DE69433562T2

DE69433562T2 - Prosaposin und cytokinabhängige peptide als therapeutisch wirksame mittel

Info

Publication number: DE69433562T2
Application number: DE69433562T
Authority: DE
Inventors: John S. O'brien; Yasuo Kishimoto
Original assignee: University of California; Myelos Corp
Current assignee: University of California; Myelos Corp
Priority date: 1993-07-30
Filing date: 1994-07-28
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2014-07-29
Also published as: JP2007314575A; AU7515494A; PT720482E; DE69433562D1; EP0720482A1; DK0720482T3; EP0720482A4; CA2168029C; JPH09503999A; ES2215999T3; CA2168029A1; US5700909A; ATE259828T1; JP4070803B2; WO1995003821A1; EP0720482B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung offenbart Proteine und Peptide mit therapeutischen Eigenschaften. Insbesondere sind diese Moleküle beim Fördern des Wachstums und der Differenzierung von verschiedenen Zellenarten wirksam.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Prosaposin, ein Glycoprotein von 70 Kilodalton, ist die Vorstufe einer Gruppe von vier kleinen wärmestabilen Glycoproteinen, die für die Hydrolyse von Glycosphingolipiden durch lysosomale Hydrolasen erforderlich sind (Kishimoto et al. (1992) J. Lipid Res., 33: 1255–1267). Prosaposin wird in Lysosomen proteolytisch verarbeitet, um Saposine A, B, C und D zu erzeugen, die als vier benachbarte Tandemdomänen in Prosaposin existieren (O'Brien und Kishimoto, (1991) FASEB J., 5: 301–308). Alle vier Saposine sind strukturell einander ähnlich, einschließlich der Anordnung von sechs Cysteinen, einer Glycosylierungsstelle und erhaltenen Prolinresten.
Unverarbeitetes Prosaposin existiert auch als integrales Membranprotein und ausgeschiedenes Protein, das in menschlicher Milch, zerebrospinaler Flüssigkeit und Spermienplasma vorliegt. Die Anwesenheit von hohen Konzentrationen von unverarbeitetem Prosaposin im zentralen Nervensystem weist darauf hin, daß es eine signifikante Rolle zusätzlich zur Aktivierung von lysosomalen Hydrolasen spielen kann.
Prosaposin bindet Membranlipide, die Glycosphingolipide genannt werden, die Sphingolipide sind, die aus einer Kohlenhydratkopfgruppe und zwei Kohlenwasserstoffketten; einer Fettsäure und einem Sphingosinderivat bestehen.
Glycosphingolipide sind wichtige Komponenten der Myelinhülle, eine Struktur, die Nervenfasern schützt und isoliert. Die Demyelinisierung ist ein Defekt, der einer Anzahl von Störungen des zentralen Nervensystems gemeinsam ist, wobei die üblichste Multiple Sklerose (MS) ist. MS, eine chronische Störung, die zu vollkommener Unfähigkeit führen kann, ist durch eine Beschädigung der Myelinhülle gekennzeichnet, wobei die Axone meist intakt bleiben. Es wird derzeit angenommen, daß Autoimmunmechanismen, die vielleicht viral induziert werden, bei der Entwicklung der Krankheit eine Rolle spielen können. Es gibt derzeit keine wirksame Behandlung für MS. Andere Störungen des zentralen Nervensystems, die Demyelinisierung beinhalten, umfassen Enzephalomyelitis disseminata acuta, amyotrophische Lateralsklerose, akute, nekrotisch machende, hämorrhagische Leukodystrophie, progressive multifokale Leukoenzephalitis, metachromatische Leukodystrophie und Nebennieren-Leukodystrophie. Ein Beispiel einer Demyelinisierungskrankheit des peripheren Nervensystems ist das Guillain-Barré-Syndrom (Pathologic Basis of Disease, Robbins, S. L. und Cotran, R. S., Hrsg., W. B. Saunders, Philadelphia, (1979), S. 1578–1582).
Das Postpoliomyelitis-Syndrom ist durch Muskelermüdung und verringerte Ausdauer mit begleitender Muskelschwäche und -atrophie gekennzeichnet. Es wird angenommen, daß die Krankheit teilweise durch dieselbe Art von Schädigung von motorischen Neuronen des Rückenmarks verursacht wird, die bei der amyotrophischen Lateralsklerose auftritt.
Periphere Nervenverletzungen und periphere Neuropathien wie z. B. jene, die sich aus Diabetes oder Chemotherapie ergeben, umfassen die vorherrschendsten Störungen des peripheren Nervensystems (siehe Tabelle 1). Derzeitige Behandlungen für periphere Nervenstörungen behandeln nur die Symptome, nicht die Ursache der Krankheit.
TABELLE 1
Prosaposin bindet Glycosphingolipide wie z. B. Ganglioside, Cerebroside und Sulfatide mit hoher Affinität und erleichtert ihren Transport von Mizellen zu Membranen (Sueda, et al. (1993), J. Biol. Chem. im Druck; Hiraiwa et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 11254–11258). Ganglioside enthaften einen oder mehrere Sialsäurereste und sind in der Plasmamembran von Neuronen am reichlichsten, wo sie ungefähr 6% der gesamten Lipidmasse bilden. Obwohl die Funktion von Gangliosiden weitgehend unbekannt ist, wurden sie bei der Stimulation von neuronaler Differenzierung, Neuritogenese und Nervensystemreparatur impliziert.
Neurotrophine können als jene Proteine definiert werden, die in der Lage sind, das Überleben, die Zielinnervation und/oder die Funktion von Nervenzellenpopulationen zu beeinflussen (Barde, (1989) Neuron, 2: 1525–1534). Die Wirksamkeit von Neurotrophinen sowohl in vitro als auch in vivo wurde gut dokumentiert. Das am besten charakterisierte von solchen Proteinen ist der Nervenwachstumsfaktor (NGF), der durch Zielzellen von sympathischen und Sinnesneuronen synthetisiert wird und als Ernährungsfaktor für cholinergische, periphere und Sinnes-Vorderhirnneuronen wirkt (Hefti et al., (1989) Neurobiol. Aging, 10: 515–533). Experimente in vivo deuten darauf hin, daß NGF natürlich vorkommende sowie physische traumatische Verletzungen an peripheren Nerven umkehren kann. Es wurde beispielsweise gezeigt, daß die lokale Anwendung von NGF die Atrophie von Sinnesganglien, die sich aus einem Querschnitt des Ischiasnervs bei erwachsenen Ratten ergibt, verhindert (Rich et al., (1987) J. Neurocytol., 16: 261–268). Außerdem spielt NGF eine Rolle beim Nervenregenerationsprozeß, da er die Neuritenverlängerung von sich entwickelnden sympathischen und Sinnesneuronen verstärkt (Purves et al., (1988) Nature 336: 123–128). Da NGF die Funktion von cholinergischen Vorderhirnneuronen unterstützt, die bei Alzheimer-Patienten verloren sind, deutet dies überdies darauf hin, daß NGF bei der Behandlung dieser Krankheit klinischen Nutzen haben kann (Hefti et al., (1989) Neurobiol. Aging, 10: 515–533).
Der vom Gehirn abgeleitete neurotrophe Faktor (BDNF) wird im zentralen Nervensystem synthetisiert und ist ein Ernährungsfaktor für periphere Sinnesneuronen, dopaminerge Neuronen der Substantia nigra, von zentralen cholinergischen Neuronen und Netzhautganglien (Henderson et al., (1993) Restor. Neurol. Neurosci. 5: 15–28). Es wurde auch gezeigt, daß BDNF den normalerweise auftretenden Zellentod sowohl in vitro als auch in vivo verhindert (Hofer und Barde, (1988) Nature, 331: 261–262).
Da NGF und BDNF sich große Homologiebereiche teilen (ungefähr 50%), wurden degenerierte Oligonukleotidprimer entsprechend vier von diesen Bereichen in PCR-Reaktionen verwendet, um neue verwandte Sequenzen zu erweitern. Ein verwandter neurotropher Faktor, der Neurotrophin 3 (NT-3) genannt wird, wurde geklont (Maisonpierre et al., (1990) Science, 247: 1446–1451). NT-3 ist sowohl zentral als auch peripher zu finden und ist in der Lage, das Überleben von Sinnes- und sympathischen Neuronen, einschließlich Gewebeentnahmen von dorsalen Rückenmarkswurzelganglien (DRG), zu fördern.
Die drei vorstehend beschriebenen Neurotrophine weisen verschiedene Neuronenspezifitäten auf. Alle drei Neurotrophine induzierten Neuritenauswuchs von DRG-Gewebeentnahmen. NGF induziert Neuritenauswuchs von sympathischen Ganglien (SG), aber nicht von einem Knotenganglion (NG), wohingegen BDNF Neuritenauswuchs von NG, aber nicht SG induziert. NT-3 fördert den Neuritenauswuchs von NG und in einem geringeren Ausmaß von SG, was auf eine breitere Spezifität schließen läßt als entweder NGF oder BDNF (Lindsay et al., (1991) Restor. Neurol. Neurosci., 2: 211–220).
Der neurotrophe Wimpernfaktor (CNTF; Lin et al., (1989) Science, 246: 1023) fördert das Überleben von Hühnerembryo-Wimpernganglien in vitro, und es wurde auch festgestellt, daß er das Überleben von kultivierten sympathischen Sinnes- und motorischen Rückenneuronen unterstützt (lp et al., (1991) J. Physiol., Paris, 85: 123–130). Es wurde gezeigt, daß die lokale Verabreichung dieses Proteins an die Läsionsstelle von neugeborenen Ratten die Degeneration der entsprechenden motorischen Neuronen verhindert. CNTF rettete auch motorischen Neuronen vor einem Entwicklungszelltod (Henderson et al., (1993) Restor. Neurol. Neurosci., 5: 15–28). CNTF enthält ein Strukturelement, das AB-Schleife genannt wird, welches am Rest 43 beginnt, von dem angenommen wird, daß er beim Binden an eine C-endständige Domäne in CNTF wichtig ist, was somit zur funktionalen Aktivierung des Zytokins führt (Bazan, (1991) Neuron, 7: 197–208). CNTF sowie andere neuropoetische Zytokine teilen sich Sequenz/Struktur-Motive mit hämatopoetischen Zytokinen, einschließlich Interleukin-6 und Granulozytenkolonie-Stimulationsfaktor. Von einem hervorstechenden Sequenzmotiv in den C-endständigen Enden dieser Zytokine wird vorhergesagt, daß es eine genaue tertiäre Struktur übernimmt, die mit dem Zytokinrezeptor in Wechselwirkung treten kann (Bazan, ibid.)
Derzeitige Modelle der Zytokin-Rezeptor-Bindung (Sprang und Bazan, (1993) Curr. Opin. Struct. Biol., 3: 816) haben die Entwicklungserhaltung einer spezifischen Packungsgeometrie zwischen den A- und D-Helizes des Zytokinproteinbündelkerns, die einen Hauptteil des Rezeptorkomplexes bilden, hervorgehoben. Diese Struktur ist den meisten Zytokinen gemeinsam. Die AB-Schleife und Helix D, die als zum Binden erforderlich vorgeschlagen werden, sind durch eine große Anreicherung von Aminosäuren in allen Zytokinen (mehr als 50 Aminosäuren) getrennt. Dies impliziert, daß kleine Peptide mit ungefähr 20 Aminosäuren als Rezeptorliganden inaktiv wären und es ihnen mißlingen würde, eine Zellenreaktion hervorzurufen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1a ist ein Kurvenbild, das die Neuritenauswuchsreaktion von NS20Y-Neuroblastomzellen, die mit rekombinantem Prosaposin (Prosap-r), aus Milch isoliertem Prosaposin (Prosap-m), Saposin C, von Saposin C abgeleitetem aktiven 22-Mer-Peptid und mit Jod markiertem 18-Mer, das von Saposin C abgeleitet ist, behandelt wurden, über den Bereich von 0,01–5 μg/ml darstellt. Die Konzentration des Effektorproteins in μg/ml ist auf der x-Achse gezeigt und der Prozentsatz von Zellen mit Neuriten ist auf der y-Achse gezeigt.
1b ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung von 5 μg/ml NGF auf den Neuritenauswuchs in mit Prosaposin und Saposin C behandelten NS20Y-Zellen zeigt. Die y-Achse gibt den Prozentsatz von Zellen mit Neuriten an.
1c ist ein Kurvenbild, das die Wirkung eines 20-Rest-Peptids, das von CNTF abgeleitet ist, das Peptid 9 genannt wird (SEQ ID NR.: 2), auf die Neuritenauswuchsreaktion von NS20Y-Neuroblastomzellen zeigt. Die Konzentration an Peptid ist auf der x-Achse gezeigt und der Prozentsatz von Zellen mit Neuriten ist auf der y-Achse gezeigt.
1d ist ein Balkendiagramm, das die Wirkung von CNTF und Peptid 9 entweder allein oder in Gegenwart des Antikörpers AM64, eines monoklonalen Antikörpers gegen Glycoprotein 130 (gp130), auf den Neuritenauswuchs in NS20Y-Neuroblastomzellen zeigt. CNTF und Peptid 9 wurden zu den Medien mit 100 ng/ml bzw. 20 ng/ml zugegeben. Die Effektoren sind auf der x-Achse gezeigt und der Prozentsatz von Zelten mit Neuritenauswuchs ist auf der y-Achse gezeigt.
2 zeigt ein Balkendiagramm, das die Cholinacetyltransferase-(ChAT) Aktivität angibt, die durch verschiedene Effektoren induziert wird. SKNMC-Neuroblastomzellen wurden in DMEM, enthaltend 0,5% fötales Kalbsserum (FCS), für 48 Stunden in Gegenwart von Effektoren (200 ng/ml) gezüchtet und die ChAT-Aktivität wurde gemessen. Die Effektoren sind auf der x-Achse gezeigt und der Einschluß von Marker (cpm/mg Protein/min) ist auf der y-Achse gezeigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Ein Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Stimulieren von Nervenzellenauswuchs oder erhöhter Myelinisierung durch In-Kontakt-Bringen von Nervenzellen mit einer Zusammensetzung, die Prosaposin, Saposin C oder ein Peptid enthält, das der nachstehend beschriebenen Consensus-Sequenz entspricht, mit der Fähigkeit, erhöhten Nervenauswuchs oder erhöhte Myelinisierungsaktivität zu fördern. Vorzugsweise ist das Prosaposin nativ; am meisten bevorzugt wird das Prosaposin rekombinant erzeugt. Das Peptid kann vorteilhafterweise Saposin C, ein Peptid mit den Aminosäuren 8–29 von Saposin C, oder das aktive neurotrophe Fragment, das sich innerhalb der Aminosäuren 8–29 von Saposin C befindet, sein. Vorzugsweise sind die Nervenzellen Neuroblastomzellen und das Peptid besteht im wesentlichen aus SEQ ID NRN.: 2 oder 7–14. Diese Nervenzellen werden vorzugsweise in vitro in Kontakt gebracht und am meisten bevorzugt in vivo in Kontakt gebracht. In einem weiteren Aspekt dieses bevorzugten Ausführungsbeispiels stammen die Zellen von Gewebeentnahmen vom Kleinhirn der Maus.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung von Demyelinisierungsstörungen in einem Säuger durch Identifizieren eines mit der Störung befallenen Säugers und Verabreichen einer pharmazeutisch wirksamen, die Demyelinisierung inhibierenden Menge an Prosaposin, eines neurotrophen Fragments davon oder eines Consensus-Peptids, das den nachstehend beschriebenen Regeln entspricht, an den Säuger. Vorzugsweise ist dieses Fragment Saposin C und die Demyelinisierungsstörung ist entweder Multiple Sklerose, Leukoenzephalitis disseminata acuta, progressive multifokale Leukoenzephalitis oder Nebennieren-Leukodystrophie. Vorteilhafterweise ist das Verabreichungsverfahren entweder intramuskulär, intradermal, subkutan, intrakranial, intrazerebrospinal oder örtlich in einem biologisch verträglichen Träger. Das Prosaposin oder Fragment davon kann vorteilhafterweise in einer liposomartigen (lamellaren) Struktur eingeschlossen sein.
Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zum Anhalten oder Verlangsamen des Fortschritts von Nerven- oder Myelindegeneration in Nervengewebe durch In-Kontakt-Bringen von Nervengewebe, das für einen solchen Abbau anfällig ist, mit Prosaposin oder einem aktiven, den Abbau inhibierenden Fragment davon. Vorzugsweise ist das Fragment Saposin C und das Gewebe ist in vitro; am meisten bevorzugt ist das Gewebe in vivo.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren für die Behandlung von neuronalen degenerativen Krankheiten des zentralen oder peripheren Nervensystems durch Verabreichen einer Menge eines Prosaposinfragments, das zum Verlangsamen oder Anhalten der Nervendegeneration wirksam ist, an einen Säuger, der unter einer solchen Krankheit leidet. Vorzugsweise umfaßt dieses Fragment die neurotrophe Aktivität des Peptids von SEQ ID NR.: 1 und wird intravenös, intramuskulär, intradermal, subkutan, intrakranial, intrazerebrospinal, örtlich oder oral verabreicht. Vorteilhafterweise ist die Krankheit eine Krankheit des zentralen Nervensystems und das Fragment wird ausgewählt, um die Blut-Hirn-Schranke zu durchqueren. In einem weiteren Aspekt dieses bevorzugten Ausführungsbeispiels ist die Krankheit Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Schlaganfall, Postpoliomyelitis-Syndrom oder amyotrophische Lateralsklerose.
Ferner umfaßt die Erfindung ein Verfahren zum Verlangsamen des Fortschritts von retinaler Neuropathie bei einem Patienten durch Verabreichen einer wirksamen Menge an Prosaposin oder eines neurotrophen Fragments davon an den Patienten. Vorzugsweise ist diese retinale Neuropathie Makuladegeneration, der Patient ist ein Mensch über dem Alter von 65 und die Verabreichung ist entweder örtlich, intravenös, intraokular oder oral.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung mit Prosaposin oder einem neurotrophen Fragment davon in Einnahmeeinheitsform.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung mit Prosaposin oder einem neurotrophen Fragment davon, die mit einem Material für regulierte Freisetzung formuliert wird.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Identifikation von Prosaposin selbst als neurotropher Faktor, der in den Zellenkörpern von großen Populationen von Neuronen, einschließlich oberen und unteren motorischen Neuronen, vorliegt, und seine Fähigkeit, Myelinisierung in Gewebeentnahmen vom Kleinhirn der Maus zu induzieren, stellen signifikante neue Funktionen für dieses Protein dar. Außerdem wurde die Verwendung von Prosaposinpeptiden, um das Zellenwachstum und die Differenzierung zu fördern, nicht beschrieben. Überdies wurde die Fähigkeit von kleinen Peptiden (gemäß der nachstehend beschriebenen Consensus-Sequenz), die von neuropoetischen und hämatopoetischen Zytokinen abgeleitet sind, als Zytokine selbst zu wirken, nicht demonstriert. Somit stellt die vorliegende Erfindung Prosaposin, seine Derivate und Peptide, die von verschiedenen neurotrophen und hämatopoetischen Zytokinen abgeleitet sind, zur Verwendung als therapeutische Mittel bereit.
Die vorliegende Erfindung offenbart eine Consensus-Sequenz eines neurotrophen Peptids, die in einer Anzahl von neurotrophen und hämatopoetischen Zytokinen gefunden wird, die sowohl den Neuritenauswuchs stimulieren als auch die Aktivität des Moleküls, aus dem sie abgeleitet wurde, nachahmen. Diese Consensus-Sequenz ist in Prosaposin, Saposin C, einem Peptid mit den Aminosäuren 8–29 von Saposin C und einem 20-Mer-Peptid mit den Aminosäuren 38–57 von CNTF zu finden, die alle neuritogene Aktivität zeigten. Da das aktive 22-Mer von Saposin C eine Sequenzähnlichkeit zum CNTF-20-Mer sowie zu Peptiden, die von einer Anzahl von hämatopoetischen Zytokinen abgeleitet sind, einschließlich Interleukin (IL)-1, IL-2 und Erythropoetin (EPO), zeigte, sind diese Peptide auch als Zytokinanaloge nützlich. Außerdem können Prosaposin, Saposin C und das Saposin-C-Peptid verwendet werden, um erhöhte Myelinisierung zu fördern.
Prosaposin, seine Derivate, das 20-Mer-CNTF-Peptid und die Consensus-Peptide, die von anderen Neurotrophinen, Zytokinen und Wachstumsfaktoren abgeleitet sind, besitzen signifikante therapeutische Anwendungen beim Fördern der funktionalen Wiederherstellung nach toxischen, traumatischen, ischämischen, degenerativen und vererbten Läsionen am peripheren und zentralen Nervensystem. Kleine Peptide, die von Zytokinen abgeleitet sind, haben auch Nutzen beim Vermitteln ähnlicher Effekte an die Zytokine selbst. Die Verwendung dieser Peptide erleichtert die Behandlung von verschiedenen Störungen, da sie stabiler und leichter zu synthetisieren sind als entweder die nativen oder rekombinanten Zytokine. Außerdem können Prosaposin und seine Derivate verwendet werden, um den Effekten von Demyelinisierungskrankheiten entgegenzuwirken.
Von Prosaposin und seinen Derivaten ist bekannt, daß sie in vielen Arten von Neuronen vorliegen, wasserlöslich sind (im Gegensatz zu Glycosphingolipiden) und weniger immunogen sind als Gangliosidmizellen, da zur Therapie in Menschen die menschliche Sequenz verwendet wird, die keine Immunreaktion hervorruft.
Das aktive 22-Mer-Peptid, das von Saposin C abgeleitet wird, hat die in SEQ ID NR.: 1 (CEFLVKEVTKLIDNNKTEKEIL) dargelegte Aminosäuresequenz. Das 20-Mer-CNTF-Peptid hat die in SEQ ID NR.: 2 (YVKHQGLNKNINLDSVDGVP) dargelegte Aminosäuresequenz. Menschliches Prosaposin hat die in SEQ ID NR.: 3 dargelegte Aminosäuresequenz. Saposin C hat die in SEQ ID NR.: 4 dargelegte Aminosäuresequenz. Die menschliche cDNA-Sequenz für Prosaposin ist in SEQ ID NR.: 5 dargelegt. Ein aktives 18-Mer-Fragment, das vom aktiven 22-Mer-Fragment abgeleitet ist, ist als SEQ ID NR.: 6 (YKEVTKLIDNNKTEKEIL) dargelegt. Wie in den Beispielen in speziellerem Detail erörtert wird, sind Prosaposin, Saposin C, die Aminosäuren von Saposin C, die zumindest die Aminosäuren 8–29 umfassen, und das CNTF-20-Mer-Peptid als neurotrophe Faktoren aktiv. Außerdem ist ein Peptid mit zumindest den Aminosäuren 12–29 (mit einem gegen Valin in der Position 12 ausgetauschten Tyrosin) auch ein aktiver neurotropher Faktor. Es wurde beobachtet, daß die Aminosäurereste 8–29 der Saposin-C-Sequenz eine Sequenzähnlichkeit zu den Resten 44–57 von CNTF aufwiesen.
Eine Sequenzanordnung von CNTF mit zwanzig verschiedenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren enthüllte eine Sequenzähnlichkeit zu menschlichem (h) IL-6, IL-2, IL-3, IL-1 γ-Kette, Erythropoetin (EPO), menschlichem Leukozytenhemmfaktor (LIF), IL-1 β-Kette, Onkostatin-M sowie Saposin C (Tabelle 2).
TABELLE 2
Die in der vorstehenden Tabelle aufgelisteten Peptide können durch herkömmliche automatisierte Peptidsynthese hergestellt und auf neurotrophe Aktivität, wie in Beispiel 1 beschrieben, durch einen gewöhnlichen Fachmann selektiert werden. Ähnliche aktive Peptide, die von Prosaposin oder Saposin C abgeleitet sind, die auch innerhalb des Schutzbereichs dieser Erfindung liegen, können auch ähnlich hergestellt und selektiert werden. Außerdem können von Zytokin abgeleitete Peptide auf die Aktivität ihres entsprechenden Zytokins getestet werden. Dies ist in den Beispielen 11 und 12 für IL-6 bzw. EPO beschrieben. Diese Peptide fördern dieselben Zellenprozesse wie das entsprechende Protein mit voller Länge. Das IL-6-Peptid weist beispielsweise eine entzündungshemmende Aktivität auf, indem es die Tumornekrosefaktor-(TNF) Freisetzung aus aktivierten Makrophagen hemmt, und das EPO-Peptid stimuliert die Differenzierung von Stammzellen (Erythrozytenkolonie bildende Zellen) in rote Blutkörperchen. Jene Peptide, die von Zytokinen mit neurotropher Aktivität abgeleitet sind, stimulieren auch den Auswuchs von Neuriten und können die Myelinisierung fördern und den programmierten Zellentod in Nervengeweben verhindern.
Außerdem scheint es, daß diese Peptide mit etwa 15 bis etwa 50 Aminosäuren dieselben Aktivitätskategorien aufweisen wie die Sequenzen von SEQ ID NRN.: 1 und 2 und im allgemeinen in derselben Weise verwendet werden können und im allgemeinen in denselben Formen wie diese Moleküle bereitgestellt werden können. Somit sollten die Offenbarungen der vorliegenden Erfindung, die mit Prosaposin, Saposin C und neurotrophen Fragmenten davon in Zusammenhang stehen, auf die Peptide von SEQ ID NRN.: 2 und 7–14 erweitert werden. Überdies sind diese Sequenzen in Tabelle 2 als entweder von der AB-Schleife oder Helix C der jeweiligen Zytokine abgeleitet offenbart. Peptide mit etwa 15 bis etwa 50 Aminosäuren, die von jenen Teilen des nativen Moleküls abgeleitet sind, die die Aktivität der beschriebenen Peptide aufrechterhalten, liegen auch innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Die Messung der Aktivität von irgendeinem interessierenden Peptid kann wie in den Beispielen dargelegt oder unter Verwendung eines begründeten Tests auf die Aktivität des Moleküls, von dem das Peptid abgeleitet ist, durchgeführt werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Erleichtern des Auswuchses von Neuriten in differenzierten oder undifferenzierten Nervenzellen. Dieses Verfahren erfordert die Verabreichung einer wirksamen, den Neuritenauswuchs erleichternden Menge von Prosaposin, Saposin C, dessen Fragment mit 18 oder 22 Aminosäuren, des CNTF-20-Mer-Peptids oder von irgendeinem der Peptide entsprechend den vorstehend beschriebenen Regeln an die fraglichen Zellen. Eine typische minimale Menge an Prosaposin für die Aktivität des neurotrophen Faktors im Zellenwachstumsmedium ist gewöhnlich mindestens etwa 1,4 × 10^–11 M oder etwa 10 ng/ml. Diese Menge oder mehr von Saposin C, seinen aktiven Fragmenten mit 18 oder 22 Aminosäuren, des CNTF- 20-Mers oder von irgendeinem der anderen Peptide der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden. Übliche Konzentrationen im Bereich von 0,1 μg/ml bis etwa 10 μg/ml von irgendeinem dieser Materialien werden verwendet. Wirksame Mengen für irgendein spezielles Gewebe können gemäß Beispiel 1 bestimmt werden.
Die Nerven- oder hämatopoetischen Zellen können in vitro oder ex vivo durch direktes Verabreichen der Protein- oder Peptidfaktoren der vorliegenden Erfindung an die Zellen behandelt werden. Dies kann beispielsweise durch Kultivieren der Zellen in einem Wachstumsmedium, das für den speziellen Zelltyp geeignet ist, gefolgt durch Zugabe des Faktors zum Medium durchgeführt werden.
Wenn die zu behandelnden Zellen in vivo sind, typischerweise in einem Wirbeltier, vorzugsweise einem Säuger oder einem Vogel, kann die Zusammensetzung an die zu behandelnden Zellen durch eines von mehreren Verfahren verabreicht werden. Am meisten bevorzugt kann die Zusammensetzung direkt in das Blut in einer ausreichenden Menge injiziert werden, um die gewünschte Konzentration an neurotrophem oder hämatopoetischem, von Zytokin abgeleitetem Peptid zu geben, da ein jodiertes 18-Mer-Peptid, das aus den Aminosäuren 12–29 des 22-Mers mit einem Austausch von Tyrosin gegen Valin an der Aminosäure 12 besteht (MW = 2000), die Blut-Hirn-Schranke durchquert und in das zentrale Nervensystem eintritt, wie in Beispiel 7 beschrieben (siehe Banks et al., (1992) Peptides, 13: 1289–1294). Die Aufnahme durch das Gehirn war ungefähr 0,03%, welches im Mittelbereich von Werten für Peptide dieser ungefähren Größe liegt, die die Blut-Hirn-Schranke durchqueren. Obwohl dies der einzige bisher beschriebene neurotrophe Faktor ist, der die Blut-Hirn-Schranke durchquert, wenn er intravenös verabreicht wird, wird die intravenöse Verabreichung von irgendeinem der Peptide der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Die direkte intrakraniale Injektion oder Injektion in die zerebrospinale Flüssigkeit kann auch in ausreichenden Mengen verwendet werden, um die gewünschte lokale Konzentration von Protein oder Peptid zu geben. In beiden Fällen kann ein pharmazeutisch verträglicher injizierbarer Träger von gut bekannter Art verwendet werden. Solche Träger umfassen beispielsweise phosphatgepufferte Salzlösung (PBS). Alternativ kann die Zusammensetzung an peripheres Nervengewebe durch direkte lokale Injektion oder durch systemische Verabreichung verabreicht werden. Verschiedene herkömmliche Verabreichungsarten werden in Erwägung gezogen, einschließlich intravenöser, intramuskulärer, intradermaler, subkutaner, intrakranialer, epiduraler, örtlicher und oraler Verabreichung.
Die Zusammensetzung kann in Einnahmeeinheitsform verpackt und verabreicht werden, wie z. B. als injizierbare Zusammensetzung oder lokale Zubereitung in einer Dosierungsmenge äquivalent zur täglichen Dosierung, die an einen Patienten verabreicht wird, oder als Zusammensetzung mit regulierter Freisetzung. Ein mit Scheidewand versiegeltes Fläschchen, das eine tägliche Dosis des Wirkstoffs entweder in PBS oder in lyophilisierter Form enthält, ist ein Beispiel für eine Einheitsdosierung.
Da das Molekulargewicht des aktiven 22-Mers ungefähr 2600 ist und ein jodiertes 18-Mer, das innerhalb dieser Sequenz enthalten ist, die Blut-Hirn-Schranke durchquert, dann durchquert auch das 22-Mer sehr wahrscheinlich das zentrale Nervensystem und tritt in dieses ein (Banks et al., (1992) Peptides, 13: 1289–1294). Es wird auch in Erwägung gezogen, daß das CNTF-20-Mer sowie Peptide, die von anderen Zytokinen abgeleitet sind, diese Schranke auch durchqueren. Geeignete tägliche systemische Dosierungen auf der Basis des Körpergewichts des Wirbeltiers liegen im Bereich von etwa 10 bis etwa 100 μg/kg, obwohl Dosierungen von etwa 0,1 bis etwa 1000 μg/kg auch in Erwägung gezogen werden. Tägliche Dosierungen von lokal verabreichtem Material liegen etwa in einer Größenordnung niedriger. Die orale Verabreichung kann möglich sein, wenn das Peptid für den gastrointestinalen Abbau stabil ist und leicht aufgenommen wird.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird der Protein- oder Peptidfaktor lokal an die Nervenzellen in vivo durch Implantation des Materials verabreicht. Polymilchsäure, Polygalactinsäure, regeneriertes Kollagen, multilamellaré Liposome und viele andere herkömmlichen Depotformulierungen umfassen beispielsweise bioerodierbare oder bioabbaubare Materialien, die mit biologisch aktiven Zusammensetzungen formuliert werden können. Wenn diese Materialien implantiert werden, zerfallen sie allmählich und setzen das aktive Material an das Umgebungsgewebe frei. Die Verwendung von bioerodierbaren, bioabbaubaren und anderen Depotformulierungen wird ausdrücklich in der vorliegenden Erfindung in Erwägung gezogen. Infusionspumpen, Matrixeinfangsysteme und die Kombination mit Vorrichtungen zur transdermalen Abgabe werden auch in Erwägung gezogen.
Die Protein- und Peptidfaktoren der vorliegenden Erfindung können auch vorteilhafterweise in Mizellen oder Liposomen eingeschlossen sein. Die Liposomeinkapselungstechnologie ist gut bekannt. Liposome können auf spezielles Gewebe wie z. B. Nervengewebe durch die Verwendung von Rezeptoren, Liganden oder Antikörpern, die in der Lage sind, das Zielgewebe zu binden, abgezielt werden. Die Herstellung dieser Formulierungen ist auf dem Fachgebiet gut bekannt (d. h. Radin und Metz, (1983) Methods Enzymol., 98: 613–618).
Derzeit stehen keine Arzneistoffe zur Verfügung, die die volle funktionale Regenerierung und Wiederherstellung der strukturellen Integrität von Nervensystemen fördern können. Dies gilt besonders für das zentrale Nervensystem. Die Regenerierung von peripheren Nerven durch die Verwendung von neurotrophen Faktoren ist ein unmittelbarer demonstrierbares Ziel. Eine solche Behandlung liegt innerhalb des Schutzbereichs dieser Erfindung. Überdies können neurotrophe Faktoren bei der Behandlung von neurodegenerativen Krankheiten, die mit der Degeneration von Nervenpopulationen oder spezifischen Bereichen des Gehirns verbunden sind, therapeutisch nützlich sein. Die Hauptursache für Parkinson-Krankheit ist die Degeneration von dopaminergen Neuronen der Substantia nigra. Da Antikörper gegen Prosaposin die dopaminergen Neuronen der Substantia nigra in menschlichen Gehirnabschnitten immunohistochemisch anfärben, können Prosaposin und seine aktiven Fragmente bei der Behandlung der Parkinson-Krankheit therapeutisch nützlich sein. Da gezeigt wurde, daß die lokale Verabreichung von CNTF an die Läsionsstelle von neugeborenen Ratten die Degeneration der entsprechenden motorischen Neuronen verhindert und CNTF auch motorische Neuronen vor einem Entwicklungszellentod retten kann, kann die Verwendung des CNTF-Peptids oder von irgendeinem der Peptide der vorliegenden Erfindung auch therapeutische Anwendungen in neurodegenerativen Krankheiten haben.
Es wurde lang angenommen, daß, um neuronale Populationen im Gehirn zu erreichen, neurotrophe Faktoren intrazerebral verabreicht werden müßten, da diese Proteine die Blut-Hirn-Schranke nicht durchqueren. Das aktive jodierte 18-Mer durchquert und das aktive 22-Mer durchquert äußerst wahrscheinlich jedoch diese Schranke, wie vorher erwähnt, und würde folglich intravenös verabreicht werden. Andere neuronale Populationen, wie z. B. motorische Neuronen, würden auch durch intravenöse Injektion behandelt werden, obwohl eine direkte Injektion in die zerebrospinale Flüssigkeit auch als alternativer Weg in Erwägung gezogen wird.
Zellen können in der vorstehend beschriebenen Weise sowohl in vitro, ex vivo als auch in vivo behandelt werden, um die Myelinbildung zu erleichtern oder um die Demyelinisierung zu verhindern. Es gibt verschiedene Krankheiten, die zur Demyelinisierung von Nervenfasern führen, einschließlich Multipler Sklerose, Leukoenzephalitis disseminata acuta, progressiver multifokaler Leukoenzephalitis, metachromatischer Leukodystrophie und Nebennieren-Leukodystrophie. Diese Krankheiten können durch Verabreichung der neurotrophen Faktoren der vorliegenden Erfindung an die Zellen, die mit der Krankheit befallen sind, behandelt werden und der Forschritt der Demyelinisierung kann verlangsamt oder angehalten werden. Obwohl nur Prosaposin und seine Derivate im Myelinisierungstest (Beispiel 2) getestet wurden, wird in Erwägung gezogen, daß das 20-Mer-CNTF-Peptid die erhöhte Myelinisierung auch fördern würde.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in vitro als Forschungswerkzeuge zum Untersuchen der Wirkungen von Zytokinen, neurotrophen Faktoren und die Myelinisierung erleichternden Materialien verwendet werden. Praktischer haben sie jedoch eine unmittelbare Verwendung als Laborreagenzien und Komponenten von Zellenwachstumsmedien, um das Wachstum von Zellen in vitro besser zu ermöglichen.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Prosaposin kann aus verschiedenen Quellen erhalten werden und kann beispielsweise ein natürlich vorkommendes Protein, das aus menschlicher Milch oder Samenplasma isoliert wird, oder rekombinantes menschliches Prosaposin sein, das aus verbrauchten Medien von Zellen von Spodoptera frugiperda (Sf9) gereinigt wird, die mit einem Baculovirus-Expressionsvektor infiziert sind, der cDNA mit voller Länge für menschliches Prosaposin enthält, wie beschrieben (Dewji et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8652–8656). O'Brien et al., (1988) Science, 241: 1098–1101); Hiraiwa et al., (1993) Arch. Biochem. Biophys. 304: 110–116). Saposin C wird in reiner Form von Milzen von Patienten mit Gaucher-Krankheit, einer lysosomalen Speicherstörung, isoliert (Morimoto et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3493–3497). Saposin C (80 Aminosäuren) kann auch chemisch synthetisiert und rückgefaltet werden (Weiler et al., (1993) J. Mol. Neurosci., 4: 161–172).
Die Sequenzen innerhalb Saposin C entsprechenden Peptide und die anderen vorstehend beschriebenen Peptide können unter Verwendung eines automatisierten Festphasenprotokolls an einem Applied Biosystems Modell 430 Peptidsynthesizer synthetisiert werden. Nach der Synthese werden die Peptide an einer Sephadex G-75 Säule vor der Verwendung entsalzt.
Beispiel 1
Wirkung von Prosaposin, Saposinen, CNTF und NGF auf NS20Y Neuritenauswuchs und Cholinacetyltransferase-Aktivität
NS20Y-Neuroblastomzellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle-Medium (DMDM), enthaltend 10% fötales Kalbsserum (FCS) und 1 mM Natriumpyruvat, gezüchtet. Die Zellen wurden mit Trypsin entfernt und in 30 mm Petrischalen auf Deckgläsern ausgestrichen. Nach 20–24 Stunden wurde das Medium gegen DMEM, enthaltend 0,5% fötales Kalbsserum plus Effektorproteine, ausgetauscht.
Die Zellen wurden für weitere 24 Stunden kultiviert, mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und mit Bouin's Lösung (gesättigte wässerige Pikrinsäure/Formalin/Essigsäure 15 : 5 : 1) für 30 Minuten fixiert. Das Fixierungsmittel wurde mit PBS entfernt und der Neuritenauswuchs wurde unter einem Phasenkontrastmikroskop bewertet. Zellen, die ein oder mehr deutlich definierte Neuriten gleich oder länger als ein Zellendurchmesser aufwiesen, wurden als positiv bewertet. Mindestens 200 Zellen wurden in verschiedenen Teilen von jeder Schale bewertet, um den Prozentsatz von Neuriten tragenden Zellen festzustellen, und die Tests wurden doppelt durchgeführt.
Eine Dosis-Reaktions-Kurve (1a) demonstrierte, daß Prosaposin den reversiblen Neuritenauswuchs in NS20Y-Neuroblastomzellen förderte. Die niedrigste Konzentration für die Aktivität war 1,4 × 10^–11 M (10 ng/ml), was im effektiven Konzentrationsbereich anderer Neurotrophine liegt. Wenn Prosaposin entfernt wurde, war der Rückzug des Neuritenauswuchses bei 36 Stunden vollständig, was demonstriert, daß seine kontinuierliche Anwesenheit erforderlich ist, um den Neuritenauswuchs beizubehalten. Außerdem war Saposin C das einzige Fragment von Prosaposin, von dem festgestellt wurde, daß es neurotogene Aktivität besitzt, wie das 22-Mer und jodierte 18-Mer-Peptide, die von der Saposin-C-Sequenz abgeleitet sind.
Da der Nervenwachstumsfaktor (NGF) auf eine Vielzahl von Zellenarten wirkt, wollten wir feststellen, ob er am durch Prosaposin vermittelten Auswuchs in Neuroblastomzellen beteiligt ist. NGF hatte allein keine Wirkung auf den Neuritenauswuchs in SN20Y-Zellen und steigerte die Prosaposinreaktion nicht. (1b). Wenn 5'-Methyladenosin (MeSAdo), das NGF-induzierte Neuritogenese in PC12M-Pheochromozytom-Zellen spezifisch inhibiert, zugegeben wurde, inhibierte MeSAdo den durch Prosaposin induzierten NS20Y-Neuritenauswuchs nicht. Außerdem mißlang es Prosaposin, den Neuritenauswuchs von auf NGF reagierenden PC12M-Zellen bei hohen Konzentrationen (2 mg/ml) zu stimulieren. Da NS20Y-Zellen nicht auf NGF reagieren, deutet dies darauf hin, daß die NGF-Reaktion und die Prosaposinreaktion unterschiedlich sind.
Das von CNTF abgeleitete 20-Mer-Peptid (SEQ ID NR.: 2), Peptid 9, stimulierte auch den Neuritenauswuchs in NS20Y-Neuroblastomzellen (1c). Das Peptid 9 stimulierte tatsächlich den Neuritenauswuchs bei Konzentrationen, die etwa 10-mal höher sind als CNTF auf einer molaren Basis.
Die Stimulation des Neuritenauswuchses durch das Peptid 9 und CNTF wurde durch einen monoklonalen Antikörper AM64 gegen ein Zellenoberflächenglycoprotein, gp 130, vollständig blockiert (1d). Dieses Protein ist eine β-Rezeptorkomponente des CNTF-Rezeptorkomplexes und ist für die durch CNTF induzierte Signaltransduktion erforderlich.
Die Fähigkeit von Prosaposin, seinen Derivaten, CNTF und des CNTF-20-Mers, Cholinacetyltransferase (ChAT) zu stimulieren, wurde dann bestimmt. ChAT ist ein Enzym, das die Synthese des Neurotransmitters Acetylcholin katalysiert und erhöhte Anteile des Enzyms deuten auf erhöhte Anteile von neuronaler Differenzierung hin.
SKNMC-Neuroblastomzellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD; ATCC HTB 10) wurden 48 Stunden in Gegenwart von 200 ng/ml von entweder Saposin C, dem Saposin-C-22-Mer, Prosaposin, CNTF, dem CNTF-Peptid, Peptid 9 oder Saposin A kultiviert. Die ChAT-Aktivität wurde dann durch die Überführung von [¹⁴C]-Acetylgruppen von Acetyl-CoA in Cholin gemessen (Fonnun, (1975), J. Neurochem., 24: 407–409). Die Ergebnisse deuteten darauf hin, daß alle Peptide mit der Ausnahme von Saposin A die ChAT-Aktivität stimulierten.
Ein Satz von synthetischen Peptiden von verschiedenen Bereichen von Saposin C wurde verwendet, um die aktive Sequenz weiter zu definieren. Ein Aminoendständiges Peptid (1–40) war aktiv und ein Carboxy-endständiges Peptid (41–82) war inaktiv. Das Testen von vier weiteren Peptiden (Tabelle 3) engte die aktive Sequenz auf einen Bereich zwischen den Resten 8–29, dem hydrophilsten Bereich in der Saposin-C-Domäne, weiter ein (3a), der auch die einzige Glycosylierungsstelle (Asn 22) enthält. Höhere Konzentrationen des aktiven 22- Mers (Reste(8–29) waren für die Aktivität erforderlich, aber das Ausmaß des Neuritenauswuchses war größer als mit Prosaposin oder Saposin C (1a). Die Sequenz zwischen den Resten 18 und 29 wird stark erhalten (3b). Interessanterweise ist menschliches Saposin A zu Saposin C in diesem Bereich abgesehen von den ersten vier Resten fast identisch, was darauf hindeutet, daß die aktive Sequenz die Anwesenheit von Leucin 18 und Asparaginen an den Resten 21 und 22 oder beiden erfordert.
TABELLE 3
Um zu testen, ob Ganglioside an der Reaktion beteiligt waren, wurde ein Prosaposin-Gangliosid-GM1-Komplex (4 : 1) durch ein auf dem Fachgebiet gut bekanntes Verfahren erzeugt. Wenn er im Neuritenauswuchstest getestet wurde, hatte der Komplex eine vernachlässigbare Aktivität. Dasselbe Ergebnis wurde mit einem Gangliosid-GM3-Saposin-C-Komplex erhalten. Dies deutet darauf hin, daß die neurotogene Wirkung nicht das Ergebnis des Gangliosidtransports war, sondern statt dessen am Prosaposin bzw. Saposin C lag.
Um festzustellen, ob Prosaposin oder seine Fragmente eine Wirkung auf den Neuritenauswuchs in nicht-transformierten Zellen hätte, wurden Gewebeentnahmen vom Kleinhirn von neugeborenen Mäusen wie im folgenden Beispiel beschrieben verwendet:
Beispiel 2
Wirkung von Prosaposin und seinen aktiven Fragmenten auf den Neuritenauswuchs in Gewebeentnahmen vom Kleinhirn der Maus
Gewebeentnahmen vom Kleinhirn von neugeborenen Mäusen wurden gemäß Satomi (Zool. Sci. 9: 127–137 (1992)) vorbereitet. Der Neuritenauswuchs und die Myelinisierung wurden über 22 Tage in der Kultur während des Zeitraums, in dem das Kleinhirn von neugeborenen Mäusen normalerweise eine neuronale Differenzierung erlebt und die Myelinisierung beginnt, beobachtet. Prosaposin (5 μg/ml) und Saposine A, B und C (10 μg/ml) wurden am zweiten Tag nach der Vorbereitung der Gewebeentnahmen zugegeben (drei Kontroll- und drei behandelte Gewebeentnahmen) und der Auswuchs von Neuriten und die Myelinisierung wurden unter einem Hellfeld-Mikroskop mit einer Videokamera bewertet. Am achten Tag wurden Kulturen, die Prosaposin und Saposin C enthielten, dünner und ausgebreiteter als die Kontrollkulturen. Am Tag 15 enthielten die mit Prosaposin und Saposin C behandelten Kulturen viele Zellen mit langen Vorsprüngen am Umfang der Gewebeentnahme, die in den Kontrollen oder jenen, die mit Saposinen A oder B behandelt wurden, weniger hervorstechend waren. Mit Saposin C behandelte Kulturen enthielten zweimal so viele myelinisierte Axone in der subkortikalen weißen Hirnsubstanz bei 22 Tagen wie die Kontrollen oder jene, die mit Saposinen A oder B behandelt wurden. Sowohl die Anzahl der visuell per optischem Feld beobachteten myelinisierten Fasern als auch die Aktivität des Myelinmarkerenzyms CNP waren zweimal der Kontrollwert. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß der neurotrophe Effekt von Prosaposin und Saposin C auch im differenzierenden Kleinhirn ex vivo auftritt. Diese Ergebnisse demonstrieren ferner die Fähigkeit von Prosaposin und Saposin C, erhöhte Myelinisierung im differenzierenden Kleinhirn ex vivo zu indizieren. Es wird auch in Erwägung gezogen, daß irgendeine Peptidsequenz, die den vorstehend beschriebenen Regeln entspricht, beim Fördern von erhöhter Myelinisierung in vivo nützlich ist.
Da Prosaposin an der Plasmamembran aktiv zu sein scheint, sollte es in den Plasmamembranen von reagierenden Zellen vorhanden sein, wie im folgenden Beispiel gezeigt:
Beispiel 3
Western-Blots von Prosaposin und Saposin C von NS20Y-Zellen
NS20Y-Zellen wurden zum Zusammenfluß in Kolben von 75 cm in Gegenwart von Wachstumsmedium gezüchtet. Die Zellen wurden durch Abkratzen geerntet und Oberflächenmembranen wurden durch das Zinkionenverfahren von Warren und Glick (1969) unter Verwendung von diskontinuierlichen Gradienten von 50, 48, 45, 43, 40 und 35% Saccharose isoliert; die Oberflächenmembranen lokalisieren in der 40 und 43% Saccharose-Fraktion. Diese Fraktionen sowie die Unterstand- und Überstandfraktionen, die diese begrenzen, wurden an 10% SDS-Polyacrylamidgelen zusammen mit den ganzen Zellenextrakten Elektrophorese unterzogen, auf Nitrozellulosefilter überführt und mit einem monoklonalen Antikörper für Saposin C durch auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren sondiert.
Die Untersuchung von Western-Blots deckte auf, daß Prosaposin, das als 68 kDa Band an SDS-Polyacrylamidgelen wanderte, an Oberflächenmembranfraktionen von sowohl NS20Y- als auch Neuro-2A-Zellen lokalisiert wurde. Reifes Saposin C und Saposinderivate mit mittlerem Molekulargewicht waren geringere Komponenten der Membranfraktionen, waren jedoch in dem ganzen Zellenextrakt reichlich vorhanden. Dies demonstriert, daß sich Prosaposin in der Plasmamembran von reagierenden Zellen befindet.
Um Prosaposin histochemisch zu lokalisieren, wurden Neuroblastom-Zellinien mit einem für Prosaposin spezifischen Antikörper (JP-1) immungefärbt, wie im folgenden Beispiel dargestellt:
Beispiel 4
Immunohistochemische Lokalisierung von Prosaposin
Zellen wurden auf Deckgläsern gezüchtet, dreimal mit PBS gewaschen und mit Bouin's Lösung für eine Stunde bei Raumtemperatur fixiert. Bouin's Lösung wurde dann mit 5 Waschungen von PBS ausgespült und die Gläser wurden in 30% Ziegenserum, 0,5% Tween 20 in PBS inkubiert, um die nicht-spezifische Bindung zu blockieren, und wurden nach Spülen in einer 1 : 100-Verdünnung von IgG-gereinigtem Kaninchen-JP-1 bei 4°C über Nacht inkubiert. Nach Spülen mit 0,1 Triton-X-100 enthaltendem PBS wurden die Zubereitungen entweder mit Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-IgG (Bio-Rad, 1 : 2000) oder FITC-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-IgG (Cappel, 1 : 2000) inkubiert. Nach Spülen wurde die Peroxidase-Immunfärbung unter Verwendung der Imidazol-Diaminobenzidin-H₂O₂-Reaktion nachgewiesen. Die Fluoreszenzimmunfärbung wurde unter einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung von Nofade als Löschwaschmittel nachgewiesen. Vorimmunes Kaninchen-IgG (1 : 100) wurde als Kontrolle für die nicht-spezifische Bindung verwendet. Die Immunfärbung von ausgedehnten Neuriten, Plasmamembranen und Wachstumskegeln wurde beobachtet.
Eine ähnliche Methodologie wurde verwendet, um menschliche Gehirnabschnitte nach dem Tod immunzufärben, um reaktive Zellenarten zu erfassen. In der vorderen Rinde wurde eine intensive Färbung der Perikarya von großen und mittelgroßen Neuronen vom Golgi-Typ 1 beobachtet. Die Oberfläche der neuronalen Perikarya und das proximate Segment von Axonen im Hügelbereich wurden auch stark gefärbt ebenso wie einige ausgedehnten Axonen. Im Kleinhirn wurde eine starke Färbung von Purkinje- und sternförmigen Zellen sowie großen Neuronen in den Kleinhirnkernen (gezähnte, Emboliform- und Globosekerne) beobachtet. Granuläre Kleinhirnzellen wurden mäßig gefärbt. Im Mittelhirn wurde eine mäßige Färbung in dopaminergen Neuronen der Substantia nigra beobachtet. Große Neuronen im Nucleus ruber, Neuronen im augenbewegenden Kern, im mandelförmigen Kern und in ependymalen Zellen, die die seitliche Gehirnkammer auskleiden, wurden auch mäßig gefärbt. Im Hippocampus wurden pyramidenförmige Zellen und Granulumzellen der gezähnten Gehirnwindung stark gefärbt. Im Rückenmark wurden motorische Alphaneuronen stark gefärbt. Dieser Überblick deutete darauf hin, daß Prosaposin in Populationen von großen Neuronen, einschließlich oberen und unteren motorischen Neuronen, lokalisiert wurde.
Da alle bisher identifizierten Neurotrophine ihre Wirkungen durch Binden an einen Zellenoberflächenrezeptor und Einleiten einer Kinasekaskade ausüben, wurden Phosphorylierungstests in NS20Y-Zellen, die mit Prosaposin oder seinen Fragmenten behandelt wurden, wie im folgenden Beispiel beschrieben durchgeführt:
Beispiel 5
Einschluß von 32P in NS20Y-Proteine nach Behandlung mit Prosaposin oder seinen aktiven Fragmenten
NS20Y-Zellen wurden in phosphatfreier ausgeglichener Hank's Salzlösung, die 2,5 μg/ml Actinomycin D und 80–100 μCi/ml trägerfreies [³²P]-Orthophosphat (New England Nuclear) enthielt, und Effektorproteinen (0,5–1,0 μg/ml) inkubiert und 10–15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen wurden in SDS-PAGE-Probenpuffer solubilisiert, durch SDS-PAGE analysiert und autoradiographiert.
Von Prosaposin, Saposin C und SEQ ID NR.: 1 wurde festgestellt, daß sie die Phosphorylierung von Proteinen von 148, 100, 80, 68, 50, 38 und 34 kDa in einem größeren Ausmaß stimulieren als die Kontrollen oder Zellen, die mit ähnlichen Konzentrationen von Saposinen A, B oder D behandelt wurden. Dieses Protein von 148 kDa kann Phospholipase C-γ, ein Protein, von dem bekannt ist, daß es am Phospholipidmetabolismus beteiligt ist, und das an Tyrosinresten als Reaktion auf eine Anzahl von Wachstumsfaktoren phosphoryliert wird, sein. Eine Densitometeranalyse deutete auf eine 3-5-fache Stimulierung der Phosphorylierung nach 10 Minuten hin. Die Behandlung von Gelen mit Alkali deckte auf, daß die hervorstechenden phosphorylierten Proteine alkalibeständig waren, was darauf hinweist, daß sie Phosphotyrosin- und/oder Phosphothreonin-(neben Prolin befindlich) Reste enthalten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß Prosaposin und seine aktiven Fragmente an einen Zellenoberflächenrezeptor binden und eine Kinasekaskade aktivieren, ähnlich anderen Neurotrophinen und Wachstumsfaktoren.
Da Prosaposin-Gangliosid-GM1- oder Saposin-C-Gangliosid-GM3-Komplexe die Neuritogenese inhibieren, während Prosaposin oder Saposin C allein diesen Prozeß fördert, deutet dies darauf hin, daß Ganglioside die neurotogene Aktivität durch Maskieren einer Rezeptorbindungsstelle am Neurotrophin außer Kraft setzen können. Da Prosaposin und seine aktiven Fragmente außerdem die Tyrosinphosphorylierung von zytoplasmatischen Proteinen in reagierenden Zellen induzieren, am wahrscheinlichsten durch Aktivierung von (einer) Tyrosinkinase(n) ähnlich Zytokinen und Wachstumsfaktoren, stellt dies einen weiteren Beweis bereit, daß ein Zellenoberflächenrezeptor beteiligt ist.
Ein Protein von 60 kDa wurde als mutmaßlicher Rezeptor für Prosaposin identifiziert, wie im folgenden Beispiel beschrieben:
Beispiel 6 (nur zur technischen Information)
Isolation des Prosaposinrezeptors
Das mutmaßliche Prosaposinrezeptorprotein wurde aus ganzem Rattenhirn, Rattenkleinhirn und Maus-Neuroblastomzellen unter Verwendung der Plasmamembran-P-100-Fraktion isoliert. Kurz gesagt, Zellen oder Gewebe wurden solubilisiert und bei 14000 U/min zentrifugiert, um den Abfall zu entfernen. Der Überstand wurde bei 40000 U/min für 1 Stunde bei 4°C zentrifugiert. Das Pellet, das mit Plasmamembran angereichert war, wurde in RIPA-Puffer (10 mM MOPS, pH 7,5, 0,3 M Saccharose, 5 mM EDTA, 1% Trasylol, 10 μM Leupeptin und 10 μM Antipain) solubilisiert. Diese P-100-Fraktion wurde auf eine Affinitätssäule aufgebracht, die das gebundene, aktive 22-Mer-Fragment von Saposin C enthielt. Die Säule wurde mit 0,05 M NaCl gewaschen, um locker gebundene Proteine zu eluieren, gefolgt von 0,25 M NaCl, das den mutmaßlichen Prosaposinrezeptor von 60 kDa eluierte. Außerdem wurde festgestellt, daß das Protein von 60 kDa unter Verwendung eines 100-fachen Überschusses von ungebundenem Peptid eluiert werden konnte, was folglich eine spezifische Elution demonstrierte. Das Protein von 60 kDa war ungefähr 90% rein, wie durch SDS-PAGE beurteilt. Das Protein wurde unter Verwendung von HPLC bis zur Homogenität gereinigt und bei 50% Acetonitril in einem Acetonitril/Wasser-Gradienten an einer Vydac-C4-Säule eluiert. Nach Behandlung mit dem Vernetzungsreagens Disuccinimidylsuberat (DSS, Pierce; Rockford, IL) band das Protein von 60 kDa irreversibel an ¹²⁵I-markiertes Saposin C, wie durch das Molekulargewicht von 72 kDa des Komplexes (60 kDa + 12 kDa) nachgewiesen.
Beispiel 7
In vivo Peptidaufnahme durch das zentrale Nervensystem
Ein 18-Mer-Peptid, das aus den Aminosäuren 12–29 von Saposin C bestand, mit einem gegen Valin in der Position 12 ausgetauschten Tyrosin wurde an einem Applied Biosystems Modell 430 Peptidsynthesizer chemisch synthetisiert. Das Peptid wurde dann durch das Lactoperoxidaseverfahren radiojodiert und 20 × 10⁶ cpm wurden in die äußeren Ohren von Ratten injiziert. Die Tiere wurden nach einer Stunde und 24 Stunden geopfert und die Herzen wurden mit isotonischer Salzlösung benetzt, um das Blut vom Gehirn zu entfernen. Das Gehirn wurde dann in einem Gammazähler gezählt, um den Prozentsatz an Peptidaufnahme zu bestimmen. Außerdem wurde in dem Experiment von 24 Stunden das Gehirn homogenisiert und in eine kapillarreiche Fraktion (Pellet) und eine Parenchymgehirnfraktion (Überstand) nach Dextranzentrifugation getrennt (Triguero et al., (1990) J. Neuro–chem. 54: 1882–1888). Dieses Verfahren ermöglicht die Unterscheidung zwischen radiomarkiertem Peptid innerhalb Blutgefäßen und jenem innerhalb des Gehirns. In dem Experiment von 24 Stunden wurden 0,017% des injizierten Peptids im ganzen Gehirn nachgewiesen; 75% des Markers befanden sich in der Parenchymafraktion und 25% befanden sich in der Kapillarfraktion. Bei 1 Stunde lagen 0,03% der injizierten Dosis im ganzen Gehirn vor.
Beispiel 8
Verwendung von Prosaposin und seinen aktiven Fragmenten bei der Behandlung von traumatischen ischämischen Läsionen am CNS in vivo
Ratten mit traumatischen Läsionen am Rückenmark erhalten eine direkte oder intravenöse Verabreichung von Prosaposin, seinen aktiven Fragmenten oder einem Peptid, das der vorstehend beschriebenen Consensus-Sequenz entspricht, im Bereich von 10 ng–10 mg/ml in einer sterilen Salzlösung oder in einer Depotform, um eine langsame Freisetzung zu ermöglichen. Dieselbe Anzahl von Tieren erhält nur Salzlösung. Nach einem chirurgischen teilweisen Durchschneiden des Rückenmarks oder einer Stoßverletzung wird Prosaposin oder ein neurotrophes Fragment davon direkt in die Läsionsstelle unter Verwendung desselben Dosisbereichs injiziert (die Kontrolltiere erhalten Salzlösungsinjektionen) und die Verbesserung wird durch Gewinnung der motorischen Neuronenfunktion (d. h. erhöhte Gliedmaßenbewegung) bewertet. Die Behandlungen fahren fort, bis keine weitere Verbesserung auftritt. Da Prosaposin und seine aktiven Fragmente sehr wasserlöslich sind, ist kein spezielles Abgabesystem für die Zubereitung erforderlich. Die Injektion der Peptide ist bevorzugt, da weniger Wahrscheinlichkeit einer Verschlechterung besteht und die Diffusion größer ist. Außerdem können diese Fragmente in großen Mengen chemisch synthetisiert werden.
Beispiel 9
Verwendung von Prosaposin und seinen aktiven Fragmenten bei der Behandlung von Demyelinisierungsstörungen
Patienten, bei denen ein frühes Stadium von MS (oder einer anderen Demyelinisierungsstörung) diagnostiziert wurde, wird das aktive 18- oder 22-Mer-Fragment von Saposin C oder von irgendeinem der von Zytokin abgeleiteten Consensus-Peptide (in Salzlösung) durch direkte intravenöse Injektion oder Injektion in die zerebrospinale Flüssigkeit unter Verwendung desselben Dosisbereichs wie in Beispiel 7 gegeben. Kontrollpatienten erhalten nur Salzlösung. Die Behandlung wird wöchentlich oder monatlich verabreicht und jegliche Verbesserung wird durch erhöhte Muskelstärke, Skelettmuskulaturkoordination und Bewerten der Myelinisierung durch Magnetresonanzabbildung bewertet.
Beispiel 10
Verwendung von Prosaposin oder seinen aktiven Fragmenten bei der Behandlung von retinaler Neuropathie
Von der retinalen Neuropathie, einer neurodegenerativen Augenstörung, die zum Sehverlust bei den Älteren führt, wird angenommen, daß sie eine Störung ist, die durch Prosaposin oder seine aktiven Fragmente behandelbar ist. Prosaposin, seine aktiven neurotrophen Fragmente oder eines der vorstehend beschriebenen Consensus-Peptide, werden entweder örtlich, systemisch oder intraokular in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um eine lokale Konzentration von Neurotrophin von etwa 10 ng/ml bis etwa 10 μg/ml zu erzeugen. Die Verabreichung wird wöchentlich fortgesetzt, bis der Sehverlust verlangsamt wird oder keine weitere Zunahme der Sicht bemerkt wird.
Beispiel 11
Inhibierung der TNF-Freisetzung durch von IL-6 abgeleitetes Peptid
Das in Tabelle 2 beschriebene von IL-6 abgeleitete Peptid (SEQ ID NR.: 9), ein Mutanten-PSS-Peptid, das einen Aspartatrest anstelle des Stromaufwärts-Asparagins enthält, oder ein verwürfeltes Kontrollpeptid wird zu Makrophagen in einer Kultur zugegeben. Eine unbehandelte Kultur wirkt als Kontrolle. Die Makrophagen werden durch die Zugabe von bakteriellem Lipopolysaccharid (LPS; Sigma. St. Louis, MO) aktiviert, was zur Freisetzung von TNF in das Kulturmedium führt, was eine Entzündungskaskade einleitet. Es ist bekannt, daß IL-6 die durch LPS induzierte Freisetzung von TNF inhibiert (Aderka et al., (1989) J. Immunol., 143: 3517–3523). In Kulturen, die vor der LPS-Stimulation mit dem IL-6-Peptid behandelt wurden, wird die Menge an freigesetztem TNF im Vergleich zu Kulturen, denen das Peptid nicht gegeben wird, signifikant verringert. Der Grad der Inhibierung der TNF-Freisetzung ist für sowohl IL-6 als auch das von IL-6 abgeleitete Peptid ähnlich, während die Mutanten- und verwürfelten Peptide die TNF-Freisetzung nicht inhibieren.
Beispiel 12
Stimulation der Erythropoese durch das von EPO abgeleitete Peptid
Von der Milz abgeleitete rötliche Stammzellen von mit Phenylhydrazin behandelten Mäusen werden unter Verwendung von gut bekannten Verfahren kultiviert. Die Zellen werden dann entweder mit rekombinantem menschlichen EPO, dem von EPO abgeleiteten Peptid oder einem Mutanten-EPO-Peptid, das einen Aspartatrest anstelle des Stromaufwärtsasparagins enthält, behandelt. Die Zellenwucherung wird durch den Einschluß von [³H]-Thymidin in die DNA nach drei Tagen in der Kultur gemessen (Krystal, (1983) Exp. Hematol., 11: 649–654). Die Zellen werden dann gewaschen, lysiert und das eingeschlossene Thymidin durch Szintillationszählung bestimmt. Die EPO- und von EPO abgeleiteten Peptide stimulieren den [³H]-Thymidineinschluß signifikant, wohingegen das Mutantenpeptid den Einschluß oberhalb Kontrollpegeln nicht stimuliert.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren zur Stimulierung von Nervenzellenauswuchs oder zunehmender Myelinisierung in vitro, umfassend: In-Kontakt-Bringen von Nervenzellen mit einer Zusammensetzung, die Prosaposin, Saposin C oder ein die Aminosäuren 8–29 von Saposin C mit der Fähigkeit, zunehmenden Nervenzellenauswuchs oder zunehmende Myelinisierungsaktivität zu fördern, umfassendes Peptid enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Prosaposin nativ ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Prosaposin rekombinant produziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung Saposin C enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Peptid im Wesentlichen aus dem aktiven neurotrophen Fragment von SEQ ID NR. 1 besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die Nervenzellen Neuroblastomzellen sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1–5, wobei die Zellen aus Gewebeentnahmen vom Kleinhirn der Maus stammen.
Verwendung von Prosaposin, Saposin C oder eines die Aminosäuren 8–29 von Saposin C mit der Fähigkeit, zunehmenden Nervenzellenauswuchs oder zunehmende Myelinisierungsaktivität zu fördern, umfassenden Peptids zur Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung von Nervenzellenauswuchs oder zunehmender Myelinisierung.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Prosaposin nativ ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Prosaposin rekombinant produziert wird.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Zusammensetzung Saposin C enthält.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Peptid im Wesentlichen aus dem aktiven neurotrophen Fragment von SEQ ID NR. 1 besteht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8–12, wobei die Nervenzellen Neuroblastomzellen sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8–12, wobei die Zellen aus Gewebeentnahmen vom Kleinhirn der Maus stammen.
Verwendung von Prosaposin oder eines neurotrophen Fragments davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von Nerven- oder Demyelinisationserkrankungen in Nervengewebe.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das Fragment Saposin C enthält.
Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Demyelinisationserkrankungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Multipler Sklerose, Leukoenzephalitis disseminata acuta, progressiver multifokaler Leukoenzephalitis, Nebennierenleukodystrophie.
Verwendung nach einem der Ansprüche 15–17, wobei das Prosaposin oder das Fragment davon in einer Lamellarstruktur eingeschlossen ist.
Verwendung eines Fragments von Prosaposin, wobei das Fragment die neurotrophe Aktivität des Peptids von SEQ ID NR. 1 einschließt, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von neuronalen degenerativen Krankheiten des Zentral- oder peripheren Nervensystems.
Verwendung nach Anspruch 19, wobei die Krankheit eine Krankheit des Zentralnervensystems ist und das Fragment ausgewählt ist, um die Blut-Hirn-Schranke zu durchqueren.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei das Fragment die Aminosäuren 12–29 von Saposin C enthält
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das Fragment im Wesentlichen aus dem aktiven neurotrophen Fragment von SEQ ID NR. 6 besteht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 20–22, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Schlaganfall, Postpoliomyelitis-Syndrom und amyotrophischer Lateralsklerose.
Verwendung von Prosaposin oder eines neurotrophen Fragments davon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Therapie von retinaler Neuropathie.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei die retinale Neuropathie Makuladegeneration ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8–25, wobei das Prosaposin oder das neurotrophe Fragment in einer Einnahmeeinheitsform zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Excipienten vorliegt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8–26, wobei das Prosaposin oder das neurotrophe Fragment mit einem Material für regulierte Freisetzung formuliert ist.