachstum von Neuronen und inhibieren den programmierten Zelltod in neuronalem Gewebe. Die erfindungsgemäßen aktiven neurotropen und myelinotropen Peptide haben zwischen ungefähr 12 oder 14 und ungefähr 50 Aminosäuren und schließen vorzugsweise die nicht natürlich auftretende Prosaposin-Sequenz, die in SEQ ID NO. 2 gezeigt ist, ein. Z.B. besitzen die erfindungsgemäßen aktiven neurotropen und myelinotropen Peptide zwischen 14 und ungefähr 50 Aminosäuren und schließen die nicht natürlich auftretende Prosaposin-Sequenz ein, die in SEQ ID NO. 2 gezeigt ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Stimulieren des Neurit-Wachstums, zum Inhibieren des neuralen Zelltodes, zur Förderung der Myelinisierung oder Inhibierung der Demyelinisierung in differenzierten und undifferenzierten neuronalen Zellen zur Verfügung gestellt, indem neuronalen Zellen eine wirksame Menge eines das Neurit-Wachstum fördernden oder eines Myelinisierungseigenschaften aufweisenden Peptids, das zwischen ungefähr 12 und ungefähr 50 Aminosäuren besitzt und vorzugsweise das in SEQ ID NO. 2 gezeigte Peptid einschließt, verabreicht wird. In den erfindungsgemäßen Verfahren zum Anregen des Neurit-Wachstums, zum Inhibieren des neuralen Zelltodes, zur Förderung der Myelinisierung oder Inhibierung der Demyelinisierung kann eine wirksame Menge eines Peptids, das z.B. zwischen 14 und ungefähr 50 Aminosäuren aufweist und das das in SEQ ID NO. 2 gezeigte Peptid einschließt, verwendet werden.
Die Eignung solcher Peptide, das Neurit-Wachstum anzuregen, den neuralen Zelltod zu inhibieren, die Myelinisierung zu fördern oder Demyelinisierung zu inhibieren, kann von einem Fachmann unter Verwendung der in den Beispielen IV bis VII beschriebenen Verfahren einfach bestimmt werden. Die Verfahren zum Prüfen der Eignung dieser Peptide, die Myelinisierung zu fördern und die Demyelinisierung zu inhibieren, werden in den Beispielen VI und VII unten gezeigt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Inhibierung einer sensorischen Neuropathie durch In-Kontakt-Bringen neuronaler Zellen mit einer Zusam mensetzung bereit, die eine wirksame inhibierende Menge eines aktiven Prosaposin-Fragments enthält. Die Erfindung stellt z.B. ein Verfahren zur Inhibierung einer sensorischen Neuropathie durch In-Kontakt-Bringen neuronaler Zellen mit einer Zusammensetzung bereit, die eine wirksame inhibierende Menge eines Peptids enthält, welches die als SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 2 gezeigte Sequenz aufweist.
Wie hierin in Beispiel X beschrieben, kann ein von Prosaposin abgeleitetes Peptid bei der Inhibierung einer sensorischen Neuropathie verwendbar sein. In einem Mausmodell, in dem eine sensorische Neuropathie durch eine Taxol-Verabreichung induziert wird, wird normalerweise ein Verlust der thermischen Empfindung beobachtet. Jedoch wurde der Verlust der thermischen Empfindung in den mit Taxol behandelten Mäusen, denen 100 μg/kg des Peptids der SEQ ID NO. 1 gegeben wurden, inhibiert. Diese Ergebnisse zeigen an, dass von Prosaposin abgeleitete Peptide ein neurotroper Faktor sowohl für sensorische als auch für motorische Neuronen sein können.
Ein in den erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbares Peptid kann z.B. auch die SEQ ID NOS. 11 bis 19 (siehe Tab. 5) haben. Z.B. zeigt die Sequenz-Anordnung des von Prosaposin abgeleiteten 22-mer-Peptids der SEQ ID NO. 1 mit Zytokinen und Wachstumsfaktoren eine Sequenz-Ähnlichkeit zu einer Anzahl von menschlichen (h) Zytokinen, einschließlich hCNTF, hIL-6, hIL-2, hIL-3, hIL1-γ, Erythropoietin (hEPO), Human Leukocyte Inhibition Faktor (hLIF), der hIL-1-β-Kette und On-costatin-M (hONC-M), an. Die SEQ ID NOS. 11 bis 19, wie das aktive Prosaposin-Fragment der SEQ ID NO. 1, enthalten zwei Asparagin-Reste, die benachbart oder durch eine Aminosäure getrennt sind. Außerdem können die von Zytokinen abgeleiteten Peptidsequenzen enthalten: einen drei bis vier Reste vom N-Terminus der zwei Asparagin-Reste entfernten Leucin (L)- oder Isoleucin (I)-Rest und einen oder mehrere zwei bis acht Reste zum C-Terminus der zwei Asparagin-Reste entfernte geladene Reste (Asparaginsäure (D), Lysin (K), Glutaminsäure (E) oder Arginin (R)), wie es in dem aktiven Prosaposin-Fragment zu sehen ist (22-mer; SEQ ID NO. 1). Jeder dieser Reste ist in Tab. 5 unterstrichen.
Die Modelle für eine Zytokin-Rezeptor-Bindung (Sprang und Bazan, Curr. Opin. Struct. Biol., 3:816 (1993)) haben die evolutionäre Konservierung einer vier-helikalen Strangstruktur hervorgehoben, die vielen Zytokinen gemein ist. Jede der Zytokin- oder Wachstumsfaktor-Sequenzen, welche zur von Prosaposin abgeleiteten Sequenz SEQ ID NO. 1 verwandt ist, befindet sich zwischen den Helices A und B (AB-Loop bzw. -Schleife) oder innerhalb der Helix C des Zytokins.
Die strukturell verwandten, von Zytokin und Wachstumsfaktor abgeleiteten Peptide der SEQ ID NOS. 11 bis 19 können in den Verfahren zur Linderung neuropathischer Schmerzen auch verwendbar sein. Die Peptide der SEQ ID NOS. 11 bis 19 können auf Aktivität zur Linderung neuropatischer Schmerzen getestet werden, z.B. im Chung-Rattenmodell, beschrieben in Beispiel I; in einem Modell für diabetische Neuropathie, wie beschrieben in Beispiel III-Tests, beschrieben von Wall et al., Pain 7:103-113 (1979); Bennett und Xie, Pain 33:87-107 (1988); Lekan et al., Soc. Neurosci. Abstr.. 18:287 (1992) oder Palacek et al., Soc. Neurosci. Abstr.. 18:287 (1992); oder anderen Tests zu neuropatischen Schmerzen.
Die von Zytokin und Wachstumsfaktor abgeleiteten Peptide der SEQ ID NOS. 11 bis 19 können auch in Verfahren zur Stimulation des Neurit-Wachstums, zum Inhibieren des neuralen Zelltodes, zum Fördern der Myelinisierung oder zum Inhibieren der Demyelinisierung oder in Verfahren der Inhibierung der sensorischen oder motorischen Neuropathie einsetzbar sein. Ein Peptid, das zwischen ungefähr 14 und ungefähr 50 Aminosäuren aufweist und die aktive neurotrope Region enthält, enthaltend eine der Sequenzen SEQ ID NO. 11 bis 19, kann getestet werden: auf die Eignung, das Neurit-Wachstum zu fördern, wie in Beispiel IV beschrieben, auf die Eignung, den neuralen Zelltod zu inhibieren, wie in Beispiel V beschrieben, oder auf die Eignung, die Myelinisierung zu fördern, wie in Beispiel VI beschrieben, oder auf die Eignung, die Demyelinisierung zu inhibieren, wie in Beispiel VII beschrieben, oder auf die Eignung, die sensorische Neuropathie zu inhibieren, wie beschrieben in Beispiel X.
Ein bei der Linderung von neuropatischen Schmerzen verwendbares aktives Prosaposin-Fragment oder ein Peptid kann durch Screening bzw. Reihentests einer großen Sammlung oder Bibliothek von Zufallspeptiden oder in Frage kommenden Peptiden, zum Beispiel aus einem der Tiermodelle für neuropatische Schmerzen, identifiziert werden. Solche in Frage kommenden Peptide können zum Beispiel sein: die von Zytokin und Wachstumsfaktor abgeleiteten Peptide der SEQ ID NOS. 11 bis 19, die zum aktiven Prosaposin-Fragment (SEQ ID NO. 1) verwandte Aminosäuresequenzen aufweisen. In Frage kommende Peptide können z.B. auch sein: eine Population von zur Aminosäuresequenz SEQ ID NO. 1 verwandten Peptiden, welche konservierte Asparagin-Reste, einen Leucin-/Isoleucin-Rest und einen oder mehrere geladene Reste an den Positionen aufweisen, die den Positionen entsprechen, in denen diese Reste in SEQ ID NO. 1 gefunden werden, wobei diese auch eine oder mehrere Aminosäuren haben, die sich von den Aminosäuren der SEQ ID NO. 1 unterscheiden.
Die Peptidbibliotheken schließen z.B. die markierten chemischen Bibliotheken mit ein, die Peptid- und peptidomimetische Moleküle enthalten. Die Peptidbibliotheken enthalten auch jene, welche durch eine Bakteriophagenanzeige-Technologie bzw. Phage Display Technology generiert werden. Die Bakteriophagenanzeige-Technologie schließt die Expression von Peptidmolekülen auf der Oberfläche eines Bakteriums sowie andere Verfahrensweisen ein, durch die ein Protein-Ligand der Nukleinsäure, die ihn kodiert, zugeordnet ist oder werden kann. Verfahren zur Generierung von Bakteriophagenanzeige-Bibliotheken, einschließlich Vektoren, und Verfahren zur Diversifizierung von Peptid-Populationen, welche exprimiert werden, sind weithin bekannt (siehe z.B., Smith und Scott, Methods Enzymol. 217:228-257 (1993); Scott und Smith, Science 249:386-390 (1990); und Huse, WO 91/07141 und WO 91/07149). Diese oder andere weithin bekannte Verfahren können verwendet werden, um eine Bakteriophagenanzeige-Bibliothek zu generieren, von welcher aus die angezeigten Peptide gespalten und auf eine Aktivität zur Linderung von neuropatischen Schmerzen oder auf eine andere neurotrope oder myelinotrope Aktivität, wie hierin beschrieben, getestet werden können. Wenn gewünscht, kann eine Population von Peptiden auf eine Aktivität getestet werden, und eine aktive Population kann abgeteilt werden, und der Test kann wiederholt werden, um ein aktives Peptid aus dieser Population zu isolieren. Andere gemäß der Erfindung anwendbare Verfahren für die Herstellung von Peptiden schließen zum Beispiel auf einem rationalen Design und Mutagenese basierende Aminosäuresequenzen von aktiven Prosaposin-Fragmenten, wie z.B. SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2, ein.
Wie hierin offenbart, kann ein aktives Prosaposin-Fragment oder ein Peptid, das bei der Linderung neuropatischer Schmerzen einsetzbar ist, durch seine Aktivität bei der Linderung neuropatischer Schmerzen in irgendeinem der etablierten Tiermodelle für neuropatische Schmerzen identifiziert werden (Bennett, ibid., 1993). Z.B. kann ein aktives Prosaposin-Fragment unter Anwendung eines Experimentalmodells für periphere Neuropathie, hergestellt durch segmentale Spinalnerven-Ligation in der Ratte, identifiziert werden. Das Chung-Rattenmodell dupliziert die Symptome bei menschlichen Patienten mit Causalgia oder starken Schmerzen auf Grund einer Verletzung eines peripheren Nervs (Kim und Chung, ibid., 1992). Das chirurgische Verfahren von Kim und Chung erzeugt eine lang anhaltende Hyperalgesie gegenüber schädlicher Hitze und eine mechanische Allodynie beim betroffenen Fuß. Wie im Beispiel I beschrieben, sind Ratten mit Spinalnerven-Ligation, entsprechend dem von Chung und Kim entwickelten Verfahren, bei der Identifizierung eines aktives Prosaposin-Fragments zur Verwendung bei der Linderung neuropatischer Schmerzen verwendbar.
Ein für die Linderung neuropatischer Schmerzen verwendbares aktives Prosaposin-Fragment oder ein Peptid kann auch durch seine Aktivität bei der Linderung neuropatischer Schmerzen in einem Rattenmodell für schmerzhafte diabetische Neuropathie identifiziert werden. Eine Hyperalgesie gegenüber thermisch, mechanisch und chemisch schädlichen Reizen ist ebenfalls in diabetischen Ratten mit einer Kurzzeit-Insulinmangel-Diabetes berichtet worden, die durch ausgewählte β-Zelltoxine, wie Streptozotocin (Calcutt et al., Pain 68:293-299 (1996)), induziert wird. Solch ein Rattenmodell ist für einen Schmerz repräsentativ, der bei diabetischen Menschen nachgewiesen worden ist, die eine Vielzahl von anomalen Empfindungen bzw. Empfindlichkeiten zeigen, einschließlich spontaner Schmerzen, Schmerzen, ausgelöst durch Lichtkontakt und Hyperalgesie. Die Ratten, die mit Streptozotocin oder einem anderen ausgewählten β-Zelltoxin behandelt wurden, können mit einem Fragment oder einem in Frage kommenden Peptid behandelt werden; anschließend wird die Erwiderung auf einen schädlichen Reiz bzw. einen schädlichen Stimulus, wie durch 0,5 % Formalin, gemessen. Eine verringerte Erwiderung kann verwendet werden, um ein bei der Linderung neuropatischer Schmerzen verwendbares aktives Prosaposin-Fragment oder ein Peptid zu identifizieren.
Ein zur Linderung neuropatischer Schmerzen verwendbares aktives Prosaposin-Fragment oder ein Peptid kann auch mit dem Neurom-Modell von Wall et al. identifiziert werden. Dieses anerkannte Modell für neuropatische Schmerzen reproduziert die menschlichen Symptome, die nach einer Amputation oder Nervendurchtrennung in einem intakten Glied zu sehen sind (Wall et al., ibid., 1979). Wie oben besprochen, bildet sich ein Neurom einfach nach einer Nervendurchtrennung auf Grund eines vereitelten Wachstums der Neurit-Sprößlinge.
Ein Modell einer chronischen Konstriktionsverletzung kann auch verwendet werden, um ein aktives Prosaposin-Fragment oder ein Peptid, das bei der Linderung neuropatischer Schmerzen verwendbar ist, zu identifizieren. Das chronische Konstriktionsverletzungs-Modell von Bennett und Xie, ibid., 1988, ist ein Rattenmodell für periphere Neuropathie, welches Schmerzerkrankungen bzw. -störungen wie beim Menschen produziert. Im Bennett-Modell wird eine Nervenverletzung durch lose bindende Konstriktions-Ligaturfäden um einen Hüftnerv der Ratte erzeugt, wodurch eine Degeneration des Nervenendes hin zur Konstriktion verursacht wird.
Allodynie und Hyperalgesie werden durch die Konstriktionsverletzung zusätzlich zu dem spontanen Schmerz erzeugt.
Primaten-Modelle für neuropatische Schmerzen sind auch einsetzbar, um ein aktives Prosaposin-Fragment oder ein Peptid zu identifizieren, welches bei der Linderung neuropatischer Schmerzen verwendbar ist (siehe z.B. Lekan et al., ibid., 1992; Palacek et al., ibid., 1992).
Der hierin verwendete Begriff "Peptid", wie mit Hinweis auf ein aktives Prosaposin-Fragment, auf ein von Prosaposin abgeleitetes Peptid oder auf ein Peptid, das in den erfindungsgemäßen Verfahren einsetzbar ist, verwendet, hat die Bedeutung einer Verbindung, die natürlich vorkommende Aminosäuren, nicht natürlich vorkommende Aminosäuren oder chemisch modifizierte Aminosäuren enthält, vorausgesetzt, dass die Verbindung eine Aktivität bei der Linderung neuropatischer Schmerzen oder eine andere neurotrope oder myelinotrope Aktivität, wie hierin beschrieben, aufweist. Ein von Prosaposin abgeleitetes Peptid kann auch ein mimetisches Peptid sein, das nicht die chemische Struktur einer Aminosäure aufweist, das die Struktur eines von Prosaposin abgeleiteten Peptids nachahmt und eine Aktivität behält. Solch ein Mimetic wird allgemein dadurch charakterisiert, dass es ähnliche physikalische Eigenschaften, wie Größe, Ladung oder Hydrophobie, bei gleicher räumlicher Anordnung hat, wie dies bei den von Prosaposin abgeleiteten Peptid-Gegenstücken gefunden wird. Ein spezifisches Beispiel eines mimetischen Peptids ist eine Verbindung, in der eine Amidbindung zwischen einer oder mehreren Aminosäuren z.B. durch eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung oder durch andere gut bekannte Bindungen ersetzt ist (siehe z.B. Sawyer, Peptid Based Drug Design, ACS, Washington (1995)).
Der hierin verwendete Begriff "Aminosäure" bezieht sich auf eine der zwanzig natürlich vorkommenden Aminosäuren, einschließlich der L-Aminosäuren und D-Aminosäuren, wenn nichts anderes angegeben ist. Der Begriff Aminosäure bezieht sich auch auf Verbindungen, wie chemisch modifizierte Aminosäuren, einschließlich Aminosäure-Analoga, natürlich vorkommende Aminosäuren, die normalerweise nicht in Proteine eingebaut werden, wie Norleucin, und auf chemisch synthetisierte Verbindungen, die für Aminosäuren charakteristische Eigenschaften aufweisen, vorausgesetzt, dass die Verbindung innerhalb des Peptids ersetzt werden kann, so dass es seine biologische Aktivität beibehält. Z.B. kann Glutamin ein Aminosäure-Analoges des Asparagins sein, vorausgesetzt, dass es innerhalb eines aktiven Prosaposin-Fragments ersetzt werden kann, so dass es seine Aktivität bei der Linderung neuropatischer Schmerzen oder eine andere neurotrope oder myelinotrope Aktivität behält, wie hierin beschrieben. Andere Beispiele für Aminosäuren und Aminosäure-Analoga sind in Gross und Meienhofer, The Peptides: Analysis. Synthesis. Biology, Academic Press, Inc., New York (1983) verzeichnet. Eine Aminosäure kann auch eine mimetische Aminosäure sein, die eine Struktur aufweist, die im Wesentlichen die gleiche räumliche Anordnung der funktionellen Gruppen wie bei einer Aminosäure zeigt, die aber nicht notwendigerweise sowohl die α-Amino- als auch α-Carboxyl-Gruppen aufweist, die für eine Aminosäure charakteristisch sind.
Ein erfindungsgemäß verwendbares aktives Prosaposin-Fragment oder ein Peptid kann unter Anwendung von bekannten Verfahren isoliert oder synthetisiert werden. Solche Verfahren schließen rekombinante DNA-Verfahren und chemische Syntheseverfahren zur Herstellung eines Peptids ein. Rekombinante Verfahren zur Herstellung eines Peptids durch Expression einer Nukleinsäuresequenz, die das Peptid in einer geeigneten Wirtszelle kodiert, sind weithin bekannt und werden z.B. in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ed., Vol. 1 bis 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989) beschrieben.
Ein erfindungsgemäß verwendbares aktives Prosaposin-Fragment oder ein Peptid kann auch durch chemische Synthese, z.B. durch das Solid-Phase-Peptid-Syntheseverfahren von Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1964), hergestellt werden. Die weithin bekannten Standardlösungsverfahren können auch angewendet werden, um ein erfindungsgemäß verwendbares Peptid zu synthetisieren (siehe, z.B., Bodanszky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) und Bodanszky, Peptide Chemistry, Springer-Verlag, Berlin (1993)). Ein neu-synthetisiertes Peptid kann z.B. durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt und z.B. mittels Massenspektrometrie oder Aminosäuresequenzanalyse charakterisiert werden.
Es versteht sich, dass begrenzte Modifikationen an einem aktiven Prosaposin-Fragment durchgeführt werden können, ohne seine biologische Funktion zu zerstören. So liegt eine Modifikation eines aktiven Prosaposin-Fragments, welche nicht seine Eignung zur Linderung neuropatischer Schmerzen zerstört, innerhalb der Definition eines aktiven Prosaposin-Fragments. Eine Modifikation kann z.B. eine Hinzufügung, eine Deletion oder einen Austausch von Aminosäureresten, einen Austausch einer Verbindung, welche eine Aminosäurestruktur oder -funktion nachahmt und eine Hinzufügung von chemischen Resten, wie Amino- oder Acetylgruppen, einschließen. Die Aktivität eines modifizierten Peptids bei der Linderung neuropatischer Schmerzen kann mit einem Tiermodell für neuropatische Schmerzen geprüft werden, wie mit jenen, die oben beschrieben wurden, oder mit dem im Beispiel I dargestellten Test.
Eine besonders nützliche Modifikation eines aktiven Prosaposin-Fragments verleiht diesem z.B. erhöhte Stabilität. Z.B. kann die Einbringung einer oder mehrerer D-Aminosäuren oder der Austausch oder die Deletion von Lysin die Stabilität eines aktiven Prosaposin-Fragments erhöhen, indem dieses gegen einen Peptidabbau geschützt wird. Wie hierin offenbart, hat das von Prosaposin abgeleitete 14-mer mit SEQ ID NO. 2 zum Beispiel eine Aminosäuresequenz, die von den Aminosäuren 16 bis 29 des Saposin C abgeleitet ist, welche aber durch Austausch oder Deletion einer der drei natürlich vorkommenden Lysine und Hinzufügung eines C-terminalen Tyrosin-Restes modifiziert worden ist. Insbesondere hat das von Prosaposin abgeleitete 14-mer mit SEQ ID NO. 2 ein D-Alanin durch Austausch von Lysin an Position 2, ein Alanin durch Austausch von Lysin an Position 8 und eine Deletion des Lysins an Position 11. Der D-Alanin-Austausch an Position 2 verleiht eine erhöhte Stabilität, indem er das Peptid vor einem weithin bekannten Endoprotease-Abbau schützt (siehe, z.B. Seite 247 aus Patridge, Peptide Drug Delivery to the Brain, Raven Press, New York (1991)). Der Austausch oder die Deletion eines Lysin-Restes verleiht einen erhöhten Widerstand gegenüber Trypsin-ähnlichen Proteasen, was aus der Literatur bekannt ist (Partridge, ibid., 1991). Dieser Austausch erhöht die Stabilität und so die Bioverfügbarkeit des Peptids der SEQ ID NO. 2, beeinflusst aber nicht die Aktivität bei der Linderung neuropatischer Schmerzen.
Eine nützliche Modifikation kann auch darin bestehen, den Peptiddurchgang durch die Blut-Hirn-Schranke zu fördern, z.B. eine Modifikation, welche Lipophilie erhöht oder die Wasserstoff-Bindung verringert. Z.B. erhöht ein am C-Terminus des von Prosaposin abgeleiteten Peptids (SEQ ID NO. 2) zugefügter Tyrosin-Rest die Hydrophobie und Permeabilität durch die Blut-Hirn-Schranke (siehe z.B., Banks et al., Peptides 13:1289-1294 (1992) und Pardridge, ibid., 1991). Ein chimärisches Peptid-Arzneimittel, das eine erhöhte biologische Stabilität oder erhöhte Permeabilität durch die Blut-Hirn-Schranke hat, kann z.B. auch in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sein.
Ein Fachmann kann, wie in Beispiel II offenbart, zum Beispiel auf einfache Weise die Eignung eines aktiven Prosaposin-Fragments, die Blut-Hirn-Schranke in vivo zu passieren, testen. Außerdem kann ein aktives Prosaposin-Fragment auf seine Eignung, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren, getestet werden, indem ein in vitro – Modell für eine Blut-Hirn-Schranke eingesetzt wird, das auf einem Gehirn-Mikrogefäß-Endothel-Zellkultursystem beruht, z.B. beschrieben in Bowman et al., Ann. Neurol. 14:396-402 (1983) oder Takahura et al., Adv. Pharmacol. 22:137-165 (1992).
Der hierin verwendete Begriff "wirksame Menge" bedeutet die zur Linderung neuropatischer Schmerzen oder zur Verhinderung neuropatischer Schmerzen brauchbare Menge eines aktiven Prosaposin-Fragments. Eine wirksame Menge zur täglichen systemischen Verabreichung hängt vom Körpergewicht des Subjektes ab. Vorzugsweise beträgt eine wirksame Menge zur täglichen systemischen Verabreichung ungefähr 0,1 μg/kg bis ungefähr 1000 μg/kg. Bevorzugter beträgt eine wirksame Menge zur täglichen systemischen Verabreichung ungefähr 10 μg/kg bis ungefähr 100 μg/kg. Eine wirksame Menge eines Peptids zur Linderung oder Verhinderung von Schmerzen kann mit den weithin bekannten Verfahren empirisch festgestellt werden, einschließlich z.B. des im Beispiel I beschriebenen Tests oder jenen oben offenbarten, einschließlich der Tests mit Primaten (Lekan et al., ibid., 1992 und Palacek et al., ibid., 1992).
Eine typische Mindestmenge der erfindungsgemäßen Peptide für eine neurotrope oder myelinotrope Aktivität im Zellwachstumsmedium liegt bei mindestens unge fähr 5 ng/ml. Diese Menge oder eine größere Menge eines erfindungsgemäßen Peptids kann für eine in vitro-Anwendung verwendet werden. Gewöhnlich können Konzentrationen im Bereich von 0,1 μg/ml bis zu ungefähr 10 μg/ml eines erfindungsgemäßen Peptids verwendet werden. Eine wirksame Menge für die Behandlung eines bestimmten Gewebes kann, wie in den Beispielen IV und VI beschrieben, bestimmt werden.
Neurale Zellen können in vitro oder ex vivo mittels einer direkten Verabreichung eines erfindungsgemäßen Peptids an die Zellen behandelt werden. Dies kann z.B. durch Kultivierung von Zellen in einem für einen bestimmten Zelltyp geeigneten Wachstumsmedium durchgeführt werden, gefolgt von einer Zugabe des Peptids zum Medium. Wenn die zu behandelnden Zellen in vivo sind, typischerweise in einem Wirbeltier, vorzugsweise einem Säugetier, kann ein erfindungsgemäßes Peptid durch eine der verschiedenen unten beschriebenen Techniken verabreicht werden.
Der hierin verwendete Begriff "Subjekt" steht für ein Wirbeltier, vorzugsweise ein Säugetier und insbesondere einen Menschen.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Linderung von Schmerzen, zur Stimulation des Neurit-Wachstums, zur Inhibierung des neuralen Zelltodes, zur Förderung der Myelinisierung und zur Inhibierung der Demyelinisierung sowie Verfahren zur Inhibierung sensorischer oder motorischer Neuropathie durch intravenöse, intramuskuläre, intradermale, subkutane, intrakranielle, intrazerebrospinale, topische, orale, transdermale, transmucosale oder transnasale Verabreichung einer wirksamen Menge eines aktiven Prosaposin-Fragments bereit. Ein pharmazeutisch verträglicher, gut bekannter Träger kann mit einem aktiven Prosaposin-Fragment verabreicht werden. Derartige Träger schließen z.B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) ein.
Vorzugsweise wird eine wirksame Menge eines aktiven Prosaposin-Fragments direkt in den Blutstrom des Subjekts eingespritzt. Z.B. kann eine intravenöse Einspritzung eines aktiven Prosaposin-Fragments angewendet werden, um das aktive Fragment dem peripheren oder Zentralnervensystem zu verabreichen, wobei ein jodiertes von Prosaposin abgeleitetes 18-mer Tyr-Lys-Glu-Val-Thr-Lys-Leu-Ile-Asp-Asn-Asn-Lys-Thr-Glu-Lys-Glu-Ile-Leu (SEQ ID NO. 20), bestehend aus den Aminosäuren 12 bis 29 des von Prosaposin abgeleiteten 22-mer der SEQ ID NO. 1 mit einem Austausch des Tyrosins durch ein Valin bei Aminosäure 12 (MW = 2000) die Blut-Hirn-Schranke passierte und in das Zentralnervensystem eintrat, wie in Beispiel II beschrieben. Die Aufnahme durch das Gehirn betrug ungefähr 0,03 %, was im mittleren Wertebereich für Peptide dieser ungefähren Größe liegt, die die Blut-Hirn-Schranke passieren (Banks et al., ibid., 1992).
Eine orale Verabreichung kann häufig wünschenswert sein, vorausgesetzt dass das aktive Prosaposin-Fragment so modifiziert ist, dass es gegen einen gastrointestinalen Abbau beständig und einfach absorbierbar ist. Der Austausch z.B. einer oder mehrerer D-Aminosäuren kann einem von Prosaposin abgeleiteten Peptid eine erhöhte Stabilität verleihen, was in der Erfindung nützlich ist.
Eine direkte intrakranielle Injektion oder eine Injektion in die zerebrospinale Flüssigkeit kann auch angewendet werden, um eine wirksame Menge eines aktiven Prosaposin-Fragments in das Zentralnervensystem eines Subjekts einzubringen. Außerdem kann ein aktives Prosaposin-Fragment durch direkte Injektion oder lokale topische Verabreichung oder durch systemische Verabreichung in ein peripheres Nervengewebe eingebracht werden. Verschiedene herkömmliche Arten der Verabreichung werden ebenso erwogen, einschließlich intravenöser, intramuskulärer, intradermaler, subkutaner, intrakranieller, epiduraler, topischer, oraler, transdermaler, transmucosaler und intranasaler Verabreichung.
Ein aktives Prosaposin-Fragment kann auch in einer Abgabeform mit verzögerter Freisetzung verabreicht werden. Die Abgabeform eines aktiven Prosaposin-Fragments mit verzögerter Freisetzung hat den Vorteil der Linderung neuropatischer Schmerzen über einem ausgedehnten Zeitabschnitt ohne die Notwendigkeit von wiederholten Verabreichungen des aktiven Fragments.
Die Abgabeform mit verzögerter Freisetzung kann z.B. mit einem Abgabematerial mit verzögerter Freisetzung, wie einem Wafer, einem Immunobead, einer Mikropumpe oder anderem Material, erreicht werden, das eine kontrollierte, langsame Freisetzung des aktiven Prosaposin-Fragments vorsieht. Solche kontrollierten Abgabematerialien sind weithin bekannt und bei kommerziellen Anbietern erhältlich (Alza Corp., Palo Alto CA; Depotech, La Jolla CA, siehe auch Pardoll, Ann. Rev. Immunol. 13:399-415 (1995)). Außerdem kann ein bioerodierbares oder bioabbaubares Material, wie Polymilchsäure, Polygalactidsäure, regeneriertes Kollagen, multilamellare Liposomen oder andere herkömmliche Depotformulierungen, das mit einem aktiven Prosaposin-Fragment formuliert werden kann, implantiert werden, um das aktive Prosaposin-Fragment langsam freizugeben. Die Verwendung von Infusionspumpen, Matrixeinschlusssystemen und transdermalen Abgabevorrichtungen sind mit der vorliegenden Erfindung ebenso berücksichtigt.
Ein aktives Prosaposin-Fragment kann auch vorteilhaft in Mizellen oder in Liposomen eingeschlossen werden. Die Liposomenverkapselungstechnologie ist gut bekannt. Liposomen können durch die Verwendung von Rezeptoren, Liganden oder Antikörpern, welche zum Binden des entsprechenden Gewebes geeignet sind, auf ein spezifisches Gewebe, wie ein Nervengewebe, aufgebracht werden. Die Zubereitung dieser Formulierungen ist weithin bekannt (siehe z.B., Pardridge, ibid., 1991 und Radin und Metz, Meth. Enz mol. 98:613-618 (1983)).
Eine erfindungsgemäße Peptidzusammensetzung kann in einer Einheitsdosierungsform, wie einer spritzbaren Zusammensetzung oder einer lokalen Zubereitung in einer Dosierungsmenge verpackt und verabreicht werden, die zu einer täglichen Dosierung bzw. Dosis gleichwertig ist, die einem Patienten verabreicht wird, und kann, wenn gewünscht, in einer Abgabeformulierung mit kontrollierter Freisetzung zubereitet werden. Die Einheitsdosierungsform kann, zum Beispiel, eine mit einem Septum abgeschlossenes Ampulle sein, die eine tägliche Dosis der erfindungsgemäßen aktiven Zusammensetzung in PBS oder in lyophilisierter Form enthält. Für die Behandlung von neuralen Krankheiten basieren geeignete tägliche systemische Dosierungen eines erfindungsgemäßen Peptids auf dem Körpergewicht des Wirbeltiers und liegen im Bereich von ungefähr 10 bis ungefähr 100 μg/kg, obgleich Dosierungen von ungefähr 0,1 bis ungefähr 1.000 μg/kg auch beabsichtigt sind. So kann eine systemische Dosierung für einen typischen 70-Kg-Menschen zwischen ungefähr 7 und ungefähr 70.000 μg täglich und vorzugsweise zwischen ungefähr 700 und ungefähr 7.000 μg täglich liegen. Eine tägliche Dosis eines lokal verabreichten Materials wird ungefähr um eine Größenordnung kleiner sein als die systemische Dosierung. Eine orale Verabreichung ist auch beabsichtigt.
Die Erfindung liefert auch ein Verfahren zur Linderung neuropatischer Schmerzen in einem Subjekt, indem eine genetisch modifizierte Zelle in das Subjekt implantiert wird, um ein aktives Prosaposin-Fragment zu exprimieren und zu sekretieren. Eine Transplantation kann eine fortlaufende Quelle eines aktiven Prosaposin-Fragments und so eine unterstützende Linderung neuropatischer Schmerzen bereitstellen. Für ein Subjekt, das unter ausgedehnten oder chronischen neuropatischen Schmerzen leidet, hat ein derartiges Verfahren den Vorteil einer Beseitigung oder Verringerung der Notwendigkeit einer wiederholten Verabreichung eines aktiven Prosaposin-Fragments.
Mit den weithin bekannten Verfahren kann eine Zelle einfach mit einem Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure enthält, die ein aktives Prosaposin-Fragment kodiert, transfiziert werden (Chung, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Boca Raton (1995)). Z.B. exprimiert und sekretiert die transfizierte Zelle nach einer Transplantation in das Gehirn ein aktives Prosaposin-Fragment und lindert so neuropatische Schmerzen. Ein derartiges Verfahren kann nützlich sein, um neuropatische Schmerzen zu lindern, wie dies für die Transplantation von Zellen beschrieben ist, die Substanzen mit schmerzlindernden Eigenschaften sekretieren (siehe z.B. Czech und Sagen, Prop. Neurobiol. 46:507-529 (1995)).
Die Zelle kann jede beliebige Zelle sein, die nach einer Transplantation überleben kann und die modifiziert werden kann, um ein aktives Prosaposin-Fragment zu exprimieren und zu sekretieren. In der Praxis sollte die Zelle mit dem Subjekt immunologisch kompatibel sein. Z.B. ist eine besonders nützliche Zelle eine Zelle, die vom zu behandelnden Subjekt isoliert wurde, da eine derartige Zelle mit dem Subjekt immunologisch kompatibel ist.
Eine Zelle, die von einer anderen Quelle als dem zu behandelnden Subjekt erhalten wird, kann auch verwendbar sein, wenn sie gegen eine immunologische Abstoßung z.B. durch Mikroverkapselung oder Immunsuppression, geschützt wird.
Verwendbare Mikroverkapselungsmembran-Materialien schließen ein: Alginatpoly-L-Lysin, Alginat und Agarose (siehe z.B. Goosen, Fundamentals of Animal Cell Encapsulation and Immobilization, CRC Press, Boca Raton (1993); Tai und Sun, FASEB J. 7:1061 (1993); Liu et al., Hum. Gene Ther. 4:291 (1993); und Taniguchi et al., Transplant. Proc. 24: 2977 (1992)). Zum Beispiel ist eine Schmerzreduktion unter Verwendung von mit Polymer verkapselten Zellen erzielt worden, die in den spinalen subarachnoiden Raum der Ratte transplantiert wurden (Wangs et al., Soc. Neurosci. Abstr.. 17:235 (1991)).
Zur Behandlung eines menschlichen Subjekts kann die Zelle eine Human-Zelle sein, obgleich eine nicht-menschliche Säugetierzelle auch verwendbar sein kann. Insbesondere kann ein menschlicher Fibroblast, eine Muskelzelle, eine Glial-Zelle, eine neuronale Vorläuferzelle oder ein Neuron mit einem Expressionsvektor transfiziert werden, um ein aktives Prosaposin-Fragment, z.B. mit SEQ ID NO. 1, zu exprimieren und zu sekretieren. Ein Primärfibroblast kann z.B. durch eine Hautbiopsie von dem zu behandelnden Subjekt erhalten und unter Standardgewebekulturbedingungen aufrechterhalten werden. Eine Primärmuskelzelle kann für eine Transplantation auch verwendbar sein. Überlegungen für neurale Transplantationen werden z.B. in Chang, ibid., 1995 beschrieben.
Eine Zelle, die vom Zentralnervensystem abgeleitet wird, kann für eine Transplantation in das Zentralnervensystem besonders nützlich sein, da das Überleben einer derartigen Zelle innerhalb seiner natürlichen Umgebung erhöht wird. Eine neuronale Vorläuferzelle ist in dem erfindungsgemäßen Verfahren besonders nützlich, da eine neuronale Vorläuferzelle in einer Kultur gezogen, mit einem Expressionsvektor transfiziert und in ein Individium eingeführt werden kann, wo es integriert wird. Die Isolierung neuronaler Vorläuferzellen, welche fähig sind, zu proliferieren und in Neuronen und Glial-Zellen zu differenzieren, wird in Renfranz et al., Cell 66:713-729 (1991) beschrieben.
Verfahren zum ex vivo-Transfizieren von Zellen sind weithin bekannt (Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H. Freeman & Co., New York (1990)). Für die Transfektion einer Zelle, die sich weiterhin teilt, wie ein Fibroblast, eine Muskelzelle, eine Glial-Zelle oder eine neuronale Vorläuferzelle, wird ein retroviraler Vektor bevorzugt. Für die Transfektion eines Expressionsvektors in eine postmitotische Zelle, wie ein Neuron, ist ein replikationsdefekter Herpes-Simplex-Virus-Typ 1 (HSV-1)-Vektor verwendbar (During et al., Soc. Neurosci. Abstr.. 17:140 (1991); Sable et al., Soc. Neurosci. Abstr.. 17:570 (1991)).
Eine Nukleinsäure, die ein aktives Prosaposin-Fragment kodiert, kann unter der Kontrolle einer Vielzahl von weithin bekannten Promotoren exprimiert werden, einschließlich eines konstitutiven Promotors oder induzierbaren Promotors, siehe z.B. Chang, ibid., 1995. Ein besonders nützlicher konstitutiver Promotor zur Hochlevel-Expression ist der Moloney Murine Leukemia Virus Long-terminal Repeat (MLV-LTR), der Cytomegalovirus Immediate-early (CMV-IE) oder der Simian Virus 40 Early Region (SV40).
Eine Nukleinsäuresequenz, die ein aktives Prosaposin-Fragment kodiert, wird hierin offenbart. Z.B. ist eine Nukleinsäuresequenz die SEQ ID NO. 1 kodiert, 5'-TGTGAATTCCTGGTGAAGGAGGTGACCAAGCTGATTGACAACAACAAGACTG AGAAAGAAATACTC-3' (SEQ ID NO. 21) (Dewji et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8652-8656 (1987)). Für eine direkte Sekretion des Peptids der SEQ ID NO. 1 kann zum Beispiel eine Nukleinsäure, die eine Signalsequenz, wie die Signalsequenz der β-Lactamase, kodiert, funktionstüchtig mit SEQ ID NO. 21 verbunden werden, wie beschrieben in Simon et al., J. Cell Biol. 104:1165 (1987).
Die Erfindung liefert weiter ein Verfahren zur Verhinderung neuropatischer Schmerzen in einem Subjekt, indem eine wirksame Menge eines aktiven Prosaposin-Fragments verabreicht wird. Das Verfahren zur Verhinderung neuropatischer Schmerzen ist anwendbar, wenn es vor einem schmerzhaften Ereignis, z.B. vor einer Chemotherapie oder einer Operation, angewendet wird, die bekannt sind, zu neuropatischen Schmerzen zu führen.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung veranschaulichen, aber nicht beschränken.
Beispiel I
Linderung europatischer Schmerzen bei Chung-Modellratten
In diesem Beispiel sind die Wirkungen einer intrathekalen Bolus-Injektion eines aktiven Prosaposin-Fragments in das Chung-Experimentiermodell für periphere neuropatische Schmerzen beschrieben.
Jedes der drei Peptide wurde in reiner Form durch chemische Synthese erhalten, in sterilem PBS aufgelöst und auf einen neutralen pH gepuffert.
Das chirurgische Verfahren, zuvor beschrieben von Kim und Chung, ibid., 1992, wurde an männlichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 120 bis 150 Gramm durchgeführt, um einen allodynischen Zustand zu induzieren. Kurz zusammengefasst, wurden die Ratten mit Halothan betäubt; anschließend wurden die linken Spinalnerven L-5 und L-6 benachbart zur Wirbelsäule isoliert und mit einer 6,0 Seiden-Naht mit dem Hinterwurzelganglion bzw. Spinalganglion distal verbunden. Nach einer zehn- bis vierzehn-tägigen post-operativen Erholungszeit wurde ein Spinal-Katheter eingeführt. Fünf Tage nach der zweiten Operation wurde ein Arzneimittel mittels einer Zahnrad-getriebenen Mikroinjektionsspritze, die an einen Spinal-Katheter angeschlossen und durch das Foramen-Magnum eingeführt wurde, intrathekal verabreicht. Vor dem Test wurden die Ratten in durchsichtige Plastikdrahtmaschenkäfige gesetzt, um sich einzugewöhnen.
Um den 50%-Mechanik-Schwellenwert für das Zurückziehen der Pfote zu untersuchen, wurde ein von-Frey-Haar am Hinterfuß angebracht, um eine Fußauflage zu vermeiden. Jedes der von-Frey-Haare, die kalibriert wurden, um sich bei zunehmenden Log-Kräften zu biegen, wurde mit genügender Kraft senkrecht zum Fuß gepresst, um ein leichtes Verbiegen während einer Dauer von ungefähr sechs bis acht Sekunden zu verursachen. Eine positive Erwiderung wurde bemerkt, wenn der Fuß deutlich zurückgezogen wurde. Sechs Datenpunkte wurden für jeden Punkt gesammelt, wobei der Maximum- und der Minimumreiz fürjeden Zeitpunkt notiert wurden. Das resultierende Muster der Antworten wurde tabelliert, und der 50%-Ansprechschwellenwert wurde berechnet. Der Graph gibt die Erwide rung zur gezeigten Dosierung des Peptids, angegeben als eine einzelne intrathekale Bolus-Injektion, wieder. Die X-Achse zeigt die Zeit nach der Injektion, an dem die Überempfindlichkeit gegen Druck auf die Fußauflage gemessen wurde.
Alle operativ verletzten Ratten zeigten eine Tast-Allodynie vor einer Injektion mit einem aktiven Prosaposin-Fragment. Wie zum Zeitpunkt Null in 1 gezeigt, war die gemessene Schwelle in Abwesenheit des Peptids geringer als 3,0 bis 4,0 g. Eine intrathekale Injektion von 0,7 oder 0,07 μg des von Prosaposin abgeleiteten 22-mer-Peptids (SEQ ID NO. 1) unterdrückte eine Allodynie in einer von der Dosis abhängigen Weise. Die Verringerung der Allodynie wird durch die Zunahme des Kraftschwellenwertes erkennbar, wenn die Ratten einer zunehmenden Kraft widerstehen, bevor sie den betroffenen Fuß zurückziehen.
Ein erheblicher Effekt wurde 15 Minuten nach der Injektion beobachtet. Der Maximumeffekt wurde 120 Minuten nach der Injektion gesehen. Die mit der höchsten Dosis des von Prosaposin abgeleiteten 22-mer-Peptids (SEQ ID NO. 1) gespritzten Raten zeigten weiterhin eine erheblich verringerte Allodynie zum zuletzt geprüften Zeitpunkt (180 Minuten). Ratten, die mit 0,007 μg des von Prosaposin abgeleiteten 22-mer-Peptids (SEQ ID NO. 1) gespritzt wurden, zeigten keine bedeutende Verringerung der Allodynie. Bei keiner der möglichen Konzentrationen wurden bedeutende Nebenwirkungen, wie Beruhigung, beobachtet.
Die Eignung des von Prosaposin abgeleiteten 14-mer-Peptids (SEQ ID NO. 2; siehe Tab. 1), die Allodynie in Chung-Modellratten zu lindern, wurde auch untersucht. Wie in 2 gezeigt, war das aktive Prosaposin-Fragment (SEQ ID NO. 2) hinsichtlich der Verringerung von Allodynie wirksam. Der Höchsteffekt des von Prosaposin abgeleiteten 14-mer-Peptids (SEQ ID NO. 2) wurde 15 bis 30 Minuten nach der Injektion beobachtet und kehrte nach 60 Minuten auf den Vor-Injektionswert (2) zurück. Bei keiner der getesteten Konzentrationen des von Prosaposin abgeleiteten 14-mer-Peptids (SEQ ID NO. 2) wurden Nebenwirkungen beobachtet.
Ein Mutante eines 22-mer-Peptids (SEQ ID NO. 8), das sich von von Prosaposin abgeleitetem 22-mer-Peptid (SEQ ID NO. 1) dadurch unterscheidet, dass es einen Asparaginsäure-Rest anstelle eines Asparagins enthält (siehe Tab. 4), wurde auch auf Aktivität zur Linderung von Allodynie in Chung-Modellratten getestet. Nach einer Injektion von 17,5 μg der Mutante des 22-mer-Peptids (SEQ ID NO. 8) wurde keine Änderung hinsichtlich der allodynischen Erwiderung bei den Chung-Ratten beobachtet.
Normale Ratten, die keinen Schmerzen als Ergebnis einer chirurgischen Verletzung, eingeführt entsprechend dem Chung-Modell, erfuhren, wurden auch mit einem aktiven Prosaposin-Fragment (SEQ ID NO. 1) gespritzt und auf ihre Erwiderung auf einen Hitzereiz entsprechend dem Verfahren, das von Bennett und Xie, ibid., 1988 entwickelt wurde, untersucht. Kurz zusammengefasst, der Zeitabschnitt, bevor die Ratte den betroffenen Fuß von einer Hitzequelle zurückzieht, wird als Hot-Plate-Latency bzw. Heiße-Platte-Latenzzeit definiert und ist ein Maß für die Schmerztoleranz, die durch einen Hitzereiz verursacht wird.
Ein intrathekaler Katheter wurde in normale männliche Sprague-Dawley-Ratten gesetzt. Fünf Tage nach dieser Operation wurden die Ratten mit einem aktiven Prosaposin-Fragment (SEQ ID NO. 1) intrathekal gespritzt. Die Ratten wurden auf der heißen Plate (52,5 °C) untersucht; die Hot-Plate-Latency wurde vor der Injektion und zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 180 Minuten nach der Injektion gemessen. Es wurde keine signifikante Erhöhung der Hot-Plate-Latency beobachtet. Somit beeinflusst das von Prosaposin abgeleitete Peptid SEQ ID NO. 1 die Wahrnehmung von Schmerzen in normalen Tieren nicht.
Beispiel II
In vivo – Aufnahme von von Prosaposin abgeleiteten Peptiden in das Zentralnervensystem
Die in diesem Beispiel beschriebenen Ergebnisse zeigen, dass von Prosaposin abgeleitete Peptide die Blut-Hirn-Schranke passieren.
Ein 18-mer-Peptid (SEQ ID NO. 20), das aus den Aminosäuren 12-29 des Saposin C mit einem für Valin an Position 12 substituierten Tyrosin bestand, wurde auf einem Applied Biosystems Model 430-Peptidsynthesizer chemisch synthetisiert. Das Peptid wurde dann mit dem Laktoperoxidase-Verfahren radio-jodiert; 20 × 10⁶ cpm radiomarkiertes Peptid wurde in die Ohrläppchen der Ratten gespritzt. Die Tiere wurden nach einer Stunde und 24 Stunden getötet, und die Herzen wurden mit isotonischer Kochsalz-Lösung gespült, um das Blut aus dem Gehirn zu entfernen.
Um den Prozentsatz der Peptidaufnahme festzustellen, wurde das Gehirn dann in einem Gamma-Zähler gemessen. Zusätzlich wurde das Gehirn homogenisiert und nach einer Dextranzentrifugation in eine Kapillar-reiche Fraktion (Pellet) und in eine parenchymale Gehirnfraktion (Überstand) fraktioniert (Triguero et al., J. Neurochem., 54:1882-1888 (1990)). Diese Methode erlaubt die Unterscheidung zwischen einem radiomarkierten Peptid innerhalb der Blutgefässe und dem innerhalb des Gehirns. Nach 24 Stunden wurden 0,017 % des gespritzten Peptids (SEQ ID NO. 20) im gesamten Gehirn detektiert; 75% der Markierung befanden sich in der parenchymalen Fraktion und 25 % in der Kapillar-Fraktion. Nach einer 1 Stunde lagen 0,03 % der gespritzten Dosis im gesamten Gehirn vor.
Das von Prosaposin abgeleitete Peptid SEQ ID NO. 2 wurde auch auf die Eignung, die Blut-Hirn-Schranke zu passieren, getestet. Eine weibliche Sprague-Dawley-Ratte wurde mit Methoxyfluran betäubt, und ungefähr 20 μg Peptid mit SEQ ID NO. 2 (3,2 × 10⁸ cpm) wurden in die Schwanzvene gespritzt. Nach 40 Minuten wurde die Ratte durch eine Etherbetäubung getötet und das Herz mit ungefähr 250 ml PBS gespült. Die Gesamtmenge des Peptids in Gehirn, Leber und Blut wurde als Prozentsatz des gespritzten Materials errechnet, wie in Tab. 6 gezeigt. Um die Lokalisierung im Gehirn zu bestimmen, wurde das Capillary Depletion-Verfahren von Triguero, J. Neurochem. 54:1882 (1990) angewendet, um das Gehirngewebe in eine parenchymale Fraktion und in eine Gehirn-Kapillar-Fraktion zu trennen. Die Ergebnisse aus der Fraktionierung zeigten, dass 87 % des SEQ ID NO. 2-Peptids, das im Gehirn vorhanden war, im Gehirn-Parenchym lokalisiert waren, während 13% in der Gehirn-Kapillar-Fraktion gefunden wurden.
In einem ähnlichen Experiment, in dem Ratten nach drei Stunden Behandlung mit SEQ ID NO. 2 getötet wurden, waren 0,06 % des Peptids im Gehirn nachweisbar, von welchen sich 85% im Parenchym befanden. Diese Ergebnisse zeigen, dass mindestens ein Teil des von Prosaposin abgeleiteten Peptids der SEQ ID NO. 2 die Blut-Hirn-Schranke passierte und eher im Hirn-Parenchym als im Gefäßendothelium (Blutgefäße) konzentriert wurde. Der Prozentsatz des Peptids, der die Blut-Hirn-Schranke passiert, liegt im Mittelbereich der Peptide, welche die Schranke passieren, wie beschrieben in Banks, ibid., 1992.
Um den Prozentsatz des intakten Materials im Gehirn, in der Leber und im Blut zu bestimmen, wurde das vom Gewebe isolierte radiomarkierte Material (SEQ ID NO. 2) durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie analysiert. Um den Abbau während der Verarbeitung der Gewebehomogenate zu normieren, wurde das Peptid SEQ ID NO. 2 zu den Gewebehomogenaten hinzugefügt. Der Umfang des Abbaus, der beim zugefügten Peptidmaterial beobachtet wurde, wurde verwendet, um den Abbau während der Gewebeverarbeitung zu normieren. Nach der Normierung ergaben sich folgende Ergebnisse: SEQ ID NO. 2 war zu ungefähr 60% im Gehirn, zu ungefähr 80% in der Leber und zu ungefähr 40% im Blut intakt. In einem zweiten Experiment war das Peptid der SEQ ID NO. 2 zu ungefähr 68% im Gehirn intakt. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Peptid der SEQ ID NO. 2 die Blut-Hirn-Schranke passiert und im Gehirn überwiegend intakt vorliegt.
Beispiel III
Linderung neuropatischer Schmerzen in diabetischen Ratten
In diesem Beispiel sind die Wirkungen einer intraperitonealen Verabreichung eines Peptids, welches die Sequenz SEQ ID NO. 2 hat, in einem Rattenmodell für diabetische Neuropathie beschrieben.
Die Ratten wurden mit einer einzigen intraperitonealen Injektion von Streptozotocin (50 mg/kg Körpergewicht, frisch gelöst in 0,9 % steriler Kochsalz-Lösung) diabetisch gemacht, um Pankreas-β-Zellen zu ablatieren und um einen Insulin-Mangel zu induzieren, wie in Calcutt et al., Pain 68:293-299 (1996) beschrieben. Zwei Tage später wurde Diabetes in den mit Streptozotocin gespritzten Ratten bestätigt, indem die Blutglukose-Konzentrationen bestimmt wurden. Die mit Streptozotocin gespritzten Tiere mit einer Blutglukose-Konzentration unter 15 mmol/l wurden, entsprechend der allgemein geltenden Definition für nicht-nüchterne Hyperglykämie bei Diabetes-Studien in Ratten, von den nachfolgenden Studien ausgeschlossen.
Sowohl die Diabetiker- als auch die Kontrollratten wurden nach 8 Wochen untersucht, indem die Verhaltenserwiderung auf das schädliche chemische Formalin als Indikator für Allodynie analysiert wurde (Calcutt et al. ibid., 1996). Kurz zusammengefasst, die Ratten erhielten eine subkutane Injektion von frisch zubereitetem Formalin (50 μl einer 0,5 % Lösung in steriler Kochsalz-Lösung) in die rückseitige Oberfläche der rechten Hinterpfote. Diese Konzentration des Formalins induziert sub-maximale Verhaltenserwiderungen bei den Kontrollratten und erlaubt eine Detektion der Hyperalgesie in diabetischen Ratten während der Phasen Q und 2 (Calcutt et al., Eur. J. Pharmacol. 285:189-197 (1995)). Die Tiere wurden in einen Beobachtungsraum gebracht, der so konstruiert war, dass eine ununterbrochene Beobachtung der Pfoten möglich war. Die Anzahl der Ausschläge bzw. Flinches während einer Dauer von einer Minute wurde in 5-Minuten-Abständen während der folgenden 60 Minuten von einem Beobachter gezählt, der von der Behandlungsgruppe jedes der Tiere keine Kenntnis hatte. Phase 1 wurde als die initiale Messungsphase der Ausschläge definiert (1-2 und 5-6 Minuten nach der Injektion), die Q-(bewegungslose)-Phase als die Phase, in der die Messungen nach 10-11, 15-16 und 20-21 Minuten durchgeführt wurden, und Phase 2 als die Phase, in der alle folgenden Messungen nach der Injektion vorgenommen wurden, wie zuvor bei Studien für diabetische Ratten definiert (siehe z.B. Malmberg et al., Neurosci. Lett. 161:45-48 (1993)). Vergleiche der Aktivität während jeder Phase wurden durchgeführt, indem die Ausschläge an den Messpunkten innerhalb der Phase summiert wurden. Die diabetischen Ratten gaben eine anormale Ausschlagserwiderung, wie zuvor berichtet worden ist.
Das Peptid der SEQ ID NO. 2 wurde in reiner Form durch chemische Synthese erhalten, in sterilem PBS aufgelöst und auf einen neutralen pH gepuffert. Die diabetischen Ratten wurden in zwei Gruppen zu jeweils vier Tieren aufgeteilt, welchen Kochsalz-Lösung bzw. Peptid der SEQ ID NO. 2 verabreicht wurde. Zwei Stunden vor der Behandlung mit 0,5 % Formalin wurden die diabetischen Ratten mit Kochsalz-Lösung oder 200 μg/kg Peptid der SEQ ID NO. 2 mittels einer intraperitonealen Verabreichung behandelt. Wie in 3 gezeigt, verhinderte die Verabreichung des SEQ ID NO. 2 die anormale Ausschlagserwiderung in Phase 1 vollständig und verbesserte die Erwiderung in Phase 2 um 70 %. So linderte die parenterale Verabreichung des Peptids der SEQ ID NO. 2 Schmerzen von einer Formalin-Injektion in einem Rattenmodell für schmerzhafte diabetische Neuropathie.
Beispiel IV
Stimulation des in vitro Neurit-Wachstums
In diesem Beispiel ist die Verwendung eines Peptids mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 bei der Stimulation des in vitro Neurit-Wachstums beschrieben.
Neuroblastom-Zellen NS20Y wurden in DMEM gezogen, das 10 % fötales Kälberserum (FCS) enthielt. Die Zellen wurden mit Trypsin entfernt und in 30 mm – Petrischalen auf Deckgläsern ausplattiert. Nach 20 bis 24 Stunden wurde das Medium durch 2 ml DMEM, das 0,5 % fötales Kälberserum mit 0; 0,5; 1; 2; 4 oder 8 ng/ml eines Peptids mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 oder ein durcheinander gemischtes Kontrollpeptid enthielt, ersetzt. Die Zellen wurden während weiterer 24 Stunden kultiviert, mit PBS gewaschen und mit Bouin's Lösung (gesättigte wässri ge Pikrinsäure/Formalin/Essigsäure 15:5:1) während 30 Minuten fixiert. Nachdem das Fixiermittel mit PBS entfernt war, wurde das Neurit-Wachstum unter einem Phasen-Kontrastmikroskop bestimmt. Die Zellen, die ein oder mehrere eindeutig definierte Neuriten, die gleich oder länger als ein Zelldurchmesser waren, wurden als positiv für Neurit-Wachstum gezählt. Mindestens 200 Zellen wurden in doppelter Ausführung an unterschiedlichen Stellen in jeder Schale gezählt, um den Prozentsatz der Neurit enthaltenden Zellen mit jedem Peptid zu bestimmen.
Das in SEQ ID NO. 2 gezeigte Peptid erhöht das Neurit-Wachstum in NS20Y-Zellen erheblich, verglichen mit einem durcheinander gemischten Kontrollpeptid, welches die gleichen Aminosäuren in einer anderen Reihenfolge aufwies. Das erhöhte Neurit-Wachstum war bereits mit der geringen Menge von 0,5 ng/ml Peptid nachweisbar.
Beispiel V
Inhibierung des neuralen Zelltodes in vitro
In diesem Beispiel ist die Verwendung eines Peptids mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 bei der Inhibierung des neuralen Zelltodes in vitro beschrieben.
Die NS20Y-Zellen wurden, wie in Beispiel IV beschrieben, ausplattiert und 2 Tage lang in 0,5 % fötalem Kälberserum auf Deckgläsern in Gegenwart oder Abwesenheit von 8 ng/ml eines Peptids mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 oder einem durcheinander gemischten Kontrollpeptid gezogen. Das Medium wurde entfernt, und 0,2 Trypan-Blau in PBS wurden in jede Vertiefung hinzugefügt. Die toten Zellen wurden durch den Trypan-Blau-Farbstoff blau gefärbt und wurden als Prozentsatz der Gesamtmenge auf einem Inverse-Mikroskop bestimmt, wobei 400 Zellen in vier Bereichen einer jeden Vertiefung gezählt wurden. Der durchschnittliche Fehler in den Doppelzählungen betrug +/– 5 %. Das Peptid, gezeigt als SEQ ID NO. 2, verringerte die Zahl der Trypan-Blau-positiven (toten) Zellen wesentlich. Dies zeigt, dass ein Peptid mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 den programmierten Zelltod inhibieren kann.
Beispiel VI
Ex Vivo Myelinisierungs-Test
In diesem Beispiel ist die Verwendung eines Peptids mit der SEQ ID NO. 2 bei der Stimulation des ex vivo Neurit-Wachstums und bei der Förderung der Myelinisierung beschrieben.
Zerebelläre Entnahmeproben wurden aus neugeborenen Mäusen entsprechend Satomi, Zool.Sci. 9:127-137 (1992) gewonnen. Das Neurit-Wachstum und die Myelinisierung wurden 22 Tage lang in einer Kultur beobachtet, wobei in dieser Zeit die zerebellären Entnahmeproben aus den neugeborenen Mäusen normalerweise einer neuronalen Differenzierung unterliegen und die Myelinisierung beginnt. Am zweiten Tag nach der Herstellung der Entnahmeproben wurde das Peptid, welches die SEQ ID NO. 2 aufwies, zu drei Entnahmeproben mit einer Konzentration von 10 μg/ml hinzugegeben, und ein durcheinander gemischtes Kontrollpeptid wurde zu drei Entnahmeproben mit einer Konzentration von 10 μg/ml hinzugegeben. Das Neurit-Wachstum und die Myelinisierung in den drei Kontrollproben und den drei behandelten Entnahmeproben wurde unter einem Durchsicht-Feldmikroskop mit einer Videokamera untersucht. Am achten Tag waren die Kulturen, welche die Peptide enthielten, dünner und mehr verteilt als die Kontroll-Kulturen. An Tag 15 enthielten die mit dem Peptid der SEQ ID NO. 2 behandelten Kulturen viele Zellen mit langen Projektionen an der Peripherie der Entnahmeproben. Solche Projektionen fehlten oder waren in den Kontroll-Kulturen weniger vorhanden. Die mit dem Peptid der SEQ ID NO. 2 behandelten Kulturen enthielten, verglichen mit dem Kontroll-Entnahmeproben, am 22. Tag deutlich mehr myelinisierte Axone in der subcortikalen weißen Substanz. So induzierte das erfindungsgemäße Peptid eine Myelinisierung bei der zerebellären Differenzierung ex vivo.
Beispiel VII
Inhibierung der Demyelinisierung
Die Reduzierung des Schwann-Zelltodes ist mit der Inhibierung der Demyelinisierung korreliert. Die Schwann-Zellen enthalten eine umfangreiche Myelin-Scheide. Die Zugabe des in SEQ ID NO. 2 gezeigten Peptids zu den Schwann-Zellen verringerte den Schwann-Zelltod in einer von der Dosis abhängigen Weise in der Kultur, die bei den durcheinander gemischten Kontrollpeptiden nicht zu sehen war. So kann ein erfindungsgemäßes Peptid mit der Sequenz SEQ ID NO. 2 die Demyelinisierung inhibieren.
Beispiel VIII
Behandlung traumatischer ischämischer CNS-Verletzungen
Menschen mit traumatischen Verletzungen des Rückenmarks erhalten eine intrazerebrospinale Injektion oder eine direkte Injektion von ungefähr 100 μg/ml des Peptids, gezeigt in SEQ ID NO. 2, in einer sterilen Kochsalz-Lösung oder in einer Depotform zur langsamen kontinuierlichen Abgabe des Peptids am Verletzungsort. Eine Verbesserung wird durch eine Erhöhung der motorischen Nervenfunktion, wie eine verbesserte Gliedbewegung, getestet. Die Behandlungen werden wiederholt, bis keine weitere Verbesserung auftritt.
Beispiel IX
Behandlung von Demyelinisierungsstörungen
Patienten mit einem diagnostizierten frühen MS-Stadium wurde ein Peptid der Sequenz, gezeigt in SEQ ID NO. 2, durch eine direkte intravenöse Injektion in die zerebrospinale Flüssigkeit unter Verwendung desselben Dosisbereiches wie in Beispiel VIII verabreicht. Die Dosierungen wurden täglich oder wöchentlich wieder holt, und eine Verbesserung der Muskelstärke, der Muskelskelett-Koordination und der Myelinisierung (wie mit MRI festgestellt) wurden verfolgt.
Beispiel X
Behandlung von sensorischer Neuropathie
Mäusen wurde Taxol verabreicht, um eine sensorische Neuropathie zu induzieren. Den mit Taxol behandelten Mäusen wurden 100 μg/kg, 200 μg/kg oder 1 mg/kg des von Prosaposin abgeleiteten Peptids der SEQ ID NO. 2 verabreicht. Der Verlust thermischer Empfindlichkeit wurde mit einem Hargreaves Sensorik-Prüfgerät als Anzeiger einer sensorischen Neuropathie gemessen. Jede der drei Dosen des verabreichten Peptids der SEQ ID NO. 2 war hinsichtlich der Inhibierung des Verlustes der thermischen Empfindlichkeit bei mit Taxol behandelten Mäusen wirksam. Das von Prosaposin abgeleitete 22-mer-Peptid der SEQ ID NO. 1 wurde auch ähnlich getestet und hinsichtlich der Inhibierung des Verlustes der thermischen Empfindlichkeit in mit Taxol behandelten Mäusen als wirksam gefunden. Diese Ergebnisse zeigen, dass von Prosaposin abgeleitete Peptide, wie mit SEQ ID NO. 1 und SEQ ID NO. 2, verwendet werden können, um sensorische Neuropathie wirksam zu inhibieren. SEQUENZ AUFLISTUNG

Claims

Von Prosaposin abgeleitetes Peptid mit ungefähr 14 bis ungefähr 50 Aminosäuren und einschließlich mit der in SEQ ID NO. 2 gezeigten Sequenz.
Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid die in SEQ ID NO. 2 gezeigte Sequenz aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend das Peptid nach Anspruch 1 oder 2 und wahlweise einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, welche in einer Formulierung zur kontrollierten Freisetzung, in einer liposomalen oder lyophilisierten Form oder in einer Einheitsdosierform vorliegt.
In vitro – Verfahren zur Stimulation des Neurit-Wachstums, zur Inhibierung des neuralen Zelltodes, zur Förderung der Myelinisierung oder zur Inhibierung der Demyelinisierung oder sensorischen oder motorischen Neuropathie, umfassend den Schritt des In-Kontakt-Bringens neuronaler Zellen mit einer Zusammensetzung, die eine wirksam stimulierende oder inhibierende Menge eines Peptids mit bis zu ungefähr 50 Aminosäuren und einschließend die aktive, in der Sequenz von SEQ ID NO. 2 enthaltene, neurotrope Region enthält.
Verwendung einer wirksamen Menge eines Peptids mit bis zu ungefähr 50 Aminosäuren und einschließend die aktive, in der Sequenz von SEQ ID NO. 2 enthaltene, neurotrope Region für die Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Vermeidung, Linderung und/oder Behandlung neuropathischer Beschwerden, zur Stimulation des Neurit-Wachstums, zur Inhibierung des neuralen Zelltodes, zur Förderung der Myelinisierung oder zur Inhibierung der Demyelinisierung oder sensorischen oder motorischen Neuropathie.
In vitro – Verfahren nach Anspruch 5 oder Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Peptid die Sequenz von SEQ ID NO. 2 aufweist.
Verwendung des Peptids nach Anspruch 1 oder 2 zur Zubereitung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung neuraler Fehlfunktionen oder von Fehlfunktionen der Demyelinisierung von neuralem Gewebe.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei sich die neuropathischen Beschwerden aus einer peripheren Nervenfehlfunktion, einer Fehlfunktion des Hinterwurzelganglions, des Rückenmarks, des Hirnstamms, des Thalamus' oder des Kortex' ergeben.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei die periphere Nervenfehlfunktion aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Neuroma, Nervenkompression, Nervenquetschung, Nervendehnung und unvollständiger Nervendurchtrennung, Mononeurophatie und Polyneurophatie.
Verwendung nach einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung intravenös, intramuskulär, intradermal, subkutan, intrakraniell, intrazerebrospinal, tropisch, oral, transdermal, transmucosal oder transnasal verabreicht wird.