DE60023139T2

DE60023139T2 - Verwendung von il6r- il6 chimären für die behandlung von neurodegenerativen erkankungen

Info

Publication number: DE60023139T2
Application number: DE60023139T
Authority: DE
Inventors: Michel Revel; Judith Chebath; Marina Pizzi; Pierfranco Spano; Ursula Boschert
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd; Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA; Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1999-06-21
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2006-05-04
Anticipated expiration: 2020-06-22
Also published as: KR100678290B1; EP1185293A2; EP1185293B1; MXPA02000116A; ZA200109488B; DE60023139D1; EA200200063A1; ES2250140T3; DK1185293T3; BR0011363A; WO2000078331A3; ATE306280T1; CA2374997C; EE05559B1; EA004626B1; JP4846148B2; CN1164328C; EE200100689A; US7201896B1; NO20015673D0

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liegt im Allgemeinen auf dem Gebiet neurologischer Erkrankungen und Störungen. Insbesondere bezieht sie sich auf neurodegenerative Erkrankungen, Neuroprotektion, Nervenmyelinisierung und Bildung von Zellen, die Myelinscheide herstellen. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung von IL6R-IL6-Chimären für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen oder Störungen, speziell zur Neuroprotektion und für die Behandlung von Demyelinisierungserkrankungen und die Verbesserung der Nervenregeneration bereit.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Nervenmyelinisierung ist ein wesentlicher Vorgang bei der Bildung und Funktion der Teile des zentralen Nervensystems (ZNS) und peripheren Nervensystems (PNS). Die Myelinscheide um Axone ist notwendig für die richtige Weiterleitung von elektrischen Impulsen entlang von Nerven. Der Verlust von Myelin tritt bei einer Anzahl von Erkrankungen auf, darunter die das ZNS betreffende Multiple Sklerose (MS), das Guillain-Barre-Syndrom, CIDP und andere (siehe Abramsky und Ovadia, 1997; Trojaborg, 1998, Hartung et al. 1998). Obwohl verschiedene Krankheitsursachen zugrunde liegen, wie beispielsweise infektiöse Pathogene oder Autoimmunattacken, verursachen alle Demyelinisierungserkrankungen den Verlust von neurologischen Funktionen und können zu einer Lähmung und zum Tod führen. Während gegenwärtige therapeutische Wirkstoffe inflammatorische Attacken bei MS reduzieren und den Krankheitsfortschritt verzögern, besteht ein Bedarf zur Entwicklung von Therapien, die zu einer Remyelinisierung und Wiederherstellung von neurologischen Funktionen führen könnten (Abramsky und Ovadia, 1997, Pohlau et al. 1998).
Die Synthese von Myelin ist eine Funktion von spezialisierten Gliazellen: den Oligodendrozyten im ZNS und den myelinisierenden Schwann-Zellen im PNS. Diese zwei Zelltypen können in ihrem voll differenzierten Stadium myelinisierende Zellen genannt werden. Myelin ist eine Lipidmembranstruktur, die eine Anzahl von verschiedenen Proteinen enthält. Myelinbasisproteine (MBP) stellen die Hauptkomponenten (30%) der ZNS- und ebenso der PNS-Myelinproteine dar. Die Expression von MBP und anderen Genen, die für verschiedene Myelinproteine kodieren (z.B. P0, PMP-22, MAG bei PNS, PLP, MOG bei ZNS), wird während der terminalen Differenzierung von Oligodendrozyten und myelinisierenden Schwann-Zellen angeschaltet. Der Ursprung dieser Zellen liegt in der embryonalen Neuralleiste (Fraser, 1991) von wo sie abwandern und einer Differenzierung unterworfen sind, die in einer Anzahl von Schritten fortschreitet. Die Entwicklung der Schwann-Zellen (SC) scheint drei Hauptschritte zu beinhalten: 1) die Erzeugung von Vorläufern (pSC) aus abwandernden Zellen; 2) die Teilung und der Übergang zu embryonalen SC (eSC), die das S100-Protein exprimieren; 3) die postnatale terminale Differenzierung eines Teils der eSC-Population in myelinisierende SC, die MBP und andere Myelinproteine exprimieren (Kioussi und Gruss, 1996). Die von der Neuralleiste abwandernden Zellen ergeben nicht nur pSC, sondern ebenso sensorische und sympathische Neuronen, glatte Muskelzellen und Zellen, die die Haut und Haarfollikel erreichen und pigmentierte Melanocyten werden. Das Schicksal der Zellen der Neuralleiste wird durch verschiedene induzierende Faktoren beeinflusst: Differenzierung zu Gliazellen, zu Neuronen und zu Muskeln wird durch Neureguline, wie beispielsweise Gliawachstumsfaktor (GGF), durch BMP2/4 bzw. durch TGF-β unterstützt (Anderson, 1997). Die Differenzierung zu Melanozyten kann durch Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise bFGF oder PDGF oder SDF unterstützt werden (Stocker et al. 1991; Anderson, 1997).
Die terminate Differenzierung der Schwann- und Oligodendrozyten-Vorgänger in aktive myelinisierende Zellen und die Myelinisierung selbst scheint von Signalen, die durch die Interaktion zwischen neuronalen Axonen und den Gliazellen erzeugt werden, abhängig zu sein (Lemke und Chao, 1988; Trapp et al. 1988). Wenn der Kontakt zwischen Axon und Schwann-Zelle unterbrochen ist, wie nach einer Nervenschädigung, kehren die Zellen zu einem nicht-myelinisierenden Zustand zurück und die Expression von Myelinprotein-Genen geht verloren (Jessen und Mirsky, 1991). Um die Myelinisierung oder Remyelinisierung nach neuralen Erkrankungen oder Trauma stimulieren zu können, würde es äußerst wichtig sein, die Faktoren zu identifizieren, die fähig sind, die Synthese von Myelin zu induzieren
ZNS-Verletzungen, die durch akute Verletzungen einschließlich Trauma, Hypoxie und Ischämie verursacht werden, können sowohl Neuronen als auch weiße Hirn- und Rückenmarksubstanz beeinträchtigen. Obwohl die meiste Aufmerksamkeit auf Prozesse gelenkt war, die zum Tod von Neuronen geführt haben, legen zunehmende Beweise nahe, dass eine Schädigung von Oligodendrozyten, die Axone myelinisieren, ebenso eine spezifische Komponente einer ZNS-Verletzung ist. So wurde in einer sehr frühen Phase nach einer Gehirn-Ischämie (drei Stunden) bei Ratten eine Oligodendrozyten-Pathologie gezeigt, die nahe legt, dass diese Zellen sogar noch anfälliger gegenüber exzitotoxischen Ereignissen sind, als neuronale Zellen (Pantoni et al. 1996). Ein potentieller Kandidat, der den Zelltod vermittelt, ist die markante Erhöhung der Glutamatkonzentration, die viele akute ZNS-Verletzungen begleitet (Lipton et al. 1994). Tatsächlich wurde herausgefunden, dass neben Neuronen sogar Oligodendrozyten funktionale Glutamat-Rezeptoren exprimieren, die zu dem AMPA/Kainat-Subtyp gehören. Ferner zeigen Oligodendrozyten eine hohe Anfälligkeit gegenüber Glutamat-Verabreichung (McDonald et al. 1998).
Neureguline, wie beispielsweise GGF, die auf embryonale Schwann-Zellen-Vorläufer wirken, sind ebenso Überlebens-, Wachstums- und Reifungsfaktoren für postnatale Oligodendrozyten und Schwann-Zellen in verletzten Nerven, und GGF ist einer der mitogenen Faktoren, der durch axonalen Kontakt bereitgestellt wird (Topliko et al. 1996). Rekombinantes hGGF2 konnte die Remyelinisierung nach einer längeren Verabreichung in einem Mausmodell für Multiple Sklerose (Cannella et al. 1998) oder in gequetschten peripheren Nerven (Chen et al. 1998) verbessern. Ein weiteres Zytokin, das in Schwann-Zellen durch axonalen Kontakt induziert wird, ist der ziliäre neurotrophe Faktor CNTF (Lee et. al. 1995). Es wurde gezeigt, dass CNTF sowie der Leukämie-inhibierende Faktor (LIF) das Überleben von Oligodendrozyten von optischen Nerven, die in vitro mit bFGF oder PDGF kultiviert wurden, verbessert und die Anzahl von MBP-exprimierenden Oligodendrozyten in diesen Kulturen erhöht (Mayer et al. 1994). Wenn CNTF und LIF zu Glia-Vorläuferzellen hinzugefügt werden, scheinen sie jedoch eher die Astrozyten-Differenzierung zu begünstigen und die Expression des Astrozyten-Markers GFAP zu induzieren, während sie auf Oligodendrozyten hauptsächlich eine Überlebenswirkung haben würden, mit wenig Auswirkung auf das Niveau der MBP-Genexpression (Kahn and De Vellis, 1994, Bonni et al. 1997). Trotzdem verbessern Kombinationen aus CNTF mit dem aus dem Gehirn abgeleitetem neurotrophen Faktor BNDF die Regenerierung eines verletzten peripheren Ischiasnervs (Ho et al. 1998).
CNTF und LIF sind Zytokine, die durch ein gemeinsames Rezeptorsystem wirken, das den LIF-Rezeptor (LIFR) und die gp130-Kette umfasst, wobei letztere auch ein Teil des Interleukin-6-(IL6)-Rezeptorkomplexes ist (Ip et al. 1992). CNTF und LIF sind daher Teil der IL6-Zytokinfamilie. Im Fall von CNTF und LIF funktioniert die Signalübermittlung durch Dimerisierung von LIFR mit gp130, wohingegen im Fall von IL6 das Signal durch die Dimerisierung von zwei gp130-Ketten erzeugt wird (Murakami et al. 1993). Um gp130 zu binden, bildet IL6 einen Komplex mit einer IL6-Rezeptorkette, die auf bestimmten Zellen als ein gp80-Transmembranprotein vorkommt, aber dessen lösliche Form ebenso als ein IL6-Agonist wirken kann, wenn sie von außerhalb der Zelle bereitgestellt wird (Taga et al. 1989, Novick et al. 1992). Durch Fusionieren der gesamten kodierenden Regionen der cDNAs, die für den löslichen IL6-Rezeptor (sIL6R) und IL6 kodieren, kann eine rekombinante IL6R-IL6-Chimäre in CHO-Zellen hergestellt werden (Chebath et al. 1997, WO 99/02552). Diese IL6R-IL6-Chimäre hat verbesserte IL6-typische biologische Aktivitäten und bindet in vitro mit einer viel höheren Effizienz an die gp130-Kette als das Gemisch von IL6 mit sIL6R (Kollet et al. 1999).
Eine Übersicht der Wirkungen von IL6 auf Zellen des zentralen und peripheren Nervensystems zeigt, dass die Zytokine sowohl schützende Wirkungen auf neuronale Zellen haben können als auch an inflammatorischen neurodegenerativen Prozessen teilhaben können (Gadient und Otten, 1997, Mendel et al. 1998). Bei Gliazellen waren CNTF und LIF viel wirksamer als IL6, um Astrozyten-Differenzierung zu stimulieren, aber sie hatten keine Wirkung auf Myelinprotein-produzierende Zellen (Kahn und De Vellis, 1994). Es wurde festgestellt, dass IL6 den Glutamat-induzierten Zelltod in Neuronen des Hippokampus (Yamada et al. 1994) sowie des Striatums (Toulmond et al. 1992) verhindert. Der IL6-Mechanismus der Neuroprotektion gegenüber der durch NMDA, dem selektiven Agonisten für den NMDA-Subtyp des Glutamat-Rezeptors, bewirkten Toxizität ist noch unbekannt. Tatsächlich wurde festgestellt, dass IL6 die NMDA-vermittelte intrazelluläre Kalziumerhöhung fördert. In transgenen Mäusen, die höhere Levels von sowohl IL6 als auch löslichem IL6R (sIL6R) exprimieren, wurde nach einer Verletzung des Hypoglossus eine beschleunigte Nervenregeneration festgestellt, wie durch retrograder Markierung des Hypoglossus im Gehirn gezeigt wurde (Hirota et al. 1996). In dieser Arbeit zeigte die Zugabe von IL6 und sIL6R zu Kulturen von Spinalganglien-(DRG)-Zellen eine erhöhte Neuritenverlängerung in Neuronen, aber es wurde keine Wirkung auf myelinisierende Zellen gemeldet.
Im Hinblick auf die vorstehend präsentierten Daten, haben CNTF, LIF oder ein Gemisch aus IL6 und sIL6R nicht gezeigt, dass sie die terminale Differenzierung von Gliazellen in myelinisierende Zellen induzieren. Wie jedoch vorstehend erwähnt, würde die Stimulierung der Diffenzierungen von myelinisierenden Zellen von großem Nutzen für Patienten sein, die an demyelinisierenden oder neurodegenerativen Erkrankungen leiden.
Die Erwähnung irgendeines Dokuments hierin, soll nicht als Aussage dahingehend verstanden werden, dass ein derartiges Dokument einen relevanten Stand der Technik oder berücksichtigtes Material für die Patentierbarkeit eines Patentanspruchs der vorliegenden Anmeldung darstellt. Jede Angabe im Hinblick auf den Inhalt oder ein Datum irgendeines Dokuments beruht auf der Information, die den Anmeldern zum Zeitpunkt der Einreichung zur Verfügung stand, und stellt keine Aussage über die Richtigkeit einer derartigen Angabe dar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel für die Behandlung und/oder Vorbeugung von neurologischen Erkrankungen oder Störungen, ausgewählt aus der Gruppe aus traumatischer Nervendegeneration, Demyelinisierungserkrankungen des ZNS oder PNS und/oder neurodegenerativen Erkrankungen, bereitzustellen. Im Besonderen ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel bereitzustellen, um die Differenzierung von Vorgängern oder differenzierten Gliazellen in myelinisierende Zellen zu stimulieren oder zu verbessern. Die Grundlage der Erfindung liegt in der Verwendung des rekombinanten IL6R-IL6-Chimären-Proteins, das eine wesentlich höhere Affinität für gp130 besitzt als das Gemisch von IL6 und sIL6R.
Es ist ferner eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Mittel bereitzustellen, um die Myelinisierung oder Remyelinisierung von verletzten Fasern zu stimulieren, wie es durch die induzierte Remyelinisierung von Axonen nach einer Axotomie der Ischiasnerven in vivo, zusätzlich zu den myelinisierenden Wirkungen der IL6-Chimäre auf die Induktion von Myelingenen in vitro, veranschaulicht wird.
Es ist ebenso eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die IL6R-IL6-Chimäre dafür zu verwenden, um die Anzahl an Schwann-Zellen, die sich in Kulturen von Spinalganglien (DRG) entwickeln, zu erhöhen. Weiterhin ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, IL6R-IL6 zur Induktion der Differenzierung von diesen Zellen zu verwenden, bis zu dem Punkt, an dem diese sich um Axone wickeln und Myelinbasisprotein herstellen, wie es in Co-Kulturen von Schwann-Zelllinien mit primärem DRG veranschaulicht wird.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die IL6R-IL6-Chimäre zur Induktion der Transkription der Myelinbasisprotein-(MBP)-Gene zu verwenden, in einem Transdifferenzierungssystem, in dem Zellen mit melanozytischem Phänotyp in einen myelinisierenden Schwann-Phänotyp umgewandelt werden, wie durch die Wirkung von IL6R-IL6 auf ein Mausmelanom veranschaulicht wird.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die IL6R-IL6-Chimäre als einen protektiven Wirkstoff gegen den Neurotoxizitätsprozess, der durch exzitatorische Aminosäuren ausgelöst wird, zu verwenden, wie es durch den Schutz von Glutamatinduzierter Neurotoxizität, der durch die IL6-Chimäre in Primärkulturen von Kleinhirnneuronen von neugeborenen Ratten bereitgestellt wird, veranschaulicht wird.
Ein molekularer Mechanismus wird vorgeschlagen, durch den IL6R-IL6 spezifische Transkriptionsfaktoren, die die Induktion der MBP-Gendifferenzierung in den myelinisierenden Phänotyp hervorbringen, induziert und reprimiert.
Daher stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der IL6R-IL6-Chimäre zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung und/oder Vorbeugung von neurologischen Erkrankungen und Störungen, ausgewählt aus der Gruppe von traumatischer Nervendegeneration, demyelinisierenden Erkrankungen des ZNS oder PNS und/oder neurodegenerativen Erkrankungen bereit.
Genauer gesagt, stellt die Erfindung die Verwendung von IL6R-IL6-Chimären bei der Behandlung von Multipler Sklerose (MS), Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit oder ALS bereit.
Die Erfindung stellt ebenso pharmazeutische Zusammensetzungen, die die IL6R-IL6-Chimäre, wahlweise zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch-akzeptablen Exzipienten umfassen, für die Behandlung und/oder Vorbeugung von neurologischer Erkrankung und Störungen, ausgewählt aus der Gruppe von traumatischer Nervendegeneration, demyelinisierenden Erkrankungen des ZNS oder PNS und/oder neurodegenerativen Erkrankungen, bereit.
Eine bevorzugte Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von MS, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit oder ALS.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt den Anstieg von MBP-RNA in Kulturen von Schwann-Zellen, die mit der IL6R-IL6-Chimäre oder mit Forskolin (FSK) behandelt wurden oder unbehandelt blieben (NT).
2 zeigt die Proliferation von undifferenzierten Oli-neu-Zellen, gemessen nach 24, 48 und 72 Stunden nach der Behandlung mit verschiedenen Mengen der IL6R-IL6-Chimäre.
3 zeigt, dass IL6R-IL6 im Lauf der Zeit in den F10.9 Zellen MBP-mRNAs (A) stark induziert und Pax-3-mRNA (B) herabsetzt. NT kennzeichnet unbehandelte Zellen.
4 zeigt einen Vergleich der Neuroprotektion durch IL6 alleine und der IL6-Chimäre auf NMDA-vermittelte Neurotoxizität in hippokampalen organtypischen Schnitten.
5 zeigt die anhaltende neuroprotektive Wirkung der IL6-Chimäre vs. die Wirkung von IL6 alleine in hippokampalen organtypischen Schnitten.
6 zeigt die Wirkung der IL6R-IL6-Chimäre auf das Überleben von Neuronen, denen NGF entzogen wurde, mittels MTT-Assay nach 24 Stunden der Behandlung gemessen.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
In Übereinstimmung mit der Erfindung wurde herausgefunden, dass die Zugabe von IL6-IL6R-rekombinantem Protein zu Kulturen von Spinalganglienzellen oder von Melanomzellen die Differenzierung von diesen Zellen in myelinisierende Zellen stimuliert. Es wurde ebenso herausgefunden, dass die Zugabe von dem IL6-IL6R-rekombinantem Protein zu Co-Kulturen von Neuronen und Schwann-Zellen die Letzteren dazu induziert, eine normale Scheide um die Axonen zu bilden. Die Erfindung bezieht sich daher auf die Verwendung der IL6R-IL6-Chimäre für die Herstellung eines Medikaments, um myelinisierende Zellen zu erzeugen oder die Erzeugung von myelinisierenden Zellen zu stimulieren, zu verbessern oder zu beschleunigen.
Die IL6-Chimäre induziert weiterhin in vivo die Remyelinisierung von durchtrennten Fasern nach einer Axotomie von Ischiasnerven bei Ratten. Die Erfindung bezieht sich daher ferner auf die Verwendung der IL6R-IL6-Chimäre zur Herstellung eines Medikaments, um die Remyelinisierung insbesondere nach Nervenschädigung oder Trauma oder axonaler Verletzung zu induzieren, zu verbessern oder zu beschleunigen.
Es wurde ferner herausgefunden, dass die Zugabe des IL6-IL6R-rekombinanten Proteins zu organtypischen Kulturen eine anhaltende protektive Wirkung vor neurotoxischen Wirkstoffen induziert. Die Erfindung bezieht sich daher ebenso auf die Verwendung der IL6R-IL6-Chimäre zur Herstellung eines Medikaments, um die Neuroprotektion zu induzieren, zu verbessern, zu verlängern oder zu beschleunigen, insbesondere vor neurotoxischen Wirkstoffen, und um den Tod von Neuronen, der z.B. aufgrund von programmiertem Zelltod (Apoptose) eintritt, zu inhibieren, zu reduzieren oder zu verlangsamen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der „IL6R-IL6-Chimäre" (auch „IL6R-IL6" oder „IL6-Chimäre" genannt), die ein rekombinantes Glykoprotein darstellt, das durch Fusionieren der gesamten kodierenden Sequenz des natürlich vorkommenden löslichen IL6-Rezeptors δ-Val an die gesamte kodierende Sequenz des reifen natürlich vorkommenden IL6 erhalten wird, wobei beide humanen Ursprungs sind. Die IL6R-IL6-Chimäre kann in beliebigen geeigneten eukaryotischen Zellen hergestellt werden, wie beispielsweise Hefezellen, Insektenzellen und dergleichen. Sie wird bevorzugt in Säugerzellen hergestellt, am meisten bevorzugt in genetisch veränderten CHO-Zellen, wie in WO 99/02552 beschrieben wird. Während das Protein humanen Ursprungs bevorzugt wird, ist dem Fachmann klar, dass ein ähnliches Fusionsprotein irgendeines anderen Ursprungs gemäß der Erfindung verwendet werden kann, solange es seine hierin beschriebene biologische Aktivität behält.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der IL6R-IL6-Chimäre, um die Differenzierung von Vorgänger- oder differenzierten Gliazellen in myelinisierende Zellen zu stimulieren. Wie hierin bewiesen, führt der Differenzierungsprozess der IL6R-IL6-induzierten myelinisierenden Zellen sowohl zur Aktivierung von Genen, die für die Bildung der Myelinscheide um neuronale Axone erforderlich sind, als auch zur Repression eines Gens, das für den Erhalt von nicht-myelinisierenden Phänotypen erforderlich ist.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde beobachtet, dass die Zugabe der IL6R-IL6-Chimäre zu Kulturen von embryonalen Spinalganglien (eDRG)-Zellen, die aus Mausembryos an den Gestationstagen 14–15 isoliert wurden, eine große Wirkung auf die Entwicklung der Schwann-Vorläuferzellen, die in den DRG vorliegen, hat. Nach 2–5 Tagen in Kultur tritt ein markanter Anstieg der Anzahl der embryonalen Schwann-Zellen, eine markante phänotypische Veränderung dieser Zellen, die beginnen, ihre Membran um die DRG-Axone zu wickeln, und eine Induktion von MBP auf. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde ferner beobachtet, dass in einer Co-Kultur von Schwann-Zellen mit Neuronen die IL6-Chimäre einen signifikanten Anstieg der Bindung der Schwann-Zellen entlang der nicht-myelinisierten Axone innerhalb von 5 Stunden induzieren kann. Die mit Fluorogold markierten Schwann-Zellen verlängern sich und nach einigen Tagen konnte beobachtet werden, dass ihr fluoreszierendes Zytoplasma eine regelmäßige Scheide um die Axone bildete. Ohne die Chimäre, oder mit NGF, binden die Schwann-Zellen weit weniger und bilden keine Scheide.
Daher bezieht sich die Erfindung ferner auf die Verwendung der IL6R-IL6-Chimäre für die Herstellung eines Medikaments, um die Proliferation und/oder Differenzierung der Schwann-Zellen zu induzieren, sowie auf die Myelinisierung durch Schwann-Zellen in dem peripheren Nervensystem.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde weiterhin gezeigt, dass die IL6-Chimäre die Remyelinisierung von peripheren Nerven in vivo induzieren kann. Nach einer Axotomie von Ischiasnerven bei Ratten und dem Nebeneinanderstellen der proximalen und distalen Enden konnte die IL6-Chimäre die Regeneration der peripheren Nerven und die Remyelinisierung der durchtrennten Fasern in vivo induzieren. In Gegenwart der IL6-Chimäre wurde ein vierfacher Anstieg der Anzahl und Dicke der myelinisierten Fasern gefunden und ein Anstieg der Remyelinisierung der weiter entfernten Fasern. Daher bezieht sich die Erfindung ferner auf die Verwendung der IL6R-IL6-Chimäre zur Herstellung eines Medikaments, um eine Remyelinisierung in dem peripheren Nervensystem zu induzieren.
Weiterhin wurde auch herausgefunden, dass die IL6-Chimäre gemäß der vorliegenden Erfindung die Expression von Genen, die für Bestandteile des Myelinproteins kodieren, wie beispielsweise MBP, PLP und P0-Gene in myelinisierenden Zellen des peripheren Nervensystems, wie beispielsweise Schwann-Zellen, und in Zellen des zentralen Nervensystems, wie beispielsweise Oligodendrozyten, induzieren kann.
Daher bezieht sich die Erfindung weiterhin auf die Verwendung der IL6R-IL6-Chimäre für die Herstellung eines Medikaments, um eine Myelinisierung und/oder Remyelinisierung durch Oligodendrozyten in dem zentralen Nervensystem zu induzieren.
Ferner wurde gemäß der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass die Zugabe der IL6R-IL6-Chimäre zu Kulturen der B16/F10.9 Mausmelanom-Zelllinie innerhalb von 6–12 Stunden die Expression des MBP-Gens induziert. Andere Gene, die für Proteine des Myelins kodieren, wie beispielsweise das CNPase-Gen, werden induziert, wohingegen die Expression von Genen, die an der Melanogenese (Bildung von Melaninpigmenten) beteiligt sind, wie beispielsweise Tyrosinase, stark reprimiert wird. Die mit IL6R-IL6 behandelten F10.9-Zellen machen auch eine markante morphologische Veränderung durch und erwerben einen Schwann-ähnlichen Phänotyp. Die phänotypischen Veränderungen und die Induktion von spezifischen Myelingenen unterstützen die Hypothese, dass IL6R-IL6 eine Transdifferenzierung dieser Zellen von einem melanozytischen zu einem myelinisierenden Zustand verursacht. Da in den Embryozellen, die von der Neuralleiste abwandern, entweder zu Melanozyten oder zu myelinisierenden Schwann-Zellen und Oligodendrozyten führen können, wird vorgeschlagen, dass IL6R-IL6 das Schicksal dieser Zellen beeinflussen und die Bildung von myelinisierenden Zellen begünstigen kann. Daher bezieht sich die Erfindung ebenso auf die Verwendung der IL6R-IL6-Chimäre für die Herstellung eines Medikaments, um die Bildung von myelinisierenden Zellen in dem peripheren und dem zentralen Nervensystem zu induzieren, zu unterstützen, zu verbessern oder zu beschleunigen und/oder die Transdifferenzierung von melanocytischen Zellen in myelinisierende Zellen zu induzieren.
Mehr noch wird in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung gezeigt, dass IL6R-IL6 durch Herabregulierung des Homöobox-Gens Pax-3 wirkt, ein Gen, das in embryonalen Neuralleistenzellen exprimiert wird, bevor diese in myelinisierende Schwann-Zellen differenzieren (Kioussi und Gruss, 1996). Pax-3 repromiert bekanntlich das MBP-Gen. Daher scheint die Pax-3-Repression ein Schlüsselereignis in der terminalen Reifung der myelinisierenden Zellen zu sein. Daher wirkt IL6R-IL6 auf einen Schlüsselschalter der Differenzierung (d.h. pax-3-Repression).
Pax-3 ist ein Transaktivator des Mikrophthalmie-assoziierten Transkriptionsfaktors MITF, der wiederum die Expression von Tyrosinase und anderen Genen, die für den melanozytischen Phänotyp verantwortlich sind, induziert und aufrecht erhält. Die Entdeckung der schnellen Repression von Pax-3 durch IL6R-IL6 kann daher die molekularen Ereignisse erklären, die die myelinisierende Aktivität der von Neuralleisten abstammenden Zellen unterstützen. Nach einer Nervenverletzung, machen die myelinisierten Axone eine Demyelinisierung als Teil der Waller-Degeneration durch. Während dieses Prozesses regulieren die Schwann-Zellen die Expression des MBP-Gens und anderer verwandter Myelinprotein-Gene herab. Gleichzeitig findet eine Heraufregulierung von Pax-3 und GFAP statt, die eine Reversion von myelinisierender SC zu nicht-myelinisierender und proliferierender SC kennzeichnet (Kioussi und Gruss, 1996). In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung scheint die IL6R-IL6-Chimäre ein potentes Zytokin zu sein, um den Prozess der Waller-Nervendegeneration durch Repression von Pax-3 umzukehren und die SC zu induzieren, ihre myelinisierenden Aktivitäten wiederaufzunehmen. Dieselben Überlegungen würden auf Demyelinisierungserkrankungen des Gehirns zutreffen, da, wie in Traumen, die Neurodegeneration bei diesen Erkrankungen durch einen von Makrophagen und anderen inflammatorischen Zellen angetriebenen Demyelinisierungsprozess angespornt wird. Daher bezieht sich die Erfindung ebenso auf die Verwendung der IL6R-IL6-Chimäre für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Nervenschädigungen und/oder traumatischer Nervendegeneration und/oder axonaler Verletzung.
IL6R-IL6 kann Mäusen injiziert werden, in denen eine autoimmune Demyelinisierung als ein Modellsystem für chronisch wiederkehrende Multiple Sklerose durch Immunisierung mit MBP induziert wurde (Cannella et al. 1998). Die Fähigkeit von IL6R-IL6 Myelinprotein-Gene und die Differenzierung von myelinisierenden Gliazellen zu induzieren, kann in vivo unter Verwendung dieses pharmazeutischen Musterbeispiels beobachtet werden. Die Erfindung bezieht sich daher weiterhin auf die Verwendung der IL6R-IL6-Chimäre für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung von autoimmunen Demyelinisierungserkrankungen, insbesondere für die Behandlung und/oder Vorbeugung von Multipler Sklerose.
Es wurde auch gezeigt, dass die IL6-Chimäre neuroprotektive Wirkungen aufweist und dem durch exzitotoxische Wirkstoffe induzierten Verlust der Lebensfähigkeit von neuronalen Zellen in Regionen, die an der Gedächtniskodierung sind, und eine frühe Degeneration bei der Alzheimer-Krankheit und Ischämie aufweisen, verhindert. Es wurde herausgefunden, dass die IL6-Chimäre Neuronen vor Glutamat-induzierter Neurotoxizität schützt. Daher bezieht sich die Erfindung auf die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung und/oder Vorbeugung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie z.B. Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit oder ALS.
Die Definition „pharmazeutisch-akzeptabel" soll einen beliebigen Träger umfassen, der nicht mit der Wirksamkeit der biologischen Aktivität des aktiven Inhaltsstoffes interferiert und der nicht toxisch auf den Empfänger, dem er verabreicht wird, wirkt. Die IL6R-IL6-Chimäre kann, z.B. für parenterale Verabreichung, in einer Einheitsdosisform für die Injektion in Vehikeln, wie beispielsweise Salzlösung, Glukoselösung, Serumalbumin und Ringer-Lösung formuliert sein.
Die IL6R-IL6-Chimäre ist geeignet, um einem Patienten, der eine Verabreichung davon benötigt, in einer Vielfalt von Wegen verabreicht zu werden. Die Verabreichungswege umfassen intradermale, transdermale (z.B. in Rezepturen für eine langsame Freisetzung), intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, orale, epidurale, topische und intranasale Wege. Jeder andere therapeutisch wirksame Verabreichungsweg kann verwendet werden, z.B. Absorption durch epitheliales und endotheliales Gewebe oder mittels Gentherapie, bei der dem Patienten ein DNA-Molekül, das für die IL6R-IL6-Chimäre kodiert, (z.B. über einen Vektor) verabreicht wird, was dazu führt, dass die IL6R-IL6-Chimäre in vivo exprimiert und sezerniert wird. Zusätzlich kann die IL6R-IL6-Chimäre zusammen mit anderen Bestandteilen von biologisch aktiven Wirkstoffen, wie beispielsweise pharmazeutisch-akzeptablen oberflächenaktiven Stoffen, Exzipientien, Trägern, Verdünnungsmitteln und Vehikeln verabreicht werden.
Für die parenterale (z.B. intravenöse, subkutane, intramuskuläre) Verabreichung, kann die IL6R-IL6-Chimäre als eine Lösung, Suspension, Emulsion oder lyophilisiertes Pulver in Verbindung mit einem pharmazeutisch-akzeptablen parenteralen Vehikel (z.B. Wasser, Salzlösung, Glukoselösung) und Zusätzen, die die Isotonizität (z.B. Mannitol) oder die chemische Stabilität (z.B. Konservierungsmittel und Puffer) aufrecht erhalten, formuliert sein. Die Formulierung wird durch herkömmlich verwendete Techniken sterilisiert.
Eine „wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge der aktiven Inhaltsstoffe, die ausreichend ist, um den Ablauf und die Schwere der vorgenannt beschriebenen Erkrankungen zu beeinflussen und dabei zur Reduzierung oder Remission einer derartigen Pathologie führt. Die wirksame Menge wird von dem Verabreichungsweg und dem Zustand des Patienten abhängig sein.
Die als Einzel- oder Mehrfachdosis an ein Individuum verabreichte Dosis wird von verschiedenen Faktoren abhängig sein, einschließlich pharmakokinetischer Eigenschaften der IL6R-IL6-Chimäre, dem Verabreichungsweg, dem Zustand der Patienten und Charakteristika (Geschlecht, Alter, Körpergewicht, Gesundheit, Größe), dem Ausmaß der Symptome, den gleichzeitig erfolgenden Behandlungen, der Häufigkeit der Behandlung und der gewünschten Wirkung. Die Einstellung und Veränderung von etablierten Dosierungsbereichen gehört zu der Fähigkeit der Fachleute, und das gilt auch für in vitro und in vivo Verfahren zum Bestimmen der Remyelinisierung der Nerven.
Während die Erfindung in Verbindung mit einer spezifischen Ausführungsform davon beschrieben wird, soll verstanden werden, dass sie weiteren Veränderungen unterworfen werden kann. Diese Anmeldung soll, jegliche Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung abdecken, welche im allgemeinen die Grundsätze der Erfindung befolgen, einschließlich derartiger Abweichungen von der vorliegenden Veröffentlichung, die zur bekannten oder gebräuchlichen Praxis in dem Fachgebiet gehören, auf das sich die Erfindung bezieht, und die auf die wesentlichen Merkmale angewendet werden können, die nachfolgend im Bereich der beigefügten Patentansprüche dargelegt sind.
Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlicher in den folgenden nicht-beschränkenden Beispielen und den begleitenden Abbildungen beschrieben werden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Wirkung von IL6R-IL6 auf Myelinisierung und Remyelinisierung in vitro
Im Rückenmark umfasst die hintere Spinalwurzel essentielle sensorische Neuronen, die Synapsen in den Spinalganglien (DRG) bilden. Während der Embryogenese der Maus (an den Tagen e14–e15) stellen DRGs eine geeignete Quelle an Neuronen und embryonalen Schwann-Zellen dar, die sich noch nicht in myelinisierende SC differenziert haben. Verfahren, um Explantate (kleine Gewebefragmente) von DRGs für in vitro Kulturen zu erhalten, werden von Li (1998) beschrieben. Die Kulturen wurden auf Glasobjektträgern durchgeführt, die in die Vertiefungen (wells) von Costar-Platten im Medium F12/DMEM (Gibco) übertragen wurden. Die Objektträger waren entweder mit Collagen oder mit poly-D-Lysin überzogen und ergaben im wesentlichen ähnliche Ergebnisse. Die Kulturen wurden entweder in einem Medium ohne Wachstumsfaktor oder Zytokinzugaben oder in einem Medium, das mit Nervenwachstumsfaktor (NGF, 40 ng/ml) ergänzt wurde, oder in einem Medium, das mit IL6R-IL6-chimärischen rekombinanten Proteinen (3 μg/ml) ergänzt wurde, ausgeführt. Die Kulturen wurden täglich mittels Lichtmikroskopie mit einem Olympus-Umkehrmikroskop, das mit einem Videokamera-Bildsystem (Leica LIDA-System) verbunden war, überprüft. Ein Teil der Objektträger wurde in Paraformaldehyd fixiert und MBP-Proteine wurden mit monoklonalen primären Antikörpern gegen Myelinbasisproteine und Fluoresceinkonjugierten sekundären Antikörpern markiert. Neuronale Zellkörper und Axone wurden mit Antikörpern gegen das Neurofilament-Protein gefärbt. Einige der Objektträger wurden mittels Raster-Elektronenmikroskopie (EM) überprüft.
Nach 2 bis 5 Tagen zeigten die DRG-Explantate, die ohne Zugabe kultiviert wurden, dass die aus dem Explantat ausgewachsenen Zellen entweder polygonal oder ovalförmig waren. Wenn NGF hinzugefügt wurde, entwickelten jedoch die ovalförmigen Zellen lange axonale Verlängerungen, die ein dünnes durch Antikörper gegen Neurofilamente gefärbtes Netzwerk bildeten. Einige der Axone waren lang und gabelten sich, aber es konnten keine Schwann-Zellen entlang der Axone beobachtet werden. Im Gegensatz dazu zeigten Kulturen mit IL6R-IL6 nicht nur neuronale Zellen mit Axonen, die für Neurofilamente gefärbt wurden, sondern auch Schwann-Zellen, die als flache Zellen erschienen, und die lange bipolare Ausläufer mit endständigen Verzweigungen aufwiesen. Diese Ausläufer wurden nicht für Neurofilamentproteine gefärbt. Mittels Rasterelektronenmikroskopie wurden diese Schwann-Zellen deutlich entlang der axonalen Verlängerungen beobachtet, mit Membrankrausen (membrane rufflings), die begannen, sich um das Axon herumzuwickeln.
Das Anfärben mit Anti-MBP zeigte positiv gefärbte Schwann-Zellen in den IL6R-IL6-behandelten Kulturen, insbesondere von Zellen, die eine nach der anderen angeordnet waren. Andererseits wurde wenig MBP-spezifische Fluoreszenz in den NGF-behandelten Kulturen ohne IL6R-IL6 gesehen.
Ähnliche Ergebnisse wurden bei DRG-Kulturen aus e15 Rattenembryonen beobachtet.
Schwann-Zellen, die von den Ischiasnerven der Maus abstammen, wurden ebenso in vitro mit IL6R-IL6 1,4 μg/ml kultiviert und das Niveau des MBP-RNA-Transkripts wurde gemessen. Im Vergleich dazu, wurden die gleichen Kulturen mit Forskolin 20 μM behandelt, einer Chemikalie, die das zyklische AMP-Niveau in den Zellen künstlich erhöht und dafür bekannt ist, MBP zu induzieren (Lemke und Chao, 1988). Die Ergebnisse zeigten, dass IL6R-IL6 genauso wirksam war wie Forskolin, um die MBP-Genexpression zu induzieren, und noch wirksamer, um die MBP-RNA-Niveaus nach 3 Tagen Kultivierung aufrechtzuerhalten (1).
In einer Studie in 18 Tage alten embryonalen Spinalganglien (DRG)-Zellen wurde herausgefunden, dass die IL6-Chimäre die MBP- und P0-mRNA-Expression innerhalb von 3 Tagen induziert, wohingegen Pax-3-mRNA in demselben Zellsystem stark gehemmt wurde. Eine dosisabhängige Kurve der Wirkung der IL6-Chimäre auf die P0 und MBP-Genexpression zeigt eine maximale Wirkung der IL6-Chimäre bei 500 ng/ml. Die IL6-Chimäre erscheint daher als ein wichtiger Induktor der Myelin-Genexpression in normalen Neurogliazellen.
Schwann-Zelllinien, die vom Ischiasnerv von Ratten oder von Spinalganglien (DRG)-Zellen von Ratten erhalten wurden, wurden hergestellt, um weiter die Wirkungen der IL6-Chimäre zu studieren.
Es wurde herausgefunden, dass die vom Ischiasnerv von Ratten abstammende Schwann-Zelllinie auf die IL6-Chimäre mit einer mittels RT-PCR und Northern-Blot-Analyse bestimmten 2–3-fachen P0-Geninduktion antwortet, deren Proteinprodukt ungefähr 50 % des peripheren Nervenmyelins bildet.
Um die transkriptionale Aktivierung der Myelin-Genkomponenten durch die IL6-Chimäre zu studieren, wurde der MBP-Promotor in einen Expressionsvektor stromaufwärts des Luziferase-Reportergens eingebracht und in der Schwann-Zelllinie des Ischiasnervs von Ratten überprüft. Eine bis zu 7-fache Induktion der transkriptionalen Aktivität des MBP-Promotors wurde als Antwort auf die IL6-Chimäre in diesen Zellen in der Abwesenheit von Forskolin beobachtet. In einem zusätzlichen Reportergen-Assay wurde herausgefunden, dass die IL6-Chimäre eine 2,5fache Induktion der Transkription des Promotors des P0-Gens in diesen Zellen induziert.
Die vorstehenden Ergebnisse deuten darauf hin, dass die IL6-Chimäre eine direkte Wirkung auf die Myelin-Gentranskription in determinierten Schwann-Zellen hat.
Eine zusätzliche Schwann-Zelllinie wurde aus dem Spinalganglion (DRG) von Ratten isoliert und „CH-Zelllinie" genannt. Über diese Zelllinie wurde herausgefunden, dass sie eine langsame Wachstumsrate hat und ihr Wachstum von der IL6-Chimäre (140 ng/ml) abhängig ist. Interessanterweise hatten die CH-Zellen eine sternförmige Morphologie, die der von Oligodendrozyten ähnelte. Die Zellen schienen bezogen auf die Induktion der Myelinisierung durch die IL6-Chimäre funktional zu sein. Die Zellen exprimierten P0 und MBP und starben ab, wenn sie in einem Serum-haltigen Medium in Abwesenheit der Chimäre gezüchtet wurden.
Beispiel 2: Hemmung der Oligodendrozytenproliferation in vitro
Die Wirkungen der IL6-Chimäre wurden an Zellen des zentralen Nervensystems untersucht. Es ist bekannt, dass die Differenzierung der Oligodendrozyten mit der Hemmung ihrer Proliferation einhergeht und daher die Scheidenbildung und Myelinisierung durch Oligodendrozyten unterstützt.
Folglich wurde die Fähigkeit der IL6R-IL6-Chimäre, die Proliferation von Oligodendrozyten zu inhibieren, in vitro getestet. Für diesen Versuch wurde eine primäre Oligodendrozyten (Oligodendroglia)-Zelllinie der Maus, die mit dem t-neu-Onkogen („Oli-neu"-Zelllinie) immortalisiert wurde, verwendet. Die Etablierung und die Eigenschaften der Oli-neu-Zelllinie sowie die Kultivierungsbedingungen werden von Jung et al. (1995) beschrieben.
Die Proliferation der undifferenzierten Oli-neu-Zellen wurde nach 1, 2 und 3 Tagen als Antwort auf verschiedene Mengen der IL6R-IL6-Chimäre (1μg/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml und 0 ng/ml (Kontrolle)) gemessen. Die Wachstumsrate wurde durch Messen der zellulären Stoffwechselaktivität mit einem fluorometrischen/colorimetrischen Wachstumsindikator, Alamar Blue, quantifiziert. Dieser Wirkstoff enthält einen Oxidations-Reduktions-Indikator, der sowohl Fluoreszenz zeigt als auch seine Farbe als Antwort auf die aus dem Zellwachstum resultierende chemische Reduktion des Wachstumsmediums ändert. Der verwendete Wirkstoff und Assay werden von Ahmed et al. (1994) und in dem US-Patent 5,501,959 beschrieben.
Die Ergebnisse werden in 2 gezeigt. Die Zugabe der IL6R-IL6-Chimäre zu dem Kulturmedium der Oligodendrozyten führte zu einer deutlichen Reduzierung des Wachstums bereits nach 48 Stunden. Nach 72 Stunden war das Wachstum auf 40 bis 50 % im Vergleich zur Kontrolle reduziert. Interessanterweise war die höchste Menge an IL6R-IL6-Chimäre (1 μg) weniger wirksam als die niedrigeren Mengen von 500 bis 125 ng/ml.
Dieser Versuch zeigt, dass die IL6R-IL6-Chimäre die Proliferation der Oligodendrozyten in vitro stark inhibiert, was anzeigt, dass sie ein Promotor der Differenzierung von Oligodendrozyten ist. Da Oligodendrozyten die Gliazellen sind, die Myelinscheiden im ZNS produzieren, kann die IL6R-IL6-Chimäre ein Wirkstoff sein, der aktiv Remyelinisierung in vivo unterstützt.
Beispiel 3: Einfluss der IL6R-IL6-Chimäre auf Oligodendrozytenmorphologie
Um die Wirkung der IL6-Chimäre auf die Morphologie von Oligodendroglia zu untersuchen, wurden Oli-neu-Zellen (siehe Beispiel 2) in Gegenwart von 1 μg/ml der IL6R-IL6-Chimäre für 3 Tage kultiviert.
Dibutyl-cAMP (dbcAMP) ist ein Wirkstoff, der bekannt dafür ist, die Differenzierung in Oligodendrozyten zu induzieren (siehe z.B. Jung et al. (1995)). Um zu überprüfen, welche morphologische Wirkung die IL6R-IL6-Chimäre der Wirkung von dbcAMP hinzufügt, wurden Oli-neu-Zellen vor der Zugabe der IL6R-IL6-Chimäre plus dbcAMP für 3 Tage mit dbcAMP vorbehandelt. Gleichzeitig wurden Zellen mit der IL6R-IL6-Chimäre ohne Vorbehandlung behandelt.
Änderungen der Morphologie wurden mittels Phasenkontrastmikroskopie oder mittels Immunohistochemie-Färbung für die Oligodendrozyten-Marker CNPase (2',3'-Cyclonucleosid-3'-phosphodiesterase) und GalC (Sialoganglioside und Sulfatide) und unter Verwendung des Antikörpers A2B5, der für das Myelinlipid Galactocerebrosid spezifisch ist, bewertet.
Die Zugabe der IL6R-IL6-Chimäre induzierte deutliche morphologische Veränderungen in den Oli-neu-Zellen. Zellkörper sammelten sich in Reihen an und ihre Fortsätze wurden länger. Die Zellen selber wurden länger und schienen fusioniert zu sein, was einen fortgeschrittenen Zustand der Differenzierung anzeigt.
Die Expression der Oligodendrozyten-Marker wurde mittels Immunohistochemie gezeigt. Die Zellen waren positiv für die Oligodendrozyten-spezifischen Marker A2B5-Antigen und CNPase, aber negativ für den Astroglia-Marker GFAP, was zeigt, dass der Phänotyp der Oligodendrozyten tatsächlich erhalten blieb.
Die DbcAMP-Vorbehandlung und kombinierte Behandlung mit der IL6R-IL6-Chimäre und dbcAMP erhöhte die Anzahl der Scheiden-bildenden Oligodendrozyten nach 3 Tagen. Neben verlängerten Zellen, die mit der IL6R-IL6-Chimäre allein auftraten, sah die Morphologie der Zellen sogar noch differenzierter aus. Zellen mit einer blattähnlichen Form konnten beobachtet werden, was einen fortgeschrittenen Differenzierungszustand anzeigt.
Als Schlussfolgerung führte die Behandlung mit der IL6R-IL6-Chimäre zu einer morphologischen Veränderung der Oligodendrozyten in vitro, was ihre Rolle als ein Induktor der Oligodendroglia-Differenzierung und -Myelinisierung weiter unterstützt.
Beispiel 4: Wirkungen der IL6-Chimäre auf neuronale Schwann-Zellinteraktion
Durch Kultivieren von Maus-DRG in Anwesenheit der DNA-Syntheseinhibitoren ArabinoseC (AraC) und Fluordesoxyuridin (FudR) können neuronale Zellen Axone entwickeln, wohingegen die Gliazell-Proliferation inhibiert ist. Diese DRG-Kulturen können als eine Quelle von neuronalen Zellen mit nicht-myelinisierten Axonen verwendet werden. Schwann-Zellen werden exogen zu diesen Kulturen hinzugefügt, um die Interaktion zwischen Neuronen und Schwann-Zellen zu untersuchen.
Ischiasnerv-Schwann'-Zelllinienzellen von Ratten wurden mit Fluorogold markiert, einem Marker, der in die Zellmembranlipiddoppelschicht eindringt und für eine lange Zeitdauer erhalten bleibt, ohne die Zellfunktion zu beeinträchtigen. Die Co-Kultivierung der neuronalen Zellen mit diesen Schwann-Zellen in Anwesenheit der IL6-Chimäre führt zu einem wesentlichen Anstieg der Bindung der Schwann-Zellen entlang der Axonzellen innerhalb 5 Stunden. Die Zellen werden länger und nach ein paar Tagen kann man sehen, dass ihr fluoreszierendes Cytoplasma eine reguläre Scheide um die Axone bildet. Ohne die Chimäre oder mit NGF binden die Schwann-Zellen weit weniger und bilden keine Scheide. Diese Ergebnisse zeigen, dass die IL6-Chimäre eine sehr schnelle Wirkung auf die Interaktion der Gliazellen mit Neuronen besitzt, und deuten darauf hin, dass Adhäsionsmoleküle induziert oder aktiviert sind. Dieses System erlaubt es, die verschiedenen, durch die IL6-Chimäre beeinflussten Schritte des Myelinisierungsprozesses zu untersuchen.
Beispiel 5: Wirkung der IL6R-IL6-Chimäre auf die Myelinisierung in gemischten Kulturen aus Neuronen und Oligodendrozyten
Um weiterhin die Myelinisierungs-induzierende Aktivität der IL6R-IL6-Chimäre zu überprüfen, wurden getrennte Kulturen aus Großhirnhälften der Maus am E15 (Embryonaltag 15) hergestellt. Die Herstellung und Kulturbedingungen werden von Lubetzki et al. (1993) beschrieben. Die Primärzellen wurden für 8 Tage in Kultur gehalten, bevor IL6R-IL6 (1,5 μg/ml) für 11 Tage zugegeben wurde.
MBP (Myelinbasisprotein) und das Oligodendrozyten-spezifische Protein PLP (ProteoLipid Protein) sind Marker für reife und/oder myelinisierende Oligodendrozyten und sind die Hauptbestandteile des ZNS-Myelins. Sie können daher als Marker für die Bewertung der aktiven Myelinisierung, die in der Zellkultur stattfindet, verwendet werden.
Unter den Bedingungen der Kultur ist am Tag 4 keine Myelinisierung zu sehen. Daher wurde die Tag 4-mRNA als eine Eichkontrolle in diesem Versuch verwendet. Am Tag 19 wurde unter den Kulturbedingungen eine Myelinisierung in der Zellkultur beobachtet.
So wurde an den Tagen 4 und 19 mRNA aus behandelten und nicht-behandelten Vertiefungen extrahiert, um MBP und PLP-mRNA zu quantifizieren.
Die mRNAs für MBP, PLP und GAPDH, die als eine interne Kontroll-RNA dienten, wurden durch quantitative Echtzeit-RT-PCR gemessen (Medhurst et al (2000)), wobei ein PE Applied Biosystems Prism Modell 7700 Sequenzerkennungsgerät verwendet wurde.
Die Ergebnisse werden nachfolgend in Tabelle 1 zusammengefasst. Zwei unabhängige Versuche wurden ausgeführt. Die mRNA-Expression ist als Vielfaches der Expression der Kontroll-RNA an Tag 4 gezeigt. In beiden Versuchen steigerte die IL6R-IL6-Chimäre deutlich die Expression von MBP und BLP um ein Zweifaches, was die Rolle der IL6R-IL6-Chimäre als ein Induktor oder Verstärker der Myelinisierung wiederum unterstützt.
Tabelle 1: MBP- und PLP-Expression in primären kortikalen Kulturen
Als Schlussfolgerung zeigen die Beispiele 1 bis 5, dass die IL6R-IL6-Chimäre eine antiproliferative Differenzierungs- und Myelinisierungs-induzierende Aktivität aufweist. Diese Aktivität der IL6R-IL6-Chimäre deutet stark darauf hin, dass die IL6R-IL6-Chimäre eine nützliche Wirkung in der Remyelinisierung des peripheren und zentralen Nervensystems hat. Diese Wirkung kann für alle Störungen, die auf Myelinisierungsdefekten, Demyelinisierung oder ungenügender Myelinisierung der Nerven des ZNS oder PNS basieren, ausgenutzt werden. Die IL6R-IL6-Chimäre kann folglich ein wirksamer Wirkstoff sein, um Re- und/oder Demyelinisierungsstörungen, wie z.B. Multiple Sklerose, zu behandeln.
Beispiel 6: Die Wirkung der IL6-Chimäre auf periphere Nervenregeneration in vivo
Nach einer Axotomie des Ischiasnervs bei Ratten und dem Nebeneinanderstellen von proximalen und distalen Enden bzw. Stümpfen, können periphere Nerven induziert werden, zu regenerieren und durchgeschnittene Fasern können induziert werden in vivo zu remyelinisieren (Sahenk et al. 1994). Die Wirkung der IL6-Chimäre auf Remyelinisierung von peripheren Nerven nach einer Axotomie wurde untersucht. Den Ratten (7 Tiere) wurde, beginnend mit dem Tag der Operation, jeden zweiten Tag die sIL6-IL6-Chimäre intraperitonal in einer Dosis von 100 μg/kg für 12 Tage verabreicht. Kontrolltieren (9 Ratten) wurde PBS injiziert. Nach 12 Tagen wurden Schnitte der regenerierenden Nerven 2,5 und 5 mm unterhalb der Axotomie mittels Transmissionselektronenmikroskopie analysiert und die Anzahl der positiven Fasern wurde bewertet.
In Anwesenheit der IL6-Chimäre wurde ein 2,5-facher Anstieg der Anzahl an myelinisierten Fasern in einem Abstand von 2,5 mm unterhalb der Axotomie, verglichen zu PBS-behandelten Kontrollen, gefunden.
Es wurde weiter herausgefunden, dass die Chimäre die Remyelinisierung von weiter entfernten Fasern erhöhte und dabei einen 5,2-fachen Anstieg der Anzahl von myelinisierten Fasern 5 mm distal zu dem Schnitt induzierte. Das ist wichtig, da die Remyelinisierung abnimmt, wenn der Abstand von dem Schnitt zunimmt. Wirkungen von CNTF wurden 0,5 mm von dem Schnitt entfernt beobachtet, aber mit der IL6-Chimäre scheint die Wirkung stark erweitert und bei 5 mm größer als bei 2,5 mm zu sein. Auch nahm die Dicke der myelinisierten Fasern nach einer Behandlung mit der Chimäre um mehr als das 2-fache zu. Insgesamt scheint die IL6-Chimäre eine Remyelinisierung von ungefähr 10 % der Fasern im Vergleich zu intakten nicht-axotomisierten Ratten zu induzieren.
Beispiel 7: Induktion des MPB-Gens durch IL6R-IL6 in Kulturen aus B16-F10.9-Melanomzellen
Der embryonale Ursprung von Hautmelanozyten, die die Melaninpigmente herstellen, und der von Schwann-Zellen liegt in gemeinsamen Vorläuferzellen, die aus der Neuralleiste in e8-Mausembryonen auswandern. Melanome sind bösartige Tumoren, die sich in der Haut aus Melanozyten entwickeln, und stammen daher ebenso von Neuralleisten-Vorfahren ab. Die B16-Zelllinie ist aus einem spontanen Melanom der Balb/c-Maus abgeleitet und der F10.9-Klon wurde aus B16 wegen seines sehr bösartigen Metastasen-Phänotyps isoliert. Die F10.9-Zellen stellen, wie andere B16-Zellen, schwarzes Eumelaninpigment her und sind reich an Tyrosinase, dem ersten Enzym des melanogenen Stoffwechselweges (Bertolotto et al., 1996).
Die F10.9-Zellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen zu 30.000 Zellen/Vertiefung eingesät und für 3 Tage in DMEM-Medium mit 10% FCS kultiviert, ohne oder mit IL6R-IL6 in Konzentrationen von 0,3–1 μg/ml. Gesamtzell-RNA wurde extrahiert und mittels Northern-Blot mit cDNA-Sonden für MBP analysiert. Die MBP- mRNAs wurden in den F10.9-Zellen mittels IL6R-IL6 bei 48 (Stunden) sehr stark induziert (3A). Eine Zeitverlaufsstudie zeigte, dass der Anstieg der MBP-RNA 12 Stunden nach der Zugabe der IL6R-IL6-Chimäre zu den Zellkulturen begann.
Die IL6R-IL6-Chimäre induziert nicht nur die MBP-Genexpression, sondern ebenso die 2'3'-Cyclo-AMP-Phosphodiesterase oder CNPase, die eine weitere Komponente des Myelins und ein Marker für differenzierte Schwann-Zellen ist. Die Zellen entwickelten ebenso verlängerte Ausläufer an entgegengesetzten Polen des Zellkörpers und ordneten sich in langen Reihen an, wie sie für Schwann-Zellen in Kulturen typisch sind.
Überraschenderweise schaltete IL6R-IL6 den Phänotyp der F10.9-Zellen von Melaninproduzierenden Zellen in Myelin-produzierende Schwann-Zellen um. Die Tyrosinase-Enzymaktivität und die Herstellung von Melanin waren 48 Stunden nach Zugabe der IL6R-IL6-Chimäre zu den Zellen vollständig verloren.
MITF ist ein Transkriptionsfaktor, der das Tyrosinase-Gen aktiviert (Bertolotto et al. 1996). Die Behandlung der F10.9-Zellen durch IL6R-IL6 reprimierte die MITF-Genexpression stark. MITF selbst wird durch den homöotischen Transkriptionsfaktor Pax-3 transaktiviert (Watanabe et al. 1998) und Messungen der Pax-3-mRNA in den IL6R-IL6-behandelten F10.9-Zellen zeigten, dass Pax-3-Expression beginnend ab 6 Stunden bis zu 48 Stunden abnimmt (3B). Pax-3 ist bekannt dafür, das MBP-Gen zu reprimieren (Kioussi und Gruss, 1996). Die Wirkung der IL6R-IL6-Chimäre kann daher einer genregulatorischen Wirkung auf das Pax-3-Homöobox-Gen zugeschrieben werden, das während der Entwicklung der embryonalen Schwann-Zellen vor der Myelinisierung exprimiert wird und reprimiert werden muss, damit eine Myelinisierung auftreten kann. Weiterhin wird Pax-3 in degenerierenden demyelinisierenden Nerven in den Schwann-Zellen re-exprimiert, wenn diese Zellen aufhören, MPB herzustellen. Daher ist es von großer Bedeutung, dass IL6R-IL6 sowohl Pax-3 reprimieren, als auch die Differenzierung der Schwann-Zellen in myelinisierende Zellen durch Induzieren der Myelinproteingene verursachen kann.
Beispiel 8: Injektionen von IL6R-IL6 in einem Mausmodell der chronisch wiederkehrenden Multiplen Sklerose
Mäuse des SJL/J-Stamms entwickeln experimentelle Autoimmunencephalomyelitis (EAE) nach einer Immunisierung mit 0,4 mg Rinder-MBP in inkomplettem Freund'schen Adjuvans, enthaltend 60 μg Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco). Die Erkrankung kann passiv auf syngene Empfänger durch intravenöse Injektion von 30 Millionen Lymphknotenzellen, die 10 Tage nach der Immunisierung entnommen wurden, übertragen werden. Die klinischen Zeichen der Lähmung erscheinen nach einer Woche bis zu 10 Tagen. Auf eine akute Phase der Erkrankung folgen später Remissionen und Rückfälle. IL6R-IL6 wird diesen Mäusen intraperitonal oder subkutan in einer Dosis von 1, 3 und 5 μg pro Maus (Körpergewicht ungefähr 25 g) injiziert. Die Injektionen werden 4 Mal pro Woche für mindestens 3 Wochen gegeben, beginnend entweder an Tag 3 oder Tag 7 nach dem passiven Transfer. Die klinische Bewertung der Tiere folgt und wird eingestuft als: 1) Verlust der Rigidität des Schwanzes; 2) Schwäche der hinteren Extremität; 3) Extremitätenlähmung auf einer Seite; 4) Extremitätenlähmung auf beiden Seiten; 5) Lethalität. Das Gehirn und Rückenmark der Tiere wird nach der Färbung des Myelins mit Luxol fast blue mittels Lichtmikroskopie untersucht. Die Wirkung des IL6R-IL6 auf die Reduzierung der klinischen Einstufung und die Reduzierung der Demyelinisierung der weißen Gehirnsubstanz kann bestimmt werden.
Beispiel 9: Neuroprotektive Wirkung der IL6-Chimäre auf neuronale und Oligodendroglia-Neurozytotoxizität
Organotypische Kulturen stellen eine einzigartige Strategie dar, mit der viele Aspekte der Gehirnphysiologie und -pathologie untersucht werden können. Langzeitschnittkulturen des Hippokampus, einer Region, die an der Gedächtniskodierung beteiligt ist, und die eine frühe Degeneration bei Alzheimer-Krankheit und Ischämie aufweist, sind besonders nützlich in diesem Bezug aufgrund ihrer Expression der synaptischen Plastizitätsmechanismen (z.B. Langzeit-Potenzierung) und Empfindlichkeit gegenüber pathologischen Einwirkungen (z.B. Exzitotoxizität).
Die Kulturen wurden, wie bereits früher von Bahr et al. (Bahr 1995) beschrieben, mit geringen Veränderungen hergestellt. Hippokampi wurden von 8 Tage alten Wistar-Ratten herausgenommen und 400 μm dicke Scheiben wurden auf eine poröse und transparente Millizell-CM-Membran (Millipore) gelegt und in Multiwellplatten mit 6 Vertiefungen kultiviert. Auf jede Membran wurden vier Scheiben gelegt. Das Kulturmedium bestand aus 50 % minimalem essentiellen Medium (+ 25 mM HEPES, + 4 mM NaHCO₃ + NaOH, pH 7,2), 25 % Pferdeserum und 25 % Hank'sche Lösung, Glukose (6,4 g/l), Penicillin/Streptomycin (10 ml/l), L-Glutamin (2 mM). Kulturen wurden bei einer Temperatur von 37°C für mindestens 3 Wochen in einem 5 % CO₂-Inkubator gehalten, bevor sie verwendet wurden. Das Medium wurde jede Woche gewechselt.
Hippokampale Schnitte wurden dem IL6 oder der IL6-Chimäre bei Konzentrationen im Bereich von 10 pg/ml bis 10 μg/ml für 15 Minuten ausgesetzt, anschließend wurde 50 μM NMDA für zusätzliche 30 Minuten hinzugefügt. Die Kulturen wurden in frisches Medium mit oder ohne IL6 oder der IL6-Chimäre überführt. Mindestens vier Scheiben wurden für jeden Versuchspunkt verwendet. NMDA-induzierter Zelltod wurde entweder einen oder 3–7 Tage nach der experimentellen Verletzung mittels Inkubieren der Kulturen für 1 Stunde in frischem Medium, das Propidiumiodid (PI 5 μl/ml) enthielt, bewertet. Aufgrund seiner hydrophilen Eigenschaft geht PI in zerstörte Zellen und bindet an das Chromatin des Kerns. Die abgestrahlte rote Fluoreszenz (Marker für Zelltod) wurde unter Verwendung eines Fluoreszenz-Umkehrmikroskops (Zeiss) in Verbindung mit einer intensivierten CCD-Kamera (intensified charged-coupled device camera) untersucht. Eine Quantifizierung der Gesamtfluoreszenz wurde durch ein Bildanalysensystem (Image Pro Plus) durchgeführt.
Es wurde festgestellt, dass sowohl IL6 als auch die IL6-Chimäre vor NMDA-induziertem hippokampalen Zelltod schützen. Es wurde festgestellt, dass nach einem Tag in Kultur IL6 bei einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 10 ng/ml ungefähr 50 % bzw. 30 % der neuronalen Zellen schützt, während die IL6-Chimäre bei einer Konzentration im Bereich von 0,05 bis 1 pg/ml ungefähr 40 %–75 % der neuronalen Zellen schützt. Die maximale Schutzwirkung der IL6-Chimäre (Schutz von 75 % der Zellen) wurde bei einer Konzentration von 0,5 pg/ml beobachtet (3).
Es wurde festgestellt, dass die protektiven Wirkungen von IL6 mit der Zeit abnehmen. Die Lebensfähigkeit der neuronalen Zellen verringerte sich nach der Behandlung und nach zwei Tagen wurde die protektive Wirkung von IL6 nur mit der Konzentration von 0,1 ng/ml des IL6 mit einer Schutzwirkung bei nur 30 % der Zellen an Tag 5 beibehalten. Im Gegensatz hierzu hatte die IL6-Chimäre bei einer Konzentration von 0,5 pg/ml eine verlängerte protektive Wirkung und ungefähr 60 % der Zellen wurden für 5 Tage (4) aufrechterhalten.
Die Anwesenheit der Oligodendrozyten in den organotypischen Schnitten wurde durch immunohistologisches Färben mit Gal-C bestimmt, einem spezifischen Oligodendrozytenmarker. Nach 2–3 Wochen wurden in vitro organotypische Schnitte für 30 Minuten 50 μM NMDA ausgesetzt, was den nekrotischen Zelltod der in diesen Kulturen vorliegenden Zellen induziert. Tatsächlich geht, wie durch RT-PCR bestimmt wurde, nach einer Behandlung mit NMDA jegliche MBP-Expression, die für Oligodendrozyten charakteristisch ist, in diesen Kulturen verloren.
Die Aktivierung von ionotropen Glutamat-Rezeptoren stellt das Primärereignis in dem Neurotoxizitätsprozess, der durch exzitatorische Aminosäuren ausgelöst wird, dar. Primärkulturen aus Kleinhirnneuronen von neugeborenen Ratten (welche > 97 % Neuronen enthalten) wurden für die Untersuchung der Wirkungen der IL6-Chimäre auf die Glutamat-induzierte Neurotoxizität eingesetzt und mit den Wirkungen von IL6 verglichen.
Primärkulturen von Kleinhirnkörnerzellen wurden von 8 Tage alten Sprague-Dawley-Rattenbabies, wie vorher beschrieben (Pizzi et al. 1993), hergestellt. Die Zellen wurden auf poly-L-Lysin-überzogene Schalen ausplattiert und in Eagle-Basalmedium, das 10 % Hitze-inaktiviertes fötales Rinderserum, Glutamin (2 mM), Gentamicin (50 μg/ml) und KCl (25 mM) enthielt, bei einer Dichte von 2,5 × 10⁵ Zellen/cm² kultiviert. Cytosin-Arabinosid (10 μM) wurde 18 Stunden nach dem Einsäen zu den Kulturen hinzugefügt, um eine nicht-neuronale Zellproliferation zu verhindern. Die Versuche wurden nach Kultivierung der Neuronen für 10 Tage ausgeführt.
Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden die Kulturen für 15 Minuten 50 μM Glutamat in einer Mg²+-freien Locke-Lösung ausgesetzt. IL6 oder die IL6-Chimäre wurden 5 Minuten vor der Glutamat-Behandlung hinzugefügt. Die Schalen wurden dann zu konditioniertem Kulturmedium bei 37°C in 95 % Luft/5 % CO₂ zurückgebracht und die Lebensfähigkeit der Zellen wurde 18–24 Stunden später gemessen.
Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde 18 Stunden später durch intravitale Färbung mit einem Gemisch aus Fluorescein-Diacetat und Propidiumiodid bewertet, wie vorher beschrieben (Pizzi et al. 1993). Der Prozentsatz der überlebenden Neuronen in der einlagigen Schicht wurde durch Bewerten des Verhältnisses zwischen der Fluorescein-Diacetat- (grüne lebensfähige Zellen) und Fluorescein-Diacetat plus Propidiumiodid-Färbung (Gesamtzellen) in Mikroaufnahmen von drei repräsentativen Gebieten aus jeder einlagigen Schicht berechnet. Die Werte wurden aus drei gleichartigen Schalen entnommen.
Während keine protektive Wirkung auf Kleinhirnkörnerzellen von Ratten mit IL6 bei einer Dosis im Bereich von 0,1 bis 10 ng/ml induziert wurde, schützten 0,1 pg/ml bzw. 1pg/ml der IL6-Chimäre 40–20 % der neuronalen Zellen vor Glutamat-induzierter Neurotoxizität.
Beispiel 10: Wirkung der IL6R-IL6-Chimäre auf das Überleben von oberen Halsganglienneuronen nach NGF-Wegnahme
Die durch die IL6R-IL6-Chimäre ausgeübte neuroprotektive Wirkung, wurde auch in einem peripheren neuronalen Kultursystem untersucht.
Die oberen Halsganglienneuronen (SCG-Neuronen) wurden aus oberen Halsganglien von Ratten zum Zeitpunkt P0–P3 (postnatale Tage 0 bis 3) isoliert. Die Neuronen wurden für 4 Tage in einem Medium, das 5 % Rattenserum und NGF enthielt, gehalten. NGF wird von den Neuronen für das Überleben benötigt, wohingegen NFG-Entzug dazu führt, dass die Zellen aufgrund der Induktion der Apoptose sterben. Das Ursprungsmedium wurde durch NGF-freies Medium, das neutralisierende Antikörper gegen den Wachstumsfaktor enthielt, ausgetauscht. Zu diesem Zeitpunkt wurden 0,1 oder 1 μg/ml IL6R-IL6-Chimäre in 1 % DMSO Endkonzentration hinzugefügt. Die Kultur wurde für 24 Stunden bei 37°C gehalten.
Die Wirkung der IR6R-IL6-Chimäre auf das Überleben der Neuronen, denen NFG entzogen wurde, nach 24 Stunden der Behandlung wurde mittels Mikroskopie sowie mittels der mitochondrialen Aktivität der Zellen, gemessen mittels MTT-Assay, der ausführlich von Mosmann (1983) beschrieben wird, bewertet. Die Konzentrationen der IL6R-IL6-Chimäre, die verwendet wurden, zeigten keine toxische oder morphologische Wirkung auf die mit NGF behandelten SCG-Neuronen.
Die Zugabe der IL6R-IL6-Chimäre in Konzentrationen von 100 ng/ml und 1 μg/ml rettete bis zu 40 % der SCG-Neuronen vor dem neuronalen Tod, der durch NGF-Entzug induziert wurde, wie aus den Ergebnissen des MTT-Assays (6) entnommen werden kann. Daher besitzt die IL6R-IL6-Chimäre eine neuroprotektive Wirkung auf periphere Neuronen, was auf eine Aktivität in neurodegenerativen Erkrankungen, wie z.B. Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit oder ALS (Amyotrophe Lateralsklerose) hindeutet.
Da die Erfindung nunmehr vollständig beschrieben wurde, ist dem Fachmann klar, dass dieselbe innerhalb eines breiten Bereiches von äquivalenten Parametern, Konzentrationen und Bedingungen ohne unangemessenes Experimentieren durchgeführt werden kann.
Referenzen

Abramsky, O. and Ovadia, H. (1997) Frontiers in Multiple Sclerosis, clinical research and therapy. Martin Dunitz publisher, London.
Ahmed S.A., Gogal, R.M., Jr., Walsh, J.E. (1994) A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation. J. of Immunol. Methods 170, 211–224
Anderson, D.J. (1997) Cellular and molecular biology of neural crest cell lineage determination. Trends Genet. 13, 276–280.
Bahr, B.A. (1995). Long-term hippocampal slices: a model system for investigating synaptic mechanisms and pathologic processes. J Neurosci Res, 42, 294–305.
Bertolotto, C., Bille, K., Ortonne, J.P. and Ballotti, R. (1996) Regulation of tyrosinase gene expression by cAMP in B 16 melanoma involves two CATGTG motifs surrounding the TATA box: implication ofthe microphtalmia gene product. J. Cell. Biol. 134, 747–755.
Bonni A, Sun Y, Nadal-Vicens M, Bhatt A, Frank DA, Rozovsky I, Stahl N, Yancopoulos GD, Greenberg ME (1997) Regulation of gliogenesis in the central nervous system by the JAK-STAT signaling pathway. Science 278, 477–483
Cannella, B., Hobam, C.J. Gao, Y.L. et al (1998) The neuregulin, glial growth factor 2, diminishes autoimmune demyelination and enhances remyelination in a chronic relapsing model for Multiple Sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 10100–10105.
Chebath, J., Fischer, D., Kumar, A., Oh, J.W., Kollet, O., Lapidot, T., Fischer, M., Rose-John, S., Nagler, A., Slavin, S. and Revel, M. (1997) Interleukin-6 receptor- Interleukin-6 fusion proteins with enhanced Interleukin-6 type pleiotropic activities. Eur. Cytokine Netw. 8, 359–365.
Chen, L.E., Liu, K., Seaber, A. V., Katragadda, S., Kirk, C and Urbaniak, J.R. (1998) Recombinant human glial growth factor 2 (rhGGF2) improves functional recovery of crushed peripheral nerve (a double-blind study). Neurochem. Int., 33, 341–351.
Fraser, S.E. and Bronner-Fraser, M. (1991). Migrating neural crest cells in the trunk of the avian embryo are multipotent. Development 112. 913–920.
Gadient, R.A. and Otten, U.H. (1997) Interleukin-6 (IL-6) – A molecule with both beneficial and destructive potentials. Prog. Neurobiol., 52, 379–390.
Hartung, H.P., van der Meche, F.G/, Pollard, J.D. (1998) Guilain-Barre syndrome, CIDP and other chronic immune-mediated neuropathies. Curr. Opin. Neurol., 11, 497–513
Hirota, H., Kiyama, H., Kishimoto, T. and Taga, T. (1996) Accelerated nerve regeneration in mice by upregulated expression of Interleukin (IL) 6 and IL-6 receptor after trauma. J. Exp. Med., 183, 2627–2634.
Ho, P.R., Coan, G.M., Cheng, E.T., Niell, C., Tarn, D.M., Shou, H., Sierra, D. and Terris, D.J. (1998) Repair with collagen tubules linked with brain-derived neurotrophic factor and ciliary neurotrophic factor in a rat sciatic nerve injury model. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 124, 761–766.
Ip NY, Nye SH, Boulton TG, Davis S, Taga T, Li Y, Birren SJ, Yasukawa K., Kishimoto T, Anderson DJ, et al (1992) CNTF and LIF act on neuronal cells via shared signaling pathways that involve the IL-6 signal transducing receptor component gp130. Cell 69:1121–32
Jessen, K. R. and Mirsky, R. (1991). Schwann cell precursors and their development. Glia 4, 185–194.
Jung, M., Krämer, E., Grzenkowsko, M., Blakemore, W., Aguzzi, A., Khazaiu, K., Chlichlia, K., von Blankenfeld, G., Kettenmann, and Trotter, J. (1995). Lines of Murine Oligodendroglial Precursor Cells Immortalized by an Activated neu Tyrosine Kinase Show Distinct Degrees of Interaction with Axons In Vitro and In Vivo. Eur. J. of Neuroscience 7, 1245–1265
Kahn, M.A. and De Vellis, J. (1994) Regulation of an oligodendrocyte progenitor cell line by the interleukin-6 family of cytokines. Glia. 12,87–98.
Kollet, O., Aviram, R., Chebath, J., ben-Hur, H., Nagler, A., Shultz, L., Revel, M. and Lapidot, T. (1999) The soluble IL-6 receptor/IL-6 fusion protein enhances maintenance and proliferation of human CD34⁺CD38^–/low/SCID repopulating cells (SRC) in vitro. Blood, in press.
Kioussi, C. and Gruss, P. (1996) Making a Schwann. Trends Genet., 12, 84–86.
Lee, U.A., Zurawel, R.H. and Windebank, A.J. (1995) Ciliary Neurotrophic factor expression in Schwann cells is induced by axonal contact. J. Neurochem. 65, 564–568.
Lemke, G. and Chao, M. (1988). Axons regulate Schwann cell expression of the major myelin and NGF receptor genes. Development 102,499.
Li, R. (1998) Culture methods for selective growth of normal rat and human Schwann cells. Meth. Cell. BioL, 57, 167–186.
Lipton, S.A., and Rosenberg, P.A. (1994). Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders. N Engl J Med, 330, 613–22.
Lubetzki, C., Demerens, C-, Anglade, P., Villarroya, H., Frankfurther, A., Lee., V. M.-Y., and Zalc, B. (1993) Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. PNAS 90, 6820–6824.
Mayer, M., Bhakoo, K. and Noble, M. (1994) Ciliary Neurotrophic factor and Leukemia Inhibitory factor promote the generation, maturation and survival of oligodendrocytes in vitro. Development, 120, 143–153.
McDonald, J.W., Althomsons, S.P., Hyrc, K.L., Choi, D.W., and Goldberg, M.P. (1998). Oligodendrocytes from forebrain are highly vulnerable to AMPA/kainate receptormediated excitotoxicity. Nat Med, 4, 291–7.
Medhurst, A.D., Harrison, dbcAMP, Read, S.J., Campbell, C.A., Robbins, M.J. and Pangalos, M.N. (2000) The use of TagMan RT-PCR assays for semiquantitative analysis of gene expression in CNS tissues and disease models. J. Neurosci. Methods 15, 9–20.
Mendel, I., Katz, A., Kozak, N., Ben-Nun, A. and Revel, M. (1998) Interleukin-6 functions in autoimmune encephalomyelitis: a study in gene-targeted mice. Eur. J. Immunol. 28, 1727–1737.
Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65, 55–63
Murakami, M., Hibi, M., Nakagawa, N., Nagakawa, T., Yasukawa, K., Yamanishi, K., Taga, T. and Kishimoto, T. (1993) IL-6 induced homodimerization of gp130 and associated activation of a tyrosine kinase. Science 260, 1808–1810.
Novick, D., Shulman, L.M., Chen, L. and Revel, M. (1992) Enhancement of interleukin-6 cytostatic effect on human breast carcinoma cells by soluble IL-6 receptor from urine and reversion by monoclonal antibodies. Cytokine, 4, 6–11.
Pantoni, L., Garcia, J.H., and Gutierrez, J.A. (1996). Cerebral white matter is highly vulnerable to ischemia. Stroke, 27, 1641–6.
Pizzi, M., Fallacara, C., Arrighi, V., Memo, M., and Spano, P.F. (1993). Attenuation of excitatory amino acid toxicity by metabotropic glutamate receptor agonists and aniracetam in primary cultures of cerebellar granule cells. J Neurochem, 61, 683–9.
Pohlau, D., Aktas, O., Epplen, C. Hartung, H.P., Hoffmann, V. and Przuntek, H. (1998) Promoting remyelination as a future therapeutic principle in Multiple Sclerosis. Nervenarzt, 69, 841–850.
Sahenk, Z., Seharaseyon, J., and Mendell, J. R. (1994). CNTF potentiates peripheral nerve regeneration. Brain Res, 655, 246–50.

Claims

Verwendung einer IL6R-IL6-Chimäre zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung und/oder Vorbeugung von neurologischen Erkrankungen und Störungen, ausgewählt aus der Gruppe der traumatischen Nervendegeneration, Demyelinisierungserkrankungen des ZNS oder PNS und/oder neurodegenerativen Erkrankungen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die Demyelinisierungserkrankung Multiple Sklerose (MS) ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, worin die neurodegenerative Erkrankung ausgewählt ist aus Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit und ALS.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, worin das Medikament weiterhin einen pharmazeutisch-akzeptablen Träger umfasst.