CN1364088A - 治疗神经变性疾病的il6ril6嵌合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及采用IL6RIL6嵌合物治疗和预防神经性疾病和神经紊乱。

Description

治疗神经变性疾病的IL6RIL6嵌合物

技术领域

本发明总地涉及神经疾病和神经紊乱领域，具体涉及神经变性疾病、神经保护、神经髓鞘生成和生成髓鞘的细胞的产生。更具体地说，本发明提供IL6RIL6嵌合物用于制造治疗神经性疾病或紊乱，尤其是保护神经和治疗脱髓鞘疾病，并增强神经再生的药物。

技术背景

神经髓鞘的形成是中枢神神经系统(CNS)和周围神经系统(PNS)形成和发挥作用的基本过程。包围轴突的髓鞘是电脉冲沿神经正常传导所必须的。髓鞘丧失见于许多疾病，其中有影响到CNS的多发性硬化症(MS)、急性感染性多神经炎(Guilain-Barre Syndrone)CIDP等(见Abramsky和Ovadia 1997；Trojaborg，1998；Hartung等1998)。虽然病因多样，如传染性病源，或自身免疫攻击等，但脱髓鞘病都会导致神经功能丧失，可能导致瘫痪和死亡。虽然目前的治疗药物减少了MS中的炎症损伤并延缓了疾病发展，然而仍需要发展能导致髓鞘再生和神经功能恢复的疗法(Abramsky和Ovadia 1997，Pohlan等1998)。

合成髓鞘的是特异性神经胶质细胞：CNS中的少突神经胶质细胞和PNS中的生髓性许旺细胞。这两类细胞在其完全分化阶段可称为髓鞘生成性细胞。髓鞘是一种由含不同蛋白质的脂性膜结构。髓鞘碱性蛋白(MBP)是CNS和PNS髓鞘蛋白的主要成分(30％)。在少突神经胶质细胞和髓鞘生成性许旺细胞的终未分化期间，MBP基因和编码各种髓鞘蛋白的其他基因(如PNS的P0、PMP-22、MAG，CNS的PNS、PLP、MOG)的表达变得活跃。这些细胞起源于胚胎神经嵴(Fraser 1991)，从该嵴迁移出并经历了有许多步骤的分化过程。许旺细胞(SC)的发育看来包括三个主要步骤：1)从移行细胞产生前体细胞(pSC)；2)增殖并转变成胚胎SC(eSC)，表达S100蛋白；3)出生后部分eSC群最终分化为生髓SC，表达MBP和其他髓鞘蛋白(Kioussi和Gruss 1996)。从神经嵴迁出的细胞不仅有pSC，还有感觉和交感神经元、平滑肌细胞和到达皮肤与毛囊的细胞，以及产生色素的黑素细胞。神经嵴细胞的命运受到各种诱导因子的影响：分别在诸如胶质细胞生长因子(GGF)、BMP2/4和TGF-β的神经调节素，促进下分化成神经胶质细胞、神经元和肌细胞(Anderson1997)。生长因子，如bFGF或PDGF或SDF，可促进黑素细胞的分化(Stocker等1991；Anderson 1997)。

许旺和少突神经胶质祖代细胞最终分化成活跃的生髓细胞。髓鞘生成本身似乎依赖于神经轴突和胶质细胞之间相互反应所产生的信号(Lemke和Chao1998，Trapp等1988)。当轴突一许旺细胞接触中断时，如神经损伤后，细胞逆转为非生髓状态，髓鞘蛋白基因失去表达(Jessen和Mirsky 1991)。在神经疾病或创伤后为了能刺激髓鞘形成或髓鞘再生，极其重要的可能是鉴定能诱导髓鞘合成的因子。

急性损伤(包括创伤、缺氧和局部缺血)诱导的CNS损伤，可影响到神经元和白质。虽然最大注意力给予了导致神经元死亡的过程，但越来越多的证据提示少突神经胶质细胞(形成髓鞘轴突)的损伤也是CNS损伤的特殊组成部分。大鼠脑局部缺血后的早早期3小时显示少突神经胶质细胞起着病理作用，提示这些细胞比神经元细胞对兴奋毒素的作用甚至更敏感(Pantoni等1996)。介导细胞死亡的一种可能候选因素是许多急性CNS损伤都伴有谷氨酸浓度的显著升高(Lipton等1994)。的确，除神经元外甚至发现少突神经胶质细胞也能表达AMPA/红藻氨酸亚型的功能性谷氨酸受体。然而，少突神胶质细胞对施加的谷氨酸显示了高脆弱性(易受伤)。

作用于胚胎前体许旺细胞的神经调节素，如GGF，也是出生后受损神经中少突神经胶质细胞和许旺细胞的存活、生长和成熟因子。GGF是轴突接触所提供的有丝分裂因子之一(Topliko等1996)。在多发性硬化病的小鼠模型(Cannella等1998)或碾压伤的外周神经(Chen等1998)中，长时间给予重组hGGF₂能促进髓鞘的生成。许旺细胞轴突接触诱导的另一种细胞因子是睫状神经营养因子CNTF(Lee等1995)。CNTF和白血病抑制因子(LIF)显示能促进体外与bFGF或PDGF一起培养的眼神经少突胶质细胞的存活，并提高这些培养物中表达少突胶质细胞的MBP数量(Mayer等1994)。然而，当CNTF和LIF加入前体胶质细胞中时，它们看来倒是促进星形细胞的分化和诱导星形细胞GFAP标记的表达，对少突胶质细胞主要是存活作用而对MBP基因表达的水平作用很小(Kahn和DeVallis 1994，Bonni等1997)。但CNTF与脑产生的神经营养因子BNDF合用，促进了损伤的外周坐骨神经的恢复(Ho等1998)。

CNTF和LIF是通过一共同受体系统起作用的细胞因子，该系统包括LIF受体(LIFR)和gp130链，gp130链是白介素-6(IL-6)受体复合物的一部分(Ip等人1992)，因此，CNTF和LIF是细胞因子IL-6家族的一部分。对于CNTF和LIF，通过LIFR与gp130形成二聚体而开通信号转导，而IL-6是通过两条gp130链形成二聚体产生信号(Murakami等1993)。为了结合gp130，IL-6与IL-6受体链(存在于某些细胞上，是一种gp80跨膜蛋白质，其可溶形式当从细胞外提供时，也可能起IL-6激动剂的作用)形成复合物(Taga等1989，Novick等1992)。使编码可溶性IL-6受体(sIL-6R)的cDNA的整个编码区与IL-6融合，可在CHO细胞中产生重组IL6RIL6嵌合物(Chebath等1997，WO99/02552)。该IL6RIL6嵌合物提高了IL-6型的生物活性，与IL-6和sIL-6R的混合物相比，其与gp130链以高得多的效率相结合(Kollet等1999)。

综合IL-6对中枢和外周神经系统细胞的作用，表明该细胞因子对神经元细胞有保护作用，以及参与炎症性神经变性过程(Gadient和Otten 1997，Mendel等1998)。对胶质细胞的活性，CNTF和LIF比IL-6对星形细胞分化的刺激作用高得多，对髓鞘蛋白产生细胞无作用(Kahn和De Vellis 1994)。发现IL-6能防止海马回(Yamada等1994)和纹状体(Toulmond等1992)神经元中谷氨酸诱导的细胞死亡。IL-6保护神经抵抗NMDA引发的毒性的机制，及对NMDA亚型谷氨酸受体的选择性兴奋仍未明。实际上发现IL-6能加强NMDA介导的细胞内钙升高。在表达较高水平IL-6和可溶性IL-6R(sIL6-R)的转基因小鼠中，如脑中舌下神经核退变所示，观察到舌下神经损伤后，神经的再生加速(Hirota等1996)。在该研究中，将IL-6和sIL-6R加到背根神经节(DRG)细胞培养物中，显示增加了神经元的轴突伸展，但未报告对髓鞘形成细胞有作用。

根据上述资料，CNTF、LIF或IL-6和sIL-6R的混合物均未显示能诱导胶质细胞最后分化成髓鞘产生细胞。然而，综上所述，刺激髓鞘生成细胞的分化对患脱髓鞘疾病或神经变性疾病的患者可能有很大好处。

本文引用的文件不意味承认这些文件或所述材料是与本申请权利要求的专利性相关的现有技术，对于任一文件的内容或日期的陈述是以申请人在提交专利申请时可得到的信息为基础的，并不构成对这些陈述正确性的认可。

发明简述

本发明的目的是提供治疗和/或预防神经性疾病或紊乱的方法。具体讲，本发明的一个目的是提供一种刺激或增强分化的胶质细胞或其前体细胞分化形成髓鞘生成细胞的方法。本发明的基础是应用重组IL6RIL6嵌合蛋白，该嵌合蛋白与IL-6和sIL-6R的混合物相比对gp130明显地具有更高的亲和力。

本发明另一目的是提供一种刺激或增强受损神经纤维髓鞘形成或再生的方法，如除了IL-6嵌合物体外诱导生髓鞘基因的髓鞘生成作用外，体内坐骨神经轴突切开术后诱导轴突髓鞘再生的那样。

本发明另一目的是采用IL6RIL6嵌合物来提高背根神经节(DRG)培养物中许旺细胞发育数。另外，本发明的目的是利用IL6RIL6来诱导这些细胞分化包裹到轴突周围并产生髓鞘碱性蛋白，如许旺细胞系与原代DRG共同培养所示。

本发明另一目的是利用IL6RIL6嵌合物来诱导转分化系统中髓鞘碱性蛋白(MBP)基因的转录。在此转分化系统中，具有黑素细胞表型的细胞转变成许旺生髓鞘表型细胞，如IL6RIL6对小鼠黑色素瘤的作用所示。

本发明另一目的是采用IL6RIL6嵌合物作为神经保护剂来防止海马回中涉及记忆密码的区域神经细胞的死亡，在阿尔茨默病和局部缺血时海马回的此区域显示早期变性。

本发明另一目的是采用IL6RIL6嵌合物作为保护剂来对付兴奋性氨基酸所引起的神经毒性过程，如在新生大鼠小脑神经元原代培养中IL-6嵌合物提供的对谷氨酸诱导的神经毒性的保护作用。

本发明还提出了IL6RIL6诱导和抑制特异性转录因子的分子机制，该转录因子诱导MBP基因分化为生髓鞘表型。

因此，本发明提供了IL6RIL6嵌合物用于制造治疗和/或预防神经性疾病和紊乱的药物的用途。具体说，本发明提供IL6RIL6嵌合物用于制造治疗CNS或PNS的创伤性神经变性、脱髓鞘疾病和/或神经变性疾病药物的用途。

更具体说，本发明提供IL6RIL6嵌合物在治疗多发性硬化症(MS)、阿尔茨默病、帕金森病或ALS中的用途。

本发明还提供用于治疗和/或预防神经性疾病和紊乱的药物组合物，包含IL6RIL6嵌合物和可任选地加入一种或多种药学上可接受的赋形剂。具体说该药物组合物用于治疗CNS或PNS的创伤性神经变性、脱髓鞘病和/或神经变性疾病。

本发明药物组合物的较佳用途是治疗MS、阿尔茨默病、帕金森病或ALS。

附图简述

图1显示用IL6RIL6嵌合物或毛猴素(FSK)处理或不处理(NT)的许旺细胞培养物中，MBP RNA的增加情况。

图2显示用不同量IL6RIL6嵌合物处理24、48和72小时后，测得的未分化的少突神经胶质细胞的增殖情况的测定。

图3显示在F10.9细胞整个培养时间中IL6RIL6强烈诱导了MBP mRNA(A)和减少了Pax-3mRNA(B)，NT为未处理细胞。

图4显示IL-6单独和IL-6嵌合物对海马器官型切片中NMDA所介导的神经毒性的神经保护作用的比较。

图5显示在海马器官型切片中IL-6嵌合物的长效神经保护作用和IL-6单独的作用。

图6显示IL6RIL6嵌合物处理24小时后，对取去NGF的神经元存活的作用，以MTT试验测定。

发明详述

本发明发现，在培养的背根神经节细胞或黑色素病细胞中加入IL6RIL6重组蛋白能刺激这些细胞分化成髓鞘生成细胞，还发现在共培养的神经元和许旺细胞中加入IL6RIL6重组蛋白能诱导后者形成有规律地围绕轴突的髓鞘。因而本发明涉及采用IL6RIL6嵌合物来制造能产生髓鞘生成细胞，或刺激、增强或加速髓鞘生成细胞产生的药物。

此种IL-6嵌合物还在体内诱导了大鼠坐骨神经轴突切开术后，横断纤维的髓鞘再生。因此，本发明还涉及采用IL6RIL6嵌合物来制造神经创伤或损伤或轴突损伤后能诱导、增强或加速髓鞘再生的药物。

还发现在器官型培养物中加入IL6RIL6重组蛋白诱导了对抗神经毒剂的长时间保护作用，因此，本发明还涉及采用IL6RIL6嵌合物来制造能诱导、增强、延长或加速神经保护作用抵抗神经毒剂的药物，以及能抑制、降低或减缓神经细胞死亡(例如，可能因为凋亡而死亡)的药物。

本发明涉及的IL6RIL6嵌合物(又称IL6RIL6或IL-6嵌合物)是一种重组糖蛋白，得自将天然可溶性IL-6受体δ-Val的编码全序列与成熟的天然IL-6的整个编码序列(二者均为人源性)融合而成。可在适当的真核细胞，如酵母细胞、昆虫细胞等中生产该IL6RIL6嵌合物，优选在哺乳动物细胞中。最优选在WO99/02252所述的基因工程改造的CHO细胞中生产。本领域技术人员懂得，虽然该蛋白质优选人来源的，但其他来源的类似融合蛋白也可用于本发明，只要它保留了上述生物学活性。

更具体说，本发明涉及采用IL6RIL6嵌合物来刺激分化的胶质细胞或其前体细胞分化为髓鞘生成细胞。如本文所示，IL6RIL6诱导的髓鞘生成细胞的分化过程，包括活化形成围绕神经轴突的髓鞘所需的基因，并抑制维持非髓鞘生成表型所需的基因两种过程。

本发明发现，在培养的胚胎背根神经节(eDRG)细胞(分离得自妊娠14～15天的小鼠胚胎)中加入IL6RIL6嵌合物，在存在DRG时，对前体许旺细胞的发育产生了显著的影响：培养2～5天后，胚胎许旺细胞的数量显著增加，其表型发生显著改变，它们的膜开始包裹围绕DRG轴突，并且MBP诱生。本发明还发现在许旺细胞与神经元的共培物中IL-6嵌合物在5小时内诱导了明显增加的许旺细胞沿无髓鞘轴突的结合。用荧光素金标记的许旺细胞伸长几天后，可见它们的荧光胞质形成围绕轴突的规则性鞘。不用该嵌合物或用NGF，许旺细胞结合少得多，而且不形成鞘。

因此，本发明还涉及采用IL6RIL6嵌合物来制造能诱导许旺细胞增殖或/和分化以及能使外周神经系统中许旺细胞形成髓鞘的药物。

本发明还显示IL-6嵌合物能在体内诱导外周神经的髓鞘形成。大鼠坐骨神经轴突切开术和近侧端和远侧端残枝的对合后，IL-6嵌合物能诱导体内外周神经再生和横断纤维的髓鞘再生。发现存在IL-6嵌合体时形成的髓鞘纤维数量和厚度增加4倍，远侧端纤维的髓鞘再生增加，因此本发明还涉及采用IL6RIL6嵌合物来制造能诱导外周神经系统髓鞘再生的药物。

另外，本发明发现IL-6嵌合物能在外周神经系统的髓鞘生成细胞(如许旺细胞)和在中枢神经系统的细胞(如少突神经胶质细胞)中，诱导编码髓鞘蛋白质成分的基因，如MBP、PLP和PO基团的表达。

因此，本发明还涉及采用IL6RIL6嵌合物来制造能诱导中枢神经系统少突神经胶质细胞髓鞘生成和/或髓鞘再生的药物。

本发明还发现在培养的B16/F10.9小鼠黑色素瘤细胞系中加入IL6RIL6嵌合物在6～12小时内诱导MBP基因的表达。编码髓鞘蛋白的其他基因，如CNP酶基因也被诱导，但涉及黑色素生成(黑色素色素的形成)如酪氨酸酶的基因表达受到强烈抑制，经IL6RIL6处理的F10.9细胞也发生了显著的形态学变化，获得了许旺样表型。表型的变化和特异性髓鞘质基因的诱导支持以下假设：即IL6RIL6引起这些细胞从黑素瘤细胞状态转分化为髓鞘生成状态。因为胚胎中，从神经嵴迁移出的细胞可产生黑色素瘤细胞或髓鞘生成许旺细胞和少突神经胶质细胞。这提示IL6IL6可能影响到这些细胞的归宿，并促进髓鞘生成细胞的形成。因此，本发明还涉及采用IL6RIL6嵌合物来制造能诱导、促进、增强或加速中枢和外周神经系统中髓鞘生成细胞的形成和/或能诱导黑色素瘤细胞转分化为髓鞘生成细胞的药物。

此外，本发明显示IL6RIL6作用是下调同源异型框基因Pax-3(一种在胚胎神经嵴细胞分化为髓鞘生成性许旺细胞前在此细胞中表达的基因)(Kioussi和Grass 1996)。已知，Pax-3抑制MBP基因。因此，看来Pax-3抑制是髓鞘生成细胞最终成熟中的关键，故IL6RIL6作用于关键性的分化转换(即Pax-3抑制)。

Pax-3是micropthalmia相伴随的转录因子MITF的反式激活蛋白，MITF进而诱导和维持酪氨酸酶及负责黑素细胞表型的其他基因的表达。IL6RIL6快速抑制Pax-3这一发现可解释促进神经嵴衍生细胞髓鞘生成活性的分子活动。神经损伤后，有髓鞘的轴突经历了作为华勒氏变性一部分的脱髓鞘。此期间许旺细胞减少了MBP基因和其他相关的髓鞘质蛋白基因的表达。伴随Pax-3和GFAP的上调，这意味着从髓鞘生成性SC逆转为非髓鞘生成性和增殖性SC(Kioussi和Gruss 1996)。根据本发明看来IL6RIL6嵌合物是抑制Pax-3和诱导SC恢复其髓鞘生成活性，从而逆转华勒氏神经变性的一种强细胞因子。同样的考虑适用于脑脱髓鞘疾病，因为如创伤中，巨噬细胞和其他炎症细胞触发的脱髓鞘过程加重了这些疾病中的神经变性。因此，本发明还涉及采用IL6RIL6嵌合物来制造治疗神经损伤和/或创伤性神经变性和/或轴突损伤的药物。

给免疫接种MBP而诱生了自身免疫性脱髓鞘的小鼠(慢性复发性多硬化症的一种模型系统)注射IL6RIL6(Cannella等1998)。用这种药学范例，可观察IL6RIL6体内诱导髓鞘质蛋白基因表达和髓鞘生成细胞分化的能力。因此本发明还涉及采用IL6RIL6嵌合物来制造治疗和/或预防自身免疫性脱髓鞘疾病，特别是治疗和/或预防多发性硬化症的药物。

还显示IL-6嵌合物具有神经保护作用，能在阿尔茨默病和局部缺血中预防毒性物质在记忆编码区所引起的神经细胞活力丧失和抑制早期变性。发现IL-6嵌合物能保护神经免受谷氨酸引起的神经毒性作用，因此本发明涉及制造保护神经细胞避免死亡(特别是由于神经毒性物质所引起的)，以及治疗和/或预防阿尔茨默病、帕金森病或ALS等神经变性疾病的药物。

可用IL6RIL6嵌合物治疗的其他神经疾病是中风、运动失调、癫痫、疼痛等。

“药学上可接受的”意指包括不干扰活性成分的生物活性作用并对宿主无毒性的任何载体。例如，对于胃肠外给药而言，IL6RIL6嵌合物可以注射用单位剂量形式配制在赋形剂(如盐水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和Ringer溶液)中。

可以各种方法将IL6RIL6嵌合物给予需要治疗的病人，给药途径包括皮内、透皮(在缓释制剂中)、肌内、腹腔内、静脉内、皮下、口服、硬膜外、局部和鼻内途径。亦可采用其他治疗上有效的给药途径，例如通过上皮或内皮组织吸收、或基因治疗，基因治疗时将编码IL6RIL6嵌合物的DNA分子给予病人(通过一载体)导致体内表达和分泌IL6RIL6嵌合物。此外IL6RIL6嵌合物可与其他生物活性成分，如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、载体、稀释剂和运载体一起给予。

对于胃肠外给药(静脉内、皮下、肌内)，可将IL6RIL6与药学上可接受的胃肠赋形剂(如水、盐水、葡萄糖溶液)和维持渗透性(如甘露醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲剂)的添加剂一起配制成溶液、混悬液、乳剂或冻干粉剂。用常用技术将制剂灭菌。

“有效量”指足以影响到上述疾病病程和严重程度、导致病情减轻或缓和的有效成分的量。有效量取决于给药途径和病人状况。

以单剂或多剂给予病人的剂量视各种因素而不同，包括IL6RIL-6嵌合物的药物动力学性质、给药途径、病人情况和特点(性别、年龄、体重、健康和块头大小)、疾病程度、同时的治疗、治疗频率和要求的效果。已确定剂量范围的调整和控制，以及测定神经髓鞘再生的体内外方法，是技术人员能力中的事。

虽然本发明结合具体实施例作了描述，但应明白可作进一步的改进。本申请旨在覆盖任何变化、应用和适应性变化，它们一般来说遵循本发明原则，是本发明所属领域已知的或可从常规实践中得出的，以及如所附权利要求范围所述适合上述基本特征的未在本发明中公开的内容。本发明的原理和不脱离本文公开的内容都可如本发明权利要求所述的基本特征应用本领域已知的或习惯的方法实施。

本文引用的所有参考文献，包括杂志文章或摘要、公开或未公开的专利申请、出版物或外国专利或其他参考文献，全都纳入本文作参考，包括所有数据表格、附图和文章，在这些文献中所引的文献的全部内容也全部纳入本文作为参考。

本发明通过以下非限制性实施例和附图将作更详细的描述。

实施例

实施例1 IL6RIL6体外对髓鞘生成和髓鞘再生的作用

脊髓中背根主要包含感觉神经元，它们在背根神经节(DRG)中形成突触。小鼠胚胎形成期(e14～e15天)DRG是神经元和胚胎许旺细胞(还没分化成髓鞘生成性SC)的方便来源。Li(1998)描述了获得体外培养的DRG外植体的方法，将其置于Costar板孔中的盖玻片上以F12/DMEM培养液(Glbco)进行培养，用胶原或用聚-D-赖氨酸包被盖玻片效果基本相似。在不加生长因子或细胞因子添加物的培养液中，或在添加神经生长因子(NGF 40μg/ml)的培养液或添加IL6RIL6嵌合重组蛋白(3μg/ml)的培养液中进行培养。每日以连有图象摄影成象系统(Lecia LIDA系统)的Olympus倒置显微镜检查培养物。以多聚甲醛固定部分盖被片并用抗髓鞘碱性蛋白的单克隆第一抗体和偶联荧光素的第二抗体标出MBP蛋白质，用抗神经微丝蛋白的抗体染色神经元细胞体和轴突，用扫描电镜(EM)检查某些盖玻片。

2-5天后，物添加物培养的DRG外值体显示，长出外植体的细胞呈现多角形或卵形。然而，加入NGF时卵形细胞长出长的轴突突起，形成可被抗神经微丝抗体染色的细网络。某些轴突呈长分叉状但沿轴突未看到许旺细胞。相反，加IL6RIL6的培养物不仅显示带有神经微丝染色轴突的神经元细胞，而且有呈扁平的许旺细胞，它们具有未端分枝的双极长伸展状，这些伸展不能作为神经微丝蛋白染色。扫描电镜清晰地观察到这些许旺细胞沿轴突突起以边缘波纹的膜开始包裹围绕轴突。

抗MBP染色显示IL6RIL6处理的培养物中，特别是一个接一个排列的细胞阵列中，许旺细胞呈阳性染色，另一方面在NGF处理而无IL6RIL6的培养物中几乎没看见MBP特异性荧光。

在妊娠15天的大鼠胚胎DRG培养物中观察到类似结果。

将来自小鼠坐骨神经的许旺细胞与1.4g/ml IL6RIL-6一起进行体外培养，测定MBP RNA转录水平。相比较，用毛猴素20M处理同一培养物，这是一种人为增加细胞AMP的水平并诱导cMBP的化学物质(Lemke和Chao 1998)。结果显示，培养3天后IL6RIL6诱导MBP基因表达的效果与毛猴素一样，对维持MBP RNA水平则更有效(图1)。

在18天胚胎背根神经节(DRG)细胞的研究中，发现IL-6嵌合物在三天内诱导MBP和POmRNA的表达，而同一细胞系统中Pax-3 mRNA受到强烈抑制。IL-6嵌合物对PO和MBP基因表达作用的剂量依赖曲线显示，IL-6嵌合物于500ng/ml时显示最大效应，因此，IL-6嵌合物看来是正常神经细胞胶质基因表达的重要诱导剂。

制备了来自大鼠坐骨神经或大鼠背根神经节(ORG)细胞的许旺细胞系以供进一步研究IL-6嵌合物的效应。

如RT-PCR和Northern印迹分析所测定，发现来自大鼠坐骨神经的许旺细胞系在对IL-6嵌合物的反应中诱生了2～3倍的PO基因(表达)，其蛋白产物形成了约50％的外周神经髓鞘。

为了研究IL-6嵌合物对髓鞘基因成分的转录活化，将MBP启动子导入一表达载体中，该载体位于荧光素酶报道基因的上游并在大鼠坐骨神经许旺细胞中检出。在缺乏毛猴素时，在这些细胞对IL-6嵌合物的反应中观察到诱导了高达7倍的MBP启动子转录活性。在其他报道基因试验中发现，IL-6嵌合物在这些细胞中诱导了PO基因启动子2.5倍转录活性。

上述结果提示IL-6嵌合物对有关的许旺细胞中髓鞘基因的转录有直接作用。

从大鼠背根神经节(DRG)分离得到另一许旺细胞系，命名为CH细胞系，发现此细胞系生长速度慢，生长依赖于IL-6嵌合物(14ng/ml)。令人感兴趣的是，CH细胞为星形，类似于少突神经胶质细胞。此细胞显示IL-6嵌合物诱导而产生髓鞘的功能。该细胞表达PO和MBP，当在含有血清但缺乏此嵌合物的培养液中培养时死亡。

实施例2：体外抑制少突神经胶质细胞增殖

研究了IL-6嵌合物对中枢神经系统细胞的作用。已明确少突神经胶质细胞的分化伴随着其增殖的抑制，这促进了少突神经胶质细胞形成鞘和髓鞘。

因此，测定了体外IL6RIL6嵌合物抑制少突神经胶质细胞增殖的能力。此实验采用了带t-neu癌基因的无限增殖小鼠原代少突神经胶质细胞(“oli-neu”细胞)系。Jung等人(1993)描述了此细胞系的建立、性质和培养条件。

1、2和3天后，测定未分化oli-neu细胞对不同剂量IL6R/IL6嵌合物(1g/ml，500ng/ml，250ng/ml，125ng/ml和0ng/ml(对照))的增殖反应，通过用荧光分光/比色生长指示剂，Alamar兰，测定细胞代谢活性来定量测定生长速率。该试剂含有氧化还原指示剂，在因细胞生长所致生长培养基化学还原的反应中可显示荧光和色泽的双重变化。Ahmed等(1994)和美国专利5,501,959描述了该试剂和试验。

结果见图2。少突神经胶质细胞培养液中加入IL6R/IL6嵌合物48小时后导致生长显著降低，72小时后与对照相比生长降至40～50％。令人感兴趣的是，最高量(1g)IL6R/IL6嵌合物作用比较低量(500～125ng/ml)差。

此实验显示IL6R/IL6嵌合物能强烈抑制少突神经胶质细胞体外增殖，表明它是该细胞分化的促进剂。因为少突神经胶质细胞是CNS中产生髓鞘的胶质细胞，故IL6R/IL6嵌合物可能是活跃促进体内髓鞘生成的一种物质。

实施例3：IL6R/IL6嵌合物对少突神经胶质细胞形态的影响

为了研究IL-6嵌合物对少突神经胶质形态的影响，以1g/ml IL 6 R/IL6嵌合物培养Oli-neu细胞(见实施例2)3天。

二丁基cAMP(dbcAMP)是一种已知能诱导少突神经胶质细胞分化的物质(见例如Jung等1995)为了研究加入IL6R/IL6嵌合物对dbcAMP的形态作用有何影响，用dbcAMP预处理oli-neu细胞3天，然后加入IL6R/IL6嵌合物与dbcAMP。平行试验用IL6R/IL-6嵌合物(不预处理)处理细胞。

用相差显微镜或通过少突神经胶质细胞标记物CNP酶(2，3-环化核苷3’-磷酸二酯酶)和GalC(唾液酸神经节苷脂和硫苷脂)的免疫组织化学染色(采用髓鞘脂质半乳糖脑苷脂的特导性抗体A2B5)来评估形态学变化。

在Oli-neu细胞中加入IL6R/IL6嵌合物诱导了显著的形态学变化。细胞胞体装配成一排排，变得更长，细胞本身伸长似乎融合在一起，表明进入分化后期。

用免疫组织化学显示了少突神经胶质细胞标记物的表达，细胞对少突神经胶质细胞的特异性标记物A2B5抗原和CNP酶呈阳性，但对星形胶质细胞标记物GFAP呈阴性，这表明确实保持了少突神经胶质细胞的表型。

DbcAMP预处理和IL6R/IL6嵌合物与dbcAMP联合处理3天后，增加了鞘生成少突神经胶质细胞的数量。单用IL6R/IL6嵌合物除看见伸长的细胞外，这些细胞的形态学看起来更象分化细胞。可见片层状的细胞，表明为分化后期。

结论是：用IL6R/IL6嵌合物体外处理导致少突神经胶质细胞形态学变化，这进一步支持其作用为少突神经胶质分化和髓鞘生成的诱导剂。

实施例4：IL-6嵌合物对神经元许旺细胞相互作用的影响

通过在存在DNA合成抑制剂阿拉伯糖C(AraC)和氟化脱氧尿苷(FudR)时培养小鼠DRG，可见神经元细胞产生轴突而胶质细胞增殖受到抑制。这些DRG培养物可用作无髓鞘轴突神经元细胞的来源。将许旺细胞外源性加入这些培养物中以研究神经元和许旺细胞之间的相互作用。

用氟化金，一种能渗透细胞膜脂质双层并长时间保持而不影响细胞功能的标记物，标记大鼠坐骨神经许旺细胞系细胞。在存在IL-6嵌合物下共培养神经元细胞和这些许旺细胞，5小时内导致沿轴突结合的许旺细胞显著增加。这些细胞伸长，几天后可见它们的荧光胞质围绕轴突形成有规律的鞘。不用此嵌合物或用NGF，许旺细胞的结合大大减少并且不形成鞘。这些结果显示IL-6嵌合物对胶质细胞与神经元的相互作用有非常快的效应，提示诱导或活化了粘附分子。此系统可研究髓鞘生成过程中受IL-6嵌合物影响的各个步骤。

实施例5：IL6R/IL6嵌合物对神经元和少突神经胶质细胞混合培养物中髓鞘形成的影响

为了进一步研究IL6R/IL6嵌合物诱导髓鞘生成的活性，制备了小鼠E15(胚胎15天)大脑半球的解剖培养物。制备和培养条件如Lubetzki等(1993)所述。原代细胞维持培养8天，然后加入IL6R/IL6(1.5g/ml)培养11天。

MBP(髓鞘碱性蛋白质)和少突神经胶质细胞特异性蛋白PLP(蛋白脂性蛋白)是成熟和/或髓鞘生成少突神经胶质细胞的标志，并且是CNS髓鞘质的主要组成部分。因此它们可用作评估细胞培养中髓鞘活跃产生的标志。

在此培养条件下第4天无髓鞘生成，因此在该试验中用第4天的mRNA作为标准对照。在此条例下第19天，细胞培养中观察到髓鞘形成。

于第4和第19天，从处理和未处理的孔中抽提mRNA以定量测定MBP和PLPmRNA。

用实时定量RT-PCR法(Medhurst等2000)测定了MBP、PLP和GAPDH的mRNA作为内对照RNA，采用PE Applied Biosystems Prism model 7700测序检测仪。

结果总结于下表1。进行了两次独立试验。表明mRNA表达是第4天对照RNA表达的数倍。两试验中IL6R/IL6嵌合物明显增加了MBP和PLP的表达2倍，再次支持IL6R/IL6嵌合物的作用是髓鞘形成的诱导剂或增强剂。

表1：MBP和PLP在原代皮质培养物中的表达

                第4天对照    第19天对照    第19天IL6R/IL6嵌合物

实验I

MBP             1            72            181

PLP             1            1265          2157

实验II

MBP             1            187           2157

PLP             1            1884          4198

结论：实施例1-5显示IL6R/IL6嵌合物具有抗增殖、诱导和分化髓鞘形成活性。IL6R/IL6嵌合物的这种活性强烈提示IL6R/IL6嵌合物在外周和中枢神经系统髓鞘形成中的有益作用。这种作用可用于CNS和PNS神经元的髓鞘生成缺陷、脱髓鞘和髓鞘形成不足等疾病。IL6R/IL6嵌合物可能是治疗，例如多发性硬化症等脱髓鞘疾病和/或髓鞘再生的有效制剂。

实施例6：嵌合物对体内外周神经再生的作用

在体内试验中，将大鼠坐骨神经轴突切开术后近端和远端残枝对接，可诱导外周神经再生，并可诱导横断的纤维再生成髓鞘(Sahenk等，1994)。检验了轴突切开术后IL-6嵌合物对外周神经髓鞘再生的作用。手术当天开始，每隔2天腹腔内给予大鼠(7只)100mcg/kg剂量的sIL-6/IL-6嵌合物共12天。对照动物(9只)注射PBS。12天后用透射电镜分析轴突切开下方2.5和5mm再生神经的切片并评价恢复纤维的数目。

在存在IL-6嵌合物时，与PBS处理的对照相比，发现轴突切开下方2.5mm距离处有髓鞘纤维的数目增加了2.5倍。还发现该嵌合物增加了更远处纤维的髓鞘再生，在距切口5mm处有髓鞘纤维的数目增加了5.2倍。这是重要的，因为随着距切口距离的增加，髓鞘再生减少。观察到距离切口0.5mm处CNTF有作用，但是IL-6嵌合物的作用似乎伸得更远，5mm距离处作用比2.5mm处更强。用该嵌合物处理后有髓纤维的厚度也增加2倍以上。总之，与完整的未曾轴突切开的大鼠相比，IL-6嵌合物看来诱导了10％纤维的髓鞘再生。

实施例7：在黑色素瘤B16-F10.9细胞培养物中IL6RIL6诱导MPB基因

产生黑色色素的皮肤黑色素细胞和许旺细胞的胚胎来源是从8日小鼠胚胎神经嵴中迁移出来的共同前体细胞。黑色素瘤是皮肤中从黑色素细胞产生的恶性肿瘤，因而也衍生自神经嵴祖代细胞。B16细胞系是衍生自Balb/c鼠的自发性黑色素瘤。从B16分离得到的F10.9克隆具有高度恶性转移表型。如同其它B16细胞，F10.9细胞也产生黑色色素并富含酪氨酸酶：黑色素生成途径的第1个酶(Bertolotto，1996)。

将P10.9细胞以30,000细胞/孔接种于96孔微量滴定板中，在加有10％FCS的DMEM培养液中培养3天，加或不加0.3-1g/ml浓度的IL6RIL6。抽提细胞总RNA并用MBP的cDNA探针进行Northern印染分析。48小时时IL6RIL6在F10.9细胞中非常强烈地诱导了MBP mRNA(图3A)。时程研究显示MBP RNA的增加始于细胞培养中加入IL6RIL6嵌合物后12小时。

IL6RIL6嵌合物不仅诱导MBP基因表达也诱导髓鞘质的另一种成分和分化的许旺细胞的一种标志：2’3’AMP磷酸二酯酶或CNP酶的表达。这些细胞在细胞体的两极还产生延伸物，在培养中排列成许旺细胞典型的长阵列。

令人惊奇的是，IL6R/IL6能将F 10.9细胞的表型从黑色素产生细胞转变成髓鞘质产生许旺细胞。细胞中加入IL6RIL6嵌合物后48小时，酪氨酸酶的酶活性和黑色素产生完全丧失。

MITF是激活酪氨酸酶基因的转录因子(Bertolotto等，1996)。用IL6RIL6处理F10.9细胞，强烈抑制了MITF基因的表达，MITF本身由同源转录因子Pax-3转激活(Watanabe等，1998)。测定了IL6RIL6处理的F10.9细胞中的Pax-3mRNA，显示Pax-3表达下降始于6小时至48小时(图3)。已知Pax-3能抑制MBP基因(Kioussi和Gruss，1996)。因此，IL6RIL6嵌合物的作用可能归因于对Pax-3同源框基因(其在许旺细胞胚胎发育期髓鞘形成前表达，并且在髓鞘形成时必须受到抑制)的基因调节作用。然而在变性的脱髓鞘神经中，当许旺细胞停止产生MBP时，Pax-3在此细胞中重新表达。因此，最重要的是IL6RIL6既可抑制Pax-3又能通过诱导髓鞘质蛋白质基因导致许旺细胞分化为髓鞘生成细胞。

实施例8：在慢性复发性多发硬化症小鼠模型中注射IL6RIL6

用0.4mg牛MBP加弗氏不完全佐剂(含60微克结核分枝杆菌H37Ra，Difco)免疫接种SJL/J小鼠后，该小鼠产生实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)。通过静脉注射免疫后12天取得的30,000,000个淋巴细胞可将此病被动转移给同系受体小鼠。一周至10天后出现临床麻痹症状。急性期后有缓解和复发。给这些小鼠(体重约25克)每只腹腔内或皮下注射1，3和5微克剂量的IL6RIL6。被动转移后3天或7天开始，每周注射4次，至少3周。将动物如下进行临床评分和分等级：1)尾强直消失；2)后肢软弱；3)一侧肢体麻痹；4)双侧肢体麻痹；5)死亡。用Luxol快兰将髓鞘质染色后用光学显微镜检查动物的脑和脊髓，可以确定IL6RIL6对降低临床等级和减少脑白质脱髓鞘的作用。

实施例9：IL6RIL6嵌合体对神经元和少突神经胶质细胞神经细胞毒性的保护作用

组织型培养物为检查脑生理和病理的许多方面提供了独一无二的方法。海马回(一个涉及记忆编码的区域，在阿尔茨默病和局部缺血中其出现早期变性)切片的长期培养物在这方面是特别有价值的，这是因为它们的突触可塑性机制(如长期潜能)的表达和对病理性侵犯(如兴奋性毒性)的反应。

按Bahr等人(Bahr 1995)所述并作少许修改制备了培养物。解剖分离8日龄Wistar大鼠的海马回，将40微米厚的切片放在多孔透明的Millicell-CM膜(Millipore)上，在6孔多孔板中培养。每张膜上放4个切片，培养液由50％极限必须培养基(+25mM HEPES，+4mM NaHCO₃+NaOH pH7.2)、25％马血清和25％Hank’s液、葡萄糖(6.4g/L)、青霉素/链霉素(10ml/L)、L-谷氨酰胺(2mM)组成。使用前培养于5％CO₂孵箱37℃至少3周，每周更换培养液。

使海马回切片接触浓度为10pg/ml-10μg/ml的IL6或IL6嵌合物15分钟，然后加入NMDA 50μM再30分钟。将培养物置于新鲜培养液中，加或不加IL6或IL6嵌合物。每个实验点至少使用4张切片。在含碘化丙锭(PI 5μl/ml)的新鲜培养液中培养此培养物1小时进行实验性损伤后，对NMDA引起的细胞死亡作1或3-7天的评价。由于PI的亲水性，其进入破裂的细胞并与核染色质连接。用连有强化偶联电荷照相机装置的倒置荧光显微镜检查发射的红色荧光(细胞死亡的标记)。用成象分析系统(Image Pro Plus)定量测定总荧光。

发现IL6和IL6嵌合物都起保护作用避免了NMDA诱导的海马回细胞死亡。以0.1-10ng/ml浓度的IL6培养1天后，发现它们分别保护了50％-30％的神经细胞，而0.05-1pg/ml浓度的IL6嵌合物保护了40％-75％的神经元细胞。0.5pg/ml浓度时观察到IL6嵌合物的最大保护作用(75％细胞受到保护)(图3)。

发现IL-6的保护作用随时间而减弱。处理后，神经元细胞的生存力降低，2天后IL-6的保护作用仅维持于其浓度0.1ng/ml时，第5天仅在30％细胞上有保护作用。与此相反，IL-6嵌合物在0.5ng/ml时却有长时间的保护作用，约60％细胞维持5天(图4)。

用少突神经胶质细胞的特异性标记Gal-C作免疫组织化学染色，测定了该器官型切片中少突神经胶质细胞的存在。2-3周后，使器官型切片体外接触50μM NMDA 30分钟，诱导这些培养物中的细胞坏死性死亡。事实上，如RT/PCR所测定，用NMDA处理后这些培养物中与少突神经胶质细胞不同的所有MBP表达都消失了。

谷氨酸离子化受体的激活代表了兴奋性氨基酸触发的神经毒性过程的初期表现。用新生大鼠小脑神经元的原代培养物(含＞90％神经元)研究IL-6嵌合物对谷氨酸引起的神经毒性的影响，并与IL-6的作用进行比较。

如前所述制备了8日龄Sprague-Dawley幼大鼠的小脑颗粒细胞原代培养物(Pizzi等，1993)。将细胞接种在聚-L-赖氨酸包被的平皿上，在含10％热灭活胎牛血清、谷氨酰胺(2mM)、庆大霉素(50μg/ml)和KCl(25mM)的Eagle’s基础培养液中培养，密度2.5×10⁵细胞/cm²。接种后18小时向培养物中加入胞嘧啶阿拉伯糖苷(10M)以防非神经元细胞增殖。培养神经元细胞后进行实验10天。

除非另有说明，使培养物接触以无Mg²⁺Locke’s溶液配的50μM谷氨酸15分钟。在谷氨酸处理前5分钟加入IL6或IL6嵌合物，平皿重用条件培养液37℃、95％空气/5％CO₂培养，18-24小时后测定细胞活力。

如前所述，用二乙酸荧光素和碘化丙锭混合液作活体染色18小时后评估细胞生存力(Pizzi等，1993)。从每个单层神经元的三个代表性视野的显微摄影，评估二乙酸荧光素(绿色存活细胞)和二乙酸荧光素+碘化丙锭之间的比例来计算单层存活神经元的百分率。数值取自三个姐妹平皿。

虽然0.1-10ng/ml剂量的IL6没能诱导对大鼠小脑颗粒细胞的保护作用，但0.1pg/ml和1pg/ml的IL6嵌合物分别保护40-20％的神经元细胞避免了谷氨酸诱导的神经毒性。

实施例10：NGF撤出后IL6R/IL6嵌合物对上颈部神经节神经元存活的作用

也研究了IL6R/IL6嵌合物在外周神经元培养系统中所发挥的神经保护作用。

分离获得P0-P3大鼠(出生后0-3天)颈上神经节(SCG)的神经元，将其在含5％大鼠血清和NGF的培养液中保存4天。NGF为该神经元存活所必须，而取去NGF导致细胞因诱导凋亡而死亡。用含有抗生长因子中和抗体的无NGF培养液替代先前的培养液。此时加入IL6R/IL6嵌合物0.1或1g/ml(以最终浓度1％的DMSO配制)。将培养物于37℃保持24小时。

通过显微镜检和MTT试验测定细胞的线粒体活性，评估了处理24小时后IL6R/IL6嵌合物对撤去NGF的神经元存活的作用。Mosmann(1983)详细描述了这一试验。所用浓度IL6R/IL6未显示对用NGF处理的SCG神经元有任何毒性和形态学影响。

MTT试验(图6)结果可见，加入100ng/ml和1g/ml浓度的IL6R/IL6嵌合物拯救了高达40％的SCG神经元免于因撤去NGF所导致的死亡。因此，IL6R/IL6对外周神经元具有神经保护作用，提示其在阿尔茨默病、帕金森病或ALS(肌萎缩侧索硬化症)等神经变性疾病中有活性。

本发明现已作了全面描述，本领域技术人员将明白在广泛的等价参数、浓度和条件范围内无须过多实验可进行同样的工作而不脱离本发明的宗旨和范围。

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Claims (10)

1.一种IL6RIL6嵌合物在制造用于治疗和/或预防神经性疾病和紊乱的药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，制造用于治疗CNS或PNS创伤性神经变性、脱髓鞘疾病和/或神经变性疾病药物。

3.如权利要求2所述的用途，其中脱髓鞘疾病是多发性硬化症。

4.如权利要求2所述的用途，其中神经变性疾病选自阿尔茨默病、帕金森病和ALS。

5.一种用于治疗和/或预防神经性疾病或紊乱的药物组合物含有IL6RIL6嵌合物，以及可任选地加入一种或多种药学上可接受的赋形剂。

6.如权利要求5所述的药物组合物，包含IL6RIL6，并可任选地加入一种或多种药学上可接受的赋形剂，用于治疗CNS或PNS创伤性神经变性、脱髓鞘疾病和/或神经变性疾病。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中脱髓鞘疾病是多发性硬化症。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其中神经变性疾病选自阿尔茨默病、帕金森病和ALS。

9.一种治疗神经性疾病或紊乱的方法，该方法包括给予需要的病人有效量的IL6RIL6嵌合物，可任选地加入药学上可接受的载体。

10.一种治疗阿尔茨默病、帕金森病或ALS的方法，该方法包括给予需要的病人有效量的IL6RIL嵌合物，可任选地加入药学上可接受的载体。

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