MXPA02000116A - Quimera il6ril6 para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al uso de la quimera IL6RIL6 en el tratamiento y prevención de enfermedades y alteraciones neurológic

Description

QUIMERA IL6RIL6 PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención está generalmente en el campo de las enfermedades y trastornos neurológicos. En particular se refiere a enfermedades neurodegenerativas, neuroprotección, mielinización nerviosa y generación de células que producen la vaina de mielina. Más particularmente, la presente invención provee el uso de quimeras IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para tratamiento de enfermedades o trastornos neurológicos, especialmente para neuroprotección y para el tratamiento de enfermedades de desmielinización y la mejoría de la regeneración nerviosa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La mielinización nerviosa es un procedimiento esencial en la formación y función de los compartimentos del sistema nervioso central (CNS) y el sistema nervioso periférico (PNS). La vaina de mielina alrededor de los axones es necesaria para la conducción adecuada de impulsos eléctricos a lo largo de los nervios. La pérdida de mielina ocurre en un número de enfermedades, entre las cuales está la esclerosis múltiple (MS) que afecta el CNS, el síndrome de Guillain-Barre, CIDP y otros (véase Abramsky y Ovadia, 1997; Trojaborg, 1998, Hartung et al, 1998). A pesar de varias etiologías, tales como patógenos infecciosos o ataques autoinmunes, las enfermedades de desmielinización ocasionan todas las pérdidas de funciones neurológicas y pueden llevar a parálisis y muerte. A pesar de que los agentes terapéuticos actuales reducen los ataques inflamatorios en MS y retrasan la progresión de la enfermedad, hay una necesidad para desarrollar terapias que puedan llevar a la remielinización y a la recuperación de funciones neurológicas (Abramsky y Ovadia, 1997, Pohlau et al, 1998). La síntesis de mielina es una función de las células gliales especializadas: los oligodendrocitos en el CNS y las células de Schwann que forman mielina en el PNS. Estos dos tipos celulares en su estado completamente diferenciado pueden llamarse células formadoras de mielina. La mielina es una estructura de membrana lipídica que contiene un número de proteínas diferentes. Las proteínas básicas de la mielina (MBP) representan los componentes principales (30%) del CNS y también de las proteínas de mielina PNS. La expresión de las MBP y de otros genes que codifican varias proteínas de mielina (por ejemplo P0, PMP-22, MAG en PNS, PLP, MOG en CNS), se enciende durante la diferenciación terminal de los oligodendrocitos y de las células de Schwann formadoras de mielina. El origen de estas células es en la cresta neural embrional (Fraser, 1991) a partir de la cual éstas migran, y llevan a cabo una diferenciación que procede en un número de pasos. El desarrollo de la célula de Schwann (SC) parece implicar tres pasos principales: 1 ) la generación de precursores (pSC) a partir de células migrantes; 2) la proliferación y transición de SC embrionarias (eSC) que expresan la proteína S100; 3) la diferenciación terminal postnatal de parte de la población eSC hacia SC que forman mielina que expresan MBP y otras proteínas de mielina (Kioussi y Gruss, 1996). Las células que migran a partir de la cresta neural dan lugar no solamente a pSC sino también a neuronas sensitivas y simpáticas, a células de músculo liso y a células que alcanzan la piel y folículos capilares y se vuelven melanocitos pigmentados. El destino de las células de la cresta neural se afecta por varios factores inductores: la diferenciación a células gliales, a neuronas y a músculos se promueve por neuregulinas tales como factor de crecimiento gial (GGF), por BMP2/4 y por TGF-ß respectivamente (Anderson, 1997). La diferenciación a melanocitos puede promoverse mediante factores de crecimiento tales como bFGF o PDGF o SDF (Stocker et al, 199 ; Anderson, 1997). La diferenciación final de progenitores de Schwann y de oligodendrocitos hacia células activamente formadoras de mielina y la mielinización por si misma parece depender de señales generadas por la interacción entre los axones neuronales y las células gliales (Lemke y Chao, 1988; Trapp et al, 1988). Cuando el contacto axón-célula de Schwann se interrumpe, como después del daño nervioso, las células regresan a un estado de no mielinización y la expresión de los genes de proteína de mielina se pierde (Jessen y Mirsky, 1991). Para ser capaz de estimular la mielinización o remielinización, después de la enfermedad neural o del trauma, sería extremadamente importante identificar factores que sean capaces de inducir la síntesis de mielina. La lesión al CNS inducida por problemas agudos incluyendo trauma, hipoxia e isquemia pueden afectar tanto a las neuronas como a la materia blanca. Aunque la mayoría de la atención se ha puesto a los procedimientos que llevan a la muerte neuronal, la evidencia en incremento sugiere que el daño a los oligodendrocitos, los cuales mielinizan los axones, también es un componente específico del daño al CNS. Por lo tanto la patología de oligodendrocitos se demostró en etapas muy tempranas después de la isquemia cerebral (3 horas) en ratas, sugiriendo que estas células son incluso más vulnerables a eventos exitotóxicos que las células neuronales (Pantoni et al. 1996). Un candidato potencial que media la muerte celular es la elevación marcada de la concentración de glutamato que acompaña a muchas lesiones agudas de CNS (Lipton et al. 1994). De hecho, además de las neuronas incluso los oligodendrocitos encontraron que expresan receptores de glutamato funcionales que pertenecen al subtipo AMPA/cainato. Además los oligodendrocitos exhiben alta vulnerabilidad a la aplicación de glutamato (McDonald et al. 1998). Las neuregulinas tales como GGF, las cuales actúan sobre los precursores de las células Schwann embrionarias, también son factores de supervivencia, crecimiento y maduración para los oligodendrocitos postnatales y células de Schwann en nervios dañados, y GGF es uno de los factores mitogénicos provistos por el contacto axonal (Topliko et al, 1996). hGGF2 recombinante puede mejorar la remielinización después de la administración prolongada en un modelo de murino para esclerosis múltiple (Canella et al, 1998) o en nervio periférico triturado (Chen et al, 1998). Otra citocina que se induce en las células de Schwann por el contacto axonal es el factor neurotrófico ciliar CNTF (Lee et al, 1995). CNTF, también junto con el factor inhibidor de leucemia (LIF), se mostró que promueve la supervivencia de oligodendrocitos a partir de cultivos de nervio óptico in vitro con bFGF o PDGF, y para incrementar el número de oligodendrocitos que expresan MBP en estos cultivos (Mayer et al, 1994). Sin embargo, cuando se añade a células precursoras gliales, CNTF y LIF parecen más bien favorecer la diferenciación de astrocitos e inducir la expresión del marcador GFAP de astrocito, mientras que en oligodendrocitos éste podría tener principalmente una acción de supervivencia con poco efecto en el nivel de expresión del gen MBP (Kanhn y De Vellis, 1994, Bonni et al, 1997). Sin embargo, la combinaciones de CNTF con factor neurotrófico derivado de cerebro BNDF mejora la recuperación de un nervio ciático periférico dañado (Ho et al, 1998). CNTF y LIF son citocinas que actúan a través de un sistema de receptor común el cual comprende el receptor LIF (LIFR) y la cadena gp130, éste último siendo también parte del complejo del receptor de interleucina-6 (IL-6) (Ip et al, 1992). CNTF y LIF son, por lo tanto, parte de la familia IL-6 de citocinas. En el caso de CNTF y LIF, la transducción de la señal opera a través de la dimerización de LIFR con gp130, mientras que en el caso de IL-6 la señal se genera por la dimerización de dos cadenas gp130 (Murakami et al, 1993). Con el objeto de unir gp130, IL-6 hace un complejo con una cadena del receptor IL-6, la cual existe sobre ciertas células como una proteína transmembranal gp80 pero cuya forma soluble también puede funcionar como un agonista IL-6 cuando se provee fuera de la célula (Taga et al, 1989; Novick et al, 1992). Al fusionar las regiones codificantes completas del ADNc que codifica al receptor IL-6 soluble (slL-6R) y IL-6, puede producirse una quimera IL6RIL6 recombinante en células CHO (Chebath et al. 1997, WO99/02552). Esta quimera IL6RIL6 tiene actividades biológicas tipo IL-6 mejoradas y ésta se une con mucha mayor eficiencia a la cadena gp130 ¡n vitro que lo que hace la mezcla de IL-6 con slL-6R (Kollet et al., 1999). Una revisión de los efectos de IL-6 sobre células en el sistema nervioso central y periférico indica que la citocina puede tener efectos protectores sobre células neuronales así como participar en procedimientos neurogenerativos inflamatorios (Gadient y Otten, 1997, Mendel et al, 1998). En las células gliales, CNTF y LIF fueron mucho más activos que IL-6 para estimular la diferenciación de astrocitos y no hubo efecto sobre las células productoras de proteína de mielina (Kahn y De Vellis, 1994). Se encontró que IL-6 previene la muerte celular inducida por glutamato en el hipocampo (Yamada et al. 1994) así como en neuronas estriadas (Toulmond et al. 1992). El mecanismo IL-6 de neuroprotección en contra de la toxicidad producida por NMDA, el agonista selectivo para el subtipo NMDA de receptores de glutamato, aún se desconoce. De hecho, se encontró que IL-6 mejora la elevación de calcio intracelular medida por NMDA. En los ratones transgénicos que expresan altos niveles tanto de IL-6 como de IL-6R (sll_6-R) soluble, una regeneración nerviosa acelerada se observó después de la lesión del nervio hlpoglosal como se muestra por el marcado retrógrado de núcleos hipoglosales en el cerebro (Hirota et al, 1996). En ese trabajo, la adición de IL-6 y slL-6R a los cultivos de células ganglionares de la raíz dorsal (DRG) mostraron un incremento en la extensión de neuritas en neuronas, pero no se reportó ningún efecto sobre células que forman mielina. A la luz de los datos presentados anteriormente, no se ha encontrado que CNTF, LIF o una mezcla de IL-6 y slL-6R induzcan la diferenciación terminal de células gliales hacia células formadoras de mielina. Sin embargo, como se describió anteriormente, la estimulación de la diferenciación de células que forman mielina podría ser de gran beneficio para pacientes que padecen de enfermedades desmielinizantes o neurogenerativas. La cita de cualquier documento en la presente no se pretende como una admisión de que dicho documento es una técnica precedente pertinente, o se considere como material patentable de cualquier reivindicación de la presente solicitud. Cualquier aseveración del contenido o de la fecha de cualquier documento se basa en la información disponible para los solicitantes en el tiempo de la presentación y no constituye una admisión de dicha declaración.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Es un objetivo de la presente invención proveer medios para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o trastornos neurológicos. En particular, es un objetivo de la presente invención provee medios para estimular o mejorar la diferenciación de progenitores o de células gliales diferenciadas hacia células que forman mielina. La base de la invención está en el uso de la proteína quimérica IL6RIL6 recombinante, la cual tiene una afinidad marcadamente mayor para gp130 que la mezcla de IL-6 y slL-6R. Es un objetivo adicional de la presente invención proveer medios para estimular o mejorar la mielinización o remielinización de fibras lesionadas como se ilustra por la remielinización inducida de axones después de la axotomía del nervio ciático in vivo además del efecto de formación de mielina de la quimera IL-6 sobre la inducción de genes de mielina in vitro. También es un objetivo de la presente invención utilizar la quimera IL6RIL6 para incrementar el número de células de Schwann que se desarrollen en cultivos de ganglio de la raíz dorsal (DRG). Además, es un objetivo de la presente invención utilizar el IL6RIL6 para la inducción de la diferenciación de estas células hasta el punto en donde estás rodean los axones y producen la proteína básica mielina como se ¡lustra en cocultivos de líneas de célula de Schwann con DRG primario. Incluso es otro objetivo de la presente invención utilizar la quimera IL6RIL6 para la inducción de transcripción de los genes de la proteína básica mielina (MBP) en un sistema de transdiferenciación en el que las células con fenotipo de melanocito se convierten hacia Schwann, fenotipo mielinizante, como se ilustra por el efecto de IL6RIL6 en un melanoma de murino. Es otro objetivo de la presente invención utilizar la quimera IL6RIL6 como un agente neuroprotector y para prevención de muerte celular neuronal en el hipocampo, una región implicada en la codificación de la memoria y una que exhibe degeneración temprana en enfermedad de Alzheimer e isquemia. Es otro objetivo de la presente invención utilizar la quimera IL6RIL6 como un agente protector en contra de los procedimientos neurotóxicos disparados por aminoácidos exitatorios como se ilustra por la protección de neurototoxicidad inducida por glutamato provisto por la quimera IL-6 en cultivos primarios de neuronas cerebelares de rata recién nacida. Un mecanismo molecular se propone por medio del cual IL6RIL6 induce y reprime factores de transcripción específicos que realizan la inducción de la diferenciación de genes MBP hacia el fenotipo mielinizante. Por lo tanto, la presente invención provee el uso de quimera IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades y trastornos neurológicos. En particular, la presente invención provee el uso de la quimera IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para tratar degeneración nerviosa traumática, enfermedades de desmielinización de CNS o PNS y/o enfermedades neurodegenerativas. Más particularmente, la invención provee el uso de las quimeras ILR6IL6 en el tratamiento de esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson o ALS. La invención también provee composiciones farmacéuticas que comprenden la quimera IL6RIL6, opcionalmente junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento y/o prevención de enfermedades neurológicas y trastornos. En particular la composición farmacéutica es para tratar degeneración nerviosa traumática, enfermedades de desmielinización del CNS o PNS y/o enfermedades neurodegenerativas. Un uso preferido para las composiciones farmacéuticas de la presente invención es el tratamiento de MS, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson o ALS.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra el incremento en ARN de MBP en cultivos de células de Schwann tratadas con la quimera IL6RIL6 o por forskolina (FSK) o dejadas sin tratar (NT). La figura 2 muestra la proliferación de las células oli-neu no diferenciadas medidas después de 24, 48 y 72 horas después del tratamiento con diferentes cantidades de quimera IL6R/IL6.

La figura 3 muestra que IL6RIL6 fuertemente induce ARNm de MBP (A) y disminuye ARNm de Pax-3 (B) durante el tiempo en las células F10.9. NT designa células no tratadas. La figura 4 muestra una comparación de la neuroprotección mediante IL-6 sola y la quimera IL-6 en neurotoxicidad mediada por NMDA en secciones organotípicas del hipocampo. La figura 5 muestra el efecto neuroprotector prolongado de la quimera IL-6 contra el efecto de IL-6 sola en secciones organotípicas del hipocampo. La figura 6 muestra el efecto de la quimera IL6R/IL6 sobre la supervivencia de las neuronas carentes de NGF después de 24 horas de tratamiento como se midió mediante el ensayo MTT.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION De conformidad con la invención se ha encontrado que la adición de proteína recombinante IL6IL6R a cultivos de células de ganglios de la raíz dorsal o a células de melanomas estimula la diferenciación de aquellas células formadoras de mielina. También se encontró que la adición de la proteína recombinante IL6IL6R a los cocultivos de neurona y células de Schwann induce la formación posterior de una vaina regular alrededor de los axones. La invención se refiere al uso de la quimera IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para generar células formadoras de mielina o para estimular, mejorar o acelerar la generación de células formadoras de mielina. La quimera IL-6 además induce la remielinización ¡n vivo de fibras cortadas siguiendo a la axotomía de nervio ciático en ratas. La invención además se refiere al uso de la quimera IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para inducir, mejorar o acelerar la remielinización, en particular después de daño nervioso o trauma o lesión axonal. La adición de la proteína recombinante IL6RIL6 a cultivos organotípicos se encontró que adicionalmente induce un efecto protector prolongado a partir de agentes neurotóxicos. La invención también se refiere al uso de la quimera IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para inducir, mejorar, prolongar o acelerar la neuroprotección, en particular a partir de agentes neurotóxicos, y para inhibir, reducir o desacelerar la muerte neuronal, la cual puede deberse a apoptosis, por ejemplo. La presente invención concierne al uso de "quimera IL6RIL6" (también denominada quimera " IL6RIL6" o IL-6), la cual es una glucoproteína recombinante obtenida mediante la fusión de la secuencia codificante completa del receptor soluble d-Val de IL-6 que ocurre de manera natural con la secuencia codificante completa de IL6RIL6 madura que se presenta de manera natural, ambos de origen humano. La quimera IL6RIL6 puede producirse en cualesquiera células eucariontes adecuadas, tales como células de levadura, células de insecto, y similares. Se produce preferiblemente en células de mamífero, más preferiblemente en células CHO diseñadas genéticamente como se describe en WO 99/02552. A pesar de que la proteína de origen humano se prefiere, se apreciará por una persona experta en la técnica que una proteína de fusión similar de cualquier otro origen puede utilizarse de conformidad con la invención, siempre y cuando retenga la actividad biológica descrita en la presente. Más particularmente, la presente invención se refiere al uso de la quimera IL6RIL6 para estimular la diferenciación de células viales progenitoras o diferenciadas hacia células formadoras de mielina. Como se demuestra en la presente el procedimiento de diferenciación de las células formadoras de mielina inducidas por IL6RIL6 implica tanto, la activación de genes requeridos para la formación de la vaina de mielina alrededor de los axones neuronales, así como la represión de un gen requerido para el mantenimiento de fenotipos no mielinizantes. De conformidad con la presente invención se ha observado que la adición de la quimera IL6RIL6 a cultivos de célula del ganglio de la raíz dorsal embrional (eDRG), aisladas a partir de embriones de ratones a los días 14-15 de gestación, tiene un efecto profundo sobre el desarrollo de los precursores de las células de Schwann presentes en el DRG. Después de 2-5 días en cultivo, hay un incremento marcado en el número de células de Schwann embrionarias, un cambio fenotípico marcado en estas células, las cuales empiezan a envolver su membrana alrededor de los exones DRG, y una inducción de MBP. De conformidad con la presente invención se ha observado adicionalmente que en el cocultivo de células Schwann con neuronas la quimera IL-6 puede inducir un incremento significativo en la unión de las células Schwann a lo largo de los axones no mielinizados dentro de 5 horas. Las células de Schwann, las cuales están marcadas con fluoro-oro, se elongan y después de pocos días puede observarse que su citoplasma fluorescente forma una vaina regular alrededor de los axones. Sin la quimera, o con NGF, las células de IL6RIL6 se unen mucho menos y no forman una vaina. Por lo tanto, la invención se relaciona adicionalmente al uso de la quimera IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para inducir la proliferación de células de Schwann y/o diferenciación, así como la mielinización por las células de Schwann en el sistema neural periférico. De conformidad con la presente invención se ha observado adicionalmente que la quimera IL-6 puede inducir la remielinización de nervios periféricos in vivo. Siguiendo a la axotomía del nervio ciático en las ratas y a la yuxtaposición de los muñones proximal y distal la quimera IL-6 podría inducir la regeneración de los nervios periféricos y la remielinización de las fibras seccionadas in vivo. En la presencia de la quimera IL-6 se encontró un incremento de 4 veces en el número y grosor de las fibras mielinizadas y un incremento en la remielinización de las fibras más distantes. Por lo tanto, la invención además se refiere al uso de la quimera IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para inducir la remielinización en el sistema nervioso periférico.

Además, también se encontró de conformidad con la presente invención que la quimera IL-6 puede inducir la expresión de los genes que codifican componentes de proteína de mielina tales como MBP, PLP y PO genes en células formadoras de mielina del sistema nervioso periférico tales como células de Schwann, y en células del sistema nervioso central tales como oligodendrocitos. Por lo tanto, la invención además se refiere al uso de la quimera IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para inducir mielinización y/o remielinización por oligodendrocitos en el sistema nervioso central. También se ha encontrado de conformidad con la presente invención que la adición de la quimera IL6RIL6 a cultivos de línea celular de melanoma de murino B16/F10.9, induce la expresión del gen MBP dentro de 6-12 horas. Otros genes, los cuales codifican la proteína mielina, tales como el gen de CNPasa se inducen mientras que la expresión de genes los cuales están implicados en melanogénesis (formación de pigmentos de melanina) tales como tirosinasa, están fuertemente reprimidos. Las células F10.9 tratadas por IL6RIL6 también llevan a cabo un cambio morfológico marcado, y adquieren un fenotipo semejante a Schwann. Los cambios fenotípicos y la inducción de genes de mielina específicos apoyan la hipótesis de que IL6RIL6 ocasiona una transdiferenciación de las células a partir de un estado melanocítico a mielinizante. Puesto que en el embrión, las células que migran a partir de la cresta neural pueden dar lugar ya sea a melanocitos o células de Schwann mielinizantes y oligodendrocitos, se sugiere que IL6RIL6 puede influir el destino de las células y promover la formación de células mielinizantes. Por lo tanto, la invención también se refiere al uso de la quimera IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para inducir, promover, mejorar o acelerar la formación de células mielinizantes en el sistema nervioso periférico y central y/o para inducir transdiferenciación de células melanocíticas hacia células mielinizantes. Además, se muestra de conformidad con la presente invención que IL6RIL6 actúa al subregular el gen homeobox Pax-3, un gen expresado en las células de la cresta neural embrionarias antes de que se diferencien hacia células de Schwann mielinizantes (Kioussi y Gruss, 1996). Se sabe que Pax-3 reprime al gen MBP. Por lo tanto, la represión de Pax-3 parece un evento clave en la maduración final de las células mielinizantes. Por lo tanto IL6RIL6 actúa sobre un interruptor de diferenciación clave (es decir represión de pax-3). Pax-3 es un transactivador de la microftalmia asociada con el factor de transcripción MITF, el cual a su vez induce y mantiene la expresión de la tirosinasa y otros genes responsables para el fenotipo melanocítico. El descubrimiento de la represión rápida de Pax-3 por IL6RIL6 puede por lo tanto explicar los eventos moleculares que promueven la actividad mielinizante de la célula derivada de la cresta neural. Después de la lesión nerviosa, los axones mielinizados llevan a cabo desmielinización como parte de la degeneración Walleriana. Durante ese proceso, las células de Schwann disminuye la expresión del gen MBP y de otros genes relacionados con la proteína mielina. Concomitantemente hay una sobrerregulación de Pax-3 y GFAP que denota una reversión a partir de una SC formadora de mielina a SC no formadora de mielina y proliferante (Kioussi y Gruss, 1996). De conformidad con la presente invención, la quimera IL6RIL6 parece ser una citocina potente que revierte el proceso de degeneración nerviosa Walleriana al reprimir Pax-3 e induce a SC para reasumir sus actividades formadoras de mielina. Las mismas consideraciones podrían aplicarse a las enfermedades desmielinizantes de cerebro puesto que, como en los traumas, la neurodegeneración en estas enfermedades se acrecienta por un procedimiento de desmielinización dirigido por los macrófagos y otras células inflamatorias. La invención por lo tanto también se refiere al uso de la quimera IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento de lesión nerviosa y/o degeneración nerviosa traumática y/o lesión axonal. IL6RIL6 también puede inyectarse a ratones en los que una desmielinización autoinmune se ha inducido por la inmunización con MBP como un sistema modelo para esclerosis múltiple de retardo crónica (Cannella et al, 1998). La capacidad de IL6RIL6 para inducir genes de proteína mielina y la diferenciación de células viables formadoras de mielina puede observarse in vivo, utilizando este paradigma farmacéutico. La invención por lo tanto además se refiere al uso de la quimera IL6RIL6 para la elaboración de un medicamento para tratamiento y/o prevención de enfermedades de desmielinización autoinmunes, en particular al tratamiento y/o prevención de esclerosis múltiples.

La quimera IL-6 también se ha mostrado que tiene efectos neuroprotectores, previniendo la pérdida de viabilidad de células neuronales inducida por agentes exitotóxicos en regiones implicadas en la codificación de la memoria y que exhiben degeneración temprana en enfermedad de Alzheimer e isquemia. Se encontró que la quimera IL-6 protege a las neuronas de la neurotoxicidad inducida por glutamato. Por lo tanto, la invención se refiere a la elaboración de un medicamento para la protección de células neurales en contra de muerte celular, en particular debido a los efectos de agente neurotóxicos, y al tratamiento y/o prevención de enfermedades neurogenerativas como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson o ALS, por ejemplo. Las enfermedades neurológicas adicionales que pueden ser tratadas con la quimera IL6RIL6 son choques, alteraciones de movimiento, epilepsia, dolor y similares. La definición de "farmacéuticamente aceptables" se pretende que abarque cualquier vehículo, que no interfiere con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo y que no sea tóxico con el hospedero en el cual se administra. Por ejemplo, para la administración parenteral, la quimera IL6RIL6 puede formularse en una forma de unidad de dosis para inyección en vehículos tales como solución salina, solución de dextrosa, albúmina de suero y solución de Ringer. La quimera IL6RIL6 puede administrarse a un paciente que necesita de dicha administración en una variedad de modos. La ruta de ' administración incluye rutas intradermales, transdermales (por ejemplo en • formulaciones de liberación lenta), intramusculares, intraperitoneales, intravenosas, subcutáneas, orales, epidurales, tópicas, intranasales. Cualquier otra ruta terapéuticamente efectiva de administración puede utilizarse, por 5 ejemplo absorción a través de tejido epitelial o endotelial o mediante terapia génica en donde una molécula de ADN que codifica la quimera IL6RIL6 se administra al paciente (por ejemplo vía un vector) el cual causa que la quimera IL6RIL6 se exprese y se secrete in vivo. Además la quimera IL6RIL6 puede administrarse junto con otros componentes de agentes biológicamente activos 10 tales como agentes tensioactivos farmacéuticamente aceptables, excipientes, portadores, diluyentes y vehículos. Para administración parenteral (por ejemplo intravenosa, subcutánea, intramuscular), la quimera IL6RIL6 puede formularse como una solución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado en la asociación con un 15 vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable (por ejemplo agua, solución salina, solución de dextrosa) y aditivos que mantiene la isotonicidad (por ejemplo manitol) o estabilidad química (por ejemplo conservadores y amortiguadores). La formulación se esteriliza mediante técnicas comúnmente utilizadas. 20 Una "cantidad efectiva" se refiere una cantidad de los ingredientes activos que es suficiente para afectar el curso y la severidad de las enfermedades descritas anteriormente, llevando a la reducción o disminución de dicha patología. La cantidad efectiva dependerá de la ruta de administración y la condición del paciente. La dosis administrada, como dosis particular o múltiple, a un individuo variará dependiendo de una variedad de factores, incluyendo propiedades farmacocinéticas de la quimera IL6RIL6, la ruta de administración, condiciones del paciente y características (sexo, edad, peso corporal, salud tamaño), grado de síntomas, tratamiento concomitante, frecuencia de tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulación de los intervalos de dosis establecidos se conocen bien dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, así como los métodos in vitro e in vivo de determinación de la remielinización de los nervios. Mientras que la invención se describirá en conjunción con modalidades especificas de la misma, se entenderá que es capaz de modificaciones adicionales. Esta aplicación se pretende que abarque cualesquiera variaciones, usos o adaptaciones de la invención siguiendo, en general, los principios de la invención e incluyendo dichos inicios a partir de la presente descripción como se sabe en la practica común dentro de la técnica a la cual la invención pertenece y puede aplicarse a las características esenciales establecidas como siguen en el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo artículos de revistas o IL6RIL6, solicitudes de patentes publicadas o no publicadas, revistas o patentes externas, o cualquier otra referencia, se incorporan completamente como referencia en la presente, incluyendo todos los datos, tablas, figuras y textos presentes en la citada referencia. De conformidad, los contenidos completos de las referencias citadas dentro de las referencias citadas en la presente invención también se incorporan completamente como referencias. La presente invención ahora se describirá en más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y dibujos anexos.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Efecto de IL6RIL6 sobre mielinización y remielinización in vitro En la médula espinal, la raíz dorsal comprende neuronas sensitivas esencialmente, las cuales forman sinapsis en el ganglio de la raíz dorsal (DRG). Durante el embriogénesis de ratón (al día e14-e15), las DRG son una fuente conveniente de neuronas y de células de Schwann embrionarias las cuales no se han diferenciado aún hacia SC formadoras de mielina. Los procedimientos para obtener explantes de DRG para cultivos in vitro se describen por Li (1998). Los cultivos se llevaron a cabo sobre cubreobjetos de vidrio colocados en los pozos de cajas Costar, en medio F12/DMEM (Gibco). Los cubreobjetos se cubrieron ya sea con colágena o con poli-D-lisina, con resultados esencialmente similares. Los cultivos se hicieron ya sea en medio sin factor de crecimiento o con adición de citocina o en medio suplementado con factor de crecimiento nervioso (NGF, 40 ng/ml), o en medio suplementario con proteína recombinante quimérica IL6RIL6 (3 µg/ml). Los cultivos se examinaron todos los días mediante microscopía de luz con un microscopio invertido Olympus unido a un sistema de imagen con vídeo cámara (Leica LIDA system). Parte de los cubreobjetos se fijaron en formaldehído y las proteínas MBP se marcaron con anticuerpos primarios monoclonales para proteínas básicas de mielina y anticuerpos secundarios conjugados a fluoresceína. Los cuerpos y axones de las células neuronales se tiñeron con anticuerpos para proteína de neurofilamento. Algunos de los cubreobjetos se examinaron mediante microscópica electrónica de barrido (EM). Después de 2 a 5 días, los explantes de DRG cultivados sin adición mostraron que las células que crecieron fuera del explante eran ya sea poligonales o de forma oval. Sin embargo, cuando se añadió NGF, las células de forma oval desarrollaron proyecciones axonales largas. Las cuales formaron una red delgada teñida por anticuerpos a neurofilamentos. Algunos de los axones fueron largos y bifurcados, pero no se observaron células de Schwann a lo largo de los axones. En contraste, los cultivos con IL6RIL6 no mostraron solamente células neuronales con axones teñidos para neurofilamentos, sino que también las células de Schwann aparecieron como células planas que tenían largas extensiones bipolares con ramificaciones en los extremos. Estas extensiones no se tiñeron con proteínas para neurof ¡lamento. Mediante EM de barrido, estás células de Schwann se observaron claramente a lo largo de proyecciones axonales con borde de membrana que iniciaban a enrollarse alrededor del axón. La tinción con antiMBP mostró tinción positiva a células de Schwann en los cultivos tratados con IL6RIL, en particular en los arreglos de células las cuales estaban alineadas una después de la otra. Por otra parte, se observó poca fluorescencia específica a MBP en los cultivos tratados con NGF sin IL6RIL6. Resultados similares se observaron en cultivos DRG a partir de embriones de rata e15. Las células de Schwann derivadas a partir de nervio ciático de ratón también se cultivaron in vrt' ro con IL6RIL6 1.4 µ9/?t?? y se midió el nivel de transcrito de ARN MBP. En comparación, los mismos cultivos se trataron con forskolina 20 µ??, un químico que artificialmente incrementa los niveles de AMP cíclico en las células y se conoce que induce MBP (Lemke y Chao, 1988). Los resultados mostraron que IL6RIL6 fue tan eficiente como la forskolina para inducir la expresión del gen MBP y más eficiente para mantener niveles de ARN de MBP después de 3 días de cultivo (figura 1 ). En un estudio de células de ganglio de raíz dorsal (DRG) de embriones de 18 días se encontró que la quimera IL-6 induce la expresión del ARNm de MBP y P0 dentro de 3 días, mientras que el ARNm de Pax-3 se inhibió fuertemente en el mismo sistema celular. Una curva dosis-dependiente del efecto de la quimera IL-6 sobre la expresión del gen P0 y MBP muestra efecto máximo en la quimera IL-6 a 500 ng/ml. La quimera IL-6 parece, por lo tanto, como un inductor importante de la expresión del gen de mielina en las células neurogliales normales. Las líneas de célula de Schwann derivada a partir de nervio ciático de rata o a partir de células del ganglio de la raíz dorsal de rata (DRG) se generaron para estudiar adicionalmente los efectos de la quimera IL-6. La línea celular de Schwann derivada a partir de nervio ciático de rata se encontró que responde a la quimera IL-6, como se determinó mediante RT-PCR y análisis Northern blot por una inducción del gen P0 de 2-3 veces cuyo producto de proteína forma aproximadamente 50% de la mielina del nervio periférico. Con el objeto de estudiar la activación transcripcional de los componentes del gen de mielina mediante la quimera IL-6 el promotor MBP se introdujo dentro de un vector de expresión hacia el extremo 5' del gen reportero de luciferasa y se evaluó en el nervio ciático de rata de la línea de célula de Schwann. Después de una inducción de 7 veces la actividad transcripcional a partir del promotor MBP se observó en respuesta a la quimera IL-6 en estas células en la ausencia de forskolina. En un ensayo del gen reportero adicional se encontró que la quimera IL-6 induce una inducción de 2.5 veces en la transcripción a partir del promotor del gen P0 en estas células.

Los resultados anteriormente mencionados sugieren que la quimera IL-6 tiene un efecto directo sobre la transcripción de gen de mielina en las células de Schwann comprometidas. Una línea de células de Schwann adicional se aisló a partir del ganglio de raíz dorsal de rata (DRG) y se denominó la línea celular CH. Se encontró que esta línea celular tiene una velocidad de crecimiento lenta y es dependiente para el crecimiento de la quimera IL-6 (140 ng/ml). Interesantemente, las células CH tienen una morfología estelar que se parece a los oligodendrocitos. Las células parecen ser funcionales con respecto a la inducción de mielinización por la quimera IL-6. Las células que expresaron P0 y MBP murieron cuando crecieron en medio que contenía suero en la ausencia de la quimera.

EJEMPLO 2 Inhibición de proliferación de oligodendrocitos in vitro El efecto de la quimera IL-6 se estudió sobre células de sistema nervioso central. Se estableció que la diferenciación de oligodendrocitos se asocia con la inhibición de su proliferación, por lo tanto promoviendo la formación de la vaina y la mielinización mediante oligodendrocitos. Por lo tanto, se evaluó in vitro la capacidad de la quimera IL6R/IL6 para inhibir la proliferación de oligodendrocitos. Una línea celular de oligodendrocito primario de murino (olidendroglial) inmortalizada con el oncogen t-neu (línea celular "oli-neu") se utilizó en este experimento. El establecimiento y propiedades de la línea celular oli-neu así como las condiciones de cultivo se describen en Jung et al. (1995). La proliferación de las células IL6R/IL5 no diferenciadas se midió después de 1 , 2 y 3 días en respuesta a las diferentes cantidades de quimera IL6R/IL6 (1 ng/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml y 0 ng/ml (control)). La velocidad de crecimiento se cuantificó al medir la actividad metabólica celular con un indicador de crecimiento fluorométrico/colorimétrico, Alamar Blue. Este agente contiene un indicador de oxidación/reducción que muestra tanto la fluorescencia como los cambios en su color en respuesta a la reducción química del medio de crecimiento resultando a partir del crecimiento celular. El agente y el ensayo utilizado se describe en Ahmed et al. (1994) y en la patente de E. U. A. 5,501 ,959. Los resultados se muestran en la figura 2. La adición de la quimera IL6R/IL6 al medio de cultivo de oligodendrocitos llegó a la reducción pronunciada del crecimiento después de 48 horas. Después de 72 horas, el crecimiento se redujo de 40 a 50% en comparación con el control. Interesantemente, las cantidades mayores de la quimera IL6R/IL6 (1 µg) fueron menos efectiva que las cantidades menores de 500 a 125 ng/ml. Este experimento muestra que la quimera IL6R/IL6 Inhibe fuertemente la proliferación de oligodendrocitos in vitro, indicando que éste es un promotor de la diferenciación de oligodendrocitos. Puesto que los oligodendrocitos son las células gliales que producen vainas de mielina en el CNS, la quimera IL6R/IL6 puede ser un agente activamente promotor de la remielinización in vivo.

EJEMPLO 3 Impacto de la quimera IL6R/IL6 sobre la morfología de oliqodendrocitos Con el objeto de estudiar el efecto de la quimera IL6 sobre la morfología oligodendroglial, las células oli-neu (véase ejemplo 2) se cultivaron por 3 días en la presencia de 1 µg/ml de la quimera IL6R/IL6. Dibutil AMPc (dbcAMP) es un agente conocido para inducir la diferenciación en oligodendrocitos (véase, por ejemplo Jung et al. (1995). Con el objeto de investigar, qué efecto morfológico de la quimera IL6R/IL6 se añade al efecto de dbcAMP, las células oli-neu se pretrataron por 3 días con dbcAMP antes de la adición de la quimera IL6R/IL6R/IL6 más dbcAMP. En paralelo, las células se trataron con la quimera IL6R/IL6 sin pretratamiento. Los cambios en la morfología se evaluaron con microscopía de contraste de fases o mediante tinción inmunohistoquímica para marcadores CNPasa de oligodendrocitos (2',3'-ciclico-nucleosido-3'-fosfodiesterasa) y GalC (sialogangliósidos y sulfatidas) y se utilizó el anticuerpo A2B5, específico para el lípido de mielina galactocerebrósido. La adición de la quimera IL6R/IL6 claramente indujo los cambios morfológicos en las células oli-neu- los cuerpos celulares ensamblados en rodillos y sus procesos se volvieron más elongados. Las células mismas se elongaron y parecieron fusionarse, indicando un estado avanzado de diferenciación. La expresión de marcadores de oligodendrocitos se mostró mediante inmunohistoquímica. Las células fueron positivas para los marcadores específicos de oligodendrocitos A2B5-antígeno y CNPasa pero fueron negativas para el marcador astrogial GFAP por lo tanto mostrando que de hecho, el fenotipo oligodendrocitos se mantuvo. El pretatamiento con dbcAMP y el tratamiento combinado con la quimera IL6R/IL6 y dbcAMP incrementó el número de oligodendrocitos formadores de vaina después de 3 días. Además de las células elongadas observadas con la quimera sola, la morfología de las células se mostró incluso más diferenciada. Las células que tenían una forma semejante a vaina pudieron observarse, indicando un estado avanzado de diferenciación. En conclusión, el tratamiento con la quimera IL6R/IL6 resulto en un cambio morfológico de oligodendrocitos in vitro, por lo tanto apoyando adicionalmente su papel como un inductor de la diferenciación oligodendroglial y la mielinización.

EJEMPLO 4 Efectos de la quimera IL-6 sobre la interacción de la célula de Schwann y neuronal Al cultivar DRG de murino en la presencia de inhibidores de la síntesis de ADN arabinosa C (AraC) y fluorodeoxiuridina (FudR), las células neuronales pueden desarrollar axones mientras que se inhibe la proliferación de las células gliales. Estos cultivos DRG pueden utilizarse como una fuente de células neuronales con axones no mielinizados. Las células de Schwann se añaden exógenamente a los cultivos para estudiar la interacción entre neuronas y células de Schwann. Las células de las líneas de la célula de Schwann de nervio ciático de rata se marcaron con fluoro-oro, una marca que penetra la membrana celular lipídica en bicapa y se mantiene por un período extensivo de tiempo sin afectar la función celular. El co-cultivo de las células neuronales con estas células de Schwann en la presencia de la quimera IL-6 lleva un incremento significativo en la unión de las células de Schwann a lo largo de las células axonales dentro de 5 horas. Las células se elongan y después de pocos días puede observarse que sus citoplasmas fluorescentes forman una vaina regular alrededor de los axones. Sin la quimera, o NGF, las células de Schwann unen mucho menos y no forman una vaina. Estos resultados muestran que la quimera IL-6 tiene un efecto muy rápido sobre la interacción de las células gliales con neuronas, sugiriendo que las moléculas de adhesión están inducidas o activadas. Este sistema permite el estudio de varios pasos en el procedimiento de mielinización los cuales se afectan por la quimera IL-6.

EJEMPLO 5 Efecto de la quimera IL6R/IL6 en la mielinización en cultivos mezclados de neuronas y oligodendrocitos Con el objeto de investigar adicionalmente la actividad inductora de mielinización de la quimera IL6R/IL6, se prepararon cultivos disociados a partir de hemisferios cerebrales de murino E15 (día embrionario 15). La preparación y las condiciones de cultivo se describen por Lubetzki et al (1993). Las células primarias se mantuvieron en cultivo por 8 días antes de la adición de IL6R/IL6 (1 ^g/ml) por 11 días. MBP (proteína básica mielina) y la proteína específica de oligodendrocito PLP (proteína proteolípido) son marcadores para oligodendrocitos maduros y/o mielinizantes y son constituyentes principales de la mielina del CNS. Estas pueden por lo tanto usarse como marcadores para evaluar la mielinización activa que toma lugar en el cultivo celular. Bajo las condiciones de cultivo, al día 4, no hay mielinización. Por lo tanto, el ARNm del día 4 se utilizó como control de calibración en este experimento. Al día 19, bajo las condiciones de cultivo, se observó la mielinización en el cultivo celular.

Por lo tanto a los días 4 y 19, el ARNm se extrajo a partir de pozos tratados y no tratados, con el objeto de cuantificar ARNm de MBP y PLP. Los ARNm para MBP, PLP y GAPDH, los cuales sirven como un ARN de control interno, se midieron mediante RT-PCR (Medhurst et al. (2000) de tiempo real cuantitativo utilizando un PE Applied Biosystems Prism modelo 7700 de instrumento de detección de secuencias. Los resultados se resumen en el cuadro 1 a continuación. Dos experimentos independientes se llevaron a cabo. La expresión de ARNm se indica como una expresión de veces del ARN control al día 4. En ambos experimentos, la quimera IL6R/IL6 claramente mejoró la expresión de MBP y PLP por dos veces, de nuevo apoyando el papel de la quimera IL6R/IL6 como un inductor o mejorador de la mielinización.

CUADRO 1 Expresión de MBP v PLP en cultivos corticales primarios Control día 4 Control día 19 Quimera IL6R/IL6 día 19 Experimento 1 MBP 1 72 181 PLP 1 1265 2157 Experimento II MBP 1 187 2157 PLP 1 1884 4198 En conclusión, los ejemplos 1 a 5 muestran que la quimera L6R/IL6 tiene una actividad anti-proliferativa, inductora de diferenciación y de mielinización. Esta actividad de la quimera IL6R/IL6 sugiere fuertemente un efecto benéfico de la quimera IL6R/IL6 en la remielinización del sistema nervioso periférico y central. Este efecto puede explotarse en todos los trastornos basados en defectos de mielinización, desmielinización o mielinización insuficiente de las neuronas del CNS o PNS. La quimera IL6R/IL6 puede por lo tanto ser un agente efectivo para tratar trastornos de re y/o desmielinización como esclerosis múltiple, por ejemplo.

EJEMPLO 6 El efecto de la quimera IL-6 sobre la generación del nervio periférico in vivo Siguiendo a la axotomía del nervio ciático en ratas y a la yuxtaposición de los muñones proximales y distales, los nervios periféricos pueden inducirse a regeneración y las fibras seccionadas pueden inducirse para remielinizarse in vivo (Sahenk et al. 1994). Se examinó el efecto de la quimera IL-6 sobre la remielinización de los nervios periféricos siguiendo a la axotomía. A las ratas (7 animales) se les dio la quimera Sil-6/il-6 intraperitonealmente cada segundo día a una dosis de 100 mcg/Kg por 12 días empezando el día de la cirugía. Los animales control (9 ratas) fueron inyectados con PBS. Después de 12 días, las secciones de los nervios en regeneración de 2.5 y 5 mm por debajo de la axotomía se analizaron mediante microscopía electrónica de transmisión y se evaluó el número de fibras positivas. En la presencia de la quimera IL-6 se encontró un incremento de 2.5 veces en el número de fibras mielinizadas a una distancia de 2.5-mm por debajo de la axotomía en comparación con los controles tratados con PBS. Además se encontró que la quimera incrementa la remielinización de las fibras más distantes induciendo un incremento del 5.2 veces en el número de fibras mielinizadas en la posición distal a 5 mm de la sección. Esto es importante puesto que la remielinización disminuye conforme la distancia desde la sección se incrementa. Los efectos de CNTF se han observado a 0.5 mm a partir de la sección, pero con la quimera IL-6 el efecto parece mucho más extendido y mayor a 5 mm que a 2.5 mm. También el grosor de las fibras mielinizadas se incrementa más de dos veces después del tratamiento con la quimera. En general la quimera IL-6 parece inducir la remielinización de aproximadamente 10% de fibras en comparación con las ratas no axotomizadas intactas.

EJEMPLO 7 Inducción del gen MPB mediante IL6RIL6 en cultivos de células B 6- F10.9 de menaloma El origen embrionario de los melanocitos de piel, los cuales producen el pigmento melanina, y células de Schwann es a partir de células precursoras comunes que emigran fuera de la cresta neural en embriones de ratón e8. Los melanomas son tumores malignos que se desarrollan en la piel a partir de melanocitos, y por lo tanto también derivan a partir de ancestros de la cresta neural. La línea celular B16 deriva a partir de un melanoma espontáneo de ratón Balb/c, y la clona F10.9 se aisló a partir de B16 por su genotipo metastásico altamente maligno. Las células F10.9, como otras células B16, producen el pigmento negro eumelanina y son ricas en tirosinasa, la primera enzima de la ruta melanogénica (Bertolotto et al., 1996).

Las células F10.9 se sembraron en microcajas de 96 pozos a 30,000 células/pozo y se cultivaron por 3 días en medio DMEM con FCS al 10%, con o sin IL6RIL6 a concentraciones de 0.3-1 µ9/???. El ARN celular total se extrajo y se analizó mediante Northern blot con sondas de ADNc para MBP. Los ARNm de MBP se indujeron muy fuertemente a 48 h por IL6RIL6 en las células F10.9 (figura 3A). Un estudio de tiempo mostró que el incremento en el ARN de MBP inició a las 12 horas después de la adición de la quimera IL6RIL6 a los cultivos celulares. La quimera IL6RIL6 induce no solamente la expresión del gen MBP sino también la 2'3' AMP fósfodiesterasa cíclica o CNPasa, la cual es otro componente de la mielina y un marcador de las células de Schwann diferenciadas. Las células también desarrollan extensiones prolongadas en polos opuestos dél cuerpo celular, y se alinean en disposiciones a lo largo como es típico para los cultivos de células de Schwann. Sorprendentemente, IL6RIL6 es un interruptor del genotipo de las células F10.9 a partir de las células productoras de melanina a células de Schwann productoras de mielina. La actividad enzimática tirosinasa y la producción de melanina se perdieron completamente a las 48 horas después de la adición de la quimera IL6RIL6 a las células. MITF es un factor de transcripción que activa el gen tirosinasa (Bertolotto et al., 1996). El tratamiento de células F10.9 mediante IL6RIL6 reprime fuertemente la expresión del gen MITF. El MITF mismo se transactiva mediante el factor de transcripción homeótico Pax-3 (Watanabe et al., 1998) y las mediciones del ARNm de Pax-3 en las células IL6RIL6 tratadas con F10.9 muestran que la expresión de Pax-3 disminuye al inicio a partir de 6 horas y por más de 48 horas (figura 3B). Se sabe que Pax-3 reprime el gen MBP (Kioussi y Gruss, 1996). El efecto de la quimera IL6RIL6 puede, por lo tanto, subscribirse a un efecto regulador del gen homeobox Pax-3 el cual se expresa durante el desarrollo de la célula de Schwann embrionaria antes de la mielinización, y tiene que reprimirse para que ocurra la mielinización. Además, en nervios desmielinizados regenerados, Pax-3 se re-expresa en las células de Schwann cuando estas células paran de producir MBP. Por lo tanto, es de gran importancia que IL6RIL6 pueda tanto reprimir Pax-3 y causar la diferenciación de células de Schwann hacia células mielinizantes al inducir a los genes productores de mielina.

EJEMPLO 8 Invecciones de IL6RIL6 en un modelo de murino de esclerosis crónica de retraso múltiple Los ratones de la cepa SJL/J desarrollan encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) siguiendo a la inmunización con 0.4 mg de MBP bovino en adyuvante incompleto de Freund que contiene 60 µ?t? de Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco). La enfermedad puede transferirse pasivamente a recipientes singeneicos mediante inyección intravenosa de 30 millones de células de nodulo linfático tomadas 10 días después de la inmunización. Las señales clínicas de la parálisis aparecen después de una semana a 10 días. Una fase aguda de enfermedad sigue después por la disminución y el retraso. Se inyecta en estos ratones intraperitonealmente o subcutáneamente a dosis de 1, 3 y 5 pg por ratón (peso corporal aproximadamente 25 g). La inyecciones se dan 4 veces por semana por al menos 3 semanas, iniciando ya sea al día 3 o al día 7 después de la transferencia pasiva. La evaluación clínica de los animales se sigue y se gradúa como: 1) pérdida de rigidez de la cola; 2) debilidad de extremidades; 3) parálisis de extremidad en un lado; 4) parálisis de extremidad en ambos lados; 5) letalidad. El cerebro y la médula espinal de los animales se examina mediante microscopía de luz siguiendo a la tinción con mielina con azul rápido de luxol. El efecto de IL6RIL6 sobre la reducción en el grado clínico y la reducción de la desmielinización de la materia blanca del cerebro puede evaluarse.

EJEMPLO 9 Efecto neuroprotector de la quimera IL6 en neurotoxicidad neuronal y oligodendrogial Los cultivos organotípicos provee una estrategia única con los que se examinan muchos aspectos de la fisiología y patología cerebral. El cultivo de secciones a largo plazo a partir del hipocampo, una región implicada en la codificación de la memoria y una que exhibe degeneración temprana en la enfermedad de Alzheimer e isquemia, es particularmente valioso a este respecto debido a la expresión del mecanismo de plasticidad sináptica (por ejemplo, potenciación a largo plazo) y responsividad a daños patológicos (por ejemplo, excitotoxicidad). Los cultivos se prepararon como previamente se describe por Bahr et al. (Bahr 1995) con modificaciones menores. Los hipocampos se disectaron a partir de ratas Wistar de ocho días de edad y las secciones de 400 µ?? de grosor se depositaron sobre una membrana porosa y transparente Millicell-CM (Millipore) y se cultivaron en cajas de multipozos de 6 pozos. Cuatro secciones se colocaron sobre cada membrana. El medio de cultivo consistió de medio esencial mínimo al 50% (HEPES 25 mM, + NaHC03 4 mM + NaOH pH 7.2), suero de caballo al 25% y solución de Hank al 25%, glucosa (6.4 g/l), penicilina/estreptomicina (10 ml/l), L-glutamina (2 mM). Los cultivos se mantuvieron en un incubador con CO2 al 5% establecido a una temperatura de 37°C por al menos 3 semanas antes de usarlos. El medio se cambió cada semana. Las secciones del hipocampo se expusieron a IL6 o a la quimera IL6 a concentraciones con un intervalo de 10 pg/ml a 10 µg/ml por 15 minutos, después NMDA 50 µ? se añadió por 30 minutos adicionales. Los cultivos se colocaron en medio fresco con o sin IL6 o la quimera IL6 al menos cuatro secciones se utilizaron para cada punto experimental. La muerte celular inducida por NMDA se evaluó ya sea a los 1 o 3-7 días después de la lesión experimental al incubar los cultivos por 1 hora en medio fresco que contenía yoduro de propidio (Pl 5 µ?/ml). Debido a sus propiedades hidrófilas, Pl entra dentro de las células alteradas y se une a la cromatina nuclear. La fluorescencia roja emitida (marcador de muerte celular) se examina utilizando un microscopio fluorescente invertido (Zeiss) asociado con un dispositivo de cámara acoplado a carga intensificada. La cuantificación de la fluorescencia total se llevó a cabo mediante un sistema de análisis de imagen (Image Pro Plus). Se encontró que tanto IL-6 como la quimera IL-6 protegen de la muerte celular hipocampal inducida por NMDA. Después de un día en cultivo con IL-6 a la concentración en un intervalo de 0.1 a 10 ng/ml, se encontró que ésta protege aproximadamente 50%-30% de las células neuronales respectivamente, mientras que la quimera IL-6 a concentraciones con un intervalo de 0.05 a 1 pg/ml protege aproximadamente 40%-75% de las células neuronales. El efecto protector máximo de la quimera IL-6 (protección de 75% de las células) se observó a una concentración de 0.5 pg/ml (figura 3). Los efectos protectores de IL-6 se encontraron que diminuyen con el tiempo. La viabilidad de las células neuronal declina después del tratamiento y después de dos días de efecto protector de IL-6 se mantiene solamente con concentración de 0.1 ng/ml de IL-6 con un efecto protector sobre solamente 30% de las células al día 5. En contraste con los mismos, la quimera IL-6 a una concentración de 0.5 pg/ml tiene un efecto protector prolongado, manteniendo aproximadamente 60% de las células para los 5 días (figura 5).

La presencia de oligodendrocitos en las secciones organotípicas se determinó mediante tinción inmunohistológica con Gal-C, un marcador de oligodendrocitos específico. Después de 2-3 semanas in vitro las secciones organotípicas se expusieron por 30 minutos a NMDA 50 µ?, la cual induce muerte celular necrótica de las células presentes en estos cultivos. De hecho, como se determina mediante RT/PCR, después del tratamiento con NMDA toda la expresión MBP que es distinta a los oligodendrocitos se pierde en estos cultivos. La activación de los receptores ionotrópicos de glutamato representa el primer evento en el proceso de neurotoxicidad disparado por los aminoácidos excitatorios. Los cultivos primarios de neuronas cerebelares de rata recién nacida (los cuales contienen >97 de neuronas) se emplearon para estudiar los efectos de la quimera IL-6 sobre la neurotoxicidad inducida por glutamato y se compara con los efectos de IL-6. Los cultivos primarios de células granulares cerebelares se prepararon a partir de ratas pupales Sprague-Dawley de 8 días de edad como se describió previamente (Pizzi et al. 1993). Las células se sembraron sobre cajas cubiertas con poli-L-Lisina y se cultivaron en medio basal de Eagle que contenía suero bovino fetal inactivado con calor al 10%, glutamina (2 mM), gentamicina (50 µg/ml), y KCI (25 mM), a una densidad de 2.5 x 105 células/cm2. La citocina arabinosa (10 µ?) se añadió a los cultivos 18 h después de sembrados para prevenir la proliferación de las células no neuronales. Los experimentos se llevaron a cabo después de cultivar las neuronas por 10 días. A menos que de otra manera se indique, los cultivos se expusieron por 15 minutos a glutamato 50 µ? en una solución de Locke libre de Mg2+". IL-6 o la quimera IL-6 se añadieron 5 minutos antes del tratamiento con glutamato. Los discos entonces se regresaron a medio condicionado de cultivo a 37°C en aire al 95%/C02 al 5% y la viabilidad celular se midió 18-24 horas después. La viabilidad celular se evaluó 18 horas después mediante tinción intravital con diaceato de fluoresceína y yoduro de propidio mezcla, como se describió previamente (Pizzi et al. 1993). El porcentaje de las neuronas sobrevivientes en la monocapa se computó al evaluar la relación entre la tinción de diacetato de fluoresceína (células viables verdes) y de diaceato de fluoresceína más yoduro de propidio (células totales) en fotomicrografías de tres campos representativos para cada monocapa. Los valores se tomaron a partir de discos hermanos. A pesar de que no se indujo efecto protector sobre células granulares cerebelares de rata con IL-6 a dosis con un intervalo a partir de 0.1 a 10 ng/ml, 0.1 ng/ml y 1 pg/ml de la quimera IL-6 se protegió respectivamente a 40-20% de la células neuronales a partir de la neurotoxicidad inducida por el glutamato.

EJEMPLO 10: Efecto de la quimera IL6R IL6 sobre la supervivencia de las neuronas ganqlionares cervicales superiores después de remoción de NGF El efecto neuroprotector ejercido por la quimera IL6R/IL6 también se estudió en un sistema de cultivo neuronal periférico. Las neuronas del ganglio cervical superior (SCG) se aislaron a partir de ganglio cervical superior de rata P0-P3 (días post-natales 0 a 3). Las neuronas se mantuvieron por 4 días en un medio que contenía suero de rata al 5% y NGF. El NGF se necesita por la neurona para su supervivencia, mientras que la ausencia de NGF lleva la muerte de las células debido a la inducción de apoptosis. El medio inicial se reemplazó por medio libre de NGF que contenía anticuerpos neutralizantes al factor de crecimiento. En este punto del tiempo, 0.1 ó 1 g/ml de la quimera IL6R/IL6 se añadieron a una concentración final de DMSO al 1%. El cultivo se mantuvo al 37°C por 24 horas. El efecto de la quimera IL6R/IL6 sobre la supervivencia de las neuronas carentes de NGF después de 24 horas de tratamiento se evalúo mediante microscopía así como mediante actividad mitocondrial de las células como se mide por el ensayo MTT, el cual se describe en detalle por Mosmann (1983). Las concentraciones de la quimera IL6R/IL6 utilizadas no mostraron ningún efecto tóxico o morfológico sobre las neuronas SCG tratadas con NGF.

La adición de la quimera IL6R/IL6 en concentraciones de 100 ng/ml y ^g/ml rescataron más del 40% de las neuronas SCG de la muerte neuronal, la cual había sido inducida por la ausencia de NGF como se puede observar a partir de los resultados del ensayo MTT (figura 6). Por lo tanto, la quimera IL6R/IL6 tiene un efecto neuroprotector en las neuronas periféricas, sugiriendo una actividad en enfermedades neurodegenerativas similares, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson o LAS (esclerosis lateral amiotrófica). Habiendo descrito completamente la invención, será apreciado por los expertos en la técnica que la misma puede llevarse a cabo en un amplio intervalo de parámetros equivalentes, concentraciones y condiciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención y sin llevar a cabo experimentación.

Referencias Abramsky, O. y Ovadia, H. (1997) Frontiers in Múltiple Sclerosis, clinical research and therapy. Martin Dunitz publisher, London. Ahmed S.A., Gogal, R.M., Jr., Walsh, J. E. (1994) A ne rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternativa to [3H]thymidine incorporation. J. of Immunol. Methods 170,211-224 Anderson, D.J. (1997) Cellular y molecular biology of neural crest cell lineage determination. Trends Genet. 3, 276-280.

Bahr, B. A. (1995). Long-Term hippocampal slices: a model I ' system for investigating synaptic mechanisms and pathologic processes. J. Neurosci Res, 42, 294-304. Bertolotto, C, Bille, K., Ortonne, J.P. y Ballotti, R. (1996) 5 Regulation of tirosinase gene expresión by cAMP in B16 melanoma involves two CATGT motifs surrounding the TATA box: implication of the microftalmia gene product. J. Cell. Biol. 134, 747-755. Bonni A, Sun Y, Nadal-Vicens M, Bhatt A, Frank DA, Rozovsky I, Stahl N, Yanopoulos GD, Greenberg ME (1997) Regulation of gliogenesis in 10 the central nervous system by the JAK-STAT signaling pathway. Science 278, 477-483 Cannella, B., Hobam, CJ. Gao, Y.L et al (1998) The neuregulin, glial growth factor 2, diminishes autoimmune demyelination and enhances remyelination in a chronic relapsing model for Múltiple Sclerosis. Proc. Nati. 15 Acad. Sci. USA, 95, 10100-10105. Chebath, J., Fischer, D., Kumar, A., Oh, J.W., Kollet, O., Lapidot, T., Fischer, M., Rose-John, S., Nagler, A., Slavin, S. y Revel, M. (1997) lnterleukin-6 receptor- lnterleukin-6 fusión proteins with enhanced lnterleukin-6 i type pleiotropic activities. Eur. Cytokins Netw. 8,329-365. 20 Chen, L.E., Liu, K. Seaber, A.V., Katragadda, S., Kirk C y Urbaniak, J.R. (1998) Recombinant human glial growth factor 2 (rhGGF2) improves functional recovery of crushed peripheral nerve (a double-blind study). Neurochem. Int., 33, 341-351.

Fraser, S. E. y Bronner-Frase, M. (1991 ). Migrating neural crest cells in the trunk of the avian embryo are multipotent. Development 112, 913- 920. Gadient, R.A. y Otten, U.H. (1997) lnterleukin-6 (IL-6)-A molecule with both beneficial and destructive potencial. Prog. Neurobiol., 52, 379-390. Hartung, H.P., van der Meche, F.G/, Pollard, J.D. (1998) Guillain-Barre syndrome, CIDP and other chronic immune-mediated neuropathies. Curr. Opin. Neurol., 11 , 497-513 Hirota, H., Kiyama, H., Kishimoto, T y Taga, T. (1996) Accelerated nerve regeneración in mice by upregulated expression of Interleukin (IL) 6 y IL-6 receptor after trauma. J. Exp. Med., 183, 2627-2634. Ho, P.R., Coan, G.M., Cheng, E.T., Niell, C, Tarn, D.M., Shou, H., Sierra, D. y Terris, D.J. (1998) Repair with collagen tubules linked with brain-derived neurotrofic factor and ciliary neutrofic factor in a rat sciatic nerve injury model. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 124, 761-766. Ip NY, Nye SH, Boulton TG, Davis S, Taga T, Li Y, Birren SJ, Yasukawa K, Kishimoto T, Anderson DJ, et al (1992) CNTF y LIF act on neuronal cells via shared signaling pathways that involve the IL-6 signal transducing receptor component gp130. Cell 69:1121-32. Jessen, K. R. y Mirsky, R. (1991). Schwann cell precursors and their development. Glia 4, 185-194. Jungh, M., Krámer, E., Grzenkowsko, M., Blakemore, W., Aguzzi Khazaiu, K., Chlichlia, K., von Blankenfeld, G., Kettenmann, y Trotter, J. (1995). Lines of Murine Oligodendroglial Precursor Cells Immortalized by an Activated neu Tyrosine Kinase Show Distinct Degrees of Interaction with Axons In Vitro and In Vivo. Eur. J. de Neuroscience 7, 1245-1265 Kahn, M.A. y De Vellis, J. (1994) Regulación of an oligodendrocyte progenitor cell line by the ¡nterleukin-6 family of cytokines. Glia. 12, 87-98. Kollet, O., Aviram, R., Chebath, J., Ben-Hur, H.p Nagler, A., Shuitz, L., Revel, M.. y Lapidot, T. (1999) The soluble IL-6 receptor/iL-6 fusión protein enhances maintenance and proliferation of human CD34+CD38-/low /SCID repopulating cells (SRC) in vitro. Blood, en prensa. Kioussi, C. y Gruss, P. (1996) Making a Schwann. Trends Genet., 12, 84-86. Lee, D.A., Zurawel, R.H. y Windebank, A.J. (1995) Ciliary Neurotrophic factor expression in Schwann cells is induced by axonal contact. J. Neurochem. 65, 564-568. Lemke, G. y Chao, M. (1988). Axons regúlate Schwann cell expression of the major myelin and NGF receptor genes. Development 102, 499. Li, R. (1988) Culture methods for selective growth of normal y human Schwann cells. Meth. Cell. Biol., 57, 167-186. Lipton, S. A., y Rosenberg, P. A. (1994). Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders. N Engl J Med, 330, 613- 2.

Lubetzki, C, Demerens, C, Anglade, P., Villarroya, H., Frankfurther, A., Lee., V. M.-Y., y Zalc, B. (1993) Even in culture, oligodendrocytes myelinate solely axons. PNAS 90, 6820-6824. ayer, M., Bhakoo, K. y Noble, M. (1994) Ciliary Neurotrophic factor and Leukemia Inhibitory factor promote the generation, maturation and survival of oligodendrocytes in vitro. Development, 120, 143-153. McDonald, J. W., Althomsons, S. P., Hyrc, K. L, Choi, D. W., y Goldberg, M. P. (1998). Oligodendrocytes from forebrain are highly vulnerable to AMPA/kainate receptor-mediated excitotoxicity. Nat Med, 4, 291-7. Medhurst, A. D., Harrison, dbcAMP, Read, S.J., Campbell, C.A., Robbins, M.J. y Pángalos, M.N. (2000) The use of TaqMan RT-PCR assays for semiquantitative analysis of gene expression in CNS tissues y disease models. J. Neurosci. Methods 15, 9-20. Mendel, I., Katz, A., Kozak, N., Ben-Nun, A. y Revel, M. (1998) lnterleukin-6 functions in autoimmune encephalomyelitis: a study in gene-targeted mice. Eur. J. Immunol. 28, 1727-1737. Mosmann, T. (1983). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65, 55-63. Murakami, M., Hibi, M., Nakagawa, N., Nagakawa, T. Yasukawa, K., Yamanishi, K., Taga, T. y Kishimoto, T. (1993) IL-6 induced homodimerization of gp 130 and associated activation of a tyrosine kinase. Science 260, 1808-1810.

Novick, D., Shulman, L.M., Chen, L. y Revel, M. (1992) Enhancement of interleukin-6 citostatic effect on human breast carcinoma cells by soluble IL-6 receptor from uriñe and reversión by monoclonal antibodies. Cytokine, 4, 6-11. Pantoni, L, Garda, J. H., y Gutiérrez, J. A. (1996). Cerebral white matter is highly vulnerable to ischemia. Stroke, 27, 1641-6. Pizzi, M., Fallacara, C, Arrighi, V., Memo, M., y Spano, P. F. (1993). Attenuation of excitatory amino acid toxicity by metabotropic glutamate receptor agonists and aniracetam ¡n primary cultures of cerebellar granule cells. J Neurochem, 61 , 683-9. Pohiau, D., Aktas, O., Epplen, C. Hartung, H.P., Hoffmann, V. y Przuntek, H. (1998) Promoting remyelination as a future therapeutic principie in Múltiple Sclerosis. Nervenarzt, 69, 841-850. Sahenk, Z., Seharaseyon, J., y Mendell, J. R. (1994). CNTF potentiates peripheral nerve regeneration. Brain Res, 655, 246-50. Stocker, K.M, Sherman, L, Ree, S. y Ciment, G. (1991 ) Basic FGF and TGF-betal influence commitment to melanogenesis in neural crest-derived cells of avian embryos. Development, 111 , 635-645. Taga, T., Hibin M., Hirata, Y., Yanasaki, K., Yasukawa, K., Matsuda, T., Hirano, T. y Kishimoto, T. (1989) lnterleukin-6 triggers the association of its receptor with a possible signal transducer gp 130. Cell, 58, 573-581.

Topliko, P., Murphy, P. y Charnay, P. (1996) Embryonic development of Schwann cells: Múltiple roles for Neuregulins along the pathway. Mol. Cell. Neuroso., 8, 71-75. Toulmond, S., Vige, X., Fage, D., y Benavides, J. (1992). Local infusión of interleukin-6 attenuates the neurotoxic effects of NMDA on rat striatal cholinergic neurons. Neurosci Lett, 144, 49-52. Trapp, B. D., Hauer, P. y Lemke, G. (1988). Axonal regulation of myelin protein mRNA levéis in actively myelinating Schwann cells. J. Neurosci. 8. 3515. Trojaborg W (1998) Acute and chronic neuropathies: new aspects of Guillain-Barre syndrome and chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, an overview and an update. Electroencephalogr Clin Neurophysiol., 107, 303-316. Watanabe, A., Takeda, K., Plopis, B. y Tachibana, M. (1998) Epistatic relationship between Waardenburg syndrome genes MITF and Pax3. Nature Genet., 18, 283-286. Yamada, M., y Hatanaka, H. (1994). lnterleukin-6 protects cultured rat hippocampal neurons against glutamate-induced cell death. Brain Res, 643, 173-80.

Claims (4)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 5 1.- El uso de la quimera IL6RIL6 sola o junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para la elaboración de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades y trastornos neurológicos. 2. - El uso de conformidad con la reivindicación 1 , para la elaboración de un medicamento para tratar degeneración nerviosa traumática, 10 enfermedades de desmieilnización del CNS o PNS y/o enfermedades neurodegenerativas. 3. - El uso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la enfermedad de desmieilnización es esclerosis múltiple (MS). 15 4.- El uso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la enfermedad neurodegenerativa se selecciona a partir de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y ALS. * 5 - Una composición farmacéutica que comprende quimera i ¾ IL6RIL6, opcionalmente junto con uno o más excipientes farmacéuticamente 20 aceptables, para tratar y/o prevenir una enfermedad o desorden neurológico. 6.- La composición farmacéuticamente de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque comprende quimera IL6RIL6, opcionalmente junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, para tratar degeneración nerviosa traumática, enfermedades de desmielinización del CNS o PNS y/o enfermedades neurodegenerativas. 7. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la enfermedad de desmielinización es MS. 8. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque la enfermedad neurodegenerativa se selecciona a partir de enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y ALS.